PT93314B

PT93314B - Processo de floculacao - coagulacao para a obtencao de caldos de fermentacao de streptomyces sp. clarificados

Info

Publication number: PT93314B
Application number: PT93314A
Authority: PT
Inventors: Maria Concepcion Graci Alvarez; Maria Pilar J De Urrie Senante; Fernando De La Calle Verdu; Guillermo Diaz Del Aguil Sarda
Original assignee: Pharma Mar Sa
Priority date: 1989-03-01
Filing date: 1990-03-01
Publication date: 1996-02-29
Also published as: EP0385552B1; ATE112591T1; PT93314A; DE69013033D1; EP0385552A1; ES2010144A6

Description

PROCESSO DE FLOCULAÇAO - COAGULAÇAO PARA A OBTENÇÃO DE

CALDOS DE FERMENTAÇÃO DE STREPTOMYCES SP. CLARIFICADOS

Campo Técnico da Invenção

A presente Invenção refere-se ã utilização dum processo de floculação de caldos de fermentação de S treptomvces sp, consti tuindo este processo f ís i co-qu í mi co uma inovação neste campo técni^ co.

Estado da Técnica Anterior

Não existe nenhum antecedente para a floculação de caldos de cultura que permita uma separação simultânea do micélio e a des. protei ni zação e eliminação de metabolitos que interferem no proces. so posterior de purificação, isolamento e identificação do correç pondente principio activo.

A patente de invenção espanhola ηθ 537 158, faz referência a utilização de Praestol como agente adjuvante da filtração mas não faz qualquer referência ã utilização de nolielectrõlitos orgã nicos nem de nenhum outro tino de substâncias químicas como agentes f1oculantes.

Até ao presente, a floculação-coagulação tem sido uma te£ nica utilizada, quase exclusivamente para o tratamento de águas

-2residuais e sua posterior recuperação e purificação,

Descrição da Invenção

A presente invenção refere-se a um método de obtenção de caldos de fermentação floculados, conseguindo-se uma simplificação no processo de isolamento dos princípios activos produzidos por diferentes espécies de Streptomyces.

A clarificação do caldo de cultura realiza-se mediante o processo fisico-quimico de f1oculação-coagulação, Com a escolha do tipo de agente floculante adequado, elimina-se o material coloidal ou em suspensão no caldo juntamente com as substancias di£ solvidas que dificultam o processo de purificação,

De acordo com este orocesso, conseguem-se caldos complet£ mente transparentes sem a necessidade de se utilizarem métodos co£ vencionais tais como a centrtfugação, a adorção sobre carvão acti_ vado, filtração com adjuvantes, etc, Apesar disso, conseguem-se melhores rendimentos reduzindo ao máximo o numero de fases ante riores ao processo de extracção propriamente dito,

A floculação das partículas mais Dequenas inicia-se com a adição de electrolitos inorgânicos que se dispersam na solução fja vorecendo a agregação intermolecular ao 1nteractuarem com a supe£ ficie das partículas e reduzirem as forças de repulsão de curto alcance que atrasam ou impedem a agregação e sedimentação, aumento da força iõnica do caldo de fermentação favore

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ce o inicio do processo de floculação, A adição de polímeros orgâ nicos de elevado peso molecular dã lugar a formação de floculos de dimensão maior e mais compactos, facilitando muito a sua separação do caldo floculado.

Os caldos de fermentação de Streptomyces costumam ser ba£ tante complexos e os diferentes metabõlitos de interesse farmacológico que se produzem podem ficar retidos no micólio, dissolvidos na ãgua ou parte no micêlio e parte na solução aquosa, Para realizar a extracção destes compostoa do meio de cultura são necessários processos tais como a separação celular, desproteinização, dessalinização, etc,

Mediante a aplicação de filtração rotativa sob vazio ou centrifugação continua pode obter-se a separação de células do caldo, mas, posteriormente, Ó necessário realizar a dessalinização, desproteinização do meio e a eliminação dos restantes metabo 1 i tos presentes no caldo de cultura, o que suoóe perdas muito grajn des de principio activo reiativamente ã sua concentração inicial no caldo. A utilização de técnicas mais sofisticadas no processo de extracção e purificação, como a ultrafi1 tração ou a osmose inversa, não simplificaria o processo, jã que oara a sua aplicação seria necessário realizarem-se filtrações preliminares com carvão activado ou com resinas iónicas,

A presente invenção refere-se a um método de floculação-coagulação que permite obter caldos completamente transparentes com perdas pequenas dos produtos com interesse farmacológico que se tem que extrair. Por outro lado, a utilização deste processo ⁴V /

permite, nos casos em que ê necessário, realizar simultaneamente com a floculação uma extracção com um dissolvente orgânico, e ain da proporcionar uma solução aquosa, suficientemente límpida, que possibilita a sua concentração directa, quer por osmose inversa quer por ultrafi1 tração, dependendo do tamanho das moléculas dos compostos em causa.

Os derivados Inorgânicos que se utilizam mais correntemen. te são sais de metais h1drolisãveis , tais como sulfato de alumínio, sulfato fêrrico e, de forma mais favorável, cloretos de alumínio pré-hidrolisados fpolicloretos de alumínio),

Realiza-se de forma vantajosa o processo de coagulação se se aumenta a força ionica do meio, por exemplo mediante adição no caldo de fermentação de um electrõlito inorgânico.

As substâncias de floculação, coadjuvantes, são polielectrõlitos orgânicos, de preferência polímeros orgânicos sintéticos do tipo das poliaminas e ooliacri1amidas de diferentes graus de ionogeneidade dependendo da natureza química do produto activo,

Constitui objectivo da presente invenção proporcionar um processo simples e eficaz para a obtenção de caldos de cultura com pletamente isentos de células, proteínas, etc, que facilite a extracção dos compostos activos a partir dos caldos de fermentação de Streptomyces, uma vez floculados e passados através de peneiros rotativos (ou submetidos a simples filtração) para a separação dos flõculos formados. Este método consiste nas fases seguintes:

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a) Adição ao caldo de cultura dum electròlito para favorecer a acção do coagulante, como cloretos de metais alcalinos e de metais a 1 ca 1ino-terrosos , de preferência cloreto de sódio ou cloreto de potássio, vantajosamente cloreto de amónio, Geral mente, utilizam-se numa proporção de 0,5-4 g/1 de caldo de cultura, podendo, não obstante, ser uma proporção mais elevada, de acordo com os meios de cultura utilizados.

b) Incorporação sob agitação a um pH compreendido entre 5 e 8, de preferência entre 6 e 7, de um agente coagulante inorgânico, preferencia 1 mente do tipo de policloretó de alumínio com um teor de Al^Og de 10 a 20%, A quantidade necessária varia entre 2 e 20 ml/1 de caldo de cultura, iniciando-se a floculação do referido caldo e uma diminuição do pH até alcançar um valor compreendido entre 3 e 4.

c) Uma vez iniciado o processo de floculação com o agente coagulante inorgânico, adiciona-se o polielectròlito orgânico ou uma mistura destes, geralmente pollaminas ou, de oreferencfa, ooliacrj lamidas sintéticas de carácter iõnico adequado. 0 pH necessário para se obter o efeito máximo destes floculantes varia entre 6 e 8, sendo determinante para a formação e tamanho dos flõculos finais, tanto o tipo de agitação como a duração da mesma, As soluções que se utilizam nos diferentes tinos de poliacri1amidas são muito diversas, sendo as mais utilizadas as concentrações entre 0,01 e 0,2%, de preferência entre 0,05 e 0,1%, com uma concentração total no caldo de 150 a 400 mg/1 de caldo de cultura,

d) Separação dos flõculos do caldo de fermentação, o que se pode

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realizar mediante a utilização de peneiros rotativos ou por simples filtração, seguida de decantação das fases nos casos em que se realiza a floculação no caldo de fermentação na presença dum dissolvente orgânico não miscível com a água e, uma vez que se dis ponha de líquido completamente transparente, se apropriado, concen. tração previa do dito líquido, quer por osmose inversa quer por evaporação, dependendo de ser o líquido agua ou um dissolvente or g â n i c o .

método de flocu1 ação-coagulação de caldos de fermentação da presente invenção, torna possível, duma forma simples, directa e eficaz, a obtenção de líquidos floculados completamente transp^ rentes. No caso de caldos provenientes de Streptomyces clavulígerus conseguem-se rendimentos compreendidos entre 85 e 95% de sub£ tância activa relativamente ao seu teor Inicial no caldo de fermeni tação, permitindo assim elevar grandemente os rendimentos globais de obtenção do referido composto,

Nos exemplos que se descrevem em seguida, ficam claramente definidas as vantagens da utilização de agentes floculantes na obtenção de caldos completamente límpidos que permitem iniciar a extracção dos metabolitos farmacologicamente activos.

Formas de Realização da Presente Invenção

Em seguida, descrevem-se alguns exemplos ilustrativos da forma de realizar na prática a presente invenção,

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Exemplo 1

A 250 ml dum caldo de fermentação de Streptomyces clavu1Tgerus (1660 mg/1 de composto activo) adicionou-se uma solução aquosa dum poli-hidroxicloreto de alumínio, Prodefloc AR-180, numa proporção de 1/70, com prévia adição dum electrólito inorgânico, cloreto de amónio, na relação de 1:1000 (p:v), iniciando-se a fio. culação crescente a medida que se neutralizava a solução aquosa com hidróxido de sódio. Mantendo-se sob forte agitação, adiciono^ -se um polielectrõlito orgânico, neste caso Praestol 2540 a 0,05% numa concentração de 250 mg/1 e ãgua numa relação de 1:5 (v:v). Deu-se o aparecimento de grandes flõculos que se separaram em seguida do liquido sobrenadante ficando este completamente transparente e a partir do qual se pôde extrair directamente Z(2R-5R)-3-(2-hidroxietiliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo/*3,2,0/heptano-2-car boxTlico. Foi de 85% o rendimento comparativo do princToio activo do caldo floculado relativamente ao recolhido,

Exemplo 2

Procedeu-se ã floculação de 1 litro de caldo de fermentação de S. clavulTgerus. Adi ci onaram-se 1 ,2 g de cloreto de amónio e 13,5 ml/1 de policloreto de alumínio (Prodefloc AR-180), como agente iniciador da floculação. Foi aumentando a formação de flõculos a medida que se neutralizou a suspensão com hidróxido de sódio. Adicionaram-se 300 mg de Praestol 2395 em solução aquosa a 0,1%, provocando-se um aumento nos flõculos previamente formados. Adicionaram-se 100 ml de agua, mantendo-se sob agitação durante alguns minutos. A separação dos flõculos permitiu a obten-8-

ção dum liquido completamente límpido contendo 95% de princípio activo relativamente ao caldo de cultura.

Exemplo 3

Dispos-se dum caldo de fermentação de- Streptomyces clavulígerus com um teor de 1 025 mg/1 de princípio activo.

Provocou-se a floculação de 500 ml deste caldo com policloreto de alumínio, Prodefloc AR-1Q0, numa concentração de 30 ml/1. Util1zou-se como electrõlito inorgânico cloreto de amónio que se adicionou, neste caso numa relação de 3:2000 (p:v), Os flõ. culos formados aumentaram consideravelmente quando se adicionou, após prévia neutralização, Praestol 2395 em solução aquosa a 0,1% na relação de 1:5 (v:v). Depois de se adicionarem 50 ml/1 de agua agitou-se fortemente durante aproximadamente 2 minutos produzindo-se uma desagregação dos floculos formados anteriormente, o que facilitou a sua separação. Obteve-se um líquido amarelo completa-ente transparente contendo 902 mg/1 relativamente ao caldo ' de fermentação,

Exemplo 4

F1ocularam-se 500 ml dum caldo de fermentação de- Streotomyces clavulígerus /1730 mg/1) com cloreto de amonfo e Prodefloc AR-180 na relação de 1:100 C.v; v X, Neutralizou-se com hidróxido de sódio e adicionou-se, como adjuvante de floculação, 85 mg de Praestol 2500 em solução aquosa a 0,05%, Diluiu-se com agua e Dro. cedeu-se ã separação dos flõculos. 0 líquido resultante, complet^

-9mente transparente, continha 1478 mg/1 do composto activo relativamente ao caldo Inicial,

Exemplo 5

Procedeu-se a floculação de 2 litros dum caldo de fermentação de Streptomyces clavulTgerus contendo 1100 ^g/ml de composto activo. Adicionou-se cloreto de amonio numa relação (o/v) de 1:1000 e como iniciador de floculação utilizou-se Prodefloc AR-180 numa concentração de 10 ml/1. Neutralizou-se com hidróxido de potássio e adicionaram-se 480 ml duma solução aquosa de Praestol 2395 a 0,1%. Quando se iniciou o aumento dos flõculos juntaram-se 200 ml. Manteve-se sob agitação durante alguns minutos para se obter a formação total dos floculos e separou-se, em seguida, mediante utilização de penelros rotativos, Obteve-se um líquido transparente cujo volume se reduziu por um processo de osmose inversa. A concentração equivalente no caldo concentrado foi de 86% relativamente ao caldo de fermentação, A partir deste concentrado procedeu-se ã extracção do princípio activo com dissolventes orga n i c o s.

Exemplo 6

Procedeu-se de modo análogo do-se como polielectrõlito orgânico aquosa a 0,1% e uma concentração de ao do Exemplo 3 mas utilizanCrosefloc A-200 em solução 200 mg/1,

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Exemplo 7

Um caldo de fermentação de 5treptomyces c 1 avu1Tgerus (500 ml), floculou-se com cloreto de amónio (1,2 g/1) e Prodefloc AR-180 numa relação de 1:80 (v/v), Adicionou-se Crosefloc A-304 em solução aquosa a 0,1% e na quantidade de 280 mg/1 tendo-se previa, mente ajustado o pH com hidróxido de potássio para 7, Diluiu-se com água, e depois de alguns minutos de agitação formaram-se flóculos compactos que.se separaram rapidamente do liquido sobrenadante completamente transparente. 0 rendimento obtido do princTpi o acti vo foi de- 85% .

Exemplo 8

Neste caso procedeu-se como no Exemplo 3 introduzindo-se como variante a utilização da mesma concentração de Praestol 2395, mas numa solução aquosa a 0,2%, 0 rendimento foi semelhante ao obtido no caso do Exemplo 3,

Exemplo 9

Um litro de caldo de cultura de S, cl avul igertis com: um teor de Z(2R-5R)-3-(2-hidroxietilidenJ-7-oxO’'4-oxa-l-azabiciclo£*3,2 ,ojheptano-2-carboxi 1 ico de 950 mg/1, floculou-se com 1,6 g de cloreto de amónio e 12 ml de Prodefloc AR-180 (descendo o pH para 3,9) e adicionou-se hidróxido de sódio ate se obter um pH 7 e, em seguida, adicionou-se 200 ml duma solução a 0,1% de poliacr/ lamida sintética, neste caso Magnafloc 156, Desagregaram-se os flóculos formados, por agitação forte, faci1icando-se a separação

-lidos mesmos e ficando um líquido transparente de cor amarela com uma concentração de principio activo de 4,2 mmoles/1 relativamente ao caldo de cultura. Este liquido floculado concentrou-se medi, ante osmose inversa para depois se proceder a extracção do produto farmacologicamente activo.

Exemplo 10

F1ocularam-se 250 ml dum caldo de fermentação de S , d a vu1í gerus com um teor de princípio activo de 2090 yjg/ml , com cloreto de amÕnio a 1 g/1 e Prodefloc AR-180 a 14 ml/1 neutralizando-se com hidróxido de sódio. Os flõculos aumentaram de tamanho com a adição de 70 ml de Praestol 2395 a 0.1% e 50 ml de ãgua. A sep£ ração dos flõculos permitiu a obtenção dum líquido completamente transparente. 0 rendimento em princípio activo relativamente ao caldo recolhido foi de 86,4%,

Exemplo 11

Realizou-se a floculação de 2 litros dum caldo de fermentação de Streptomyces clavulígerus com 2 g de cloreto de amõnio e 28 ml de Prodefloc AR-180 como agente coagulante, Juntou-se a sus, pensão, previamente neutralizada, 560 mg de adjuvante de floculação (Praestol 2395 em solução aquosa a 0,1%) diluindo-se em segui, da com ãgua e mantendo-se sob agitação durante 2 minutos para facilitar a desagregação e separação dos flõculos, Rendimento obtido 92%.

Exemplo 12

F1ocularam-se 500 ml de caldo de fermentação de S, clavulígerus com 0,7 g de cloreto de amónio, 7 ml de Prodefloc AR-180 (neutralização com hidróxido de potássio) e Praestol 2540 a 0,1% e com uma concentração de 280 ml/1, Part1ndo-se duma concentração de princípio activo de 1340 mg/1 obteve-se uma concentração de 1165,6 mg/1 referidos ao caldo Inicial.

Exemplo 13

Procedeu-se a floculação de um caldo de cultura de S, cl avulígerus ( 1 275 mg/1 de substância activa) utH 1 zando-se, após a adição de cloreto de amónio, 14 ml/1 de Prodefloc AR-180 como age£ te coagulante. Uma vez neutralizada a suspensão resultante com hi_ drõxido de amónio, adicionaram-se 120 mg de adjuvante de floculação, neste caso Magnafloc 919 em solução aquosa a 0,05% e água em uma relação de 1:5 (v/v). Depois da separação dos flóculos formados, obteve-se um líquido completamente transparente contendo 5,5 mmoles/1 de caldo de fermentação.

Exemplo 14

A 250 ml de caldo de cultura de Streptomyces clavulígerus adic1onou-se uma solução aquosa de um poli-hidroxic1oreto de alumínio, Prodefloc AR-180, na proporção de 7:500 com adição prévia de 1,5 g/1 de cloreto de amónio. Neutralizou-se com hidróxido de sódio e juntou-se 70 mg de Praestol 2395 em solução aquosa a 0,1%, Adicionou-se ãgua até um volume de 400 ml e manteve-se sob agita-13-

ção durante alguns minutos, Deixaram-se sedimentar os flõculos for mados para posterior separação. 0 rendimento obtido em Z(2R-5R)-3-(2-hi droxietil iden)-7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo/'3,2,o/heptano-2-carboxílico foi de 94%.

Claims

REIVINDICAÇOES

1.- Processo de floculação-coagulação de caldos de fermentação de Streptomyces sp. que permite a obtenção directa de líquidos completamente transparentes, posssibilitando a separação simultânea de células, proteínas, sais e metabolitos que interferem no processo de isolamento dos princípios activos, caracterizado pelo facto de compreender as fases seguintes:

a) adição ao caldo de cultura de um electólito inorgânico para favorecer a acção do agente coagulante;

b) incorporação, sob agitação e a um pH compreendido entre

5 e 8 de um agente coagulante inorgânico como iniciador do processo de coagulação;

c) adição, uma vez iniciada a floculação, sob agitação e mantendo o pH compreendido entre 6 e 8, de um polielectrólito orgânico ;

d) separação dos flõculos formados do caldo de fermentação, utilizando tamizes oscilantes ou simplesmente filtração; decantação eventual das fases, uma vez formados e separados os flõculos, se se provocou a floculação na presença de um dissolvente orgânico imiscível com a água; e concentração eventual do líquido por osmose inversa ou evaporação.
2, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como electrólito inorgânico na fase a) um cloreto de metais alcalinos ou alcalino-terrosos ou o cloreto de amónio.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se utilizar como eletrõlito inorgânico o cloreto de sódio ou de potássio.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se utilizar como electrólito inorgânico o cloreto de amónio.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como agente coagulante inorgânico na fase b) um policloreto de alumínio com um teor em óxido de alumínio compreenddido entre 10 e 20%
6.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como polielectrõlito orgânico na fase c) uma poliamina ou uma poliacrilamida sintética,