[go: up one dir, main page]

RS56741B1 - Materijal i postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa her-3 - Google Patents

Materijal i postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa her-3

Info

Publication number
RS56741B1
RS56741B1 RS20180048A RSP20180048A RS56741B1 RS 56741 B1 RS56741 B1 RS 56741B1 RS 20180048 A RS20180048 A RS 20180048A RS P20180048 A RSP20180048 A RS P20180048A RS 56741 B1 RS56741 B1 RS 56741B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
agent
antibody
cells
cancer
antibodies
Prior art date
Application number
RS20180048A
Other languages
English (en)
Inventor
Thore Hettmann
Daniel J Freeman
Robert Radinsky
Original Assignee
Daiichi Sankyo Europe Gmbh
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Sankyo Europe Gmbh, Amgen Inc filed Critical Daiichi Sankyo Europe Gmbh
Publication of RS56741B1 publication Critical patent/RS56741B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

Opis
OSNOVA PRONALASKA
1. Tehnička oblast
[0001] Ovaj dokument se odnosi na materijale i postupke za lečenje subjekata koji imaju hiperproliferativnu bolest povezanu sa receptorom humanog epidermalnog faktora rasta 3 (HER-3) primenom prvog sredstva koje se vezuje za HER-3, u kombinaciji sa trastuzumabom.
2. Osnova pronalaska
[0002] HER-3, takođe poznat kao ErbB3, je receptorska protein tirozin kinaza koja pripada familiji receptora epidermalnog faktora rasta (EGF-R, takođe poznat kao HER), receptorskih protein tirozin kinaza, koja uključuje i HER-1 (takođe poznat kao EGF-R ili erbB), HER-2 (takođe poznat kao erbB2), i HER-4 (takođe poznat kao erbB4) (Plowman et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. US 87:4905-4909; Kraus et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. US 86:9193-9197; i Kraus et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. US 90:2900-2904). Kao prototipski receptor epidermalnog faktora rasta, transmembranski receptor HER-3 se sastoji od ekstracelularnog ligand-vezujućeg domena (ECD), dimerizacionog domena unutar ECD, transmembranskog domena (TMD), intracelularnog protein tirozin kinaznog domena (TKD), i C-terminalnog fosforilacionog domena.
[0003] Ligand za HER-3, poznat kao heregulin (HRG), se vezuje za ekstracelularni domen HER-3 i aktivira prenos signala posredovan receptorom doprinoseći dimerizaciji sa drugim članovima familije receptora epidermalnog faktora rasta (HER), naknadnoj transfosforilaciji intracelularnog domena HER-3, i aktivaciji nishodnih signalnih kaskada. Obrazovanje dimera sa više članova HER familije uvećava signalni potencijal HER-3, i predstavlja sredstvo za širenje signala, kao i za amplifikaciju signala.
[0004] WO 2007/077028 se odnosi na antitela usmerena protiv HER-3 i njihove upotrebe. Naročito su opisana antitela koja se vezuju za HER-3 i polinukleotidi koji ih kodiraju. Takođe su opisani ekspresioni vektori i ćelije-domaćini koje ih sadrže za proizvodnju opisanih antitela.
REZIME PRONALASKA
[0005] Ovaj dokument se odnosi na prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu u lečenju ili prevenciji hiperproliferativne bolesti povezane sa HER-3, gde je pomenuta hiperproliferativna bolest kancer koji eksprimira ili prekomerno eksprimira HER-3, gde je pomenuto drugo sredstvo trastuzumab, i
gde je pomenuto prvo sredstvo antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3, i sadrži: aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži CDRH1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 256; CDRH2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 282; i CDRH3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 315; i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži CDRL1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 340; CDRL2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 344; i CDRL3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 387.
[0006] Drugi proteini koji se vezuju za HER3 su dati samo kao uporedni primeri. Prema pronalasku, prvo sredstvo može da bude antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3 i sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 70. Antigen-vezujući protein može da uključuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NO: 72.
[0007] Antigen-vezujući protein može da bude usmeren protiv ekstracelularnog domena HER-3. Vezivanje antigen-vezujućeg proteina za HER-3 može da smanji prenos signala posredovan sa HER-3, smanji fosforilaciju HER-3, smanji ćelijsku proliferaciju, smanji migraciju ćelija, i/ili poveća nishodnu regulaciju HER-3.
[0008] Antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3 može da bude antitelo. Antitelo može da bude monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov fragment antitela (npr., Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2 fragment, Fv fragment, diantitelo, ili molekul jednolančanog antitela). Antitelo može da bude tipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.
[0009] Prvo sredstvo može da bude antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3, i antigen-vezujući protein može da bude spojen sa efektorskom grupom. Efektorska grupa može da bude radioizotop ili radionuklid, toksin, ili terapeutska ili hemoterapeutska grupa (npr., terapeutska ili hemoterapeutska grupa izabrana iz grupe koja se sastoji od kaliheamicina, auristatina-PE, geldanamicina, maitansina i njihovih derivata).
[0010] Drugo sredstvo je trastuzumab. Druga sredstva su data kao uporedni primeri.
[0011] Postupci koji su ovde dati mogu izborno da uključuju primenu trećeg ili sledećeg terapeutskog sredstva i/ili zračnu terapiju. Treće ili sledeće terapeutsko sredstvo može da bude antineoplastično sredstvo (npr., antitumorsko antitelo ili hemoterapeutsko sredstvo, kao što je kapecitabin, antraciklin, doksorubicin, ciklofosfamid, paklitaksel, docetaksel, cisplatin, gemcitabin, ili karboplatin).
[0012] Prvo sredstvo i drugo sredstvo mogu da se primene intravenskom, subkutanom, intramuskularnom ili oralnom primenom. Prema pronalasku, bolest je kancer koji eksprimira ili prekomerno eksprimira HER3 (npr., izabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera debelog creva, kancera bubrega, kancera pluća, kancera pankreasa, epidermoidnog karcinoma, fibrosarkoma, melanoma, nazofaringealnog karcinoma i karcinoma skvamoznih ćelija).
[0013] Postupci koji su ovde opisani mogu da uključuju primenu prvog sredstva u dozi od oko 1 do oko 20 mg/kg telesne težine, najmanje jednom na svakih 6 nedelja. Postupci mogu da uključuju primenu drugog sredstva u dozi od oko 1 do oko 20 mg/kg telesne težine, najmanje jednom na svakih 6 nedelja. Postupci dalje mogu da uključuju, pre primene, korišćenje postupka koji obuhvata ispitivanje prognostičkog markera za izbor subjekta koji ima bolest povezanu sa HER-3. Postupci mogu dalje da uključuju, nakon primene, praćenje terapeutskog ishoda.
[0014] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što uobičajeno podrazumeva stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu da se koriste za praktikovanje pronalaska, pogodni postupci i materijali su opisani u nastavku teksta. U slučaju neslaganja, ova specifikacija će, uključujući definicije, imati prevlast. Pored toga, materijali, postupci i primeri su isključivo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.
[0015] Detalji jednog ili više primera izvođenja pronalaska su prikazani u pratećim crtežima i opisu u nastavku. Druga svojstva, ciljevi, i prednosti pronalaska će biti očigledni iz opisa i crteža, i iz patentnih zahteva.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0016]
SL. 1 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela i panitumumaba, bilo samostalno ili u kombinaciji, na rast ksenograftskog tumora (Calu-3) nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC).
SL. 2 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela i erlotiniba, bilo samostalno ili u kombinaciji, na rast Calu-3.
SL. 3 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa c2C4 (inhibitor dimerizacije HER2), ili trastuzumabom na bazalni rast nezavisan od adhezije ćelija SkBr-3 kancera dojke.
SL. 4 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa c2C4, trastuzumabom, ili cetuksimabom, na rast nezavisan od adhezije stimulisan sa HRG ćelija SkBr-3 kancera dojke.
SL. 5 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa 2C4), trastuzumabom, ili cetuksimabom, na bazalni rast nezavisan od adhezije ćelija MDA-MB-435 kancera jajnika.
SL. 6A-6D predstavljaju seriju grafika koji prikazuju dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa trastuzumabom (SL. 6A), lapatinibom (SL. 6B), gemcitibinom (SL. 6C), ili cisplatinom (SL. 6D), na proliferaciju ćelija MDA-MB-175VII kancera dojke.
SL. 7 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa c2C4, trastuzumabom, ili lapatinibom, na proliferaciju stimulisanu sa HRG ćelija ZR-75-30 kancera dojke.
SL. 8 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa c2C4, trastuzumabom, ili lapatinibom, na proliferaciju stimulisanu sa HRG ćelija BT474 kancera dojke.
SL. 9 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa cetuksimabom, c2C4, ili trastuzumabom, na proliferaciju stimulisanu sa HRG ćelija DLD-1 kancera debelog creva.
SL. 10 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa c2C4, ili trastuzumabom, ili lapatinibom na proliferaciju stimulisanu sa HRG ćelija HCC-1569 kancera dojke.
SL. 11 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitelo, bilo samostalno ili u kombinaciji sa 2C4, trastuzumabom, ili lapatinibom, na proliferaciju stimulisanu sa HRG ćelija SkBr-3 kancera dojke.
SL. 12 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa panitumumabom na proliferaciju FaDu ćelija kancera glave i vrata.
SL. 13 je slika Western blot testa koja prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa cetuksimabom, c2C4, ili trastuzumabom, na fosforilaciju HER-3 (gornji panel), Akt (srednji panel), i ERK (donji panel) u ćelijama MDA-MB-175VII kancera dojke.
SL. 14 je slika Western blot testa koja prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa cetuksimabom, c2C4, trastuzumabom, ili lapatinibom, na fosforilaciju HER-3 (gornji panel), Akt (srednji panel), i ERK (donji panel) u ćelijama SkBr-3 kancera dojke stimulisanim sa HRG.
SL. 15 je slika Western blot testa koja prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa cetuksimabom, pertuzumabom (c2C4), ili trastuzumabom, na fosforilaciju HER-3 (gornji panel) ili Akt (donji panel) u ćelijama Ls174T kancera debelog creva stimulisanim sa HRG.
SL. 16 je slika Western blot testa koja prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa cetuksimabom, c2C4, ili trastuzumabom, na fosforilaciju HER-3 (gornji panel), Akt (srednji panel), i ERK (donji panel) u ćelijama HCC 1569 kancera dojke stimulisanim sa HRG.
SL. 17 je slika Western blot testa koja prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitelo, bilo samostalno ili u kombinaciji sa panitumumabom, na fosforilaciju Akt, PGFR, HER-2, HER-3, HER-4, i ERK u alveolarnim epitelijalnim ćelijama A549. Traka 1, IgG kontrola; traka 2, panitumumab, samostalno; traka 3, U1-59, samostalno; traka 4, U1-59, u kombinaciji sa panitumumabom. Tubulin je korišćen kao kontrola za ravnomerno nanošenje uzoraka.
SL. 18 je slika Western blot testa koja prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji sa panitumumabom ili lapatinibom, na fosforilaciju HER-3, Akt, HER-2, ERK, i EGF-R u Calu3 ćelijama NSCLC. Traka 1, IgG kontrola; traka 2, panitumumab samostalno; traka 3, U1-59 samostalno; traka 4, lapatinib samostalno; traka 5, U1-59 u kombinaciji sa panitumumabom; traka 6, U1-59 u kombinaciji sa lapatinibom.
SL. 19 je grafik koji prikazuje dejstva humanog anti-HER-3 antitela i lapatiniba, bilo samostalno ili u kombinaciji, na rast ksenograftskog tumora (HCC-1569) kancera dojke.
SL. 20 pokazuje da tretman A549 ćelija NSCLC sa U1-59 inhibira fosforilaciju HER3 i snižava reaktivaciju nakon tretmana sa gefitinibom. Ćelije A549 su tretirane sa gefitinibom, U1-59 ili oba, i fosforilacija HER3 je procenjena pomoću ELISA testa. Tretman sa gefitinibom tokom 1 časa je rezultovao u delimičnoj inhibiciji fosforilacije HER, koja se vratila na kontrolne nivoe nakon 24 časa. Nasuprot tome, tretman sa U1-59 je vodio većoj inhibiciji fosforilacije HER koja se održala nakon 24 časa. Kombinovani tretman sa oba sredstva sprečio je poništavanje inhibicije viđeno nakon 24 časa u ćelijama tretiranim samo sa gefitinibom. Eksperimenti su izvedeni u triplikatu bunarčića i ponovljeni najmanje 2 puta. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ±SD.
DETALJAN OPIS
[0017] Naslovi poglavlja koji se ovde koriste su samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za opisani predmet pronalaska.
[0018] Osim ako ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini korišćeni u vezi sa predmetnom prijavom će imati značenja koja uobičajeno podrazumeva stručnjak u oblasti. Dalje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, termini u jednini će uključivati množinu i termini u množini će uključivati jedninu.
[0019] Uopšteno, nomenklature korišćene u vezi sa, i tehnike, kulture ćelija i tkiva, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije, genetike, i hemije i hibridizacije proteina i nukleinskih kiselina, koje su ovde opisane su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u stanju tehnike. Postupci i tehnike predmetne prijave se uopšteno izvode prema uobičajenim postupcima dobro poznatim u stanju tehnike i kao što je opisano u opštim i specifičnijim referencama koje su navedene i razmatrane u ovoj specifikaciji osim ako nije drugačije naznačeno. Videti, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), i Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvedene prema specifikacijama proizvođača, kao što se uobičajeno radi u ovoj oblasti, ili kao što je ovde opisano. Terminologija koja se koristi u vezi sa, i laboratorijski postupci i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su one dobro poznate i uobičajeno korišćene u ovoj oblasti. Standardne tehnike mogu da se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske pripreme, formulacije, i dostavu, i lečenje pacijenata.
[0020] Treba razumeti da pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole i reagense, itd., koji su ovde opisani i kao takvi mogu da variraju. Terminologija koja se ovde koristi je samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namenjena da ograniči oblast pronalaska, koja je definisana samo patentnim zahtevima.
[0021] Osim u operativnim primerima, ili gde je drugačije naznačeno, sve brojeve koji izražavaju količine sastojaka ili reakcione uslove koji se ovde koriste, treba razumeti kao modifikovane u svim slučajevima terminom "oko". Termin "oko" kada se koristi u vezi sa procentima može da znači /-,1%.
1. Opšti pregled
[0022] Ovaj dokument opisuje materijale i postupke povezane sa lečenjem ili prevencijom bolesti povezanih sa HER-3, korišćenjem kombinacije prvog sredstva koje se vezuje za HER-3, i drugog sredstva koje se vezuje za/ili inhibira aktivnost drugih članova HER familije. Predmet pronalaska je prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu u lečenju ili prevenciji hiperproliferativne bolesti povezane sa HER-3, gde je pomenuta hiperproliferativna bolest kancer koji eksprimira ili prekomerno eksprimira HER-3, gde je pomenuto drugo sredstvo trastuzumab, i
gde je pomenuto prvo sredstvo antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3, i sadrži: aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži CDRH1 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 256; CDRH2 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 282; i CDRH3 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 315; i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži CDRL1 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 340; CDRL2 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 344; i CDRL3 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 387.
2. HER-3 vezujuća sredstva
[0023] Kao što je ovde opisano, sredstvo koje se vezuje za HER-3 je antigen-vezujući protein, kao što je antitelo. Kako se ovde koristi, "antigen vezujući protein" ili "vezujući protein", označava protein koji se specifično vezuje za naznačeni ciljni antigen, kao što je član HER familije, npr., HER-3. Kaže se da se antigen-vezujući protein "specifično vezuje" za ciljni antigen kada je disocijaciona konstanta (KD) ≤10-8 M. Antitelo se specifično vezuje za antigen sa "visokim afinitetom" kada je KD≤5x10-9 M, i sa "veoma visokim afinitetom" kada je KD≤5x 10-10 M. U jednom primeru izvođenja, antitelo ima KDod ≤10-9 M i brzinu disocijacije od oko 1x10-4/sek. U jednom primeru izvođenja, brzina disocijacije je oko 1x105/sek. U drugim primerima izvođenja, antitela će se vezati za navedeni član HER familije sa K -8
Dizmeđu oko 10 M i 10-10 M, i u još jednom primeru izvođenja vezaće se sa KD≤2x10-10. Antitelo usmereno na HER-3 može da bude usmereno protiv ekstracelularnog domena (ECD) HER-3. Na primer, anti-HER-3 antitelo kao što je ovde opisano može da interaguje sa bar jednim epitopom u ekstracelularnom delu HER-3. Epitopi mogu da budu smešteni na amino-terminalnom L1 domenu (ak 19-184), u domenima bogatim cisteinom S1 (ak 185-327) i S2 (ak 500-632), u L2 domenu (ak 328-499), koji je oivičen sa dva domena bogata cisteinom, ili u kombinaciji HER-3 domena. Epitopi se takođe mogu naći u kombinacijama domena kao što je, bez ograničenja, epitop sačinjen od delova L1 i S1.
[0024] Protein koji se vezuje za HER-3 može da bude dodatno okarakterisan time što njegovo vezivanje za HER-3 smanjuje prenos signala posredovan sa HER-3. Smanjenje prenosa signala posredovanog sa HER-3 može, npr., da bude izazvano nishodnom regulacijom HER-3 što rezultuje u bar delimičnom nestajanju molekula HER-3 sa ćelijske površine ili stabilizacijom HER-3 na površini ćelije u suštinski neaktivnom obliku, tj., obliku koji ispoljava slabiji prenos signala u poređenju sa nestabilizovanim oblikom. Alternativno, smanjenje prenosa signala posredovanog sa HER-3, takođe može da bude izazvano uticajem na, npr., sniženjem ili inhibicijom, vezivanje liganda ili drugog člana HER familije za HER-3. Na primer, smanjenje prenosa signala posredovanog sa HER-3 takođe može da bude izazvano smanjenjem obrazovanja dimera koji sadrže HER-3 sa drugim članovima HER familije (npr., EGF-R).
[0025] Sredstvo koje se vezuje za HER-3 može da bude proteinski nosač koji ima vezujuću aktivnost sličnu onoj kod antitela (npr., ima aktivnost sličnu anti-HER-3 antitelu) ili antitelo, tj., anti-HER-3 antitelo. Kako se ovde koristi, termin "proteinski nosač" označava polipeptid ili protein sa izloženim površinskim oblastima u kojima su insercije, supstitucije ili delecije aminokiselina visoko podnošljive. Primeri proteinskih nosača koji mogu da se koriste u skladu sa predmetnim postupcima uključuju protein A iz Staphylococcus aureus, bilinvezujući protein iz Pieris brassicae ili druge lipokaline, proteine sa ankirinskim ponovcima, i humani fibronektin (pregled u Binz and Plückthun (2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16:459-69). Projektovanje proteinskih nosača može da bude posmatrano kao kalemljenje ili ugrađivanje funkcije afiniteta na, ili u strukturni okvirni region stabilno sklopljenog proteina. Funkcija afiniteta označava protein-vezujući afinitet u skladu sa ovim dokumentom. Proteinski nosač može da bude strukturno odvojiv od aminokiselinske sekvence doprinoseći specifičnosti vezivanja. Uopšteno, proteini koji izgledaju pogodni za razvoj takvih veštačkih afinitetnih reagenasa mogu da se dobiju racionalnim, ili najčešće, kombinatorijalnim tehnikama proteinskog inženjerstva, kao što je selekcija prema afinitetu prema HER-3, bilo na prečišćenom proteinu ili proteinu prikazanom na površini ćelije, za vezujuća sredstva u veštačkoj biblioteci proteinskih nosača prikazanoj in vitro, tehnikama koje su poznate u ovoj oblasti (videti, npr., Skerra (2000) J. Mol. Recog. 13:167-87; i Binz and Plückthun, gore). Osim toga, proteinski nosač koji ima aktivnost vezivanja sličnu antitelu, može da bude izveden iz akceptorskog polipeptida koji sadrži domen proteinskog nosača, koji može da bude kalemljen sa vezujućim domenima donorskog polipeptida, kako bi se specifičnost vezivanja donorskog polipeptida dodelila domenu proteinskog nosača koji sadrži akceptorski polipeptid. Ubačeni vezujući domeni mogu da budu, na primer, region za određivanje komplementarnosti (CDR) antitela, posebno anti-HER-3 antitela. Insercija može da se postigne različitim postupcima koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti uključujući, na primer, sintezu polipeptida, sintezu nukleinske kiseline kodirane aminokiseline, kao i različitim oblicima rekombinantnih postupaka dobro poznatih stručnjacima u ovoj oblasti.
[0026] Termin "antitelo" uključuje monoklonska antitela, poliklonska antitela, rekombinantna antitela, humanizovana antitela (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al.
(1988) Nature 332:323-329; i Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596), himerna antitela (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. US 81:6851-6855), multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) obrazovana od najmanje dva antitela, ili njihove fragmente antitela. Termin "fragment antitela" obuhvata bilo koji deo gore pomenutih antitela, kao njihove antigen vezujuće ili varijabilne regione. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab fragmente, Fab' fragmente, F(ab')2fragmente, Fv fragmente, di-antitela (Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. US 90:6444-6448), molekule jednolančanih antitela (Plückthun u: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer Verlag, NY (1994), 269-315) i druge fragmente sve dok ispoljavaju željenu sposobnost vezivanja za HER-3.
[0027] Osim toga, termin "antitelo," kako se ovde koristi, uključuje antitelu-slične molekule koji sadrže projektovane subdomene antitela ili prirodne varijante antitela. Ovi antitelu-slični molekuli mogu da budu jedno-domenska antitela kao što su samo VHili samo VLdomeni izvedeni ili iz prirodnih izvora kao što su kamelide (Muyldermans et al. (2001) Rev. Mol. Biotechnol. 74:277-302) ili putem in vitro prikaza biblioteka poreklom od ljudi, kamelida ili drugih vrsta (Holt et al. (2003) Trends Biotechnol.21:484-90).
[0028] "Fv fragment" je minimalni fragment antitela koji sadrži potpuno mesto prepoznavanja i vezivanja antigena. Ovaj region se sastoji od dimera jednog varijabilnog domena teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji tri CDR regiona svakog varijabilnog domena interaguju da definišu antigen-vezujuće mesto na površini VH-VLdimera. Zajedno, šest CDR regiona čine antigenvezujuću specifičnost antitela. Međutim, čak i pojedinačni varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri CDR regiona specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže se za antigen, iako obično sa nižim afinitetom nego celo vezujuće mesto. "Fab fragment" takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. "Fab fragment" se razlikuje od "Fab' fragmenta" prema dodatku od nekoliko ostataka na karboksi-terminusu CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. "F(ab')2fragment" je originalno napravljen kao par "Fab' fragmenata" koji imaju cisteine zgloba između sebe. Postupci pripreme takvih fragmenata antitela, kao što je digestija papainom ili pepsinom, su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0029] Antitelo može da bude tipa IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM, uključujući tipove IgG ili IgM kao što su, bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgMl i IgM2. Na primer, u nekim slučajevima, antitelo je tipa IgG1, IgG2 ili IgG4.
[0030] U određenim slučajevima, npr., u vezi sa stvaranjem antitela kao kandidata za terapeutska sredstva protiv HER-3, može biti poželjno da antitelo bude sposobno za fiksaciju komplementa i učestvovanje u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC). Postoje brojni izotipovi antitela koji su sposobni za to uključujući: mišji IgM, mišji IgG2a, mišji IgG2b, mišji IgG3, humani IgM, humani IgG1, humani IgG3, i humani IgA, na primer. Jasno je da antitela koja su stvorena ne moraju na početku da imaju dati izotip, već radije antitelo kakvo je proizvedeno može da ima bilo koji izotip, i izotip antitela može da se promeni dodavanjem molekularno kloniranih gena ili cDNK V regiona molekularno kloniranim genima ili cDNK konstantnog regiona u odgovarajućim ekspresionim vektorima korišćenjem uobičajenih molekularno-bioloških tehnika koje su dobro poznate u ovoj oblasti, i zatim eksprimiranjem antitela u ćelijama-domaćinima korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti. Antitelo kome je izotip promenjen može takođe da ima Fc region koji je dobijen molekularnim inženjeringom tako da poseduje nadmoćnu CDC u odnosu na prirodne varijante (Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571-2575) i da se rekombinantno eksprimira u ćelijama-domaćinima korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti. Takve tehnike uključuju upotrebu direktnih rekombinantnih tehnika (videti, npr., SAD patent br.
4,816,397), tehnike fuzije ćelija-ćelija (videti, npr., SAD patent br. 5,916,771 i 6,207,418), između ostalog. U tehnikama fuzije ćelija-ćelija, priprema se ćelijska linija mijeloma ili druga ćelijska linija kao CHO, koja ima teški lanac bilo kog željenog izotipa, i priprema se druga ćelijska linija mijeloma, ili druga ćelijska linija kao CHO, koja ima laki lanac. Takve ćelije mogu zatim da se fuzionišu, i ćelijska linija koja eksprimira intaktno antitelo može da bude izolovana. U smislu primera, humanom anti-HER-3 IgG4 antitelu koje ispoljava željeno vezivanje za HER-3 antigen može lako da bude promenjen izotip da bi se proizveo humani IgM, humani IgG1 ili humani IgG3 izotip, dok i dalje ima isti varijabilni region (koji definiše specifičnost antitela i deo njegovog afiniteta). Takav molekul može tada da ima sposobnost fiksacije komplementa i učestvovanja u CDC.
[0031] Sa druge strane, antitelo takođe može da ima sposobnost vezivanja za Fc receptore na efektorskim ćelijama kao što su monociti i ćelije prirodne ubice (NK), i da učestvuje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC). Brojni izotipovi antitela su sposobni za to, uključujući, bez ograničenja, sledeće: mišji IgG2a, mišji IgG2b, mišji IgG3, humani IgG1 i humani IgG3. Podrazumeva se da antitela koja su proizvedena ne moraju na početku da imaju taj izotip, već radije antitelo kakvo je proizvedeno može da ima bilo koji izotip, i izotip antitela može da se promeni dodavanjem molekularno kloniranih gena ili cDNK V regiona molekularno kloniranim genima ili cDNK konstantnog regiona u odgovarajućim ekspresionim vektorima korišćenjem uobičajenih molekularno-bioloških tehnika koje su dobro poznate u ovoj oblasti, i zatim eksprimiranjem antitela u ćelijama-domaćinima korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti. Antitelo kome je izotip promenjen može takođe da ima Fc region koji je dobijen molekularnim inženjeringom tako da poseduje nadmoćnu ADCC u odnosu na prirodne varijante (Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604) i da se rekombinantno eksprimira u ćelijama-domaćinima korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti. Takve tehnike uključuju upotrebu direktnih rekombinantnih tehnika (videti, npr., SAD patent br. 4,816,397), tehnike fuzije ćelija-ćelija (videti, npr., SAD patente br.
5,916,771 i 6,207,418), između ostalog. U tehnikama fuzije ćelija-ćelija, priprema se ćelijska linija mijeloma, ili druga ćelijska linija kao CHO, koja ima teški lanac bilo kog željenog izotipa, i priprema se druga ćelijska linija mijeloma, ili druga ćelijska linija kao CHO, koja ima laki lanac. Takve ćelije mogu zatim da se fuzionišu, i ćelijska linija koja eksprimira intaktno antitelo može da bude izolovana. U smislu primera, humanom anti-HER-3 IgG4 antitelu koje ispoljava željeno vezivanje za HER-3 antigen, može lako da bude promenjen izotip da bi se proizveo humani IgG1 ili humani IgG3 izotip, dok i dalje ima isti varijabilni region (koji definiše specifičnost antitela i deo njegovog afiniteta). Takav molekul može tada da ima sposobnost vezivanja za FcγR na efektorskim ćelijama i učestvovanja u ADCC.
[0032] TABELA 10 ovde obezbeđuje aminokiselinske sekvence za brojne CDR regione koji mogu da budu uključeni u antitela protiv HER-3. Izolovani vezujući protein usmeren na HER-3 može da uključuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži najmanje jedan CDR izabran iz grupe koja se sastoji od: (a) CDRH1 kao što je prikazano u SEQ ID NOS:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 i 230, (b) CDRH2 kao što je prikazano u SEQ ID NOS:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 i 230, i (c) CDRH3 kao što je prikazano u SEQ ID NOS:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 i 230, i/ili aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži najmanje jedan od CDR regiona izabran iz grupe koja se sastoji od: (d) CDRL1 kao što je prikazano u SEQ ID NOS:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 i 232, (e) CDRL2 kao što je prikazano u SEQ ID NOS:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 i 232, i (f) CDRL3 kao što je prikazano u SEQ ID NOS:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 i 232, kao što je prikazano u listi sekvenci koja je ovde podneta. Antigen-vezujući protein za upotrebu prema pronalasku je kao što je definisano u patentnim zahtevima. drugi antigen-vezujući proteini su obezbeđeni kao uporedni primeri.
[0033] Izolovani vezujući protein usmeren na HER-3 može da uključuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 i 230, i/ili aminokiselinsku sekvencu lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 i 232, kao što je prikazano u listi sekvenci koja je ovde podneta.
[0034] Anti-HER-3 antitelo može da uključuje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca kao što je prikazano u SEQ ID NOS:2 i 4, 6 i 8, 10 i 12, 14 i 16, 18 i 20, 22 i 24, 26 i 28, 30 i 32, 36 i 38, 42 i 44, 46 i 48, 50 i 52, 54 i 56, 60 i 58, 62 i 64, 66 i 68, 70 i 72, 74 i 76, 78 i 82, 80 i 82, 84 i 86, 88 i 90, 92 i 94, 96 i 98, 100 i 102, 104 i 106, 108 i 110, 112 i 114, 116 i 118, 122 i 124, 126 i 128, 130 i 132, 134 i 136, 138 i 140, 142 i 144, 146 i 148, 150 i 152, 154 i 156, 158 i 160, 162 i 164, 166 i 168, 170 i 172, 174 i 176, 178 i 180, 182 i 184, 186 i 188, 190 i 192, 194 i 196, 198 i 200, 202 i 204, 206 i 208, 210 i 212, 214 i 216, 218 i 220, 222 i 224, 226 i 228, 230 i 232, ili aminokiselinsku sekvencu teškog lanca kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOS:34, 40, 60, 62, i 120, ili aminokiselinsku sekvencu lakog lanca kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NOS: 58 i 64, kao što je prikazano u listi sekvenci koja je ovde podneta.
[0035] Protein usmeren na HER-3 može da bude proteinski nosač koji ima antitelu-sličnu vezujuću aktivnost (npr., ima aktivnost sličnu anti-HER-3 antitelu), ili antitelo, npr., anti-HER-3 antitelo. Primeri anti-HER-3 antitela su označeni kao U1-1, U1-2, U1-3, U1-4, U1-5, U1-6, U1-7, U1-8, U1-9, U1-10, U1-11, U1-12, U1-13, U1-14, U1-15, U1-16, U1-17, U1-18, U1-19, U1-20, U1-21, U1-22, U1-23, U1-24, U1-25, U1-26, U1-27, U1-28, U1-29, U1-30, U1-31, U1-32, U1-33, U1-34, U1-35, U1-36, U1-37, U1-38, U1-39, U1-40, U1-41, U1-42, U1-43, U1-44, U1-45, U1-46, U1-47, U1-48, U1-49, U1-50, U1-51, U1-52, U1-53, U1-55.1, U1-55, U1-57.1, U1-57, U1-58, U1-59, U1-61.1, U1-61, i U1-62, ili antitelo koje ima najmanje jedan teški ili laki lanac jednog od gore pomenutih antitela. Antitelo označeno kao U1-59 (SEQ ID NO: 70/72) može da bude korišćeno prema predmetnom pronalasku.
[0036] Podrazumeva se da aminokiselinska sekvenca HER-3 vezujućih proteina koji su ovde opisani nije ograničena na dvadeset uobičajenih aminokiselina (videti, Immunology - A Synthesis (2nd Edition, Golub and Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991). Na primer, aminokiseline mogu da uključuju stereoizomere (npr., D-aminokiseline) dvadeset uobičajenih aminokiselina, aminokiseline koje nisu prirodne kao što su α-,α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, i druge neuobičajene aminokiseline. Primeri neuobičajenih aminokiselina, koje mogu takođe da budu pogodne komponente za vezujuće proteine koji su ovde dati, uključuju: 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline, npr., 4-hidroksiprolin.
[0037] Osim toga, manje varijacije u aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NOS:70 i 72 (kako je navedeno u prilogu koji je ovde podnet), smatraju se obuhvaćenim ovim opisom, pod uslovom da varijacije nisu u CDR sekvencama definisanim u patentnim zahtevima i da zadržavaju najmanje 75% (npr., najmanje 80%, 90%, 95%, ili 99%) od sekvenci prikazanih u SEQ ID NOS:70 i 72. Varijacije mogu da se jave u okvirnim regionima (tj., van CDR regiona). U nekim primerima izvođenja, varijacije u aminokiselinskim sekvencama, tj., delecije, insercije i/ili supstitucije najmanje jedne aminokiseline, mogu da se dogode u blizini granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu da se identifikuju poređenjem podataka o nukleotidnoj i/ili aminokiselinskoj sekvenci sa javnim ili zaštićenim bazama podataka o sekvencama. Postupci za kompjutersko poređenje mogu da se koriste za identifikaciju motiva sekvence ili domena predviđene proteinske konformacije koji se javljaju u drugim vezujućim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Postupci za identifikaciju proteinske sekvence koja se sklapa u poznatu trodimenzionalnu strukturu su poznati u ovoj oblasti. (Videti, npr., Bowie et al. (1991) Science 253:164; Proteins, Structures and Molecular Principles, Creighton, Ed., W H. Freeman and Company, New York (1984); Introduction to Protein Structure, Branden and Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991); i Thornton et al. (1991) Nature 354:105) Na taj način, stručnjaci u ovoj oblasti mogu da prepoznaju motive sekvence i strukturne konformacije koje mogu da se koriste za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena u skladu sa proteinima koji su ovde opisani.
[0038] Varijacije u aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NOS:70 i 72 mogu da uključuju one koje vode smanjenoj podložnosti proteolizi ili oksidaciji, menjaju obrasce glikozilacije ili menjaju afinitete vezivanja ili dodeljuju ili modifikuju druga fizičkohemijska ili funkcionalna svojstva vezujućeg proteina. Naročito, obuhvaćene su konzervativne aminokiselinske zamene. Konzervativne zamene su one koje se događaju unutar familije aminokiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima. Familije aminokiselina uključuju sledeće: familiju kiselih aminokiselina = aspartat, glutamat; familiju baznih aminokiselina = lizin, arginin, histidin; familiju nepolarnih aminokiselina = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i familiju nenaelektrisanih polarnih aminokiselina = glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Alternativne familije uključuju: familiju alifatičnih-hidroksi aminokiselina = serin i treonin; familiju aminokiselina koje sadrže amid = asparagin i glutamin; familiju alifatičnih aminokiselina = alanin, valin, leucin i izoleucin; i familiju aromatičnih aminokiselina = fenilalanin, triptofan i tirozin. Na primer, razumno je očekivati da izdvojena zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom, ili slična zamena aminokiseline strukturno srodnom aminokiselinom neće imati veliki efekat na vezivanje ili svojstva rezultujućeg vezujućeg proteina, posebno ako zamena ne uključuje aminokiselinu u okvirnom regionu. Međutim, sve druge moguće zamene aminokiselina su ovde takođe obuhvaćene. Da li promena aminokiseline rezultuje u funkcionalnom HER-3-vezujućem proteinu koji smanjuje prenos signala pomoću HER-3, može lako da se odredi ispitivanjem specifične aktivnosti vezivanja HER-3 rezultujućeg vezujućeg proteina pomoću ELISA ili FACS testova, ili in vitro ili in vivo funkcionalnim testovima.
[0039] U nekim primerima izvođenja, protein koji se vezuje za HER-3 može da bude spojen sa efektorskom grupom. Takav vezujući protein može da bude posebno koristan za terapeutske primene. Kako se ovde koristi, termin "efektorska grupa" odnosi se na citotoksičnu grupu kao što je radioizotop ili radionuklid, toksin, terapeutska grupa ili druga efektorska grupa poznata u ovoj oblasti. Primeri pogodnih efektorskih grupa su radioizotopi ili radionuklidi (npr., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I) ili neradioaktivni izotopi (npr., 2D), kaliheamicin, analozi dolastatina kao što su auristatini, i hemoterapeutska sredstva kao što su derivati geldanamicina i maitansina, uključujući DM1. Tako, u nekim slučajevima, grupa može da bude i grupa za obeležavanje i efektorska grupa. Različiti postupci spajanja efektorskih grupa za polipeptide ili glikopolipeptide (kao što su antitela) su poznati u ovoj oblasti, i mogu da se koriste u pravljenju i izvođenju kompozicija i postupaka koji su ovde opisani. U nekim primerima izvođenja, može da bude korisno imati efektorske grupe spojene sa vezujućim proteinom ručicama za razmicanje različitih dužina da bi se, na primer, smanjilo potencijalno prostorno ometanje.
[0040] Ovaj dokument se takođe odnosi na postupke za pripremu izolovanog proteina koji se vezuje za HER-3, koji uključuju korak pripreme proteina iz ćelije-domaćina koja eksprimira protein. Ćelije-domaćini koje mogu da se koriste uključuju, bez ograničenja, hibridome, eukariotske ćelije (npr., sisarske ćelije kao što su ćelije hrčka, zeca, pacova, svinje, ili miša), biljne ćelije, ćelije gljiva, ćelije kvasca (npr., ćelije Saccharomyces cerevisiae ili Pichia pastoris), prokariotske ćelije (npr., ćelije E. coli), i druge ćelije koje se koriste za proizvodnju vezujućih proteina. Različiti postupci za pripremu i izolovanje vezujućih proteina, kao što su proteinski nosači ili antitela, iz ćelija-domaćina su poznati u ovoj oblasti i mogu da se koriste u izvođenju postupaka koji su ovde opisani. Osim toga, postupci za pripremu fragmenata vezujućeg proteina, npr., fragmenti proteinskog nosača ili fragmenti antitela, kao što su digestija papainom ili pepsinom, savremene tehnike kloniranja, tehnike za pripremu molekula jednolančanih antitela (Plückthun, goe) i di-antitela (Hollinger et al., gore), takođe su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i mogu da se koriste u izvođenju prethodno opisanih postupaka.
[0041] U nekim primerima izvođenja, protein koji se vezuje za HER-3 može da bude pripremljen iz hibridoma koji sekretuje protein. Videti, npr., Köhler et al. (1975) Nature 256:495.
[0042] U nekim primerima izvođenja, protein koji se vezuje za HER-3 može da bude pripremljen rekombinantno optimizacijom i/ili amplifikacijom ekspresije vezujućeg proteina u ćelijama-domaćinima, i izolovanjem vezujućeg proteina iz ćelija-domaćina. U tom cilju, ćelije-domaćini mogu da budu transformisane ili transficirane sa DNK (npr., vektorom) koja kodira protein koji se vezuje za HER-3, i gajene pod odgovarajućim uslovima za proizvodnju vezujućeg proteina. Videti, npr., SAD patent br. 4,816,567. Korisne ćelije-domaćini uključuju, na primer, CHO ćelije, NS/0 ćelije mijeloma, 293 ćelije humanog embrionskog bubrega, ćelije E. coli i ćelije Saccharomyces cerevisiae.
[0043] HER-3-vezujući proteini koji su antitela mogu da budu pripremljeni iz životinja koje su genetski modifikovane tako da proizvode potpuno humana antitela, ili iz biblioteke koja prikazuje antitelo napravljene u bakteriofagu, kvascu, ribozomu ili E. coli. Videti, npr., Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Feldhaus and Siegel (2004) J. Immunol. Methods 290:69-80; Groves and Osbourn (2005) Expert Opin. Biol. Ther. 5:125-135; i Jostock and Dubel (2005) Comb. Chem. High Throughput Screen 8:127-133.
[0044] U nekim primerima izvođenja, antitela kao što su ovde data, mogu da budu potpuno humana ili humanizovana antitela. Humana antitela izbegavaju određene probleme povezane sa ksenogenim antitelima, kao što su antitela koja imaju mišje ili pacovske varijabilne i/ili konstantne regione. Prisustvo ksenogenih proteina može da dovede do imunskog odgovora protiv antitela kod pacijenta, što dovodi do brzog klirensa antitela, gubitka terapeutske korisnosti putem neutralizacije antitela, i/ili ozbiljnih, čak životno-ugrožavajućih, alergijskih reakcija. Da bi se izbeglo korišćenje antitela dobijenih iz miša ili pacova, potpuno humana antitela mogu da budu proizvedena putem uvođenja lokusa funkcionalnog humanog antitela u glodara ili drugog sisara ili životinju, tako da glodar, drugi sisar ili životinja proizvodi potpuno humana antitela.
[0045] Jedan postupak za stvaranje potpuno humanih antitela je korišćenje sojeva XENOMOUSE® miševa koji su modifikovani tako da sadrže fragmente veličine 245 kb i 190 kb lokusa teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca čoveka u konfiguraciji klicine linije. Drugi sojevi XENOMOUSE® miševa sadrže fragmente veličine 980 kb i 800 kb lokusa teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca čoveka u konfiguraciji klicine linije. Sledeći sojevi XENOMOUSE® miševa sadrže fragmente 980 kb i 800 kb lokusa teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca čoveka u konfiguraciji klicine linije i dodatno potpuni lokus lambda lakog lanca čoveka veličine 740 kb u konfiguraciji klicine linije. Videti, Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; i Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495. Sojevi XENOMOUSE® su dostupni kod Amgen, Thousand Oaks, CA.
[0046] Proizvodnja XENOMOUSE® miševa se dodatno razmatra i opisuje u SAD patentnoj objavi 2003/0217373, podnetoj 20. novembra 2002.; SAD patentima br. 5,939,598, 6,075,181, 6,114,598, 6,150,584, 6,162,963, 6,673,986, 6,833,268 i 7,435,871, i japanskim patentima br. 3068180B2, 3068506B2 i 3068507B2. Videti, takođe, evropski patent br. EP0463151, PCT objave br. WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893 i WO 00/76310.
[0047] Alternativno, može da se koristi pristup "minilokusa". U pristupu minilokusa, egzogeni Ig lokus se imitira putem uključivanja delova (pojedinačni geni) iz Ig lokusa. Na taj način, jedan ili više VHgena, jedan ili više DHgena, jedan ili više JHgena, mu konstantni region, i drugi konstantni region (npr., gama konstantni region) se oblikuju u konstrukt za umetanje u životinju. Ovaj pristup je opisan u SAD patentima br. 5,545,806, 5,545,807, 5,569,825, 5,591,669, 5,612,205, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,643,763, 5,661,016, 5,721,367, 5,770,429, 5,789,215, 5,789,650, 5,814,318, 5,874,299, 5,877,397, 5,981,175, 6,023,010, 6,255,458. Videti, takođe, EP patent br.0546073, i PCT objave br. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 i WO 98/24884.
[0048] Humana antitela takođe mogu da budu dobijena iz miševa u koje su uvedeni, putem mikroćelijske fuzije, veliki delovi hromozoma, ili celi hromozomi. Videti, EP patentne prijave br. 773288 i 843961, čiji su opisi ovde ugrađeni u celosti prema referenci. Dodatno, stvoreni su KM™ miševi, koji su rezultat ukrštanja Kirin Tc miševa sa Medarex minilokus (Humab) miševima. Ovi miševi imaju HC transhromozom Kirin miševa i transgen kapa lanca Medarex miševa (Ishida et al. (2002) Cloning Stem Cells 4:91-102).
[0049] Humana antitela takođe mogu da budu dobijena in vitro postupcima. Pogodni primeri uključuju, ali bez ograničenja, prikaz na fagu (komercijalizovano u Cambridge Antibody Technology, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (bivši Proliferon), i Affimed), prikaz na ribozomu (komercijalizovano u Cambridge Antibody Technology), prikaz na kvascu, i slično.
[0050] Kao što je ovde opisano, antitela su pripremljena korišćenjem tehnologije XENOMOUSE®, kao što je opisano u nastavku. Takvi miševi su sposobni da proizvode humane imunoglobulinske molekule i antitela, i deficitarni su u proizvodnji mišjih imunoglobulinskih molekula i antitela. Tehnologije koje su korišćene za postizanje ovoga su opisane u patentima, prijavama, i referencama koje su ovde opisane. Na primer, transgeno dobijanje miševa i antitela iz njih opisano je u SAD patentnoj prijavi serijski br.08/759,620, podnetoj 3. decembra 1996, i PCT objavama br. WO 98/24893 i WO 00/76310. Videti takođe Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156.
[0051] Korišćenjem tehnologije kao što je ovde opisano, potpuno humana monoklonska antitela na razne antigene mogu da budu proizvedena. Na primer, XENOMOUSE® linije miševa mogu da budu imunizovane HER-3 antigenom od interesa (npr., HER-3 ili njegovim fragmentom), limfatične ćelije (kao B-ćelije) mogu da budu izdvojene iz miševa koji eksprimiraju antitela, i izdvojene ćelijske linije mogu da budu fuzionisane sa ćelijskom linijom mijeloidnog tipa da bi se pripremile imortalizovane ćelijske linije hibridoma. Ove ćelijske linije hibridoma mogu da budu ispitane i selektovane da bi se identifikovale ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela specifična za antigen od interesa. Ovde su dati postupci za proizvodnju multiplih ćelijskih linija hibridoma koje proizvode antitela specifična za HER-3. Dodatno su ovde obezbeđeni postupci za karakterizaciju antitela proizvedenih u takvim ćelijskim linijama, uključujući analize nukleotidne i aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca takvih antitela.
[0052] Uopšteno, antitela proizvedena u fuzionisanim hibridomima kao što je dole opisano su teški lanci humanog IgG1 sa potpuno humanim kapa lakim lancima, mada neka antitela koja su ovde opisana imaju teške lance humanog IgG4 kao i teške lance IgG1. Antitela takođe mogu da budu drugih humanih izotipova, uključujući IgG2 i IgG3. Antitela uopšteno imaju visoke afinitete, sa KDobično od oko 10-6 do oko 10-13 M ili manje, mereno tehnikama čvrste faze i tehnikama zasnovanim na ćelijama.
[0053] Ovaj dokument takođe opisuje izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju proteine koji se vezuju za HER-3 kao što je ovde opisano. Termin "izolovani molekul nukleinske kiseline", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotid genomskog, cDNK, ili sintetičkog porekla, ili neku njihovu kombinaciju, koji (1) nije povezan sa celim ili delom polinukleotida sa kojim se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) je operativno vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi, ili (3) ne javlja se u prirodi kao deo veće sekvence. Dalje, termin "molekul nukleinske kiseline", kako se ovde koristi, označava polimerni oblik nukleotida sa dužinom od najmanje 10 baza, bilo ribonukleotida ili deoksinukleotida ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida, kao što su nukleotidi sa modifikovanim ili supstituisanim grupama šećera i slično. Termin takođe uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.
[0054] Molekul nukleinske kiseline može da bude operativno vezan za kontrolnu sekvencu. Termin "kontrolna sekvenca", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne za postizanje ekspresije i obrade kodirajućih sekvenci sa kojima su spojene. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina. Kod prokariota, takve kontrolne sekvence uopšteno uključuju promotore, vezujuća mesta za ribozome, i transkripcione terminacione sekvence. Kod eukariota, uopšteno, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i transkripcione terminacione sekvence. Termin "kontrolna sekvenca" je namenjen da uključuje, najmanje, sve komponente čije prisustvo je neophodno za ekspresiju i obradu, i može takođe da uključuje dodatne komponente čije prisustvo predstavlja prednost, na primer, lider sekvence i sekvence fuzionih partnera. Osim toga, termin "operativno vezan", kako se ovde koristi, odnosi se na položaje tako opisanih komponenti, koje se nalaze u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na način koji je za njih očekivan. Dodatno, ekspresiona kontrolna sekvenca koja je operativno vezana za kodirajuću sekvencu je vezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa ekspresionom kontrolnom sekvencom.
[0055] Takođe, ovde su opisani vektori koji sadrže molekul nukleinske kiseline koji kodira vezujući protein kao što je ovde opisano. Molekul nukleinske kiseline može da bude operativno vezan za kontrolnu sekvencu. Osim toga, vektor može dodatno da sadrži oridžin replikacije ili selekcioni marker gen. Primeri vektora koji mogu da se koriste uključuju, npr., plazmide, kozmide, fage i viruse.
[0056] Ovaj dokument takođe opisuje ćelije-domaćine transformisane molekulom nukleinske kiseline ili vektora kao što je ovde opisano. Transformacija može da bude postignuta bilo kojim poznatim postupkom za uvođenje polinukleotida u ćeliju-domaćina, uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukciju ćelije-domaćina virusom (ili vektorom), ili postupcima za transfekciju poznatim u ovoj oblasti, kao što je prikazano u SAD patentima br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 i 4,959,455. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u sisarske ćelije su dobro poznati u ovoj oblasti, i uključuju, bez ograničenja, transfekciju posredovanu dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida u lipozome i direktnu mikroinjekciju DNK u jedra. Primeri ćelija-domaćina koje mogu da se koriste uključuju hibridome, eukariotske ćelije (npr., sisarske ćelije kao što su ćelije hrčka, zeca, pacova, svinje, miša, ili drugih životinja), biljne ćelije (npr., ćelije kukuruza i duvana), ćelije gljiva (npr., ćelije S. cerevisiae i P. pastoris), prokariotske ćelije kao E. coli, i druge ćelije koje se koriste u ovoj oblasti za proizvodnju antitela. Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u ovoj oblasti i uključuju, na primer, mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne iz Američke kolekcije kultura sojeva (ATCC; Manassas, VA). One uključuju, bez ograničenja, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije majmunskog bubrega (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2 ćelije), i brojne druge ćelijske linije.
3. Sredstva koja se vezuju za druge članove familije HER
[0057] Kao što je prethodno istaknuto, kompozicije i postupci koji su ovde opisani za lečenje bolesti povezane sa HER-3 uključuju prvo sredstvo koje se vezuje za HER-3, u kombinaciji sa drugim sredstvom koje se vezuje za i/ili inhibira bar jedan dodatni član HER familije, uključujući, ali bez ograničenja, EGF-R, HER-2, HER-4. Prema pronalasku, drugo sredstvo je trastuzumab. Drugi primeri van obima pronalaska uključuju biološki lek, npr., vezujući protein, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za člana HER familije, jedinjenje malog molekula koje se vezuje za i/ili menja (npr., inhibira) aktivnost najmanje jednog člana HER familije koji nije (ili pored) HER-3, siRNK, ili prirodnu supstancu. Kako se ovde koristi, termini "drugi članovi HER familije" i "drugi član HER familije" odnosi se na članove HER familije koji nisu HER-3. Primeri su EGF-R, HER-2, i HER-4, ali "član HER familije" takođe uključuje članove familije koji još nisu identifikovani.
[0058] Drugo sredstvo može da izmeni aktivnost (npr., poveća ili smanji aktivnost) drugog člana HER familije, bilo putem neposrednog delovanja ili posrednog delovanja na člana HER familije. Treba napomenuti, međutim, da će sva druga sredstva, kao što je ovde opisano, imati dejstvo na funkciju i aktivnost HER familije.
[0059] Trastuzumab (takođe poznat kao HERCEPTIN®) je humanizovano monoklonsko antitelo koje interferira sa HER2/neu receptorom. Prema pronalasku, kompozicija za lečenje bolesti povezane sa HER3, koja predstavlja kancer koji eksprimira ili prekomerno eksprimira HER3, može da bude U1-59 u kombinaciji sa trastuzumabom, ili U1-59, u kombinaciji sa trastuzumabom i drugim sredstvom(ima) kao docetaksel ili paklitaksel, za lečenje kancera koji eksprimira ili prekomerno eksprimira HER3, kao što je kancer dojke, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer pluća, kancer bubrega, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, tiroidni kancer, kancer bešike, gliom, melanom, metastatski kancer dojke, nesitnoćelijski kancer pluća, epidermoidni karcinom, fibrosarkom, melanom, nazofaringealni karcinom, ili karcinom skvamoznih ćelija. U nekim poželjnim primerima izvođenja, U1-59 može da se koristi u lečenju pacijenata sa kancerima uključujući kancer dojke i metastatski kancer dojke čiji tumori eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-2 protein i koji nisu primili hemoterapiju za svoju (metastatsku) bolest, u kombinaciji sa trastuzumabom i paklitakselom, ili u kombinaciji sa trastuzumabom i docetakselom.
4. Dodatna sredstva za upotrebu u kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani
[0060] Dodatna sredstva mogu da se dodaju prvom i drugom sredstvu kao što je ovde opisano. To će, u nekim primerima izvođenja, biti hemoterapeutski lekovi.
[0061] Na primer, sredstva koja deluju kao stimulansi mikrotubula uključuju NK-105 (paklitaksel) [(-)-(1S,2R,3S,4S,SR,7S,8S,10R,13S)-4,10-diacetoksi-2-benzoiloksi-5,20-epoksi-1,7-dihidroksi-9-oksotaks-11-en-13-il (2R,3S)-3-benzoilamino-2-hidroksi-3-fenilpropionat] (NanoCarrier, Chiba, Japan), milataksel (1,10β-dihidroksi-9-okso-5β,20-epoksi-3zeta-taks-11-en-2α,4,7β13α-tetrail 4-acetat 2-benzoat 13-[(2R,3R)-3-(tercbutoksikarbonilamino)-3-(furan-2-il)-2-hidroksipropanoat] 7-propanoat) (Taxolog, Fairfield, NJ), laulimalid (Kosan Biosciences, Hayward, CA (B-M Squibb)), sarkodiktiin A ((1R,4aR,6S,7S,10R,12aR)-11-metoksikarbonil-7,10-epoksi-10-hidroksi-1-izopropil-4,7-dimetil-1,2,4a,5,6,7,10,12a-oktahidrobenzociklododecen-6-il estar 3-(1-metilimidazol-4-il)-2(E)-propenske kiseline) (Pfizer, New York, NY), simotaksel ((2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-4,11-dihidroksi-4a,8,13,13-tetrametil-5-okso-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodekahidro-7,11-metano-1H-ciklodeka[3,4]benz[1,2-b]okset-6,9,12,12b-tetrail 12b-acetat 12-benzoat 6-ciklopentankarboksilat 9-[(2R,3R)-2-hidroksi-3-[[(1-metiletoksi)karbonil]amino]-3-(tiofen-2-il)propanoat]) (Taxolog, Fairfield, NJ), SYN-2001 (CLL Pharma, Nice, Francuska), TL-310 (Taxolog, Fairfield, NJ), TL1836 (Taxolog, Fairfield, NJ), tesetaksel (2'-[(dimetilamino)metil]-1-hidroksi-5β,20-epoksi-9α,10α-dihidro[1,3]dioksolo[4',5':9,10]taks-11-en-2α,4,13α-triil4-acetat 2-benzoat 13-[(2R,3S)-3-[(terc-butoksikarbonil)amino]-3-(3-fluoropiridin-2-il)-2-hidroksipropanoat) (Daiichi Sankyo, Tokyo, Japan), TL-1892 (Taxolog, Fairfield, NJ), TPI-287 (N-terc-butil estar (2'R,3'S)-2'-hidroksi-N-karboksi-3'-amino-5'-metil-heksanska kiselina, 13 estar 5β-20-epoksi-1,2α,4,7β,9α,10α,13α-heptahidroksi-4,10-diacetat-2-benzoat-7,9-akrolein acetal-taks-11-en) (Tapestry Farmaceutskas, Boulder, CO), ortataksel (6,12b-diacetoksi-12-benzoiloksi-10,11-karbonildioksi-4-hidroksi-4a,8,13,13-tetrametil-5-okso-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodekahidro-1H-7,11-metanociklodeka[3,4]benz[1,2-b]okset-9-il estar 2aR-[2aα,4β,4aβ,6β,9α(2R,3S),10β,11β,12α,12aα,12bα]-3-(tercbutoksikarbonilamino)-2-hidroksi-5-metil-heksanske kiseline) (Indena, Milan, Italija), paklitaksel poliglumeks (L-piroglutamilpoli-L-glutamil-L-glutaminska kiselina delimično γesterifikovana sa (1R,2S)-2-(benzoilamino)-1-[[[(2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetiloksi)-12-(benzoiloksi)-4,11-dihidroksi-4a,8,13,13-tetrametil-5-okso-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodekahidro-7,11-metano-1H-ciklodeka[3,4]benzo[1,2-b]okset-9-il]oksi]karbonil]-2-feniletilom) (Cell Therapeutics, Seattle, WA), paklitakselčestice vezane za protein (paklitaksel : (-)-(1S,2R,3S,4S, 5R,7S,8S,10R,13S)-4,10-diacetoksi-2-benzoiloksi-5,20-epoksi-1,7-dihidroksi-9-oksotaks-11-en-13-il (2R,3S)-3-benzoilamino-2-hidroksi-3-fenilpropionat) (Abraxis BioScience, Los Angeles, CA), paklitaksel(NCI) ((-)-(1S,2R,3S,4S,5R,7S,8S,10R,13S)-4,10-diacetoksi-2-benzoiloksi-5,20-epoksi-1,7-dihidroksi-9-oksotaks-11-en-13-il (2R,3S)-3-benzoilamino-2-hidroksi-3-fenilpropionat) (NCI(NIH)), paklitaksel (NeoPharm, Lake Bluff, IL) ((-)-(1S,2R,3S,4S,5R,7S,8S,10R,13S)-4,10-diacetoksi-2-benzoiloksi-5,20-epoksi-1,7-dihidroksi-9-oksotaks-11-en-13-il (2R,3S)-3-benzoilamino-2-hidroksi-3-fenilpropionat) (NeoPharm, Lake Bluff, IL), patupilon ((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)-7,11-dihidroksi-8,8,10,12,16-pentametil-3-[(1E)-1-(2-metil-1,3-tiazol-4-il)prop-1-en-2-il]-4,17-dioksabiciklo[14.1.0] heptadekan-5,9-dion) ( SAD objava br. 2003/0104625, Novartis, Basel, Švajcarska), PEG-paklitaksel (Enzo Pharmaceuticals, Long Island, NY), docetaksel hidrat ((-)-(1S,2S,3R,4S,5R,7S,8S,10R,13S)-4-acetoksi-2-benzoiloksi-5,20-epoksi-1,7,10-trihidroksi-9-oksotaks-11-en-13-il(2R,3S)-3-tercbutoksikarbonilamino-2-hidroksi-3-fenilpropionat trihidrat) (Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ), eleuterobin ((1R,4aR,6S,7S,10R,12aR)-11-(2-O-acetil-β-D-arabinopiranoziloksimetil)-7,10-epoksi-1-izopropil-10-metoksi-4,7-dimetil-1,2,4a,5,6,7,10,12a-oktahidrobenzociklododecen-6-il estar 3-(1-metilimidazol-4-il)-2(E)-propenske kiseline) (Bristol-Myers Squibb, New York, NY), IDN-5390 (Indena, Milan, Italija), iksabepilon ((1S,3S,7S,10R,11S,12S,16R)-7,11-dihidroksi-8,8,10,12,16-pentametil-3-[(1E)-1-metil-2-(2-metiltiazol-4-il)etenil]-17-oksa-4-azabiciklo[14.1.0]heptadekan-5,9-dion) (Bristol-Myers Squibb, New York, NY), KOS-1584 (Kosan Biosciences, Hayward, CA(B-M Squibb)), KOS-1803 (17-izo-oksazol 26-trifluoro-9,10-dehidro-12,13-dezoksi-epotilon B) (Kosan Biosciences, Hayward, CA (B-M Squibb)), KOS-862 (Kosan Biosciences, Hayward, CA (B-M Squibb); SAD patent br.6204388 i 6303342), larotaksel (1-hidroksi-9-okso-5β,20-epoksi-7β,19-ciklotaks-11-en-2α,4,10β,13α-tetrail 4,10-diacetat 2-benzoat 13-[(2R,3S)-3-[(tercbutoksikarbonil)amino]-2-hidroksi-3-fenilpropanoat] dehidrat) (Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ, PCT objave br. WO 95/26961 i WO 96/1259), ANG-1005 (Angiopep-2/paklitaksel konjugat) (AngioChem, Montreal, Kanada, SAD patent br.7557182), BMS-184476 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY, EP objava br.639577), BMS-188797 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY), BMS-275183 (3'-terc-butil-3'-N-terc-butiloksikarbonil-4-deacetil-3'-defenil-3'-N-debenzoil-4-O-metioksi-karbonil-paklitaksel) (Bristol-Myers Squibb, New York, NY), BMS-310705 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY), BMS-753493 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY), kabazitaksel (1-hidroksi-7β,10β-dimetoksi-9-okso-5β,20-epoksitaks-11-en-2α,4,13α-triil 4-acetat 2-benzoat 13-[(2R,3S)-3-[[(terc-butoksi)karbonil]amino]-2-hidroksi-3-fenilpropanoat]) (Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ), DHA-paklitaksel (Protarga, King of Prussia, PA, TAXOPREXIN®), disermolid ([3S-[3α,4β,5β,6α(2R*,3Z,5R*,6R*,7S*,8Z,11R*,12S*,13S*,14S*,15R*,16E)]]-6-[14[(aminokarbonil)oksi]-2,6,12-trihidroksi-5,7,9,11,13,15-heksametil-3,8,16,18-nonadekatetraenil]tetrahidro-4-hidroksi-3,5-dimetil-2H-piran-2-on) (Novartis, Basel, Švajcarska, SAD patenti br.4939168 i 5681847). Neki od ovih stimulansa mikrotubula imaju prsten taksana u svojim hemijskim strukturama; takva jedinjenja koja imaju taksanski prsten su ovde označena kao "taksani".
[0062] Antraciklini uključuju aktinomicine kao aktinomicin D (daktinomicin: 2-amino-N,N'-bis[(6S,9R,10S,13R,18aS)- 6,13-diizopropil- 2,5,9-trimetil- 1,4,7,11,14-pentaoksoheksadekahidro- 1H-pirolo[2,1-i] [1,4,7,10,13] oksatetraazacikloheksadecin- 10-il]-4,6-dimetil- 3-okso- 3H-fenoksazin- 1,9-dikarboksamid), bleomicin (bleomicin hidrohlorid: (3-{[(2'-{(5S,8S,9S,10R,13S)-15-{6-amino-2- [(1S)-3-amino-1-{[(2S)-2,3-diamino-3-oksopropil]amino}-3-oksopropil] -5-metilpirimidin-4-il}-13-[{[(2R,3S,4S,5S,6S)-3-{[(2R,3S,4S,5R,6R)-4-(karbamoiloksi)-3,5-dihidroksi-6-(hidroksimetil)tetrahidro-2H-piran-2-il]oksi} -4,5-dihidroksi-6-(hidroksimetil) tetrahidro-2H-piran-2-il]oksi} (1H-imidazol-5-il)metil]-9-hidroksi-5-[(1R)-1-hidroksietil]-8,10-dimetil-4,7,12,15- tetraokso-3,6,11,14-tetraazapentadec-1-il}-2,4'-bi-1,3- tiazol-4-il)karbonil]amino}propil)(dimetil)sulfonijum), daunorubicin hidrohlorid (daunorubicin: 8S-cis)-8-acetil-10-((3-amino-2,3,6-trideoksi-alfa-L-likso-heksopiranozil) oksi)-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroksi-1-metoksi-5,12-naftacendion hidrohlorid), doksorubicin hidrohlorid (doksorubicin: (8S,10S)-10-[(3-amino2,3,6-trideoksi-α-L-likso-heksopiranozil)oksi]-8-glikoloil-7,8,9,10-tetrahidro-6, 8,11-trihidroksi-1-metoksi-5,12-naftacendion hidrohlorid) (Alza, Mountain View, CA), idarubicin hidrohlorid ((7S,9S)-9-acetil-7,8,9,10-tetrahidro-6,7,9,11-tetrahidroksi-7-O-(2,3,6-trideoksi-3-amino-α-L-likso-heksopiranozil)-5,12-naftacendion hidrohlorid) (Pfizer, New York, NY, SAD patenti br. 4046878 i 4471052), i mitomicin ((1aS,8S,8aR,8bR)-6-amino-4,7-diokso-1,1a,2,8,8a,8b-heksahidro-8a-metoksi-5-metilazirino[2,3:3,4]pirolo[1,2-α]indol-8-ilmetilkarbamat) (Kyowa-Hakko-Kirin, Tokyo, Japan).
[0063] Cisplatin i gemcitabin su hemoterapeutska sredstva. Cisplatin ili cisdiamindihloroplatina(II) je lek na bazi platine koji se koristi za lečenje različitih tipova kancera. Cisplatin kompleks platine reaguje in vivo, vezujući se za, i izazivajući unakrsno vezivanje DNK, što na kraju izaziva apoptozu. Gemcitabin je nukleozidni analog u kome su atomi vodonika na 2' ugljenicima deoksicitidina zamenjeni atomima fluora. Kao fluorouracil i drugi analozi pirimidina, gemcitabin zamenjuje citidin tokom replikacije DNK, što zaustavlja rast tumora budući da sledeći nukleozidi ne mogu da se vežu za "pogrešni" nukleozid, što rezultuje u apoptozi. Gemcitabin se prodaje na tržištu kao GEMZAR® kod Eli Lilly and Company (Indianapolis, IN). U nekim primerima izvođenja, kombinacija za lečenje bolesti povezane sa HER-3 može da bude: U1-59 u kombinaciji sa trastuzumabom kao što je ovde opisano i cisplatin ili gemcitabin i drugo sredstvo(a), za lečenje kancera koji je gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer bubrega, kancer debelog creva, tiroidni kancer, kancer bešike, gliom, melanom, kancer pluća uključujući nesitnoćelijski kancer pluća, kolorektalni kancer i/ili kancer dojke uključujući metastatski kancer dojke.
[0064] Kapecitabin (pentil[1-(3,4-dihidroksi-5-metil-tetrahidrofuran-2-il)-5-fluoro-2-okso-1H-pirimidin-4-il]aminometanoat, Xeloda, Roche) je hemoterapeutsko sredstvo koje se primenjuje oralno. Kapecitabin je prolek koji se enzimski pretvara u 5-fluorouracil u tumoru, gde inhibira sintezu DNK i usporava rast tumorskog tkiva. U nekim primerima izvođenja, kombinacija za lečenje bolesti povezane sa HER-3 može da bude: U1-59 u kombinaciji sa trastuzumabom i kapecitabin za lečenje kancera, gde je kancer gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer bubrega, kancer debelog creva, tiroidni kancer, kancer bešike, gliom, melanom, kancer pluća uključujući nesitnoćelijski kancer pluća, kolorektalni kancer i/ili kancer dojke uključujući metastatski kancer dojke. U nekim slučajevima, takva kombinacija može da bude primenjena nakon neuspeha prethodnog lečenja sa antraciklinom ili taksanom, na primer. U nekim poželjnim primerima izvođenja, U1-59 može da se koristi u lečenju pacijenata sa kancerima uključujući kancer dojke i metastatski kancer dojke čiji tumori eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-2 protein i koji su primili prethodnu hemoterapiju uključujući antraciklin (na primer, doksorubicin ili srodno sredstvo), i/ili taksan (na primer, paklitaksel ili docetaksel), i trastuzumab, u kombinaciji sa lapatinibom i kapecitabinom.
[0065] Docetaksel(13-estar N-terc-butil estra (2R,3S)-N-karboksi-3-fenilizoserina sa trihdratom 5, 20-epoksi-1, 2, 4, 7, 10, 13-heksahidroksitaks-11-en-9-on 4-acetat 2-benzoata) i paklitaksel ((2α,4α,5β,7β,10β,13α)-4,10-bis(acetiloksi)-13-{[(2R,3S)-3-(benzoilamino)-2-hidroksi-3-fenilpropanoil]oksi}-1,7-dihidroksi-9-okso-5,20-epoksitaks-11-en-2-il benzoat) su hemoterapeutska sredstva. Docetaksel se na tržištu nalazi pod imenom Taxotere proizvođača Sanofi Aventis. Paklitaksel se na tržištu nalazi pod imenom Taxol proizvođača Bristol-Myers Squibb. U formulaciji Taxol, paklitaksel je rastvoren u Cremophor EL i etanolu, kao sredstvu za dostavu. Formulacija u kojoj je paklitaksel vezan za albumin se nalazi na tržištu kao Abraxane. U nekim primerima izvođenja, kombinacija za lečenje bolesti povezane sa HER-3 može da bude: U1-59 u kombinaciji sa trastuzumabom i docetaksel ili paklitaksel i drugo sredstvo(a) za lečenje kancera, gde je kancer gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer bubrega, kancer debelog creva, tiroidni kancer, kancer bešike, gliom, melanom, kancer pluća uključujući nesitnoćelijski kancer pluća, kolorektalni kancer i/ili kancer dojke uključujući metastatski kancer dojke. U nekim poželjnim primerima izvođenja U1-59 može da se koristi u lečenju pacijenata sa kancerima uključujući kancer dojke i metastatski kancer dojke čiji tumori eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-2 protein i koji nisu primali hemoterapiju za svoju (metastatsku) bolest, u kombinaciji sa trastuzumabom i paklitakselom, ili u kombinaciji sa trastuzumabom i docetakselom.
[0066] Injekcija lipozomalnog doksorubicin hidrohlorida se nalazi na tržištu kao Doxil, lipozomska formulacija koja sadrži doksorubicin hlorid. U nekim primerima izvođenja, kombinovani tretman za bolest povezanu sa HER-3 može da uključuje primenu U1-59 u kombinaciji sa trastuzumabom i injekcije lipozomalnog doksorubicin hidrohlorida, sa ili bez jednog ili više dodatnih sredstava kao paklitaksel ili hemoterapeutska sredstva na bazi platine, za lečenje kancera kao što je kancer dojke, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer pluća, kancer bubrega, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, tiroidni kancer, kancer bešike, gliom, melanom, metastatski kancer dojke, nesitnoćelijski kancer pluća, epidermoidni karcinom, fibrosarkom, melanom, nazofaringealni karcinom i karcinom skvamoznih ćelija.
[0067] Irinotekan hidrohlorid hidrat (irinotekan: (+)-(4S)-4,11-dietil-4-hidroksi-9-[(4-piperidinopiperidino)karboniloksi]-1H-pirano[3',4':6,7]indolizino[1-2-b]kvinolin-3,14(4H,12H)-dion hidrohlorid trihidrat) (Yakult, EP objave br.137145 i 56692) se na tržištu nalazi kao Campto, Camptosar i Ircan. U nekim primerima izvođenja, kombinovani tretman za bolest povezanu sa HER-3 može da uključuje primenu antitela U1-59 u kombinaciji sa trastuzumabom i irinotekan hidrohlorid hidrata, ili antitela U1-59 u kombinaciji sa trastuzumabom, irinotekan hidrohlorid hidrata, i jednog ili više dodatnih sredstava kao 5-FU (5'-deoksi-5-fluorouridin ili 5-fluoro-2,4(1H,3H)-pirimidindion), kalcijum folinat (kalcijumova so N-[4-[[(2-amino-5-formil-1,4,5,6,7,8-heksahidro-4-okso-6-pteridinil)metilamino]benzoil]-L-glutaminske kiseline (1:1)) ili kalcijum levofolinat ((-)-kalcijum N-[4-[[[(6S)-2-amino-5-formil-1,4,5,6,7,8-heksahidro-4-okso-6-pteridinil]metil]amino]benzoil]-L-glutamat), i njihovih kombinacija, za lečenje kancera kao što je kancer dojke, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer pluća, kancer bubrega, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, tiroidni kancer, kancer bešike, gliom, melanom, metastatski kancer dojke, nesitnoćelijski kancer pluća, epidermoidni karcinom, fibrosarkom, melanom, nazofaringealni karcinom i karcinom skvamoznih ćelija.
[0068] U nekim primerima izvođenja, dodatna sredstva za upotrebu u kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani mogu da predstavljaju veštački ili prirodni nosač koji nije antitelo, ali ima aktivnost sličnu antitelu (npr., ima aktivnost sličnu onoj kod antitela).
[0069] U nekim drugim primerima izvođenja, pomenuta dodatna sredstva mogu da budu sredstva koja inhibiraju, blokiraju ili smanjuju (deluju kao antagonisti), ili aktiviraju, stimulišu ili ubrzavaju (deluju kao agonisti) aktivnost drugih ciljnih molekula, uključujući, ali bez ograničenja, one koji deluju na puteve ćelijskog rasta i/ili preživljavanja, kao što su inhibitori PI3K, inhibitori AKT, inhibitori mTOR, inhibitori RAF/B-RAF, inhibitori RAS, inhibitori MEK, inhibitori receptora smrti uključujući agoniste DR4 i DR5 kao što su anti-DR4 ili DR5 agonistička antitela (na primer, cedelizumab, tigatuzumab, drozirumab, konatumumab), agoniste PPAR gama (na primer, efatutazon, troglitazon, pioglitazon, rosiglitazon), inhibitore c-MET, inhibitore Hsp-90 i inhibitore telomeraze.
[0070] Pomenuta dodatna sredstva mogu da budu anti-angiogena sredstva, uključujući, ali bez ograničenja, antagoniste/inhibitore VEGF (na primer, bevacizumab, vandetanib).
[0071] Pomenuta dodatna sredstva mogu da budu imunoterapeutska kao što su vakcine ili terapeutici na bazi ćelija.
[0072] Kao što je dalje opisano u nastavku teksta, ova i druga sredstva mogu da budu sadržana u kompozicijama koje su ovde opisane, i mogu da se primene u brojnim različitim oblicima, kombinacijama i dozama.
5. Kompozicije
[0073] Ovaj dokument takođe opisuje farmaceutske kompozicije koje sadrže sredstvo koje se vezuje za HER-3 kao što je ovde opisano, u kombinaciji sa drugim sredstvom koje je usmereno protiv drugog proteina HER familije ili je hemoterapeutsko jedinjenje, kao i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili adjuvanasa. Termin "farmaceutska kompozicija", kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje ili kompoziciju koja može da indukuje željeno terapeutsko dejstvo kada se pravilno primeni kod pacijenta (The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, Parker, Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)). Potentnost ovde obezbeđenih farmaceutskih kompozicija obično se zasniva na vezivanju najmanje jednog vezujućeg proteina za HER-3. Ovo vezivanje može da vodi smanjenju prenosa signala posredovanog sa HER-3.
[0074] "Farmaceutski prihvatljiv nosač" (ovde takođe označen kao "ekscipijens" ili "nosač") je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, sredstvo za suspendovanje, sredstvo za stabilizovanje, ili bilo koji drugi farmakološki inertni vehikulum za dostavljanje jednog ili više terapeutskih jedinjenja (npr., proteina koji se vezuju za HER) subjektu, koji je netoksičan za ćeliju ili sisara koji mu je izložen u dozama i koncentracijama koje se koriste. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu da budu tečni ili čvrsti, i mogu da budu odabrani imajući u vidu planirani način primene kako bi se obezbedio željeni obim, konzistentnost, i druga relevantna transportna i hemijska svojstva, kada se kombinuju sa jednim ili više terapeutskih jedinjenja i bilo kojim drugim komponentama date farmaceutske kompozicije. Tipični farmaceutski prihvatljivi nosači koji ne reaguju štetno sa aminokiselinama uključuju, u smislu primera i bez ograničenja: vodu, slani rastvor, vezujuća sredstva (npr., polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilcelulozu), punioce (npr., laktozu i druge šećere, želatin, ili kalcijum sulfat), lubrikanse (npr., skrob, polietilen glikol, ili natrijum acetat), sredstva za raspadanje (npr., skrob ili natrijum skrob glikolat), i sredstva za kvašenje (npr., natrijum lauril sulfat). Farmaceutski prihvatljivi nosači takođe uključuju vodene rastvore koji su pH puferisani ili lipozome (male vezikule sastavljene od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanata koji su korisni za dostavu leka sisaru). Sledeći primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, i druge organske kiseline, antioksidanse kao askorbinska kiselina, polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka), proteine kao serum albumin, želatin, ili imunoglobulini, hidrofilne polimere kao polivinilpirolidon, aminokiseline kao glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin, monosaharide, disaharide i druge ugljovodonike uključujući glukozu, manozu ili dekstrine, helirajuća sredstva kao EDTA, šećerne alkohole kao manitol ili sorbitol, protiv-jone koji obrazuju soli kao natrijum i/ili nejonske surfaktante kao TWEEN™, polietilen glikol (PEG), i PLURONICS™.
[0075] Lipozomi su vezikule koje imaju membranu obrazovanu od lipofilnog materijala i vodenu unutrašnjost koja može da sadrži kompoziciju koja treba da se dostavi. Lipozomi mogu da budu posebno korisni sa aspekta dostave leka, zahvaljujući svojoj specifičnosti i trajanju dejstva koje pružaju. Lipozomske kompozicije mogu da budu obrazovane, na primer, od fosfatidilholina, dimiristoil fosfatidilholina, dipalmitoil fosfatidilholina, dimiristoil fosfatidilglicerola, ili dioleoil fosfatidiletanolamina. Brojna lipofilna sredstva su komercijalno dostupna, uključujući LIPOFECTIN® (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA) i EFFECTENE™ (Qiagen, Valencia, CA).
[0076] Najmanje jedno od sredstava sadržanih u farmaceutskoj kompoziciji (npr., HER-3 vezujuće sredstvo ili sredstvo koje se vezuje za, i/ili inhibira drugog člana HER familije) može da bude spojeno sa efektorom kao što je kaliheamicin, duokarmicini, auristatini, maitansinoidi, radioizotop, ili toksično hemoterapeutsko sredstvo kao što je geldanamicin i maitansin. Takvi konjugati mogu da budu posebno korisni za ciljno delovanje na ćelije (npr., kancerske ćelije) koje eksprimiraju HER-3.
[0077] Spajanje vezujućih proteina sa radioizotopima može da obezbedi prednosti u lečenju tumora. Za razliku od hemoterapije i drugih oblika lečenja kancera, radioimunoterapija ili primena kombinacije radioizotop-vezujući protein može neposredno ciljno da deluje na kancerske ćelije uz minimalno oštećenje okolnog normalnog, zdravog tkiva. Sa ovim "magičnim metkom", pacijenti mogu da budu lečeni mnogo manjim količinama radioizotopa nego u drugim danas dostupnim oblicima lečenja. Pogodni radioizotopi uključuju, na primer, itrijum90(90Y), indijum111 (111In), 131I, 99mTc, radioaktivno srebro-111, radioaktivno srebro-199, i bizmut213. Povezivanje radioizotopa sa vezujućim proteinima može da se izvede sa, na primer, uobičajenim bifunkcionalnim helatima. Kako je srebro monovalentno, za vezivanje radioaktivnog srebra-111 i radioaktivnog srebra-199, mogu da se koriste linkeri na bazi sumpora (Hazra et al. (1994) Cell Biophys.24-25:1-7). Povezivanje radioizotopa srebra može da uključuje redukciju imunoglobulina askorbinskom kiselinom. Dalje, tiuksetan je MX-DTPA linker helator spojen sa ibritumomabom tako da obrazuje ibritumomab tiuksetan (Zevalin) (Witzig (2001) Cancer Chemother. Pharmacol. 48 (Suppl 1):91-95). Ibritumomab tiuksetan može da reaguje sa radioizotopima kao indijum<111>(<111>In) ili<90>Y da bi se obrazovao 111In-ibritumomab tiuksetan i 90Y-ibritumomab tiuksetan, redom.
[0078] Vezujući proteini koji su ovde opisani, posebno kada se koriste za lečenje kancera, mogu da budu konjugovani sa toksičnim hemoterapeutskim lekovima kao što su maitansinoidi, (Hamann et al. (2002) Bioconjug. Chem. 13:40-46), geldanamicinoidi (Mandler et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92:1549-1551) i maitansinoidi, na primer, lek na bazi maitansinoida, DM1 (Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. US 93:8618-8623). Linkeri koji oslobađaju lekove u kiselim ili redukujućim uslovima ili nakon izlaganja specifičnim proteazama mogu da se koriste sa ovom tehnologijom. Vezujući protein može da bude konjugovan kao što je opisano u tehnici.
[0079] Vezujući protein može da bude konjugovan sa auristatinom-PE. Auristatin-PE, npr., je antimikrotubularno sredstvo koje predstavlja strukturnu modifikaciju dolastatina 10, peptidnog sastojka morskog mekušca bez ljušture. Auristatin-PE ima obe, i antitumorsku aktivnost i antitumorsku vaskularnu aktivnost (Otani et al. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91:837-44). Na primer, auristatin-PE inhibira rast ćelija i indukuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa i apoptozu u ćelijskim linijama kancera pankreasa (Li et al. (1999) Int. J. Mol. Med.3:647-53). Prema tome, da bi se antitumorska aktivnost i antitumorske vaskularne aktivnosti auristatina-PE specifično usmerile na određene tumore, auristatin-PE može da bude konjugovan sa vezujućim proteinom kao što je ovde opisano.
[0080] Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane takođe mogu da sadrže bar jedno dodatno aktivno sredstvo. Primeri dodatnih aktivnih sredstava uključuju antitela ili inhibitore male molekulske težine drugih receptorskih protein kinaza, kao IGFR-1 i c-met, receptorske ligande kao što su vaskularni endotelijalni faktor (VEGF), citotoksična sredstva kao doksorubicin, cisplatin ili karboplatin, citokine, ili antineoplastična sredstva. Mnoga antineoplastična sredstva su poznata u tehnici. Antineoplastično sredstvo može da bude izabrano iz grupe terapeutskih proteina uključujući, ali bez ograničenja, antitela i imunomodulatorne proteine. Antineoplastično sredstvo može da bude izabrano iz grupe malih molekula inhibitora i hemoterapeutskih sredstava koja se sastoji od mitotičkih inhibitora, inhibitora kinaze, alkilirajućih sredstava, antimetabolita, interkalirajućih antibiotika, inhibitora faktora rasta, inhibitora ćelijskog ciklusa, enzima, inhibitora topoizomeraze, inhibitora histon deacetilaze, sredstava protiv preživljavanja, modifikatora biološkog odgovora, anti-hormona (npr., anti-androgena), stimulansa mikrotubula, antraciklina i antiangiogeneznih sredstava. Kada je antineoplastično sredstvo zračenje, lečenje može da se postigne ili sa unutrašnjim izvorom (npr., brahiterapija) ili spoljnim izvorom (npr., zračna terapija zrakom iz spoljašnjeg izvora). Jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava može da bude primenjeno sa sredstvom koje se vezuje za HER3 i drugim sredstvom ili istovremeno ili odvojeno, u jednoj formulaciji ili u pojedinačnim (odvojenim) formulacijama za svako aktivno sredstvo.
[0081] Farmaceutske kompozicije koji su ovde opisane mogu da budu posebno korisne za dijagnozu, prevenciju, ili lečenje hiperproliferativne bolesti. Hiperproliferativna bolest može da bude povezana sa povećanim prenosom signala HER familije. Naročito, bolest može da bude povezana sa povećanom fosforilacijom HER-3, povećanim obrazovanjem kompleksa između HER-3 i drugih članova HER familije, povećanom aktivnošću PI3kinaze, povećanom aktivnošću c-jun terminalne kinaze i/ili aktivnošću AKT, povećanom aktivnošću ERK2 i/ili PYK2, ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Hiperproliferativna bolest može da bude, na primer, izabrana iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, gastrointestinalnog kancera, kancera pankreasa, kancera prostate, kancera jajnika, kancera želuca, endometrijalnog kancera, kancera pljuvačne žlezde, kancera pluća, kancera bubrega, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, tiroidnog kancera, kancera bešike, glioma, melanoma, ili drugih kancera koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-3, i formiranja metastaza tumora.
[0082] Farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane mešanjem jednog ili više aktivnih sredstava sa jednim ili više fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača, i/ili adjuvansa, i izborno drugih sredstava koja su obično uključena u formulacije kako bi se obezbedio poboljšani prenos, dostavljanje, tolerancija, i slično. Farmaceutska kompozicija može da bude formulisana, npr., u liofilizovanim formulacijama, vodenim rastvorima, disperzijama, ili čvrstim preparatima, kao što su tablete, dražeje ili kapsule. Mnoštvo pogodnih formulacija može da se nađe u formulama poznatim svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), naročito poglavlje 87 autora Block, Lawrence, u knjizi. Ove formulacije uključuju, na primer, prahove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katijonske ili anjonske) (kao LIPOFECTIN™), konjugate DNK, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulje u vodi i voda u ulju, emulzije „carbowax“ (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polučvrsti gelovi, i polučvrste smeše koje sadrže „carbowax“. Bilo koja od gore navedenih smeša može da bude pogodna u lečenju i terapijama kao što je ovde opisano, pod uslovom da aktivno sredstvo u formulaciji nije inaktivisano formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i tolerabilna sa putem primene. Videti, takođe, Baldrick (2000) Regul. Toxicol. Pharmacol. 32:210-218; Wang (2000) Int. J. Pharm. 203:1-60; Charman (2000) J. Pharm. Sci. 89:967-978; i Powell et al. (1998) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311), i citate u njima za dodatne informacije u vezi sa formulacijama, ekscipijensima i nosačima dobro poznatim farmaceutskim hemičarima.
[0083] Ovaj dokument se takođe odnosi na upotrebu bar jednog sredstva (npr., izolovanog proteina koji se vezuje za HER-3) kao što je ovde opisano, i bar jednog dodatnog aktivnog sredstva (npr., sredstva koje se vezuje za drugog člana HER familije ili hemoterapeutskog jedinjenja) u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, razblaživačima i/ili adjuvansima, za proizvodnju farmaceutske kompozicije za dijagnozu, prevenciju ili lečenje hiperproliferativne bolesti (npr., bolesti povezane sa HER-3). Farmaceutska kompozicija može da bude farmaceutska kompozicija kao što je ovde opisano, i hiperproliferativna bolest može da bude hiperproliferativna bolest kao što je ovde opisano.
[0084] Postupci za formulaciju i sledstvenu primenu terapeutskih kompozicija su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Doziranje uopšteno zavisi od ozbiljnosti i responsivnosti bolesnog stanja koje treba da se leči, sa tokom lečenja koji traje od nekoliko dana do nekoliko meseci, ili sve dok se ne izleči ili dok se ne postigne smanjenje stanja bolesti. Osobe sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti rutinski određuju optimalne doze, metodologije doziranja i učestalost ponavljanja. Optimalne doze mogu da variraju u zavisnosti od relativne potentnosti pojedinačnih polipeptida, i mogu uopšteno da se procene na osnovu EC50za koju je utvrđeno da je efikasna u životinjskim modelima in vitro i in vivo. Tipično, doza je od 0.1 µg do 100 mg po kg telesne težine, i može da se primeni jednom ili više puta dnevno, dva puta nedeljno, nedeljno, mesečno, ili čak ređe. Nakon uspešnog lečenja, može da bude poželjno da pacijent dobije terapiju održavanja da bi se sprečio povratak stanja bolesti.
[0085] Farmaceutske kompozicije mogu da budu primenjene brojnim postupcima, u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje i u zavisnosti od oblasti koja treba da se leči. Primena može da bude, na primer, topikalna (npr., transdermalna, sublingualna, oftalmička, ili intranazalna); pulmonalna (npr., inhalacijom ili insuflacijom prahova ili aerosola); oralna; ili parenteralna (npr., subkutanom, intratekalnom, intraventrikularnom, intramuskularnom, ili intraperitonealnom injekcijom, ili intravenskom infuzijom). Primena može da bude brza (npr., injekcijom) ili može da se odvija tokom perioda vremena (npr., sporom infuzijom ili primenom formulacija sa sporim oslobađanjem). Za tretiranje tkiva u centralnom nervnom sistemu, proteini koji se vezuju za HER-3 mogu da se primene injekcijom ili infuzijom u cerebrospinalnu tečnost, obično sa jednim ili više sredstava sposobnih da pospeše prolazak polipeptida kroz krvno-moždanu barijeru.
[0086] Kompozicije i formulacije za parenteralnu, intratekalnu ili intraventrikularnu primenu mogu da uključuju sterilne vodene rastvore, koji takođe mogu da sadrže pufere, razblaživače i druge pogodne aditive (npr., pojačivače penetracije, jedinjenja-nosače i druge farmaceutski prihvatljive nosače).
[0087] Farmaceutske kompozicije uključuju, bez ograničenja, rastvore, emulzije, vodene suspenzije i formulacije koje sadrže lipozome. Ove kompozicije mogu da budu napravljene od raznih komponenti koje uključuju, na primer, preformirane tečnosti, samo-emulgirajuće čvrste supstance i samo-emulgirajuće polučvrste supstance. Emulzije su često bifazni sistemi koji su sačinjeni od dve nemešljive tečne faze koje su dobro izmešane i dispergovane jedna sa drugom; uopšteno, emulzije predstavljaju varijaciju voda-u-ulju (w/o) ili ulje-u-vodi (o/w). Formulacije emulzije se široko koriste za oralno dostavljanje terapeutika zbog jednostavnosti njihove formulacije i efikasnosti rastvaranja, apsorpcije i biološke raspoloživosti.
[0088] Sredstva koja se vezuju za HER mogu dalje da obuhvataju bilo koje farmaceutski prihvatljive soli, estre, ili soli takvih estara, ili bilo koje drugo jedinjenje koje, nakon primene kod životinje uključujući čoveka, može da obezbedi (neposredno ili posredno) biološki aktivan metabolit ili njegov ostatak. Prema tome, na primer, ovaj dokument obezbeđuje farmaceutski prihvatljive soli malih molekula i polipeptida, prolekove i farmaceutski prihvatljive soli takvih prolekova, i druge bioekvivalente. Termin "prolek" označava terapeutsko sredstvo koje je pripremljeno u neaktivnom obliku i pretvara se u aktivni oblik (tj., lek) u telu ili njegovim ćelijama delovanjem endogenih enzima ili drugih hemikalija i/ili uslova. Termin "farmaceutski prihvatljive soli" odnosi se na fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli polipeptida koji su ovde dati (tj., soli koje zadržavaju željenu biološku aktivnost parentalnog polipeptida bez dodavanja neželjenih toksikoloških efekata). Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali nisu ograničeni na, soli obrazovane sa katjonima (npr., natrijumom, kalijumom, kalcijumom, ili poliaminima kao spermin); kisele adicione soli obrazovane sa neorganskim kiselinama (npr., hlorovodoničnom kiselinom, bromovodoničnom kiselinom, sumpornom kiselinom, fosfornom kiselinom, ili azotnom kiselinom); i soli obrazovane sa organskim kiselinama (npr., sirćetnom kiselinom, limunskom kiselinom, oksalnom kiselinom, palmitinskom kiselinom, ili fumarnom kiselinom).
[0089] Ovde su opisane farmaceutske kompozicije koje sadrže (a) jedno ili više sredstava koja se vezuju za HER-3; (b) jedno ili više sredstva koja se vezuju za drugog člana HER familije; i (c) jedno ili više drugih sredstava koja funkcionišu drugačijim mehanizmom. Na primer, jedno ili više sredstava iz (c) su zamenljiva onima iz (b); antiinflamatorni lekovi, uključujući, ali bez ograničenja, nesteroidne antiinflamatorne lekove i kortikosteroide, i antivirusni lekovi, uključujući, ali bez ograničenja ribivirin, vidarabin, aciklovir i ganciklovir, mogu da budu uključeni u kompozicije. Druga sredstva koja nisu na bazi polipeptida (npr., hemoterapeutska sredstva) takođe su u okviru ovog dokumenta. Tako kombinovana jedinjenja mogu da se koriste zajedno ili jedno za drugim.
[0090] Kompozicije dodatno mogu da sadrže druge pomoćne komponente koje se uobičajeno nalaze u farmaceutskim kompozicijama. Tako, kompozicije takođe mogu da uključuju kompatibilne, farmaceutski aktivne materijale kao što su, na primer, antipruritici, adstringensi, lokalni anestetici ili antiinflamatorna sredstva, ili dodatne materijale korisne za fizičko formulisanje različitih doznih oblika kompozicija koje su ovde obezbeđene, kao što su boje, sredstva za davanje arome, konzervansi, antioksidansi, sredstva za zamućivanje, sredstva za zgušnjavanje i stabilizatori. Osim toga, kompozicija može da bude pomešana sa pomoćnim sredstvima, npr., lubrikantima, konzervansima, stabilizatorima, sredstvima za kvašenje, emulzifikatorima, solima za delovanje na osmotski pritisak, puferima, sredstvima za bojenje, sredstvima za davanje arome i aromatičnim supstancama. Međutim, kada se dodaju, takvi materijali ne bi trebalo da prekomerno interferiraju sa biološkim aktivnostima polipeptidnih komponenti unutar kompozicija koje su ovde obezbeđene. Formulacije mogu da budu sterilisane ako je poželjno.
[0091] Farmaceutske formulacije, koje mogu da budu pogodno prezentovane u jediničnom doznom obliku, mogu da se pripreme prema uobičajenim tehnikama dobro poznatim u farmaceutskoj industriji. Takve tehnike uključuju korak povezivanja aktivnih sastojaka (npr., ovde obezbeđenih sredstava koja se vezuju za HER familiju) sa željenim farmaceutskim nosačem(ima) ili ekscipijensom(ima). Tipično, formulacije mogu da budu pripremljene ravnomernim mešanjem i dovođenjem u blisku povezanost aktivnih sastojaka sa tečnim nosačima ili fino raspodeljenim čvrstim nosačima ili sa oba, i zatim, ako je neophodno, oblikovanjem proizvoda. Formulacije mogu da budu sterilisane ako je poželjno, pod uslovom da postupak sterilizacije ne interferira sa efikasnošću polipeptida sadržanog u formulaciji.
[0092] Kompozicije koji su ovde opisane mogu da budu formulisane u bilo koji od mnogih mogućih doznih oblika kao što su, ali bez ograničenja, tablete, kapsule, tečni sirupi, meki gelovi, supozitorije i klizme. Kompozicije takođe mogu da budu formulisane kao suspenzije u vodenim, ne-vodenim ili mešanim medijumima. Vodene suspenzije dodatno mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol, i/ili dekstran. Suspenzije takođe mogu da sadrže stabilizatore.
[0093] Proteini koji se vezuju za HER mogu da budu kombinovani sa pakovnim materijalom i da se prodaju kao kitovi za lečenje bolesti povezanih sa HER-3. Komponente i postupci za proizvodnju proizvodnih artikala su dobro poznati. Proizvodni artikli mogu da kombinuju jedan ili više polipeptida i jedinjenja prikazanih u prethodnim odeljcima. Pored toga, proizvodni artikli dodatno mogu da uključuju, na primer, pufere ili druge kontrolne reagense za smanjenje ili praćenje smanjenog obrazovanja imunskog kompleksa. Uputstva koja opisuju kako su polipeptidi efikasni za lečenje bolesti povezanih sa HER-3 mogu da budu uključena u takve kitove. Bilo koje od prvih sredstava, drugih sredstava i dodatnih sredstava može da se dostavi u nanočestici(ama) ili lipozomu(ima), ili bilo kom drugom pogodnom obliku/oblicima.
6. Postupci
[0094] Ovaj dokument takođe opisuje postupke za lečenje ili sprečavanje bolesti i stanja povezanih sa ekspresijom HER-3. Na primer, postupak može da uključuje dovođenje u kontakt subjekta ili biološkog uzorka uzetog od subjekta (npr., sisara kao što je čovek) sa proteinom koji se vezuje za HER-3 u kombinaciji sa drugim sredstvom kao što je ovde opisano. Uzorak može da bude ćelija koja ispoljava ekspresiju HER-3, kao što je tumorska ćelija, uzorak krvi ili drugi pogodan uzorak. Dovođenje u kontakt može da se izvede in vivo, kao kada se kompozicija koja sadrži sredstvo koje se vezuje za HER-3 i drugo sredstvo koje se vezuje za drugog člana HER familije primeni kod subjekta kome je to potrebno. Bolesti ili stanja povezana sa ekspresijom HER-3 koja mogu da se leče korišćenjem postupaka koji su ovde opisani uključuju, na primer, hiperproliferativne bolesti kao kancer dojke, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer pluća, kancer bubrega, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, tiroidni kancer, kancer bešike, gliom, melanom, kancer bubrega, metastatski kancer dojke, nesitnoćelijski kancer pluća, epidermoidni karcinom, fibrosarkom, melanom, nazofaringealni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija i drugi kanceri koji su HER-3-pozitivni, eksprimiraju HER-3 ili prekomerno eksprimiraju HER-3.
[0095] Termin "lečenje ili prevencija", kada se ovde koristi, odnosi se i na terapeutsko lečenje i na profilaktičke ili preventivne mere, koje mogu da se koriste za sprečavanje, usporavanje, ili smanjenje dejstava ciljnog patološkog stanja ili poremećaja. Oni kojima je potrebna prevencija ili lečenje mogu da uključuju one koji već imaju poremećaj, kao i one za koje je verovatno da će razviti poremećaj, ili one kod kojih treba sprečiti poremećaj. Pacijent kome je potrebna prevencija ili lečenje može da bude sisarski pacijent (tj., bilo koja životinja svrstana u sisare, uključujući ljude, domaće i životinje sa farme, i životinje iz zoološkog vrta, životinje koje se koriste u sportu, ili kućne ljubimce, kao što su psi, mačke, goveda, konji, ovce, svinje, koze, zečevi, itd.) U nekim primerima izvođenja, pacijent kome je lečenje potrebno je humani pacijent.
[0096] Postupci za sprečavanje ili lečenje bolesti ili stanja povezanih sa ekspresijom HER-3 kod pacijenta kome je to potrebno mogu da uključuju primenu kod pacijenta efikasnih količina najmanje jednog sredstva koje se vezuje za HER-3 kao što je ovde opisano i najmanje još jednog sredstva protiv drugog člana HER familije, ili hemoterapeutskog jedinjenja (npr., bar jednog od "dodatnih/drugih" sredstava koja su ovde opisana). Takvo lečenje može, na primer, da inhibira abnormalni ćelijski rast, migraciju ili invaziju. Sredstvo protiv HER-3 i bar još jedno dodatno sredstvo mogu da budu primenjeni istovremeno (npr., kada su sadržani u istoj kompoziciji, ili mešanjem u istoj kesi za i.v.), ili odvojeno (npr., uzastopno). Bolesti ili stanja povezana sa ekspresijom HER-3 koja mogu da se leče korišćenjem postupaka koji su ovde obezbeđeni uključuju, na primer, hiperproliferativne bolesti koje su ovde nabrojane. Pacijent kome je potrebna prevencija ili lečenje može da bude sisar (npr., čovek, domaća ili životinja sa farme, ili životinja iz zoološkog vrta, životinja koja se koristi u sportu, ili kućni ljubimac, kao što je pas, mačka, krava, konj, ovca, svinja, koza ili zec). U nekim slučajevima, pacijent je humani pacijent.
[0097] Kako se ovde koristi, termin "efikasna količina" je količina sredstva koja rezultuje u smanjenju ili stabilizaciji jednog ili više simptoma ili kliničkih odlika stanja povezanog sa HER-3 koje se leči. Na primer, primena efikasne količine kompozicije, kao što je ovde opisano, može da rezultuje u usporavanju napredovanja rasta tumora, u smanjenoj veličini tumora, ili u smanjenoj aktivaciji HER-3 ili HER-3-responsivnih biomarkera (npr., Akt, HER-2, ERK, ili EGF-R). Usporavanje ili smanjenje može da bude bilo kakvo smanjenje u poređenju sa prethodnom vrednošću (npr., 5%, 10%, 20%, 25%, ili više od 25% smanjenja simptoma ili odlika). "Efikasna količina" može da rezultuje u stabilnoj bolesti.
[0098] Pored klasičnih načina primene vezujućih proteina kao potencijalnih terapeutika, npr., putem gore pomenutih formulacija, novo-razvijeni modaliteti primene mogu takođe da budu korisni. Na primer, lokalna primena monoklonskog antitela obeleženog sa<131>I za lečenje primarnih tumora mozga nakon hirurške intervencije je opisana. Dodatno, direktna stereotaktična intracerebralna injekcija monoklonskih antitela i njihovih fragmenata je takođe ispitivana klinički i pretklinički. Intrakarotidna hiperosmolarna perfuzija je eksperimentalna strategija za ciljno delovanje na primarni malignitet mozga humanim monoklonskim antitelima konjugovanim sa lekom.
[0099] Kao što je gore opisano, doza primenjenih sredstava može da zavisi od različitih faktora. Oni uključuju, na primer, prirodu sredstva, vrstu tumora, i put primene. Treba naglasiti da predmetni postupci nisu ograničeni na određene doze. Postupci za određivanje pogodnih doza su poznati u ovoj oblasti, i uključuju one koji su ovde opisani u primerima.
[0100] U zavisnosti od vrste i ozbiljnosti stanja koje treba da se leči, do oko 20 mg/kg svakog HER vezujućeg antitela može da bude primenjeno kod pacijenta kome je to potrebno, npr., putem jedne ili više odvojenih primena ili kontinuiranom infuzijom. Tipična dnevna doza može da se kreće u opsegu od oko 1 µg/danu do oko 100 mg/danu ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja koje treba da se leči, lečenje može da bude nastavljeno do postizanja željenog potiskivanja simptoma bolesti.
[0101] Postupak kao što je ovde opisano može da uključuje analizu određenog markera (npr., HER-3) u biološkom uzorku uzetom od subjekta kako bi se odredilo da li subjekat ima bolest povezanu sa ekspresijom HER-3. Takvi postupci mogu da se koriste za odabir subjekata koji imaju bolesti povezane sa HER-3. U takvim postupcima, korak analize može da bude urađen pre koraka primene, budući da takvim skriningom pacijenata mogu da se izbegnu lečenja za koja nije verovatno da će biti efikasna. Na taj način, u nekim slučajevima, postupci koji su ovde opisani mogu dalje da uključuju detekciju HER-3 antigena u ili na ćeliji, za određivanje koncentracije HER-3 antigena kod pacijenata koji pate od hiperproliferativne bolesti kao što je gore pomenuto, ili za određivanje stadijuma hiperproliferativne bolesti kod pacijenta. U cilju određivanja stadijuma napredovanja hiperproliferativne bolesti kod subjekta koji se ispituje, ili karakterizacije odgovora subjekta na tok terapije, uzorak krvi može da bude uzet od subjekta i može da se odredi koncentracija HER-3 antigena prisutnog u uzorku. Tako dobijena koncentracija može da se koristi za identifikovanje opsega koncentracija kome vrednost pripada. Tako identifikovan opseg može da bude korelisan sa stadijumom napredovanja ili stadijumom terapije identifikovanim u različitim populacijama subjekata sa dijagnozom, čime se obezbeđuje identifikacija stadijuma za subjekte uključene u ispitivanje. Biopsija bolesti, npr., kancera, tkivo dobijeno od pacijenta takođe može da se upotrebi za procenu količine prisutnog HER-3 antigena. Količina prisutnog HER-3 antigena u obolelom tkivu može da se proceni korišćenjem, na primer, imunohistohemije, ELISA testa, ili matrice antitela upotrebom HER-3 antitela kao što je ovde opisano. Drugi parametri od dijagnostičkog interesa su stanje dimerizacije kao i dimerizacioni partneri HER-3 proteina i stanje aktivacije njega i njegovih partnera. Postupci analize proteina za određivanje ovih parametara su dobro poznati u ovoj oblasti i predstavljaju, između ostalih, Western blot test i imunoprecipitacione tehnike, FACS analize, hemijsko unakrsno vezivanje, bioluminiscentno rezonantni energetski transfer (BRET), fluorescentno rezonantni energetski transfer (FRET) i slično (npr., Price et al. (2002) Methods Mol. Biol. 218:255-268, ili eTag tehnologija (WO 05/03707, WO 04/091384 i WO 04/011900).
[0102] U nekim slučajevima, postupak kao što je ovde opisano može da uključuje jedan ili više koraka za praćenje terapeutskog ishoda lečenja. Na primer, mogu da se prate simptomi bolesti kod subjekta, da bi se odredilo da li dolazi do smanjenja simptoma. Takođe mogu da se prate kod subjekta, na primer, potencijalni sporedni efekti lečenja. Praćenje može da sprovedeno nakon koraka primene, i, u nekim primerima izvođenja, može da bude sprovedeno više puta (npr., između primena, ako se doze primenjuju više od jednom). Takvi postupci mogu da se koriste za procenu efikasnosti i bezbednosti postupaka lečenja koji su ovde opisani, na primer.
[0103] Pronalazak će biti dodatno opisan u primerima koji slede, koji ne ograničavaju oblast pronalaska opisanu u patentnim zahtevima.
PRIMERI
PRIMER 1: HER-3 antigen i priprema ćelijske linije
[0104] Pripremljeni su rekombinantni HER-3 proteini. cDNK ekstracelularnog domena HER-3 (ECD) je klonirana pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) iz pcDNA3-HER-3 (ekspresioni vektor sa celom dužinom humanog HER-3, Wallasch et al. (1995) EMBO J.
14:4267-4275) sa prajmerima koji se zasnivaju na sekvenci HER-3 (GeneBank pristupni br. NM_001982): Direktni prajmer: 5'-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3' (SEQ ID NO: 233); Reverzni prajmer: 5'-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATG TTGTCCTAAACAGTCTTG-3' (SEQ ID NO: 234).
[0105] Proizvod PCR reakcije je bio podvrgnut digestiji sa BamH1 i Xbal i ubačen ligacijom u pcDNA3 (Invitrogen) digestiran sa BamH1 i Xbal. Plazmidi su transficirani u HEK293 ćelije korišćenjem postupka sa CaPO4. Fuzioni protein HER-3-HIS je prečišćen iz prikupljenog kondicioniranog medijuma primenom Ni-NTA afinitetne hromatografije.
[0106] RatI HER-3 ćelije su proizvedene putem retroviralnog transfera gena. Ukratko, GP+E 86 ćelije (3x10<5>) su zasejane na disk za kulturu promera 60 mm i transficirane sa 2 µg/ml plXSN vektora ili cDNK plXSN-HER-3 (C. Wallasch, PhD Thesis, Max-Planck Insitute of Biochemistry, Martinsried, Nemačka) korišćenjem postupka sa kalcijum fosfatom. Nakon 24 časa medijum je zamenjen svežim medijumom i GP+E 86 ćelije su inkubirane 4-8 časova. Subkonfluentne Rat1 ćelije (2x10<5>ćelija po posudi prečnika 6 cm) su zatim inkubirane sa supernatantima GP+E 86 ćelija koje oslobađaju visoki titar pLXSN ili pLXSN-HER-3, p virusa (>1 X 106 G418 c.f.u./ml; m.o.i. od 10) u vremenu od 4-12 časova u prisustvu Polibrena (4 mg/ml; Aldrich). Nakon promene medijuma, započeta je selekcija RatI ćelija sa G418. Obično, stabilni klonovi su odabirani nakon selekcije u trajanju od 21 dan.
PRIMER 2: Ekspresija HER-3 u ćelijskim linijama humanog kancera
[0107] Ekspresija HER-3 je kvantitativno određena u panelu ćelijskih linija humanog kancera da bi se razjasnila uloga HER-3 u obrazovanju humanog kancera. Ćelijske linije kancera su uzgajane kao što je preporučeno od strane ATCC. Detaljno, 10<5>ćelija je prikupljeno sa 10 mM EDTA u PBS, isprano jednom FACS puferom (PBS, 3% FCS, 0.4% azida) i zasejano na ploču sa 96 bunarčića okruglog dna. Ćelije su centrifugirane 3 minuta pri brzini od 1000 obr/min da bi se uklonio supernatant, a zatim resuspendovane sa α-HER-3 antitelom 2D1D12 (WO03013602) (3 µg/ml). Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu 1 čas, isprane dvaput FACS puferom i resuspendovane sa sekundarnim antitelom (100 µl/bunarčiću), magarećimanti-humanim-PE (Jackson) razblaženim u odnosu 1:50 u FACS puferu. Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu i u mraku tokom 30 minuta, isprane dva puta FACS puferom i analizirane (FACS, Beckman Coulter). HER-3 je eksprimiran u različitim humanim kancerskim ćelijskim linijama, uključujući različite ćelijske linije dojke, debelog creva, epidermoidne ćelijske linije, ćelijske linije melanoma, nazofarinksa, jajnika, pankreasa i prostate. Videti, slike iz SAD objave br.20080124345.
PRIMER 3: Imunizacija i titriranje
[0108] HER-3 ECD protein, koji je pripremljen kao što je opisano u Primeru 1 i C32 ćelije (Humani melanom; ATCC br. CRL-1585) su korišćene kao antigen. Monoklonska antitela protiv HER-3 su razvijena sekvencijalnom imunizacijom XENOMOUSE® miševa (sojevi XMG1 i XMG4; Abgenix, Inc., Fremont, CA). XENOMOUSE® životinje su imunizovane preko donjeg dela šape za sve injekcije. Ukupna zapremina svake injekcije je bila 50 µl po mišu, 25 µl po donjem delu šape.
[0109] Za kohortu br. 1 (10 XMG1 miševa), inicijalna imunizacija je bila sa 10 µg HER-3 ECD proteina pomešanog u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa TITERMAX GOLD® (Sigma, Oakville, ON) po mišu. Sledećih pet buster doza su bile izvedene sa 10 µg HER-3 ECD proteina pomešanog u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa 100 µg aluminijum gela (Sigma, Oakville, ON) u D-PBS bez pirogena. Šesta buster doza se sastojala od 10 µg HER-3 ECD proteina pomešanog u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa TITERMAX GOLD®. Sedma injekcija se sastojala od 10 µg HER-3 ECD proteina pomešanog u odnosu 1:1 zapr./zapr. sa 100 µg aluminijum gela. Poslednja buster doza je napravljena sa 10 µg HER-3 ECD proteina u DPBS bez pirogena, bez adjuvansa. XENOMOUSE® miševi su imunizovani 0, 4, 7, 11, 15, 20, 24, i 29. dana u okviru ovog protokola i fuzije su izvedene 33. dana. Dva vađenja krvi su urađena primenom Retro-Orbital Bleed postupka 13. dana nakon četvrte buster doze i 19. dana nakon šeste buster doze. Nije bilo kohorte br.2. Za kohortu br.3 (10 XMG1 miševa) i kohortu br.4 (10 XMG4 miševa), prva injekcija je bila sa 10<7>C32 ćelija u Dulbecco-vom PBS (DPBS) bez pirogena pomešanom u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa TITERMAX GOLD®, po mišu. Sledeće četiri buster doze su bile sa 10<7>C32 ćelija u DPBS, bez pirogena, pomešanom sa 25 µg Adju-Fos i 10 µg CpG po mišu. Šesta buster doza je bila sa 10<7>C32 ćelija u DPBS bez pirogena, pomešanom u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa TITERMAX GOLD®, po mišu. Sedma, osma i deveta buster doza su bile sa 107 C32 ćelija u DPBS bez pirogena, pomešanom sa 25 µg Adju-Fos i 10 µg CpG, po mišu. Od desete do četrnaeste, buster doze su bile 5 µg HER-3 ECD proteina u DPBS bez pirogena, pomešanom sa 25 µg Adju-Fos i 10 µg CpG, po mišu. Poslednja buster doza se sastojala od 5 µg HER-3 ECD proteina u DPBS bez pirogena, bez adjuvansa. U obe kohorte, br. 3 i br.4, miševi su imunizovani 0, 3, 7, 11, 14, 17, 21, 24, 28, 33, 35, 38, 42. i 45. dana i fuzije su izvedene 49. dana. Tri krvarenja su urađena prema Retro-Orbital Bleed proceduri 12. dana nakon četvrte buster doze, 19. dana nakon šeste buster doze i 40. dana nakon dvanaeste buster doze.
[0110] Selekcija životinja za prikupljanje antitela prema titru: Za kohortu br. 1, titar anti-HER-3 antitela u serumu imunizovanih miševa je određen primenom ELISA testa protiv HER-3 ECD proteina. Specifični titar za svaku XENOMOUSE® životinju je određen iz optičke gustine na 650 nm i prikazan u TABELI 1 u nastavku teksta. Vrednost titra je recipročna najvećem razblaženju seruma sa očitanom OD vrednošću dvostrukom u odnosu na pozadinski šum. Dakle, što je veća brojčana vrednost, veći je humoralni imunski odgovor na HER-3 ECD.
TABELA 1
[0111] Za kohorte br. 3 i br. 4, titar anti-HER-3 antitela u serumu imunizovanih miševa je određen primenom FACS metode, korišćenjem Rat1/HER-3 ćelija (antigen pozitivna ćelijska linija) i Rat1/pLSXN ćelija (antigen negativna ćelijska linija). Podaci su prikazani u TABELAMA 2 i 3, kao geometrijska sredina (GeoMean) fluorescentnog intenziteta ćelijskog anti-HER-3 bojenja ćelija serijskim razblaženjima uzoraka seruma.
TABELA 2
TABELA 3
PRIMER 4: Ponovno dobijanje limfocita, izolovanja B-ćelija, fuzije i stvaranje hibridoma [0112] Imunizovani miševi su žrtvovani i limfni čvorovi su sakupljeni i objedinjeni iz svake kohorte posebno. Limfoidne ćelije su razdvojene mlevenjem u DMEM da bi se ćelije oslobodile iz tkiva i ćelije su suspendovane u DMEM. Ćelije su izbrojane, i 0.9 ml DMEM na 100 milliona limfocita je dodato ćelijskom talogu da bi ćelije bile pažljivo, ali u potpunosti resuspendovane. Korišćenjem 100 µl CD90+ magnetnih perli na 100 milliona ćelija, ćelije su obeležene inkubacijom ćelija sa magnetnim perlama na temperaturi od 4°C tokom 15 minuta. Magnetno-obeležena ćelijska suspenzija koja sadrži do 10<8>pozitivnih ćelija (ili do 2x10<9>ćelija ukupno) naneta je na LS+ kolonu i kolona je isprana DMEM. Ukupni efluent je sakupljen kao CD90-negativna frakcija (očekivano je da su većina ovih ćelija B ćelije).
[0113] Fuzija je izvedena mešanjem ispranih obogaćenih B ćelija dobijenih kao u prethodnom tekstu i ćelija P3X63Ag8.653 nesekretornog mijeloma nabavljenih iz ATCC (Kat. br. CRL 1580) (Kearney et al. (1979) J. Immunol.123:1548-1550) u odnosu 1:1. Smeša ćelija je pažljivo istaložena centrifugiranjem na 800 g. Nakon potpunog uklanjanja supernatanta, ćelije su tretirane sa 2 do 4 ml rastvora pronaze (CalBiochem, Kat. br. 53702; 0.5 mg/ml u PBS) tokom ne više od 2 minuta. Zatim je 3 do 5 ml FBS dodato da bi se zaustavila aktivnost enzima i suspenzija je dopunjena do 40 ml ukupne zapremine korišćenjem rastvora za elektrofuziju ćelija, ECFS (0.3 M saharoza, Sigma, Kat. br. S7903, 0.1 mM magnezijum acetat, Sigma, Kat. br. M2545, 0.1 mM kalcijum acetat, Sigma, Kat. br. C4705). Supernatant je uklonjen nakon centrifugiranja i ćelije su resuspendovane u 40 ml ECFS-a. Ovaj korak ispiranja je ponovljen i ćelije su ponovo resuspendovane u ECFS do koncentracije od 2x106 ćelija/ml.
[0114] Elektrofuzija ćelija je izvedena korišćenjem fuzionog generatora, model ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. Veličina upotrebljene fuzione komore je bila 2.0 ml, primenom sledećih podešavanja instrumenta: Uslov poravnanja: napon: 50 V, vreme: 50 sec; pucanje membrane na: naponu: 3000 V, vreme: 30 µsek; vreme zadržavanja posle fuzije: 3 sek.
[0115] Nakon ECF, ćelijske suspenzije su pažljivo uklonjene iz fuzione komore pod sterilnim uslovima i prenete u sterilnu epruvetu koja sadrži istu zapreminu medijuma Hybridoma Culture Medium (DMEM (JRH Biosciences), 15% FBS (Hyclone), obogaćenog L-glutaminom, pen/strep, OPI (oksaloacetat, piruvat, goveđi insulin) (sve Sigma) i IL-6 (Boehringer Mannheim). Ćelije su inkubirane tokom 15 do 30 minuta na 37°C, a zatim centrifugirane na 400 g tokom pet minuta. Ćelije su pažljivo resuspendovane u maloj zapremini medijuma Hybridoma Selection Medium (Hybridoma Culture Medium obogaćen sa 0.5x HA (Sigma, Kat. br. A9666)), i zapremina je podešena na odgovarajući način sa još medijuma Hybridoma Selection Medium, na osnovu konačnog zasejavanja ukupno 5x10<6>B ćelija po ploči sa 96 bunarčića i 200 µl po bunarčiću. Ćelije su pažljivo izmešane i pipetirane u ploče sa 96 bunarčića i ostavljene da rastu. Polovina medijuma je uklonjena 7. ili 10. dana, i ćelije su ponovo nahranjene medijumom Hybridoma Selection Medium.
PRIMER 5: Selekcija antitela-kandidata primenom ELISA testa
[0116] Nakon 14 dana kultivacije, izveden je primarni skrining supernatanta hibridoma iz kohorte br.1 (miševi u kohorti jedan su proizvoljno podeljeni na fuziju br.1 i br.2) za HER-3-specifična antitela primenom ELISA testa korišćenjem prečišćenog, histidinom obeleženog HER-3 ECD, i protiv-skrining protiv irelevantnog proteina obeleženog histidinom primenom ELISA testa, korišćenjem kozjeg anti-huIgGFc-HRP (Caltag Inc., Kat. br. H10507, korišćena koncentracija je bila razblaženje 1:2000) da bi se detektovao humani IgG koji se vezuje za HER-3 ECD imobilisan na ELISA-pločama. Supernatanti stare kulture iz bunarčića sa pozitivnim rastom ćelija hibridoma na osnovu primarnog skrininga su uklonjeni i HER-3 pozitivne ćelije hibridoma su suspendovane sa svežim medijumom za kulture hibridoma i prenete u ploče sa 24 bunarčića. Nakon 2 dana u kulturi, ovi supernatanti su bili spremni za drugostepeni konfirmacioni skrining. U drugostepenom konfirmacionom skriningu za potpuno humana IgGk antitela specifična za HER-3, supernatanti pozitivni u prvom skriningu su podvrgnuti skriningu primenom ELISA testa sa dva seta antitela za detekciju: kozje antihuIgGFc-HRP (Caltag Inc., Kat. br. H10507, korišćena koncentracija je bila razblaženje 1:2000) za detekciju humanog gama lanca i kozje anti-hlg kappa-HRP (Southern Biotechnology, Kat. br. 2060-05) za detekciju humanog kapa lakog lanca. Iz kohorte br. 1, dobijeno je 91 potpuno humano IgG/kapa HER-3 specifično monoklonsko antitelo.
PRIMER 6: Selekcija antitela-kandidata pomoću FMAT/FACS
[0117] Nakon 14 dana kultivacije, supernatanti kulture hibridoma iz kohorte br. 3 i br. 4 (fuzija br. 3 i br. 4) su podvrgnuti skriningu na HER-3-specifična monoklonska antitela pomoću FMAT. U primarnom skriningu, supernatanti kulture hibridoma u finalnom razblaženju 1:10 su inkubirani sa Rat1-HER-3 ćelijama koje eksprimiraju humani HER-3 i 400 ng/ml Cy5-konjugovanog kozjeg F(ab’)2 anti-humanog IgG, Fc-specifičnog antitela (Jackson ImmunoResearch, Kat. br. 109-176-098) na sobnoj temperaturi tokom 6 časova. Vezivanje antitela i antitela za detekciju za ćelije je mereno primenom FMAT (Applied Biosystems). Nespecifično vezivanje antitela za ćelije je određeno preko njihovog vezivanja za parentalne Rat1 ćelije. Ukupno 420 hibridoma koji proizvode HER-3-specifična antitela je selektovano iz primarnog skrininga fuzije br. 3. Supernatanti iz ovih umnoženih kultura su ispitani ponovo korišćenjem istog FMAT protokola i za 262 od njih je potvrđeno da se specifično vezuju za ćelije koje eksprimiraju HER-3. Ukupno 193 hibridoma koji proizvode HER-3 specifična antitela je odabrano iz primarnog skrininga fuzije br. 4. Supernatanti iz ovih umnoženih kultura su ispitivani pomoću FACS metode i za 138 od njih je potvrđeno da se specifično vezuju za ćelije koje eksprimiraju HER-3. U konfirmacionom testu urađenom primenom FACS metode, Rat1-XHER-3 ćelije i parentalne Rat1 ćelije (kao negativna kontrola) su inkubirane sa supernatantantima hibridoma razblaženim u odnosu 1:2 tokom 1 časa na 40°C u PBS koji sadrži 2% FBS. Nakon ispiranja sa PBS, vezivanje antitela za ćelije je detektovano pomoću 2.5 µg/ml Cy5-konjugovanog kozjeg F(ab’)2 anti-humanog IgG, Fcspecifičnog antitela (JIR br. 109-176-098) i 5 µg/ml PE-konjugovanog kozjeg F(ab’)2 antihumanog antitela specifičnog za kapa lanac (SB br. 2063-09). Nakon uklanjanja nevezanih antitela ispiranjem sa PBS, ćelije su fiksirane citofiksom (BD br. 51-2090KZ) u razblaženju 1:4 i analizirane pomoću FACSCalibur aparata.
PRIMER 7: Selekcija hibridoma za kloniranje
[0118] Antitela iz kohorte br. 1 su selektovana za kloniranje hibridoma na osnovu specifičnosti prema HER-3 u odnosu na HER1 (EGF-R), HER-2 i HER-4 pomoću ELISA testa korišćenjem prečišćenih rekombinantnih ekstracelularnih domena (dostupnih kod, na primer R&D Biosystems, Minneapolis, MN) i analiza zasnovanih na FACS metodi ćelijskih linija humanog tumora koje eksprimiraju druge članove HER familije, i više od petostrukog porasta srednje vrednosti intenziteta fluorescencije pri FACS bojenju za HER-3 pozitivne ćelije u odnosu na pozadinski šum. Na osnovu ovog kriterijuma, ukupno 23 linije hibridoma su selektovane za kloniranje zasejavanjem ćelija postupkom graničnog razblaženja.
[0119] Antitela iz kohorti 3 i 4 su selektovana za kloniranje hibridoma na osnovu specifičnosti prema HER-3 u odnosu na HER-1 (EGF-R), HER-2 i HER-4 i još tri dodatna kriterijuma. Prvi kriterijum je bio skrining ELISA testom na antitela sa epitopima koji su sadržani unutar L2 domena HER-3 (videti, primer 8 dole u tekstu).
[0120] Drugi kriterijum je bio neutralizacija vezivanja biotinilovanog heregulina-alfa za ćelije koje eksprimiraju HER-3 u testu zasnovanom na FACS. SKBR-3 ćelije su sakupljene, isprane medijumom za kultivaciju, istaložene centrifugiranjem i resuspendovane u medijumu za kultivaciju. Alikvoti resuspendovanih ćelija su preneti u ploče sa 96 bunarčića. Ploče su centrifugirane da bi se istaložile ćelije. Test-antitela u prikupljenim supernatantima hibridoma su dodata u količini od 25µl/bunarčiću i inkubirana tokom 1 časa na ledu da se dozvoli vezivanje antitela. Pedeset µl 10 nM rastvora heregulina-alfa (R&D Biosystems) je dodato u svaki bunarčić do finalne koncentracije od 5 nM i inkubirano na ledu tokom 1,5 časova. Ćelije su isprane sa 150 µl PBS, staložene centrifugiranjem i supernatant je uklonjen. Ćelije su resuspendovane u 50 µl kozjeg anti-HRG-alfa poliklonskog antitela u koncentraciji od 10 µg/ml i inkubirane tokom 45 minuta na ledu. Ćelije su isprane sa 200 µl PBS, staložene centrifugiranjem i supernatant je uklonjen. Pedeset µl rastvora zečjeg Cy5-obeleženog antikozjeg poliklonskog antitela u koncentraciji od 5 µg/ml i 7AAD u koncentraciji od 10 µg/ml je dodato i inkubirano na ledu tokom 15 minuta. Ćelije su isprane sa 200 µl PBS, staložene centrifugiranjem i supernatant je uklonjen. Ćelije su resuspendovane u 100 µl FACS pufera i očitane u FACS aparatu. Ispitivana HER-3 antitela koja su smanjila vezivanje heregulina-alfa su bila ona koja su imala najniži intenzitet fluorescencije. Kao pozitivne kontrole korišćena su serijska razblaženja sa korakom od 1:5 od 10000 ng/ml do 16 ng/ml mišjeg HER-3 mAb (105.5) ili humanog IgG1 HER-3 mAb, U1-49. Negativne kontrole su bile sam heregulinalfa, same ćelije, samo kozje anti-heregulin-alfa poliklonsko antitelo i samo zečje Cy5-obeleženo anti-kozje poliklonsko antitelo.
[0121] Treći kriterijum je bio relativno rangiranje prema afinitetu i/ili viša relativna srednja vrednost intenziteta fluorescencije u FACS testu korišćenjem ćelijskih linija koje eksprimiraju HER-3. Relativno rangiranje prema afinitetu je izvedeno normalizovanjem koncentracija HER-3-specifičnog antitela i njihovim postavljanjem na grafikon nasuprot podataka iz ELISA testa sa ograničavajućim antigenom kao što sledi u tekstu.
[0122] Normalizovanje koncentracija antigen-specifičnog antitela korišćenjem visokoantigenog ELISA testa: Korišćenjem ELISA metode, normalizovane su koncentracije antigen-specifičnog antitela u supernatantima. Upotrebom dva anti-HER-3 humana IgG1 antitela iz kohorte 1, poznate koncentracije titrirane paralelno, konstruisana je standardna kriva i količina antigen-specifičnog antitela u supernatantima ispitivanog hibridoma iz kohorti 3 i 4 je upoređena sa standardom. Na ovaj način je procenjena koncentracija humanog HER-3 IgG antitela u svakoj kulturi hibridoma.
[0123] Neutravidin ploče su napravljene oblaganjem neutravidinom u koncentraciji od 8 µg/ml u 1XPBS/0.05% natrijum azidu, Costar 3368 medijum-vezujućih ploča sa 50 µl/bunarčiću, inkubacijom preko noći na temperaturi od 4°C. Sledećeg dana, ploče su blokirane sa 1XPBS/1% obranog mleka. Fotobiotinilovani HER-3 ECD obeležen his-tag sekvencom koncentracije 500 ng/ml u 1XPBS/1% obranom mleku je vezan za ploče obeležene neutravidinom inkubacijom u toku 1 časa na sobnoj temperaturi. Supernatant hibridoma, serijski razblažen u onosu 1:2.5, od početnog razblaženja od 1:31 do finalnog razblaženja od 1:7568 u 1XPBS/1% obranom mleku/0.05% azidu, je dodat u količini od 50 µl/bunarčiću, i zatim inkubiran 20 časova na sobnoj temperaturi. Serijska razblaženja su korišćena da bi se osiguralo dobijanje OD očitavanja za svaku nepoznatu u linearnom opsegu testa. Zatim je dodato sekundarno antitelo za detekciju, kozji anti humani IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml u 1XPBX/1% obranom mleku u količini od 50 µl/bunarčiću. Nakon 1 časa na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo isprane 5 puta vodom, i 50 µL jednokomponentnog TMB supstrata je dodato u svaki bunarčić. Reakcija je zaustavljena nakon 30 minuta dodavanjem 50 µl 1M hlorovodonične kiseline u svaki bunarčić i ploče su očitane na talasnoj dužini od 450 nm. Konstruisana je standardna kriva za dva IgG1 HER-3 mAb antitela iz kohorte br.1, serijski razblažena u odnosu 1:2, od 1000 ng/ml do 0.06 ng/ml i ispitana ELISA testom korišćenjem protokola opisanog u prethodnom tekstu. Za svaku nepoznatu, OD očitavanja u linearnom opsegu testa su korišćena za procenu koncentracije humanog HER-3 IgG u svakom uzorku.
[0124] Analiza sa ograničenim antigenom je postupak koji rangira afinitet antigen-specifičnih antitela pripremljenih u supernatantima kultura B-ćelija u odnosu na sva druga antigenspecifična antitela. U prisustvu veoma tankog sloja antigena, samo antitela sa najvišim afinitetom bi trebalo da mogu da se vežu na bilo kom detektabilnom nivou u ravnotežnom stanju (videti, npr, PCT objavu br. WO/03048730A2). U ovom slučaju su korišćena, kao reperi u testu, dva mAb antitela iz kohorte br. 1, poznate koncentracije i poznate KD vrednosti.
[0125] Neutravidin ploče su napravljene oblaganjem neutravidinom u koncentraciji od 8 µg/ml u 1XPBS/0.05% natrijum azidu, Costar 3368 medium-vezujućih ploča sa 50 µl/bunarčiću inkubacijom preko noći na temperaturi od 4°C. Sledećeg dana, ploče su blokirane sa 1XPBS/1% obranog mleka. Biotinilovani HER-3 ECD obeležen his-tag sekvencom (50 µl/bunarčiću) je vezan za neutravidin ploče sa 96 bunarčića u pet koncentracija: 125, 62.5, 31.2, 15.6 i 7.8 ng/ml u 1XPBS/1% obranom mleku tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Svaka ploča je isprana 5 puta vodom. Supernatanti hibridoma razblaženi u odnosu 1:31 u 1XPBS/1% obranom mleku/0.05% azidu su dodati u količini od 50 ul/bunarčiću. Nakon 20 časova inkubacije na sobnoj temperaturi na šejkeru, ploče su ponovo isprane 5 puta destilovanom vodom. Zatim, sekundarno antitelo za detekciju, kozji anti humani IgG Fc HRP (peroksidaza rena) u koncentraciji od 400 ng/ml u 1XPBX/1% obranom mleku je dodato u količini od 50 µl/bunarčiću. Nakon 1 časa na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo isprane 5 puta destilovanom vodom i 50µL jednokomponentnog TMB supstrata je dodato u svaki bunarčić. Reakcija je zaustavljena nakon 30 minuta dodavanjem 50 µl 1M hlorovodonične kiseline u svaki bunarčić i ploče su očitane na talasnoj dužini od 450nm. OD očitavanja koncentracije antigena koja su dala OD vrednosti u linearnom opsegu su korišćena za analizu podataka.
[0126] Postavljanje na grafik podataka za antigen prisutan u velikoj količini, (koji daju relativnu procenu koncentracije specifičnog antitela, videti prethodni tekst za detalje), naspram OD za ograničeni antigen, ilustrovalo je da su antitela relativno višeg afiniteta, npr, ona koja su vezana, imala višu OD vrednost u testu sa ograničenim antigenom, dok su imala manje količine IgG HER-3 antitela u supernatantu. Hibridomi iz kohorti br. 3 i br. 4 za 33 antitela koja su dala najbolje rezultate u ovim setovima testova su prosleđena na kloniranje zasejavanjem hibridoma postupkom graničnog razblaženja.
[0127] Alternativno, FACS analiza HER-3 ekspresije u Ratl/pLXSN i RatI/HER-3 ćelijama je pokazala slične rezultate (nema ukrštene reaktivnosti sa endogenim epitopima pacova). Detaljno, 1x105 ćelija je sakupljeno korišćenjem 10 mM EDTA u PBS, isprano jednom FACS puferom (PBS, 3% FCS, 0.4% azid) i zasejano na ploču sa 96 bunarčića okruglog dna. Ćelije su centrifugirane 3 minuta na 1000 obr/min da bi se uklonio supernatant i zatim resuspendovane sa specifičnim antitelima HER-familije (3 µg/ml). Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu tokom 45 minuta, isprane dva puta FACS puferom i resuspendovane sa sekundarnim antitelom (100 µl/bunarčiću) magarećim-antihumanim-PE (Jackson Immunoresearch, PA) razblaženim u odnosu 1:50 u FACS puferu. Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu i u mraku tokom 30 minuta, isprane dva puta FACS puferom i analizirane (FACS, Beckman Coulter).
PRIMER 8: Strukturno ispitivanje anti-HER-3 antitela
[0128] U narednoj diskusiji, obezbeđene su informacije o strukturi koje se odnose na antitela pripremljena kao što je ovde opisano. U cilju analiziranja struktura antitela proizvedenih u skladu sa predmetnim pronalaskom, umnoženi su geni koji kodiraju fragmente teškog i lakog lanca određenog hibridoma. Sekvenciranje je urađeno kao u nastavku teksta:
[0129] Transkripti VHi VLsu umnoženi iz pojedinačnih klonova hibridoma na ploči sa 96 bunarčića korišćenjem lančane reakcije polimeraze kojoj prethodi reverzna transkripcija (RT-PCR). Poly(A)+-iRNK je izolovana iz približno 2x10<5>ćelija hibridoma korišćenjem FastTrack kita (Invitrogen). Četiri PCR reakcije su izvedene za svaki od hibridoma: dve za laki lanac (kapa (κ), i dve za gama teški lanac (γ). Za umnožavanje je korišćen QIAGEN OneStep kit za PCR na sobnoj temperaturi (Qiagen, kataloški br. 210212). U povezanim PCR reakcijama na sobnoj temperaturi, cDNK su sintetisane uz pomoć mešavine enzima koji deluju na sobnoj temperaturi (Omniscript i Sensiscript) korišćenjem specifičnog prajmera za antisens sekvencu koji je odgovarao C-κ, ili konsenzus sekvenci CH1 regiona Cγ gena. Reverzna transkripcija je izvedena na temperaturi od 50°C tokom 1 časa što je praćeno PCR amplifikacijom cDNK pomoću HotStarTaq DNK polimeraze za visoku specifičnost i osetljivost. U svakoj PCR reakciji korišćena je smeša 5’-sens prajmera; sekvence prajmera su bile zasnovane na lider sekvencama VHi VKdostupnim na Vbase vebsajtu (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
[0130] PCR reakcije su izvedene na 94°C tokom 15 min, inicijalno na povišenoj temperaturi, praćeno sa 40 ciklusa na 94°C tokom 30 sekundi (denaturacija), 60°C tokom 30 sekundi (hibridizacija) i 72°C tokom 1 minuta (elongacija).
[0131] PCR proizvodi su prečišćeni i direktno sekvencirani korišćenjem direktnih i reverznih PCR prajmera upotrebom „ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing ready reaction“ kita (Perkin Elmer). Oba lanca su bila sekvencirana korišćenjem „Prism dye-terminator sequencing“ kitova i ABI 377 aparata za sekvenciranje.
[0132] Analiza sekvence: Analize humanih cDNK sekvenci za V region teškog lanca i V region kapa lanca HER-3 antitela su ostvarene poravnanjem HER-3 sekvenci sa sekvencama V regiona teškog lanca i V regiona kapa lanca humane klicine linije korišćenjem Abgenix softvera (5AS) razvijenog u laboratoriji. Softver je identifikovao korišćenje V gena, D gena J gena, kao i nukleotidne insercije na rekombinacionim spojevima i somatske mutacije. Aminokiselinske sekvence su takođe stvorene in silico da bi se identifikovale somatske mutacije. Slični rezultati su mogli da se dobiju sa komercijalno dostupnim softverom za analizu sekvenci i iz javno dostupnih informacija o sekvenci humanih V, D i J gena, npr, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
[0133] Molekularno kloniranje mAb U1-59: Ukupna RNK je ekstrahovana iz bunarčića za kulturu tkiva koji sadrži višestruke linije hibridoma, uključujući liniju hibridoma koja izlučuje antitelo U1-59. Varijabilni region teškog lanca je umnožen korišćenjem 5’-lider prajmera specifičnih za VH familiju, sa 3’-C-gama prajmerom. Glavna traka je umnožena korišćenjem VH4 prajmera, druge trake nisu bile vidljive. VH4-34 gama fragment je kloniran u pCDNK ekspresioni vektor u isti okvir čitanja sa humanim gama 1 genom za konstantni region.
[0134] Varijabilni region teškog lanca IgM je umnožen korišćenjem 5’ specifičnih prajmera za VH familiju sa 3’ prajmerom mu konstantnog regiona. Glavna traka je umnožena korišćenjem VH2 prajmera, druge trake nisu bile vidljive. VH2-5 mu fragment je kloniran u pCDNK ekspresioni vektor u isti okvir čitanja sa humanim genom za mu konstantni region. V kapa lanci su umnoženi i sekvencirani. Identifikovana su četiri proizvoda RT-PCR kapa lanca. Proizvodi su sekvencirani i nakon analize sekvence putem in silico translacije, samo tri od njih su imala otvorene okvire čitanja. Ova tri funkcionalna kapa lanca su klonirana iz bunarčića sa oligoklonskim U1-59 hibridomom, identifikovanog na osnovu korišćenja V kapa gena, kao (1) VK1 A3-JK2, (2) VK1 A20-JK3 i (3) B3-JK1. Svi V-kapa su klonirani u pCDNK ekspresioni vektor u isti okvir čitanja sa humanim genom za konstantni region kapa lakog lanca.
[0135] Transfekcije: Svaki teški lanac je bio transficiran sa svakim od kapa lanaca u tranzijentnim transfekcijama za ukupno 6 parova teški lanac/kapa laki lanac. Transfekcija gama lanca sa A20 kapa lancem je dala slabu ekspresiju antitela, dok ni jedno antitelo nije sekretovano ili detektovano kada je A20 kapa lanac kotransficiran sa mu lancem. Ukupno tri IgG podtipa i dva IgM podtipa su bila dostupna za test vezivanja za HER-3.
[0136] Aktivnost vezivanja za HER-3+ ćelijske linije je detektovana pomoću FACS metode sa IgG1 mAb koje se sastoji od VH4-34 i B3 kapa lanca. Nijedna druga VH/Vk kombinacija nije dala signal fluorescencije iznad pozadinskog šuma u FACS analizi korišćenjem HER-3+ ćelijskih linija.
[0137] Kompeticija za vezivanje anti-HER-3 antitela: Mnogostruko kompetitivno sortiranje antitela prema vezivanju za epitop je izvedeno kao što je objavljeno kod Jia et al. J Immunol Methods. 288, 91-98 (2004) da bi se procenile grupe HER-3 antitela koje su u kompeticiji za vezivanje za HER-3. Ispitana HER-3 antitela iz kohorte 1 su se grupisala u 5 grupa na osnovu kompeticije za vezivanje.
[0138] Karakterizacija epitopa anti-HER-3 antitela: Okarakterisani su epitopi humanih anti-HER-3 antitela. Prvo je dot blot analiza redukovanog, denaturisanog His-tag-obeleženog HER-3 prečišćenog ECD proteina pokazala odsustvo vezivanja od strane ispitivanih anti-HER-3 antitela (U1-59, U1-61, U1-41, U1-46, U1-53, U1-43, U1-44, U1-47, U1-52, U1-40, U1-49)) pokazujući da su sva ona imala epitope osetljive na redukciju disulfidnih veza, sugerišući da su sva imala diskontinuirane epitope. Potom, antitela su bila mapirana u definisanim domenima u molekulu HER-3 projektovanjem različitih himernih molekula humani-pacovski HER-3, na bazi podele vanćelijskog domena HER-3 na četiri domena:
1) L1 (D1): manji ligand-vezujući domen,
2) S1 (D2): prvi cisteinom-bogati domen,
3) L2 (D3): veći ligand-vezujući domen, i
4) S2 (D4): drugi cisteinom-bogati domen.
[0139] cDNK za ekstracelularni domen (ECD) humanog HER-3 je umnožena iz ćelija RAT1-HER-3. Pacovske cDNK za HER-3 su umnožene pomoću RT-PCR iz RNK jetre pacova i potvrđene sekvenciranjem. cDNK koje eksprimiraju ECD humanog i pacovskog HER-3 su klonirane u sisarske ekspresione vektore kao V5-His fuzioni proteini. Domeni iz humanog HER-3 ECD su razmenjeni u nosaču koji obezbeđuje pacovski HER-3 ECD korišćenjem Mfe1, BstX1 i DraIII internih restrikcionih mesta. Na ovaj način, različiti himerni pacovski/humani HER-3 ECD HIS fuzioni proteini (aminokiseline 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604) su konstruisani i eksprimirani putem tranzijentne transfekcije HEK 293T ćelija. Ekspresija konstrukata je bila potvrđena korišćenjem pacovskog poliklonskog antitela protiv humanog HER-3. Humana monoklonska antitela su ispitana ELISA testom za vezivanje za sekretovane himerne ECD.
[0140] Dva od humanih antitela, uključujući antitelo U1-59, su unakrsno reagovala sa pacovskim HER-3. Da bi se odredili vezujući domeni, ova mAb antitela su ispitana protiv skraćenog oblika HER-3 koji se sastoji od L1-S1-V5-his-tag obeleženog proteina, prečišćenog iz supernatanta HEK 293T ćelija transficiranih plazmidnom DNK koja kodira ekspresiju L1-S1 vanćelijskih domena HER3. mAb U1-59 se vezalo za L1-S1 protein u ELISA testu, nagoveštavajući da je njegov epitop u L1-S1. mAb 2.5.1 se nije vezalo za L1-S1 protein, nagoveštavajući da je njegov epitop u L2-S2. Dalje mapiranje antitela U1-59 je urađeno korišćenjem SELDI masene spektroskopije u kojoj se meri vreme leta jona, sa proizvodima proteolitičke digestije kompleksa mAb-HER-3 ECD na čipu.
[0141] Mapiranje U1-59 epitopa korišćenjem SELDI metode: Dalje mapiranje antitela U1-59 je urađeno korišćenjem SELDI masene spektroskopije u kojoj se meri vreme leta jona sa sa proizvodima proteolitičke digestije kompleksa mAb-HER-3 ECD na čipu. Protein A je kovalentno vezan za PS20 proteinski čip i korišćen za učvršćivanje mAb U1-59. Nakon toga, kompleks PS20 proteina na čipu i monoklonskog antitela je inkubiran sa HER-3-His prečišćenim antigenom. Zatim je kompleks antitelo-antigen digestiran visokim koncentracijama Asp-N. Čip je ispran, čime je zadržan samo HER-3 peptid vezan za antitelo na čipu. Epitop je određen pomoću SELDI metode i identifikovan prema masi fragmenta. Identifikovani 6814 D fragment ima veliku sličnost sa dva očekivana peptida dobijena delimičnom digestijom HER-3-his ECD. Oba preklapajuća peptida mapiraju u domen S1. Povezivanjem rezultata SELDI testa sa vezivanjem za HER-3 delecioni konstrukt, utvrđeno je da epitop mapira u oblasti ostataka 251 do 325.
[0142] Položaj vezujućih domena u ekstracelularnom delu HER-3 koji su prepoznati od strane humanih anti-HER-3 mAb antitela pronalaska prikazan je u TABELI 4. Rezultati mapiranja domena epitopa bili su konzistentni sa rezultatima iz kompeticionih grupa u kompetitivnom vezivanju antitela, sa antitelima koja stupaju u unakrsnu kompeticiju jedna sa drugim za vezivanje za HER-3 koja takođe mapiraju u istom domenu na HER-3.
TABELA 4
PRIMER 9: Određivanje kanonskih klasa antitela
[0143] Strukturu antitela je opisana u pogledu "kanonskih klasa" za hipervarijabilne regione svakog lanca imunoglobulina (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-17). Atomske strukture Fab i VL fragmenata različitih imunoglobulina su analizirane kako bi se odredila veza između njihovih aminokiselinskih sekvenci i trodimenzionalnih struktura njihovih antigen-vezujućih mesta. Chothia i saradnici su otkrili da postoji relativno malo ostataka koji su, kroz svoje pakovanje, vodonične veze ili sposobnost da zauzmu neuobičajene fi, psi ili omega konformacije, primarno odgovorni za konformacije glavnog lanca hipervarijabilnih regiona. Nađeno je da se ovi ostaci pojavljuju na mestima unutar hipervarijabilnih regiona i u očuvanoj okvirnoj sekvenci β naborane ploče. Ispitivanjem sekvenci imunoglobulina koji imaju nepoznatu strukturu, Chothia i saradnici su pokazali da mnogi imunoglobulini imaju hipervarijabilne regione koji su slične veličine onima sa poznatim strukturama, i uz to sadrže identične ostatke na mestima odgovornim za zapaženu konformaciju.
[0144] Njihovo otkriće je sugerisalo da ovi hipervarijabilni regioni imaju konformacije bliske onim u poznatim strukturama. Za pet hipervarijabilnih regiona, izgleda da je repertoar konformacija ograničen na relativno mali broj odvojenih strukturnih klasa. Ove konformacije glavnog lanca hipervarijabilnih regiona koje se uobičajeno javljaju nazvane su "kanonske strukture." Dalji rad Chothia i saradnika (Nature (1989) 342:877-83) i drugih (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:800-15) potvrdio je da postoji mali repertoar konformacija glavnog lanca za najmanje pet od šest hipervarijabilnih regiona antitela.
[0145] CDR regioni svakog antitela opisani u prethodnom tekstu su ispitivani da bi se odredila njihova kanonska klasa. Kao što je poznato, kanonske klase su dodeljene samo CDR1 i CDR2 regionima teškog lanca antitela, uporedo sa CDR1, CDR2 i CDR3 regionima lakog lanca antitela. Tabele u nastavku rezimiraju rezultate analize. Podatak o kanonskoj klasi je u obliku HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3, gde se "HCDR" odnosi na CDR teškog lanca a "LCDR" se odnosi na CDR lakog lanca. Stoga se, na primer, kanonska klasa 1-3-2-1-5 odnosi na antitelo koje ima HCDR1 koji pripada kanonskoj klasi 1, HCDR2 koji pripada kanonskoj klasi 3, LCDR1 koji pripada kanonskoj klasi 2, LCDR2 koji pripada kanonskoj klasi 1 i LCDR3 koji pripada kanonskoj klasi 5.
[0146] Oznake su dodeljivane određenoj kanonskoj klasi kada je postojalo 70% ili više identičnosti aminokiselina u antitelu sa aminokiselinama definisanim za svaku kanonsku klasu. Aminokiseline definisane za svako antitelo mogu da se nađu, na primer, u člancima Chothia i saradnika, na koje se poziva u prethodnom tekstu. TABELA 5 i TABELA 6 prikazuju podatke o kanonskoj klasi za svako od HER-3 antitela. Tamo gde je bilo manje od 70% identičnosti, dodeljena kanonska klasa je označena zvezdicom ("*") da ukaže na to da je napravljena najbolja procena ispravne kanonske klase, zasnovana na dužini svakog CDR i ukupnim podacima. Tamo gde nije bilo poklapanja kanonske klase sa istom dužinom CDR regiona, dodeljivanje oznake kanonskoj klasi je označeno slovom „s“ i brojem, kao što je "s18", što znači da veličina CDR regiona iznosi 18. Tamo gde nema dostupnih podataka o sekvenci za jedan od teških ili lakih lanaca, kanonska klasa je označena sa "Z".
TABELA 5
[0147] TABELA 6 predstavlja analizu broja antitela po klasi. Broj antitela koja pripadaju određenoj kanonskoj klasi označenoj u levoj koloni prikazan je u desnoj koloni. Četiri mAb antitela kojima nedostaju podaci o sekvenci jednog lanca i zbog toga imaju "Z" kao oznaku za kanonsku klasu nisu uključena u ovaj obračun.
[0148] Najčešće viđana struktura je 3-1-2-1-1: Dvadeset jedno od četrdeset jednog mAb antitela koja imaju sekvence i teškog i lakog lanca je imalo ovu kombinaciju.
TABELA 6
PRIMER 10: Određivanje afiniteta antitela
[0149] Merenja afiniteta anti-HER-3 antitela su izvedena indirektnom FACS Scatchard analizom. Dakle, 105 ćelija od interesa ili SK-Br 3 ćelija je sakupljeno sa 10 mM EDTA u PBS, isprano jednom FACS puferom (PBS, 3% FCS, 0.4% azida) i zasejano u ploču sa 96 bunarčića okruglog dna. Ćelije su centrifugirane tokom 3 minuta na 1000 obr/min da se ukloni supernatant i zatim resuspendovane sa α-HER-3 antitelom (3 µg/ml) ili sa razblaženjima antitela (100 µl/bunarčiću) počevši sa 20 µg/ml humanog monoklonskog antitela u FACS puferu, razblaženog u koracima 1:2. Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu tokom 1 časa, isprane dva puta FACS puferom i resuspendovane sa sekundarnim antitelom (100 µl/bunarčiću) magarećim anti-humanim-PE antitelom (Jackson) razblaženim u odnosu 1:50 u FACS puferu. Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu i u mraku tokom 30 minuta, isprane dva puta FACS puferom i analizirane (FACS, Beckman Coulter). Prema FACS Scatchard analizi, srednja vrednost fluorescencije je izračunata za svako merenje. Pozadinski šum bojenja (= bez prvog antitela) je oduzet od svake srednje vrednosti fluorescencije. Konstruisan je Scatchard dijagram na kome je x-vrednost = srednja vrednost fluorescencije i y-vrednost = srednja vrednost fluorescencije /koncentraciju mAb (nM). KD je uzeta kao apsolutna vrednost od 1/m linearne jednačine. Merenja afiniteta za određena antitela odabrana na ovaj način su data u TABELI 7.
TABELA 7
PRIMER 11: Anti-HER-3 antitela indukuju endocitozu HER-3 receptora
[0150] HER-3 je identifikovan kao faktor koji može da utiče na otpočinjanje i napredovanje hiperproliferativnih bolesti na taj način što služi kao važan „čuvar kapije“ ćelijskog signalnog puta posredovanog HER familijom. Stoga, ukoliko se HER-3 efikasno ukloni sa ćelijske površine/membrane putem internalizacije receptora, ćelijski prenos signala i time i transformacija i/ili održavanje ćelija u stanju malignosti može na kraju da bude umanjeno ili potisnuto.
[0151] U cilju ispitivanja da li su anti-HER-3 antitela pronalaska sposobna da indukuju ubrzanu endocitozu HER-3, upoređene su relativne količine HER-3 molekula na površini ćelije nakon 0.5 časova i 4 časa inkubacije ćelija sa anti-HER-3 antitelima. 3x10<5>ćelija je zasejano u normalnom medijumu za rast u posudu sa 24 bunarčića i ostavljeno da raste preko noći. Ćelije su preinkubirane sa 10 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela u normalnom medijumu za rast tokom navedenih vremenskih perioda na temperaturi od 37°C. Ćelije su odvojene od podloge sa 10 mM EDTA i inkubirane sa 10 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela u puferu za ispiranje (PBS, 3% FCS, 0.04% azida) tokom 45 minuta na 4°C. Ćelije su isprane dva puta puferom za ispiranje, inkubirane sa magarećim-anti-humanim-PE sekundarnim antitelom (Jackson) razblaženim u odnosu 1:100 tokom 45 minuta na 4°C, isprane dva puta puferom za ispiranje i analizirane pomoću FACS aparata (BeckmanCoulter, EXPO). Procenat internalizacije je izračunat na osnovu smanjenja srednjeg intenziteta fluorescencije uzoraka obrađenih sa anti-HER-3 u odnosu na uzorke obrađene kontrolom. Ovi eksperimenti su pokazali da tretiranje ćelija anti-HER-3 antitelima vodi internalizaciji receptora. Videti, sliku 5 u SAD objavi br.20080124345.
PRIMER 12: Inhibicija vezivanja liganda za ćelije humanog kancera SKBr3 pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0152] Eksperimenti kompeticije radioaktivno obeleženog liganda su izvedeni u cilju kvantitativnog određivanja sposobnosti anti-HER-3 antitela da inhibiraju vezivanje liganda za HER-3 u testu zasnovanom na ćelijama. Dakle, test vezivanja za HER-3 receptor je izveden sa 4x105 SK-BR-3 ćelija koje su inkubirane sa različitim koncentracijama antitela tokom 30 minuta na ledu. Dodat je 1.25 nM [I125]-α-HRG/[<125>I]-β-HRG u svaki bunarčić i inkubacija je nastavljena tokom 2 časa na ledu. Ploče su isprane pet puta, osušene na vazduhu i izbrojane u scintilacionom brojaču. Antitela su bila sposobna da specifično smanje vezivanje [<125>I]-α-HRG/[125I]-β-HRG za ćelije koje eksprimiraju endogeni HER-3. Videti, slike 6a-6e u SAD objavi br.20080124345.
PRIMER 13: Inhibicija ligandom indukovane fosforilacije HER-3 humanim anti-HER-3 antitelima
[0153] ELISA eksperimenti su izvedeni u cilju istraživanja da li su antitela sposobna da spreče aktivaciju HER-3 posredovanu ligandom β-HRG. Aktivacija HER-3 posredovana ligandom je detektovana pomoću povećane fosforilacije receptorskog tirozina.
1. dan: Sud sa 1 x 96 bunarčića je obložen sa 20 µg/ml kolagena I u 0,1 M sirćetnoj kiselini tokom 4 časa na 37 °C.2.5x10<5>ćelija je zasejano u normalnom medijumu za rast.
2. dan: Ćelije su izgladnjivane u 100 µl medijuma bez seruma tokom 24 časa.
3. dan: Ćelije su preinkubirane sa 10 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela tokom 1 časa na 37°C i zatim tretirane sa 30 ng/ml β-HRG-EGF domena (R&D Systems) tokom 10 minuta. Medijum je odliven uz lagano lupkanje i ćelije su fiksirane 4% rastvorom formaldehida u PBS tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Rastvor formaldehida je uklonjen i ćelije su isprane puferom za ispiranje (PBS/0.1% Tween 20). Ćelije su kvenčovane dodatkom 1% H2O2, 0.1% NaN3u puferu za ispiranje i inkubirane tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, zatim blokirane sa NET-Gelantin tokom 5 časova na 4°C. Primarno antitelo fosfo-HER-3 (Tyr1289) (poliklonsko zečje; ćelijski prenos signala br.4791; 1:300) je dodato preko noći na temperaturi od 4°C.
4. dan: Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje, zatim inkubirana sa anti-zečjim-POD antitelom razblaženim u odnosu 1:3000 u PBS - 0.5% BSA je dodat u svaki bunarčić i inkubiran tokom 1.5 časa na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje i jednom sa PBS. Tetrametilbenzidin (TMB, Calbiochem) je dodat i praćen na 650 nm. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 250 nM HCl i apsorbanca je očitana na 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 650 nm korišćenjem Vmax čitača ploča (Thermo Lab Systems).
[0154] Ovi eksperimenti su pokazali da su anti-HER-3 antitela sposobna da smanje aktivaciju HER-3 posredovanu ligandom što je pokazano smanjenom fosforilacijom receptorskog tirozina. Videti, sliku 7a u SAD objavi br.20080124345.
[0155] Da bi se ispitao potencijal mAb U1-53 da inhibira aktivaciju HER-3 posredovanu ligandom, MCF-7 ćelije su izgladnjivane tokom 24 časa, inkubirane sa mAb U1-53 tokom 1 časa na temperaturi od 37°C i stimulisane sa 10 nM HRG-β tokom 10 minuta. Lizati su prebačeni u ploče za ELISA test obložene sa 1B4 (mišje anti-HER-3 mAb) i fosforilacija HER-3 je analizirana sa antitelom 4G10. Fosforilacija HER-3 je skoro u potpunosti inhibirana na dozno-zavisni način pri IC50od 0.14 nM. Videti, sliku 7b u SAD objavi br.
20080124345.
PRIMER 14: Inhibicija ligandom indukovane fosforilacije p42/p44 MAP-kinaze pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0156] Sledeći ELISA eksperimenti su izvedeni u cilju istraživanja da li su antitela sposobna da spreče aktivaciju p42/p44 MAP-kinaze posredovanu ligandom β-HRG. Aktivacija HER-3 posredovana ligandom je detektovana preko povećane fosforilacije proteina (Thr202/Tyr204).
1. dan: Sud sa 1 x 96 bunarčića je obložen sa 20 µg/ml kolagena I u 0,1 M sirćetnoj kiselini tokom 4 časa na 37°C. 3x10<5>ćelija je zasejano u normalnom medijumu za rast.
2. dan: Ćelije su izgladnjivane u 100 µl medijuma bez seruma tokom 24 časa.
3. dan: Ćelije su preinkubirane sa 5 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela tokom 1 časa na 37°C i zatim tretirane sa 20 ng/ml β-HRG-EGF domena (R&D Systems) tokom 10 minuta. Medijum je odliven uz lagano lupkanje i ćelije su fiksirane sa 4% rastvorom formaldehida u PBS tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Rastvor formaldehida je uklonjen i ćelije su isprane puferom za ispiranje (PBS/0.1% Tween 20). Ćelije su kvenčovane dodatkom 1% H2O2, 0.1% NaN3u puferu za ispiranje i inkubirane tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, zatim blokirane sa PBS/ 0.5% BSA tokom 5 časova na temperaturi od 4°C. Primarno antitelo fosfo-p44/p42 MAP Kinaza (Thr202/Tyr204) (poliklonsko zečje; ćelijski prenos signala br. 9101; 1:3000) je dodato preko noći na temperaturi od 4°C.
5. dan: Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje, zatim inkubirana sa anti-zečjim-HRP antitelom razblaženim u odnosu 1:5000 u PBS - 0.5% BSA je dodato u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1.5 časova na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje i jednom sa PBS. Tetrametilbenzidin (TMB, Calbiochem) je dodat i praćen na 650 nm. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 250 nM HCl i apsorbanca očitana na 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 650 nm korišćenjema Vmax čitača ploča (Thermo Lab Systems). Ovi eksperimenti otkrili su da su antitela sposobna da smanje aktivaciju p42/p44 MAP-kinaze posredovanu ligandom na šta ukazuje smanjena fosforilacija. Videti, sliku 8 u SAD objavi br.
20080124345.
PRIMER 15: Inhibicija β-HRG-indukovane fosforilacije fosfo-AKT pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0157] U sledećem ELISA eksperimentu istraživali smo da li su anti-HER-3 antitela sposobna da spreče aktivaciju AKT-kinaze posredovanu β-HRG ligandom. Aktivacija AKT posredovana ligandom je detektovana preko povećane fosforilacije proteina (Ser473).
1. dan: Sud sa 1 x 96 bunarčića je obložen sa 20 µg/ml kolagena I u 0,1 M sirćetnoj kiselini tokom 4 časa na 37°C. 3x10<5>ćelija je zasejano u normalnom medijumu za rast.
2. dan: Ćelije su izgladnjivane u 100 µl medijuma bez seruma tokom 24 časa.
3. dan: Ćelije su preinkubirane sa 5 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela tokom 1 časa na 37°C i zatim tretirane sa 20 ng/ml β-HRG-EGF domena (R&D Systems) tokom 10 minuta. Medijum je odliven uz lagano lupkanje i ćelije su fiksirane sa 4% rastvorom formaldehida u PBS tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Rastvor formaldehida je uklonjen i ćelije su isprane puferom za ispiranje (PBS/0.1% Tween 20). Ćelije su kvenčovane dodatkom 1% H2O2, 0.1% NaN3u puferu za ispiranje i inkubirane tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, zatim blokirane sa PBS/ 0.5% BSA tokom 5 časova na temperaturi od 4°C. Primarno antitelo fosfo-Akt (Ser473) (poliklonsko zečje; ćelijski prenos signala br.9217; 1:1000) je dodato preko noći na 4°C.
4. dan: Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje, zatim inkubirana sa anti-zečjim-HRP antitelom razblaženim u odnosu 1:5000 u PBS - 0.5% BSA je dodato u svaki bunarčić i ploča inkubirana tokom 1.5 časova na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje i jednom sa PBS. Tetrametilbenzidin (TMB, Calbiochem) je dodat i praćen na 650 nm. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 250 nM HCl i apsorbanca očitana na 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 650 nm korišćenjema Vmax čitača ploča (Thermo Lab Systems). Anti-HER-3 antitela su imala sposobnost da smanje β-HRG- posredovanu AKT na šta ukazuje smanjena fosforilacija. Videti, sliku 9 u SAD objavi br.20080124345.
PRIMER 16: Inhibicija proliferacije MCF7 ćelija posredovane α-HRG/β-HRG pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0158] In vitro eksperimenti su izvedeni u cilju određivanja sposobnosti antitela da inhibiraju proliferaciju ćelija stimulisanu sa HRG.2000 ćelija MCF7 je zasejano u medijum koji sadrži FCS na ploču sa 96 bunarčića preko noći. Ćelije su preinkubirane u četiri ponavljanja sa antitelom razblaženim u medijumu sa 0.5% FCS tokom 1 časa na 37°C. Ćelije su stimulisane sa 30 ng/ml α- ili 20 ng/ml β-HRG (R&D Systems) dodavanjem liganda direktno u rastvor antitela i zatim ostavljene da rastu tokom 72 časa. ALAMARBLUE™ (BIOSOURCE) je dodat i ćelije su inkubirane na 37°C u mraku. Apsorbanca je merena na 590 nm svakih 30 minuta. Podaci su uzeti 90 minuta nakon dodavanja boje alamar plave. Ova ispitivanja su pokazala da reprezentativna antitela mogu da inhibiraju rast ćelija indukovan sa HRG u humanim kancerskim ćelijama. Videti sliku 10 u SAD objavi br.20080124345.
PRIMER 17: Inhibicija β-HRG-indukovane migracije MCF7 ćelija pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0159] Eksperimenti transmigracije su izvedeni u cilju istraživanja da li antitela sprečavaju migraciju ćelija. MCF7 ćelije lišene seruma su preinkubirane dodavanjem naznačene količine antitela ćelijskoj suspenziji i njihovim inkubiranjem tokom 45 minuta na 37°C. 500 µl ćelijske suspenzije (50 000 ćelija) je zatim smešteno u gornju komoru trans-bunarčića obloženih kolagenom I (BD Falcon, pore 8 µm).750 µl medijuma (MEM, aminokiseline, Napiruvat, Pen.-Strept., 0,1% BSA, bez fetalnog telećeg seruma), samog ili koji sadrži ligande β-HRG-EGF domen (R&D Systems) je korišćeno u donjoj komori. Ćelije su ostavljene da migriraju tokom 8 časova na temperaturi od 37°C i obojene sa DAPI. Obojena jedra su brojana ručno; procenat inhibicije je izražen kao inhibicija u odnosu na kontrolno antitelo. Ovi eksperimenti su pokazali da reprezentativna anti-HER-3 antitela mogu da smanje ćelijsku migraciju indukovanu sa HRG. Videti sliku 11 u SAD objavi br.20080124345.
PRIMER 18: Test obrazovanja kolonija (test na mekom agaru)
[0160] Testovi na mekom agaru izvedeni su u cilju istraživanja sposobnosti anti-HER-3 antitela pronalaska da inhibiraju ćelijski rast nezavisan od adhezije. Test obrazovanja kolonija na mekom agaru je standardni in vitro test za ispitivanje transformisanih ćelija, budući da samo takve transformisane ćelije mogu da rastu u mekom agaru.
[0161] 750 do 2000 ćelija (zavisno od ćelijske linije) je preinkubirano sa naznačenim antitelima u koncentraciji od 10 µg/ml u IMDM medijumu (Gibco) tokom 30 minuta i resuspendovano u 0.4% Difco noble agaru. Ćelijska suspenzija je zasejana na formirani sloj od 0.75% agaroze koja sadrži 20% FCS u četiri ponavljanja na ploču sa 96 bunarčića. Kolonije su ostavljene da se formiraju tokom 14 dana i zatim obojene sa 50 µl MTT (0.5 mg/ml u PBS) preko noći, i izbrojane pomoću sistema sa kamerom Scanalyzer HTS (Lemnatec, Wuerselen). Anti-HER-3 antitela su bila u stanju da smanje ćelijski rast nezavisan od adhezije MDA-MB361 i NCI-ADR ćelija kancera dojke, MKN-28 kancera želuca, HT144 melanoma ćelija, Skov3 ćelija karcinoma jajnika, PPC-1 ćelija kancera prostate, BX-PC3 ćelija kancera pankreasa, A431 ćelija epidermoidnog karcinoma i ćelija karcinoma pluća. Videti slike 12a-12i u SAD objavi br.20080124345.
PRIMER 19: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast humanog karcinoma dojke u nude miševima
[0162] Anti-tumorska efikasnost terapijskih antitela se često procenjuje u studijama humanog ksenograft tumora. U ovim studijama, humani tumori rastu kao ksenograftovi u imunokompromitovanim miševima i terapijska efikasnost se meri stepenom inhibicije rasta tumora. U cilju određivanja da li anti-HER-3 antitela interferiraju sa tumorskim rastom ćelija humanog kancera dojke u nude miševima, 5x10<6>T47D ćelija je implantirano u ženke NMRI nude/nude miševa. Tumori su bili subkutani, izrasli na leđima životinje. Tretmani su počinjali kada tumori dostignu srednju zapreminu od 20 mm3; osam dana nakon implantacije. Pre prvog tretmana, miševi su razvrstani po slučajnom izboru i statistički testovi su izvedeni da bi se osigurala ravnomernost početnih zapremina tumora (srednja vrednost, medijana i standardna devijacija) između tretmanskih grupa. Tretman je započet početnom dozom od 50 mg/kg praćenom injekcijama od 25 mg/kg jednom nedeljno, intraperitonealnim injektovanjem. Kontrolna grupa je primila doksorubicin (farmaceutske čistoće). Sve životinje su dopunski primale 0.5 mg/kg/nedeljno estrogena injektovanog i.p. Detalji o tretmanskim grupama su dati u TABELI 8 ispod. Ova ispitivanja su pokazala da primena anti-HER-3 antitela rezultuje u smanjenju rasta tumora. Videti sliku 13 u SAD objavi br.20080124345.
TABELA 8
PRIMER 20: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast humanog tumora pankreasa u SCID miševima
[0163] Da bi se ispitao terapijski potencijal anti-HER3 antitela u drugim tipovima solidnih tumora, anti-HER-3 antitela, U1-53 i U1-59, su ispitana u miševima sa uspostavljenim tumorima izvedenim iz ćelijske linije BxPC3 humanog tumora pankreasa. Kao kontrole, uključene su grupe miševa tretiranih vehikulumom, PBS, ili ustanovljenim terapijskim antitelom erbituksom. 5x106 BxPC3 ćelija je inokulisano subkutano bez matrigela u CB 17 SCiD miševe. Miševi koji nose uspostavljene tumore sa srednjom zapreminom od 140 mm<2>su primili 50 mg/kg U1-53, U1-59, erbituksa ili odgovarajuću zapreminu PBS putem intraperitonealne injekcije. Posle toga miševi su primali jednom nedeljno injekcije sa 25 mg/kg tokom trajanja studije.
[0164] U1-53 i U1-59 su smanjili rast humanih tumora pankreasa na citostatički način. Videti sliku 14 u SAD objavi br. 20080124345. Značajno, u ovom eksperimentu, U1-53 i U1-59 su bili efikasniji od antitela koje ciljano deluje na EGFR, erbituksa, u odlaganju rasta tumora. Ovi podaci su pokazali terapijsku efikasnost anti-HER-3 antitela u poređenju sa terapijskim sredstvom koje predstavlja reper.
PRIMER 21: Kombinovanje humanih anti-HER-3 antitela sa anti-EGFR antitelima povećava anti-tumorsku aktivnost
[0165] Monoterapija hiperproliferativnih bolesti ciljanim antitelima je često otežana problemima kao što je, sa jedne strane, razvoj otpornosti na lekove, a sa druge strane, promena antigenosti. Na primer, gubitak antigenosti nakon produženog tretmana može da učini tumorske ćelije neosetljivim na terapijska antitela, budući da one tumorske ćelije koje ne eksprimiraju ili su izgubile ciljani antigen imaju selektivnu prednost rasta. Ovi problemi mogu da budu izbegnuti korišćenjem antitela u kombinaciji sa terapijskim antitelom koje ciljano deluje na različiti receptor na tumorskim ćelijama, ili drugim antineoplastičnim sredstvom. Delovanje na višestruke signalne puteve ili čak srodne puteve, ali sa višestrukim koracima delovanja, može takođe da obezbedi terapijsku korist. Ovi kombinovani modaliteti lečenja su verovatno efikasniji, jer kombinuju dva anti-kancerska sredstva, od kojih svaki deluje putem drugačijeg mehanizma delovanja.
[0166] Da bi se pokazala praktična korisnost primene anti-HER-3 antitela U1-53 i U1-59, kao pogodne kombinacija sredstava, uporedili smo monoterapijsku primenu U1-53 ili U1-59 sa primenama u kojima su ili U1-53 ili U1-59 kombinovani sa anti-EGR specifičnim antitelom, erbituksom. 5x106 BxPC3 ćelija je inokulisano subkutano sa matrigelom u CB17 SCID miševe. Nakon što je zapremina tumora dostigla 200 mm<3>, miševi su razvrstani po slučajnom izboru u pojedinačne tretmanske grupe. Jednom nedeljno su intraperitonealno primenjivani U1-53, U1-59 i erbituks, kao pojedinačna sredstva ili kombinacije anti-HER3 antitela sa erbituksom ili koktel dva anti HER-3 antitela. Sva antitela su dozirana u pojedinačnim početnim dozama od 50 mg/kg/nedeljno, praćenim injekcijama od 25 mg/kg, jednom nedeljno, tokom šest nedelja. Kontrolne grupe su primale injekcije jednom u dve nedelje gemcitabina (120 mg/kg), jednom nedeljno objedinjenog humanog IgG ili jednom nedeljno vehikuluma (PBS). Terapijski režimi su detaljno opisani u TABELI 9 nastavku teksta.
TABELA 9
[0167] Antitela U1-53 i U1-59, kada se primene kao pojedinačna sredstva, odlagala su rast humanih tumora pankreasa u istom stepenu kao gemcitabin, koji se često koristi kao standardna hemoterapija protiv kancera pankreasa. Zajednička primena erbituksa sa U1-53 ili U1-59 je za rezultat imala značajno veće smanjenje rasta tumora nego što je primećeno kod pojedinačne primene U1-53, U1-59 ili erbituksa. Stoga, koristan terapijski odgovor može da se postigne kombinovanjem anti-HER-3 antitela sa odgovarajućim antitelima koja ciljano deluju na zasebne antigene tumora. Videti sliku 15 u SAD objavi br.20080124345.
[0168] Ukratko, anti-HER-3 antitela pronalaska imaju moćnu terapijsku efikasnost protiv humanih tumora in vivo. Ona mogu efikasno da se kombinuju sa drugim antineoplastičnim terapeuticima za povećanu anti-tumorsku aktivnost.
PRIMER 22: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju tumorski rast humanog melanoma u nu/nu miševima
[0169] Članovi erbB familije receptora, uključujući HER-3, su abnormalno eksprimirani u velikom broju epitelijalnih kancera i poznato je da imaju važne uloge u rastu i preživljavanju mnogih od ovih solidnih tumora. Ovi tumori uključuju melanome, kancere skvamoznih ćelija glave i vrata, nesitnoćelijske kancere pluća i kancere prostate, gliom, kancere želuca, dojke, kolorektalne kancere, kancere pankreasa i jajnika. U cilju potvrde da anti-HER-3 antitela nisu ograničena u svom antikancerskom delovanju na pojedinačne tipove tumora, npr. kancere pankreasa (videti Primer 21), već mogu da se koriste kao terapeutici protiv mnogih HER-3-zavisnih tumora, ispitali smo U1-53 i U1-59 u dodatnim ksenograftskim studijama. Ćelije humanog melanoma (5 x 105), HT144, su injektovane subkutano u CB17 SCID miševe, što je neposredno praćeno intraperitonealnom injekcijom 50 mg/kg U1-53 i U1-59, odgovarajuće zapremine PBS ili dakarbacina (DITC) u dozi od 200 mg/kg. Posle toga, miševi su primali 25 mg/kg U1-53 ili U1-59 jednom nedeljno, dok je DITC davan jednom na svake dve nedelje u dozi od 200 mg/kg.
[0170] Medijane zapremina tumora iz svake tretmanske grupe su izračunate. Primena antitela je dovela do smanjenja rasta humanih melanoma u poređenju sa tumorima koji su bili tretirani sa vehikulumom kao kontrolom. Videti sliku 16 SAD objave br. 20080124345. Ovi rezultati pokazuju da antitela nisu ograničena u svom terapijskom potencijalu i ciljano deluju na veliki broj kancera koji eksprimiraju HER-3.
PRIMER 23: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast ksenograftova karcinoma debelog creva u miševima
[0171] HT-29 ćelije humanog karcinoma debelog creva su suspendovane u medijumu koji sadrži matrigel u odnosu 2:1, do finalne koncentracije od 10 x 10<6>ćelija/ml. 0.2 ml ćelijske suspenzije je injektovano s.c. u desni bok 4-5 nedelja starih CD1 nu/nu miševa. Ukupno 95 miševa je korišćeno.
[0172] Miševi su po slučajnom izboru svrstani u kontrolne i tretmanske grupe. Tretman je započet istog dana. Trajanje tretmana je bilo 29 dana. Nakon završetka studije, tri tumora po grupi je sakupljeno 3 časa nakon primene tretmana. Tumori su podvrgnuti brzom smrzavanju i čuvani na temperaturi od -80 °C.
[0173] Sledeći protokoli tretmana su izvedeni:
- Kontrolna grupa: nespecifični humani IgG 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno - Tretmanska grupa: antitelo U1-53, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno - Tretmanska grupa: antitelo U1-7, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
- Tretmanska grupa: antitelo U1-59, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno - Tretmanska grupa: 5-FU: 5-fluorouracil, 50 mg/kg, 9d x 5, intraperitonealno
[0174] Medijane zapremina tumora svake grupe su izračunate. Primena antitela je rezultovala u smanjenju rasta HT-29 tumora karcinoma debelog creva u poređenju sa tumorima koji su bili tretirani nespecifičnim humanim IgG1. Videti, sliku 17 u SAD objavi br. 20080124345.
PRIMER 24: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast kancera pluća u miševima
[0175] Ćelije Calu-3 humanog nesitnoćelijskog kancera pluća su suspendovane u medijumu koji sadrži matrigel u odnosu 1:1, do finalne koncentracije od 5 x 10<6>ćelija/ml. 0.05 ml ćelijske suspenzije je injektovano s.c. u desni bok 9 nedelja starih ženki CB17 scid miševa. Ukupno 60 miševa je korišćeno.
[0176] Miševi su po slučajnom izboru svrstani u kontrolne i tretmanske grupe. Tretman je započet istog dana. Trajanje tretmana je bilo 32 dana.
[0177] Sledeći protokoli tretmana su izvedeni:
PBS - vehikulum grupa
- hG kontrolna grupa: nespecifični humani IgG: 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
- Tretmanska grupa antitelo U1-53, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno - Tretmanska grupa antitelo U1-7, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno - Tretmanska grupa antitelo U1-59, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
[0178] Medijane zapremina tumora iz svake kontrolne i tretmanske grupe su izračunate. Primena antitela je rezultovala u smanjenju rasta ksenograftova humanog nesitnoćelijskog kancera pluća u poređenju sa tumorima koji su bili tretirani sa PBS kao kontrolom vehikuluma ili nespecifičnim humanim IgG. Videti sliku 18 u SAD objavi br.20080124345.
PRIMER 25: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast humanog tumora pankreasa u Balb/C-miševima
[0179] BxPC3 ćelije humanog tumora pankreasa su suspendovane u medijumu koji sadrži matrigel u odnosu 2:1, do finalne koncentracije od 5 x 106 ćelija/ml. 0.2 ml ćelijske suspenzije je injektovano s.c. u desni bok 5-7 nedelja starih ženki BalbC nu/nu miševa. Ukupno 100 miševa je korišćeno.
[0180] Miševi su po slučajnom izboru svrstani u kontrolne i tretmanske grupe. Tretman je započet istog dana. Trajanje tretmana je bilo 27 dana.
[0181] Sledeći protokoli tretmana su izvedeni:
- hIgG kontrolna grupa: nespecifični humani IgG2, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
- Tretmanska grupa antitelo U1-53, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno - Tretmanska grupa antitelo U1-7, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno - Tretmanska grupa antitelo U1-59, 25 mg/kg, nedeljno, intraperitonealno
- Gemzar tretmanska grupa, gemcitabin, 80 mg/kg, nedeljno, intraperitonealno
[0182] Medijane zapremina tumora iz svake kontrolne i tretmanske grupe su izračunate. Primena antitela je rezultovala u smanjenju rasta humanih tumora pankreasa u poređenju sa tumorima koji su bili tretirani nespecifičnim humanim IgG ili gemzarom. Videti sliku 19 u SAD objavi br.20080124345.
[0183] Inhibicija HER-3 u humanim tumorima pankreasa bi takođe mogla da bude pokazana u farmakodinamskom eksperimentu. Ksenograftovi BxPC3 tumora su gajeni kao što je opisano u prethodnom tekstu.3 miša su tretirana sa 500 µg IgG1 kontrolnog antitela, i 3 miša su tretirana sa 500 µg anti-HER-3 antitela U1-59. Miševi su tretirani 1. i 4. dana i zatim žrtvovani 5. dana da bi se izmerila inhibicija fosforilacije HER-3 zavisna od antitela (pHER-3).
[0184] Tumori su homogenizovani u standardnom RIPA puferu sa inhibitorima proteaze. 50 µg bistrog lizata je razdvojeno na 4-20% Tris-glicin gelu, preneto na nitroceluloznu membranu i blokirano u 3% goveđem serum albuminu (BSA). Imunobloting je izveden korišćenjem anti-pHER-3 antitela (antitelo 21D3, tehnologija ćelijskog prenosa signala). Anti-aktin antitelo (AB a-2066, Sigma) je korišćeno kao kontrola.
[0185] Ekspresija je detektovana pojačanom hemiluminiscencijom (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Slike su snimane pomoću sistema za snimanje Versadoc 5000 (BioRad, Hercules, CA). Nakon primene humanog anti-HER-3-antitela U1-59 fosforilacija HER-3 više nije bila detektabilna. Videti sliku 20 u SAD objavi br. 20080124345. Stoga, antitela su bila sposobna da značajno smanje aktivaciju HER-3 u ćelijama humanog tumora pankreasa.
PRIMER 26: U1-59 inhibira rast tumora u kombinaciji sa drugim sredstvom u ispitivanjima na ksenograftu
[0186] Modeli ksenograftova Calu-3 NSCLC tumora su korišćeni za procenu efikasnosti anti-HER-3 antitela (U1-59), bilo samostalno ili u kombinaciji sa panitumamabom ili erlotinibom. Da bi se odredila efikasnost in vivo, miševi koji nose Calu-3 NSCLC ksenograftove od ∼200 mm3 su tretirani dva puta nedeljno inhibitorima usmerenim na HER familiju ili kontrolom. Ostali eksperimenti su urađeni sa ćelijama A549. U ispitivanjima kombinacije sa panitumumabom, IgG1 je korišćen kao negativna kontrola za U1-59, i IgG2 je korišćen kao negativna kontrola za panitumumab. Kao što je prikazano na slici 1, dok 100 µg U1-59 ili 100 µg samog panitumumaba znatno smanjuje rast tumora u poređenju sa kontrolom, kombinacija 100 µg svakog od dva sredstva u potpunosti inhibira rast tumora (p < 0.0001 za kombinaciju nasuprot svakog od sredstava pojedinačno). U ispitivanjima kombinacije sa erlotinibom, IgG1 je korišćen kao negativna kontrola za U1-59, i vehikulum erlotiniba je korišćen kao negativna kontrola za erlotinib. Kao što je prikazano na slici 2, kombinacija 100 µg U1-59 i 25 µg erlotiniba imala je veće inhibitorno dejstvo nego bilo koje sredstvo primenjeno pojedinačno. Kombinacija UI-59 sa erlotinibom bila je značajno efikasnija od samog U1-59 (p = 0.0376).
PRIMER 27: U1-59 u kombinaciji sa inhibitorima HER inhibira rast ćelija kancera dojke i jajnika nezavisan od adhezije
[0187] Izvedeni su eksperimenti da bi se ocenilo dejstvo U1-59 u kombinaciji sa inhibitorima HER pertuzumabom, trastuzumabom, ili cetuksimabom na rast nezavisan od adhezije kancerskih ćelija SkBr-3 (bazalni ili stimulisan sa HRG) i MDA-MB-435 (bazalni). IgG je korišćen kao negativna kontrola za sva ispitivanja. Kolonije tumorskih ćelija obrazovane su u odsustvu ili prisustvu HRG tokom 6 do 10 dana i obojene sa MTT tokom 4 do 6 časova i kvantitativno određene. U1-59 kao pojedinačno sredstvo nije inhibirao rast kolonija ćelija MDA-MB 435, ali je za 50% inhibirao rast kolonija ćelija SkBr-3 (p<0.001), i do 95% kada je kombinovan sa drugim inhibitorima HER (p<0.05). Na primer, kombinacija 5 µg/ml pertuzumaba ili trastuzumaba sa 5 µg/ml U1-59 smanjila je rast nezavisan od adhezije kod bazalnih ćelija kancera dojke SkBr-3 značajno više nego bilo koje sredstvo pojedinačno (slika 3), pertuzumab, trastuzumab, ili cetuksimab u kombinaciji sa U1-59 bili su značajno (p<0.006) efikasniji nego U1-59 primenjen pojedinačno u SkBr-3 ćelijama stimulisanim sa HRG (slika 4). Slično, kombinacije U1-59 bilo sa pertuzumabom, trastuzumabom ili cetuksimabom su inhibirale obrazovanje kolonija bazalnih ćelija kancera jajnika (MDA-MB-435) značajno bolje (p<0.002) od U1-59 primenjenog pojedinačno (slika 5).
PRIMER 28: U1-59 u kombinaciji sa inhibitorima HER-2 ili hemoterapeutskim sredstvima smanjuje proliferaciju kancerskih ćelija
[0188] Sprovedena su ispitivanja da bi se procenilo dejstvo U1-59 u kombinaciji sa inhibitorima HER-2 ili hemoterapeutskim sredstvima na proliferaciju kancerskih ćelija. Posebno, sledeći eksperimenti su sprovedeni na MDA-MB-175VII ćelijama kancera dojke:
U1-59 i trastuzumab
Kontrola = DMSO 75 μg/ml IgG1 PBS
10 µg/ml U1-59
75 µg/ml trastuzumaba
10 µg/ml U1-59 75 µg/ml trastuzumaba
U1-59 i lapatinib
Kontrola = DMSO 150 μg/ml IgG1
73.5 µg/ml U1-59
0.1 µM lapatiniba
73.5 µg/ml U1-59 0.1 µM lapatiniba
U1-59 i gemcitibin
Kontrola = DMSO 75 μg/ml IgG1 PBS
10 µg/ml U1-59
1 µg/ml gemcitibina
10 µg/ml U1-59 1 µg/ml gemcitibina
U1-59 i cisplatin
Kontrola = DMSO 75 μg/ml IgG1 PBS
10 µg/ml U1-59
1 µg/ml cisplatina
10 µg/ml U1-59 1 µg/ml cisplatina
[0189] Ćelije kancera dojke MDA-MB-175VII su inkubirane sa U1-59 i/ili drugim sredstvima 1 čas pre stimulacije sa HRG. Nakon četiri dana, rast tretiranih ćelija je meren pomoću ALOMAR BLUE™. U ovim testovima, U1-59 je smanjio proliferaciju ćelija MDA-MB-175VII stimulisanih sa HRG do 40% (p<0.05) kao pojedinačno sredstvo, i do 80% (p<0.05) kada je kombinovan sa trastuzumabom ili lapatinibom (slike 6A i 6B). Treba napomenuti da je aditivna aktivnost takođe primećena u ćelijama MDA-MB-175VII kada je U1-59 kombinovan sa hemoterapeuticima koji predstavljaju standard nege (gemcitabin i cisplatin; p<0.05 nasuprot bilo kom od sredstava primenjenom pojedinačno) (slike 6C i 6D). U svakom od ovih eksperimenata, kombinacija U1-59 sa inhibitorom HER-2 bila je efikasnija u smanjenju proliferacije MDA-MB175VII ćelija nego bilo koje sredstvo pojedinačno.
[0190] Slični eksperimenti su izvedeni sa U1-59 i pertuzumabom, trastuzumabom, ili lapatinibom u ćelijama kancera dojke ZR-75-30 stimulisanim sa HRG i ćelijama kancera dojke BT474 stimulisanim sa HRG (slike 7 i 8, redom). U svakom slučaju, kombinacija U1-59 i lapatiniba imala je najveće inhibitorno dejstvo na ćelijsku proliferaciju. U poređenju sa tretmanom pojedinačnim sredstvom, kombinacija U1-59 sa pertuzumabom ili trastuzumabom ili lapatinibom bila je značajno (p < 0.004) efikasnija od U1-59 primenjenog pojedinačno. Kombinovanje U1-59 sa jednim ili više od pertuzumaba, trastuzumaba, i cetiksumaba u ćelijama kancera debelog creva DLD-1 stimulisanim sa HRG i ćelijama kancera dojke HCC-1569 stimulisanim sa HRG imala je slična dejstva, kao što je prikazano na slikama 9 i 10. Dodatno, kombinacije U1-59 sa trastuzumabom ili lapatinibom u ćelijama kancera dojke SkBr-3 stimulisanim sa HRG takođe je bilo efikasnije nego U1-59 primenjen pojedinačno (p < 0.004) (slika 11).
[0191] U dodatnim eksperimentima, ćelije kancera glave i vrata (FaDu) su gajene u medijumu za rast (MEM 10% FBS 1X PSG) i tretirane sa IgG kontrolama, U1-59, panitumumabom ili kombinacijom U1-59 sa panitumabom. Nakon inkubacije tokom 5 dana na 37°C, proliferacija je merena pomoću ALOMAR BLUE™. Kao pojedinačno sredstvo, U1-59 je smanjio proliferaciju FaDu ćelija za 15% do 20%, dok je kombinacija U1-59 sa panitumumabom rezultovala u smanjenju od više od 80%. Kombinacija U1-59 sa panitumumabom rezultovala je u značajnom (p = 0.001 nasuprot najbolje aktivnosti pojedinačnog sredstva) poboljšanju u odnosu na upotrebu bilo kog pojedinačnog sredstva (slika 12).
PRIMER 29: U1-59 u kombinaciji sa drugim inhibitorima HER inhibira prenos signala
[0192] Dejstvo U1-59, bilo samostalno, ili u kombinaciji sa cetuksimabom, pertuzumabom, trastuzumabom, ili lapatinibom na prenos signala mereno je u nestimulisanim ćelijama kancera dojke MDA-MB-175VII, ćelijama kancera dojke SkBr-3 stimulisanim sa HRG, ćelijama kancera kolona Ls174T stimulisanim sa HRG, i ćelijama kancera dojke HCC-1569 stimulisanim sa HRG. Ćelije su tretirane sredstvima kao što je naznačeno na slikama 13-16, i fosforilacija HER-3, Akt, i ERK je procenjena pomoću testa Western blot sa fosfospecifičnim antitelima. Kombinacija U1-59 bilo sa pertuzumabom, trastuzumabom, ili lapatinibom dodatno je smanjila fosforilaciju HER-3, Akt i ERK u svim ispitivanim vrstama ćelija u poređenju sa tretmanima pojedinačnim sredstvom. Izgleda da kombinacija U1-59 sa cetuksimabom u ovim testovima ima manje efikasno sinergističko delovanje.
[0193] Slična ispitivanja su izvedena u alveolarnim epitelijalnim ćelijama A549 (slika 17) i ćelijama Calu3 NSCLC (slika 18) tretiranim samo sa U1-59 ili U1-59 u kombinaciji sa panitumumabom ili lapatinibom, korišćenjem testa Western blot za procenu fosforilacije Akt, EGF-R, HER-2, HER-3, HER-4, i ERK. Kombinacija U1-59 sa panitumumabom je imala najveće očigledno dejstvo na fosforilaciju HER-3 u ćelijama A549, dok je kombinacija bila efikasnija u pogledu fosforilacije Akt i EGF-R u ćelijama Calu3.
[0194] Dodatni eksperimenti su izvedeni da bi se procenila in vitro efikasnost i rast nezavisan od adhezije A549 ćelija tretiranih sa 10 µg/mL U1-59, drugim antitelima protiv HER familije, ili kontrolnim mAb u medijumu koji sadrži serum. Kolonije tumorskih ćelija su se obrazovale u odsustvu egzogenog liganda tokom 10 dana i obojene su sa MTT i kvantitativno određene korišćenjem sistema za snimanje kamerom Scanalyzer HTS. U1-59 je inhibirao rast kolonija za 50% (p<0.001) u ćelijskoj liniji A549 i rezultovao u stagnaciji tumora u ksenograftskom modelu A549 NSCLC nasuprot IgG kontroli ili drugim monoklonskim antitelima protiv HER (p<0.05).
[0195] Ovi rezultati pokazuju da U1-59 inhibira proksimalni i distalni HER-3 onkogeni prenos signala u ćelijskim linijama dojke in vitro, i da su ćelije kancera dojke osetljive na tretman sa U1-59 kao pojedinačnim sredstvom i u kombinaciji sa anti-HER sredstvima.
PRIMER 30: U1-59 senzitizuje lapatinib za in vivo aktivnost
[0196] Da bi se procenila kombinovana dejstva U1-59 i lapatiniba in vivo, miševima su usađene humane ćelije kancera dojke (HCC-1569) i oni su tretirani sa U1-59 i lapatinibom bilo samostalno ili u kombinaciji. Tumori su ostavljeni da dostignu veličine veće od, ili jednake 100 mm3, i miševi su zatim tretirani kontrolom, lapatinibom, U1-59, ili kombinacijom U1-59 i lapantiniba. Kao što je prikazano na slici 19, sam U1-59 nije inhibirao rast tumora HCC-1569, a sam lapatinib je izazvao određenu, ali ne i značajnu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa kontrolom (p=0.16). Međutim, kombinacija lapatiniba sa U1-59, rezultovala je u značajnoj inhibiciji rasta tumora (p < 0.02 nasuprot kontroli ili p < 0.05 nasuprot lapatinibu).
[0197] Ovi rezultati ukazuju na to da kombinacija U1-59 i lapatiniba rezultuje u sinergističkoj inhibiciji rasta tumora HCC-1569 in vivo. Ovi rezultati su posebno zanimljivi i ohrabrujući jer pokazuju da čak i tipovi tumora koji ne odgovaraju na U1-59 ili lapatinib primenjene pojedinačno, mogu vrlo efikasno da se tretiraju kombinacijom ova dva.
PRIMER 31: Upotreba anti-HER-3 antitela kao dijagnostičkih sredstava
[0198] Anti-HER-3 mAb može da se koristi u dijagnostici malignih bolesti. HER-3 je eksprimiran na tumorskim ćelijama na vrlo poseban način u poređenju sa normalnim tkivom i, zbog toga bi analiza eksprimiranja HER-3 pomogla u postavljanju primarne dijagnoze solidnih tumora, određivanju stadijuma i stepena solidnih tumora, proceni prognostičkih kriterijuma za proliferativne bolesti i neoplazije i upravljanje rizikom kod pacijenata sa HER-3 pozitivnim tumorima.
A. Detekcija HER-3 antigena u uzorku
[0199] Razvijen je enzimski imunosorbentni test (ELISA) za detekciju HER-3 antigena u uzorku. U testu, bunarčići mikrotitar ploče, kao što je mikrotitar ploča sa 96 bunarčića ili mikrotitar ploča sa 384 bunarčića, su adsorbovani tokom nekoliko časova prvim potpuno humanim monoklonskim antitelom usmerenim protiv HER-3 antigena. Imobilisano antitelo služi kao antitelo za pričvršćivanje bilo kog od HER-3 antigena koji mogu da budu prisutni u uzorku. Bunarčići se ispraju i tretiraju sredstvom za blokiranje kao što je protein mleka ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0200] Nakon toga se bunarčići tretiraju ispitivanim uzorkom za koji se pretpostavlja da sadrži HER-3 antigen, ili rastvorom koji sadrži standardnu količinu HER-3 antigena. Takav uzorak je, na primer, uzorak seruma ispitanika za koga se pretpostavlja da ima određeni nivo cirkulišućeg HER-3 antigena što se smatra pokazateljem patologije. Nakon uklanjanja ispiranjem test uzorka ili standarda, bunarčići se tretiraju drugim potpuno humanim monoklonskim anti-HER-3 antitelom koje je obeleženo konjugovanjem sa biotinom. Obeleženo anti-HER-3 antitelo služi kao antitelo za detekciju. Nakon uklanjanja ispiranjem viška sekundarnog antitela, bunarčići se tretiraju peroksidazom rena (HRP) konjugovanom sa avidinom i odgovarajućim hromogenim supstratom. Koncentracija HER-3 antigena u test uzorcima se određuje poređenjem sa standardnom krivom nastalom iz standardnih uzoraka.
B. Imunohistohemijska (IHC) detekcija HER3-antigena
[0201] U cilju određivanja HER-3-antigena u isečcima tkiva pomoću IHC, sa tkiva ukalupljenih parafinom prvo se uklanja parafin u ksilenu tokom 2 x 5 minuta, a zatim se tkiva hidriraju 100% etanolom 2 x 3 minuta, 95% etanolom 1 minut, i ispraju destilovanom vodom. Antigeni epitopi maskirani fiksacijom formalinom i kalupljenjem parafinom se izlažu demaskiranjem epitopa, enzimskom digestijom ili saponinom. Za demaskiranje epitopa parafinski isečci se zagrevaju u aparatu koji proizvodi paru, vodenom kupatilu ili mikrotalasnoj rerni tokom 20-40 minuta u rastvoru za demaskiranje epitopa, kao što je na primer rastvor 2N HCl (pH 1.0). U slučaju enzimske digestije, isečci tkiva se inkubiraju na 37°C tokom 10-30 minuta u različitim rastvorima enzima kao što je protienaza K, tripsin, pronaza, pepsin itd.
[0202] Nakon uklanjanja ispiranjem rastvora za demaskiranje epitopa ili viška enzima, isečci tkiva se tretiraju puferom za blokiranje da bi se sprečile nespecifične interakcije. Primarno antitelo se inkubira u odgovarajućim razblaženjima u puferu za razblaživanje tokom 1 časa na sobnoj temperaturi ili preko noći. Višak primarnog antitela se ispira i isečci se inkubiraju u rastvoru za blokiranje peroksidaze tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon još jednog koraka ispiranja, isečci tkiva se inkubiraju sa sekundarnim antitelom obeleženim grupom koja može da posluži za pričvršćivanje enzima. Primeri za to su sekundarna antitela obeležena biotinom koja prepoznaje peroksidaza rena vezana za streptavidin. Detekcija pomenutog kompleksa antitelo/enzim se postiže inkubiranjem sa pogodnim hromogenim supstratom.
C. Određivanje koncentracije antigena HER-3 u serumu pacijenata
[0203] Sendvič ELISA test je razvijen za kvantitativno određivanje nivoa HER-3 u humanom serumu. Na primer, dva potpuno humana monoklonska anti-HER-3 antitela, korišćena u sendvič ELISA testu, prepoznaju različite domene na HER-3 molekulu i nisu u kompeticiji za vezivanje (videti primer 8). ELISA test se izvodi kao što sledi: ELISA ploče (Fisher) se oblažu sa 50 µl anti-HER-3 antitela koje vezuje antigen u puferu za oblaganje (0.1 M NaHCO3, pH 9.6) u koncentraciji od 2 µg/ml. Nakon inkubacije na 4°C preko noći, ploče se tretiraju sa 200 µl pufera za blokiranje (0.5% BSA, 0.1% Tween 20, 0.01% timerosal u PBS) tokom 1 časa na 25°C. Ploče su isprane (3x) korišćenjem 0.05% Tween 20 u PBS (pufer za ispiranje, WB). Normalni ili serumi pacijenata (Clinomics, Bioreclaimation) se razblažuju u puferu za blokiranje koji sadrži 50% humanog seruma. Ploče se inkubiraju sa uzorcima seruma preko noći na 4°C, ispiraju sa WB, a zatim inkubiraju sa 100 µl/bunarčiću anti-HER-3 antitela za detekciju obeleženog biotinom tokom 1 časa na 25°C. Nakon ispiranja, ploče se inkubiraju sa HRP-streptavidinom tokom 15 minuta, ispiraju kao u prethodnom koraku, a zatim tretiraju sa 100 µl/bunarčiću o-fenilendiamina u H2O2(Sigma rastvor za razvijanje boje) za stvaranje boje. Reakcija se zaustavlja sa 50 µl/bunarčiću H2SO4(2 M) i analizira korišćenjem čitača ploča za ELISA test na 492 nm. Koncentracija HER-3 antigena u uzorcima seruma se izračunava poređenjem sa razblaženjima prečišćenog HER-3 antigena korišćenjem četvoroparametarskog programa za fitovanje krive.
[0204] Utvrđivanje stadijuma kancera kod pacijenta: Na osnovu rezultata prikazanih i razmatranih u tačkama A, B i C, moguće je utvrditi stadijum kancera kod ispitanika na osnovu nivoa ekspresije HER-3 antigena. Za dati tip kancera, uzimaju su uzorci krvi od ispitanika kod kojih su dijagnostikovani različiti stadijumi progresije bolesti, i/ili se nalaze na različitim tačkama lečenja kancera. Koncentracija HER-3 antigena prisutna u uzorcima krvi se određuje korišćenjem postupka koji specifično određuje količinu antigena koja je prisutna. Takav postupak uključuje ELISA test, kao što je test opisan u tačkama A i B. Korišćenjem populacije uzoraka koji obezbeđuju statistički značajne rezultate za svaki stadijum progresije ili terapije, određen je opseg koncentracija HER-3 antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaki stadijum.
[0205] U cilju određivanja stadijuma progresije kancera kod ispitanika u studiji, ili karakterisanja odgovora ispitanika na tok terapije, uzima se uzorak krvi ispitanika i određuje se koncentracija HER-3 antigena prisutna u uzorku. Tako dobijena koncentracija se koristi za utvrđivanje kom opsegu koncentracija nađena vrednost pripada. Tako identifikovani opseg je u korelaciji sa stadijumom progresije ili stadijumom terapije identifikovanim u različitim populacijama dijagnostikovanih ispitanika, pružajući na taj način informaciju o stadijumu kod ispitanika u studiji.
[0206] Anti-HER-3 antitela kao što je ovde opisano, koriste se za lečenje određenih hiperproliferativnih poremećaja ili poremećaja povezanih sa HER-3, koji se zasnivaju na mnogim faktorima kao što je na primer ekspresija HER-3. Tipovi tumora kao što su kancer dojke, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, kancer endometrijuma, kancer pljuvačne žlezde, kancer pluća, kancer bubrega, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, kancer tiroidne žlezde, kancer mokraćne bešike, gliom, melanom, drugi kanceri koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-3 predstavljaju primere indikacija koje se leče kombinovanom terapijom kao što je ovde opisano, mada indikacije nisu ograničene na one navedene na prethodnom spisku. Uz to, sledeće grupe pacijenata mogu da imaju korist od lečenja kao što je ovde opisano:
• Pacijenti koji ne ispunjavaju uslove za lečenje sa anti-HER-2 mAb
• Pacijenti rezistentni na anti-HER-1 mAb ili mali molekul anti-EGFR inhibitora
• Pacijenti sa NSCLC rezistentni na erlotinib ili gefitinib
[0207] Anti-HER-3 antitela se koriste u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih sredstava u takozvanoj "kombinovanoj terapiji". Takva kombinovana terapija uključuje, ali nije ograničena na sredstva koja su ovde opisana. Kombinovana terapija sa anti-HER3 antitelima i drugim sredstvima može da produži preživljavanje pacijenta, poveća vreme do progresije tumora, ili poboljša kvalitet života pacijenta. Protokol i plan primene će uzeti u obzir terapijsku efikasnost, kao i na mogućnost smanjivanja uobičajenih doza standardnih terapija, kao što je hemoterapija ili zračna terapija, na primer.
[0208] Lečenje ljudi anti-HER-3 antitelima pronalaska: Da bi se odredili in vivo efekti lečenja anti-HER-3 antitelom kod humanih pacijenata sa tumorima, takvi humani pacijenti, tokom određenog vremena primaju injekcije sa efikasnom količinom anti-HER-3 antitela pronalaska. Periodično tokom tretmana, humani pacijenti se prate da bi se odredilo da li njihovi tumori napreduju, naročito, da li tumori rastu i metastaziraju.
[0209] Pacijent sa tumorom lečen anti-HER-3 antitelima pronalaska ima niži nivo rasta tumora i/ili metastaza u poređenju sa nivoom rasta tumora i metastaza kod pacijenata sa tumorom lečenih terapeuticima koji predstavljaju aktuelni standard nege.
[0210] Lečenje konjugatima anti-HER-3 antitela: Da bi se odredili in vivo efekti konjugata anti-HER-3 antitela, humani pacijenti ili životinje koje ispoljavaju tumore, tokom određenog vremena primaju injekcije sa efikasnom količinom konjugata anti-HER-3 antitela. Na primer, primenjeni konjugat anti-HER-3 antitela je konjugat DM1-anti-HER-3 antitelo, konjugat auristatin-anti-HER-3 antitelo ili konjugat radioizotop-anti-HER-3 antitelo. Periodično tokom tretmana, humani pacijenti ili životinje se prate da bi se odredilo da li njihovi tumori napreduju, naročito, da li tumori rastu i metastaziraju.
[0211] Humani pacijent ili životinja koja ispoljava tumore i podvrgnuta je lečenju sa, na primer, konjugatima DM1-anti-HER-3 antitelo ili konjugatima radioizotop-anti-HER-3 antitelo ima niži nivo rasta tumora i metastaza u poređenju sa kontrolnim pacijentom ili životinjom koja ispoljava tumore i podvrgnuta je lečenju alternativnom terapijom. Kontrolna DM1-antitela koja mogu da se koriste kod životinja uključuju konjugate koji sadrže DM1 vezan za antitela istog izotipa kao anti-HER-3 antitela pronalaska, ali konkretno, koja nemaju mogućnost da se vežu za HER-3 tumorski antigen. Kontrolna radioizotop-antitela koja mogu da se koriste u testovima na životinjama uključuju konjugate koji sadrže radioizotop vezan za antitela istog izotipa kao anti-HER-3 antitela pronalaska, ali konkretno, koja nemaju mogućnost da se vežu za HER-3 tumorski antigen. Zapaziti: kontrolni konjugati se neće primenjivati na ljude.
PRIMER 33: Identifikovanje doza i rasporeda primene u prvom ispitivanju na ljudima anti-HER-3 mAb na osnovu pretkliničke farmakokinetike, farmakodinamike i podataka o efikasnosti
[0212] Izvedena su ispitivanja da bi se pretklinički model iskoristio za predviđanje režima minimalne efikasne doze za objektivni odgovor korišćenjem pretkliničke farmakokinetike (PK), antitumorske efikasnosti kod BxPC3 ksenograft miševa i farmakodinamskih (PD) podataka.
[0213] Miševi koji nose uspostavljene ksenograftove pankreasa BxPC3 zapremine ∼200mm<3>tretirani su dva puta nedeljno sa U1-59 u dozama od 25, 100, 200, 500 µg/mišu. Inhibicija pHER u BxPC3 ksenograftskim tumorima ispitivana je pomoću testa Western blot. Model za PK/PD/efikasnost (zasnovan na Simeoni et al. (2004) Cancer Res.64:1094-1101) je korišćen za potencijalno odabiranje doze i rasporeda za dalje ispitivanje. Za potvrdu modela za PK/PD/efikasnost, miševi koji nose BxPC3 tumor pankreasa su tretirani sa 400 µg/mišu na dve nedelje i 200 µg/mišu na dve nedelje, nedeljno i dva puta nedeljno. Preračunavanje vrednosti za primenu kod različitih vrsta zasnovano na telesnoj težini (BW), korišćeno je za predviđanje parametara U1-59 PK kod čoveka, na osnovu serumskih koncentracija dobijenih kod miševa, pacova i majmuna. Veza između koncentracije leka, inhibicije pHER-3 kod životinja, i preračunavanja PK za različite vrste korišćena je za izbor minimalne efikasne doze za prvo od ispitivanja na ljudima.
[0214] Tretman BxPC3 ksenograftova sa U1-59 rezultovao je u statistički značajnoj inhibiciji rasta tumora i nivoa pHER-3 na način zavisan od doze i rasporeda primene (p<0.05). Tretman sa U1-59 u dozi od 400 µg/mišu na dve nedelje i 200 µg/mišu na dve nedelje, nedeljno i dva puta nedeljno rezultovao je u 50%, 33%, 74% i 70% inhibicije rasta tumora (p<0.05), 30%, 58%, 23% i 20% inhibicije pHER-3 (kvantitativni Western blot) nasuprot kontrolnoj grupi tretiranoj sa IgG, redom. Serumske koncentracije U1-59 na obdukciji za odgovarajuće dozne grupe bile su (srednja vrednost (SD)) 2.07 (0.97), 0.45 (0.21), 3.08 (0.82) i 34.9 (9.1) µg/mL, redom. Procenjeno je da je minimalna koncentracija potrebna za postizanje 90% od maksimalne inhibicije pHER-3 (IC90) iznosila ∼3 µg/ml. Razvijeni model za PK/PD/efikasnost predvideo je srednju vrednost zapremine tumora (R2 = 0.925). Klirens (CL) i polazni volumen distribucije (Vd) kod čoveka je procenjen na 11 mL/danu/kg i 28 mL/kg. Poređenje simuliranih humanih PK profila je sugerisalo da doze od > 3 mg/kg na dve nedelje, koje bi trebalo da ispoljavaju linearnu PK, mogu da rezultuju u > 90% inhibicije pHER-3 tokom doznog intervala od dve nedelje.
[0215] Antitumorska efikasnost u modelu BxPC3 ksenografta pankreasa bila je u korelaciji sa povećanom serumskom koncentracijom U1-59 i smanjenjem nivoa pHER-3, omogućavajući razvoj odnosa PK/PD/efikasnost. Ovaj odnos je korišćen za određivanje doze i rasporeda za ispitivanje U1-59 u prvom ispitivanju na ljudima (FIH).
PRIMER 34: Ispitivanja reaktivacije
[0216] Ćelije A549 su zasejane u Ham-ovom F-12 medijumu (Gibco), svi medijumi su bili obogaćeni sa 10% FBS (Hyclone, Logan, UT) i 1X L-glutaminom (Gibco). Ćelije su preko noći lišene seruma. Medijum je zamenjen svežim medijumom bez seruma i ćelije su tretirane sa 50 µg/ml U1-59 ili 5 µM samog gefitiniba, ili kombinacijom U1-59 i gefitiniba, tokom 1 ili 24 časa na 37°C. Ćelije su oprane hladnim PBS nakon odgovarajućih vremenskih tačaka tretmana i lizirane upotrebom pufera RIPA (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% Igepal, 1% natrijum deoksiholat, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100) koji je sadržao 200 µM fenilmetansulfonilfluorida (PMSF) (Fluka Biochemica), 200 µM kita sa koktelom inhibitora proteaze Halt (Pierce Biotechnology), i 200 µM natrijum ortovanadata (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Lizati su propušteni kroz kolone za usitnjavanje QIA (Qiagen) i frakcija koja je protekla kroz kolonu je kvantitativno određena korišćenjem spektrofotometra (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Proteini, 50 µg po bunarčiću, su ispitivani u duplikatu na pHER3 korišćenjem ELISA Duoset (R&D systems) prema protokolu proizvođača. Rezultati su prikazani na SLICI 20.
DRUGI PRIMERI IZVOĐENJA
[0217] Podrazumeva se da je oblast pronalaska definisana oblašću priloženih patentnih zahteva.

Claims (11)

Patentni zahtevi
1. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu u lečenju ili prevenciji hiperproliferativne bolesti povezane sa HER-3,
naznačeno time što je pomenuta hiperproliferativna bolest kancer koji eksprimira ili prekomerno eksprimira HER-3,
naznačeno time što je pomenuto drugo sredstvo trastuzumab, i
naznačeno time što pomenuto prvo sredstvo predstavlja antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3, i sadrži: aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži CDRH1 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 256; CDRH2 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 282; i CDRH3 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 315; i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži CDRL1 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 340; CDRL2 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 344; i CDRL3 kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 387.
2. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što pomenuto prvo sredstvo predstavlja antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3, i sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 70 ili/i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 72.
3. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što pomenuto prvo sredstvo predstavlja antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3, i sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 70 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 72.
4. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 6, naznačeno time što je pomenuti antigen-vezujući protein usmeren protiv ekstracelularnog domena HER-3, ili smanjuje prenos signala posredovan sa HER-3, ili smanjuje fosforilaciju HER-3, ili smanjuje ćelijsku proliferaciju, ili smanjuje ćelijsku migraciju ili/i povećava nishodnu regulaciju HER-3.
5. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što pomenuti antigen-vezujući protein koji se vezuje za HER-3 predstavlja antitelo, naročito monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov fragment antitela, naročito Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2 fragment, Fv fragment, di-antitelo, ili molekul jednolančanog antitela, naročito antitelo tipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.
6. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je pomenuto prvo sredstvo vezano za efektorsku grupu, naročito za radioizotop ili radionuklid, toksin, ili terapeutsku ili hemoterapeutsku grupu, gde je terapeutska ili hemoterapeutska grupa poželjno kaliheamicin, auristatinPE, geldanamicin, maitansin i njihovi derivati.
7. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što pomenuto lečenje ili prevencija sadrži primenu dodatnog terapeutskog sredstva i/ili zračne terapije, gde je dodatno terapeutsko sredstvo poželjno antineoplastično sredstvo ili antitumorsko antitelo ili hemoterapeutsko sredstvo, gde je hemoterapeutsko sredstvo poželjno izabrano iz grupe koja se sastoji od kapecitabina, antraciklina, doksorubicina, ciklofosfamida, paklitaksela, docetaksela, cisplatina, gemcitabina i karboplatina.
8. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što su pomenuto prvo sredstvo i pomenuto drugo sredstvo za primenu intravenskom, subkutanom, intramuskularnom ili oralnom primenom.
9. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je pomenuta hiperproliferativna bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera debelog creva, kancera bubrega, kancera pluća, kancera pankreasa, epidermoidnog karcinoma, fibrosarkoma, melanoma, nazofaringealnog karcinoma, i karcinoma skvamoznih ćelija.
10. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pomenuto lečenje ili prevencija sadrži primenu pomenutog prvog sredstva ili drugog sredstva u dozi od oko 1 do oko 20 mg/kg telesne težine, najmanje jednom na svakih 6 nedelja.
11. Prvo sredstvo i drugo sredstvo za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pomenuto lečenje ili prevencija dalje sadrži, nakon primene kod subjekta, praćenje terapeutskog ishoda.
RS20180048A 2009-11-13 2010-11-12 Materijal i postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa her-3 RS56741B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26114909P 2009-11-13 2009-11-13
EP13189092.3A EP2719708B1 (en) 2009-11-13 2010-11-12 Material and methods for treating or preventing HER-3 associated diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56741B1 true RS56741B1 (sr) 2018-03-30

Family

ID=43618172

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200651A RS60390B1 (sr) 2009-11-13 2010-11-12 Materijal i postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa her-3
RS20180048A RS56741B1 (sr) 2009-11-13 2010-11-12 Materijal i postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa her-3

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200651A RS60390B1 (sr) 2009-11-13 2010-11-12 Materijal i postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa her-3

Country Status (26)

Country Link
US (4) US9101760B2 (sr)
EP (5) EP2896632B1 (sr)
JP (5) JP5931736B2 (sr)
KR (1) KR101806323B1 (sr)
CN (2) CN105999263B (sr)
AR (1) AR080564A1 (sr)
AU (1) AU2010319483B2 (sr)
BR (1) BR112012012160B1 (sr)
CA (1) CA2780935C (sr)
CY (2) CY1119751T1 (sr)
DK (2) DK3351558T3 (sr)
ES (3) ES2655737T3 (sr)
HK (1) HK1207651A1 (sr)
HR (2) HRP20180104T1 (sr)
HU (2) HUE049880T2 (sr)
LT (2) LT3351558T (sr)
MX (3) MX358013B (sr)
NO (1) NO2719708T3 (sr)
PL (2) PL3351558T3 (sr)
PT (2) PT3351558T (sr)
RS (2) RS60390B1 (sr)
SI (2) SI3351558T1 (sr)
SM (2) SMT202000267T1 (sr)
TW (1) TWI630916B (sr)
UY (1) UY33034A (sr)
WO (1) WO2011060206A2 (sr)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101313702B1 (ko) 2005-02-03 2013-10-04 와이어쓰 제피티니브 및/또는 에를로티니브 내성암 치료용 약제학적 조성물
TW200803892A (en) 2005-11-04 2008-01-16 Wyeth Corp Antineoplastic combinations with MTOR inhibitor, herceptin, and/or HKI-272
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US9365634B2 (en) * 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
US8022216B2 (en) 2007-10-17 2011-09-20 Wyeth Llc Maleate salts of (E)-N-{4-[3-chloro-4-(2-pyridinylmethoxy)anilino]-3-cyano-7-ethoxy-6-quinolinyl}-4-(dimethylamino)-2-butenamide and crystalline forms thereof
DK2310011T3 (da) 2008-06-17 2013-10-14 Wyeth Llc Antineoplastiske kombinationer indeholdende hki-272 og vinorelbin
KR101434009B1 (ko) 2008-08-04 2014-08-25 와이어쓰 엘엘씨 4-아닐리노-3-사이아노퀴놀린과 카페시타빈의 항신생물성 조합물
AU2009304560A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 Angiochem Inc. Conjugates of GLP-1 agonists and uses thereof
ES2572728T3 (es) * 2009-03-20 2016-06-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-HER biespecíficos
US9211291B2 (en) 2009-04-06 2015-12-15 Wyeth Llc Treatment regimen utilizing neratinib for breast cancer
CN102030742B (zh) 2009-09-28 2013-06-19 齐鲁制药有限公司 作为酪氨酸激酶抑制剂的4-(取代苯胺基)喹唑啉衍生物
WO2011051333A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novartis Ag Universal fibronectin type iii bottom-side binding domain libraries
CN105999263B (zh) * 2009-11-13 2021-06-29 第一三共欧洲有限公司 用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(her-3)相关疾病的材料和方法
AU2015201262B2 (en) * 2009-11-13 2017-04-27 Amgen Inc. Material and methods for treating or preventing her-3 associated diseases
UA107821C2 (en) 2009-12-22 2015-02-25 Roche Glycart Ag Antibody her3 and its application
SG187225A1 (en) 2010-07-30 2013-02-28 Novartis Ag Fibronectin cradle molecules and libraries thereof
PL2606070T3 (pl) 2010-08-20 2017-06-30 Novartis Ag Przeciwciała dla receptora epidermalnego czynnika wzrostu 3 (her3)
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
AU2011324871B2 (en) 2010-11-01 2016-05-19 Symphogen A/S Anti-HER3 antibodies and compositions
HK1200468A1 (en) 2011-09-30 2015-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb3 antibodies and uses thereof
US9273143B2 (en) 2011-09-30 2016-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody
CN104053670A (zh) 2011-10-31 2014-09-17 百时美施贵宝公司 具有降低的免疫原性的纤连蛋白结合域
MX350957B (es) 2011-11-23 2017-09-27 Medimmune Llc Moleculas de union especificas para her3 y usos de las mismas.
SG11201402783YA (en) * 2011-12-05 2014-06-27 Novartis Ag Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)
MX2014006731A (es) * 2011-12-05 2015-06-04 Novartis Ag Anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento epidermico 3 (her3) dirigidos al dominio iii y al dominio iv del her3.
JP2015509492A (ja) * 2012-02-22 2015-03-30 ユー３・ファーマ・ゲーエムベーハー Ｈｂ−ｅｇｆ結合タンパク質およびｅｇｆｒ阻害剤の組合せ
WO2013124419A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 U3 Pharma Gmbh Her3 inhibitor for modulating radiosensitivity
HK1202431A1 (en) * 2012-05-02 2015-10-02 Symphogen A/S Humanized pan-her antibody compositions
AU2013302273A1 (en) * 2012-08-14 2015-02-19 Angiochem Inc. Conjugates including an antibody moiety, a polypeptide that traverses the blood-brain barrier, and a cytotoxin
EP2727942A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Bispecific antibodies against human EGFR, HER2, and HER3
EP2727943A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Trispecific antibodies against human EGFR, HER2 and HER3
EP2727941A1 (en) 2012-11-05 2014-05-07 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
EP2914629A1 (en) 2012-11-05 2015-09-09 MAB Discovery GmbH Method for the production of multispecific antibodies
WO2014071531A1 (en) * 2012-11-12 2014-05-15 Angiochem Inc. Aprotinin-derived polypeptide-antibody conjugates
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
US11305012B2 (en) 2013-09-24 2022-04-19 Medimmune, Llc Binding molecules specific for HER3 and uses thereof
WO2015100459A2 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarker profiles for predicting outcomes of cancer therapy with erbb3 inhibitors and/or chemotherapies
AU2015245122B2 (en) * 2014-04-10 2019-10-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-HER3 antibody-drug conjugate
US10745490B2 (en) 2014-04-11 2020-08-18 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ErbB antibodies and methods of use thereof
CA2959716A1 (en) 2014-09-08 2016-03-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-her3 antibodies and uses of same
AU2015313811A1 (en) 2014-09-08 2017-04-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating cancer resistant to a tyrosine kinase inhibitor (TKI)
CN104861068B (zh) * 2015-01-23 2020-11-17 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种全人源抗her3抗体及其治疗相关疾病的用途
US10184006B2 (en) 2015-06-04 2019-01-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for predicting outcomes of cancer therapy with ErbB3 inhibitors
EP3307326B9 (en) 2015-06-15 2021-02-24 Angiochem Inc. Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis
HUE061408T2 (hu) 2015-06-29 2023-06-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Eljárás antitest-gyógyszer konjugátum szelektív elõállítására
WO2017102789A1 (en) * 2015-12-17 2017-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-her3 antibodies and anti-her2 antibodies
US11008402B2 (en) * 2016-09-15 2021-05-18 Universitat Stuttgart Antigen binding protein against HER3
WO2018110515A1 (ja) 2016-12-12 2018-06-21 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ
BR112019012847A2 (pt) 2017-01-17 2019-12-10 Daiichi Sankyo Co Ltd anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo, polinucleotídeo, vetor de expressão, células hospedeiras, método para produção de um anticorpo de interesse ou de um fragmento funcional do anticorpo e para produção de um conjugado de anticorpo-fármaco, conjugado de anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, fármaco antitumoral, e, método de tratamento de um tumor.
WO2018159582A1 (ja) * 2017-02-28 2018-09-07 学校法人近畿大学 抗ｈｅｒ３抗体－薬物コンジュゲート投与によるｅｇｆｒ－ｔｋｉ抵抗性の非小細胞肺癌の治療方法
JP7328151B2 (ja) * 2017-04-28 2023-08-16 シージェン インコーポレイテッド Ｈｅｒ２陽性がんの処置
TW202530220A (zh) 2017-05-15 2025-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物之製造方法
AU2018327171B2 (en) 2017-08-31 2023-03-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
KR102422860B1 (ko) 2017-08-31 2022-07-19 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 신규 제조 방법
HRP20230787T1 (hr) 2018-05-18 2023-10-27 Glycotope Gmbh Anti-muc1 antitijelo
WO2019241893A2 (en) * 2018-06-22 2019-12-26 Crd Pharmaceuticals Inc Anti-her3 antibody and uses thereof
US12358999B2 (en) 2018-07-27 2025-07-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Protein recognizing drug moiety of antibody-drug conjugate
KR102894505B1 (ko) 2018-07-31 2025-12-02 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트 투여에 의한 전이성 뇌종양의 치료
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
CA3169406A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 Reflexion Medical, Inc. Joint optimization of radionuclide and external beam radiotherapy
US20260028417A1 (en) * 2022-03-03 2026-01-29 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Her3 binding protein and use thereof
KR20250004686A (ko) * 2022-04-29 2025-01-08 쓰촨 케룬-바이오테크 바이오파마수티컬 컴퍼니 리미티드 항체-약물 접합체, 및 이의 제조 방법 및 용도

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1467383A (en) 1974-06-12 1977-03-16 Farmaceutici Italia Daunomycin analogues
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399276A (en) 1981-01-09 1983-08-16 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha 7-Substituted camptothecin derivatives
US4471052A (en) 1982-01-18 1984-09-11 Adria Laboratories, Inc. Biosynthesis of simplified anthracyclines
JPS58166633A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
JPS58166634A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6019790A (ja) 1983-07-14 1985-01-31 Yakult Honsha Co Ltd 新規なカンプトテシン誘導体
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
JPS62170639A (ja) 1986-01-22 1987-07-27 株式会社システムメンテナンス 防蟻板の取付け工法
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) * 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US4939168A (en) 1989-08-11 1990-07-03 Harbor Branch Oceanographics Institution, Inc. Discodermolide compounds, compositions containing same and methods of preparation and use
US5183884A (en) * 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2090473A1 (en) 1990-08-29 1992-03-01 Robert M. Kay Homologous recombinatin in mammalian cells
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP2938569B2 (ja) 1990-08-29 1999-08-23 ジェンファーム インターナショナル，インコーポレイティド 異種免疫グロブリンを作る方法及びトランスジェニックマウス
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
CA2135313A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Theodore Choi Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0652950B1 (en) 1992-07-24 2007-12-19 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
CA2129288C (en) 1993-08-17 2000-05-16 Jerzy Golik Phosphonooxymethyl esters of taxane derivatives
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
EP0730646A1 (en) * 1993-11-23 1996-09-11 Genentech, Inc. PROTEIN TYROSINE KINASES NAMED Rse
FR2718135B1 (fr) 1994-04-05 1996-04-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Procédé de préparation d'hydroxy-7 taxanes.
FR2721928A1 (fr) 1994-07-04 1996-01-05 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux taxoides, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
TW321649B (sr) 1994-11-12 1997-12-01 Zeneca Ltd
US5837815A (en) * 1994-12-15 1998-11-17 Sugen, Inc. PYK2 related polypeptide products
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US6150581A (en) * 1995-06-07 2000-11-21 United States Surgical Corporation Chitosan/alginate anti-adhesion barrier
EP0773288A3 (en) 1995-08-29 1997-07-09 Kirin Brewery Chimera animal and its method of manufacture
US5681847A (en) 1995-12-05 1997-10-28 Harbor Branch Oceanographic Institution, Inc. Methods of using discodermolide compounds
EP1728802A3 (en) 1996-03-27 2006-12-13 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
US5968511A (en) * 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
US6114595A (en) * 1996-04-11 2000-09-05 The Procter & Gamble Company Stretchable, extensible composite topsheet for absorbent articles
US5916771A (en) * 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6204388B1 (en) 1996-12-03 2001-03-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
DE69729954T2 (de) 1996-12-11 2005-09-08 Sugen, Inc., San Francisco Identifizierungsverfahren für Substanzen die an das Pyk2 Polypeptid binden
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
NZ511722A (en) 1998-11-20 2004-05-28 Kosan Biosciences Inc Recombinant methods and materials for producing epothilone and epothilone derivatives
AU2209899A (en) 1998-12-30 2000-07-24 Sugen, Inc. Pyk2 (raftk) and inflammation
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
AUPQ105799A0 (en) * 1999-06-18 1999-07-08 Victor Chang Cardiac Research Institute, The Cell growth inhibition
PL204629B1 (pl) 1999-06-25 2010-01-29 Genentech Inc Zastosowanie przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia raka sutka, zastosowanie przeciwciała do leczenia raka jajnika, zastosowanie przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia raka płuc i zastosowanie przeciwciała do leczenia raka okrężnicy, raka odbytnicy i raka jelita grubego i odbytu
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
SI1210115T1 (sl) 1999-08-27 2009-12-31 Genentech Inc Doziranja za zdravljenje s protitelesi proti ErbB2
FR2817258B1 (fr) * 2000-11-27 2003-01-10 Atofina Procede de sulfochloration photochimique d'alcanes gazeux
IL152420A0 (en) 2001-02-23 2003-05-29 Novartis Ag Novel oncolytic adenoviral vectors
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
US7718387B2 (en) 2001-09-20 2010-05-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
DK1461442T3 (en) 2001-11-30 2017-12-04 Amgen Fremont Inc Transgenic animals with human Ig lambda light chain genes
ES2294193T3 (es) 2001-12-03 2008-04-01 Amgen Fremont Inc. Identificacion de moleculas de alta afinidad mediante deteccion con dilucion limitada.
CN1219882C (zh) 2002-03-18 2005-09-21 上海泽生科技开发有限公司 以erbb－3为基础的用于肿瘤治疗的方法和组合物
AU2003218600C1 (en) 2002-03-26 2009-12-17 Zensun (Shanghai) Science & Technology Co., Ltd. ERBB3 based methods and compositions for treating neoplasms
US7332580B2 (en) * 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
KR20050025669A (ko) 2002-07-25 2005-03-14 아클라라 바이오사이언시스 인코퍼레이티드 수용체 올리고머화의 검출
EP1578799B8 (en) 2002-12-02 2011-03-23 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof
JP2006523314A (ja) 2003-04-01 2006-10-12 モノグラム バイオサイエンシズ，インコーポレーテッド バイオマーカーとしてのＥｒｂＢ表面受容体複合体
JP2005024385A (ja) 2003-07-02 2005-01-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 感圧センサ
UA94899C2 (ru) * 2005-01-21 2011-06-25 Дженентек, Инк. Фиксированное дозирование антител к her
EP1859041B2 (en) 2005-02-18 2014-11-19 Angiochem Inc. Aprotinin polypeptides for transporting a compound across the blood-brain barrier
PE20070207A1 (es) * 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc Tratamiento combinado de los tumores que expresan el her
BRPI0520530A2 (pt) * 2005-10-05 2009-09-29 Astrazeneca Uk Ltd método para predizer ou monitorar a resposta de um paciente a uma droga receptora do erbb
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US7547781B2 (en) 2006-09-11 2009-06-16 Curis, Inc. Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety
DK2716301T3 (en) * 2007-02-16 2017-07-31 Merrimack Pharmaceuticals Inc ANTIBODIES AGAINST ERBB3 AND APPLICATIONS THEREOF
GB0706633D0 (en) * 2007-04-04 2007-05-16 Cyclacel Ltd Combination
PE20090368A1 (es) * 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
UY31800A (es) * 2008-05-05 2009-11-10 Smithkline Beckman Corp Metodo de tratamiento de cancer usando un inhibidor de cmet y axl y un inhibidor de erbb
EP2138511A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. HER3 as a determinant for the prognosis of melanoma
EA201200195A1 (ru) * 2009-08-21 2012-12-28 Мерримаск Фармасьютикалс, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЭКТОДОМЕНА ErbB3 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN105999263B (zh) * 2009-11-13 2021-06-29 第一三共欧洲有限公司 用于治疗或预防人表皮生长因子受体-3(her-3)相关疾病的材料和方法
CA2815154A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
JP7372920B2 (ja) 2017-12-29 2023-11-01 セレクティス Ｃａｒ ｔ細胞の作製を改良するための方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012012160B1 (pt) 2022-04-26
EP3670539A1 (en) 2020-06-24
KR101806323B1 (ko) 2017-12-07
JP2016128430A (ja) 2016-07-14
NO2719708T3 (sr) 2018-03-24
HK1207651A1 (en) 2016-02-05
CY1119751T1 (el) 2018-06-27
ES2647466T3 (es) 2017-12-21
CA2780935A1 (en) 2011-05-19
AU2010319483A1 (en) 2012-05-31
DK3351558T3 (da) 2020-06-02
RS60390B1 (sr) 2020-07-31
BR112012012160A2 (pt) 2017-01-10
CN102812045A (zh) 2012-12-05
US12139549B2 (en) 2024-11-12
JP2022000445A (ja) 2022-01-04
SMT201800167T1 (it) 2018-05-02
PL2719708T3 (pl) 2018-04-30
PT2719708T (pt) 2018-01-16
EP3351558B1 (en) 2020-03-11
JP2018076300A (ja) 2018-05-17
CN102812045B (zh) 2018-04-13
LT2719708T (lt) 2018-02-12
CA2780935C (en) 2022-05-24
MX357972B (es) 2018-08-01
WO2011060206A3 (en) 2011-09-09
EP3351558A2 (en) 2018-07-25
US20140017166A1 (en) 2014-01-16
US20180134805A1 (en) 2018-05-17
MX2012005589A (es) 2012-11-30
CN105999263A (zh) 2016-10-12
US9988462B2 (en) 2018-06-05
MX349513B (es) 2017-08-02
EP2896632B1 (en) 2017-10-25
US20110229406A1 (en) 2011-09-22
EP2719708A2 (en) 2014-04-16
LT3351558T (lt) 2020-06-10
EP2896632A3 (en) 2015-08-19
US20160222126A1 (en) 2016-08-04
EP2896632A2 (en) 2015-07-22
US9803025B2 (en) 2017-10-31
EP3351558A3 (en) 2018-08-29
AU2010319483B2 (en) 2015-03-12
AR080564A1 (es) 2012-04-18
HUE049880T2 (hu) 2020-10-28
TWI630916B (zh) 2018-08-01
SMT202000267T1 (it) 2020-07-08
JP2013510868A (ja) 2013-03-28
ES2655737T3 (es) 2018-02-21
EP2719708A3 (en) 2014-09-03
HRP20180104T1 (hr) 2018-03-09
HUE035605T2 (en) 2018-05-28
WO2011060206A2 (en) 2011-05-19
MX358013B (es) 2018-08-01
CY1123030T1 (el) 2021-10-29
ES2781299T3 (es) 2020-09-01
CN105999263B (zh) 2021-06-29
JP5931736B2 (ja) 2016-06-08
PL3351558T3 (pl) 2020-08-24
KR20120114262A (ko) 2012-10-16
PT3351558T (pt) 2020-04-09
JP6235620B2 (ja) 2017-11-22
EP2499162A2 (en) 2012-09-19
JP2020011980A (ja) 2020-01-23
UY33034A (es) 2011-05-31
TW201129378A (en) 2011-09-01
SI3351558T1 (sl) 2020-07-31
HRP20200921T1 (hr) 2020-09-18
JP7317650B2 (ja) 2023-07-31
EP2719708B1 (en) 2017-10-25
SI2719708T1 (en) 2018-03-30
DK2719708T3 (da) 2018-01-29
US9101760B2 (en) 2015-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7317650B2 (ja) Ｈｅｒ－３関連疾患を治療または予防するための物質および方法
AU2015201262B2 (en) Material and methods for treating or preventing her-3 associated diseases
AU2015201263B2 (en) Material and methods for treating or preventing her-3 associated diseases
HK40026791A (en) Material and methods for treating or preventing her-3 associated diseases
HK1194390B (en) Material and methods for treating or preventing her-3 associated diseases
HK1194390A (en) Material and methods for treating or preventing her-3 associated diseases