[go: up one dir, main page]

RS55683B1 - Antikoagulantni protivotrovi - Google Patents

Antikoagulantni protivotrovi

Info

Publication number
RS55683B1
RS55683B1 RS20170195A RSP20170195A RS55683B1 RS 55683 B1 RS55683 B1 RS 55683B1 RS 20170195 A RS20170195 A RS 20170195A RS P20170195 A RSP20170195 A RS P20170195A RS 55683 B1 RS55683 B1 RS 55683B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dabigatran
antibody
seq
fab
methyl
Prior art date
Application number
RS20170195A
Other languages
English (en)
Inventor
Ryn Joanne Van
John Edward Park
Norbert Hauel
Ulrich Kunz
Tobias Litzenburger
Keith Canada
Sanjaya Singh
Alisa Waterman
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42061991&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55683(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of RS55683B1 publication Critical patent/RS55683B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39583—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials not provided for elsewhere, e.g. haptens, coenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast tehnike
Predmetni pronalazak pripada oblasti medicine, prvenstveno oblasti antikoagulantne terapije.
Stanje tehnike
Antikoagulanti su supstance koje sprečavaju koagulaciju; odnosno, oni sprečavaju krv da se zgruša. Antikoagulanti su široko rasprostranjeni u ljudskoj terapiji kao lek za tromboidne poremećaje, na primer primarna i sekundarna prevencija duboke venske tromboze, pulmonamog embolizma, miokardialnih infarkta i moždanih udara kod onih koji su predisponirani.
Važna klasa oralnih antikoagulanata deluje antagonizujući dejstva vitamina K, na primer kumarina koji obuhvata varfarin. Druga klasa jedinjenja inhibira koagulaciju indirektno preko kofaktora kao što je antitrombin III ili heparin kofaktor II. Ovo obuhvata nekoliko nižih molekulskih težina proizvoda heparina koji katalizuju inhibiciju predominantnog faktora Xa (i u manjoj meri trombin) preko antitrombina III (bemiparin, certoparin, dalteparin, enoksaparin, nadroparin, pamaparin, reviparin, tinzaparin). Oligosaharidi malog lanca (fondaparinuks, idraparinuks) inhibiraju samo faktor Xa preko antitrombina III. Heparinoidi (danaparoid, sulodeksid, dermatan sulfat) deluju preko oba kofaktora i inhibiraju oba faktora Xa i trombin. Treća klasa predstavlja direktne inhibitore koagulacije. Direktni faktori Xa inhibitora obuhvataju apiksaban, edoksaban, otamiksaban, rivaroksaban, i direktni trombin inhibitori obuhvataju bivalentne hirudine (bivalirudin, iepirudin, desirudin), i monovalentna jedinjenja argatioban i dabigatran.
Zgrušavanje krvi predstavlja biološki mehanizam za zaustavljanje krvarenja, sporedni efekat antikoagulantne terapije može biti neželjeno krvarenje. Stoga je poželjno da se obezbedi protivotvor koji će moći da zaustavi takvo krvarenje koje je povezano sa antikoagulacijom kada se desi (Zikria and Ansell, Current Opinion in Hematologv 2009. 16(5): 347-356). Jedan način da se postigne ovo jeste neutralizacija aktivnosti antikoagulantnog jedinjenja koji je prisutan kod pacijenta posle pri mene.
Trenutno dostupni antikoagulantni protivotrovi su protamin (za neutralizaciju heparina) i vitamin K za neutralizaciju antagonista vitamina K kao što je varfarin. Sveže zamrznuta plazma i rekombinantni faktor Vila su takođe korišćeni kao ne specifični protivotrovi kod pacijenata pod niskom molekulskom težinom heparin lečenja koji pate od velike traume ili teškog krvarenja (Lauritzen. B. et ai. Blood. 2005, 607A-608A.). Takođe su prijavljenji protamin fragmenti (US Patent Br. 6.624,141) i mali sintetički peptidi (US Patent Br. 6,200,955) kao heparin ili heparin protivotrovi niske molekulske težine; i trombin muteini (US Patent Br. 8,060,300) kao protivotrovi za trombin inhibitor. Protrombin intermedijeri i derivati su prijavljeni kao protiotrovi za hirudin i sintetički trombin inhibitori (US Patent Br. 5,817,309 i 8,086,871). Za direktni faktor Xa inhibitora, analozi inaktivnog faktora Xa su predloženi kao protivotrovi (WO 2009042962). Dalje, rekombinantni faktor Vila je korišćen kako bi preokrenuo efekat indirektnog antitrombin III zavisnog faktora Xa inhibitora kao što je fondaparinuks i idraparinuks (Bijsterveld, NR et al. Circulation. 2002. 106: 2550-2554: Bijsterveld. NR et al. British J. of Haematology, 2004 (124): 653-658). Pregled postupaka antigoaguantnog preokreta je obezbeđen u Schulman i Bijsterveld, Transfusion Medicine Revievvs 2007. 21(1): 37-48. Zikriaetal., curr. opin. Hematol. (Sep 2009), Vol 16, Br. 5, str. 347-356 otkriva prednost direktnog trombin inhibitora dabigatrana i beleži da protivotrovi za direktne trombin inhibitore nedostaju.
Postoji potreba da se obezbedi poboljšani protivotrovi za antikoagulantnu terapiju, a prvenstveno da se obezbede protivotrovi za direktne trombin inhibitore kao što je dabigatran za koji do sada nisu otkriveni specifični protivotrovi.
KRATAK OPIS PRONALASKA
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela koji ima sposobnost vezivanja molekula za dabigatran, kao što je opisano u zahtevima.
U referentnim aspektima, koji nisu deo predmetnog pronalaska, antikoagulant je disupstutisani biciklični heterocikl opšte formule
gde
A označava karbonil ili sulfonil grupu vezanu za benzo, pirido ili tieno ostatak grupe Het,
B označava etilen grupu u kojoj metilen grupa vezana za grupu Ar može biti zamenjena sa atomom kiseonika ili sumpora ili sa -NR^ grupom, gde
Rioznačava atom vodonika ili C^-alkil grupu,
E označava RbNH-C(=NH)- grupu gde
Rboznačava atom vodonika, hidroksi, d-9-alkoksikarbonil, cikloheksiloksikarbonil, fenil-Ci_3-alkoksikarbonil, benzoil, p-Ci_3-alkil-benzoil ili piridinoil grupu, doketoksi ostatak na položaju 2 prethodno navedene d.g-alkoksikarbonil grupe može dodatno biti supstutisan sa d-3-alkilsulfonil
ili 2-(C1-3-alkoksi)-etil grupom.
Ar označava 1,4-fenilen grupu opciono supstituisanu sa atomom hlora ili sa metil, etil ili metoksi grupom ili označava 2,5-tienilen grupu,
Het označava 1-(d-3-alkil)-2,5-benzimidazolilen, 1-ciklopropil-2,5-benzimidazolilen, 2,5-benzotiazolilen, 1 -(Ci_3-alkil)-2,5-indolilen, 1 -(d-3-alkil-2,5-imidazo[4,5-b]piridinilen, 3-(C1_3-alkil)-2,7-imidazo[1,2-a]piridinilen ili 1 -(Ci.3-alkil)-2,5-tieno[2,3-d]imidazolilen grupu i Raoznačava R2NR3- grupu gde
R2je d-4-alkil grupa koja može biti supstituisana sa karboksi, d-6-alkiloksi karbonil, benziloksikarbonil, d_3-alkilsulfonilaminokarbonil ili 1 H-tetrazol-5-il grupom.
C2-4-alkil grupa supstituisana sa hidroksi, benziloksi, karboksi-d-3-alkilamino, d-3-alkoksikarbonil-d_3-alkilamino, N-(C^-aikiO-karboksi-d-s-alkilamino ili N-(d-3-alkil)-Ci. 3-alkoksikarbonil-d-3-alkilamino grupu, dok u prethodno navedenim grupama atom ugljenika na a-položaju ka susdnom atomu azota može da ne bude supstituisan,
R3označava C3 7-cikloalkil grupu, propargil grupu, pri čemu nezasićeni deo ne mora da bude vezan direktno za atom azota R2NR3grupe, fenil grupu koja je opciono supstituisana sa atomofluora ili hlora, ili sa metil ili metoksi grupu, pirazolil, piridazolil ili piridinil grupu opciono supstituisanu sa metil grupom ili
R2 i R3zajedno sa atomom azota između njih označava 5- do 7- članu cikloalkilenimino grupu, opciono supstituisanu sa karboksi ili d_4-alkoksikarbonil grupom, za koji prsten fenila može dodatno da bude spojen,
njegovi tautomeri, stereoizomeri i soli.
U daljem referentnom aspektu, antikoagulant je jedinjenje odabrano između
(a) 2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benztiazol-5- karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-karboksietil)-amid, (b) 2 -[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benztiazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (c) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (d) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(3-hidroksikarbonilpropil)-amid, (e) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(hidroksikarbonilmetil)-amid, (f) 1 -Metil-2-[2-(2-amidinotiofen-5-il) etil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (g) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (h) 1-Metil-2-[2-(4-amidinofenil) etil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (i) 1 -Metil-2-[2-(4-amidinofenil) etil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (j) 1-Metil-2-[2-(4-amidinofenil) etil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-[2-(1 H-tetrazol-5-il) etil]-amid, (k) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-[2-(1 H-tetrazol-5-il) etil]-amid, (I) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (m) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil aminometil]- benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(3-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (n) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]- benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (o) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-[(N-hidroksikarboniletil-N-metil)-2-aminoetil]-amid, (p) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(3-fluorofenil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (q) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(4-fluorofenil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (r) 1-Metil-2-[N-(4-amidino-2-metoksi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (s) 1-Metil-2-[N-(4-amidino-2-metoksi-fenil) -aminometil]-benzimidazol-5-il- karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (t) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)aminometil]-indol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-metoksikarboniletil)-amid, (u) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)aminometil]-tieno[2.3-d]imidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (v) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(w) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(x) 1-Metil-2-[N-(4-amidino-2-metoks-fenil)- aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid.
(y) 1 -Metil-2-[N-[4-(N-n-heksiloksikarbonilamidino)fenil]- aminometilj-benzimidazol-
5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-etoksikarboniletil)-amid, i
njegovi tautomeri, stereoisomeri i soli.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela protiv dabigatrana, dabigatran eksetilata, i/ili O-acilglucuronid dabigatrana.
U drugom aspektu, molekul antitela je monoklonalno antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, fragment antitela, prvenstveno Fab, Fab', ili F(ab')2 fragment, antitelo pojedinačnog lanca, prvenstveno varijabilni fragment pojedinačnog lanca (scFv), ili diatelo.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela kao što je prethodno opisano za korišćenje u medicini, prvenstveno kao medikament.
U drugom aspektu, predmetni opis se odnosi na molekul antitela kao što je ranije opisano za korišćenje u terapiji ili prevenciji sporednih efekata antikoagulantne terapije.
U drugom aspektu, sporedni efekat predstavlja krvarenje.
U drugom aspektu, predmetni opis se odnosi na postupak lečenja ili prevencije sporednih efekata antikoagulantne terapije, koji obuhvata primenu efikasne količine molekula antitela kao što je ranije opisano na pacijenta kome je to potrebno.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kit koji obuhvata molekul antitela kao što je opisano, zajedno sa posudom i etiketom.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1:Povećano vreme za zgrušavanje viđeno sa povećanim koncentracijama dabigatrana korišćenjem analize vremena zgrušavanja trombina. 200 nM koncentracija rezultuje u~5-fold proceni vremena zgrušavanja preko osnovne linije i korišćen je u prvom i drugom setu eksperimenata. 500 nM koncentracija (supraterapeutska) je korišćena u poslednjem setu eksperimenata.
Slika 2:Četiri različita antitela na dabigatran (A-D) svi neutrališu produženo vreme zgrušnjavanja dabigatran u ljudskoj plazmi. Osnovna linija koagulacija u ljudskoj plazmi je 10.9 sekundi, kada je 200 nM dabigatrana preinkubirano sa plazmom, zgrušnjavanje je produženo na 51 sekundi. Svako antitelo je dodato plazmi koja je preinkubirana sa 200 nM dabigatrana i dalje inkubirana na 5 min. Vreme zgrušnjavanja trombina je potom započeto dodavanjem trombina. Svako antitelo bi moglo prekokrenuti vreme zgrušnjavanja dabigatran na različite stepene. Najkoncentrovaniji rastvor rezultovan u najvećem preokretu antikoagulantne aktivnosti.
Slika 3:Efekat povećanih koncentracija poliklonalnog antitela (antitelo D) dodato ljudskoj plazmi koja je bila preinkubirana sa 200 nM dabigatrana je izmeren. Osbovno vreme zgrušnjavanja je 11 sekundi, dodavanje dabigatrana produžuje zgrušnjavanja na 63.7 sekundi. Efekat koji povećava razblaživanje antitela tako što preokreće produženo vreme zgrušnjavanja trombina sa dabigatranom je potom testiran. Najniža koncentracija redukuje vreme zgrušnjavanja trombina na 43.9 sekundi. Visoke koncentracije u potpunosti redukuju vreme zgrušnjavanja trombina do osnovnih nivoa i rezultuje u potpunoj neutralizaciji antikoagulantnog efekta dabigatrana. Dodavanje ne određenog zečijeg poliklonalnog antitela (kvadrat) nema nikakvog efekta na promenu smera antikoagulantnog efekta dabigatrana.
Slika 4:Efekat povećanja koncentracija poliklonalnog antitela (antitelo D) dodatog u ljudsku plazmu koja je prethodno bila inkubirana sa 500 nM dabigatrana je izmeren. Osnovna linija vremena zgrušavanja je bila 10.9 sekundi, dodavanje ovako visoke koncentracija dabigatrana je produžilo zgrušavanje na 111.7 sekundi (~10-fold povećanje). Efekat 1:2 razblažanja antitela ili rastvora preokreće produženo vreme zgrušavanja trombina sa dabigatranom na način koncentracione zavisnosti. Najviša koncentracija takođe upotpunosti preokreće vreme zgrušavanja trombina na osnovne nivoe i rezultuje u potpunoj neutralizaciji antikoagulantnog efekta čak superterapeutskih koncentracija dabigatrana.
Slika 5:Sekvence varijabilnih regiona teških lanaca anti-dabigatran molekula antitela.
Slika 6:Sekvence varijabilnih regiona lakih lanaca anti-dabigatran molekula antitela.
Slika 7:Mišije monoklonalno antitelo (Klon 22) preokreće antikoagulacioni efekat dabigatrana u ljudskoj plazmi i u ljudskom krvotoku. Povećane koncentracije mišijeg antitela su dodate ljudskoj plazmi ili krvotoku koja je prethodno bila inkubirana sa 30 nM dabigatrana. Analiza je započeta dodavanjem 1.5 - 2 U/mL trombina i vreme zgrušavanja je izmereno. 100% dabigatran aktivnosti je definisano kao diferencija u vremenu zgrušavanja u prisustvu i odsustvu jedinjenja. Zavisnost doze antitela inhibira posredovanje dabigatrana u produženju vremena zgrušavanja.
Slika 8:Mišiji Fab generisan iz Klona 22 antitela preokreće antikoagulantni efekat dabigatrana u ljudskoj plazmi. Povećane koncentracije mišijeg Fab su dodate ljudskoj plazmi koja je prethodno bila inkubirana sa 7 nM dabigatrana. Nedirnuto antitelo je takođe testirano kao pozitivna kontrola. Analiza je započeta dodavanjem 0.4 U/mL trombina i vreme zgrušavanja je izmereno. 100% inhibicije je definisano kao potpuna blokada povećanja dabigatrana koji posreduje u povećanju vremena zgrušavanja. Dozna zavisnost Fab inhibiranog dabigatrana izaziva produženje vremena zgrušavanja u ljudskoj plazmi.
Slika 9:Mišije monoklonalno antitelo (Klon 22) preokreće antikoagulantni efekat dabigatran acilglukuronida u ljudskoj plazmi. Povećane koncentracije mišijeg antitela su dodate ljudskoj plazmi koja je prethodno inkubirana sa 7 nM dabigatran acilglukuronida ili dabigatrana. Analiza je započeta dodavanjem of 0.4 U/mL trombina i vreme zgrušavanja je izmereno. 100% inhibicije je definisano kao potpuna blokada jedinjenja posredovanog u povećanju vremena zgrušavanja. Dozna zavisnost antitela inhibira dabigatran acilglukuronid koji izaziva produženje vremena zgrušavanja u ljudskoj plazmi.
Slika 10:Humanizovani Fab (Fab 18/15) peokreće antikoagulacioni efekat dabigatrana u ljudskoj plazmi. Povećane koncentracije Fab 18/15 su dodate ljudskoj plazmi koja je prethodno bila inkubirana sa 7 nM dabigatrana. Analiza je započeta sa dodavanjem 0.4 U/mL trombina i vreme zgrušavanja je izmereno. 100% inhibicije je definisano kao potpuna blokada dabigatrana posredovanog u povećanju vremena zgrušavanja. Dozna zavisnost Fab inhibira dabigatran koji izaziva produženje vremena zgrušavanja u ljudskoj plazmi.
Slika 11:Vreme zgrušavanja trombina ex vivo krvotoka (3.0 U/mL trombin) kod pacova koji primaju dabigatran kao kontinuirana infuzija sa bolus primenom ekvimolarnog Fab pri t-0. Linija sa punim krugovima predstavlja tretman sa nosačem bez leka. Linija sa punim kockama predstavlja dabigatran antikoagulantnu aktivnos bez Fab. Linija sa punim trouglovima predstavlja antikoagulantnu aktivnost posle primene Fab. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SE, n=4 životinja po lečenoj grupi.
Slika 12:Ex vivo krvotok aPTT kod pacova koji primaju dabigatran kao kontinuirana infuzija sa bolus primenom ekvimolarnog Fab pri t=0. Linija sa punim krugovima predstavlja tretman sa nosačem bez leka. Linija sa punim kockama predstavlja dabigatran antikoagulantnu aktivnos bez Fab. Linija sa punim trouglovima predstavlja antikoagulantnu aktivnost posle primene Fab. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SE, n=4 životinja po lečenoj grupi.
Slika 13:Vreme zgrušavanja trombina ex vivo krvotoka (3.0 U/mL trombin) kod pacova koji primaju dabigatran kao kontinuirana infuzija sa bolus primenom povećanih doza Fab pri t=0. Linija sa punim krugovima predstavlja tretman sa nosačem bez leka. Linija sa punim kockama predstavlja dabigatran antikoagulantnu aktivnos bez Fab. Linija sa punim trouglovima predstavlja antikoagulantnu aktivnost posle primene Fab i isprekidana linija 50% ekvimolarne doze. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SE, n=4 životinja po lečenoj grupi.
Slika 14:Ex vivo krvotok aPTT kod pacova koji primaju dabigatran kao kontinuirana infuzija sa bolus primenom ekvimolarnog Fab pri t=0. Linija sa punim krugovima predstavlja tretman sa nosačem bez leka. Linija sa punim kockama predstavlja dabigatran antikoagulantnu aktivnost bez Fab. Linija sa punim trouglovima predstavlja antikoagulantnu aktivnost posle primene Fab i isprekidana linija 50% ekvimolarne doze. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SE, n=4 životinja po lečenoj grupi.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela sposoban da neutrališe aktivnost dabigatrana.
Antitela (takođe poznata kao imunoglobulini, skraćeno Ig) su gama globulin proteini koji mogu da se pronađu u krvi ili drugim telesnim tečnostima kičmenjaka, i korišćeni su od strane imunog sistema kako bi identifikovali i neutralisali strane objekte, kao što su bakterije i virusi. Oni su obično napravljeni od bazičnih strukturnih jedinica - svaka sa dva velika teška lanca i dva mala laka lanca - kako bi se obrazovali, na primer, monomeri sa jednom jedinicom, dimeri sa dve jedinice ili pentamera sa pet jedinica. Antitela se mogu vezati, sa ne kovalentnom interakcijom, za druge molekule ili strukture poznati kao antigeni. Ovo vezivanje je specifično u smislu da će se antitelo vezati samo za određenu strukturu sa visokim afinitetom. Jedinstveni deo antigena prepoznat od strane antitela se naziva epitop, ili antigenska determinanta. Deo antitela koji se vezuje za epitop se ponekad naziva paratop i nalazi se u takozvanom varijabilnom domenu, ili varijabilnoj regiji (Fv) antitela. Varijabilni domen obuhvata tri takozvana komplementarno određena regiona (CDR s) razmaknut sa okvirnim regionima (PR's).
U okviru konteksta ovog pronalaska, referenca za CDR's je zasnovana na definiciji od strane Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917), zajedno sa Kabat ( E.A. Kabat. T.T. Wu. H. Biiofskv. M. Reid-Milfer and H. Perry. Sequence of Proteins of Immunological Interest, National institutes of Health. Bethesda (1983)).
Tehnika je dalje razvila antitela i učinila ih svestranim u medicini i tehnologiji. Prema tome, u kontekstu predmetnog pronalaska termini "molekul antitela" ili "antitelo" (ovde korišćen sinonim) ne samo da obuhvata antitela kao što se mogu naći u prirodi, koja obuhvataju npr. dva laka lanca i dva teška lanca, III samo dva teška lanca kao kod vrste kamile, ali dalje obuhvata sve molekule koji sadrže bar jedan paratopen sa vezujućom specifičnosti za antigen i strukturnu sličnost za varijabiln i domen imunoglobulina.
Prema tome, molekul antitela prema pronalasku može biti monoklonalno antitelo, ljudsko antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, fragment antitela, prvenstveno Fv, Fab, Fab', ili F(ab')2fragment, antitelo pojedinačnog lanca, prvenstveno varijabilni fragment pojedinačnog lanca (scFv), Malo Modularno Imunofarmaceutsko (Small Modular Immunopharmaceuticai (SMIP)), diatelo.
Poliklonalna antitela predstavljaju kolekciju molekula antitela sa različitim amino kiselinskim sekvencama i mogu se dobiti iz krvi kičmenjaka posle imunizacije sa antigenom postupkom koji je opšte poznat u tehnici.
Monoklonalna antitela (mAb ili moAb) su monospecifična antitela koja su identična u amino kiselinskoj sekvenci. Oni mogu biti dobijeni hibridnom tehnologijom iz hibridne ćelijske linije (koja se zove hibridoma) predstavljajući klon fuzije određene B ćelije koja proizvodi antitelo sa mijeloma (B ćelija raka) ćelijom (Kohler G. Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibodv of predefined specificitv. Nature 1975:256:495-7.). Alternativno, monoklonalna antitela mogu se dobiti rekombinantnom ekspresijom u ćeliji domaćina (Norderhaug L Olafsen T, Michaeisen TE. Sandlie i. (May 1997;. "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.". J Immunol Methods 204 (1); 77-87: videti takođe u nastavku).
Za primenu kod čoveka, često je poželjno da se smanji imunogenost antitela originalno izvedeni iz drugih vrsta, kao što su miševi. Ovo se može uraditi sa konstrukcijom himernih antitela, ili sa postupkom koji se zove "humanizacija". U ovom kontekstu "himemo antitelo" se shvata da je antitelo koje sadrži deo sekvence (npr. varijabilni domen) izveden iz jednih vrsta (npr. miševa) spojeni za deo sekvence (npr. konstantne domene) izvedene iz različitih vrsta (npr. ljudi). "Humanizovano antitelo" je antitelo koje sadrži varijabilni domen originalno izveden iz ne ljudskih vrsta, pri čemu izvesne amino kiseline su mutirane kako bi ličile na celokupnu sekvencu tog varijabilnog domena što bliže sekvenci humanog varijabilnog domena. Postupci himerizacije i humanizacije antitela su opšte poznati u tehnici (Biiletta R. Lobuglio AF. "Chimeric antibodies". Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76; Riechmann L, Clark M, VValdmann H, VVinter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy".Nature:332:323.).
Dalje, razvijene su tehnologije za stvaranje antitela zasnovana na sekvencama izvedenim iz ljudskog genoma, na primer, fagnim prikazom ili korišćenjem transgenskih životinja (WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCaffertv, A.D. Griffiths and G. VVinter (1991) "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displaved on phage." J.Mol.Biol., 222, 581-597; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; S. Carmen and L. Jermutus, "Concepts in antibody phage displav". Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2): 189-203; Lonberg N, Huszar D. "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.; Brijggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice". CurrOpin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.). Takva antitela su "humana anitela " u kontekstu predmetnog pronalaska.
Molekuli antitela prema predmetnom pronalasku takođe obuhvataju fragmente imunoglobulina koji zadržavaju antigenske vezujuće sposobnosti, kao što su Fab, Fab', ili F(ab')2fragmenti. Takvi fragmenti mogu biti dobijeni fragmentacijom imunoglobulina npr. proteolitičkom digestijom, ili sa rekombinantnom ekspresijom takvih fragmenata. Na primer, imunoglobulinska digestija može da se izvodi pomoću rutinskih tehnika, npr. korišćenjem papaina ili pepsina (WO 94/29348), ili endoproteinaze Lys-C (Kleemann, et al, Anal. Chem. 80, 2001-2009, 2008). Papain ili Lys-C digestija antitela obično proizvodi dva identična antigenska vezujuća fragmenta, takozvani Fab fragmente, svaki sa pojedinačnim antigenskim vezujućim mestom, i preostalim Fc fragmentom. Tretiranje pepsinom stvara F(ab')2. Postupci dobijanja Fab molekula sa rekombinantnom ekspresijom kod ćelija domaćina su naznačeni u više detalja u nastavku.
Veliki broj tehnologija je razvijeno za postavljanje varijabilnih domena imunoglobulina, ili molekula izvedenih iz takvih varijabilnih domena, u različitom molekularnom kontekstu. Njih takođe treba uzeti u obzir kao "molekuli antitela" u skladu sa ovim pronalaskom. Uopšteno, ovi molekuli antitela su po veličini mali kada se porede sa imunoglobulinima, i mogu obuhvatati pojedinačni lanac amino kiselina ili mogu biti sastavljeni od nekoliko lanaca amino kiselina. Na primer, varijabilni fragment pojedinačnog lanca (scFv) predstavlja spoj varijabilnih regiona teških i lakih lanaca imunoglobulina, koji su povezani zajedno sa kratkim linkerom, obično serinom (S) ili glicinom (G)
(WO 88/01649; WO 91/17271; Huston et al; International Revievvs of lmmunology, Volume 10, 1993, 195 -217), "Pojedinačni domeni antitela" ili „nanotela" štite mesto vezivanja antigena u pojedinačnom Ig-sličnom domenu (VVO 94/04878; WO 03/050531, Ward et al. Nature, 1989 Oct 12:341 (6242):544-6; Revets etal.. Expert Opin Biol Ther. 5(1): 111-24, 2005). Jedan ili više pojedinačnih domena antitela sa vezujućim osobinama za isti ili različiti antigen može biti povezan zajedno. Diatela su bivalentni molekuli antitela koji se sastoje od dva lanca amino kiselina koji sadrže dva varijabilna domena (VVO 94/13804, Holliger et al., Proc Natl Acad Set USA. 1993 Jul 15;90(14):6444-8). Drugi primeri za molekule koji su slični antitelu su imunoglobulinska super familijarna antitela (tgSF: Srinivasan and Roeske. Current Proloin Pept. Sci. 2005. 6(2): 185-96 ). Različiti koncept dovodi do takozvane Male Modularne Imunofarmaceutike (Small Modular
Immunopharmaceuticai (SMIP)) koja obuhvata Fv domen koji je vezan za pojedinačnu lančanu vezu i efektorske domene lišeni konstantnog domena CH1 (WO 02/056910).
U daljem aspektu, molekul antitela može čak imati samo udaljenu strukturnu povezanost za imunoglobulinski varijabilni domen, ili bez takvog odnosa uopšte, do god postoji izvesna vezujuća specifičnost i sposobnost koja se poredi sa imunoglobulinskim varijabilnim domenom. Takav ne imunoglobulin ("antitelni mimici", ponekad nazvani "skeletni proteini"), može biti zasnovan na genima proteina A, lipocalinima, fibronektin domenu, ankirin konsenzusnom ponavljajućem domenu, i tioredoksinu (Skerra. Current Opinion in Biotechnologv 2007,18(4): 295-304). Referentni aspekt označava ankirin ponavljajuće proteine (DARPin s: Steiner et at.. J Mol 25
Biol. 2008 Oct 24:382(5): 1211-27: Stumpp MT, Amstutz P. Curr Opin Drug Discov Devel. 2007 Mar; 10(2): 153-9).
Molekul antitela može biti spojen (kaofuzioni protein) ili povezan drugačije (sa kovalentnim ili ne kovalentnim vezama) za druge molekularne entitet koji imaju željeni udar na osobine molekula antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljšaju farmakokinetičke osobine molekula antitela, stabilnost npr. u telesnim tečnostima kao što je krv, prvenstveno u slučaju pojedinačnog lanca antitela ili domena antitela. Veliki broj tehnologija je razvijeno u ovom pogledu, prvenstveno za produženje polu veka takvih molekula antitela, u cirkulaciji, kao što je pegilacija (VVO 98/25971; VVO 98/48837; VVO 2004081026), spajanje ili drugačije kovalentno vezivanje molekula antitela za drugi molekul antitela koji ima sposobnost za serum proteina kao što je albumin (VVO 2004041865; VVO 2004003019), ili ekspresija molekula antitela kao spojeni protein sa celim ili deo serumskog proteina kao što je albumin ili transferin (VVO 01/79258).
Molekul antitela ima vezujuću sposobnost za antikoagulantni dabigatran. "Vezujuća sposobnost" označava da molekul antitela ima značajno visoku vezujuću sposbnost za antikoagulant nego za strukturno ne povezane molekule.
Sposobnost predstavlja interakciju između pojedinačnog vezujućeg mesta vezivanja na molekulu antitela i pojedinačnog epitopa. Iskazano je konstantom udruživanja KA= kass/kdiss ili konstantnom disocijacije KD<=>kdiss/kaSs-
U jednom aspektu pronalaska, antitelo se vezuje za antikoagulant sa sposobnosti, kao što je određeno npr. sa analizom površinse plazmon rezonance (Malmqvist M.. "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibodv-antigen affinitv and kinetics.". Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.), sa vrednosti KDkoja se kreće u opsegu od 0.1 pM do 100 uM. poželjno 1 pM do 100 uM, prvenstveno 1 pM do 1 uM. Sposobnost antitela se takođe može izmeriti korišćenjem tehnologije kinetičke ekskluzione analize (KinExA) (Darling. R.J.. and Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions." ASSAY and Drug Development Technologies. 2004. Dec 2(6): 647-657).
Vezujuća sposobnost molekula antitela može biti pojačana sa postupkom koji je poznat kao sposobnost sazrevanje (Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783; Barbas, etal., 1994. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813: Shieret al.. 1995, Gene 169:147-155). Antitela sa sposobnošću sazrevanja su prema tome takođe obuhvaćena predmetnim pronalaskom.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je sposoban da neutrališe aktivnost antikoagulantnog dabigatrana. Odnosno, nakon vezivanja za molekul antitela, antikoagulant nije više u mogućnosti da vrši svoju antikoagulantnu aktivnost, ili da postoji takva aktivnost u znatno smanjenom obimu. Poželjno, antikoagulaciona aktivnost je smanjenja za bar2fold, 5fold, 10fold, ili 10Ofold nakon vezivanja antitela, kao što je određeno u aktivnoj analizi koja je odgovarajuća za antikoagulanta u pitanju, prvenstveno analiza zgrušavanja koja je osetljiva na trombin, kao što je vreme zgrušavanja ecarina ili vreme zgrušavanja trombina (H. Bounamoaux. Marbel GA, Lammlc B. etal. "Monitoring of heparin treatment. Comparison of thrombin time, activated partial thromboplastin time, and plasma heparin concentration, and analysis of the behaviour of antithrombin 111". American Journal of Clinical Pathology 1980 74(1); 68-72).
Za proizvodnju molekula antitela pronalaska, stručna osoba može odabrati iz raznih metoda koje su opšte poznate u tehnici (Norderhaug et at, J Immunol Methods 1997, 204 (1): 77 87; Kipriyanow and Le Gali, Molecular Biotechnology 26: 39- 60, 2004: Shukla et al.. 2007. J. Chromatography B. 848( 1 >: 28-39).
Antikoagulanti su opšte poznati u tehnici, kao što je prethodno naznačeno.
Inventivni antikoagulant je direktni inhibitor trombina. Referentni antikoagulanti su inhibitor Faktora Xa, ili antagonist vitamina K. Primeri antagonista vitamina K su kumarini, koji obuhvataju varfarin. Primeri indirektnih predominantnih inhibitora faktora Xa su heparin grupa supstanci koje deluju kroz aktivaciju antitrombin III uključujući nekoliko nižih molekulskih težina heparin proizvoda (bemiparin, certoparin, dalteparin, enoxaparin, nadroparin, parnaparin, reviparin, tinzaparin), određenih oligosaharida (fondaparinuks, idraparinuks), heparinoida (danaparoid, sulodeksid, dermatan sulfat), i direktni inhibiora faktora Xa (apiksaban, otamiksaban, rivaroksaban). Primeri inhibitora trombina obuhvataju bivalentne hirudine (bivalirudin, lepirudin, desirudin), i monovalentna jedinjenja argatroban i dabigatran.
Antikoagulant za koji antitelo pronalaska ima specifičnost, jeste dabigatran.
U referentnom aspektu, koji nije deo pronalaska, antikoagulant je disusptituisani biciklični heterocikl opšte formule
pri čemu
A označava karbonil ili sulfonil grupu vezanu za benzo, pirido ili tieno ostatak grupe Het,
B označava etilen grupu u kojoj metilen grupa koja je vezana za grupu A može biti zamenjena sa atomom kiseonika ili sumpora ili sa -NR!grupom, gde
Rioznačava atom vodonika ili Ci_4-alkil grupu,
E označava RbNH-C(=NH)- grupu gde
Rboznačava atom vodonika, hidroksi, d-g-alkoksikarbonil, cikloheksiloksikarbonil, -fenil-Ci-3-alkoksikarbonil, benzoil, p-d-3-alkil-benzoil ili piridinoil grupu, dok etoksi ostatak u položaju 2 prethodno navedene d-g-alkoksikarbonil grupe može dodatno biti supstituisana sa d_3-alkilsulfonil ili 2-(d_3-alkoksi)-etil grupom,
Ar označava 1,4-fenilen grupu opciono supstituisanu sa atomom hlora ili sa metil, etil ili metoksi grupom ili označava 2,5-tienilen grupu,
Het označava 1-(d.3-alkil)-2,5-benzimidazolilen, 1-ciklopropil-2,5-benzimidazolilen, 2,5-benzotiazolilen, 1 -(d 3-alkil)-2,5-indolilen, 1 -(d 3-alkil)-2,5-imidazo[4,5-b]piridinilen, 3-(d3-alkil)-2,7-imidazo[1,2-a]piridinilen ili 1 -(d.3-alkil)-2,5-tieno[2,3-d]imidazolilen grupu i
Raoznačava R2NR3- grupu gde
R2 je d-4-alkil grupa koja može biti supstituisana sa karboksi, d.6-alkiloksikarbonil, benziloksikarbonil, d-3-alkilsulfonilaminokarbonil ili 1 H-tetrazol-5-il grupom, d-4-alkil grupa supstituisana sa hidroksi, benziloksi, karboksi-d-3-alkilamino, d-3-alkoksikarbonil-d-3-alkilamino, N-(d-3-alkil)-karboksi-d-3-alkilamino ili N-(d.3-alkil)-d-3-alkoksikarbonil-d-3-alkilamino grupom, dok u prethodno navedenim grupama atom ugljenika u a-položaju prema susednom atomu azota može da ne bude supstituisan, R3označava C3-7-cikloalkil grupu, propargil grupu, gde nezasićeni deo ne mora da bude vezan direktno za atom azota R2NR3grupe, fenil grupu opciono supstituisanu sa atomom fluora ili hlora, ili sa metil ili metoksi grupom, pirazolil, piridazolil ili piridinil grupu opciono supstituisanu sa metil grupom ili
R2 i R3zajedno sa atomom azota između njih označava 5- do 7-članu cikloalkilenimino grupu, opciono supstituisanu sa karboksi ili Ci_4-alkoksikarbonil grupom, za koju fenil prsten može dodatno da bude spojen,
njegovi tautomeri, stereoizomeri i soli. Jedinjenja formule (I), dobijanje ovakvih jedinjenja i njihova primena kao antikoagulantni je opisano u WO 98/37075.
U drugom referentnom aspektu, antikoagulant je jedinjenje odabrano između
(a) 2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benztiazol-5-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-karboksietil)-amid, (b) 2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benztiazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (c) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (d) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(3-hidroksikarbonilpropil)-amid, (e) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(hidroksi-karbonilmetil)-amid, (f) 1 -Metil-2-[2-(2-amidinotiofen-5-il) etil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (g) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (h) 1-Metil-2-[2-(4-amidinofenil) etil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (i) 1 -Metil-2-[2-(4-amidinofenil) etil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (j) 1 -Metil-2-[2-(4-amidinofenil) etil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-[2-(1H-tetrazol-5-il) etil]-amid, (k) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-[2-(1 H-tetrazol-5-il) etil]-amid, (I) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N-metil-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (m) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N- metil-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(3-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(n) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-N- metil-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(o) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-[(N-hidroksikarboniletil-N-metil)-2-aminoetil]-amid,
(p) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(3-fluoro-f e ni I )-N -(2 -h id ro ksi-ka rbon i I eti I )-a m id,
(q) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(4-fluoro-fenil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(r) 1-Metil-2-[N-(4-amidino-2-metoksi-fenil)-aminometil]-benzirnidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(s) 1 -Metil-2-[N-(4-amidino-2-metoksi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(t) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)aminometil]-indol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-metoksi-karboniletil)-amid,
(u) 1-Metil-2-[N-(4-amidinofenil)aminometil]-tieno[2.3-d]imidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid, (v) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-fenil-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(w) 1 -Metil-2-[N-(4-amidinofenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(x) 1 -Metil-2-[N-(4-amidino-2-metoksi-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksil^ kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-hidroksikarboniletil)-amid,
(y) 1 -Metil-2-[N-[4-(N-n-heksiloksikarbonilamidino) fenil]- aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N-(2-etoksikarboniletil)-amid, i
njihovi tautomeri, stereoizomeri i soli, koje su sve opisane u VVO 98/37075.
Antikoagulant u kontekstu predmetnog pronalaska jeste dabigatran (CAS 211914-51-1,N-[ 2-( 4-Amidinofenilaminometil)-1-metil-1H-benzimidazol-5- ilkarbonil]-A/-(2-piridil)-beta-alanin) koji ima hemijsku formulu (II):
Dabigatran je poznat iz VVO 98/37075, koji otkriva jedinjenja sa trombinskim inhibitornim efektom i efektom produženja vremena trombina, pod nazivom 1-Metil-2-[N-(4-amidino-fenil)-aminometil]-benzimidazol-5-il-karboksilna kiselina-N-(2-piridil)-N- (2-hidroksi-karboniletil)-amid. Videti takođe Hauel et at. J Med Chem 2002. 45 (9): 1757- 66.
Dabigatran se primenjuje kao prolekformule (III):
Jedinjenje formule III (pod nazivom dabigatran eteksilat, CAS 211915-06-9: etil 3-[(2-{[4-(heksilooksikarbonilamino-imino-metil)-fenilamino]-metil}-1-metil-1H-benzimidazol-5-karbonil)-piridin-2-il-amino]-propionat) je konvertovan u aktivno jedinjenje (II) posle ulaska u telo. Poželjan polimorf dabigatran eteksilata jeste dabigatran eteksilat mesilat.
Glavna naznaka za dabigatran su post-operativna prevencija tromboze dubokih vena, lečenje ustanovljene tromboze dubokih vena i prevencija moždanog udara kod pacijenata sa arterijskom fibrilacijom (Eriksson et al., Lancet 2007, 370 (9591): 949-56: Schulman S et al, N Engl J Med 2009. 361 (24): 2342-52: Connolly S et al.. N Engl J Med 2009, 361 (12): 1139-51; VVallentin et al.. Lancet 2010. 376 (9745): 975-983).
U ljudskom telu, glukuronidacija karboksilatnog ostatka je glavna ljudska metabolička putanja dabigatrana (Ebneretal.. Drug Metab. Dispos. 2010. 38(91:1 567-75). On rezultuje u formulaciji 1 -O-acilglukuronid (beta anomer). 1-O-acilglukuronid, u odnosu na blagu hidrolizu naaglikonu, može pod neenzimskom acilnom migracijom u vodenom rastvoru, rezultovati u obrazovanju 2-0-, 3-0-, i 4-O-acilglukuronida. Primeri sa prečišćenim 1-O-acilglukuronidom i njegovim izomernim preuređenim proizvodima otkrivaju ekvipotentno produženje aktiviranog delimičnog tromboplastin vremena u poređenju sa dabigatranom.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela vezuje oba za dabigatran i dabigatran eteksilat.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela vezuje oba za dabigatran i O-acilglukuronide dabigatrana, prvenstveno 1-O-acilglukuronida dabigatrana.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela vezuje dalje za 2-0-, 3-0-, i 4-O-acilglukuronide dabigatrana.
U drugom aspektu pronalaska, moleklul antitela je sposoban za neutralizaciju aktivnosti dabigatrana i O-acilglukuronida dabigatrana, prvenstveno 1-0- acilglukuronid dabigatrana.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela ima vezujuću sposobnost za dabigatran i sadrži CDR sekvence kao što je prikazano na Slici 5 i 6, i dalje je određen u zahtevima.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela sadrži one CDR sekvence teškog lanca kao što je prikazano na Slici 5, i one CDR sekvence lakog lanca kao što je prikazano na Slici 6, koje su navedene u zahtevima.
U drugom aspketu pronalaska, molekul antitela sadrži sekvencu varijabilnog domena taškog lanca kao što je prikazano na Slici 5, i sekvencu varijabilnog domena lakog lanca kao što je prikazano na Slici 6, kao što je naznačeno u zahtevima.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela sadrži sekvencu varijabilnog domena taškog lanca prikazanu sa naznakom Eng VH# 15 na Slici 5, i sekvencu varijabilnog domena lakog lanca kao što je prikazano sa naznakom Eng VK# 18 na Slici 6.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela ima vezujuće sposobnosti za dabigatran i sadrži varijabilni domen teškog lanca sa CDR1 SEQ ID NO: 1, CDR2 SEQ ID NO: 7, i CDR3 SEQ ID NO: 10, i varijabilni domen lakog lanca sa CDR1 SEQ ID NO: 13, CDR2 SEQ ID NO: 14, i CDR3 SEQ ID NO: 15.
U drugom aspektu pronalaska, molekuil antitela je scFv molekul. U ovom formatu, varijabilni domeni otkriveni ovde mogu biti spojeni jedan za drugi sa pogodnim vezujućim peptidom, npr. odarban iz grupe koja se sastoji između SEQ ID Nos: 28, 29, 30 ili 31. Konstrukcija može sadržati ove elemente po redosledu, od N kraja do C kraja, (varijabilni domen teškog lanca)-(vezujući peptid)-(varijabilni domen lakog lanca), ili (varijabilni domen lakog lanca)-(vezujući peptid)-(varijabilni domen teškog lanca).
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je scFv molekul koji sadrži SEQ ID NO: 32, ili SEQ ID NO: 33. U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je scFv molekul koji se sastoji od SEQ ID NO: 32, ili SEQ ID NO: 33.
Postupci su poznati u tehnici koji dozvoljavaju rekombinantnu ekspresiju nukleinskih kiselina koje kodiraju sFv konstrukcije u ćeliji domaćina (kao što je E. coli, Pichia pastoris, ili ćelijska linija sisara, npr. CHO ili NSO), dajući funkcionalne molekule scFv (videti npr. Rippmann et al., Applied and Environmental Microbiologv 1998, 64(12): 4862-4869; Yamawaki et al., J. Biosci. Bioeng. 2007, 104(5): 403-407; Sonoda et al., Protein Expr. Purif. 2010, 70(2): 248-253).
Prvenstveno, scFv molekuli antitela pronalaska mogu da se dobiju kao što sledi. Konstrukcije mogu da se ekspresuju u različitim sojevimaE. colikao što je W3110, TG1, BL21, BL21(DE3), HMS174, HMS174(DE3), MM294 pod kontrolom indukovanog promotera. Ovaj promoter može biti izabran iz lacUV5, tac, T7, trp, trc, T5, araB. Kultivacioni medijumi su poželjno upotpunosti definisani prema VVilms era/., 2001 (Wilms et al., Biotechnologv and Bioengineering 2001, 73(2): 95-103), DeLisa etal., 1999 (DeLisaet al., Biotechnology and Bioengineering 1999, 65(1): 54-64) ili ekvivalent. Međutim, suplementacija smeše medijuma i / ili hranjivog medijuma sa amino kiselinama kao što je izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan i valin ili kompleksnog medijuma komponenti kao što je soja pepton ili ekstrakt kvasca mogu biti korisni. Postupak za fermentaciju je izveden u fed-batch modu. Uslovi: Temperatura 20 - 40 °C, pH 5.5 - 7.5, DO je čuvana iznad 20%. Nakon konzumacije početnog izvora ugljenika kultura je hranjena sa hranjivim medijumom kao što je prethodno navedeno (ili ekvivalent). Kada je dostignuta težina suve ćelije od 40 do 100 g/L u fermentu kulture je indukovana sa odgovarajućim induktorom koji odgovara korišćenom promoternom sistemu (npr. IPTG, laktoza, arabinoza). Indukcija može biti izvedena ili kao pulsna potpuna indukcija ili kao delimična indukcija hranjenjem respektivnog induktora u fermentu tokom produženog vremena ili njihovom kombinacijom. Produkciona faza bi trebalo da traje 4 sata najmanje. Ćelije su oporavljene centrifugiranjem u doznom centrifugatoru, cevastom doznom centrifugatoru ili centrifugatoru u obliku cevastog diska, kulturni supernatant je odbačen.
Ćelijska masaE. colicell je ponovo suspendovana u 4- do 8-fold količine pufernog lizina (fosfat ili Tris pufer, pH 7-8.5). Ćelija lizina je poželjno izvedena homogenizacijom pod visokim pritiskom praćena oporavkom kuglicama centrifugiranjem u posudi, cevastoj posudi ili u obliku cevastog diska centrifugatora. Kuglice koje sadrže scFv inkluziona tela su isprane 2-3 puta sa 20 mM Tris, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 2 M Urea, 0.5% Triton X-100, pH 8.0 praćeno sa dva koraka ispiranja korišćenjem 20 mM Tris, 150 mM NaCI. 5 mM EDTA, pH 8.0. scFv inkluziona tela su konačno oporavljena centrifugiranjem posudi, cevastoj posudi ili u obliku cevastog diska centrifugatora, Rastvorljivost scFv inkluzionih tela može biti izvedena u 100 mM Glicin/NaOH, 5 mM EDTA, 20 mM ditiotreitol, pH 9.5-10.5 koji sadrži haotropne agense kao što je 6 M Guanidin-HCI ili 8-10 mM Urea. Posle inkubacije od 30-60 minuta rastvor je centrifugiran i supernatant koji sadrži ciljani protein oporavljen za sledeće ponovno preklapanje. Ponovno preklapanje je izvedeno u fed batch modu razblaženjem proteinskog rastvora 1:10-1:50 u puferu za ponovno preklapanje do finalne koncentracije proteina od 0.1-0.5 mg/ml. Pufer za ponovno preklapanje može sadržati 50-100 mM Tris i/ili 50-100 mM Glicina, 50-150 mM NaCI, 1-3 M urea, 0.5-1 M arginin, 2-6 mM redoks sistema
kao što je npr. citein/ cistin ili oksidizovani/redukovani glutation, pH 9.5-10.5. Posle inkubacije od 24-72 h na 4 °C rastvor za ponovno preklapanje je opciono filtriran korišćenjem 0.22 pm filtera, razblažen i pH podešena na pH 7.0-8.0. Protein je odvojen preko katjonske razmenjivačke hromatografije u vezujućem modu (npr. Tovopearl GigaCap S-650M. SP Sepharose FF ili S HvperCet™) pri pH 7.0-8.5. Elucija je izvedena sa linearnim povećanjem NaCI gradienta. Frakcije koje sadrže ciljani protein su spojene i potom odvojene na anjonskoj izmenjivačkoj koloni u ne vezujućem modu (npr. Tovopearl GigaCap O.-650M, Q-Sepharose FF, Q HvperCef™) praćeno sa korakom katjonske razmene poliranjem (npr. SP Sepharose HP). Frakcije koje sadrže ciljani protein sa nivoom čistoće od minimalno 90% su sakupljene i formulisane sa diafiltracijom ili veličinom ekskluzione hromatografije u PBS. Identitet i kvalitet proizvedenog scFv molekula su analizirani redukcijom SDS-PAGE gde scFv može biti detektovan u jednoj velikoj grupi od približno 26 kDa. Dalja analiza za karakterizaciju scFv obuhvata masenu spektrometriju, RP-HPLC i SE-HPLC.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je imunoglobulin, poželjno imunoglobulin vrste lgG1, ili njegova efektorska funkcija knock-out, ili lgG4. U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je imunoglobulin koji ima teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 40, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 35.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je imunoglobulin koji ima teški lanac koji se sastoji od SEQ ID NO: 40, i laki lanac koji se sastoji od SEQ ID NO: 35.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je imunoglobulin koji ima teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 40, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 35.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je Fab molekul. U tom formatu, varijabilni domeni prethodno otkriveni mogu svaki da budu spojeni za imunoglobulinski konstantni domen, poželjno ljudskog porekla. Prema tome, varijabilni domen teškog lanca može biti spojen za CHidomen (tako zvani Fd fragment), i varijabilni domen lakog lanca može biti spojen za CL domen.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je Fab molekul koji ima Fd fragment koji sadrži SEQ ID NO: 36, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 37. U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je Fab molekul koji ima Fd fragment koji sadrži SEQ ID NO: 41, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 37. U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela je Fab molekul koji ima Fd fragment koji se sastoji od SEQ ID NO: 36, i laki lanac koji se sastoji od SEQ ID NO: 37. U drugom aspektu pronalaska, molekula antitela je Fab molekul koji ima Fd fragment koji se sastoji od SEQ ID NO: 41, i laki lanac koji se sastoji od SEQ ID NO: 37.
Nukleinske kiseline koje kodiraju Fab konstrukcije mogu da se koriste za ekspresiju takvih teških i lakik lanaca u ćelijama domaćina, kao što je E. coli, Pichia pastoris, ili ćelijska linija sisara (npr. CHO, ili NSO). Postupci su poznati u tehnici koji dozvoljavaju odgovarajuće preklapanje, vezivanje, i disulfidno vezivanje ovih lanaca na funkcionalnim Fab molekulima koji obuhvataju Fd fragment i laki lanac (Burtet et al., J. Biochem. 2007, 142(6), 665-669; Ning et al., Biochem. Mol. Biol. 2005, 38: 204-299; Ouintero-Hernandez etal., Mol. Immunol. 2007, 44:13071315; VVillems etal. J. Chromatogr. B. Analvt. Technol. Biomed. Life Sci. 2003;786:161-176.).
Prvenstveno, Fab molekuli pronalaska mogu se dobiti u CHO ćelijama kao što sledi. CHO-DG44 ćelije (Urlaub.G., Kas,E., Carothers.A.M., and Chasin,L.A. (1983). Brisanje mestadiploid ne dihidrofolat reduktaze iz kultivisanih ćelija sisara. Ćelija 33, 405-412.) koja raste u suspenziji u medijumu oslobođenog od seruma su transfektovani sa ekspresijom konstrukcije koje kodiraju teški i laki lanac Fab molekula korišćenjem Lipofectamine™ i Plus™ reagensa (Invitrogen) prema instrukcijama proizvođača. Posle 48 sati, ćelije su podvrgnute odabiru u medijumu koji sadrži 200 pg/mL antibiotika G418 i bez hipoksantina i timidina kako bi generisali stabilne transfektovane ćelijske populacije. Ovi stabilni transfektanti su potom podvrgnuti genskom pojačanju dodavanjem metotreksata (MTX) u povećanju koncentracija (do 100 ili 400 nM) u kulturnom medijumu. Jednom kada su ćelije prihvaćene, one su podvrgnute fed-batch fermentaciji tokom 10 do 11 dana kako bi se dobio Fab proteinski materijal.
Suspenzione kulturne CHO-DG44 ćelija i njihovi stabilni transfektanti su inkubirani u hemijskom definisanom, kulturnom medijumu bez seruma. Kulture za zasejavanje su sub-kultivisane svaka 2-3 dana sa gustinom zasejavanja od 3 x105 - 2 x 10<5>ćelija/mL respektivno. Ćelije su rasle u balonima koji se tresu u Multitron HT inkubatorima (Infors) pri 5% C02, 37°C i 120 rpm. Za fed-batch eksperimente, ćelije su zasejane pri 3x10<5>Ćelija/mL u balonima koji se tresu u vlasništvu BI produkcionom medijumu bez antibijotika ili MTX. Kulture su mućkane pri 120 rpm na 37°C i 5% C02koji je kasnije smanjen na 2% što se broj ćelija povećava. Parametri kulture koji obuhvataju brojanje ćelija, pH, koncentracije glukoze i laktata su određeni dnevno i pH je podešena na pH 7.0 korišćenjem ugljenika ako je potrebno. Rastvor za hranjenje koji je u vlasništvu BI je dodat svaka 24 hrs. Uzorci iz supernatanta su uzeti pri različitim vremenskim tačkama kako bi se odredila koncentracija Fab proizvoda od strane ELISA. Posle 10 do 11 dana, tečnost za ćelijsku kulturu je prikupljena centrifugiranjem i prebačena u laboratoriju za prečišćavanje.
Fab molekul je prečišćen iz supernatanta fed-batch kulture uz pomoć hromatografije i filtracije. Kao primarni korak zarobljavanja sklonost hromatografiji, npr. Proteina G ili Proteina L, se primenjuje. Alternativno, u slučaju slabe vezujuće sposobnosti i kapaciteta, Fab je zarobljen sa hromatografijom katjonske razmene (CEX) iskorišćavanjem pi molekula. Proteini ćelije domaćina i kontaminanti, npr. DNK ili virusi, su uklonjeni dodatnim ortogonalnim koracima prečišćavanja.
Identitet i kvalitet proizvodnje dobijenog Fab molekula su analizirani primenom elektroforetičkih metoda, npr. SDS-PAGE, kojima Fab može biti detektovan kao jedna velika grupa od približno 50 kDa. Dalja analiza za karakterizaciju Fab proizvoda obuhvata masenu spektrometriju, izoelektrično fokusiranje i veličinu ekskluzione hromatografije. Vezujuća aktivnost je praćena sa BlAcore analizom.
Kvantifikacija Fab ili IgG molekula pune dužine u supernatantu ćelijskih kultura je izvedena preko sendvič enzimske vezujuće imunosorbentne analize (ELISA). IgG pune dužine može se detektovati korišćenjem antitela podignuti protiv Ijudskog-Fc fragmenta (Jackson Immuno Research Laboratories) i ljudskog kapa lakog lanca (konjugovana peroksidaza, Sigma). Fab fragment je imobilisan sa kozjim poliklonalnim anti-Human IgG (H i L, Novus) i detktovan sa ovčijim poliklonalnim antitelima podignutim protiv ljudskog IgG (konjugovana peroksidaza, Vezujuće Mesto).
Fab molekuli mogu takođe da budu generisani iz molekula antitela pune dužine sa enzimatskim odcepljenjem. Prednost ovog pristupa jeste da je procesna platforma za robust i efikasnost fermentacije i prečišćavanja prihvatljiva koje su odgovorne za bolje performanse i visoki prinos pri željenom kvalitetu proizvoda. Za prečišćavanje srodna hromatografija koja koristi ostatak rekombinantnog Proteina A može da se koristi kao primarni korak zarobljavanja koji obično rezultuje u visokoj čistoći.
Iz tih razloga, teški lanac koji kodiraju Fab sekvence su spojeni za Fc-region humanog IgG molekula antitela. Rezultujuće ekspresione konstrukcije su potom transfektovane u CHO-DG44 ćelije koje rastu u suspenziji u medijumu bez seruma korišćenjem lipofekcije. Posle 48 sati, ćelije su podvrgnute selekciji u medijumu koji sadrži 200 pg/ml antibiotika G418 i bez hipoksantina i timidina kako bi se generisale stabilne transfektovane ćelijske populacije. Ovi stabilni transfektanti su potom podvrgnuti genskoj amplifikaciji dodavanje metotreksata (MTX) u povećanim koncentracijama (do 100 ili 400 nM) u kulturnom medijumu. Kada su se ćelije jednom prilagodile, one su podvrgnute fed-batch fermentacijama tokom 10 do 11 dana kako bi se dobio IgG proteinski materijal.
IgG protein je prečišćen iz kulturnog supernatanta korišćenjem rekombinantne Protein A-srodne hromatografije. Kako bi se dobio željeni neutrališući Fab fragment IgG pune dužine je potom inkubiran u prisustvu papaina koji odcepljuje IgG unutar zglobnog regiona, i na taj način otpušta dva Fab fragmenta i Fc-ostatak. Fab molekul koji sadrži Fd lanac SEQ ID NO: 41 jeste primer Fab molekula dobijenog sa papain varenjem IgG proteina pune dužine.
Fab molekul je izolovan sa srodnom hromatografijom, npr. Protein G ili Protein L. Alternativno, u slučaju slabih vezujućih osobina i kapaciteta, Fab je zarobljen sa hromatografijom katjonske razmene (CEX) iskorišćavajući pi molekula. Proteini ćelije domaćina i kontaminanti, npr. Papain, DNK ili virusi, su uklonjeni dodatnim ortogonalnim koracima prečišćavanja.
U drugom aspektu pronalaska, molekul antitela jeste amino kiselinska sekvencna varijanta molekula antitela kao što je ovde opisano.
Amino kiselinske sekvencne varijante antitela mogu se dobiti uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u DNK antitelu, ili sa peptidnim sintezama. Takve varijante obuhvataju, na primer, brisanje iz, i/ili ubacivanje u i/ili susptitucije, ostataka unutar amino kiselinskih sekvenci antitela primera koji su ovde navedeni. Bilo koja kombinacija brisanja, ubacivanja, i supstitucije je urađena kako bi se dobila finalna konstrukcija, obezbeđujući da finalna konstrukcija poseduje željene karakteristike. Amino kiselinske promene takođe mogu izmeniti post translacioni postupak humanizovane varijante antitela, tako da se menja broj ili položaj mesta glikozilacije.
Korisni postupak za identifikaciju izvesnih ostataka ili regiona antitela koji su poželjne lokacije za
mutagenezu se naziva "alanin skenirajuća mutageneza," kao što je opisano od strane Cunningham i VVells (Science, 244:1081-1085 (1989)). Ovde, ostatak ili grupa ciljanih ostataka su identifikovane (npr., naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjeni sa neutralnom ili negativno naelektrisanom amino kiselinom (obično alanin) kako bi delovao na interakciju amino kiselina sa
antigenom. Ove amino kiselinske lokacije pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije nego što su refinirani sa ubacivanjem drugih ili nekih drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Stoga, dok je mesto za ubacivanje amino kiselinske sekvencne varijante predodređen, priroda mutacije sama posebi ne treba da bude predodređena. Na primer, kako bi se analizirala performanca mutacije na datom mestu, alanin skeniranje ili nasumična mutageneza je sprovedena na ciljanom ili željenom kodonu i varijante ekspresionog antitela su skenirane na željenu aktivnost.
Ubacivanje amino kiselinske sekvence obuhvata amino- i/ili karboksil-krajnje spojeve rangirane u dužini od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže hiljade ili više ostataka, kao i intrasekvencna ubacivanja pojedinačnog ili višestrukih amino kiselinskih ostataka. Primeri krajnjih ubacivanja obuhvataju antitelo spojeno za epitop tag. Druge varijante ubacivanja molekula antitela obuhvataju spajanje za N- ili C-krajeve antitela enzima ili polipetida koji povećavaju serumski polu vek antitela. Druga vrsta varijante jeste varijanta amino kiselinske supstitucije. Ove varijante imaju bar jedan amino ksielinski ostatak u molekulu antitela koji je uklonjen i drugačiji ostatak ubačen na njegovo mesto. Mesta najvećeg interesa za supstituciju mutageneze obuhvataju hipervarijabilne regione, ali FR alteracije su takođe razmatrane. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli u nastavku pod naslovom "poželjne supstitucije". Ukoliko takve supstitucije rezultuju u promeni u biološkoj aktivnosti, onda više značajnih promena, imenovani "primerne supstitucije", ili kao druge opisane u nastavku u odnosu na amino kiselinske klase, mogu biti ubačene, a proizvodi skenirani.
U proteinskoj herniji, uopšteno je prihvaćeno da biološke osobine antitela mogu biti ispunjene odabirom suptituenata koji se razlikuju značajno u njihovom efektu na održavanju (a) strukture polipeptidne osnove u području supstitucije, na primer, kao listna ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) glavnog dela bočnog lanca. Ostaci koji se javljaju u prirodi su podeljeni u grupe zasnovane na uobičajenim osobinama bočnog lanca: (1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralno hidrofilni: cys, ser, thr; (3) kisleinski: asp, glu; (4) bazni: asn, gin, his, lys, arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i
(6) aromatični: trp, tyr, phe.
Ne-konzrvativne supstitucije će upotpunosti zameniti član jednog od ovih klasa za drugu klasu.
Bilo koji ostatak cisteina koji nije uključen u održavanju pogodne konformacije humanizovanog ili varijantnog antitela takođe može biti supstituisan, uopšteno sa serinom, kako bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula, sprečilo nenormalno unakrsno vezivanje, ili obezbedilo za ustanovljene tačke konjugacije za citotoksično ili citostatičko jedinjenje. Obrnuto, cisteinska(e) veza(e) mogu biti dodate antitelu kako bi se poboljšala njegova stabilnost (prvestveno gde je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).
Vrsta supstitucione varijante obuhvata supstituciju jednog ili više hipervarijabilnih regionalnih ostataka roditeljskog antitela (npr., humanizovano ili humano antitelo). Uopšteno, rezultujuća(e) varijanta(e) odabrane za dalji razvoj će imati poboljšane biološke osobine u odnosu na roditeljsko antitelo iz kojega su generisani. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti jeste sposobnost sazrevanja korišćenjem fagnog prikaza. Ukratko, nekoliko hipervarijabilnih regionskih mesta (npr., 6-7 mesta) su mutirana kako bi se generisale sve moguće amino supstitucije na svakom mestu. Tako generisane varijante antitela su prikazane na monovalentni način iz filamentoznih fagnih čestica kao fuzije na gen III proizvodu M13 pakovane unutar svake čestice. Varijante fagnog prikaza su potom skenirane za njihovu biološku aktivnost (npr., vezujuću sposobnost). U cilju da se identifikuje kandidat hipervarijabilnih regionskih mesta za modifikaciju, alalnin koji skenira mutagenezu može biti izveden za identifikaciju hipervarijabilnih regionskih ostataka koji doprinose značajno antigenskom vezivanju. Alternativno, ili kao dodatak, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo kako bi se identif i kovale kontaktne tačke između antitela i ljudskog Dabigatrana. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema tehnikama koje su razrađene ovde. Jednom kada su takve varijante generisane, panel varijanti je podvrgnut proveravanju kao što je opisano ovde, i antitela sa superiornim
osobinama u jednoj ili više relevantnih analiza mogu biti odabrana za dalji razvoj.
Druga vrsta amino kiselinske varijante antitela poboljšava originalni glikozilacioni šablon antitela. Pod "poboljšanjem" se podrazumeva brisanje jednog ili više ugljovodoničnih ostataka pronađeni u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više glikozilacionih mesta koja nisu prisutna u antitelu.
U nekim rešenjima, može biti poželjno da se modifikuju antitela pronalaska kako bi se dodatala glikozilaciona mesta. Glikozilacija antitela je obično ili N-vezan ili O-vezan. N-vezivanje se odnosi na vezivanje ugljovodoničnog ostatka za bočni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serina i asparagin-X-tronina, gde X predstavlja bilo koju amino kiselinu osim prolina, su prepoznatljive sekvence za enzimsko vezivanje ugljovodoničnog ostatka za asparaginski bočni lanac. Stoga, prisustvo ili ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno glikozilaciono mesto. O-vezivanje glikozilacije se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-aceilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze za hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, iako 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin mogu takođe biti korišćeni. Stoga, u cilju da se glikoziluje dati protein, npr., antitelo, amino kiselinska sekvenca proteina je projektovana tako da sadrži jednu ili više prethodno opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana glikozilaciona mesta). Promena može takođe da bude sačinjena dodavanjem, ili supstitucijom, jednog ili više ostataka serina ili treonina na sekvencu originalnog antitela (za O-vezana glikozilaciona mesta).
Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante amino kiselinske sekvence antitela su dobijeni nizom postupaka koji su poznati u tehnici. Ovi postupci obuhvataju, ali nisu ograničeni na, izolaciju iz prirodnog izvora (u slučaju varijanti amino kiselinskih sekvenci koji se javljaju u prirodi) ili dobijanje sa mutagenezom posredovanjem oligonukleotida (ili detekcije mesta), PCR mutagenezom, i kasetna mutagenezom ranije dobijene varijantne ili ne varijantne verzije molekula antitela kao što je ovde opisano. Kao što je ovde naznačeno, antigen molekula antitela pronalaska je antikoagulant. Antigen je korišćen kako bi se generisao molekul antitela, ili sa imunizacijom životinje, ili selekcijom sekvence antitela iz biblioteke sekvence, kao i sa postupcima prikaza fage.
Imunizacioni protokoli za životinje su opšte poznati u tehnici. Kako bi se postigao odgovarajući imuni odgovor, moglo bi biti neophodno da se kombinuje antigen sa adjuvansom, kao što je aluminijum fosfat, aluminijum hidroksid, skvalen, ili Freund's kompletni/nekompletni adjuvans. Antigeni u konteksu predmetnog pronalaska, kao što je dabigatran, su uglavnom uporedivi mali organski molekuli, koji ponekad ne stimulišu formiranje antitela nakon primene na životinje. Stoga, može biti neophodno da se veže antigen za makromolekul, kao što je hapten.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela kao što je prethodno opisano za korišćenje u medicini.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži molekul antitela kao što je ranije opisano, i farmaceutski nosač.
Da bi se koristio u terapiji, molekul antitela je uključen u farmaceutske kompozicije koje su odgovarajuće tako da omoguće primenu na životinje ili ljude. Tipične formulacije molekula antitela mogu biti dobijene mešanjem molekula antitela sa fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima, u vidu liofilizovanih ili drugačije osušenih formulacija ili vodenih rastvora ili vodenih i ne vodenih suspenzija. Nosači, ekscipijensi, modifikatori ili stabilizatori su ne toksični pri uključenim dozama i koncentracijama. Oni obuhvataju puferne sisteme kao što su fosfat, citrat, acetat i druge neorganske ili organske kiseline i njihove soli; antioksidanse koji obuhvataju askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid: heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); proteini, kao što su serum albumina, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što su polivinilpirolidon ili polietilen glikol (PEG); amino kiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin: monosaharidi, disaharidi, oligosaharidi ili polisaharidi i drugi ugljovodonici koji sadrže glukozu, manozu, saharozu, trehalozu, dekstrine ili dekstrane; helatni agensi kao što je EDTA; šećerni alkoholi kao što su, manitot ili sorbitol: kontra joni koji obrazuju so kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr.. Zn-protein kompleksi); i/ili jonske ili ne jonske površinske supstance kao što je TVVEEN™ (polisorbati), PLURONICS™ ili estri masnih kiselina, etri masnih kiselina ili estri šećera. Takođe organski rastvarači mogu da budu sadržani u formulaciji antitela kao što je etanol ili izopropanol. Ekscipijensi mogu takođe da imaju funkciju modifikovanja prilikom otpuštanja ili modifikaciju prilikom apsorpcije.
U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija sadrži molekul antitela u vodenom, pufernom rastvoru pri koncentraciji od 10-20 mg/ml, ili liofilizat napravljen iz takvog rastvora.
Poželjan način primene jeste parenteralno, infuzijom ili ublizgavanjem (intravenozno, intramuskularno, potkožno, intraperitonealno, intradermalno), ali drugi načini primene kao što je inhalacija, transdermalna, intranazalna, bukalna, oralna, mogu takođe da budu primenljiva.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela kao što je prethodno opisano za korišćenje u lečenju ili prevenciji neželjenih efekata terapije sa dabigatranom, prvenstveno slučajeva povezani sa krvarenjem.
U drugoom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela kao što je ranije opisano za korišćenje u ukidanju predoziranja dabigatrana ili dabigatran eksetilata.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela kao što je prethodno opisano za korišćenje kao protivotrov antikoagulanta, prvenstveno dabigatrana ili dabigatran eksetilata.
U drugom aspektu, predmetni opis se odnosi na postupak lečenja ili prevencije neželjenih efekata terapije sa antikoagulantima, koji se sastoji od primene efikasne količine molekula antitela kao što je ranije opisano na pacijenta kome je to potrebno.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na korišćenje antitela u postupku lečenja predoziranja u terapiji sa dabigatranom, koji obuhvata primenu efikasne količine molekula antitela kao što je prethodno opisano na pacijenta kome je to potrebno.
"Terapeutski efikasna količina" antitela koja se primenjujeje minimalna količina koja je neophodna za prevenciju, amelioraciju, ili lečenje neželjenih efekata teapije sa antikoagulantom, prvenstveno minimalna količina koja je efikasna da zaustavi krvarenje. Ovo može biti postignuto sa stehiometrijskim količinama molekula antitela.
Dabigatran, na primer, može dostići koncentraciju plazme u veličini od 200 nM kada se daje u preporučenoj dozi. Kada se koristi monovalentni molekul antitela čija težina je ca. 50 kD, neutralizacija može biti postignuta na primer pri dozi od oko 1 mg/kg, kada se daje intravenozno kao kuglica. U drugom primeru izvođenja, doza Fab molekula koja se primenjuje na ljudskog pacijenta može biti 50-1000 mg po primeni, na primer 100, 200, 500, 750, ili 1000 mg. U zavisnosti od situacije, npr. kada je dabigatran predoziran kod pacijenta, onda može biti adekvatno da se primenjuju čak i veće doze, npr. 1250, 1500, 1750 ili 2000 mg po primeni. Odgovarajuća doza može biti različita, u zavisnosti od vrste i doze antikoagulanta koji je primenjen; proteklog vremena takve primene, priroda molekula antigena, stanja pacijenta, i drugih faktora. Stručna osoba poznaje postupke kako bi se ustanovile doze koje su obe terapeutski efikasne i sigurne.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na molekul antitela sa vezujućim afinitetom za dabigatran i/ili dabigatran eteksilat. Poželjno, molekul antitela se vezuje za dabigatran i/ili dabigatran eteksilat sa sposobnošću, kao što je određeno npr. sa analizom površinske plazmon rezonance (Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibodv-antigen affinitvand kinetics. "Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.) ili analizom kinetičke ekskluzione tehnologije (KinExA) (Darling, R.J., and Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions." ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6): 647-657), sa KDvrednosti u opsegu od 0.1 pM do 100 uM, poželjno 1 pM do 100 pM, prvenstveno 1 pM do 1 pM.
Molekuli antitela pronalaska mogu takođe da budu korišćena za analitičke i dijagnostičke procedure, na primer kako bi se ustanovila koncentracija antigena u uzorcima kao što je plazma, serum, ili druga telesna tečnost. Na primer, molekuli antigena mogu biti korišćeni u enzimsko povezanoj imunoadsorbentnoj analizi (ELISA), kao što su one koje su opisane u primerima. Stoga, u drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na analitičke i dijagnostičke kitove koji sadrže molekule antitela kao što je opisano ovde, i na respektivne analitičke i dijagnostičke postupke.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak proizvodnje molekula antitela prema bilo kom od navedenih zahteva, koji obuhvata a) obezbeđivanje ćelije domaćina koja sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju molekul antitela u funkcionalnoj povezanosti sa ekspresionom kontrolnom sekvencom,
b) kultivaciju navedene ćelije domaćina, i
c) oporavak molekula antitela iz ćelije kulture.
Pronalazak dalje obezbeđuje članove proizvodnje i kit koji sadrži materijale koristne za
neutralizaciju oralnih antikoagulanata, prvenstveno direktnih trombin inhibitora. Članovi proizvodnje obuhvataju posudu sa etiketom. Pogodne posude obuhvataju, na primer, boce, posude, i test cevi. Posude mogu biti obrazovane od različitog materijala kao što je staklo, metal, plastika ili njihova kombinacija. Posuda sadrži farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo opisano ovde ili dabigatran, dabigatran eteksilat, prolek dabigatrana ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Aktivni agens u farmaceutskoj kompoziciji je prvenstveno antitelo ili dabigatran, dabigatran eteksilat, prolek dabigatrana ili njegova farmaceutski prihvatljivu so. Etiketa na posudi antitela ukazuje da se farmaceutska kompozicija koristi za neutralizaciju ili delimičnu neutralizaciju dabigatrana, dabigatran eteksilata, proleka dabigatrana ili njegove farmaceutski prihvatljive soliin vivo.
Kit obuhvata jednu ili više posuda prethodno opisani. Može dalje da obuhvata druge materijale poželjno sa komercijalnog i korisničkog stanovništva, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, šprice, i ubačena pakovanja sa instrukcijama za korišćenje.
U jednom rešenju pronalaska, kit obuhvata antitelo bilo kog antitela prema zahtevima ili njegovu farmaceutsku kompoziciju. Na primer, kit može sadržati (1) bilo koje antitelo prema zahtevu ili njegovu farmaceutsku kompoziciju, (2) posudu i (3) etiketu.
U drugom primeru izvođenja, kit obuhvata antitelo bilo kog antitela prema zahtevima ili njegovu farmaceutsku kompoziciju, i dabigatran, dabigatran eteksilat, prolek dabigatrana ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Oblik dabigatrana, dabigatran eteksilata, proleka dabigatrana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli može biti u vidu čvrste supstance, tečnosti ili gela. U poželjnom rešenju, farmaceutski prihvatljiva so dabigatran eteksilata je mesilatna so. A ipak u drugom poželjnom primeru izvođenja, jačina po doznoj jedinici dabigatrana, dabigatran eteksilata, proleka dabigatrana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli je između oko 50 mg i oko 400 mg, oko 75 mg i oko 300 mg, oko 75 mg i 150 mg, ili oko 110 mg i oko 150 mg, dat jednom na dan (QD) ili dva puta na dan (BID). Na primer, kit može sadržati (1) bilo koje antitelo prema zahtevima ili njegovu farmaceutsku kompoziciju, (2) farmaceutsku kompoziciju dabigatrana, dabigatran eteksilata, prolek dabigatrana ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, (3) posudu i (4) etiketu.
U alternativnom primeru izvođenja, kit sadrži (1) prvo farmaceutsku kompoziciju koja sadrži dabigatran, dabigatran eteksilat, prolek dabigatrana ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, (2) drugo farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koje antitelo prema zahtevima ili njegovu kombinaciju, (3) instrukcije za odvojenu primenu navedenih prvih i drugih farmaceutskih kompozicija na pacijenta, pri čemu navedene prve i druge farmaceutske kompozicije su sadržane u odvojenim posudama i navedena druga farmaceutska kompozicija se primenjuje na pacijenta kome je potrebna neutralizacija ili delimična neutralizacija dabigatrana ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana.
Pronalazak takođe obezbeđuje dijagnostički postupak za neutralizaciju ili delimičnu neutralizaciju dabigatrana ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana kod pacijenta koji se leči sa dabigatranom, dabigatran eteksilatom, prolekom dabigatrana ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli, koji obuhvata primenu bilo kog antitela koji je opisan ovde, njegovu kombinaciju ili njegovu farmaceutsku kompoziciju. Naročito, pronalazak obezbeđuje postupak neutralizacije ili delimične neutralizacije dabigatrana ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana kod pacijenta koji obuhvata korake (a) potvrđivanja daje pacijent lečen sa dabigatranom, dabigatran eteksilatom, prolekom dabigatrana ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli, i količina koja je uzeta od strane pacijenta; (b) neutralizacije dabigatrana ili 1-O-acilglukuronida sa bilo kojim antitelom prema zahtevima ili njegovom kombinacijom pre stvaranja zgrušavanja ili testa koagulacije ili analize pri čemu dabigatran ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana će ometati tačno očitavanje rezultata testa ili analize; (c) izvođenja testa ili analize zgrušavanja ili koagulacije na uzorku uzetom od pacijenta kako bi se odredio nivo formiranja ugruška bez dabigatrana ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana prisutnog; i (d) podešavanja količine dabigatrana, dabigatran eteksilata, proleka dabigatrana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koja se primenjuje na pacijenta u cilju postizanja odgovarajućeg balansa između formiranog ugruška i degradacije kod pacijenta. Molarni odnos antitela u odnosu na dabigatran ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana je u molarnom odnosu između 0.1 i 100, poželjno između 0.1 i 10. Tačno očitavanje rezultata testa ili analize može biti tačno očitano na fibrinogenim nivoima, aktiviranoj protein C rezistentnosti ili srodnim testovima.
PRIMERI
I. DOBIJANJE POLIKLONALNIH ANTITELA ANTI-DABIGATRANA
Za proizvodnju poliklonalnih antitela anti-dabigatrana, 3 različita imunogena su dobijena sa dva različita heptena i različitim molarnim input odnosom heptana i nosača proteina (BSA).
Za skeniranje, enzima peroksidaze iz rena (HRP)-konjugat je dobijen i razvijena enzim-imunosorbentna analiza (ELISA).
Dalje prečišćavanje poliklonalnih antitela je izvedeno sa srodnom hromatografijom na proteinu A sefaroze FF.
1. MATERIJALI I POSTUPCI
1.1 HAPTEN KORIŠĆEN ZA SINTEZU IMINOGENA I TRAKERA
1.2 SINTEZA HAPTENA
Hapteni Hapten 1 i Hapten 2 su sintetizovani kao što sledi:
Haptenl [2-(4-amino-butilkarbamoil)-etil]-fenil-amid 2-[(4-Karbamimidoil-phenilamino)-metil]-1 - metil-1 H-benzoimidazol-5-karboksilne kiseline 1a Metil estar 3-[(4-Metilamino-3-nitro-benzoil)-fenil-amino]-propionske kiseline
Rastvoru hlorida 4-metilamino-3-nitro-benzoeve kiseline (23.3 mmol) i metil estra 3-fenil-amino-propionske kiseline (23.3 mmol) u 80 mL suvom tetrahidrofuranu (THF) u kapima je dodat uz mešanje na sobnoj temperaturi trietilamin (50.2 mmol). Posle tri sata reakciona smeša je uparena do suvog ostatka, preostala črvsta supstanca je triturana sa vodom i čvrsti proizvod je izolovan putem filtracije.
Prinos: 99%
C18H19N305(357.36)
TLC (silika gel; Dichlorometane/etanol 19:1): Rf = 0.48
lb Metil estar 3-[(3-Amino-4-metilamino-benzoil)-fenil-amino]-propionske kiseline
Nitro grupa proizvoda 1a je redukovana sa hidrogenizacijom na sobnoj temperaturi u etanolu sa Pd (10% na uglju) kao katalizatorom.
Prinos: 99%
C18H21N303(327.38)
TLC (silika gel; Dihlorometan/etanol 9:1): Rf= 0.23
Maseni spektrum (ESI): [M+H]<+>= 328
1c Metil estar 3-({3-[2-(4-Cijano-fenilamino)-acetilamino]-4-metilamino-benzoil}-fenil-amino)-propionske kiseline
Proizvod 1b (23.2 mmol) i N-(4-cijano-fenil)-glicin (23.2 mmol) su kuplovani sa CDI (23.2 mmol) u suvom THF na sobnoj temperaturi. Posle završetka reakcije smeša je uparena do suvog ostatka i sirovi proizvod je korišćen bez daljeg prečišćavanja.
Prinos: 97%
C27H27N5O4(485.54)
Maseni spektrum (ESI): [M+H]<+>= 486
Id Metil estar 3-({2-[(4-Cijano-fenilamino)-metil]-1 -metil-1 H-benzoimidazol-5-karbonil}-fenil-amino)-propionske kiseline
Rastvor proizvoda 1c (22.6 mmol) u 100 ml_ koncentrovane sirćetne kiseline je zagrevan do refluksa jedan sat. Rastvor je potom uparen do suvog ostatka, preostala čvrsta supstancaje triturovana sa vodom i uz mešanje pH je podešena na oko 8-9. Sirovi proizvod je izolovan putem ekstrakcije sa etil acetatom i prečišćen sa hromatografijom na silika gelu (eluent: dihlorometan/etanol 1:1).
Prinos: 58%
C27H25N5O3(467.52)
TLC (silika gel; Dihlorometan/etanol 9:1): Rf= 0.71
Maseni spektrum (ESI): [M+H]<+>= 468
1e 3-({2-[(4-Cijano-fenilamino)-metil]-1 -metil-1 H-benzoimidazol-5-karbonil}-fenil-amino)-propionska kiselina
Rastvoru proizvoda 1d (13.0 mmol) u 100 mL metanola dodat je natrijum hidroksid (20.0 mmol). Smeša je mešana 2.5 sata na 40°C i potom uparena do suvog ostatka. Preostala čvrsta supstanca je mešana sa 100 mL vode i pH je podešen na oko 6 sa koncentrovanom sirćetnom kiselinom. Istaloženi proizvod je izolovan sa filtracijom, ispran sa vodom i osušen na 60°C.
Prinos: 88%
C26H23N5O3(453.49)
TLC (silika gel; Dihlorometan/etanol 9:1): Rf= 0.33
Maseni spektrum (ESI): [M+H]<+>= 454
1f Terc-butil estar {4-[3-({2-[(4-Cijano-fenilamino)-metil]-1 -metil-1 H-benzoimidazol-5-karbonil}-fenil-amino)-propionilamino]-butil}-karbaminske kiseline
Rastvor proizvoda 1e (5.23 mmol), 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TBTU, 5.23 mmol) i N-metil-morfolina (5.23 mmol) u 20 mL DMF je mešan na sobnoj temperaturi oko 30 minuta. Potom je dodat terc-butil estar (4-amino- butil)-karbaminske kiseline (5.23 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi još dodatna 24 sata. Smeša je potom razblažena sa vodom (100 mL) i proizvod je izolovan putem ekstrakcije sa etil acetatom.
Prinos: 92%
C35H41N704(623.75)
TLC (silika gel; Dihlorometan/etanol 9:1): Rf= 0.51
1q [2-(4-amino-butilkarbamoil)-etil]-fenil-amid 2-[(4-Karbamimidoil-fenilamino)-metil]-1 -metil-1 H-benzoimidazol-5-karboksilne kiseline
Proizvod 1f (4.81 mmol) je rastvoren u zasićenom rastvoru HCI u etanolu (250 mL), smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći i potom uparena do suvog ostatka na 30°C. Preostali sirovi materijal je rastvoren u 200 mL suvog etanola, potom je dodat amonijum karbonat (48.1 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Posle uparavanja rastvarača preostali sirovi materijal je triturovan sa ca. 5 mL etanola, nerastvoreni materijal je odvojen filtracijom i rastvarač je uparen na 30°C. Proizvod je potom rastvoren u 30 mL vode, rastvor mešan sa ca. 2 g uglja, filtriran i uparen do suvog ostatka.
Prinos: 90%
C3oH36N802(540.67)
TLC (reverzna faza RP-8; metanol/5% vodeni rastvor NaCI 9:1): Rf= 0.79
Maseni spektrum (ESI): [M+H]<+>= 541
[M+CI]- = 575/7
Hapten2 [2-(2-amino-etilkarbamoil)-etil]-piridin-2-il-amid 2-[(4-Karbamimidoil-fenilamino)-metil]-1
-metil-1 H-benzoimidazol-5-karboksilne kiseline
2a 3-({2-[(4-Cijano-fenilamino)-metil]-1 -metil-1 H-benzoimidazol-5-karbonil}-piridin-2-il-amino)-propionska kiselina
Rastvoru natrijum hidroksida (50.0 mmol) u 500 mL etanola i 50 mL vode dodat je etil estar 3-({2-[(4-Cijano-fenilamino)-metil]-1-metil-1 H-benzoimidazol-5-karbonil}-piridin-2-il-amino)-propionske kiseline (41.4 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tri sata, potom je destilovano ca. 350 mL etanola, dodato je ca. 100 mL vode i pH je podešena na 6. Potom je destilat dodat (50 mL) i smeša je mešana preko noći. Proizvod je izolovan sa filtracijom i korišćen bez daljeg prečišćavanja.
Prinos: 78%
C25H22N603(454.48)
2b Terc-butil estar {2-[3-({2-[(4-Cijano-fenilamino)-metil]-1 -metil-1 H-benzoimidazol-5-karbonil}-piridin-2-il-amino)-propionilamino]-etil}-karbaminske kiseline
Rastvor proizvoda 2a (2.20 mmol), 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum tetrafluoroborata (TBTU, 2.20 mmol) i N-metil-morfolina (2.20 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (100 mL) je mešan na sobnoj temperaturi 15 minuta. Potom je dodat terc-butil estar (2-amino-etil)-karbaminske kiseline (2.20 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi još dodatna 24 sata. Smeša je potom razblažena sa 40 mL vode, proizvod je izolovan putem ekstrakcije sa etil acetatom i prečišćen sa hromatografijom (silika gel; dihlorometan/metanol 15:1).
Prinos: 61%
C32H36N804 (596.68)
Maseni spektrum (ESI): [M+H]<+>= 597
[M+H]"= 595
2c [2-(2-Amino-etilkarbamoil)-etil]-piridin-2-il-amid 2-[(4-Karbamimidoil-fenilamino)-metil]-1 -metil-1 H-benzoimidazol-5-karboksilne kiseline
Proizvod 2b (1.34 mmol) je dodat zasićenom rastvoru HCI u suvom etanolu (30 mL). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 5 sati, potom uparen do suvog ostatka na 30°C. Etanol (30 mL) i amonijum karbonat (13.0 mmol) su dodati i smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je potom uparen, ostatak materijala je triturovan 5 puta sa ca. 4 mL smeše dihlorometan/metanol (30:1), filtriran i uparen u cilju da se odvoji proizvod od neorganskih soli.
Prinos: 27%
C27H31N902 (513.61)
Maseni spektrum (ESI): [M+CI]"= 548/50
[M+HCI+CI]- = 584/6
[M+H]<+>= 514
2. HEMIKALIJE
2.1 HEMIKALIJE ZA SINTEZU REAGENSA
2.2 HEMIKALIJE ZA ELISA 2.3 PUFERI ZA ELISA
Voda iz Elgastat Maxima-HPLC ultra čistog vodenog procesnog sistema je korišćena za dobijanje pufernih rastvora.
3. SINTEZA IMUNOGENA
U cilju da se stimuliše imuni sistem zečeva kako bi proizvodili poliklonalna antitela protiv dabigatrana, tri imunogena (lot. br.GL256, GL258, i GL262,)su sisntetizovani kuplovanjem haptena HAPTEN 1 i HAPTEN 2 do nosećeg proteina goveđeg seruma albumina (BSA) korišćenjem 1,4-benzohinona ili 1,1'-karbonil-di-(1,2,4-triazol) kao reagensa za kuplovanje.
Za sintezuGL256,1,4-benzohinonje korišćen kao homobifunkcionalno jedinjenje sa dva reakciona mesta. Prvo reaguje pri kiselinskoj pH sa amino grupama na samo jednom od dva mesta i pri alkalnom pH na drugom mestu sa minimalnom polimerizacijom.GL258iGL262su sintetizovani korišćenjem 1,1 '-karbonil-di-(1,2,4-triazol) kao reagensa za kuplovanje sa različitim input odnosima haptena na nosećem proteinu.
3.1 SINTEZA GL256
Rastvoru 0.75 pMol BSA u 8.5 mL 0.1 M KH2P04-pufera (pH = 4.5), dodato je 0.416 mMol 1,4-benzohinona (u 1.5 mL etanola) i inkubirano 1.5 h u mraku na sobnoj temperaturi. Posle toga rastvor je dodat sefadeks G25 koloni ekvilibriran u 0.15 M NaCI kako bi se eliminisao višak 1,4-benzohinona (konačna zapremina 12.5 mL).
2.5 mL (0.15 pMol) pufernog BSA-rastvora je dodato polako uz mešanje rastvoru od 525 pMol haptena HAPTEN 1 rastvorenog u 2 mL 0.1 M NaHC03//Na2C03-puferu (pH=8.5). Tokom dodavanja BSA rastvora pH je podešena do približno 8.0. Molarni input odnos haptena i nosača proteina je bio 3500:1.
Posle inkubacije na sobnoj temperaturi preko noći imunogen je dijalizovan 6 puta protiv 1 litarskog voden. dest. Hromatografija tankog sloja je pokazala da ni jedno mesto ne vezanog haptena nije preostalo u vezama hapten-nosač.
Imunogen je skladišten zamrznut u alikvotima na - 20°C. Stepen supstitucije BSA sa haptenom u supernatantu imunogena je oko 1:18 kao što je određeno sa UV apsorpcijonim spektrometrom na 302 nm. Sadržaj imunogena u finalnom rastvoru je bio 0.75 mg GL256/ml.
3.2 SINTEZA GL258
Rastvor 158 pMol HAPTEN 2 u 6.3 mL N,N-dimetilformamidu (DMF) je dobijen na sobnoj temperaturi. 158 pMol 1,1'-karbonil-di-(1,2,4-triazol) je dodato i inkubirano prvo na 4 sata na 10°C i posle još 30 min na sobnoj temperaturi. Hemijska reakcija je proverena sa hromatografijom na tankom sloju i iznosila je oko 20-25%. Potom je 0.75 pMol BSA rastvoreno u 2 mL 0.13 M NaHC03i dodat je u kapima uz mešanje 1 mL N,N-dimetilformamida (DMF). pH je podešena na približno 8.3. Na kraju rastvor haptena (6.3 mL) i 4 mL 0.13 M NaHC03su dodati u kapima BSA rastvoru uz mešanje i pH je podešena na 8.4. Molarni input odnos haptena i nosećeg proteina je bio 210:1 za imunogen GL258.
Posle inkubacije na sobnoj temperaturi preko noći uz mešanje, imunogen je dijalizovan 6 puta protiv 1 litra voden. dest. Hromatografija na tankom sloju pokazuje da ni jedno mesto ne vezanog heptena nije preostalo u vezama hapten-nosač.
Imunogen je skladišten smrzavanjem u alikvotima na - 20°C. Stepen supstitucije BSA sa haptenom u supernatantu imunogena je oko 1:5 kao što je određeno UV apsorpcionom spektrometrijom na 302 nm. Sadržaj imunogena u finalnom rastvoru je bio 0.28 mg GL258 / mL.
3.3SINTEZA GL262
Rastvor 225 pMol HAPTEN 2 u 8.75 mL N,N-dimetilformamida (DMF) je dobijeno na sobnoj temperaturi. 225 pMol 1,1'-karbonil-di-(1,2,4-triazol) je dodato i inkubirano 4 sata na 10°C. Hemijska reakcija je proverena sa hromatografijom na tankom sloju i iznosila je oko 20-25%.
Potom 0.49 pMol BSA je ratsvoreno u 2 mL 0.13 M NaHC03 i dodat je u kapima uz mešanje 1 mL N,N-dimetilformamida (DMF). pH je podešena do približno 8.2. Na kraju rastvor haptena (8.75 mL) i 6 mL 0.13 M NaHC03su dodati u kapima BSA rastvoru uz mešanje i pH je podešena na 8.3. Molarni input odnos heptena i nosećeg proteina je bio 460:1 za imunogen GL262.
Posle inkubacije na sobnoj temepraturi preko noći uz mešanje, imunogen je dializovan 6 puta protiv 1 litra vod. dest. Hromatografija na tankom sloju pokazuje da ni jedno mesto ne vezanog heptena nije preostalo u vezama hapten-nosač.
Imunogen je skladišten smrzavanjem u alikvotima na - 20°C. Stepen supstitucije BSA sa haptenom u supernatantu imunogena je oko 1:32 kao što je određeno UV apsorpcionom spektrometrijom na 302 nm. Sadržaj imunogena u finalnom rastvoru je bio 0.71 mg GL262/mL.
4. SINTEZA KONJUGATA
4.1 SINTEZA GL261
RAstvor37.4 uMol HAPTEN 2 u 1.5 mL N,N-dimetilformamida (DMF) je dobijeno na sobnoj temperaturi. 37.5 pMol 1,1'-karbonil-di-(1,2,4-triazol) je dodato i inkubirano 4 sata na 10°C i na kraju 30 min na sobnoj temperaturi. Hemijska reakcija je proverena sa hromatografijom na tankom sloju i iznosila je oko 20-25%.
Potom 1.125 pMol enzima ren peroksidaze (HRP) je rastvoreno u 0.4 mL 0.13 M NaHC03 i u kapima uz mešanje je dodato 0.267 mL N,N- dimetilformamida (DMF). pH je podešena do približno 8.2. Na kraju je dodato 0.9 mL hapten rastvora (22.5 pMol) i 0.57 mL 0.13 M NaHC03u kapima HRP rastvoru uz mešanje i pH je podešena do 8.4. Molarni input odnos haptena i HRP je bio 20:1 za HRP spojeni GL261.
Posle inkubacije na sobnoj temperaturi preko noći uz mešanje, HRP spajanje je odvojeno od organskih rastvarača i viška haptena sa gel hromatografijom. Rastvor je dodat sefadeks G25 koloni ekvilibriran sa 0.1 M fosfatnim puferom pH 7.0.
Finalna koncentracija hapten-HRP spajanja (traker, 5.64 mg/mL) je skočio sa BSA prinosom koncentracije od oko 10 mg/mL, jednaka zapremina glicerina kako bi se sprečilo zamrzavanje i timol kristal kako bi se sprečio rast bakterija. Rastvor trakera je označen kao lot br. GL261 i skladišten u alikvotima na -20°C.
Stepen supstitucije HRP sa haptenom je bio 1:0.2 kao što je određeno sa UV spektroskopijom na 302 nm.
Specifična aktivnost trakera je izmerena u BSA-blokiranim mikrotitarskim pločama korišćenjem o-fenilen-diamin (OPD) kao supstrat i nativnog HRP kao referentni materijal. Smeša razblaženih HRP standarda ili hapten-HRP spojenog i supstratnog rastvora su inkubirani na 30 min u mraku, zasutavljeni sa sumpornom kiselinom i apsorpcija je izmerena na 490 nm. Preostala aktivnost je bila 94 % nativnog HRP a specifična aktivnost konjugovane formulacije u glicerinu je bila 611 U/mL.
Kratak sadržaj trakera:
5.IMUNIZACIJA I PROIZVODNJA ANTITELA
5.1 IMUNIZACIJA ZEČEVA
Dvanaest ženskih činčila zečeva, starosti 3 meseca, su imunizovani sa emulzijom od 100 ug imunogena GL256, GL258 i GL262 u 0.5 mL 0.9 % NaCI rastvora i 0.5 mL potpunog Freund's adjuvansa (CFA). Nekoliko buster imunizacija je praćeno u sledećem mesecu. Za treću imunizaciju korišćeno je 0.5 mL nepotpunog Freund's adjuvansa (IFA). Svaka imunizacija je izvedena na četiri potkožna i četiri intramuskularna mesta.
Grupa A - imunogen
Grupa B - imunogen
Grupa C - imunogen
GL262
Zec 11 #48 Zec 12 #49
5.2 ANALIZA ŽEČIJEG SERA
Serum je pripremljen centrifugiranjem koagulisane krvi zeca. Proteinska frakcija je dobijena taloženjem sa amonijum sulfatom i desaliziran kroz Sephadex G25 kolonu.
Pojedinačne proteinske frakcije iz zečijeg sera su skenirane na anti-dabigatrana titer standardnom ELISA procedurom.
Skeniranje-ELISA:
5.3DETEKCIJA ANTI-DABIGATRAN ANTITELA U ZEČIJEM SERA
Poslednje tri kolone: vrednosti su za dabigatran
Posle skeniranja proteinskih frakcija svih zečeva iz krvarenja 2, očigledno je bilo da zec br. 5 (#54) ima najveći titar anti-dabigatran antitela sa poželjnim haptenom HAPTEN2. Dalje, bilo je moguće premestiti traker sa vezujućeg mesta antitela samo sa niskom koncentracijom analita (dabigatran).
Za skeniranje finalnog krvarenja 3, premeštanje trakera sa vezujućeg mesta antitela sa niskim koncentracijama analita (dabigatran) je korišćen kao glavni kriterijum odluke, zbog nedostajanja informacije o korišćenom imunogenu. Stoga zečevi br. 2, 3 i 5 su korišćeni za dalje prečišćavanje.
5.4 PREČIŠĆAVANJE POLIKLONALNIH ANTITELA
Anti-serum zeca br. 5 (#54) krvarenje br. 2 i zečeva br. 2, 3 i 5 krvarenje br. 3 (finalno krvarenje) je istaloženo sa amonijum sulfatom. Talog je centrifugiran 30 min na 10°C pri 4500 U/min, odvojen iz rastvora i ponovo rastvoren u Tris puferu. Ova procedura je ponovljena. Dalje prečišćavanje je izvedeno sa srodnom hromatografijom na proteinu A sefaroze FF. Kolona pufera je 0.01 M Tris pH = 7.5 i 0.1 M glicin pH = 3.0 je korišćen za eluciju. Frakcije koje sadrže zečiji IgG su kombinovane. Koncentracija proteina je određena sa UV spektroskopijom na 280 nm.
Kratak oois antitela:
II. Neutralizacija dabigatrana
Dve serije eksperimenata su izvedene kako bi se pokazao efekat antitela protiv antikoagulantne aktivnosti dabigatranain vitro.Četiri poliklonalna antitela su primljena u laboratoriju i dalje testirana na ljudskoj plazmi. Ovo je testirano u funkcionalnoj analizi, vreme zgrušavanja trombina.
Opis analize:
Ukratko, ljudska plazma je dobijena uzimanjem krvi u 3.13% natrijum citrata. Potom je centrifugirano kako bi se dobila plazma oslobođena trombocida i prebačena u odvojenu tubu i zamrznuta dok ne bude potrebna na dan analize. Plazma je otopljena na 37°C na dan analize.
Vreme zgrušavanja trombina je izvedeno kao što sledi. Prvo trombin je razblažen po uputstvima proizvođača (3 lU/mL trombina) u obezbeđenom puferu (Dade Behring Test kit) i prethodno zagrejan do 37°C. Korišćen je u periodu od 2 sata od kada je pripremljen. Sve analize su izvedene na komercijalno dostupnoj CL4 mašini za zgrušavanje (Behnk Electronics, Norderstadt, Nemačka). Pedeset IJL plazme je pipetirano u obezbeđene kivete sa magnetnom mešalicom i ostavljeno da se meša 2 min u posudi koja je prethodno zagrejana na 37°C u CL4 mašini. U tom trenutku 100 pL rastvora trombina je dodato i vreme koje je potrebno za uzorak plazme da se zgruša je zabeleženo automatski od strane CL4. Dabigatran je prethodno inkubiran na 5 min u plazmi u obezbeđenim kivetama, pre dodavanja trombina i početka merenja. Ukoliko je antitelo takođe testirano (do 50 pL matičnog rastvora), postoji dodatnih 5 minuta inkubacije na 37°C pre započinjanja zgrušavanja (odn. 10 min ukupne inkubacije sa dabigatranom, 5 min ukupne inkubacije sa antitelom i potom je zgrušavanje započeto sa trombinom).
Na početku standardna kriva dabigatrana je izvedena dodavanjem povećanih koncentracija dabigatrana ljudskoj plazmi i merenjem vremena zgrušavanja posle dodavanja trombina (Slika 1). Postojalo je povećanje koncentracija-zavisnost u vremenu zgrušavanja trombina sa povećanjem koncentracija dabigatrana.
Za prvi set eksperimenata neutralizacije, klinički bitna koncentracija 200 nM dabigatrana je dodata svim uzorcima plazme za neutralizaciju. Sva 4 preparata antitela su bila u mogućnosti da skrate vreme zgrušavanja u plazmi koja sadrži dabigatran (Slika 2). Produženje neutralizacije je povezano sa koncentracijom proteina u svakom preparatu antitela. Rastvor antitela sa najvećom koncentracijom (D)je potom bio serijski razblažen i testiran na sposobnost neutralizacije 200 nM antikoagulantne aktivnosti dabigatrana u odvojenom setu eksperimenata. Može se videti na Slici 3, da postoji koncentraciona zavisnost inhibicije dabigatran-izazvane antikoagulantne aktivnosti sa povećanjem koncentracija antitela. Dodatno kada je ne specifično zečije poliklonalno antitelo (plavi kvadrat) dodato plazmi koja sadrži dabigatran, nije postojala sposobnost da se neutrališe antikoagulaciona aktivnost. Koncentraciona zavisnost i nedostatak neutralizacije ne specifičnog antitela ukazuje na reverznu antikoagulaciju od strane antitela je posebna za dabigatran.
Međutim, ove koncentracije dabigatrana su klinički relevantne, i krvarenje ili predoziranje će se verovatno desiti sa višim koncentracijama. Prema tome sposobnost antitela da inhibira antikoagulantna aktivnost više koncentracije dabigatrana (500 nM) u standardnoj krivoj na Slici 1 je takođe testirano. Slika 4 ilustruje da će antitelo D takođe inhibirati visoke koncentracije dabigatrana.
III. PROIZVODNJA I KARAKTERIZACIJA MONOKLONALNIH ANTI-DABIGATRAN ANTITELA
1. Proizvodnja monoklonalnih anti-dabigatran antitela i Fabs
Miševi su imunizirani sa Hapten 1 (videti Primer 1.1) konjugovani na nosečem proteinu tako da su hemocijanin i imunoglobulin i hibridomi su generisani prema standardnim postupcima. Monoklonalna antitela prečišćena iz kulture supernatanata vezuju se za dabigatran-protein konjugate i ovo vezivanje može se takmičiti sa dabigatranom u rastvoru sa polu-maksimalnom inhibicijom pri koncentracijama u opsegu od 1 do 10 nM. Fabs su generisani sa papin cepanjem monoklonalnih antitela sa sledećom eliminacijom Fc domena preko Proteina A.
Varijabilni regioni iz teških i lakih lanaca mišijih antitela su klonirana i sekvencionirana korišćenjem standardnih metoda. Sekvence su potvrđene analizom proteina sa masenom spektrometrijom i N-krajnjim sekvencioniranjem antitela. DNK konstrukcije kodiraju himerna antitela koja sadrže određene mišije varijabilne regione i humani IgG konstantni regioni su generisani i protein je iskazan u HEK 293T ćelijama i prečišćen.
2. Karakterizacija monoklonalnih anti-dabigatran antitela i Fabs
Sekvence varijabilnih domena tri klona monoklonalnog antitela su prikazani na Slici 5 i 6. Ove amino kiselinske sekvence varijabilnih domena klona 13 su prikazane na Slici 5 (DBG 13 VH, teški lanac, SEQ ID NO: 16) i Slici 6 (DBG 13 VK, laki lanac, SEQ ID NO: 17). Amino kiselinske sekvence varijabilnih domena klona 14 su prikazane na Slici 5 (DBG 14 VH, teški lanac, SEQ ID NO: 18) i Slici 6 (DBG 14 VK, laki lanac, SEQ ID NO: 19). Amino kiselinske sekvence varijabilnih domena klona 22 su prikazane na Slici 5 (DBG 22 VH, teški lanac, SEQ ID NO: 20) i Slici 6 (DBG 22 VK, laki lanac, SEQ ID NO: 21).
Mišiji klon monoklonalnog antitela 22 je testiran na njegovu sposobnost da neutrališe antikoagulantnu aktivnost u ljudskoj plazmi u analizi vremena zgrušavanja trombina koja navedena u Primeru II. Antitelo upotpunosti menja dabigatran-posredovano produženje trombin zavisnog zgrušavanja u ljudskoj plazmi na dozno zavisan način (Slika 7). Antitelo takođe efikasno inhibira funkciju dabigatrana u ljudskoj krvi. Fab generisan iz ovog antitela blokira aktivnost dabigatrana u ljudskoj plazmi demonstrirajući da monovalentni antigenski vezujući domeni mogu neutralisati jedinjenje antikoagulantne aktivnosti. (Slika 8).
Najveća metabolička putanja dabigatrana kod ljudi jeste krozglukuronidaciju karboksilnog ostatka. Dabigatran acilglukuronidi su pokazali da su farmakološki aktivni (Ebner et al., Drug Metab. Dispos. 2010, 38(9):1567-75). Kako bi se testiralo da li mišiji klon monoklonalnog antitela 22 mogu da neutrališe ove metabolite, dabigatran acilglukuronidi su prečišćeni iz urina rezus majmuna koji su tretirani sa dabigatranom i procenjeni u analizi vremena zgrušavanja trombina. Dozna zavisnost antitela preokreće dabigatran acilglukuronid-posredovano produženje zavisnog zgrušavanja trombina u ljudskoj plazmi sa sličnim potencijalom u odnosu na ono koje je viđeno sa dabigatranom (Slika 9). Prema tome, antitelo je efikasno u blokiranju antikoagulantne aktivnosti dabigatran metabolita koji su pronađeni kod ljudi.
Sposobnosti Fab i mišijih-humanih himernih antitela koji sadrže varijabilne domene klonova 22, 13 i 14 i humane imunoglobulinske konstantne regione (konstantni region lakog lanca: SEQ ID NO: 44; konstantni region teškog lanca: SEQ ID NO: 45) su određene korišćenjem Kinexa tehnologije. Konstantna koncentracija Fab ili himerno antitela je inkubirano sa raznim koncentracijama dabigatrana dok nije dostignut ekvilibrijum. Posle ove inkubacije koncentracija slobodnog antitela je određena zarobljavanjem antitela na Neutravidin kuglicama koje su spojene sa Biotin-konjugovanim dabigatran analogom. Zarobljeni Fab je detektovan sa anti-Mišijim IgG (Fab specifičnim) F(ab')2 fragmentom označenim sa FITC. Zarobljena himerna antitela su detektovana sa anti-humanim IgG konjugovanim sa Cy5. Konstantne disocijacije su izračunate korišćenjem 1:1 vezujućeg modela. Rezultati su iz ovih eksperimenata sumirani u tabeli u nastavku.
Oba Fab i himerna antitela vezuju dabigatran sa visokim afinitetom.
3. Generisanje humanizovanih monoklonalnih anti-dabigatran antitela i Fabs
U cilju da se smanji potencijalna imunogenost koja je praćena primenom kod muškaraca, mišija monoklonalna antitela su 'humanizovana.' Humani okviri sekvenci su odabrani iz miševa koji vode na osnovu okvirne homologije, CDR strukture, konzervisanih kanonskih ostataka, konzervisanih pristupnih pakovanih ostataka i drugih parametara. Određena supstitucija amino kiselinskih ostataka u ovim okvirnim pozicijama može poboljšati razne aspekte performance antitela koji uključuju vezujući afinitet i/ili stabilnost, preko toga demonstrirani u humanizovanim antitelima obrazovani sa "direktnom zamenom" CDRs ili HVLs u ljudskim embrijonskim okvirnim regionima. Fabs koji pokazuju bolju ili jednako vezivanje i poboljšanu ekspresiju kada se poredi sa himernim roditeljskim Fab su odabrani za dalju karakterizaciju. Amino kiselinske sekvence varijabilnih domena humanizovanih Fabs su prikazani na Slici 5 (Eng VH 14, SEQ ID NO: 22; ENG VH 15, SEQ ID NO: 24; i ENG VH 31, SEQ ID NO: 26) i na Slici 6 (Eng VK 11, SEQ ID NO: 23; ENG VK 17, SEQ ID NO: 25; i ENG VK 18, SEQ ID NO: 27). Fab koji obuhvata Eng VH 15 i Eng VK 18 (laki lanac: SEQ ID NO: 37; teški lanac: SEQ ID NO: 36) je direktno iskazan u CHO ćelijama i prečišćen korišćenjem izabranog Kappa i Protein G smole.
Fab koji sadrži Eng VH 15 i Eng VK 18 je takođe konvertovan do pune dužine IgG u lgG1 KO format (laki lanac: SEQ ID NO: 35; teški lanac: SEQ ID NO: 40). lgG1 KO (knock-out efektorskih funkcija) ima dve mutacije u Fc regionu, Leu234Ala i Leu235Ala, koji redukuje efektorsku funkciju kao što je FcgR i dopunjuju vezivanje. IgG format je opisan u literaturi (videti na primer Hezareh et al. (2001) Journal of Virologv 75: 12161-12168). Humanizovana anti-dabigatran antitela opciono uobuhvataju određene amino kiselinske supstitucije u konsezusnim ili embrijonskim okvirnim regionima. 18/15 antitelo je iskazano u HEK293T ćelijama ili CHO ćelijama i prečišćeno. Fab fragmenti su generisani sa ili Lys-C ili papain odcepljivanjem netaknutog antitela i prečišćeni sa eliminacijom Fc domena preko Proteina A.
4. Karakterizacija anti-dabigatran Fabs
18/15 Fab fragment generisan sa Lys-C cepanjem netaktnutog antitela je testiran na njegovu sposobnost da neutrališe dabigatran antikoagulantnu aktivnost u ljudskoj plazmi u analizi vremena zrgušavanja trombina kao što je navedeno u Primeru II. Fab potpuno preokreće dabigatran-posredovano produženje zavisnog zgrušavanja trombina u ljudskoj plazmi na dozno zavisan način sa IC50od 2.6 nM (Slika 10). Direktno iskazan Fab fragment i Fab fragment generisan sa papain cepanjem netaktnutog antitela takođe neutrališe dabigatran antikoagulantnu aktivnost sa IC50od 2.6 i 2.7 nM, respektivno.
Sposobnosti 18/15 Fab generisanog sa Lys-C cepanjem netaknutog antitela i direktno iskazanog Fab su određene na BlAcore instrumentu korišćenjem SPR tehnologije. Fabs su prethodno inkubirani sa povećanim koncentracijama dabigatrana na 30 minuta na sobnoj temperaturi. Smeša je tekla preko senzornog čipa koji je presvučen sa imobilisanim analogom biotin spojenim dabigatranom i vezivanje slobodnog Fab je praćeno. Korišćenjem ovog rešenja konkuretnog dizajna analize, KDvrednosti Fabs za dabigatran su određene da budu 0.16 pM za Lys-C generisani i 0.45 pM za direktno iskazane Fabs.
In vivo eksperimenti sa Fab generisani sa papain cepanjem
Pacovi (muški Wistar, -300 g) su podvrgnuti anesteziji sa pentobarbitalom kao bolusom (60 mg/kg i.p.) i konstantnom infuzijom za održavanje anestezije (20 mg/kg/hr i.p.) i postavljeni su na ploču koja se zagreva na 37°C kako bi se održala unutrašnja telesna temperatura. Karotidna arterija je izolovana i ubačena je tanka cevčica radi uzorkovanja krvi i desna jugularna vena za primenu supstance. Dabigatran je iniciran kao bolus (0.3 uM/kg) i praćen infuzijom (0.1 pM/kg/hr) tokom 20 min kako bi se postiglo stabilno stanje plazma nivoa. Posle 20 min, Fab je ubrizgan i.v. kao pojedinačni bolus ili kao ekvimolarne ili polu ekvimolarne koncentracije preko leve jugularne vene. Uzeti su uzorci krvi (1/10 razblaženje u 3.13% natrijum citratu) na osnovnoj liniji (-20, -2 min) i pri različitim intervalima za 30 min post Fab ubrizgavanja.
Antikoagulantni efekti dabigatrana su izmereni kao vreme zgrušavanja krvi, uključujući vreme potrebno za trombin (thrombin time (TT)) i vreme potrebno za aktivirani delimični tromboplastin (aktivira activated partial thromboplastin time (aPTT)). Ukratko, vreme potrebno za trombin je izvedeno na koagulometru dodavanjem 50 pL krvi u bunarčić koji je prethodno zagrejan do 37°C. Trombin (Siemens Healthcare, Marburg, Nemačka) u koncentraciji od 3.0 U/mL je dodat (100 uL zapremine) a vreme koje je potrebno za zgrušavanje je izmereno. aPTT krvi je izveden prethodnim zagrevanjem 50 pL krvi na 37°C u koagulometru i dodavanjem 50 pL aPTT reagensa (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemačka) na 3 min. Vreme zgrušavanja je započeto dodavanjem 50 pL 0.025 M prethodno zagrejanog (37°C) kalcijum hlorida. Vreme potrebno da se uzorak krvi zgruša je potom zabeleženo.
Rezultati 18/15 Fab (laki lanac: SEQ ID NO: 37, teški lanac Fd fragmenta: SEQ ID NO: 41; dobijen sa papain cepanjem punog imunoglobulina iskazanog u CHO ćelijama) dati kao pojedinačno i.v. ubrizgavanje pri ekvimolarnoj dozi u odnosu na dabigatran su prikazani na Slici 11 i 12. Postoji brza, skoro trenutna inhibicija dabigatran antikoagulacione aktivnosti, izmerena obe kao TT (Slika 11) i aPTT (Slika 12) u ovom modelu. U okviru jednog minuta od ubrizgavanja, dabigatran antikoagulaciona aktivnost je upotpunosti neutralisana nazad do nivoa osnovne linije. Ovo je održavano tokom 20 min, uprkos tekućoj kontinuiranoj infuziji i.v. dabigatrana.
Kada je niža doza, polovina molarne doze dabigatrana data, onda takođe dolazi do početne redukcije oba TT (Slika 13) i aPTT (Slika 14). Ovo je međutim, ne održivo kao dugo pošto viša doza pod uslovima tekuće kontinuirane infuzije dabigatran.
Prema tome, ovi rezultati pokazuju predviđenu doznu zavisnost i veoma brzu neutralizaciju dabigatran antikoagulantne aktivnosti posle pojedinačne i.v. primene anti-dabigatran Fab u ovom životinjskom modelu.
SEKVENCNA LISTA

Claims (20)

1. Molekul antitela koji ima vezujuće sposobnosti za dabigatran koji sadrži varijabilni domen teškog lanca sa CDR1 SEQ ID NO: 1, CDR2 SEQ ID NO: 7, CDR3 SEQ ID NO: 10, i varijabilni domen lakog lanca sa CDR1 SEQ ID NO: 13, CDR2 SEQ ID NO: 14, i CDR3 SEQ ID NO: 15.
2. Molekul antitela prema zahtevu 1 koji sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 24, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID No: 27.
3. Molekul antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva koji je monoklonalno antitelo, ljudsko antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, fragment antitela, prvenstveno Fab, Fab', ili F(ab')2fragment, antitelo pojedinačnog lanca, prvenstveno varijabilni fragment pojedinačnog lanca (scFv), Mali Modularni Imunofarmaceutski (Small Modular Immunopharmaceutical (SMIP)), ilidiatelo.
4. Molekul antitela prema zahtevu 3 koji je scFv, pri čemu varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca su povezani jedan za drugi preko vezujućeg peptida odabranog između grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, i SEQ ID NO: 31.
5. Molekul antitela prema zahtevu 3 koji ima teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 40, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 35.
6. Antitelo prema zahtevu 3 koje je Fab molekul koji ima Fd fragment koji sadrži SEQ ID NO: 36, ili SEQ ID NO: 41, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 37.
7. Antitelo prema zahtevu 6 koje ima Fd fragment koji sadrži SEQ ID NO: 36, i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 37.
8. Molekul antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva za korišćenje kao medikament.
9. Molekul antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva za korišćenje kao protivotrov dabigatran ili dabigatran eteksilat terapije, i/ili za preokret prekomerne doze dabigatrana ili dabigatran eteksilata.
10. Postupak proizvodnje molekula antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji obuhvata (a) obezbeđivanje ćelije domaćina koja sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju navedeni molekul antitela u funkcionalnoj vezi sa ekspresionom kontrolnom sekvencom, (b) kultivisanje navedene ćelije domaćina, i (c) oporavak molekula antitela iz ćelijske kulture.
11. Kit sadrži: (a) antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7, ili njegovu farmaceutsku kompoziciju; (b) farmaceutsku kompoziciju dabigatrana, dabigatran eteksilata, proleka dabigatrana ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; (c) posudu;i (d) etiketu.
12. Kit prema zahtevu 11, pri čemu farmaceutski prihvatljiva so dabigatran eteksilata je mezilatna so.
13. Kit prema zahtevu 11 ili 12, pri čemu jačina po doznoj jedinici dabigatrana, dabigatran eteksilata, proleka dabigatrana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli je između 75 mg i 300 mg, ili jednom na dan (QD) ili dva puta na dan (BID).
14. Kit obuhvata: (a) prvu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži dabigatran, dabigatran eteksilat, prolek dabigatrana ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; (b) drugu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7; (c) instrukcije za odvojenu primenu navedenih prvih i drugih famraceutskih kompozicija na pacijenta, pri čemu su navedene prve i druge farmaceutske kompozicije sadržane u odvojenim posudama i navedena druga farmaceutska kompozicija je za korišćenje u primeni na pacijenta kome je potrebna neutralizacija ili delimična nautralizacija dabigatrana ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana.
15. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za korišćenje u postupku neutralizacije ili delimične neutralizacije dabigatrana ili 1- O-acilglukuronid dabigatrana kod pacijenta koji se leči sa dabigatranom, dabigatran eteksilatom, prolekom dabigatrana ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli.
16. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7 za korišćenje u postupku neutralizacije ili delimične nautralizacije dabigatrana ili 1- O-acilglukuronid dabigatrana kod pacijenta obuhvata: (a) potvrdu daje pacijent lečen sa dabigatranom, dabigatran eteksilatom, prolekom dabigatrana ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli, i količinom koja je uzeta od strane pacijenta; (b) neutralizaciju dabigatrana ili 1-O-acilglukuronida sa antitelom prema bilo kom od zahteva 1 do 9 pre izvođenja testa ili analize zgrušavanja ili koagulacije gde će dabigatran ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana ometati tačno očitavanje rezultata testa ili analize; (c) izvođenje testa ili analize zgrušavanja ili koagulacije na uzorku uzetom od pacijenta kako bi se utvrdio nivo obrazovanja ugruška bez prisustva dabigatrana ili 1-O-acilglukuronid dabigatrana; i (d) podešavanje količine dabigatrana, dabigatran eteksilata, proleka dabigatrana ili njegove farmaceutski prihvatljive soli primenjene na pacijenta u cilju da se postigne odgovarajući balans između obrazovanja ugruška i degradacije kod pacijenta.
17. Antitelo za korišćenje prema zahtevima 15 ili 16, pri čemu količina antitela prema dabigatranu ili 1-O-acilglukuronid dabigatranu je u molamom odnosu između 0.1 i 100.
18. Antitelo za korišćenje prema zahtevu 17, pri čemu količina antitela prema dabigatranu ili 1-O-acilglukuronid dabigatranu je u molamom odnosu između 0.1 i 10.
19. Antitelo za korišćenje prema zahtevu 16, pri čemu tačno očitani rezultat testa ili analize je tačno očitani nivoi fibrinogena, aktivirane rezistentnosti proteina C, ili srodni testovi.
20. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema jednom ili više zahteva 1 do 7, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
RS20170195A 2010-01-20 2011-01-20 Antikoagulantni protivotrovi RS55683B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10151239 2010-01-20
US38391410P 2010-09-17 2010-09-17
PCT/EP2011/050749 WO2011089183A2 (en) 2010-01-20 2011-01-20 Anticoagulant antidotes
EP11703410.8A EP2525812B1 (en) 2010-01-20 2011-01-20 Anticoagulant antidotes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55683B1 true RS55683B1 (sr) 2017-07-31

Family

ID=42061991

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170195A RS55683B1 (sr) 2010-01-20 2011-01-20 Antikoagulantni protivotrovi

Country Status (43)

Country Link
US (3) US8486398B2 (sr)
EP (2) EP3195876A1 (sr)
JP (2) JP5575923B2 (sr)
KR (1) KR101781787B1 (sr)
CN (1) CN102711813B (sr)
AP (1) AP2012006242A0 (sr)
AR (1) AR079944A1 (sr)
AU (1) AU2011208719C1 (sr)
BR (1) BR112012018021B1 (sr)
CA (1) CA2787566A1 (sr)
CO (1) CO6571889A2 (sr)
CY (2) CY1118875T1 (sr)
DK (1) DK2525812T3 (sr)
EA (1) EA028371B1 (sr)
EC (1) ECSP12012105A (sr)
ES (1) ES2614992T3 (sr)
FR (1) FR17C1026I2 (sr)
GE (1) GEP20156341B (sr)
HR (1) HRP20170613T1 (sr)
HU (2) HUE032263T2 (sr)
IL (1) IL219427B (sr)
LT (2) LT2525812T (sr)
LU (1) LUC00028I2 (sr)
MA (1) MA33936B1 (sr)
ME (1) ME02602B (sr)
MX (1) MX2012008360A (sr)
MY (1) MY162323A (sr)
NL (1) NL300882I2 (sr)
NO (2) NO2017034I1 (sr)
NZ (1) NZ599508A (sr)
PE (1) PE20121516A1 (sr)
PH (1) PH12012501493A1 (sr)
PL (1) PL2525812T3 (sr)
PT (1) PT2525812T (sr)
RS (1) RS55683B1 (sr)
SG (1) SG182552A1 (sr)
SI (1) SI2525812T1 (sr)
TN (1) TN2012000366A1 (sr)
TW (1) TWI513466B (sr)
UA (1) UA110470C2 (sr)
UY (1) UY33196A (sr)
WO (1) WO2011089183A2 (sr)
ZA (1) ZA201202876B (sr)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI513466B (zh) * 2010-01-20 2015-12-21 Boehringer Ingelheim Int 抗凝血劑解毒劑
DK3604339T3 (da) 2011-01-14 2021-04-12 Univ California Terapeutiske antistoffer mod ror-1-protein og fremgangsmåder til anvendelse af samme
CN103619883A (zh) * 2011-01-19 2014-03-05 拜耳知识产权有限责任公司 凝血因子抑制剂的结合蛋白
MA34978B1 (fr) * 2011-03-30 2014-03-01 Boehringer Ingelheim Int Antidotes pour anticoagulants
ME02424B (me) 2011-11-29 2016-09-20 Perosphere Inc Agensi koji vrše reverziju antikoagulanta
RU2015143696A (ru) 2013-03-14 2017-04-19 Байер Хелскеа Ллк МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АНТИТРОМБИНА β
WO2015059159A1 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticoagulant antidotes
TW201623331A (zh) * 2014-03-12 2016-07-01 普羅帝納生物科學公司 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法
CN105223348A (zh) * 2014-05-26 2016-01-06 北京九强生物技术股份有限公司 人抗凝血酶iii的胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒
EP2980218A1 (en) 2014-07-30 2016-02-03 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Aptamer thrombin complex for use as an antidote to direct acting thrombin inhibitors
WO2016019145A1 (en) * 2014-07-31 2016-02-04 Haemonetics Corporation Detection and classification of an anticoagulant using a clotting assay
US10300154B2 (en) 2014-09-17 2019-05-28 David R Elmaleh Anticoagulant derivatives for cardiovascular imaging
JP6581197B2 (ja) 2014-12-31 2019-09-25 深▲セン▼市薬欣生物科技有限公司Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｉｎ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 医薬組成物及びその製造方法
US10449195B2 (en) 2016-03-29 2019-10-22 Shenzhen Pharmacin Co., Ltd. Pharmaceutical formulation of palbociclib and a preparation method thereof
US11879014B2 (en) 2017-03-17 2024-01-23 Tusk Therapeutics Ltd. Method of treating cancer or depleting regulatory T cells in a subject by administering a human IGG1 anti-CD25 antibody
WO2019124468A1 (ja) * 2017-12-24 2019-06-27 ノイルイミューン・バイオテック株式会社 ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ｉｌ－７、及びｃｃｌ１９を発現する免疫担当細胞
EP3765503B1 (en) * 2018-03-13 2024-05-01 Tusk Therapeutics Ltd Anti-cd25 for tumour specific cell depletion
CN112567244A (zh) 2018-05-11 2021-03-26 哈尔西恩治疗公司 靶向gasp-1颗粒的结合蛋白和嵌合抗原受体t细胞及其用途
KR102882178B1 (ko) 2018-10-29 2025-11-05 화하이 유에스 인코퍼레이티드 신규한 디펩티드 화합물과 이의 용도
US12251377B2 (en) 2019-03-06 2025-03-18 University Of Rochester Anticoagulant compositions and uses thereof
CN114306245A (zh) 2020-09-29 2022-04-12 深圳市药欣生物科技有限公司 无定形固体分散体的药物组合物及其制备方法
TW202321311A (zh) * 2021-08-02 2023-06-01 日商諾伊爾免疫生物科技股份有限公司 與scFv等之連接子結合的抗體
US11446286B1 (en) * 2022-02-28 2022-09-20 King Faisal University Treatment of fungal infections using dabigatran etexilate
NL2036011B1 (en) 2023-10-12 2025-04-30 Synapse Res Institute Molecules for reversing anti-coagulant activity of direct oral anticoagulants
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6087380A (en) 1949-11-24 2000-07-11 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Disubstituted bicyclic heterocycles, the preparations and the use thereof as pharmaceutical compositions
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
KR100254759B1 (ko) * 1992-01-23 2000-05-01 플레믹 크리스티안 단량체 및 이량체 항체-단편 융합 단백질
DE4203965A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Max Planck Gesellschaft Antidot fuer hirudin und synthetische thrombininhibitoren
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
US5837242A (en) 1992-12-04 1998-11-17 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
ATE183513T1 (de) 1993-06-03 1999-09-15 Therapeutic Antibodies Inc Herstellung von antikörperfragmenten
AT404357B (de) 1995-06-13 1998-11-25 Immuno Ag Prothrombin-derivate
DE19605126A1 (de) 1996-02-12 1997-08-14 Basf Ag Thrombinmuteine als Antidot für Thrombininhibitoren
US6200955B1 (en) 1996-06-11 2001-03-13 Commonwealth Biotechnologies, Inc. Heparin binding peptides
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
PE121699A1 (es) 1997-02-18 1999-12-08 Boehringer Ingelheim Pharma Heterociclos biciclicos disustituidos como inhibidores de la trombina
JP2002505574A (ja) 1997-04-30 2002-02-19 エンゾン，インコーポレイテッド ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
DE19729544A1 (de) * 1997-07-10 1999-01-14 Basf Ag Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischung oder Derivate und deren Verwendung
US6440417B1 (en) 1998-11-06 2002-08-27 Conjuchem, Inc. Antibodies to argatroban derivatives and their use in therapeutic and diagnostic treatments
US6624141B1 (en) 1999-03-17 2003-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Protamine fragment compositions and methods of use
ES2529300T3 (es) 2000-04-12 2015-02-18 Novozymes Biopharma Dk A/S Proteínas de fusión de albúmina
WO2002056910A1 (en) 2001-01-17 2002-07-25 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20040097547A1 (en) 2001-04-16 2004-05-20 Taveras Arthur G. 3,4-Di-substituted cyclobutene-1,2-diones as CXC-chemokine receptor ligands
WO2004081026A2 (en) 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides
US20070031438A1 (en) * 2001-12-10 2007-02-08 Junghans Richard P Antibodies as chimeric effector cell receptors against tumor antigens
US20050214857A1 (en) 2001-12-11 2005-09-29 Algonomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
AU2003244817B2 (en) 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
EP2284192A3 (en) 2002-11-08 2011-07-20 Ablynx N.V. Camelidae antibodies for sublingual administration
PT2193196T (pt) * 2007-09-28 2016-10-24 Portola Pharm Inc Antídotos para inibidores do fator xa e métodos de utilização dos mesmos
AR070141A1 (es) * 2008-01-23 2010-03-17 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticuerpos humanizados especificos para el factor von willebrand
AU2010288601A1 (en) 2009-08-24 2012-02-02 Boehringer Ingelheim International Gmbh Emergency interventions of active charcoal with dabigatran etexilate overdosing
TWI513466B (zh) 2010-01-20 2015-12-21 Boehringer Ingelheim Int 抗凝血劑解毒劑

Also Published As

Publication number Publication date
LUC00028I1 (sr) 2017-07-14
CN102711813B (zh) 2015-03-04
PL2525812T3 (pl) 2017-07-31
LUC00028I2 (sr) 2017-09-25
JP2013517317A (ja) 2013-05-16
WO2011089183A3 (en) 2011-11-17
BR112012018021A2 (pt) 2017-06-20
ME02602B (me) 2017-06-20
CY2017025I2 (el) 2017-11-14
NO2022036I1 (no) 2022-08-12
ES2614992T3 (es) 2017-06-02
EP2525812A2 (en) 2012-11-28
GEP20156341B (en) 2015-08-10
EP3195876A1 (en) 2017-07-26
CY2017025I1 (el) 2017-11-14
KR20120128126A (ko) 2012-11-26
ECSP12012105A (es) 2012-10-30
UY33196A (es) 2011-08-31
LT2525812T (lt) 2017-02-27
CO6571889A2 (es) 2012-11-30
NZ599508A (en) 2014-05-30
HUS1700030I1 (hu) 2017-08-28
CN102711813A (zh) 2012-10-03
KR101781787B1 (ko) 2017-09-26
ZA201202876B (en) 2012-12-27
MY162323A (en) 2017-05-31
TWI513466B (zh) 2015-12-21
IL219427B (en) 2018-05-31
UA110470C2 (ru) 2016-01-12
US20120027780A1 (en) 2012-02-02
HK1173957A1 (en) 2013-05-31
DK2525812T3 (en) 2017-02-27
PH12012501493A1 (en) 2012-10-22
US9034822B2 (en) 2015-05-19
FR17C1026I2 (fr) 2018-07-20
CA2787566A1 (en) 2011-07-28
US20130289248A1 (en) 2013-10-31
EA028371B1 (ru) 2017-11-30
IL219427A0 (en) 2012-06-28
FR17C1026I1 (fr) 2017-09-08
NO2017034I1 (no) 2017-07-11
MX2012008360A (es) 2012-08-08
TW201136606A (en) 2011-11-01
SI2525812T1 (sl) 2017-05-31
US8486398B2 (en) 2013-07-16
PE20121516A1 (es) 2012-11-24
EA201201016A1 (ru) 2013-02-28
LTPA2017021I1 (lt) 2017-07-25
MA33936B1 (fr) 2013-01-02
SG182552A1 (en) 2012-08-30
HRP20170613T1 (hr) 2017-06-30
JP5575923B2 (ja) 2014-08-20
CY1118875T1 (el) 2018-01-10
AR079944A1 (es) 2012-02-29
PT2525812T (pt) 2017-04-26
HUE032263T2 (en) 2017-09-28
BR112012018021B1 (pt) 2020-12-08
JP2014210794A (ja) 2014-11-13
US20150210778A1 (en) 2015-07-30
WO2011089183A2 (en) 2011-07-28
NL300882I2 (nl) 2017-07-20
AU2011208719A1 (en) 2012-05-17
AU2011208719C1 (en) 2017-07-13
AP2012006242A0 (en) 2012-04-30
TN2012000366A1 (en) 2014-01-30
EP2525812B1 (en) 2017-01-18
LTC2525812I2 (lt) 2019-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2011208719B2 (en) Anticoagulant antidotes
AU2011208719C1 (en) Anticoagulant antidotes
TW201302796A (zh) 抗凝血劑解毒劑
JP2025503707A (ja) ガレクチン－１０抗体
US9499633B2 (en) Dabigatran antidotes
HK1173957B (en) Anticoagulant antidotes
HK1189532A (en) Anticoagulant antidotes
NZ613543B2 (en) Anticoagulant antidotes
AU2012234338A1 (en) Anticoagulant antidotes
OA16600A (en) Anticoagulant antidotes.