[go: up one dir, main page]

RS55982B1 - Rekombinantne elastaze proteina i metode njihove proizvodnje i njihova upotreba - Google Patents

Rekombinantne elastaze proteina i metode njihove proizvodnje i njihova upotreba

Info

Publication number
RS55982B1
RS55982B1 RS20170443A RSP20170443A RS55982B1 RS 55982 B1 RS55982 B1 RS 55982B1 RS 20170443 A RS20170443 A RS 20170443A RS P20170443 A RSP20170443 A RS P20170443A RS 55982 B1 RS55982 B1 RS 55982B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
elastase
protein
seq
sequence
mature
Prior art date
Application number
RS20170443A
Other languages
English (en)
Inventor
Nicholas F Franano
Kimberly Bland
Marco D Wong
Bee C Ding
Original Assignee
Proteon Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proteon Therapeutics Inc filed Critical Proteon Therapeutics Inc
Publication of RS55982B1 publication Critical patent/RS55982B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/486—Elastase (3.4.21.36 or 3.4.21.37)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21036—Pancreatic elastase (3.4.21.36)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21037—Leukocyte elastase (3.4.21.37), i.e. neutrophil-elastase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
1. OBLAST PRONALASKA
[0001] Dati pronalazak se odnosi na kombinovane metode proizvodnje i formulisanja proteina elastaze za upotrebu u lečenju i prevenciji bolesti bioloških kanala. Dati pronalazak se, dalje, odnosi na rekombinantne proteine elastaze i farmaceutske kompozicije koje sadrže takve proteine. Na kraju, dati pronalazak se odnosi na upotrebu farmaceutskih kompozicija koje obuhvataju rekombinantne proteine elastaze u lečenju i prevenciji bolesti bioloških kanala.
2. POZADINA PRONALASKA
[0002] Elastin je protein sposoban na spontano prodiranje nakon rastezanja. Umreženi elastin je glavna strukturna komponenta elastičnih vlakana koja im daje elastičnost tkiva. Proteinazom može biti nazvan elastazom ukoliko poseduje sposobnost da rastvori zreo, umrežen elastin (Bieth, JG "Elastases: katalitička i biološka svojstva, str. 217-320 Mecham izdanje, Regulacija of Matrix akumulacije, New York, Academic Press, 1986). Nekoliko objavljenih patentnih prijava (WO 2001/21574; WO 2004/073504; i WO 2006/036804) pokazuju da elastaza, sama i u kombinaciji sa drugim sredstvima, je blagotvorna u lečenju bolesti bioloških kanala, uključujući biološke kanale koji su nadražljivi ili osetljivi na nadražaje, opstrukcije i vasospazme. U terapijama elastazom na ljudskim subjektima, upotreba ljudske elastaze je preporučljiva za smanjenje rizika od imunološke reakcije na neljudsku elastazu.
[0003] Do danas, međutim, ne postoji poznato komercijalno održivo sredstvo za proizvodnju biološki aktivne elastaze u dovoljno čistom obliku i u dovoljnim količinama za kliničke aplikacije. Iz razloga što elastaza predstavlja snažnu protaazu tako što može da hidrolizuje brojne proteine osim elastina, proteolička aktivnost elastaze predstavlja potencijalne prepreke za rekombinantnu proizvodnju. Na primer, aktivnost zrele elastaze može oštetiti ćelije domaćine što predstavlja ili samodegradaciju ili degradaciju agensa koji se koristi da pomogne u proizvodnji ili karakterizaciji elastaze.
[0004] Elastaze su češće izražene u vidu preproteina koji sadrže singalni peptid, aktivacioni peptid i zreo aktivan deo. Cepanjem signalne sekvence lučenjem se dobija proprotein koji može imati malo ili nimalo enzimske aktivnosti i čija amino acid sekvenca sadrži amino acidnu sekvencu aktivacijskog peptida i zreo protein. Generalno, za rekombinaciju, neaktivni prethodnik moće biti izražen umesto zrelog aktivnog enzima da bi se izbeglo oštećenje ćelije koja se izražava. Na primer, U.S Patent broj 5,212,068 opisuje kloniranje ljudske elastaze pankreasa cDNAs (koja je ovde predstavljena kao elastaza "IIA," "IIB," "IIIA" i "IIIB"). Različite elastaze su izražene kao uzdužan cDNAs, uključujući domaće signalne sekvence, kod COS-1 ćelija sisara. Pored toga, prerađene verzije elastaze, sadrže B subtilis signalnu sekvencu i βgalaktosidas signalnu sekvencu izraženu, takođe, kao B subtilis i E koli. U.S. Patent takođe sugeriše na izražajne elastaze u S. cerevisiae. Generalno, radni primeri izražaja elastaze u U.S. Patentu broj 5,212,068 pokazuje slabu aktivnost obnovljene elastaze ili zahtevaju aktivacijski korak u koji je uključen tretman tipsinom, za generisanje aktivne elastaze. Pored toga, elastaze su uglavnom bile prisutne u inkluziji tela kada je izražena u E. koli i samo mali delovi izražene elastaze su bili rastvorljivi i aktivni. Nijedan od proizvoda elastaze koji je opisan u U.S. Patentu broj 5,212,068 nije prečišćen na farmaceutske stepene.
[0005] Dall’Acqua et al., 1999, Protein Inženjering 12, pp 981-986, otkriva ekspresiju i lučenje rekombinantnog divljeg tipa i varijantu ljudskih neutrofilnih elastaza sa izmenjenom specifičnošću supstrata. Elastaze su izražene u Pichia Pastoris bez pro sekvence elastaze, i zbog toga nije potreban korak aktivacije zimogena. WO00/68363 se odnosi na varijantu elastaza sa izmenjenom specifičnošću supstrata, i dalje obezbeđuje proizvodnju elastaze ili varijantu elastaze koja ne zahteva aktivaciju zimogena, uporedo sa molekulom nukleinske kiseline, vektorom i ćelijom domaćina pogodnom za upotrebu u ovom metodu proizvodnje, pri čemu molekul nukleinske kiseline kodira elastazu nedostajeće prosekvence koja zbog toga ne zahteva aktivaciju zimogena.
[0006] Međutim, za uspešne rekombinantne proizvodne metode postoji potreba da se dozvoli obrada terapeutskih vrednosti biološki aktivnih farmaceutskih stepena elastaze i da je poželjno izbeći tipsinski aktivacijski korak koji je skup za velike pripreme i što može rezultirati tipsin kontaminacijom gotovog proizvoda. Primena elastaze koja sadrži tipsin kod pacijenta može izazvati aktiviranje proteaza aktivnih receptora 1 i 2, što može smanjiti neke od korisnih efekata lečenja elastazom.
[0007] Navodi ili identifikacije bilo koje reference u odeljku 2 ili u bilo kom drugom odeljku ove prijave ne treba da se tumače kao priznanje da je takva preporuka dostupna u stanju tehnike ovog pronalaska.
3. REZIME PRONALASKA
[0008] Dati pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. U granicama opisa koji sledi mogu da se uoče detalji u vezi sa predmetom koji nisu predstavljeni u patentnim zahtevima i koji postoje samo radi pružanja dodatnih informacija.
[0009] Dati pronalazak predstavlja nove, efikasne metode proizvodje rekombinantnih proteina elastaze i upotrebe rekombinantnih proteina u kompozicijama, odnosno farmaceutskim kompozicijama, formulacijama elastaze ili doznim jedinicama u lečenju i prevenciji bolesti bioloških kanala.
[0010] Dati pronalazak je usmeren na auto-aktivacijske proteine proelastaze, nukleinske kiseline auto-aktivacijskih proteina proelastaze, ćelije domaćina koje obuhvataju navedene nukleinske kiseline, metode proizvodnje autoaktivacijskih proteina proelastaze i upotrebu auto-aktivacijskih proteina proelastaze u proizvodnji zrelih, biološki aktivnih proteina elastaze, na primer za upotrebu u farmaceutskim formulacijama.Termin “auto-aktivacija ili samoaktivacija koji se ovde koriste naizmenično sa terminima auto-aktivacija, samoaktivacija i samoaktiviran te nema za cilj predstavljanje više aktivacijskih koraka na ovom mestu. Termin “aktivacija” se koristi naizmenično sa terminom “konverzija” i nema za cilj da predstavi da aktivacija proteina nužno podrazumeva da protein poseduje enzimsku aktivnost.
[0011] Kako se koriste naizmenično, i ukoliko nije drugačije naznačeno, termin “elastaza” generalno podrazumeva zrele proteine elastaze aktivnosti kao i nezreli proteini elastaze, uključujući i nezrele proteine elastaze (u daljem tekstu: proelastaze) i nezrele proteine proelastaze (u daljem tekstu: proproteini elastaze)
[0012] Prvenstveno elastaze u ovom pronalasku su tip I elastaza pankreasa odnosno tip I ljudskih elastaza pankreasa i tip I svinjskih elastaza pankreasa. Tip I elastaza pankreasa su ponekad u daljem ekstu označene kao “elastaze-1”, “elastaze-I”, “elastaze tip 1”, “elastaze 1 tipa” ili “ELA-1”. Ljudske tip 1 elastaze pankreasa su, takođe, u daljem tekstu označene kao hELA-1 ili ljudski ELA-1 a svinjske tip I elastaze pankreasa su, takođe, u daljem tekstu označene kao pELA-1 ili sviljske ELA-1.
[0013] Zreo protein elastaze ovog pronalaska obično ima sekvencu amino kiseline kodirane prirodnim genom elastaze ili varijantom takve sekvence. Prvenstveno, ovde su opisane varijante sekvence, uključujući varijante koje sadrže zamene amino kiseline. Proteini proelastaze su uglavnom neaktivna preteča zrelog proteina elastaze i proteini proelastaze na dalje sadrže signalnu sekvencu za proteinsko lučenje. Pre i pro sekvence proteina elastaze u ovom pronalasku obično nisu maternji genima elastaze kodiranim zrelim proteinima elastaze ovog pronalaska. Tako, u izvesnom smislu, nezreli proteini elastaze u pronalasku su “himerički” proteini sa njihovim zrelim delovima kodiranim prirodnim genima elastaze i njihovim nezrelim delovima kodiranim sekvencama gena ne-elastaze.
[0014] Radi lakšeg snalaženja, proteini elastaze u ovom pronalasku i komponente sekvenci njihovog jezgra su opisani na slici 2. Kao što je prikazano na slici 2. ostaci aminokiselina u sekvencama proelastaze gde su N-terminali na cepanju spojeva (odnosno, spojevi se cepaju te se dobijaju zreli proteini elastaze) označeni kao PX,....P5, P4, P3, P2 i P1, gde je P1 na N-terminalu neposredno do cepanja spoja, a ostaci aminokiselina su smešteni na C-završetku cepanja spoja (i na N-završetku) zrelog proteina elastaze gde su označeni P1’, P2’, P3’,...PX’, gde je P1’ na C-terminalu neposredno do cepanja spoja i predstavlja N-terminal ostatka aminokiseline zrelog proteina. Slika 2. prikazuje, takođe, i sledeće komponente:
(1) SIGNALNU SEKVENCU: Sekvenca koja povećava procenat izraženih molekula koji se izlučuju iz ćelije. Prikazana sekvenca je aminokiselina 1-22 of SEK ID BRS:50 ili 51.
(2) PROPEPTID+ ODSTOJNIK: Po mogućstvu, sekvenca propeptida ne-elastaze (kao što je kvasac α-faktor propeptida) koja može opciono da uključi jednu ili više sekvenci odstojnika (kvasac α-faktor sekvence propeptida i Kex2 i STE 13 sekvence odstojnika su prikazane na slici 1B). U određenom obliku, sekvence propeptida ne uključuju odstojnik.
(3) PROPEPTID ELASTAZE: Peptid, kada je prikazan na kraju N-terminala elastaze, čini molekul neaktivnim ili manje aktivnim u odnosu na isti zrelog proteina elastaze. Propeptid elastaze može da se graniči sa aktivacijskim peptidom ili može da sadrži dodatne ostatke aminokiselina u aktivacijskom peptidu. Prikazane sekvence propeptida elastaze su aminokiseline 1-10 of SEK ID BRS:64 i 69.
(4) AKTIVACIJSKI PEPTID: Korišćen naizmenično sa “aktivacijskom sekvencom”, aktivacijski peptid je komponenta ili može da se graniči sa propeptidom elastaze. Kako je prikazano na slici 2., aktivacijski peptid sadrži ostatke aminokiseline P10 do P1. Prikazani aktivacijski peptid je odgovarajući sekvenci SEK ID BR:80; drugi primeri aktivacijskog peptida su SEK ID BRS: 23, 72 i 73.
(5) PREPOZNAVAJUĆU SEKVENCU: Prepoznavajuća sekvenca je komponenta propeptida elastaze. Kako je prikazano na slici 2., prepoznavajuća sekvenca sadrži ostatke aminokiseline P3 do P1. Prikazana prepoznavajuća sekvenca je odgovarajuća sekvencama SEK ID BRS:11-13 i 93, i prikazana prepoznavajuća sekvenca je SEK ID BR:20.
(6) CEPAJUĆE PODRUČJE: Je oblast u kojoj protein proelastaze obuhvata rascepljenu vezu. Kako je prikazano na slici 2. cepajuće područije sadrži ostatke aminokiseline P5-P3’. Prikazana cepajuća područja sekvenci su SEK ID BRS:42, 43, 48, 49, 53, 53, 54 i 55.
(7) CEPAJUĆI POLOŽAJ: Drugo područje u kome proteini proelastaze obuhvataju rascepljenu vezu. Kako je prikazano na slici 2, cepajući položaji sadrže ostatke amino kiseline P4-P4’. Prikazani cepajući položaj sekvence je SEK ID BR:27.
(8) PROTEIN PREPROELASTAZU: Protein koji može da obuhvati sve komponente. Prikazani protein proelastaze može da obuhvati peptide SEK ID BR:50, 51, 96, ili 97 operativno povezanog proteina od SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:69.
(9) PROTEIN PROELASTAZU: Protein koji obuhvata zreli protein elastaze, propeptid elastaze i opcioni propeptid i sekvencu odstojanja. Prikazane sekvence proelastaze su SEK ID BR S:64 i 69.
(10) ZRELI PROTEIN ELASTAZU: Protein koji, kada je propisno obrađen, prikazuje aktivnost elastaze. Prikazane zrele sekvence su SEK ID BR:1 (ljudska) i SK ID BR:39 (svinjska).
[0015] Komponente proteina elastaze mogu se smatrati modularnim gradivnim blokovima proteina elastaze, proteina proelastaze i proteina preproelastaze. Na primer, dati pronalazak prikazuje protein proelastaze koji sadrži sekvencu propeptida elastaze i zreli protein elastaze. Propeptid elastaze može da sadrži aktivacijski peptid. Propeptid elastaze može, takođe, da sadrži prepoznavajuću sekvencu elastaze. Dati pronalazak, takođe, prikazuje protein proelastaze sa cepajućim područjem ili cepajućim položajem u oblasti spajanja puteva između propeptida elastaze i zrelog proteina elastaze. Proteini proelastaze mogu, nadalje, da sadrže signalnu sekvencu za lučenje. Takvi proteini se smatraju proteinima preproelastaze. Proteini preproelastaze mogu nadalje da sadrže kvasac alfa faktora propeptida i opcionalno sekvencu odstojanja između signalne sekvence i propeptida elastaze. Proteini elastaze ovog pronalaska, takođe, mogu da sadrže komponente pored jezgra modularnih komponenata prikazanih na slici 2. Na primer, protein elastaze može da sadrži epitop dodatak ili histidin dodatak za prečišćavanje. Moglo bi se, takođe, zapaziti da proteini elastaze ovog pronalaska nužno ne sadrže sve komponente opisane na slici 2. ali generalno sadrže najmanje jednu komponentu (uključujući, primera radi, zrelu sekvencu elastaze ili proelastaze) opisanu na slici 2. Prikazani proteini elastaze ovog pronalaska su navedeni u oblicima 1-12, 28-39 i 68-69 u nižem odeljku 8, uključujući prikazani tip I proteina proelastaze navedenog u obliku 13-27 u nižem odeljku 8.
[0016] Nukleinske kiseline kodirane proteinima elastaze iz ovog pronalaska, metodi proizvodnje i prečišćavanja proteina, rekombinantnih ćelija i ćelije kulture, kompozicije koje sadrže proteine elastaze (odnosno farmaceutske kompozicije, jedinične doze, formulacije), upotreba proteina u terapeutske svrhe i kompleti koji obuhvataju proteine, formulacije, farmaceutske kompozicije, jedinične doze su obuhvaćeni ovde. Nukleinske kiseline kodirane proteinima elastaze iz ovog pronalaska su prikazane u oblicima 40-67 u nižem odeljku 8, uključujući vektore (vidi, oblike 70-72). Takođe, prikazani u odeljku 8. su rekombinantne ćelije (vidi oblike 73-84), ćelije koje sadrže proteine elastaze (vidi oblik 88). Metodi za proizvodnju proteina elastaze su prikazani u oblicima 89-224, 261-276 i 347-373 u odeljku 8. Metodi proizvodnje formulacija elastaze su prikazani u oblicima 225-260 u odeljku 8. Metodi proizvodnje farmaceutskih kompozicija su prikazani u oblicima 374-385 odeljku 8. Farmaceutske kompozicije koje sadrže proteine elastaze su prikazane u oblicima 277-313 i 386 u odeljku 8, i jedinične doze su prikazane u oblicima 415-420 u odeljku 8. Formulacije proteina elastaze su prikazane u oblicima 324-346 u odeljku 8. Upotreba proteina elastaze u terapeutske svrhe je prikazana u obliku 387-414 u odeljku 8. Kompleti koji sadrže proteine su prikazani u odeljku 8 na način iz oblika 421-424.
[0017] Različiti aspekti pronalaska u pogledu farmaceutskih kompozicija i-ili proteina proelastaze sa SEK ID BRS:64 i 69 su prikazani kao oblici 425-472 u nižem odeljku 8; međutim, takvi oblici su primenljivi i na druge sekvence proteina elastaze i kompozicije koje su ovde opisane.
[0018] Metodi proizvodnje koji su ovde opisani često uključuju aktivacijski korak, pri čemu je aktivacijski peptid premešten od sekvence proelastaze-odvojene od zrele sekvence elastaze, kako bi se generisao zreli protein elastaze. Ovde opisani aktivacijski koraci mogu biti autoaktivacijski koraci, na dalje dobijeni aktivnošću elastaze ili neautoaktivacijskim korakom, na dalje, uz posredstvo elastaze, dobijeni tipsinom.
[0019] U određenim aspektima, dati pronalazak prikazuje molekul nukleinskih kiselina koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je kodirana proteinom elastaze (uključujući, ne nužno, protein bilo koje SEK ID BRS: 6-9, 64-69, 88-91 ili 98-103) koja obuhvata (i) peptid elastaze koji obuhvata sekvencu aktivacijskog peptida koji obuhvata prepoznavajuču sekvencu elastaze operativno povezanu sa (ii) sekvencom amino kiseline proteina sa aktivnošču elastaze. Protein, opciono, na dalje obuhvata signalnu sekvencu kako kvasac α-faktora signalnog peptida i prikazana je sekvencom amino kiseline SEK ID BR:34, operativno povezana sa navedenim propeptidom elastaze. α- faktor je ponekad ovde označen kao “alfa-faktor” ili “alfa faktor parenja” ili "α-faktor parenja." U određenim oblicima, protein obuhvata propeptid neelastaze kakav je kvasac α-faktor propeptida. U određenim oblicima, protein može sadržati jednu ili više sekveci odstojanja. Sekvence odstojanja mogu da uključe, ali ne nužno, Kex2 i STE13 mesta razlaganja protaaze. U specifičnim oblicima, Kex2 odstojanje može biti upotrebljeno. U drugim oblicima, Kex2 odstojanje može operativno biti povezano sa STE 13 odstojanjem kako je prikazano na slici 1B. Signalna sekvenca peptida i sekvenca propeptida ne-elastaze su prikazane kao sekvenca amino kiseline SEK ID BRS:51 ili 97. Peptid sadrži signalnu peptidnu sekvencu, sekvencu prppeptida ne-elastaze i sekvencu odstojanja prikazanu kao sekvenca amino kiseline SEK ID BRS:50 ili 96.
[0020] U drugim specifičnim oblicima, signalna sekvenca je signalna sekvenca lučenja kod sisara kao što je svinjska ili ljudska tip I signalne sekvence elastaze (koriščene naizmenično sa tip I elastaze pankreasa).
[0021] Prvenstveno, prepoznavajuča sekvenca elastaze je tip I prepoznavajuće sekvence elastaze pankreasa.
[0022] U određenim oblicima, protein koji ima tip I aktivnosti elastaze je zreo ljudski tip I elastaze, na primer protein sekvence amino kiseline SEK ID BR:1, 4, 5, 84, ili 87.
[0023] Dati pronalazak takođe prikazuje molekul nukleinske kiseline koji obuhvata nukleotidnu sekvencu kodiranu proteinom (i) koji obuhvata signalnu sekvencu operabilnu u Pichia pastoris operativno povezanu sa (ii) aktivacijskom sekvencom (uključujući, ali ne nužno, sekvencu amino kiseline SEK ID BRS: 23, 72, 73, ili 80) koja obuhvata prepoznavajuću sekvencu protaaze (uključujući, ali ne nužno, sekvencu amino kiseline bilo koje SEK ID BRS:11-23 i 93) koja je, s druge strane, operativno povezana sa (iii) sekvencom amino kiseline zrelog tipa I elastaze. U usavršenim oblicima, prepoznavajuća sekvenca protaaze je prepoznavajuća sekvenca ljudske tip I elastaze, a najusavršenija je prepoznavajuća sekveca elastaze SEK ID BR:20.
[0024] Proteini proelastaze (koji, po želji, mogu da sadrže signalnu sekvencu koja predstavlja proteine preproelastaze) i zreli proteini elastaze kodirani nukleinskim kiselinama iz ovog pronalaska su, takođe, prikazani kao kompozicije (odnosno farmaceutske kompozicije, formulacije i jedinične doze) koje obuhvataju navedene proteine elastaze.
[0025] U željenim oblicima, protein proelastaza zrelog proteina elastaze nema na N-terminalu ostatak metionina. U drugim oblicima, međutim, protein proelastaza zrelog proteina elastaze ima na N-terminalu ostatak metionina.
[0026] Niža, tabela 1, objedinjuje sekvence identifikatore korišćene u predstavljenoj specifikaciji. Usavršeni proteini iz ovog pronalaska obuhvataju ili sadrže bilo koju od SEK ID BRS:1-32, 34, 37-73, 77, 78, 82-92, i 98-105 navedenu u nižoj Tabeli 1, ili su kodirani u delu ili u celosti sa nukleotidnom sekvencom SEK ID BR:33 i SEK ID BR:81.
Tabela 1: Sumiranje aminokiselinske i nukleotidne SEK ID BR S.
nastavak
(nastavak)
nastavak
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
nastavak
[0027] Ovde se poslednjih 5 potvrđenih polimorfizama nalazi u proteinu ljudske elastaze tipa I na položajima 10 (Q ili H); 44 (W ili R); 59 (M ili V); 220 (V ili L); i 243 (Q ili R). Celom svojom dužinom protein (preproelastaze) je jednak dužini 258 amino kiselina. Prvih osam aminokiselina odgovara signalnoj ili “pre” peptidnoj sekvenci gde je cepanje isključeno da bi se generisao neaktivni proprotein, i na dalje “pro” peptidna sekvenca (koja obuhvata ili sadrži 10 amino kiselina odgovarajućih aktivacijskom peptidu) je cepajuća da bi se generisali aktivni, zreli proteini. Tako, polimorfizom na položaju 10 je iskazan u proproteinu ali da se ne nalazi u zrelom proteinu.
[0028] Prema tome, u nižoj tabeli 2 su predstavljene sve moguće kombinacije 5 polimorfizoma ljudske tip I elastaze. Dati pronalazak prikazuje proteine preproelastaze i proelastaze (uključujući ali ne nužno varijante proteina preproelastaze i proelastaze koji su ovde opisani), tako da su proteini prikazani u oblicima 1-39 i 68-69 dobijeni ili dobijani metodom bilo kog od oblika 89-224, 261-276, i 347- 373 u odeljku 8, koji obuhvataju bilo koju kombinaciju polimorfizoma navedeni u nižoj tabeli 2.
Tabela 2: Varijante ljudske tip I nezrele elastaze (pre-pro) i proteina pro elastaze. Numeracija odgovara položaju u kontekstu preproproteina domaćina ljudske tip I elastaze.
[0029] Šta više, u nižoj tabeli 3 su predstavljene sve moguće kombinacije 4 polimorfizoma ljudske tip I elastaze koja može iskazana u zrelom proteinu elastaze. Dati pronalazak predstavlja zrele proteine elastaze (uključujući ali ne nužno varijante zrelih proteina elastaze koji su ovde opisani) tako da se zreli proteini elastaze dobijaju ili su dobijeni metodom bilo kog od oblika 89-224, 261-276, i 347-373 u odeljku 8, koji obuhvataju bilo koju od kombinacija polimorfizoma navedenog u nižoj tabeli 3.
Tabela 3: Varijante zrelih proteina elastaze tipa I. Numeracija odgovara položaju u kontekstu preproproteina domaćina ljudske tip I elastaze.
[0030] Zrela elastaza tipa I iz ovog pronalaska može biti prečišćena, na primer za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama. U specifičnim oblicima, elastaze su najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% čiste.
[0031] Zrela elastaza tipa I iz ovog pronalaska prvenstveno ima specifičnu aktivnost veću od 1, veću od 5, veću od 10, veću od 20, veću od 25, ili veću od 30 U/mg proteina kako je određeno merenjem stope hidrolize malog peptid substrata N-succinyl-Ala-Ala-Ala-pNitroanilide (SLAP), koji je katalizovan dodatkom elastaze. Jedna jedinica aktivnosti je definisana kao vrednost elastaze koja katalizuje hidrolizu od 1 mikromola substrata po minuti na 30°C i specifična aktivnost je definisana kao aktivnost po mg proteina elastaze (U/mg). Prvenstveno, ljudska elastaza tipa I ima specifičnu aktivnost u rasponu gde je niži limit 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ili 20 U/mg proteina i gde je viši limit, nezavisno, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili 50 U/mg proteina. U prikazanim oblicima, specifična aktivnost je u rasponu od 1 do 40 U/mg proteina, od1 do 5 U/mg proteina, od 2 do 10 U/mg proteina, od 4 do 15 U/mg proteina, od 5 do 30 U/mg proteina, od 10 do 20 U/mg proteina, od 20 do 40 U/mg proteina, ili bilo koji raspon čiji su viši i niži limiti izabrani od napred navedenih vrednosti. Zrela svinjska elastaza tipa I prvenstveno ima specifičnu aktivnost u rasponu gde je niži limit 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, ili 75 U/mg proteina i gde je viši limit, nezavisno, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 90, 95 ili 100 U/mg protein. U prikazanim oblicima, specifična aktivnost svinjske elastaze je u rasponu od 10 do 50 U/mg proteina, od 20 do 60 U/mg proteina, od 30 do 75 U/mg proteina, od 30 do 40 U/mg proteina, od 20 do 35 U/mg proteina, od 50 do 95 U/mg proteina, od 25 do 100 U/mg proteina, ili bilo koji raspon čiji su viši i niži limiti izabrani od napred navedenih vrednosti.
[0032] Prema tome, određeni aspekti ovog pronalaska odgovaraju kompozicijama, kakve su farmaceutske kompozicije, formulacije elastaze i jedinične doze, kakve su prikazane u oblicima 277-314, 346, 386, i 415-420 ili koje su dobijene metodom bilo kog oblika 261-276 i 374-385 nižeg odeljka 8.
[0033] U određenim oblicima, kompozicije iz pronalaska obuhvataju proteine elastaze aktiviranog tipsina odnosno proteini aktiviranog tipsina dobijeni metodama koji su ovde opisani. U drugim oblicima, kompozicije obuhvataju autoaktivirane proteine elastaze odnosno autoaktivirane proteine elastaze dobijeni metodama koji su ovde opisani. U određenim aspektima, kompozicije iz pronalaska karakterizovane sa poslednjom, poslednje dve, poslednje tri, poslednje četiri, poslednjih pet, poslednjih šest ili poslednjih sedam veličina: (a) kompozicija oslobođena od tipsina; (b) kompozicija substancijalno oslobođena od tipsina; (c) kompozicija oslobožena bilo kog proteina koji sadrži SEK ID BRS:70 i 71; (d) kompozicija substancijalno oslobođena bilo kog proteina koji sadrži SEK ID BRS:2 i 3; (e) kompozicija oslobođena proteina bakterije; (f) kompozicija substancijalno oslobođena proteina bakterije; (g) kompozicija oslobođena proteina sisara više nego navedeni zreli protein elastaze; (h) kompozicija substancijalno oslobođena proteina sisara više nego navedeni zreli protein elastaze; (i) kompozicija oslobođena ili substancijalno oslobođena jednog, dva, tri ili četiri proteina koji obuhvataju SEK ID BR:85, 86, 94 ili 95; (j) kompozicija oslobođena ili substancijalno oslobođena jednog, dva, tri ili četiri proteina koji obuhvataju SEK ID BR:106, 107 i 108; (k) kompozicija obuhvata farmaceutski prihvatljive nivoe endotoksina (odnosno, 10 EU/mg elastaze ili manje, ili 5 EU/mg elastaze ili manje); (1) zreo protein elastaze u kompoziciji je karakterizovan specifičnom aktivnosti 1 do 40 U/mg of proteina ili bilo koji raspon specifične aktivnosti koji je ovde opisanany; (m) aktivnost tipsina u datoj kompoziciji odgovara manje od 4 ng po 1 mg zrelog proteina elastaze ili bilo koji raspon aktivnosti tipsina koji je ovde opisan; Kompozicija obuhvata polisorbat-80; (o) kompozicija obuhvata dekstran; (p) kompozicija obuhvata jone natrijuma, kalijuma, fosfata, hlorida i polisorbat-80; (q) kompozicija obuhvata jone natrijuma, kalijuma, fosfata, hlorida i dekstran; (r) kompozicija obuhvata jone natrijuma, kalijuma, fosfata, hlorida, polisorbat-80 i dekstran; (s) zreli protein elastaze u datoj kompoziciji služi za stabilnost vrednosti koje su ovde opisane, odnosno održava 60% do 100% specifične aktivnosti nakon najmanje jedne nedelje držanja na 4°C, nakon najmanje meseca držanja na 4°C, nakon dva meseca držanja na 4°C, nakon najmanje tri meseca držanja na 4°C, ili nakon najmanje šest meseci držanja na 4°C; i (t) kompozicija obuhvata jediničnu dozu od 0.0033 mg do 200 mg datog zrelog proteina ili bilo koju drugu jedinicu proteina elastaze koji je ovde opisan.
[0034] U određenim aspektima, kompozicija je karakterizovana sa poslednje tri karakteristike, poslednje četiri karakteristike ili pet karakteristika nezavisno odabranih od sledećih grupa (i) do (v):
(i) (a), (b) ili (m)
(ii) (e) ili (f)
(iii) (g) ili (h)
(iv) (k)
(v) (1)
[0035] U specifičnim oblicima, dve od navedene poslednje tri ili poslednje četiri karakteristike su odabrane iz grupa (i) i (iv) ili (v). U ostalim oblicima, tri od poslednje navedene četiri karakteristike su odabrane iz grupa (i), (iv) i (v).
[0036] U specifičnim oblicima, dati pronalazak prikazuje kompoziciju, uključujući, ali ne nužno, farmaceutsku kompoziciju, formulaciju elastaze ili jediničnu dozu, koja obuhvata (i) terapeutski efektivnu vrednost ljudske elastaze tipa I tako da je oslobođena od tipsina i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca. Alternativno, dati pronalazak prikazuje kompoziciju koja obuhvata (i) terapeutski efektivnu vrednost ljudske elastaze tipa I koja je supstancijalno oslobođena od tipsina i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca. U specifičnim oblicima, ljudska elastaza tipa I i/ili kompozicija koja obuhvata manje od 5 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 4 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 3 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od of 2 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 1.56 ng/ml aktivnosti tipsina. U navedenim primerima, ng/ml aktivnosti tipsina može biti proanalizirana u tečnoj kompoziciji ljudske elastaze tipa I ili preparatu koji sadrži 1 mg/ml proteina ljudske elastaze tipa I. Tako, aktivnosti tipsina mogu, takođe, biti opisane terminima miligrama proteina elastaze, na primer, manje od 3 ng aktivnosti tipsina/mg proteina elastaze, manje od 1.56 ng ktivnosti tipsina/mg proteina elastaze, itd. Dati pronalazak na dalje prikazuje kompoziciju koja obuhvata (i) terapeutski efektivnu vrednost ljudske elastaze tipa I i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca, pri čemu kompozicija obuhvata manje od 5 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 4 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 3 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 2 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze ili manje od 1.56 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze.
[0037] Dati pronalazak, na dalje, prikazuje metode za poboljšanje kvaliteta zrelog proteina elastaze proizvedenog metodama aktivacije tipsina (odnosno, metode oblika 145 iz nižeg odeljka 8), koji sadrži prečišćeni zreo protein elastaze na Makro-Prep visokoj S koloni smole. Pronalazači su utvrdili da zreo protein elastaze prečišćen na Makro-Prep visokoj S koloni smole kvasi kompozicije elastaze na nivoima aktivnosti tipsina koji odgovaraju 20-25 ng aktivnosti tipsina/mg proteina elastaze, u poređenju sa prečišćavanjem na koloni Poros (Poly (Styrene-Divinyl-benzenu)) koji kvasi kompozicije elastaze na nivoima aktivnosti tipsina odgovara aproksimativno 1000 ng aktivnosti tipsina/mg proteina elastaze. Dati pronalazak, na dalje, prikazuje da kompozicije elastaze koje sadrže zrele proteine elastaze su proizvedene prečišćavanjem proteina elastaze aktivnošću tipsina na Makro-Prep visokoj S koloni smole. Makro-Prep visoka S kolona smole je dostupna od Biorada Hercules, CA), prema kome je kolona krutog metakrilata podržana sa malim skupljanjem i bubrenjem. Ostale slične prilike menjaju kolone iste klase i/ili sa kuglicama iste veličine (oko 50 mm) koje mogu biti upotrebljene kao ostale metakrilate kolone što može biti prikladno korišćenje.
[0038] Drugi aspekti datog pronalaska povezuju kompozicije, uključujući ali ne nužno, farmaceutske kompozicije, formulacije elastaze ili jedinične mere, koje obuhvataju elastazu tipa I svinjskog pankreasa. U specifičnim oblicima, dati pronalazak prikazuje kompozicije koje obuhvataju (i) terapeutski efektivnu vrednost elastaze tipa I pankreasa svinje koja je oslobođena od tipsina i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca. Alternativno, dati pronalazak prikazuje kompozicije koje obuhvataju (i) terapeutski efektivnu vrednost elastaze tipa I pankreasa svinje koja je supstancijalno oslobođena od tipsina i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca. U specifičnim oblicima, elastaza tipa I svinjskog pankreasa i/ili kompozicija obuhvata manje od 100 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 75 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 50 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 25 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 15 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 10 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 5 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 4 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 3 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 2 ng/ml aktivnosti tipsina, manje od 1.56 ng/ml aktivnosti tipsina. U navedenim primerima, ng/ml aktivnosti tipsina može biti proanaliziran u tečnoj kompoziciji elastaze tipa I svinjskog pankreasa ili proizvodima koji sadrže 1 mg/ml elastaze tipa I svinjskog pankreasa. Tako, aktivnost tipsina može, takođe, biti opisana terminima miligrama proteina elastaze, na primer,
manje od 25 ng aktivnosti tipsina/mg proteina elastaze, manje od 5 ng aktivnosti tipsina/mg proteina elastaze, itd. Dati pronalazak dalje prikazuje kompozicije koje obuhvataju (i) terapeutski efektivnu vrednost elastaze tipa I pankreasa svinje i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca, pri čemu kompozicija obuhvata manje od 100 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 75 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 50 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 25 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 15 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 10 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 5 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 4 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 3 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze, manje od 2 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze ili manje od 1.56 ng aktivnosti tipsina po mg elastaze.
[0039] U drugim oblicima, dati pronalazak prikazuje kompozicije proteina elastaze kao zrele proteine elastaze, uključujući ali ne nužno, farmaceutske kompozicije, formulacije elastaze ili jedinične doze, oslobođene od varijanti N-terminala odgovarajućim jednoj, drugoj, trećoj ili sve četiri SEK ID BR S: 70, 71, 104, 105. U određenim oblicima, dati pronalazak prikazuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju (i) terapeuski efektivnu vrednost zrele ljudske tip I elastaze (ii) farmeceuski prihvatljivog nosioca, pri čemu su farmaceuske kompozicije oslobođene od bilo kog proteina sa SEK ID BR S:70, 71, 104, 105.
[0040] U drugim oblicima, dati pronalazak prikazuje kompoziciju, uključujući ali ne nužno, farmaceutsku kompoziciju, formulaciju elastaze ili jediničnu dozu, koja obuhvata (i) terepeutski efektivnu vrednost ljudske tip I elastze koja je oslobođena ili supstancijalno oslobođena od varijanti proteina koji sadrže specifične dodatne amino kiseline na kraju N-terminala zrelog proteina elastaze (SEK ID BR S: 37, 38, 70, 71, 94, 95, 104, 105) i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca. U drugim oblicima, dati pronalazak prikazuje kompoziciju koja obuhvata (i) terepeutski efektivnu vrednost ljudske tip I elastze koja je oslobođena ili supstancijalno oslobođena od varijanti proteina kojima nedostaju amino kiseline zrelog proteina elastaze na N-terminalu (SEK ID BR S: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, 108) i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca. U specifičnim oblicima, ljudska elastaza tipa I i/ili kompozicija koja obuhvata manje od 25% N-terminal varijanti, manje od 20% N-terminal varijanti, manje od 15% N-terminal varijanti, manje od 10% N-terminal varijanti, manje od 5% N-terminal varijanti, manje od 4% N-terminal varijanti, manje od 3% N-terminal varijanti, manje od 2% N-terminal varijanti, manje od 1% N-terminal varijanti, manje od 0.5% N-terminal varijanti, manje od 0% N-terminal varijanti, ili obuhvata varijante N-terminala u vrednosti raspona između bilo koja dva navedena postotka (odnosno, 2%-25% varijanti N-terminala, 0.5%-10% varijanti N-terminala, 5%-15% varijanti N-terminala, 0%-2% varijanti N-terminala, itd). Kako je upotrebljen ovde, termin “manje od X% N-terminal varijanti” odgovara vrednosti varijanti N-terminala kao postotak od celog proteina elastaze.
[0041] U drugim oblicima, dati pronalazak prikazuje kompoziciju, uključujući ali ne nužno, farmaceutsku kompoziciju, formulaciju elastaze ili jediničnu dozu, koja obuhvata (i) terepeutski efektivnu vrednost ljudske zrele elastaze tipa I i (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca, gde je farmaceutska kompozicija supstancijalno oslobođena bakterioloških proteina i/ili je supstancijalno oslobođena proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I. U specifičnim oblicima, ljudska elastaza tipa I i/ili kompozicija koja obuhvata manje od 25% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 20 % bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 15% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 10% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 5% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 4% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 3% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 2% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 1% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 0.5% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, manje od 0% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I ili obuhvata bakteriološke proteine i/ili proteine sisara više nego navedena ljudska elastaza tipa I u vrednosti u rasponu između bilo koja dva navedena postotka (odnosno, 2%-25% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, 0.5%-10% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, 5%-15% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, 0%-2% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I, itd.). Kako je ovde upotrebljen, termin “manje od X% bakterijskih proteina i/ili proteina sisara više nego pomenuta zrela ljudska elastaza tipa I” odgovara vrednosti takvih proteina kao u postotku od celog proteina u preparatu elastaze ili u navedenoj kompoziciji. U određenim oblicima, elastaza čini najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.5% ili najmanje 99.8% celog proteina u takvoj kompoziciji ili preparatu.
[0042] Metode za lečenje i prevenciju bolesti bioloških kanala, obuhvataju načine primene kompozicija (odnosno farmaceutskih kompozicija, formulacije elastaze ili jedinične doze) koje obuhvataju prečišćenu zrelu ljudsku elastazu tipa I iz ovog pronalaska koja je pacijentu potrebna i koja je ovde opisana.
[0043] Dalje, pod uslovom da vektori obuhvataju nukleinske kiseline kodirane bilo kojim proteinima elastaze iz ovog pronalaska (“nukleinske kiseline pronalaska”), ćelije domaćini su projektovane da izraze nukleinske kiseline iz ovog pronalaska. U specifičnim oblicima, vektori na dalje obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja reguliše izražavanje proteina elastaze. Na primer, nukleotidna sekvenca kodirana sa proteinom iz ovog pronalaska može biti operativno povezana sa metanol-induktibilnim reaktorom. Drugi pogodni reaktori su predstavljeni u nižem odeljku 5.3.
[0044] U specifičnim oblicima, dati pronalazak prikazuje da vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu kodiranu vidljivo očitanom građom koja sadrži kvasac α-faktora signalnog peptida ili signalni peptid elastaze tipa I (odnosno signalni peptid svinjske elastaze) operativno povezan sa proproteinskom sekvencom ljudske elastaze tipa I. Opciono, vektor koji na dalje sadrži metanol-proizvodljiv pokretač operativno je povezan sa vidljivo očitanom građom.
[0045] Ćelije domaćina koje sadrže nukleinske kiseline i vektore ovog pronalaska su takođe prikazane. U određenim oblicaima, vektor nukleinskih kiselina je integrisan u ćeliji domaćinu genoma; u ostalim oblicima, vektor nukleinskih kiselina je ekstrahromozonski. Primarna ćelija domaćina je Pichia pastoris ćelija. Druge odgovarajuće ćelije domaćina su prikazane u nižem odeljku 5.3.
[0046] U specifičnim oblicima, dati pronalazak prikazuje Pichia pastoris ćelije domaćina generalno projektovane kodiranom vidljivom građom koja sadrži kvasac α-faktora signalnog peptida ili signalni peptid svinjske elastaze operativno povezan sa proenzimskom sekvencom ljudske elastaze tipa I. Opciono, vidljiva građa je pod kontrolom metanol-induktibilnih reaktora.
[0047] Dati pronalazak na dalje prikazuje metode proizvodnje nezrelih ili zrelih proteina elastaze koji obuhvataju kultivisane ćelije domaćina projektovane da izraze nukleinsku kiselinu iz pronalaska u uslovima u kojima je proizveden protein proelastaze. U određenim oblicima, zreli protein elastaze je takođe proizveden.
[0048] Prioritetni uslovi za proizvodnju proelastaze i zrelih proteina iz pronalaska, naročito za ćelije domaćine Pichia pastoris, uključuju period rasta sa niskim pH. Tipično, niski pH je 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, ili bilo koji opseg između bilo kog para navedenih vrednosti. U određenim oblicima, niski pH je pH vrednosti od 2.0 do 6.0, od 2.0 do 5.0, od 3.0 do 6.0, od 3.0 do 5.0, od 4.0 do 6.0, ili od 3.0 do 4.0. Na kraju perioda, pH kulture može rasti, prvenstveno do pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0 ili u opsegu između bilo koje dve od navedenih vrednosti u cilju odvajanja ili pomeranja aktivacijske sekvence od zrelog proteina elastaze. U određenim oblicima, pH kulture raste do pH vrednosti od to 10.0 ili 8.0 do 9.0 a najpoželjnije do vrednosti pH 8.0.
[0049] Kada je oblik proteina proelastaze iz pronalaska pod kontrolom metanol-induktibilnog reaktora, uslovi za proizvodnju nezrelog i zrelog proteina elastaze ovog pronalaska mogu takođe da sadrže period indukcije metanola.
[0050] Metodi za proizvodnju elastaze iz ovog pronalaska mogu, na dalje, sadržati korak obnavljanja proteina izraženog preko ćelije domaćina. Na određenim nivoima, obnovljeni protein je proelastaza koja obuhvata aktivacijsku sekvencu. Na određenim nivoima, obnovljeni protein je zrela elastaza kojoj nedostaje aktivacijska sekvenca. Pod određenim uslovima, obe proelasaze i zreli proteini elastaze su obnovljeni.
[0051] Prvenstveno, naročito u želji izbegavanja auto-aktivacije auto-aktivirane proelastaze, uslovi za ekspresiju proelastaze mogu da sadrže period rasta i indukciju niske pH. Tipično, niska pH je 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, ili 6.0, ili bilo koji opseg između bilo kog para navedenih vrednosti. U specifičnim oblicima, niska pH je pH vrednosti od 2.0 do 3.0, od 4.0 do 5.0, od 5.0 do 6.0, ili od 6.0 do 7.0. U određenim oblicima. PH vrednost je od 4.0 do 6.0 i najpoželjnija je pH 5.5.
[0052] Prvenstveno, naročito gde je poželjno izbegavanje auto-aktivacije auto-aktivirane proelastaze, uslovi za ekspresiju proelastaze mogu da sadrže period rasta i indukciju natrijum citrata, natrijum sukcinata ili natrijum acetata. U specifičnim oblicima, koncentracija 5-50 mM, 7.5-100 mM, 10-15 mM, 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ili je upotrebljen bilo koji opseg čiji je viši ili niži limit odabran od bilo koje navedenih vrednosti (odnosno 50-75 mM, 75-100 mM, itd.). U željenim oblicima, koncentracija natrijum citrata, natrijum sukcinata ili natrijum acetata je 90-110 mM a najpoželjnija je 100 mM.
[0053] Dodatno, naročito gde je poželjno izbegavanje auto-aktivacije auto-aktivirane proelastaze ili auto-degradacija zrele elastaze, uslovi za izražavanje nezrelog proteina elastaze mogu da sadrže period rasta i indukcije pri nižoj temperaturi. Na primer, gde je ćelija domaćin Pichia pastoris , poželjan opseg je oko 22-28°C. U specifičnim oblicima, Pichia pastoris ćelija domaćina je kultivisana na 28°C.
[0054] Dodatno, naročito gde je poželjno izbegavanje degradacije proteina protaazom ćelije domaćina, uslovi za ekspresiju nezrelog proteina elastaze mogu da sadrže period rasta i indukcije pri nižoj temperaturi. Na primer, gde je ćelija domaćina Pichia pastoris ćelija domaćina, najpoželjniji opseg temperature je 22-28°C. U specifičnim oblicima, Pichia pastoris ćelija domaćina je kultivisana 28°C.
[0055] Aktivacija auto-aktiviranog proteina proelastaze iz ovog pronalaska može biti inicirana dodavanjem spoljnje elastaze u maloj (kataliktičkoj) količini. U određenim oblicima, katalitička količina spoljnje elastaze predstavlja manje od 10%, manje od 5%, manje od 2%, manje od 1%, manje od 0.5% ili manje od 0.1%, bilo kog mola ili molekula snage jačine uzorka elastaze u koji je dodata katalitička elastaza.
[0056] Alternativno ili istovremeno, auto-aktivirana proelastaza može biti podvrgnuta pH 7-11 (najpoželjnije je pH vrednosti 8), na kojoj je aktivacijski peptid auto-aktivirane proelastaze odstranjen bez taženog tipsina što je rezultiralo dobijanjem aktivne zrele elastaze. U specifičnim oblicima, Tris baza je dodata koncentraciji 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ili bilo kom opsegu čiji je viši ili niži limit odabran od bilo koje od navedenih vrednosti (odnosno 50-75 mM, 75-100 mM, itd) tokom aktivacijskog koraka. U poželjnim oblicima, Tris baza je dodata koncentraciji 90-110 mM, napoželjnija 100 mM. Najpoželjnija pH Tris baze je 7-11; u određenim oblicima, Tris baza je vrednosti pH 7.0-11.0, 7-9, 7.5 do 9.5, 7.5 do 10, 8-10, 8-9, ili bilo koji opseg čiji su viši ili niži limiti odabrani od bilo koje od navedenih vrednosti. U poželjnim oblicima, Tris baza je vrednosti pH 7.5-8.5, najpoželjnija 8.0.
[0057] Ekspresija sekvence nezrele elastaze može na određenim nivoima rezultirati dobijanjem smeše proteina proelastaze i proteina zrele elastaze, kao i varijanti proteina elastaze na N-terminalu. Tako, dati pronalazak prikazuje kompozicije koje obuhvataju poslednjih dve od (1) proteina proelastaze, (2) protein zrele elastaze i (3) varijante proteina elastaze na N-terminalu.
[0058] Jednom kada bude proizvedena, zrela elastaza može biti lipofilizirana, na primer za farmaceutske formulacije. U prikazanim oblicima, dati pronalazak prikazuje metode za izolaciju lipofilizirane zrele elastaze tipa I obuhvatajući sledeće korake:
(a) kultivisanje ćelije domaćina, kao što je ćelija domaćin Pichia pastoris, projektovana da izrazi molekul nukleinske kiseline kodiran sa vidljivom građom preproelastaze pod uslovima u kojima je vidljiva građa izražena u kome, u specifičnim oblicima, navedena vidljiva građa sadrži nukleotidnu sekvancu kodiranu u 5’ to 3’ smeru (i) signalnog peptida, odnosno signalnog peptida operativno povezanog sa Pichia pastoris;
(ii) aktivacijsku sekvencu koja obuhvata prepoznavajuću sekvencu elastaze i (iii) sekvencu proteina elastaze tipa I koja pored ostalog proizvodi protein proelastaze;
(b) izlaganje proteina proelastaze autoaktivacijskim uslovima gde se pored ostalog proizvodi zrela elastaza tipa I a koji autoaktivacijski uslovi uključuju jednu od sledećih kombinacija:
(i) zamena pH rastvora (koji može biti plutajuća ćelija) koji sadrži protein proelastaze za pH 6.5-11, poželjno 8-9;
(ii) prečišćavanje proteina proelastaze, na primer, jonom razmenjenim hromatografijom, i izlaganje rastvora proširenog konverzijama da ukloni varijante N-terminala, čime se proizvodi zrela ljudska elastaza tipa I;
(iii) koncentracija proteina proelastaze (odnosno, 2-puta, 3-puta, 5-puta, 8-puta, 10-puta, 12-puta, ili u rasponima koji su viših ili nižih limita koji su nezavisno odabrani od navedenih nivoa koncentracije);
(iv) izlaganje proteina proelastaze povišenoj temperaturi (odnosno, 29°C, 30°C, 32°C, 35°C, 40°C, 45°C, ili40°C, ili u rasponima koji su viših ili nižih limita koji su nezavisno odabrani od navedenih temperatura);
(v) prečišćavanje proteina proelastaze (odnosno, upotreba Makro-Prep visoke S smole) od plutajućih ćelija kulture i inkubacija rastvora koji sadrži prečišćen protein proelastaze na sobnoj temperaturi (odnosno, od 22°C do 26°C) u periodu od poslednjeg dana (odnosno jedan dan, dva dana, tri dana, četiri dana, pet dana ili šest dana, raspon dana u kojima su viši ili niži limiti nezavisno izabrani iz navedenih vrednosti) (ovo je uticaj prisustva citrata/acetata, koncentracije, temperature i pH u rastvoru i može se pouzdano odrediti).
(c) opciono, prečišćavanje zrele ljudske elastaze tipa I, odnosno jona razmenjenog hromatografijom i
(d) lipofilizacija zrele elastaze tipa I, čime se izoluje lipofilizirana zrela ljudska elastaza tipa I. Zrela elastaza tipa I je prvenstveno ljudska elastaza tipa I. U određenim aspektima, lipofilizirana zrela elastaza tipa I je prvenstveno više od 95% čista; u specifičnim oblicima, lipofilizirana zrela elastaza tipa je više od 98% ili više od 99% čista.
[0059] Zreli proteini elastaze iz ovog pronalaska mogu biti formulisani u farmaceutske kompozicije. Tako, u prikazanim oblicima, dati pronalazak prikazuje metod generisanja farmaceutskih kompozicija koje obuhvataju ljudsku elastazu tipa I, navedeni metod obuhvata (i) izolaciju lipofilizirane ljudske elastaze tipa I prema metodama koji su ovde napred opisani; i (ii) ponovno lipofiliziranje zrele ljudske elastaze tipa I u farmaceuski prihvatljivom nosiocu. Zrela ljudska elastaza tipa I iz ovog pronalaska prvenstveno ima specifičnu aktivnost veću od 1, veću od 5, veću od 10, veću od 20, veću od 25, ili veću od 30 U/mg proteina, kako je određeno merenjem stope hidrolize malog peptidnog substrata N-sucinil-Ala-Ala-Ala-pNi-troanilide (SLAP), koja je katalizovana dodatkom elastaze. Jedna jedinica aktivnosti je definisana kao vrednost elastaze katalizovane hidrolizom 1 mikromola substrata po minuti na 30°C i specifična aktivnost je definisana kao aktivnost po mg proteina elastaze (U/mg). Prvenstveno, zrela ljudska elastaza tipa I iz ovog pronalaska ima specifičnu aktivnost u rasponu u rasponu gde je niži limit 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ili 20 U/mg proteina i u kojem je viši nivo, nezavisno 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili 50 U/mg proteina. U prikazanim oblicima, specifična aktivnost je u opsegu 1-40 U/mg of proteina, 1-5 U/mg proteina, 2-10 U/mg proteina, 4-15 U/mg proteina, 5-30 U/mg of proteina, 10-20 U/mg of proteina, 20-40 U/mg proteina, ili bilo koji drugi opseg u kojem su viši i niži limiti izbrani od bilo koje od navedenih vrednosti (odnosno, 1-10 U/mg, 5-40 U/mg, itd.).
[0060] Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska su prvenstveno stabilne. U specifičnim oblicima, farmaceuske kompozicije (na primer farmaceutske kompozicije dobijene lipofilizacijom i ponovnom kako je ovde opisano) održava najmanje 50%, više poželjno najmanje 60%, i najpoželjnije najmanje 70% specifične aktivnosti nakon nedelje boravka na 4°C. U specifičnim oblicima, farmaceutska kompozicija održava najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85% ili najmanje 95% specifične aktivnosti nakon ponovljene nedelje boravka na 4°C.
[0061] Ovaj pronalazak takođe prikazuje proteine koji obuhvataju sekvencu amino kiseline proproteina elastaze tipa I koja sadrži sekvencu elastaze sa cepajućim domenom. Drugi cepajući domeni koji mogu biti upotrebljeni u ovom pronalasku su bilo koje sekvence opisane sa odgovarajućim sekvencama cepajućeg domena (SEQ ID broj:74) Xaa1 Xaa2 Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8, gde je Xaa1=P5, Xaa2=P4, Xaa3=P3, Xaa4=P2, Xaa5=P1, Xaa6=P’1, Xaa7=P’2, i Xaa8=P’3, gde je:
- Xaa1 glutamat, histidin, prolin, gliicin, asparagin, lizin, ili alanin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa2treonin, alanin, prolin ili histidin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa3alanin, leucin, izoleucin, metionin, luzin, asparagin or valin, ili, opciono, analogno tome, ali je poželjno bez glicina ili prolina;
- Xaa4 prolin, alanin, leucin, izoleucin, glicin, valin, ili treonin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa5 alanin, leucin, valin, izoleucin, ili serin ali ne glicin, tirozin, fenilalanin, prolin, arginin, glutamat, ili lisine, ili,opciono, analogno tome;
- Xaa6 alanin, leucin, valin, izoleucin ili serin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa 7 glicin, alanin, ili valini, ili, opciono, analogno tome; i
- Xaa8 valin, treonin, fenilalanin, tirozin, ili triptofan, ili, opciono, analogno tome.
[0062] Ovaj pronalazak takođe prikazuje metod izolovanja zrele ljudske elastaze tipa I koji obuhvata: a) kultivisanje pod uslovima kultivisanja, ćelija domaćina sadrži nukleotidnu sekvencu koja je kodirana proproteinom koji obuhvata (i) aktivacijsku sekvencu koja obuhvata prepoznavajuću sekvencu tipsina operativno povezanu sa (ii) sekvencom amino kiseline proteina koji ima aktivnost elastaze pod navedenim uslovima, u kojima uslovi kultivisanja sadrže period rasta ili indukcije na pH 2 do 6; (b) ponovno izraženi proprotein; (c) kontakt obnovljenog proteina sa katalitičkom vrednosti tipsina pod pH uslovima u kojima je tipsin aktivan; i (d) izolovanje zrele ljudske elastaze tipa I. U ovom metodu zrela ljudska elastaza tipa I može da sadrži uglavnom SEQ ID broj: 1, 4, 5, 84, ili 87. U određenim oblicima, uslovi mogu da sadrže (a) period rasta ili indukcije na pH 4 do 6; (b) period rasta ili indukcije na 22°C do 28°C; ili (c) natrijum citrat, natrijum sukcinat ili natrijum acetat koncentarcije oko 50 mM do oko 200 mM ili natrijum citrat koncentracije 90 mM do oko 110 mM sredini navedenih ćelija donaćina.
[0063] Treba primetiti da neodređeni članovi “a” i “an” i određeni član “the” su upotrebljavani u datoj prijavi, što je svojstveno patentnim prijavama, da označe jednu ili mnogo više od konteksta koji drugačije diktira. Na dalje, termin “ili” je upotrebljen u predmetnoj prijavi, što je svojstveno patentnim prijavama, da označi rastavni veznik “ili” ili sastavni veznik “i”.
[0064] Bilo koja diskusija u vezi sa dokumentima, radnjama, materijalima, uređajima, člancima koja je uključena u ovaj opis ima jedino svrhu usavršavanja teksta opisa datog pronalaska. Ovo ne treba tumačiti kao priznanje da se neki ili svi pojmovi iz opisa stanja tehnike baziraju ili su bliski opštem znanju iz relevantnih oblasti koji postoje pre datuma podnošenja ove prijave.
[0065] Karakteristike i prednosti ovog pronalaska će postati još očiglednije iz sledećeg detaljnog opisa njihovih izvođenja.
4. KRATAK OPIS CRTEŽA
[0066]
Slika 1A-1B: Slika 1A prikazuje sintetičku sekvencu (na dalje, rekombinantnu) ljudske ELA-1.2A. Sekvenca rekombinantne ljudske elastaze-1 (na dalje, ljudska elastaza pankreasa tipa 1) sadrži 750-osnovna para kodiranih područja. Odabrana mesta ograničenja enzima su podvučena. Osnovne substitucije su dvostruko podvučene, sa podebljanim tekstom. Krajevi šifri su upakovani. Propeptidna sekvenca je prikazana iskošenim fontom. Kodirano područje predstavlja 250 proteina amino kiseline. Nakon cepanja 10 propeptida amino kiseline dobija se prirodni enzim 240 amino kiselina. Slika 1B prikazuje pPROT324 translativnu spajajuću regiju. Translaciona spajajuća regija između vektora i ELA-1 kodiranog regiona je opisana. PCR umnožavanje ELA-1 sekvence je predviđeno za osnivanje Kex2 i STE13 signalnog cepajućeg domena do polja lučenja proizvoda sa očekivanim N-graničnikom prve amino kiseline (u podebljanom tekstu) aktivacijske sekvence (iskošeni font).
Slika 2: N-terminal do C-terminala šematski prikazuje (preklapanje) komponenti jezgra proteina elastaze iz ovog pronalaska, u kojima numerisane komponente opisuju: (1) signalnu sekvencu (vertikalne linije); (2) opcionalno propeptidnu/sekvencu odstojanja (cigle); (3) propeptid elastaze (dijagonalne linije, neosenčene i romboidne figure kombinovano); (4) aktivacijski peptid (neosenčene i romboidne figure kombinovano); (5) prepoznavajuća sekvenca (romboidna figura); (6) cepajući domen (neosenčena, romboidna figura i levi deo horizontalnih linija); (7) mesto cepanja ( neosenčena, romboidna figura i levi deo horizontalnih linija); (8) protein (cela šema); (9) protein proelastaze (horizontalne linije, neosenčane, romboidne figure i horizontalne linije kombinovano); i (10) zreli protein elastaze (horizontalne linije). Tabela prikazuje oznake amino kiselina područja koja su na šemi označena strelicama. Nije crtano u razmerama. Nomenklatura je u prikazujuće svrhe i nije namenjena za neku drugu određenu funkciju, aktivnost ili mehanizam.
Slika 3. Dijagram pPROT24-V Vektora "α-faktor lučenja" se odnosi na kasetu koja obuhvata kvasac α- factor signalnog peptida i propeptida, prećenog sa Kex2 mestom i STE13 koji se ponavlja.
Slika 4: SDS-STRANA analize frakcija dobijenih hromatografijom 201-24-266-VU kulture koja obuhvata tipsin-aktiviran pro-PRT-201. Presek brojeva odgovara brojevima frakcija. Frakcije 6-18 pre svega sadrže glikolizirani proenzim (gornji skup) i ne-glikolizirani proenzim (donji skup). Frakcije 19-35 pre svega sadrže ne-glikolizirani proenzim. M = molekulska masa. FT = kolona izvršenog protoka.
Slike 5A-5F: Slika 5A je auto-aktivirani proprotein date tabele. Sekvence propeptida su navedene u prvoj koloni. SDS-STRANA supernanata posle 1, 2 I 3 dana indukcije (redovi, 1, 2 I 3) su prikazani u drugoj koloni. Polja srodnih proproteina baziranih na SDS-STRANI su navedeni u trećoj koloni. Odgovarajuće stabilnosti proproteina preko 3 dana indukcije bazirane na SDS-STRANI su navedeni u četvrtoj koloni. Proproteini sa 42 I 48 propeptidne sekvence su rangirani kao nisko stabilni iz razloga prisustva zrelog proteina tokom indukcije (posmatrano nakon 1, 2, I 3 dana za 42 varijante I nakon 2 I 3 dana za 48 varijanti). Stope srodnih preobražaja proproteina određene kao postizanje maksimalne brzine SLAP reakcije su navedene u petoj koloni. Proračunati procenti preobraženih proteina koji obuhvataju varijante N-terminala zrelog proteina elastaze su navedeni u šestoj koloni. Slike 5B-5F prikazuju stopu preobražaja za propeptidne sekvence 24, 42, 48, 49 i 55.
Slika 6. pPROT55M3-V šema kloniranja. pPROT55M3-V je projektovana in vitro vezivanjem dva dodatna prikaza do 4.3 kb pPROT55-V vektora kičme, dajući potpuni od tri povezana prikaza. 2.3 fragmenta prikaza su oslobođena od pPROT55-V sa BgIII i BamHT ograničena varenja I prečišćavanja, praćena vezivanjem dve kopije izražaja do pPROT55-V linearizovanog sa BamHI.
Slika 7: Optimizacija mućkanja epruveta klona 201-55M3-006-VU. Standardna srednja indukcija, BKME, je pripremljena i dopunjena sa natrijum citratom da bi se postigle finalne koncentracije 0, 12.5, 25 i 50 mM natrijum citrata, pH 5.5. Srednja indukcija je upotrebljena da bi ponovo suspendovala faza rasta ćelije odnosa 1 g nakvašene ćelije težine do 10 mL srednje indukcije. Suspenzije ćelija ili 25 mL svake je smeštena u 250 mL nezaštićene boce I inkubirana na 22°C ili 25°C za tri dana sa mućkanjem na 275 rpm. Metadon je dodavan dva puta dnevno u finalnu koncentraciju 0.5%. Plutajuće alikvote su uzete tokom 3-dana perioda and analizirana za izražaj proteina SDS-STRANOM i Coomassie bojenjem. Panel A prikazuje uzorke indukovane na 22°C i Panel B prikazuje uzorke indukovane na 25°C. Na oba panela, redovi 1-3 su plutajući nakon 1, 2 i 3 dana indukcije, sadržajavjući 0% natrijum citrata; redovi 4-6 su slični osim sa 12.5% natrijum citrata; redovi 7-9 su slični osim sa 25% natrijum citrata; I redovi 10-12 su slični osim sa 50 mM natrijum citrata.
Slika 8. SDS-STRANA analiza 201-55-001-VU i 201-55M3-003-VU plutajućih fermentacija. Redovi 1,2 : 201-55-001-VU plutajući; redovi 3, 4: 201-55M3-003-VU plutajućit; red 5: prazan; red 6: obeležen molekulskom težinom.
Slika 9. SDS-STRANA analiza frakcija pPROT55M3-V proproteina dobijenog hromatografijo. Ukupno od 30 mikrolitara od svakog odvajanja frakcije je pomešan sa 10 mikrolita 4X Laemmli uzorka očekujući tampon zamenjen sa betamerkaptoetanolom. Proteini su elektrolizovani na an 8-16% dužinskom stepenu gela praćenog sa Coomassie bojenjem. Dve preovlađujuće forme PRT-201 su posmatrane: proprotein (frakcije 15-43) i spontano preobraženi zreli PRT-201 (frakcije 15-44). Brojevi redova odgovaraju brojevima frakcija. M, obeležava molekulsku težinu. BC, prednja kolona (prethodno napunjeni) uzorak.
Slika 10: HIC-HPLC analiza prečišćeni preobražaj proproteina. Prečišćeni pro-PRT-201-55M3-003-VU je podvrgnut preobražaju na 26°C. Grafika prikazuje odgovarajuće vrednosti zrelog (pune brzine) PRT-201 I varijante N-terminala proizvedene tokom preobražaja.
Slika 11: HIC-HPLC analiza preobražaja proproteina u plutajućoj fermentaciji se odražava effected dodirnom protočnom filtracijom. Pojašnjeno 201-55M3-003-VU plutajuća fermentacija je dobijena dodirnom protočnom filtracijom sa 100 mM Tris, pH 8.0, koristeći stalni volumen diafiltracije na sobnoj temperaturi sa regenerisanim membranama celuloze. Grafika prikazuje odgovarajuće vrednosti proproteina, zrelog (pune brzine) PRT-201 I varijante N-terminala prikazane na različitim tačkama vremena tokom preobražaja.
Slika 12. SDS-STRANA analiza frakcija od pPROT55M3-V preobražaja dobijenog hromatografijom. Ukupno od 30 mikrolitara od svakog odvajanja frakcije je pomešan sa 10 mikrolitara 4X Laemmli uzorka očekujući tampon zamenjen sa beta-merkaptoetanolom. Proteini su elektrolizovani na an 8-16% dužinskom stepenu gela praćenog sa Coomassie bojenjem. Dve preovlađujuće forme PRT-201 su posmatrane: zreli glikosilat (frakcija 35-70), I zreli ne-glikosilat od (frakcije 75-160). Brojevi redova odgovaraju brojevima frakcija. M, obeležava molekulsku težinu. BC, prednja kolona (prethodno napunjeni) uzorak.
Slika 13: Koncentracija zavisi od pro preobražaja. Prečišćena pro-PRT-201 od 201-55M3-003-VU klona (pro-PRT-201-55M3-003-VU) je podvrgnuta preobražaju na koncentracijama 0.2, 1.0, 1.6 ,i 1.8 mg/mL. Preobražajne reakcije su bile praćene HIC-HPLC u vremenu dok je proprotein bio ≤ 1% ukupnog proteina. Slika prikazuje odgovarajuće vrednosti zrelog (pune brzine) PRT-201 (neosenčani zbir) I varijante N-terminala (dijagonalna polja) proizvedene tokom preobražaja.
Slika 14. DNA sintetička sekvenca (na dalje, rekombinantna) elastaze tipa I svinjskog pankreasa. Rekombinantna sekvenca sadrži 750 osnovnih parova kodirajuće oblasti. Podvučena su SacII i XbaI ograničavajuća mesta gde se dešava inkorporacija u olakšavajuće kloniranje. Zaustavljajući kodoni su upakovani. Pro-peptidna sekvenca je označena podebljano.
Slika 15. Sintetička sekvenca amino kiseline (na dalje, rekombinantna) elastaze tipa I svinjskog pankreasa. Oblast propeptida je podebljana dok je cepajući domen tipsina upakovan. Nakon cepanja 10 peptida amino kiseline dobija se zreli enzim od 240 amino kiseline.
Slika 16. Šema kloniranja elastaze tipa I svinjskog pankreasa unutar PV-1 vektora. Nakon sinteze proproteina elastaze tipa I svinskog pankreasa na kodiranoj oblasti, kloniran je u Plavom Heron pUC vektoru. U dodatku za pojačavanje kodirajućih sekvenci elastaze tipa I svinjskog pankreasa, PCR je upotrebljen za inkorporaciju XhoI i SacII ograničavajućih mesta za kloniranje unutar PV-1 vektora. PCR proizvod je prevaren, prečišćen gelom I ligated sa PV-1 prevarenim vektorom sa XhoI i SacII, tako da se dobije u pPROT101-24-V izrazu vektora kodiranog aktivacijskim tipsinom proproteina elastaze tipa I svinjskog pankreasa.
Slika 17. Analize auto-aktivacijskog pPROT101-42-V i klona aktivacijskog tipsina pPROT101-24-V tokom during indukcije metanola SDS-STRANOM. Mešanje sadržaja epruveta, nakon 1 dana indukcije bilo je analizirano na 8-16% stepeni gela praćeno bojenjem sa Komasi bojama. Redovi I-10 obuhvataju sadržaje od deset različitih klonova transformisanih sa pPROT101-42-V. Redovi 11-12 obuhvataju sadržaje od dva različita klona transformisana sa pPROT101-24-V. M, obeležava molekulsku težinu.
Slika 18. Analiza auto-aktiviranog pPROT101-49-V i pPROT101-55L-V klonova tokom indukcije metanola SDS-STRANOM. Mešanje sadržaja epruveta, nakon 1 I 2 dana indukcije bilo je analizirano na 8-16% stepeni gela praćeno bojenjem sa Komasi bojama. Redovi 1-2 obuhvataju sadržaje od pPROT101-49-V klona nakon 1 I 2 dana indukcije. Redovi 3-4 obuhvataju sadržaje od pPROT101-55L-V klona nakon 1 I 2 dana indukcije. M, obeležava molekulsku težinu.
Slika 19. Vremenski kurs aktivacije pPROT101-49-V i pPROT101-55L-V proteina testom niske skale preobražaja je određen SLAP aktivnošću elastaze. Zbirevi grešaka predstavljaj 6SD od potencijalnih (n=4).
Slika 20. SDS-STRANA analizira pPROT101-49-V i pPROT101-55L-V sadržaje pre I posle testa niske skale preobražaja. Prvenstveno do elektroforeze, uzorci su pomešani sa limunskom kiselinom, sa redukovanim agensom TCEP, i LDS uzorkom tampona (Invitrogen, CA). Uzorci su bili zagrejani na 70°C 10 minuta. Redovi 1-2: pPROT101-49-V pre i posle testa preobražaja sadržaja; redovi 3-4: pPROT101-55L- V- pre i posle testa preobražaja sadržaja. M, označava molekulsku težinu.
Slika 21. TrypZean standardna kriva.
Slika 22. Strana, sekcija parcijalnog prikaza jednog oblika medicinskog uređaja u odeljku 5.9.
Slika 23. Prikaz sličan slici 22 koji ilustruje kretanje pogona medicinskog uređeja.
Slika 24. Sekcija prikaza ravni redova 2-2 na slici 22.
Slika 25. Sekcija prikaza ravni redova 3-3 na slici 22.
Slika 26. Dijagram dela fluida medicinskog uređaja sa slike 22, proširenog od Luer kičme kroz kanale za pražnjenje do rezervoara I onda do penetratnog tkiva.
Slika 27. Strana, sekcija parcijalnog prikaza drugog oblika medicinskog uređaja datog pronalaska prikazuje pogone u njihovoj nametnutoj konfiguraciji.
Slika 28. Prikaz sličan slici 27, ali prikazuje pogone u njihovoj nenametnutoj konfiguraciji.
Slika 29. Perspektiva prikaza skupa zajedno redova 3’-3’ slike 27.
Slika 30. Perspektiva prikaza skupa zajedno redova 4’-4’ slike 29 prikazuje penetratno tkivo.
Slika 31. Strana prikaza prikazuje detalje proksimalnog kraja uređaja, prikazan desno na slikama 27 I 28.
Slika 32. Strana prikaza spoljašnjosti medicinskog uređaja sa slike 22 koji je u ograničenom položaju.
5. DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0067] Dati pronalazak je usmeren na metode rekombinantnih ekspresija I proizvodnju zrelih, biološki aktivnih proteina elastaze. Pronalazak prikazuje nove, efikasne metode pravljenja rekombinantnih proteina elastaze kultivisanjem ćelija domaćina, uključujući preferencijalnu ćeliju domaćina, Pichia pastoris, koja obuhvata nukleinske kiseline kodirane proteinima proelastaze I proteinima preproelastaze. Upotreba rekombinantnih proteina u proizvodnji farmaceutskih kompozicija za lečenje I prevenciju bolesti bioloških kanala (uključujući arterije ili vene) je takođe prikazana.
[0068] U određenim aspektima, dati pronalazak je usmeren na rekombinantne auto-aktivacijske proteine proelastaze I odgovarajuće nukleinske kiseline, ćeliju domaćina I metode proizvodnje. Tako su auto-aktivacijski proteini proelastaze projektovani da obuhvate prepoznavajuće mesto N-terminala elastaze do prvog ostatka zrelog proteina elastaze. Pod specijalnim uslovima, kakvi su opisani ovde u nižem odeljku 6, moguće je postići auto-aktivaciju do željene aktivacije. Takođe je moguće postići auto-aktivaciju dok je premeštena iz ćelijske kulture.
[0069] Dati pronalazak prikazuje delotvorne ekspresije I procese prečišćavanja za proizvodnju proteina elastaze farmaceutskog stepena. Dati pronalazak takođe prikazuje metode za lečenje ili prevenciju bolesti bioloških kanala upotrebom proteina elastaze iz ovog pronalaska.
[0070] Opis u odeljku 5 ovde je primanljiv za oblike iz odeljka 8. Tako, na primer, referenca za protein elastaze ovog pronalaska uključuje, ali ne ograničeno, referencu za protein elastaze prema bilo kom od oblika 1-39 I 68-69, ili protein elastaze dobijen ili moguće dobijen metodom bilo kog od oblika 89-224, 261 to 276, i 347 do 373. Takođe, referenca za nukleinsku kiselinu ovog pronalaska, podrazumeva, inter allia, nukleinsku kiselinu prema bilo kom obliku 40-67; referenca za vektor podrazumeva, inter allia, referencu vektora prema bilo kom obliku 70-72; referenca za ćeliju podrazumeva, inter allia, ćeliju prema bilo kom od oblika 73-87; referenca za ćelijski sadržaj podrazumeva, inter allia, ćelijski sadržaj prema obliku 88; referenca za kompoziciju, kao što su farmaceutske kompozicije, formulacije elastaze I jedinične doze, uključujući, na primer, ovde ilustrovane u oblicima 277-314, 346, 386, i 415-420 ili ovde dobijene metodom bilo kog od oblika 261-276 i 374-385; I reference za terapeutske metode takođe uključuju reference za terapeutske metode prema bilo kom od oblika 387-414; referenca za deo uključuje, inter allia, referencu za deo oblika 421-425 odeljka 8.
5.1 PROTEINI ELASTAZE
[0071] Dati pronalazak upućuje na, inter allia, metode za rekombinaciju j proizvodnju zrelih biološki aktivnih proteina elastaze. Proteini elastaze su generalno izraženi kao preproproteini, koji obuhvataju, pored ostalih sekvenci, signalni peptid, aktivacijski peptid I zreli deo sa biološkom aktivnošću. Odgovarajuće sekvence zrelog proteina elastaze su opisane u nižem odeljku 5.1.1.
[0072] Prema tome, u određenim aspektima, proteini elastaze ovog pronalaska su proteini preproelastaze. in certain aspects, the elastase proteins of the invention are preproelastase proteins. Uklanjanje signalne sekvence iz preproproteina posle izlučenja daje priliv neaktivnog proproteina koji sadrži aktivacijski peptid I zreo protein. Fraza “aktivacijska sekvenca” i “aktivacijski peptid” su ovde upotrebljeni naizmenično. Tako, u drugim aspektima, proteini elastaze ovog pronalaska su proteini proelastaze koji sadrže aktivacijski peptid koji je operativno povezan sa zrelim proteinom elastaze. U prikazanim oblicima, aktivacijski peptid ili sekvenca elastaze tipa I ljudskog pankreasa sadrži prvih 10 amino kiselina N-terminala proproteina ljudske elastaze tipa I (SEK ID BR:22). U određenim oblicima, aktivacijski peptid je peptid SEK ID BR: 80. Aktivacijski peptidi ili sekvence korisni u praksi takođe sadrže, ali ne ograničeno, SEK ID BR: 23, 72 i 73. Druge aktivacijske sekvence korisne u praksi mogu biti dobijene iz ostataka N-terminala 1-10 of SEK ID BR:64-69 i 98-103.
[0073] Uklanjanje aktivacijskog peptida iz sekvence proelastaze generiše zreli protein elastaze. Korak na kojem je aktivacijski peptid uklonjen iz sekvence proelastaze/odvojen od sekvence zrele elastaze da generiše zreli protein elastaze je ovde predstavljen kao aktivacijski korak. Dalje, u ostalim aspektima, proteini elastaze iz ovog pronalaska su zreli proteini.
[0074] Ostaci amino kiseline koji sadrže C-završetke (na dalje, karboksilne završetke) aktivacijskog peptida i N-završetke (na dalje, amino završetke) zrelog proteina koji okružuje cepajući domen su opisani na slici 2 I takođe označeni ovde kako sledi. Prvo, ostaci locirani na C-završetku aktivacijskog peptida su određeni sa PX,...P5, P4, P3, P2, i P1, gde je P1 ostatak na C-terminalu aktivacijskog peptida. Ostaci locirani na N-završetku zrelog proteina su označeni kao P1’, P2’, P3’,...PX’, gde je P1’ amino kiselina na N-terminalu ostatka amino kiseline zrelog proteina. Cepajući domen proteolize (označen kao “mesto cepanja” na slici 2) je peptid između P1 ostatka aktivacijskog peptida P1’ ostatak zrelog proteina.
[0075] Oblast koja obuhvata 4 amino kiseline C-završetka aktivaciskog peptida (ostatci od P4 do P1) do prve 4 amino kiseline N-završetka zrelog proteina (ostaci P1’ do P4’) su predstavljeni ovde kao “mesto cepanja”.
[0076] Oblast koja obuhvata aproksimativno 5 amino kiselina C-završetka aktivaciskog peptida (na dalje, ostaci P5 do P1) do aproksimativno 3 amino kiseline N-završetka zrelog proteina (na dalje, ostaci P1’ do P3’) su ovde označeni kao “cepajući domen”. Primeri cepajućih domena koji mogu biti upotrebljeni u kontekstu ovog pronalaska uključiju, ali ne nužno, SEK ID BR S: 42, 43, 48, 49, 52, 53, 54 ili 55. Drugi cepajući domeni koji mogu biti upotrebljeni u ovom pronalasku su bilo koji od sekvenci opisani kao odgovarajući sekvenci cepajućeg domena su Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7 Xaa8, gde je Xaa1=P5, Xaa2=P4, Xaa3=P3, Xaa4=P2, Xaa5=P1, Xaa6=P1’, Xaa7=P2’, i Xaa8=P3’, gde je:
- Xaa1 glutamat, histidin, prolin, glicin, asparagin, lizin, ili alanin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa2 treonin, alanin, prolin or histidin ili, opciono, analogno tome;
- Xaa3alanin, leucin, isoleucin, metionin, lisin, asparagin ili valin, opciono, analogno tome, ali je poželjno bez glicina ili prolina;
- Xaa4 prolin, alanin, leucin, isoleucin, glicin, valin, ili treonin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa5 alanin, leucin, valin, isoleucin, ili serinali ne glycin, tirosin, fenilalanin, prolin, arginin, glutamat, ili lisine, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa6 alanin, leucin, valin, izoleucin ili serini, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa7 glicin, alanin, ili valin, ili, opciono, analogno tome; i
- Xaa8 valin, treonin, fenilalanin, tirozin, ili triptofan, ili, opciono, analogno tome.
[0077] Tri oblasti amino kiseline koje obuhvataju ostatke P3, P2, i P1 aktivacijskog peptida su označene ovde kao “mesto prepoznavanja elastaze”. Primeri za mesta prepoznavanja koja mogu biti upotrebljena u kontekstu ovog pronalaska uključuju, ali ne nužno, SEK ID BRS: 14-16, i 18-21. Druga mesta prepoznavanja ovog pronalaska uključuju bilo koje mesto prepoznavanja odgovarajuće mestu prepoznavanja SEK ID BR: 11, 12, 13, ili 93. SEK ID BR:11 koja odgovara prepoznavajućoj sekvenci elastaze 1 je predstavljena peptidnom sekvencom Xaa1 Xaa2 Xaa3, pri čemu je Xaa1=P3, Xaa2=P2, Xaa3=P1, pri čemu je:
- Xaa1 alanin, leucin, izoleucin, metionin, lizin, asparagin ili valin, ili, opciono, analogno tome je poželjno bez prolina; - Xaa2 prolin, alanin, leucin, izoleucin, glicin, valin, ili treonin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa3 alanin, leucin, valin, izoleucin, ili serin, ili, opciono, analogno tome, ali je poželjno bez glicina, tirozina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamata, ili lizina.
[0078] The SEK ID BR:12 odgovarjućih prepoznavajućih sekvenci elastaze je predstavljeno sekvencom Xaa1 ProXaa2, pri čemu je:
- Xaa1alanin, leucin, izoleucin, metionin, lizin, ili valin, ili, opciono, analogno tome, ali je poželjno bez glicina ili prolina;
- Pro prolin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa2 alanin, leucin, valin, izoleucin, ili serin, ili, opciono, analogno tome, ali je poželjno bez glicina, tirozina, fenalalanina, prolina, arginina, glutamata, ili lizina.
[0079] SEK ID BR:13 odgovarjućih prepoznavajućih sekvenci elastaze 3 je predstavljeno peptidnom sekvencom Xaa1 Xaa2 Xaa3, pri čemu je Xaa1=P3, Xaa2=P2, Xaa3=P1, pri čemu je Xaa1 asparagin ili alanin, ili, opciono, analogno tome; pri čemu je Xaa2 prolin ili alanin, ili, opciono, analogno tome, i pri čemu je Xaa3 alanin, leucin, ili valin, ili, opciono, analogno tome.
[0080] The SEK ID BR:93 odgovarjućih prepoznavajućih sekvenci elastaze 4 je predstavljeno sekvencom Xaa1 Pro Xaa2, pri čemu je:
- Xaa1alanin, leucin, izoleucin, metionin, lizin, asparagin ili valin, ili, opciono, analogno tome, ali je poželjno bez glicina ili prolina;
- Pro prolin, ili, opciono, analogno tome;
- Xaa2alanin, leucin, valin, izoleucin, ili serin, ili, opciono, analogno tome, ali je poželjno bez glicina, tirozina, fenilalanina, prolina, arginina, glutamata, ili lizina.
[0081] Upućivanje na sekvencu kao “sekvenca cepanja” , "mesto cepanja" , "aktivacijska sekvenca", “prepoznavajuća sekvenca elastaze", itd, je isključivo radi jednostavnosti I nije namenjeno da vrši bilo koju funkciju sekvence ili mehanizma u kome je sekvenca prepoznata ili obrađena.
[0082] Proteini ovog pronalaska su generalno sačinjeni amino kiselinama i mogu u dodatku da uključe jedan ili više (na primer, preko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ili 15) zamena amino kiselina. Generalno, kako je ovde upotrebljeno, amino kiselina se odnosi na prirodno-hemijski L stereoisomer. Zamena amino kiselina se odnosi na D-stereoisomer, hemijski modifikovanu amino kiselinu, ili drugu neprirodnu amino kiselinu. Na primer, neprirodna amino kiselina uključuje, ali ne nužno, azetidinkarboksilnu kiselinu, 2-aminoadipiknu kiselinu, 3-aminoadipiknu kiselinu, β-alanin, aminopropionsku kiselinu, 2-aminobutiričnu kiselinu, 4- aminobutiričnu kiselinu, 6-aminokaproinsku kiselinu, 2-aminoheptaninsku kiselinu, 2-aminoisobuterinsku kiselinu, 3-aminoisbutrinsku kiselinu, 2-aminopimelsku kiselinu, tertiaributilglicin,
2,4-diaminoizobutrinsku kiselinu, desmosin, 2,2’-diaminopimelinsku kiselinu, 2,3-diaminopropionsku kiselinu, N-etilglicin, N-etilasparagin, homoprolin, hidroksilisin, alodroksilisin, 3-hidroksiprolin, 4-hidroksiprolin, izodesmosin, aloizoleucin, N-metilalanin, N-metilglicin, N-metilizoleucin, N-metilpentilglicin, N-metilvalin, naftalin, norvalin, norleucin, ornitin, pentilglicin, pipekolsku kiselinu i tioprolin. Hemijski modifikovane amino kiseline uključuju amino kiseline koje su hemijski blokirane, reverzibilno I nereverzibilno, i/ili modifikovane na jednoj ili više ovih bočnih grupa, α-atoma ugljenika, finalne amino grupe, amino grupe, ili finalne karboksilne grupe kiselina. Hemijske modifikacije uključuju dodavanje hemijskih struktura, kreiranje novih oblika I uklanjanje hemijskih struktura. Primeri hemijski modifikovanih amino kiselina uključuju, na primer, metionin sulfoksid, metionin sulfon, S-(karboksimetil)-cistein, S-(karboksimetil)-cistin sulfoksid I S-(karboksimetil)-cistin sulfon. Modifikacije bočnih grupa amino kiselina uključuju alkulaciju lisina εamino grupe, N-alkulaciju arginina, histidina, ili lisina, alkulaciju glutaminske ili aspartinske karboksilne kiseline. Modifikacije finalne amino kiseline uključuju des-amino, N-niži alkil, N-di-niži alkil, I N-acil modifikacije. Modifikacije finalne karboksilne grupe uključuju amide, niže alkil amide, diakil amide, I niže akil ester modifikacije. Niža alkil je C1-C4 alkil. Štaviše, jedna ili više bočnih grupa, ili finalne grupe, mogu biti zaštićene grupe hemičarima poznate kao redovno-kvalifikovani protein. α-ugljenik amino kiseline može biti mono- ili di- metil.
[0083] Proteini ovog pronalaska mogu biti modifikovani ili proizvedeni, kao što je modifikacija putem fosforilacijom ili glikosilacijom ili derivacija putem konjugacije, na primer od lipida do drugog proteina (odnosno, za ciljanje ili stabilizaciju) ili slično.
[0084] Dati pronalazak se često odnosi na “izolovane” ili “prečišćene” protein elastaze. Izolovani protein elastaze je onaj koji je uklonjen od ćelijske sredine. Prečišćeni protein elastaze je substancijalno oslobođen od ćelijske sredine ili drugih kontaminiranih proteina ćelije ili tkiva od koga vodi poreklo protein elastaze, ili substanciono oslobođen od hemijskih komponenti ili drugih hemikalija kada su hemijski sintetizovani.Termin “substancijalno oslobođen od ćelijskog materijala” uključuje preparate preoteina elastaze u kojima su proteini odvojeni od ćelijskih komponenti ćelija od kojih se stvara rekombinantna proizvodnja. Tako, protein elastaze je substancijalno oslobođen od ćelijskog materijala uključujući preparate proteina elastaze koji imaju manje od oko 30%, 20%, 10%, ili 5% (neto težine) heterolognog proteina (takođe ovde označen kao "kontaminirajući protein"). Kada je protein elastaze proizveden u procesu u kojem je izlučen u sredinu kulture, on je takođe prvenstveno oslobođen od sredine kulture odnosno sredina kulture predstavlja manje od oko 20%, 10%, ili 5% volumena preparata proteina elastaze.
[0085] U određenim oblicima, izolovana ili prečišćena elastaza je dodatno oslobođena ili substancijalno oslobođena od ćelijske DNA. U specifičnim oblicima, genom DNA ćelije domaćina je prikazan u vrednosti manjoj od 10 pikograma, manje od 5 pikograma, manje od 3 pikograma, manje od 2 pikograma ili manje od 1 pikograma DNA po miligramu proteina elastaze u preparatima izolovanog ili prečišćenog proteina elastaze, ili u kompozicijama koje sadrže izolovan ili prečišćen protein elastaze. U jednom obliku, DNA ćelije domaćina je Pichia pastoris DNA.
[0086] Korisna sekvenca proteina elastaze je prikazana u tabeli 1. U specifičnim oblicima, pronalazak prikazuje protein proelastaze (uključujući, ali ne nužno, protein bilo koje SEK ID BRS:6-9, 64-69, 88-91 ili 98-103) koji obuhvata (i) aktivacijsku sekvencu koja obuhvata prepoznavajuću sekvencu elastaze operativno povezanu sa (ii) sekvencom amino kiseline proteina koji ima aktivnost elastaze tipa I. Nekoliko polimorfizama ljudske elastaze tipa I su poznati. Bilo koja kombinacija polimorfizama je primerena sekvenci proteina proelastaze datog pronalaska, uključujući, ali ne nužno, kombinacije polimorfizama navedenih u tabeli 2. Protein, opciono, na dalje obuhvata signalnu sekvencu operativno povezanu sa navedenom aktivacijskom sekvencom. U specifičnim oblicima, signalna sekvenca je operativna u Pichia pastoris, kao što je signalni peptid kvasca α-factora, ilustrovana sekvencom amino kiseline SEK ID BR:34. Alternativni signalni peptid obuhvata sekvence ilustrovane u SEK ID BRS:50 i 96 (obuhvataju signalni peptid, propeptid ne-elastaze I sekvecu odstojanja) i SEK ID BRS:51 i 97 (obuhvataju signalni peptid i propeptid ne-elastaze). U drugim specifičnim oblicima, signalna sekvenca je lučenja kod sisara, kao što je signalna sekvenca svinjske elastaze. Prvenstveno, prepoznavajuća sekvenca elastaze je prepoznavajuća sekvenca elastaze tipa I, najpoželjnije prepoznavajuća sekvenca ljudske elastaze tipa I.
[0087] Dati pronalazak na dalje obuhvata varijante proteina elastaze ovog pronalaska. Varijante mogu da sadrže amino kiselinske substitucije na jednom ili više predviđenih ostataka amino kiseline. Prvenstveno, varijante uključuju ne više od 15, ne više od 12, ne više od 10, ne više od 9, ne više od 8, ne više od 7, ne više od 6, ne više od 5, ne više od 4, ne više od 3, ne više od 2 ili ne više od 1 konzervativne amino kiselinske substitucije koja odgovara prirodnom stanju elastaze i/ili ne više od 5, ne više od 4, ne više od 3, ili ne više od 2 nekonzervantne amino kiselinske substitucije ili ne više od 1 nekonzervativne amino kiselinske substitucije koja odgovara prirodnom stanju elastaze.
[0088] U specifičnim oblicima, varijanta nema nema više od 10 ili još poželjnije nema više od pet konzervativne amino kiselinske substitucije koja je odgovarajuća zreloj elastazi, proelastazi ili preproelastazi ovog pronalaska, kao što je zrela elastaza SEK ID BR: ili SEK ID BR:84 ili protein proelastaze SEK ID BR:6-9, 64-69, 88-91, i 98-103. Sekvence amino kiseline SEK ID BRS:1 i 84 obuhvataju jednu ili više pozicija odgovarajućih potencijalnim polimorfizmima u sekvenci zrele elastaze, na pozicijama 44 (W ili R); 59 (M ili V); 220 (V ili L); i 243 (Q ili R) (pozicije se odnose na preproprotein). Pronalazak dalje obuhvata zrele proteine elastaze sa bilo kojom kombinacijom četiri polimorfizma identifikovana u SEK ID BR: 84. Svaka od tih kombinacija je navedena u navedenoj tabeli 3. Sekvence SEK ID BRS:88-91 i 98-103 dalje obuhvataju potencijalne polimorfizme u peptidnoj sekvenci, na poziciji 10 (Q or H). Pronalazak dalje obuhvata sekvence preproelastaze I proelastaze koje obuhvataju bilo koju kombinaciju pet polimorfizama identifikovanih u SEK ID BRS:88-91 i 98-103. Svaka od tih kombinacija je navedena u navedenoj tabeli 2.
[0089] "Konzervativna amino kiselinska substitucija" je jedna u kojoj je ostatak amino kiseline zamenjen sa ostatkom amino kiseline koja ima sličan bočni lanac. Familije ostataka amino kiselina koje imaju slične bočne lance su definisane u članku. Takve familije uključuju amino kiseline sa bazičnim bočnim lancem (odnosno, lizin, arginin, histidin), kiselinske bočne lance (odnosno, aspartamska kiselina, gluteinska kiselina), prazne polarne bočne lance (odnosno, glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (odnosno, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (odnosno, treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (odnosno, tirozin, fenilalanin, triptofan).
[0090] Varijanta proteina elastaze ovog pronalaska može da uključi amino kiselinske substitucije sa amino kiselinskim zamenama kao što su amino kiseline koje su ovde opisane.
[0091] U specifičnim oblicima, protein iz ovog pronalaska u svojoj suštini obuhvata ili sadrži varijantu zrele ljudske elastaze tipa I, odnosno, varijantu u kojoj je najmanje oko 75%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% Identičnog sa proproteinima elastaze ili proteinima zrele elastaze navedenim u tabeli 1, kao što su, ali ne nužno, proproteini elastaze SEK ID BRS: 6-9, 64-69, 88-91, i 98-103, I zadržana aktivnost elastaze kada je izražen proizvod proteina zrele elastaze SEK ID BR: 1, 4, 5, 84 ili 87.
[0092] Da bi se odredio procenat identičnosti dve sekvence amino kiseline ili dve nukleinske kiseline, sekvence su razvrstane za optimalnu svrhu upoređivanja (odnosno, praznine mogu biti predstavljene u sekvenci prve aminokiseline ili sekvenci nukleinske kiseline za optimalno razvrstavanje sa drugom sekvencom amino ili nukleinskom kiseline). Ostatak ili nukleotid amino kiseline na odgovarajućim pozicijama amino kiseline ili nukleotidnim položajima se tako porede. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta sam ostatak amino kiseline ili nukleotida tako da odgovara poziciji u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični u takvoj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija brojeva identičnih pozicija prikazanih sekvenci (% identičnost = (# identičnih položaja/ukupno # preklapanje pozicija) x 100). U jednom obliku, dve sekvence su u istoj ravni. U drugim oblicima, dve sekvence su u ravni sa razlikom ne većom od 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ili 10% ravni sekvenci.
[0093] Određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može biti dovršeno upotrebom matematičkog algoritma. Prvenstveno, neograničeni primer matematičkog algoritma korišćenog za poređenje sličnosti između dve sekvence je algoritam Karlin I Altšul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, izmenjen u Karlin and Altšul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Kako je algoritam implementiran u NBLAST i XBLAST programe Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST pretrage nukleotida se mogu obavljati sa NBLAST programom, rezulatat = 100, za dobijanje nukleotidne sekvence homologne molekulima nukleinske kiseline iz ovog pronalaska. BLAST pretrage proteina mogu biti izvršene sa XBLAST programom, rezultat = 50, za dobijanje sekvenci amino kiselina homolognih molekulima proteina iz ovog pronalaska. Za dobijanje veličina za svrhe poređenja, Gapped BLAST može biti korišćen kako je opisano u Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativno, PSI-Blast može biti korišćen za dobijanje ponovne pretrage koja otkriva daleke veze između molekula (Id.). Kada se koriste BLAST, Gapped BLAST, i PSI-Blast programi, izostavljeni parametri u datim programima (e.g., XBLAST i NBLAST) mogu biti upotrebljeni. Videti http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
[0094] Drugi prvenstveni, neograničeni primer matematičkog algoritma korišćen za upoređivanje sekvenci je algoritam Myers i Miller, CABIOS (1989). Takav algoritam je implementiran u ALIGN program (verzija 2.0) koji je deo poravnavanja sekvence CGC softverskog paketa. Kada se koristi ALIGN program za poređenje sekvenci amino kiselina, PAM120 tabela težinskih ostataka, jaz dužine 12, i jaz dužine 4 može biti upotrebljen.Dodatni algoritmi za analize sekvenci su poznati i uključuju ADVANCE i ADAM kako je opisano u Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; i FASTA opisan u Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad Sci. 85:2444-8. Within FASTA, ktup je kontrolna opcija koja podešava osetljivost I brzinu pretrage. Ako ktup=2, slične oblasti kod dve sekvence bivaju poređene kako bi se našli parovi ostataka; ako ktup=1, jedna amino kiselina je ispitana. Ktup može biti podešen do 2 ili 1 za proteinske sekvence, ili od 1 do 6 za DNA sekvence. Podrazumeva se, da ukoliko ktup nije drugačije podešeno, da je 2 za proteine i 6 za DNA. Za dalji opis FASTA parametara, videti http://bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/fasta.1.htm1#sect2.
[0095] Procenat identičnost između dve sekvence može biti određen upotrebom tehnika koje su slične ovde navedenima, sa ili bez dozvoljenih praznina. U izračunavanju procenta identičnosti, tipična tačna podudaranja su izbrojana.
[0096] Proteini elastaze iz ovog pronalaska mogu prikazati post-translacione modifikacije, uključujući, ali ne nužno, glikosilatizaciju (odnosno, N-povezana ili O-povezana glikosilatizacija), miristilazaciju, palmitilazaciju, acetilizaciju I fosforizaciju (odnosno, serin/treonin ili tirosin). U jednom obliku, proteini elastaze iz ovog pronalaska su prikazali smanjene nivoe O-povezane glikosilatizacije i/ili N-povezane glikosilatizacije odgovarajuće endogenim proteinima elastaze. U drugim oblicima, proteini elastaze iz ovog pronalaska nisu prikazali O-povezane glikosilatizacije i/ili N-povezane glikosilatizacije.
5.1.1. SEKVENCA ZRELE ELASTAZE
[0097] Sekvence zrelih elastaza u ovom pronalasku su prvenstveno sekvence elastaza sisara, a najpoželjije su sekvence ljudske elastaze. U drugim oblicima, sekvence zrele elastaze sisara se dobijaju od ostalih sisara kao što je miš, pacov, svinja, krava ili konj.
[0098] U metodama i kompozicijama ovog pronalaska, u sekvenci zrele elastaze je prvenstveno korišćena elastaza tipa I pankreasa koja prvenstveno cepa hidrofobične sekvence proteina, prvenstveno na karboksilnoj strani malog hidrofobičnog ostatka kakav je alanin. Primeri elastaze tipa I pankreasa uključuju ljudski enzim elastaze (NCBI pristupni broj NP_001962) što je izraženo na koži I enzim elastaze I svinjskog (NCBI pristupni broj CAA27670) što je izraženo na pankreasu. SEK ID BR: I SEK ID BR: 84 su primeri sekvenci zrele ljudske elastaze tipa I.
[0099] Alternativno, elastaza tipa II koja cepa hidrofobične sekvence proteina, prvenstveno na karboksilnoj strani srednjih do velikih hidrofobičnih ostataka amino kiselina, može biti upotrebljena. Primeri elastaze tipa II uključuju ljudski enzim elastaze II A enzim (NCBI pristupni broj NP254275)I svinjski enzim elastaze tipa II (NCBI pristupni broj A26823) kako je u oba slučaja izraženo na pankreasu.
[0100] Varijante zrelog proteina elastaze iz ovog pronalaska su takođe obuhvaćene. Varijante uključuju proteine koji obuhvataju sekvence amino kiselina dovoljno identične ili dobijene iz sekvenci amino kiselina zrelog proteina elastaze iz ovog pronalaska I predstavljaju biološku aktivnost elastaze. Biološki aktivan deo zrelog proteina elastaze iz ovog pronalaska može biti protein u kome je, na primer, najmanje 150, 160, 175, 180, 185, 190, 200, 210, 220, 230, 231,232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, ili 239 amino kiselina u ravni. Štaviše, drugi biološki aktivni delovi, u kojima su drugi delovi proteina izbrisana, mogu biti pripremljeni rekombinantnim tehnikama I eventualno za jednu ili više funkkcionalnih aktivnosti izvornog oblika zrelog proteina elastaze iz ovog pronalaska.
[0101] U dodatku, zreli proteini elastaze koji obuhvataju bilo koju kombinaciju od četiri polimorfizama ljudske elastaze tipa I su predstavljeni SEQ ID broj:84. Moguće kombinacije su prikazane u navedenoj tabeli 3.
5.1.2. AKTIVACIJSKE SEKVENCE PROELASTAZE
[0102] Aktivacijska sekvenca elastaze je bilo koja sekvenca čije pomeranje od proteina proelastaze ima za rezultat biološki aktivan zreli protein elastaze.
[0103] Aktivacijske sekvence generalno sadrže susedna prepoznavajuća mesta proteaze gde se proproteini cepaju da bi proizveli zrele biološki aktivne proteine. Aktivacijska sekvenca može biti projektovana za dodavanje prepoznavajućih mesta protaaze ili elastaze ili može biti projektovana da zameni postojanje prepoznavajućeg mesta protaaze sa drugim prepoznavajućim mestima protaaze. Aktivacijski peptidi ili sekvence koji su korisni u praksi ovog pronalaska, uključuju, ali ne nužno, SEK ID BR: 23, 72 i 73. Druge aktivacijske sekvence korisne u praksi ovog pronalaska mogu biti dobijene od ostataka N-terminala 1-10 SEK ID BR:64-68.U poželjnim aspektima, aktivacijska sekvenca proelastaze je projektovana da obuhvati prepoznavajuće sekvence za tip I ili tip II elastaze. Najpoželjnije, prepoznavajuća sekvenca elastaze je prepoznata od strane zrele elastaze sa kojom je operativno povezana. Tako, u oblicima usmerenim na tip II elastaze, prepoznavajuća sekvenca je prvenstveno prepoznavajuća sekvenca elastaze tipa II. Obrnuto, u oblicima usmerenim na tip I elastaze, prepoznavajuća sekvenca je prvenstveno prepoznavajuća sekvenca elastaze tipa I. U poželjnim oblicima, prepoznavajuća sekvenca je prepoznavajuća sekvenca ljudske elastaze tipa I. Prikazane prepoznavajuće sekvence tipa I uključuju sekvencu amino kiseline SEK ID BRS: 14-16, i 18-21. Druga prepoznavajuća mesta navedena u ovom pronalasku uključuju bilo koje mesto prepoznavanja predstavljeno odgovarajućim mestom prepoznavanja SEK ID BR: 11, 12, ili 13.
5.1.3. SIGNALNE SEKVENCE
[0104] Proteini proelastaze iz ovog pronalaska mogu nadalje da sadrže signalnu sekvencu koja povećava lučenje proteina proelastaze unutar sredine ćelije domaćina u kojoj je izražena.
[0105] Osnovna signalna sekvenca proteina elastaze može biti naročito upotrebljena za izražavanje u ćeliji domaćina sisara. U drugim oblicima, osnovna signalna sekvenca proteina elastaze iz ovog pronalaska može biti uklonjena I zamenjena sa signalnom sekvencom drugog proteina, kao što je signalna sekvenca svinjske elastaze tipa I, signalna sekvenca ljudske elastaze tipa I, ili signalna sekvenca kvasaca α-faktora. U određenim specifičnim oblicima, signalni peptid kvasaca α-factora može na dalje da obuhvata (1) kvasac α-factora propeptida ili (2) kvasac α-factora propeptida ili nsekvencu odstojanja, svaki ilustrovan sekvencom amino kiseline SEK ID BRS:50 i 96 ili SEK ID BRS:51 i 97. Alternativno, sekvenca izlučivanja gp67 bakulovirusnog omotača proteina može biti upotrebljena kao heterologna signalna sekvenca (Sadašnji protokoli u molekularnoj biologiji (Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992)). Drugi primeri eukariotske heterologne signalne sekvence uključuju sekvencu izlučivanja melitina I ljudsku placentnu alkalin fosfatazu (Stratagene; La Jolla, California). U drugim primerima, korisna prokariotska heterologna signalna sekvenca uključuje phoA signal izlučivanja (Sambrook et al., supra) I signal izlučivanja proteina A (Pharmacia Biotech;Piscataway, New Jersey).
5.2 NUKLEINSKE KISELINE ELASTAZE
[0106] Jedan aspekt pronalaska se odnosi na rekombinantne nukleinske kiseline molekula kodirane proteinom elastaze iz ovog pronalaska. Kako je ovde upotrebljen termin “molekul nukleinske kiseline” ima svrhu da uključi DNA molekule (odnosno, cDNA ili genom DNA) I RNA molekule (odnosno, mRNA) I zamene DNA I RNA generisane upotrebom nukleotidnih zamena. Molekuli nukleinskih kiselina mogu biti jednostruki ili dvostruki, ali se više preferiraju dvostruki DNA.
[0107] Dati pronalazak je usmeren na nukleinske kiseline kodirane proteinom elastaze iz ovog pronalaska. Tako, u određenim oblicima, dati pronalazak prikazuje molekule nukleinskih kiselina koji obuhvataju nukleinsku sekvencu koja je kodirana proteinom proelastaze (uključujući, ali ne nužno protein bilo koje od SEK ID BRS:6-9, 64-69, 88-91, ili 98-103) koja obuhvata (i) aktivacijsku sekvencu koja obuhvata sekvencu prepoznavanja elastaze operativno povezanu sa (ii) sekvencom amino kiseline proteina koji ima aktivnost elastaze tipa I. U drugim oblicima, dati pronalazak takođe prikazuje molekul nukleinske kiseline koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je kodirana proteinom koji obuhvata (i) signalnu sekvencu operabilnu u Pichia pastoris operativno povezanu sa (ii) aktivacijskom sekvencom (uključujući, ali ne nužno, sekvence amino kiseline SEQ ID brojS: 23, 72, ili 73) koja obuhvata sekvencu prepoznavanja proteaze koja je operativno povezana sa (iii) sekvencom amino kiseline zrele ljudske elastaze tipa I.
[0108] Nukleinska kiselina iz ovog pronalaska može biti prečišćena. “Prečišćeni” molekul nukleinske kiseline, kao što je DNA molekul, može biti substancijalno oslobođen od hemijskih komponenata ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetizovan.
[0109] U instancama gde je molekul nukleinske kiseline cDNA ili RNA, odnosno, mRNA, molekul, takvi molekuli mogu da uključe poli A "rep," ili, alternativno, mogu da imaju nedostatak kakav je 3’ rep.
[0110] Molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska može biti ojačan korišćenjem cDNA, mRNA ili genoma DNA kao uzorka i pogodan oligonukleotidni početak prema standardu PCR tehnika. Tako ojačana nukleinska kiselina može biti klonirana unutar odgovarajućeg vektora sekvencne analize karakterizovane DNA-om. Štaviše, oligonukleotide koje odgovaraju celim ili delovima molekula nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu biti pripremljene standardnim tehinikama sintetizovanja odnosno korišćenjem automatskog DNA sintetizera.
5.3 REKOMBINANTNI VEKTORSKI IZRAŽAJI I ĆELIJE DOMAĆINA
[0111] Dalje su prikazani vektori koji obuhvataju bilo koju nukleinsku kiselinu iz ovog pronalaska ili ćeliju domaćina projektovanu da izrazi nukleinske kiseline iz ovog pronalaska. U specifičnim oblicima, vektori obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja reguliše izražavanje proteina kodiranog nukleinskom kiselinom iz ovog pronalaska. Na primer, nukleotidna sekvenca kodirana proteinom iz ovog pronalaska može biti operativno povezana sa metanol-induktibilnim nosiocem.
[0112] Ćelije domaćina koje obuhvataju nukleinske kiseline I vektore iz ovog pronalaska su takođe prikazane. U određenim oblicima, vektor ili nukleinska kiselina je integrisan unutar genoma ćelije domaćina; u ostalim oblicima, vektor ili nukleinska kiselina je ekstrahromozovan. Prioritetna ćelija domaćina je Pichia pastoris ćelija.
[0113] Kako je ovde upotrebljen, termin “vektor” se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban za prenos druge nukleinske kiseline sa kojom je bio povezan. Jedan tip vektora je “plazmid” koji se odnosi na kružnu dvostruku DNA petlju unutar koje dodatni DNA segmenti mogu biti smešteni. Drugi tip vektora je virusni vektor, u kojem dodatni DNA segmenti mogu biti smešteni unutar virusnog genoma. Određeni vektori su sposobni za samostalnu replikaciju u ćeliji domaćinu unutar koje se uvode (odnosno, bakterijski vektori koji imaju bakteriološko poreklo replikovanja I vektori sisara). Drugi vektori su integrisani unutar genoma ćelije domaćina na kojima su integrisani unutar ćelije domaćina I to se ponovlja sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori, su sposobni za usmeravanje izražavanja kodirajućih sekvenci sa kojima su operativno povezani. Generalno, izražavanje vektora je korisno u rekombinantnim DNA tehnikama što je češće u formi plazimida (vektora).
[0114] Rekombinantni izrazi vektora iz ovog pronalaska obuhvataju nukleotidnu sekvencu kodiranu zrelom elastazom, proelastazom ili preproelastazom iz ovog pronalaska u formi pogodnoj za izražavanje u ćeliji domaćina. Ovo znači da rekombinantni izrazi vektora uključuju jednu ili više regulatornih sekvenci, odabranih na osnovi ćelije domaćina da bi bile korišćene za izraze koji su operativno povezani sa sekvencom nukleinskih kiselina. U rekombinantnim izrazima vektora, termin “operativno povezan” ima cilj da označi da je nukleotidna sekvenca povezana sa regulatornom sekvencom (sekvencama) na način koji dozvoljava izražavanje nukleotidnih sekveci (odnosno, u in vitro transkripcijski/translacioni sistem ili u ćeliji domaćina kada je vektor predstavljen unutar ćelije domaćina). Termin regulatorna sekvenca ima za cilj da uključi nosioce, pojačivače ili druge kontrolne elemente (odnosno, poliadenilacioni signali). Regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Regulativne sekvence uključuju navedeno što usmerava konstitutivnost izražavanja nukleotidne sekvence u mnogo tipova ćelije domaćina I koje je izraz nukleotidne sekvence isključivo u određenim ćelijama domaćina ( odnosno, specifične regulatorne sekvence tkiva). Bilo bi poželjno kada bi ove veštine izražavanja vektora mogle zavisiti od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koji će biti transformisan, željeni nivo izražavanja proteina elastaze, itd. Izražavanje vektora iz ovog pronalaska može biti predstavljeno unutar ćelije domaćina ma način da se proizvedu proteini elastaze kodirani nukleinskom kiselinom kako je ovde opisano.
[0115] Rekombinantni izrazi vektora ovog pronalaska mogu biti namenjeni za izražavanje proteina elastaze ovog pronalaska u prokariotskim (odnosno, E koli) ili eukariotskim ćelijama (odnosno, ćelije insekata (korišćenje bakulovirusnih izraza vektora), ćelija kvasca ili ćelija sisara). Pogodne ćelije domaćina su razmatrane u Goeddel, supra. Alternatively, rekombinantni izrazi vektora mogu biti transkriptovani I prevedeni u in vitro, na primer, korišćenjem T7 nosioca regulatorne sekvence I T7 polimeraze.
[0116] Izražavanje proteina u prokariotama se mnogo češće sprovodi u E koli sa vektorima koji obuhvataju konstitutivne ili induktibilne nosioce koji usmeravaju izražavanje bilo koje fuzije ili ne-fuzije proteina. Vektori fuzije dodaju brojeve amino kiselina proteinima kodiranim u njima, često završecima amino kiselina rekombinantnih proteina. Takvi vektori fuzije služe u tri svrhe: 1) da povećaju izražavanje rekombinantnih proteina elastaze; 2) da povećaju rastvorljivost rekombinantnih proteina elastaze; I 3) da pomognu prečišćavanje rekombinantnih proteina elastaze. Često, u izrazima vektora fuzije, proteolitičko mesto cepanja je predstavljeno na raskrsnici polovine fuzije I rekombinantnog proteina kako bi se omogućilo odvajanje rekombinantnog proteina od sledeće sredine fuzije do prečišćavanja proteina fuzije. Tako, sredina fuzije I proteolitičko mesto cepanja zajedno mogu da deluju kao aktivacijska sekvenca, uključujući mesto prepoznavanja protaaze, za rekombinantno izražavanje proteina elastaze. Enzimi sposobni za aktivaciju takvih proteina fuzije I njihove srodne prepoznavajuće sekvence, uključuju faktor Xa, trombin i enterokinazu.Tipični izrazi vektora fuzije uključuju pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) i pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) koji otapaju glutation S-transferaza transferase (GST), maltoza E vezivni protein, ili protein A, za nalaženje rekombinantnog proteina.
[0117] Primeri pogodnih induktibilnih ne-fuzijskih E koli izaraza vektora uključuju pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69:301-315) i pET-11d (Studier et al., 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 185:60-89). Odredišni gen od pTrc vektora se oslanja na domaćina RNA polimeraze od hibridnog trp-lac nosioca fuzije. Odredišni gen od pET-11d vektora se oslanja na transkripciju od T7 gn10-lac nosioca fuzije posredstvom koizražajnog virusa RNA polimeraze (T7 gn1). Ova virusna polimeraza je oplemenjena ćeijskim stanicama BL21(DE3) ili HMS174(DE3) od rezidenta λ profaga skrivenog T7 gn1 gena pod transkripcionom kontrolom lacUV 5 nosioca.
[0118] Jedan način da se umnože rekombinantni proteini elastaze u E koli jeste da se izraze proteini u bakteriji domaćina sa oštećenim kapacitetom do proteolitičkog cepanja rekombinantnog proteina (Gottesman, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 185:119-129). Drugi način jeste da se menja sekvenca nukleinske kiseline tako da nukleinska kiselina bude ubačena unutar izraza vektora tako da su individualni kodoni svake amino kiseline prvenstveno iskorišćeni u E koli (Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res.
20:2111-2118). Takve izmene sekvenci nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska mogu biti sprovedene standardnim DNA tehnikama sinteze.
[0119] U drugim oblicima, izraz vektora je kvasac izraz vektora. Primeri vektora za izražavanje u kvascu S. cerevise ili P. pastors uključuju pYepSec1 (Baldari et al., 1987, EMBO J.6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), and pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA). Za izražavanje u kvascu, metanol-induktibilan nosilac je prvanstveno upotrebljen. Izmene sekvence nukleinske kiseline tako da nukleinska kiselina bude ubačena unutar izraza vektora tako da su individualni kodoni za svaku amino kiselinu prvenstveno iskorišćeni u P. pastoris su takođe obuhvaćeni ovde. Preciznije, kodoni SEQ ID broj:33 ili SEQ ID broj:81 mogu biti zamenjeni za kodode koji su prvenstveno iskorišćeni u P. pastoris.
[0120] Alternativno, izraz vektora je bakulovirusni izraz vektora. Bakulovirusni vektor slobodan za izražavanje proteina u kultivisanim ćelijama insekta (odnosno, Sf 9 ćelije) uključuju pAc serije (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) i the pVL serije (Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39). Drugi način jeste da se menja sekvenca nukleinske kiseline tako da nukleinska kiselina bude ubačena unutar izraza vektora tako da su individualni kodoni za svaku amino kiselinu prvenstveno iskorišćeni u ćelijama insekta.
[0121] U drugim oblicima, protein elastaze je izražen u ćelijama sisara upotrebom izraza vektora sisara. Primeri izraza vektora sisara uključuju pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329(6142):840-2) i pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195). Kada je upotrebljen u ćelijama sisara, izraz vektorske kontrolne funkcije je često predstavljen virusnim regulatornim elementima. Na primer, često korišćeni nosioci su dobijeni od polioma, Adenovirus 2, citomegalovirusa I Simian Virus 40. Za druge pogodne sisteme izražavanja za obe prokariotske I eukariotske ćelije pogledati poglavlje 16 i 17 Sambrook et al., supra.
[0122] U drugim oblicima, rekombinantni izraz vektora sisara je sposoban da usmeri izražavanje nukleinskih kiselina prvanstveno u određenim tipovima ćelije (odnosno, regulatorni elementi specifičnog tkiva su upotrebljeni da izraze nukleinsku kiselinu). Regulatorni elementi specifičnog tkiva su opisani u članku Neograničeni primeri pogodnih nosioca specifičnog tkiva uključujući nosioca belančevina (liver-specific; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), nosioce specifične limfe (Calame and Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), u određenim nosiocima T ćelijskih receptora (Winoto and Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733) and immunoglobulins (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33:741-748), nosioce specifičnih neurona (Byrne and Ruddle,1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), nosioce specifičnog pankreasa (Edlund et al., 1985, Science 230:912-916), nosioce specifičnih žlezda sisara (U.S. Patent No. 4,873,316 and European Application Publication No. EP264166). Nosioci regulisanog razvoja su takođe obuhvaćeni, na primer, nosioci miša (Kessel and Gruss, 1990, Science 249:374-379) I nosioci beta-fetoproteina (Campes and Tilghman, 1989, Genes Dev.3:537-546).
[0123] U određenim aspektima pronalaska, izraz proteina može biti povećan povećavanjem doze odgovarajućeg gena, na primer upotrebom jake kopije izraza vektora ili amplifikacijom gena. Amplifikacija gena može se postići u redukciji dihidrofolata ("dhfr-") nepotpunim CHO ćelijama genom sa dhfr genom i izlaganjem odabiru sredine sa postepenim povećanjem koncentracije metotreksata.Videti, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology Unit 16.14, (John Wiley & Sons, New York, 1996). Drugi metod za povećavanje genskog broja je multimerizacija izraza kasete (odnosno, nosilac sa sekvencom kodiranja) kodirane proteinom elastaze u prioritetnom vektoru za uvođenje vektora unutar ćelije domaćina. Metode I vektori za postizanje izraza kasete multimerizacijom su poznati/opisani u sistemimaćelija domaćina kvasca I sisara (videti, odnosno, Monaco, Methods in Biotechnology 8:Animal Cell Biotechnology, at pp. 39-348 (Humana press, 1999); Vassilevaet al., 2001, Protein Expression and Purification 21:71-80; Mansur et al., 2005, Biotechnology Letter 27(5):339-45. U dodatku, kompleti za multiplikaciju izraza gena su komercijalno dostupni. Na primer, miltiplikacija izraza Pichia-e može biti dobijena od Invitrogen (Carlsbad, California). Multimerizacija izraza kasete je predstavljena u primeru 6, ispod.
[0124] Prema tome, drugi aspekti pronalaska se odnose na ćelije domaćina unutar kojih je predstavljen rekombinantan izraz vektora iz ovog pronalaska. Termini “ćelija domaćina” i “rekombinantna ćelija domaćina” su ovde korišćeni naizmenično. Razumljivo je da takvi termini označavaju ne samo određene pojmove ćelije već I progen ili potencijalni progen takve ćelije. Iz razloga što se određene izmene mogu pojaviti u budućim generacijama tokom svakog mutiranja ili uticaja okoline, takvi progeni ne mogu, u suštini, biti identični matičnim ćelijama, ali su još uvek uključeni u okvir termina koji se ovde koriste.
[0125] Ćelija domaćina može biti bilo koja prokariotska (odnosno, E koli) ili eukariotska ćelija (odnosno, ćelije insekta, kvasca ili sisara).
[0126] Vektor DNA može biti predstavljen unutar prokariotskih ili eukariotskih ćelija pomoću konvencionalnih tehnika transformacije ili transfera. Kako su ovde upotrebljeni, termini “transformacija” I “transfer” imaju cilj da predstave raznovrsnost tehnika za predstavljanje strane nukleinske kiseline unutar ćelije domaćina, uključujući fosfat ili kalcijumhlorid, DEAE-dekstran-transfer posredovanja, lipofekciju, ili elektroporaciju. Pogodni metodi za transformaciju ili transfer ćelija domaćina može biti pronađen u Sambrook et al. (supra), i drugim labaratorijskim priručnicima.
[0127] Poznato je, za stabilan prenos ćelija sisara, u zavisnosti od izraza vektora I tehnike prenosa korišćene isključivo u malim frakcijama ćelija da može integrisati stranu DNA unutar njihovog genoma. Da bi se identifikovala i izabrala, sekvenca kodiranja za odabir pokazivača (odnosno, za rezistentnost na antibotike) je generalno predstavljena unutar duži ćelija domaćina sa otvorenim vidljivim sadržajem. Prvenstveno odabrani pokazivači uključuju pokazivače za koje se veruje da stvaraju rezistenciju na droge, kakav je G418, higromicin, zeocin and metotreksat. Stabilno prenete ćelije sa predstavljenom nukleinskom kiselinom mogu biti identifikovane odabirom droga (odnosno, ćelije koje imaju inkorporisan odabrani pokazivač sekvence kodiranja će preživeti, dok će ostale ćelije umreti).
[0128] U drugim oblicima, izrazi karakteristika sekvence kodiranja endogena elastaze unutar ćelije, ćelijske linije ili mikroorganizma mogu biti izmenjeni ubacivanjem DNA regulatornog heterolognog elementa sekvence kodiranja elastaze unutar genoma ćelije, stabilne ćelijske linije ili kloniranog mikroorganizma tako da je ubačeni regulatorni elemenat operativno povezan sa endogenima gena.
[0129] Heterologna sekvenca koja sadrži regulatorni element može biti ubačena unutar stabilne ćelijske linije ili kloniranog mikroorganizma tako da je operativno povezana sa aktivnim izrazom endogena gena elastaze, korišćenjem tehnika, kakva je ciljna homologna rekombinacija, koja je dobro poznata kao veština I opisana u Chappel, U.S. Patent No. 5,272,071; PCT publication No. WO 91/06667, published May 16, 1991. Heterologna sekvenca može na dalje da uključi signalni peptid, sekvencu cepanja i/ili aktivacijsku sekvencu iz datog pronalaska.
5.4 METODE ZA PROIZVODNJU ZRELOG PROTEINA ELASTAZE
[0130] Ćelija domaćina iz pronalaska, kakva je prokariotska ili eukariotska ćelija domaćina jedinke, može biti korišćena za proizvodnju proteina elastaze iz ovog pronalaska. Prema tome, pronalazak na dalje predstavlja metode za proizvodnju proteina elastaze iz ovog pronalaska upotrebom ćelija domaćina iz ovog pronalaska. U jednom obliku, metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina iz pronalaska (unutar kojih je predstavljen rekombinantni izraz vektora kodiran sa proteinom elastaze) u pogodnoj sredini tako da je protei elastaze proizveden. U drugim oblicima, metod na dalje obuhvata protein elastaze izolovan od sredine ili ćelije domaćina.
[0131] Dati pronalazak na dalje predstavlja metode za proizvodnju nezrelih proteina elastaze iz pronalaska koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina projektovane da izrazi nukleinsku kiselinu iz pronalaska pod uslovima u kojima je proizveden protein proelastaze. U određenim oblicima, protein preproelastaze je takođe proizveden. Dati pronalazak na dalje predstavlja metode za proizvodnju zrelih proteina elastaze iz pronalaska koji obuhvataju kultivisanje ćelije domaćina projektovanog da izrazi nukleinsku kiselinu iz pronalaska pod uslovima u kojima je proizveden protein proelastaze I podvrgavanje proteina proelastaze aktivaciskim uslovima tako da je proizveden zreli protein elastaze.
[0132] Poželjni uslovi kultivisanja za proizvodnju nezrelih I zrelih proteina iz ovog pronalaska, naročito za ćeliju domaćina Pichia pastoris, uključuju period rasta na niskoj low pH. U specifičnim oblicima, niska pH je pH 2-6, pH 2-5, pH 3-6, pH 3-5, pH 4-6, pH 3-4 ili bilo koji opseg čiji su viši ili niži limiti odabrani od bilo koje od navedenih vrednosti. Na kraju perioda kultivisanja, pH kulture može da opadne, prvenstveno do pH 7-11, najpoželjnije je do pH 8.
[0133] Gde je izraz proteina proelastaze iz ovog pronalaska pod kontrolom metanol-induktibilnog nosioca, uslovi za proizvodnju nezrelog ili zrelog proteina elastaze mogu takođe da sadrže period indukcije metanola.
[0134] Metodi proizvodnje elastaze iz ovog pronalaska mogu na dalje da obuhvataju korak obnavljanja proteina izražen ćelijom domaćina. Na određenim instancama, obnovljeni protein je proelastaza koji obuhvata aktivacijsku sekvencu. Na drugim instancama, obnovljeni protein je zrela elastaza kojoj nedostaje aktivacijska sekvenca. Pod određenim uslovima, obe proelastaze I zreli proteini elastaze su proizvedeni. Na drugim instancama, proelastaza je proizvedena.
[0135] Prvenstveno, naročito gde je poželjno zaobići auto-aktivaciju proelastaze, uslovi kultivisanja za izražavanje proelastaze obuhvataju period rasta natrijum citrata, natrijum sucinata ili natrijum acetata. U specifičnim oblicima, koncentracija oko 5-50 mM, 7.5-100 Mm, 10-150 mM, 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150mM, 75-125 mM, ili bilo koji opseg čiji su viši I niži limiti odabrani od bilo koje od upotrebljenih vrednosti. U poželjnim oblicima, koncentracija natrijum citrata, natrijum sucinata ili natrijum acetata je 90-110 mM, najpoželjnije je 100 mM.
[0136] Dodatno, naročito gde je poželjno zaobići degradaciju proteina, uslovi kultivisanja za izražavanje proelastaze obuhvataju period rasta I indukcije na nižoj temperaturi pogodnog opsega za ćeliju domaćina koja je u pitanju. Na primer, gde je ćelija domaćin Pichia pastoris ćelija domaćin, poželjan opseg je oko 22-28°C. U specifičnim oblicima, Pichia pastoris ćelija domaćin je kultivisana na temperaturi oko 28°C. Rast I indukciju ne treba izvoditi na istoj temperaturi; na primer, u obliku gde je Pichia pastoris iskorišćena kao ćelija domaćin, rast može biti izveden na 28°C dok indukcija može biti izvedena na 22°C.
[0137] Aktivacija auto-aktiviranog proteina proelastaze iz ovog pronalaska može biti inicirana dodatkom sporedne elastaze u malim (katalitičkim) količinama. Alternativno ili istovremeno, aktivacija auto-aktiviranog proteina proelastaze iz pronalaska može biti inicirana rastom pH koji obuhvata auto-aktivacijski protein proelastaze. Poželjna pH je 7-11; u specifičnim oblicima, rešenje je pH 7-10, 7-9, 8-10, 8-9, ili bilo koji opseg čiji su viši I niži limiti odabrani od navedenih vrednosti. U poželjnim oblicima, pH je 7-9, najpoželjnija 8.
[0138] U specifičnim oblicima, auto-aktivacijska proelastaza može biti podvrgnuta Tris bazi, tokom aktivacijskog koraka. U specifičnim oblicima, Tris baza je dodata koncentraciji od 5-50 mM, 7.5-100 Mm, 10-150 mM, 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM, ili bilo kom opsegu čiji su viši I niži limiti odabrani od bilo kojih od navedenih vrednosti. U poželjnim oblicima, Tris baza je dodata koncentraciji 90-110 mM, najpoželjnije 100 mM. PH Tris baze je poželjno 7-11; u specifičnim oblicima, Tris baza je pH 7-10, 7-9, 8-10, 8-9, ili bilo koji opseg čiji su viši I niži limiti odabrani od bilo kojih od navedenih vrednosti. U poželjnim oblicima, Tris baza je pH 7-9, najpoželjnije 8.
[0139] U određenim aspektima pronalaska, temperatura za autoaktivaciju elastaze je sobna temperatura, odnosno temperatura raspona od 22°C do 26°C. U određenim oblicima, korak ativacije elastaze se po mogućnosti izvodi sa proelastazom na niskoj inicijalnoj koncentarciji 0.1-0.3 mg/ml, za optimalnu tačnost reakcije cepanja I minimalnu formaciju varijanti N-terminala.
[0140] U određenim oblicima pronalaska, dodavanje katalitičkih vrednosti elastaze nije potrebno za pretvaranje autoaktivirane proelastaze u zrelu elastazu tako da proelastaza može proći autoproteolizu. U određenim oblicima, deo autoproteolize je nezavisan u koncentraciji. Bez traženja ograničenja u teoriji, veruje se da je koncentracija nezavisne autoproteolize određena auto-aktiviranom proelastaza posredstvom intramolekularnog procesa gde se molekuli proelastaze cepaju posredstvom intramolekularne reakcije. Štaviše, u drugim oblicima, aktivacija auto-aktivirane proelastaze u koncentraciji je zavisna. Bez traženja ograničenja u teoriji, veruje se da je koncentracija zavisne autoproteolize određena auto-aktiviranih proteina proelastaze posredstvom pomoću intermolekularne reakcije gde se cepa proelastaza drugom proelastazom i/ili zrelom elastazom. U još drugih oblika, određeni auto-aktivirani proproteini elastaze prikazuju kombinaciju koncentraciju zavisne I koncentraciju nezavisne aktivacije. Na tim instancama gde je auto-aktivacija koncentracije zavisna, proprotein može biti održan u više razređenoj formi kako bi se smanjila željena aktivacija. Aktivacija proproteina elastaze obuhvata cepajuće mesto propeptida elastaze SEK ID BR:55 što uključuje ali ne nužno, proprotein SEK ID BR:69 što može kontrolisati takve proproteine u razređenom obliku.
[0141] Priznaje se da određene nepoželjne varijante sekvenci N-terminala zrele elastaze mogu akumulirati u pravcu proizvodnje zrelih proteina elastaze iz ovog pronalaska. Preciznije, proteini proelastaze koji obuhvataju SEK ID BR:42 mesto cepanja propeptida elastaze koje uključuje proprotein ID broj:6 mogu proizvesti varijante sekvenci N-terminala gde je do cepanja došlo na kosti peptida tako da je C-terminal bilo kog ostataka na poziciji P3 ili P2. Štaviše, nepoželjna pojava varijanti N-terminala može biti smanjena postavljanjem određenih amino kiselina na određene lokacije u aktivacijskoj sekvenci. Na primer, kada je prolin prisutan u P2 poziciji, proizvodnja varijanti N-terminala sa jednom ili dve dodatne amino kiseline N-terminala, je smanjena ili eliminisana. Takođe, eliminiše se potreba za tipsinom za aktivaciju ostataka ili proizvodnja varijante kojoj nedostaje devet ostataka N-terminala. Dodatno, pojava nepoželjnih varijanti N-terminala može biti smanjena ili eliminisana sprovođenjem aktivacijske reakcije pod određenim uslovima.
[0142] Još preciznije, u određenim oblicima, uslovi aktivacije uključuju korak “proširene konverzije” tokom koje su varijante N-terminala proizvedene tokom inicijalnog dela preobražajne reakcije potom selektivno degradirane. Odgovarajuće vrednosti vrste proteina tokom “proširene konverzije” mogu biti praćene u stvarnom vremenu putem HICHPLC. Selektivna degradacija neželjenih varijanti N-terminala povećava procenat pune snage zrele PRT-201 u preobražajnoj reakciji I proceinat ostataka varijanti N-terminala. Za proteine proelastaze koji obuhvataju SEK ID BR:55 cepanje propeptida elastaze korakom proširene konverzije je izvršeno za 4 do 8 časova, a u najboljem slučaju za 6 časova. Za druge proteine proelastaze, korak proširene konverzije može povećati ili smanjiti procenat, u zavisnosti od procenta varijanti N-terminala koji odgovaraju zreloj (pune snage) elastazi kada, odmah nakon svega, proelastaza bude preobražena. Kada do konverzije dolazi u složenim sredinama, kakva je fermentisana smesa, period proširene konverzije može biti povećan tokom nadmetanja na aktivnom delu zrele elastaze pomoću drugih proteina I peptida u rastvoru. Alternativno, smeša zrele elastaze I varijanti N-terminala elastaze može biti obnovljena sa složenim činiocima pre koraka proširene konverzije, čime se smanjuje aktivnost mesta nadmetanja I vreme potrebno za uklanjanje vrsta varijanti N-terminala.
[0143] Kako je napred navedeno, tokom reakcije preobražaja za pro-PRT-201-55M3-003-VU, prisutna je bočna reakcija koja dovodi do proizvodnje varijanti N-terminala. U specifičnom slučaju pro-PRT-201-55M3-003-VU, ovim varijantama N-terminala nedostaju prve dve vrednosti i imaju malo ili nimalo aktivnosti elastaze. Za ostale mutirane pro-proteine postoje dodatne proizvedene varijante N-terminala, neke sa dodacima a druge sa različitim brisanjima. Otkriven je korak uklanjanja N-terminala što smanjuje varijante N-terminala na raspon od 0-2%. Otkriće koraka uklanjanja je poteklo od raznih eksperimeneta I posmatranja. Kako je prethodno navedeno, prilikom optimizacije uslova konverzije u eksperimentima sa pro-PRT-201-42 su posmatrane reakcije konverzije što je često dovodilo do veoma niskog procenta varijanti N-terminala. Kasnije je utvrđeno da su duže reakcije konverzije praćene sa zrelim PRT-201 selektivno degradirale varijante N-terminala. Otkriće sposobnosti PRT-201 da selektivno degradira varijante N-terminala pod određenim uslovima imalo je veliku korist potpomaganju proizvodnje prečišćenih PRT-201 proizvoda sa manje varijanti N-terminala. Ovaj korak uklanjanja varijanti N-terminala je implementiran unutar ogromnog proizvodnog procesa sa uspostavljenim uslovima koji mogu da dozvole konverziju PRT-201 u zreli PRT-201 I da nakon toga dozvole da PRT-201 degradira varijante N-terminala.
[0144] Reprezentativni primer takvog koraka je prikazan na slici 10 tako što je prikazano u realnom vremenu pomoću HIC-HPLC. Na, aproksimativno, 50 minuta, 100% pro-PRT-201-SSM3 je u potpunosti preobraženo u aproksimativno 86% zrelog PRT-201 i 14% varijanti N-terminala. Reakcija konverzije je bila proširena što je dozvolilo da zreli PRT-201 selektivno degradira varijante N-terminala što je dovelo do smanjenja varijanti od 14% do 2%. Sa dužom inkubacijom varijante N-terminala mogu biti selektivno degradirane do desetkovanog nivoa. Kada je nivo varijanti N-terminala dovoljno nizak, aktivnost PRT-201 je potisnuta sa natrijum citratom I with sodium citrate and reakcija se prilagođava pH do 5.0.
[0145] Kada je dobijena prečišćena zrela elastaza, aktivni enzim može biti unet unutar rastvora u kojem je protein elastaze relativno neaktivan I smešten unutar tampona za dalju hromatografiju odnosno kajone razmene hromatografijom, korake prečišćavanja. Generalno, protein elastaze može biti smešten u natrijum citrat u koncentraciji oko 5 do 25 mM i pH oko 2 do 5. U specifičnim oblicima, elastaza je smeštena u 20 mM natrijum citrata, pH 5. Frakcije su onda analizirane opciono putem jednog, više nego jednog ili svim sledećim metodama: (1) spektrofotometrom na A280 za određivanje koncenracije, (2) SDS-STRANOM za procenu čistoće, (3) aktivnim testom, odnosno, SLAP testom, za određivanje specifične aktivnosti elastaze I (4) HIC-HPLC za otkrivanje zrele elastaze I varijanti N-terminala, I frakcija sa pogodnim karakteristikama (odnosno, prihvatljiva specifična aktivnost, prihvatljivi niski nivoi (poželjno odsustvo) otkrivenih glikoformi, prihvatljivi niski nivoi (poželjno odsustvo) otkrivenih varijanti N-terminala) se objedinjuju.
[0146] Kada je dobijena prečišćena zrela elastaza, aktivni enzim može biti unet u odgovarajući rastvor za liofilizaciju. Generalno, protein elastaze može biti smešten unutar tampona 1 X slanog fosfata ("PBS") (137 mM natrijum hlorida, 10 mM nartijum fosfata, 2.7 mM kalijum fosfata pH 7.4) pre liofilizacije. U određenim oblicima, preotein elastaze može biti smešten unutar tampona od 0.1 X PBS (13.7 mM natrijum hlorida, 1.0 mM natrijum fosfata, 0.27 mM kalijum fosfata pH 7.4) pre liofilizacije.
[0147] Izrazi sekvence proelastaze mogu u nekim instancama proizvesti smešu proelastaze i zrelih proteina elastaze. Tako dati pronalazak predstavlja kompozicije koje obuhvataju oba proteina proelastaze i zreli protein elastaze.
5.5 FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE
[0148] Zreli proteini elastaze iz ovog pronalaska mogu biti inkorporisani unutar farmaceuskih kompozicija pogodnih za primenu. Takve kompozicije obučno sadrže protein elastaze I farmaceuske interne sastojke, za primer farmaceutski prihvatljivog nosioca. Kako je upotrebljen u tekstu, termin “farmaceutski prihvatljiv nosilac” ima za cilj da uključi neki ili sve rastvarače, disperzije sastoajak, premaze, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične i agense otklanjanja asorbcije i ostalo što je u skladu sa farmaceutskim propisima. Takođe su obuhvaćeni I farmakološki interni sastojci kao što su konvencionalne pomoćne supstance, vozila, punila, veziva, rastvarači I sredstva za bojenje. Upotreba takvih sastojaka I agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata. Osim ukoliko bi bilo konvencionalnih sastojaka ili agenasa koji su nekompatibilni zrelom proteinu elastaze, upotreba ovoga u kompozicijama je odobrena. Dodatna aktivna jedinjenja kogu takođe biti inkorporisana u kompozicije.
[0149] Prema tome, određeni aspekti ovog pronalaska se odnose na farmaceutske kompozicije. U specifičnim oblicima, dati pronalazak predstavlja kompozicije koje obuhvataju (i) terapeutski efektivne vrednosti zrele ljudske elastaze tipa I I (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca. Zrela ljudska elastaza tipa I koja može biti korišćena u kompozicijama uključuke, ali ne nužno, proteine SEK ID BR: 1, 4, 5, 84, 87. Zrela ljudska elastaza tipa I može da sadrži bilo koju kombinaciju polimorfizama prikazanih u navedenoj tabeli 3.
[0150] U drugim oblicima, dati pronalazak predstavlja farmaceutske kompozicije koje obuhvataju (i) terapeutski efektivne vrednosti zrele ljudske elastaze tipa I (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca koji je farmaceutska kompozicija oslobođena od tipsina ili fragmenata tipsina. U drugim oblicima, farmaceutska kompozicija je substancijalno oslobođena od tipsina ili fragmenata tipsina. Kako je ovde upotrebljen, termin “oslobođen od tipsina” podrazumeva kompoziciju u kojoj tipsin nije upotrebljen u bilo kom delu procesa proizvodnje. Kako je ovde upotrebljen, termin “ substancijalno oslobođen od tipsina” podrazumeva kompoziciju u kojoj je tipsin prisutan u finalnom proizvodu (odnosno, težina tipsina/težina kompozicije) ne više od oko 0.0025% ili više poželjno, manje od oko 0.001 % od osnovne težina/težina. Kako je ovde upotrebljena, fraza “oslobođen od” tipsina podrazumeva kompoziciju u kojoj je prisustvo neprimetno, odnosno, test enzimskog sredstva ili ELIZA.
[0151] U određenim aspektima, kompozicije iz pronalaska imaju manje tipsinske aktivnosti što je ekvivalentno 3 ng/ml od tipsina kako je izmereno BENZ testom, poželjno je manje aktivnosti tipsina tako da je ekvivalent od 2.5 ng/ml tpsina izmeren BENZ testom, pa čak više poželjno manje aktivnosti tipsina tako da je ekvivalent od 2 ng/ml tipsina izmeren BENZ testom. U određenim oblicima, dati pronalazak predstavlja kompozicije koje obuhvataju terapeutski efektivnu vrednost proteina elastaze u kome je aktivnost tipsina ekvivalentna manje od 1.6 ng/ml tipsina kako je izmereno BENZ testom. Primeri za kompoziceije elastaze sa niskom aktivnosti tipsina ekvivalenta od 1.6 ng/ml tipsina kako je izmereno BENZ testom su predstavljeni u nižem primeru 8. U određenim oblicima, In certain embodiments, ng/ml aktivnosti tipsina može biti testirano u tečnosti kompozicije ljudske elastaze tipa I ili preparatu koji sadrži 1 mg/ml proteina ljudske elastaze tipa I. Tako, aktivnost tipsina može takođe biti opisana vrednostima miligrama proteina elastaze, na primer, manje od 3 ng aktivnosti tipsina/mg proteina elastaze, manje od 1.56 ng aktivnosti tipsina/mg proteina elastaze, itd.
[0152] Dati pronalazak na dalje predstavlja kompozicije gde je svaka oslobođena ili substancijalno oslobođena od neželjenih varijanti N-terminala zrele elastaze. Neželjene varijante N-terminala uključuju, ali ne nužno, varijante proizvedene cepanjem na peptidnoj kosti tako da je C-terminal do bilo kog ostatka na pozicijama P5, P4, P3, P2, P’1, P’2, P’3, P’4, P’6, i/ili P’9. Određene neželjene varijante N-terminala su proizvedene aktivnošću tipsina; druge su proizvedene autoaktivacijom sekvence proelastaze tako da ne sadrže optimizovane aktivacijske sekvence.
[0153] U odeđenim oblicima, farmaceutske kompozicije su oslobođene ili substancijalno oslobođene jedne, više od jedne ili svih varijanti N-terminala zrele elastaze što uključuje ali ne nužno SEK ID BRS: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, 108. U određenim oblicima, dati pronalazak predstavlja farmaceutske kompozicije koje obuhvataju (i) terapeutski efektivnu vrednost zrele ljudske elastaze tipa I (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca, gde je farmaceutska kompozicija oslobođena ili substancijalno oslobođena bilo kog dela sa SEK ID BRS: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, ili 108. U drugim oblicima, farmaceutska kompozicija je substancijalno oslobođena od varijanti N-terminala zrele elastaze što uključuje ali ne nužno SEK ID BR S: 2, 3, 37, 38, 70, 71, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107, ili 108. Kako je ovde upotrebljena, fraza “oslobođen od” naročito označava kompoziciju u kojoj su varijante desetkovane, odnosno, putem razmene katjona HPLC testom,hidrofobičnom interakcijom HPLC testa ili masenim spektrometrom u kombinaciji sa tečnom hromatografijom. Kako je ovde upotrebljena, fraza “substancijalno oslobođena” označava kompoziciju gde su varijante N-terminala prisutne u finalnom proizvodu (težina varijanti N-terminala/težina cele kompozicije) najnmanje oko 0.5%. U drugim oblicima, kompozicija koja je substancijalno oslobođena od varijanti N-terminala je kompozicija gde je koncentracija varijanti N-terminala manja od oko 0.1 % ili manja od oko 0.01 % ili, još poželjnije, čak manja od oko 0.001 % na osnovu težina/težina. U određenim aspektima, prisustvo varijanti N-terminala je otkriveno razmenom katjona pomoću HPLC testa, hidrofobične interakcije HPLC testa ili or masenim spektrometrom u kombinaciji sa tečnom hromatografijom.
[0154] U određenim specifičnim oblicima, farmaceutska kompozicija koja je oslobođena varijanti N-terminala SEK ID BR:70, 71, 104 i 105 je proizvedena aktivnošću proelastaze koja ne sadrži arginin na poziciji P1 i/ili alanin na poziciji P2.
[0155] U ostalim oblicima, dati pronalazak predstavlja farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata (i) terapeutski efektivnu vrednost zrele ljudske elastaze tipa I (ii) farmaceutski prihvatljivog nosioca gde je farmaceutska kompozicija substancijalno oslobođena proteina bakterija i/ili substancijalno oslobođena od proteina sisara više nego navedena zrela ljudska elastaza tipa I. Kako je ovde upotrebljena, fraza “substancijalno oslobođena od proteina sisara” ili “substancijalno oslobođena od proteina bakterija” označava kompoziciju u kojoj su takvi proteini prisutni u finalnom proizvodu (težina proteina sisara) više nego kod elastaze I opciono nosilaca proteina kakav je belančevina ili proteini bakterije/ukupna težina kompozicije) najmanje oko 0.5%. U određenim oblicima, kompozicija koja je substancijalno oslobođena od takvih proteina je kompozicija u kojoj je koncentracija neželjenog proteina manja od oko 0.1% ili manja od oko 0.01%, ili, još poželjnije, manja čak od oko 0.001 % na osnovi težina/težina.
[0156] U određenim aspektima, farmaceutska kompozicija koja je “oslobođena od proteina sisara” (više nego elastaza) sadrži elastazu koja je proizvedena od rekombinantne ćelijske linije koja nije ćelija sisara I gde nema proteina sa sekvencom sisara ili je substancijalno sekvenca sisara prisutna u nekom delu proizvodnog procesa. U određenim aspektima, farmaceutska kompozicija koja je “oslobođena od proteina bakterija” sadrži elastazu koja je proizvedena od rekombinantne ćelijske linije koja nije ćelija bakterije I gde nema proteina sa sekvencom bakterije ili je substancijalno sekvenca bakterije prisutna u nekom delu proizvodnog procesa.
[0157] Zrele ljudske elastaze tipa I (uključujući varijante) iz ovog pronalaska su prvenstveno prečišćene za upotrebu u farmaceutskim kompozicijama. U specifičnim oblicima, elastaze su najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% čiste. U drugim specifičnim oblicima, elastaze su preko 98%, 98.5%, 99%, 99.2%, 99.5% ili 99.8% čiste.
[0158] Za formulisanje unutar farmaceutskih kompozicija, zrele ljudske elastaze tipa I iz ovog pronalaska prvenstveno imaju specifičnu aktivnost veću od 1, veću od 5, veću od 10, veću od 20, veću od 25, ili veću od 30 U/mg proteina, kako je određeno merenjem delova hidrolize malih peptid substrata Nsucinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilid (SLAP), koji je katalizovan dodatkom elastaze. Jedna jedinica aktivnosti je definisana kao vrednost elastaze koja je katalizovana hidrolizom 1 mikromola substrata po minuti na 30°C I specifična aktivnost je definisana kao aktivnost po mg proteina elastaze (U/mg). Prvenstveno, farmaceutska kompozicija obuhvata zrelu ljudsku elastazu tipa I koja ima specifičnu aktivnost u rasponu gde je niži limit 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10,15 ili 20 U/mg proteina I gde je viši limit, nezavisno, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 or 50 U/mg proteina. U prikazanim oblicima, specifična aktivnost je u rasponu od 1-40 U/mg proteina, 1-5 U/mg proteina, 2-10 U/mg proteina, 4-15 U/mg proteina, 5-30 U/mg of proteina, 10-20 U/mg of proteina, 20-40 U/mg proteina, ili bilo koji raspon čiji je viši I niži limit odabran od bilo koje od navedenih vrednosti.
[0159] Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska su prvenstveno stabilne. U specifičnim oblicima, farmaceutske kompozicije (na primer farmaceutske kompozicije pripremljene navedenom liofilizacijom) održavaju najmanje 50%, više poželjno najmanje 60%, najpoželjnije70% ove specifične aktivnosti nakon nedelje, još poželjnije nakon meseca, još poželjnije nakon 3 meseca, a najpoželjnije nakon 6 meseci čuvanja na 4°C. U specifičnim oblicima, farmaceutske kompozicije održavaju najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% ove specifične aktivnosti nakon nedelje, još poželjnije nakon meseca, još poželjnije nakon 3 meseca, a najpoželjnije nakon 6 meseci čuvanja na 4°C.
[0160] Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska su formulisane na način da budu kompatibilne planiranom načinu njihove primene. Metodi za primenu elastaze u lečenju ili prevenciji bolesti bioloških kanala su opisani u WO 2001/21574; WO 2004/073504; i WO 2006/036804. Najpoželjniji način primene je parenteralni, na primer, usmeravanje primene na zidove sudova, uključujući lokalnu primenu na vanjskim površinama hirurški izloženih sudova I lokalna primena na zidovima sudova korišćenjem terapijskog katetera. Rešenja korišćena za parenteralnu primenu mogu uključiti sledeće komponente: sterilne rastvarače kao što je voda za ubrizgavanje, rastvori, fosfatni slani rastvori, šećeri kao što je saharoza ili dektrans, fiksna ulja, polietilen, glikoli, glicerin, propilen glikol, polisorbat-80 (takođe poznat kao između-80), ili drugi sintetički rastvarači; antibakterijski agensi kao što je metil paraben; antioksidansi kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfat; hepatni agensi kao što su etilenenediaminettraacetinska kiselina; tamponi poput fosfata ili sredstava za prilagođavanje tonicitetu kao što su natrijum hlorid ili dekstros. PH se može prilagođavati sa kiselinama ili bazama, kao što je solna kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralna priprema može biti zatvorena u ampulama, špricevima za jednokratnu ili višekratnu upotrebu, razne bočice napravljene od stakla ili plastike. Parenteralna priprema može takođe biti zatvorena kao terapijski kateter. U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna.
[0161] U specifičnim oblicima, farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska je tečna formulacija koja obuhvata jedno ili više od sledećih pomoćnih sredstava: dekstroza (2-10% w/v); laktoza ( 2-10% w/v); manitol (2-10% w/v);sukroza ( 2-10% w/v); trehaloza (2-10% w/v); askorbinska kisela (2-10 mM); kalcijum hlorid (4-20 mM); dekstran-70 ( 2-10% w/v); poloksamer 188 (0.2-1% w/v); polisorbat-80 (0.001-5% w/v, više poželjno 0.1-5%); glicerin (0.2-5% w/v); arginin (2-10% w/v); glicin (2-10% w/v); dekstran-44 (2-10% w/v); i dekstran-18 (2-10% w/v).U određenim oblicima, koncentracija, pojedinačno ili grupno, dekstroze, laktoze, manitola, sukroze, trehaloze, dekstrana-70, glicerina, arginina, glicina, dekstrana-44 ili dekstrana-18 je u rasponu čiji je niži limit.5, 4, 5, ili 7% w/v I čiji je viši limit, nezavisno, 4, 5, 6, 8, ili 10% w/v.
[0162] Tečne formulacije mogu biti napravljene dodavanjem vode suvim formulacijama koje sadrže zreli protein elastaze. jedan ili više tampon reagens i/ili jedno ili više pomoćnih sredstava. Suve formulacije mogu biti napravljene liofilizacijom rastvora koji obuhvata zreli protein elastaze, jedan ili više tampon reagens i/ili jedno ili više pomoćnih sredstava.
[0163] Tečne formulacije mogu biti napravljene, na primer, ponovnom liofilizacijom proteina elastaze ovog pronalaska sa sa sterilisanom vodom ili tampon rastvorom. Primeri tampon rastvora uključuju sterilne rastvore fiziološkog rastvora ili fosfatne tampon rastvore. U specifičnim oblicima, nakon ponovljene suve formulacije koja obuhvata zreli protein elastaze do željene koncentracije proteina, rastvor sadrži aproksimativno 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum fosfata,10 mM natrijum fosfata (fosfat tampon rastvor je koncentracije kako je predviđeno 1X) i pH rastvora aproksimativno 7.4. U određenim oblicima, suva formulacija koja obuhvata zrele proteine elastaze takođe obuhvata natrijum, hlorid, fosfatne jone u vrednostima kakve su vodi potrebne za rekonstituciju.
[0164] Tečna formulacija može takođe biti napravljena, na primer, ponovnom liofilizacijom proteina elastaze sa tampon rastvorom koji obuhvata jedno ili više pomoćnih sredstava. Primeri za pomoćna sredstva uključuju polisorbat-80 I dekstran. U specifičnim oblicima, nakon ponovljene suve formulacije koja obuhvata zreli protein elastaze do željene koncentracije proteina, dobijeni rastvor sadrži aproksimativno 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum fosfata, 10 mM natrijum fosfata, 0.01% polisorbata-80, i pH rastvora je aproksimativno 7.4. Jedno ili više pomoćnih sredstava može biti pomešano sa zrelim proteinom elastaze pre liofilizacije ili nakon liofilizacije ali pre rekonstitucije. Tako, u određenim aspektima, suva formulacija obuhvata zreli protein elastaze takođe obuhvata pomoćna sredstva kao što je polisorbat -80 ili dekstran.
[0165] U određenim aspektima, dati pronalazak predstavlja tečne formulacije koje obuhvataju: 0.001-50 mg/ml zrelog proteina elastaze u rastvoru od 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum fosfata, 10 mM natrijum fosfata I sadrže 5-10%, više poželjno 6-9%, pomoćnih sredstava odabranih od dekstroze, laktoze, manitola, sukroze, trehaloze,dekstrana-70, glicerina, arginina, glicina, dekstrana-44 ili dekstrana-18.
[0166] U specifičnim oblicima, dati pronalazak prikazuje tečnu formulaciju koja obuhvata: 001-50 mg/ml zrelog proteina elastaze u rastvoru od 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum fosfata, 10 mM natrijum fosfata sa pH od 7.4.
[0167] U drugim specifičnim oblicima, dati pronalazak prikazuje tečnu formulaciju koja obuhvata: 001-50 mg/ml zrelog proteina elastaze u rastvoru od 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum fosfata, 10 mM natrijum fosfata I obuhvata 0.01% polisorbata-80, sa pH od 7.4.
[0168] U drugim specifičnim oblicima, dati pronalazak prikazuje tečnu formulaciju koja obuhvata: 001-50 mg/ml zrelog proteina elastaze u rastvoru od 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum fosfata, 10 mM natrijum fosfata I obuhvata 0.01% polisorbata-80 I 8% dekstrana-18, sa pH od 7.4.
[0169] U drugim specifičnim oblicima, dati pronalazak prikazuje tečnu formulaciju koja obuhvata: 001-50 mg/ml zrelog proteina elastaze u rastvoru od 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum fosfata, 10 mM natrijum fosfata I obuhvata 8% dekstrana-18, sa pH od 7.4.
[0170] Tečna formulacija iz ovog pronalaska prvenstveno obuhvata finalnu koncentraciju zrelih proteina elastaze u rasponu u kojoj je niži limit 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 15 ili 20 mg/ml I u kojoj je viši limit, nezavisno, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, ili 1500 mg/ml.
[0171] U određenim aspektima, dati pronalazak predstavlja likvidnu formulaciju koja obuhvata: 0.0001-500 mg/ml (više poželjno1-100 mg/ml, I čak više poželjno 0.5-20 mg/ml) zrelog proteina elastaze u rastvoru 0.5X PBS-1.5X PBS (više poželjno 1X PBS), rastvor sadrži 5-10% (više poželjno 6-9%) pomoćnih sredstava odabranih od dekstroze, laktoze, manitola, sukroze, trehaloze, dekstrana-70, glicerina, arginina, glicina, dekstrana-44 ili dekstran-18 I ima pH od 6.5 -8.5. U specifičnim oblicima, tečna formulacija sadrži 0.5 mg/ml proteina zrele elastaze I 8% dekstrana-188 u 1X PBS, pH 7.4. U specifičnim oblicima, tečna formulacija sadrži 5 mg/ml proteina zrele elastaze I 8% dekstrana-188 u 1X PBS, pH 7.4.
[0172] Tečna formulacija iz ovog pronalaska prvenstveno ima jačinu u rasponu u kojem je niži limit 100,125, 150, 175, 200, 250 ili 275 mOsm/kg I u kojem je viši limit, nezavisno, 500, 450, 400, 350, 325, 300, 275 ili 250 mOsm/kg. U specifičnim oblicima, jačina tečne formulacije prvenstveno ima jačinu aproksimativno 125 do 500 mOsm/kg, više poželjno aproksimativno 275 do 325 mOsm/kg, na primer kako je izmereno metodom depresije tačke smrzavanja.
[0173] Posebno je ponovljena formulacije perenteralnih kompozicija, kakva je kompozicija napravljena unutar tečne formulacije iz ovog pronalaska u formi dozne jedinice radi lakše primene I ujednačenosti doze. Forma dozne jedinice kako je ovde upotrebljena se odnosi na fizički odvojene jedinice pogodne za subjekte koji se leče; svaka jedinica obuhvata predodređenu količinu zrelog proteina elastaze od koje se očekuje da proizvede željeni terapeutski efekat u saradnji sa potrebnim farmaceutskim nosiocem.
[0174] Kako je definisano ovde, terapeutski efektivna vrednost zrelog proteina elastaze (na dalje, efektivna doza) je u rasponu od oko 0.0033 mg - 200 mg. Za zidove sudova manjeg prečnika I tanjih zidova kakvi su ovi I radiocefaličnoj arteriovenusnoj fistuli, smanjene doze (kao što su 0.0033 mg - 2.0 mg) su poželjnije. Za zidove većeg prečnika I debljih zidova kakva je butna arterija, veće doze (kakve su 2.05 - 100 mg) su poželjne.
[0175] U određenim oblicima, farmaceutske kompozicije mogu biti spakovane u kontejnere, pakovanja, dozatore ili katetere. U ostalim oblicima, farmaceutske kompozicije mogu biti spakovane u kontejnere, pakovanja, dozatore ili katetere zajedno sa uputstvima za upotrebu.Uputstva za upotrebu mogu biti u štampanoj formi bilo u okviru sa ili na kontejnerima, pakovanjima, dozatorima ili kateterima. Alternativno, uputstva za upotrebu mogu biti uključena bilo u okviru sa ili na kontejnerima, pakovanjima, dozatorima ili kateterima u formi koja podrazumeva drugi štampani ili internet materijal koji predstavlja instrukcije.
[0176] U određenim oblicima, farmaceutske kompozicije mogu biti spakovane u kontejnere, pakovanja, dozatore ili katetere. U ostalim oblicima, farmaceutske kompozicije mogu biti spakovane u kontejnere, pakovanja, dozatore ili katetere zajedno sa uputstvima za upotrebu.Uputstva za upotrebu mogu biti u štampanoj formi bilo u okviru sa ili na kontejnerima, pakovanjima, dozatorima ili kateterima. Alternativno, uputstva za upotrebu mogu biti uključena bilo u okviru sa ili na kontejnerima, pakovanjima, dozatorima ili kateterima u formi koja podrazumeva drugi štampani ili internet materijal koji predstavlja instrukcije.
[0177] Pronalazak uključuje metode za pripremu farmaceutskih kompozicija. Kada je zrela elastaza proizvedena prema opisu iz pronalaska, ona može biti liofilizirana I smeštena sve dok se ne obnovi unutar farmaceutske kompozicije pogodne za primenu. U prikazanim oblicima, dati pronalazak predstavlja metod izolacije liofilizovane zrele ljudske elastaze tipa I koji sadrži: (a) kultivisanu ćeliju domaćina kakva je Pichia pastoris ćelija domaćina, projektovana da izrazi molekul nukleinske kiseline kodiran proelastazom sa otvorenim vidljivim sadržajem pod uslovima u kojima je izražen vidljivi otvoreni sadržaj I gde navedeni vidljivi otvoreni sadržaj obuhvata nukleotidnu sekvencu kodiranu u 5’ do 3’ pravcu (i) signalni peptid operabilan u Pichia pastoris; (ii) aktivacijsku sekvencu koja obuhvata prepoznavajuću sekvencu elastaze; I (iii) sekvencu zrelog proteina elastaze tipa I koji je proizveden proteinom proelastaze; (b) izlaganje proteina proelastaze aktivaciskim uslovima koji proizvodi zreli protein elastaze tipa I, u kojima autoaktivacijski uslovi uključuju, na primer: (i) menjanje pH rastvora koji sadrži protein proelastaze, odnosno, do pH od 6.5-11, poželjno 8-9; ili (ii) prečišćavanje proteina proelastaze, na primer, pomoću jons razmenjenih hromatografijom, I izlaganje rastvora produženoj konverziji za uklanjanje varijanti N-terminala, čime se proizvodi zrela ljudska elastaza tipa I; (c) opciono, prečišćavanje zrele ljudske elastaze tipa I, odnosno, joni razmenjeni hromatografijom u koraku poliranjem hromatografijom; i (d) liofilizacija zrele elastaze tipa I čime se proizvodi izolovani liofilizirana zrela ljudska elastaza tipa I. Zrela elastaza tipa I je prvenstveno ljudska elastaza tipa I. U određenim aspektima, liofilizirana zrela elastaza tipa I je prvenstveno više od 95% čista; u specifičnim oblicima, liofilizirana zrela elastaza tipa I je više od 98% ili više od 99% pure.
[0178] Zreli proteini elastaze iz ovog pronalaska mogu biti formulisani unutar farmaceuskih kompozicija. Tako, u prikazanim oblicima, dati pronalazak predstavlja metod generisanja farmaceutskih kompozicija koji obuhvata zrelu ljudsku elastazu tipa I, navedeni metod obuhvata (i) izlovanu liofilizirana isolating zrela ljudska elastaza tipa putem metoda koji je napred opisan (odnosno, u odeljku 5.4); i (ii) obnovljenu liofiliziranu zrelu ljudsku elastazu tipa I u farmaceutski prihvatljivom nosiocu.
5.6 EFEKTIVNE DOZE
[0179] Dati pronalazak generanlo predstavlja korisnost parenteralne, prvenstveno lokalne, upotrebe rekombinantnih proteina elastaze, samostalno ili u kombinaciji sa drugim agensima, u lečenju ili prevenciji bolesti bioloških kanala.
[0180] U određenim oblicima, kao alternativa parenteralnoj primeni, oralna primena agenasa u lečenju ili prevenciji bolesti bioloških kanala može biti upotrebljena.
[0181] Toksičnost i terapeutska efikasnost proteina elastaze korišćenih u primeni metoda ovog pronalaska mogu biti određeni standardnim farmaceutskim procedurama u ćeliji kulture ili eksperimentalnih životinja, odnosno, za određivanje LD50 (smrtonosna doza za 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski efektivna u 50% populacije). Racionalna doza između toksina I terapeutskih efekata je terapeuski indeks I to može biti izraženo kao racionalni LD50/ED50. Takve informacije mogu biti upotrebljene za precizno određivanje korisnih doza kod ljudi.
5.7 METODE PRIMENE
[0182] Pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje obuhvataju nove proteine elastaze i metode njihove upotrebe za prevenciju ili lečenje bolesti bioloških kanala. Takve farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane konvencionalnim načinom kakav je opisan u navedenom odeljku 5.5.
[0183] Kompozicije elastaze datog pronalaska mogu biti primenjene u željenim segmentima biološkog kanala koji je lečen uređajem poznatim kao jedna od veština koji je prihvatljiv za dobijanje rastvora za zid arterije ili vene, odnosno, špric, upotreba lekova pomoću katetera, upotreba lekova pomoću igle, upotreba lekova pomoću implanta polimera, kakva je mikrosferna priprema, implantiran kateter ili polimer-obložen vaskularni stent, po mogućnosti samošireći stent.
[0184] U određenim oblicima, primena na željenom segmentu može biti rukovođena direktnom vizualizacijom, ultrazvukom, CT-om, floroskopskim smernicama, MRI-om ili endoskopskim smernicama.
[0185] U određenim aspektima datog pronalaska, primena elastaze na biološke kanale obuhvata primenu tečne formulacije elastaze direktno na spoljnju površinu hirurški izložene arterije ili vene. U specifičnim aspektima datog pronalaska, primena je sprovedena sa špricem.
[0186] U određenim aspektima datog pronalaska, primena elastaze na biološki kanal obuhvata lokalizovanje aparata u blizini segmenta biološkog kanala koji se leči. U nekim oblicima, tokom nastanka proteina elastaze pomoću aparata, deo aparata može biti ubačen unutar zida biološkog kanala. U nekim oblicima, lumen biološkog kanala može da izvrši pritisak dok se ne proizvede protein elataze pod pritiskom segmenta biološkog kanala od strane člana koji se sam širi a koji je deo katetera ili uređaja. U nekim oblicima, protein elastaze je proveden a pritisak dolazi od samog uredjaja. U nekim delovima biološki kanal je hirurški izložen I protein elastaze dolazi u lumen ili je upotrebljen na spoljnu površinu biološkog kanala in vivo. U oblicima koji uključuju luminalnu dopremu, krvotok kroz komoru može biti zaustavljen spojnicom ili dozvoliti elastazi da stupi u kontakt sa zidom komore za duži vremenski period da bi zaustavili inhibiciju elastaze serumom. U nekim oblicima, biološki kanal je hirurški otklonjen I elastaza dolazi do luminalne površine i/ili spoljne površine kanala in vitro. Lečeni kanal se onda u nekim oblicima može vratiti u telo.
[0187] U drugom aspektu današnjeg pronalaska, primena elastaze u biološki kanal povlači za sobom upotrebu polimer formulacije koja se koristi kao proteza u komori koja se leči, spojnica ili traka koja se primenjuje na spoljnu površinu biološkog kanala ili omotač za komoru koja se leči ili drugi uredjaj u, oko ili blizu komore koja se leči.
[0188] U drugačijem aspektu današnjeg pronalaska, elastaza je punkturno ubrizgana direktno u zid arterije ili vene ili u tkiva koje je okružuju da bi proširila odredjeni segment komore. U oblicima koji se fokusiraju na lečenje srčanih komora, protein elastaze se može dostaviti punkturno oko srca ili direktno ubrizgana u hirurški izložene koronarne komore.
[0189] Medicinski uredjaji koji se mogu koristiti da bi dostavili proteine elastaze pronalaska u krvne sudove su opisani u delu 5.9 ispod.
5.8 SETOVI
[0190] Danasnji pronalazak uključuje opremu za vežbanje metoda ovog pronalaska. "Terapeutska" oprema obuhvata jedan ili vise kutija jedne ili više supstanci jer herein je koristan u lečenju ili prevenciji zaraze u biološkom kanalu, koja može da ide zajedno sa bilo kojom supstancom koja olakšava njihovo sprovođenje. Alternativna oprema ovog pronalaska, "proizvođačka" oprema sadrži jednu ili više kutija sa jednom ili više supstanci hereina koji je koristan u kreiranju autentičnih proteina elastaze.
[0191] Terapeutska oprema može sadržati dodatne komponente korisne za primenu metoda ovog pronalaska. Na primer, terapeutska oprema može sadržati farmaceutske nosioce koji su korisni za formulaciju supstanci. Terapeutska oprema takođe može sadržati uredjaj ili komponentu uredjaja za obavljanje terapeutskih metoda ovog pronalaska, na primer špriceve ili igle. Uključivanje uredjaja kao što su intramuralnih ili perivaskularnih katetera za ubrizgavanja ili intraluminalnih katetera za ubrizgavanje je takođe uključeno u terapeutsku opremu. U odredjenim oblicima, supstance pronalaska mogu biti u vidu doznih jedinica. U dodatku ili kao alternativa pronalasku, oprema pronalaska može pružiti instrukcijski materijal koji opisuje performanse jednog ili više metoda pronalaska ili obaveštenju prepisanom od strane vladine agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju. Instrukcijski materijali mogu biti u štampanoj formi u ili iznad kutija opreme. Alternativno, instrukcijski materijal se može nalaziti u ili iznad kutija u obliku reference za štampani ili dokument dostupan na internetu koji omogućuje instrukcijske materijale.
[0192] U specifičnim oblicima, oprema pronalaska sadrži medicinski uredjaj koji je opisan u delu 5.9 ispod.
[0193] Proizvodjačka oprema pronalaska nekad može sadržati dodatne komponente koje su korisne za primenu metoda pronalaska.
5.9 MEDICINSKI UREDJAJI KORISNI ZA PRIMENU PROTEINA ELASTAZE
[0194] Ovde su navedeni medicinski uredjaji koji se mogu koristiti za primenu elastaze proteina ovog pronalaska u biološkom kanalu kao što su arterija ili vena. Takvi uredjaji su opisani ispod i u privremenoj aplikaciji broj 61/025,084, podnetoj 31 Januara 2008, privremenoj aplikaciji broj 61/025,463, podnetoj 1 Februara 2008, i privremenoj aplikaciji broj 61/075,710 podnetoj 25 Juna 2008.
[0195] Elastaze proteina ovog pronalaska se takodje mogu primeniti u biološkim kanalima kroz konvencionalne katetere.
[0196] U jednom obliku, medicinski uredjaj koji je koristan za primenu proteina elastaze ima centralnu uzdužnu osu i sadrži jedan ili više pokretača gde jedan ili više pokretača mogu postojati u ograničenoj konfiguraciji gde dužina jednog ili više pokretača je orijentisana paralelno sa dužinskom osom tog medicinskog uredjaja I neograničenoj configuraciji gde bar jedan deo dužine jednog ili više pokretača je orijentisan neparalelno prema centralnoj dužinskoj osi uredjaja. Pošto je uredjaj pozicioniran na željeno mesto u dodiru sa zidom biološkog kanala, jedan ili više pokretača (ako je potrebno I svi pokretači) mogu biti oslobodjeni iz ograničene konfiguracije sa mogućnošću da poprime I neograničenu i tako ostvare kontakt sa zidom biološkog kanala. Jedan ili više pokretača mogu biti bilo kog oblika i u željenim oblicima, kretnja jednog ili više pokretača iz ograničene konfiguracije u neograničenu se javlja prilikom puštanja ograničene sile od strane operatora uredjaja ali bez inputa deformacionih snaga od strane operatora ka uredjaju ili izabranom tkivu.
[0197] U prvom specifičnom obliku koji je prikazan na slici 22, uredjaj je kateter 10 za provod tečnosti ograničen jednim ili sa više pokretača koji su formirani kao par izduženih gredica 12, 14, srednjih regiona koji se mogu kretati izmedju ograničene konfiguracije koja je orijentisana paralelno sa centralnom dužinskom osom 15 kateterske konstrukcije I neograničene konfiguracije gde barem jedan par gredica je orijentisan neparalelno pomenutoj centralnoj dužinskoj osi (pogledati leve L I desne R doze dužina gredica na slici 23). Jedna ili više gredica 12, 14 mogu biti napravljene kao izdužena lanca ili žice od kojih svaka ima suprotne proksimalne I distalne krajeve. U željenom obliku, gredice imaju ravne suprotne unutrašnje površine 24, 26 I ravno suprotne spoljne površine 28, 30 koje su okrenute jedna prema drugoj. U ovom obliku, gredice 12, 14 mogu da prenose izmedju ograničenih I neograničenih pozicija kao što je prikazano na slici 22 I 23. U jednom obliku, par gredica je pozicioniran tako da su naslonjene jedna na drugu u njihovim ograničenim konfiguracijama kao što je prikazano na slici 22.
[0198] Kateter 10 dalje obuhvata jedan ili više penetratora tkiva 16, 18 obezbedjenih za jednu ili više površina jedne ili više gredica 12, 14, centralna komponenta katetera 20 sa produženom dužinom I spoljna komponenta katetera 22 koja može zaštititi penetratora tkiva ili penetratore tokom pomeranja katetera u biološkom kanalu.
[0199] Penetratori tkiva 16, 18 mogu biti napravljeni od bilo kog odgovarajućeg materijala. Primeri takvih materijala koji se preferiraju sadže, ali ne moraju, nikl, aluminijum, čelik I legure. U specifičnom obliku, penetratori tkiva su napravljeni od nitinola.
[0200] Centralna komponenta katetera 20 i spoljna komponenta katetera 22 mogu biti napravljene od materijala koji su obično sadržani u pravljenju katetera. Primeri takvih materijala sadrže , ali nisu obavezni, silicone I poliretan, najlon, Dacron i PEBAX™.
[0201] Pokretači su najčešće napravljeni od fleksibilnog, otpornog materijala, U preferiranom obliku, fleksibilni, otporni material može biti ograničen prilikom aplikacije ograničavajuće sile, npr kada su pokretači u ograničenoj konfiguraciji pa se usvaja njihov ogirinalni neograničeni oblik kada se ukloni sila koja ih ograničava ili kada su pokretači u neograničenoj konfiguraciji. Svaki takav fleksibilan I otporan material se može koristiti uključujući hirurški čelik, aluminijum, polipropilen, olefinski material, polietan I drugih sintetičkih guma ili plastike. Jedan ili više pokretača su najčešće napravljeni u obliku memorijskog materijala, Primeri takvih oblika memorijskog materijala sadrže , ali to nije neophodno, bakarne-cink-aluminijum I nikal legure, bakar-alumninikalne legure, I nikal-titanijumske (NiTI) legure. U željenom obliku, oblik memorijskog materijala je nitinol. U željenom obliku kada par gredica prisvoji neograničenu konfiguraciju, oblik memorijskih karakteristika od materijala od kog je svaka gredica formirana jer one bez aplikacije bilo koje spoljne deformacione sile, spuštaju se radijalno daleko jedni od drugih u jednoj ravni kao što je prikazano na slici 23.
[0202] Jedna ili više gredica (po mogućnosti svaka od njih) ima fleksibilan dovod tečnosti u kanal 32,34 koji se pruža dužinom gredice ili unutar gredice kao sto je prikazano na slici 24. Kako se gredice 12 I 14 pomeraju od njihovih pravih, ograničenih konfiguracija prema njihovim spuštenim, neograničenim konfiguracijama, dostavljač tečnosti kanalu 32, 34 su odvojene cevi koje su obezbedjene dužinom gredica 12, 14 koji su njihovi parovi. U drugom obliku, kanali za dostavljanje tečnosti su kanali pretvoreni ili formirani u material od gredica.
[0203] Jedna ili više gredica (po mogućnosti svaka od gredica 12,14) je takodje formirana uz pomoć prugastog zatvarača 36,38 koji se pruža duž gredice (Slika 24). Prugasti zatvarači 36,38 su formirani od istog materijala kao gredice 12, 14 ili materiala koji se savija sa gredicama 12,14.
[0204] Jedan ili više penetratora tkiva 16, 18 je pričvršćen za spoljne površine 28,30 paru gredica 12, 14 (Slika 24). Penetratori tkiva 16,18 su povezani I u dodiru su sa kanalom za dovod tečnosti 32, 34 koji se proteže duž gredica 12, 14. Penetratori tkiva 16, 18 su pozicionirati da projektuju vertikalan položaj od spoljnih površina 28, 30 od gredica 12, 14. Penetratori tkiva 16, 18 imaju šuplje unutrašnje rupe koje su u dodiru sa kanalima za dovod tečnosti 32, 34 od gredica. Distalni krajevi od penetratora tkiva imaju portove za dovod tečnosti koji su u dodiru sa unutrašnjim rupama penetratora tkiva.
[0205] Uredjaj dozvoljava dovod tečnosti u ili kroz jednu ili više različitih slojeva zida biološkog kanala, npr vaskularnog zida. Vaskularni zid obuhvata brojne strukture I slojeve uključujući endotelni sloj I osnovni sloj membrane, unutrašnji elastični list, srednji sloj I adventicijalni sloj. Ovi slojevi su uredjeni tako što endotel je izložen listu suda I osnovne membrane, unutrašnjem elastičnom listu, posredniku I adventitia su slojeviti preko endotela kao što je opisano u U.S. Pat. App. Publication No. 2006/0189941A1. Sa medicinskim uredjajima ovog pronalaska, dubina do koje penetratori tkiva 16, 18 se mogu probiti je odredjena dužinom svakog penetratora tkiva 16, 18. Na primer, ako je ciljani sloj adventitial sloj, penetratori tkiva 16,18 će imati DEFMED dužinu dovoljnu za penetraciju do dubine adventitial sloja pošto je razvoj uredjaja iskorišten. Takodje ako je ciljani sloj posredni, penetratori tkiva 16, 18 imaju definisanu dužinu dovoljnu za penetraciju do dubine posrednog sloja pošto je razvoj uredjaja iskorišten.
[0206] U specifičnom obliku, dužina penetratora tkiva 16, 18 može biti od 0.3 mm do 5 mm za vaskularne aplikacije ili do 20 ili 30 mm za aplikacije koje uključuju druge biološke praznine ili kanale, npr aplikacije kod debelog creva. Penetratori tkiva 16, 18 imaju dijametar od 0.2 mm (kalibar 33) do 3.4 mm (kalibar 10), ali prednost imaju oni od 0.2 mm do 1.3 mm (kalibar od 33 do 21). Distalni vrhovi penetratora tkiva mogu imati standardni nagib, mali nagib ili skroz mali nagib. U alternativnom obliku, penetratori tkiva su pričvršćeni za gredice koje nisu identične dužine ali mogu biti konfigurisani tako da njihovi distalni krajevi se ravnaju kako bi bili na jednakom odstojanju od zida biološkog kanala kada je medicinski uredjaj u neograničenoj poziciji, npr prilikom upotrebe.
[0207] Centralna komponenta katetera 20 ima produženu dužinu sa obrnutim proksimalnim I distalnim krajevima što je prikazano levo I desno na slici 22. U jednom obliku, centralna komponenta katetera 20 ima cilindričnu spoljnu površinu koja se pruža preko produžene dužine. Proksimalni krajevi gredica 12, 14 su povezani, npr zalemljeni ili zalepljeni za distalne krajeve centralne komponente katetera 20, dok distalni krajevi gredica 12, 14 su povezani, zalemljeni ili zalepljeni za vodeći vrh katetera 40. Vrh 40 ima glatku spoljnu površinu koja je dizajnirana da se lako kreće u biološkom kanalu. Glavna žičana rupa 48 se pruža kroz dužinu centralnog katetera 20 I vrha 40. Glavna žičana rupa je postavljena da prima glavnu žicu u klizećem uključivanju kroz rupu.
[0208] Par lumena 44, 46 za dovod tečnosti se pružaju kroz unutrašnjost centralne komponente katetera 20 celom dužinom kateterske komponente (Slika 25). Na distalnom kraju centralne komponente katetera 20 par lumena za dovod tečnosti 44,46 dolazi u dodir sa parom kanalima za dovod tečnosti 32, 34 koji se pružaju dužinom gredica 12, 14 do penetratora tkiva 16, 18. Glavna žičana rupa 48 se takodje produžava kroz unutrašnjost centralne komponente katetera 20 od proksimalnog do distalnog kraja (Slika 25). Proksimalni kraj centralne komponente katetera 20 je omogućen od strane para Luer čvorišta 50, 52 (Slika 22). U jednom obliku, svako Luer čvorište 50, 52 je u dodiru sa jednim of lumena za dostavu tečnosti 44, 46, šireći se dužinom centralnog katetera. Svako Luer čvorište 50, 52 je napravljeno da bude povezano sa izvorom za dostavu tečnosti da bi svaki od čvorišta imao priliv tečnosti kroz svaki lumen za dovod tečnosti 44, 46 koji se širi kroz centralni kateter komponente 20 a onda kroz svaki kanal za priliv tečnosti 32, 34 šireći se dužinom parova gredica 12, 14 I onda kroz penetratore tkiva 16, 18 koji su obezbedjeni za svaki par gredica. U drugom obliku, svako Luer čvorište nezavisno komunicira sa oba lumena za priliv tečnosti 44, 46, šireći se dužinom komponente centralnog katetera. U ovoj konfiguraciji, prva tečnost može biti dostavljena kroz prvi Luer čvor za oba penetratora tkiva 16, 18 a druga tečnost može biti dostavljena kroz drugi Luer čvor do oba penetratora tkiva 16, 18. Priliv tečnosti ka oba penetratora tkiva iz svakog Luer čvorišta se može postići putem nezavisnog kanala koji se pruža od svakog Luer čvorišta do distalnog zajedničkog rezervoara 61 kao što je prikazano na slici 32. Rezervoar je u dodiru sa oba penetratora tkiva 16, 18. Alternativno, u drugom obliku, medicinski uredjaj instant pronalaska obuhvata samo jedno Lueb čvorište koje je povezano sa jednim lumenom za priliv tečnosti koje se pruža kroz centralni kateter koji je onda povezan sa distalnim zajedničkim rezervoarom, dozvoljavajući priliv jedne tečnosti za oba penetratora tkiva 16, 18.
[0209] Spoljni kateter komponenta 22 ima cevastu konfiguraciju koja okružuje par gredica 12, 14 I većinu centralnog katetera 20 (Slika 22). Komponenta katetera 22 ima izduženu dužinu koja se širi izmedju suprotnih proksimalnih I distalnih završetaka komponente katetera koja je prikazana levo I desno na slici 22. Distalni završetak komponente katetera je dimenzioniran da se uključi u sigurnom uključenju sa vodećim vrhom 40 gde spoljna površina se spaja sa spoljnom površinom komponentom katetera 22 kada je distalni završetak komponente katetera je u dodiru sa vrhom. Cevasta konfiguracija komponente katetera 22 je dimenzionirana tako da unutrašnja površina rasporedjena izvan mnoštva penetratora tkiva 16, 18 na par gredica 12, 14 u pozicijama obuhvaćenim sa parom gredica. Proksimalni završetak centralnog katetera 20 se širi preko proksimalnog završetka komponente katetera 22 kada se distalni završetak komponente katetera stupi u dodir sa vodećim vrhom 40 katetera.
[0210] Mehanička konekcija 54 je obezbedjena izmedju spoljnog proksimalnog završetka katetera komponente 22 I centralnog katetera komponente 20 proksimalnog kraja koju omogućava da se spoljna komponenta katetera pomera sa zadnjom stranom duž para gredica 12, 14 I centralnog katetera komponente 20 prouzrokujući spoljnu komponentu katetera 22 I njen distalni završetak da se odvoje od vodećeg vrha 40 I predaju par gredica 12, 14, napred preko dužine centralnog katetera komponente 20 I preko dužina parova gredica 12, 14 da bi pokrenuli spoljni kateter komponentu 22 I njen distalni završetak sa vrhom 40 (Slika 22). Mehanička konekcija 54 se može obezbediti ručicom ili dugmetom koje ručno gura spoljni kateter komponente 22 preko centralnog katetera komponente 20. Konekcija 54 se takodje može obezbediti potenciometrom ili prekidačem. Dodatno, konekcija 54 može biti obezbedjena zvučnim ili dodirnim indikatorom (npr klikom) inkremetalne kretnje od spoljnog katetera komponente 22 koja je povezana na centralni kateter komponente 20.
[0211] U jednom obliku, spoljni kateter komponente 22 je obezbedjen sa jednim rajfešlusom 56 koji se pruža celom dužinom jedne strane spoljnog katetera komponente 22 na unutrašnju površinu spoljneg katetera komponente (Slika 24). Rajfešlus 56 u unutrašnjosti spoljnjeg katetera komponente 22 se uključuje u klizećem kontaktu sa trakama rajfešlusa 36, 38 na jednoj strain od svakih gredica 12, 14. Napredujući spoljni kateter komponente 22 dužinom centralnog katetera komponente 20 I para gredica 12, 14 prema vodećem vrhu 40 konstrukcije katetera prouzrokuje traku rajfešlusa 56 od spoljnog katetera komponente da klizi preko traka 36, 38 id parova gredica 12, 14. Ovo pomera par gredica 12, 14 od njihove spuštene, neograničene konfiguracije prikazane na slici 23 prema njihovim suprotnim stranama, ograničene konfiguracije prikazane na slici 22. Dodir traka gredica 36, 38 u traci rajfešlusa 56 od eksternog katetera komponente 22 drži par gredica 12, 14 u njihovom suprotno povezanim pozicijama prikazanim na slici 22. Sa spoljnim kateterom komponente 22 koji je pomeren unapred preko centralnog katetera komponente 20 I para gredica 12, 14 tamo gde se distalni završetak spoljnjeg katetera komponente 22 dodiruje sa vodećim vrhom 40, penetratori tkiva 16, 18 su pokriveni I konstrukcija katetera ovog pronalaska se moze slobodno pomeriti napred ili nazad u biološkom kanalu. Spoljni kateter komponenta 22 prekriva penetratore tkiva 16, 18 projektovane iz para gredica 12, 14 I kontakta sa spoljnim kateterom komponente 22 sa distalnim vodećim vrhom 40 omogućuje konstrukciji katetera glatku spoljnu površinu koja olakšava umetanje konstrukcije katetera u I kroz biološki kanal kao što su krvni sudovi. U drugom obliku, eksterni kateter komponente 22 je obezbedjen sa dve trake rajfešlusa na 180 stepeni jedne od druge koje se pružaki celom dužinom eksternog katetera komponente 22 na unutrašnju površinu tako da gredice imaju trake na obe strane.
[0212] Vodeća žica 58 se koristi sa konstrukcijom katetera (Slika 22). Vodeća žica se prostire kroz centralnu komponentu katetera žičanom rupom 48, dužinom gredica 12, 14 I kroz otvor vodećeg vrha 42. U odredjenim oblicima vodeća žica 58 ima čvrsto jezgro npr. od nerđajućeg čelika ili superelastičnog nitinola. Vodeća žica može biti napravljena od materijala koji blokira rendgenske zrake bilo u celini ili u njenim distalnim delovima (npr. distalna dužine 1 mm do 25mm ili najduže od 3mm do 10mm). Vodeća žica 48 može opcijalno biti obložena sa medicinski neaktivnim oblogama kao što je TEFLON®.
[0213] U upotrebi ovog uredjaja, vodeća žica 58 je pozicionirana u biološkom kanalu metodama koje su dobro poznate u umetnošću. Vodeća žica 58 se prostire od biološkog kanala, kroz otvor vodeće žice 42 u vrhu 40 kateterske konstrukcije kroz spoljni zaštitni kateter 22 pored penetratora tkiva 16, 18 I kroz vodeće žičane rupe 48 od centralnog katetera 20. U drugim oblicima, konstrukcija katetera je brza razmena konstrukcije gde vodeća žica lumena je prisutna u distalnim završecima od vodećeg vrha 40 od katetera ali se ne širi kroz celu dužinu medicinskog uredjaja.
[0214] Posle pozicioniranja vodeće žice, uredjaj je unapredjen u biološki kanal kroz vodeću žicu 58 koja je pozicionirana ranije. Jedan ili više markera otpornih na rendgen mogu biti na uredjaju kako bi pratili poziciju uredjaja u biološkom kanalu. Bilo koji material koji sprečava prolaz elegromagnetske radijacije se smatra otpornim na rendgen i stoga se može koristiti. Najbolji materijali koji su otporni na rendgen sadrže platinu, zlato ili srebro I mogu biti omotani na površini svih delova vrha 40, na svim delovima krivih 12, 14 I drugih pokretača na vodećoj žici 58 ili na nekoj kombinaciji od navedenih struktura. Alternativno, pristen materijala otpornih na rendgen zrake mogu se pričvrstiti na vrh 40. Uredjaj moze biti opcijalno opremljen sa slikanjem kartica kao što su intravaskularni ultrazvuk ili optička koherentnost topografije. Vrh uredjaja može biti dodatno opremljen sa optikom koja se koristi u odredjivanju pozicije uredjaja ili karakteristika bioloških kanala koji ga okružuju.
[0215] Kada je uredjaj na željenom položaju u biološkom kanalu, operator koristi mehaničku konekciju 54 da povuče spoljnu katetersku komponentu 22 od vodećeg vrha 40. U željenom obliku, gde se spoljni kateter komponente 22 povlači preko penetratora tkiva 16, 18, trake rajfešlusa 56 od spoljog katetera komponente 22 se povlače preko traka 36, 38 od parova gredica 12, 14. Ovo kretanje oslobadja par gredica 12, 14 iz njenih ograničenih suprotnih konfiguracija prikazanih na slici 22 I dozvoljava obliku memorijskog materijala gredica 12, 14 da prisvoje njihovu neograničenu spuštenu konfiguraciju prikazanu na slici 23. Kako se gredice 12, 14 pomeraju do njihovih neograničenih I spuštenih konfiguracija, gredice dolaze u kontakt sa unutrašnjom površinom zida ili zidova biološkog kanala I penetratora tkiva 16, 18 na spoljnim površinama 28, 30 od gredica 12, 14 koji su pritisnuti na unutrašnju površinu biološkog kanala na poziciji uredjaja.
[0216] Nakon što su penetratori tkiva 16, 18 ubačeni u željeni spoj zida biološkog kanala, fluid može biti sproveden kroz fluidne lumene 44, 46 u centralnoj komponenti katetera 20, kroz fluidne kanale 32, 34 na paru krivih 12, 14 I kroz penetratore tkiva 16, 18. Kada je priliv tečnosti završen operator koristi mehaničku konekciju 54 da bi pomerio spoljni kateter komponente 22 (koji isto može služiti kao zaštitna komponenta) napred preko centralnog katetera komponente 20 I preko para krivih 12, 14 prema glavnom vrhu 40. Kako eksterni kateter komponente 22 se pomera unapered preko para krivih 12, 14 traka rajfešlusa 56 na unutrašnjem delu spoljnog katetera komponente 22 prelazi preko traka 36, 38 na paru krivih 12, 14 prouzrokujući da krive 12, 14 izađu iz njihove neograničene, spuštene konfiguracije nazad u njihovu ogreničenu konfiguraciju. Kada se spoljnji kateter komponente 22 potpuno prebaci preko para krivih 12, 14 I ponovo dođe u dodir sa glavnim vrhom 40 traka rajfešlusa 56 u spoljnom kateteru komponente 22 drži krive 12, 14 u njihovoj ograničenoj konfiguraciji. Onda se uređaj može podesiti za oslobađanje na drugoj lokaciji u biološkom kanalu, drugom biološkom kanalu ili se povući iz tela.
[0217] Oblik i dužina krivih 12, 14 su izabrani tako da razni oblici uređaja se mogu koristiti u biološkim prazninama ili kanalima raznih veličina I dijametara. U određenim oblicima, krive mogu biti ravne ili okrugle. Ravne krive najčešće imaju uzak razmak od 0,2 mm do 20 mm a njihova visina je u razmaku od 0,2 do 5 mm, a njihova dužina je razmaka od 10 do 200 mm a to zavisi od određene aplikacije. Okrugle krive najčešće imaju dimenzije koje se kreću od 0,2 do 20 mm, dužinu od 10 do 200 mm koja zavisi od određene aplikacije. U specifičnim oblicima, ravne krive su od 3,5 do 5 mm, 5 mm do 10 mm, 10 mm do 15 mm, 15 mm do 20 mm u širini, ili bilo koji raspon od (odnosno, 3.5 mm do 10 mm); 3.5 mm do 5 mm, 5 mm do 10 mm. 10 mm do 15 mm, 15 mm do 20 mm u visini, ili bilo koji raspon od (odnosno, 3.5 mm do 10 mm); and 10 mm do 20 mm, 20 mm do 40 mm, 40 mm do 80 mm, 80 mm do 120 mm, 120 mm do 150 mm ili 150 do 200 mm u dužini, ili bilo koji raspon od (odnosno, 10 mm do 40 mm), ili bilo koja permutacija gore navedenog (odnosno, širina 5 mm do 10 mm, visina ili 3.5 do 5 mm, I dužina 20 do 40 mm). U drugim oblicima, okrugle krive su 3.5 mm do 5 mm, 5 mm do 10 mm, 10 mm do 15 mm, 15 mm do 20 mm u razmeri, ili bilo koji raspon (odnosno, 3.5 mm do 10 mm) i 10 mm do 20 mm, 20 mm do 40 mm, 40 mm do 80 mm, 80 mm do 120 mm, 120 mm do 150 mm ili 150 do 200 mm u dužini, , ili bilo koji raspon od (odnosno, 10 mm do 40 mm), ili bilo koja permutacija gore navedenog (odnosno, razmera od 5 mm do 10 mm i dužine od 20 do 40 mm).
[0218] U drugom specifičnom obliku, prikazanog na slici 27, uređaj iz datog pronalaska je dovod tečnosti kateteru 110 koji sadrži centralnu komponentu katetera 112 koji ima izduženu dužinu sa uzdužnom osom 113, jednim ili više (poželjno dva) fleksibilna, otporna pokretača koji u ovom specifičnom obliku su formirani kao penetratori tkiva predstavljenih cevi 114, 116 koje se protežu od ditalnog dela od centralnog katetera komponente 112. Barem jedan deo tkiva predstavljenih cevi 114, 116 se može pomerati između ograničene konfiguracije koja je paralelna sa centralnom uzdužnom osom 113 konstrukcije katetera I neograničene konfiguracije koja nije paralelna sa centralnom uzdužnom osom 113 tog katetera.
[0219] Na dalje kateter obuhvata jedan ili više (poželjno dva ) fleksibilna I izdužena penetratora tkiva 118, 120 koji se pružaju kroz dva penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 I spoljno povlačenje cevi 122 koje se širi preko dužina centralnog katetera komponente 122, penetratora tkiva 114, 116 I srednje trake 132.
[0220] Centralni kateter komponenta 112 I spoljna implementaciona tuba 122 mogu biti napravljeni od bilo kojih materijala koji su odgovarajući za pravljenje katetera. Primeri takvih materijala uključuju, ali nije obavezno, silicon, poliretan, najlon, Dacron I PEBAX™.
[0221] Penetrari tkiva 118, 120 se povezuju za odgovarajuća čvorišta 166. 168 (Slika 31). Jedan ili vise parova penetratora tkiva 118, 120 imaju raspon od 0.2mm (veličina 33) do 3.4mm (veličina 10), a najpoželjnije je da budu od 0.8mm do 1.3mm (od veličine 18 do 21). Jedan ili vise parova penetratora tkiva može imati standardni nagib, kratki nagib ili mnogo kratki nagib. Par penetratora tkiva 118, 120 su najčešće napravljeni od materijala koji im dozvoljavaju da se savijaju preko njihovih dužina. Primeri takvih materijala sadrže, ali to nije neophodno, nikal, aluminijum, čelik I legure navedenih materijala. U specifičnom obliku, penetratori tkiva su napravljeni od nitinola. Puna dužina penetratora tkiva 118, 120 može biti napravljena od jednog materijala ili distalnih krajeva ( od distalnog 1mm do distalnih 20mm), uključujući vrhove 156, 158 od penetratora tkiva 118, 120 može biti napravljen od jednog materijala koji je povezan za vrhove 166, 168 kroz cevčicu napravljenu od drugačijeg materijala, npr. plastike.
[0222] Jedan ili vise parova penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 je napravljen najčešće od fleksibilnog I otpornog materijala. Takav fleksibilan I otporan material se može deformisati kada se penetrator tkiva predstavljenih cevi 114, 116 su u pravoj, ograničenoj konfiguraciji slike 27 ali se vraćaju originalnom obliku kada se sila deformacije otkloni, npr kada su penetratori tkiva predstavljenih cevi 114, 116 u krivoj, neograničenoj konfiguraciji prikazanoj na slici 28. Bilo koji takav fleksibilan I otporan material se može koristiti, uključujući I hirurški čelik, aluminijum, polipropilen, poliretan ili druga sintetička vlakna ili plastični materijal. Primeri takvih oblika memorijskog materijala uključuju, ali nisu obavezni, legure bakra, cinka, aluminijuma I nikla, bakrene-aluminijumske-nikl legure I legure niklatitanijuma. U željenom obliku, oblik memorijskog materijala je nitinol.
[0223] Centralni kateter komponenta 112 ima fleksibilnu izduženu dužinu sa suprotnim proksimalnim 124 I distalnim 126 završetak (Slika 27). Distalni završetak 126 centralnog katetera komponente je napravljen kao glavni vrh koji ima spoljno oblikovanu konfiguraciju koja će voditi distalni završetak 126 kroz bioloski kanal. Glavna žičana rupa 128 u srednjoj traci 132 se širi kroz sredinu centralnog katetera 112 iz proksimalnog završetka 124 prema distalnom završetku 126. Glavna žičana rupa poprima fleksibilnu, produženu glavnu žicu 130 za klizeću kretnju rupe 128 preko žice (slika 29). Glavna žica 130 se koristi da vodi konstrukciju katetera kroz biološki kanal. U odredjenim oblicima glavna žica 130 ima čvrsto jezgro od nerdjajućeg čelika ili superelastičnog nitinola. Glavna žica može opcionalno biti napravljena od materijala koji je otporan na rendgenske zrake ili u celini ili u distalnim delovima. Glavna žica 130 može po mogućnosti biti obložena sa medicinski inertnom oblogom kao što je TEFLON@. U drugim oblicima, konstrukcija katetera je konstrukcija katetera brze razmene gde je glavna žica postavljena na distalne završetke od vodećeg vrha 126 koja se odatle širi.
[0224] Uska srednja traka 132 okružuje glavnu žičanu rupu 128 šireći se preko glavnog vrha katetera distalnog završetka 126 prema kateteru proksimalnog završetka 124. Srednja traka 132 povezuje glavni vrh 126 za osnovni deo 138 od centralne komponente katetera.
[0225] Centralna komponenta katetera sa osnovnim delom 138 ima cilindričnu spoljnu površinu koja se pruža preko cele dužine osnovnog dela. Osnovni deo 138 se pruža preko većine ukupnih dužina centralnog katetera komponente osnovnog dela 138. Dodatno, par penetratora tkiva lumena 140, 142 se takodje širi kroz dužinu centralnog katetera komponente osnovnog dela 138 sa glavnom žičanom rupom 128. Na proksimalnom završetku 124 od centralnog katetera komponente, par otvora 144, 146 dolazi u dodir sa parom lumena 140, 142 sa spoljnim delom centralnog katetera komponente 112 (Slika 27).
[0226] U alternativnom obliku, medicinski uredjaj sa slike 27 može takodje sadržati jednog fleksibilnog I otpornog pokretača koji je formiran kao penetrator tkiva predstavljene cevi, jedan fleksibilan, izduženi penetrator tkiva koji se pruža preko delova dužina centralnog katetera komponente, penetratora tkiva predstavljene cevi I srednje trake.
[0227] Par od prvog I drugog penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 idu od centralnog katetera komponente osnovnog dela 138 prema kateteru distalnog završetka 126. Svaki od penetratora tkiva predstavljenih cevi je formiran kao uska, izdužena cev koja ima proksimalni završetak koji je sproveden do centralnog katetera komponente osnovnog dela 138, I suprotnog distalnog završetka 148, 150. Svaki od prvog I drugog penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 ima unutrašnje rupe 152, 154 koje su u dodiru sa prvim penetratorom tkiva lumen 140 I drugim penetratorom tkiva lumen 142 u centralnom kateteru komponente osnovnog dela 138.
[0228] Kao što je I prikazano na slikama 29 i 30, spoljna konfiguracija penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 su povezane sa srednjom trakom 132 tako da dužina penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 može biti postavljena jedna pored druge na suprotnim stranama srednje trake 132. Penetrator tkiva cevi distalnog završetka 148, 150 može biti formiran kao glavni vrh površina koji takodje olakšava prolaz od katetera kroz vaskularni sistem. Penetratori tkiva distalnih završetaka 148, 150 su duži u razmeri nego penetratori tkiva predstavljenih cevi 114, 116. U specifičom obliku, penetrator tkiva cevi distalnih vrhova 148, 150 su okrugli I loptasti. Takvi vrhovi nisu štetni I cevi neće nehotice bušiti zid biološkog kanala. Vrhovi 148, 150 su izloženi I ne šire se preko razmera vodećeg vrha 126.
[0229] Svaki od penetratora tkiva cevi 114, 116 je napravljen od memorijskog materijala koji se može oblikovati kao što je nitinol. Cevi 114, 116 su formirane sa zakrivljenim, neograničenim konfiguracijama koje su prikazane na slici 28 kada neograničavajuća sila je primenjena prema cevima. Da bi predstavljene cevi 114, 116 ležale pravo, ograničene konfiguracije preko srednje trake 132, ograničavajuća sila mora biti primenjna na cevi da bi ih zadržala u njihovim pravim, ograničenim pozicijama prikazane na slici 27. Kako se svaka od cevi 114, 116 pomera iz prave, ograničene konfiguracije prikazane na slici 28 prema njihovim zakrivljenim, neograničenim konfiguracijama prikazanim na slici 28, penetratori tkiva rupa 152 I 154 se šire kroz cevi I takodje se pomeraju iz pravih konfiguracija u zakrivljene konfiguracije.
[0230] Par penetratora tkiva 118, 120, od njihovih distalnih vrhova do čvorišta 166, 168 imaju dužine koje su malo duže nego kombinovane dužine penetratora tkiva lumena 140, 142 koje se pružaju kroz penetrator tkiva predstavljenih cevi 114, 116. Vrhovi 156, 158 penetratora tkiva 118, 120 su pozicionirani do distalnih završetaka 148, 150 od penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 I pozicionirane su u rupama 152, 154 cevi u ograničenoj konfiguraciji kao na slici 27. Suprotni, proksimalni žavršeci penetratora tkiva 118, 120 odlaze kroz otvore 144, 146 sa strane centralnog katetera 112. Par penetratora tkiva 118, 120 su dimenzionirane da bi lagano klizile kroz penetratore tkiva lumena 140, 142 od centralnog katetera komponente 112 I penetratora tkiva rupa 152, 154 od penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116. Otvori sa strane 144, 146 od centralnog katetera komponente 112 su najčešće na 20 do 90 stepeni uglova do centralnog katetera proksimalnog završetka 124, najčešće od 30 do 60 stepeni uglova do centralnog katetera proksimalnog završetka 124.
[0231] Par manualnih kretanja operatora ka linearnoj kretnji kontrolora 162, 164 se može povezati na proksimalni završetak od penetratora tkiva 118, 120 I može se sprovesti do centralnog katetera otvora 144, 146 (Slika 31). Kontrolori 162, 164 mogu biti napravljeni da pretvore kretnju operatora u kontrolisanu linearnu kretnu penetratora tkiva 118, 120 kroz centralni kateter tkiva lumena 140, 142 I kroz penetrator tkiva predstavljenih rupa cevi 152, 154. U jednom obliku postoje rotirajući kontrolori 162, 164 koji mogu biti pomerani ručno u jednom pravcu kao što se penetratori tkiva injekcionih vrhova 156, 158 na distalnom završetku penetratora tkiva se može pozicionirati da bi proširilo željenu dužinu iz penetratora tkiva rupa cevi 152, 154 na penetratoru tkiva cevi distalnim završecima 148, 150. Rotirajući kontrolore u suprotnim smerovima, penetratori tkiva 118, 120 se mogu uvući nazad u penetratore tkiva rupe cevi 152, 154. Svaki od operatora kretnje prema linearnim pokretnim kontrolorima 162, 164 može sadržati čvorište 166, 168 koja su u dodiru sa unutrašnjom rupom koja se prostire kroz penetratore tkiva 118, 120 I može se koristiti da poveže špriceve ili cevi sadržavajući rešenje dijagnoze ili terapeutske supstance.
[0232] Spoljna cev za razvijanje 122 ima cevastu dužinu koja okružuje centralni katetera 122, penetratore tkiva predstavljenjih cevi 114, 116 I srednje trake 132. Cev za razvijanje 122 se može podići na centralni kateter komponentu 112 I par penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 da bi klizile napred u poziciju cevi za razvijanje 122 gde otvoreni distalni završetak 172 je pozicioniran do distalnih završetaka 148, 150 od penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 kao što je predstavljeno na slici 27 I stražnji položaj cevi za razvijanje 122 gde je distalni završetak cevi 172 pozicioniran do veze sa penetratorom tkiva predstavljenih cevi 114, 116 sa centralnim kateterom komponente 112 kao sto je prikazano na slici 28. Suprotni proksimalni završeci 174 od cevi za razvijanje 122 mogu biti opremljeni mehaničkom konekcijom 176 do centralnog katetera 112. Mehanička konekcija 176 omogućava cevi za razvijanje 122 da se pomera izmedju prednjih I zadnjih pozicija koje su u vezi sa centralnim kateterom 112 I penetratorima tkiva predstavljenih cevi 114, 116 (Slike 27 I 28). Takva konekcija bi mogla biti omogućena potenciometrom, klizećom konekcijom, prekidačem ili dugmetom ili nekom drugom konekcijom koja je operativna ručno da bi naterali cev za razvijanje da se pomera u vezi sa centralnim kateterom 112 I predstavljenim cevima 114, 116. Kada se cev za razvijanje pomeri u poziciju ispred prikazanoj na slici 27, distalni završetak cevi 172 predaje dužine penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 I pomera predstavljene cevi prema njihovim ograničenim pozicijama pružajući se kroz suprotne strane centralnog katetera srednje trake 132. Kada se cev za razvijanje pomeri u stražnju poziciju prikazanoj na slici 28, distalni završetak 172 cevi za razvijanje je uvučen iz dužine penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 I postepeno dozvoljava predstavljenim cevima 114, 116 da oslobode njihovu ograničenu energiju I krenu ka njihovim zakrivljenim, neograničenim konfiguracijama prikazanim na slici 28.
[0233] U upotrebi katetera 110, cev za razvijanje 122 je u prednjoj poziciji prikazanoj na slici 27. Glavna žica 130 je pozicionirana u biološkom kanalu (kao što je arterija ili vena) na poznat način. Kateter se onda pomera u biološki kanal preko glavne žice. Glavna žica 130 se pruža od biološkog kanala I ulazi u centralni kateter komponente distalnog završetka 126 kroz glavnu žicu lumen 128. Žica 130 prolazi kroz dužinu centralnog katetera 112 I spaja se proksimalnim završetkom od centralnog katetera komponente do kateterskih otvora 144, 146 gde vodeća žica 130 može biti ručno manipulisana.
[0234] Kateter 110 se može pomeriti kroz biološki kanal I može biti vođen glavnom žicom 130. Radiopaque marker mogu biti dodatno obezbedjeni na konstrukciji da nadgledaju poziciju konstrukcije u biološkom kanalu. Bilo koji materijal koji sprečava prolaz elektromagnetske radijacije se smatra radiopaque I može se koristiti. Korisni radiopaque materijali sadrže ali nisu obavezni, platinu, zlato I srebro. Radiopaque materijal može biti obložen na površini svih delova vrha 126, na svim delovima predstavljenih cevi 114, 116, na svim delovima penetratora tkiva 118, 120, na glavnoj žici 130 ili bilo kojim kombinacijama nabrojanih struktura. Alternativno, prsten radiopaque materijala se može pričvrstiti na vrh 126. Konstrukcija može biti dodatno opremljena sa slikanjem kartica kao što su unutarvaskularni ultrazvuk ili optičko koherentna tomografija. Vrh konstrukcije može biti dodatno opremljen sa optikom koja je korisna za odredjivanje pozicije konstrukcije ili karakteristika biološkog kanala koji je okružuje. Kada je konstrukcija na željenoj poziciji, spoljna cev za ratvijanje 122 se može pomeriti iz njene prednje pozicije prikazane na slici 27 prema stražnjoj poziciji prikazanoj na slici 28 manualnim korištenjem mehaničke konekcije 176.
[0235] Kako je cev za razvijanje 122 povučena od para penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 ograničena energija od penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 je oslobodjena I cevi se kreću napred prema njihovim neograničenim, zakrivljenim konstrukcijama prikazanim na slici 28. Ovo kretanje postavlja rupe penetratora tkiva 152, 154 na njene distalne završetke 148, 150 prema unutrašnjoj površini biološkog kanala u koju je konstrukcija 110 ubačena.
[0236] Kretanje operatora do linearnog kretanja kontrolora 162, 164 može biti uradjena ručno da bi se proširili distalni krajevi penetratora tkiva 156, 158 od rupa penetratora tkiva 152, 154 kod penetratora tkiva predstavljenih cevi distalnih krajeva 148, 150. Veličina se može obezbediti na svaku kretnju operatora do linearnog kretanja kontrolora 162, 164 koje omogućava vizualnu indikaciju opsega projekcije penetratora tkiva vrhova 156, 158 od penetratora tkiva I krajeva cevi 148, 150 I kontrolora 162, 164 su rotirane. Kontrolori takodje obezbedjuju zvuk ili taktični osećaj kao sto je kliktanje da bi ukazali na inkrementalne korake udaljenosti od kretanja penetratora tkiva. Ovo razmešta vrhove penetratore tkiva 156, 158 na željenu udaljenost u zidove biološkog kanala.
[0237] U trećem specifičnom obliku, medicinski uredjaj ovog pronalaska je kateter za priliv tečnosti koji sadrži jedan ili vice penetratora tkiva koji su napravljeni od fleksibilnog, otpornog materijala. U odredjenim aspektima, medicinski uredjaj ovog pronalaska ima centralnu uzdužnu osu, obuhvata jedan ili vise penetratora tkiva gde jedan ili vise penetratora tkiva može postojati u ograničenoj konfiguraciji u kojoj dužina jednog ili vise penetratora tkiva je paralelna uzdužnoj osi od pomenutog medicinskog uredjaja I neograničene konfiguracije u kojoj bar jedan deo dužine pomenutih penetratora tkiva nije paralelan sa uzdužnom osom uredjaja. Pošto je uredjaj pozicioniran na željeno mesto do zida biološkog kanala jedan ili vise penetratora tkiva (ili ako je potrebno svi penetratori tkiva) mogu biti oslobodjeni iz ograničene konfiguracije sa mogućnošću da usvoje neograničenu konfiguraciju I uspostave dodir sa zidom biološkog kanala. Jedan ili vise penetratora tkiva može biti bilo kog oblika, kretanje jednog ili vise penetratora tkiva iz ograničene u neograničenu konfiguraciju se dogadja posle ispuštanja ograničavajuće sile od strane operatora uredjajem ali bez ikakvog unosa od strane operator ili nekih deformišućih sila na uredjaj ili ciljano tkivo.
[0238] U željenom obliku, penetratori tkiva su napravljeni od fleksibilnog I otpornog materijala koji može da bude ograničen posle aplikacije ograničavajuće sile npr kada su penetratori tkiva u ograničenoj konfiguraciji te usvoje njihovu originalnu neograničeni oblik kada je ograničavajuća sila uklonjena, npr kada su penetratori tkiva u neograničenoj konfiguraciji. Bilo koji takav fleksibilan, otporan materijal se može koristiti, koji sadrži hirurški čelik, aluminijum, polipropilen, poliretan ili druga sintetička vlakna ili plastični materijal. Jedan ili vise penetratora tkiva su najčešće napravljeni od oblikovanog memorijskog materijala čiji primeri uključuju bakar-cink-aluminijum-nikal legure, bakaraluminijum-nikal legure I nikal-titanijum legure. U željenom obliku, oblikovani memorijski materijal je nitinol. U željenom obliku, kada penetratori tkiva poprime neograničenu konfiguraciju, karakteristike oblika memorije materijala od kojeg je napravljen penetrator tkiva prouzrokuju da penetratori tkiva, bez aplikacije bilo kakvih spoljnih deformišućih sila, da se pomere sa pozicije paralelne uzdužnoj osi medicinskog uredjaja u poziciju okomitu uzdužnoj osi medicinskog uredjaja.
[0239] U željenom obliku, penetratori tkiva su održani u ograničenoj konfiguraciji od strane spoljnog katetera komponente sa cevastom konfiguracijom koja okružuje penetratore tkiva. Mehanička konekcija je obezbedjena izmedju eksternog katetera komponente I centralnog katetera komponente na koji su penetratori tkiva povezani. Mehanička konekcija omogućava spoljnu katetersku komponentu da se pomera dužinom centralnog katetera komponente I otkriva ograničen jedan ili vise penetratora tkiva I dozvoljavajući im da poprime neograničenu konfiguraciju gde stupaju u kontakt sa željenim mestom dostave. Jedna od prosečnih veština u umetnosti bi cenila da ovaj specifični oblik može biti brzo prilagodjena povezanim radiopaque markerima da olakšaju pozicioniranje uredjaja ili opcija brze razmene da bi se olakšala upotreba uredjaja.
[0240] Medicinski uredjaj ovog pronalaska u njegovim različitim oblicima omogućava dostavu tečnosti u udaljene slojeve vaskularnog zida. Vaskularni zid sadrži mnoge strukture I slojeve, uključujući endotelijalni sloj I osnovni sloj membrane, unutrašnju elastičnu opnu, srednji sloj I adventijalni sloj. Ovi slojevi su uredjeni tako da je endotelijum izložen lumenu suda I osnovi membrane, unutrašnje elastične opne, posrednika I adventija su svaki uspešno prekriveni preko endotelijuma kao što je objašnjeno u U.S. Pat. App. Publication No. 2006/0189941A1. Sa medicinskom uredjajem ovog pronalaska, dubina do koje vrhovi penetratora tkiva 156, 158 mogu da ulaze u ciljano tkivo mogu se kontrolisati rotacijom kontrolora 162, 164. Npr, ako ciljani omotač je adventijalni, ograničena energija cevi 114, 116 je oslobodjena, cevi prisvajaju njihovu neograničenu, iskrivljenu konfiguraciju prikazanu na slici 28 I vrhovi penetratora tkiva 156, 158 su pomereni sa kontrolorima do dužine dovoljne za penetraciju do dubine adventijalnog omotača. Isto tako, ako je ciljani omotač srednji omotač, ograničena energija cevi 114, 116 je oslobodjena, cevi prisvajaju njihovu neograničenu, iskrivljenu konfiguraciju prikazanu na slici 28 I vrhovi penetratora tkiva 156, 158 se pomeraju sa kontrolorima do dužine dovoljne za penetraciju u dubini srednjeg omotača.
[0241] Pošto su penetratori tkiva ugradjeni u željeni omotač zida biološkog kanala, onda tečnost može biti dostavljena kroz penetratore tkiva 118, 120. Kada je dostava tečnosti završena, kontrolori 162, 164 se mogu koristiti da izvuku vrhove penetratora tkiva 156, 158 nazad u unutrašnje rupe 152, 154 od penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116. Cev za razvijanje 122 se onda može pomeriti napred gde distalni kraj cevi za razvijanje 172 pomera penetratora tkiva predstavljenih cevi 114, 116 nazad u njihovu ograničenu poziciju prikazanu na slici 27. Kada je cev za razvijanje 122 pomerena skroz ispred u poziciju predstavljenu na slici 27, konstrucija se može premestiti ili izvući iz tela.
[0242] Medicinski uredjaj instantnog pronalaska takodje dozvoljava priliv tečnosti pločastim ležištima unutar zida biološkog kanala.
[0243] Medicinski uredjaj instantnog pronalaska takodje dozvoljava protok tečnosti do izvanstraničnih praznina ili tkiva koja se nalaze izvan spoljnog zida biološkog kanala (npr prema spoljašnjoj površini krvnog suda ili mišiću koji se nalazi uz spoljnu površinu suda kao što je miokard).
[0244] Jedna prednost uredjaja ovog pronalaska je što pokretači, po prirodi njihovog dizajna, ostvaruju kontakt sa manje nego kompletan obim unutrašnjeg zida biološkog kanala prateći njihovo postavljanje. U željenim oblicima, pokretači ostvaruju kontakt sa manje od 100% obimom unutrašnjeg zida biološkog kanala u koji su ispušteni. Preferirano je da pokretači ostvare kontakt sa manje od 75%, 50% ili 25% obima unutrašnjeg zida biološkog kanala u koji su ispušteni. Najviše se preferira da pokretači ostvare kontakt sa manje od 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.5% ili 0.1% od obima unutrašnjeg zida biološkog kanala u koji su ispušteni.
[0245] Uredjaji koji se mogu koristiti za dostavu tečnosti obuhvataju mnoštvo terapeutskih I dijagnostičkih supstance zidu biološkog kanala. Terapeutske supstance obuhvataju, ali nije obavezno, proteine, hemikalije, male molekule, ćelije I nukleinske kiseline. Terapeutska supstanca dostavljena od strane uredjaja može obuhvatati mikro ili nano čestice, biti kompleksna sa mikro ili nano česticama ili vezana za mikro ili nano čestice. Proteinske supstance obuhvataju elastaze, antiproliferativne suspstance I supstance koje sprečavaju vasospazmu. Upotreba uredjaja za dostavljanje elastaze je specifično smišljena. Mnoge objavljene patent aplikacije (WO 2001/21574; WO 2004/073504; i WO2006/036804) govore da elastaza, sama I u kombinaciji sa drugim supstancama, je korisna u lečenju bolesti biološkog kanala, uključujući obstrukciju biološkog kanala I vasospazma. Dijagnostičke supstance uključuju ali nisu obavezne kontrast, mikročestice, nanočestice Ili druge supstance.
[0246] Mnoštvo različitih metoda za priliv tečnosti se mogu uvežbati sa uredjajem. U odredjenim aplikacijama, razne tečnosti se mogu dostaviti kroz svaki penetrator tkiva od uredjaja istovremeno ili uzastopno. Oblici i/ili metodi gde je prva tečnost dosatvljena kroz oba penetratora tkiva praćena dostavom druge tečnosti kroz oba penetratora tkiva je takodje dobro planirana.
[0247] Metode korištenja uredjaja da bi se dostavila tečnost u ili kroz zid biološkog kanala su takođe specifično osmišljene. Ove metode obuhvataju korake od predstavljanja uredjaja u biološki kanal, napredujući uredjajem do ciljnog mesta u kanalu, otpuštajući pokretače iz njihovih ograničenih pozicija, opcionalno pomerajući penetratore tkiva kroz lumene u pokretačima da bi se penetriralo na željenu dubinu u zid biološkog kanala, dostavljajući barem jednu tečnost u ili kroz zid, I opcionalno vraćajući penetratore tkiva nazad u lumen pokretača, uvlačeći pokretače u njihovu ograničenu poziciju, premeštajući uredjaj u isti ili drugi kanal za dostavu dodatne tečnosti ako je potrebno I otklanjajući uredjaj iz kanala.
6. PRIMERI
[0248] Ovaj deo opisuje medote proizvodnje rekombinantnog tipa I elastaze za kliničku upotrebu, na primer kao supstance da se poveća razmera krvnih sudova I lumena krvih sudova. Ljudski tip I elastaze gušterače prikazuje 89% osobina amino-kiselina kroz delu dužinu svinjskog tipa I elastaze gušterače sa totalnom zaštitom "kataličke trijade" I podlogu specifičnosti da odredjivanje ostataka. Svinjski tip I elastaze je početno sinteziran kao enzimski neaktivan proenzim koji je aktiviran od strane tripsina da doprinese zrelom enzimu koji sadrži četiri unutrašnje disulfide veze bez glikozilacije (pročitati Shotton, 1970, Methods Enzymol 19:113-140, Elastase I Hartley and Shotton, 1971, Biochem. J.
124(2): 289-299, Pancreatic Elastase. The Enzymes 3:323-373) i reference u njima.
[0249] Primeri ispod će prikazati razvoj od efikasnih i podesivih rekombinanata svinjskog I ljudskog tipa i pojave elastaze I šema za čišćenje koje su odgovarajuće za cGMP proizvodnju ovih enzima za kliničke I van-kliničke studije I komercijalne farmaceutske upotrebe. Zrela svinjska elastaza je dobila ime PRT-102. Zreo ljudski tip I elastaze je dobio ime PRT-201.
6.1 TERMINOLOGIJA I SKRAĆENICE
[0250] Kao što je dosad korišteno, izrati PRT-101, PRT-102, PRT-201 I pro-PRT-201 znače sledeće:
PRT-101: svinjska elastaza gušterače. Ukoliko to nije drugačije naznačeno, svinjska elastaza gušterače korištena u primerima je visoko pročišćena svinjska elastaza gušterače kupljena od Elastin Products Company, Inc, Owensville, MO, katalog # EC134.
PRT-102: zero rekombinantni tip I svinjske elastaze gušterače. Trebalo bi naglasiti da vektori sa oznakom "pPROT101-XXX" su kodirani kao PRT-102
PRT-201: zero rekombinantni tip I ljudske elastaze gušterače
Pro-PRT-201: proenzim forma rekombinantnog ljudskog tipa I elastaze gušterače koji sadrži propeptidnu sekvencu.
[0251] Sledeće skraćenice su korištene u Delu 6 ove aplikacije:
BKGY: baferiran srednji glicerol-kompleks
BKME: baferiran srednji metanol-kompleks
CHO: Kineski jajnici hrčaka
E. coli: Ešerihija koli
ELA-1: tip I elastaze gušterače
HEK : ljudski embrionski bubreg
hELA-1 : ljudski ELA-1
HIC : hidrofobne interakcije hromatografije
MBP : maltoza vezujućeg proteina
pELA-1 : svinjski ELA-1
P. pastoris: Pichia pastoris
PCR: lančana reakcija polimeraze
PMSF : fenilmetilsulfonilni florid
RP: reverzne faze
S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae
SDS-PAGE: natrijev dodecisulfat-gel-elektroforeza
SEC: hromatografija isključenja po veličini
USP: United States Pharmacopeia
YPDS: srednji ekstrakt kvasca peptonskom dekstrozom sorbitol
6.2 PRIMER 1: SINTEZA DNK ELASTAZE
[0252] Sekvenca kodiranja ljudske elastaze 1 je dobijena od U.S. Patent No. 5,162,205 (Takiguichi et al., 1992). Mnoge promene sekvence su napravljene da bi se olakšalo kloniranje u ekspresne vektore (Slika 1A). Osnovne promene su pale pod izrodjenost genetičkog koda tako da se otpaci amino-kiselina nisu menjali. Druga stanica kodona je dodana odmah posle izvorne stanice kodona da se smanji potencijal ribozoma.
[0253] Modifikovana sekvenca kodiranja je sintetizovana od strane Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA) koristeći ne-PRC "dugu oligo" tehniku pod licencom od Amgen (Thousand Oaks, CA). Rekombinantni DNK, nazvan ELA-1.2A (broj sekvence 81) je kloniran u vektor Blue Heron pUC, izvod iz pUC119 I rezultirajući plazmidi su nazvani pPROT1. pPROT1 je sekvenciran na obe strukture da bi se potvrdila tačna sekvenca. Sekvencione informacije visokog kvaliteta sa opsežnim preklapanjima na obe strukture su dozvolile nedvosmislene osnovne zadatke širom cele sekvence koja je obezbedjena sa bar četiri sekvencione reakcije sa bar jednom reakcijom za svaku strukturu.
6.3 PRIMER 2: IZRAŽAJ PRT-201 U E. KOLI
[0254] Raznovrsnost ekspresije strategija je pokušana u naporu da se dobije rastvorljiva ili enzimatično aktivna ljudska elastaza u E. coli.
[0255] Jedan komplet E. coli izražavanja vektora obuhvaćen u okviru fuzija ljudskog tipa I elastaze gušterače (ELA-1) do karbonskog završetka vezujućeg proteina maltose (MBP) koji je stupio u fuziju sa N-terminalom za izlučivanje peptide. Obe I ljudska ELA-1 zrela I proenzimska sekvenca kodiranja su klonirane kao u format C-terminal fuzija do MBP sekvence kodiranja od plazmida pMAL-p2G (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) da se iskoristi ili pPROT3 (zreo ELA-1) ili pPROT5 (ELA-1 proenzim). Konstrukcija PROT3 je izvršena prvo dobivanjem PCR mutageneza 6.6kb zrelog ljudskog ELA-1 kodirajući fragment sa SnaBI sajtom na N-terminal valin kodona od zrelog ljudskog ELA-1 I HindIII sajta koji se nalazi 3’ do zrelog ELA-1 terminacionog kodona. Ova PCR mutageneza je koristila pPROT1 šablon obuhvatajući
ELA-1.2A sekvencu kodiranja (Broj sekvence 81) I dva oligonukleotidna primera (5’ ATC TAC GTA GTC GGA GGG ACT GAG GCC, broj sekvence 75; and 5’ gtc gac aag ctt atc agt tgg agg cga t, broj sekvence 76). Rezultanta 6.6 kb PCR fragment je izolovan, prevaren sa SnaBI I HindIII I kloniran u XmaI/HindIII svareni pMAL-p2G vektor da bi proizveli pPROT3. Konstrukcija pPROT3 je proizvedena kloniranjem ScaI/HindIII fragmenta iz PPROT1 I podvezan u PMAL p2G vektor koji je svaren pomoću SnaBI I HindIII. Rezultanta fuzije operativno povezuje N-terminus od ljudskog ELA-1 kodiranje proenzima prostirući se do C-terminusa od MBP od pMAL-p2G u pPROT5. Tripsinsko cepanje domena ljudskog ELA-1 proproteina je očuvan u pPROT5.
[0256] E. coli crta TB 1 je transformisana sa pPROT3 I pPROT5 I inducirana sa IPTG da bi se odredilo ako fuzija proteina ili enzimično aktivna ljudska ELA-1 može biti proizvedena. U slučaju pPROT3, sve proizvedeno od MBP-ELA-1 fizuje proteina je bilo netopljivo. Netopljivo ili enzimatički aktivna MBP-ELA-1 fuzija proteina je otkrivena u periplazmičnom materijalu koji je dobijen osmotskim šokom od inducirane pPROT3 koja sadrži E. coli. U slučaju pPROT5, manji nivoi topljivih rekombinanata MBP-proELA-1 proteina su uočeni u periplazmičnom materijalu dobijenom osmotskim šokom od inducirane pPROT5- koja sadrži E. coli kroz upotrebu SDS-PAGE I Coomassie boje ili upotrebom anti-MBP antitela na Zapadnoj mrlji (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Topljivi recombinant MBP-proELA-1 protein se može svariti sa tripsinom da bi se proizveli I MBP I zrela ljudska ELA-1. Zrela ljudska ELA-1 je dobijena iz indukcije pPROT5 I ispitana za aktivnost elastaze sa SLAP peptid podlogom. Aktivnost elastaze je posmatrana u pPROT5 periplazmičnim ekstraktima. Ova aktivnost enzimske elastaze je zavisila o tripsinskoj aktivaciji (nijedna aktivnost nije posmatrana u odsustvu tripsina I količina aktivnosti je uvećana povećanjem vremenskog perioda od aktivacije tripsina). Aktivnost elastaze je zavisila od pPROT toliko da nije posmatrana aktivnost u pMAL-p2G vektoru koja kontroliše ekstrakte lečene paralelno sa tripsinom. Na kraju, pPROT5 aktivnost elastaze je bila nastanjena od strane PMSF (poznata serin proteaza inhibitor)
[0257] Rekombinant MBP-proELA-1 fuzije proteina je prečišćen I rascepljen sa tripsinom da bi se dobio enzimični aktivan pPROT5- dobijen iz zrele ljudske ELA-1. Fuzija proteina je prvo bila pročišćena na amilozi afinitetne kromatografije praćene ispiranjima sa maltozom. Pročišćeni MBP-proELA1 je bio lečen sa imobilisanim tripsinom. Prateći aktivacijski korak tripsina, rascepljeni MBP-proELA-1 je pročišćen kationskom SP Sepharose hromatografijom. Inače eksperimenti sa ispiranim pročišćenim pPROT5- dobijenim zrelim ljudskim ELA-1 nagoveštavajući da samo ograničene količine topljivog I enzimatično aktivne elastaze se može dobiti iz E. coli koji sadrži pPROT5. Specifična aktivnost od ispranog pročišćenog PROT5-dobijenog zrelog ljudskog ELA-1 je bio vrlo nizak, u rasponu od 0.27 do 0.38 U/mg (U= mikromoli od SLAP podloge koja je hidrolizirana po minuti).
[0258] Alternativna stragetija dobijanja rastopljivog I enzimično aktivnog ELA-1 u E. coli je takodje bila razvijena. Ukratko, pPROT8 vektor koji kodira fuziju proteina koja sadrži prvih 8 ostataka amino-kiselina od E. coli lacZ alfa podjedinica plus 5 amino-kiselina od ostataka u prahu koji su praćeni ljudskim ELA-1 N-terminal proenzimom je napravljen. Ovaj vektor je napravljen od povezivanjem BamHI/NcoI fragmenta koji sadrži ljudski ELA-1 sekvencu kodiranja iz pPROT1 (vektor koji sadrži ELA-1.2A sekvence; broj sekvence 81) u pBlueHeron pUC (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA, USA) koji je svaren sa BamHI/NcoI.
[0259] E. coli žica EC100(EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI) je transformisana sa pPROT8 I inducirana sa IPTG da bi se odredilo da li fuzija proteina ili enzimično aktivnog ljudskog ELA-1 može biti proizveden. U slučaju EC100 transformisanih ćelija, sve pPROT8 izvedene LacZ-proELA-1 fuzijski protein koji je proizveden je bio netopljiv (pronadjen je u uključenim telima). E. coli žica koja sadrži mutacije u trxB i gor genima (Origami™ strain, Takara Mirus Bio, Inc., Madison, WI) je transformisana sa pPROT8 kao E. coli žica sa mutacijama u ovim sekvencama kodiranja da bi promovisali oporavak topljivih I enzimski aktivnih rekombinantnih proteina. Iako neke topljive pPROT8 izvedenice od LacZ-proELA-1 fuzije proteina u trxB / gor E.coli žica se povratila posle indukcije sa IPTG, I konverzija u enzimično aktivnu ljudsku ELA-1 sa tripsinom ne bi bila moguća.
6.4 PRIMER 3: IZRAŽAVANJE PRT-201 U ĆELIJSKIM LINIJAMA SISARA
[0260] Brojna izražavanja strategija su pokušavana u cilju da se dobije topljiv I enzimično aktivan ljudski tip I elastaze gušterače (ELA-1) I ćelijskim linijama sisara. Kopija sisarskog izražavanja vektora pcDNA3.1 (Invitrogen) koji sadrži CMV promoter je korišten kao osnova za dva ljudska ELA-1 vektora izražavanja elastaze, pPROT30 I pPROT31. Da bi se napravio pPROT30, ljudski ELA-1 proenzimska sekvenca je pojačana sa PCR I spojena za svinjsku elastazu gušterače I signalnu sekvencu sjedinjenu u naprednu PCR terciju. Koristeći mesta restrikcije sjedinjenih u PCR tercije, PCR proizvod je svaren I spojen uz odgovarajuća mesta restrikcije u pcDNA3.1 vektoru. pPROT31 je napravljen na sličan način samo što je je zrela ljudska ELA-1 sekvenca kodiranja korištena umesto proenzimske sekvence kodiranja u pokušaju direktnog izražavanja zrelog enzima. E. coli je transformisan sa spojenim reakcijama I klonovi su izabrani za mini-pripreme skrininga. Jedan klon za svako izražavanje vektora je izabra na bazi očekivanih restrikcijskih šema za varenje za tačan unos. Plazmidni DNA je pripremljen za svakog klona I izražavanje vektora kodiranja sekvence je potvrdjen od strane DNA redosleda.
[0261] Ćelijske linije sisara CHO, COS, HEK293 I HEK293T su privremeno ubačeneo odvojeno sa pPROT30 I pPROT31. Posle nekoliko dana, kultura ćelija supernatanta su prikupljene I analizirane za ljudski ELA-1 proprotein (pPROT30) ili zreli protein (pPROT31) izraženi Zapadnom mrljom. Anti-svinjsko poliklonsko antitelo elastaze gušterače je reagovala unakrsno sa grupom očekivanih molekularnih težina za ljudski ELA-1 proprotein u pPROT30 supernatantima I za zreo ljudski ELA-1 protein u pPROT31 supertantima.
[0262] pPROT30 I pPROT31 supertanti su analizirani na aktivnost elastaze po SLAP analizi. Za pPROT30, supertanti su prvo lečeni tripsinom da pretvore proenzim u zreo PRT-201 ali nije pronadjena bilo kakva aktivnost elastaza u nekom od supertanata za bilo koji vektor koji koristi SLAP analizu.
6.5 PRIMER 4: IZRAŽAVANJE PRT-201 KOJI JE AKTIVIRAN TIPSINOM U P. PASTORIS
[0263] Vektor za P. pastoris luči izraz PV-1 koji je sintetizovan od strane Blue Heron I korišten da se prvo klonira divlji tip ljudske ELA-1 sekvence kodiranja. PV-1 vektor je napravljen za jednostavno kloniranje, izbor I visok nivo izražavanja rekombinantnih proteina. Vektor sadrži Zeocin™ otporni gen za direktnu selekciju multi-kopija integral. Fuzija N-terminus elastaze propeptida kvasca – parenje tipa sekvence koja sadrži signal lučenja kvasca, propeptida I fiksatora sekvenci kao što je prikazano na Slici 1B, dozvoljava lučenje izraženog proteina u kulturi posrednika. Izlučena elastaza proproteina se može lako odvojiti od ćelijske kuglice, bitnog prvog koraka ka pročišćavanju. Dodatno, proenzimska forma ljudske ELA-1 obuhvata cepajuće mesto tipsina koje je odabrano za izražavanje kojim se izbegava direktno izražavanje zrelog aktiviranog enzima koji može dovesti od proteina ili toksičnosti do ćelija izražavajući rekombinantni enzim.
[0264] Kloniranje izražene konstrukcije pPROT24-V za usmeravanje ELA-1 proenzima je završeno kako sledi. Mesto kodiranja ljudske ELA-1 (SEK ID BR:81) je umnoženo od Blue Heron pUC ELA-1 od PCR (Expand High Fidelity PCR System, Roche, Indianapolis, IN). 20F fitilj inkorporisan u XhoI mestu (5’-ggctcgagaaaagagaggctgaagctactcaggaccttccggaaaccaatgcccgg-3; broj sekvence 35). Fitilj 24R je inkorporisan u SacII site (5’-gggccgcggcttatcagttggaggcgatgacat-3’; broj sekvence:36). Dobijeni PCR product je prečišćen gelom I kloniran u pCR2.1-TOPO (Invitrogen). ELA-1 sekvenca kodiranja je bila izolovana uz pomoc Xhol I SacII, prečišćena gelom I klonirana u PV-1 vektor na mestima koja koriste pPROT24-V (Slika 3).
[0265] pPROT24-V spojeni proizvod je pojačan u E. coli žici TOP10. Mešavina ćelija je postavljena na neslane LB podloge I suplementirana sa 25 mikrograma/mL Zeocin. DNK plazmida je pripremljena (Qiagen, Valencia, CA) I ljudska ELA-1 je koja je ubačena je prepoznata od strane restrikcijske digestije. pPROT24 sekvenca kodiranja je verifikovana od strane obe sekvencione strukture pročišćenog pripremljenog DNK sa više preklapajućih reakcija. Visok kvalitetsekvencione informacije je omogućio nedvosmislene baze zadataka I potvrdio tačnu sekvencu kodiranja. Skladišta glicerola pPROT24-V/TOP10 su napravljene I uskladištene na -80°C.
[0266] Divlji tip NRRL Y-11430 P. pastoris žice dobijene od USA odela za poljoprivredu (USDA, Peoria, IL, USA) je korišten za transformaciju. Plazmidni DNK iz pPROT24-V je linearizovan sa Sacl I kompletna digestija je potvrdjena malim delom reakcije na agarozni gel. Elektroporacija je korištena da se transformiše P. pastoris sa pPROT24-V plazmidni DNK. Izmešane ćelije su postavljene na YPDS podlonge koje sadrže 100 mikrograma/mL Zeocin. Posle tri dana počelo je formiranje kolonija I izabrane su posle nekoliko dana za ponovno postavljanje na svežim podlogama.
[0267] Generalno transformanti otporni na lekove su prikazani za ekspresiju u 1L zaštitnoj flaši. Jedna kolonija je korištena da se da injekcija 200 mL srednjeg BKGY. Sastav BKGY rešenja je bilo sledeće: 10 g/L glicerola, 13.4 g/L nitrogene baze kvasca sa amonijum-sulfatom bez amino-kiselina (Invitrogen), 20 g/L peptone soje, 10 g/L ekstrakta kvasca, , 0.4 mg/L biotina u 0.1 M u kalijum-fosfat baferu (pH 5.0). Uzgoj je porastao za dva dana na 28°C sa centrifugom od 275 rpm. Uzgoj je zaokrugljen centrifugom na 650xg za 10 minuta na sobnoj temperature. Ćelije kuglice su bile ponovo zaustavljene sa BKME indukcijom posrednika, pH 5.0, sa zaustavljanjem kuglica u omeru 1g mokrih ćelija na 5mL indukcijskog posrednika. 50mL ćelijske otopine je stavljeno u 500mL nepregradjene flaše da bi se dobio odnos 1:10 ćelijske supstance u balonu zapremine. Ćelije su inkubirane na 22°C sa centrifugom od 275 rpm tokom 1 do 3 dana. Metanol u indukcijskom posredniku je bio dodat krajnjoj koncentraciji od 0.5% dva puta dnevno preko kursa indukcije.
[0268] Da bi se proverila ekspresija, 1mL alikota je uzeto, prebačeno u 1.5 mL mikro-centrifugalne cevi, izložene centrifuge 5 minuta na 20,000 x g. Supernatanti su prebačeni u čiste cevi I uskladištene na -80°C. Za SDSPAGE analizu, supernatanti alikota su rastopljene I izmešane sa 4x Laemmli buferom koji je suplementiran do 5% jačine sa redukujućom supstancom beta- mercaptoethanol. Uzorci su proključani 5 minuta, oprezno centrifugirani I napunjeni na 8-16% gradijent Tris-HCl prefabrikovanog gela u Criterion elektroforeznom sistemu (Bio-Rad). Posle eletroforeze, gel je obojen sa Coomassie I analiziran na ekspresiju ljudskog ELA-1 proenzima. Klon 201-24-266-VU je izabran kao najprinosniji klon za dalju evaluaciju. Razvojna banka ćelija sadrži 201-24-266-VU glycerol zaliha koje su pripremljene I uskladištene na -80°C.
[0269] Za scale-up produkciju ljudskog ELA-1 proenzima koristeći klona 201-24-266-VU, više proizvodnji je obavljeno koje su generalno pratile metode opisane ispod. Gde je aplikacija bila moguca, run-to-run varijacije u metodama su obeležene.
[0270] Za uzgoj ćelije, serije zaštitnih boca za mućkanje (najčešće od 20 do 40 boca) koje sadrže 500mL BKGY srednjeg uzgoja su cijepljene sa 0 mikrolitara od otopljenih 201-24-266-VU gliceroh zaliha.Uzgoji su čuvani na 28°C dva dana u inkubatoru za mućkanje na 250 - 300 rpm. Posle 2 dana, ćelije su zaokrugljene centrifugom I supernatant je odbačen. Ćelije su ponovo zaustavljene u BKME indukcijskom posredniku, pH 5.0 na omjeru 1g težine ćelina na 5mL posrednika. Jačina od 200-400 mL suspenzije ćelija su stavljene u 2L nezaštićene boce I uzgajane 3 dana u inkubatoru za mućkanje (250-300 rpm) na 22°C. Metanol u posredniku je bio dopunjen do 0.5% jačine dva puta na dan tokom indukcije. Na kraju indukcije, boca za mućkanje uzgoja je centrifugirana da bi zaokruglila ćelije. Supernatant je otklonjen I odmah filtriran na sobnoj temperature kroz 0.22 um polietersufonske membrane koristeći 1L vakum filtracione jedinice da bi se odstranile sve preostale ćelijski ostaci. Filtrat je bio očuvan na 2-8°C tokom 45 dana. Bazirano na HIC-HPLC analizi, doprinos ljudskog ELA-1 proenzima od klona pro-PRT-201-24-266-VU u bistro supernatantu je obično bio od 200 do 250 mg/L.
[0271] Skupljanje pro-PRT-201-24-266-VU od supernatanta je teklo na ovaj način; Prvo, supernatant iz različitih okvira boce za mućkanje uzgoja (najčešće od 4 do 10 okvira) su kombinovani (najčešće od 8 do 25 L) razredjene 8 puta sa vodom I prilagodjene pH 5.0 sa 1 M HCI. Razredjeni supernatant je onda ubačen u uravnoteženi 2 L ležište jačine Macro-Prep High S jonske razmene upotrebljene kolumne na 2-8°C na omjeru 100mL/min (linearni protok 76 cm/hr). Hromatografija programa obuhvata sledeće korake: 1. Red za čišćenje sa 10L (5 redova jačina [CVs]) od bufera A (20mM natrijum citrata , pH5.0) na 100 mL/min (76 cm/1h); 2. Red za čišćenje sa 4L (dva CVs) od mešavine 90% bafera A I 10% bafera B (500mM natrijum hlorida; 20mM natrijum citrata, pH 5.0) za finalni bafer koji sadrži 50mM natrijum hlorida, 20mM natrijum citrata , pH 5.0 na 100mL/min (76 cm/h); 3. Red za čišćenje sa 6L (3 CVs) od mešavine 80% bafera A I 20% bafera B za konačnu bafer mešavinu od 100mM natrijum hlorida, 20mM natrijum citrata, pH 5.0 na 100ml/min (76 cm/h); 4. Red za čišćenje sa 6L (3 CVs) od linearnog gradijenta, startujući od 75% bufera A I 25% bafera B do 68% bafera A I 32% bafera b, na 100 ml/min (153 cm/h); 5. Elut sa linearnim gradijentom 30 L (15 CVs) počevši od 68% bafera A i 32% bafera B do 0% bafera A i 100% bafera B, na 100 ml/min (76 cm/hr). Eluat je sakupljen u frakcijama od 500 - 1000 mL svaka.
[0272] Tipično, dve predominantne proteinske vrste su posmatrane SDS-STRANOM praćenom Coomassie bojenjem: glikosilirani ljudski ELA-1 proenzim i ne-glikosilirani ELA-1 proenzim su određeni sledećim LC/MS analizama, tipičnim ispiranjem sa oko 320 mM natrijum hlorida, prikazano na slici 4. U nekim koracima proizvodnje protein je blago manji nego proenzim ljudske ELA-1 što je posmatrano kao minorna vrsta. Daljim LC/MS analizama ovih frakcija koje se pojavljuju utvrđuje se da one u većini proteina nisu proenzim pune snage već da umesto toga nedostaje nekoliko amino kiselina na N-završecima. Ove varijante N-terminala su prečišćene i namenjene analizama ektivnosti elastaze, kojima se otkriva da one imaju nižu aktivnost elastaze nego PRT-201 pune snage. Varijante N-terminala mogu nastati od proenzima ljudske ELA-1 izlažući se niskom nivou aktivnosti elastaze tokom kultivisanja ćelije i asorbcije hromatografskih operacija ili njihovog cepanja kroz intramolekularnu reakciju ili cepanje drugog molekula proenzima ljudske ELA-1 kroz intramolekularnu reakciju. Suboptimalni uslovi cepanja tokom ove operacije mogu dovesti do visokog nivoa nepreciznosti cepanja proenzima (nekada označen kao spontana ili nekontrolisana konverzija) što dovodi do pune snage PRT-201 na većini varijanti N-terminala.
[0273] Nakon pregleda rezultata SDS-STRANE, set frakcija je udružen za dobijanje prečišćenog ne-glikoliziranog PRT-201 za dalji proces. Frakcije obuhvataju glikoliziran proenzim ili PRT-201 pune snage i/ili varijante N-terminala koje su obučno izuzete od udruživanja. Udruženi pro-PRT-201 je obučno smešten u 5 plastičnih posuda na 2-8°C na nekoliko sati da bi se preko noći desila konverzija od proenzima do zrelog enzima.
[0274] Konverzija od pro-PRT-201 do zrelog PRT-201 imobilizovanim tripsinom ima sledeće efekte. Udružene frakcije pro-PRT-201 su dijalizovane u 20 mM natrijum fosfata, pH 5.0, preko noći na 2-8°C. Ovaj korak je predstavlja uklanjanje citrata koji inhibira tripsin. U sledećim dijalizama, pro-PRT-201 je prešao preko kolone rekombinantnog tripsina (TrypZean) da imobiliše aragozne petlje pre-ekvilibriranog sa 20 mM natrijum fosfata, pH 5.0. Obično, kontakt između pro-PRT-201 i imobilizovanog TrypZean je između 3.5 do 5 min. Materijal dobijen postkonverzijom je analiziran SDS-STRANOM kako bi se potvrdila konverzija i naknadno učitana Macro-Prep Visoka S kolona poliranja. Kolona je isprana u nizu sa 5 CVs od 20 mM natrijum citrata, pH 5.0; 2 CVs od 20 mM natrijum hlorida, pH 5.0; i 3 CVs of 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, pH 5.0. Kolona je dalje isprana sa linearnim gradijentom od 125 mM natrijum hlorida do 160 mM natrijum hlorida u 20 mM natrijum citrata, pH 5.0. PRT-201 je eluiran u linernom gradijentu od 165 mM do 500 mM natrijum hlorida u 20 mM natrijum citrata, pH 5.0 i sakupljen u frakcijama. Frakcije su analizirane za protein SDS-STRANOM praćenom Coomassie bojenjem i za aktivnost elastaze SLAP testom. Obično su udruživane frakcije imale specifičnu aktivnost od 90% ili veću od frakcija sa većom specifičnom aktivnosti. U daljim LC/MS analizama, otkriveno je frakcije sa nižom specifičnom aktivnosti one u PRT-201 varijantama N-terminala.
[0275] Udružene frakcije sa visokom specifičnom aktivnosti su difiltrirane unutar formulacije bafer sastojka od 0.1X PBS (13.7 mM natrijum hlorida, 1 mM natrijum fosfata, 0.27 mM kalijum fosfata) sa pH 5.0. Nakon koncentarcije PRT-201 do 1 mg/mL, pH je prilagođena na 7.4. Rešenje se tada nalazi u alikvotama unutar staklenih sa bočica seruma sa gumenim čepom i lipofilizaciji. Lipofilizacija se obično obavlja u primarnom ciklusu sušenja na -30 to -50°C i drugom ciklusu sušenja na -15°C. Nakon lipofilizacije, serumi su zatvoreni pod vakumom i označeni aluminijumskim pečatom. Serumi se obično čuvaju na 2-8°C ili -80°C.
[0276] Da bi se procenila stabilnost lipofiliziranog PRT-201 u serumima, dve stavke koje su proizvedene unutar sterilnog GMP leka su smeštene na stabilan program. Stabilan program sadrži čuvanje leka na 15°C i periodično testiranje seruma sledećom analitičkom metodom za pokazivanje stabilnosti (specifikacija se nalazi u zagradama): pojava lipofiliziranog materijala (od belog do bezbojnog praha), pojava specifične aktivnosti nakon obnavljanja (bistar, bezbojan rastvor bez čestica) putem SLAP testa (25-45 U/mg), prečišćenost RP-HPLC (totalna prečišćenost: ne manja od 93%; individualna nečistoća: ne veća 2%), čistoća redukovana SDS-STRANOM (ne manje od 93%), čistoća neredukovana SDS-STRANOM (ne manje od 93%), inekcijama sa nataloženom materijom (u skladu sa USP), agregati SEC- HPLC (ne više od 3%), sadržaj po bočici (4.5 - 5.5 mg), pH (6.5-8.5), vlaga (ne prelazi 5%) i sterilnost ( skladu sa USP). Do danas, obe stavke su upoznate sa navedenom specifikacijom u svim vremenskim tačkama testiranja (stavka C0807117 kroz 12 meseci i stavka C1007132 kroz 9 meseci). Ovi rezultati upućuju da je PRT-201 stabilan u periodu od najmanje 12 meseci kada je lipofilizirani serum čuvan na -15°C.
[0277] Upotreba natrijum citrata, pH 5.0 tokom obe hromatografije pro-PRT-201 i hromatografije poliranjem konvertovanog PRT-201 je bazirana na osnovu toga da je natrijum citrat inhibiran aktivnošću elastaze prečišćenog PRT-201 i stoga možda inhibiran aktivnošću elastaze pro-PRT-201 i PRT-201 tokom operacija procesa. Takva inhibicija može da minimizuje spontane konverzije pro-PRT-201 na varijantama N-terminala i minimizuje autodegradaciju PRT-201. U eksperimentu gde SLAP test sadrži 115 mM natrijum citrata, pH 5.0, specifična aktivnost PRT-201 je inhibirana sa 91%.
[0278] Povremeno, eluirani materijali iz pro-PRT-201 kolone nisu namenjeni konverziji tripsinom kako je napred opisano ali već upotrebi za dobijanje preparata obogaćenih raznim vrstama proteina. Na primer, skupovi frakcija koji prvenstveno obuhvataju glikosilirani pro-PRT-201, ne- glikosilirani pro-PRT-201 ili proteine koji proizilaze iz spontane konverzije su napravljeni od kolone elauata. Obično, ovi skupovi frakcija su difilterizovani unutar 10 mM lipofiliziranog natrijum fosfata, pH 5.0, i čuvani na - 80°C.
[0279] Studija je obavljena da bi se odredio efekat pH i temperature na stabilnost prečišćenog pro-PRT-201. Lipofilizirani pro-PRT-201 je obnovljen u 10 mM nartijum fosfata sa pH u rasponu od 3.0 do 8.4, praćeno inkubacijom na 4°C ili 25°C u periodu od 7 dana. Nakon 7 dana, pro-PRT-201 uzorak pod uslovima gde je pH 4.0 - 8.0 i 25°C je prikazan kao obogaćenje u zrelom PRT-201 povećano sa rastućom pH kako je prikazano SDS-STRANOM i Coomassie bojenjem. Pod uslovima gde je pH 8.4 i 25°C, posmatrana je potpuna konverzija pro-PRT-201 u zreli PRT- 201. Uzorci na 4°C, od pH 4.0 do 8.4 prikazuju malu ili nikakvu konverziju. Na pH 3.0, nije bila primećena konverzija na 4°C i 25°C. Izloženo je u literaturi (Hartley and Shotton, 1971, Pancreatic Elastase.Enzymes 3:323-373) da je elastaza svinjskog pankreasa nepovratno neaktivna nakon produženog držanja na pH koja je niža od 3.0. Tako, osnovna tri rezultata ove studije i izbegavanje nepovratne neaktivnosti PRT-201, i korisni uslovi za minimizaciju konverzije prečišćenog pro-PRT-201 su čuvanje na 4°C između pH 3.0 - 4.0.
6.6 PRIMER 5: IZRAŽAVANJE AUTO-AKTIVIRANOG PRT-201 U P. PASTORIS
[0280] Za dobijanje varijante proenzima koja je sposobna za auto-aktivaciju čime se eliminiše potreba za aktivacijom tripsina, drugi oblik mesta cepanja raznih vektora elastaze je napravljen i analiziran u malim kulturama i eksperimentima konverzije. Varijante vektora su napravljene putem usmerenih PCR mutageneza vektora pPROT24-V i drugih dobijenih vektora. Usmerene mutageneze se obavljaju putem upotrebe Turbo DNK polimeraze (Stratagene).
E.coli XL10-Zlatna crta je transformisana sa dobijenim plazimidima. Transformisana smeša ćelija je obložena sa malo soli LB koja je dopunjena sa 25 mikrograma/mL Zeocina. Klon rezistenta leka je odabran i plazmid DNK je pripremljen (Qiagen, Valencia, CA). Klonovi su potvrdili očekivane promene kodona putem sekvenciranja oba lanca plazmida DNK u mestu propeptida sa preklapanjem više reakcija. P. pastoris je transformisana sa varijantama vektora i klonovima koji su odabrani kako je opisano u prethodnom Primeru.
[0281] Zbir varijanti mesta cepanja elastaze je predstavljen u nižoj tabeli 4:
M n
Tabela 4: Varijante mesta cepanja elastaze
[0282] Za tabelu 4 iznad, prvi red koji prikazuje "Pro-Peptid Ime Sekvence" odgovara broju sekvence za naznačenu elastazu rascepa domena. Prema tome, 24 odgovara divljem tipu tripsinskom rascepu domena sekvence broja 24.
Brojevi 40-49, 52-63 odgovaraju varijanti elastaze rascepa domena sekvencama brojeva 40-49 I 52-63.
[0283] Da bi se uzgajali varijantni klonovi, boca za mućkanje uzgoja napravljena je za tripsinski aktivirani 201-24-266-VU klon opisan u prethodnom primeru. Razne metode pretvaranja varijantnih proproteina izlučenih u bocu za mućkanje supernatanta ka zrelom PRT-201 su testirani. Prva strategija pretvaranja je podrazumevala hromatografsko pročišćavanje varijante proenzima, zatim kontrolisani rascep u specifičnom baferu za pretvaranje. Pošto se amino kiselina menja u varijanti proproteina rezultira u malim promenama u teoretskim izoelektričkim tačkama u poredjenju sa divljim tipom proenzima, hromatografija razmene kationaje sprovedena generalno kao što je opisano u prethodnom primeru. Supernatanti iz varijantnog klona uzgoja su pripremljene za hromatografiju razredjivanjem sa vodom kao što je opisano u prethodnom primeru ili koncentracijom praćenom difiltracijom supernatanta koristeći protok tangencijalne filtracije u kolumnu napunjenog bafera. Poste hromatografičkog pročišćavanja, elucioni komadići su analizirani sa SDS-PAGE praćeni sa Coomassie bojenjem. Analiza gelom je demonstrirala velike količine pretvorenog zrelog proteina u proprotein u delićima u poredjenju sa početnim supertantom, što indicira da se je izvršena konverzija značajne količine spontanog proproteina. Posle pročišćavanja, spontano konvertovani protein je odredjen od strane LC/MS to da bude sadržan najviše od N-terminal varijanti koje su prikazane sa malo ili bez aktivnosti elastaze u SLAP analizi.
[0284] Druga strategija pretvaranja sadrži pretvaranje varijantnog proproteina pre pročišćavanja od uzgoja supernatanta, praćena hromatografskim pročišćavanjem zrelog enzima. Strategija pretvaranja je prvo testirana u u analizi male-skale I povećavana da smesti veće jačine pretvaranja. Za pretvaranje male skale, bistri supernatant iz varijantnog uzgoja klona je najčešće koncentrovan 5 puta centrifugom od 2 do 8 °C u ultracentrifugičnom filterskom uredjaju. Posle koncentracije, retentant je razredjen 5 puta sa Tris baferom do konačne koncentracije od 100mM od Tris-HCI u pH visini od 8.0 do 9.0. Primerci su inkubirani na sobnoj temperature na pomerajućoj platformi. Aktivnost elastaze je nadgledana od strane SLAP analize dok aktivnost reakcije nije dostigla vrhunac. U nekim slučajevima, reakcija brzine se povećavala polako tako da nadgledanje SLAP je bilo zaustavljeno pre no što je dostignut vrhunac. Pretvoreni primerci su analizirani na proteinske vrste (proprotein I PRT-201/N-Terminal varijante) od strane SDSPAGE. Da bi povećali ovu strategiju konverzije, supernatant koji sadrži varijantni proprotein je koncentrisan 10 puta koristeći tangencijalni tok filtracije praćen defiltracijom sa 100mM Tris-HCI pH visnine izmedju 8.0 I 9.0 gde su bile veće stope konverzije.
[0285] Proproteini elastaze su navedeni u Tabeli 5 gde je opisano izražavanje u P. pastoris i testiran njihov kapacitet da se podvrgnu auto-konverziji u malim konverzijama u testovima kako su opisani u navedenoj drugoj strategiji konverzije. Rezultati ovih studija su prikazani u nižoj tabeli 5:
Tabela 5: Rezultati izražavanja proproteina elastaze u P. pastoris
[0286] Tabela 5 iznad prikazuje u prvoj koloni prikazuje "Pro-Peptid Ime Sekvence" koja odgovara broju sekvence za naznačenu elastazu rascepa domena. prikazuje "Pro-Peptid Ime Sekvence" odgovara broju sekvence za naznačenu elastazu rascepa domena. Prema tome, 24 odgovara divljem tipu tripsinskom rascepu domena sekvence broja 24. Brojevi 40-49, 52-63 odgovaraju varijanti elastaze rascepa domena sekvencama brojeva 40-49 I 52-63. Kolumna obeležena kao "Korištena boca za mućkanje" odgovara količini odgovarajućeg proproteina u uzgoju superttanta 3 dana posle indukcije kao što je odredjeno SDS-PAGE analizom. Kolumna "Stabilnost boce za mućkanje" odgovara stabilnosti odgovarajućeg proproteina u supernatantu uzgoja boce za mućkanje I posrednika 3 dana posle indukcije kao što je odredjeno količinom PRT-201 / N-terminal varijanti vidjeni u SDS-PAGE analizi. Kolumna obeležena kao Razmera Konverzije odgovara povezanim razmerama konverzije proproteina u PRT-201 kao što je to indicirano vremenom da se dostigne maksimalna SLAP reakcija brzine (brzo; manje od 60 minuta, Srednje; od 60 do 120 minuta, sporo; više od 120 minuta). Vreme konverzije varijante proproteina je odredjena uz pomoć malih skala za analizu konverzije koje je opisana iznad I uporedjena sa vremenom konverzije 24 proproteina odredjena od strane aktivacije koristeći imobilisani tripsin. Kolumna obeležena kao "% N-Terminal Varijanti" se odnosi na procenat konvertovanog proteina koji sadrži N-terminal varijante od zrelog proteina (varijante koje sadrže rascep na vezi C-terminala sa bilo kojim mestom osim P1). Da bi ilustrovali povezane sisteme rangiranja koji su korišteni u tabeli 5, primeri SDS-PAGE, omera konverzije I N-terminal varijanti se analiziraju za podvrstu autoaktiviranih varijanti koje su prikazane na slici 5.
[0287] Analiza raznih varijanti je pokazala da elastaza proproteina koje sadrže ili sekvencu broj 48 ili sekvencu broj 55 varijantne elastaze rascepa domena obezbedjuju autoaktivirane elastaze sa superiornim kvalitetima uključujući srednje i visoke prinose boce za mućkanje I mali procenat varijanti posle konverzije. Dalja analiza elastaze proproteina koja sadrže sekvencu broj 48 ili sekvencu broj 55 varijantne elastaze rascepa domena je otkrila da autoaktivacije odgovarajućih proproteina (elastaza proenzima sekvence broja 64 I sekvence broja 69) su napravile samo jednu klasu N-terminal varijante sa rascepom na peptidnoj vezi C-terminala na ostatke P’2. Dalja analiza elastaze proproteina otkriva da proprotein koji sadrži sekvencu broj 55 varijantne elastaze rascepa domena je stabilnija nego proprotein koji sadrži sekvencu broj 48 varijantne elastaze rascepa domena.
[0288] Početni eksperimenti da se optimizuju uslovi za kontrolisani rascep pročišćenog pro-PRT-201 su obavljeni koristeći proprotein sa 42 pro-peptidnom sekvencom (sekvenca broj 6). Ovaj pročišćeni proprotein je podvrgnut konverziji u matriksu uslova uključujući pH (7.7 do 8.9), sadržaju bafera (0.4 do 10mM natrijum citrate), proteinske koncentracije (0.14 do 0.23 mg/mL) I vremena reakcije (5 do 24 sata). Na kraju konverzijskog perioda, reakcije su bile ugašene dodavanjem mravlje kiseline da bi se pH smanjio na 3.0. Povezane količine proteinskih vrsta u svakoj reakciji su odredjene masivnom spektrometrijom. Na osnovu ovih rezultata, konverzija uslova koja je rezultirala u najmanjem procentu N-terminal varijante je sadržala pH 8.3, sadržaj bafera 100mM Tris I manje od 1mM natrijum citrate, proteinsku koncentraciju od 0.2 mg/mL I vremensku reakciju od 5 do 24 sata. U ovoj studiji, samo krajnje tačke reakcije su bile analizirane. Tako današnje informacije na koverziji kvaliteta nisu pribavljene I konačni rezultati su možda oslikali obe inicijalne produkcije N-terminal varijanti I količinu vremena za degradaciju tih varijanti. HIC-HPLC analiza je napravljena da bi omogućila današnje posmatranje konverzijske reakcije. Dalja konverzija studija optimizacije, uključujući one koje koriste današnje HIC-HPLC posmatranje su opisane u primeru 6.
6.7. PRIMER 6: IZRAŽAVANJE AUTOAKTIVIRANIH PRT-201 u P. PASTORIS-U KORISTEĆI VIŠEKOPIJSKI VEKTOR
[0289] Visestruka integracija rekombinantnih gena u P. pastoris-u je bila koriscena da poveca ekspresiju zeljenih proteina (videti, npr., Sreekrishna et al., 1989, Biochemistry 28:4117-4125; Clare et al., 1991,
Bio/Technology 9:455-460; Romanos et al., 1991, Vaccine 9:901-906). Medjutim, u odredjenim slucajevima, nivoi ekspresije dobijeni od jedne kopije vektorskih integranata bila je efikasna i nije bila poboljsana od strane visekopijskih vektorskih integranata.( (Cregg et al., 1987, Bio/Technology 5:479-485). Spontane multikopijske plazmidske integracije dogadjaju se in vivo u malom broju u P. pastoris-u. da bi se pridobile genomske integracije visestrukih kopija gena i eventualno povecala proteinska izrazenost, In vitro metoda fuzije gena moze biti koriscena da proizvede tandem gena za ubacivanje u vektor koji se eksprimira, pracen transformacijom P. pastoris.
[0290] Pridobiti multikopijski deo celine pPROT55-V varijante, in vitro metodom fuzije gena je koriscena da napravi vektor koji sadrzi više kopija pPROT55-V koji je zatim koriscen za P. pastoris transformaciju. Da bi se napravio multikopijski vektor, pPROT55-V vektor je bio svaren sa BglII i BamHI da otpusti 2.3 kb ekspresione kasete za dešifrovanje pro-PRT-201 gena, AOX1 promotera, i AOX1 transkripcione terminacione sekvence. Ekspresiona kaseta je potom bila spojena sa preparacijom pPROT55-V vektora koji je bio linearizovan sa BamHI i tretiran sa telecom intestinalnom alkalnom fosfatazom (New England Biolabs, MA, USA) da bi se sprecilo pogrešno spajanje. Smesa je bila inkubirana preko noci na 16°C. E. coli TOP 10 soj (Invitrogen, CA, USA)a potom je bila transformisana u ligacionoj reakciji. Transformaciona smesa je bila razlivena na LB-u sa niskom koncentracijom soli u prisustvu 25 mikrograma/ml Zeocina. Transformansi koji su rezistentni na lekove su korisceni i plazmidska DNK je bila spremljena.
[0291] Da bi se utvrdio broj ekspresionih kaseta u rezultirajucim klonovima, plazmidska DNK je bila razlozena sa BglII i BamHI i analizirana pomocu agaroze gel elektroforeze sa DNK velicinskim standardnim markerom. Klon koji sadrzi pojedinacno definisan ubaceni pojas sa velicinom u skladu sa trima 2.3 kb ekspresionim kasetama je bio identifikovan i nazvan pPROT55M3-V. Restrikciono enzimsko mapiranje je korisceno da potvrdi orijentaciju linearne glava-rep multimer formacije za pPROT55M3-V vektor. Figura 6 oslikava pPROT55M3-V klonsku shemu.
[0292] Divlji tip P. pastoris NRRL Y-11430 je koriscen za transformaciju, koji je izveden kao sto je u Primeru 4 objasnjeno, s tim sto je pPROT55M3-V vektor linearizovan sa BglII umesto sa Sacl pre transformacije. Transformantni rezistentni na lekove su uzgajani i skrinizovani za ekspresiju pPROT55M3 proproteina kao sto je objasnjeno u Primeru 4.
[0293] Optimizicija šejker boce je izvedena da smanji spontani rascep tokom indukcije. Optimizacija šejker boce je fokusirana na 2 promenljive, indukcione temperature I indukcione medijske kompozicije. Prvo, utvrđeno je da obavljanje indukcije na 22°C u poređenju sa 25°C rezultiralo je u većoj meri na proenzime nego na zrele enzime u kulturi supernatanta za sve testirane medijske kompozicije.Drugo, dodavanje Natrijum citrata da poveća puferisanu jačinu indukcije, medijski rezultira odsustvom spontanosti konvertovanog zrelog enzima u kulturi supernatanta kroz sve testirane koncentracije natrijum citrata (12.5 to 50 mM).. Efekti ovih promenljivih na prinosu proproteinske ekspresije I stabilnost u šejker bocama supernatanta preko vremena su prikazane na slici 7.
[0294] Visoko izražavanje trostrukog klona 201-55M3-003-VU je izabrano za scale – up fermentaciju analize koristeći fermentacione procedure za utvrđen 201-55M3-003-VU klon opisano na sledeći način. Fermentacija u 201-55M3-003-VU klonu je izvedena odmrzavanjem jedne ćelije u banci koristeći je za ubrizgavanje u šejker bocu koja sadrži 500 ml BKGY, srednjeg rasta pH 5.7. Zasejana kultura je porasla za 24 sata mešanjem na 28°C dok je molalitet mokre ćelije bio približno 40 g/L.. Fermentator koji sadrži BKGY koji raste u pH 5.7 je sterilizovan u autoklavu.Nakon što je medijum ohlađen na 28°C , kvasac, azotna baza I biotin su dodati. Fermentator je inokulisan u razmeri 1:33 u kulturi zasejavanja na BKGY srednjem rastu.
[0295] Procedura vrenja je počela sa feed serijom glicerola I glicerolom zasejanim na pH 5.7 na 28°C.pH je kontrolisan 10 % fosfornom kiselinom I 30 % rastvorima amonijum sulfata. Kultura je mućkana od 300-1000 rpm sa aeracijom za kontrolu rastvorenog kiseonika na 40%.Nakon inicijalne serije glycerol je osiromašen I rastvoren kiseoničnim šiljcima što indukuje pražnjenje glicerola iz sistema, dodatnih 50% glicerola je zasejano na 131 g/h sve dok molalitet nije dostigao između 200g/L do 300g/L. Nakon što je mokra ćelija dostigla molalitet od 200g/L do 300g/L. indukcija je momentalno inicirana sa bolusom metanola koji ima 0,025 mL tečne biomase. Nakon iscrpljivanja metanol bolusa I porasta nezasićenog kiseonika, indukcija je nastavljena dodavanjem ograničenih količina metanola sa konstantnom feed stopom od 0.0034 g metanola/g mase mokre celije/vreme .Na početku konstantnog pothranjivanja metanola pH fermentacione smese je promenjen od 5,7 do 5,5 a temperature je promenjena sa 28°C na 22°C. Fermentacija je prekinuta posle 70h indukcije.
[0296] Za odredivanje relativnih prinosa pojedinacnih i troduplih klonova, klon 201-55-001-VU, koji sadrži jednu genomsku integrantu pojedinacne kopije pPROT55-V vektora fermentovan je paralelno sa klonom 201-55M3-003-VU koji sadrži genomsku integrantu 201-55M3-003-VU vektora. Sve fermentacije su sprovedene na nacin gore opisan osim što je pH bio održavan na 5.7 kroz indukciju. Korišceni supernatanti od 201-55-001-VU do 201-55M3-003-VU fermentacije su analizirani gradijentom SDS - PAGE pracen koloidno plavim bojenjem (slika 8), koja pokazuje da je ekspresija višeg proproteina održavana od multikopije 201-55M3-003-VU u poredenju sa 201-55-001-VU klonom. SDG - PAGE rezultati su potvrdeni HIC HPLC analizom proproteinskom koncentracijom u fermentacionim supernatantima, demonstrirajuci da 201-55M3-003-VU klon proizvodi približno 600 mg/l sekretovanog proproteina dok 201-55-001-VU klon produkuje 400 mg/l. Tako da, multikopija 201-55M3-003-VU koja sadrži tri ekspresione kasete produkuje približno 50 % više proproteina u poredenju sa pojedinacnom kopijom 201-55-001-VU klon koji sadrži pojedinacnu ekspresionu kasetu.
[0297] Dve strategije pretvaranja su testirane koriscenjem 201-55M3-003-VU supernatanta proizvedenim fermentacijom. Ove strategije uglavnom prate opisane strategije za druge varijante proproteina u Primeru 5, osim sto su izvrsavana u vecem obliku. U prvoj strategiji, proprotein je zarobljen iz supernatanta hromatografskom razmenom katjona, pracen pretvaranjem na zrele proteine i hromatografijom poliranja. U drugoj strategiji, proprotein je pretvoren u zrele proteine pre procišcavanja, pracen hromatografskom razmenom katjona, produzenom konverzijom da se uklone N-terminal varijante i dalja hromatografija poliranja. Obe strategije ukljucuju prosirene korake inkubacije u puferu pri pH 8.0 posle konverzije da bi uticao na selektivnu degradaciju N-terminalnih varijanti.
[0298] Koristeci prvu strategiju, zarobljavanje proproteina praceno konverzijom i PRT-201 polish purification su uticali na sledeci nacin. 201-55M3-003-VU supernatant je dobijen iz fermentacione kulture i zamrznuti na -80°C. Oko 7l zamrznutog prociscenog supernatanta ( 3.5L iz 201-55M3-003-VU fermentacije opisane gore i 3.5 L iz 201-55M3-003-VU iz sejker boce kultura pripremljenih generalno kao sto je opisano u primerima 4 i 5) je otopljeno i razredjeno 8 puta sa deioniziranom vodom i 1 M natrijum citrata, pH 4.3, na 2-8°C da dobije konacnu koncentraciju od 25mM natrijum citrata. Ph rastvora je prilagodjen na 4.7. Rešenje je ucitano na 2.3 L bed Macroper High S ne znam ovo. Red je uklonjen sa 5 Cvs 25mM natrijum citrata, pH 4.7, pracen sa 5 CVs 160mM natrijum hlorida, 25mM natrijum citrata pH 4.7.
Proprotein je eluiran sa 15 Cvs linearnog gradijenta pocevsi od 160mM natrijum hlorida na 500mM natrijum hlorida u 25mM natrijum citrata , pH 4.7 na 87 ml/min (67 cm/hr).Eluati su prikupljeni u delovima. Delovi su analizirani SDS-PAGE-om za sadrzaj proteina ( Slika 9.) . Mala kolicina spontano pretvorenog proteina je posmatrana od strane SDS-PAGE-a. Delovi proproteina su prikupljeni za dalju obradu. Objedinjen materijal je izlozen HIC-HPLC analizi, koja je pokazala da se on sastoji od 92% proproteina i 8 % zrele PRT-201
[0299] Da bi se pokrenula konverzija,pribavljen materijal je razmenjen puferom putem tangencijalne filtracije na 100mM natrijum hlorida, 20MM Tris, pH 4.0 koriscenjem stalne jacine difiltracije na 10-12°C. Tangencijalna filtracija je obavljena sa regenerisanom membranom celuloze, transmembranskog pritiska od 15psi, stope protoka od 20L/min i fluksa od 800ml/min. Tri povracene kolicine pufera na 2-8°C dodate su u istoj razmeri kao i fluks. Nakon toga, tri dodatne kolicine pufera, na sobnoj temeraturi , su dodati u istoj razmeri kao i fluks da podignu temperaturu od resenja konverzije do cilja od 26°C. Tangencijalna filtracija je koriscena da se utvrdi resenje konverzije do cilja od 1.5 mg/mL koristeci uslove 15 psi transmembranskog pritiska, 1.2 L/min stope protoka, i 76 ml/min fluksa. Medjutim, posle otprilike 2 minuta od pocetka koncentracije postupka, neocekivani pad je primecen, i proces koncentracije je obustavljen. Koncentracija proteina konverzije resenja je odredjena da bude 1.1 mg/mL UV apsorpcije na 280nm u zapremini od 570mL. Da bi se smanjio dalji pad, konverzija resenja je razredjena do 1mg/mL sa 100mM natrijum hlorida, 20mM Tris, pH 4.0, i filtrira se kroz 0.22 mikrona membrane. Sesnaest mL 3M Tris, pH 9.0 je dodat konverziji resenja.Konverzija resenja je smestena u vodeno kupatilo na 26 °C. Konverzija je pracena HIC-HPLC analizom. Posle 30 minuta, HIC-HPLC je pokazala da je vecina proproteina pretvorena u PRT-201 i neke varijante N-terminala (Slika 10). Nakon 1 sata, konverzija je bila sadrzana od 0% proproteina, 86% pune duzine PRT-201 i 14% N-terminalnih varijanti. Materijal konverzije je dalje inkubiran jos 4 sata, za vreme cega su HIC-HPLC analize pokazale da materijal konverzije sadrzi 98% pune duzine PRT-201 i 2% N-terminalnih varijanti.
[0300] Materijal konverzije je razblazen 4 puta dejonizovanom vodom i 1 M natrijum citratom, pH 4.3, do finalne koncentracije od 25mM natrijum citrata. pH rastvora je prilagodjen za 5.0 u pripremi za poliranje. Rezultat je napunjen na 600 mL bed Macroprep High S za razmenu kationa na 27 mL/min. (83 cm/h). Red je očišćen sa 5 CVs od 20 mM natrijum citrata, pH 5.0 praćen sa 5 CVs od 160 mM natrijum hlorija, 20mM natrijum citrate, pH 5.0 PRT-201 je elutiran sa 15 CVs od linearnog gradijenta počevši od 160mm do 500mm natrijum hlorida u 25mM sodijum citrate, pH 5.0 na 87 mL/min (67 cm/h). Eluati su prikupljeni u delovima. Delovi su analizirani SDS-Page-om za sadrzaj proteina i slap testom za odredjenu aktivnost. Delovi sa sadrzanim PRT-201 sa odredjenom aktivnoscu =30 U/mg su sabrani. Objedinjeni delovi PRT-201 su difilrirani tangecijalnom filtracijom into formula3tion buffer (0.1X PBS, pH 5.0). pH difiltrirane PRT-201 je prilagodjen pH 7.4 i koncentracija proteina je prilagodjena 1 mg/mL tangencijalne filtracije. Bocice su popunjene i liofilizirane kao sto je opisano za PRT-201 proizvedenih od 201-24-266-VU klona u primeru 4.
[0301] Koristeći drugu strategiju, proprotein konverzije je praćen pročišćavanjem PRT-201. Otprilike 7L zaledjenog bistro supernatanta iz 201-55M3-003-VU fermentacije koja je opisana iznad je istpoljeno I konverzija reakcije je inicirana tangentijalnim tokom filtracije sa konverzijom bafera koji sadrži 100mM Tris, pH 8.0, koristeći konstantnu jačinu defiltracije sa temperaturom atmosphere sa regenerisanim celulozama membrane. Dve količine filtrate od 100mM Tris-HCI, pH 8.0 su bile dovoljne za promenu pH od retenanta od 5.0 do 8.0 da bi imale efekta na konverziju. Takodje je sproveden eksperiment direktnim ubrizgavanjem pH bistrog supernanta do 8.0 dodavanjem Tris baze do konačne koncentracije od 100mM I prilagodjavanju pH na 8.0 na 1 N natrijum hidroksida. Ovo je rezultiralo stvaranjem taloga I mutnog supernatanta zbog snižavanja komponenti mešavine, koja nije bila željena. Preferirani metod konverzije koji je koristio tangentalni tok filtracije nije rezultirao taloženjem.
[0302] Konverzija reakcije je posmatrana današnjom HIC-HPLC analizom. Posle pokretanja konverzije, pro-PRT-201 lagano pretvoren u zreo PRT-201 tokom prva 2 sata, praćen je ubrzanjem konverzije (slika 11). Posle 4 I po sata, reakcija konverzije je imala otprilike 4% pro-PRT-201, 75% zrelog PRT-201 I 21% N-terminal varijanti. Posle 6 I po sati, konverzija je imala otprilike 1% pro-PRT-201, 83% zrelog PRT-201 I 16% N-terminal varijanti. Smanjenje N-terminal varijante sa 21% na 16% izmedju 4 I po I 6 I po sati je uzrok degradacije N-terminal varijanti celom dužinom, aktivnog PRT-201, ali ovo nije bilo završeno I ne tako brzo kao redukcija N-terminal varijanti koja se desila tokom konverzije pročišćenog pro-PRT 201. U drugoj strategiji, produžavanje reakcije konverzije možda neće skroz ukloniti N-terminal varijante zbog konkurentnih proteina u supernatantu koji se bori za aktivno mesto elastaze. Da bi se poboljšala reakcija konverzije, materijal posle konverzije je korišten I defiltriran u odgovarajući bafer da bi se pokrenula produžena konverzija na pH 8.0 za selektivnu degradaciju N-terminal varijanti kao što je objašnjeno ispod.
[0303] Skupljanje PRT-201 iz konverzije materijala je bila izvršena na sledeći način. Konverzijski materijal je izmenjen baferom u 20mM natrijum citrata, pH 5.0 I ubačeno u Macro-Prep High S hromatografiju reda za razmenu kationa. Red je očišćen sa 5 CVs od 20mM natrijum citrata, pH 5.0 praćena sa 5 CVs od 20mM natrijum citrata, 160 mM natrijum hlorida, pH 5.0. Delovi koji su analizirani sa SDS-PAGE za proteinski sadržaj, HIC-HPLC za N-terminal varijante, UV absorbovanje na 280 nm na proteinsku koncentraciju, I SLAP analizu za aktivnost elastaze. Dva preovladajuća proteinska kruga su detektovana od strane SDS-PAGE, odgovarajući PRT-201 I PRT-201 glikoformama, kao što je prikazano na slici 12. Delovi koji su sadržali PRT-201 glikoforme odredjene od strane SDS-PAGE ili N-terminal varijantama odredjenim HIC-HPLC su isključene iz udruživanja.Delovi koji su nastanjivali relativno nisku specifičnu aktivnost (manje od 30 U/mg) kao što je odredjeno SLAP analizom su takodje isključene iz udruživanja. Preostali delovi koji sadrže PRT-201 su uključeni za dalju obradu. HIC-HPLC analiza uključenih delova je otkrila da ovaj materijal sadrži otprilike 98% PRT-201 pune dužine I 1-2% N-terminal varijante. Uključeni materijal je uskladišten na temperaturi od 2 do 8 stepeni celzijusa na 12 do 16 sati.
[0304] Imajući u vidu prethodnu obzervaciju da N-terminal varijante su se pojavile da smanje produžen konverzijski period kao što je opisano iznad, udruženi PRT-201 materijal je bio podvrgnut produženoj inkubaciji na pH 8.0. Produžena inkubacija je obavljena defiltracijom I tangentijalnim tokom filtracije sa 100 mM Tris, 300 mM natrijum hlorida, pH 8.0 na 2 I po sata sobne temperature. Posle 2 I po sata, konverzijski materijal se sastojao od 100% zrelog PRT-201 kao što je prikazano HIC-HPLC analizom. Konverzijski materijal je bio podvrgnut defiltraciji I tangentijalnom toku filtracije u 20 mM natrijum citrata, pH 5.0 da bi se suzbila aktivnost elastaze I pripremila za kolonu hromatografije. Defiltrirani PRT-201 materijal je uskladišten na otprilike 64 sata na temperaturi 2-8°C.
[0305] Hromatografija lakom pročišćavanja od PRT-201 je bila izvršena na sledeći način. Defiltrirani PRT-201 materijal je ubačen u Macro-Prep High S kolumnu za razmenu kationa I očišćen sa 5 CVs od Bufera C (20 mM natrijum citrata, pH 5.0) praćeno sa 5 CVs pd 160mM natrijum hlorida, 20mM natrijum citrata, pH 5.0. Elucija PRT-201 je izvršena sa linearnim gradijentom od 15 CVs počevši sa 68% Bafer C I 32% Bafer D (160mM natrijum hlorid, 25 mM natrijum citrat, pH 5.0) do 0% Bafera C I 100% Bafera D (500 mM natrijum hlorida, 25 mM natrijum citrata, pH 5.0), na 50 ml/min (153 cm/h). Eluacija je pokupljena u delovima. PRT-201 je eluirao kao simetričan vrh na 37 mS/cm (330 mM natrijum hlorida). Delovi su analizirani sa SDS-PAGE analizom za proteinski sadržaj, UV absorbovanje na 280 nm za proteinsku koncentraciju I SLAP analizu za specifičnu aktivnost. Delovi koji sadrže PRT-201 koji su imali specifičnu aktivnost od 30.1 – 38.8 u/mg su bili udruženi. Udruženi PRT-201 delovi su defiltrirani tangentijalnim tokom filtracije u formulaciju bafera (0.1X PBS, pH 5.0). pH defiltriranog PRT-201 je prilagodjena na pH 7.4 I proteinska koncentracija je prilagodjena na 1 mg/mL tangentijalnog toka filtracije. Bočice su napunjene I liofilizirane kao što je objašnjeno za PRT-201 koji je napravljen od 201-24-266-VU klona u primeru 4.
[0306] Uslovi za procedure konverzije koje su opisane iznad su izabrane na bazi optimatizacionih studija za konverzije koje su ispitivale koncentraciju proteina, temperature, sadržaja bafera, jačine I pH varijabli. U prvoj studiji, efekt proproteinske koncentracije na proizvodnju N-terminal varijanti tokom konverzije je analizirana. Pročišćeni pro-PRT 201 iz 201-55M3-003-VU klona (pro-PRT-201-55M3-003-VU) na početnoj koncentraciji od 0.2 mg/mL u 20 mM natrijum fosfata, pH 5.0 je alikovan I koncentrisan na 1.0, 1.6 I 1.8 mg/mL koristeći centrifugalnu napravu za koncentraciju kao što je predvidjeno UV absorbovanjem na 280 nm. Konverzija proproteina je izmenjena dodavanjem Tris I natrijum hlorida na 100mM za svaki od 4 koncentraciona uzorka, prilagodjavajući pH od 5.0 do 8.0 I inkubiranjem uzoraka na sobnoj temperature. Reakcija konverzije ne posmatrana HIC-HPLC dok proprotein nije bio 1% ukupnog proteina (Slika 13). Na kraju, 0.2 mg/mL uzorak je imao otprilike 8% N-terminal varijanti gde 1.0 mg/mL, 1.6 I 2.0 mg/mL uzorci su sadržali oko 14%, 19% I 29% N-terminal varijanti.Ostatak proteina u svakom uzorku se sadržao od punih PRT-201. Ovi rezultati pokazuju da povećavanje koncentracije pro-PRT-201-55-003-VU tokom konverzije vodi to formacije više N-terminal varijanti I manje celih PRT-201. Druge studije kažu da se pro-PRT-201-55M3-003-VU konverzija dešava kroz oba intramolekularna I intermolekularne reakcije. Zato za ovu varijantu proproteina ima verovatnoća da intramolekularne reakcije dobiju preciznije konverzije gde intermolekularne reakcije rezultiraju u manje preciznim konverzijama, npr gde je formulacije većeg stepena od N-terminal varijante povezana sa celim PRT-201.
[0307] u drugoj studiji, efekat temperature na produkciju N-terminal varijanti tokom konverzije je analiziran. Pročišćeni pro-PRT-201 iz 201-55M3-VU klona (nazvan pro-PRT-201-55M3-003-VU) je napravljen u koncentraciji od 1.6 mg/mL koji je podvrgnut konverziji kao što je opisano iznad na 15°C ili 26°C. Reakcije konverzije su posmatrane sa HIC-HPLC I dozvoljeno im je da napreduju dok proprotein nije sadržao manje od 1% ukupnog proteina. Vreme koje je bilo potrebno da se dodje do ove redukcije proproteina je otprilike 30 minuta na 26°C I otprilike 90 minuta na 15°C. Danas, sličan procenat N-terminal varijanti (oko 20% ukupnog proteina) za obe temperature je analiziran. Viša temperatura od 26°C je rezultirala bržom reakcijskom konverzijom u poredjenju sa nižom temperaturom od 15°C dok se proizvodila esencijalno identična reakcija profila proizvoda.
[0308] Treća studija je ispitala efekat sadržaja bafera na proproteinsku rastopljivost tokom reakcijske konverzije. Pročišćeni pro-PRT-201 (pro-PRT-201-55M3-003-VU) na koncentraciji od 1.0 mg/mL je podvrgnut konverziji pod uslovima koji su navedeni u tabeli 6. Reakcijska konverzija je izvršena na sobnoj temperature osim jedne (bafer sadržan od 20 mM Tris-HCI, 100mM natrijum hlorid, pH 4.0) koji je izvršen na temperature od 2 do 8 stepeni. Reakcija konverzije su vizualno ispitane na taloženje. Kao što je navedeno u tabeli 6, sadržaj bafera koji nije rezultirao taloženjem je imao 100 mM Tris-HCI, pH 8.0, 100 mm Tris-HCI, 100mM natrijum hlorida, pH 5.0 I 100 mM This-HCI, 300 mM natrijum hlorida, pH 8.0. Sadržaj bafera sa manjom koncentracijom od Tris ili bez natrijum hlorida sa manjim pH (npr. 5.0) je izložen taloženju.
Tabela 6: Efekat tampon kompozicija na taloženje tokom konverzije
[0309] U četvrtoj studiji, analiziran je efekat tangencijalnog protoka filtracije divolumira broj taloga tokom konverzije supernanta koji obuhvata proprotein (pro-PRT-201-55M3-003-VU). Rastvor korišćen za tamponsku razmenu je 100 mM Tris-HCI, 100 mM natrijum hlorida, pH 8.0. Dodatno, prilagođena pH supernata od pH 5.0 do 8.0 bez tangencijalnog protoka filtracije je testirana. Kao što je naznačeno u tabeli 7, prilagođena pH supernata daje veliku vrednost taloga. Sa 1 divolumenom razmene, određeni talog je posmatran. Talog je posmatran kada su korišćena 2 do 5 divolumena.
Tabela 7: Efekat broja divolumena na taloženje tokom tampon promene
[0310] U petoj studiji, analiziran je efekat pH aktivnosti elastaze zrelog PRT-201. Ova studija služi identifikaciji korisnog pH raspona konverzije koji neće rezultirati nepovratnim gubitkom aktivnosti elastaze zrelog PRT-201 proizvoda konverzije. Rastvor od 1 mg/mL PRT-201 u 20 mM Tris-HCl, 20 mM kalijum fosfata je pripremljen od pH 1 to 14. Rastvori su čuvani na sobnoj temperaturi 0.5, 2, 24 i 48 sata. U zadatim vremenskim tačkama, rastvori su testirani na aktivnost elastaze SLAP testom. Aktivnost elastaze je daleko stabilnija od pH 3 do 8 na svim vremenskim tačkama. Na pHs manjoj od 3 i većoj od 8, aktivnost elastaze je redukovana na svim vremenskim tačkama sa korelacijom između tačaka dužeg vremena i niske aktivnosti elastaze. Ovi rezultati ukazuju da konverzijska reakcija koja se obavlja sa pH u rasponu od 3 do 8 može negativno odraziti na aktivnost elastaze PRT-201 produkta konverzije.
6.8 PRIMER 7: PROIZVODNJA AUTO-AKTIVIRANE REKOMBINANTNE ELASTAZE TIPA I SVINJSKOG PANKREASA
[0311] Vektor kodiran sa auto-aktiviranim proenzimom svinjske ELA-1 je izražen u P. pastoris. Rezultat auto-aktivirane svinjske ELA-1 upoređen sa proteinom svinjske ELA-1 protein je izražen kao aktivirani divlji tip proproteina.
[0312] Da bi se napravio aktivirani tripsin vektora svinjske ELA-1 vector, mesto kodiranja svinjske ELA-1 je sintetizovano pomoću Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA) koristeći ne-PCR tehniku "dugi oligo" licenciranu od Amgen (Thousand Oaks, CA). Rekombinantni gen je kloniran unutar Blue Heron pUC vektora, derivata pUC119. Gen svinjske ELA-1 je usklađen sa oba lanca da bi se potvrdila tačnost sekvence. SacII and Xbal mesta ograničenja su inkorporisana kao potencijalna mesta kloniranja bočnih gena svinjske ELA-1 kako je prikazano na slici 14. Drugi korak je takođe dodat odmah nakon kodona domaćina kako bi se minimalizovalo potencijalno očitavanje ribozoma. Slika 15 prikazuje sekvence identičnih amino kiselina proenzima svinjske ELA-1 koji obuhvata mesto aktiviranog enzima.
[0313] Mesto kodiranja svinjske ELA-1 je pojačano PCR korišćenjem para oligonukleotida koji obuhvataju XhoI iSacII mesta ograničenja kako bi se olakšalo kloniranje. The PCR proizvod je prevaren sa Xhol i SacII i prečišćen gelom aragoze elektroforeze. Fragment svinjske ELA-1 je kloniran unutar vektora PV-1 na mestima ograničenja XhoI i SacII E. coli TOP 10 crta je transformisana sa spornom smešom. Smeša ćelija je obložena sa malo soli LB dopunjenom sa 25 mg/mL Zeocin. Klonovi rezistenta leka su odabrani i plazimid DNK je pripremljen (Qiagen, CA). Baziran na restriktivnoj analizi, klon koji obuhvata ubačeni gen svinjske ELA-1 je identifikovan i vektor je imanovan kao pPROT101-24-V. Sekvenca kodiranja ovog vektora je potvrđena DNK sekvenciranjem. Šema kloniranja za pPROT101-24-V je opisna na slici 16.
[0314] Korišćenjem vektora aktiviranog tripsina pPROT101-24-V, tri različita auto.aktivirana klona su projektovana promenom mesta cepanja tripsina u mestu pro-peptida mesta cepanja svinjske elastaze ELA-1. Mesto usmerenja mutageneza se obavlja generalno kako je opisano u primeru 4 korišćenjem sintetičkih početaka oligonukleotida koji obuhvataju željene mutacije kako je opisano u tabeli 8. Sve mutacije mesta pro-peptida su potvrđene dvostrukim standardom DNK sekvenciranja.
Tabela 8: Sekvence mesta cepanja aktiviranog tripsina i vektora svinjske ELA-1. Mutagenizovani kodoni su osenčeni.
Spona cepanja je između P1 i P'1.
[0315] Divlji tip NRRL Y-11430 P. P. pastoris je transformisan i tipovi koji su otporni na lekove su stavljeni u uzgoj i testirani na ekspresiju svinjskih ELA-1 proteina i opisani su u trećem primeru. Na osnovu SDSPAGE-a i Coomassie staining (videti grafike 17 i 18) vidi se da je divlji tip tripsinski aktiviranih pProt 101-24-V klonova imao najviši nivo ekspresije kada se uporedi sa klonovima koji su imali auto aktivaciju. Od auto aktiviranih klonova pPROT101-49-V klonovi su imali najveći nivo ekspresije, i za njim slede pPROT101-55L-V i pPROT101-49-V klonovi. Klonovi sa auto aktivacijom, pPROT101-42-V i pPROT101-55L-V, ispoljili su spontanu konverziju tokom introdukcije, dok su tripsinski aktivirajući pPROT101-24-V i auto-aktivirajući pPROT101-49-V proptoteini pokazali veću stabilnost u medijumu.
[0316] Studije aktivnosti elastaze od PRT-102 dobijenog tripsinskom aktivacijom proelastaznog proteina izraženog iz pPROT101-24-V je pokazao viši nivo specifične aktivnosti nego PRT-201 prikazan na tabeli 9 ispod:
Tabela 9: Aktivnost elastaze na tri različita uzorka zrele elastaze tipa I svinjskog pankreasa (aktivirani tripsin) kao poređenje sa zrelom elastazom tipa I ljudskog pankreasa
[0317] Eksperiment konverzije na maloj skali je korišten da se odredi da li pPROT101-55L-V I pPROT101-49-V proproteining mogu biti pretvoreni u zrele enzime izložene aktivnosti elastaze. pPROT101-55L-V I pPROT101-49-V boca za mućkanje supernatanta je bila koncentrisana 10 puta sa centrifugalnim filterskom jedinicom I razblažena 5 puta sa 100 mM Tris-HCI, pH 9.0. Konverzija je omogućena da bi se nastavila na sobnoj temperature I aktivnost elastaze je bila posmatrana neko vreme SLAP analizom. Prosečna promena u absorbovanju po minuti je bila odredjena svake vremenske tačke I prijavljena kao brzinska reakcija koja nije normalizovana (Slika 19). Konverzija oba pPROT101-55L-V I pPROT101-49-V supernatanata je rezultirala povećanjem aktivnosti elastaze. Poslednja vremenska tačka uzorka iz svakog klona je analizirana sa SDS-PAGE I skoro čitav pPROT101-49-V proprotein je pretvoren u zreo protein na kraju
konverzijske analize. Rezultati SDS-PAGE su pokazali da skoro čitav pPROT101-55L-V je bio spontano pretvoren u zreo protein pre analize konverzije.
[0318] Pročišćeni preparati od pPROT101-24-V I pPROT101-49-V proproteina I zrelih enzima su poslati u Danforth Plant Science Center, MO za čistu analizu molekularne težine. Proproteini su pročišćeni sa hromatografskom razmenom kationa (Macroprep High S, Bio-Rad). Za analizu zrelih enzima, proproteini iz oba klona su prvo lečeni da bi proizveli zrele enzime I onda pročišćeni hromatografskom razmenom kationa. Proprotein koji je aktiviran tripsinski je lečen sa tripsinom dok je automatska aktivacija proproteina pretvorena u prisustvu 100mM Tris-HCI, pH 9.0, praćena hromatografskom razmenom kationa. Najveći vrhunci dobijeni iz masovne spektrometrijske analize su prikazani u tabeli 10.
Tabela 10: Očekivane i posmartane molekularne težine proteina svinjske ELA-1
[0319] SDS-PAGE, rezultati aktivnosti elastaze I masovne spektromentrije su predstavljeni tako što su autoaktivacijske forme tipa I svinjske elastaze gušterače mogu biti napravljeni tehnikom propeptidne sekvence da se zameni tripsinski rascep sa elastazom mesta rascepa. Ekspresioni nivoi ovih autoaktiviranih formi tipa I svinjske elastaze gušterače su manji nego divlji tip tripsinski aktivirane forme. Od autoaktiviranih klonova koji su testirani, oni sa pPROT101-49-V propeptid sekvencom su pokazali najveći nivo ekspresije I najmanje spontane konverzije. Konverzija pPROT101-49-V I pPROT101-55L-V klonova je rezultirala produkcijom zrelih proteina sa aktivnosti elastaze. Analiza masivne spektrometrije je pokazala da molekularna težina pPROT101-49-V proproteina I zrelog svinjskog tipa I odgovarala očekivanoj težini.
6.9 PRIMER 8: ANALIZA TRIPSINSKE AKTIVNOSTI U ZRELOM REKOMBINANTU LJUDSKE ELASTAZE-1 OD BENZ KOLOMETRIJSKIM ANALIZAMA PEPTIDSKE PODLOGE
[0320] Kolometrijska analiza hidrolize koristeći malu peptidsku podlogu N-benzoil-Phe-Val-Arg- pNitroanilide (BENZ) je izvršena da bi se odredilo da li pročišćena zrela elastaza proteina koja je napravljena od autoaktiviranog klona 201-55M3-003-VU poseduje tripsinsku aktivnost. Tri bočice liofiliziranog PRT-201 pročišćenog od klona 201-55M3-003-VU su dobijene iz skladišta sa - 80°C I rekonstutisani sa vodom da bi dobili 1 mg/mL PRT-201 u 0.1 X PBS , pH 7.4 Proteinske koncentracije su potvrdjene merenjem UV absorbovanja na 280 nm. TrypZean (10 mg/mL) je korišten za stvaranje standardne krive za tripsinsku aktivnost. Prethodno testiran PRT-201 uzorak na tripsinsku aktivaciju je usvojen kao pozitivna kontrola. Dodano, neki eksperimenti I kontrolni uzorci su probijeni sa TrypZean da bi se odredio povratak tripsinske aktivnosti u prisustvu PRT-201. Podskup probijenih I neprobijenih uzoraka je lečen sa sojom tripsinskog inhibitatora (SBTI) da bi se odredila mogućnost SBTI da sprečavaju bilo kakvu svojstvenu ili probijenu tripsinsku aktivnost. TrypZean standardi su takodje lečeni sa SBTI da bi potvrdili efektivnost inhibiatora. Pogledati tabelu 11 ispod za pregled uzoraka koji su korišteni u ovoj studiji.
Tabela 11: TrypZean rastvori za standardne krive su pripremljeni upotrebom testa tampona (0.1 M Tris, pH 8.3).
Standardna kriva za Tr Zean rastvorie e rikazana na slici 21.
[0321] Substratno rešenje je pripremljeno (0.4 mg/mL N-benzoyl-Phe-Val-Arg-pNitroanilide Lot 7733 u 0.1 M Tris,pH 8.3) I prethodno zagrejan na 30°C u vodi. Utrostručen, 100 mikrolitara svakog uzorka je ubačene u mikroploču sa 96 rupica. Koristeći multikanalski ubacivač, 200 mikrolitara substratnog rešenja je ubačeno u svaku rupicu I mikroploča je odmah postavljena u čitač mikroploče koji je prethodno zagrejan na 30°C. Čitač mikroploče je zabeležio absorbovanje na 405 nm za svaku rupicu jednom u minuti za 60 minuta.
[0322] PRT-201 uzorci su takodje testirani na aktivnost elastaze u SLAP analizi. SLAP substratsko rešenje je bilo pripremnjeno (4.5 mg/mL SLAP u 0.1 M Tris, pH 8.3) I prethodno zagrejano na 30°C u vodi. 1 mg-mL PRT-201 uzoraka su razredjene 20 puta sa vodom do 0.05 mg/mL. Utrostručeno, 10 mikrolitara svakog razredjenog uzorka je ubačen u mikroploču sa 96 rupica. Koristeći multikanalski ubacivač, 300 mikrolitara SLAP substratskog rešenja je ubačeno u svaku rupicu I mikroploča je odmah postavljena u čitač mikroploče prethodno zagrejane na 30 °C. Čitač mikroploče je zabeležio absorbovanje na 405 nm za svaku rupicu jednom u minuti za 5 minuta.
[0323] Rezultati BENZ i SLAP analiza aktivnosti su predstavljene u tabelama 12 i 13 ispod.
Tabela 12: Glavna tripsinska aktivnost, navedena kao TrypZean ekvivalent koncentracije (ng/mL). [a] Koeficijent regresije < 8.0.
Tabela 13. Glavna SLAP aktivnost navedena kao U/m
[0324] Nivo tripsinske aktivnosti od PRT-201 iz klona 201-55M3-003-VU je bio ispod nivoa standardne krive u analizi tripsinske aktivnost (manje od 1.56 ng/mL). Dodatno, koeficijenti regresije za utrostručavanje hidrolize reakcija su bile male (manje od 0.8 podržavajući nedostatak tripsinske aktivnosti u ovom autoaktiviranom zrelom proteinu elastaze. U poredjenju, nivo tripsinske aktivnosti od kontrole tripsinsko-aktivacionog uzorka je odredjena da bude 8.7 ng/mL.
7. LISTA SEKVENCI
[0325]
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
nastavak
(nastavak)
nastavak
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
nastavak
(nastavak)

Claims (23)

Patentni zahtevi
1. Autoaktivaciona protein proelastaza obuhvatajući (i) sekvencu propeptida koja obuhvata sekvencu elastaze aktivacionog peptida koji sadrži aminokiseline označene P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1, od kojih su aminokiseline P3-P2-P1 napravljene da formiraju sekvencu prepoznavanja elastaze, operativno povezanu na (ii) aminokiselinsku sekvencu zrelog tipa I elastaze čije su tri N-terminalne amino kiseline označene P1'- P2'- P3', pri čemu
(a) propeptidna sekvenca nije poreklom iz zrelog tipa I elastaze, i
(b) kada podleže autoaktivacionim uslovima, proizveden je zreli tip I elastaze.
2. Autoaktivaciona protein proelastaza prema patentnom zahtevu 1, u kojoj :
(a) sekvenca za prepoznavanje elastaze ima prolinski ostatak lociran na poziciji P2;
(b) aminokiseline P3 preko P1 se sastoje od sekvence aminokiselina SEK ID BR: 11, SEK ID BR: 12, SEK ID BR: 13, SEK ID BR: 18, SEK ID BR: 20, SEK ID BR: 21 ili SEK ID BR: 93;
(c) amino kiseline P5 preko P3’ se sastoje od amino kiseline SEK ID BR: 48, SEK ID BR: 49, SEK ID BR: 52, SEK ID BR: 53, SEK ID BR: 54, SEK ID BR: 55, SEK ID BR: 56, SEK ID BR: 57, SEK ID BR: 58, SEK ID BR: 59 ili SEK ID BR: 60; ili
(d) aminokiseline P10 preko P1 se sastoje od sekvence aminokiselina SEK ID BR: 72, SEK ID BR: 73, ili SEK ID BR: 80.
3. Autoaktivaciona protein proelastaza prema patentnom zahtevu 1ili patentnom zahtevu 2, pri čemu:
(a) autoaktivaciona protein proelastaza obuhvata sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 66 ili SEK ID BR: 68; (b) zreli tip I elastaze je zreli humani tip I elastaze, koji opciono sadrži sekvencu aminokiseline koja ima:
(i) najmanje 85% identiteta sekvence, najmanje 95% identiteta sekvence, najmanje 98% identiteta sekvence, najmanje 99% identiteta sekvence ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom aminokiseline SEK ID BR: 1, SEK ID BR: 78 ili SEK ID BR: 84; ili
(ii) ne više od 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 konzervativne supstitucije (a) amino kiseline u poređenju sa sekvencom aminokiseline SEK ID BR: 1 ili SEK ID BR: 84 i/ili ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nekonzervativne supstitucije (a) aminokiseline u poređenju sa sekvencom amino kiseline SEK ID BR: 1, SEK ID BR: 78 ili SEK ID BR: 84; ili
(c) zreli tip I elastaza je zreli tip svinjske I elastaze, koji opciono sadrži sekvencu aminokiseline koja ima:
(i) najmanje 85% identiteta sekvence, najmanje 95% identiteta sekvence, najmanje 98% identiteta sekvence, najmanje 99% identiteta sekvence ili 100% identiteta sekvence sa sekvencom amino kiseline SEK ID BR: 39; ili
(ii) ne više od 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 konzervativne supstitucije (a) amino kiseline u poređenju sa sekvencom amino kieline SEK ID BR: 39 i/ili ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 ne-konzervativne supstitucije (a) amino kiseline u poređenju sa sekvencom aminokiseline SEK ID BR: 39.
4. Autoaktivaciona protein proelastaza prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, koja:
(a) nema signalnu sekvencu;
(b) obuhvata signalnu sekvencu, koja je opciono:
(i) signalna sekvenca koja je operabilna u Pichia pastoris, koja je opciono kvasac α-faktor signalne sekvence i/ili obuhvata sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 34; ili
(ii) signalna sekvenca sekrecije sisara, koja je opciono signalna sekvenca humanog tipa 1 elastaze ili signalna sekvenca svinjske tipa 1 elastaze;
(c) obuhvata alfa faktor propeptida kvasca;
(d) obuhvata jedan ili više razmak sekvenci, opciono pri čemu je najmanje jedan razmak sekvenci Kex2 sekvenca i / ili sekvenca STE13;
(e) nema N-terminalni ostatak metionina; ili
(f) obuhvata N-terminalni ostatak metionina.
5. Supernatant ćelijske kulture koja sadrži autoaktivacionu protein proelastazu tipa I pankreasa prema bilo kojem od patentnih zaheva od 1 do 4.
6. Molekul nukleinske kiseline koja kodira autoaktivacionu protein proelastazu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4.
7. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 6, pri čemu opciono;
(a) sekvenca koja kodira autoaktivacionu protein proelastazu je multimerizovana;
(b) sekvenca koja kodira autoaktivacionu protein proelastazu koristi kodone koji se prvenstveno koriste u Pichia pastoris; ili
(c) vektor sadrži selektivni marker gen za rezistenciju na Zeocin.
8. Ćelija domaćina koja:
(a) je proizvod genetskog inženjeringa da izrazi molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahevu 6, pri čemu opciono:
(i) jedna kopija pomenute nukleinske kiseline je integrisana u genom ćelije domaćina; ili
(ii) više od jedne kopije pomenute nukleinske kiseline je integrisano u genom ćelije domaćina, pri čemu opciono su 2-5 kopija, 2 kopije ili 3 kopije nukleinske kiseline integrisane u genom ćelije domaćina;
ili
(b) sadrži vektor prema patentnom zahtevu 7, pri čemu opciono:
(i) jedna kopija pomenutog vektora je integrisana u genom ćelije domaćina; ili
(ii) više od jedne kopije pomenutog vektora je integrisano u genom ćelije domaćina, pri čemu opciono 2-5 kopija, 2 kopije ili 3 kopije vektora su integrisane u genom ćelije domaćina.
9. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je ekspresija autoaktivacione protein proelastaze pod kontrolom promotera inducibilnog metanolom i/ili pri čemu je ćelija domaćina Pichia pastoris ćelija domaćina.
10. Metod produkcije autoaktivacione protein proelastaze, obuhvatajući kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 8 ili patentnom zahtevu 9 pod uslovima koji dovode do proizvodnje autoaktivacione protein proelastaze i oporavljanja autoaktivacione protein proelastaze, pri čemu opciono:
(a) ćelija domaćina je kultivisana u kompleksnom medijumu, koji je opciono puferisan metanol kompleksnim medijumom ili puferisan glicerol kompleksnim medijumom; i/ili
(b) ekspresija autoaktivacione protein proelastaze je pod kontrolom metanol- inducibilnog promotera i pri čemu uslovi kultivisanja uključuju period indukcije metanola; i ili
(c) ćelija domaćina je kultivisana u prisustvu jedinjenja citrata, sukcinata ili acetata, pri čemu opciono:
(i) jedinjenje citrata, sukcinata ili acetata je natrijum citrat, natrijum sukcinat ili natrijum acetat, respektivno; i/ili
(ii) najmanje jedno jedinjenje citrata, sukcinata ili acetata je prisutno u pomenutoj kulturi pri koncentraciji od 5 - 50 mM, 7,5-100 mM, 10-150 mM, 50 - 200 mM, 100-150 mM, 75 - 125 mM, ili 90 - 110 mM; i/ili
(d) ćelija domaćina je ćelija domaćina Pichia pastoris, i pri čemu uslovi kulture obuhvataju period rasta ili indukcije:
(i) na temperaturi od 22 - 28°C; ili
(ii) na pH od 2 - 6; i/ili
(e) ćelija domaćina je kultivisana u kompleksnom medijumu, i korak oporavljanja autoaktivacione protein proelastaze obuhvata oporavljanje supernatanta iz kulture ćelije domaćina i opciono dalje obuhvata oporavljanje autoaktivacione protein proelastaze iz supernatanta.
11. Metod prema patentnom zahtevu 10, koji dalje obuhvata podvrgavanje oporavljene autoaktivacione protein proelastaze u uslove aktivacije tako da je proizveden zreli tip I protein elastaze, pri čemu opciono:
(a) uslovi aktivacije obuhvataju podešavanje pH rastvora koji sadrži autoaktivirajuću protein proelastazu do bazne pH, pH od 7-9; ili pH od 8 dok se ne proizvode zreli tip I protein elastaze, i opciono:
(i) održavanje pH tokom perioda od 0,5-8 sati, 2-7 sati ili 6 sati;
(ii) izloženost baznoj pH se izvodi na temperaturi od 22°C do 28°C ili temperaturi od 26°C; i/ili (iii) koncentracija oporavljene autoaktivacione protein proelastaze u rastvoru je manja od 10 mg/ml, manja od 5 mg/ml, manja od 2 mg/ml, manja od 1 mg/ml, manja od 0,5 mg/ml, manja od 0,25 mg/ml i/ili najmanja od 0,1 mg/ml ili najmanja od 0,2 mg/ml; i/ili
(b) uslovi aktivacije obuhvataju dodavanje katalitičke količine elastaze u rastvor koji sadrži autoaktivacionu protein proelastazu; i/ili
(c) autoaktivacija se izvodi u prisustvui Tris baze u koncentraciji od 50-200 mM, 75-175 mM, 100-150 mM, 75-125 mM; i/ili
(d) održavanje uslova aktivacije dok su N-terminalne varijante redukovane na raspon od 0-2%.
12. Metod prema patentnom zahtevu 11, pri čemu:
(a) autoaktivacioni korak je izveden posle prečišćavanja autoaktivacione protein proelastaze; ili
(b) autoaktivacioni korak je izveden u supernatantu.
13. Metod prema patentnom zahtevu 11 ili patentnom zahtevu 12, koji dalje obuhvata korak izolovanja zrelog tipa I proteina elastaze, pri čemu opciono:
(a) zreli tip I elastaze proteina je izolovan hromatografijom na koloni, pri čemu opciono hromatografija uključuje katjon izmenjivačku hromatografiju; i/ili
(b) glikolizovani oblici zrelog tipa I protein elastaze su uklonjeni.
14. Postupak za proizvodnju formulacije zrelog tipa I protein elastaze, pomenuti metod obuhvata:
(a) podvrgavanje autoaktivacionog proteina proelastaze prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4, za autoaktivacione uslove tako da je proizveden zreli tip I protein elastaze;
(b) opciono, prečišćavanje zrelog tipa I elastaze; i
(c) formulisanje zrelog tipa I protein elastaze,
na taj način proizvodeći farmaceutsku kompoziciju koja sadrži pomenuti zreli tip I protein elastaze.
15. Metod prema patentnom zahtevu 14, koja obuhvata prečišćavanje zrelog tipa I elastaze putem hromatografije na koloni, opciono katjon izmenjivačke hromatografije.
16. Metod prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 15, pri čemu formulisanje zrelog tipa I protein elastaze obuhvata liofiliziranje pomenutog zrelog tipa I elastaze, opciono dalje obuhvatajući mešanje zrelog tipa I protein elastaze sa jednim ili više puferskih sastojaka pre ili posle liofilizacije.
17. Farmaceutska kompozicija koja:
(a) obuhvata zreli tip I protein elastaze koji ima aktivnost od 20 do 50 U/mg proteina kao kvantificiranog koristeći kolorimetrijski N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilid (SLAP) hidrolizni test, pri čemu je gornja granica tripsina u pomenutoj farmaceutskoj kompoziciji manja od 25 ng tripsina po 1 mg zrelog tipa I protein elastaze, i pri čemu:
(i) zreli tip I elastaze obuhvata sekvencu aminokiseline sa najmanje 85% identičnosti sekvence, najmanje 95% identičnosti sekvence, najmanje 98% identičnosti sekvence ili najmanje 99% identičnosti sekvence, ili sadrži 100% identičnosti sekvence, u sekvenci aminokiseline SEK ID BR: 1, SEK ID BR: 78 ili SEK ID BR: 84; ili
(ii) zreli tip I protein elastaze obuhvata sekvencu aminokiseline koja ima ne više od 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstitucije konzervativne aminokiseline i/ili ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 supstitucije nekonzervativne amino kiseline u poređenju sa sekvencom amino kiseline SEK ID BR: 1, SEK ID BR: 78 ili SEK ID BR: 84; ili
(b) obuhvata zreli tip protein elastaze koji ima aktivnost od 20 do 100 U/mg proteina kao kvantifikovanog koristeći kolorimetrijski N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-pNitroanilid (SLAP) hidrolizni test, pri čemu je gornja granica tripsina u pomenutoj farmaceutskoj kompoziciji manja od 25 ng tripsina po 1 mg zrelog tipa protein elastaze, i pri čemu opciono:
(i) zreli tip I elastaze obuhvata sekvencu aminokiseline sa najmanje 85% identičnosti sekvence, najmanje 95% identičnosti sekvence, najmanje 98% identičnosti sekvence ili najmanje 99% identičnosti sekvence, ili sadrži 100% identičnosti sekvence, u sekvenci amino kiseline SEK ID BR: 39; ili
(ii) zrel tip I protein elastaze sadrži sekvencu amino kiseline koja ima ne više od 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstitucije konzervativne amino kiseline u poređenju sa sekvencom amino kiseline SEK ID BR: 39.
18. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahevu 17, pri čemu:
(a) gornja granica aktivnosti tripsina u pomenutoj kompoziciji je manja od 4, 3, 2 ili 1,56 ng po 1 mg zrelog tipa I protein elastaze, pri čemu je opciono gornja granica aktivnosti tripsina u pomenutoj kompoziciji kvantifikovana koristeći kolorimetrijski N-benzoil-Phe-Val-Arg pNitroanilid (BENZ) kolorimetrijski test aktivnosti tripsina;
(b) farmaceutska kompozicija je bez tripsina; i/ili
(c) farmaceutska kompozicija je karakterisana sa jednim ili više od sledećeg:
(i) farmaceutska kompozicija je bez bakterijskih proteina;
(ii) farmaceutska kompozicija je bez proteina sisara, osim pomenute zrele protein elastaze;
(iii) količina endotoksina u pomenutoj farmaceutskoj kompoziciji ne prelazi farmaceutski prihvatljivu količinu,
ne prelazi 10 EU po gramu elastaze tipa I elastaze ili ne prelazi 5 EU po gramu tipa I elastaze;
(iv) farmaceutska kompozicija je u obliku jedinične doze obuhvatajući 0.0033 mg - 200 mg pomenute zrele protein elastaze;
(v) farmaceutska kompozicija obuhvatajući polisorbat-80;
(vi) farmaceutska kompozicija obuhvatajući dekstran;
(vii) farmaceutska kompozicija obuhvatajući natrijumove jone, kalijumove jone, fosfatne jone, hloridne jone, i polisorbat 80;
(viii) farmaceutska kompozicija obuhvatajući natrijumove jone, kalijumove jone, fosfatne jone, hloridne jone, i dekstran;
(ix) farmaceutska kompozicija obuhvatajući natrijumove jone, kalijumove jone, fosfatne jone, hloridne jone,
polisorbat-80 i dekstran;
(x) farmaceutska kompozicija obuhvatajući trehalozu;
(xi) farmaceutska kompozicija obuhvatajući manitol;
(xii) zrela protein elastaza u farmaceutskoj kompoziciji održava 60% do 100% njegove specifične aktivnosti posle najmanje jednog meseca skladištenja na 4°C, posle najmanje tri meseca skladištenja na 4°C ili posle najmanje šest meseci skladištenja na 4°C.
19. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 17 (a), koja
(a) sadrži manje od 0.5% po težini proteina koji se sastoji od SEK ID BR: 2 i/ili manje od 0.5% po težini proteina koji se sastoji od SEK ID BR: 3, i opciono je bez ili suštinski bez proteina od SEK ID BR: 2
i od proteina koji se sastoji od SEK ID BR: 3; i/ili
(b) je bez ili suštinski bez bilo kojeg proteina koji se sastoji od SEK ID BR: 70 i 71; i opciono
(c) je bez ili suštinski bez jednog ili više proteina koji se sastoje od bilo kojeg od SEK ID BR: 37, 38, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 i 108, poželjno bez ili suštinski bez bilo kojeg proteina koji se sastoji od bilo koje od SEK ID BR: 37, 38, 85, 86, 94, 95, 104, 105, 106, 107 ili 108.
20. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 17 do 19, koja je liofilizovana farmaceutska kompozicija.
21. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 17 do 19, koja je tečna farmaceutska kompozicija i opciono:
(a) sadrži natrijum hlorid;
(b) sadrži fiziološki rastvor puferisan sa fosfatom;
(c) sadrži fosfatni pufer;
(d) sadrži manitol u koncentraciji od 2 - 10% težine po zapremini ili 2,5-4% težine po zapremini;
(e) sadrži polisorbat-80 u koncentraciji od 0,001 do 5% težine po zapremini ili 0,01 % težine po zapremini; (f) ima osmolarnost od 125-500 mOsm/kg ili 275-325 mOsm/kg; ili
(g) ima koncentraciju zrelog tipa I elastaze od 0,1 mg/ml - 50 mg/ml.
22. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 21, koja:
(a) sadrži 137 mM natrijum hlorida, 2.7 mM kalijum fosfata, 10 mM natrijum fosfata, ima pH 7.4, gde opciono:
(i) farmaceutska kompozicija sadrži 0,01% polisorbat-80 i opciono gde koncentracija zrelog tipa I protein elastaze u pomenutoj farmaceutskoj kompoziciji je 0.001 - 50 mg/ml;
(ii) koncentracija zrelog tipa I protein elastaze u pomenutoj farmaceutskoj kompoziciji je 0.001 - 50 mg/ml i farmaceutska kompozicija sadrži 5-10% ili 6-9% ekscipijensa izabranog iz dekstroze, laktoze, manitola, saharoze, trehaloze, dekstrana-70, glicerina, arginina, glicina, dekstrana-44 ili dekstrana-18; ili
(iii) koncentracija zrelog tipa I protein elastaze u pomenutoj farmaceutskoj kompoziciji je 0.001-50 mg/ml i kompozicija dalje sadrži 8% dekstrana-18 i opciono 0,1% polisorbat-80; ili
(b) sadrži jednu ili više od dekstroze, laktoze, manitola, saharoze, trehaloze, dekstrana-70, glicerina, arginina, glicina, dekstrana-44 i dekstrana-18 u koncentraciji agregata od 2-10% w/v, 2,5-8% w/v ili 4-6% w/v.
23. Farmaceutska kompozicija kao što je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva 17 do 22, za upotrebu u metodi:
(a) lečenja ili sprečavanja bolesti bioloških kanala putem primenjivanja farmaceutske kompozicije na pacijentu kojem je to potrebno, gde opciono:
(i) farmaceutska kompozicija je primenjena parenteralno;
(ii) farmaceutska kompozicija je primenjena direktno u zid krvnog suda;
(iii) farmaceutska kompozicija je primenjena direktno na spoljnu adventijalnu površinu hirurški izloženog krvnog suda; ili
(iv) farmaceutska kompozicija je primenjena na zidu krvnog suda pomoću katetera za isporuku leka;
(b) terapijskog povećanja prečnika arterije ili vene kod ljudskog subjekta kojem je to potrebno lokalno primenjujući farmaceutsku kompoziciju na zid arterije ili vene kod ljudskog subjekta;
(c) sprečavanja vazospazma arterije ili vene kod ljudskog subjekta kojem je to potrebno lokalno primenjujući farmaceutsku kompoziciju na zid arterije ili vene kod ljudskog subjekta;
(d) lečenja opstruirane arterije ili vene kod ljudskog subjekta kojem je potreban takav tretman lokalnim primenjivanjem farmaceutske kompozicije na zid arterije ili vene kod ljudskog subjekta, pri čemu pomenuta primena rezultira u proteolizi elastina u zidu arterije ili vene što dovodi do povećanja prečnika arterije ili vene;
(e) lečenja arterije ili vene koje je povezano sa arteriovenoznom hemodijalizom transplanta ili arteriovenskom fistulom kod ljudskog subjekta kojem je potrebno takvo lečenje lokalnim primenjivanjem farmaceutske kompozicije na zid arterije ili vene kod ljudskog subjekta, pri čemu pomenuta primena dovodi do proteolize elastina u zidu arterije ili vene koja dovodi do povećanja prečnika arterije ili vene; ili
(f) lečenja vena kod ljudskog subjekta za primenu u hemodijalizi lokalnim primenjivanjem farmaceutske kompozicije na zid vene kod ljudskog subjekta, pri čemu pomenuta primena rezultira proteolizom elastina u zidu vene koji vodi do povećanja prečnika vene.
RS20170443A 2007-12-04 2008-12-04 Rekombinantne elastaze proteina i metode njihove proizvodnje i njihova upotreba RS55982B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US99231907P 2007-12-04 2007-12-04
US12/327,809 US8501449B2 (en) 2007-12-04 2008-12-03 Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
EP13181046.7A EP2666854B1 (en) 2007-12-04 2008-12-04 Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55982B1 true RS55982B1 (sr) 2017-09-29

Family

ID=40344763

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170443A RS55982B1 (sr) 2007-12-04 2008-12-04 Rekombinantne elastaze proteina i metode njihove proizvodnje i njihova upotreba
RS20130514A RS53083B (sr) 2007-12-04 2008-12-04 Rekombinantni proteini elastaze i metodi proizvodnje i upotrebe istih

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20130514A RS53083B (sr) 2007-12-04 2008-12-04 Rekombinantni proteini elastaze i metodi proizvodnje i upotrebe istih

Country Status (25)

Country Link
US (14) US8501449B2 (sr)
EP (3) EP2666854B1 (sr)
JP (3) JP5829808B2 (sr)
KR (3) KR101824350B1 (sr)
CN (4) CN103952388B (sr)
AR (1) AR069584A1 (sr)
AU (1) AU2008338743B2 (sr)
BR (1) BRPI0819977A2 (sr)
CA (1) CA2707051C (sr)
CY (2) CY1114724T1 (sr)
DK (2) DK2666854T3 (sr)
ES (2) ES2627066T3 (sr)
HR (2) HRP20131135T1 (sr)
HU (1) HUE032739T2 (sr)
IL (2) IL206157A (sr)
LT (1) LT2666854T (sr)
MX (2) MX341317B (sr)
NZ (2) NZ601592A (sr)
PL (2) PL2666854T3 (sr)
PT (2) PT2229440E (sr)
RS (2) RS55982B1 (sr)
RU (1) RU2611200C2 (sr)
SI (2) SI2666854T1 (sr)
TW (2) TWI577385B (sr)
WO (1) WO2009079220A2 (sr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8501449B2 (en) * 2007-12-04 2013-08-06 Proteon Therapeutics, Inc. Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
CN102250863B (zh) * 2011-04-29 2012-12-05 天津金斯坦生物科技有限公司 基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途
US10202630B2 (en) 2013-03-15 2019-02-12 Alderbio Holdings Llc Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells
CA2905180C (en) 2013-03-15 2023-03-07 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells
KR20250121449A (ko) * 2017-03-10 2025-08-12 볼트 쓰레즈, 인크. 재조합 단백질을 고분비 수율로 생산하기 위한 조성물 및 방법
EP4292606B1 (en) * 2017-06-15 2025-11-12 The University of Chicago Compositions for treating cancer
IL293238A (en) * 2019-11-26 2022-07-01 Childrens Hospital Med Ct Cela-1 inhibition for treatment of lung disease
EP4090758A1 (en) * 2020-01-14 2022-11-23 Basf Se Method for producing recombinant protein in yeast cells
WO2022040288A1 (en) * 2020-08-18 2022-02-24 Onchilles Pharma, Inc. Modified serine protease proproteins
JP2023545346A (ja) * 2020-08-18 2023-10-30 オンチレス・ファーマ・インコーポレイテッド 改変ブタ膵臓エラスターゼタンパク質

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2508408A (en) 1943-10-11 1950-05-23 Sidney H Liebson Averaging indicator
US2546308A (en) 1948-12-29 1951-03-27 Kahler John Floor marking device
US5212068A (en) * 1985-04-05 1993-05-18 Sankyo Company Limited Human pancreatic elastase
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
JPH0673456B2 (ja) * 1986-04-26 1994-09-21 三共株式会社 ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉ▼
US5162205A (en) 1986-04-26 1992-11-10 Sankyo Company, Limited Human pancreatic elastase I
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5543302A (en) 1988-05-27 1996-08-06 Solvay Enzymes, Inc. Proteases of altered stability to autolytic degradation
DK105489D0 (da) 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
SG122763A1 (en) 1989-11-06 2006-06-29 Cell Genesys Inc Production of proteins using homologous recombination
GB8927722D0 (en) 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
NZ236819A (en) 1990-02-03 1993-07-27 Max Planck Gesellschaft Enzymatic cleavage of fusion proteins; fusion proteins; recombinant dna and pharmaceutical compositions
US5503333A (en) 1993-06-23 1996-04-02 Laventure; David Duster extension tube system with dust collecting region and tube cleaner and method of using the same
ATE226642T1 (de) 1994-07-07 2002-11-15 Tno Modifizierte proenzyme als substrate für proteolische enzyme
US5955072A (en) 1994-07-13 1999-09-21 Sankyo Company, Limited Expression systems utilizing autolyzing fusion proteins and a reducing polypeptide
US7531325B2 (en) 1997-04-25 2009-05-12 Sembiosys Genetics Inc. Method for cleavage of fusion proteins
US20030207402A1 (en) 1997-08-22 2003-11-06 Erhard Kopetzki Autocatalytically activatable zymogenic precursors of proteases and their use
GB9817909D0 (en) 1998-08-17 1998-10-14 Zeneca Ltd DNA constructs
GB9908458D0 (en) 1999-04-13 1999-06-09 Queen Mary & Westfield College Enzyme
WO2000068363A2 (en) 1999-05-05 2000-11-16 Genentech, Inc. Elastase variants and substrates
US7001892B1 (en) * 1999-06-11 2006-02-21 Purdue Research Foundation Pharmaceutical materials and methods for their preparation and use
ATE361095T1 (de) * 1999-09-24 2007-05-15 Proteon Therapeutics Inc Verwendung von elastase zur öffnung verstopfter arterien und venen
US7063838B1 (en) 1999-09-24 2006-06-20 Proteon Therapeutics Llc Methods for treating an artery or vein in a human subject
US7351549B2 (en) 2000-01-24 2008-04-01 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Method for the manufacture of recombinant trypsin
AU4329001A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Compound Therapeutics, Inc. Improved methods for generating catalytic proteins
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US20060189941A1 (en) 2002-01-22 2006-08-24 Mercator Medsystems, Inc. Methods and kits for volumetric distribution of pharmaceutical agents via the vascular adventitia and microcirculation
EP1624786A4 (en) 2003-02-20 2011-07-13 Proteon Therapeutics Inc METHOD FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF ILLNESSES OF BIOLOGICAL CHANNELS
US7571008B2 (en) 2003-08-18 2009-08-04 Medtronic, Inc. System and apparatus for remote activation of implantable medical devices
WO2005124342A2 (en) * 2004-06-21 2005-12-29 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
CA2580957A1 (en) 2004-09-22 2006-04-06 Proteon Therapeutics, Inc. Methods for the treatment and prevention of diseases of biological conduits
RU2299070C2 (ru) * 2005-02-08 2007-05-20 Открытое акционерное общество "Химико-фармацевтический комбинат "АКРИХИН" (ОАО "АКРИХИН") Фармацевтическая композиция для лечения заболевания вен и способ ее получения
US20060193824A1 (en) 2005-02-28 2006-08-31 Rubin Bruce K Methods for the treatment of infectious and inflammatory airway diseases
CN1769424A (zh) * 2005-09-20 2006-05-10 浙江大学 一种芽孢杆菌菌株及其用途
KR20140072201A (ko) * 2006-07-05 2014-06-12 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
US8501449B2 (en) 2007-12-04 2013-08-06 Proteon Therapeutics, Inc. Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
CN104928335A (zh) * 2008-04-03 2015-09-23 哈森阿尔法生物技术研究院 用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20131135T1 (hr) 2014-01-03
US20190062718A1 (en) 2019-02-28
IL226771A0 (en) 2013-07-31
IL206157A (en) 2013-07-31
CY1118930T1 (el) 2018-01-10
HUE032739T2 (en) 2017-10-30
US10301612B2 (en) 2019-05-28
EP2229440A2 (en) 2010-09-22
RU2010127232A (ru) 2012-01-10
JP6084653B2 (ja) 2017-02-22
US9057060B2 (en) 2015-06-16
CY1114724T1 (el) 2016-10-05
RU2611200C2 (ru) 2017-02-21
AU2008338743A1 (en) 2009-06-25
PT2666854T (pt) 2017-06-28
US20160243205A1 (en) 2016-08-25
SI2229440T1 (sl) 2013-12-31
JP5829808B2 (ja) 2015-12-09
TW200938219A (en) 2009-09-16
US20110081705A1 (en) 2011-04-07
WO2009079220A3 (en) 2009-08-06
WO2009079220A2 (en) 2009-06-25
JP2017104114A (ja) 2017-06-15
KR20180011860A (ko) 2018-02-02
DK2666854T3 (da) 2017-05-22
CN104711243B (zh) 2019-06-11
US10308924B2 (en) 2019-06-04
US20190010476A1 (en) 2019-01-10
KR20100120639A (ko) 2010-11-16
ES2627066T3 (es) 2017-07-26
US20090162343A1 (en) 2009-06-25
US20150166974A1 (en) 2015-06-18
HK1148772A1 (en) 2011-09-16
JP2015172056A (ja) 2015-10-01
PT2229440E (pt) 2013-11-11
CA2707051A1 (en) 2009-06-25
US20150322420A9 (en) 2015-11-12
EP2229440B1 (en) 2013-08-28
KR101824350B1 (ko) 2018-01-31
US20130336956A1 (en) 2013-12-19
TWI619726B (zh) 2018-04-01
RS53083B (sr) 2014-06-30
CN101918547B (zh) 2015-01-14
CA2707051C (en) 2019-05-21
NZ601592A (en) 2014-02-28
HRP20170755T1 (hr) 2017-07-28
JP2011505164A (ja) 2011-02-24
IL206157A0 (en) 2010-12-30
BRPI0819977A2 (pt) 2020-08-18
TWI577385B (zh) 2017-04-11
ES2436783T3 (es) 2014-01-07
EP3176262A1 (en) 2017-06-07
CN109893647A (zh) 2019-06-18
PL2229440T3 (pl) 2014-07-31
TW201643188A (zh) 2016-12-16
SI2666854T1 (sl) 2017-06-30
US20110008315A1 (en) 2011-01-13
US20180208918A1 (en) 2018-07-26
US20150329846A1 (en) 2015-11-19
CN104711243A (zh) 2015-06-17
MX2010006211A (es) 2010-10-25
US20160319267A1 (en) 2016-11-03
CN103952388B (zh) 2017-10-03
US20200208132A1 (en) 2020-07-02
LT2666854T (lt) 2017-06-12
NZ585866A (en) 2012-09-28
KR101732190B1 (ko) 2017-05-04
MX341317B (es) 2016-08-15
EP2229440B9 (en) 2013-11-13
US8501449B2 (en) 2013-08-06
US20180155703A1 (en) 2018-06-07
AR069584A1 (es) 2010-02-03
EP2666854A1 (en) 2013-11-27
CN103952388A (zh) 2014-07-30
US20180273928A1 (en) 2018-09-27
KR20160095184A (ko) 2016-08-10
AU2008338743B2 (en) 2015-02-19
EP2666854B1 (en) 2017-03-15
DK2229440T3 (da) 2013-12-09
PL2666854T3 (pl) 2017-08-31
CN101918547A (zh) 2010-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10301612B2 (en) Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
AU2013204017B2 (en) Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
HK1191673A (en) Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
HK1148772B (en) Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
HK1191673B (en) Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof