RS57481B1 - Pirazolopirimidinska jedinjenja - Google Patents

Description

OBLAST I STANJE TEHNIKE

Proteinske kinaze su predmet opsežnih studija u istraživanju novih terapeutskih agenasa za različite bolesti, na primer, kancera. Poznato je da proteinske kinaze posreduju pri transdukciji intracelularnih signala ostvarivanjem prenosa fosforila iz nukleozidnog trifosfata do proteinskog akceptora koji je uključen u signalnu putanju. Postoji više kinaza i putanja pomoću kojih ekstracelularni i drugi stimulansi izazivaju odvijanje različitih ćelijskih reakcija unutar ćelije.

Humana TTK proteinska kinaza (TTK), takođe poznata kao tirozin treonin kinaza, proteinska kinaza dvostruke specifičnosti TTK, monopolarno vratilo 1 (Mps1) i fosfotirozinom-selektovana treonin kinaza (PYT), je konzervirana multispecifična kinaza koja može da fosforiluje serinske, treoninske i tirozinske ostatke kada je izražena u E. coli (Mills et al., J. Biol. Chem.22(5): 16000-16006 (1992)). TTK iRNK nije izražena u većini fiziološki normalnih tkiva kod ljudi (Id). TTK iRNK je izražena samo u nekim tkivima sa brzom proliferacijom, kao što su testis i timus, kao i u nekim tumorima (na primer, TTK iRNK koja nije izražena u karcinomu bubrežnih ćelija, a bila je izražena u 50% uzoraka kancera dojke, te je bila izražena u uzorcima tumora testisa i kancera jajnika) (Id). TTK je izražena u nekim ćelijskim linijama kancera i tumorima u odnosu na njihove normalne parnjake (Id.; vidi takođe WO 02/068444 A1).

Zbog toga agensi koji inhibiraju proteinsku kinazu, a naročito TTK, imaju potencijal za lečenje kancera. Postoji potreba za dodatnim agensima koji mogu da deluju kao inhibitori proteinskih kinaza, a naročito TTK inhibitorima.

Pored toga, vraćanje kancera, rezistencija na lekove ili metastaze su jedan od najvećih izazova u terapijama kancera. Pacijenti sa kancerom koji su pozitivno reagovali na inicijalnu anti-kancersku terapiju često razvijaju rezistenciju na lekove, kao i sekundarne tumore koji dovode do vraćanja bolesti. Skorašnji dokazi iz istraživanja sugerišu da sposobnost tumora da raste i da se razvija zavisi od malog podskupa ćelija unutar tumora. Ove ćelije se nazivaju ćelijama koje iniciraju tumor (engl. tumor-initiating cells, skr. TICs) ili kancerskim matičnim ćelijama. Smatra se da su TICs odgovorne za rezistenciju na lekove, vraćanje kancera i metastaze. Jedinjenja koja mogu inhibirati rast i preživljavanje ovih ćelija koje iniciraju tumor se mogu primeniti za lečenje kancera, metastaza ili prevenciju vraćanja kancera. Zbog toga postoji potreba za novim jedinjenjima koja mogu inhibirati rast i preživljavanje ćelija koje iniciraju tumor.

SUŠTINA PRONALASKA

Podnosioci prijave su sada otkrili da su izvesna pirazolopirimidinska jedinjenja potentni inhibitori kinaze, kao što je TTK proteinska kinaza (vidi Primer B). Podnosioci prijave su takođe otkrili da ova jedinjenja imaju potentnu antikancersku aktivnost protiv ćelija kancera dojke, kancera debelog creva, i kancera jajnika u studijama na ćelijskim kulturama (vidi Primere C-D). Na osnovu ovih otkrića, ovde su otkrivena pirazolopirimidinska jedinjenja, njihove farmaceutske kompozicije i metode lečenja kancera sa pirazolopirimidinskim jedinjenjima.

Predmetna otkrivanja su usmerena, bar delimično, na jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu:

R<1>je –NH-CH2-Cy,

Cy je ciklopropil ili ciklobutil, pri čemu je ciklopropil ili ciklobutil opciono supstituisan sa jednom ili dve grupe izabrane

između alkila i hidroksila;

R<2>je -O-piridinil; -NH-(C2-C6)hidroksialkil opciono supstituisan sa ciklopropilom ili izopropilom; ili -NH-(C3-C6)cikloalkil opciono supstituisan sa hidroksilom ili (C1-C2)hidroksilalkilom;

R<4>je izabran između vodonika, halogena, i (C1-C3)alkila; i

R<d>je ciklopropil. Prvenstveno, R<4>je hlor ili metil.

U jednom primeru izvođenja, predmetna otkrivanja obuhvataju farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač ili razređivač i jedinjenje predstavljeno gore opisanom strukturnom formulom (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

U sledećem primeru izvođenja, predmetnim otkrivanjima je realizovan metod lečenja subjekta koji ima kancer koji sadrži davanje subjektu efektivne količine jedinjenja strukturne formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

Sledećim primerom izvođenja predmetnih otkrivanja je realizovan metod inhibicije TTK aktivnosti kod subjekta kome je potrebna inhibicija TTK aktivnosti, koji sadrži davanje subjektu efektivne količine jedinjenja predstavljenog strukturnom formulom (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

Sledeći primer izvođenja predmetnih otkrivanja obuhvata primenu jedinjenja predstavljenog strukturnom formulom (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli u terapiji. U nekim primerima izvođenja, terapija je lečenje subjekta sa kancerom. Alternativno tome, terapija je za inhibiciju TTK aktivnosti kod subjekta kome je potrebna inhibicija TTK aktivnosti.

Sledeći primer izvođenja predmetnih otkrivanja obuhvata primenu jedinjenja predstavljenog strukturnom formulom (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju leka za lečenje subjekta sa kancerom.

Sledeći primer izvođenja predmetnih otkrivanja obuhvata primenu jedinjenja predstavljenog strukturnim formulama (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli za proizvodnju leka za inhibiciju TTK aktivnosti kod subjekta kome je potrebna inhibicija TTK aktivnosti.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

U jednom primeru izvođenja, predmetna otkrivanja su usmerena na jedinjenje predstavljeno strukturnom formulom (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Pronalazak takođe obuhvata jedinjenja prikazana strukturom i/ili opisana po imenu u delu sa primerima, a obuhvata i neutralne oblike, kao i njihove farmaceutski prihvatljive soli. Lečenja i/ili primene ovih jedinjenja (uključujući neutralne oblike i njihove farmaceutski prihvatljive soli) koja su ovde opisana su takođe uključena u pronalazak. Specifični primeri jedinjenja prema pronalasku su prikazani dole:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; i

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Izraz “alkil” koji se koristi sam ili kao deo većeg radikala, kao što je “hidroksialkil”, i slično, označava zasićeni alifatični linearni ili razgranati monovalentni ugljovodonični radikal. Osim ako nije drugačije navedeno, alkil grupa obično ima 1-6 atoma ugljenika, tj. (C1-C6)alkil. Kada se ovde koristi, “(C1-C6)alkil” grupa označava radikal koji ima od 1 do 6 atoma ugljenika raspoređenih linearno ili razgranato.

“Cikloalkil” označava zasićeni alifatični ciklični ugljovodonični radikal. On može biti monociklični, biciklični (npr. premošćeni biciklični prsten), policiklični (npr. triciklični), ili kondenzovani. Na primer, monociklični (C3-C7)cikloalkil označava radikal koji ima od 3-7 atoma ugljenika raspoređenih u monocikličnom prstenu. (C3-C7)cikloalkil obuhvata, ali nije ograničen na ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, i cikloheptil.

Izvesna ovde opisana jedinjenja mogu postojati u različitim stereoizomernim ili tautomernim oblicima. Stereoizomeri su jedinjenja koja se razlikuju samo po svom prostornom rasporedu. Kada je otkriveno jedinjenje imenovano ili prikazano strukturom bez naznačavanja stereohemije, podrazumeva se da to ime ili struktura obuhvata sve moguće stereoizomere, tautomere, geometrijske izomere ili njihovu kombinaciju.

Kada je geometrijski izomer prikazan imenom ili strukturom, podrazumeva se da je geometrijska izomerna čistoća imenovanog ili prikazanog geometrijskog izomera najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99.9 tež. % čistoće. Čistoća geometrijskog izomera se određuje deljenjem težine imenovanog ili prikazanog geometrijskog izomera u smeši sa ukupnom težinom svih geometrijskih izomera u smeši.

Racemska smeša označava 50% jednog enantiomera i 50% odgovarajućeg enantiomera. Predmetna otkrivanja obuhvataju sve enantiomerno čiste, enantiomerno obogaćene, dijastereomerno čiste, dijastereomerno obogaćene i racemske smeše i dijastereomerne smeše ovde opisanih jedinjenja.

Enantiomerne i dijastereomerne smeše se mogu razdvojiti na svoje komponentne enantiomere ili stereoizomere dobro poznatim metodama, kao što su hiralno-fazna gasna hromatografija, hiralno-fazna tečna hromatografija visokih performansi, kristalizacija jedinjenja kao kompleksa hiralnih soli, ili kristalizacija jedinjenja u hiralnom rastvaraču. Enantiomeri i dijastereomeri se takođe mogu dobiti od dijastereomerno ili enantiomerno čistih intermedijera, reagenasa i katalizatora dobro poznatim metodama sinteze.

Kada je jedinjenje označeno imenom ili strukturom koje ukazuje na samo jedan enantiomer, osim ako nije drugačije naznačeno, jedinjenje je najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99.9% optički čisto (takođe se navodi kao “enantiomerno čisto”). Optička čistoća je težina u smeši imenovanog ili prikazanog enantiomera podeljena sa ukupnom težinom oba enantiomera u smeši.

Kada je stereohemija opisanog jedinjenja imenovana ili prikazana strukturom, i imenovana ili prikazana struktura obuhvata više od jednog stereoizomera (npr. kao u dijastereomernom paru), onda se podrazumeva da je uključen jedan od obuhvaćenih stereoizomera ili bilo koja smeša obuhvaćenih stereoizomera. Dalje se podrazumeva da je stereoizomerna čistoća imenovanih ili prikazanih stereoizomera najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99.9 tež. %. Stereoizomerna čistoća u ovom slučaju se određuje deljenjem ukupne težine stereoizomera sa imenom ili strukturom sadržanih u smeši sa ukupnom težinom svih stereoizomera u smeši.

U predmetna otkrivanja su uključene farmaceutski prihvatljive soli ovde opisanih jedinjenja. Opisana jedinjenja imaju bazne amino grupe i zato mogu da formiraju farmaceutski prihvatljive soli sa farmaceutski prihvatljivom kiselinom, odnosno kiselinama. Podesne farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli ovde opisanih jedinjenja obuhvataju soli neorganskih kiselina (kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična, fosforna, azotna i sumporna kiselina) i organskih kiselina (kao što su sirćetna kiselina, benzensulfonska, benzojeva, metansulfonska i p-toluensulfonska kiselina). Jedinjenja prema predmetnim otkrivanjima sa kiselim grupama, kao što su karboksilne kiseline mogu formirati farmaceutski prihvatljive soli sa farmaceutski prihvatljivom bazom, odnosno bazama. Podesne farmaceutski prihvatljive bazne soli obuhvataju amonijumske soli, soli alkalnih metala (kao što su natrijumove i kalijumove soli) i soli zemnoalkalnih metala (kao što su magnezijumove i kalcijumove soli). Jedinjenja sa kvaternarnom amonijum grupom takođe sadrže kontraanjon kao što su hlorid, bromid, jodid, acetat, perhlorat i slično. Drugi primeri takvih soli obuhvataju hidrohloride, hidrobromide, sulfate, metansulfonate, nitrate, benzoate i soli sa aminokiselinama kao što je glutaminska kiselina.

Ovde opisana jedinjenja mogu inhibirati različite kinaze, uključujući TTK. Shodno tome, generalno, ovde opisana jedinjenja su korisna u lečenju bolesti ili stanja koja su povezana sa takvim kinazama. U nekim primerima izvođenja, ovde opisana jedinjenja mogu inhibirati TTK.

U jednom primeru izvođenja, ovde opisana jedinjenja su TTK inhibitori i korisna su za lečenje bolesti, kao što je kancer, koje su povezane sa takvom kinazom, odnosno kinazama.

Sledeći aspekt prema predmetnim otkrivanjima se odnosi na metod lečenja subjekta sa kancerom koji sadrži davanje subjektu efektivne količine ovde opisanog jedinjenja. U jednom primeru izvođenja, ovde opisana jedinjenja inhibiraju rast tumora. Na primer, ovde opisana jedinjenja inhibiraju rast tumora koji prekomerno izražava TTK.

Kanceri koji mogu biti lečeni (uključujući smanjenje verovatnoće vraćanja) metodama prema predmetnim otkrivanjima obuhvataju kancer pluća, kancer dojke, kancer debelog creva, kancer mozga, neuroblastom, kancer prostate, melanom, glioblastom multiforme, kancer jajnika, limfom, leukemiju, melanom, sarkom, paraneoplaziju, osteosarkom, germinom, gliom i mezoteliom. U jednom primeru izvođenja, kancer je izabran između leukemije, akutne mijeloidne leukemije, hronične mijelogene leukemije, kancera dojke, kancera mozga, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, kancera glave i vrata, hepatocelularnog karcinoma, adenokarcinoma pluća, metastatičkog melanoma, kancera pankreasa, kancera prostate, kancera jajnika i kancera bubrega. U jednom primeru izvođenja, kancer je kancer pluća, kancer debelog creva, kancer mozga, neuroblastom, kancer prostate, melanom, glioblastom multiforme ili kancer jajnika. U sledećem primeru izvođenja, kancer je kancer pankreasa, kancer prostate, kancer pluća, melanom, kancer dojke, kancer debelog creva, ili kancer jajnika. U jednom drugom primeru izvođenja, kancer je kancer dojke, kancer debelog creva i kancer jajnika. U jednom drugom primeru izvođenja, kancer je kancer dojke. U jednom drugom primeru izvođenja, kancer je bazalni podtip kancera dojke ili luminalni B podtip kancera dojke. U jednom drugom primeru izvođenja, kancer je bazalni podtip kancera dojke koji prekomerno izražava TTK. U jednom drugom primeru izvođenja, bazalni podtip kancera dojke je ER (estrogenski receptor), HER2 i PR (progesteronski receptor) negativni kancer dojke. U jednom drugom primeru izvođenja, kancer je kancer mekog tkiva. “Kancer mekog tkiva” je u odgovarajućoj oblasti prihvaćeni pojam koji obuhvata tumore nastale od bilo kog mekog tkiva tela. Takvo meko tkivo spaja, nosi ili okružuje različite strukture i organe tela uključujući, ali bez ograničenja na glatke mišiće, skeletne mišiće, tetive, vlaknasta tkiva, masno tkivo, krvne i limfne sudove, perivaskularno tkivo, nerve, mezenhimalne ćelije i sinovijalna tkiva. Shodno tome, kanceri mekih tkiva mogu biti od masnog tkiva, mišićnog tkiva, nervnog tkiva, zglobnog tkiva, krvnih sudova, limfnih sudova i vlaknastih tkiva. Kanceri mekih tkiva mogu biti benigni ili maligni. Generalno, maligni kanceri mekih tkiva se nazivaju sarkomi, ili sarkomi mekog tkiva. Postoji mnogo tipova tumora mekih tkiva, uključujući lipom, lipoblastom, hibernom, liposarkom, lejomiom, lejomiosarkom, rabdomiom, rabdomiosarkom, neurofibrom, švanom (neurilemom), neurom, maligni švanom, neurofibrosarkom, neurogeni sarkom, nodularni tenosinovitis, sinovijalni sarkom, hemangiom, glomus tumor, hemangiopericitom, hemangioendoteliom, angiosarkom, Kapošijev sarkom, limfangiom, fibrom, elastofibrom, superficijelnu fibromatozu, vlaknasti histiocitom, fibrosarkom, fibromatozu, dermatofibrosarkom protuberans (DFSP), maligni vlaknasti histiocitom (MFH), miksom, granularni ćelijski tumor, maligne mezenhimome, sarkom alveolarnog mekog dela, epitelioidni sarkom, čisto ćelijski sarkom, i desmoplastični tumor malih ćelija. U posebnom primeru izvođenja, kancer mekog tkiva je sarkom izabran iz grupe koja se sastoji od fibrosarkoma, gastrointestinalnog sarkoma, lejomiosarkoma, nediferenciranog liposarkoma, pleomorfinog liposarkoma, malignog fibroznog histiocitoma, sarkoma okruglih ćelija, i sinovijalnog sarkoma.

U nekim primerima izvođenja, predmetnim otkrivanjima su realizovani metodi inhibicije rasta ćelija koje iniciraju tumor ili smanjenje verovatnoće povratka kancera kod subjekta koji je podvrgnut anti-kancerskoj terapiji. Metod sadrži korake:

a) procenjivanje subjekta da bi se odredilo da li je kancer u remisiji; i

b) ako je kancer u remisiji, onda sledi davanje subjektu efektivne količine TTK inhibitora (npr. jedinjenja predstavljenog strukturnom formulom (I). Ako kancer nije u remisiji, onda metod opciono dalje sadrži korak nastavka anti-kancerske terapije sve dok kancer ne pređe u remisiju, pa onda korak b) davanja efektivne količine TTK inhibitora (npr. jedinjenja predstavljenog strukturnom formulom (I).

Kada se ovde koristi, izraz “ćelije koje iniciraju tumor” ili “TICs” se odnose na ćelije koje su prisutne unutar nekih tumora koji poseduju sposobnost da se samostalno obnavljaju i priliferiraju. Ove ćelije se ponekad nazivaju kancerske matične ćelije (eng. cancer stem cells (CSCs) i može se uočiti da dele izvesne karakteristike sa normalnim matičnim ćelijama, uključujući fenotip sličan matičnim ćelijama i funkciju. U nekim primerima izvođenja, TICs su karakterisane njihovom sposobnošću da formiraju tumore posle ksenotransplantacije u imunodeficijentne miševe.

U nekim primerima izvođenja, predmetnim otkrivanjima su realizovani metodi inhibicije rasta ćelija koje iniciraju tumor ili smanjuju verovatnoću vraćanja kancera kod subjekta čiji kancer je u remisiji koji sadrže davanje subjektu efektivne količine TTK inhibitora (npr. jedinjenja predstavljena strukturnom formulom (I)).

U nekim primerima izvođenja, npr. gde se subjekt leči da bi se smanjila verovatnoća vraćanja kancera, subjekt je već bio lečen anti-kancerskom terapijom. Alternativno tome, subjekt je već bio lečen anti-kancerskom terapijom i subjekt je u remisiji.

U nekim primerima izvođenja, predmetnim otkrivanjima su realizovani metodi lečenja subjekta sa kancerom koji sadrže davanje subjektu efektivne količine jedinjenja predstavljenog strukturnom formulom (I) u kombinaciji sa efektivnom anti-kancerskom terapijom. U jednom primeru izvođenja, kancer je metastatički kancer.“Metastatički kancer” je kancer koji se širi sa svog primarnog mesta na druge delove tela.

U drugom primeru izvođenja, predmetna otkrivanja su usmerena metod lečenja subjekta sa kancerom rezistentnim na lekove. “Kancer rezistentan na lekove” je kancer koji ne reaguje na jedan, dva, tri, četiri, pet ili više lekova koji se obično upotrebljavaju za lečenje kancera. U jednom primeru izvođenja, kancer rezistentan na lekove je posredovan rastom ćelija koje iniciraju tumor.

Podesni metodi koji su poznati iz odgovarajuće oblasti se mogu koristiti za procenjivanje subjekta da bi se odredilo da li je kancer u remisiji. Na primer, može se pratiti veličina tumora i/ili tumor markera, obično proteina povezanih sa tumorima da bi se odredilo stanje kancera. Veličina tumora se može nadzirati pomoću uređaja za snimanje kao što su rentgen, MRI, CAT skeniranja, ultrazvuk, mamografija, PET i slično ili putem biopsije.

Za ovde opisane metode, npr. metode koadministracije, anti-kancerske terapije su izabrane iz grupe koja se sastoji od hirurgije, zračne terapije, imunoterapije, endokrine terapije, genske terapije i administracije anti-kancerskog agensa. Alternativno tome, antikancerska terapija je zračna terapija. U sledećoj varijanti, anti-kancerska terapija je imunoterapija. U sledećoj varijanti, anti-kancerska terapija je administracija anti-kancerskog agensa. U jednoj drugoj varijanti, anti-kancerska terapija je hirurgija.

Zračna terapija je upotreba zračenja za ubijanje, uništavanje ili lečenje kancera. Primeri zračne terapije obuhvataju, ali nisu ograničeni na gama-zračenje, radioterapiju neutronskim snopom, radioterapiju elektronskim snopom, protonsku terapiju, brahiterapiju, i radioizotopsku terapiju (tj. sistemsku terapiju radioaktivnim izotopima).

Endokrina terapija je lečenje koje dodaje, blokira ili odstranjuje hormone. Na primer, hemoterapeutski agensi koji mogu blokirati proizvodnju ili aktivnost estrogena se koriste za lečenje kancera dojke. Pored toga, hormonska stimulacija imunog sistema se primenjuje za lečenje specifičnih kancera, kao što su karcinom bubrežnih ćelija i melanom. U jednom primeru izvođenja, endokrina terapija obuhvata administraciju prirodnih hormona, sintetičkih hormona ili drugih sintetičkih molekula koji mogu blokirati ili povećati proizvodnju prirodnih hormona u telu. U sledećem primeru izvođenja, endokrina terapija obuhvata odstranjivanje žlezde koja proizvodi izvesni hormon.

Kada se ovde koristi, genska terapija je umetanje gena u subjektovu ćeliju i biološka tkiva radi lečenja bolesti kao što je kancer. Primeri genske terapije obuhvataju, ali nisu ograničeni na gensku terapiju germinativnim linijama i somatsku gensku terapiju.

Imunoterapija (takođe se naziva terapija modifikacijom bioloških reakcija, biološka terapija, bioterapija, imuna terapija, ili biološka terapija) je lečenje koje koristi delove imunog sistema za borbu protiv bolesti. Imunoterapija može pomoći imunom sistemu da prepozna ćelije kancera, ili da pojača reakciju protiv ćelija kancera. Imunoterapije obuhvataju aktivne i pasivne imunoterapije. Aktivne imunoterapije stimulišu sopstveni imuni sistem tela, dok pasivne imunoterapije generalno koriste komponente imunog sistema stvorene izvan tela.

Primeri aktivnih imunoterapija obuhvataju, ali nisu ograničeni na vakcine, uključujući kancerske vakcine, vakcine sa tumorskim ćelijama (autologe ili alogene), vakcine sa dendritskim ćelijama, antigene vakcine, anti-idiotipske vakcine, DNK vakcine, virusne vakcine, ili vakcine sa limfocitima infiltriranim u tumor (engl. Tumor-Infiltrating Lymphocyte, skr. TIL), vakcine sa interleukinom-2 (IL-2) ili ćelijsku terapiju sa limfokinom aktiviranim ubicama (engl. Lymphokine-Activated Killer, skr. LAK).

Primeri pasivnih imunoterapija obuhvataju, ali nisu ograničeni na monoklonska antitela i ciljane terapije koje sadrže toksine. Monoklonska antitela obuhvataju gola antitela i konjugovana monoklonska antitela (takođe se nazivaju tagovanim, obeleženim ili napunjenim antitelima). Gola monoklonska antitela nemaju pričvršćen lekoviti ili radioaktivni materijal, dok su konjugovana monoklonska antitela povezana, na primer, sa hemoterapeutikom (hemoobeležena), radioaktivnom česticom (radioobeležena), ili toksinom (imunotoksin). Primeri lekova sa ovim golim monoklonskim antitelima obuhvataju, ali nisu ograničeni na Rituksimab (Rituksan), antitelo protiv CD20 antigena koje se primenjuje za lečenje, na primer, ne-Hodžkinovog limfoma B ćelija; Trastuzumab (Herceptin), antitelo protiv HER2 proteina koje se primenjuje za lečenje, na primer, uznapredovalog kancera dojke; Alemtuzumab (Kampat), antitelo protiv CD52 antigena koje se primenjuje za lečenje, na primer, hronične limfocitne leukemije B ćelija (B-CLL); Cetuksimab (Erbituks), antitelo protiv EGFR proteina koje se primenjuje, na primer, u kombinaciji sa irinotekanom za lečenje, na primer, uznapredovalog kolorektalnog kancera i kancera glave i vrata; i Bevacizumab (Avastin) koji je antiangiogenezna terapija koja deluje protiv VEGF proteina i primenjuje se, na primer, u kombinaciji sa hemoterapijom za lečenje, na primer, metastaziralog kolorektalnog kancera. Primeri konjugovanih monoklonskih antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na radiooznačeno antitelo Ibritumomab tiuksetan (Zevalin) koje isporučuje radioaktivnost direktno do kanceroznih B limfocita i koje se primenjuje za lečenje, na primer, ne-Hodžkinovog limfoma B ćelija; radiooznačeno antitelo Tositumomab (Beksar) koje se primenjuje za lečenje, na primer, izvesnih tipova ne-Hodžkinovog limfoma; i imunotoksin Gemtuzumab ozogamicin (Milotarg) koji sadrži kaliheamicin i koje se primenjuje za lečenje, na primer, akutne mijelogene leukemije (AML). BL22 je konjugovano monoklonsko antitelo za lečenje, na primer, leukemija vlasastih ćelija, imunotoksini za lečenje, na primer, leukemija, limfoma i tumora mozga, i radioobeležena antitela, kao što su OncoScint na primer, za kolorektalni kancer i kancer jajnika i ProstaScint, na primer, za kancere prostate.

Dalji primeri terapeutskih antitela koja se mogu primeniti obuhvataju, ali nisu ograničeni na HERCEPTIN<®>(Trastuzumab) (Genentech, CA) koji je humanizovano anti-HER2 monoklonsko antitelo za lečenje pacijenata sa metastatičkim kancerom dojke; REOPRO<®>(abciksimab) (Centocor) koji je receptor anti-glikoproteina IIb/IIIa na trombocitima za prevenciju formiranja ugrušaka; ZENAPAKS<®>(daklizumab) (Roche Pharmaceuticals, Švajcarska) koji je imunosupresivno, humanizovano anti-CD25 monoklonsko antitelo za prevenciju odbacivanja akutnog bubrežnog alografta; PANOREKS™ koji je mišije anti-17-IA ćelijsko površinsko antigensko IgG2a antitelo (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 koji je mišije anti-idiotipsko (GD3 epitop) IgG antitelo (ImClone System); IMC-C225 koji je himerično anti-EGFR IgG antitelo (ImClone System); VITAKSIN™ koji je humanizovano antiαVβ3 integrinsko antitelo (Applied Molecular Evolution/MedImmune); Campath 1H/LDP-03 koji je humanizovano anti CD52 IgG1 antitelo (Leukosite); Smart M195 koji je humanizovano anti-CD33 IgG antitelo (Protein Design Lab/Kanebo); RITUKSAN™ koji je himerično anti-CD20 IgG1 antitelo (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LIMFOCID™ koji je je humanizovano anti-CD22 IgG antitelo (Immunomedics); LIMFOCID™ Y-90 (Immunomedics); Limfoskan (Tc-99m-obeleženo; radiosnimanje; Imunomedics); Nuvion (protiv CD3; Protein Design Labs); CM3 je humanizovano anti-ICAM3 antitelo (ICOS Pharm); IDEC-114 je primatirano anti-CD80 antitelo (IDEC Pharm/Mitsubishi); ZEVALIN™ je radioobeleženo mišije anti-CD20 antitelo (IDEC/Schering AG); IDEC-131 je humanizovano anti-CD40L antitelo (IDEC/Eisai); IDEC-151 je primatirano anti-CD4 antitelo (IDEC); IDEC-152 je primatirano anti-CD23 antitelo (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 je humanizovani anti-CD3 IgG (Protein Design Lab); 5G1.1 je humanizovano anti-komplementarno faktorsko 5 (C5) antitelo (Alexion Pharm); D2E7 je humanizovano anti-TNF-α antitelo (CAT/BASF); CDP870 je humanizovani anti-TNF-α Fab fragment (Celltech); IDEC-151 je primatirano anti-CD4 IgG1 antitelo (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 je humano anti-CD4 IgG antitelo (Medarex/Eisai/Genmab); CD20-streptdavidin (+biotin-itrijum 90; NeoRx); CDP571 je humanizovano anti-TNF-α IgG4 antitelo (Celltech); LDP-02 je humanizovano anti-α4β7 antitelo (LeukoSite/Genentech); OrthoClone OKT4A je humanizovano anti-CD4 IgG antitelo (Ortho Biotech); ANTOVA™ je humanizovano anti-CD40L IgG antitelo (Biogen); ANTEGREN™ je humanizovano anti-VLA-4 IgG antitelo (Elan); i CAT-152 je humano anti-TGF-β2antitelo (Cambridge Ab Tech).

Imunoterapije koje se mogu primeniti u predmetnim otkrivanjima obuhvataju adjuvansne imunoterapije. Primeri obuhvataju citokine, kao što su faktor stimulacije kolonija granulocitnih makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), zapaljenski protein makrofaga (MIP)-1-alfa, interleukine (uključujući IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 i IL-27), faktore nekroze tumora (uključujući TNF-alfa), i interferone (uključujući IFN-alfa, IFN-beta, i IFN-gama); aluminijum hidroksid (alum); Bacille Calmette-Guérin (BCG); hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata (KLH); nekompletni Frojndov adjuvans (IFA); QS-21; DETOKS; Levamizol; i Dinitrofenil (DNP), i njihove kombinacije, kao što su, na primer, kombinacije interleukina, na primer, IL-2 sa drugim citokinima, kao što je IFN-alfa.

Alternativno tome, ovde opisana anti-kancerska terapija obuhvata davanje antikancerskog agensa. “Anti-kancerski agens” je jedinjenje koje kada se daje u efektivnoj količini subjektu sa kancerom može ostvariti, delimično ili suštinski, jedno ili više od sledećih: zaustavljanje rasta, smanjenje obima kancera (npr. smanjenje veličine tumora), inhibiciju brzine rasta kancera i ublažavanje ili poboljšanje kliničkog simptoma ili indikatora povezanog sa kancerom (kao što su komponente tkiva ili seruma) ili povećanje životnog veka subjekta.

Anti-kancerski agens koji je podesan za upotrebu u ovde opisanim metodama obuhvata bilo koji od anti-kancerskih agenasa koji su odobreni za lečenje kancera. U jednom primeru izvođenja, anti-kancerski agens obuhvata, ali nije ograničen na ciljno antitelo, inhibitor angiogeneze, alkilujući agens, antimetabolit, vinka alkaloid, taksan, podofilotoksin, inhibitor topoizomeraze, hormonski antineoplastični agens i druge antineoplastične agense.

Primeri alkilujućih agenasa koji su korisni u metodama predmetnih otkrivanja obuhvataju, ali nisu ograničeni na azotne slačice (npr. mehloroetamin, ciklofosfamid, hlorambucil, melfalan, itd.), etilenimine i metilmelamine (npr. heksametilmelamin, tiotepa), alkil sulfonate (npr. busulfan), nitrozouree (npr. karmustin, lomustin, semustin, streptozocin, itd.), ili triazene (dekarbazin, itd.). Primeri antimetabolita koji su korisni u metodama predmetnim otkrivanjima obuhvataju, ali nisu ograničeni na analoge folne kiseline (npr.

metotreksat), ili analoge pirimidina (npr. fluorouracil, floksouridin, citarabin), analoge purina (npr. merkaptopurin, tiogvanin, pentostatin). Primeri biljnih alkaloida i terpenoida ili njihovih derivata obuhvataju, ali nisu ograničeni na vinka alkaloide (npr. vinkristin, vinblastin, vinorelbin, vindesin), podofilotoksin, i taksane (npr. paklitaksel, docetaksel). Primeri inhibitora topoizomeraze obuhvataju, ali nisu ograničeni na irinotekan, topotekan, amsakrin, etopozid, etopozid fosfat i tenipozid. Primeri antineoplastičnih agenasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na aktinomicin, antracikline (npr. doksorubicin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin, epirubicin), bleomicin, plicamicin i mitomicin.

U jednom primeru izvođenja, anti-kancerski agensi koji se mogu upotrebiti u predmetnim otkrivanjima obuhvataju sledeće: Adriamicin, Daktinomicin, Bleomicin, Vinblastin, Cisplatin, acivicin; aklarubicin; akodazol hidrohlorid; akronin; adozelesin; aldesleukin; altretamin; ambomicin; ametantron acetat; aminoglutetimid; amsakrin; anastrozol; antramicin; asparaginazu; asperlin; azacitidin; azetepa; azotomicin; batimastat; benzodepa; bikalutamid; bisantren hidrohlorid; bisnafid dimezilat; bizelesin; bleomicin sulfat; brekvinar natrijum; bropirimin; busulfan; kaktinomicin; kalusteron; karacemid; karbetimer; karboplatin; karmustin; karubicin hidrohlorid; karzelesin; cedefingol; hlorambucil; cirolemicin; kladribin; krisnatol mezilat; ciklofosfamid; citarabin; dakarbazin; daunorubicin hidrohlorid; decitabin; deksormaplatin; dezagvanin; dezagvanin mezilat; diazikvon; doksorubicin; doksorubicin hidrohlorid; droloksifen; droloksifen citrat; dromostanolon propionat; duazomicin; edatreksat; eflornitin hidrohlorid; elsamitrucin; enloplatin; enpromat; epipropidin; epirubicin hidrohlorid; erbulozol; ezorubicin hidrohlorid; estramustin; estramustin fosfat natrijum; etanidazol; etopozid; etopozid fosfat; etoprin; fadrozol hidrohlorid; fazarabin; fenretinid; floksuridin; fludarabin fosfat; fluorouracil; flurocitabin; foskvidon; fostriecin natrijum; gemcitabin; gemcitabin hidrohlorid; hidroksiurea; idarubicin hidrohlorid; ifosfamid; ilmofozin; interleukin II (uključujući rekombinantni interleukin II, ili rIL2), interferon alfa-2a; interferon alfa-2b; interferon alfa-n1 ; interferon alfa-n3; interferon beta-I a; interferon gamma-I b; iproplatin; irinotekan hidrohlorid; lanreotid acetat; letrozol; leuprolid acetat; liarozol hidrohlorid; lometreksol natrijum; lomustin; losoksantron hidrohlorid; masoprokol; majtansin; mehloretamin hidrohlorid; megestrol acetat; melengestrol acetat; melfalan; menogaril; merkaptopurin; metotreksat; metotreksat natrijum; metoprin; meturedepa; mitindomid; mitokarcin; mitokromin; mitogilin; mitomalcin; mitomicin; mitosper; mitotan; mitoksantron hidrohlorid; mikofenolna kiselina; nokodazol; nogalamicin; ormaplatin; oksisuran; pegaspargaza; peliomicin; pentamustin; peplomicin sulfat; perfosfamid; pipobroman; piposulfan; piroksantron hidrohlorid; plikamicin; plomestan; porfimer natrijum; porfiromicin; prednimustin; prokarbazin hidrohlorid; puromicin; puromicin hidrohlorid; pirazofurin; riboprin; rogletimid; safingol; safingol hidrohlorid; semustin; simtrazen; sparfosat natrijum; sparsomicin; spirogermanijum hidrohlorid; spiromustin; spiroplatin; streptonigrin; streptozocin; sulofenur; talizomicin; tekogalan natrijum; tegafur; teloksantron hidrohlorid; temoporfin; tenipozid; teroksiron; testolakton; tiamiprin; tiogvanin; tiotepa; tiazofurin; tirapazamin; toremifen citrat; trestolon acetat; triciribin fosfat; trimetreksat; trimetreksat glukuronat; triptorelin; tubulozol hidrohlorid; uracil slačica; uredepa; vapreotid; verteporfin; vinblastin sulfat; vinkristin sulfat; vindesin; vindesin sulfat; vinepidin sulfat; vinglicinat sulfat; vinleurosin sulfat; vinorelbin tartrat; vinrozidin sulfat; vinzolidin sulfat; vorozol; zeniplatin; zinostatin; zorubicin hidrohlorid.

Još neki anti-kancerski agensi/lekovi koji se mogu primeniti u predmetnim otkrivanjima obuhvataju, ali nisu ograničeni na sledeće: 20-epi-1,25 dihidroksivitamin D3; 5-etiniluracil; abirateron; aklarubicin; acilfulven; adecipenol; adozelesin; aldesleukin; ALL-TK antagonisti; altretamin; ambamustin; amidoks; amifostin; aminolevulinska kiselina; amrubicin; amsakrin; anagrelid; anastrozol; andrografolid; inhibitori angiogeneze; antagonist D; antagonist G; antareliks; anti-dorsalizirajući morfogenetski protein-1; antiandrogen, prostatični karcinom; antiestrogen; antineoplaston; antisensni oligonukleotidi; afidikolin glicinat; modulatori gena apoptoze; regulatori apoptoze; apurinska kiselina; ara-CDP-DL-PTBA; arginin deaminaza; asulakrin; atamestan; atrimustin; aksinastatin 1; aksinastatin 2; aksinastatin 3; azasetron; azatoksin; azatirozin; bakatin III derivati; balanol; batimastat; BCR/ABL antagonisti; benzohlorini; benzoilstaurosporin; beta laktamski derivati; beta-aletin; betaklamicin B; betulinska kiselina; bFGF inhibitor; bikalutamid; bisantren; bisaziridinilspermin; bisnafid; bistraten A; bizelesin; breflat; bropirimin; budotitan; butionin sulfoksimin; kalcipotriol; kalfostin C; derivati kamptotecina; kanaripoks IL-2; kapecitabin; karboksamid-amino-triazol; karboksiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibitor koji potiče iz hrskavice; karzelesin; kazeinski inhibitori kinaze (ICOS); kastanospermin; cekropin B; cetroreliks; hlorlni; hlorokvinoksalin sulfonamid; cikaprost; cis-porfirin; kladribin; analozi klomifena; klotrimazol; kolismicin A; kolismicin B; kombretastatin A4; analog kombretastatina; konagenin; krambescidin 816; krisnatol; kriptoficin 8; derivati kriptoficina A; kuracin A; ciklopentantrakvinoni; cikloplatam; cipemicin; citarabin okfosfat; citolitički faktor; citostatin; dakliksimab; decitabin; dehidrodidemnin B; deslorelin; deksametazon; deksifosfamid; deksrazoksan; deksverapamil; diazikvon; didemnin B; didoks; dietilnorspermin; dihidro-5-azacitidin; 9- dioksamicin; difenil spiromustin; dokosanol; dolasetron; doksifluridin; droloksifen; dronabinol; duokarmicin SA; ebselen; ekomustin; edelfozin; edrecolomab; eflornitin; elemen; emitefur; epirubicin; epristerid; analog estramustina; agonisti estrogena; antagonisti estrogena; etanidazol; etopozid fosfat; eksemestan; fadrozol; fazarabin; fenretinid; filgrastim; finasterid; flavopiridol; flezelastin; fluasteron; fludarabin; fluorodaunorunicin hidrohlorid; forfenimeks; formestan; fostriecin; fotemustin; gadolinijum teksafirin; galijum nitrat; galocitabin; ganireliks; inhibitori želatinaze; gemcitabin; inhibitori glutationa; hepsulfam; heregulin; heksametilen bisacetamid; hipericin; ibandronska kiselina; idarubicin; idoksifen; idramanton; ilmofozin; ilomastat; imidazoakridoni; imikvimod; imunostimulantni peptidi; inhibitor receptora insulinu sličnog faktora rasta-1; agonisti interferona; interferoni; interleukini; jobengvan; jododoksorubicin; ipomeanol, 4-; iroplakt; irsogladin; izobengazol; izohomohalikondrin B; itasetron; jasplakinolid; kahalalid F; lamelarin-N triacetat; lanreotid; leinamicin; lenograstim; lentinan sulfat; leptolstatin; letrozol; inhibirajući faktor leukemije; leukocitni alfa interferon; leuprolid+estrogen+progesteron; leuprorelin; levamizol; liarozol; linearni poliaminski analog; lipofilni disaharidni peptid; lipofilna jedinjenja platine; lisoklinamid 7; lobaplatin; lombricin; lometreksol; lonidamin; losoksantron; lovastatin; loksoribin; lurtotekan; lutecijum teksafirin; lizofilin; litični peptidi; maitansin; manostatin A; marimastat; masoprokol; maspin; inhibitori matrilizina; inhibitori matriksa metaloproteinaze; menogaril; merbaron; meterelin; metioninaza; metoklopramid; MIF inhibitor; mifepriston; miltefozin; mirimostim; pogrešno uparena dvolančana RNK; mitogvazon; mitolaktol; analozi mitomicina; mitonafid; mitotoksin faktor rasta fibroblastasaporin; mitoksantron; mofaroten; molgramostim; monoklonsko antitelo, humani horionski gonadotrofin; monofosforil lipid A+miobakterijumski ćelijski zid sk; mopidamol; inhibitor gena višestruke rezistencije na lekove; terapija bazirana na višestrukom tumorskom supresoru 1; slačicin antikancerski agens; mikaperoksid B; ekstrakt ćelijskog zida mikobaktera; miriaporon; N-acetildinalin; N-supstituisani benzamidi; nafarelin; nagrestip; nalokson+pentazocin; napavin; nafterpin; nartograstim; nedaplatin; nemorubicin; neridronska kiselina; neutralna endopeptidaza; nilutamid; nisamicin; modulatori azotnog oksida; nitroksidni antioksidans; nitrulin; O6-benzilgvanin; oktreotid; okicenon; oligonukleotidi; onapriston; ondansetron; ondansetron; oracin; oralni citokinski induktor; ormaplatin; osateron; oksaliplatin; oksaunomicin; palauamin; palmitoilrizoksin; pamidronska kiselina; panaksitriol; panomifen; parabaktin; pazeliptin; pegaspargaza; peldesin; pentosan polisulfat natrijum; pentostatin; pentrozol; perflubron; perfosfamid; perilil alkohol; fenazinomicin; fenilacetat; inhibitori fosfataze; picibanil; pilokarpin hidrohlorid; pirarubicin; piritreksim; placetin A; placetin B; inhibitor plazminogenskog aktivatora; kompleks platine; jedinjenja platine; kompleks platina-triamin; porfimer natrijum; porfiromicin; prednizon; propil bisakridon; prostaglandin J2; inhibitori proteazoma; imuni modulator na bazi proteina A; inhibitor proteinske kinaze C; inhibitori proteinske kinaze C, mikroalgal; inhibitori proteinske tirozin fosfataze; inhibitori purin nukleozidne fosforilaze; purpurini; pirazoloakridin; piridoksilovani konjugat hemoglobina polioksietilena; raf antagonisti; raltitreksed; ramosetron; inhibitori ras farnezil proteinske transferaze; ras inhibitori; ras-GAP inhibitor; reteliptin demetilovani; renijum Re 186 etidronat; rizoksin; ribozimi; RII retinamid; rogletimid; rohitukin; romurtid; rokvinimeks; rubiginon B1; ruboksil; safingol; saintopin; SarCNU; sarkofitol A; sargramostim; Sdi 1 mimetici; semustin; senescensno dobijeni inhibitor 1; sensni oligonukleotidi; inhibitori transdukcije signala; modulatori transdukcije signala; jednolančani protein koji se vezuje za antigen; sizofiran; sobuzoksan; natrijum borokaptat; natrijum fenilacetat; solverol; somatomedin vezujući protein; sonermin; sparfosična kiselina; spikamicin D; spiromustin; splenopentin; spongistatin 1; skvalamin; inhibitor matičnih ćelija; inhibitori deobe matičnih ćelija; stipiamid; inhibitori stromelizina; sulfinozin; antagonist superaktivnog vazoaktivnog intestinalnog peptida; suradista; suramin; svainsonin; sintetički glikozaminoglikani; talimustin; tamoksifen metjodid; tauromustin; tazaroten; tekogalan natrijum; tegafur; telurapirilijum; inhibitori telomeraze; temoporfin; temozolomid; tenipozid; tetrahlorodekaoksid; tetrazomin; taliblastin; tiokoralin; trombopoietin; trombopoietin mimetik; timalfazin; agonist timopoietinskog receptora; timotrinan; tiroidni stimulišući hormon; kalaj etil etiopurpurin; tirapazamin; titanocen bihlorid; topsentin; toremifen; totipotentni faktor matičnih ćelija; inhibitori translacije; tretinoin; triacetiluridin; triciribin; trimetreksat; triptorelin; tropisetron; turosterid; inhibitori tirozin kinaze; tirfostini; UBC inhibitori; ubenimeks; urogenitalni inhibitorni faktor rasta dobijen iz sinusa; antagonisti receptora urokinaze; vapreotid; variolin B; vektorski sistem, eritrocitna genska terapija; velarezol; veramin; verdini; verteporfin; vinorelbin; vinksaltin; vitaksin; vorozol; zanoteron; zeniplatin; zilaskorb; i zinostatin stimalamer. Poželjni dodatni anti-kancerski lekovi su 5-fluorouracil i leukovorin.

U jednom primeru izvođenja, anti-kancerski agensi koji se mogu upotrebiti u ovde opisanim metodama su izabrani iz grupe koja se sastoji od sledećih: paklitaksel, docetaksel, 5-fluorouracil, trastuzumab, lapatinib, bevacizumab, letrozol, goserelin, tamoksifen, cetuksimab, panitumumab, gemcitabin, kapecitabin, irinotekan, oksaliplatin, karboplatin, cisplatin, doksorubicin, epirubicin, ciklofosfamid, metotreksat, vinblastin, vinkristin, melfalan i njihova kombinacija.

U jednom primeru izvođenja, anti-kancerski agens i jedinjenje predstavljeno strukturnom formulom (I) se daju istovremeno. Kada se daju istovremeno, anti-kancerski agens i jedinjenje se mogu davati u istoj formulaciji ili u različitim formulacijama. Alternativno tome, jedinjenje i dodatni anti-kancerski agens se daju odvojeno. Alternativno tome, jedinjenje i dodatni anti-kancerski agens se mogu davati sukcesivno, kao posebne kompozicije, u okviru podesnog vremenskog okvira (npr. sesije/intervala lečenja kancera (npr. od oko 1.5 do oko 5 sati do oko 10 sati do oko 15 sati do oko 20 sati; od oko 1 dana do oko 2 dana do oko 5 dana do oko 10 dana do oko 14 dana)) koji je odredio stručni ordinirajući lekar (npr. vreme koje je dovoljno da se omogući preklapanje farmaceutskih efekata terapija). Jedinjenje i dodatni anti-kancerski agens se mogu davati u samo jednoj dozi ili u više doza po redosledu i po rasporedu koji su podesni za ostvarivanje željenog terapeutskog efekta (npr. inhibiciju rasta tumora).

U jednom primeru izvođenja, subjekt u ovde opisanim metodama nije bio prethodno lečen sa TTK inhibitorom (npr. jedinjenjem predstavljenim strukturnom formulom (I).

Izraz “inhibiranje rasta ćelija koje iniciraju tumor” se odnosi na smanjenje brzine proliferacije i/ili preživljavanja ćelija koje iniciraju tumor.

Kada se ovde koristi, izraz “smanjenje verovatnoće vraćanja kancera” označava delimičnu ili potpunu inhibiciju, odlaganje povratka kancera na ili u blizini primarnog mesta i/ili na sekundarnom mestu posle perioda remisije. On takođe znači da je manje verovatno da se kancer vrati sa ovde opisanim lečenjem nego u njegovom odsustvu.

Kada se ovde koristi, izraz “remisija” se odnosi na stanje kancera, pri čemu su klinički simptomi ili indikatori povezani sa kancerom nestali ili ne mogu biti detektovani, obično pošto je subjekt bio uspešno lečen anti-kancerskom terapijom.

Kada se ovde koristi, “lečenje” je pristup za dobijanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate. Korisni ili željeni klinički rezultati obuhvataju, ali nisu ograničeni na ublažavanje jednog ili više simptoma ili stanja, smanjenje obima bolesti, stabilizovano (tj. nepogoršano) stanje bolesti, smanjenje verovatnoće širenja bolesti, odlaganje ili usporavanje širenja bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, ublažavanje ili umirivanje stanja bolesti, bilo da je detektabilno ili nedetektabilno. “Lečenje” takođe može značiti produženo preživljavanje u poređenju sa očekivanim preživljavanjem bez dobijanja lečenja. “Lečenje” takođe obuhvata smanjenje verovatnoće ponovne pojave bolesti.

Kada se ovde koristi, “lečenje subjekta sa kancerom” obuhvata ostvarivanje, delimično ili potpuno, jednog ili više od sledećih: zaustavljanje rasta, smanjenje obima kancera (npr. smanjenje veličine tumora), inhibiciju brzine rasta kancera, ublažavanje ili poboljšanje kliničkog simptoma ili indikatora povezanog sa kancerom (kao što su komponente tkiva ili seruma) ili povećanje životnog veka subjekta; i smanjenje verovatnoće vraćanja kancera.

Generalno, efektivna količina ovde opisanog jedinjenja varira u zavisnosti od različitih faktora, kao što je davani lek ili jedinjenje, farmaceutska formulacija, način administracije, tip bolesti ili poremećaja, identitet subjekta ili domaćina koji se leči i sličnog, ali je ipak može rutinski odrediti stručnjak iz odgovarajuće oblasti. Efektivna količina jedinjenja prema predmetnim otkrivanjima može biti lako određena od strane prosečnog stručnjaka rutinskim metodama koje su poznate iz odgovarajuće oblasti.

Izraz “efektivna količina” označava količinu koja kada se daje subjektu rezultuje korisnim ili željenim rezultatima, uključujući kliničke rezultate, npr. inhibira, potiskuje ili smanjuje kancer (npr. kao što se određuje kliničkim simptomima ili količinom ćelija kancera) kod subjekta u poređenju sa kontrolom.

U jednom primeru izvođenja, efektivna količina ovde opisanog jedinjenja se nalazi u opsegu od oko 0.1 do oko 1000 mg/kg telesne težine, alternativno tome od oko 1 do oko 500 mg/kg telesne težine, u sledećoj varijanti, od oko 20 do oko 300 mg/kg telesne težine. U sledećem primeru izvođenja, efektivna količina ovde opisanog jedinjenja se nalazi u opsegu od oko 0.5 do oko 5000 mg/m<2>, alternativno tome od oko 5 do oko 2500 mg/m<2>, i u sledećoj varijanti od oko 50 do oko 1000 mg/m<2>. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će proceniti da izvesni faktori mogu uticati na doziranje koje je potrebno za efektivno lečenje subjekta koji boluje od kancera ili smanjenje verovatnoće vraćanja kancera. Ovi faktori obuhvataju, ali nisu ograničeni na ozbiljnost bolesti ili poremećaja, prethodna lečenja, opšte zdravstveno stanje i/ili starost subjekta i druge prisutne bolesti.

Pored toga, za ovde opisane metode (uključujući lečenje subjekta sa kancerom ili smanjenje verovatnoće vraćanja kancera), “lečenje” ili režim doziranja subjekta efektivnom količinom jedinjenja prema predmetnim otkrivanjima mogu se sastojati od samo jedne administracije, ili alternativno tome, sadrže niz aplikacija. Na primer, jedinjenje prema predmetnim otkrivanjima se može davati najmanje jednom nedeljno. Međutim, u sledećem primeru izvođenja, jedinjenje se može davati subjektu od oko jednom nedeljno do jednom dnevno za dato lečenje. Dužina perioda lečenja zavisi od mnoštva faktora, kao što je ozbiljnost bolesti, starost pacijenta, koncentracija i aktivnost jedinjenja prema predmetnim otkrivanjima, ili njihove kombinacije. Takođe se ceni da se efektivno doziranje jedinjenja koje se koristi za lečenje može povećati ili smanjiti u toku specifičnog režima lečenja. Promene doziranja mogu rezultovati i postati očigledne na osnovu standardnih dijagnostičkih testova koji su poznati iz odgovarajuće oblasti. U nekim slučajevima, može biti potrebna hronična administracija.

“Subjekt” je sisar, a prvenstveno čovek, ali takođe može biti životinja kojoj je potrebno veterinarsko lečenje, npr. kućni ljubimci (npr. psi, mačke i slično), stoka (npr. krave, ovce, svinje, konji i slično) i laboratorijske životinje (npr. pacovi, miševi, zamorčići i slično).

Ovde opisana jedinjenja se pacijentu mogu davati u različitim oblicima u zavisnosti od izabranog načina administracije, kao što će shvatiti stručnjaci iz odgovarajuće oblasti. Jedinjenja prema predmetnim otkrivanjima mogu se davati, na primer, oralnom, parenteralnom, bukalnom, sublingvalnom, nazalnom, rektalnom administracijom, pomoću flastera, pumpe ili transdermalnom administracijom i farmaceutskim kompozicijama koje su formulisane u skladu sa time. Parenteralna administracija obuhvata intravenski, intraperitonealni, subkutani, intramuskularni, transepitelni, nazalni, intrapulmonarni, intratekalni, rektalni i topički način administracije. Parenteralna administracija može biti pomoću kontinualne infuzije tokom izabranog vremenskog perioda.

Ovde opisana jedinjenja mogu biti podesno formulisana u farmaceutske kompozicije za administraciju subjektu. Farmaceutske kompozicije prema predmetnim otkrivanjima opciono sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili razređivača za njih, kao što su laktoza, skrob, celuloza i dekstroza. Takođe mogu biti uključeni drugi ekscipijensi, kao što su arome; zaslađivači; i konzervansi, kao što su metil, etil, propil i butil parabens,. Detaljnije liste podesnih ekscipijenasa se mogu naći u Handbook of Pharmaceutical Excipients (5. izd., Pharmaceutical Press (2005)). Stručnjak iz odgovarajuće oblasti bi znao kako da pripremi formulacije koje su podesne za različite tipove načina administracije. Uobičajene procedure i sastojci za izbor i pripremu podesnih formulacija su opisani, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences (2003 - 20. izdanje) i The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19) objavljenoj 1999. Nosači, razređivači i/ili ekscipijensi su “prihvatljivi” u smislu da su kompatibilni sa drugim sastojcima farmaceutske kompozicije i da nisu škodljivi za njenog primaoca.

Obično, za oralnu terapeutsku administraciju, jedinjenje prema predmetnim otkrivanjima može biti inkorporirano sa ekscipijensom i upotrebljeno u obliku tableta za gutanje, bukalnih tableta, lozengi, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafli i sličnog.

Obično za parenteralnu administraciju, rastvori jedinjenja prema predmetnim otkrivanjima generalno mogu da se pripreme u vodi podesno pomešani sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima, DMSO i njihovim smešama sa ili bez alkohola, i u uljima. Pod uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervanse za sprečavanje rasta mikroorganizama.

Obično su za injektabilnu upotrebu podesni sterilni vodeni rastvori ili disperzije i sterilni praškovi ovde opisanih jedinjenja za ekstemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija.

Za nazalnu administraciju, jedinjenja prema predmetnim otkrivanjima mogu biti formulisana kao aerosoli, kapi, gelovi i praškovi. Formulacije aerosola obično sadrže rastvor ili finu suspenziju aktivne supstance u fiziološki prihvatljivom vodenom ili nevodenom rastvaraču i obično su prisutne u količinama za jednu ili više doza u sterilnom obliku u zatvorenom kontejneru, koji može imati oblik patrone ili zamenskog punjenja za upotrebu sa uređajem za atomizaciju. Alternativno tome, zatvoreni kontejner može biti unitarni uređaj za izdavanje kao što je nazalni inhalator za jednu dozu ili dispenzator za aerosol opremljen sa dozirnim ventilom koji je namenjen za odbacivanje posle upotrebe. Kada dozirani oblik sadrži dispenzator za aerosol, on će sadržati propelant koji može biti komprimovani gas, kao što je komprimovani vazduh ili organski propelant kao što je fluorohlorougljovodonik. Dozirani oblici aerosola takođe mogu imati oblik pumpe-atomizera.

Za bukalnu ili sublingvalnu administraciju, jedinjenja prema predmetnim otkrivanjima mogu biti formulisana sa nosačem kao što je šećer, akacija, tragakanta, ili želatin i glicerin, kao tablete, lozenge ili pastile.

Za rektalnu administraciju, ovde opisana jedinjenja se mogu formulisati u obliku supozitorija koje sadrže uobičajenu bazu za supozitorije, kao što je kakao puter.

Jedinjenja prema pronalasku se mogu pripremiti metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, kao što je prikazano opštim šemama i procedurama u nastavku i primerima pripremanja koji slede. Svi polazni materijali su komercijalno raspoloživi ili se pripremaju metodama koje su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti i dole opisanim procedurama.

Prema sledećem aspektu predmetnog pronalaska, jedinjenja prema pronalasku se mogu pripremiti procesima koji su analogni onima koji su uspostavljeni u odgovarajućoj oblasti. Opšte metode za sintezu jedinjenja za koja se traži zaštita su elaborirane dole u Primeru A.

PRIMERI

Primer A: Sinteza

Opšte metode

Komercijalno raspoloživi polazni materijali, reagensi i rastvarači su bili upotrebljeni onakvi kakvi su primljeni. Generalno, anhidrovane reakcije su bile izvedene pod inertnom atmosferom, kao što su azot ili argon. PoraPak<®>Rxn CX se odnosi na komercijalnu katjonoizmenjivačku smolu koja se može nabaviti od firme Waters.

Mikrotalasne reakcije su bile izvedene pomoću Biotage Initiator mikrotalasnog reaktora. Napredovanje reakcije je generalno bilo praćeno pomoću TLC uz korišćenje Merck silika gel ploča sa vizualizacijom pomoću UV na 254 nm, analitičke HPLC ili pomoću LCMS (Bruker Exquire 4000 ili Waters Acquity UPLC sistem). Prečišćavanje međuproizvoda ili finalnih proizvoda fleš kolonskom hromatografijom je bilo izvedeno uz korišćenje silika gela 60 sa 230-400 meša firme EMD chemicals ili Silicycle, ili prečišćavanjem uz korišćenje Biotage Isolera sa KP-SIL ili HP-SIL patrona sa silikom, ili KP-NH bazno modifikovane silike i odgovarajućih uzoraka. Reverzno-fazno HPLC prečišćavanje je bilo izvedeno na Varian PrepStar modelu SD-1 HPLC sistema sa Varian Monochrom 10µ C-18 reverzno-faznom kolonom uz korišćenje oko 5-30% MeCN ili MeOH/0.05% TFA-H2O do 70-90% MeCN ili MeOH/0.05% TFA u H2O u toku period od 20-40-min sa protokom od 30-80 mL/min. Reverzno-fazno prečišćavanje je takođe bilo izvedeno uz korišćenje Biotage Isolera opremljenog sa KP-C18-H kolonom korišćenjem između 10-95% MeOH ili CH3CN/ 0.1% TFA u H2O. Protonske NMRs su bile snimljene na Bruker 400 MHz spektrometru, a maseni spektri su bili dobijeni korišćenjem Bruker Esquire 4000 spektrometra ili Waters Acquity UPLC sistema.

Imena jedinjenja su bila generisana korišćenjem softvera ugrađenog u CambridgeSoft-PerkinElmer’s ChemBioDraw Ultra version 11.0 ili 12.0.

Skraćenice:

aq vodeni

Ar argon

Boc terc-butoksikarbonil

br. široki

izrač izračunati

d dublet

DCM dihlorometan

DIPEA diizopropiletilamin

DMF N,N-dimetilformamid

DMSO dimetilsulfoksid

dppf 1,1'- bis(difenilfosfino) ferocen

h sat

HPLC tečna hromatografija visokih performansi

LC-MS tečna hromatografija kuplovana sa masenom spektrometrijom

min minut

m multiplet

MS ESI maseni spektri, elektrosprej jonizacija

NMR nuklearna magnetna rezonanca

O/N preko noći

PE petrol etar

PMB para-metoksibenzil

prep preparativni

st sobna temperatura

s singlet

t triplet

TFA trifluorosirćetna kiselina

THF tetrahidrofuran

Međuproizvodi:

4-bromo-N-ciklopropil-2-metilbenzamid

Suspenziji 4-bromo-2-metilbenzojeve kiseline (43.0 g, 200 mmol) i oksalil dihlorida (30.5 g, 240 mmol) u DCM (300 mL) je bio dodat DMF (0.1 mL).

Rezultujuća reakciona smeša je bila mešana na st tokom 16 h. Reakcija

se polako pretvarala u bistri žuti rastvor preko 16 h. Rastvarač je bio onda odstranjen in vacuo, a sirovi proizvod je bio upotrebljen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. Sirovi proizvod je ponovo rastvoren u DCM (300 mL), pa je ohlađen na 0<o>C. Smeša TEA (42 mL, 300 mmol) i ciklopropilamina (12.6 g, 220 mmol) u DCM (100 mL) je bila dodavana polako preko 15 min, a rezultujuća smeša je bila mešana na st tokom 2 h. Reakcija je bila razređena sa DCM (200 mL), pa je bila dodata voda. Rezultujuća smeša je bila ekstrahovana sa DCM, a sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko MgSO4i koncentrisani da bi se dobio željeni proizvod u vidu bledo ružičaste čvrste materije (50.1 g, 99%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.37 (s, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.93 (br. s, 1H), 2.90-2.85 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 0.90-0.85 (m, 2H), 0.62-0.58 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>253.9, izrač. za [C11H12BrNO H]<+>254.0.

N-(4-bromo-2-metilfenil)ciklopropankarboksamid

U 100 mL RBF, 4-bromo-2-metilanilin (3.7 g, 20 mmol) i DIPEA (6.95 mL, 40 mmol) su bili sjedinjeni sa DMF (40 mL). Reakcija je bila

ohlađena na 0 ºC u ledenom kupatilu, pa je bio dodat

ciklopropankarbonil hlorid (2.1 g, 20 mmol). Smeša je bila mešana na 0 ºC tokom 1 h. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Organski slojevi su bili sjedinjeni, te su osušeni preko Na2SO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani pod smanjenim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste materije (4.76 g, 94%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.85-7.72 (m, 1H), 7.38-7.28 (m, 2H), 7.15-7.02 (m, 1H), 2.27 (s, 3H), 1.57-1.48 (m, 1H), 1.10 (kvint, J = 3.9 Hz, 2 H), 0.92-0.79 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>253.9, izrač. za [C11H12BrNO H]<+>254.0.

N-ciklopropil-2-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)benzamid

Smeša 4-bromo-N-ciklopropil-2-metilbenzamida (3.73 g, 14 mmol), bis(pinakolato)dibora (5.59 g, 22 mmol), i KOAc (4.29 g, 43 mmol) u DMF (37 mL) je bila prečišćavana sa Ar tokom 10 min na st. Onda je

bio dodat PdCl2(dppf)·DCM (0.59 g, 5 mol%), pa je reakcija bila

zagrevana na 100<o>C u uljnom kupatilu tokom 4 h. Posle završetka reakcije reakciona masa je bila razređena sa EtOAc (200 mL) i H2O (100 mL). Sjedinjeni sloj je bio isfiltriran kroz celitni umetak, pa je ispran sa malo EtOAc. Aq. sloj je dalje bio ekstrahovan sa EtOAc (50 mL), pa je sjedinjeni organski sloj bio ispran slanim rastvorom, te je osušen preko Na2SO4, a onda je isfiltriran i koncentrisan da bi se dobio sirovi uljani ostatak. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 0-100%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu čvrste materije krem boje (4.15 g, 94%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.66 (s, 1H), 7.63-7.61 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.32-7.30 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.85 (s, 1 H), 2.93-2.87 (m, 1H), 2.46 (s, 3H), 1.35 (s, 12H), 0.90-0.86 (m, 2H), 0.63-0.59 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>302.2, izrač. za [C17H24BNO3+ H]<+>302.2.

3-bromo-5,7-dihloropirazolo[1,5-a]pirimidin

Mešanom rastvoru natrijum etoksida u EtOH, koji je bio pripremljen od natrijuma (281.3 g, 12.0 mol) i EtOH (10 L) konvencionalnim metodom, bili

su dodati dietil malonat (963.7 g, 6.02 mol) na temperaturi okruženja, pa

onda jedinjenje 1H-pirazol-3-amin (500 g, 6.02 mol). Reakciona smeša je refluksovala tokom 12 sati. Posle hlađenja do sobne temperature, talozi su bili isfiltrirani, pa su rastvoreni u vodi. Vodeni rastvor je bio zakišeljen sa 2 M HCl (pH = 2). Rezultujući talozi su bili isfiltrirani i osušeni pod smanjenim pritiskom da bi se dobio pirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7(4H,6H)-dion (649 g, 71%) u vidu žute čvrste materije, koja je bila upotrebljena za sledeću reakciju bez daljeg prečišćavanja.

Mešana suspenzija pirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7(4H,6H)-diona (265 g, 1.75 mol) i N,N-dimetilanilina (335.6 mL) u POCl3(2.00 kg, 13.2 mol) je refluksovala tokom 4 sata. Posle hlađenja na sobnu temperaturu, reakciona smeša je bila izlivena u led-vodu, pa je mešana tokom 30 min, te je neutralizovana zasićenim vodenim natrijum karbonatom i ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski slojevi su bili isprani sa vodom, slanim rastvorom, pa su osušeni preko MgSO4, isfiltrirani su i upareni. Ostatak je bio prečišćen kolonskom hromatografijom na silika gelu (gradijent: EtOAc/PE 1:10) da bi se dobio 5,7-dihloropirazolo[1,5-a]pirimidin (287 g, 87%) u vidu žute čvrste materije.

Rastvoru 5,7-dihloropirazolo[1,5-a]pirimidina (246.6 g, 1.31 mol) u CH3CN (1.8 L) je bio dodat NBS (245 g, 1.38 mol ). Rezultujuća smeša je bila mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Posle odstranjivanja rastvora, reakciona smeša je bila prečišćena kolonskom hromatografijom na silika gelu (gradijent: EtOAc/PE 1:5) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (313.5 g, 89%) u vidu svetlo žute čvrste materije.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm 7.04 (s, 1H), 8.21 (s, 1H); MS ESI [M H]<+>265.9, izrač. za [C6H2BrCl2N3+ H]<+>265.9.

3-bromo-5-hloro-N-(ciklopropilmetil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin

Rastvoru 3-bromo-5,7-dihloropirazolo[1,5-a]pirimidina (5.0 g, 19 mmol) u DCM (50 mL) su bili dodati ciklopropilmetanamin (1.48 g, 21 mmol) i DIPEA (6.6 mL, 38 mmol). Reakcija je bila mešana na st tokom 2 h. Bili su dodati

voda i DCM da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana

sa DCM. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko NaSO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 0-50%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu žute čvrste materije (5.25 g, 92%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.97 (s, 1H), 6.50 (br. s, 1H), 5.97 (s, 1H), 3.25 (dd, J = 7.3, 5.5 Hz, 2H), 1.26-1.13 (m, 1H), 0.74-0.65 (m, 2H), 0.37 (q, J = 5.0 Hz, 2H); MS ESI [M H]<+>301.0, izrač. za [C10H10BrClN4+ H]<+>301.0.

(1s,3s)-3-(((3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino)metil)-1-metilciklobutanol Rastvoru 3-bromo-5,7-dihloropirazolo[1,5-a]pirimidina (14.6 g, 55.3 mmol) u DCM (200 mL) su bili dodati cis-hidroksi-3-metilciklobutan-1-

metilamin (7.0 g, 60.9 mmol), i DIPEA (19.2 mL, 110.6 mmol). Reakcija

je bila mešana na st tokom 16 h. Bili su dodati voda i DCM da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa DCM. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko Na2SO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu žute čvrste materije (18.1 g, 95%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.96 (s, 1 H), 6.60-6.49 (m, 1H), 5.99 (s, 1H), 3.47 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.38-2.27 (m, 3H), 1.96-1.85 (m, 2H), 1.43 (s, 3H); MS ESI [M H]<+>345.1, izrač. za [C12H14BrClN4O H]<+>345.0.

Terc-butil (3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(ciklopropilmetil)karbamat Rastvoru 3-bromo-5-hloro-N-(ciklopropilmetil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (5.25 g, 17.5 mmol) u DCM (150 mL) su bili dodati Boc2O (5.70 g, 26.2 mmol), DMAP (0.21 g, 1.75 mmol), i TEA (7.3 mL, 52.5 mmol).

Reakcija je bila mešana na st tokom 4 h. Bili su dodati voda i DCM da bi se

razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa DCM. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko MgSO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 0-40 %) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu žute čvrste materije (6.24 g, 89%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.12 (s, 1H), 6.85 (s, 1H), 3.72 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.05-0.94 (m, 1H), 0.46-0.37 (m, 2H), 0.13-0.03 (m, 2H); MS ESI [M – C4H8]<+>345.0, izrač. za [C15H18BrClN4O2– C4H8]<+>345.0.

Terc-butil (3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(((1s,3s)-3-((tercbutoksikarbonil)oksi)-3-metilciklobutil)metil)karbamat

Rastvoru (1s,3s)-3-(((3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino)metil)-1-metilciklobutanola (18.1 g, 52.6 mmol), Boc2O

(34.3 g, 158 mmol), i ), i TEA (22 mL, 157.8 mmol) u DCM (200

mL) je bio dodat DMAP (1.28 g, 10.5mmol). Reakcija je bila mešana na 40 °C tokom 16 h. Rastvarač je bio odstranjen in vacuo, pa su bili dodati voda i DCM da bi se razdvojile faze, te je vodena faza bila ekstrahovana sa DCM. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko NaSO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (3 Biotage 100g SiO2kolone paralelno, gradijent: EtOAc/heks 0-30%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu bež čvrste materije (12.7 g, 44%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.11 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.88 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 2.17 (s, 3H), 1.99-1.88 (m, 2H), 1.47 (s, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.35 (s, 9H); MS ESI [M H]<+>545.1, izrač. za [C22H30BrClN4O5+ H]<+>545.1.

(1s,3s)-3-(((3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(4-metoksibenzil)amino)metil)-1-metilciklobutanol

Rastvoru (1s,3s)-3-(((3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino)metil)-1-metilciklobutanola (12.0 g, 34.7 mmol) i 4-

metoksibenzil hlorida (5.2 mL, 38.2 mmol) u DMF (50 mL) je bio dodat

K2CO3(9.6 g, 69.4 mmol). Rezultujuća smeša je bila mešana na 60�C tokom 3 h. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili isprani sa vodom, a zatim su osušeni preko MgSO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 10-100%) uz korišćenje tri kolone paralelno. Nečiste frakcije su bile izdvojene, te su prečišćene pomoću fleš hromatografije uz korišćenje gore navedenih uslova. Čiste frakcije su bile sjedinjene i koncentrisane da bi se dobio željeni proizvod u vidu bledo žute čvrste materije (13.1 g, 81%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.01 (s, 1H), 7.17 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.02 (s, 1H), 4.98 (s, 2H), 3.83 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.25-2.16 (m, 3H), 1.76-1.72 (m, 2H), 1.36 (s, 3H); MS ESI [M H]<+>467.1, izrač. za [C20H22BrClN4O2+ H]+ 467.1.

Terc-butil (3-bromo-5-(((1S,2R)-2-hidroksicikloheksil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(ciklopropilmetil)karbamat

Rastvoru terc-butil (3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(ciklopropilmetil)karbamata (9.0 g, 22.5 mmol) u NMP (90 mL) su bili dodati (1R,2S)-2-aminocikloheksanol·HCl (4.08 g, 27.0 mmol), i

DIPEA (3.47 g, 25.1 mmol). Reakcija je bila raspodeljena i zatvorena

u šest bočica za mikrotalase. Svaka bočica je bila izložena dejstvu mikrotalasa tokom 3 h na 130 ºC. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko Na2SO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 0-50%) uz korišćenje tri kolone paralelno da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu bež čvrste materije (8.51 g, 79%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.80 (s, 1H), 6.08 (s, 1H), 5.33-5.19 (m, 1H), 4.26-4.14 (m, 1H), 4.13-4.06 (m, 1H), 3.61 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 2.51 (br. s, 1H), 1.89-1.62 (m, 8H), 1.55-1.45 (m, 2H), 1.40 (s, 9H), 1.06-0.95 (m, 1H), 0.47-0.38 (m, 2H), 0.17-0.07 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>408.3, izrač. za [C21H30BrN5O3+ H]<+>480.2.

Terc-butil (3-bromo-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(ciklopropilmetil)karbamat Smeša terc-butil (3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(ciklopropilmetil)karbamata (400 mg, 1.0 mmol), 3-hidroksipiridina (475

mg, 5.0 mmol), DBU (0.75 mL, 5.0 mmol) u DME (5 mL) je bila sjedinjena, pa je zatvorena u bočicu za mikrotalase. Smeša je bila izložena dejstvu mikrotalasa tokom 1 h na 85 ºC. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko Na2SO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 0-50%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu smeđeg ulja (367 mg, 80%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.64 (d, J = 2.5 Hz, 1H) 8.54 (dd, J = 4.5, 1.5 Hz, 1H) 7.97 (s, 1H), 7.78-7.72 (m, 1H), 7.44-7.38 (m, 1H) 6.61 (s, 1H) 3.71 (d, J = 7.3 Hz, 2H) 1.39 (s, 9 H), 1.06-1.01 (m, 1H) 0.45 (s, 2H), 0.13-0.09 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>460.0, izrač. za [C20H22BrN5O3+ H]<+>460.1.

Terc-butil (3-bromo-5-(ciklopentilamino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(((1s,3s)-3-((tercbutoksikarbonil)oksi)-3-metilciklobutil)metil)karbamat

Rastvoru terc-butil (3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(((1s,3s)-3-((terc-butoksikarbonil)oksi)-3-metilciklobutil)metil)karbamata (0.45 g, 0.83 mmol) u NMP (4 mL) su

bili dodati ciklopentilamin (0.085 g, 1.0 mmol), i DIPEA (0.21 g, 1.66

mmol). Reakcija je bio izložena dejstvu mikrotalasa tokom 3 h na 130 ºC. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko Na2SO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent:

EtOAc/heks 0-60%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu bele čvrste materije (0.40 g, 67%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.79 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 5.08 (br. s, 1H), 4.23 (br. s, 1H), 3.85-3.72 (m, 2H), 2.28-2.06 (m, 5H), 2.02-1.89 (m, 2H), 1.81-1.61 (m, 5H), 1.48 (s, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.36 (s, 9H); MS ESI [M H]<+>594.3, izrač. za [C27H40BrN5O5+ H]<+>594.2.

Terc-butil (3-bromo-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(((1s,3s)-3-((tercbutoksikarbonil)oksi)-3-metilciklobutil)metil)karbamat

Smeša terc-butil (3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(((1s,3s)-3-((terc-butoksikarbonil)oksi)-3-metilciklobutil)metil)karbamata (12.7 g, 23.3 mmol), 3-hidroksipiridina (4.43 g, 46.6 mmol), i K2CO3(9.65 g, 69.9 mmol) je bila sjedinjena u DMF (100 mL), pa je mešana na st

preko noći. Reakciona smeša je bila razređena sa EtOAc, a zatim je

isprana vodom, te je osušena preko Na2SO4, pa je isfiltrirana i koncentrisana in vacuo. Sirovi proizvod je bio rastrljan sa Et2O, te je isfiltriran da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu bež čvrste materije (8.43 g, 14.0 mmol). Matična tečnost je bila koncentrisana in vacuo, pa je bila prečišćena pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 0-40%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu svetlo narandžaste čvrste materije (4.07 g, 6.74 mmol). Čvrste materije dobijene rastrljavanjem i fleš hromatografijom su bile sjedinjene da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu svetlo narandžaste čvrste materije (12.50 g, 89%)<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.65 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.55 (dd, J = 4.6, 1.4 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.78-7.73 (m, 1H), 7.46-7.40 (m, 1H), 6.50 (s, 1H), 3.89 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.30-2.15 (m, 3H), 2.02-1.93 (m, 2H), 1.50 (s, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.38 (s, 9H); MS ESI [M H]<+>604.3, izrač. za [C27H34BrN5O6+ H]<+>604.2.

(1s,3s)-3-(((3-bromo-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(4-metoksibenzil)amino)metil)-1-metilciklobutanol

Rastvoru (1s,3s)-3-(((3-bromo-5-hloropirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(4-metoksibenzil)amino)metil)-1-metilciklobutanola (13.1 g, 28.2 mmol) i 3-hidroksipiridina (4.0 g, 42.3 mmol) u DMF (70 mL) je bio dodat K2CO3(7.8 g, 56.3 mmol). Rezultujuća smeša je bila mešana na 80�C tokom

22 h. Smeša 60% NaH (0.6 g, 15 mmol) i 3-hidroksipiridina (1.4 g, 14.7

mmol) u DMF je bila mešana na st tokom 30 min pre dodavanja reakcionoj smeši.

Rezultujući rastvor je bio mešan na 100�C tokom 20 h. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili isprani sa vodom, a zatim su osušeni preko MgSO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heksani 10-100%) uz korišćenje tri kolone paralelno. Nečiste frakcije su bile izdvojene i prečišćene pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heksani 50-100%). Čiste frakcije su bile sjedinjene i koncentrisane da bi se dobio željeni proizvod u obliku bledo žute čvrste materije (9.5 g, 64%).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.56 (d, J = 4 Hz, 1H), 8.45 (d, J = 8 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.69-7.65 (m, 1H), 7.36 (dd, J = 4.8, 0.4 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.71 (s, 1H), 4.91 (s, 2H), 3.87 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H), 2.30-2.15 (m, 3H), 1.77 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 1.37 (s, 3H); MS ESI [M H]<+>524.2, izrač. za [C25H26BrN5O3+ H]+ 524.1.

N-ciklopropil-4-(7-((((1s,3s)-3-hidroksi-3-metilciklobutil)metil)(4-metoksibenzil)amino)-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)-2-metilbenzamid

Smeša (1s,3s)-3-(((3-bromo-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(4-metoksibenzil)amino)metil)-1-metilciklobutanola (9.5 g, 18.1 mmol), N-ciklopropil-2-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)benzamida (7.6 g, 25.4 mmol), 2M K3PO4(23 mL, 45.3 mmol) u THF (100 mL) je

bila prečišćavana sa Ar tokom 10 min pre dodavanja PdCl2dppf<.>DCM (1.5 g, 1.8 mmol). Rezultujuća smeša je bila zagrevana pod refluksom u uljnom kupatilu na 84 ºC tokom 16 h. Reakciona smeša je bila razređena sa DCM i zas. NaHCO3. Vodena faza je bila ekstrahovana sa DCM, pa su sjedinjeni organski ekstrakti bili osušeni preko MgSO4, te su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 50-100%) uz korišćenje tri kolone paralelno. Nečiste frakcije su bile izdvojene, pa su prečišćene pomoću fleš hromatografije uz korišćenje gore navedenih uslova. Čiste frakcije su bile sjedinjene i koncentrisane da bi se dobio željeni proizvod u vidu narandžaste čvrste materije (9.6 g, 85%).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.90-8.84 (m, 1H), 8.55 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.29 (s, 1H).7.88-7.83 (m, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.58-7.53 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 1H), 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.19 (br. s, 1H), 5.82 (s, 1H), 4.99 (s, 2H), 3.90 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.93-2.90 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.36-2.28 (m, 1H), 2.22-2.20 (m, 2H), 1.89-1.88 (m, 1H), 1.80 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 1.38 (s, 3H), 0.88-0.85 (m, 2H), 0.68-0.64 (m, 2H); MS ESI 619.3 [M H]<+>, izrač. za [C36H38N6O4+ H]+ 619.3.

Dobijanje ilustrativnih jedinjenja prema pronalasku

A1: N-ciklopropil-4-(7-((ciklopropilmetil)amino)-5-(((1S,2R)-2-hidroksicikloheksil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)-2-metilbenzamid hidrohlorid Smeša terc-butil (3-bromo-5-(((1S,2R)-2-hidroksicikloheksil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(ciklopropilmetil)karbamata (8.48 g, 17.7 mmol), N-ciklopropil-2-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)benzamida (6.92 g, 23.0 mmol), PdCl2dppf<.>DCM (1.44 g, 1.76 mmol), i 2M K3PO4(26.6 mL, 106.2 mmol) u THF (60 mL) je bila raspodeljena

i zatvorena u četiri bočice za mikrotalase. Svaka bočica je bila napunjena sa Ar, pa je zagrevana pod dejstvom mikrotalasa na 125 ºC tokom 3 h. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko Na2SO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 20-100%) uz korišćenje dve kolone paralelno da bi se dobila žuta čvrsta materija.

Gore navedeno jedinjenje je bilo rastvoreno u DCM (20 mL), pa je tretirano sa TFA (20 mL) na st tokom 1 h. Posle završetka reakcije, rastvarač je bio odstranjen u vakuumu, a sirova reakcija je bila ponovo rastvorena u DCM (20 mL), pa je neutralizovana sa zasićenim vodenim natrijum bikarbonatom, a zatim je ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko NaSO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: 50-100% EtOAc/heks, onda MeOH/DCM 0-10%), a onda je rastrljan sa Et2O da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu slobodne baze (bela čvrsta materija). Slobodna baza je bila rastvorena u smeši DCM (25 mL), a onda su bili dodati polako MeOH (50 mL), HCl (1M Et2O, 2 ekv). Rastvarač je bio odstranjen in vacuo da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu bledo žute čvrste materije u HCl soli (2.09 g, 25% preko 2 koraka).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.21 (s, 1H), 7.51-7.37 (m, 3H), 5.67 (br. s, 1H), 4.04-3.82 (m, 2H), 3.46-3.37 (m, 2H), 2.93-2.82 (m, 1H), 2.47 (s, 3H), 1.89-1.64 (m, 6H), 1.61-1.42 (m, 2H), 1.31-1.21 (m, 1H), 0.88-0.78 (m, 2H), 0.70-0.58 (m, 4H), 0.46-0.36 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>475.3, izrač. za [C27H34N6O2+ H]<+>475.3. HPLC čistoća: 98% na 254 nm.

A2: N-ciklopropil-4-(7-((ciklopropilmetil)amino)-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)-2-metilbenzamid hidrohlorid

Smeša terc-butil (3-bromo-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(ciklopropilmetil)karbamata (367 mg, 0.80 mmol)), N-ciklopropil-2-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)benzamida (289 mg, 0.96 mmol), PdCl2dppf<.>DCM (65 mg, 0.080 mmol), i 2M K3PO4

(1.4 mL, 2.8 mmol) u THF (4 mL) je bila zatvorena u bočicu za

mikrotalase. Bočica je bila napunjena sa Ar, pa je bila zagrevana pod dejstvom mikrotalasa na 130 ºC tokom 4 h. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko Na2SO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 20-100%) da bi se dobilo žuto ulje.

Gore navedeno jedinjenje je bilo rastvoreno u DCM (6 mL), pa je tretirano sa TFA (2 mL) na st tokom 1 h. Posle završetka reakcije, rastvarač je bio odstranjen in vacuo, a sirova reakcija je bila ponovo rastvorena u MeOH (4 mL), pa je isfiltrirana, i prečišćena pomoću prep HPLC. Frakcije su bile propuštene kroz PoraPak kolonu, pa su rastrljane sa Et2O da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu slobodne baze (bela čvrsta materija, 119 mg). Deo slobodne baze (67 mg, 0.15 mmol) je onda bio rastvoren u MeOH (10 mL), a zatim je polako bila dodata HCl (1M Et2O, 2 ekv). Smeša je bila koncentrisana, pa je rastrljana sa Et2O da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu žute čvrste materije u HCl soli (55 mg, 25% prinosa iz 2 koraka).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 9.10 (s, 1H), 8.82 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 8.73-8.66 (m, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.24-8.15 (m, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.07 (s, 1H), 3.39 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 2.89-2.78 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 1.37-1.23 (m, 1H), 0.86-0.75 (m, 2H), 0.70-0.56 (m, 4H), 0.45-0.38 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>455.2, izrač. za [C26H26N6O2+ H]<+>455.2. HPLC čistoća: 95.9% na 254 nm.

A3: 4-(5-(ciklopentilamino)-7-((((1s,3s)-3-hidroksi-3-metilciklobutil)metil)amino)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)-N-ciklopropil-2-metilbenzamid hidrohlorid

il)benzamida (0.26 g, 0.88 mmol), PdCl2dppf<.>DCM (0.055 g, 0.067 mmol), i 2M K3PO4(1 mL, 2.01 mmol) u THF (4 mL) je bila snabdevena sa Ar, pa je zagrevana pod dejstvom mikrotalasa na 130 ºC tokom 3 h. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko Na2SO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 20-100%) da bi se dobilo žuto ulje.

Gornje jedinjenje je bilo rastvoreno u DCM (10 mL), pa je bilo tretirano sa TFA (3 mL) na st tokom 3 h. Posle završetka reakcije, rastvarač je bio odstranjen in vacuo, a sirovi proizvod je bio rastvoren u MeOH (5 mL). Smeša je bila isfiltrirana i prečišćena pomoću prep-HPLC. Jedinjenje je bilo propušteno kroz PoraPak patronu, pa je rastrljano sa Et2O da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu slobodne baze (bela čvrsta materija). Slobodna baza je bila rastvorena u MeOH (5 mL), a zatim je polako bila dodata HCl (1M Et2O, 2 ekv). Rastvarač je bio odstranjen in vacuo da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu svetlo narandžaste čvrste materije u HCl soli (75 mg, 21% iz 2 koraka).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.18 (s, 1H), 7.42 (s, 3H), 5.52 (br. s, 1H), 4.23-4.11 (m, 1H), 3.68-3.54 (m, 2H), 2.93-2.81 (m, 1H), 2.46 (s, 3H), 2.38-2.27 (m, 1H), 2.26-2.07 (m, 4H), 1.99-1.89 (m, 2H), 1.88-1.59 (m, 6H), 1.35 (s, 3H), 0.86-0.79 (m, 2H), 0.66-0.58 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>489.4, izrač. za [C28H36N6O2+ H]<+>489.3. HPLC čistoća: 99% na 254 nm.

A4: N-ciklopropil-4-(7-((((1s,3s)-3-hidroksi-3-metilciklobutil)metil)amino)-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)-2-metilbenzamid hidrohlorid i njegova slobodna baza A). Pomoću Boc deprotekcije: Smeša terc-butil (3-bromo-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)(((1s,3s)-3-((tercbutoksikarbonil)oksi)-3-metilciklobutil)metil)karbamata (0.23 g, 0.38 mmol), N-ciklopropil-2-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)benzamida (0.15 g, 0.49 mmol),

PdCl2dppf<.>DCM (0.15 g, 0.49 mmol), i 2M K3PO4(0.57 mL, 1.14 mmol) u THF (4 mL) je bila snabdevena sa Ar, pa je zagrevana pod dejstvom mikrotalasa na 130 ºC tokom 3 h. Bili su dodati voda i EtOAc da bi se razdvojile faze, pa je vodena faza bila ekstrahovana sa EtOAc. Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni preko NaSO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio prečišćen pomoću fleš hromatografije (gradijent: EtOAc/heks 20-60%) da bi se dobilo žuto ulje.

Gore navedeni međuproizvod je bio rastvoren u DCM (10 mL), a zatim je tretiran sa TFA (3 mL) na st tokom 3 h. Posle završetka reakcije, rastvarač je bio odstranjen in vacuo, a sirovi proizvod je bio rastvoren u MeOH (5 mL). Smeša je bila isfiltrirana, pa je prečišćena pomoću prep-HPLC. Jedinjenje je bilo propušteno kroz PoraPak patronu, te je rastrljano sa Et2O da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu slobodne baze (bela čvrsta materija). Slobodna baza je bila rastvorena u MeOH (5 mL), a onda je polako bila dodata HCl (1 M Et2O, 2 ekv). Rastvarač je bio odstranjen in vacuo da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu bež čvrste materije u HCl soli (96 mg, 47% iz 2 koraka).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 9.14 (br. s, 1H), 8.89-8.82 (m, 1H), 8.79-8.71 (m, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.31-8.21 (m, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.59 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.06 (s, 1H), 3.56 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 2.88-2.79 (m, 1H), 2.40-2.31 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 2.26-2.18 (m, 2H), 1.99-1.89 (m, 2H), 1.37 (s, 3H), 0.85-0.76 (m, 2H), 0.63-0.53 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>499.3, izrač. za [C28H30N6O3+ H]<+>499.2. HPLC čistoća: 99.5% na 254 nm.

B). Putem PMB deprotekcije: Smeša N-ciklopropil-4-(7-((((1s,3s)-3-hidroksi-3-metilciklobutil)metil)(4-metoksibenzil)amino)-5-(piridin-3-iloksi)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)-2-metilbenzamida (9.6 g, 15.5 mmol), TFA (50 mL) u DCE (70 mL) je bila zagrevana u uljnom kupatilu na 50 ºC tokom 4 h.

Posle završetka reakcije rastvarač je bio odstranjen in vacuo, a

sirovi proizvod je bio rastvoren u smeši MeOH/DCM (100 mL/25 mL). Onda je bilo dodato 2M Na2CO3(150 mL), te je rezultujuća smeša bila mešana na st tokom 30 min. Reakciona smeša je bila razređena sa DCM, pa su faze bile razdvojene. Vodena faza je bila ekstrahovana sa DCM, a sjedinjeni organski ekstrakti su bili isprani sa vodom, te su osušeni preko MgSO4, pa su isfiltrirani i koncentrisani. Sirovi proizvod je bio rastrljan, pa je izložen dejstvu ultrazvuka u smeši DCM/Et2O (10 mL/70 mL) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova u vidu beličaste čvrste materije u slobodnoj bazi (5.9 g, 77%).<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8.58-8.53 (m, 1H), 8.50-8.46 (m, 1H), 8.36 (s, 1H), 7.86-7.80 (m, 1H), 7.76-7.72 (m, 1H), 7.61-7.55 (m, 2H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 3.52 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.86-2.77 (m, 1H), 2.38-2.28 (m, 1H), 2.25 (s, 3H), 2.24-2.18 (m, 2H), 1.99-1.88 (m, 2H), 1.37 (s, 3H), 0.84-0.75 (m, 2H), 0.64-0.54 (m, 2H); MS ESI [M H]<+>499.2, izrač. za [C28H30N6O3+ H]<+>499.2. HPLC čistoća: 96.1% na 235 nm.

Sledeća finalna jedinjenja su bila sintetizovana slično sintezama A1-4.

Primer B: Test inhibicije TTK

Aktivni TTK je bio nabavljen od firme Invitrogen kao amino terminalna GST fuzija cele dužine humanog TTK. Amino terminalni 6 histidin, sumo tagovani humani TTK (ostaci 1-275) je bio izražen u E. coli, pa je zatim prečišćen do >95% homogenosti pomoću Ni<2+>agaroze, gel filtracijom i jonoizmenjivačkom hromatografijom.

TTK aktivnost je bila izmerena uz korišćenje ELISA sistema za indirektnu detekciju. GST-TTK (0.68 nM) je bio inkubiran u prisustvu 16 μM ATP (Sigma cat# A7699) ili 100 μM ATP, 50mM Hepesa pH 7.2, 1mM EGTA, 10mM MgCl2, i 0.1% Pluronika u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića prethodno obloženoj sa amino terminalnim 6 histidinom, sumo tagovanim TTK (aminokiselinski ostaci 1-275).

Bilo je dozvoljeno da se reakcija nastavi tokom 30 minuta, što je bilo praćeno sa 5 ispiranja ploče sa puferom za ispiranje (fosfatni puferovani slani rastvor kome je bilo dodato 0.2% Tween 20), i inkubacijom tokom 30 minuta sa razređivanjem primarnog antitela od 1:3000 (Cell Signaling cat# 9381). Ploča je bila isprana 5 puta sa puferom za ispiranje, pa je bila inkubirana tokom 30 minuta u prisustvu sekundarnog antitela kuplovanog sa ren peroksidazom (BioRad cat# 1721019, koncentracija 1:3000), pa je isprana još 5 puta sa puferom za ispiranje, a zatim je inkubirana u prisustvu TMB supstrata (Sigma cat# T0440). Bilo je dozvoljeno da se kolorimetrijska reakcija nastavi još 5 minuta, što je bilo praćeno dodavanjem zaustavnog rastvora (0.5 N sumporne kiseline), i kvantifikovano je detekcijom na 450 nm sa monohromatskim ili na filteru baziranom čitaču ploča (Molecular Devices M5 ili Beckman DTX880, respektivno).

Inhibicija jedinjenja je bila određena bilo za fiksnu koncentraciju (10 μM) ili za različite koncentracije inhibitora (obično 0.5 μM do 0.001 μM u 10 tačaka reakcija titracije za doze). Jedinjenja su bila prethodno inkubirana u prisustvu enzima tokom 5 minuta pre dodavanja ATP, pa je aktivnost preostalih kvantifikovana korišćenjem gore opisanog testa aktivnosti. % inhibicije jedinjenja je bio određen uz korišćenje sledeće formule: % inhibicije = 100 x (1 – (eksperimentalna vrednost – osnovna vrednost)/(kontrola visoke aktivnosti– osnovna vrednost)). IC50vrednost je bila određena uz korišćenje nelinearnog logaritamskog fitovanja krive sa 4 tačke (XLfit4, IDBS) sa formulom; (A+(B/(1+((x/C)^D)))), gde je A = osnovna vrednost, B = opseg, C = prevojna tačka, D = parametar fitovanja krive.

U tabeli 1 dole su dati opsezi IC50vrednosti za primere jedinjenja uz korišćenje 100 uM ATP. IC50opsezi su označeni sa "A", "B" i "C" za vrednosti manje od ili jednake 0.1 μM; one veće od 0.1 μM ili manje od ili jednake 0.5 μM; i one veće od 0.5 μM, respektivno. IC50opsezi označeni zvezdicom ukazuju da je u testu bilo upotrebljeno 16 μM ATP (Sigma cat# A7699).

Primer C: Podaci za primere jedinjenja prema pronalasku sa kancerskim ćelijskim linijama

Ćelije kancera dojke (MDA-MB-468), ćelije kancera debelog creva (HCT116) i ćelije kancera jajnika (OVCAR-3) su bile zasejane (1000 do 4000 u 80 μl po bunarčiću u zavisnosti od brzine rasta ćelija) u ploče sa 96 bunarčića 24 sata pre prekrivanja jedinjenjem. Jedinjenja su bila pripremljena kao matični rastvori od 10 mM u 100% DMSO koji su bili razređeni sa medijumom za kultivaciju ćelija (Invitrogen, Barlington, ON, Kanada) sa DMEM (Dulbekov modifikovani Igl medijum) koji je sadržao 10% FBS (fetusni goveći serum) do koncentracija u opsegu od 50 nM do 250 μM. Alikvotima (20 μl) od svake koncentracije je bilo prekriveno 80 μl prethodno zasejanih ćelija u pločama sa 96 bunarčića da bi se dobile finalne koncentracije od 10 nM do 50 μM. Ćelije su bile kultivisane tokom 5 dana pre nego što je bio izveden sulforhodaminski B test (SRB) da bi se odredila aktivnost jedinjenja u pogledu inhibicije rasta ćelija.

Sulforhodamin B (nabavljen od firme Sigma, Oukvil, ON, Kanada) je vodorastvorna boja koja se vezuje za bazne aminokiseline ćelijskih proteina. Shodno tome, kolorimetrijsko merenje vezane boje obezbeđuje procenu ukupne mase proteina koja je vezana za broj ćelija. Ćelije su fiksirane in situ nežnim isisavanjem medijuma za kultivaciju i dodavanjem 50 μl ledeno hladne 10%-tne trihlorosirćetne kiseline (TCA) po bunarčiću i inkubacijom na 4<o>C tokom 30-60 min. Ploče su isprane sa H2O pet puta, pa je ostavljeno da se suše na vazduhu tokom 5 min. Dodavanje 50 μl 0.4%(w/v) SRB rastvora u 1% (v/v) sirćetne kiseline svakom bunarčiću i inkubacija tokom 30 min na st dovršavaju reakciju bojenja. Posle bojenja, ploče su isprane četiri puta sa 1% sirćetne kiseline da bi se odstranila nevezana boja, pa je onda ostavljeno da se suše na vazduhu tokom 5 min. Boja je solubilizovana sa 100 μl 10 mM Tris pH 10.5 po bunarčiću. Apsorbansa je očitana na 570 nm.

Procenat (%) relativne inhibicije rasta je bio izračunat poređenjem sa ćelijama tretiranim samo sa DMSO (100%). GI50su bile određene za jedinjenja sa citotoksičnom aktivnosti. GI50je bio izračunat korišćenjem GraphPad PRISM softvera (GraphPad Software, Inc., San Dijego, CA, USA). GI50(inhibicija rasta) je koncentracija jedinjenja koja izaziva 50%-tnu inhibiciju rasta ćelija.

U tabeli 1 dole su dati opsezi GI50vrednosti za primere jedinjenja protiv ćelijskih linija kancera dojke (MDA-MB-468), ćelijskih linija kancera debelog creva (HCT116) i ćelijskih linija kancera jajnika (OVCAR-3). Primeri jedinjenja su pokazali različitu aktivnost na inhibiciju rasta/ubijanje ćelija protiv ćelija kancera dojke, kancera debelog creva i kancera jajnika. GI50opsezi su označeni sa "A", "B" i "C," za vrednosti manje od ili jednake 0.1 μM; one veće od 0.1 μM i manje od ili jednake 0.5 μM; i one veće od 0.5 μM, respektivno.

Primer D: Podaci za primere jedinjenja sa ćelijama koje iniciraju tumor kancera debelog creva i jajnika

Materijali i metode: Netkivom ili tkivom kultivisani tretirani T-75 balon i ploče sa 96 bunarčića su bili nabavljeni od firme VWR. Suplement sa vitaminom B-27, MEM NEAA (minimalni esencijalni medijum sa neesencijalnim aminokiselinama), natrijum piruvat, L-glutamin, N2 suplement, penicilin-streptomicin i fungizon/amfotericin B su bili nabavljeni od firme Invitrogen. Smeše lipida, heparina i EGF su bile nabavljene od firme Sigma; bFGF od firme BD Biosciences. Ćelije za inicijaciju tumora (TICs) debelog creva su bile rutinski održavane uz korišćenje netkivom kultivisanih tretiranih T-75 balona u DMEM:F12 medijumu koji je sadržao 0.2XB-27 suplement, 4ug/ml heparina, 1XMEM NEAA, 1Xnatrijum piruvat, 1 mM glutamin, 10 pg/ul bFGF, 20 pg/ul EGF, 1X N2 suplement, smešu lipida, penicilinstreptomicin i fungizon/amfotericin B. TICs jajnika su bile rutinski održavane uz korišćenje tkivom kultivisanih tretiranih T-75 balona u DMEM:F12 medijumu koji su sadržali 1XB-27 suplement, 4ug/ml heparina, 20 pg/ul bFGF, 20 pg/ul EGF i penicilina-streptomicina.

Protokol testa: Ovde opisana jedinjenja su bila rastvorena u DMSO i dalje su bila razređena u medijumu za ćelijske kulture radi određivanja GI50. TICs debelog creva su bile tripsinizovane i zasejane u netkivom kultivisane tretirane ploče sa 96 bunarčića sa 4,000 ćelija/bunarčiću. Posle 24 h, jedinjenje je bilo dodato u ćelijsku kulturu u različitim koncentracijama, pa je bila podešena finalna koncentracija DMSO od 0.1%. Ćelije su onda bile kultivisane na 37<o>C tokom 9 dana. TICs jajnika su bile tripsinizovane i zasejane u tkivom kultivisane tretirane ploče sa 96 bunarčića sa 1,000 ćelija/bunarčiću. Posle 24 h, jedinjenje je bilo dodato u ćelijsku kulturu u različitim koncentracijama, a finalna koncentracija DMSO je bila podešena na 0.1%. Ćelije su onda bile kultivisane na 37<o>C tokom 6 dana. Vijabilnost ćelija je bila određena pomoću Alamar Blue testa: 10 ul Alamar Blue je bilo dodato u svaki bunarčić. Posle inkubacije od 4 sata na 37<o>C, fluorescencija je snimljena pri pobidi od 544 i emisiji od 590. GI50(inhibicija rasta) je bila izračunata uz korišćenje GraphPad Prism 4.0 softvera. Podaci u vezi inhibicije rasta ćelija za ovde opisana jedinjenja su dati dole tabelarno.

U donjoj tabeli 1 su dati opsezi GI50vrednosti za primere jedinjenja protiv TICs (debelo crevo 12 i jajnik 2393A). Opsezi GI50su označeni kao "A," "B" i "C" za vrednosti manje od ili jednake 0.1 μM; one koje su veće od 0.1 μM i manje od ili jednake 0.5 μM; i one koje su veće od 0.5 μM, respektivno.

Tabela 1: In vitro aktivnost primera jedinjenja

NO – nije određeno

Claims (9)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: R<1>je –NH-CH2-Cy; Cy je ciklopropil ili ciklobutil, pri čemu je ciklopropil ili ciklobutil opciono supstituisan sa jednom ili dve grupe izabrane između alkila i hidroksila; R<2>je -O-piridinil; -NH-(C2-C6)hidroksialkil opciono supstituisan sa ciklopropilom ili izopropilom; ili -NH-(C3-C6)cikloalkil opciono supstituisan sa hidroksilom ili (C1-C2)hidroksilalkilom; R<4>je izabran između vodonika, halogena, i (C1-C3)alkila; i R<d>je ciklopropil.
2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je R<4>hlor ili metil.
3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
4. 4. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
5. 5. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
6. 6. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
7. 7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od prethodnih zahteva i farmaceutski prihvatljivi nosač ili razređivač.
8. 8. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, za primenu u lečenju kancera kod subjekta.
9. 9. Jedinjenje ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 8, pri čemu kancer je kancer pankreasa, kancer prostate, kancer pluća, melanom, kancer dojke, kancer debelog creva, ili kancer jajnika. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5