PT97836B

PT97836B - Processo para a preparacao de novas proteinas e de composicoes farmaceuticas que as contem

Info

Publication number: PT97836B
Application number: PT97836A
Authority: PT
Inventors: Gunnar Bjursell; Lars Blackberg; Peter Carlsson; Sven Enerback; Olle Hernell; Jeanette Nilsson; Thomas Olivecrona
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-05-31
Publication date: 1998-11-30
Also published as: IL98273A; EP0535048B1; RU2140983C1; NO924528D0; AU7964591A; TW221712B; HK62497A; CA2083396A1; PL166534B1; HUT63184A; FI925453A0; HU9203774D0; IE911844A1; DZ1503A1; AU651979B2; BG61165B1; TNSN91041A1; PH30761A; DE69125489D1; RO114793B1

Description

INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES

CAMPO OAS CEBOLAS, 1100 LISBOA

TEL: 888 51 51 / 2 / 3 TELEX! 18356ΙΝΡΙ

TELEFAX :87 53 08

Modalidade e n.°

FOLHA DO RESUMO (Continuação)

22,

Classificação internacional (stj

Resumo (continuação) (57) 2

As novas proteínas da presente invenção encontram-se relacionadas com uma enzima, conhecida entre outras como a lipase estimulada pelos sais biliares humanos.

processo é caracterizado pelo facto de se desenvol ver um organismo hospedeiro contendo um vector apropriado e'de se isolar a proteína.

NÃO PREENCHER AS ZONAS SOMBREADAS (Dr. Jojger-Úarin) 'DSM-5 — MOOREP£-3HX3e«ww.-.

¢Processo para a preparação de novas proteínas e de composições farmacêuticas que as contêm

Âmbito da presente invenção

A presente invenção refere-se a novas sequências de ADN, a novas proteínas codificadas por essas sequências de ADN e â utilização, tal como se descreve posteriorrnente, de tais proteínas.

A presente invenção também engloba vectores, tais como construções plasmídicas, constituídos por tais sequências de ADN susceptíveis de expressarem a enzima desejada. A presente invenção também engloba organismos hospedeiros transfectados com tais construções, por exemplo, leveduras bacterianas, células de mamíferos e animais trans gênicos. A presente invenção também engloba processos para a preparação dos novos produtos da presente invenção. As novas proteínas da presente invenção encontram-se associadas a um enzima conhecido, entre outros como a lipase estimulada pelos sais biliares humanos.

Antecedentes da presente invenção

As glândulas mamárias humanas, no período de lactação, sintetizam e segregam conjuntamente com o leite uma lipase estimulada pelos sais biliares (LESB)' que, apôs a activação específica pelos sais biliares primários £ 2, 57, 58 J, contribui para a capa-

cidade endógenas das crianças alimentadas com leite materno para efectuarem a digestão das gorduras a nível intestinal 3-5 J. Este enzima, que representa aproxímadamente 1% das proteínas totais do leite /~6 J7, consiste em uma lipase não específica; hidrolisa, in vitro, não só os tri-, di- e monoacilglicerõis, como também os ésteres colesterílicos e retinílicos e os lisofosfatidilgliceróis £ 7-10 _7. Para além disso, a sua actívidade não se limita à emulsificação dos substratos mas hidrolisa também em proporções semelhantes aos substratos solúveis e micelares £ 11 £.

A LESB não se degrada durante a passagem do leite através do estômago e o teor duodenal ê protegido pelos sais biliares da inactivação das proteases pancreãticas tais como a tripsina e a quimiotripsina £ 2,11£. No entanto, ê inactivada quando o leite é pasteurizado, por exemplo aquecido a 62,5°C, durante 30 minutos £ 12 £. Experiências com modelos, in vitro, sugerem que os produtos finais da digestão do triacilglicerol são diferentes na presença de LESB £ 5,7 £. Devido às baixas concentrações intraluminais os sais biliares durante o período neõnatal £ 13,14 £ este facto pode ser benéfico para absorção do produto £ 5,15 £.

A hidrolase do éster carboxílíco (HEC) do suco pancreãtico humano £ 16 £ parece ser funcionalmente idêntica ou pelo menos muito parecida com a LESB £ 8 £. Partilham inclusivamente epitopes comuns £8,17J, possuem sequências aminoácidas da extremidade N idênticas £ 17 £ e são inibidas pelos inibidores da serina-estearases, como por exemplo serina e di-isopropilfluorofosfato £ 6,8,16,7. PÔs-se a hipótese de que os dois enzimas fossem produtos do mesmo gene £ 18,19,7. A diferença de peso molecular observada £ 8,19 £ poderia ser explicada por diferentes padrões de glicosilação, tal como recentemente se sugeriu £ 17 £.

Os lípidos dietéticos constituem uma importante fonte de energia. Os triacilgliceróis ricos em energia constituem mais de 95% desses lípidos. Alguns dos lípidos, por exemplo determinados ácidos gordos e as vitaminas lipossolúveis são constituintes dietéticos essenciais. Antes da absorção gastro-intestinal os triacilgliceróis assim como os componentes menores, isto é, as vitaminas lipossolúveis esterificadas e o colesterol e os diacilfosfatidilglicerõis necessitam da hidrólise das ligações éster para proporcionarem produtos menos hidrofóbicos e absorvíveis. Estas reacçÕes são catalisadas por um grupo de enzimas específicos designados por lipases.

No ser humano adulto condidera-se que as lipases essenciais envolvidas são a lipase gástrica, a lipase dependente da colipase pancreãtica (hidrólise de tri- e diacilglicerol), a fosfolipase pancreática A2 (diacilfosfatidilgliceróis) e a hidrolase do éster carboxílico (ésteres de colesteril- e de vitaminas lipossolúveis).

Nos recém-nascidos alimentados pelo leite materno as lipases estimuladas pelos sais biliares representam ou desempenham o papel essencial na hidrólise de diversos lípidos anteriormente referidos. Conjuntamente com os sais biliares os produtos da digestão dos lípidos formam micelas mistas a partir dos quais se efectua a absorção (3-5).

As causas comuns da mal absorção dos lípidos e também da deficiente nutrição residem nos níveis intraluminais reduzidos de lipase dependente de colipase pancreãtica e/ou sais biliares. Exemplos típicos dessa deficiência de lipase são os doentes que sofrem de fibrose cística, um distúrbio genético comum que origina uma deficiência ao longo da vida em 80% dos doentes e pancreatite crónica, muita vezes devida ao alcoolismo crónico.

As funções pancreãticas e hepáticas não se encontram total- 4 -

mente desenvolvidas na altura do nascimento especialmente nas crianças prematuras. A deficiente absorção das gorduras, por razões fisiológicas, constituem um dado comum e que se pensa resultar das pequenas concentrações intraluminais de lipase dependente da colipase pancreãtica e dos sais biliares (3,4,13-15). No entanto, devido à LESB, esta deficiente absorção é muito menos frequente nas crianças alimentadas com leite materno do que nas crianças alimentadas com leite humano pasteurizado de formulas infantis (3, 5, 12, 59, 60, 61). Esta ê uma das razões porque se tem defendido que as crianças recém-nascidas, especialmente as crianças prematuras, que não podem ser alimentadas pelo leite das suas próprias mães devem ser alimentadas com leite não pasteurizado de outras mães (12).

O presente tratamento de doentes que sofrem de uma deficiência de lipase pancreãtica consiste na administração oral de grandes doses de uma preparação bruta de enzimas pancreãticos porcinos. A lipase pancreãtica dependente da colipase é inactivada a um pH baixo. Estas condições existem no estômago o que origina que a lipase pancreãtica oralmente administrada seja virtual e completamente inactivada ao passar do estômago para o intestino. No entanto, este efeito não pode ser completamente ultrapassado pela utilização de grandes doses de enzima. As grandes doses administradas são inadequadas para a maioria dos doentes e as preparações são impuras e intragáveis. Pormularam-se alguns comprimidos que passam através das regiões acidas do estômago e descarregam o enzima apenas num meio reiativamente alcalino do jejuno. No entanto, muitos doentes que sofrem de distúrbios pancreãticos possuem um jejuno anormalmente ãcido e esses comprimidos podem não conseguir descarregar o enzima e tornarem-se assim enificazes. Para além disso, uma vez que as pre-

paraçoes existentes presentemente no mercado sao de uma fonte não humana, existe risco de surgirem reacções imunológicas que podem originar efeitos perniciosos para o doente ou originar uma reduzida eficácia terapêutica.

Uma outra desvantagem que existe na utilização das actuais preparações reside no facto dos teores de outras actividades lipolíticas diferentes da lipase dependente da colipase não se encontrarem confirmadas. De facto, a maioria delas contem níveis muito baixos de actividade de HEC/LESB. Esta pode ser uma das razões pela qual muitos doentes que sofrem de fibroses císticas, apesar de se encontrarem submetidos a uma terapia complementar, sofrerem, de deficiências de vitaminas lipossolúveis e de ácidos gordos essenciais.

Deste modo, existe uma necessidade premente de produtos com propriedades e estruturas derivadas de lipases humanas e com uma larga especificidade de substratos, produtos esses que podem ser administrados oralmente aos doentes que sofram de uma deficiência de um ou de vários dos enzimas lipolíticos pancreáticos. Os produtos da presente invenção preenchem esta necessidade por si próprios ou em combinação com outras lipases ou em combinação com preparações contendo outras lipases. Para além disso, para algumas crianças existe uma necessidade óbvia de melhorar a utilização das gorduras a partir das fórmulas convencionais para crianças ou do leite humano pasteurizado dos chamados bancos de leite.

A LESB possui diversas propriedades únicas que a tornam idealmente adequada para a terapia de substituição e de complementarização:

Foi concebida pela natureza para administração oral. Assim, resiste à passagem através do estômago e é activadano meio do intestino delgado.

seu mecanismo de activação específico poderá evitar a lopolise inadequada dos alimentos ou dos lípidos tecidulares durante o armazenamento e passagem para o seu local de acção. Devido à sua ampla especificidade de substrato possui o potencial de por si própria mediar a digestão completa da maioria dos lípidos dietéticos incluindo os ésteres das vitaminas lipossolúveis.

A LESB pode ser superior à lipase dependente da colipase pancreãtica para hidrolisar os ácidos gordos poli-insaturados de cadeia longa que contêm ligações éster.

Na presença da lipase gástrica e na sua ausência ou a baixos níveis de lipase dependente de colipase, a LESB pode levar a efeito uma digestão completa de triacilglicerol in vitro, mesmo no caso dos níveis dos sais biliares serem tão baixos como os que se encontram nas crianças recém-nascidas. Na presença de LESB, os produtos finais da digestão de triacilglicerol transformam-se em ácidos gordos livres e em glicerol livre em vez de se transformarem em ácidos gordos livres e em monoacilglicerol originado pelas outras duas lipases (5). Este facto pode favorecer a absorção dos produtos especialmente quando os níveis intraluminais dos sais biliares são baixos (3,15) .

Partindo de um ponto de vista histérico, desenvolveram-se e melhoraram-se as fórmulas infantis a partir do conceito de que as suas composições deveriam ser tão idênticas quanto possível ao leite humano. Pretende-se suplementar estas fórmulas.

Para a utilização para complementar!zação, substituição ou terapia de lipases estimuladas por sais biliares (LESB) ou de proteínas com as funções essenciais de LESB, é necessário no entanto ter acesso a quantidades do produto numa escala técnica muito grande. Não é possível, à escala industrial, contar-se com fontes naturais

tais como o leite, como material de partida. Para além do problema anteriormente referido com a inactivação de LESB durante a pasteurização, existe ainda o risco adicional de contaminação do material a partir de uma fonte natural com agentes infecciosos como por exemplo vírus, tais como o vírus HIV e CMV. De acordo com o anteriormente exposto, existe uma necessidade de acesso a produtos em larga escala que possuam as propriedades de LESB. A presente invenção proporciona esses produtos e os métodos para a sua preparação.

Fornecem-se adiante, na presente memória descritiva, as referências da técnica anterior.

A presente invenção

A presente invenção baseia-se na clonagem do cADN que codifica a LESB derivada da glândula mamária humana. Também se isolou, a partir do pâncreas humano, um cADN parcial que codifica HEC. As sequências aminoãcidas deduzidas dos cADNs humanos e a comparação com as HEC de outras espécies, suportam a interpretação de que LESB e HEC são idênticas.

Tal como se descreverá mais pormenorizadamente adiante, descobriu-se de um modo surpreendente que a estrutura da proteína tal como foi deduzida a partir da sequência de cADN ê bastante diferente da estrutura de outras lipases. A estrutura mostrou de um modo inesperado que era muito mais parecida com a estrutura das esterases típicas tal como a colinesterase.

No que se refere â figura II e a figura VII, os produtos da presente invenção são os seguintes:

a) uma proteína, tal como a definida pela sequência aminoãcida 1-722 na fig. VII,

b) uma proteína, tal como a definida pela sequência aminoãcida 1-535 na fig. VII,

c) uma proteína, tal como a definida pela sequência aminoãcida 1-278 na fig. VII,

d) uma proteína, tal como a definida pela sequência aminoãcida 1-341 na fig. VII,

e) uma proteína, tal como a definida pela sequência aminoãcida 1-409 na fig. VII,

f) uma proteína, tal como a definida pela sequência aminoãcida 1-474 na fig. VII,

g) combinações de proteínas tais como as definidas nas alíneas

b) - f), por exemplos como as definidas pela sequência aminoãcida nas posições 1-278, 279-341, 279-409, 279-474, 342-409, 342-474 e

536-722,

h) combinações de proteínas tais como as definidas nas alíneas

b) - g) em combinação com uma ou mais das repetições de acordo com a figura V,

i) uma proteína tal como as defenidas nas alíneas a) - h) possuin do nm aminoãcido N-terminal adicional, designadamente metionina, e variantes e mutantes funcionalmente equivalentes às proteínas definidas nas alíneas a) - i) anteriores;

Deverá ter-se em consideração que as proteínas referidas nas alíneas a, b, c, d, e, f, hei anteriores não são idênticas em todos os aspectos ã LESB natural mas apresentam uma ou mais funções críticas da LESB natural. Indicam-se adiante as funções críticas.

j) uma sequência de ADN que codifique as proteínas definidas nas alíneas a, b, c, d, e, f, hei anteriores.

k) uma sequência de ADN de acordo com a fig. II, definida pelos seguintes números nucleotídicos, da fig. II;

a) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

b) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

c) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

d) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

e) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

f) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

g) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

h) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

i) uma sequência de codifique a proteína fig. VII,

j) uma sequência de

ADN, 151-2316, de acordo com a fig definida pela sequência aminoãcida

ADN, 151-1755, de acordo com a fig definida pela sequência aminoãcida

ADN, 151-985, de acordo com a fig. definida pela sequência aminoãcida

ADN, 151-1172, de acordo com a fig definida pela sequência aminoãcida

ADN, 151-1376, de acordo com a fig definida pela sequência aminoãcida

ADN, 151-1574, de acordo com a fig definida pela sequência aminoãcida

ADN, 986-1172, de acordo com a fig definida pela sequência aminoãcida

ADN, 986-1376, de acordo com a fig definida pela sequência aminoãcida

ADN, 986-1574, de acordo com a fig definida pela sequência aminoãcida

II, que

1-722 na

II, que

1-535 na

II, que

1-278 na

II, que

1-341 na

II, que

1-409 na

II, que

1-474 na

II, que

279-341 na

II, que

279-409 na

II, que

279-474 na

ADN, 1173-1376, de acordo com a fig. II, que codifique a proteína definida pela sequência aminoácida 342-409 na

-/LO fig. VII,

k) uma sequência de ADN, 1173-1574, de acordo com a fig. II, que codifique a proteína definida pela sequência aminoãcida 342-474 na fig. VII.

As funções significativas das proteínas da presente invenção são as seguintes:

a) são adequadas para administração oral;

b) são activadas por sais biliares específicos;

c) actuam como lipases não específicas no interior do intestino delgado, isto ê, são capazes de hidrolisar os lípidos de um modo relativamente independente da sua estrutura química e do seu estado físico (emulsifiçados, micelares, solúveis);

d) São capazes de hidrolisar os triacilglicerõis com ãcidos gordos de diferentes comprimentos de cadeia e com diferentes graus de insaturação;

e) São capazes de hidrolisar também os ésteres de diacilglicerol, monocilglicerol e colesterilo, e os ésteres vitamínicos lipossolúveis delisofosfatidilacilglicerol, de retinilo e de outras gorduras.

f) São capazes de hidrolisar não apenas as ligações éster sn-1(3) em triacilglicerol mas também as ligações éster sn-2;

g) São capazes de interactuarem não apenas com os sais biliares primários mas também com os sais biliares secundários;

h) dependem dos sais biliares para uma actividade óptima;

i) São estáveis de tal modo que o conteúdo gástrico não afecta a eficácia catalítica em qualquer grau significativo;

j) São estáveis face à inactivação pelas proteases pancreãticas, como por exemplo a tripsina, desde que se encontrem presentes sais biliares;

k) São capazes de se ligarem à heparina e aos derivados de heparina, como por exemplo sulfato de heparina;

i) São capazes de se ligarem a interfases lípido-ãgua;

m) têm estabilidade que permite a liofilização;

n) São estáveis quando misturados com constituintes alimentares tais como o leite humano ou fórmulas de leite.

As funções críticas para o enriquecimento, substituição ou terapia são aquelas que se encontram de acordo com as alíneas a), c), d), e) , f), i), j) e 1). Para outras finalidades, podem não ser necessárias todas as funções críticas.

Para a expressão das proteínas anteriormente referidas, deverá inserir-se a sequência de ADN indicada num vector adequado que depois se introduz num organismo hospedeiro adequado. 0 referido vector poderá também possuir um sinal adequado e outras sequências que possibilitem ao organismo expressar a proteína desejada.

Organismos adequados para a expressão:

Com as técnicas do ADN recombinante é possível clonar e expressar uma proteína com interesse em diversos organismos hospedeiros procarióticos e eucariõticos. Os organismos possíveis para expressão são bactérias, organismos eucariõticos simples (leveduras), culturas de células animais, culturas de células de insectos, culturas de células de plantas, plantas e animais trangênicos. Cada um dos sistemas possui individualmente as suas próprias vantagens e desvantagens específicas. A conclusão óbvia ê de que cada um dos genes que se pretende expressar constitui um problema único e que não existem soluções normalizadas.

- 12 Ç *

Os sistemas bacterianos habitualmente utilizados consistem na E. coli, no Bacillus subtilis e Streptomyces. As leveduras habitualmente utilizadas são saccharomyces e Pichia Pastoris. As células animais habitualmente utilizadas são as células CHO e as células COS. As culturas de células de insectos habitualmente utilizadas são as células derivadas de Drosophila.

A planta habitualmente utilizada ê a planta do tabaco. Os animais trangênicos possivelmente ou habitualmente utilizados são a cabra e a vaca.

Os vectores bacterianos possíveis podem exemplificar-se por PUC e vectores de proteína A. Os vectores possíveis de levedura são exemplificados pelo pMA 91. Os vectores possíveis de insectos são derivados do vírus Báculo. Os vectores de células animais possíveis são derivados de SV/40. Os vectores de plantas possíveis são derivados do plasmídeo-Ti. Em cada um dos sistemas podem utilizar-se promotores naturais ou de síntese e terminadores naturais ou de síntese.

É evidente que dependendo da selecção do sistema de expressão, a proteína expressa pode conter um aminoácido adicional N-terminal (metionina), pode conter alguns aminoácidos suplementares ou pode encontrar-se fundida com uma proteína heteróloga (como por exemplo a proteína A) ou pode diferir da proteína natural no que se refere à glicosilação. Para além disso, os vectores também podem conter sequências principais no sentido de fazerem sair a proteína para o periplasma ou para o meio de cultura.

Deste modo, constituem outros aspectos da presente invenção:

a) um vector que englobe uma sequência de ADN que codifique uma proteína, tal como anteriormente se definiu,

b) um organismo hospedeiro que englobe uma sequência de ADN tal como anteriormente se definiu,

c) um processo para a produção de uma proteína tal como anteriormente se definiu, caracterizado por se desenvolver um organismo hospedeiro contendo um vector tal como anteriormente se definiu na alínea a) e no isolamento da proteína.

Os métodos para a purificação baseiam-se nos sistemas de expressão a utilizar (por exemplo proteína A/IgG) e/ou em métodos utilizados para a purificação de enzimas naturais tais como os descritos na referência 6.

Constituem exemplos adicionais da presente invenção:

- uma composição farmacêutica que englobe uma proteína tal como anteriormente se definiu;

a utilização de uma proteína tal como anteriormente se definiu para a preparação - de um medicamento para o tratamento de uma situação patológica relacionada com a insuficiência patológica exócrina;

a utilização de uma proteína tal como anteriormente se definiu para a preparação de um medicamento para o tratamento de fibrose cística;

- a utilização de uma proteína tal como anteriormente se definiu como suplemento para uma formulação alimentar para crianças;

a utilização de uma proteína tal como anteriormente se definiu para a preparação de um medicamento para o tratamento de pancreatite crónica;

a utilização de uma proteína tal como anteriormente se definiu para a preparação de um medicamento para o tratamento da deficiente absorção das gorduras qualquer que seja a sua etiologia;

a utilização de uma proteína tal como anteriormente se definiu

para a preparaçao de um medicamento para o tratamento da deficiente absorção das vitaminas lipossolúveis;

a utilização de uma proteína tal como anteríormente se definiu para a preparação de um medicamento para o tratamento da deficiente absorção das gorduras devido a razões de carácter fisiológico, por exemplo nas crianças recém-nascidas.

A sequência de ADN que se indica na fig. II desde a posição 151 até à posição 2316 inclusive ê a sequência de ADN que codifica a proteína total. A sequência que se estende desde a posição 2317 até â posição 2415 inclusivé não é transferida para a proteína mas é incluída no exão d que se identifica no quadro 2 adiante.

De acordo com um aspecto da presente invenção, proporciona-se a proteína, tal como se definiu nos parágrafos de a) - i) anteriores, na sua forma isolada e/ou na sua forma essencialmente pura.

As sequências de ADN, tal como se definiu nos parágrafos de a) - k) anteriores, são proporcionadas de acordo com um aspecto da presente invenção na sua forma isolada e/ou na sua forma essencialmente pura.

Parte Experimental

Abreviaturas aa, aminoácido; pb, par de bases; LESB, lipase estimulada pelos sais biliares; c-AMP, monofosfato de adenosina cíclico; MEC hidrolase do éster carboxílico; Da, dalton; c GTP, 5¹-trifosfato de 7-desasa-2-desoxiguanosina; EDTA, tetra acetato de etilenodiamina; kb, quilobases; MOPS, ácido 3-N-morfolinopropanossulfõnico; nt, nucleotido; PAGE, electroforese sobre gel de poliacrilamida; SDS, dodecil-sulfato

5-bromo-4-cloro-3-indolil/>de sódio; SSC, citrato de NaCl, xGal,

-D-galactopiranosilo.

Enzimas

Lipase estimulada pelos sais biliares EC 3.1.1.3

Hidrolase do éster carboxílico EC 3.1.1.3

Materiais e métodos

A. Preparação de enzimas e de anticorpos

Purificou-se LESB a partir de leite humano tal como se descreveu anteriormente (6). Quando utilizada para a produção de anticorpos purificou-se posteriormente o enzima por SDS-PAGE. A banda de proteína correspondente â lipase foi, após coloração com azul de Brilhante de Coomassie, electro-eluída a partir do gel. Purificaram-se vinte cincoyig de enzima purificado, em conjunto com igual volume de coadjuvante completo de Preund numa primeira^injecção i.c. e utilizou-se a mesma quantidade de enzima coadjuvante incompleto para injecções mensais subsequentes de reforço. Retirou-se sangue dos coelhos aproximadamente duas semanas depois de cada uma das inoculações e preparam-se os soros que se armazenaram a -20°C.

B. Preparação de fragmentos trípticos e analise da sequência aminoâcida

Dissolveu-se 3 mg de LESB purificada em 1 ml de tampão de Tris-Cl 0,1M', a pH 8,5, contendo cloridrato de guanidínio 6M e EDTA 2 mM. Adicionou-se ditrioeritritol até uma concentração 5mM.

Apos incubaçao a 37 C durante 2 horas, adicionou-se 300 jil de acetato de iodo 50mM. Após 90 minutos de incubação a 25°C, na ausência de luz, dessalinizou-se o enzima reduzido e carboximetilado numa coluna Sephadex G-25, equilibrada com bicabornato de amónio 0,5M. Antes da liofilização adicionou-se 30 jjg de clorometano de tosil-L-fenilalanina tratado com tripsina de bovino (Worthington Diagnostics System Inc., Freehold, NJ, EUA). Dissolveu-se a proteína liofilizada em 4 ml de bicabornato de amónio O,1M e adicionou-se mais 90 ^ug de tripsina. Decorridas 5 horas de incubação a 37°C a proteína estava novamente liofilizada. Dissolveu-se o produto da digestão tríptica com ãcido trifluoroacético a 0,1% (2 mg/ml). Efectuou-se a cromatografia de 300 jig de LESB tratada com tripsina por CLAP utilizando uma coluna C-18 de fase inversa e eluíu-se com um gradiente de 0-50% de acetonitrilo em ãcido trifluoroacético a 0,01%. Monitorizou-se o péptido recolhido, registando continuamente a absorvência até 215 nm. Os péptidos que se pretendiam sequenciar foram posteriormente purificados por nova cromatografia utilizando a mesma coluna com gradiente ajustados. Secaram-se as amostras dos fragmentos peptídicos que se pretendiam sequenciar, em atmosfera de azoto, para se eliminar o acetonitrilo e aplicaram-se no sequenciador. Para a anãlise sequencial N-terminal, dissolveu-se a LESB nativa em ãcido acético a 0,1%. Efectuaram-se as análises de sequenciação num sequenciador de fase líquida com impulsos de 477A da Applied Biosystems Inc. e num analisador PTH 120A em linha com programas de ciclo regular e utilizando os produtos químicos fornecidos pelo fabricante. Os rendimentos iniciais e repetitivos, calculados a partir de uma proteína normalizada sequenciada, a β -lactoglobulina foram respectivamente de 47% e 97%.

C. Isolamento da ARN

Obtiveram-se as amostras dos tecidos adiposos pancreãtlcos e da glândula mamaria humanos em período de lactação por cirurgia e colocaram-se imediatamente em tiocionato de guanidínio (1-5 g em 50 ml). Extraíu-se o ARN total tal como descrito por Chirgwin /*20 J7. Preparou-se o poli (A)-ARN por eromatografia numa coluna de oligo-desoxitimidilato-(oligo(DT)-celulose

D. Construção e rastreio de bibliotecas de cADN

Desnaturaram-se aproximadamente 15 jig de ARN Poli-adenilato do pâncreas humano com hidróxido de mercúrio de metilo ^22/ e prepararam-se com preparadores oligo (dT)^2-18 (Pharmacia, Uppsala, Suécia) e efectuou-se a transcrição inversa utilizando procedimentos normalizados / 23 7· Efectuou-se a síntese da segunda estirpe de acordo com Gubler e Hoffman £ 24 J, com excepção de se ter omitido a ADN-ligase e ^-NAD e a temperatura de reacção ter sido 15°C. Digeriu-se o excesso de ARN com ARNase A (50 jig/ml) e tratou-se o cADN de estirpe dupla com EcoRI-metilase 7 257. Complementarizaram-se as extremidades com o enzima de Klenow. Após ligação aos ligantes de EcoRI e clivagem com EcoRI, fraccionou-se o cADN numa coluna de sefarose 4B-C1. Precipitou-se a fracção de volume nulo no seio de etanol e ligou-se o cADN no sítio EcoRI do vector gtll tratado com fosfatase 7 26 7· θ embalamento in vitro rendeu mais do que 7x10 recombinantes.

Adquiriu-se uma biblioteca de cADN a partir da glândula mamaria humana derivada dos tecidos obtidos de mulheres no oitavo mês de gravidez (Clontech Laboratories; Inc., Paio Alto, CA; EUA).

'18

Colocaram-se os bacteriõfagos da biblioteca de cADN em 4

5x10 unidades de formaçao de placas por disco de 120 mm. Diluiuse o anti-soro numa proporção de 1:3200 e efectuou-se o rastreio de acordo com Young e Davis Utilizaram-se anticorpos de cabra em anti-coelho-conjugados-com-fosfatase-alcalina como anticorpos secundários (Bio-Rad, Richmond, CA EUA). Para se isolarem os clones correspondentes à extremidade 5’ do mARN, efectuou-se a hibridização do ácido nucleico em condições normalizadas £ 23 J utilizando um fragmento subclonado de um dos clones imunologicamente positivos, como uma sonda.

E. Análise do ARN

Efectuou-se a electroforese num gel de agarose a 1% em tampão MOPS 40 mM, a pH 7,0, após desnaturação com glioxal e sulfόχι do de dimetilo /”28 Transferiu-se depois o ARN-total glioxilado para filtros de nitrocelulose / 29 J?. Sondaram-se as manchas com subclones de LESB e com recombinantes de HEC que se tinham marcado de acordo com a técnica de oligo-marcação radioactiva £ 30 _7. Efectuou-se a prê-hibridização e a hibridização com formamida a 50% a 46°C £ 23 J⁷. Efectuaram-se as lavagens de põs-hibridização com um rigor bastante elevado (SDS 0,1% e 0,lxSSC a 60°C). (lxSSC, NaCl 0,5M, citrato de Na^ 0,0015M, a pH 7,6).

F. Sequência nucleotídica

Clonaram-se as inserções de cADN a partir dos recombinantes de LESB e de HEC quer directamente em M3mpl8 e mpl9 após tratamento com ultrassons e fraccionamento ou subclonaram-se posteriorrnente alguns

deles em pTZl9R após digestão com PstI, BstXI, NarI, Smal e Ahalí. Determinou-se a sequência nucleotídica de acordo com o método de terminação da cadeia didesoxi £ 31 J7. Também se sequenciaram as re ~ 7 petições ricas em GC com polimerase de Taql e com dc GTP. (Ver em seguida). Sequenciaram-se ambos os cordões. Recuperou-se a informação sequencial a partir de auto-radiogramas utilizando o software M5-EdSeq tal como descrito por SjÕberg e outros Z55?.

G. Sequências aminoãcidas previsões e homologias

Para se prever a sequência aminoãcida correspondente as inserções de cADN, comparou-se a utilização do codão de diferentes sequências de transcrição de acordo com Staden e obteve-se uma sequência de transcrição aberta £ 32 £. Pesquisaram-se as homologias com os programas do package de Software de UWGCG ^*33 £.

Resultados e discussão

A. Sequências de fragmentos tripticos e da extremidade-N de LESB

A digestão por tripsina de LESB purificada originou aproximadamente 50 fragmentos que se calcularam de acordo com o número de picos obtidos durante a cromatografia por CLAP (fig. I). Recolheram-se os picos e os picos indicados que puderam ser isolados num estado de purificação elevado e em quantidades razoáveis foram sequenciados. Indicam-se no quadro I as sequências resultantes. Para além disso, sequenciaram-se os 30 resíduos N-terminal maiores (fig. II) e confirmou-se a sequência anteriormente referida por Abouakil e outros (30 resíduos) £ Y1 £.

Na presente invenção, os 22 resíduos da sequência N-terminal referidos por Wang & Johnson consistem numa glicina e numa lisina nas referências de Wang & Johnson.

B. Sequência nucleotídica de LESB

Para a construção da biblioteca de cADN de p^gtll utilizou-se ARN poliadenilado do pâncreas humano. Inicialmente isolaram-se quatro clones imunologicamente positivos e depois efectuou-se o rastreio dessa biblioteca de cADN de expressão pancreãtica com anti-soro contra LESB. A análise da sequência nucleotídica dos quatro clones indicou que estes se encontravam em perfeita concordância e correspondência com a extremidade 3' do mARN. Iniciavam-se todos com uma extremidade poli A e diferiam apenas no comprimento; a inserção mais longa, que se designou por ACEH, possuía uma extensão de 996 pb.

Efectuou-se o rastreio de uma biblioteca de cADN da glândula mamária humana com anti-soro e utilizou-se o clone ACEH do pâncreas como uma sonda. Isolaram-se os clones positivos em ambos os rastreios e verificou-se que todos eles tinham início numa extremidade-3*. 0 clone mais comprido da glândula mamária que se originou por ABSSL atingia 2100 pb a montante. Continha quatro dos fragmentos trípticos sequenciados (fig. II) mas não incluia sequência aminoãcida N-terminal. Para se prolongar a sequência para além do início da transferência, voltou a efectuar-se o rastreio da biblioteca de cADN da glândula mamária com uma sonda com uma extensão de 118 bases derivada da parte mais próximal da extremidade 5’ da ABSSL. Isolou-se um clone que se prolongou durante mais 328 nucleotidos a montante. Assemelhava-se â sequência aminoãcida da extremidade-N e continha o

restante fragmento tríptico. Tal como se indica na fig. II, o cADN possui uma extensão de 2428 nucleótidos e contêm 81 bases a montante do primeiro codão ATG. 0 sinal de poliadenilação, AATAAA localizava-se 13 nucleótidos a montante do prolongamento poli A e o codão de terminação TAG encontrava-se localizado no nucleotido 2317 seguido de uma região 3'-não transferida, de 112 pb.

Descobriu-se uma região rica em GC que consistia em 16 repetições de 33 bases na extremidade 3’ da sequência que se encontrava entre a base 1756 e a base 2283. A sequência nucleotidica da repetição, indicada na fig. III, consistia em seis repetições idênticas rodeadas por dez repetições com diferente número de substituições que tinham ocorrido provavelmente após diversas duplicações. 0 baixo número de substituições sugeria que estas repetições tinham aparecido mais tarde durante o período de evolução.

C. Destribuição tecidular da expressão

Analisou-se o ARN das glândulas mamárias humanas em lactação, do pâncreas, do tecido adiposo e da celina doihepatoma humano (HepG2) por análise da mancha de Northern. Determinou-se que a extensão do ARN mensageiro era aproximadamente de 2,5 kb em ambas as glândulas mamárias em lactação e no pâncreas. Não se detectou qualquer sinal nas calhas com ARN extraído de HepG2 ou do tecido adiposo (fig. IV).

Uma vez que o rnARN utilizado para a biblioteca da glândula mamária tinha sido obtido a partir de uma mulher no seu 8- mês de gravidez, é evidente que a transcrição e provavelmente a transferência do gene de LESB se tinha efectuado antes do parto, o que se encontrava em concordância com descobertas anteriores sob a secreção de LESB antes do parto £ 35 J. Ver figura IV.

D. Sequência aminoãcida de LESB

Por análise SDS-PAGE estabeleceu-se que a massa molecular, tal como se tinha referido, era de 107-125 kDa /”8,36 J e por ultracentrifugação analítica era de 105 kDa /”37 }. O enzima, tal como se deduziu a partir do cADN, consistia em 722 resíduos aminoácidos (fig. II), o que, dando uma massa molecular de 76 271 Da, indicava que o enzima continha pelo menos 15-20% de hidratos de carbono. A sequência principal tinha um comprimento de 23 resíduos. Um sítio activo experimental do resíduo de serina localiza-se no resíduo serina-217 (fig. V). A sequência em redor deste resíduo de serina está de acordo com a sequência de consenso de sítio activo das serino-hidrolases f 38 J. Pôs-se recentemente a hipótese de que os resíduos básicos encontrados próximo do sítio activo de serina pudessem encontrar-se envolvidos na clivagem das ligações éster nos acilgliceróis pelas lipases £ 39 J⁷. É interessante verificar que tais resíduos não se encontram presentes em LESB. O único sítio experimental de N-glicosilação encontra-se localizado em apenas sete resíduos de serina.

O grau de glicosilação /”6,16 J sugere que o enzima contém hidratos de carbono ligados por oxigénio. Existem numerosos sítios em que pode ter ocorrido tal glicosilação. A composição aminoãcida com base nos enzimas purificados demonstrou um alto teor de resíduos de prolina /* 6 J⁷. A sequência aminoãcida obtida a partir do cADN confirma esta hipótese. Para além disso, a maioria dos resíduos de prolina encontra-se localizada nas 16 repetições, cada uma delas com 11 resíduos, que constitui a parte principal da metade C-terminal do enzima.

E. Comparação dos enzimas na glândula mamária (LESB)

e no pâncreas (HEC)

Demonstrou-se anteriormente que a LESB do leite humano e a HEC do pâncreas humano eram semelhantes senão idênticas. Os dados actuais sugerem fortemente que os dois enzimas são produtos do mesmo gene. A sequência nucleotídica dos clones de cADN indica que o clone pancreãtico ACEH ê idêntico ao clone ABSSL da glândula mamária desde a extremidade poli A e 996 bases para álém da extremidade 5’, incluindo a sequência que codifica as repetições ricas em prolina. A análise da mancha de Northen mostra uma única banda de 2,5 kb do ARN do pâncreas e da glândula mamária em lactação (fig. IV). As manchas genõmicas da análise Southern reforçam ainda mais a ideia de que ape nas um gene codifica LESB e HEC. A diferença na mobilidade na análise SDS-PAGE entre LESB e HEC pode ser explicada com uma consequência de diferentes glicosilações ou de diferentes uniões.

A similaridade de LESB com os enzimas das ratazanas e dos bovinos (ver adiante) e com os resultados obtidos a partir de manchas genõmicas, reforçam a possibilidade de que diferentes uniões não podem contribuir para a diferença de mobilidade. Uma vez que a sequêncial C-terminal não foi confirmada ao nível das proteínas, existe uma possibilidade muito pequena de que HEC possa ser tratado por remoção proteolítica da extremidade C-terminal.

Tanto quanto se sabe, os enzimas pancreãticos que correspondem obviamente a HEC foram muitas vezes designados consoante a es pécie e o substrato em particular que se utilizou para determinar as suas actividades respectivas; lisofosfolipase, colesterilestearase, esterol-êster-hidrolase, lipase não específica, lipase de éster carboxílico e hidrolase do éster cloresterílico. Os dados disponíveis

são compatíveis com o ponto de vista de que todas estas actividades descritas são originadas numa e única entidade funcional /**42,43 J⁷. Estes dados ilustram a ampla especificidade de substratos e a relevância da designação destes enzimas como lipases não específicas. Quando se compara a sequência de LESB/HEC humanas com a sequência da lisofosfolipase do pâncreas gordo /* 40 J e com colesterol-estearase do pâncreas de bovino /*41^7, descobrem-se grandes similaridades que se estendem ao longo de aproximadamente 530 resíduos desde a extremidade N-terminal (fig. V); mas diferem na parte da molécula em que surgem as repetições. O enzima de ratazana possui apenas quatro repetições e o enzima de bovino apenas três. 0 enzima humano ê, portanto, um péptido consideravelmente mais longo.

Para além disto, descobriram-se similaridades ou semelhanças espantosas entre LESB e diversas estearases típicas, como por exemplo a acetil-colina estearase de diversas espécies, incluindo o homem e a Drosofila e as carboxil-esterases (fig. VI). Estas semelhanças limitavam-se aos 300 resíduos N-terminais de LESB que inclui o sítio activo experimental do resíduo activo de serina. Previu-se a semelhança com a acetilcolina-estearase a partir do facto de LESB ser inibida pelos inibidores típicos da colino-esterase /”6, 8, 16J. Com possível excepção para a carboxil-esterase do fígado de ratazana /45 7, nenhum destes enzimas semelhantes demonstrou possuir a mesma dependência em relação aos sais biliares que LESB possui; isto sugere que a base estrutural para esta propriedade reside na proporção C-terminal da proteína. Para além disso, LESB pode atacar de um modo eficaz substratos emulsifiçados o que não constitui uma característica conhecida de esterases idênticas. Para se verificar esta actividade, os sais biliares constituem um requesito prévio.

Comparou-se a sequência previsível para a LESB humana com outras lipases de mamíferos bem caracterizadas. Com excepção da sequência de consenso em redor do sítio activo de serina (G-X-S-X-G), não se descobriram quaisquer semelhanças óbvias / 44 ].

Para além das semelhanças com outros enzimas, existem também outras semelhanças significativas com uma proteína dependente de c-AMP de Dictyostelium discoideum / 46 J assim como a tiroglobulina de diversas espécies (fig. VI) /47-49 /. As semelhanças entre a LESB e a tiroglobulina que engloba a região do sítio activo mas não o próprio sítio activo, indicam que estas sequências altamente conservadas de aminoãcidos possuem uma importância mais generalizada do que a de suportarem meramente a actividade enzimãtica das esterases.

Em conclusão, a LESB do leite humano consiste em 722 resíduos aminoãcidos. Os dados disponíveis indicam de modo muito consistente que esta cadeia peptídica ê idêntica â cadeia peptídica de HEC pancreãtico e que são codificadas pelo mesmo gene. A evidência mais forte reside no facto das sequências nucleotídicas das suas extremidades 3 e das suas sequências aminoacidas N-terminais serem idênticas. As espantosas homologias descobertas com as lidofosfolipases pancreãticas de ratazana e com a colesterol-esterq.se pancreãtica de bovino reforçam a hipótese de que também estes enzimas são funcionalmente idênticos. No entanto, tal como se sugeriu, as diferentes dimensões das moléculas descobertas entre as espécies não são devidas a diferenças meramente existentes na glicosilação; reflectem em vez disso um número variável de uma repetição de onze aminoãcidos. A semelhança da sequência do sítio activo entre estas esterases sugere que estas proteínas derivam de um gene ancestral comum.

No que se refere ãs figuras I-VII, fornecem-se as seguintes legendas:

2.

Figura I; Separação do produto da digestão tríptica de LESB por CLAR

Tratou-se LESB purificada com tripsina e efectuou-se a sua cromatografia por CLAR tal como descrito nos Materiais e Métodos. Recolheram-se os picos indicados e purificaram-se posteriormente efectuando uma nova cromatografia e determinou-se a sua sequência aminoãcida.

Figura II: Sequência nucleotídica do cADN e sequência aminoácida deduzida da lipase estimulada pelos sais biliares humanos:

cADN possuía 2428 bases de comprimento. A sequência N-terminal de 23 codoes (nt82-150) com início no codão ATG, foi interpretada como um péptido principal uma vez que a sequência aminoãclda da extremidade-N da proteína madura se iniciava no codão 24 (nt 151 Ala). 0 péptido principal encontra-se sublinhado. 0 símbolo * indica o ponto de partida de um exão. 0 símbolo indica o ponto da partida da parte de repetição.

Figura III: Sequência nucleotídica das repetições ricas em GC C-terminais na lipase estimulada pelos sais biliares:

Indicam-se as substituições com o símbolo *.

Figura IV; Hibridização da mancha de Northern

Análise da mancha de Northern do ARN total isolado a partir da glândula mamária humana em lactação, do pâncreas, do tecido adiposo

V e da linha celular do hepatoma humano (HepG2). Efectuou-se a electroforese do ARN total (10 jug) da glândula mamária humana em lactação (pista A), do pâncreas (pista Β) , do tecido adiposo (pista C) e de HepG2 (pista D) num gel de agarose a 1% em tampão MOPS 40mM, a pH 7,0, apos desnaturação do ARN em glioxal 1M, sulfoxido de dimetilo a 50% e MOPS 40 mM. Transferiu-se depois o ARN glioxilado para papel de nitrocelulose para hibridizaçao com cADN de LESB com £ P J (ABSSL).

Figura V: Comparação da sequência aminoãcida deduzida de LESB do leite humano, da llscfosfolipase pancreática de ratazana (Ratipl) / 40/ e da colesterol-estearase pancreãtica de bovino (Bovceh) 41 J⁷;

Os resíduos de serina envolvidos no sítio activo são indicados pelo símbolo *, e o símbolo indica o único sinal possível de N-glicosilação da proteína. As repetições directas das sequências aminoãcidas encontram-se envolvidas por uma esquadria. As sequências de união encontram-se salientadas por letras maiusculas, as sequências de união de dois enzimas são indicadas por letras minúsculas e as sequências qúe representam uniões sem êxito encontram-se indicadas por um ponto.

Figura VI; Comparação da estrutura primária de LESB com outras esterases, tioroglobulina e com um enzima dependente de c-AMP a partir de Dictyostelium discoideum:

LESB: lipase humana estimulada pelos sais biliares;

Cheshum: colinesterase de tecido de feto humano /507; Torpace: acetilcolino-esterase do Torpedo marmorata /51/; Drosceh: hidro2 lase de éster carboxílico da Drosophila malaogaster £ 52 J;

Ratlivce: esterase carboxílica do fígado de ratazana /”53

Drosace: acetilcolino-esterase da Drosophila melaogaster ^54 ;

Thyrhum: tiroglobulina de seres humanos 49} e Dict.Di: enzima dependente de c-AMP de Dictyostelium discoideum 46 J. Existem 7 domínios diferentes que apresentam semelhanças entre os enzimas.

Os resíduos que são idênticos encontram-se rodeados por uma esquadria e as letras minúsculas na sequência de consenso indicam resíduos idên ticos em todos os enzimas excepto um. Os pontos indicam uniões mal sucedidas. 0 resíduo de serina envolvido no sítio activo encontra-se indicado por um *. A figura que se encontra no canto direito indica a orientação dos domínios.

Figura VII:

proporciona a sequência aminoãcida 1-722 da proteína total (código de uma letra) e indica os exões a, b, c, e d. 0 símbolo indica o ponto de iniciação da porção de repetição.

Quadro 1. Sequência aminoãcida dos péptidos de LESB

Devido aos picos de interferência, não foi possível efectu/ ar-se a identificação positiva dos resíduos nos ciclos 1 e 2 da fase de sequenciaçao no pêptido número 26. Qs números dos péptidos referem-se aos picos da fig. I.

Fragmentos trípticos

TP16:LysValThrGluGluAspPheTyrLys TP19:GlylleProPheAlaAlaProThrLys Tp20:LeuValSerGluPheThrlleThrLys TP24:ThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg TP26:PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp

ProSerGlnGluAsnLys

Quadro 2: Identificação dos exÕes a, b, c e d que se encontram numerados tal como nas figuras II e VII.

exão	Localização
	entre os nucleotidos números:	entre os aminoácidos números:

a	986-1172	279-341
b	1173-1376	342-409
c	1377-1574	410-474
d	1575-2415	475-722
proteína completa	151-2316	1-722
proteína completa excluindo o número de repetições	151-1755	1-535

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de proteínas com a sequência indicada a seguir,

10 ' 30 50

AKLGAVYTEGGFVEGVNKXLGLLGDSVDIFKGIPFAAPTXALENPQPHPGWQGTLKAXNF

70 90 110

KXRCLQATITQDSTYGDEDCLYLNIWVPQGRXQVSRDLPVMIWIYGGAFLMGSGHGANFL

130 150 170

NNYLYIGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNYGLRDQHMAIAWVXRNIAA

190 210 230

FGGDFNNITLFGZSAGGASVSLQTLSFYNKGLIRKAI5QSGVAL5FWVIQKNPLFWAKXV

250 270 290

AEKVGCPVGDAARMAQCLXVTDPRALTLAYKVPLAGLEYPMLHYVGFVFVIDGDFIPADP -sxo n-a310 330 350

INLYANAADIDYIAGTNNJÍDGHIFASIDMPAINKGNKXVT2EDFYKLVS2FTITKGLRGA

370

390

410

KTTFDYYTESWAQDPSQENKXXTWDFETDVLFLVFTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSH —' sxon. b — ^{1 111} — 430

450

470

PSRMP7YPKWVGADHADDIQYVFGKPFATPTGYRPQDRTVSRAMIAYWTNFAXTGDPNMG - sxon c—-*——

490 510 530

DSAGPTHWFPYTTENSGYLEITKXMGSSSMKRSLRTNFLRYWTLTYLALPTVTDQEATPV —ⁿⁱ - n., — exon d ^{1 1} — ι·— — —

550 570 590

PPTGDSZAT?V??TGDSETAPVP?TGDSGAPPV?PTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGD

510 630 650

SGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDAGPPPVPPTGDSGAP?

670 690 710

V? PTGI S GA? P VTPTGDS ETA? V? PTGDS GAP PV? PTGDS Ξ AA? V? PTDDSXZAQMPAVI

RF desde a posição 1 até â posição 722, caracterizado pelo facto de se desenvolver um organismo hospedeiro contendo um vector apropriado e de se isolar a proteína.
2. - Processo de acordo terizado pelo facto de se obter uma dicada antes, desde a posição 1 até
3. - Processo de acordo terizado pelo facto de se obter uma dicada antes, desde a posição 1 até
4. - Processo de acordo terizado pelo facto de se obter uma dicada antes, desde a posição 1 até
5. - Processo de acordo terizado pelo facto de se obter uma dicada antes, desde a posição 1 até
6. - Processo de acordo terizado pelo facto de se obter uma dicada antes, desde a posição 1 até
7. - Processo de acordo terizado pelo facto de se obter uma com a reivindicação 1, carac proteína com a sequência inà posição 535.

com a reivindicação 1, carac proteína com a sequência inà posição 278.

com a reivindicação 1, carac proteína com a sequência inã posição 341.

com a reivindicação 1, carac proteína com a sequência inà posição 409.

com a reivindicação 1, carac proteína com a sequência inã posição 474.

com a reivindicação 1, carac proteína com a sequência in- dicada antes, desde a posição 1 à posição 278, da posição 279 até à posição 341, da posição 279 até ã posição 409, da posição 279 até ã posição 474, da posição 342 até à posição 409, da posição 342 até à posição 409, da posição 342 até à posição 474 ou da posição 536 até à posição 722.
8.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se ccsiibinar.ainda a proteína obtida com uma ou mais das repetições de acordo com a sequência seguinte:

1 50

Conaacaaa ·*

Baal

XatipL

Beveah

... ,pl... .l^Lzcalaaa.aAAXLGavYrSGGPYBGVHKXLalJ.G.DSVDIJXGiPÍAa.. .Xai2aP^r2?®JQG71XUt.?mC31QÀTiSqDaTXG

201 250 f *

Saal HIAAPCCDPMlilTUGZSAGGASVSI Sitiai HlAiPGGOPOHITi?G2SAGGA17SI èovcah HLZAPGCOPDHITUGSSAGGASVSI

Coaaanaaa HlaAJGGSPdHXTlPOZS AGGAsVSLQTLSr!SXGLIrS*ISQSG7*La?V»IQ. aPLPWAX. ÍAkCTGCPv. DtaklíAgClXiTDPRALTLAISlPL. a

301

350

3sal

Satlol

Bovcãh

Coaaanaua .ST? ..¹.Sr-.?'7?ViDGD?I?dDPiHLTaHAADíOTiAGcHdljDG313a. .Dv?Al2k.kqdTOZi>nkL7Sg.T7tS5L:Ga.*TfdvTrSs«AQI>pS

401

450

Baal 0Sl.Xtrr?ZBi’2TByL?L7?T2LUAQffl._______________—

Sitiai feSSXTWjJET:·! : JLlZTSMAÍÃeaÃSAXSAmSIUSSs SHPTYPZSKIADEADD.

Sovcali Q^Ol^OÚ2TDXXJI.I?IXÍ2?AQSSBAXSAinTni2SQPSSlíPn?lSl£AflEAOD:

Coaseasaa QEa. ESW.j· STBiLZIiPTeiAlAQfcaUXSAXn .II3ShPSSlí?tZ?33fsGADEADDlQTV7GS?’ÀT?lGZSaQDST7SSAliIATffni7AktGD i!V?GK?ZATSTGlSP0DST7SSAMIAWra?AXTGD ZGSPZATPlGISAÕpSTVSXAMIAWraZAXSGD ^GEPZATPLGTSAÕDST/SSAMIAràTlíZASTGD

501

550

KATPYPPTSOS

VGDETPPZDDS gasllppsdns

ZATPVPPTGDS IZTAPVPPTGOS KAAPVSPTBDS QGGPVPPTDDS QASPVPPADNS GAPTZPSAGDS

IHIQlfDSHSi£SL3LS12iZLQZWTÕi?QAL2T7rSÀ.

Conaanaua PlfBG.S.TPti^.prr.Za.alLalaSa.S.SMr.hlStafL.fWt.Ty.aLPr?:. .PPsddS.aA.PVPPtddS... .ovPatgDS

600

Consenaua

GAP?

QTT?

645

Baal

Sitiai

Bovcah

691

3sal

Satlol

3ovcãh

GO:

GaPP^TPTG.SS ZTAPVPPTGDS

736

GAPPYPPTGDS 2AAPVPPT3DS ........GDS

..... ^J

X2.ACHPAVI27

VZ.aCHPGPIGP •ZVAÇHPVTIGZ

Coaaanaaa da..a.AÇMP.vIg?

.¾
9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de a proteína obtida possuir metionina como aminoãcido adicional na extremidade N.
10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de a proteína obtida apre sentar uma ou várias das funções críticas da lipase natural, estimulada pelos sais biliares.
11. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 9 caracterizado pelo facto de se obter uma variante ou mutante fun cionalmente equivalente a uma qualquer das citadas proteínas.
12. - Sequência de ADN, caracterizada pelo facto de codificar uma proteína que possua a sequência de aminoácidos de acordo com a reivindicação 1.
13. - Sequência de ADN, caracterizada pelo facto de codificar uma proteína que possua uma sequência de aminoácidos de acordo com a reivindicação 2.
14. - Sequência de ADN, caracterizado pelo facto de codificar uma proteína que possua a sequência de aminoácidos de acordo com uma qualquer das reivindicações 3,4,5,6,7,8,9, 10 e

11.

k
15.- Sequência de ADN, caracterizada pelo facto de ser definida pelos nucleotidos com os seguintes números:

151 -2316

151 -1755

151 -985

151 -1172

151 -1376

151 -1574

986 -1172

986 -1376

986 -1574

1173-1376

1173-1574 na sequência que se indica a seguir:

10 30 50

ÀCCTTCTGTATCAGTTAAGTGTCAAGATGGAAGGAACAQCAGTCTCAAGATAATGCAAAG

70 90 110

AGTTTATTCATCCAGAGGCTGATGCTCACCATGGGGCGCCTGCAACTGGTTGTGTTGGGC

MetLeuThrMetGlyArgLeuGlnLeuValValLeuGly

130 150 170

CTCACCTGCTGCTGGGCAGTGGCGAGTGCCGCGAAGCTGGGCGCCGTGTACACAGAAGGT

LsuThrCysCysTrpAlaValAlaSerAlaAlaLysLeuGlyAlaValTyrThrGluGly

190 210 ' 230

GGGTTCGTGGAAGGCGTCAATAAGAAGCTCGGCCTCCTGGGTGACTCTGTGGACATCTTC GlyPhsValGluGlyValAsnLysLysLeuGlyLeuLeuGlyAspSerValAspIlePhe

250 270 290

AAGGGCATCCCCTTCGCAGCTCCCACCAAGGCCCTGGAAAATCCTCAGCCACATCCTGGC

LysGlylieProPbeAlaAlaProThrLysAlaLeuGluAsnProGlnProHísProGly

310 330 350

TGGCAÀGGGACCCTGAAGGCCAAGAACTTCAAGAAGAGATGCCTGCAGGCCACCATCACC

TrpGinGlyThrLeuLysAlaLysAsnPheLysLysArgCysLeuGlnAlaThrlleThr

370 390 410

CAGGACAGCACCTACGGGGATGAAGACTGCCTGTACCTCAACATTTGGGTGCCCCAGGGC

GlnAspSerThrTyrGlyAspGluAspCysLeuTyrLeuAsnlleTrpVaiPrcGlnGly

430 450 470

AGGAAGCAAGTCTCCCGGGACCTGCCCGT7ATGATCTGGATCTATGGAGGCGCCTTCCTC

ArgLysGlnValSerAxgAspLeuProValMetlleTrpIleTyrGlyGlyAiaPheLeu 490 510 530

ATGGGGTCCGGCCATGGGGCCAACTTCCTCAACAACTACCTG7ATGACGGCGAGGAGATC

MetGIyGsrGlyHisGiyAlaAsnPheLeuAsnAsnTyrLeuTyrAspGlyGiuGluIle

Í39550 570 590

GCCACACGCGGAAACGTCATCGTGGTCACCTTCAACTACCGTGTCGGCCCCCTTGGGTTC

AlaThrArgGlyAsnValIleValValThrPheAsnTyrArgValGlyProLeuGlyPhe

610 630 650

CTCAGCACTGGGGACGCCAATCTGCCAGGTAACTATGGCCTTCGGGATCAGCACATGGCC

LeuSerThrGlyAspÀlaAsnLeuProGlyAsnTyrGlyLeuArgAspGlnHisMetAla

670 690 710

ATTGCTTGGGTGAAGAGGAATATCGCGGCCTTCGGGGGGGACCCCAACAACATCACGCTC

IleAlaTrpValLysArgAsnlleAlaAlaPheGlyGlyAspProAsnAsnlieThrLeu

730 750 770

TTCGGGGAGTCTGCTGGAGGTGCCAGCGTCTCTCTGCAGACCCTCTCCCCCTACAACAAG

PheGIyGluSerAlaGlyGlyAlaSerValSerLeuGlnThrLeuSerProTyrAsnLys

790 810 830

GGCCTCATCCGGCGAGCCATCAGCCAGAGCGGCGTGGCCCTGAGTCCCTGGGTCA7CCAG

GlyLeuIleArgArgAlalleSerGlnSerGlyValAlaLeuSerProTrpValIleGln

850 870 890

AÀAAACCCACTCTTCTGGGCCAAAAAGGTGGCTGAGAAGGTGGGTTGCCCTGTGGGTGAT

LysAsnProLeuPheTrpAlaLysLysValAlaGluLysValGlyCysProValGlyAsp

910 930 950

GCCGCCAGGATGGCCCAGTGTCTGAAGGTTACTGATCCCCGAGCCCTGACGCTGGCCTAT

AlaAlaArgMetAlaGlaCysLeuLysValThrAspPrcArgAlaLeuThrLeuAlaTyr

970 990 1010 *

AAGGTGCCGCTGGCAGGCCTGGAGTACCCCATGCTGCACTATGTGGGCTTCGTCCCTGTC LysValProLeuAlaGlyLeuGluTyrProMetLeuHí sTyrValGlyPheValProVal

1030 1050 1070

ATTGATGGAGÂCTTCATCCCCGCTGACCCGATCAACCTGTACGCCAACGCCGCCGACATC

IleAspGlyAspPhelleProAlaAspProIleAsnLeuTyrÀlaAsnAlaAlaAsplie

1090 1110 113Q

GACTATATAGCAGGCACCAACAACATGGACGGCCACATCTTCGCCAGCATCGACATGCCT

AspTyrIleAlaGlyThrAsnAsnMetA5pGl·yHisIlePheAlaSerIl^AspHetPro

1150 1170 1190 *

GCCATCAACAAGGGCAACAAGAAAGTCACGGAGGAGGACTTCTACAAGCTGGTCAGTGAG

AlalleAsnLysGlyAsnLysLysValThrGluGluAspPheTyrLysLeuValSerGlu

1210 1230 1250

TTCACAATCACCAAGGGGCTCAGAGGCGCCAAGACGACCTTTGATGTCTÂCACCGAGTCC

PheThrlleThrLysGlyLeuArgGlyAiaLysThrThrPheAspValTyrThrGluSer

1270 1290 1310

TGGGCCCAGGACCCATCCCAGGAGAATAAGAAGAAGACTGTGGTGGACTTTGAGACCGAT

TrpAlaGlnAspProSerGlnGluAsnLysLysLysThrValValAspPheGluThrAsp

1330 1350 _ 1370 »

GTCCTCTTCCTGGTGCCCACCGAGATTGCCCTAGCCCAGCACAGAGCCAATGCCAAGAGT

VaiLeuPheLeuValProThrGluIleAiaLeuAIaGlnHisArgAlaAsnAlaLysSer

1390 1410 1430

GCCAAGACCTACGCCTACCTGTTTTCCCATCCCTCTCGGATGCCCGTCTACCCCAAATGG

AlaLysThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArgMetProValTyrProLysTrp

1450 1470 1490

GTGGGGGCCGACCATGCAGATGACATTCAGTACGTTTTCGGGAAGCCCTTCGCCACCCCC

ValGlyAlaAspHisAlaAspAspIÍ BGlriTyrValPheGlyLysProPheAlaThrPro 1510 1530 1550

ACGGGCTACCGGCCCCAAGACAGGACAGTCTCTAAGGCCATGATCGCCTACTGGACCAAC

ThrGlyTyrArgProGlnAspArgThrValSerLvsAlaMetlleAlaTyrTrpThrAsn

1570 1590 1610 *

TTTGCCAAAACAGGGGACCCCAACATGGGCCACTCGGCTGTGCCCACACACTGGGAACCC

PheAiaLysThrGlyAspProAsnMetGlyAspSerAiaVaiProThrHísTrpGiuPro

11630 1650 1670

TACACTACGGAAAACAGGGGCTACCTGGAGATCACCAAGAAGATGGGCAGCAGCTCCATG

TyrThrThrGluAsnSerGlyTyrLeuGluIleThrLysLysHetGiySerSerSerMet

1690 1710 1730

AAGCGGAGCCTGAGAACCAACTTCCTGCGCTACTGGACCCTCACCTATCTGGCGCTGCCC

LysArgSerLeuArgThrAsnPheLauArgTyrTrpThrLeuThxTyrLeuAlaLauPro

1750 1770 1790

ACAGTGACCGACCAGGAGGCCACCCCTGTGCCCCCCACAGGGGACTCCGAGGCCACTCCC

ThrYalThrAspGlnGluAlaThrProValProProThrGlyAspSerGluAlaThrPro

1810 1830 1850

GTGCCCCCCÀCGGGTGACTCCGAGACCGCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGGGCC

ValProProThrGlyAspSerGluThrAlaProValProProThrGlyAspSerGlyAla

1870 1890 1910

CCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC

ProProValProProThrGlyAspSerGlyAlaProPrcValProProThrGlyAspSer

1930 1950 1970

GGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGT

GlyAlaProProValProProThrGlyAspSerGlyAlaProFroValProProThrGly

1990 2010 2030

GACTCCGGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGGGCCCCCCCCGTGCCGCCC AspSerGlyAlaProProValProProThrGlyAspSerGiyAJ aProProValProPro

2050 2070 2090

ACGGGTGACTCCGGCGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACGCCGGGCCCCCCCCCGTG

ThrGlyAspSerGlyAlaProProValProProThrGIyAspAlaGlyProFroProVai

2110 2130 2150

CCGCCCACGGGTGACTCCGGCGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGGGCCCCC

ProProThrGlyAspSerGlyAlaProProYal?ro?ro7hrGiyAsp5erGlyAla?ro

2170 2190 2210

CCCGTGACCCCCACGGGTGACTCCGAGACCGCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGG

ProValThrProThrGlyAspSerGluThrAlaProValProProThrGlyAspSerGly

2230 2250 2270

GCCCCCCCTGTGCCCCCCACGGGTGACTCTGAGGCTGCCCCTGTGCCCCCCACAGATGAC

AlaProProValProProThrGlyAspSerGluAlaAlaProValProProThrAspAsp

2290 2310 2330

TCCÃAGGAÀGCTCAGATGCCTGCAGTCATTAGGTTTTAGCGTCCCATGÀGCCTTGGTATC

SerLysGluAlaGlnMetProAlaValIleArgPhe

2350 2370 2390

AAGAGGCCACAAGAGTGGGACCCCAGGGGCTCCCCTCCCATCTTGAGCTCTTCCTGAATA

2410

AAGCCTCATACCCCTAAAAAAAAAAAAA
16. - Vector, caracterizado pelo facto de ser constituído por uma sequência de ADN que. codifica uma proteína de acordo com as reivindicações 1 a 11.
17. - Vector, caracterizado pelo facto de ser constituído por uma sequência de ADN de acordo com as reivindicações 12 a 15.
18. - Organismo hospedeiro, caracterizado pelo facto de ser transformado com um vector de acordo com as reivindicações 16 ou 17.
19. - Processo para a preparação ce uma composição far macêutica apropriada para o tratamento de uma situação patológica associada a insuficiência pancreática exócrina, para o tratamento de fibrose cística, para o tratamento de pancreatite crónica, para o tratamento da deficiente absorção das gorduras, para o tratamento da deficiente absorção de vitaminas lipossolúveis, ou para o tratamento de deficiências na absorção das gorduras devido a razões de carácter fisiológico, caracterizado pelo facto de se mistu rar uma quantidade efectiva de uma proteína preparada pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, com agentes auxiliares de formulação apropriados.
20. - Processo de acordo com a reivindicação 19, carac terizado pelo facto de. se incorporar também uma lipase ou preparações que contenham lipases.
21. - Processo para a preparação de uma formulação ali mentar para crianças, caracterizado pelo facto de se misturar uma proteína preparada pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, com agentes auxiliares de formulação apropriados.