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PT99667B - Processo de preparacao de nonapeptidos antagonistas da bombesina e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Processo de preparacao de nonapeptidos antagonistas da bombesina e de composicoes farmaceuticas que os contem Download PDF

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PT99667B
PT99667B PT99667A PT9966791A PT99667B PT 99667 B PT99667 B PT 99667B PT 99667 A PT99667 A PT 99667A PT 9966791 A PT9966791 A PT 9966791A PT 99667 B PT99667 B PT 99667B
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psi
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PT99667A
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Inventor
Andrew V Schally
Ren Zhi Cai
Original Assignee
Univ Tulane
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Publication date
Application filed by Univ Tulane filed Critical Univ Tulane
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Publication of PT99667B publication Critical patent/PT99667B/pt

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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 99 667
REQUERENTE: ADMINISTRATORS DF THE TULANE EDUCATIONAL EUND, norte-americana (Estado de Louisiana), com sede em 1430 Tulane Aue, Meu/ Orleans LA 70112, Estados Unidos da América
EPÍGRAFE: Processo de preparação de nonapéptidos antagonistas da bombesina e de composições Farmacêuticas que os contêm
INVENTORES: Andreuj V. Schally, Ren Zhi Cai
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Estados Unidos da América em 29 de Novembro de 1990 sob ο ηθ. 619 747.
MOD m ,1 1673Í
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SHAL3.0-010CT/PT
PATENTE N=. 99 667
Processo de preparação de nonapéptidos antagonistas da bombesina e de composições farmacêuticas que os contêm
RESUMO
O presente invento refere-se ao processo de preparação de uma porção nonapeptídica de fórmula I
X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-psi-A9-Q na qual
Q é NH2 ou OQ1 onde Q1 é hidrogénio, alquilo ci-10' fenilo ou fenil-alquilo C7_10; X é hidrogénio ou uma ligação simples unindo a A2, o resíduo acilo de um ácido orgânico ou um grupo da fórmula rÍCO- onde (1) R1 é hidrogénio, alquilo ci-i0, fenilo ou fenil-alquilo c7-10? (2) R1CO- é (a)----R2
J>N-C0onde
R2 é hidrogénio, alquilo fenilo ou fenil-alquilo C7_10, R3 é hidrogénio ou alquilo Cq-10' (b) R4-O-CO- onde R4 é alquilo fenilo ou fenil-alquilo C7_10;
A1 é D-, L- ou DL-pGlu, Nal, Phe, Thi, Tyr, Tpi, Hca, Hpp, Mpp, Trp ou Trp substituído no anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, N02, NH2, OH, alquilo 0^-3 θ aleoxi sendo o halogéneo flúor, cloro e bromo,
A2 é Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) ou um grupo da fórmula Dpa (X), Asp (Y), Glu [-] e Glu (Y) onde
X é definido como anteriormente,
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Y é -OR5 OU onde
R5 é hidrogénio, alquilo ou fenilo;
r6 é hidrogénio ou alquilo
R7 é hidrogénio, alquilo Cx_3 ou -NHCONH2;
e [-] é uma ligação simples unindo o grupo carboxilo lateral com o grupo alfa-amino de A1 quando X é uma ligação simples;
A3 é Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) ou Trp substituído no anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, N02, NH2, OH, alquilo <^„3 e alcoxi Cl-3, sendo 0 halogéneo flúor, cloro e bromo;
A4 é Ala, MeAla, ou Gin;
A5 é Val ou MeVal;
A6 é Gly, Phe ou D-Ala;
A7 é His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) ou Pal;
A8 é um isóstero reduzido de Leu ou Phe;
A9 é Leu, Phe, Tpi, Trp ou Trp substituído no anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, N02, NH2, OH, alquilo C1-3 e alcoxi 01-3, sendo o halogéneo flúor, cloro e bromo;
desde que quando A9 é Leu ou Phe, A1 seja diferente de D-Nal ou DL-Phe e quando A1 é D-Nal ou DL-Phe, A9 seja diferente de Leu ou Phe; e dos seus sais com ácidos farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por se efectuar uma condensação de fragmentos, dos fragmentos de péptido correspondentes, ou se efectuar uma síntese passo a passo e, quando necessário, se acilarem os péptidos assim obtidos e/ou se converterem em sais de ácidos farmaceuticamente aceitáveis.
O presente invento refere-se ainda ao processo de preparação de composições farmacêuticas contendo os compostos preparados.
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-3MEMÓRIA DESCRITIVA
O presente invento foi feito com o apoio do Governo dos Estados Unidos da América através da bolsa Na. CA 40 077 concedida pelo N.C.I. (NIH). O Governo dos Estados Unidos da América tem certos direitos neste pedido.
Domínio do Invento
O presente invento tem por objecto a preparação de novos péptidos que influenciam o crescimento dos tumores cancerosos nos seres humanos. Mais especificamente, o presente invento refere-se à preparação de antagonistas da bombesina que são [t|t 8-9 pseudo]-nonapéptidos contendo um ácido D- ou L-triptofano ou análogo de triptofano 2,3,4,9-tetra-hidro-lH-pirido[3,4-b]indol-3-carboxílico (Tpi) no terminal N e/ou C, o qual possui propriedades antagonistas contra a bombesina ou péptidos do tipo bombesina, dos seus sais e de composições farmacêuticas e aos métodos de utilização destes péptidos.
Antecedentes do Invento
O invento refere-se à preparação de compostos polipeptídicos que possuem propriedades antagonistas contra a bombesina ou péptidos do tipo bombesina tais como o péptido libertador de gastrina (GPR), a Neuromedin C e análogos, em seguida denominadas propriedades antagonistas da bombesina, e que são valiosos, por exemplo no tratamento de doenças malignas em animais de sangue quente, como o Homem. 0 invento refere-se aos processos para o fabrico destes novos compostos polipeptídicos e de novas composições farmacêuticas contendo os referidos compostos polipeptídicos e a processos para o fabrico de medicamentos que os contêm destinados a serem utilizados na produção de um efeito antagonista da bombesina em animais de sangue quente como o Homem.
A bombesina é uma amida tetradecapeptídica que foi isolada primeiramente da pele da rã Bombina-bombina (Anastasi, Erspamer e Bucci, Experientia. 1971, 27, 166). Sabe-se que a bombesina é um potente mitogeno para as células de fibroblasto Suiço 3T3 no
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SHAL3.0-010CT/PT —4 — ratinho (Rozengurt e Sinnett-Smith, Proc. Natl. Acad. Sei. USA.
1983, 80., 2936) e que estimula a secreção de amilase nos ácinos pancreáticos da cobaia (Jensen, Jones, Folkers e Gardner, Nature.
1984, 309. 61). Também se sabe que os péptidos do tipo bombesina são produzidos e segregados pelas células do cancro pulmonar das células pequenas (SCLC) humano (Moody, Pert, Gazdar, Carney, e Minna, Science, 1981, 214. 1246), que os péptidos do tipo bombesina adicionados exogenamente podem estimular o cresimento das células (SCLC) humanas in vitro (Carney, Cuttita, Moody e Minna, Câncer Research. 1987, 47, 821) e que um anticorpo monoclonal específico para a região C-terminal de bombesina e GRP pode bloquear a ligação do GRP aos seus receptores e impedir o cresimento das células SCLC humanas tanto in vitro como in vivo (Cuttita, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler e Minna, Nature. 1985, 316. 823).
O GPR que tem propriedades do tipo bombesina é uma amida peptídica largamente distribuída que contém 27 aminoácidos, isolados do intestino do porco (MacDonald, Jornvall, Nilsson, Vagne, Ghatei, Bloom e Mutt, Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 1979, 90. 227) na qual a sequência de aminoácidos do terminal C é quase idêntica à da bombesina. A Neuromedin C é uma amina decapeptídica cuja estrutura é idêntica aos dez últimos aminoácidos na região do terminal C de GPR, que foi isolado do intestino delgado do cão (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke e Shively, J. Biol. Chem.. 1983, 258. 5582). 0 GPR estimula diversas respostas biológicas, incluindo a libertação de gastrina na circulação sistémica. Ele também funciona como um factor de cresimento dos fibroblastos 3T3 de ratinho e na célula do cancro pulmonar das células pequenas (SCLC). Assim considerou-se que o GPR desempenhava um papel patofisiológico directo no desenvolvimento da SCLC por meio de um mecanismo de crescimento autocrino.
As estruturas da bombesina, Neuromedin C e nonapéptido Carboxilo-terminal de GPR são as seguintes:
Bombesina pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val -Gly-His -Leu-Met-NH2
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Neuromedin C H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
Nonapéptido C-terminal de GPR -Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
A pesquisa de outros péptidos anfíbios do tipo bombesina levou ao isolamento do Litorin, um nonapéptido (pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2), na pele da rã da Papua, Nova Guiné, o qual provou ser a mais potente bombesina (Yasukara e outros, Chem. Pharm. Buli., 1979, 27., 492). Os estudos sobre análogos da bombesina demonstraram que um segmento mínimo dos 9 resíduos de aminoácido da posição 6-14 da bombesina tinha o espectro completo da actividade da bombesina.
São agora conhecidos diversos géneros de antagonistas de bombesina. A substância P (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) que tem ligeira homologia da sequência de aminoácidos com a bombesina não inibe a ligação da bombesina e de péptidos do tipo bombesina mas verificou-se que os análogos da substância P modificados pela substituição de vários L-aminoácidos por D-aminoácidos como (D-Arg1, D-Pro2, D-Trp7'9, Leu11) Substância P e (D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7'9, Leu11) Substância P, (Moody e outros, Fed. Proceedings, 1987, 46., 2201), bloqueiam a secrecção de bombesina nas células acinares pancreáticas e antagonizam os efeitos de promotores do crescimento da bombesina nas células suiças 3T3. Dois tipos de antagonistas da bombesina derivados da bombesina, por exemplo (D-Phe6, D-Phe12)bombesina e rLeu13-psi-Leu14lbombesina (Coy e outros, J. Biol. Chem., 1988, 263. 5056 e péptidos, 1989, 10, 587) demonstraram ser potentes inibidores, in vitro e in vivo, da resposta da bombesina.
Outro tipo de antagonista da bombesina revelado por Heimbrook e outros (J. Biol. Chem., 1989, 264 11258) é o N-acetil-GPR(20-26) e os seus análogos onde o resíduo metionina C-terminal é deleccionado dos análogos GPR(20-27). Recentemente, Coy (J. Biol. Chem.. 1989, 264. 14691) relatou que alguns antagonistas de bombesina de cadeia curta baseados na sequência do Litorin como a [D-Phe6, Leu^-psi-Phe1^ )bombesina-( 6-14) e [D-Phe6, Leu13-psi-Leu14)bombesina-(6-14) apresentavam muito
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-6maior potência do que o seu correspondente péptido progenitor [Leu13-psi-Leu14]bombesina.
Sumário do Invento presente invento tem por objecto o processo de preparação de novos polipéptidos que são potentes antagonistas da bombesina, de composições farmacêuticas incluindo os referidos polipéptidos e a sua utilização como agentes farmaceuticamente activos.
Mais particularmente o presente invento refere-se à preparação de pseudopéptidos compreendendo uma porção nonapéptido da fórmula I:
X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-PSÍ-Α9-Q onde
Q é NH2 ou OQ1 onde Q1 é hidrogénio, alquilo fenilo ou fenil-alquilo C7_10; X é hidrogénio ou uma ligação simples unindo a A2, o resíduo acilo de um ácido orgânico ou um grupo da fórmula R1CO- onde (1) R1 é hidrogénio, alquilo ci-io' fenilo ou fenil-alquilo c7-10' (2) R1CO— é
R3
onde
R2 é hidrogénio, alquilo fenil° ou fenil-alquilo C7_10, R3 é hidrogénio ou alquilo (b) R4—O—CO— onde R4 é alquilo C^_^q, fenilo ou fenil-alquilo C7_10;
A1 é D-, L- ou DL-pGlu, Nal, Phe, Thi, Tyr, Tpi, Hca, Hpp, Mpp, Trp ou Trp substituído no anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, N02, NH2, OH, alquilo C1-3 e alcoxi C1-3, onde o halogéneo é flúor, cloro e bromo,
A2 é Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) ou um grupo da fórmula Dpa (X), Asp (Y), Glu [-] e Glu (Y) onde
X é definido como anteriormente,
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-7Rc onde
R7
R5 é hidrogénio, alquilo C-£_3 ou fenilo?
R6 é hidrogénio ou alquilo C1_3;
R7 é hidrogénio, alquilo C·^ ou -NHCONH2;
e [-] é uma ligação simples unindo o grupo carboxilo lateral com o grupo alfa-amino de A1 quando X é uma ligação simples;
A8 é Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) ou Trp substituído no anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, N02, NH2, OH, alquilo 0^-3 e alcóxi cl-3z θηάθ o halogéneo é flúor, cloro e bromo;
A4 é Ala, MeAla, ou Gin;
A5 é Vai ou MeVal;
A6 é Gly, Phe ou D-Ala;
A7 é His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) ou Pal;
A8 é um isóstero reduzido de Leu ou Phe;
A9 é Leu, Phe, Tpi, Trp ou Trp substituído no anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, N02, NH2, OH, alquilo c1-3 e alcóxi C1-3, onde o halogéneo é flúor, cloro e bromo?
desde que quando A9 é Leu ou Phe, A1 seja diferente de D-Nal ou DL-Phe e quando A·1· é D-Nal ou DL-Phe, A9 seja diferente de Leu ou Phe; e dos seus sais com ácidos farmaceuticamente aceitáveis.
Descrição de Formas de Realização Preferidas Para facilitar a descrição deste invento utilizam-se as abreviaturas convencionais dos aminoácidos, péptidos e seus derivados tal como são geralmente aceites no domínio dos péptidos e como são recomendadas pela Comissão sobre a Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (European J. Biochem.. 1984, 138. 9-37).
As abreviaturas dos resíduos de aminoácido individuais baseiam-se no nome trivial do aminoácido, por exemplo, Trp é triptofano, Gin é glutamina, His é histidina, Ala é alanina, Vai é valina, Gly é glicina, Leu é leucina, Phe é fenilalanina. Quando o resíduo de aminoácido tem formas isómeras é a forma L-do aminoácido que está representada excepto quando indicada de outro
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-8modo por D- ou DL- antes do símbolo do aminoácido.
As abreviaturas de aminoácidos invulgares empregados no presente invento são as seguintes
Dpa para o ácido 2,3-diaminopropiónico Nal para a 3-(2-naftil)-alanina Thi para a jS-2'-tienilalanina
Tpi para o ácido 2,3,4,9-tetra-hidro-lH-pirido-[3,4-b]indolo-3-carboxílico.
As sequências peptídicas são escritas de harmonia com a convenção segundo a qual o aminoácido N-terminal fica à esquerda e o aminoácido C-terminal fica à direita.
Hca é o ácido hidrocinâmico
Hna é o ácido 3-hidroxi-2-naftóico
Hpp é o ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico
Mpp é o ácido 3-(4-metoxifenil)propiónico
Paa é o ácido fenilacético
Outras
AC
Ac
AcOH
BOC (BOC)2O
BHA
Bzl
BSA
DIC
DMEM
ET
EDTA
FCBS
FMOC
For
HITES μΐ/ml de abreviaturas utilizadas são: acilo acetilo ácido acético terc-butoxicarbonilo di-terc-butildicarbonato benz idrilamina benzilo albumina do soro bovino 1,3-diisopropilcarbodiimida meio Eagle modificado de Dulbeco etilo ácido etilenodiaminatetraacético soro do vitelo fetal 9-fluorenilmetiloxicarbonilo formilo
Meio RPMI 16 4D mais hidrocortisona 10-8 M, insulina bovina, 10 /zg/ml de transferrina humana,
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-9jS-estradiol
HOBt
HPLC
Me
MeCN
MeOH
TEA
PBS
PGlU psi
10θ M e Na2SeO3 3 x 10“8 M 1-hidroxibenzotriazolo cromatográfia líquida de elevado rendimento metilo acetonitrilo álcool metílico trietilamina solução salina tamponada com fosfato ácido piroglutâmico uma ligação pseudopeptídica de estrutura CH2-NH excepto quando o resíduo seguinte tem um N-terminal secundário, caso em que o significado é ch2n
TFA ácido trifluoracético
Z benziloxicarbonilo
Os polipéptidos particularmente preferidos preparados pelo presente invento são:
Polipép- Estrutura tido N2.
1. NH2-CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
2. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
3. D-Trp-Glu(MeNH) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NHn
4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
6. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-G1v-His-Leu-psi-Leu-NH2
7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NHg
8. D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NHg
9. NH^CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NHo
10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH2
11. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NH2
12. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2
13. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2
14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
15. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
16. Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NHn
17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
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Jlfr
-1018. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2
19. D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHn
20. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
21. D-Trp-Glu-(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHg
24. NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Tpi-NH2
25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHn
26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHn
27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Glv-His-Leu-psi-Trp-NHo
28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NHg
29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NH2
30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NHg
31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
3. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)~NH2
34. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
35. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Tpi-OMe
36. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
37. NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
38. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHMe
39. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OH
40. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-N2H2CONH2
Os polipéptidos especialmente preferidos preparados pelo presente invento incluem os péptidos nas. 5, 7, 12, 17, 18, 22, 26 e 38
Síntese de Polipéptidos
Os polipéptidos segundo o presente invento podem ser preparados por quaisquer das técnicas que são conhecidas pelos especialistas no domínio dos péptidos. Um sumário das técnicas assim disponíveis pode ser encontrado em Principies of Peptide Synthesis de M. Bodansky, SpringerVerlag, Heidelberg, 1984.
As técnicas de síntese exclusivamente em fase sólida estão expostas no livro de J. M. Stewart e J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2a
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-11edição) e na revista de G. Barany e outros, Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739, 1987.
Um método particularmente preferido de preparação dos polipéptidos e dos seus péptidos intermediários segundo este invento é a síntese em fase sólida. 0 suporte empregado na síntese em fase sólida dos polipéptidos segundo este invento é a resina de benzidrilamina (BHA) ou a resina de poliestireno clorometilado reticulada a 1% com divinilbenzeno, produtos estes disponíveis no comércio. 0 grupo protector escolhido para o grupo α-amino foi o grupo terc-butoxicarbonilo (Boc-) que é removido em cada passo da síntese. 0 material de partida contendo o aminoácido protegido é feito a partir de um Boc aminoácido acoplado à resina BHA ou ligado à resina de poliestireno clorometilado com KF. A síntese começou no C-terminal do polipéptido e foi executada utilizando um aparelho manual, repetida por um processo passo a passo de desprotecção do grupo alfa-amino e acoplamento ao aminoácido seguinte .
Purificação dos Polipéptidos
Os polipéptidos foram geralmente purificados por cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC) numa coluna de fase invertida, realizada num Sistema de HPLC Rainin (Rainin Inc., Co., Woburn, MA) constituído por três bombas de HPLC Rainin Rabbit HP controladas por um computador Apple Macintosh Plus, um Injector Rheodyne e um monitor de UV com comprimento de onda variável Knauer Modelo 87. Os péptidos brutos (10-40 mg) foram carregados numa coluna Dynamax Macro (21,2 x 250 mm) enchida com gel de sílica esférico C18 (tamanho de poro: 300A; tamanho de partícula: 12 /ím) (Rainin Inc. Co.) e eluídos com gradiente linear, utilizando um sistema solvente constituído por (A) TFA a 0,1% e (B) TFA a 0,1% em acetonitrilo aquoso a 70%, a um caudal de 2,0 ml/min. Todas as fracções foram avaliadas quanto à pureza e tempo de retenção por uma HPLC analítica descrita a seguir.
A qualidade e as características de eluição do péptido bruto e purificado foram determinadas por meio de HPLC analítica num cromatógrafo em fase líquida Hewlett-Packard Modelo 1090 equipado
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-12com um jogo detector com formatura de diodos a 220 e 280 nm e uma coluna de fase invertida de 4,6 x 250 nm W-porex C18 (tamanho de poro; 300A; tamanho de partícula; 5 gm). Um caudal de 1,2 ml/min do sistema solvente (A) e (B) acima descrito foi mantido e as separações foram realizadas à temperatura ambiente.
Em muitos casos, os polipéptidos foram ainda purificados por re-cromatografia na mesma coluna com ligeira modificação das condições do gradiente. A homogenidade dos péptidos purificados demonstrou ter uma pureza superior a 97% por HPLC analítica.
Análises de Aminoácidos
As análises de aminoácidos de polipéptidos no presente invento foram realizadas num analisador de aminoácidos Beckman 6300 em amostras que foram hidrolisadas a 110 °c durante 20 h, em tubos com vácuo, selados, com ácido metanossulfónico 4 M contendo 0,2% de 3-(2-amino-etil)-indolo. As proporções de aminoácido foram as que se esperavam. Os resíduos de Leu-psi-Leu e Leu-psi-Phe apresentam picos de absorção com tempos de retenção de 39,93 e 44,56 min respectivamente. Não se encontrou Tpi depois de 50 min de digestão em procedimentos de análise.
Procedimentos de Ensaio (A) Ensaio de União do Receptor
A união de 125I-GRP (14-27) e o deslocamento por meio de antagonistas de bombesina foram realizados em placas de cultura de tecidos de 24 cavidades (GIBCO) utilizando células suiças 3T3. Fibroblastos murinos suiços 3T3 foram mantidos por meio de passagem semanal em DMEM contendo 10% de FCBS e antimicóticos. As culturas foram incubadas em 5% de C02 em ar, a 37°C. As cavidades foram semeadas com 105 células/cavidade (viabilidade > 95%) cultivadas até à confluência e quiescência. O procedimento de união foi realizado 7 dias após a sementeira. As células foram lavadas 2 vezes com 0,5 ml de tampão de união (Meio de Eagle modificado de Dulbecco contendo HEPES-NaOH 20 nM (pH 7,4), 0,2% de BSA e 100 mcg/ml de bacitracina). As células foram depois incubadas com 125I-GRP(14-27) 0,2nM na presença ou ausência de diferentes concentrações de antagonistas (6xlO-11-6xlO~6M,
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-13volume total 0,4 ml).
Segundo Zachary & Rozengurt (Pres. Natl. Acad. Sei.. USA, 1985, 85, 3636-3670) e Layton e outros (Câncer Res.. 1988, 43, 4783-4789) a união de 125I-GRP a 37°C atingia um valor máximo aos 30 min diminuindo depois; assim, as células foram incubadas a 37°C durante 30 min. Após isto, as células foram lavadas 2 vezes com tampão de união frígido (4°C) e 2 vezes com solução salina tamponada com fosfato, frígida, (PBS, mM): NaCl 138, KC1 2,8, Na2HP04 8, KH2PO4 1,45, CaCl2 0,91, MgCl2 0,49. Culturas lavadas foram extractadas em 0,5 ml de NaOH 0,5 M e transferidas para tubos para contagem. As cavidades foram lavadas uma vez com 0,5 ml de água destilada (estéril) e as lavagens foram adicionadas aos tubos apropriados. Depois foi contada a radio-actividade das amostras num contador gama automático (Micromedic System, Inc., Huntsville, Ala.).
Usou-se o programa de ajuste da curva do Ligando computadorizado em PC de Munson e Rodbard (Anal. Biochem., 1987, 107, 220-239) para determinar os tipos de união de receptor, constante de dissociação (Kd), constante de associação (Ka), a capacidade máxima de união de receptores (Bmax) e inibição semi-máxima (IC50).
Os valores IC50 representam concentrações de antagonistas que provocam inibição semi-máxima do crescimento estimulado por GRP (14-27) 0,2 nM. A constante de dissociação e a capacidade de união máxima de ^2^I-GRP (14-27) nas nossas experiências foram de 1,32 nm e 0,769 pm/mg de proteína respectivamente, que eram semelhantes às relatadas para ^2^i-GRP e, l^i-Tyr^-bombesina. As características de união de receptores de GRP em células 3T3, nestas experiências, concordam bem com os valores obtidos para união de bombesina às células acinares pancreáticas (Jensen e outros, (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1978, 75, 6139-6143)) e células pituitárias (Westendqrf e Schonbrunn, (J. Biol. Chem. 1983, 258, 7527-7535)).
GRP (14-27) inibe a união de
125
I-GRP (14-27) com IC50 a γ
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-142,32, ο que concorda com os dados de Layton e outros (1988) 2,2 nM. Os dados sobre união de polipéptidos no presente invento estão expostos na seguinte Tabela 1.
DADOS DE UNIÃO EM 3T3 SUÍÇAS
Código Κ-^ηΜ1) Kd(nM) IC50(nM)
7. N.D. - -
5. 0,129 8 9,2
12. 0,014 71 81,65
26. 0,045 22 25,3
17. 0,955 1 1,2
2. 0,095 10,6 12,19
34. 0,0006 1667 1917,05
11. 0,217 5 5,75
27. 0,013 74,5 85,66
29. 0,0019 526,3 604,9
30. 0,254 4 5,15
28. 0,125 8 9,16
33. 0,002 556 639,4
18. 0,257 4 4,6
10. 1 1 1,15
22. 1,012 0,9 1,14
8. 0,014 71 82,14
GRP(14 -27) 0,758±0,23 l,32±0,43 l,52±0,7
Bmax = 7,12 x 10-12, isto é 0,354 x N.D. = SEM DESLOCAMENTO 10-12 M/mg de proteína
IC50 é a concentração de ligando não marcado que deslocava metade
da união específica de radioligando. É calculada segundo a equação de Cheng e Prusoff (Biochem-Pharmacol., 1973, 22, 3099):
ΙΟ^θ = Kc (1+L/Kh) onde Kc e Kh são as constantes de dissociação de ligando não marcado (frio) e marcado (quente) respectivamente e L é a concentração de radioligando utilizada.
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-15(B) Libertação de Amilase
Os ácinos pancreáticos isolados foram preparados por digestão com colagenase do pâncreas obtido de ratazanas macho Wistar (150-180 g) que jejuaram durante a noite. Os animais foram mortos por deslocação cervical sendo o pâncreas retirado e depois digerido por meio de colagenase altamente purificada (CLSPA, 540 U/mg, Cooper Biomedical, Freehold, N.J. EUA) segundo o método de Amsterdam, Solomon e Jamieson (1978).
Ácinos dispersos foram suspensos num meio de incubação contendo HEPES 24,5 mM, NaCl 98 mM, KC1 4,0 mM, KH2PO4 11,7 mM, MgCl2 1,0 mM, CaCl2 0,3 mM, glucose 5,0 mM, 1% (p/v) de mistura de aminoácidos essenciais e não essenciais (Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Alemanha), glutamina 2 mM, 0,2% de BSA e 0,01% (p/v) de inibidor de tripsina. A solução de incubação foi saturada com oxigénio e mantida a 37 °C num banho com agitação (60 oscilações/min). A suspensão acinar foi incubada na presença de várias concentrações de GRP ou antagonistas de GRP.
Depois da incubação os tubos foram centrifugados a 1 000 g durante 5 min e o líquido sobrenadante foi separado do sedimento. 0 teor de amilase no líquido sobrenadante e no sedimento dissolvido foi determinado separadamente conforme Bernfeld (1955) descreveu. A secreção de amilase foi dada com o incremento percentual em relação ao valor basal. As incubações foram duplicadas. A libertação de amilase não estimulada durante todo o tempo da experiência foi determinada como valor basal.
Quando adicionada ao meio de incubação em concentrações gradualmente crescentes deu lugar a uma inibição dependente da concentração da libertação de amilase estimulada por uma concentração submáxima de GRP (10-9M).
(C) Inibição da incorporação de 3H-Timidina por células 3T3
Foram utilizadas células SCLC 2 a 4 dias após passagem. Preparam-se suspensões de célula única lavando as células (2 vezes com PBS e depois pipetando-as em PBS contendo 0,2 g/litro de glucose, 0,2 g/litro de EDTA e hidrocloreto de lidocaína 14 mM a
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-16- ***1 <
37°C) até a suspensão se tornar uniforme (2-4 min). As células foram lavadas três vezes e novamente suspensas em HITES sem PCSB. As culturas foram estabelecidas à razão de 1,34 x 105 células em placa no dia 0 e todos os péptidos foram adicionados ao mesmo tempo em 1 ml de meio RPMI-1640 mais HITES e 0,125% de albumina. 48 horas depois adicionou-se 1 μα de timidina tritiada a cada cavidade e continuou-se a incubação durante mais 24 horas. As células foram então lavadas, depositadas em papel de filtro de vidro e lavadas com ácido tricloro-acético a 5% frígido. 0 papel de filtro foi colocado em frascos contendo fluido de cintilação e procedeu-se à contagem durante 1 minuto.
TABELA II
ENSAIO DE ANÁLOGOS ANTAGONISTAS DE PÉPTIDO LIBERTADOR DE GASTRINA (GRP) EM CÉLULAS 3T3
INIBIÇÃO DE INCORPORAÇÃO DE 3H-TIMIDINA % de inibi-
Análogo de ção contra
péptido ng/ml GRP 3ng/ml DPM1S.E. GRP+
Número 20700014200 348000115300 (**)
26 50 + 23300018800 82
500 + 205000112500 >100 (-1*
100 Λ + 22200013900 89
17 U 50 + 27700019800 50
500 + 20700013800 100
100 0 50 + 22300011200 89
5 + 28300015400 46
500 + 280000121900 48
100 + 19900017100 >100 (-4*)
10 U 50 + 261000119500 62
500 + 24200018300 75
100 0 50 + 255000126200 66
22 + 269000114000 56
500 + 280000114000 48
100 + 198000118800 >100 (-4*
0 **
** P<0,01; (-*) Inibição abaixo do nível não estimulado basal
+ 348 000-207 000 = 141 000 foi tomado como a estimulação (D) Inibição do crescimento de vários carcinomas pulmonares das células pequenas
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-17Células S.C.L.C. H-69 e H-345 de uma cultura em caldo (stock) obtidas do National Câncer Institute (N.C.I.) são mantidas em cultura de suspensão. A inibição da síntese de ADN induzida por GRP pelos antagonistas de bombesina é efectuada por medição da incorporação de (3H)timidina. A inibição da síntese de ADN induzida por GRP pelos antagonistas de bombesina mostrou ser significativa e dependente da concentração.
(E) Efeito sobre a secreção pancreática in vivo
Estudos de secreção foram executados em 6 gatos (2-3 kg) conscientes, preparados com fístulas gástricas e pancreáticas crónicas conforme já descritas (Konturek e outros, (J.Physiology. London, 1976, 257. 663-672)). Resumindo, a cânula utilizada na fístula gástrica era do tipo descrito por Emas (Gastroenterolocrv. 1960, 39., 886-782). Esta cânula foi inserida na zona da glândula pilórica próxima da curvatura maior. A fístula pancreática foi feita utilizando uma cânula metálica especial em T com os ramos laterais e principal por nós adaptados para gatos. 0 dueto comum da bílis foi cortado exactamente antes da união com o dueto pancreático e transplantado para o duodeno superior para se separar a corrente de bílis do suco pancreático. Foi preparada uma pequena bolsa duodenal contendo a entrada do dueto pancreático principal e o ramo lateral da cânula pancreática foi metido dentro desta bolsa. O ramo principal da cânula foi colocado no duodeno distai, cerca de 3 cm para além da duodenostomia do duodeno.
Os estudos das secreções começaram cerca de 3 meses depois da intervenção cirúrgica. Retirou-se a comida das gaiolas pelo menos 18 horas antes de cada ensaio. Durante cada ensaio (excepto aquando da alimentação) a fístula gástrica foi deixada aberta para permitir a drenagem do suco gástrico para o exterior.
A secreção proveniente da fístula pancreática foi recolhida continuamente e dividida em amostras de 15 min. Registou-se o volume, e as concentrações e débitos de proteína e bicarbonato foram determinados como anteriormente se descreveu (Konturek e outros, 1976).
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Foram executadas diversas séries de ensaios em cada animal para comparação das potências das secreções. O GRP foi infundido i.v. em doses graduadas (1250 pmol/kg-h de GRP) em ensaio de 1 dia, com ou sem adição de péptido 5. Em ensaios com alimentação a fístula gástrica foi mantida fechada e a cada gato davam-se 50 g de carne de vaca picada cozida e homogeneizada que habitualmente era completamente consumida. A infusão intravenosa de solução salina (cerca de 10 ml/h) foi mantida durante o período após prandial e quando a resposta da secreção pancreática atingiu um nível bem sustido, administrou-se o péptido 5 e a secreção foi examinada durante mais um período de 2 h. Em ensaios independentes em gatos em jejum (sem infusão de péptido nem alimentação com carne) foi medida a secreção pancreática basal (com a fístula gástrica aberta) durante um período de 2 h e depois o péptido 5 (10 nmole/kg-h) foi adicionado à infusão numa dose que abolia completamente a secreção pancreática induzida por GRP. Os resultados são expostos no seguimento.
Os péptidos (5), (10) e (2) análogos de bombesina foram ensaiados in vivo na inibição de gastrina de soro após estimulação com GRP. Oito minutos depois da estimulação com GRP (3 /xg/lOO g BW) os níveis de gastrina de soro aumentavam de 16,7 pg/ml (controlo) para 105 pg/ml. Ratazanas infectadas, dez minutos antes da estimulação com GRP, com um bólus de antagonistas de péptidos (5), (10) e (2) (30 /xg/lOO g B) apresentavam uma diminuição do nível de secreção de gastrina (após 8 minutos): 36,8 pg/ml para o péptido (2) 24,2 pg/ml para o péptido (10) e 39,2 pg/ml para o péptido (5)).
Os antagonistas de bombesina/GRP segundo o presente invento são úteis no tratamento de estados de hipergastrinemia, por exemplo, anemia perniciosa, gastrite atrófica crónica, síndroma de Zollinger-Ellison e vitiligo, associados com a hiperplasia difusa de células gástricas do tipo enterocromafina e com um risco ampliado de cresimento de tumores carcinoides gástricos multifocais. Além disso, a hiperplasia de células do tipo entero-cromafina ocorre facilmente nos animais que se tornam hipergastrinémicos.
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-19Este tratamento tem vantagens em relação às drogas actuais, visto os antagonistas de H2 como a cimetidina provocarem a hipergastrinemia e poderem levar ao aparecimento de tumores carcinoides nos seres humanos. Além disso, a cessação da terapia com antagonistas de H2 provoca uma recorrência imediata de úlceras por causa da existência da hipergastrinemia.
Como os compostos preparados segundo o presente invento são antagonistas de receptores de bombesina/GRP podem ser utilizados no tratamento do cancro pulmonar, cancro do cólon e cancro gástrico.
Com base nestes resultados acima expostos e dados obtidos em ratazanas, os péptidos segundo o invento podem ser administrados na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis e não tóxicos como os sais de adição de ácido, sendo exemplo destes sais de adição de ácido o hidrocloreto, o hidrobrometo, o sulfato, o fosfato, o fumarato, o gluconato, o tanato, o maleato, o acetato, o citrato, o benzoato, o succinato, o alginato, o pamoato, o malato, o ascorbato, o tartarato e análogos.
As microcápsulas ou micropartículas destes péptidos formulados com poli(DL-lactido-coglicolido) podem ser os sistemas preferidos de distribuição sustida. Também pode ser usada a administração intravenosa, intramuscular ou subcutânea em soro isotónica, soluções tamponadas com fosfato ou análogos. Aerossois para distribuição pulmonar também podem ser utilizados.
Estas composições farmacêuticas conterão o péptido em conjunto com um portador convencional farmaceuticamente aceitável. A dosagem será da ordem de cerca de 1 a 1 000 microgramas do péptido por quilograma de peso corporal do hospedeiro quando administrado parentericamente. 0 tratamento de pacientes com estes péptidos pode ser executado da mesma maneira que o tratamento clínico utilizando outros agonistas e antagonistas de LHRH, análogos de somatostatina ou outros péptidos.
Estes péptidos podem ser administrados aos mamíferos por via
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lk
-20intravenosa, subcutânea, intramuscular, intranasal ou por meio de aerossol pulmonar para conseguir o efeito gástrico inibitório ou antitumor. As dosagens eficazes variarão com a forma de administração e a espécie particular do mamífero a ser tratada. Um exemplo de uma forma de dosagem típica é uma solução salina fisiológica contendo o péptido, solução esta que é administrada de forma a dar uma dose da ordem de cerca de 0,01 a 0,20 mg/kg de peso corporal. As formulações de distribuição sustida podem ter que ser dadas apenas uma vez por mês e a duração do tratamento pode ser de vários meses.
Embora o invento tenha sido descrito em relação às suas formas preferidas de realização, deve-se compreender que podem ser feitas alterações e modificações óbvias para um perito ordinário na arte sem se exorbitar o quadro do invento que é o exposto nas reivindicações anexas. Substituições conhecidas nesta arte que não afectem significativamente a sua eficácia podem ser empregadas no invento.
OPERAÇÕES GERAIS PARA A SÍNTESE DO POLIPÉPTIDO COMEÇANDO
COM UMA UNIDADE BOC-AMINOÁCIDO-RESINA
Operação I:
(1) lavagem com CH2C12 (3x1 min);
(2) desprotecção com TFA a 50% em CH2C12 em duas vezes durante 5 min e 25 min respectivamente. Para péptidos-resinas contendo D- ou L-Trp ou Tpi, desprotecção com TFA a 50% em CH2C12 contendo 5% de mercaptoetanol e 5% de anisolo;
(3) lavagem com CH2C12 (6x1 min);
(4) neutralização com trietilamina a 10% em CH2C12 (2x3 min);
(5) lavagem com CH2C12 (6x1 min);
(6) acoplamento: i) adição de BOC-aminoácido (3 equiv.) e HOBt (3,3 equiv.) em DMF (3 min) ii) adição de diisopropilcarbodiimida a 20% (3 equiv.) em CH2C12 e agitação durante 60-90 min (7) lavagem com CH2C12 (2x1 min), etanol (2x1 min) e CH2C12 (5x1 min).
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Operação II
Para introdução da ligação de péptido reduzido: -CH2NH-, o passo (6) da operação I foi modificado como segue:
(1) lavagem com DMF (2x1 min) (2) adição de aldeído de Boc leucina (3 equiv.) em DMF contendo 1% de AcOH;
(3) adição de NaBH3CN (3,5 equiv.) em DMF e agitação durante 60 min;
(4) lavagem com MeOH a 50% (3x1 min)
MeOH a 100% (3x1 min)
CH2CI2 (3x1 min)
Operação III
Para o acoplamento de Boc-Asn, Boc-Gln e Boc-Gly, o passo (6) da operação I é modificado como segue:
diisopropilcarbodiimida a 20% (3 equiv.) em CH2CI2 foi adicionada a uma mistura de solução em DMF de Boc aminoácido (3,0 equiv.) e HOBt (3,3 equiv.) a 0°C durante 15 min e à temperatura ambiente 15 min, os insolúveis foram retirados por filtração, o filtrado foi adicionado ao péptido-resina e agitado com Boc-Gln ou Boc-Asn durante 2-4 horas ou com Boc-Gly durante 1 hora.
Operação IV
Os seguintes procedimentos foram realizados para a introdução de Fmoc aminoácido:
(1) após desprotecção e neutralização, lavagem com CH2C12 (3x1 min) e DMF (3x1 min) (2) acoplamento i) adição de Fmoc aminoácido (3 equiv.) e HOBt (3,3 equiv.) em DMF (3 min) ii) adição de diisopropilcarbodiimida a 20% (3 equiv.) em CH2C12 e agitação durante 60 min (3) lavagem com etanol (3x1 min)
DMF (3x1 min) (4) desprotecção do grupo Fmoc com piperidina a 50% em DMF durante 30 min (5) lavagem com DMF (6x1 min) (6) outro acoplamento como o descrito no passo (2)
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-22Depois de preparados os desejados péptidos intermediários da fórmula I, o péptido-resina foi tratado com HF líquido na presença de anisolo para dar o polipéptido na forma livre na qual X da fórmula I era hidrogénio e Y da fórmula I era -NH2 ou OH; ou na forma protegida na qual A2 da fórmula I é Glu (OMe) ou His(Bz).
A conversão de um grupo funcional no N,C-terminal ou grupo de cadeia lateral de polipéptido, da forma livre ou protegida, noutro N ou C-terminal ou grupo funcional lateral de polipéptido, foi executada com um reagente apropriado em solução. Por exemplo, fez-se reagir um polipéptido protector contendo Glu na posição A2 com metilamina na forma de DIC para se obter um polipéptido contendo Glu(MeNH) na posição A2. Fez-se reagir um polipéptido de N-terminal livre com KOCN para se obter um polipéptido contendo NH2CO- na posição X.
Nos exemplos seguintes é utilizado a seguinte codificação numérica para identificar intermediários. O código a/b/Res indica a resina inicial usada no Exemplo a” passo b”. 0 código a/b/c é um precursor do péptido c feito no passo ”b” do Exemplo ”a. a, b1’ e c são todos números inteiros.
Exemplo (1) (1) A: Exemplo de L-e D-Tpi
2,04 g (10 mM) de L-Trp foram dissolvidos em 25 ml de água fervente contendo 2,1 g de ácido cítrico. Juntaram-se 0,5 ml de formaldeído a 40% e os sólidos começaram a formar-se imediatamente. A mistura foi arrefecida um banho de gelo e os sólidos foram recolhidos e lavados com água fria e secos com ar à temperatura ambiente para dar 2,14 g ou 99% de sólidos com p.f. de cerca de 310°C (decomposição). 0 isómero D é formado da mesma maneira e também tem p.f. de cerca de 310°C (decomposição).
B: Exemplo de L- e D-Boc-Tpi
A uma suspensão agitada de 10,8 g (50 mM) de D-Tpi em 250 ml de NaOH 0,2 N e 7,5 ml de trietilamina adicionaram-se 10 g de dicarbonato de di-terc-butilo, agitou-se a mistura durante 4 h,
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j untaram-se outros 10 g de dicarbonato e depois de outras 3 h de agitação mais 10 g. A mistura foi agitada de um dia para o outro e extractada (2x100 ml) com éter que foi eliminado. Adicionou-se ácido cítrico à camada aquosa até à acidez (pH 3-5). Os sólidos foram recolhidos, lavados com água e secos ao ar de um dia para o outro.
Os sólidos foram suspensos em 100 ml de tetra-hidrofurano. Dissolveram-se quase todos os sólidos. Os insolúveis foram eliminados por filtração e o THF foi eliminado por vácuo. O resíduo foi triturado com éter para dar 9,20 g ou 58%. Este material tinha o mesmo ponto de fusão que o material de partida mas diferia em solubilidade e TLC sobre sílica empregando-se CHCl3:MeOH:HOAc 85:15:0,5.
2,55 g de L-Tpi dão 2,22 g ou 59% de Boc-Tpi utilizando o mesmo método.
(2) Exemplo de Boc-Leu-CHO éster metílico de Boc-Leucina (35 g, 134 mmoles) em tolueno seco (250 ml) sob N2 foi arrefecido com gelo seco/acetona e (150 ml) de hidreto de diisobutil-alumínio a 25% em tolueno foram adicionados durante 30 min. A mistura foi agitada durante 20 min num banho de gelo seco/acetona depois da adição do hidreto de diisobutil-alumínio e então juntou-se cuidadosamente metanol (15 ml). A mistura foi lançada em 1 000 ml de água gelada, agitada e filtrada. 0 tolueno separou-se e a fase aquosa foi novamente extractada com éter (3x300 ml). Os extractos de tolueno e éter foram combinados e secos (Na2SO4). 0 óleo resultante foi rapidamente passado por uma coluna de gel de sílica (3x50 cm) em 1 500 ml de EtOAc a 15% em éter de petróleo. Obteve-se o aldeído de Boc-Leu sob a forma de óleo (27,6 g).
Exemplo (2)
Péptido Ns.
1. NHo-CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NHn
2.
3.
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NHo
D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
331
SHAL3.0-010CT/PT —24—
áã» íf
4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
6. D—Tpi—Glu( OMe) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
8. D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Esi-Leu-NH2
Neste exemplo, os polipéptidos contendo o mesmo fragmento Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NHg mas dois resíduos diferentes no N-terminal foram construídos passo a passo sobre resina de benzidrilamina (BHA) de harmonia com os métodos normais da síntese em fase sólida.
Trataram-se 0,50 g de resina de BHA (0,9 mmole de NH2/g) com TEA a 10% em CH2C12 (neutralização) por duas vezes de três minutos cada e lavaram-se 6 vezes com CH2C12. A resina foi misturada com 1,35 mmole de Boc-Leu e 1,50 mmole de 1-hidroxibenzotriazolo (HOBt) em DMF durante três minutos. Juntou-se 1,3 diisopropilcarbodiimida (DIC) a 20%, com 1,3 mmole, em αΗ2Ο12. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 60 min. 0 resultante Boc-Leu-resina de BHA foi lavado com CH2C12 e metanol, duas vezes cada, e três vezes com CH2C12, sendo depois submetido ao ensaio de Kaiser (Anal. Biochem. 34., 595, 1970). No caso de ocorrer um acoplamento incompleto repete-se o procedimento de acoplamento.
A remoção do grupo Boc (desprotecção) de Boc-Leu-resina de BHA foi realizada numa solução de TFA a 50% em DCM durante 5 min que é filtrada, tratada de novo durante 25 min e depois lavada seis vezes com DCM.
A neutralização é executada como acima se descreveu para resina de BHA.
acoplamento de Boc-Leu-CHO é executado pela operação seguinte (II):
(1) lavagem com DMF por 2 vezes;
(2) adição de 1,5 mmoles de Boc-Leu-CHO em DMF contendo 1% de AcOH;
(3) adição de 2,0 mmoles de NaBH3CN em DMF e agitação du73 331
SHAL3.0-010CT/PT
-25rante 60 min.
(4) lavagem com metanol a 50% em H2O por 2 vezes, MeOH a 100% por 2 vezes e CH2C12 por 3 vezes.
Depois de remoção do grupo Boc de Boc-Leu-psi-Leu-resina de BHA e neutralização, o acoplamento de Boc-His(Z) foi realizada como se descreveu na operação (I).
acoplamento de Boc-Gly é realizado como na operação (III).
Adicionou-se 1,3-diisopropilcarbodiimida (1,5 mmole) a 20% em CH2C12, a uma solução em DMF de 1,5 mmole de Boc-Gly e 1,65 mmole de HOBt a 0°C, agitou-se sob refrigeração durante 15 min e à temperatura ambiente durante 15 min; o precipitado separou-se por filtração e adicionou-se à resina, agitando-se durante 60 min.
Os subsequentes resíduos de aminoácido Boc-Val, Boc-Ala e Boc-Trp foram depois introduzidos em sequência por acoplamento da mesma maneira que foi descrita na operação (I) para dar 0,90 g de péptido-resina protegido com uma estrutura Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA (2/1/Res).
Depois da incorporação de Boc-Trp a desprotecção do grupo Boc é realizada com TFA a 50% em DCM contendo 5% de mercapto-etanol e 5% de anisolo para dar a TFA Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA (2/2/Res).
0,91 g de TFA-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA (2/2/Res) foram divididos em oito porções (cerca de 100 mg cada) que foram usadas para fazer a síntese dos pretendidos polipéptidos-resinas protegidos de harmonia com os procedimentos descritos na Operação I para o acoplamento de Boc-D-Trp, Boc-5F-D-Trp, Βοσ-D-Tpi e Boc-His(Z) e com a Operação III para Boc-Gln.
A adição em sequência de Boc-Gln e Boc-Trp ao heptapéptido-resina (2/2/res) dá:
Λ
331
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-26$ia.
tíf 2/2/01 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA.
O acoplamento em sequência de Boc-Gln e Boc-D-Trp ao heptapéptido-resina (2/2/res) dá:
2/2/0 2 Boc-D-Trp-Gln-trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-res ina de BHA.
O acoplamento de Boc-Gln e Boc-5F-D-Trp ao heptapéptido-resina (2/2/res) leva a:
2/2/04 Boc-5FD-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA.
J
2/2/05 Boc-D-Tpi-Gln-trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA é obtido por acoplamento sucessivo de Boc-Gln e Boc-D-Tpi.
2/2/06 Boc-D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leuresina de BHA é obtido por acoplamento sucessivo de Boc-Glu(OMe) e Boc-D-Tpi.
2/2/07 Boc-D-Tpi-His(Z)-trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA é obtido por acoplamento sucessivo de Boc-His(Z) e Boc-D-Tpi.
2/2/08 Boc-D-Tpi-His(Bz)-trp-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA é obtido por acoplamento sucessivo de Boc-His(Bz) e Boc-D-Tpi.
Depois da remoção do grupo Boc com TFA a 50% em DCM contendo 5% de mercapto-etanol e 5% de anisolo, o polipéptido-resina desprotegido de Boc é lavado com DCM, metanol e DCM, por três vezes cada, e tratado com HF recém destilado (5 ml) e anisolo (0,25 ml) a 0°C durante 1 h. 0 solvente é evaporado sob vácuo e lavado com éter ou acetato de etilo, sendo depois extractado com ácido acético a 70-80% e liofilizado para dar em bruto:
2/3/01 Trp-Gln-trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
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Péptido n2. ‘ G‘
2. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
4. 5F-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
5. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
6. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Leu-NHn
7. D-Tpi-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Leu-NH2
8. D-Tpi-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
Uma mistura de 40 mg de Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 (2/3/1) e 20 μΐ de TEA em 0,5 ml de DMF e 20 mg de KOCN em 100 μΐ de H2O foi agitada a 0°C adicionando-se depois à mistura, gota a gota, 100 μΐ de AcOH e agitou-se a 0°C durante 1 h. A mistura de reacção foi submetida a purificação para dar:
Péptido n2.
1. NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 péptido (3) foi preparado por acoplamento sucessivo Fmoc-Glu(OBut) e Fmoc-D-Trp, pelo método indicado na Operação (IV) a Trp-Ala-Val-His(Z)-Leu-psi-Leu-resina de BHA (2/2/Res) para dar a Fmoc-D-trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ÊSÍ-Leu-resina de BHA (2/4/3). 0 péptido-resina foi tratado com TFA a 10% em DCM contendo 5% de 2-mercaptoetanol durante 30 min para retirar o grupo But do grupo carboxilo de Glu. Depois de seis lavagens com DCM, borbulKou-se MeNH2 através de um leito de Fmoc-D-Trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi.-Leu-resina de BHA (2/5/ /Res) em 5 ml de DMF a 0°C durante 5 min, adicionaram-se 0,25 ml de DIC a 20% em DCM e deixou-se reagir a 0°C durante 2 h. A resina foi depois lavada com DCM e o grupo Fmoc retirado com piperidina.
Péptido (3) D-Trp-Glu(MeNH)Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 (RC-3490) foi obtido depois de tratamento com HF.
A purificação foi feita por meio de HPLC com um sistema solvente constituído por (A) TFA a 0,1% e (B) TFA a 1% em 70% de acetonitrilo. Os péptidos purificados provaram ser 97% puros em HPLC analítica. Os tempos de retenção dos polipéptidos deste exemplo estão expostos na Tabela seguinte.
331
SHAL3.0-010CT/PT -28- Dados de HPLC Analítica
Péptido na. Gradiente Tempo de retenção
% B/min na coluna
2. 25-65% B/40 11,84
4. 25-65% /40 14,85
5. 25-65% /40 14,32
6. 25-65% /40 19,21
7. 30-70% /40 9,11
Os resultados das análises de aminoácido para os polipéptidos deste exemplo foram os esperados. Por exemplo, as proporções de aminoácido do péptido (2) com a estrutura D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2 foi 1,11:2,09:0,90:1,03:0,95:0,92 (Gln:Trp:Ala:Val:Gly:His). 0 resíduo de Leu-psi-Leu apresentava um pico de absorção com tempo de retenção de 39,95 min. Não se detectou Tpi nos péptidos (5), (6), (7) e (8).
Exemplo (3)
Péptido
9.
10.
11.
12.
13.
Os
NO.
NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Esi-Phe-NH2 D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Esi-Phe-NH2 D-Trp-Glu (MeNH) -Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NHg D-Tpi-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 D-Tpi-Glu(OMe) -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NHn polipéptidos neste exemplo contêm o mesmo fragmento Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-PheNH^. Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z) -Leu-psi-Phe-resina de BHA (3/1/res) foi construído passo a passo sobre 0,5 g de resina de BHA (0,9 mmole NH2/g) de harmonia com a síntese em fase sólida descrita na porção do Exemplo (2) com a excepção de Boc-Phe figurar em vez de Boc-Leu no primeiro acoplamento.
péptido-resina parcial contendo cerca de 150 mg de
Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-resina de BHA (3/1/Res) foi cada um acoplado com outros dois resíduos de harmonia com os
331
SHAL3.0-010CT/PT
-29procedimentos descritos na Operação I para acoplamento de Boc-Trp, Boc-D-Trp, Boc-D-Tpi e Boc-Glu(OMe) e Operação III para Boc-Gln para dar o polipéptido-resina final.
acoplamento em sequência de Boc-Gln e Boc-Trp ao supra mencionado heptapéptido-resina (3/1/res) dá:
3/2/09 Boc-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-resina de BHA
A adição sucessiva de Boc-Gln e Boc-D-Trp ao heptapéptido-resina (3/1/res) dá:
3/2/10 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-resina de BHA acoplamento de Boc-Gln e Boc-D-Tpi ao heptapéptido-resina (3/1/res) dá:
3/2/12 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-resina de BHA
3/2/13 Boc-D-Tpi-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Pheresina de BHA é construído por acoplamento de Boc-Glu(OMe) e Boc-D-Tpi ao heptapéptido-resina (3/1/res).
Depois de remoção do grupo Boc com TFA a 50% em DCM contendo 5% de mercaptoetanol e 5% de anisolo, o polipéptido-resina é lavado com DCM, metanol e DCM, três vezes cada e tratado com HF recém-destilado (5 ml) e anisolo (0,25 ml), a 0°C durante 1 h. O solvente é evaporado sob vácuo e lavado com acetato de etilo, extractado com ácido acético a 70-80% e liofilizado. Obtém-se os seguintes polipéptidos:
3/3/09 Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Phe-NHn
Péptido na.
10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2
12. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2
13. D-Tpi-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NHg
O péptido que tem NH2CO no N-terminal foi preparado pelo
331
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-30procedimento seguinte:
uma mistura de 40 mg de polipéptido bruto (3/3/9) Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 e 20 μΐ de TEA em 0,5 ml de DMF e 20 mg de KOCN em 100 μΐ de H2O foi agitada a 0°C, juntando-se depois a esta mistura gota a gota 100 μΐ de AcOH e mantendo-se a reacção em agitação a 0°C durante 1 h. A mistura de reacção contendo o desejado péptido (9) NH2CO-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 foi submetida a purificação por HPLC.
péptido (11) foi preparado por acoplamento sucessivo de dois Fmoc-aminoácidos pelo método indicado na Operação IV de síntese em fase sólida.
J
150 mg de TFA Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-Phe-resina de BHA (3/1/Res) foram neutralizados com TEA a 10%, lavados com CH2C12 e DMF e acoplados com Fmoc-Glu( OBut) para dar Fmoc-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi.-Phe-resina de BHA (3/5/11). Fmoc-D-Trp-Glu(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Phe-resina de BHA foi obtido depois de desprotecção com 50% de piperidina e acoplamento com Fmoc-D-Trp. O grupo But foi retirado do péptido-resina protegido com Fmoc por tratamento com TFA a 10% em DCM contendo 2% de mercaptoetanol durante 30 min. Borbulhou-se MeNH2 através de um leito de 200 mg de Fmoc-D-trp-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His(H)-Leu-psi-Phe-resina de BHA (3/6/11) em 5 ml de DMF . a 0°C durante 5 min, adicionou-se 0,2 ml de DIC a 20% em DCM e agitou-se a mistura durante 2 h a 0’C. A resina foi depois lavada com DCM e o grupo Fmoc foi retirado com piperidina. Depois de tratamento com HF e anisolo, o Péptido (11) D-Trp-Glu(MeNH)Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-PheNHg foi submetido a purificação por HPLC.
Os tempos de retenção dos péptidos deste exemplo são os indicados na Tabela seguinte:
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SHAL3.0-010CT/PT
Dados de HPLC Analítica
Péptido n2. Gradiente % B/min Tempo de retenção na coluna D
9. 25-65 16,38
10. 25-65 14,62
12. 25-65 14,72
13. 25-65 19,20
As proporções de aminoácidos mostradas pelas análises de aminoácidos foram as esperadas. Por exemplo, as proporções no Péptido (10) D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2 eram 1,15:0,96:0,95:1:0,1:0,94:1,97 (Glu:Gly:Ala:Vai:His:Trp) e tinham um pico com tempo de retenção de 44,56 min. As proporções do Péptido (13) eram 1,04:0,98:1,02:1,00:1,03:0,94 (Glu:Gly:Ala:Vai:His:Trp) e um pico de absorção com tempo de retenção 44,56 Leu-psi-Phe. Não se detectou Tpi no Péptido (13).
Exemplo (4)
Péptido n2.
14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
15. D-p-Glu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
16. Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-Psi-Tpi-NH2
17. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHg
18. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHo
19. D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
20. D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2
21. D-Trp-Glu-(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-TpÍ-NH2
22. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHg
23. Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
24. NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
25. Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2
26. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
Leu-psi-Tpi-resina de BHA é feito fazendo reagir Boc-Leu-psi-Trp-resina de BHA com formaldeído de harmonia com os procedimentos seguintes:
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O Boc-Leu-psi-Trp-resina de BHA foi obtido a partir de 1,0 g de resina de BHA (0,9 mmole NH2/g) acoplando Boc-Trp e Boc-Leu-CHO sucessivamente pelo método indicado na Operação I e Operação II. 10 ml de DMF contendo 1% de ácido acético são adicionados ao péptido-resina anterior e depois reagidos com 1 ml de formaldeído a 10% à temperatura ambiente durante 60 minutos e lavados com DMF, MeOH e DCM.
Todos os polipéptidos neste exemplos contêm um, fragmento comum Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-ps i-Tpi-NH2. O Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA (4/1/Res) foi construído passo a passo em Leu-psi-Tpi-resina de BHA acoplando sucessivamente Boc-His(Z) (Operação I), Boc-Gly (Operação III), Boc-Val, Boc-Ala e Boc-Trp (Operação I).
Uma porção de 150 mg do péptido-resina intermediário anterior foi submetido a mais dois acoplamentos segundo os procedimentos descritos na Operação I para o acoplamento de HCa, D-pGlu, Boc-Glu(OMe), Boc-Glu(OBz), Boc-D-Phe, Boc-D-Trp, Boc-His(Bz), Boc-Tpi, Bod-D-Tpi, AC-Tpi e Hna-Tpi e na Operação III para Boc-Gln para dar os péptidos-resinas finais.
acoplamento de Boc-Gln e Hca em sequência ao supra mencionado heptapéptido-resina (4/1/res) dá:
4/2/14 Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA
A adição em sequência de Boc-Gln e D-pGlu ao heptapéptido-resina (4/1/res) dá:
4/2/15 D-p-Glu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA acoplamento sucessivo de Boc-Glu(OBz) e Boc-Phe péptido-resina intermediário anterior (4/1/res) dá:
4/2/16 Boc-Phe-Glu(OBz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA.
acoplamento de Boc-Gln e Boc-D-Phe ao heptapéptido-resina
331
SHAL3.0-010CT/PT ·Ί
-33(4/1/res) dá:
4/2/17 Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA.
4/2/18 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps i-Tpi-res ina de BHA é construído acoplando Boc-Gln e Boc-D-Trp ao heptapéptido-resina (4/1/res).
4/2/19 Boc-D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina ’ de BHA é construído por acoplamento de Boc-His(Bz) e Boc-D-Trp ao heptapéptido-resina (4/1/res).
4/2/21 Boc-D-Trp-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpiresina de BHA é construído por acoplamento de Boc-Gln(MeO) e Boc-Tpi ao heptapéptido-resina (4/1/res).
4/2/22 Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA é construído por acoplamento de Boc-Gln e Boc-Tpi ao heptapéptido-resina (4/1/res).
4/2/23 Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA é construído por acoplamento de Boc-Gln e Ac-Tpi ao heptapéptido-resina (4/1/res).
4/2/25 Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA é construído por acoplamento de Boc-Gln e Hna-Tpi ao heptapéptido-resina (4/1/res).
4/2/26 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA é construída por acoplamento de Boc-Glu e Boc-D-Tpi ao heptapéptido-resina (4/1/res).
Depois de remoção do grupo Boc e tratamento dos produtos anteriores com HF e anisolo como se descreveu nos exemplos (2) e (3) obtiveram-se, respectivamente, os péptidos seguintes:
Péptido ns.
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
14.
331
SHAL3.0-010CT/PT
-34•a*
15.
4/3/16
17.
18. 19. 21. 22. 23.
25.
26.
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2
Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHo
D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2
D-Trp-Glu-(OMe)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHn
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2
Ac-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHo
Hna-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 mg de Phe-Glu-Trp-Ala-Val-G1v-His-Leu-psi-Tpi-NH2 (4/3/ /16) 5 mg de difenilfosforilazida e 10 mg de KHCO3 em 0,5 ml de DMF foram agitados a 0°C durante 24 horas. A mistura de reacção foi submetida a purificação por HPLC utilizando o sistema solvente 40-70% B durante 60 min para dar:
Péptido (16) Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2: cerca de 4,5 mg. Este era puro (>95%) por HPLC utilizando o sistema solvente 25-65% durante 40 min. O tempo de retenção é de min.
Uma mistura de 40 mg de polipéptido 22 bruto Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHn. 20 μΐ de TEA em 0,5 ml de DMF e 20 mg de KOCN em 100 μΐ de H20 foi agitada a 0°C. Uns minutos depois foram adicionados gota a gota 100 μΐ de AcOH à referida mistura e manteve-se a mistura de reacção sob agitação a 0°C durante 1 h. A mistura de reacção contendo o desejado (oligo) péptido:
Péptido (24) NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 foi submetida a purificação por HPLC.
Fmoc-D-Trp-Gln(OBut)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpiresina de BHA (4/2/res) foi preparado acoplando sucessivamente Fmoc-Glu(OBut) e Fmoc-D-Trp a Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA (4/1/Res) segundo o método indicado na Operação IV. Depois de retirado o grupo But com TFA a 10% em DCM contendo 2% de 2-mercapto-etanol durante 30 min, fez-se reagir o péptido-resina com MeNH2 e DIC pelos procedimentos descritos no
331
SHAL3.0-010CT/PT
-35exemplo (3) para o péptido-resina (3/6/11) para se obter o Fmoc-D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-resina de BHA (4/3/Res). Depois de retirado o grupo Fmoc com piperidina, o péptido-resina foi tratado com HF (5 ml) e anisolo (0,25 ml) a 0°C durante 1 h para dar:
Péptido (20) D-trp-Glu-(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-nh2
Os tempos de retenção dos péptidos deste exemplo estão indicados na Tabela seguinte:
Dados de HPLC Analítica
Péptido n2. Gradiente Tempo de retençj
% B/min na coluna D
17. 25-65/40 17,13
18. 25-65/40 19,34
22. 25-65/40 21,32
26. 30-70/40 16,76
A análise de aminoácidos dos péptidos deste exemplo deram as composições esperadas. Por exemplo, o D-Phe-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 (17) tinha as proporções 1,04:0,99:0,96:1,00: :0,94:0,99:1,06 (Glu:Gly:Ala:Val:Phe:His:Trp). A análise de aminoácidos não acusava Tpi nos péptidos nas. 17, 24 e 26.
Exemplo (5)
Péptido nfi.
27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2
28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2
29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NBg
30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2
31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
3. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
4. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
331
SHAL3.0-010CT/PT
-36- os péptidos deste exemplo contêm um fragmento comum,
Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NHn ou Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2. 0 Boc-Gln-trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-resina de BHA (5/1/Res) é construído sobre 1,0 g de resina de BHA (0,9 mmole NH2/g) por acoplamento sucessivo por meio de operações de síntese em fase sólida como se descreveu no Exemplo (2) exceptuando-se o facto de no primeiro acoplamento se usar Boc-Trp(For) em vez de Boc-Leu. Porções de 250 mg dos anteriores péptidos-resina são utilizadas para realizar a síntese dos seguintes quatro péptidos-resina protegidos por meio do acoplamento final com MPP, Boc-D-Phe, Boc-D-Trp ou Boc-D-Tpi respectivamente segundo o procedimento descrito na operação I.
5/2/27 Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Trp-(For)-resina de BHA
5/2/28 Boc-D-Phe-Gln-trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-p(For)-resina de BHA
5/2/29 Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Trp(For)resina de BHA
5/2/30 Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-ps i-Trp(For)resina de BHA.
Depois de retirado o grupo Boc com TFA a 50% em DCM contendo 5% de mercapto-etanol e 5% de anisolo, metade de cada um dos anteriores péptidos-resinas foram tratados com HF (5 ml) e anisolo (0,25 ml) a 0°C durante 1 hora para produzir os péptidos seguintes:
Péptido n2.
31. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp (For) -NH2
3. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
4. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp(For)-NH2
A metade remanescente de cada um dos péptidos-resina foi tratado com HF contendo 5% de anisolo e 5% de dimercaptoetanol a 0°C durante 1 h para dar os péptidos seguintes:
331
SHAL3.0-010CT/PT —37—
Péptido ne.
27. Mpp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NH2
28. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NHn
29. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-G1v-His-Leu-psi-Trp-NH2
30. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-G1v-His-Leu-psi-Trp-NHo
Estes péptidos foram purificados por HPLC e os retenção estão indicados na Tabela seguinte:
tempos de
Dados de HPLC Analítica
Péptido n2. Gradiente % B/min Tempo de retenção na coluna D
27. 25-65 27,89
28. 25-65 18,70
29. 25-65 19,70
30. 25-65 20,26
31. 25-65 28,00
32. 25-65 19,10
33. 25-65 19,01
34. 25-65 17,70
Os dados da análise de aminoácidos dos péptidos deste exemplo foram os esperados. Por exemplo (28) tem as proporções de aminoácido de 0,98:0,92:1,03:0,97:0,98:1:0,9 (Gly:Ala:Vai:Phe: :His:Trp). Em (30) e (34) não aparecia Tpi.
Exemplo (6)
Péptido n=.
35. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
36. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OMe
37. NHnCO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-OMe
38. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHMe
39. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OH
40. D-Tpi-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi.-Tpi-N2H2CONH2
Boc-Trp-OCH2-resina é utilizado como material de partida
331
SHAL3.0-010CT/PT •$X·'
-38sendo feito pelo procedimento seguinte: uma mistura de Cl-CH2-resina (1,0 g, 0,7 mmoles Cl/g), Boc-Trp (2,0 mmole Trp) e KF (4 mmole) em 20 ml de DMF foi agitada a 70-80°C durante 4 h. 0 Boc-Trp-OCH2-resina foi então lavado, por duas vezes com cada um de MeOH, H20, MeOH, DMF e DCM. 0 Boc-Leu-psi-Trp-OCHn-resina é obtida por acoplamento de Boc-Leu-CHO ao Trp-OCH2-resina por meio da operação II. O Boc-Leu-psi-Tpi-OCHn-resina é obtido pela reacção de Boc-Leu-psi-Trp-OCHg-resina com formaldeído segundo o procedimento descrito no exemplo (4). Por meio de acoplamento sucessivo de Boc-His(Z), Boc-Gly-Boc, Val-Boc-Ala-Boc-Trp e Boc-Gln segundo as operações de síntese em fase sólida anteriormente descritas obtém-se 1,60 g de Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-(Z)-Leu-psi-Tpi-OCHo-resina (6/1/Res). Uma parte do anterior péptido-resina intermediário foi utilizada para dar Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-OCH2-resina (6/ /2/35) por acoplamento de Boc-tpi. Outra parte alíquota do péptido-resina foi empregue para produzir Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His ( Z )-Leu-£s_i-Tpi-OCH2-resina 6/2/36 por acoplamento de Boc-D-Tpi.
Depois de removido o grupo Boc com TFA a 50% em DEM contendo 5% de mercapto-etanol e 5% de anisolo o procedimento de trans-esterificação foi realizado como segue: 0,5 g de Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-(Z)-Leu-psi-Tpi-0CH2-resina (6/3/35), metanol (15 ml) DMF (15 ml) e diisopropiletilamina (3 ml) foram adicionados e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 dias. A resina foi lavada com DMF (3 vezes) e metanol (3 vezes). O filtrado e as lavagens foram combinados e evaporados por evaporação rotativa sob vácuo para retirar os solventes. Depois de tratamento com HF e anisolo obtiveram-se, 123 mg de Péptido (35) Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-OCH3 em bruto. 0 péptido (36) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His(Z)-Leu-psi-Tpi-OCH3 foi obtido pelo mesmo procedimento mas a partir de (6/2/36).
Uma mistura de Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OCH3 (35) (45 mg), 20 μΐ de TEA em 0,5 ml de DMF e 50 mg de KOCN em 100 μΐ de H2O foi agitada a 0°C e, uns minutos depois,
331
SHAL3.0-010CT/PT «aí*·* —39— juntaram-se 50 μΐ de AcOH à mistura e deixou-se reagir a 0°C durante 1 h. A mistura foi depois submetida a purificação para dar
Péptido (37) NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-His-Leu-psi-Tpi-OCH3.
Uma mistura de D-Tpi-Gln-trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-OCH3 (36) e de uma solução de 1:2 p/p de metilamina em metanol (2 ml) foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h. Depois de evaporação por meio de evaporação rotativa sob vácuo, o material residual foi criodessecado e tratado com HF e anisolo. 0 produto era o
Péptido (38) D-TpÍ-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHCH3 que foi submetido a purificação por HPLC.
Outra porção de D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Z)-Leu-psi-Tpi-OCHg-resina (6/2/35) foi tratada com HF e anisolo para dar:
Péptido (39) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-OH.
Uma mistura de péptido 39 (40 mg), (Boc)20 (20 mg) e TEA (20 μΐ) em 0,5 ml DMF foi agitada a 0°C durante 4 horas e liofilizada. Após lavagem com éter, o resíduo HOBt (10 mg) e N2H3CONH2 (20 mg) reagiram com DCI (100 μΐ de DCI a 20% em DCM) a 0°C durante a noite, evaporou-se o DMF, lavou-se com éter e o grupo Boc foi removido com TFA a 50% contendo 5% de mercapto-etanol e anisolo para dar,
Péptido (40) D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-N2H2CONH2, em bruto.
331
SHAL3.0-010CT/PT

Claims (18)

  1. REIVINDICACÕES «ϋ*
    1 - Processo de preparação de uma porção nonapeptídica de fórmula I
    X—A1_A2—A3—A4—A5—A^—A7-A8—psi—A9-0 na qual
    Q é NH2 ou OqI onde Q1 é hidrogénio, alquilo C1_lo, fenilo ou fenil-alquilo C7_10; X é hidrogénio ou uma ligação simples unindo a A2, o resíduo acilo de um ácido orgânico ou um grupo da fórmula R-^CO- onde (1) R1 é hidrogénio, alquilo ci-iO' fenilo ou fenil-alquilo c7-10' (2) R1CO- é (a) R2
    N-COR, onde
    R2 é hidrogénio, alquilo ci-iO' fenilo ou fenil-alquilo C7_10, R3 é hidrogénio ou alquilo ci-io’ (b) R4-O-CO- onde R4 é alquilo fenilo ou fenil-alquilo C7_10;
    A1 é D-, L- ou DL-pGlu, Nal, Phe, Thi, Tyr, Tpi, Hca, Hpp, Mpp, Trp ou Trp substituído no anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogêneo, N02, NH2, OH, alquilo C1-3 e alcoxi ε1-3, sendo o halogêneo flúor, cloro e bromo,
    A2 é Asn, Dpa, Gin, His, MeHis, His(Bz), His(Z) ou um grupo da fórmula Dpa (X), Asp (Y), Glu [-] e Glu (Y) onde
    X é definido como anteriormente,
    Re
    Y é -OR5 ou
    -N<
    r>7 onde
    R5 é hidrogénio, alquilo C^_3 ou fenilo;
    R6 é hidrogénio ou alquilo
    R7 é hidrogénio, alquilo ou -NHCONH2;
    e [-] é uma ligação simples unindo o grupo carboxilo lateral com o grupo alfa-amino de A1 quando X é uma ligação simples;
    A3 é Nal, Pal, Tpi, Trp, MeTrp, Trp(For) ou Trp substituído no
    73 331
    SHAL3.0-010CT/PT
    -41anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, N02, NH2, OH, alquilo C1-3 e aleoxi cl-3, sendo o halogéneo flúor, cloro e bromo;
    A4 é Ala, MeAla, ou Gin;
    A5 é Vai ou MeVal;
    A6 é Gly, Phe ou D-Ala;
    A7 é His, MeHis, His(Bz), His(Z), Lys(Z) ou Pal;
    A8 é um isóstero reduzido de Leu ou Phe;
    A9 é Leu, Phe, Tpi, Trp ou Trp substituído no anel benzénico por um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, NO2, NH2, OH, alquilo C1-3 e aleoxi C^_3, sendo o halogéneo flúor, cloro e bromo;
    desde que quando A9 é Leu ou Phe, A1 seja diferente de D-Nal ou DL-Phe e quando A1 é D-Nal ou DL-Phe, A9 seja diferente de Leu ou Phe; e dos seus sais com ácidos farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por se efectuar uma condensação de fragmentos, dos fragmentos de péptido correspondentes, ou se efectuar uma síntese passo a passo e, quando necessário, se acilarem os péptidos assim obtidos e/ou se converterem em sais de ácidos farmaceuticamente aceitáveis.
  2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a síntese passo a passo ser realizada protegendo o grupo amino na posição α e o terminal carboxi ser ligado em covalência a um suporte sintético, em seguida o grupo α-protector ser separado, o grupo carboxi do aminoácido imediatamente seguinte ser reduzido ao grupo HC=O, o qual é depois ligado ao supramencionado grupo α-amino desprotegido, depois o grupo protector do α-amino deste segundo aminoácido ser desprotegido e o grupo carboxi do aminoácido imediatamente seguinte ser então ligado ao supramencionado segundo grupo α-amino desprotegido, sendo subsequentemente os outros aminoácidos do péptido a ser sintetizado ligados passo a passo na sequência correcta e, depois da ligação de todos os aminoácidos do péptido completo da reivindicação 1, o referido péptido ser separado do suporte e, quando necessário, serem separados outros grupos laterais protectores de funções, quando presentes.
    73 331
    SHAL
  3. 3.0-010CT/PT
    -423 - Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por o polipéptido preparado ter uma das fórmulas: D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2
    D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2
    D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly“His-Leu-psi-Phe-NH2
    D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NHn
  4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2.
  5. 5 - Processo de preparação acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH2.
  6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Trp-NHn.
  7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2.
  8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NH2.
  9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHn.
  10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2.
  11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipéptido preparado ter uma das fórmulas NH2CO-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHo e ACY-Tpi-Gln-Trp73 331
    SHAL3.0-010CT/PT
    43 —
    -Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 sendo ACY acetilo, octanoílo ou 3-hidroxi-2-naftloílo.
  12. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2.
  13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Trp-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2.
  14. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHo.
  15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um polipéptido com a fórmula D-Trp-His(Bz)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NHo.
  16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac1-1 terizado por se preparar um polipéptido com a formula Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Glv-His-Leu-psi-Tpi-NHo.
  17. 17 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se associar um polipéptido ou uma forma de sal de adição terapeuticamente aceitável, preparado de acordo com a reivindicação 1, ou um seu complexo com um portador liquido ou sólido farmaceuticamente aceitável.
  18. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac18 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por
    A8 ser um isóstero reduzido de Leu e
    A9 ser D-, L- ou DL-Tpi, Trp ou Trp substituído no anel benzénico com um ou mais membros escolhidos do grupo constituído por halogéneo, N02, NH2, OH, alquilo C1-3 e alcoxi C1-3 sendo o halogéneo flúor, cloro e bromo.
    73 331
    SHAL3.0-010CT/PT
    -44terizado por A1 ser D-, L- ou DL-Tpi ou A9 ser D-, L- ou DL-Tpi
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