LT4020B - Derivatives of human bile-salt stimulated lipase, and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Description

Šis išradimas yra apie naujas DNR sekas, apie naujus baltymus, koduojamus šių DNR sekų, ir apie šių baltymų panaudojimą, kuris aprašytas žemiau. Išradimas taip pat apima vektorius, tokius kaip sukonstruotos plazmides, savo sudėtyje turinčios šias DNR sekas, galinčias ekspresuoti norimus fermentus. Išradimas taip pat apima šių sukonstruotų plazmidžių transfekuotus organizmus, pvz., bakterijas, mieles, žinduolių ląsteles ir transgeninius gyvūnus. Išradimas taip pat pasakoja apie išrastų naujų produktų gamybos procesus. Išradimo nauji baltymai priskiriami fermentui, žinomam kaip žmogaus tulžies druskos stimuliuojama lipazė.

Moters pieno liauka laktacijos metu gamina ir išskiria su pienu tulžies druskos - stimuliuojamą lipazę (TDSL) [Blackberg, L., Anqquist, K. A., a. Hernell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41], kuri po specifinės aktyvacijos pirminės tulžies druskomis [Hernell, O. (1975) Eur. J. Clin. Invest. 5, 267272; Hernell, O., a. T. Olivecrona, 1974, Moters pieno lipazės II. Tulžies druskos - stimuliuojama lipazė. Biochim. Biophys. Actą 369: 234-244; Hernell, O., L. Blackberg, a. T. Olivecrona. 1981. Moters pieno lipazės. Kn.: Gastroenterologijos ir kūdikių mitybos vadovėlis, red. E.Lebenthal. Raven Press, New York. 347-354] krūtimi maitinamam kūdikiui suteikia endogeninę galimybę žarnyne virškinti riebalus [Hernell, O., Blackberg, L. a. Bernback S. (1988) Kn. „Perinatalinis maitinimas“/ red. Lindblad, B.S./ Bristol-Myers sinpoziumas maitinimo klausimais, t. 6. pp. 259272, Academic Press, New York; Bernback S., Blackberg, L. a. Hernell, O. (1990) J.Clin.Invest. 221-226 (1990)]. Šis fermentas, sudarantis apie 1% visų pieno baltymų, yra ne specifinė lipazė [Blackberg, L. a. Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem 116, 221-225]: in vitro jis hidrolizuoja ne tik tri-, di-, ir monoacilglicerolius, bet taip pat ir cholesteril- ir retenil esterius ir lizofosfattidilglicerolius [Hernell, O. a Blackberg, L. (1982) Pediatr. Res 16, 882-885; Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. a. Olivecrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284-288; Fredrikzon, B., Hernell, O., Blackberg,

L. a. Olivecrona, T. (1978) Pediatr. Res. 12, 1048-1052; Wang, C.-S., Hartsuck, J.A. a. Downs, D. (1988) Biochemistry 27, 4834-4840].

Be to, jo aktyvumas neapsiriboja vien tik emulsiniais substratais, panašiu greičiu jis hidrolizuoja tirpius ir micelinius substratus [Blackberg, L. a. Hernell, O. (1983) FEBS Lett. 157, 337-341].

TDSL nesuskyla keliaudama kartu su pienu per skrandį, o dvylikapirštėje žarnoje nuo inaktyvacijos tokiomis kasos proteazėmis, kaip tripsinas ir chimotripsinas, ją apsaugo tulžies druskos [Hernell, O. (1975) Eur. J. Clin. Invest. 5, 267-272; Blackberg, L. a. Hernell, O. (1983) FEBS Lett. 157, 337341 j. Tačiau šis fermentas inaktyvuojamas pieno pasterizacijos metu, pvz., kaitinant iki 62.5° C, 30 min. [Bjorksten, B., Burman, L.G., deChateu, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. a. Hernell, O. (1980) Br. Med. J. 201, 267272]. Sprendžiant iš tyrimų in vitro duomenų, manoma, kad triacilglicerolio virškinimo galutiniai produktai, gauti reakcijoje dalyvaujant TDSL, yra skirtingi [Bernback S., Blackberg, L.a.HernelI, O. (1990) J. Clin. Invest. J.CIin.Invest. 221-226 (1990); Hernell, O.a. Blackberg, L. (1982), Pediatr. Res 16, 882-885], Kadangi naujagimystės periode intraluminalinė tulžies druskos koncentracija yra mažesnė, ši sąlyga yra palankesnė geresnei produkto absorbcijai [Brueton, M.J., Berger, H.M., Brown, G.A., Ablitt, L., lyangkaran, N.a. VVharton B.A. (1978) Gut, 19, 95-98; Murphy, G.M. a Singer, E. (1975) Gut 15, 151-163; Bernback S., Blackberg, L.a.HernelI, O. (1990) J. Clin. Invest. 221-226 (1990); Hernell, O., Staggers, J.E. a. Carey,

M. C. Biochemistry (1990), 29: 2041-2056],

Atrodo, kad žmogaus kasos sulčių karboksilinė esterinė hidrolazė (KEH) funkciniu požiūriu yra identiška arba jau bent labai panaši į TDSL [Lombardo, D., Guy, O. a. Figarella, C. (1978) Biochim. Biophys. Actą 527, 142-149; Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. a. Olivecrona,

T. (1981) FEBS Lett. 136, 284-288]. Jos turi bendrus epitopus [Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. a. Olivecrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284-288; Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. a. Lombardo, d. (1988) Biochim. Biophys. Actą, 961, 299-388], turi identiškas Nterminalines aminorūgščių sekas [Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. a. Lombardo, d. (1988) Biochim. Biophys. Actą, 961, 299-388] ir jas inhibuoja serino esterazių inhibitoriai, pvz., ezerinas ir diizopropilfluorofosfatas [Blackberg, L. a. Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem 116, 221-225; Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. a. Olivecrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284-288; Lombardo, D., Guy, O. a. Figarella, C. (1978) Biochim. Biophys. Actą 527, 142-149], Spėjama, kad šie du fermentai yra to paties geno produktai [Hernell, O., Blackberg, L.a. Lindberg, T. (1988) Kn. „Gastroenterologijos ir kūdikių mitybos vadovėlis“ /red. Lebenthal, E., pp. 209-217, Raven Press, New York; Wang, C.-S. (1988) Biochem. Biophys. Res. Com. 155, 950-955]. Stebėtas molekulinių masių skirtumas gali būti paaiškintas, matomai, skirtingu glikozilinimu [Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. a. Lombardo, d. (1988) Biochim. Biophys. Actą, 961,299-388].

Maistiniai lipidai yra svarbus energijos šaltinis. Energija turtingi triacilgliceroliai daugiau nei 95% sudaryti iš šių lipidų. Kai kurie lipidai, pvz., tam tikros riebios rūgštys ir riebaluose tirpūs vitaminai, yra pagrindiniai dietiniai komponentai. Prieš rezorbciją virškinimo trakte triacilgliceroliai, o taip pat ir mažesni komponentai, t.y. esterinti riebaluose tirpūs vitaminai ir cholesterolis, diacilfosfatidilgliceroliai, turi būti hidrolizuoti suskaldant esterinius ryšius tam, kad gautųsi mažiau hidrofobiški, gerai absorbuojami produktai. Šias reakcijas katalizuoja specifinė fermentų grupė - lipazės.

Suaugusio žmogaus organizme pagrindinės lipazės yra šios: skrandžio lipazės, nuo kasos kolipazės-priklausoma lipazė (tri- ir diacilglicerolių hidrolizė), kasos fosfolipazė A2 (diacilfosfatidilgliceroliai) ir karboksilinė esterinė hidrolazė (cholesteril- ir riebaluose tirpių vitaminų esteriai). Pas krūtimi maitinamą naujagimį tulžies druskos-stimuliuojama lipazė vaidina pagrindinį vaidmenį hidrolizuojant keletą aukščiau paminėtų lipidų. Lipidų virškinimo produktai drauge su tulžies druskomis sudaro mišrias miceles, kurios dalyvauja absorbcijoje [Hernell, O., Blackberg, L. a. Bernback S. (1988) Kn. „Perinatalinis maitinimas“/ red. Lindblad, B.S./ Bristol-Myers sinpoziumas maitinimo klausimais, t. 6. pp. 259272, Academic Press, New York; Bernback S., Blackberg, L.a.HernelI, O. (1990) J. Clin. Invest.. 221226 (1990)].

Blogos lipidų rezorbcijos priežastys ir iš to atsiradęs blogas virškinimas susijęs su sumažėjusią nuo kasos kolipazės-priklausomos lipazės ir/ar tulžies druskų intraluminaliniais kiekiais. Tokių lipazių stygiaus tipišku pavyzdžiu gali būti pacientai, sergantys cistine fibroze, įprastu genetiniu susirgimu, kurių 80% pasireiškia šis stygius per visą gyvenimo trukmę, taip pat jie suserga lėtiniu pankreatitu ir dažnai lėtiniu alkoholizmu.

Naujagimių kasos ir kepenų veikla dar nėra pilnai išvystyta, o ypač tai pasireiškia pas prieš laiką gimusius naujagimius. Bloga riebalų rezorbcija dėl fiziologinių priežasčių - įprastas sutinkamas reiškinys, kurį, kaip manoma, sąlygoja maža intraluminalinė nuo kasos kolipazėspriklausomos lipazės ir tulžies druskos koncentracija [Hernell, O., Blackberg, L. a. Bernback S. (1988) Kn. „Perinatalinis maitinimas“/ red. Lindblad, B.S./ Bristol-Myers sinpoziumas maitinimo klausimais, t. 6. pp. 259272, Academic Press, New York; Hernell, O, L. Blackberg, B. Fredrikzon, and T. Olivecrona. 1981. Žmogaus pieno tulžies druskos stimuliuojama lipazė ir lipidų virškinimas naujagimystės periode. Kn.: „Gastroenterologijos ir kūdikių mitybos vadovėlis“ red. E. Lebenthal. Raven Press, New York. 465-471; Brueton, M.J., Berger, H.M., Brown, G.A., Ablitt, L., lyangkaran, N.a. VVharton B.A. (1978) Gut, 19, 95-98; Murphy, G.M. a Singer, E. (1975) Gut 15, 151-163; Hernell, O., Staggers, J.E. a. Carey, M.C. Biochemistry (1990), 29: 2041-2056]. Tačiau dėl TDSL bloga rezorbcija yra retesnė pas krūtimi maitinamus kūdikius negu pas kūdikius, maitinamus pasterizuotu žindyvės pienu [Hernell, O., Blackberg, L. a. Bernback S. (1988) Kn, „Perinatalinis maitinimas“/ red. Lindblad, B.S./ Bristol-Myers sinpoziumas maitinimo klausimais, t. 6. pp. 259272, Academic Press, New York; Hernell, O, L. Blackberg, B. Fredrikzon, and T. Olivecrona. 1981. Žmogaus pieno tulžies druskos - stimuliuojama lipazė ir lipidų virškinimas naujagimystės periode. Kn.: „Gastroenterologijos ir kūdikių mitybos vadovėlis“ red. E. Lebenthal. Raven Press, New York. 465-471; Bernback S., Blackberg, L.a.HernelI, O. (1990) J. Clin. Invest. 221-226 (1990); Bjorksten, B., Burman, L.G., deChateu, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. a. Hernell, O. (1980) Br. Med. J. 201, 267-272; Atkinson, S.A., M.H. Bryan a. G.H. Andersson, 1981. Neišnešiotų naujagimių maitinimas moters pienu: baltymų, riebalų ir angliavandenių balansas gyvenimo pirmosiomis dviem savaitėmis. J. Pediatr. 99: 617-624; Ghappell, J.E., M.T. Clandinin, C. Kearney-Volpe, B. Reichman a. P.W. Swyer. 1986. Riebiųjų rūgščių balanso tyrimai pas neišnešiotus kūdikius, maitintus moters pienu arba mišiniais: kalcio priedų efektas. J. Pediatr. 108: 438-447]. Tai yra viena iš priežasčių, kodėl patariama, kad naujagimiai, ypač prieš laiką gimę, kurie negali būti maitinami savo motinos pienu, turėtų būti maitinami nepasterizuotu kitos žindyvės pienu [Bjorksten, B., Burman, L.G., deChateu, P., Fredrikzon, B., Gothefore, L. a. Hernell, O. (1980) Br. Med. J. 201,267-272].

Dabartiniu metu ligoniai, sergantys kasos lipazės nepakankamumu, gydomi skiriant peroraliai vartoti dideles neišvalyto kiaulių kasos fermentų preparato dozes. Žemas pH inaktyvuoja nuo kolipazės-priklausomą kasos lipazę. Skrandyje kaip tik vyrauja analogiškos sąlygos, ir tai sąlygoja peroraliai pavartotų kasos lipazių faktiškai pilną inaktyvavimą joms keliaujant iš skrandžio į žarnas. Todėl naudojant dideles fermento dozes, negalima pilnai išvengti šio neigiamo poveikio. Panaudotos didelės dozės yra neadekvačios daugumai ligonių, o patys preparatai yra neišvalyti ir neskanūs. Tam tikros tabletės buvo sukurtos, galinčios pereiti skrandžio rūgščiąją zoną ir išlaisvinti fermentą santykinai šarminėje aplinkojetuščiojoje žarnoje. Tačiau daugelis ligonių, sergančių kasos sutrikimais, turi tuščiojoje žarnoje nenormaliai rūgščią terpę, ir todėl tokios tabletės bus neefektyvios. Be to, kadangi dabartinis komercinis preparatas yra gautas iš nežmogaus kilmės šaltinio, tai egzistuoja tam tikra imuninių reakcijų rizika, nes šios reakcijos pacientui gali būti žalingos arba gali mažinti terapinį efektą. Kitas dabartinis preparatų ypatumas yra tas, kad jų kiti lipoliziniai aktyvumai, Išskyrus nuo kolipazės - priklausomą lipazę, nėra nustatyti. Faktiškai, dauguma jų turi mažus KEH/TDSL-aktyvumus. Tai gali būti viena iš priežasčių, kodėl daugelis ligonių, sergančių cistine fibroze, nežiūrint papildančios terapijos, vis tiek stokoja riebaluose tirpių vitaminų ir pagrindinių riebiųjų rūgščių.

Tokiu būdu, labai reikalingi produktai, pasižymintys žmogaus kilmės lipazių ypatumais ir sandara, turintys platų substratinį specifiškumą, ir kuriuos peroraliai galėtų vartoti ligoniai, sergantys vieno ar keletos kasos lipolizinių fermentų stygiumi. Šio išradimo produktai patenkina šį poreikį patys arba derinyje su kitomis lipazėmis, arba derinyje su kitais preparatais, turinčiais kitas lipazes. Be to, kai kuriems žmonių kūdikiams reikia pagerinti riebalų įsisavinimą naudojant įprastinius kūdikių maitinimo produktus arba pasterizuotą kitų žindyvių pieną iš taip vadinamų pieno bankų.

TDSL pasižymi keletu unikalių savybių, kurios ją daro idealiai tinkama pakeičiančioje ir papildančioje terapijoje. Šios savybės būtinos vartojant peroraliai. Taigi, šis fermentas atsparus slinkčiai per skrandį ir yra aktyvuojamas plonojoje žarnoje jos turiniu. Šio fermento specifinės aktyvacijos mechanizmas turėtų apsaugoti nuo rizikingos maisto ar audinių lipidų lipolizės saugojimo metu ir slinkties į veikimo vietą metu.

Plataus substratinio specifiškumo dėka jis gali sąlygoti pilną daugumos dietinių lipidų, įskaitant ir riebaluose tirpių vitaminų esterius, suvirškinimą.

TDSL gali geriau hidrolizuoti esterinius ryšius turinčias polineprisotintas riebių rūgščių ilgas grandines negu kasos nuo kolipazės priklausoma lipazė.

Esant skrandžio lipazei ir nesant arba būnant mažiems nuo kolipazės priklausomos lipazės kiekiams, TDSL gali užtikrinti pilną triacilglicerolio suvirškinimą in vitro, net jeigu tulžies druskos kiekiai yra tokie maži kaip pas naujagimius. Esant TDSL, triacilglicerolio virškinimo galutinis produktas yra laisvos riebios rūgštys ir monoacilglicerolis, kurio atsiradimą sąlygoja kitos dvi lipazės [Bernback S., Blackberg, L.a.HernelI, O. (1990) J. Clin. Invest. 221-226 (1990)]. Tai palengvina produkto rezorbciją ypač tada, kai intraluminaliniai tulžies druskos kiekiai yra maži [Hernell, O., Blackberg, L. a. Bernback S. (1988) Kn. „Perinatalinis maitinimas“/ red. Lindblad, B.S./ Bristol-Myers sinpoziumas maitinimo klausimais, t. 6. pp. 259272, Academic Press, New York; Hernell, O., Staggers, J.E. a. Carey, M.C. Biochemistry (1990), 29; 2041-2056],

Tulžies druskos-stimuliuotų lipazių (TDSL) panaudojimą papildymui, pakeitimui ar gydymui arba baltymų su pagrindinėmis TDSL savybėmis panaudojimas aukščiau paminėtiems tikslams reikalauja didelių produkto kiekių. Gamykloje gaminant šiuos produktus negalima pasikliauti natūraliais šaltiniais, tokiais kaip pienas, kad jie galėtų būti stambiamastės gamybos pradinė medžiaga. Be to, dar be aukščiau paminėtos problemos kad pasterizacijos metu TDSL inaktyvuojasi, egzistuoja dar papildoma rizika užkrėsti medžiagą iš natūralių šaltinių įvairiais infekciniais agentais, pvz., tokiais virusais kaip ŽIV ir CMV. Taigi reikalingi dideli gamybiniai produktų, pasižyminčių TDSL savybėmis, kiekiai. Pateikiamas išradimas pristato šiuos produktus ir jų gamybos būdus.

Prioritetinės publikacijos pateiktos toliau šiame aprašyme.

Šio išradimo pagrindą sudaro cDNR (komplementarios DNR), koduojančios TDSL, išskirtos iš pieno liaukos, klonavimas. Mes taip pat išskyrėme iš žmogaus kasos dalinę cDNR, koduojančią KEH. Prielaidą, kad TDSL ir KEH yra identiškos, palaiko duomenys, gauti tiriant aminorūgščių sekas, nustatytas pagal žmogaus komplementarias DNR ir taip pat palyginant su kitų rūšių KEH.

Kaip bus aprašyta tai detaliau sekančiuose skyriuose, nustebino duomenys, gauti nustatant baltymo struktūrą pagal cDNR sekas, kuri pasirodė besanti visai skirtinga negu kitų lipazių struktūra. Netikėtai paaiškėjo, kad ši struktūra labiau panaši į tipiškų esterazių struktūrą, kaip pavyzdžiui, chlolinesterazės.

Pagal Fig. 2 ir Fig. 7 paveikslus, išradimo produktai yra:

a) baltymas, apibrėžtas 1-722 aminorūgščių sekomis Fig. 7,

b) baltymas, apibrėžtas 1-535 aminorūgščių sekomis Fig. 7,

c) baltymas, apibrėžtas 1-278 aminorūgščių sekomis Fig. 7,

d) baltymas, apibrėžtas 1-341 aminorūgščių sekomis Fig. 7,

e) baltymas, apibrėžtas 1-409 aminorūgščių sekomis Fig. 7,

f) baltymas, apibrėžtas 1-474 aminorūgščių sekomis Fig. 7,

g) baltymų, apibrėžtų b-f, deriniai, pvz., pagal aminorūgščių sekas šiose pozicijose: 1-278, 279-341, 279-409, 279-474, 342-409, 342-474 ir 536722,

h) baltymų, apibrėžtų b-g, deriniai, kombinuojant su vienu ar daugiau pakartojimų pagal Fig. 5,

i) baltymas, apibrėžtas a-h, turintis papildomą N-terminalinę aminorūgštį, metioniną ir funkciniu požiūriu ekvivalentiškas baltymų, apibrėžtų aukščiau paminėtais a-i, variantams ir mutantams;

Reikia pažymėti, kad a, b, c, d, e, f, h ir i aukščiau nurodyti baltymai nebus visais aspektais identiški natūraliai TDSL, tačiau pasižymi viena ar daugiau esminių funkcijų, kurias turi natūrali TDSL. Šios esminės funkcijos pateikiamos žemiau.

j) DNR seka, koduojanti baltymus, nurodytus aukščiau a, b, c, d, e, f, h ir i.

k) DNR seka, nurodyta Fig. 2, apibrėžta sekančių nukleotidų numerių, nurodytų Fig. 2:

a) DNR seka 151-2316, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 1722 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

b) DNR seka 151-1755 nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 1533 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

c) DNR seka 151-985, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 1278 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

d) DNR seka 151-1172, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 1341 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

e) DNR seka 151-1376, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 1409 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

f) DNR seka 151-1574, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 1474 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

g) DNR seka 986-1172, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 279-341 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

h) DNR seka 986-1376, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 279-409 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

i) DNR seka 986-1574, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 279474 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7,

j) DNR seka 1173-1376, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 342-409, nurodytų Fig. 7, aminorūgščių sekų,

k) DNR seka 1173-1574, nurodyta Fig. 2, koduojanti baltymą, apibrėžtą 342-474 aminorūgščių sekų, nurodytų Fig. 7.

Išradimo baltymų svarbiosios funkcijos yra:

a) tinkami peroraliniam vartojimui,

b) aktyvuojami specifinių tulžies druskų,

c) veikdami kaip ne-specifinės lipazės, plonosios žarnos turinyje jie hidrolizuoja lipidus, nepriklausomai nuo pastarųjų cheminės sandaros bei fizinio būvio (emulsiniai, micelės, tirpūs),

d) sugeba hidrolizuoti triacilglicerolius su riebiosiomis rūgštimis, skirtingo grandinių ilgio ir įvairaus nesotumo laipsnio,

e) sugeba hidrolizuoti taip pat diacilglicerolį, monoacilglicerolį, cholesterilesterius, lizofosfatidilacilglicerolj ir retenilą bei kitus riebaluose tirpius vitaminų esterius,

f) sugeba hidrolizuoti ne tik sn -1 (3) esterinius ryšius triacilglicerolyje, bet taip pat ir sn - 2 esterinius ryšius,

g) sugeba sąveikauti ne tik su pirminėmis, bet taip pat ir su antrinėmis tulžies druskomis,

h) optimalus aktyvumas priklauso nuo tulžies druskų,

i) toks stabilumas, kad skrandžio turinys negali paveikti jokio jų kristalitinio aktyvumo,

j) stabilumas kasos proteazių, pvz., tripsino, atžvilgiu, jeigu yra tulžies druskos,

k) sugebėjimas jungtis prie heparino ir jo darinių, pvz., heparansulfato,

l) sugebėjimas jungtis prie lipidų - vandens interfazės,

m) stabilumas, leidžiantis atlikti liofilizaciją,

n) stabilumas, esant mišinyje su tokiais maisto komponentais, kaip moters pienas arba pieno mišiniai.

Pagrindinės funkcijos, svarbios papildymui, pateikimui ir terapijai išvardintuose punktuose: a, c, d, e, f, i, j ir I. Kitiems vartojimo tikslams ne visos pagrindinės funkcijos yra būtinos.

Tam, kad būtų ekspresuoti aukščiau nurodyti baltymai, atitinkamos DNR sekos, nurodytos aukščiau, bus įterptos j tinkamus vektorius, kurie po to yra introdukuojami į tinkamo šeimininko organizmą. Minėtas vektorius turi turėti atitinkamą signalinę seką ir kitas sekas, reikalingas tam, kad po introdukcijos organizmas galėtų ekspresuoti norimą baltymą.

Tinkami organizmai ekspresijai:

Panaudojant rekombinantinius DNR metodus, galima klonuoti ir ekspresuoti norimą baltymą įvairuose prokariotiniuose ir eukariotiniuose organizmuose-šeimininkuose. Galimi ekspresijos organizmai yra bakterijos, primityvūs eukariotai (mielės), gyvūnų ląstelių kultūros, augalai ir transgeniniai gyvūnai. Kiekviena individuali sistema turi savo privalumus ir trūkumus. Paprasta išvada yra ta, kad norimo geno ekspresija kiekvienu atveju yra unikali problema ir nėra standartinių sprendimų.

Įprastinė naudojama bakterinė sistema E. Coli, Bacillus subtilis, Streptomyces. Įprastinės naudojamos mielės yra saccharomyces ir Pichia Pastoris. Įprastinės naudojamos gyvūnų ląstelės yra CHO ir COS ląstelės. Įprastinės naudojamos vabzdžių ląstelių kultūros yra iš Drosophila kilusios ląstelės.

Įprastinai naudojami augalai yra tabakas. Galimi transgeniniai gyvūnai ožka ir karvė.

Galimi bakteriniai vektoriai nukopijuojami nuo pUC ir proteino A - vektorių.

Galimas mielių vektorius nukopijuojamas nuo pMA 91.

Galimi vabzdžių vektoriai konstruojami panaudojant Baculo-virusą.

Galimi augalų vektoriai konstruojami panaudojant Ti - plazmidę.

Galimi gyvūnų ląstelių vektoriai konstruojami panaudojami SV/40.

Kiekvienoje sistemoje galima panaudoti tiek gamtinius, tiek sintetinius promotorius ir terminatorius.

Suprantama, kad priklausomai nuo pasirinktos ekspresijos sistemos, ekspresuotas baltymas gali turėti papildomą N - terminalinę aminorūgštį (metioniną), turėti kelias papildomas aminorūgštis, arba gali būti sulietas su heterologiniais baltymais (pvz., proteinu A), arba skirtis nuo gamtinio baltymo glikolizinimo charakteriu. Be to, vektoriai taip pat gali turėti ir signalines sekas tam, kad būtų galima eksportuoti baltymą j periplazmą arba kultūros terpę.

Tokiu būdu, sekantys išradimo aspektai yra šie:

a) vektorius, turintis DNR seką, koduojančią baltymą, apibūdintą aukščiau,

b) šeimininko organizmas, turintis DNR seką, apibūdintą aukščiau,

c) apibūdinto aukščiau baltymo gamybos procesas, auginant šeimininko organizmą, turintį a punkte aukščiau apibūdintą vektorių, ir po to išskiriant baltymą.

Išskyrimo metodai priklauso nuo panaudotos ekspresijos sistemos (pvz., proteino A/lgG) ir/ar išskyrimo metodu, naudojamų gamtiniam fermentui išskirti, kaip tai aprašyta L. Blackberg, O.Hernell (1981) Eur. J. Biochem., 116, 221-225.

Papildomi išradimo aspektai yra šie:

- farmacinė kompozicija, turinti savo sudėtyje aukščiau apibūdintą baltymą,

- aukščiau apibūdinto baltymo panaudojimas, vartojamo pataloginės būklės, sukeltos egzokrininio kasos nepakankamumo, gydymui medikamento gamybai,

- aukščiau apibūdinto baltymo panaudojimas medikamento, skirto cistinės fibrozės gydymui, gamybai,

- aukščiau apibūdinto baltymo panaudojimas kūdikių maisto mišinių papildymui,

- aukščiau apibūdinto baltymo panaudojimas medikamento, skirto lėtinio pankreatito gydymui, gamybai,

- aukščiau apibūdinto baltymo panaudojimas medikamento, skirto bet kokios etiologijos blogos riebalų rezorbcijos gydymui, gamybai,

- aukščiau apibūdinto baltymo panaudojimas medikamento, skirto riebaluose tirpiu vitaminų blogos rezorbcijos gydymui, gamybai,

- aukščiau apibūdinto baltymo panaudojimas medikamento, skirto fiziologinių priežasčių sukeltos (pvz., naujagimių) blogos riebalų rezorbcijos gydymui, gamybai.

Fig. 2 parodyta DNR seka, pradedant 151 pozicija iki ir įskaitant 2316 poziciją, yra seka, koduojanti visą baltymą. Seka, pradedant 2317 pozicija iki ir įskaitant 2415 poziciją, netransliuojama j baltymą, bet įeina j nurodyto 2 lentelėje žemiau egzono d sudėtį.

Vienoje iš išradimo realizacijų baltymas, apibūdintas a-i paragrafuose aukščiau, gaunamas izoliuotoje ir/arba grynoje formoje.

DNR sekos, apibūdintos a-k paragrafuose aukščiau, viename iš išradimo variantų gautos izoliuota ir/arba gryna forma.

EKSPERIMENTINĖ DALIS

Santrumpos ar - aminorūgštis, bp - bazių pora, TDSL - tulžies druskos-stiluliuojama lipazė, c-AMF - ciklinis adenozinmonofosfatas, KEH - karboksilinė esterinė hidrolizė, Da - daltonas, c7GTF-7-deaza-2-dezoksiguanozin-5’-trifosfatas, EDTA - etilendiamintetraacetatas, kb - kilobazės, MOPS - 3-Nmorfolinpropansulforūgštis, nt - nukleotidas, PAGE - elektroforezė poliakrilamidiniame gelyje, SDS - natrio dodecilsulfatas, SSC - NaCl citratas, xGal-5-brom-4-chlor-3-indolil-B-D-galaktopiranozidas.

Fermentai

Tulžies druskos - stimuliuojama lipazė EC 3.1.1.3

Karboksilinė esterinė hidrolazė EC 3.1.1.1.

Medžiaga ir metodai

A. Fermento ir antikūnų paruošimas

TDSL buvo išskirta iš moters pieno pagal metodą aprašytą [Blackberg, L. a. Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem 116, 221-225]. Tam, kad fermentas tiktų antikūnų gamybai, jis buvo išvalytas SDS-PAGE metodu. Baltymo juosta, atitinkanti lipazę, nudažius Kumasi briliantinio mėlio dažais, buvo iš gelio elektroeliuota. 25 pg išvalyto fermento kartu su tokiu pačiu kiekiu Freindo adjuvanto panaudoti pirmai i.c. injekcijai, o vėliau tokio pat kiekio fermento ir nepilno adjuvanto injekcijos kartotos kas mėnesį. Praėjus 2 savaitėms po busterinės injekcijos, iš triušių buvo imamas kraujas, ir gautas serumas saugotas -20°C temperatūroje.

B. Tripsinizacijos fragmentų paruošimas ir aminorūgščių sekos analizė mg išvalytos TDSL ištirpinama 1 ml 0.1 M Tris-CI buferio, pH 8.5, turinčio 6 M guanidinohidrochlorido ir 2 mM EDTA. Pridedamas ditioeritritolis iki 5 mM. Inkubuojama 2 vai. 37°C, po to pridedama 50 mM jodo acetato. Po 90 min. inkubacijos 25°C tamsoje redukuotas ir karboksimetilintas fermentas Sefades G-25 kolonėlėje supusiausvyrintoje 0.5 M amonio bikarbonatu, išvalomas nuo druskos. Prieš liofilizuojant pridedama 30 pg tozil-L-fenilalanino chlormetanu paveikto jaučio tripsino (VVorthington diagnostics system Ine., Freehold, N J, USA). Liofilizuotas baltymas ištirpinamas 4 ml 0.1 M amonio bikarbonato ir papildomai pridedama 90 pg tripsino. Po 5 vai. inkubacijos 37°C baltymas vėl liofilizuojamas. Po to tripsinizacijos produktas ištirpinamas 0.1% trifluoroacto rūgštyje (2mg/ml). 300 pg tripsinizuotos TDSL chromatografuojama aukšto slėgio skysta chromatografija panaudojant C-18 atvirkščių fazių kolonėlę ir eliuojama 050% acetonitrilo gradientu 0.1% trifluoroacto rūgštyje. Peptidų surinkta kolekcija pastoviai tikrinta pagal absorbciją ties 215 m. Prieš sekų nustatymą (sekvenavimą) peptidai toliau valomi panaudojant rechromatografiją toje pačioje kolonėlėje, eliuojant parinktu gradientu. Peptidų fragmentų pavyzdžiai džiovinami skystu azotu tam, kad būtų pašalintas acetonitrilas, ir po to talpinami į sekvenavimo aparatą. Nterminalinės sekos analizei natyvi TDSL ištirpinama 0.1% acto rūgšties. Sekų analizė atlikta panaudojant Applied Biosystems Ine. 477A pulsinį skystos-fazės sekvenserj ir prijungtą PTH 120A analizatorių su reguliaraus ciklo programomis ir reagentais iš gamintojo. Pradinės ir pakartotinės išeigos, paskaičiuotos pagal standartinio baltymo, B-laktoglobulino sekos analizę, buvo 47 ir 97% atitinkamai.

C. RNR išskyrimas

Operacijų metu žmogaus kasos, riebalinio ir laktuojančios pieno liaukos audiniai tuoj pat patalpinami į guanidino tiocianatą (1-5g/50 ml). Totalinė RNR išskiriama pagal metodą, aprašytą Chirgvvin [Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald R.J. a. Rutter, W.J. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299], Poli (A)-RNR gaunama chromatografijos oligodezoksitimidilat (oligo/Dt)-celiuliozės kolonėlėje būdu [Aviv, H. a. Leder, P. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 5201-5205].

D. cDNR bibliotekų konstravimas ir skriningas

Apie 15 ųg poli-adenilintos RNR, išskirtos iš žmogaus kasos denatūruojama metilgyvsidabrio hidroksidu [Bailey, J.M. a. Davidson, N. (1976) Anai. Biochem. 70, 75-85] ir nukreipiama oligo (dT) 12-18 praimeriais (Pharmacia, Uppsala, Švedija) ir atliekama atvirkštinė transkripcija pagal įprastą metodiką [Maniatis, T., Fritsch, E.F. a. Sambrook, J. (1982): Kn.: „Molekulinis klonavimas. Laboratorinis vadovas“. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]. Antrasis siūl as susintetintas pagal Gubler ir Hoffman [Gubler, U. a. Hoffman, B.J. (1983) Gene 25, 263-269] metodiką, išskyrus tai, kad DNR ligazė ir β-NAD nepanaudotos ir reakcijos temperatūra buvo 15°C.

RNR perteklius pašalinamas paveikus RNaze (50 pg/ml), ir dvisiūlė cDNR paveikiama EcoRI metilaze [Maniatis T., Haldison, R.C., Lacy, E., Lauer, J., O’Coneli, C. a. Qvon, D. (1978) Cell 15, 687-701]. Galai sutvarkomi paveikus Klenovv fermentu. Po ligavimo su EcoRI linkeriai ir skaldymo EcoRI gauta cDNR frakcionuojama Sefarozės 4B-C1 kolonėlėje.

Frakcija precipituojama etanoliu ir cDNR liguojama į fosfatazę, paveiktą gtll vektorių, EcoRI saitą [Young, R.A. a. Davis R.W. (1983) Science 222, 778-782]. Pakuojant in vitro gaunama daugiau negu 7 χ 10⁵ rekombinančių.

Moters pieno liaukos cDNR biblioteka, kilusi iš audinio, gauto iš moters su 8 mėnesių nėštumu, buvo nupirkta iš Clontech laboratories, Ine., Palo Alto, CA, JAV.

cDNR bibliotekų fagai išsėti po 5 χ 10⁴ ližės dėmes formuojančių vienetų j 120 mm lėkšteles. Antiserumas praskiestas santykiu 1:3200 ir pagal Young ir Davis metodiką [Young, R.A. a Davis R.W. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80, 1194-1198] atliktas skriningas. Ožkos-anti-triušiniai antikūnai, konjuguoti su šarmine fosfataze, naudoti kaip antriniai antikūnai (Bio-Rad, Richmond, CA JAV). Tam kad būtų išskirti klonai, atitinkantys mRNR 5’ galą, atlikta nukleino rūgščių hibridizacija įprastoms sąlygomis [Maniatis, T., Fritsch, E.F. a. Sambrook, J. (1982): Kn.: „Molekulinis klonavimas. Laboratorinis vadovas“. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York], panaudojant kaip zondą subklonuotą fragmentą vieno iš imunopozityvių klonų.

E. RNR analizė

Elektroforeze atliekama 1% agarozės gelyje 40 mM MOPS buferyje pH 7.0 prieš tai denatūravus glioksaliu ir dimetilsulfoksidu [McMaster, G.K. a.

Charmichael, G.G. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci USA 74, 48 353-48 358].

Po to glioksilintą totalinė RNR pernešama ant nitroceliuliozės filtrų [Thomas, P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205]. Blotai hibridinami su TDSL ir KEH rekombinacijų subklonais, pažymėtais oligožymėjimo metodu [Feinberg, A.P. a. Volgelstein, B. (1983) Abalyt. Biochem. 132, 6-13].

Prehibridizacija ir hibridizacija atliekama 50% formamide 46°C [Maniatis, T., Fritsch, E.F. a. Sambrook, J. (1982): Kn.: „Molekulinis klonavimas. Laboratorinis vadovas“. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]. Po hibridizacijos atplaunama labai stropiai (0.1% SDS ir 0.1 x SSC 60°C). (1 x SSC, 0.1 M NaCl, 0.0015 M Na₃ citrato, pH 7.6).

F. Nukleotidų sekos nustatymas

TDSL ir KEH rekombinančių kDNR intarpai buvo arba tiesiogiai klonuojami M3mp18 ir mp19, prieš tai suskaldžius ultragarsu ir išfrakcionavus pagal dydį, arba kai kurie jų buvo subklonuojami pTZ19R, prieš tai paveikus fermentais PstI, BstXI, Narį, Smal ir Ahall. Nukleotidų seka nustatoma dideoksi grandinės - terminacijos metodu [Sanger, R., Niclen, S.a. Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467], GCturtingi pasikartojimai (žiūr. toliau) tai pat buvo sekvenuoti panaudojant Taql polimerazę ir dc ⁷GTP. Sekvenuoti abu siūlai. Sekos analizuotos pagal autoradiogramas panaudojant programinę įrangą MS-EdSeg kaip aprašyta Sjoberg ir kt. metodikoje [Sjoberg, S., Carlsson, P., Enerback,

S., a. Bjursell, G. (1989) CABIOS 5, 41-46].

G. Aminorūgščių sekų apskaičiavimas ir homologijos

Tam, kad būtų apskaičiuota aminorūgščių seka, atitinkanti cDNR intarpus, pagal Staden metodiką [Staden, R. (1984) Nucl, Acidus Res. 12, 551-567] palyginti skirtingi skaitymo rėmeliai ir pagal tai nustatytas atviras skaitymo rėmelis. Homologijų ieškoma panaudojant UWGCG programinį paketą [Devereux, J., Haeberli, P. a. Smithies, O. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 387395],

REZULTATAI IR APTARIMAS

A. Tripsinizacijos fragmentų sekos ir TDSL N-terminalinis galas

Išvalytos TDSL tripsinizacija davė 50 fragmentų, kurie buvo nustatyti pagal pikų skaičių, gautą aukšto slėgio skysčiu chromatografijos metu (Fig. 1). Pikai surinkti ir tie pikai, kuriuos buvo galima išskirti grynus ir pakankamu kiekiu, buvo sekvenuoti. Gautos sekos parodytos 1 lentelėje. Be to, dar buvo sekvenuota 30 N-terminalinių liekanų (Fig. 2) ir jos atitiko anksčiau Abouaki ir kt. paskelbtas sekas [Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. a. Lombardo, d. (1988) Biochim. Biophys. Actą, 961,299-388).

liekanų ilgio N-terminalinė seka, aprašyta Wang ir Johnson [Wang, C.S. a. Johnson, k. (1983) Anai. Biochem. 133, 457-461], yra pagal mus glicinas, o pagal Wang ir Johnson - lizinas.

B. TDSL nukleotidų seka

Zgt11 cDNR bibliotekos konstravimui panaudota poliadenilinta RNR iš žmogaus kasos. Pradžioje išskirti 4 imunopozityvūs klonai ir po to ši kasos ekspresijos cDNR skrininguota panaudojant antiserumą anti-TDSL. 4 klonų nukleotidų sekos analizė parodė, kad jie puikiai atitinka mRNR 3’galą. Visi jie prasideda poli A uodega ir skiriasi tik ilgiu, ilgiausias intarpas, pažymėtas ACEH, turėjo 996 bp.

cDNR biblioteka iš moters pieno liaukos skrininguota antiserumu, o kasos klonas ACEH panaudotas kaip zondas. Skriningų metu išskirti pozityvūs klonai, kurie visi buvo kilę nuo 3’-galo. Ilgiausias pieno liaukos klonas, pažymėtas ABSSL, turi 21100 bp priešsrovę. Jis talpina 4 iš sekvenuotų tripsinizacijos fragmentų (Fig. 2), tačiau neturi N-terminalinės aminorūgščių sekos. Tam, kad būtų pasiektos sekos už transliacijos starto, pieno liaukos cDNR biblioteka reskrininguota panaudojant II8 bp ilgio zondą, kilusį iš ABSSL 5’-proksimalinės dalies. Išskirtas 1 klonas, turintis tolimesnius 328 nukleotidus prieš srovę. Jis turėjo N-terminalinę rūgščių seką ir likusį tripsinizacijos fragmentą. Fig. 2 matyti, kad cDNR yra 2428 nukleotidų ilgio ir turi 81 bazę priešsrovę nuo pirmojo ATG kodono. Poliadenilinimo signalas. AATAAA išsidėstęs 13 nukleotidų prieš srovę nuo poli A uodegos, o terminacijos kodonas TAG yra ties 2317 nukleotidų, o po jo seka 3’-netransliuojamas 112 bp rajonas. GC-turtingas rajonas, susidedantis iš 33 bazių 16-kos pasikartojimų, nustatytas sekos tarp 1756 ir 2283 bazių 3’-gale. Pasikartojimų nukleotidinė seka parodyta Fig. 3 ir susideda iš 6 indentiškų pasikartojimų, apsuptų 10 pasikartojimų, turinčių įvairius pakeitimų skaičius, kurie matomai atsitiko po keletos dublikacijų. Nedidelis pakeitimų skaičius leidžia prielaidą, kad šie pasikartojimai atsirado vėlai evoliucijos metu.

C. Ekspresija audiniuose

Northen blotingu išanalizuotos RNR iš moters laktuojančios pieno liaukos, kasos, riebalinio audinio ir žmogaus hepatomos ląstelių linijos HepG2. Nustatyta, kad mesendžerių dydis buvo apie 2.5 kb tiek laktuojančios pieno liaukos, tiek ir kasos. Jokio signalo neaptikta takeliuose su RNR, išskirta iš HepG2 ar riebalinio audinio (Fig. 4).

Kadangi mRNR, panaudota pieno liaukos bibliotekai gauti, buvo išskirta iš audinio moters, esančios 8 nėštumo mėnesyje, tai aišku, kad TDSL geno transkripcija, o gal transliacija yra perjungiama dar prieš gimdymą, o tai atitinka ankstesnius pastebėjimus apie TDSL sekreciją dar prieš gimdymą [Hamosh, M. (1986) Kn.: „Kūdikių maitinimas moters pienu ir sveikata“ / Hovvell. R.R. Morriss, F.H. a. Pickering, L.K. red. /pp. 66-97, Charles, C Thomas, Springfield]. Žiūr. Fig. 4.

D. TDSL aminorūgščių seka

SDS-PAGE metodu nustatyta, kad molekulinė masė yra 107-125 kDa [Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. a. Olivecrona, T. (1981)

FEBS Lett. 136, 284-288; Wang, C.-S. (1980) Anai. Biochem. 105, 398402] ir analitiniu ultracentrifugavimu - 105 kDa [Wang, C.-S. a. Lee, D. M. (1983) J. Lipid. Res 26, 824-830]. Fermentas kaip galima spręsti iš cDNR, susideda iš 722 aminorūgščių liekanų (Fig. 2), kurios atitinka 76. 271 Da molekulinę masę, o pats fermentas turi 15-20% angliavandenių. Lyderinė seka yra 23 aminorūgščių liekanų ilgio. Aktyvaus saito serino liekana išsidėsčiusi serine-217 (Fig. 5). Sekos apie šj seriną atitinka sekoms, esančioms šalia serino hidrolazių aktyvaus saito [Brenner, S. (1988) Nature 334, 528-530]. Neseniai buvo pareikšta prielaida, kad bazinės liekanos, esančios arti aktyvaus saito serino, gali dalyvauti lipazėms skaldant acilglicerolių eterinius ryšius [Yang, Gu, C.-Y., Z.-W., Yang, H.-H., Rohde, M.F.Gotto. Jr., A. M. a. Povvnall, H.J. (1989) J. Biol. Chem. 265, 16822-16827]. Jdomu pastebėti, kad šių liekanų nėra TDSL. Vienintelis Nglikozilinimo saitas išsidėstęs tik per 7 liekanas nuo serino. Glikozilinimo laipsnis [Blackberg, L. a. Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem 116, 221-225; Lombardo, D., Guy, O. a. Figarella, C. (1978) Biochim. Biophys. Actą 527, 142-149] leidžia manyti, kad fermentas turi prie O prijungtą angliavandenį. Yra daug saitų, kur toks glikozilinimas galėtų vykti. Išvalyto fermento aminorūgščių sudėties tyrimai parodė didelį kiekį prolino liekanų [Blackberg, L. a. Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem 116, 221-225]. Aminorūgščių seka, nustatyta pagal cDNR, tai patvirtinta. Be to. dauguma prolino liekanų lokalizuota 16-oje pasikartojimų, kurių kiekvieną sudaro 11 liekanų, šie pasikartojimai sudaro fermento C-terminalinės pusės pagrindinę dalį.

E. Pieno liaukos (TDSL) ir kasos (KEH) fermentų palyginimas

Moters pieno TDSL ir žmogaus kasos KEH yra panašios, jeigu neidentiškos. Tai buvo parodyta jau anksčiau. Mūsų duomenys remia prielaidą, kad šie du fermentai yra vieno geno produktai. cDNR klonų nukleotidų seka rodo, kad kasos klonas ACEH yra identiškas pieno liaukos klonui ABSSL, lyginant nuo poli A uodegos ir 996 bazės link 5’ galo, įskaitant seką, koduojančią prolinu-turtingus pasikartojimus. Tiriant Northern blotu, RNR. išskirtoje tiek iš kasos, tiek ir iš pieno liaukos, gaunama viena 2.5 kb juosta (Fig. 4). Genominio Southern bloto rezultatai patvirtina mintį, kad vienas vienintelis genas koduoja tiek TDSL, tiek ir KEH. TDSL ir KEH judrumo SDS-PAGE skirtumas gali būti paaiškinamas skirtingu glikozilinimu ar splaisingu.

TDSL panašumas į žiurkės ir jaučio fermentus (žiūr. žemiau) ir genominio bloto rezultatai rodo, kad, matomai, skirtingi splaisingai nesąlygoja skirtingo mobilumo. Kadangi C-terminalinės sekos nebuvo patvirtintos baltymo lygyje, todėl atrodo, kad mažesnė tikimybė, kad procesingo metu KEH atskeliama C-terminaliniame gale.

Iki šiol kasos fermentai, kurie akivaizdžiai atitiko KEH, dažniausiai buvo vadinami pagal rūšį ir ypač pagal substratą, naudotą jų aktyvumui nustatyti, kaip antai: lizofosfolipazė, cholesterilesterazė, sterolesterhidrolazė, nespecifinė lipazė, karboksilinė esterinė lipazė ir cholesterilesterilesterhidrolazė. Gauti duomenys patvirtina prielaidą, kad visi šie aktyvumai kyla iš vieno ir to paties funkcinio vieneto [Blackberg, L. (1981) Riebalų virškinimas pas naujagimį kūdikį. Umea Universiteto Medicininių disertacijų nauja serija Nr. 71; Rudd, E.A. a. Brocman, H.L. (1984) Kn.: „Lipazės /red. Borgstrom, B. a. Brockman, H.L. /pp. 184-204, Elsevier, Amsterdam]. Tai rodo platų substratinį specifiškumą ir apibūdina šiuos fermentus kaip nespecifines lipazes. Kuomet žmogaus TDSL/KEH sekos palyginamos su kasos fosfolipaze [Han, J.H., Stratovva, C., a. Rutter., W.J. (1987) Biochemistry, 26, 1617-1625] ir cholesterolesteraze iš jaučio kasos [Kyger, E., VViegand, R., a. Lange, L. (1989) Biochem. Biophys. Res. Com. 164, 1302-1309], randamas didelis panašumas, kuris tęsiasi nuo N-terminalinio galo 530 liekanų (Fig. 5), tačiau jos labai skiriasi toje molekulės dalyje, kur aptinkami pasikartojimai. Žiurkės fermentas turi pasikartojimus, o jaučio - 3. Tuo būdu žmogaus fermentas - žymiai ilgesnis peptidas.

Be to, dideli panašumai aptikti tarp TDSL ir tipiškų esterazių, pvz., keleto rūšių acetilcholinesterazių, įskaitant žmogaus ir Drosophila, ir karboksilesterazių (Fig. 6). Šie panašumai apima tik TDSL N-terminalinio galo 300 liekanų, kurio atkarpoje yra aktyvaus saito serino liekana. Apie panašumą į acetilcholinesterazę buvo nuspręsta iš to fakto, kad TDSL gali inhibituoti tipiški cholinesterazių inhibitoriai [Blackberg, L. a. Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem 116, 221-225; Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. a. Olivecrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284-288; Lombardo, D., Guy, O. a. Figarella, C. (1978) Biochim. Biophys. Actą 527, 142-149]. Gal būt tik išskyrus žiurkių kepenų karboksilesterazę [Cammulli, E.D., Linkę M.J., Brockman, H.L. a. Hui, D.Y. (1989) Biochim. Biophys. Actą 1005, 177-182], niekas iš šių panašių fermentų neturi tokios priklausomybės nuo tulžies druskos kaip tai turi TDSL; tai leidžia daryti prielaidą, kad šios savybės struktūrinis pagrindas slypi baltymo Cterminalinėje dalyje. Be to, TDSL gali sąveikauti su emulsiniais substratais, o tai nebūtinga panašioms esterazėms. Šis aktyvumas taip pat priklauso nuo tulžies druskos.

Žmogaus TDSL sekos palygintos su kitų gerai apibūdintų žinduolių lipazių sekomis. Išskyrus sekas šalia aktyvaus saito serino (G-X-S-X-G), jokių akivaidžių panašumų nerasta [Mickel, S., VVeidenbach, F., Svvarovsky, B., LaForge, S. a. Ssheele, G. (1989) J. Biol. Chem. 264, 12895-12901].

Be panašumų su kitais fermentais surasti žymūs panašumai ir su vienu, nuo c-AMF priklausomu baltymu, išskirtu iš Dictyostelium discoideum [Mann, S.K.O. a. Firtel, R.A. (1987) Mol. Cell Biol. 7, 458-469], o taip pat ir kelių gyvūnų rūšių tiroglobulinu (Fig. 4) [Mercken, L., Simons, M.J., Svvillens, S., Masser, M. a. Vassart, G. (1985) Nature 316, 647-651; Lauro, R., Obici, S. Condliffe, D., Ursini, V.M., Mušti, A., Moscatelli, C. a. Avvedimento, V.E. (1985) Eur.J.Biochem., 148, 7-11; Malthiery, Y. a.

Lissitzky, S. (1987) Eur. J. Biochem, 165, 491-498], Panašumai tarp TDSL ir tiroglobulino, kurie apima tik aktyvaus saito rajoną, bet ne patj aktyvųjį saitą, rodo, kad šie labai konservatyvūs aminorugščių pailginimai turi bendresnę reikšmę, negu vien tik esterazių fermentinio aktyvumo palaikymas.

Galima padaryti išvadą, kad moters pieno TDSL, susideda iš 722 aminorugščių liekanų. Gauti duomenys patvirtina, kad jos peptidinė grandinė yra identiška kasos KEH ir kad jos abi yra koduojamos vieno ir to paties geno. Didžiausias įrodymas yra tai, kad jų tiek 3' galo, tiek Nterminalinio galo nukleotidinės sekos yra identiškos. Ryškios homologijos, aptiktos su žiurkių kasos lizofosfolipaze ir jaučio kasos cholesterol esteraze, palaiko prielaidą, kad ir šie fermentai yra funkciniai identiški. Tačiau, kaip tai ir buvo spėjama anksčiau, skirtingi molekuliniai dydžiai, randami tarp skirtingų gyvūnų rūšių šių fermentų, yra ne dėl glikozilinimo skirtumų, bet jie matomai atspindi 11 aminorugščių pasikartojimų skirtingus skaičius. Aktyvaus saito sekų panašumas tarp šių esterazių leidžia prielaidą, kad šie baltymai kilo iš bendro protėvinio geno.

REKOMBINANTINIO BSSL EKSPRESIJA EUKARIOTU IR

PROKARIOTŲ LĄSTELĖSE

1. EKSPERIMENTINĖ DALIS

Rekombinantinės plazmidės pS146 plazmidė, turinti 2,3 kb žmogaus BSSL cDNR [Nilsson, J., Blackberg, L., Carlsson, P., Enerback, S., Hernell, O. ir Bjursell, G. (1990): Eur. J. Biochem. 192, 543-550], kuri buvo klonuota su pUC19, skaidoma Hind III ir Sal I ir BSSL cDNR įterpta j jaučio papilomos viruso (BPV) ekspresijos vektorių pS147 (Fig. 1). Šis vektorius turi žmogaus BSSL cDNR, kurią kontroliuoja pelių metalotioneino 1 (mMT-1) enhanceris ir promotoriaus elementas [Pavlakis, G.N., ir Hamer, D.H. (1983): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 397-401]. iRNR procesingo signalai paimti iš triušio βglobino geno fragmento, apimančio dalį egzono II, introną II, egzoną III ir toliau einančius elementus. Šis transkripcinis vienetas klonuotas su vektoriumi, turinčiu visą BPV genomą. BPV ir BSSL transkripcinis vienetas transkribuojami ta pačia kryptimi. Kad vektorius galėtų daugintis E. coli viduje, jis taip pat turi pML2d, pBR322 darinį [Sarver, N., Byrne, J.C., ir Hovvell, P.M. (1982): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7147-7151],

Ekspresijos vektorius pS147 transfekuotas kartu su vektoriumi, koduojančiu atsparumo neomicinui geną, kurį reguliuoja Harvey sarkomos viruso 5'-galo ilgojo pasikartojimo ir beždžionių viruso su 40 poliadenilinimo singalai [Lusky, M., ir Botchan, M.R. (1984): Cell 36, 391401].

Tam, kad E. coli ekspresuotų BSSL, BSSL cDNR subklonuotas kaip NdelBamHI fragmentas iš pT7-7 piazmidės [Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J. G., Smith, J.A., Struhl, K. (eds.) in: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York; edition of 1992] į pGEMEX-1 plazmidę (promega, Madison, Wl, JAV) [Studier, F.W. ir Moffat, B.A. (1986): J. Mol. Biol. 189, 113-130], Šioje klonavimo procedūroje T7 geno 10 koduojanti seka pakeičiama BSSL genu, koduojančiu subrendusį baltymą, ir startiniu kodonu. Galutinis ekspresijos vektorius, pGEMEX/BSSL, buvo patikrintas nustatant DNR seką, panaudojant specifinius BSSL vidinius pradmenis.

Žinduolio ląstelių kultūra ir transfekcijos

Vektoriai buvo drauge transfekuoti j pelių ląstelių liniją C127 (ATCC CRL 1616), pagal kalcio fosfato precipitacijos būdą [Graham, F.L., ir Van der Eb, A.J. (1973): Virology 52, 456-467].

C127 ląstelės augintos Ham'o F12-Dulbecco modifikuotoje Eagle'o terpėje (DMEM), (1:1) papildytoje 10% embrioninio veršiuko serumu.

Neomicinui atsparių ląstelių klonai atrinkti panaudojant 1,5 mg x ml’¹ G418 ir po 10-15 dienų išaugę atsparių ląstelių klonai išskirti iš pagrindinių lėkštelių ir padauginti tyrimams.

Bakterijų kamienai ir auginimo sąlygos

Atliekant ekspresijos bandymus, vektorius pGEMEX/BSSL transformacijos būdu perneštas į E. coli JM109(DE3) ir BL21 (DE3)pLysS kamienus. Ekspresijos bandymai atlikti pagal Studier ir kt. (1986) aprašymą. Surinkus bakterijų derlių, ląstelės nusodintos centrifūguojant (5000 x g, 10 min prie 4°C). Ruošiant periplazmos ir citoplazmos frakcijas, centrifugavimo nuosėdos pakartotinai suspenduotos panaudojant 4 ml 20 mM Tris-CI/20% sacharozės, pH 8,0, 200 μΙ 0,1 M EDTA ir 40 μΙ lizocimo (15 mg/ml vandenyje) kiekvienam centrifugavimo nuosėdų gramui. Suspensija laikyta 40 minučių ant ledo. Pridėta po 160 μΙ 0,5 M MgCl2 kiekvienam centrifūgavimo nuosėdų gramui, po to suspensija centrifūguota 20 minučių prie 12000 x g. Gautas supernatante buvo periplazmos proteinai, o centrifūgavimo nuosėdose - citoplazmos frakcija. Ruošiant tirpiuosius baltymus, ląstelės suspenduotos 40 mM Tris-CI, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM fenilmetilsulfonilfloride, pH 8,2, ir lizuojant keletą kartų šaldomos ir atšildomos bei paveikiamos ultragarsu. Ląstelių lizatas centrifūguotas (30000 x g, 30 min prie 25 °C).

2. REZULTATAI

BSSL iRNR ekspresija žinduoliu ląstelėse

Rekombinantinių BSSL genų ekspresijos tyrimui RNR išskirta iš atskirų ląstelių linijų. Northern blotingo eksperimentai ir hibridizacija su Apžymėtąja BSSL cDNR parodė, kad rekombinantinė iRNR aptinkama visose ląstelių linijose, priėmusiose BSSL vektorių. Kontroliniuose pavyzdžiuose, paimtuose iš ląstelių linijų, turinčių tą patį vektorių, bet be BSSL cDNR, hibridizacija nebuvo aptikta.

BSSL variantu produkavimas žinduolių ląstelėse

Surinkta terpė iš C127-ląstelių, transfekuotų pilno ilgio BSSL ir įvairiomis mutantinėmis formomis, atskirų klonų ir tirtas BSSL aktyvumas. Klonuose su didžiausia ekspresija pilno ilgio molekulės ir variantų N, B ir C aktyvumai svyravo nuo 0,7 iki 2,3 ųmol riebiųjų rūgščių išlaisvinimo x min'¹ x terpės ml’¹. Tai atitiko 7-23 ųg x terpės ml'¹ ekspresijos lygiams ir buvo artimas natyvaus pieno BSSL lyginamajam aktyvumui.

Pilno ilgio BSSL ekspresija ir biocheminis apibūdinimas Eco//ląstelėse

Du E.colikamienai, JM109(DE3) ir BL21 (DE3)pLysS (Studier ir kt., 1986), transformuoti ekspresijos vektoriumi pGEMEX/BSSL, turinčiu žmogaus BSSL cDNR, kontroliuojamą T7 promotoriaus. Transformantai iš abiejų kamienų identifikuoti, auginti ir indukuoti paveikus IPTG apie 90 min (Studier ir kt., 1986). Visos iRNR Northern blotingo analizė, naudojant BSSL cDNR kaip 32P-žymėtąjį zondą, parodė, kad ekspresija buvo produktyviai indukuota abiejuose kamienuose ir kad transkripcija buvo griežtai valdoma. Matomas rekombinantinės BSSL dydis, apytiksliai 2,4 kb, derinasi su lauktu ilgiu. Baltymo pavyzdžių atskyrimas su SDS-PAGE ir imunodetekcija su anti-BSSL antikūnais parodė, kad E.coli efektyviai gamina pilno ilgio BSSL. BL21 (DE3)pLysS kamienas išskyrė j periplazmą daugiau proteino negu JM109(DE3).

Indukuotos su IPTG E.coli kultūros turėjo aktyvią tirpią BSSL, atitinkančią 0,5 - 4 ųg BSSL proteino/kultūros ml. VVestern blotingas parodė, kad 2060% reaguojančios medžiagos buvo netirpiose centrifugavimo nuosėdose. Neindukuotos bakterijos nerodė jokio žymaus BSSL aktyvumo.

Užrašai, pateikiami po Fig. 1-7:

Fig. 1 TDSL tripsinizacijos produktų išskyrimas aukšto slėgio skysčių chromatografija

Išvalyta TDSL paveikta tripsinu ir chromatografuota aukšto slėgio skysčių chromatografijos metodu, kaip tai aprašyta skyriuje „Medžiaga ir metodai“. Nurodyti pikai surinkti ir išvalyti rechromatografija ir nustatyta jų aminorūgščių seka.

Fig. 2 cDNR nukleotidų seka ir apskaičiuota žmogaus tulžies druskos stimuliuojamos lipazės aminorūgščių seka cDNR yra 2428 bazių ilgio. N-terminalinė 23-kodono seka (nt82-150), prasidedanti ATG, laikoma lyderinio peptido, kadangi N-terminalinė aminorūgščių seka subrendusio baltymo prasideda 24 kodone (nt 151, Ala). Lyderinis peptidas pabrėžtas. * ženklas nurodo egzono starto tašką. # ženklas nurodo pasikartojančios dalies starto tašką.

Fig. 3 Tulžies druskos-stimuliuojamos lipazės C-terminalinio galo GC-turtingo pasikartojimų nukleotidų sekos pakeitimai pažymėti ženklu a*

Fig. 4 Northern blot hibridizacija

Totalinės RNR, išskirtos iš moters laktuojančios pieno liaukos, kasos, riebalinio audinio ir žmogaus hepatomos ląstelių linijos (HepG2) Northern blot analizė. Totalinė RNR (10 ąg) iš laktuojančios pieno liaukos (A takelis), kasos (B takelis), riebalinio audinio (C takelis) ir HepG2 (D takelis) elektroforeze 1% agarozės gelyje 40 mM MOPS buferyje, pH 7.0 po RNR denatūracijos 1 M glioksaliu, 50 % dimetilsulfoksidu ir 40 mM MOPS.

Glioksilinta RNR po to perneša ant nitroceliuliozės popieriaus hibridizacijai su (32 P) žymėta TDSL cDNR (ABSSL).

Fig. 5 Moters pieno TDSL, žiurkės kasos lizosfolipazės (Ratlpl) [Han, J.H., Stratovva, C., a. Rutter., W.J. (1987) Biochemistry, 26, 1617-1625] ir jaučio kasos cholesterolesterazės (Bovceh) [Kyger, E., VViegand, R., a. Lange, L. (1989) Biochem. Biophys. Res. Com. 164, 1302-1309] paskaičiuotų aminorūgščių sekų palyginimas

Serino liekanos, Įeinančios į aktyvaus saito sudėtį, pažymėtos a*, o # rodo vienintelį galimą baltymo glikozilinimo signalą.

Rėmeliais pažymėti tiesioginiai aminorūgščių pasikartojimai. Suderinto sekos pažymėtos didžiosiomis raidėmis, suderintos sekos tarp 2 fermentų pažymėtos mažomis raidėmis ir nesuderintos-taškeliais.

Fig. 6 TDSL pirminės struktūros palyginimas su kitu esterazių, tiroglobulino ir vieno c-AMF-priklausomo fermento, išskirto iš Dictyostelium discoideum, pirminėmis struktūromis

TDSL: žmogaus tulžies druskos-stimuliuojama lipazė, ChesHum: žmogaus vaisiaus audinių cholinesterazė [Prody, C., Zevin-Sonkin, D., Gnatt, A., Goldberg, O. a. Soreg, H. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3555-3559], Torpace: acetillcholinesterazė, išskirta iš Torpedo marmorata [Sikorav, J.L., Krejci, E. a. Massuolie, J. (1987) EMBO J. 6, 1865-1873], Droschen: karboksilinė esterinė hidrolazė, išskirta iš Drosophiia me/aogaster [Oakeshott, J.G. Collet, C., Phillis, R.W., Niolsen, K.M., Russel, R.J., Cambers, G.K. Ross, V. a. Richmond, R.C. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84, 3359-3363], Ratlivce: karboksilinė esterazė iš žiurkės kepenų [Long, R., Satho, H., Martin, B., Kimura, S., Gonzaloz, F. a. Pohl, L. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 156, 866-873], Drosace: acetilcholinesterazė, išskirta iš Drosophiia melanogaster [Hali, L.M.C. a.

Spierer, P. (1986) EMBO J. 5, 2949-2954], ThyrHum: žmogaus tiroglobulinas [Malthiery, Y. a. Lissitzky, S. (1987) Eur. J. Biochem, 165, 491-498] ir Dict. Di: nuo c-AMF- priklausomas fermentas, išskirtas iš Dictyostelium discoideum [Mann, S.K.O. a. Firtel, R.A. (1987) Mol. cell Biol. 7, 458-469]. Šių fermentų panašūs 7 skirtingi domenai. Rėmeliais pažymėtos identiškos liekanos ir mažosios raidės žymi suderintas sekas ir identiškas liekanas visuose, išskyrus I, fermentuose. Taškeliais pažymėtos neatitinkančios molekulių vietos. Serino liekana, įeinanti į aktyvaus saito sandarą, pažymėta *. Dešinės pusės kampe esantis ženklas žymi kaip domenai orientuoti.

Fig. 7 rodo viso baltymo 1-722 aminorūgščių seką (vienos raidės kodas) ir nurodo a, b, c ir d egzonus. Ženklas # žymi pasikartojančios dalies pradžią.

lentelė TDSL peptidų aminorūgščių seka

Peptido Nr. 26 sekvenavimo metu (1 ir 2 ciklai) neindetifikuotos liekanos dėl gautų pikų interferacijos. Peptido numeris atitinka piko numerį, nurodytą Fig. 1.

TRIPSINIZACIJOS FRAGMENTAI

TP16:	LysValThrGluGluAspPheTyrLys
TP19:	GlylIeProPheAIaAlaProThrLys
TP20:	LeuValSerGluPheThrIleThrLys
TP24:	ThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg
TP26:	PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGluAsp ProSerGInGluAsnLys

lentelė a, b, c ir d egzonų identifikavimas (numeravimas kaip Fig. 2 ir 7)

egzonas	lokalizacija
tarp nukleotidų nr.	tarp aminorūgščių nr.

a	986-1172	279-341
b	1173-1376	342-409
c	1377-1574	410-474
d	1575-2415	475-722
visas baltymas	151-2316	1-722
visas baltymas be pasikartojimų	151-1755	1-535

Claims (9)

1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

   1.
2. 2.
3. 3.
4. 4.
5. 5.
6. 6.
7. 7.
8. 8.
9. 9.

   Baltymas, parodytas Fig. 7, nuo 1 iki 722 pozicijos.

   Baltymas, parodytas Fig. 7, nuo 1 iki 535 pozicijos.

   Baltymas, parodytas Fig. 7, nuo 1 iki 278 pozicijos.

   Baltymas, parodytas Fig. 7, nuo 1 iki 341 pozicijos.

   Baltymas, parodytas Fig. 7, nuo 1 iki 409 pozicijos.

   Baltymas, parodytas Fig. 7, nuo 1 iki 474 pozicijos.

   Baltymas, parodytas Fig. 7, nuo 1 iki 278 pozicijos, nuo 279 iki 341 pozicijos, nuo 279 iki 409 pozicijos, nuo 279 iki 474 pozicijos, nuo 342 iki 409 pozicijos, nuo 342 iki 474 pozicijos arba nuo 536 iki 722 pozicijos.

   Baltymas pagal bet kurj iš 1-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad yra derinyje su vienu ar daugiau pasikartojimų, nurodytų Fig. 5.

   Baltymas pagal bet kurį iš 1-8 punktų, besiskiriantis tuo, kad turi metioniną kaip papildomą N-terminalinę aminorūgštj.

   Baltymas pagal bet kurį iš 1-9 punktų besiskiriantis tuo, kad pasižymi viena ar keliomis esminėmis gamtinės tulžies druskosstimuliuojamos lipazės funkcijomis.

   Išskirta DNR molekulė, besiskirianti tuo, kad koduoja baltymą su aminorūgščių seka pagal 1 punktą.

   Išskirta DNR molekulė, besiskirianti tuo, kad koduoja baltymą su aminorūgščių seka pagal 2 punktą.

   Išskirta DNR molekulė, besiskirianti tuo, kad koduoja baltymą su aminorūgščių seka pagal bet kurį iš 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ir 10 punktų.

   Išskirta DNR molekulė, besiskirianti tuo, kad yra apibrėžta sekančiais nukleotidų numeriais nurodytais Fig. 2:

   151-2316 151 -1755 151 -985 151-1172

   151 -1376

   151-1574

   986-1172

   986- 1376

   986-1574

   1173- 1376

   1173- 1574

   15. Vektorius, besiskiriantis tuo, kad turi DNR seką, koduojančią baltymą pagal 1-10 punktus.

   16. Vektorius, besiskiriantis tuo, kad turi DNR seką pagal 11-14 punktus.

   17. Šeimininko organizmas, besiskiriantis tuo, kad transformuotas vektoriumi pagal 15 ar 16 punktus.

   18. Baltymo pagal 1-10 punktus gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad auginamas šeimininko organizmas turintis vektorių pagal 15 ar 16 punktą, ir išskiriamas baltymas.

   19. Vaistinė sudėtis, besiskirianti tuo, kad turi baltymą pagal bet kurį iš 1-10 punktų.

   20. Vaistinė sudėtis, besiskirianti tuo, kad turi baltymą pagal bet kurį iš 1-10 punktų derinyje su lipaze ar su preparatais, turinčiais lipazes.

   21. Kūdikių maisto mišinys, besiskiriantis tuo, kad turi baltymo pagal bet kurį iš 1-10 punktų priedą.

   22. DNR seka pagal 11-14 punktus, besiskirianti tuo, kad naudojama grynu pavidalu.

   23. DNR seka pagal 11-14 punktus, besiskirianti tuo, kad yra išskirtoje formoje.