[go: up one dir, main page]

RS57608B1 - Anti-jagged1 antitela i načini primene - Google Patents

Anti-jagged1 antitela i načini primene

Info

Publication number
RS57608B1
RS57608B1 RS20180998A RSP20180998A RS57608B1 RS 57608 B1 RS57608 B1 RS 57608B1 RS 20180998 A RS20180998 A RS 20180998A RS P20180998 A RSP20180998 A RS P20180998A RS 57608 B1 RS57608 B1 RS 57608B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
antibody
acid sequence
hvr
Prior art date
Application number
RS20180998A
Other languages
English (en)
Inventor
Yvonne Chinn
Julie Q Hang
Christian W Siebel
Yan Wu
Daniel Lafkas
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52574459&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57608(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS57608B1 publication Critical patent/RS57608B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak odnosi se na anti-Jagged antitela i postupke za primenu istih.
OSNOVA
Notch signalni put reguliše širok spektar ćelijskih funkcija (Kopan i sar., Cell 137, 216-233 (2009)). Kod sisara su identifikovana četiri Notch receptora, tj. Notch 1-4, koji dele osnovne strukturne elemente koji uključuju ekstracelularni domen, transmembranski domen i intracelularni domen. Slično, kanonski ligandi Notch imaju neke strukturne sličnosti, ali je identifikovan i veći broj nekanonskih liganada Notch (Kopan i sar., Cell 137, 216-233 (2009)). Pet kanonskih liganada kod sisara su Delta-like 1, Delta-like 3, Delta-like 4, Jagged1 i Jagged2. Vezivanje Notch liganda za ekstracelularni domen Notch receptora pokreće signalnu kaskadu, koja počinje proteolitičko cepanje na ekstracelularnom mestu S2 putem alfa sekretaze iz porodice ADAM (dizintegrin i metaloproteaza). Cepanje na S2 praćeno je proteolitičkim cepanjem gama sekretazom na intracelularnom mestu S3, što dovodi do oslobađanja intracelularnog domena i nishodnih događaja koji na kraju aktiviraju Notch-zavisne transkripcione faktore, kao što su Hes1 i Hey.
Aberantna Notch ekspresija i signalizacija su uključene u veći broj bolesti, uključujući kancer (Koch i sar., Cell. Mol. Life Sci.64, 2746-2762 (2007)). Jasno je da i dalje postoji potreba za agensima sa optimalnim kliničkim osobinama kako bi se razvijali kao terapeutski agensi. Ovde opisani pronalazak zadovoljava ovu potrebu i pruža druge koristi.
WO 2011/063237 opisuje nekoliko anti-Jagged 1 antitela koja smanjuju rast tumora. REZIME
Pronalazak daje anti-Jagged1 antitela i postupke za primenu istih.
Predmetni pronalazači su neočekivano našli da se anti-Jagged1 antitelo A-1 (videti Sliku 4 i PCT publikaciju br. 2014/028446) cepa na teškom lancu nakon toplotnog tretmana i/ili zamrzavanja i otapanja. Loša stabilnost antitela potencijalno smanjuje njegovu vrednost kao leka. Analiza mesta cepanja nije otkrila nijedan poznati motiv cepanja pod uticajem proteaza. Stoga nije poznato da li promene sekvence antitela mogu da smanje primećeno cepanje. Nadalje, pošto je mesto cepanja u HVR teškog lanca, čak i ako bi promena aminokiselina smanjila cepanje, nije se znalo da li bi takve promene mogle biti načinjene bez značajnog smanjenja afiniteta antitela prema Jagged 1. Pronalazači su neočekivano našli da je mutacija aminokiseline na položaju 101 u HVRH3 smanjila cepanje, uz veoma mali gubitak afiniteta.
U nekim otelotvorenjima, dato je izolovano antitelo koje se vezuje za humani Jagged1, pri čemu, antitelo sadrži HVR-H3, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, ili pet HVR odabranih od HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 35 ili 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 28 ili 36; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 16 ili 40. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55; ili (b) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59; ili (c) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59. U svakom ovde opisanom otelotvorenju, antitelo može da sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40; ili (b) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; ili (c) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16.
U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo koje se vezuje za Jagged1 sadrži: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40; ili (b) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; ili (c) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16.
U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo koje se vezuje za Jagged1 sadrži VH sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 54, 58 ili 62. U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo koje se vezuje za Jagged1 sadrži VL sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10, 26 ili 34. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži (a) VH sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 54 i VL sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 34; ili (b) VH sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58 i VL sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10; ili (c) VH sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 62 i VL sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 26.
U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 sadrži (a) VH sekvencu SEQ ID NO: 54, pri čemu, X je bilo koja aminokiselina osim S, i VL sekvencu SEQ ID NO: 34; ili (b) VH sekvencu SEQ ID NO: 58, pri čemu, X je bilo koja aminokiselina osim S, i VL sekvencu SEQ ID NO: 10; ili (c) VH sekvencu SEQ ID NO: 62, pri čemu, X je bilo koja aminokiselina osim S, i VL sekvencu SEQ ID NO: 26. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 54 i VL sekvencu SEQ ID NO: 34. U nekim otelotvorenjima, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53. U nekim otelotvorenjima, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 57 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.
U svakom ovde opisanom otelotvorenju, X može biti bilo koja aminokiselina osim S ili H. U svakom ovde opisanom otelotvorenju, X može biti izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R T i V. U svakom ovde opisanom otelotvorenju, X može biti T.
U nekim otelotvorenjima, dato je izolovano antitelo koje se vezuje za humani Jagged1, koje sadrži: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40; ili (b) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; ili (c) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16.
U nekim otelotvorenjima, dato je izolovano antitelo koje vezuje humani Jagged1, koje sadrži (a) VH sekvencu SEQ ID NO: 33 i VL sekvencu SEQ ID NO: 34; ili (b) VH sekvencu SEQ ID NO: 65 i VL sekvencu SEQ ID NO: 10; ili (c) VH sekvencu SEQ ID NO: 66 i VL sekvencu SEQ ID NO: 26. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 33 i VL sekvencu SEQ ID NO: 34.
U svakom od gore opisanih otelotvorenja, antitelo može biti monoklonsko antitelo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo je humano, humanizovano ili himerno antitelo. U svakom od gore opisanih otelotvorenja, antitelo može biti fragment antitela.
Svako od gore opisanih otelotvorenja može biti IgG1 antitelo kompletne dužine. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG1 antitelo bez efektorske funkcije. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG1 antitelo koje sadrži N297G ili N297A mutaciju. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG1 antitelo koje sadrži N297G mutaciju.
U nekim otelotvorenjima, dato je izolovano antitelo koje se vezuje za humani Jagged1, pri čemu, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53. U nekim otelotvorenjima, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75; ili (b) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76; ili (c) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75; ili (d) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76.
U svakom od ovde opisanih otelotvorenja, antitelo može biti antagonist Jagged1-posredovane signalizacije. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani i mišji Jagged1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 čoveka, miša, pacova i majmuna cynomolgus. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1, ali ne vezuje Jagged2. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1, ali ne vezuje humani Jagged2. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani i mišji Jagged1, ali ne vezuje humani ili mišji Jagged2. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 čoveka, miša, pacova i majmuna cynomolgus, ali ne vezuje Jagged2 čoveka, majmuna cynomolgus ili miša. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1, ali ne vezuje Jagged2 ili DLL1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1, ali ne vezuje humani Jagged2 ili humani DLL1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani i mišji Jagged1, ali ne vezuje humani ili mišji Jagged2, ili humani ili mišji DLL1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 čoveka, miša i majmuna cynomolgus, ali ne vezuje Jagged2 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus, ili DLL1 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1, ali ne vezuje Jagged2, DLL1 ili DLL4. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1, ali ne vezuje humani Jagged2, humani DLL1 ili humani DLL4. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani i mišji Jagged1, ali ne vezuje humani ili mišji Jagged2, humani ili mišji DLL1, ili humani ili mišji DLL4. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 čoveka, miša, pacova i majmuna cynomolgus, ali ne vezuje Jagged2 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus, ili DLL1 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus,ili DLL4 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus.
U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1 sa afinitetom (Kd) od 2 nM ili jačim (tj. manje od 2 nM). U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1 sa afinitetom (Kd) od 1,5 nM ili jačim, ili 1 nM ili jačim, ili 0,9 nM ili jačim, 0,8 nM ili jačim, ili 0,7 nM ili jačim, (tj. manje od 1,5 nM, manje od 1 nM, manje od 0,9 nM, manje od 0,8 nM, ili manje od 0,7 nM). U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje mišji Jagged1 sa afinitetom (Kd) od 2 nM ili jačim (tj. manje od 2 nM). U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje mišji Jagged1 sa afinitetom (Kd) od 1,5 nM ili jačim, ili 1 nM ili jačim, ili 0,9 nM ili jačim, 0,8 nM ili jačim, 0,7 nM ili jačim, ili 0,6 nM ili jačim, ili 0,5 nM ili jačim (tj. manje od 1,5 nM, manje od 1 nM, manje od 0,9 nM, manje od 0,8 nM, manje od 0,7 nM, manje od 0,6 nM, ili manje od 0,5 nM). U nekim otelotvorenjima, afinitet (Kd) se meri pomoću površinske plazmonske rezonance.
U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1 sa konstantom asocijacije (kon) od najmanje 1,0E+04/Ms, ili najmanje1,5E+04/Ms, ili najmanje 2,0E+04/Ms. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1 sa konstantom disocijacije (koff) od manje od 10,0E-04/s, ili manje od 9,0E-04/s, ili manje od 8,0E-04/s, ili manje od 7,0E-04/s. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje mišji Jagged1 sa konstantom asocijacije (kon) od najmanje 1,0E+04/Ms, ili najmanje1,5E+04/Ms, ili najmanje 2,0E+04/Ms ili najmanje 3,0E+04/Ms, ili najmanje 4,0E+04/Ms, ili najmanje 5,0E+04/Ms, ili najmanje 6,0E+04/Ms, ili najmanje 7,0E+04/Ms. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje mišji Jagged1 sa konstantom disocijacije (koff) od manje od 10,0E-04/s, ili manje od 9,0E-04/s, ili manje od 8,0E-04/s, ili manje od 7,0E-04/s. U nekim otelotvorenjima, konstante asocijacije i disocijacije se mere pomoću površinske plazmonske rezonance.
U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje nativni, savijeni Jagged1, ali ne vezuje denaturisani Jagged1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 u testu sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), ali ne vezuje Jagged1 u Vestern blot testu. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje savijeni Jagged1 u testu sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), ali ne vezuje denaturisani Jagged1 u Vestern blot testu. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje savijeni Jagged1 pod fiziološkim uslovima, ali ne vezuje denaturisani Jagged1.
U nekim otelotvorenjima, antitelo smanjuje rast tumora kod ksenograft modela miša, ne izazivajući gubitak težine. U nekim otelotvorenjima, ksenograft model miša je ksenograft model kancera jetre. U nekim otelotvorenjima, rast tumora je smanjen za najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, ili najmanje 90 AUC/dan TGI%.
U nekim otelotvorenjima, primena Jagged1 antitela smanjuje metaplaziju peharskih ćelija u plućima na mišjem modelu preosetljivosti disajnih puteva. U nekim otelotvorenjima, primena antitela smanjuje broj peharskih ćelija u plućima za najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90%. U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se takmiči sa svakim od gore navedenih otelotvorenja za specifično vezivanje za Jagged1. U nekim otelotvorenjima, antitelo se takmiči za vezivanje za humani Jagged1 sa antitelom koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO.: 33, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO.: 34, pri čemu, antitelo nije antitelo A, antitelo A-1 ili antitelo A-2.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano antitelo iz gornjih otelotvorenja. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela, uključujući uzgajanje ćelije domaćina, tako da se proizvodi antitelo.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži antitelo prema bilo kom od gore opisanih otelotvorenja i citotoksični agens.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži antitelo prema bilo kom od gore opisanih otelotvorenja i farmaceutski prihvatljiv nosač.
U drugom aspektu, dato je antitelo prema bilo kom od gore opisanih otelotvorenja za primenu kao lek. U nekim otelotvorenjima, dato je antitelo prema bilo kom od gore opisanih otelotvorenja za primenu u lečenju kancera. U nekim otelotvorenjima, dato je antitelo prema bilo kom od gore opisanih otelotvorenja za primenu za smanjenje rasta ćelija kancera.
U drugom aspektu, dat je postupak za inhibiciju Jagged1-posredovane signalizacije. U jednom otelotvorenju, dat je postupak za in vitro inhibiciju Jagged1-posredovane signalizacije. U jednom aspektu, objavljena je postupak za in vivo inhibiciju Jagged1-posredovane signalizacije.
U drugom aspektu, predmetna prijava objavljuje postupak za lečenje pojedinca koji ima kancer, uključujući davanje pojedincu efikasne količine antitela prema bilo kom od gore opisanih otelotvorenja. U jednom otelotvorenju, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera pluća, kancera mozga, kancera cerviksa, kancera kolona, kancera jetre, kancera žučnih kanala, kancera pankreasa, kancera kože, maligniteta B ćelija i maligniteta T ćelija.
Predmetni pronalazači su otkrili da lečenje Jagged1 antitelom usmerava ćelijsku sudbinu u disajnim putevima tako što je udaljava od sudbine sekretorne ćelije (uključujući peharsku ćeliju), a približava sudbini trepljastih ćelija. Jagged1 signalizacija je važna za održavanje sudbine sekretorne ćelije, a inhibicija Jagged1 signalizacije je sprečila metaplaziju peharskih ćelija. Predmetni pronalazači su takođe pokazali da je konverzija bronhijalne egzokrine ćelije u trepljastu ćeliju direktna, i ne uključuje ćelijsku deobu (podaci nisu prikazani). Ova transdiferencijacija jednog ćelijskog tipa u drugi dešavala se u plućima odraslih, i razlikuje se od izbora ćelijske sudbine koji uključuju deobu progenitorske ćelije, kao nakon oštećenja ili tokom razvoja. Metaplazija peharskih ćelija ili višak sluzi predstavlja zaštitni znak više bolesti disajnih puteva, kao što je astma, cistična fibroza, hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP) i Beretov jednjak. Ti rezultati inhibicije Jagged obezbeđuju osnovu za terapeutsku primenu koja uključuje upotrebu Jagged1 ili Jagged2 inhibitora za prevenciju ili preokret metaplazije peharskih ćelija, i za lečenje stanja okarakterisanih viškom sluzi, kao kod bolesti disajnih puteva (npr. astma, HOBP, cistična fibroza) i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, dati su postupci za prevođenje bronhijalne egzokrine ćelije u trepljastu ćeliju, uključujući primenu na pojedincu antagonista antitela koji se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, ali se ne ograničavajući na, bilo koje od anti-Jagged1 antitela koja su ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, dati su postupci za povećanje prevođenja bronhijalnih egzokrinih ćelija u trepljaste ćelije, uključujući primenu na pojedincu antagonista antitela koji se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, ali se ne ograničavajući na, bilo koje od anti-Jagged1 antitela koja su ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, bronhijalna egzokrina ćelija je prisutna u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, prevođenje se dešava u odsustvu deobe bronhijalnih egzokrinih ćelija. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima bolest izabranu od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi. U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, dati su postupci za smanjenje broja peharskih ćelija, uključujući primenu na pojedincu antagonista antitela koji se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, ali se ne ograničavajući na, bilo koje od anti-Jagged1 antitela koja su ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, dati su postupci za smanjenje prevođenja bronhijalnih egzokrinih ćelija u peharske ćelije, uključujući primenu na pojedincu antagonista antitela koji se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, ali se ne ograničavajući na, bilo koje od anti-Jagged1 antitela koja su ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, peharske ćelije su prisutne u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima bolest izabranu od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi. U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, dati su postupci za smanjenje nastajanja peharskih ćelija kod ispitanika, uključujući primenu na pojedincu antagonista antitela koji se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, ali se ne ograničavajući na, bilo koje od anti-Jagged1 antitela koja su ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, nastajanje peharskih ćelija u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima) je smanjeno. U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima bolest izabranu od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi. U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, dati su postupci za smanjenje mukusa, uključujući primenu na pojedincu antagonista antitela koji se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, ali se ne ograničavajući na, bilo koje od anti-Jagged1 antitela koja su ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, mukus je mukus disajnih puteva. U nekim otelotvorenjima, mukus je prisutan u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima bolest izabranu od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi. U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, dati su postupci za povećanje broja trepljastih ćelija, uključujući primenu na pojedincu antagonista antitela koji se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, ali se ne ograničavajući na, bilo koje od anti-Jagged1 antitela koja su ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, dati su postupci za povećanje nastajanja trepljastih ćelija, uključujući primenu na pojedincu antagonista antitela koji se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, ali se ne ograničavajući na, bilo koje od anti-Jagged1 antitela koja su ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, trepljasta ćelija je prisutna u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, pojedinac ima bolest izabranu od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi. U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, na primer, svako ovde opisano anti-Jagged1 antitelo) obezbeđeno je za primenu u lečenju bolesti izabrane od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi, uključujući primenu na pojedincu sa kancerom efikasne količine antitela svakog od ovde opisanih otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, na primer, svako ovde opisano anti-Jagged1 antitelo) obezbeđeno je za primenu u lečenju bolesti izabrane od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi, uključujući primenu na pojedincu sa kancerom efikasne količine antitela svakog od ovde opisanih otelotvorenja, pri čemu, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 povećava prevođenje bronhijalnih egzokrinih ćelija u trepljaste ćelije u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, na primer, svako ovde opisano anti-Jagged1 antitelo) obezbeđeno je za primenu u lečenju bolesti izabrane od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi, uključujući primenu na pojedincu sa kancerom efikasne količine antitela svakog od ovde opisanih otelotvorenja, pri čemu, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 smanjuje broj peharskih ćelija u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, na primer, svako ovde opisano anti-Jagged1 antitelo) obezbeđeno je za primenu u lečenju bolesti izabrane od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi, uključujući primenu na pojedincu sa kancerom efikasne količine antitela svakog od ovde opisanih otelotvorenja, pri čemu, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 smanjuje nastajanje peharskih ćelija u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, na primer, svako ovde opisano anti-Jagged1 antitelo) obezbeđeno je za primenu u lečenju bolesti izabrane od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi, uključujući primenu na pojedincu sa kancerom efikasne količine antitela svakog od ovde opisanih otelotvorenja, pri čemu, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 smanjuje količinu sluzi u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, na primer, svako ovde opisano anti-Jagged1 antitelo) obezbeđeno je za primenu u lečenju bolesti izabrane od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi, uključujući primenu na pojedincu sa kancerom efikasne količine antitela svakog od ovde opisanih otelotvorenja, pri čemu, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 povećava broj trepljastih ćelija u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, na primer, svako ovde opisano anti-Jagged1 antitelo) obezbeđeno je za primenu u lečenju bolesti izabrane od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi, uključujući primenu na pojedincu sa kancerom efikasne količine antitela svakog od ovde opisanih otelotvorenja, pri čemu, antitelo koje se vezuje za humani Jagged1 povećava nastajanje trepljastih ćelija u disajnim putevima odraslih ljudi (npr. plućima). U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U drugom otelotvorenju, dati su postupci za (a) prevođenje trepljaste ćelije u bronhijalnu egzokrinu ćeliju (npr. pri čemu, trepljasta ćelija je nađena u disajnim putevima odraslih ljudi, npr.
plućima), (b) povećanje količine sluzi (npr sluzi u disajnim putevima), (c) smanjenje broja trepljastih ćelija (npr. trepljaste ćelije u disajnim putevima čoveka), uključujući primenu agonista Jagged signalizacije na pojedincu.
U nekim aspektima, objavljen je postupak za lečenje bolesti izabrane od alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i bolesti povezanih sa viškom sluzi, uključujući primenu na pojedincu sa kancerom efikasne količine antitela koje se vezuje za humani Jagged1 (uključujući, na primer, svako antitelo koje se vezuje za ovde opisani humani Jagged1). U nekim otelotvorenjima, bolest je povezana sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima). U nekim otelotvorenjima, bolest je izabrana od astme, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), cistične fibroze i Beretovog jednjaka.
U svakom ovde opisanom otelotvorenju, pri čemu, Jagged1 antitelo smanjuje rast tumora kod ksenograft modela miša, ne izazivajući gubitak težine.
U svakom ovde opisanom otelotvorenju, anti-Jagged1 antitelo može biti povezano sa oznakom. U nekim otelotvorenjima, oznaka je pozitronski emiter. U nekim otelotvorenjima, pozitronski emiter je<89>Zr. U nekim otelotvorenjima, dat je postupak za detektovanje humanog Jagged1 u biološkom uzorku, uključujući dovođenje biološkog uzorka u kontakt sa ovde opisanim antitelom pod uslovima dozvoljenim za vezivanje antitela za prirodni humani Jagged1, i detektovanje nastajanja kompleksa između antitela i prirodnog humanog Jagged1 u biološkom uzorku. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak je izabran od kancera dojke, kancera pluća, kancera mozga, kancera cerviksa, kancera kolona, kancera jetre, kancera žučnih kanala, kancera pankreasa, kancera kože, maligniteta B ćelija i maligniteta T ćelija.
KRATAK OPIS SLIKA
Sl. 1 prikazuje primer aminokiselinske sekvence humanog i mišjeg Jagged1 proteina. Sl. 2 prikazuje primer aminokiselinske sekvence humanog i mišjeg Jagged2 proteina. Sl. 3A-D prikazuju aminokiselinske sekvence peptida upotrebljenih za skrining biblioteke antitela faga i selekciju. Svi proteini su eksprimirani kao sekretovani protein u BEVS ćelijama, i njihove sekvence su navedene u smeru od N-terminalnih ka C-terminalnim. (A) Aminokiselinska sekvenca eksprimiranog proteina mišjeg Jagged 1-DSL-EGF1-4 (Q34-D377). Podebljani font na N-terminusu predstavlja sekvencu kratkog linkera (ADLGS) (SEQ ID NO: 82). Podebljani font na C-terminusu predstavlja sekvencu kratkog linkera (EFG), mesto cepanja trombina (LVPRGS) (SEQ ID NO: 83), G spejser i 6-His marker. (B) Aminokiselinska sekvenca eksprimiranog proteina humanog Jag1-DSL-EGF1-4. Prikazana je samo sekvenca Jag1, mada antigen takođe sadrži mesto cepanja TEV proteaze i 6-His marker na C-terminusu. (C) Aminokiselinska sekvenca eksprimiranog proteina mišjeg Jag2-DSL-EGF1-4 (M27-E388). Podebljani font na N-terminusu predstavlja sekvencu kratkog linkera (ADLGS) (SEQ ID NO: 82). Podebljani font na C-terminusu predstavlja sekvencu kratkog linkera (EFG), mesto cepanja trombina (LVPRGS) (SEQ ID NO: 83), G spejser i 6-His marker. (D) Aminokiselinska sekvenca eksprimiranog proteina humanog Jag2-DSL-EGF1-4 (R2-E388). Podebljani font na C-terminusu predstavlja sekvencu kratkog linkera (EFG), mesto cepanja trombina (LVPRGS) (SEQ ID NO: 83), G spejser i 6-His marker.
SL. 4A-1-B-2 prikazuju poravnavanje aminokiselinskih sekvenci za varijabilne domene teškog (SL.4A-1 i SL.4A-2) i lakog (SL.4B-1 i SL.4B-2) lanca anti-Jagged1 (A, A-1, A-2), anti-Jagged2 (B, B-1, B-2, B-3), i anti-Jagged1/2 antitela (C, C-1, D, D-1, D-2, D-3, D-4, D-5). Naznačeni su položaji aminokiselina regiona koji određuju komplementarnost (CDR).
SL. 5A-B prikazuju sekvence H1, H2, i H3 hipervarijabilnog regiona (HVR) teškog lanca anti-Jagged1 antitela, kao što je opisano u Primerima. Položaji aminokiselina su označeni prema Kabatovom sistemu numeracije, kao što je opisano ovde i na drugim mestima.
SL. 6 prikazuje HVR sekvence L1, L2, i L3 lakog lanca anti-Jagged1 antitela, kao što je opisano u Primerima. Položaji aminokiselina su označeni prema Kabatovom sistemu numeracije, kao što je opisano u nastavku.
SL. 7 prikazuje sekvence okvira lakog i teškog lanca anti-Jagged1 antitela, kao što je opisano u Primerima. Brojevi u eksponentu označavaju položaje aminokiselina prema Kabatovom sistemu.
SL. 8 prikazuju specifičnost vezivanja antitela dobijenih skriningom. Rezultati ELISA testa za merenje specifičnosti vezivanja antitela A i B, određeni tokom skrininga, uz primenu humanog Jag1-DSL-EGF1-4 (SL.3B) za antitelo A, i mišjeg i humanog Jag2-DSL-EGF1-4 (SL.3C i D) za antitelo B. Crni stubići = vezivanje za humani Jagged1; sivi stubići = vezivanje za humani Jagged2. C-1 je antitelo koje se vezuje i za Jagged1 i za Jagged2.
SL. 9A-B prikazuju inhibiciju Notch signalizacije od strane afinitetno zrelih anti-Jagged antitela. Testovi sa zajednički gajenim kulturama izvedeni su kao što je opisano u Primeru 3. Antitela faga u naznačenoj koncentraciji naznačena su na x-osi. DAPT u naznačenim koncentracijama služio je kao pozitivna kontrola za inhibiciju Notch signalizacije; DMSO je služio kao kontrola za vehikulum. Signalizacija je indukovana od strane Jagged1 (tamnosivi stubići) ili od strane Jagged2 (svetlosivi stubići). Netretirane = kulture koje nisu stimulisane ligandom, i nisu tretirane antitelom; bez stimulacije = kulture koje nisu stimulisane ligandom; agD = antitelo za kontrolu izotipa; Stim/no AB = kulture stimulisane ligandom, ali nisu tretirane antitelom; inhibitor gama-sekretaze DAPT ili DAPT kontrola vehikuluma DMSO.
Sl. 10A-B prikazuju da kombinovana inhibicija Jagged1 i Jagged2 izaziva brz gubitak težine. (A) Miševi su dva puta nedeljno dobijali dozu anti-Jagged 1/2 antitela C-1 (anti-J1/2; 5-10 mg/kg), anti-Jagged1 antitela A-2 (anti-J1; 5-20 mg/kg), anti-Jagged2 antitela B-3 (anti-J2; 5-20 mg/kg), antitela A-2 i B-3 zajedno (anti-J1 i -2; 5 mg/kg svakog) ili antitela za kontrolu izotipa (20 mg/kg). Ukupna koncentracija antitela pri svakoj dozi dopunjena je do 20 mg/kg pomoću antitela za kontrolu izotipa, tamo gde je bilo potrebno. Promene prosečne telesne težine (y-osa) su predstavljene na dijagramu kao procenat početne telesne težine tokom vremena (x-osa). (B) Balb/c miševi (deset po grupi, pojedinačno smešteni) primali su dva puta nedeljno IP injekciju koja je sadržala ili 30 mg/kg anti-gD antitela za kontrolu izotipa, ili kombinaciju 15 mg/kg antitela A-2 i 15 mg/kg antitela B-3 tokom osam dana. Unošenje hrane je procenjivano svakodnevnim merenjem hrane koja je ubačena, i koja je ostala u svakom kavezu. Intervali greške predstavljaju standardne devijacije (n = 10).
SL. 11A-1-B-2 predstavljaju inhibiciju rasta ćelija humanog kancera pluća od strane antitela antagonista anti-Jagged1 in vivo. Miševi sa ksenograftima humanog kancera pluća dva puta nedeljno su intraperitonealno (IP) primali injekciju sa 20 mg/kg anti-gD antitela za kontrolu izotipa (At za kontrolu izotipa) ili sa anti-Jagged1 antitelom A-2 (Anti-Jag1), a injekcije su počele nakon što su prosečne zapremine tumora (merene kljunastim merilom) dostigle oko 180 mm<3>. Zapremine tumora (y-osa) su zatim merene 19 dana. SL.11A-1 i SL.11A-2: Prosečne zapremine tumora za svaku grupu (n=10) prikazane su u zavisnosti od vremena (x-osa) upotrebom linearnog modela mešanih efekata (SL. 11A-1). Zapremine tumora za svakog miša u svakoj grupi predstavljene su na dva dijagrama na SL. 11A-2. SL. 11B-1 i SL.11B-2: Ukupna telesna težina svakog miša je merena i predstavljena kao procenat promene prosečan za svaku grupu (SL.11B-1), ili za svakog miša u svakoj grupi (SL.11B-2).
SL. 12A-B prikazuju inhibiciju rasta ćelija humanog kancera dojke od strane antitela antagonista anti-Jagged1 i anti-Jagged2 in vivo. C.B-17 SCID.bg miševi sa ksenograftima humanog kancera dojke su 0, 4, 7, 12, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 43, 50. i 57. dana primali injekcije sa anti-gD antitelom za kontrolu izotipa (Anti-gD), anti-ambrozija antitelom za kontrolu izotipa (anti-ambrozija), anti-Jagged1 antitelom A-2 u skeletu humanog IgG1 (anti-Jag1 A-2 (hIgG1)), anti-Jagged1 antitelom A-2 u skeletu mišjeg IgG2a (anti-Jag1 A-2 (mIgG2a)), ili anti-Jagged2 antitelom B-3 u skeletu humanog IgG1 (anti-Jag2 B-3 (hlgG1)). Zapremine tumora (y-osa) tretiranih grupa (A) ili pojedinačnih životinja (B) prikazane su upotrebom linearnog modela mešanih efekata tokom vremena (x-osa).
SL. 13A-C prikazuju cepanje anti-Jagged1 antitela u teškom lancu. (A) Antitela A, A-1 i A-2 su analizirana standardnom SDS-PAGE elektroforezom i postupcima bojenja proteina u odsustvu (-) ili prisustvu (+) redukujućeg agensa DTT, kao što je naznačeno. Takođe su prikazani standardi za molekulsku masu (u kD). Dijagram (B) prikazuje reprezentativni snimak masene spektrometrijske (MS) analize (LC-MS/TOF, redukujući uslovi) A-1. Položaji bitnih fragmenata (pikovi) su označeni, a molekulske mase su prikazane iznad pikova. Ova analiza je ukazala da je mesto cepanja bilo između HC aminokiselina G100 i S101 u CDR3, kao što je predstavljeno na aminokiselinskoj sekvenci HC na dijagramu (C), gde strelica označava mesto cepanja.
SL. 14A-C prikazuju sekvenciranje N-terminalnih peptida mesta cepanja teškog lanca anti-Jagged1 antitela. Prema standardnim postupcima za SDS-PAGE pod redukujućim uslovima i bojenje proteina, preparati kompletne dužine i pocepani fragmenti naznačenog antitela su izdvojeni i identifikovani (A). C-terminalni (B) i N-terminalni (C) pocepani peptidni fragmenti su isečeni iz gela i sekvencirani standardnim postupcima za N-terminalno sekvenciranje peptida, da bi se precizno identifikovalo mesto cepanja. Sekvence obeležene crvenom bojom slova na slikama (B) i (C) označavaju N-terminalne sekvence svakog od sekvenciranih peptida, pri čemu sekvenca na slici (B) označava mesto cepanja, a sekvenca na slici (C) označava N-terminus HC.
SL. 15 prikazuje efekat promene aminokiseline na S101 teškog lanca anti-Jagged1 antitela na mestu cepanja teškog lanca.
SL. 16A-B prikazuju (A) SDS-PAGE analizu cepanja anti-Jagged1 antitela inkubiranih na 70°C; i (B) rezime procenta cepanja teškog lanca zapaženog za svaki preparat antitela na 70°C i na 95°C.
SL. 17A-B prikazuju (A) SDS-PAGE analizu cepanja anti-Jagged1 antitela A-1 nakon različitog broja ciklusa zamrzavanja i otapanja, i (B) procenat cepanja teškog lanca primećen pod svakim od ovih uslova.
SL. 18A-C prikazuju (A) inhibiciju aktivacije koju indukuje Jagged1, od strane anti-Jagged1 antitela A-1 (levi stubići) i A-1(S101T) (desni stubići) pri različitim koncentracijama.
Slike (B) i (C) prikazuju prosečne vrednosti luciferaze svica, odnosno prosečne vrednosti Renilla luciferaze, koje su upotrebljene da se izračunaju podaci u (A), kao što je opisano u Primeru 10.
SL. 19 prikazuje imunofluorescentno bojenje trepljastih ćelija (kao što je označeno imunofluorescentnom detekcijom alfa-tubulina crvenom bojom) i bronhijalnih egzokrinih ćelija (kao što je označeno imunofluorescentnom detekcijom CC10 zelenom bojom) u bronhijalnom epitelu miševa kojima su data anti-Jagged2 antitela u kombinaciji sa anti-Jagged1 antitelom A-1 ili A-1(S101T), ili kontrola izotipa, kao što je opisano u Primeru 11.
SL. 20A-B prikazuju (A) grafikon LME (linearnih mešanih efekata) zapremine tumora kod ksenograft modela kancera jetre miša tretiranog anti-Jagged1 antitelom A-1 ili A-1(S101T), i (B) tretirane grupe prikazane na sl. (A) i dozu, zapreminu tumora poslednjeg dana studije (44. dan) AUC/Dan %TGI (površina ispod krive po danu procenta inhibicije rasta tumora (TGI) u odnosu na kontrolu, gde se gornja i donja odnose na najnižu, odnosno najvišu, vrednost %TGI za pojedinačne životinje u svakoj grupi), vreme udvostručenja tumora u danima (TTP 2X), i broj miševa koji su pokazali delimični odgovor tokom eksperimenta (PR).
SL. 21A-B prikazuju (A) grafikon LME (linearnih mešanih efekata) telesne težine miša tokom vremena za miševe prikazane na SL.20 i (B) tretirane grupe prikazane na sl. (A) i dozu, % promene telesne težine poslednjeg dana studije (% BW poslednjeg dana), maksimalni % promene telesne težine (max %BW), i dan kad se desio maksimalni % promene telesne težine (dan max %BW), i (AUC/dan (niža, viša)).
SL. 22A-B prikazuju amikokiselinske sekvence za varijabilne domene (A) teškog lanca i (B) lakog lanca anti-Jagged1 antitela A-1(S101T). Naznačeni su položaji aminokiselina regiona koji određuju komplementarnost (CDR).
SL. 23A-C prikazuju (A) bojenje perjodnom kiselinom-Šifovim reagensom disajnih puteva pluća kontrole, miševa tretiranih anti-Jagged1, anti-Jagged2 antitelom, ili kombinacijom anti-Jagged1 i anti-Jagged2 antitela, (B) kvantifikaciju broja peharskih ćelija u disajnim putevima različitih tretiranih grupa, i (C) indeks inflamacije, određen HE bojenjem.
SL. 24 prikazuje vezivanje (levo) anti-Jagged1 antitela A-2 i (desno) anti-Jagged1/2 antitela C-1 za humani Jagged1, mišji Jagged1, humani Jagged 2, mišji Jagged2, humani DLL1, mišji DLL1, humani DLL4 i mišji DLL4.
SL. 25 prikazuje klirens anti-Jagged1 A-1-S101T antitela nakon pojedinačne intravenske primene tri različite doze antitela kod miša.
DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA
I. DEFINICIJE
"Akceptorski humani okvir" je za ove svrhe okvir koji sadrži aminokiselinske sekvence okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisan dole. Akceptorski humani okvir "dobijen od" okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da obuhvati iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove, ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, broj izmena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL akceptorski humani okvir je po sekvenci identičan sa sekvencom okvira VL humanog imunoglobulina ili sekvencom okvira humanog konsenzusa.
"Afinitet" se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, "afinitet vezivanja" se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može generalno da se predstavi preko konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koje su ovde opisane. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Termin "afinitetno zrelo" antitelo odnosi se na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Termini „anti-Jagged antitelo“ ili „antitelo koje se vezuje za Jagged“ odnose se na antitelo koje je sposobno da veže Jagged1, Jagged2, ili Jagged1 i 2 (Jagged1/2) sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje Jagged. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-Jagged antitela za nepovezani protein koji nije Jagged je manji od oko 10% od vezivanja antitela za Jagged kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za Jagged ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim otelotvorenjima, anti-Jagged antitelo se vezuje za epitop Jagged koji je konzerviran između Jagged različitih vrsta. Termini „antiJagged1 antitelo“ i „antitelo koje se vezuje za Jagged1“ odnose se na antitelo koje je sposobno da veže Jagged1 sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje Jagged1.
Termin "antitelo" ovde je upotrebljen u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.
Kao što je ovde upotrebljen, termin "astma" se odnosi na kompleksni poremećaj okarakterisan promenljivim i ponovljenim simptomima, reverzibilnom opstrukcijom disajnih puteva (npr. putem bronhodilatatora) i bronhijalnom hiperaktivnošću, koja može, ili ne mora biti povezana sa osnovnom upalom. Primeri za astmu uključuju astmu osetljivu na aspirin/pogoršanu astmu, atopičnu astmu, tešku astmu, blagu astmu, umerenu do tešku astmu, astmu kod koje nisu korišćeni kortikosteroidi, hroničnu astmu, astmu otpornu na kortikosteroide, astmu refraktornu na kortikosteroide, novodijagnostikovanu i nelečenu astmu, astmu usled pušenja, astmu nekontrolisanu na kortikosteroidima, i druge astme pomenute u J Allergy Clin Immunol (2010) 126(5):926-938.
„Blokirajuće“ antitelo ili „antagonist“ antitelo je ono koje značajno inhibira (delimično ili potpuno) biološku aktivnost antigena sa kojim se vezuje.
"Fragment antitela" ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
"Antitelo koje se vezuje za isti epitop" kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.
Termin "himerno" antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
"Klasa" antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Termin "citotoksični agens" kao što se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense koji su objavljeni dole.
"Efektorske funkcije" ukazuju na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelozavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
"Efikasna količina" agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
Termin "Fc region" ovde se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, označavanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, "Okvir" ili "FR" se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Termini "antitelo pune dužine", "netaknuto antitelo" i "kompletno antitelo" ovde se koriste naizmenično da bi se ukazalo na antitelo koje ima strukturu u suštini sličnu nativnoj strukturi antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano.
Termini "ćelija domaćin", "linija ćelija domaćina" i "kultura ćelija domaćina" koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju "transformante" i "transformisane ćelije", koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.
"Humano antitelo" je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili je dobijeno iz ne-humanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane antigen-vezujuće ostatke.
"Okvir humanog konsenzusa" je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vol. 1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat et al., gore. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat et al., gore.
"Humanizovano" antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR i aminokiselinske ostatke od humanih FR. U nekim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili barem jedan, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR (npr. CDR) odgovaraju onima iz ne-humanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži barem deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. "Humanizovani oblik" antitela, npr. ne-humanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
Termin "hipervarijabilni region" ili "HVR" kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci ("regioni koji određuju komplementarnost" ili "CDR") i/ili formiraju strukturno definisane petlje ("hipervarijabilne petlje") i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom ("antigen kontakti"). Generalno, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). Ovde primeri za HVR uključuju:
a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3); (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987));
b) CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
c) antigen kontakte koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3); (MacCallum i sar. J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)); i
d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući ostatke HVR aminokiselina 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su nabrojani prema radu Kabat i sar., gore.
"Imunokonjugat" je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterologih molekula, uključujući, ali se ne ograničavajući na citotoksični agens.
"Pojedinac" ili "ispitanik" je sisar. Sisari uključuju, ali se ne ograničavaju na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ne-humane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U nekim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.
"Izolovano" antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99% kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reverzno faznim HPLC postupkom). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman i sar., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
"Izolovana" nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
"Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-Jagged antitelo" ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćina.
Termin “monoklonsko antitelo”, kako je ovde korišćen, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno prema pojedinačnoj determinanti na antigenu. Tako, reč “monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
"Golo antitelo" ukazuje na antitelo koje nije konjugovano sa heterologim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može da se nalazi u farmaceutskoj formulaciji.
"Nativna antitela" ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N- do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (<Κ>) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence svog konstantnog domena.
Termin "uputstvo za upotrebu" koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
"Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence" u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan kod Genentech, Inc., South San Francisco, California, ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.
Termin "farmaceutska formulacija" odnosi se na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
"Farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na sastojak farmaceutske formulacije, koji nije aktivni sastojak, koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali se ne ograničava na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Termin "Jagged" ili "Jag", kao što se ovde koristi, ukazuje na svaki nativni Jagged koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi) ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen Jagged, "kompletne dužine", kao i svaki oblik Jagged koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante Jagged, npr. splajsovane ili alelne varijante. Aminokiselinska sekvenca primera za humani i mišji Jagged1 i Jagged2 data je na SL.1, odnosno 2 (SEQ ID NO.:1-4).
Kao što je ovde upotrebljeno, "lečenje" (i gramatičke varijacije, kao što je "lečiti") se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok pojedinca koji se leči, i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali se ne ograničavaju na, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela iz ovog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti, ili da uspore napredovanje bolesti.
Termin "varijabilni region" ili "varijabilni domen" ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koje je uključeno u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH, odnosno VL) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (vidite, npr., Kindt i sar. Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman i Co., strana 91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen, za pregledanje biblioteke komplementarnih VH, odnosno VL domena. Videti, npr. Portolano i sar., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson i sar., Nature 352:624-628 (1991).
Termin "vektor", kao što se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao "ekspresioni vektori".
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
U jednom aspektu, pronalazak se delimično zasniva na identifikovanju anti-Jagged antitela i njihovih fragmenata. U pojedinim otelotvorenjima data su antitela koja se vezuju za najmanje jedan Jagged. Antitela iz pronalaska su korisna npr. za dijagnostikovanje ili lečenje kancera. Prema tome, pronalazak obezbeđuje postupke, kompozicije, komplete i proizvode vezane za anti-Jagged antitela.
A. Primeri za anti-Jagged1 antitela
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za Jagged1. U nekim otelotvorenjima, antitelo je antagonist Jagged1-posredovane signalizacije. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani i mišji Jagged1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 čoveka, miša i majmuna cynomolgus. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1, ali ne vezuje Jagged2. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1, ali ne vezuje humani Jagged2. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani i mišji Jagged1, ali ne vezuje humani ili mišji Jagged2. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 čoveka, miša i majmuna cynomolgus, ali ne vezuje Jagged2 čoveka, majmuna cynomolgus ili miša. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1, ali ne vezuje Jagged2 ili DLL1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1, ali ne vezuje humani Jagged2 ili humani DLL1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani i mišji Jagged1, ali ne vezuje humani ili mišji Jagged2, ili humani ili mišji DLL1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 čoveka, miša i majmuna cynomolgus, ali ne vezuje Jagged2 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus, ili DLL1 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1, ali ne vezuje Jagged2, DLL1 ili DLL4. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1, ali ne vezuje humani Jagged2, humani DLL1 ili humani DLL4. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani i mišji Jagged1, ali ne vezuje humani ili mišji Jagged2, humani ili mišji DLL1, ili humani ili mišji DLL4. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 čoveka, miša i majmuna cynomolgus, ali ne vezuje Jagged2 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus, ili DLL1 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus, ili DLL4 čoveka, miša ili majmuna cynomolgus.
U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1 sa afinitetom (Kd) od 2 nM ili jačim (tj. manje od 2 nM). U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje humani Jagged1 sa afinitetom (Kd) od 1,5 nM ili jačim, ili 1 nM ili jačim, ili 0,9 nM ili jačim, 0,8 nM ili jačim, ili 0,7 nM ili jačim, (tj. manje od 1,5 nM, manje od 1 nM, manje od 0,9 nM, manje od 0,8 nM, ili manje od 0,7 nM). U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje mišji Jagged1 sa afinitetom (Kd) od 2 nM ili jačim (tj. manje od 2 nM). U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje mišji Jagged1 sa afinitetom (Kd) od 1,5 nM ili jačim, ili 1 nM ili jačim, ili 0,9 nM ili jačim, 0,8 nM ili jačim, 0,7 nM ili jačim, ili 0,6 nM ili jačim, ili 0,5 nM ili jačim (tj. manje od 1,5 nM, manje od 1 nM, manje od 0,9 nM, manje od 0,8 nM, manje od 0,7 nM, manje od 0,6 nM, ili manje od 0,5 nM).
U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje nativni, savijeni Jagged1, ali ne vezuje denaturisani Jagged1. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje Jagged1 u testu sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), ali ne vezuje Jagged1 u Vestern blot testu. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje savijeni Jagged1 u testu sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), ali ne vezuje denaturisani Jagged1 u Vestern blot testu. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje savijeni Jagged1 pod fiziološkim uslovima, ali ne vezuje denaturisani Jagged1. "Nativni, savijeni" Jagged1 odnosi se na Jagged1 koji je pretrpeo proteinsko savijanje pod fiziološkim uslovima, i održava se u savijenom stanju. U nekim otelotvorenjima, Jagged1 se održava u savijenom stanju u rastvoru.
U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-Jagged1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 36; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-Jagged1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-Jagged1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-Jagged1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R T, i V. U nekim otelotvorenjima, X je T.
U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-Jagged1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-Jagged1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-Jagged1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 36; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 36. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 36; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T i V. U nekim otelotvorenjima, X je T.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 , pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T i V. U nekim otelotvorenjima, X je T. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T i V. U nekim otelotvorenjima, X je T. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59 , pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T i V. U nekim otelotvorenjima, X je T. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 55, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R T, i V.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 55, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R T, i V.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 37, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 64, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 64, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 37, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 64, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 64, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16.
U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78, (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71, pri čemu, X1 je izabrano od P i G, X2 je izabrano od D i N, i X3 je izabrano od T i S, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 72, pri čemu, X1 je svaka aminokiselina osim S, i X2 je W ili L; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74, pri čemu, X1 je S ili Y, X2 je P ili A, i X3 je P ili T. U nekim otelotvorenjima, X1 u SEQ ID NO: 72 je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X1 u SEQ ID NO: 72 je izabran od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T i V. U nekim otelotvorenjima, X1 u SEQ ID NO: 72 je T.
U jednom otelotvorenju, anti-Jagged1 antitelo sadrži HVR-ove kao u svakom od prethodnih otelotvorenja, i dalje sadrži akceptorski humani okvir, npr. okvir humanog imunoglobulina ili okvir humanog konsenzusa. U drugom otelotvorenju, anti-Jagged1 antitelo sadrži HVR-ove kao u svakom od prethodnih otelotvorenja, i dalje sadrži VH koji sadrži najmanje jedan, dva, tri ili četiri FR izabrana od FR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, FR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, FR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, i FR4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50. U drugom otelotvorenju, anti-Jagged1 antitelo sadrži HVR-ove kao u svakom od prethodnih otelotvorenja, i dalje sadrži VL koji sadrži najmanje jedan, dva, tri ili četiri FR izabrana od FR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43, FR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, FR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45, i FR4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46.
U drugom otelotvorenju, anti-Jagged1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnost sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 54, 58, ili 62, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim takvim otelotvorenjima, VH sekvenca sadrži HVR-H3 sekvence SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37 ili 64. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R T, i V. U nekim otelotvorenjima, X je T. U drugom aspektu, anti-Jagged1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnost sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 33, 65 ili 66. U nekim takvim otelotvorenjima, VH sekvenca sadrži HVR-H3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 37 ili 64. U nekim otelotvorenjima, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 36, i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37 ili 64. U nekim otelotvorenjima, VH sekvenca sa identičnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-Jagged1 anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za najmanje jedan Jagged1. U nekim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 33. U nekim takvim otelotvorenjima, VH sekvenca sadrži HVR-H3 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 37. U nekim otelotvorenjima, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 33, 65 ili 66, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 33, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 65, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 66, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence.
U drugom aspektu, obezbeđeno je anti-Jagged1 antitelo, pri čemu, antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10, 26 ili 34. U nekim otelotvorenjima, VL sekvenca sa identičnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-Jagged1 anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za Jagged1. U nekim otelotvorenjima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO: 10, 26 ili 34. U nekim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). U nekim otelotvorenjima, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO: 10, 26 ili 34, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO: 34, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO: 10, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO: 26, uključujući post-translacione modifikacije te sekvence.
U drugom aspektu, dato je anti-Jagged1 antitelo, pri čemu, antitelo sadrži VH kao u svakom gore navedenom otelotvorenju, i VL kao u svakom gore navedenom otelotvorenju. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 54, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; odnosno SEQ ID NO: 34, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 58, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; odnosno SEQ ID NO: 10, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 62, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S; odnosno SEQ ID NO: 26, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R T, i V. U nekim otelotvorenjima, X je T.
U drugom aspektu, dato je anti-Jagged1 antitelo, pri čemu, antitelo sadrži VH kao u svakom gore navedenom otelotvorenju, i VL kao u svakom gore navedenom otelotvorenju. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 33, odnosno SEQ ID NO: 34, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 65, odnosno SEQ ID NO: 10, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 66, odnosno SEQ ID NO: 26, uključujući post-translacione modifikacije tih sekvenci.
U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 57, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 53. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 67, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 75. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 68, pri čemu, X je svaka aminokiselina osim S, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 76. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S. U nekim otelotvorenjima, X je svaka aminokiselina osim S ili H. U nekim otelotvorenjima, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T i V. U nekim otelotvorenjima, X je T. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 51, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 53. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 52, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 53. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 69, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 75. U nekim otelotvorenjima, anti-Jagged1 antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 70, i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 76.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao ovde obezbeđeno anti-Jagged1 antitelo. Na primer, u nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-Jagged1 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 33, i VL sekvencu SEQ ID NO: 34.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se takmiči za vezivanje sa svim ovde obezbeđenim antitelima.
U daljem aspektu pronalaska, anti-Jagged1 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-Jagged1 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2fragment. U drugom otelotvorenju, antitelo je antitelo kompletne dužine, npr. netaknuto humano IgG1 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela, kao što je ovde definisano.
U daljem aspektu, anti-Jagged1 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u poglavljima 1-7 u nastavku:
1. Afinitet antitela
U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
U jednom otelotvorenju, Kd se određuje testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom otelotvorenju, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen određen je uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog pomoću (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (pogledajte npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881(1999)). Da bi se utvrdili uslovi za test, MICROTITER<®>ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) su preko noći prevučene sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), i nakon toga su blokirane 2% (m/V) albuminom goveđeg seruma u PBS-u tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23°C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br.269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, Presta i sar., Cancer Res.57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab se onda inkubira tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju se na sobnoj temperaturi (npr. jedan sat). Rastvor se zatim ukloni, i ploča se ispere osam puta 0,1% polisorbatom 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada se ploče osuše, doda se 150 μl po bunaru fluorescentnog agensa (MICROSCINT-20™; Packard), i ploče se prebroje na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom 10 minuta. Koncentracije svakog Fab-a koje daju vezivanje manje ili jednako 20% od maksimalnog vezivanja izabrane su za upotrebu u kompetitivnim testovima vezivanja.
Prema drugom otelotvorenju, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE. Na primer, obavljen je test uz korišćenje BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>- 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom na ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/minutu da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neproreagovale grupe. Za kinetička merenja, dve serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) su injektovane u PBS-u sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25°C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) je izračunata kao odnos koff/kon. Pogledajte, npr. Chen i sar. J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili serija 8000 SLM-AMINCO™ spektrofotometra (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.
2. Fragmenti antitela
Kod pojedinih otelotvorenja, ovde dato antitelo je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson i sar. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite, npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore izd., (Springer-Verlag, New York), str.
269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046.
Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Pogledajte, npr, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i sar., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u članku Hudson i sar., Nat. Med.9:129-134 (2003).
Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br.6,248,516 B1).
Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela opisuje npr. U.S. Patent br.4,816,567; kao i Morrison i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži ne-humani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili ne-humanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo "sa zamenjenom klasom", kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
U nekim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, ne-humano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog ne-humanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima ne-humanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovu pripremu daju, npr., Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), a dalje ih opisuju, npr., Riechmann i sar., Nature 332:323-329 (1988); Queen i sar., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri i sar., Methods 36:25-34 (2005) (opisuju graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (opisuje “preuređivanje površine”); Dall'Acqua i sar., Methods 36:43-60 (2005) (opisuje “mešanje FR”); i Osbourn i sar., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka i sar., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (opisuje pristup “vođene selekcije” kod mešanja FR).
Regioni humanog okvira koji se mogu upotrebiti za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: regione okvira izabrane pomoću postupka "najboljeg slaganja" (vidite, npr., Sims i sar. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regione okvira dobijene iz sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (vidite, npr., Carter i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta i sar. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili humane germinativne regione okvira (vidite, npr., Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i regione okvira dobijene skriningom biblioteka FR (vidite, npr., Baca i sar., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) i Rosok i sar., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
4. Humana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je humano antitelo. Humana antitela mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su generalno opisali van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol.
20:450-459 (2008).
Humana antitela mogu se dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su generalno inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Pogledajte takođe, npr. U.S. Patent br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju XENOMOUSE™ tehnologiju; U.S. Patent br. 5,770,429 koji opisuje H<U>M<AB>® tehnologiju; U.S. Patent br.7,041,870 koji opisuje K-M MOUSE® tehnologiju, i U.S. Patent Application Publication br. US 2007/0061900, koja opisuje V<ELOCI>M<OUSE>® tehnologiju). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koja stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela mogu se takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Vidite, npr., Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i sar., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela i njihova primena), str.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boemer i sar., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humane B-ćelije takođe su opisali Li i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humano-humane hibridome). Tehnologiju humanih hibridoma (Trioma tehnologija) su takođe opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
5. Antitela dobijena iz biblioteke
Antitela iz pronalaska mogu da se izoluju pregledanjem kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje biblioteka displeja faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih postupaka dali su, npr. Hoogenboom i sar. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien i sar., izd., Human Press, Totowa, NJ, 2001) a dalje su ih opisali, npr., McCafferty i sar., Nature 348:552-554; Clackson i sar., Nature 352: 624-628 (1991); Marks i sar., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks i Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, izd., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu i sar., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee i sar., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee i sar., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR), i nasumično rekombinovani u biblioteke faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, ili kao jednolančanih Fv (scFv) fragmenata, ili kao Fab fragmenata. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths i sar., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br. 5,750,373, i US Patent Publication br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U pojedinim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za Jagged1, a druga je za bilo koji drugi antigen. U pojedinim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa Jagged1. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju Jagged1. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac - laki lanac sa različitim specifičnostima (vidite Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker i sar., EMBO J. 10: 3655 (1991)), i “knob-in-hole” inženjerstvo (vidite, npr., U.S. Patent br.
5,731,168). Multi-specifična antitela mogu se takođe dobiti dizajniranjem pomoću efekata elektrostatičkog upravljanja, za dobijanje antitela Fc-heterodimernih molekula (WO 2009/089004A1); biokonjugacijom dva ili više antitela ili fragmenata (vidite, npr., US Patent br.
4,676,980, i Brennan i sar., Science, 229: 81 (1985)); primenom leucinskih zatvarača za proizvodnju bi-specifičnih antitela (vidite, npr., Kostelny i sar., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); primenom tehnologije "dijatela" za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela (vidite, npr., Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i primenom jednolančanih Fv (sFv) dimera (vidite, npr. Gruber i sar., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što opisuju, npr., Tutt i sar. J. Immunol.147: 60 (1991).
Dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući "antitela hobotnice", ovde su takođe obuhvaćena (pogledajte, npr. US 2006/0025576A1).
Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje "dvojno delujuće FAb" ili "DAF", koje sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za Jagged1, kao i za drugi, različit antigen (pogledajte, na primer US 2008/0069820).
7. Varijante antitela
U pojedinim otelotvorenjima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela mogu se dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, izbacivanja, i/ili ubacivanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen-vezujuće.
a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja
U pojedinim otelotvorenjima, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom "poželjne supstitucije". Veće izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom "primeri supstitucija", i kako je dalje opisano ispod u odnosu na klase bočnih nizova aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA 1
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog niza:
(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom. Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuće varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutiran, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se napraviti na "žarištima" HVR, tj. ostacima kodiranim kodonima, koji trpe mutaciju sa visokom učestalošću tokom procesa somatskog sazrevanja (vidite, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili ostacima koji ostvaruju kontakt sa antigenom, pri čemu se dobijene varijante VH ili VL ispituju na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka su opisali, npr. Hoogenboom i sar. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien i sar., izd., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim otelotvorenjima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze alaninom ili modelovanja. Posebno su često cilj CDR-H3 i CDR-L3.
U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja mogu se desiti u jednom ili više HVR-ova, dokle god takve izmene znatno ne smanje sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje ne smanjuju znatno afinitet vezivanja mogu se načiniti u HVR-ima. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim otelotvorenjima varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove "ciljana mutageneza sa alaninom", i opisali su je Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih ubacivanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante ubacivanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N- ili C- krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
b) Varijante glikozilacije
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je izmenjeno da bi se povećao ili smanjio stepen do koga je antitelo glikozilovano. Adicija ili uklanjanje mesta glikozilacije antitela može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni.
Kada antitelo uključuje Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Pogledajte, npr. Wright i sar. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharidi mogu da uključuju različite ugljovodonike, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u "osnovi" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim osobinama.
U jednom otelotvorenju, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline uzvodno ili nizvodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Pogledajte, npr. US Patent Publication br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). U nekim otelotvorenjima, konstantnom regionu IgG1 koji obuhvata N297G ili N297A mutaciju suštinski nedostaje efektorska funkcija. Primeri publikacija vezanih za "defukozilovane" ili "sa manjkom fukoze" varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki i sar. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki i sar. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Primeri za ćelijske linije sposobne za proizvodnju defukozilovanih antitela uključuju Lee 13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka i sar. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams i sar., naročito u Primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (vidite, npr., Yamane-Ohnuki i sar. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. i sar., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
Varijante antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektiran pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet i sar); US Patent br.6,602,684 (Umana i sar.); i US 2005/0123546 (Umana i sar.). Varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region su takođe date. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087 (Patel i sar.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Varijante Fc regiona
U pojedinim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region ovde datog antitela, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih mesta.
U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, ali su pojedine efektorske funkcije (kao što je komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) se mogu sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (stoga verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn.
Primarne ćelije za posredovanje kod ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII, dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464, Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri za in vitro testove za procenu aktivnosti ADCC željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br.5,500,362 (vidite, npr. Hellstrom, I. i sar. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I i sar., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (vidite Bruggemann, M. i sar., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, za testove mogu da se koriste neradioaktivni postupci (pogledajte, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes i sar., Proc. Nat’lAcad. Sci. USA 95:652-656 (1998). C1q vezujući testovi mogu takođe da se izvedu da bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q, i stoga nema CDC aktivnost. Pogledajte, npr. C1q i C3c vezujući ELISA test u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (vidite, npr. Gazzano-Santoro i sar., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. i sar., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. i sar, Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)).
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više Fc regiona ostataka 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvanog "DANA" Fc mutanta sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (US Patent br.7,332,581).
Pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR-ove su opisane. (Pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol.
Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
U pojedinim otelotvorenjima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US Patent br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie i sar. J. Immunol.
164: 4178-4184 (2000).
Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za Fc receptor novorođenčeta (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus (Guyer i sar., J. Immunol.
117:587 (1976) i Kim i sar., J. Immunol.24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton i sar.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).
Pogledajte takođe Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent br.5,648,260; U.S. Patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.
d) Varijante antitela projektovane sa cisteinom
U pojedinim otelotvorenjima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. "tioMAb", kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjeno ostacima cisteina. U naročitim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je u nastavku opisano. U pojedinim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.
7,521,541.
e) Derivati antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i dostupni su. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničeni na hidrosolubilne polimere. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše.
Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, i može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira, i ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, ali se ne ograničavajući na naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U drugom otelotvorenju, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski deo je ugljenična nanocevčica (Kam i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.
B. Rekombinantni postupci i smeše
Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i smeša, npr., kako je opisano u U.S. Patentu br.4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira ovde opisano anti-Jagged1 antitelo. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U sledećem otelotvorenju obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-Jagged1 antitela, naznačen time što postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju anti-Jagged1 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu selektivno da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakteriji, pogledajte, npr. U.S. Patente br. 5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (vidite takođe Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str.245-254, koja opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije "humanizovani", što dovodi do proizvodnje antitela sa delimičnim ili potpunim humanim glikozilacionim obrascem. Vidite Gerngross, Nat. Biotech.
22:1409-1414 (2004), i Li i sar. Nat. Biotech.24:210-215 (2006).
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte, npr. US Patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri za korisne ćelijske linije domaćina sisara su linija bubrega majmuna CV1 transformisana od strane SV40 (COS-7); linija bubrega humanog embriona (293 ili 293 ćelije, kako je opisano, npr., u Graham i sar., J. Gen Virol.
36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK); mišje sertolijeve ćelije (TM4 ćelije, kako je opisano, npr., u Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); humane ćelije karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre Buf pacova (BRL 3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr., u Mather i sar., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR’ CHO ćelije (Urlaub i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003).
C. Testovi
Anti Jagged1 antitela koja su ovde data mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, antitelo iz pronalaska ispitano je da se odredi njegova antigen vezujuća aktivnost, npr. poznatim postupcima kao što je ELISA, vestern blot, itd.
U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi da se identifikuje antitelo koje se takmiči sa antitelom A, A-1, A-2, ili A1-(S101T) oko vezivanja za humani ili mišji Jagged1. U pojedinim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo antitelo A, A-1, A-2, ili A1-(S101T).
Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
U primeru za kompetitivni test, imobilizovani Jagged1 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, koje se vezuje za Jagged1 (npr. A, A-1, A-2, ili A1-(S101T)), i drugo, neobeleženo antitelo, čija sposobnost da se takmiči sa prvim antitelom oko vezivanja za Jagged1 se ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani Jagged1 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, ali ne i drugo, neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za Jagged1, višak nevezanog antitela se uklanja, i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani Jagged1. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani Jagged1 u test uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom oko vezivanja za Jagged1. Pogledajte: Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual pogl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Testovi aktivnosti
U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju ovih anti-Jagged1 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može da uključi, npr., inhibiciju signalizacije indukovane od strane Jagged1 putem Notch1. U pojedinim drugim otelotvorenjima, ispituje se sposobnost antitela iz pronalaska da inhibira ekspresiju reporter gena koji reaguje na Notch signalizaciju koju indukuje Jagged1. U primerima su kao primer dati neograničavajući testovi. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska je ispitano na takvu biološku aktivnost. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su data.
D. Imunokonjugati
Pronalazak takođe daje imunokonjugate, uključujući anti-Jagged antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
U jednom otelotvorenju, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo konjugovano sa jednim ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na, majtanzinoid (vidite U.S. Patent br.5,208,020, 5,416,064 i European Patent EP 0425 235 B1); auristatin, kao što su fragmenti DE i DF leka monometilauristatina (MMAE i MMAF) (vidite U.S. Patent br.
5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegovi derivati (vidite U.S. Patent br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 i 5,877,296; Hinman i sar., Cancer Res.53:3336-3342 (1993); i Lode i sar., Cancer Res.58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (vidite Kratz i sar., Current Med. Chem.13:477-523 (2006); Jeffrey i sar., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov i sar., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik i sar., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King i sar., J. Med. Chem.
45:4336-4343 (2002); i U.S. Patent br. 6,630,579); metotreksat; vindezin; taksan, kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za enzimski aktivan toksin ili njegov fragment, uključujući, ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, diantin proteine, proteine vinobojke (Phytolaca americana) (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za radioaktivni atom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao magnetna rezonanca, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (pazidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti kao što opisuju Vitetta i sar., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za vezivanje radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti kiselo labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari i sar., Cancer Res.52:127-131 (1992), U.S. Patent br.5.208.020).
Imunokonjugati ADC-a koji su ovde izričito razmatrani, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju koji uključuju, ali nisu ograničeni na BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.,SAD).
E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje
U pojedinim otelotvorenjima, svako od anti-Jagged1 antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje Jagged1 u biološkim uzorcima. Termin "detekcija" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo, kao što su kancerogena tkiva.
U jednom otelotvorenju, dato je anti-Jagged1 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U daljem aspektu, dat je postupak za detekciju prisustva Jagged1 u biološkom uzorku. U pojedinim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-Jagged1 antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-Jagged1 antitela sa Jagged1, i detektovanje nastajanja kompleksa između anti-Jagged1 antitela i Jagged1. Takav postupak može biti in vitro postupak. U jednom otelotvorenju, anti-Jagged1 antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju anti-Jagged1 antitelom, npr. kada je Jagged1 biomarker za izbor pacijenata.
Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati primenom antitela iz pronalaska uključuju kancer, npr. kancer dojke, kancer pluća, kancer mozga, kancer cerviksa, kancer kolona, kancer jetre, kancer žučnih kanala, kancer pankreasa, kancer kože, malignitete B ćelija i malignitete T ćelija.
U pojedinim otelotvorenjima, data su obeležena anti-Jagged1 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, βgalaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali, i slično.
F. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije anti-Jagged1 antitela kako je ovde opisano pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedine primere sHASEGP i postupci primene, uključujući rHuPH20, opisuje US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela su opisani u US Patentu br.6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US Patentu br.6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbedi citotoksični agens, npr. hemoterapeutski agens. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol A. izd. (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. filmovi ili mikrokapsule.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
G. Postupci lečenja i kompozicije
Svako od anti-Jagged1 antitela koja su ovde data može biti upotrebljeno u postupcima lečenja.
U jednom aspektu, dato je anti-Jagged1 antitelo da se koristi kao lek. U daljem aspektu, dato je anti-Jagged1 antitelo da se koristi u lečenju bolesti ili poremećaja vezanih za aberantnu Notch signalizaciju, npr.kancera. U pojedinim otelotvorenjima, dato je anti-Jagged1 antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-Jagged1 antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine anti-Jagged1 antitela. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano.
U daljim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-Jagged1 antitelo za upotrebu u inhibiranju rasta kancera pluća. U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-Jagged1 antitelo za upotrebu u postupku za smanjivanje rasta kancera pluća u pojedincu, uključujući davanje pojedincu efikasne količine anti-Jagged1 antitela za smanjivanje rasta kancera pluća. U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-Jagged1 antitelo za upotrebu u postupku za smanjivanje rasta kancera dojke u pojedincu, uključujući davanje pojedincu efikasne količine anti-Jagged1 antitela za smanjivanje rasta kancera dojke. "Pojedinac" prema svakom od gornjih otelotvorenja je poželjno čovek.
U nekim otelotvorenjima, dato je anti-Jagged1 antitelo za lečenje alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i/ili sa viškom sluzi. Ostale alergijske bolesti koje se mogu lečiti ovde datim anti-Jagged1 antitelima uključuju, ali nisu ograničene na, alergijski rinitis, atopijski dermatitis, preosetljivost na hranu i koprivnjaču; imunološki posredovane kožne bolesti uključuju bulozne kožne bolesti, multiformni eritem i kontaktni dermatitis; autoimune bolesti uključuju psorijazu, reumatoidni artritis, juvenilni hronični artritis; inflamatornu bolest creva (tj. ulcerozni kolitis, Kronova bolest); idiopatsku intersticijalnu pneumoniju, bolesti vezane za metaplaziju peharskih ćelija (kao što je astma, HOBP, cistična fibroza i Beretov jednjak), bolesti pluća, kao što je cistična fibroza, enteropatija osetljiva na gluten i Viplova bolest; imunološke bolesti, kao što je eozinofilna pneumonija, idiopatska plućna fibroza i pneumonitis hipersenzitivnosti; hronične opstruktivne bolesti pluća, RSV infekcije, uveitis, sklerodermu, osteoporozu i Hodžkinov limfom.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-Jagged1 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom otelotvorenju, lek služi za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa aberantnom Notch signalizacijom. U jednom otelotvorenju, lek je za terapiju kancera. U daljem otelotvorenju, lek je za upotrebu u postupku za lečenje kancera, koja uključuje davanje efikasne količine leka pojedincu koji ima kancer. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano. "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, pronalazak daje postupak za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa aberantnom Notch signalizacijom. U jednom otelotvorenju, postupak uključuje davanje pojedincu, koji ima takvu bolest ili poremećaj, efikasne količine anti-Jagged1 antitela. U jednom otelotvorenju, postupak uključuje davanje pojedincu koji ima kancer efikasne količine anti-Jagged1 antitela. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, kao što je dole opisano. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, kao što je dole opisano. "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, otkriće daje postupak za inhibiranje rasta ćelija kancera u pojedincu. U jednom otelotvorenju, postupak uključuje davanje pojedincu efikasne količine anti-Jagged1 antitela za inhibiranje rasta ćelija kancera. U jednom otelotvorenju, "pojedinac" je čovek.
U nekim otelotvorenjima, pronalazak daje postupke za lečenje alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i/ili sa viškom sluzi kod pojedinca. U nekim otelotvorenjima, pronalazak daje postupke za lečenje alergijskog rinitisa, atopijskog dermatitisa, preosetljivosti na hranu i koprivnjače; imunološki posredovanih kožnih bolesti koje uključuju bulozne kožne bolesti, multiformni eritem i kontaktni dermatitis; autoimunih bolesti koje uključuju psorijazu, reumatoidni artritis, juvenilni hronični artritis; inflamatorne bolesti creva (tj. ulcerozni kolitis, Kronova bolest); idiopatske intersticijalne pneumonije, bolesti vezane za metaplaziju peharskih ćelija (kao što je astma, HOBP, cistična fibroza i Beretov jednjak), bolesti pluća, kao što je cistična fibroza, enteropatija osetljiva na gluten i Viplova bolest; imunoloških bolesti, kao što je eozinofilna pneumonija, idiopatska plućna fibroza i pneumonitis hipersenzitivnosti; hronične opstruktivne bolesti pluća, RSV infekcije, uveitisa, skleroderme, osteoporoze i/ili Hodžkinovog limfoma kod pojedinca. U nekim otelotvorenjima, postupak uključuje davanje pojedincu efikasne količine ovde datog anti-Jagged1 antitela. U nekim otelotvorenjima, "pojedinac" je čovek.
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih anti-Jagged1 antitela, npr. za upotrebu u bilo kojoj od gornjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-Jagged1 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-Jagged1 antitela, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Antitela iz pronalaska mogu se koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo iz pronalaska može biti primenjeno uz barem jedan dodatni terapeutski agens. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je citotoksični agens. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela iz pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otelotvorenju, primena anti-Jagged1 antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge. Antitela iz pronalaska mogu se takođe upotrebiti u kombinaciji sa radijacionom terapijom.
Antitelo iz pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja, uključujući, ali se ne ograničavajući na, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela iz predmetnog pronalaska bi bila formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i ostale faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz pronalaska (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 μg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg-10 mg/kg) antitela je kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, ili, na primer, putem jedne ili više primena, ili kontinualnom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore navedenih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Primer za dozni režim uključuje primenu inicijalne početne doze od oko 4 mg/kg, nakon čega sledi nedeljna doza održavanja od oko 2 mg/kg antitela. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-Jagged1 antitela ili kao njegovog dodatka.
H. Proizvodi
U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor, ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo iz pronalaska. Etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, naznačeno time što kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovoj realizaciji pronalaska može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da svaki od gorepomenutih proizvoda može da sadrži imunokonjugat iz pronalaska umesto, ili pored anti-Jagged1 antitela.
III. PRIMERI
U nastavku su dati primeri postupaka i kompozicija iz pronalaska.
Primer 1. Generisanje anti-Jagged antitela.
a. Sortiranje i skrining biblioteke za identifikovanje anti-Jagged1 antitela
Biblioteke humanih antitela faga sa sintetičkim diverzitetima u izabranim regionima koji određuju komplementarnost, koji imitiraju prirodnu raznovrsnost repertoara humanog IgG, korišćene su za spiranje Fab fragmenata izloženih na površini M13 čestica bakteriofaga. Humani Jag1-DSF-EGF1-4 (SEQ ID NO:6) ili humani Jag2-DSL-EGF1-4 (SEQ ID NO:8) je korišćen kao antigen za sortiranje biblioteke. Imunoploče Nunc Maxisorp sa 96 bunarčića prevučene su preko noći na 4°C ciljnim antigenom (10 μg/ml), a zatim tokom 1 sata blokirane na sobnoj temperaturi puferom za blokiranje faga PBST (rastvor soli sa fosfatnim puferom (PBS) i 1% (m/V) albumina goveđeg seruma (BSA) i 0,05% (V/V) tween-20). Biblioteke antitela faga VH (vidite npr., Fee i sar., J. Immunol. Meth. 284:119-132 (2004)) i VH/VF (vidite Liang i sar., JMB. 366: 815-829 (2007)) dodate su odvojeno na ploče sa antigenom i inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi. Sledećeg dana, ploče prevučene antigenom su deset puta isprane pomoću PBT (PBS sa 0,05% Tween-20), i vezani fagi su eluirani 30 min pomoću 50 mM HCl i 500 mM NaCl, a zatim neutralisani istom količinom 1 M Tris baze (pH 7,5). Sakupljeni fagi su amplifikovani na E. coli XL-1 Blue ćelijama. Tokom narednih ciklusa selekcije, inkubacija faga antitela sa pločama prevučenim antigenom skraćena je na 2-3 sata, i oštrina ispiranja ploča je postepeno povećana.
Nakon 4 ciklusa spiranja, primećeno je značajno obogaćenje. Izabrano je 96 klonova iz svakog od sortiranja VH i VH/VL biblioteke, da bi se odredilo da li se oni specifično vezuju za humani Jagged1 ili Jagged2. Varijabilni regioni tih klonova su podvrgnuti PCR sekvenciranju, da bi se identifikovali klonovi sa jedinstvenom sekvencom. Afiniteti antitela faga su poređani pomoću kompetitivne tačkaste ELISA tehnike. Vrednosti IC50 antitela faga su zatim određene pomoću kompetitivne ELISA tehnike sa vezivanjem faga. Izabrana su jedinstvena antitela faga koja se specifično vezuju za Jagged1 (a ne za Jagged2), Jagged2 (a ne za Jagged1), ili i za Jagged1 i Jagged2, i preformatirana su u IgG kompletne dužine radi procene u in vitro ćelijskim testovima.
Željeni klonovi su preformatirani u IgG putem kloniranja VLi VHregiona pojedinačnih klonova u ekspresioni vektor pRK ćelije sisara (pRK.LPG3.HumanKappa) koji je sadržao humani kapa konstantni domen, odnosno ekspresioni vektor (pRK.LPG4.HumanHC) koji kodira konstantni domen humanog IgG1 kompletne dužine, (Shields i sar., J Biol Chem 2000; 276: 6591-6604). Antitela su onda privremeno eksprimirana na CHO ćelijama sisara, i prečišćena na protein A koloni.
b. Konstrukcija biblioteka za poboljšanje afiniteta klonova dobijenih iz V<H>ili V<H>V<L>biblioteka
Fagemid pW0703, dobijen od fagemida pV0350-2b (Lee i sar., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004), koji je sadržao zaustavni kodon (TAA) u svim položajima CDR-L3, i imao je izložen jednovalentni Fab na površini M13 bakteriofaga) poslužio je kao šablon za biblioteku, za graftovanje varijabilnih domena teškog lanca (VH) željenih klonova iz VHbiblioteke za afinitetno sazrevanje. Za afinitetno sazrevanje su primenjene strategije teške i lake randomizacije. Kod teške randomizacije, jedna biblioteka lakog lanca sa izabranim položajima tri CDR lakog lanca randomizovana je pomoću aminokiselina konstruisanih da imitiraju prirodna humana antitela, i konstruisana degeneracija DNK je bila kao što su opisali Lee i sar. (J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)). Da bi se postigli uslovi za laku randomizaciju, koja je uvela stopu mutacije od oko 50% na izabranim položajima, mutagena DNK je sintetisana sa smešama 70-10-10-10 baza koje favorizuju nukleotide divljeg tipa (Gallop i sar., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)). Za laku randomizaciju, ciljani su ostaci na položajima 91-96 u CDR-L3, 30-33, 35 u CDR-H1, 50, 52, 53-54 i 56 u CDR-H2, 95-98 u CDR-H3; i izabrane su tri različite kombinacije CDR petlji, H1/L3, H2/L3 i H3/L3 za randomizaciju.
Za klonove poreklom iz VHVLbiblioteke, pojedinačno su generisani fagemidi koji su sadržali 4 zaustavna kodona (TAA) u svakom CDR-u, i koji su izlagali jednovalentni Fab na površini M13 bakteriofaga, i poslužili su kao šablon za Kunkelovu mutagenezu za konstrukciju biblioteka afinitetnog sazrevanja. Korišćena je samo strategija lake randomizacije za klonove dobijene od VHVLbiblioteke, jer je diverzitet CDR-L3 ugrađen u naivnu biblioteku. Da bi se postigli uslovi za laku randomizaciju, ciljani su ostaci na mestima 28-31 u CDR-L1, 50, 53-55 u CDR-L2, 91-96 u CDR-L3, 30-35 u CDR-H1, 50-56 u CDR-H2, 95-100 u CDR-H3; i izabrane su četiri različite kombinacije CDR petlji za randomizaciju, H1/L3*, H2/L3*, i H3/L3* i L1/L2/L3* (gde * označava mesto zaustavnog kodona u šablonu).
c. Strategija sortiranja faga za generisanje poboljšanja afiniteta
Za selekciju radi poboljšanja afiniteta, antigeni Jag1 ili Jag2 su prvo biotinilovani pod uslovima ograničenja reagensa. Biblioteke faga su podvrgnute jednom ciklusu sortiranja na ploči, i pet ciklusa sortiranja rastvorom uz povećanje oštrine. Za prvi ciklus sortiranja na ploči, 10 ug/ml antigena je prvo prevučeno na Maxisorp ploču, i preliminarno blokirano puferom za blokiranje (1% BSA i 0,05% Tween20 u PBS-u).3 O.D./ml unosa faga u puferu za blokiranje je inkubirano na pločama sa antigenom tokom 3 sata. Bunarčići su isprani deset puta sa PBS-0,05% Tween20. Vezani fag je eluiran sa 150 μl/bunarčiću 50mM HCl, 500 mM KCl tokom 30 minuta, a zatim neutralisan pomoću 50 μl/bunarčiću 1M Tris pH8, titrisan, i umnožen za sledeći ciklus. Za naredne cikluse, spiranje biblioteke faga je izvedeno u fazi rastvora, gde je biblioteka faga inkubirana sa 100 nM biotinilovanog ciljnog proteina (koncentracija se zasniva na vrednosti IC50 matičnog klona faga) u 100 μl pufera koji je sadržao 1% Superblock (Pierce Biotechnology) i 0,05% Tween20, tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Smeša je dalje razblažena 10 x pomoću 1% Superblock, i naneto je 100 μl/bunarčiću u bunarčiće prevučene neutravidinom (10 μg/ml) tokom 30 min na sobnoj temperaturi, uz blago mućkanje. Da bi se odredilo pozadinsko vezivanje, kontrolni bunarčići sa fagom su slikani na pločama prevučenim neutravidinom. Vezani fag je zatim ispran, eluiran i umnožen, kao što je opisano za prvi ciklus. Još pet ciklusa sortiranja u rastvoru je zajedno prikupljeno, uz povećanje oštrine selekcije. Prvi ciklusi su za selekciju asocijacije, putem smanjivanja koncentracija biotinilovanog ciljnog proteina od 100 nM do 0,1 nM, a dva poslednja ciklusa su za selekciju disocijacije, dodatkom viška nebiotinilovanog ciljnog proteina (300 do 1000 puta više) da se takmičenjem eliminišu oni koji se slabije vezuju na sobnoj temperaturi.
d. ELISA test sa visokopropusnim afinitetnim skriningom (konkurencija u jednoj tački) Kolonije su izabrane iz šestog ciklusa skrininga. Kolonije su preko noći uzgajane na 37°C u 150 μl/bunarčiću medijuma 2YT sa 50 μg/ml karbenicilina i 1x 10<10>/ml M13KO7 na ploči sa 96 bunarčića (Falcon). Sa iste ploče izabrana je kolonija sa XL-1 inficiranim matičnim fagom kao kontrolni uzorak. Ploče Nunc Maxisorp sa 96 bunarčića prevučene su preko noći na 4°C sa 100 μl/bunarčiću Jag1 ili Jag2 (0,5 μg/ml) u PBS-u. Ploče su blokirane sa 150 μl 1% BSA i 0,05% Tween20 u PBS 20 tokom 1 sata.
35 μl supernatanta faga razblaženo je do 75 μl pomoću pufera za ELISA (test sa imunosorbentom vezanim za enzim) (PBS sa 0,5% BSA, 0,05% Tween20) sa 5 nM Jag1 ili Jag2, ili bez njih, i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi na F ploči (NUNC). 95 μl smeše je preneto uporedo na ploče prevučene antigenom. Ploča je blago mešana trešenjem tokom 15 min, i deset puta isprana pomoću PBS-0,05% Tween 20. Vezivanje je kvantifikovano dodavanjem anti-M13 antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP) u ELISA puferu (1:2500) i inkubirano tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su deset puta isprane sa PBS-0,05% Tween 20. Zatim je dodato 100 μl/bunarčiću supstrata peroksidaze, i inkubirano 5 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 μl 0,1 M fosforne kiseline (H3PO4) u svaki bunarčić, uz inkubaciju u trajanju od 5 minuta na sobnoj temperaturi. O.D. (optička gustina) žute boje u svakom bunarčiću određena je pomoću standardnog ELISA čitača ploča na 450 nm. U poređenju sa smanjenjem OD450nm(%) bunarčića matičnog faga (100%), za sekvencijalnu analizu su izabrani klonovi koji su imali smanjenje OD450m(%) niže od 50%. Jedinstveni klonovi su izabrani za pripremu faga, da bi se odredio afinitet vezivanja (IC50 faga) prema Jag1 ili Jag2 u poređenju sa odgovarajućim matičnim klonovima. Zatim su klonovi kojima je najviše poboljšan afinitet preformatirani u humani IgG1 radi proizvodnje antitela i dalje kinetičke analize vezivanja pomoću sistema BIAcore, i drugih in vitro ili in vivo testova.
U daljim ciklusima skrininga identifikovana su antitela specifična za samo jednog od članova porodice Jagged, kako je određeno ELISA testom. Antitelo A je vezalo humani i mišji Jagged1, ali ne Jagged2 (SL. 8; sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca prikazana u SEQ ID NO: 9, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca prikazana u SEQ ID NO: 10). Obrnuto, antitelo B (matično antitelo antitela B-3) vezalo je humani i mišji Jagged2, ali ne Jagged1 (SL.8). C-1 se vezuje i za Jagged1 i za Jagged2, pa je služilo za kontrolu. Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela C-1 prikazane su na SL.4.
Primer 2. Afiniteti vezivanja antitela i mapiranje epitopa.
Afiniteti vezivanja anti-Jagged1 antitela faga izmereni su površinskom plazmonskom rezonancom (SRP) pomoću instrumenta BIAcore™-3000. Anti-Jagged1/2 fag humani IgG su uhvaćeni pomoću mišjeg anti-humanog IgG prevučenog na CM5 senzorski čip, da bi se dobilo oko 150 jedinica odgovora (RU). Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja humanog ili mišjeg Jag1/2 DSL_EGF1-4 (1,95 nM do 250 nM) injektovana su u PBT pufer (PBS sa 0,05% Tween 20) na 25°C pri protoku od 30 ml/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIAcore Evaluation Software verzija 3.2). Ravnotežna konstanta disocijacije (kd) izračunata je kao odnos koff/kon.
Tabela 2 rezimira konstante vezivanja za antitela A, A-1, A-2, B, i B-3 koja se vezuju za prečišćeni humani Jagged1, humani Jagged2 i mišji Jagged2. Matično antitelo A se specifično vezalo za humani i mišji Jagged1. Afinitetno sazrela antitela A-1 i A-2 vezala su i humani i mišji Jagged1 sa velikim afinitetom. Antitela A, A-1 i A-2 nisu vezala humani niti mišji Jagged2. Obrnuto, antitela B i B-3 nisu vezala humani niti mišji Jagged1. B-3 se specifično vezalo za humani i mišji Jagged2.
Tabela 2: Tabela za rezime Biacore analiza
Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela A prikazane su na SEQ ID NO:9, odnosno 10. Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela A-1 prikazane su na SEQ ID NO:17, odnosno 18. Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela A-2 prikazane su na SEQ ID NO:25, odnosno 26. Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela B-3 prikazane su na SEQ ID NO:41, odnosno 42. Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca antitela B prikazane su na SL.4.
Primer 3. Anti-Jagged antitela antagonisti inhibiraju signalizaciju koju indukuje Jagged1 in vitro.
Da bi se odredilo da li anti-Jagged antitela mogu da deluju kao antagonisti za Notch signalizaciju koju indukuje Jagged, izvedeni su eksperimenti sa zajedničkim uzgajanjem, u suštini kao što su opisali Wu i sar., Nature 464, 1052-1057 (15. april 2010.). NIH-3T3 ćelije dizajnirane da eksprimiraju Jagged1, kao Notch ligand, uzgajane su zajedno sa NIH 3T3 ćelijama koje stabilno eksprimiraju Notch1, i koje su privremeno transficirane da eksprimiraju reporter luciferaze svica TP-1 (12X CSL) koji daje odgovor na Notch, i suštinski eksprimiran reporter Renilla luciferaze (pRL-CMV, Promega). Jak signal Notch reportera (luciferaza svica) primećen je u zajedničkoj kulturi (SL.12 Pozitivna kontrola indukovana od strane J1). Ekspresija reportera je smanjena do osnovnih nivoa kada je u zajedničku kulturu dodat inhibitor γ-sekretaze, prikazujući Notchzavisnu ekspresiju konstrukta reportera. Podaci nisu prikazani.
Dodatak rastuće količine (0,016-50 μg/ml) anti-Jagged antitela A-2 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 25, odnosno 26) ili B-3 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 41, odnosno 42) dovele su do dozno zavisne inhibicije ekspresije reportera (SL.9). Signalizaciju je indukovao Jagged1 (SL.9A, tamnosivi stubići) ili Jagged2 (SL.
9B, svetlosivi stubići), a inhibicija je određena kao što je gore opisano. Kontrole su uključivale kulture koje nisu stimulisane ligandom i nisu tretirane antitelom (SL. 9A i B, netretirane), nisu stimulisane ligandom (SL. 9A i B, bez stimulacije), tretirane sa 5-10 μg/ml antitela za kontrolu izotipa (SL. 9A i B, agD), stimulisane ligandom ali nisu tretirane antitelom (SL.9A i B, Stim/no AB), tretirane sa 5 μM inhibitora gama-sekretaze DAPT ili DAPT kontrolnim vehikulumom DMSO.
Antitelo A-2 inhibiralo je signalizaciju indukovanu od strane Jagged1, ali ne i signalizaciju indukovanu od strane Jagged2, na dozno zavistan način (SL. 9A). Vrednost IC50za A-2 bila je između 2 i 10 μg/ml za Jagged1 inhibiciju, dok je slaba inhibicija primećena, ili uopšte nije bilo inhibicije, sa Jagged2, čak ni pri najvišim koncentracijama od 50 μg/ml. Rezultati pokazuju da je antitelo A-2 antagonist selektivan prema Jagged1, tj., antitelo A-2 inhibira Jagged1-posredovanu signalizaciju, ali ne i Jagged2-posredovanu signalizaciju. Nasuprot tome, antitelo B-3 je snažno inhibiralo Jagged2-indukovanu signalizaciju na najnižoj ispitanoj koncentraciji, ali nije inhibiralo Jagged1-indukovanu signalizaciju na najvišoj ispitanoj koncentraciji, što je pokazalo da je B-3 selektivni antagonist Jagged1 (SL.9B).
Primer 4. Uticaj terapije anti-Jagged antitelom na telesnu težinu.
Kao što je gore opisano, inhibitori gama sekretaze i drugi inhibitori višestrukih Notch receptora izazivaju gubitak težine i metaplaziju peharskih ćelija creva, koja je nepoželjna za kliničku primenu. Da bi se odredilo kako ovde opisana antitela utiču na telesnu težinu i zdravlje creva, miševi su dva puta nedeljno dobijali dozu anti-Jagged1 antitela A-2 (5-20 mg/kg; sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 25, odnosno 26), anti-Jagged2 antitela B-3 (5-20 mg/kg; sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 41, odnosno 42), antitela A-2 i B-3 zajedno (po 5 mg/kg), anti-Jagged1/2 antitela koja se vezuju i za Jagged 1 i za Jagged 2 (C-1; 5-10 mg antitela po kg telesne težine miša (mg/kg); sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca prikazane na SL.4), ili kontrole izotipa anti-gD antitela (20 mg/kg). Antitelo za kontrolu izotipa je takođe upotrebljeno da se ukupna koncentracija kod svakog doziranja podesi na 20 mg/kg. Ukupna telesna težina svakog miša je određena pre prve primene antitela, i praćena je do 12. dana studije. Promena prosečne telesne težine je prikazana na SL.10, predstavljena kao procenat početne telesne težine. Dvojna inhibicija Jagged1 i Jagged2, korišćenjem ili anti-Jagged1/2 antitela C-1 ili kombinacije antitela A-2 specifičnog za Jagged1, i antitela B-3 specifičnog za Jagged2 zajedno, izazvala je brz i značajan pad telesne težine (SL. 10A). Do 4. dana, neki miševi koji su dobijali anti-Jagged1/2 antitelo C-1 izgubili su preko 5% telesne težine, što je poraslo do skoro 8-10% gubitka telesne težine do 7. dana (SL.10A). Miševi koji su dobijali i A-2 i B-3 takođe su brzo gubili težinu, u nekim slučajevima do 17% 11. dana (SL.10A). Nasuprot tome, antitela specifična za Jagged1 i antitela specifična za Jagged2 primenjena odvojeno nisu izazvala gubitak težine tokom studije, ni pri 5 ni pri 20 mg/kg (SL.10A). Lečenje kombinacijom anti-Jagged1 i anti-Jagged2 antitela dovelo je do smanjenog unosa hrane (SL. 10B), koji je bio povezan sa primećenim smanjenjem telesne težine (SL.10A), što ukazuje da smanjeni unos hrane može delimično ili u potpunosti da objasni povezano smanjenje telesne težine.
Primer 5. Antitela anti-Jagged1 antagonisti inhibiraju rast ćelija humanog kancera pluća in vivo.
Goli, atimični miševi Harlan supkutano su inokulisani Calu-6 ćelijama, ćelijskom linijom humanog nemikrocelularnog karcinoma pluća. Nakon što je zapremina tumora dostigla oko 200 kubnih mm, miševima je intraperitonealno (IP) dva puta nedeljno (0, 4, 7, 11, 14, i 18. dana) injektovano 20 mg/kg anti-gD antitela za kontrolu izotipa (n=10), ili anti-Jagged1 antitela A-2 (n=10; sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 25, odnosno 26). Zapremina tumora kod svakog miša merena je kljunastim merilom sledećih 19 dana. Ukupna telesna težina svakog miša je praćena tokom studije.
Tumori kod miševa tretiranih sa anti-Jagged1 pokazali su značajno smanjenje zapremine tumora u odnosu na tumore u kontrolnoj grupi (SL.11A). Efekat lečenja anti-Jagged1 antitelom mogao je biti detektovan već sedam dana nakon lečenja (SL. 11 A). Prosečna zapremina tumora kod miševa koji su primali anti-Jagged1 antitelo 18. dana je dostigla oko 500 mm<3>, dok je prosečna zapremina tumora kod kontrolnih životinja 18. dana dostigla oko 750 mm<3>. Nije primećena značajna promena telesne težine između lečene i kontrolne grupe (SL.11B).
Primer 6. Antitela anti-Jagged1 i anti-Jagged2 inhibiraju rast ćelija humanog kancera dojke in vivo.
C.B-17 SCID.bg miševi su inokulisani u masno tkivo dojke MDA-MD-468 ćelijama, ćelijskom linijom humanog bazalnog kancera dojke. Nakon što je zapremina tumora dostigla oko 200 kubnih mm, miševima je IP data doza sa 30 mg/kg anti-gD antitela za kontrolu izotipa (humani IgG1 izotip), anti-ambrozija antitela za kontrolu izotipa (mišji IgG2a izotip), anti-Jagged1 antitela A-2 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 25, odnosno 26) u skeletu humanog IgG1, anti-Jagged1 antitela A-2 u skeletu mišjeg IgG2a, ili anti-Jagged2 antitela B-3 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 41, odnosno 42) u skeletu humanog IgG1, 0, 4, 7, 12, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 43, 50. i 57. dana. Zapremina tumora (y-osa) merena je kljunastim merilom tokom 60 dana nakon prve injekcije. Zapremine tumora za svaku grupu (n=9 po grupi) prikazane su upotrebom linearnog modela mešanih efekata (SL. 12A). Zapremine tumora za svakog miša u svakoj grupi predstavljene su na SL.12B.
Primer 7: Anti-Jagged1 antitela se cepaju na teškom lancu
Antitela A (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 9, odnosno 10), A-1 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 17, odnosno 18), i A-2 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 25, odnosno 26), analizirana su pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije radi određivanja celovitosti teškog i lakog lanca. Za SDS-PAGE analizu, svaki uzorak antitela je pomešan u odnosu 1:1 V/V sa 2x Tris-glicin SDS puferom za uzorke (Novex LC2676), uz 10 mM DTT ili bez njega. Uzorci su zagrevani na 95°C tokom 5 minuta, i 2 μg svakog uzorka je naneto na gel Novex 4-20% SDS-PAGE, 1,0 mm (Novex EC6025). Na gel je takođe naneto 10 μL standarda za molekulsku masu Mark 12 (Invitrogen 100006637). Elektroforeza je izvedena u 1x Tris-glicin SDS puferu za elektroforezu (Invitrogen LC2675-5) na konstantnih 250 V, dok boja za praćenje nije dostigla dno gela. Gel je zatim obojen bojom na bazi Coommassie (Expedeon InstantBlue br. ISB1L).
Za analizu masenom spektrometrijom, svako antitelo je razblaženo do finalne koncentracije od 1 mg/ml u PBS-u. pH antitela je povećana na 8,0 dodatkom 1:10 V/V 1,0 M tris, pH 8,0. Dodat je DTT do finalne koncentracije od 10 mM u rastvoru, kako bi se smanjila koncentracija antitela. Uzorak je zatim zagrevan 15 minuta na 37°C. Uzorci su zatim injektovani na kolonu PLRP-S 1000 Å, 8 μm, 2,1 x 50 mm (Agilent, PF1912-1802) zagrejanu na 80°C pomoću sistema Agilent 1200 HPFC, a zatim podvrgnuti elektrosprej jonizaciji na sistemu Agilent 6210 TOF LC/MS.
Rezultati ovih analiza prikazani su na SL. 13. SDS-PAGE analiza (SL. 13A) pokazala je da je frakcija teškog lanca (HC) pocepana u svakom antitelu. Trake koje odgovaraju netaknutom HC i lakom lancu (LC), kao i karboksi (C)- terminalno i amino (N)-terminalno pocepani fragmenti HC označeni su sa desne strane gela. Na SL. 13B prikazana je reprezentativna analiza masene spektrometrije za antitelo A-1. Ova analiza je pokazala da je mesto cepanja između HC aminokiselina G100 i S101 (sekvencijalna numeracija, što odgovara G96 i S97 prema Kabatovoj numeraciji) u CDR3, kao što je predstavljeno na aminokiselinskoj sekvenci HC na SL.13C, gde strelica označava mesto cepanja. Slične analize su pokazale da se cepanje HC desilo u svim ispitivanim preparatima tih antitela (uključujući sledeće ekspresije na dva različita ćelijska tipa, CHO i 293), i da se cepanje desilo nezavisno od vrste Fc regiona antitela (humani IgG1 ili mišji IgG2a).
SDS-PAGE gel za anti-Jagged1 antitela je urađen suštinski isto kao što je gore opisano. Umesto bojenja bojom na bazi Coomassie, antitelo je preneto na PVDF membranu (Invitrogen FC2002) pomoću XCell modula za bojenje (Invitrogen EI9051) na konstantnih 0,35 A. Membrana je obojena pomoću Coomassie Blue R-250. Uzorci na membrani su podvrgnuti analizi N-terminalne sekvence pomoću aparata Applied Biosystems Procise Sequencer 494, prema principima sekvenciranja koje je opisao Niall, 1973, Meth. Enzymol. 27: 942-1010.
Rezultati analiza sekvenciranja prikazani su na SL. 14. Ovaj postupak je potvrdio da je mesto cepanja isto kao što su predvideli rezultati masene spektrometrije, a to je između G100 i S101 (sekvencijalna numeracija, što odgovara G96 i S97 prema Kabatovoj numeraciji) HC sekvence.
Cepanje teškog lanca anti-Jagged1 antitela A, A-1 i A-2 je neočekivano. Analizom aminokiselinske sekvence oko mesta cepanja nisu identifikovana poznata mesta cepanja proteaza. Mehanizam cepanja je nejasan, i nije lako vidljiv na osnovu sekvenci antitela.
Primer 8: Mutacija S101 teškog lanca smanjuje cepanje teškog lanca anti-Jagged1 antitela Pošto je primećeno cepanje anti-Jagged1 antitela neočekivano i mehanizam nije jasan, nije se znalo da li bi izmene sekvence antitela mogle da spreče cepanje, uz zadržavanje afiniteta i efikasnosti antitela. Pored toga, nije bilo poznato koje položaje u sekvenci antitela treba promeniti da bi se sprečilo cepanje. Da bi se odredilo da li se cepanje antitela može sprečiti promenom sekvence teškog lanca, napravljen je niz promena aminokiselina na položaju S101 teškog lanca (sekvencijalna numeracija sekvence varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 17, što odgovara S97 prema Kabatovoj numeraciji). Antitela su eksprimirana u ćelijama sisara i prečišćena prema standardnim postupcima. Cepanje je analizirano pomoću SDS-PAGE, kao što je opisano u Primeru 7. Rezultati su prikazani na SL.15. Promene aminokiselina na položaju S101 značajno su smanjile ili eliminisale cepanje HC, mada je izvesno cepanje detektovano sa S101 mutacijom (SL.15, traka 5). Ovi rezultati su potvrđeni masenom spektrometrijom, izvedenom kao što je opisano u Primeru 7.
Da bi se odredili efekti izmena na vezivanje prečišćenog proteinskog fragmenta ekstracelularnog domena Jag1, afinitet vezivanja mutantnog antitela A-1 određen je pomoću BIAcore sistema. U Tabeli 3 prikazani su sažeti rezultati fragmentacije i afiniteti vezivanja Jagged1 za mutantna antitela A-1.
Tabela 3: Fragmentacija i afiniteti vezivanja Jagged1 za mutantna antitela A-1
Kao što je prikazano u Tabeli 3, izmene aminokiselinskog ostatka u položaju 101 smanjile su cepanje na nivo koji se ne može detektovati, osim za S101H. Pored toga, pošto je mehanizam cepanja nepoznat, ispitana je i izmena u položaju 100, G100A. Mutant G100A je takođe pocepan.
Pogledajte Tabelu 3. Neočekivano, pošto su mutacije napravljene na HVR-H3, mutantna antitela S101 su zadržala sposobnost vezivanja Jagged1.
Primer 9: Uticaj temperature i ciklusa zamrzavanja i otapanja na cepanje teškog lanca anti-Jagged1 antitela
Da bi se procenilo da li se cepanje anti-Jagged1 antitela povećava inkubacijom na rastućim temperaturama, različiti nezavisni preparati anti-Jagged1 antitela A-1 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 17, odnosno 18) i A-2 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 25, odnosno 26), kao i antitelo za kontrolu izotipa (ne anti-Jagged1), inkubirani su 10 min na 70°C ili 95°C. Obim cepanja je procenjen pomoću standardne SDS-PAGE tehnike i bojenja proteina. Rezultati su prikazani na SL.16. Svaki od preparata anti-Jagged1 antitela je pocepan na 70°C, dok kontrolno antitelo nije (SL. 16A). Kao što je sažeto u tabeli (SL.16B), obim cepanja anti-Jagged1 nije značajno ili dosledno izmenjen inkubacijom na 95°C u odnosu na 70°C.
Da bi se procenilo da li je cepanje rezultat ciklusa zamrzavanja i otapanja preparata anti-Jagged1 antitela, antitelo A-1 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 17, odnosno 18) podvrgnuto je višestrukim ciklusima zamrzavanja na -80°C, praćenih otapanjem. Zatim je 2 μg svakog uzorka analizirano pomoću SDS-PAGE i bojenja proteina pod neredukujućim (-DTT) ili redukujućim (+DTT) uslovima, kao što je naznačeno. Obojeni gel je snimljen pomoću instrumenta Biorad GelDoc Easy Imager, i denzitometrijska analiza je izvršena pomoću softvera Biorad Image Fab. Rezultati ovog eksperimenta prikazani su na SL. 17. F/T 1 odnosi se na originalni uzorak, sa rastućim brojevima koji pokazuju broj dodatnih ciklusa zamrzavanja i otapanja. Za svaki ciklus, A-1 antitelo je zamrznuto na -80°C, a zatim otapano na sobnoj temperaturi. Uzet je alikvot za SDS-PAGE. Zamrzavanje/otapanje je ponovljeno još dva puta, za ukupno 3 ciklusa zamrzavanja i otapanja, i alikvoti su uzimani nakon svakog ciklusa otapanja. U tabeli (SL.17B) sažet je procenat cepanja pod svakim uslovima. Eksperiment je otkrio da su dodatni ciklusi zamrzavanja i otapanja imali mali uticaj na procenat cepanja.
Primer 10: Dejstvo A-1 i A1-(S101T) na blokiranje Jagged1 in vitro
Izvedeni su in vitro testovi sa zajedničkim uzgajanjem za ispitivanje aktivnosti Jag1-indukovanog Notch reportera, da bi se izmerilo blokirajuće dejstvo A-1 na Jag1 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 17, odnosno 18) i A1-(S101T) (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 33, odnosno 34). Ćelije U87MG, koje eksprimiraju visoke nivoe Notch2, kotransficirane su sa Notch-responsivnim TP-1 (12X CSF) reporterom luciferaze svica (FF) i konstitutivno eksprimiranim reporterom Renilla luciferaze (pRF-CMV, Promega) radi kontrole efikasnosti transfekcije. Vidite Wu i sar., 2010, Nature 464: 1052-1057. Anti-Jagged1 antitelo A-1 ili A1-(S101T), antitelo za kontrolu izotipa, 5 μM DAPT (Calbiochem), ili DMSO kontrolni vehikulum dodati su sa ćelijama koje eksprimiraju ligand (NIH-3T3 ćelije stabilno transficirane humanim Jag1 ili kontrola bez liganda) 6 sati nakon transfekcije. Aktivnosti luciferaze merene su nakon 20 sati zajedničkog uzgajanja (Promega, Dual Glo Luciferase). Tipično su analizirana četiri replikata za svaki uslov, i vrednosti su eksprimirane kao relativne luciferazne jedinice (signal svica podeljen signalom Renilla), i predstavljene na dijagramu kao procenat Jag1-indukovane aktivnosti po anti-ambrozija kontroli.
Rezultati ovog eksperimenta prikazani su na SL.18. Merenja FF i Renilla luciferaze (SL.
18B, odnosno C) izvršena su standardnim postupcima, i odnos FF prema Renilla luciferazi predstavljen je kao normalizovano merenje Jag1-indukovane Notch aktivnosti (SL. 18A). Rezultati pokazuju da i A-1 i A1-(S101T) inhibiraju Jag1-indukovanu Notch signalizaciju na dozno-zavistan način. Vidite SL. 18A i B. Tako, A-1(S101T) zadržava anti-Jagged1 blokirajuću aktivnost matičnog antitela A-1.
Primer 11: Dejstvo A-1 i A-1(S101T) na blokiranje Jagged1 in vivo
Da bi se procenila Jagged1 blokirajuća aktivnost anti-Jagged1 antitela in vivo, smeša bronhijalnih egzokrinih ćelija i trepljastih ćelija bronhijalnog epitela mišjih pluća merena je nakon davanja doze kontrole ili anti-Jagged1 antitela mišu. Osam nedelja stare ženke BALB/c miša divljeg tipa (tri miša po grupi) primile su dozu 0. dana na sledeći način (sve grupe su sadržale anti-Jagged2 antitelo (B-3) radi senzitizacije bronhijalnog epitela, da bi se otkrili jasno merljivi efekti anti-Jagged1 aktivnosti):
1. Kontrola 1X - kontrola izotipa (15 mg antitela po kg telesne težine miša) anti-Jag2 B-3 (15 mg/kg; sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 41, odnosno 42)
2. A-1 1X - anti-Jag1 A-1 (15 mg/kg; sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 17, odnosno 18)+ anti-Jag2 B-3 (15 mg/kg)
3. A-1 .5X - anti-Jag1 A-1 (7,5 mg/kg) anti-Jag2 B-3 (15 mg/kg)
4. A-1 .25X - anti-Jag1 A-1 (3,75 mg/kg) anti-Jag2 B-3 (15 mg/kg)
5. A-1-S101T 2X - anti-Jag1 A1-(S101T) (30 mg/kg; sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 33, odnosno 34) anti-Jag2 B-3 (15 mg/kg)
6. A-1-S101T 1X - anti-Jag1 A1-(S101T) (15 mg/kg) anti-Jag2 B-3 (15 mg/kg) 7. A-1-S101T .5X - anti-Jag1 A1-(S101T) (7,5 mg/kg) anti-Jag2 B-3 (15 mg/kg) 8. A-1-S101T .25X - anti-Jag1 A1-(S101T) (3,75 mg/kg) anti-Jag2 B-3 (15 mg/kg) Pluća su 5. dana sakupljena, napunjena, fiksirana i obojena za imunofluorescenciju (IF) na sledeći način. Pluća su napunjena sa 4% PFA u PBS-u. Cela pluća su preneta u 10% neutralni puferizovani formalin (NBF), i fiksirana preko noći na sobnoj temperaturi. Fiksirana pluća su preneta u 70% etanol na najmanje 24 sata. Pluća su ubačena u parafin, i secirana na 5 µm. Imunofluorescentno bojenje trepljastih i bronhijalnih egzokrinih ćelija izvršeno je na sledeći način. Slajdovi su deparafinizovani, i antigeni su izdvojeni kuvanjem slajdova u citratnom puferu (Dako S1700) u ekspres loncu, 15 minuta na 125°C. Slajdovi su na kratko potopljeni u 2X PBS, a zatim permeablizovani pomoću 0,2% Triton-X100 u PBS-u tokom 45 minuta, ili 3x15 minuta. Sekcije su blokirane pomoću 5% PBS / 2% BSA, tokom 1 sata. Slajdovi su zatim inkubirani sa kozjim anti-CC10 (1:1000) i mišjim anti-acetilovanim alfa tubulinom (1:200) u blokirajućem puferu tokom 2 do 3 sata, ili preko noći. Slajdovi su ispirani PBS-om 3 puta po 15 minuta. Slajdovi su inkubirani sa sekundarnim antitelima tokom 1 sata (Invitrogen Alexa Fluor sekundarna antitela razblažena 1:1000), a zatim ispirani PBS-om dva puta po 15 minuta. Nukleusi su 15 minuta bojeni sa DAPI (0,5 ug/ml). Slajdovi su zatim ispirani PBS-om dva puta po 15 minuta, i pokriveni.
Rezultati ovog eksperimenta prikazani su na SL. 19. Blokiranje Jagged1 i Jagged2 signalizacije izaziva porast broja trepljastih ćelija (kao što je označeno imunofluorescentnom detekcijom alfa-tubulina crvenom bojom) i smanjenje broja bronhijalnih egzokrinih ćelija (kao što je označeno imunofluorescentnom detekcijom CC10 zelenom bojom) u bronhijalnom epitelu miša. Blokiranje i Jagged1 i Jagged2 ćelija dovodi do gotovo potpunog gubitka bronhijalnih egzokrinih ćelija, tako da se dobijeni epitel sastoji prvenstveno od trepljastih ćelija (crvena boja; vidite “A-1, 1X” i “A-1-S101T, 2X” na SL. 19). I A-1 i A1-(S101T) inhibiraju Jagged1-indukovanu Notch signalizaciju in vivo na dozno-zavistan način. Tako, A1-(S101T) zadržava anti-Jagged1 blokirajuću aktivnost matičnog antitela A-1 in vivo.
Primer 12: Anti-Jagged1 antitela A-1 i A-KS101T) inhibiraju rast kancera jetre in vivo Kancer jetre dobijen od humanog pacijenta, LIV br.78 (Genendesign, China), uzgajen je kao supkutani ksenograft u BALB-c golim miševima sa kompromitovanim imunitetom. Kada su tumori porasli na 150 do 200 mm<3>, miševi su podeljeni u sedam terapijskih grupa, sa deset miševa po grupi, i dobijali su dozu jednom nedeljno (osim 5. grupe, koja je primala dozu svake tri nedelje) u naznačenoj dozi (u mg antitela po kg telesne težine miša) naznačenog antitela (A1-(S101T) antitelo ima sekvence teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 51, odnosno 53; “A-1-DANG (bez efektora)” ima sekvence teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 52, odnosno 53; i A-1 antitelo ima sekvence teškog i lakog lanca SEQ ID NO: 81, odnosno 53). Vidite SL.20B. Zapremine tumora su procenjene pomoću merenja kljunastim merilom (dužina x širina x visina/2).
SL. 20A prikazuje dijagram LME (linearnih mešanih efekata) zapremine tumora u svakoj lečenoj grupi tokom trajanja studije. SL.20B daje sažetak statistike rasta, identitete grupa i dozne režime. Anti-Jagged1 A-1 i A1-(S101T) antitela su značajno inhibirala rast kancera jetre in vivo', primećeni su višestruki PR (parcijalni odgovori) sa oba anti-Jagged1 antitela. Slično, ni u jednoj od grupa lečenih sa anti-Jagged1 nije se prikazalo udvostručavanje zapremine tumora tokom 44 dana studije, dok je u kontrolnoj grupi vreme do progresije udvostručavanja tumora (TTP 2X) bilo 18,5 dana. Vidite SL.20B. Procenat inhibicije rasta tumora (% TGI, gde "niži" i "viši" ukazuje na najniže, odnosno najviše merenje % TGI kod pojedinačnih životinja iz obe grupe) kao funkcije površine ispod krive po danu (AUC/dan) u poređenju sa kontrolnom grupom u zavisnosti od doze anti-Jagged1 A-1-S101T, i u skladu sa inhibicijom rasta tumora odražava obim inhibicije Jagged1. Slično tome, inhibicija rasta tumora je bila slična kod primene A-1 ili A-1(S101T). Uporedite, npr., 3. i 7. grupu, SL.20B. Inhibicija rasta tumora nije zavisila od efektorske funkcije antitela, jer je mutantni oblik A-1 teškog lanca N297G, bez efektorske funkcije, inhibirao rast tumora podjednako efikasno kao A-1. Uporedite 6. i 7. grupu, SL.20B.
SL. 21A prikazuje dijagram LME (linearnih mešanih efekata) telesne težine miša tokom vremena za miševe prikazane na SL.20. Sl.20B prikazuje različite parametre telesne težine miša za tretirane grupe, uključujući % promene telesne težine poslednjeg dana studije (% BW poslednjeg dana), maksimalni % promene telesne težine (max %BW), i dan kad se desio maksimalni % promene telesne težine (dan max %BW), i (AUC/dan (niža, viša)). Dijagrami telesne težine za lečene grupe, uključujući kontrolnu grupu, statistički se ne razlikuju, što ukazuje da se anti-Jagged1 tretman dobro podnosi.
Primer 13: Blokiranje Jagged1 inhibira metaplaziju peharskih ćelija in vivo
Nakon 35-dnevnog perioda senzitacije na intraperitonealno injektovani albumin, miševi su podvrgavani aerosolu ovalbumina 7 uzastopnih dana, nakon čega su žrtvovani i analizirani na broj peharskih ćelija. Miševi su tretirani kontrolom, anti-Jagged1 A-2 antitelom (sa mišjim IgG2a Fc), anti-Jagged2 B-3 antitelom (sa mišjim IgG2a Fc), ili kombinacijom anti-Jagged1 i anti-Jagged2 antitela 24 sata i 96 sati nakon prvog podvrgavanja aerosolu.
SL: 23A prikazuje bojenje disajnih puteva pluća perjodnom kiselinom i Šifovim reagensom kod miševa tretiranih sa anti-Jagged1, anti-Jagged2, anti-Jagged1 i anti-Jagged2, ili kontrolnim antitelom. SL: 23B prikazuje kvantifikaciju peharskih ćelija u disajnim putevima različito tretiranih grupa. U kontrolnoj i anti-Jagged2 grupi se primećuje izobilje peharskih ćelija. Malo peharskih ćelija je prisutno u anti-Jagged1 grupi, a gotovo da i nema peharskih ćelija u grupi anti-Jagged1 anti-Jagged2. SL: 23C prikazuje indeks inflamacije procenjen pomoću bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E) . Tretiranje Jagged1 ili -2 blokirajućim antitelom ne utiče na inflamaciju u plućima.
Jagged1-indukovana Notch signalizacija usmerava ćelijsku sudbinu u disajnim putevima prema sudbini sekretorne ćelije (uključujući peharsku ćeliju), a udaljava je od sudbine trepljaste ćelije. Jagged1 signalizacija je važna za održavanje sudbine sekretorne ćelije, a inhibicija Jagged1 signalizacije je sprečila metaplaziju peharskih ćelija. Takođe smo pokazali da je konverzija bronhijalne egzokrine ćelije u trepljastu ćeliju direktna, i ne uključuje ćelijsku deobu (podaci nisu prikazani). Bronhijalne egzokrine ćelije generišu peharske ćelije u plućima. Ova transdiferencijacija jednog ćelijskog tipa u drugi dešavala se u plućima odraslih, i razlikuje se od izbora ćelijske sudbine koji uključuju deobu progenitorske ćelije, kao nakon oštećenja ili tokom razvoja. Metaplazija peharskih ćelija ili višak sluzi predstavlja zaštitni znak više bolesti disajnih puteva, kao što je astma, cistična fibroza, hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP) i Beretov jednjak. Ti rezultati inhibicije Jagged obezbeđuju osnovu za terapeutsku primenu koja uključuje upotrebu Jagged1 ili Jagged2 inhibitora za prevenciju ili preokret metaplazije peharskih ćelija, i za lečenje stanja okarakterisanih viškom sluzi, kao kod bolesti disajnih puteva (npr. astma, HOBP, cistična fibroza) i Beretovog jednjaka.
Primer 14: Specifično vezivanje anti-Jagged1 i anti-Jagged2 antitela
Antitela A-2 (SL.24, levo) i C-1 (SL.24, desno) ispitana su za vezivanje na rekombinantne prečišćene Notch ligande humanog Jagged1 (hJag-1), humanog Jagged2 (hJag-2), mišjeg Jagged2 (mJag-2), humanog Delta-like 1 (hDLL1), mišjeg Delta-like 1 (mDLL1), i humanog Delta-like 4 (hDLL4) pomoću standardnog testa sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA). 1 μg/ml proteina Notch liganda (kako je naznačeno) u PBS-u, pH 7,4, prevučeno je na ELISA ploče (Nunc Maxisorp) na 40°C preko noći. Ploče su blokirane kazeinskim blokatorom u PBS-u (Pierce) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Serijska 3-struka razblaženja IgG antitela (kako je naznačeno) u PBST puferu (PBT pufer (PBS 0,05% (V/V) Tween 20) sa 0,5% (m/V) BSA) dodata su na ploče i inkubirana jedan sat na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane sa PBST, i vezana antitela su detektovana sa kozjim anti-humanim Fab specifičnim IgG konjugovanim sa proteazom (Sigma). Korišćen je TMB supstrat (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin), i očitana je apsorbanca na 630 nM pomoću standardnog čitača ELISA ploča. Apsorbanca je predstavljena u zavisnosti od koncentracija IgG koristeći KaleidaGraph (Synergy Software). Na SL.24 prikazani su rezultati, a Ag630na y-osi predstavlja obim vezivanja.
Antitelo A2 vezalo je humani i mišji Jagged1, ali nije vezalo humani Jagged 2, mišji Jagged2, humani DLL1, mišji DLL1, humani DLL4, ili mišji DLL4 (SL. 24, levo). Antitelo C1 vezalo je humani i mišji Jagged1, humani i mišji DLL1, humani i mišji Jagged2, ali nije vezalo humani ili mišji DLL4 (Slika 24, desno).
Afiniteti vezivanja antitela i konstante brzine određeni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću instrumenta BIAcore™-T200. Humana IgG1antitela su uhvaćena pomoću mišjeg anti-humanog IgG prevučenog na CM5 senzorski čip, da bi se dobilo oko 150 jedinica odgovora (RU). Za merenja kinetike ili afiniteta, četvorostruka serijska razblaženja humanog Jagged1, mišjeg Jagged1, humanog Jagged2, mišjeg Jagged2, humanog DLL1, mišjeg DLL1, humanog DLL4, mišjeg DLL4 i pacovskog Jagged1 injektovana su u HBS-T puferu (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% V/V surfaktant P20, GE Healthcare) na 25°C, pri protoku od 30 ml/min. Fragmenti liganada su DSL-EGF1-4 fragmenti, osim pacovskog Jagged1, koji je nabavljen od R&D Systems. Za analizu kinetike, brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIAcore T200 Evaluation Software verzija 2.0). Ravnotežna konstanta disocijacije (kd) izračunata je kao odnos koff/kon. Za analizu afiniteta, Kdje izračunato koristeći afinitetni model stabilnog stanja Steady State Affinity model (BIAcore T200 Evaluation Software version 2.0).
U Tabeli 3 sažete su konstante vezivanja antitela A-2, B-3, C-1, A-1, i A-1 S101T koja se vezuju za prečišćeni humani Jagged1, mišji Jagged1, humani Jagged2, mišji Jagged2, humani DLL1, mišji DLL1, humani DLL4, mišji DLL4, i/ili pacovski Jagged1. n.d. = nije detektovano, n.t. = nije testirano. Antitela A-2, A-1 i A-1-S101T.NG (antitelo A-1S101T sa N297G mutacijom) specifično su se vezala za humani i mišji Jagged1 sa velikim afinitetom. Antitela A-1 i A-1-S101T.NG vezala su pacovski Jagged1, takođe sa velikim afinitetom. Antitelo B-3 specifično se vezalo za humani i mišji Jagged2 sa velikim afinitetom. Antitelo C-1 specifično se vezalo za humani i mišji Jagged1 i Jagged 2. Antitela B-3 i C-1, ali ne i antitelo A-2, prikazala su izvesno vezivanje za humani i mišji DLL1. Nijedno od ispitanih antitela nije se vezalo za humani ili mišji DLL4.
Primer 15: Farmakokinetika anti-Jagged1 A-1-S101T antitela
Farmakokinetički profil anti-Jagged1 A-1-S101T antitela nakon jedne intravenske injekcije pri 1, 10 i 100 mg/kg određen je kod ženki Balb/c golih miševa (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Miševi su bili stari 5-8 nedelja, i teški oko 17,3-21,8 g. Sakupljeni su uzorci seruma, i koncentracije antitela su analizirane specifičnim testom sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA). Specifične ELISA su prevučene JAG1 ekstracelularnim domenom-histidinom, i detektovane pomoću kozjeg anti-humanog Fc. Osetljivost testa bila je manja od standardne vrednosti od 6,25 ng/ml. Farmakokinetički parametri su procenjeni koristeći nekompartmentalni model Phoenix™ WinNonlin® (v.6.3; Pharsight Corporation; Mountain View, CA). Sve FK analize su se zasnivale na podacima o naivnoj grupi pojedinačnih životinja.
Povećanje izloženosti veće od onog srazmernog dozi primećeno je nakon IV primene anti-Jagged1 A-1-S101T antitela u doznom opsegu od 1 i 100 mg/kg, što nagoveštava mehanizam klirensa antitela posredovan ciljem (Slika 25 i Tabela 4). Vrednosti klirensa su se kretale približno od 13 do 75 ml/dan/kg.
Tabela 4: Farmakokinetičke osobine anti-Jagged1 A-1-S101T antitela
Iako je gornji pronalazak opisan prilično detaljno putem ilustracije i pomoću primera koji bi olakšali razumevanje, opisi i primeri ne treba da se tumače kao ograničavajući za obim pronalaska.
Tabela sekvenci
LISTA SEKVENCI
<110> GENENTECH, INC.
SIEBEL, Christian W.
WU, Yan
HANG, Julie Q.
CHINN, Yvonne
<120> ANTI-JAGGED1 ANTITELA I NAČINI PRIMENE
<130> GENE-33748/US-1/PRO
<140> US 61/939,110
<141> 12.02.2014.
<160> 111
<170> PatentIn verzija 3.5
<210> 1
<211> 1218
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mešov_karakteristike
<223> Humani Jag1
<400> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> Miš sp.
<220>
<221> mešov_karakteristike <223> Mišji Jag1
<400> 2
<211> 1238
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mešov_karakteristike <223> Humani Jag2
<400> 3
<211> 1247
<212> PRT
<213> Miš sp.
<220>
<221> mešov_karakteristike <223> Mišji Jag2
<400> 4
<211> 365
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Mišji Jag1-DSL-EGF1-4 (mišji Jag1 antigen)
<400> 5
<211> 343
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: humani Jag1-DSL-EGF1-4 (humani Jag1 antigen)
<400> 6
<211> 383
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: mišji Jag2-DSL-EGF1-4 (mišji Jag2 antigen)
<400> 7
<211> 381
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: humani Jag2-DSL-EGF1-4 (humani Jag2 antigen)
<400> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Promenljivi region teškog lanca antitela A
<400> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region lakog lanca antitela A
<400> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Hipervarijabilni region teškog lanca 1 antitela A (HVR-H1)
<400> 11
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H2 antitela A
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 antitela A
<400> 13
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Hipervarijabilni region lakog lanca 1 antitela A (HVR-L1)
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L2 antitela A
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L3 antitela A
<400> 16
<210> 17
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela A-1
<400> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region lakog lanca antitela A-1
<400> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H1 antitela A-1
<400> 19
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H2 antitela A-1
<400> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 antitela A-1
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L1 antitela A-1
<400> 22
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L2 antitela A-1
<400> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L3 antitela A-1
<400> 24
<210> 25
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela A-2
<400> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region lakog lanca antitela A-2
<400> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H1 antitela A-2
<400> 27
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H2 antitela A-2
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 antitela A-2
<400> 29
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L1 antitela A-2
<400> 30
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L2 antitela A-2
<400> 33
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L3 antitela A-2
<210> 33
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela A-1 (S101T)
<400> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region lakog lanca antitela A-1 (S101T)
<400> 34
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H1 antitela A-1 (S101T)
<400> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H2 antitela A-1 (S101T)
<400> 36
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 antitela A-1 (S101T)
<400> 37
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L1 antitela A-1 (S101T)
<400> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L2 antitela A-1 (S101T)
<400> 39
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L3 antitela A-1 (S101T)
<400> 40
<210> 41
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela B-3
<400> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region lakog lanca antitela B-3
<400> 42
<211> 23
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Okvir lakog lanca 1 (LC-FR1) antitela A, A-1, A-2, A-1(S101T), B-3
<400> 43
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: LC-FR2 antitela A, A-1, A-2, A-1(S101T), B-3
<400> 44
<211> 32
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: LC-FR3 antitela A, A-1, A-2, A1-(S101T), B-3
<400> 45
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: LC-FR4 antitela A, A-1, A-2, A1-(S101T), B-3
<400> 46
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Okvir teškog lanca 1 (HC-FR1) antitela A, A-1, A-2, A-1(S101T), B-3
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HC-FR2 antitela A, A-1, A-2, A1-(S101T), B-3
<400> 48
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HC-FR3 antitela A, A-1, A-2, A1-(S101T), B-3
<400> 49
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<223> Sintetički: HC-FR4 antitela A, A-1, A-2, A1-(S101T), B-3
<400> 50
<210> 51
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac IgG1 antitela A-1 (S101T)
<400> 51
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac N297G IgG1 antitela A-1 (S101T)
<400> 52
<211> 214
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Laki lanac antitela A-1(S101T); laki lanac antitela A-1
<400> 53
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela A-1 (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (101)..(101)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 54
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<223> Sintetički: HVR-H3 antitela A-1 (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (3)..(3)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 55
<210> 56
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac IgG1 antitela A-1 (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (101)..(101)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 56
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac N297G IgG1 antitela A-1 (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (101)..(101)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 57
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela A (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (101)..(101)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 antitela A (S101X); HVR-H3 antitela A-2 (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (3)..(3)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 59
<210> 60
000
<210> 61
<400> 61
000
<210> 62
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela A-2 (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (101)..(101)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 62
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac N297G IgG1 antitela A-1
<400> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 antitela A (S101T); HVR-H3 antitela A-2 (S101T)
<400> 64
<210> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela A (S101T)
<400> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Varijabilni region teškog lanca antitela A-2 (S101T)
<400> 66
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac N297G IgG1 antitela A (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (101)..(101)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 67
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac N297G IgG1 antitela A-2 (S101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (101)..(101)
<223> Xaa može biti bilo koja aminokiselina osim Ser
<400> 68
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac N297G IgG1 antitela A (S101T)
<400> 69
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac N297G IgG1 antitela A-2 (S101T)
<400> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H2 konsenzus
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (4)..(4)
<223> Xaa je Pro ili Gly
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (5)..(5)
<223> Xaa je Asp ili Asn
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (9)..(9)
<223> Xaa je Thr ili Ser
<400> 71
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 konsenzus (101X)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (3)..(3)
<223> Xaa je bilo koja aminokiselina osim Ser <221> mešov_karakteristike
<222> (4)..(4)
<223> Xaa je Trp ili Leu
<400> 72
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 konsenzus (101T)
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (4)..(4)
<223> Xaa je Trp ili Leu
<400> 73
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-L3 konsenzus
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (3)..(3)
<223> Xaa je Ser ili Tyr
<221> mešov_karakteristike
<222> (7)..(7)
<223> Xaa je Pro ili Ala
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (8)..(8)
<223> Xaa je Pro ili Thr
<400> 74
<210> 75
<211> 214
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Laki lanac antitela A
<400> 75
<211> 214
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Laki lanac antitela A-2
<400> 76
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: HVR-H3 konsenzus
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (3)..(3)
<223> Xaa je Ser ili Thr
<220>
<221> mešov_karakteristike
<222> (4)..(4)
<223> Xaa je Trp ili Leu
<400> 77
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Alternativni HVR-H1 antitela A, A-1, A1-(S101T), A-2
<400> 78
<210> 79
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac IgG1 antitela A (S101T) <400> 79
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac IgG1 antitela A-2 (S101T)
<400> 80
<211> 446
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Teški lanac IgG1 antitela A-1
<400> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Sekvenca kratkog linkera
<400> 82
<210> 83
<211> 6
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički: Mesto cepanja trombina
<400> 83
<210> 84
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 84
<210> 85
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 85
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 86
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 87
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 88
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 89
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 90
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 91
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 92
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 93
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 96
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 100
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 101
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 102
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 103
<210> 104
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 104
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički polipeptid
<400> 107
<211> 445
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<210> 110
<211> 698
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički
<400> 111

Claims (31)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Izolovano antitelo koje se vezuje za humani Jagged1, pri čemu, antitelo sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 ili 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 ili 59, pri čemu, X je bilo koja aminokiselina osim S ili H; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili 40.
2. Izolovano antitelo prema zahtevu 1, pri čemu, antitelo sadrži:
a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40; ili
b) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; ili
c) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16.
3. Izolovano antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu, antitelo sadrži: a) VH sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 54 i VL sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 34; ili
b) VH sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58 i VL sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10; ili
c) VH sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 62 i VL sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 26; ili
d) VH sekvencu SEQ ID NO: 54 i VL sekvencu SEQ ID NO: 34; ili
e) VH sekvencu SEQ ID NO: 58 i VL sekvencu SEQ ID NO: 10; ili
f) VH sekvencu SEQ ID NO: 62 i VL sekvencu SEQ ID NO: 26.
4. Izolovano antitelo prema zahtevu 3, pri čemu, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 54 i VL sekvencu SEQ ID NO: 34.
5. Izolovano antitelo prema zahtevu 4, pri čemu, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56 ili SEQ ID NO: 57, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.
6. Izolovano antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu, X je izabrano od A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T i V.
7. Izolovano antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu, X je T.
8. Izolovano antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje sadrži:
a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40; ili
b) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; ili
c) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78; HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 38; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; ili
d) VH sekvencu SEQ ID NO: 33 i VL sekvencu SEQ ID NO: 34; ili
e) VH sekvencu SEQ ID NO: 65 i VL sekvencu SEQ ID NO: 10; ili
f) VH sekvencu SEQ ID NO: 66 i VL sekvencu SEQ ID NO: 26.
9. Izolovano antitelo prema zahtevu 8, pri čemu, antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 33 i VL sekvencu SEQ ID NO: 34.
10. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje je IgG1 antitelo kompletne dužine.
11. Antitelo prema zahtevu 10, pri čemu, antitelo suštinski nema efektorsku funkciju.
12. Antitelo prema zahtevu 10, pri čemu, teški lanac sadrži mutaciju N297G ili N297A.
13. Izolovano antitelo prema zahtevu 8, pri čemu, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.
14. Izolovano antitelo prema zahtevu 8, pri čemu, teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52, i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.
15. Antitelo prema zahtevu 8, pri čemu, antitelo sadrži:
a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75; ili
b) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76; ili
c) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 79 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75; ili
d) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76.
16. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu, antitelo je antagonist Jagged1-posredovane signalizacije.
17. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu, antitelo ne vezuje humani Jagged2, i/ili pri čemu, antitelo ne vezuje humani DLL4, i/ili pri čemu, antitelo ne vezuje humani DLL1; i/ili pri čemu, antitelo ne vezuje mišji Jagged2, mišji DLL4 i/ili mišji DLL1.
18. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva.
19. Ćelija domaćin koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 18.
20. Postupak za proizvodnju antitela, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina prema zahtevu 19, tako da se proizvodi antitelo.
21. Imunokonjugat koji sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 17 i citotoksični agens.
22. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 17, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
23. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 17, ili imunokonjugat prema zahtevu 21, koji se primenjuje kao lek.
24. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 17, ili imunokonjugat prema zahtevu 21, za primenu u lečenju kancera.
25. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 17 za primenu u lečenju alergije, astme, autoimune bolesti, bolesti povezanih sa metaplazijom peharskih ćelija (npr. u plućima) i/ili sa viškom sluzi.
26. Antitelo za primenu prema zahtevu 25, za primenu u lečenju bolesti vezane za metaplaziju peharskih ćelija.
27. Antitelo za primenu prema zahtevu 26, za primenu u lečenju astme, cistične fibroze, hronične opstruktivne bolesti pluća ili Beretovog jednjaka.
28. Antitelo za primenu prema zahtevu 24, pri čemu, kancer je odabran od kancera dojke, kancera pluća, kancera mozga, kancera cerviksa, kancera kolona, kancera jetre, kancera žučnih kanala, kancera pankreasa, kancera kože, maligniteta B ćelija i maligniteta T ćelija.
29. Izolovano antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 17, konjugovano za obeleživač.
30. Izolovano antitelo prema zahtevu 29, pri čemu, obeleživač je pozitronski emiter, pri čemu, poželjno pozitronski emiter je<89>Zr.
31. Postupak za detektovanje humanog Jagged1 u biološkom uzorku, uključujući dovođenje biološkog uzorka u kontakt sa antitelom prema bilo kom od zahteva 1 do 17, 29 i 30, pod uslovima dozvoljenim za vezivanje antitela za prirodni humani Jagged1, i detektovanje nastajanja kompleksa između antitela i prirodnog humanog Jagged1 u biološkom uzorku.
RS20180998A 2014-02-12 2015-02-11 Anti-jagged1 antitela i načini primene RS57608B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461939110P 2014-02-12 2014-02-12
PCT/US2015/015456 WO2015123325A1 (en) 2014-02-12 2015-02-11 Anti-jagged1 antibodies and methods of use
EP15706124.3A EP3105253B1 (en) 2014-02-12 2015-02-11 Anti-jagged1 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57608B1 true RS57608B1 (sr) 2018-11-30

Family

ID=52574459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180998A RS57608B1 (sr) 2014-02-12 2015-02-11 Anti-jagged1 antitela i načini primene

Country Status (33)

Country Link
US (5) US9518121B2 (sr)
EP (3) EP3105253B1 (sr)
JP (1) JP6571115B2 (sr)
KR (2) KR20190114046A (sr)
CN (2) CN111499741A (sr)
AR (1) AR099465A1 (sr)
AU (3) AU2015217271B2 (sr)
BR (1) BR112016017986A2 (sr)
CA (2) CA3045124A1 (sr)
CL (1) CL2016002004A1 (sr)
CR (1) CR20160362A (sr)
DK (1) DK3105253T3 (sr)
EA (1) EA201691610A8 (sr)
ES (1) ES2685424T3 (sr)
HR (1) HRP20181359T1 (sr)
HU (1) HUE039940T2 (sr)
IL (1) IL246736B (sr)
LT (1) LT3105253T (sr)
MA (1) MA39248B1 (sr)
MX (1) MX372675B (sr)
MY (1) MY176855A (sr)
PE (1) PE20161335A1 (sr)
PH (2) PH12016501435A1 (sr)
PL (1) PL3105253T3 (sr)
PT (1) PT3105253T (sr)
RS (1) RS57608B1 (sr)
SG (2) SG11201606607UA (sr)
SI (1) SI3105253T1 (sr)
TR (1) TR201810635T4 (sr)
TW (2) TW201902515A (sr)
UA (1) UA121464C2 (sr)
WO (1) WO2015123325A1 (sr)
ZA (1) ZA201800315B (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7776314B2 (en) 2002-06-17 2010-08-17 Grunenthal Gmbh Abuse-proofed dosage system
PE20120631A1 (es) 2009-07-22 2012-06-06 Gruenenthal Chemie Forma de dosificacion resistente a la manipulacion para opioides sensibles a la oxidacion
HRP20171458T1 (hr) 2011-07-29 2017-11-17 Grünenthal GmbH Tableta otporna na mijenjanje koja pruža neposredno oslobađanje lijeka
WO2013052155A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
JP6117249B2 (ja) 2012-02-28 2017-04-19 グリュネンタール・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング 薬理学的に活性な化合物および陰イオン性ポリマーを含むタンパーレジスタント剤形
KR102193080B1 (ko) 2012-08-13 2020-12-18 제넨테크, 인크. 항-jagged 항체 및 사용 방법
AU2014236815B2 (en) 2013-03-15 2019-04-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
HK1224189A1 (zh) 2013-11-26 2017-08-18 Grünenthal GmbH 通过低温研磨制备粉状药物组合物
EA201691610A8 (ru) 2014-02-12 2018-05-31 Дженентек, Инк. Анти-jagged1 антитела и способы применения
WO2015181059A1 (en) 2014-05-26 2015-12-03 Grünenthal GmbH Multiparticles safeguarded against ethanolic dose-dumping
US10596200B2 (en) 2014-08-22 2020-03-24 Procella Therapeutics Ab Use of LIFR or FGFR3 as a cell surface marker for isolating human cardiac ventricular progenitor cells
DK3183337T3 (en) * 2014-08-22 2019-04-01 Procella Therapeutics Ab Use of Jagged 1 / Frizzled 4 as cell surface marker for isolation of human cardiac ventricular progenitor cells
HK1246173A1 (zh) 2015-04-24 2018-09-07 Grünenthal GmbH 具有立即释放和对溶剂萃取的抗性的抗篡改剂型
EP3417073B1 (en) 2016-02-19 2023-09-20 Procella Therapeutics AB Genetic markers for engraftment of human cardiac ventricular progenitor cells
WO2017205651A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Human notch1 based fusion proteins as decoy inhibitors of jagged-notch signaling and dll-notch signaling
US10508263B2 (en) 2016-11-29 2019-12-17 Procella Therapeutics Ab Methods for isolating human cardiac ventricular progenitor cells
JOP20190259A1 (ar) 2017-05-31 2019-10-31 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد مضادة لـ jagged1
CA3071033A1 (en) * 2017-08-18 2019-02-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of the notch signaling pathway for treatment of respiratory disorders
EP3663393A1 (en) 2017-08-23 2020-06-10 Procella Therapeutics AB Use of neuropilin-1 (nrp1) as a cell surface marker for isolating human cardiac ventricular progenitor cells
US12110342B2 (en) 2018-01-31 2024-10-08 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Nucleic acid monoclonal antibodies targeting PCSK9 and methods of use
CN112129946A (zh) * 2020-08-16 2020-12-25 陆修委 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用

Family Cites Families (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US6004924A (en) 1991-12-11 1999-12-21 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Protein sequences of serrate gene products
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
ES2601882T5 (es) 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
DK1242438T3 (da) 1999-12-29 2007-02-12 Immunogen Inc Cytotoksiske midler omfattende modificerede doxorubiciner og daunorubiciner og deres terapeutiske anvendelse
DK2857516T3 (en) 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
CA2481656A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells in which activity of the protein involved in transportation of gdp-fucose is reduced or lost
WO2003085119A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcϜ RECEPTOR IIIa
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20040101847A1 (en) 2002-11-22 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of Notch2 expression
EP1531825A2 (en) 2002-08-29 2005-05-25 University Of Southampton Use of apoptosis inducing agents in the preparation of a medicament for the treatment of liver diseases
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DK2289936T3 (en) 2002-12-16 2017-07-31 Genentech Inc IMMUNGLOBULIN VARIATIONS AND APPLICATIONS THEREOF
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
WO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α1,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するRNAを用いた抗体組成物の製造法
DK2380910T3 (en) 2003-11-05 2015-10-19 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
PT2489364E (pt) 2003-11-06 2015-04-16 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos
BRPI0416934A (pt) 2003-11-26 2007-01-16 Health Research Inc método para reduzir a gravidade dos distúrbios das células plasmáticas ou para o tratamento dos distúrbios das células plamáticas, método para reduzir a dose de um agente citotóxico, e, método para reduzir a produção de il-6 ou de vegf pelos fibroblastos que se acham em contato com as células plasmáticas cancerosas
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PL1737891T3 (pl) 2004-04-13 2013-08-30 Hoffmann La Roche Przeciwciała przeciw selektynie p
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
NZ553500A (en) 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP2842571A1 (en) * 2004-11-30 2015-03-04 Celldex Therapeutics, Inc. Antibodies directed to GPNMB and uses thereof
AT502055B1 (de) 2005-06-21 2007-11-15 Univ Wien Med Anti tumor medikament
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007058987A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying compounds that inhibit notch cleavage
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP3156418A1 (en) * 2006-01-05 2017-04-19 Genentech, Inc. Anti-ephb4 antibodies and methods using same
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
US20080241150A1 (en) 2006-05-15 2008-10-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Functional negative regulatory domain sequences from human NOTCH1 and 2 and isolated LNR domains from human NOTCH1
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008086043A2 (en) * 2007-01-10 2008-07-17 Wyeth Methods and compositions for assessment and treatment of asthma
US20100119474A1 (en) * 2007-03-06 2010-05-13 Cornell University Chronic obstructive pulmonary disease susceptibility and related compositions and methods
US8802103B2 (en) 2007-05-15 2014-08-12 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
CN102056945A (zh) * 2008-04-07 2011-05-11 埃博灵克斯股份有限公司 针对Notch途径的单可变结构域
JP5560270B2 (ja) 2008-07-08 2014-07-23 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｎｏｔｃｈ結合剤およびアンタゴニストならびにその使用方法
CA2735900A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune, Llc Antibodies directed to dll4 and uses thereof
PE20120080A1 (es) 2008-10-01 2012-02-17 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 y metodos de uso
CN106995495A (zh) * 2009-01-12 2017-08-01 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
EP2483311B1 (en) 2009-09-30 2016-05-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-Notch3 antagonistic antibodies for treating of a gamma-secretase inhibitor positive T-cell leukemia that does not respond to an anti-Notch1 antagonistic antibody.
US8945569B2 (en) * 2009-11-19 2015-02-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Jagged-binding agents and uses thereof
US20130309246A1 (en) 2011-02-02 2013-11-21 The Trustees Of Princeton University Jagged1 as a marker and therapeutic target for breast cancer bone metastasis
WO2013052155A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
JP2015521625A (ja) * 2012-06-22 2015-07-30 シトムクス セラピューティクス，インコーポレイティド 抗−Ｊａｇｇｅｄ１／Ｊａｇｇｅｄ２交差反応性抗体、活性化可能抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体及びそれらの使用方法
KR102193080B1 (ko) * 2012-08-13 2020-12-18 제넨테크, 인크. 항-jagged 항체 및 사용 방법
GB201300706D0 (en) * 2013-01-15 2013-02-27 Cancer Rec Tech Ltd Antibody
WO2014141064A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Novartis Ag Notch2 binding molecules for treating respiratory diseases
AU2014236815B2 (en) 2013-03-15 2019-04-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
EA201691610A8 (ru) 2014-02-12 2018-05-31 Дженентек, Инк. Анти-jagged1 антитела и способы применения
RU2017103289A (ru) 2014-07-11 2018-08-14 Дженентек, Инк. Ингибирование пути notch
JOP20190259A1 (ar) * 2017-05-31 2019-10-31 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد مضادة لـ jagged1

Also Published As

Publication number Publication date
TW201902515A (zh) 2019-01-16
SG10201808259TA (en) 2018-10-30
KR20190114046A (ko) 2019-10-08
JP2017512067A (ja) 2017-05-18
JP6571115B2 (ja) 2019-09-04
ZA201800315B (en) 2020-05-27
EP3105253B1 (en) 2018-06-27
CA2936565C (en) 2020-08-11
US11926674B2 (en) 2024-03-12
DK3105253T3 (en) 2018-09-03
CN106068277A (zh) 2016-11-02
AR099465A1 (es) 2016-07-27
CN111499741A (zh) 2020-08-07
SI3105253T1 (sl) 2018-10-30
US10011661B2 (en) 2018-07-03
US20210206871A1 (en) 2021-07-08
HUE039940T2 (hu) 2019-02-28
EP3825332A1 (en) 2021-05-26
IL246736B (en) 2020-09-30
AU2018229549A1 (en) 2018-10-04
US9518121B2 (en) 2016-12-13
UA121464C2 (uk) 2020-06-10
MX2016010433A (es) 2016-09-22
CL2016002004A1 (es) 2017-01-20
PE20161335A1 (es) 2016-12-07
MX372675B (es) 2020-03-25
LT3105253T (lt) 2018-09-10
MY176855A (en) 2020-08-24
EP3428190A1 (en) 2019-01-16
CN106068277B (zh) 2021-08-24
CA3045124A1 (en) 2015-08-20
AU2015217271A1 (en) 2016-08-11
HRP20181359T1 (hr) 2018-10-19
PT3105253T (pt) 2018-10-04
US20170137531A1 (en) 2017-05-18
KR102030891B1 (ko) 2019-10-11
AU2015217271B2 (en) 2018-10-25
EA201691610A8 (ru) 2018-05-31
TR201810635T4 (tr) 2018-08-27
US20180371098A1 (en) 2018-12-27
IL246736A0 (en) 2016-08-31
WO2015123325A1 (en) 2015-08-20
KR20160118348A (ko) 2016-10-11
ES2685424T3 (es) 2018-10-09
BR112016017986A2 (pt) 2017-10-10
SG11201606607UA (en) 2016-09-29
US10858440B2 (en) 2020-12-08
TW201613963A (en) 2016-04-16
PH12020550781A1 (en) 2021-08-02
EA201691610A1 (ru) 2016-11-30
TWI631135B (zh) 2018-08-01
PH12016501435A1 (en) 2017-02-06
CR20160362A (es) 2016-09-20
EP3105253A1 (en) 2016-12-21
CA2936565A1 (en) 2015-08-20
PL3105253T3 (pl) 2018-12-31
US20240384000A1 (en) 2024-11-21
US20150252117A1 (en) 2015-09-10
AU2020203547A1 (en) 2020-06-18
MA39248B1 (fr) 2018-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240384000A1 (en) Anti-Jagged1 Antibodies and Methods of Use
US20240034805A1 (en) Anti-Jagged Antibodies and Methods of Use
HK1227041B (zh) 抗锯齿蛋白1抗体及使用方法
HK1227041A1 (en) Anti-jagged1 antibodies and methods of use
HK1209432B (zh) 抗锯齿蛋白抗体及使用方法