PT85952B

PT85952B - Processo para a sintese de aminoalquilamidas peptidicas e de hidrazidas peptidicas pela tecnica da fase solida

Info

Publication number: PT85952B
Application number: PT85952A
Authority: PT
Inventors: Jochen Knolle; Gerhard Breipohl
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-10-21
Filing date: 1987-10-20
Publication date: 1990-07-31
Also published as: IE872821L; NO874374L; FI874586A0; NO172895B; FI88031C; FI874586L; DE3783009D1; JP2540564B2; NO874374D0; DK548287D0; NO172895C; AU595390B2; GR3007231T3; KR960013073B1; ATE83244T1; DK175126B1; JPS63104951A; IE60864B1; IL84195A0; DE3635670A1

Description

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. República Federal da Alemanha, em 21 de Outubro de 1986, sob ο η² P 3635 670.0

INP1. MOO. 113 RF 18732

Memória descritiva referente ã patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt/Main 80, Re pública Federal Alemã, (invento res: Dr. Gerhard Breipohl e Dr. Jochen Knolle, residentes na Re pública Federal Alemã), para PROCESSO PARA A SÍNTESE DE AMI NOALQUILÃMIDAS PEPTÍDICAS E DE HIDRAZIDAS PEPTÍDICAS PELA TÉCNICA DA FASE SÓLIDA.

MEMÓRIA DESCRITIVA

A introdução de uma aminoalquilamida no átomo de carbono terminal de um péptido biologicamente activo tem tido, em alguns casos, resultados positivos no que respeita à sua estabilidade metabólica e à sua actividade (EP-A-179 332). Na preparação dos pêptidos assim modificados utilizava-se a técnica clássica do acoplamento de fragmentos, em solução.

Na síntese de pêptidos em fase sóli da (vide Patchornila, Coen em Perspectives in Peptide Chemistry¹ pag. 118 - 128 (Karger, Basileia 1981)) não se enxertam em geral as cadeias reactivas directamente sobre a resina sintética, antes se ligam ao suporte pelos chamados spacer ou links. Conhecem-se por exemplo da literatura (por exemplo Atherton em

Sheppard em Perspectives in Peptide Chemistry, pag. 101 - 117 (Karger, Basileia 1981)) reagentes para a introdução dos tais Spacer (os chamados agentes de linkage), que obedecem ãs fó mulas VI, VII e VIII.

hoch₂-^^-ch₂-ch₂-co₂h hoch₂

och₂-co₂h hoch₂

co₂h (VII) (VIII)

Descobriram-se novos agentes de guagem que permitem a construção de péptidos modificados por noalquilamidas ou por hidrazidas, no carbono terminal, directamente pela técnica da síntese em fase sólida.

A presente invenção refere-se por isso a compostos de fórmula I (VI) lin ami (I) A-/V_p-NH-/V_m-NH-CO-O-CH

na qual significa hidrogénio ou um grupo aminoprotector reactivo em meio básico ou ligeiramente ácido, são grupos de aminoácidos, iguais ou diferentes, significa alquileno-(C^-C^₂) ou aril-(Cg-C-^θ)-alquileno-(C·^^-C12^'

Y¹, Y , Y³ e Y^ são iguais ou diferentes e significam hidrogénio, metilo, metoxi ou nitro, significando pelo menos um dos grupos hidrogénio, significa hidrogénio ou um grupo protector de carboxilo, significa ^ou ~6)-~, o ou 1, um numero um número inteiro de 0 a 6 e inteiro de 0 a 5.

Preferem-se os compostos de fórmula ou 2, em particular 0 e/ou em que m=l.

, sendo q=l-12, de preferência 1-8. De preferência pelo menos 2, 12 3 4 pecial pelo menos 3 dos grupos Y , Y , Y e Y significam génio.

em e

que p=0,l de preferência em eshidroGrupos protectores reactivos em meie o

básico ou reactivos contra ácidos fracos são, em particular, gru pos protectores de uretano como Fmoc, Ddz, Bpoc, Msc, Peoc, Psc e Tsc, de preferência Fmoc (vide por exemplo Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, N9. 3, pag. 14 - 23).

B ê o grupo de um aminoácido, de preferência de um OC-aminoácido que, caso seja quiral, pode exis tir na forma D- ou L-. Preferem-se os grupos de aminoácidos natu ralmente ocorrentes, os seus enanteõmeros, homólogos, derivados e metabolitos simples (vide por exemplo Wunsch et al., Houben-Weyl 15/1 e 2, Stuttgart, Thieme 1974). Referem-se assim por exemplo:

Aad, Abu, YAbu, ABz, S.ABz, eAca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib, (^Aib, Ala, 0Ala, ÚAla, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, Arg, Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys, Cyta, Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Dasu, Djen, Dpa, Dtc, Fel, Gin, Glu, Gly, Guv, hCys, His, hSer, Hyl, Hyp, 3Hyp, Ile, Ise, Iva, Kyn, Lant, Lcn, Leu, Lsg, Lys, |3Lys, âLys, Met, Mim, Min, nArg, Nle, Nva, Oly, Orn, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, Pic, Pro, dPro, Pse, Pya, Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, Sec, Sem, Ser, Thi, ^Thi, Thr, Thy, Thx, Tia, Tle, Tly, Trp, Trta, Tyr, Vai, bem como os grupos dos D-aminoãcidos enanteómericos correspondentes.

Os grupos funcionais nas cadeias la terais dos grupos de aminoácido referidos podem existir na forma protegida. Os grupos protectores apropriados encontram-se descri tos em Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, N9. 3, pag. 14 - 23 e em Bullesbach, Kontakte (Merck) 1980, N9. 1, pag. 23 - 35. Preferem -se os grupos que são estáveis em relação a bases e a ácidos fra cos e que podem ser removidos por acção de ácidos mais fortes.

Os grupos alquilenos podem ser line ares ou ramificados. Por arilo-(Cg-C₁₀) entende-se por exemplo fenilo, tolilo ou naftilo; prefere-se o grupo fenilo.

Um grupo protector de carboxilo, V, ê por exemplo alquilo-(C^-Cg), ou arilalquilo- (0^0^) ; prefere-se metilo, etilo, ter-butilo, benzilo e benzilo modificado como p-cloro-, p-bromo-, p-nitro e p-metoxibenzilo bem como o picolilo N-análogo. Noutra acepção entendem-se como tais grupos protec . tores grupos éster activados como ONSu, OBt, OObt ou p-nitrofeno xi.

A invenção refere-se também a um processo para a preparação de compostos de fórmula I, que se caracteriza por

a) se fazer reagir um composto de fórmula II

na qual

R é um grupo rejeitado nucleõfilo,

V é um grupo protector de carbonilo e

3 4

W, Y , Y , Y e Y se definem como anteriormente, com um composto de fórmula III

A-/V_p“NH-/X7_m-NH₂ (III) na qual

A ê um grupo aminoprotector reactivo em meio básico ou reacti vo contra ácidos fracos e

Β, X, p e m se definem como na reivindicação 1, e se remover, conforme o caso, no composto de fórmula I prote gido obtido, um ou ambos os grupos protectores A e/ou V, com formação dos grupos NH₂ e/ou COOH livres, preferindo-se os processos em que ocorre a remoção selectiva de V, por exemplo por remoção redutiva com Zn/ãcido acético, ou

b) se fazer reagir um composto de fórmula I, na qual

A significa hidrogénio e

3 4

Β, X, Y , Y , Y , Y , V, W, m, n e p se definem como na reivindicação 1, com um composto de fórmula IV

A-/B7₅__p-OH (IV) na qual

A, B e p se definem como anteriormente, mas A não significa hidrogénio, ou com os respectivos ésteres activos, halogenetos ou azidas

e, no caso de V / hidrogénio, se remover, conforme o caso, um grupo protector de carboxilo, V, com formação do grupo carboxilo.

Um grupo rejeitado nucleõfilo R é por exemplo halogénio, como cloro, bromo e iodo ou ariloxiactiva do, como p-nitrofenoxi.

A reacção de um composto de formula II com um composto de fórmula III efectua-se de preferência num solvente aprótico como por exemplo THF, DMF, CHCl^ ou CH₂C1₂, vantajosamente na presença de uma base como por exemplo uma amina terciária, por exemplo etildiisopropilamina, trietilamina ou piridina, sendo vantajoso adicionar um catalisador de acilação, como por exemplo DMAP, HOObt ou HOBt, a uma temperatura entre 09 C e o ponto de ebulição da mistura reaccional, de preferência en tre 0 e 409C.

Os compostos de fórmula I (Anidrogénio) fazem-se reagir com compostos de fórmula IV, com os respectivos ésteres activos, halogenetos ou azidas, de preferência num solvente orgânico como DMF, vantajosamente na presença de uma base, como por exemplo uma amina terciária, a uma temperatura entre -109C e a temperatura de ebulição da mistura reaccional, de preferência ã temperatura ambiente. Ésteres activos apropriados são por exemplo os compostos ONSu-, OBt-, OObt- e p-nitrofenoxi. Os derivados halogenados preferidos são os cloretos. Para melhorar a solubilidade pode adicionar-se perclorato de piridínio.

de fórmula II preparam

Os compostos

-se por exemplo, fazendo reagir ésteres de fórmula IX Y¹ Y2

(IX) em que

2

Y , Y , gnifica hidrogénio, com fosgénio ou derivados de fosgénio, como por exemplo éster ni trofenílico de ácido clorofórmioo, num solvente aprótico polar, por exemplo TMF ou DMF, na presença de uma base terciária, por anteriormente, mas V nao s:.

r

exemplo uma amina terciária como piridina, de preferência na pro porção de 1:1, a uma temperatura entre -409C e a temperatura ambiente, de preferência entre -20 e 09C.

A invenção refere-se ainda ã utilização de um composto de fórmula I, na qual V significa hidrogénio e A não significa hidrogénio, na síntese em fase sólida de compostos de fórmula V

P-NH-/X7_m-NH₂ (V) na qual

P ê um grupo peptídico de q £ p+1 -aminoácidos e X, m e p se definem como anteriormente, i bem como a um processo para a preparação de um pêptido de fórmula V, na qual Ρ, X, m e p se definem como anteriormente, por sín tese em fase sólida, que se caracteriza por se acoplar um cornpo^ to de fórmula I, na qual A não significa hidrogénio e V ê hidrogénio, a uma resina, se remover o grupo de protecção A, se acoplar em passos sucessivos q-p oC-aminoácidos, eventualmente na forma dos seus derivados activados, protegidos temporariamente por grupos aminoprotectores reactivos em meio básico ou reactivos contra ácidos fracos, e se libertar da resina, após a síntese, o pêptido de fórmula V, por meio de tratamento com um ácido moderado a forte, removendo-se simultâneamente, ou por técnicas adequadas em seguida, os grupos protectores das cadeias laterais temporariamente introduzidos.

Caso seja necessário para impedir reacções secundárias ou para a síntese de péptidos especiais, pro tegem-se também os grupos funcionais na cadeia lateral dos amino ácidos por grupos protectores apropriados (vide por exemplo T.W. Greene, Protective Groups in Organic Syntheses, New Yory, John Wiley & Sons, 1981), empregando-se principalmente Arg(Tos), Arg (Mts), Arg(Mtr), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His (Trt) , Lys(Cl-2), Lys (Boc) , Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr (Bzl), Thr(Bu^fc)

As resinas utilizadas como material • de suporte podem obter-se no mercado. Preferem-se as resinas BHA - e MBHA.

A libertação do péptido de fórmula V efectua-se então por tratamento com ácidos moderados a fortes usualmente utilizados na síntese peptídica (por exemplo, ãcido trifluoroacetico, HC), durante o qual se removem os grupos de protecção uretano contidos no Spacer.

Como reagente de acoplamento para o composto de fórmula I (V = H) e para os outros derivados de aminoácidos podem utilizar-se todos os reagentes de activação usuai na síntese peptídica, veja-se por exemplo Houben-Wely, Methoden der organischen Chemie, vol. 15/2, mas em especial carbodiimidas como por exemplo N,N'-diciclohexilcarbodiimida, N,N'-diisopropil carbodiimida ou N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida. Neste caso, o acoplamento ã resina pode efectuar-se directamente por adição de derivados de aminoacidos ao reagente de activação e, conforme o caso, a um agente de racemização, como por exemplo 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 708 (1970)) ou 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidrobenzotriazina (HOObt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 2054 (1970)) ou po de efectuar-se separadamente a pre-activação do derivado de aminoãcido a forma de anidrido simétrico ou de éster de HOBt ou HOObt e adicionar-se a solução da espécie activada, num solvente apropriado, ã resina peptídica acoplante.

O acoplamento ou activação do composto de fórmula I (V = H) e dos derivados de aminoácido a um dos reagentes de activação acima mencionados, pode efectuar-se em cloreto de metileno ou em dimetilformamida ou numa mistura dos dois. O derivado de aminoácido activado emprega-se normalmen te num excesso de 1,5 a 4 vezes. Nos casos em que se verifica um acoplamento incompleto, repete-se a reacção de acoplamento sem proceder préviamente ao bloqueamento dos grupos oó -amino da res_i na peptídica necessário para o acoplamento dos aminoãcidos seguintes .

O resultado da reacção de acoplamen to pode tratar-se por meio da reacção com ninidrina, como se des creve por exemplo em E. Kaiser et al. Anal. Biochem. 34 595 (1970). A síntese pode conduzir-se também de forma automatizada, por exemplo com um sintetizador peptídico modelo 430A da firma

Applied Biosystems, podendo utilizar-se os programas de síntese previstos pelo fabricante ou programas elaborados pelo proprio utilizador, Os últimos aplicam-se em especial à utilização de de rivados de aminoácido protegidos com o grupo Fmoc.

Na libertação das amidas peptídicas da resina, com fluoreto de hidrogénio e ácido trifluoroacêtico, adicionam-se em geral como captores catiõnicos substâncias como fenol, cresol, tiocresol, tioanisole, anisole, etanoditiol, sulfureto dimetílico, sulfureto etilmetílico ou uma mistura de dois ou mais destes aditivos. 0 ácido trifluoroacêtico pode neste caso utilizar-se deluído em solventes adequados, como por exemplo cloreto de metileno.

Abreviaturas utilizadas:

Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

Ddz ©c,pc-dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarbonilo

Bpoc 2-/bifenil- (4)_/-propil- (2) -oxicarbonilo

Msc metilsulfoniletiloxicarbonilo

Peoc piridiletiloxicarbonilo

Pse fenilsulfoniletiloxicarbonilo

Tse tolisulfoniletiloxicarbonilo

HONSu N-hidroxisuccinimida

HOBt 1-hidroxibenzotriazole

HOObt 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidrobenzotriazina

THF tetrahidrofurano

DMF dimetilformamida

DMAP dimetilaminopiridina

Os exemplos seguintes destinam-se a esclarecer a presente invenção sem contudo a limitarem.

EXEMPLO 1

Éster metílico do ácido 4-hidroximetilfenoxiacético

Dissolve-se 18,2 g de acido 4-hidroximetilfenoxiacético juntamente com 17,1 ml de N,N-diisopropiletilamina em 50 ml de DMF e adiciona-se então à solução sob agita * ção 6,1 ml de iodeto de metilo. Deste modo a mistura aquece li- • geiramente. ApÓs 3 horas a reacção está terminada. Evapora-se o solvente. Toma-se o resíduo em éter e extrai-se uma vez com ãcido clorídrico 0,5 N. Extrai-se a fase aquosa três vezes com éter lavam-se as fases etéreas reunidas com solução aquosa de hidroge nocarbonato de sódio e concentra-se. Dissolve-se o resíduo em acetato de etilo e filtra-se com sílica gel numa coluna curta. 0 óleo amarelo pálido obtido após concentração cristalisa deixando -se em repouso.

Os espectros de massa e de NMR concordam com a estrutura acima indicada

EXEMPLO 2

Fmoc-NH-(CH₂)₄-NH-CO-O-CH

Dissolve-se 9,8 g de éster metílico do ácido 4-hidroximetilfenoxiacético em 200 ml de CH₂C1₂ seco, adiciona-se então 10,1 g de éster p-nitrofenílico do ãcido cloro fórmico e 7 ml de trietilamina. Seca-se ã ebulição sob refluxo durante 6 horas, até o educto estar completamente consumido. Adi ciona-se então uma suspensão de 15,5 g de Fmoc-NH-(CH₂)₄~NH₂(preparado por reacção de Boc-NH-(CH₂)₄~NH₂ com Fmoc-ONSu e em seguida remoção de Boc) em 100 ml de CH₂C1₂ seco bem como de mais 7 ml de trietilamina e leva-se a mistura ã ebulição sob refluxo. Após terminada a reacção evapora-se o solvente, digere-se o resí duo com éter e filtra-se. Lava-se o resíduo de filtração com solução de Na₂COg 1 N e depois com ãgua quente e seca-se num exsica dor de alto vácuo.

Ponto de fusão 122-1249C, os espectros de massa e de NMR estão de acordo com a estrutura indicada acima.

EXEMPLO 3 h₂n-(ch₂)₄-nh-co-o-ch

Faz-se uma suspensão de 5,2 g do és ter obtido no Exemplo 2 em 100 ml de metanol e adicionam-se 6 Equivalentes de uma solução de NaOH 1 N. Após o fim da reacção leva-se a pH 3 com ácido clorídrico aquoso 1 N e evapora-se o me tanol. Filtra-se o precipitado, lava-se com pouca ãgua e digere-se depois com êter e filtra-se novamente.

Ponto de fusão a partir de 1969C (decomposição), os espectros de NMR e de massa estão de acordo com a estrutura dada.'

EXEMPLO 4

o-ch₂-cooh

Fmoc-Phe-NH-(CH₂)₄-NH-CO-O-CH

Faz-se uma suspensão de 1,5 g do produto obtido no Exemplo 3 em 50 ml de DMF seca. Adiciona-se en tão sucessivamente 0,9 g de perclorato de piridínio (para melhorar a solubilidade) bem como 2,6 g de Fmoc-Phe-OObt e 0,5 ml de trietilamina. Agita-se a mistura à temperatura ambiente. Apõs o fim da reacção evapora-se o solvente e extrai-se o resíduo com acetato de etilo e ãgua. Extrai-se novamente a fase aquosa com acetato de etilo e secam-se e concentram-se as fases orgânicas reunidas. Digere-se o resíduo com pouco CHClg e filtra-se. Lava-se o resíduo de filtração com pouco êter e seca-se.

Ponto de fusão a partir de 1409C (decomposição), os espectros de NMR e de massa são compatíveis com a estrutura dada.

EXEMPLO 5

Fmoc-Phe-NH-(CH₂)₄-NH-CO-O-CH₂ zilhidrilamina)

Dissolve-se 1,4 g do acido Fmoc-fεπί lalaminaspacer obtido no Exemplo 4 juntamente com 350 mg de HOBt em 40 ml de DMF seca e adiciona-se a 3,66 g de resina 4-metilbenzidrilamina (Nova Biochem, carga 0,4 mMol/g). Em seguida adiciona-se 0,6 ml de diisopropilcarbodiimida e deixou-se reagir com mistura contínua. Após terminada a reacção filtrou-se, lavaΊ

-se com DMF, isopropanol, Cl^C]^ e éter ter-butilmetilico e seca

-se em alto vacuo. Carga segundo analise elementar (por determinação de azoto): 0,3 mMole/g.

EXEMPLO 6

2 2

Síntese de /Ses-Tyr , des-Arg _/-r-artriopeptina III-(4-amino)-butilamida

A síntese do péptido efectua-se em 1 g da resina acima utilizando-se ésteres de OOBt de Fmoc-aminoâcidos num sintetisador peptídico automático, modelo 430A da fir ma Applied Biosystems com programas de síntese modificados pelo utilisador.

Para tal coloca-se 1 mMole do derivado de aminoãcido correspondente nas cartridges fornecidas pelo fabricante; colocam-se nas cartridges Fmoc-Arg(Mtr)-OH, Fmoc-Asn -OH e Fmoc-Gln-OH juntamente com 1,5 mMole de HOBt. A pré-activa ção destes aminoácidos efectua-se directamente nas cartridges por dissolução em 4 ml de DMF e adição de 2 ml de uma solução 0,55 M de diisopropilcarbodiimida em DMF. Dissolve-se o éster de HOObt em 6 ml de DMF e bombeia-se juntamente com os aminoácidos arginina, asparagina e glutamina prê-activados in situ sobre a resina previamente desbloqueada com 20% de piperidina em DMF. Acoplam-se duas vezes os aminoácidos activados in situ.

Terminada a síntese remove-se a butilamida peptídica da resina, removendo-se simultaneamente os grupos protectores das cadeias laterais com ácido trifluoroacêti co contendo tioanisole e m-cresol como captores catiõnicos. Dige re-se o resíduo obtido após evaporação do ácido trifluoroacêtico com acetato de etilo e centrifuga-se. 0 péptido bruto resultante trata-se, para remoção do grupo protector da cisteína, com tribu tilfosfina em trifluoroetanol. Após remoção do solvente digere-se novamente com acetato de etilo e centrifugou-se. Oxida-se imediatamente o péptido bruto reduzido com iodo em ácido acético aquoso a 80%, remove-se o excesso de iodo com acido ascórbico e dessalinisa-se a mistura reaccional, após concentração a reduzido volume, em ®Sephadex G25 com solução aquosa de ácido 1 N. Reu

nem-se as fracções que contêm o péptido puro e liofilizam-se. Segundo análise elementar o péptido corresponde à composição em aminoácidos da fórmula indicada.

EXEMPLO 7

Éster fenacílico do ácido 4-hidroximetilfenoxiacetico

Dissolve-se 182 g de ácido 4-hidroximetilfenoxiacético e 199 g de -bromoacetofenona em 600 ml de DMF seca e adiciona-se então rapidamente gota a gota a 09C 138 ml de trietilamina. Deixa-se atingir a temperatura ambiente e agita-se durante a noite. Verte-se a solução em DMF sobre 3,5 1 de água e extrai-se a fase aquosa com acetato de etilo. Lava-se a fase orgânica com água, seca-se sobre sulfato de sódio e concentra-se. Por evaporação o produto precipita. Filtra-se, lava-se com acetato de etilo/n-hexano 1:1 e seca-se em alto vácuo. Ponto de fusão: 94-959C, o espectro de NMR está em concordância com a estrutura acima dada.

EXEMPLO 8

O-CH

Dissolve-se 30 g de éster fenacílico do ácido 4-hidroximetilfenoxiacetico, sob atmosfera de gás inerte, em 500 ml de uma mistura de THF/piridina 1:1 e arrefece-se a -209C. Em seguida adiciona-se gota a gota 21 g de éster p-nitrofenllico do ácido clorofórmico dissolvidos em 100 ml de THF. Após 30 minutos de agitação a esta temperatura deixa-se aque cer a 09C e agita-se a mistura em 1 1 de uma solução aquosa semi -saturada de NaCl e agita-se durante 30 minutos a partir dos 09C. Filtra-se o precipitado, lava-se com água gelada e após secagem enxagua-se com n-hexano.

Ponto de fusão: 142-1459C, o espectro de NMR está de acordo com a estrutura dada.

EXEMPLO 9

Fmoc-Phe-NH-(CH₂)_g-NH-CO-O-CH₂

o-ch₂-co₂-ch₂-co

NaCl. Filtra-se após a secagem

Colocam-se num balão na forma sólida 9,3 g do produto obtido no Exemplo 8, 12,25 g de trifluoroace tato de Fmoc-Phe-NH-(CH₂)_g-NH₂ e 3,6 g de HOObt e cobre-se com uma mistura de 2,58 g de etildiisopropilamina em 100 ml de DMF sec seca. Em seguida agita-se durante 3,5 horas a 409C e então agita -se em 500 ml de solução aquosa semi-saturada de o precipitado formado, lava-se com ãgua gelada e lava-se com éter/acetato de etilo. Ponto de fusão: 147-1509C, os espectros de NMR e de acordo com a formula dada acima.

Os compostos seguintes (Exemplos 10 a 14) preparam-se de modo análogo ao do Exemplo 9:

EXEMPLO 10

Fmoc-Phe-NH-(CH₂)₄-NH-CO-O-CH₂

O-CH₂-CO₂-CH₂-CO

Ponto de fusão: 144-1479C, os espectros de NMR e de massa corres pondem à fórmula dada.

EXEMPLO 11

Fmoc-Ala-NH-(CH₂)_g-NH-CO-O-CH₂

O-CH₂-CO₂-ch₂-co

Ponto de fusão: 179-1819C, os espectros de NMR e de massa corre£ pondem à fórmula dada.

EXEMPLO 12

Fmoc-NH-(CH₂)_g-NH-CO-O-CH₂

O-CH₂-CO₂-CH₂-CO

Ponto de fusão: 144-1459C, os espectros de NMR e de massa corres pondem à formula dada.

EXEMPLO 13

Fmoc-NH(CB₂)₆

-NH-CO-O-CH

Ponto de fusão: 172-1759C, o espectro de NMR corresponde à fõrmu la dada.

EXEMPLO 14

Fmoc-NH-(CH₂)₄

-NH-CO-O-CH

Ponto de fusão: 165-1669C, o espectro de NMR corresponde à fõrmu la dada.

EXEMPLO 15

Suspende-se 8,4 g de Fmoc-Phe-NH-(CH₂)g-NH-CO-O-CH₂

O-CH_n-CO~-CH_n-CO numa

2 2 i de acido acético e de 50 ml de diclorometano e mistura de 150 ml adiciona-se pouco a pouco 12 g de zinco em põ, que foi previamente activado por la vagem com HC1 1 N e etanol seco. Após poucos minutos a suspensão, sob amorenamento ligeiro, torna-se mais espessa e difícil de agitar. Adiciona-se por isso mais 80 ml de ácido acético e 50 ml de diclorometano e continua a agitar-se durante a noite. Depois d is. to filtra-se num filtro de placa porosa e lava-se com ácido acético e diclorometano. Concentra-se o filtrado, toma-se o óleo que

fica como resíduo em pouco diclorometano e agita-se com acetato de etilo e éter. Filtra-se o produto precipitado e seca-se em al to vacuo.

Ponto de fusão: decomposição a partir de 1609C, os espectros de NMR e de massa estão em sintonia com a formula dada.

Pelo método descrito no Exemplo 15 preparam-se também os compostos dos Exemplos 16 a 18.

EXEMPLO 16

Ponto de fusão: decomposição a partir de 1509C, os espectros de NMR e de massa estão em sintonia com a fórmula dada.

EXEMPLO 17

Fmoc-Phe-NH-(CH₂)θ-NH-CO-O-CH

Ponto de fusão: decomposição a partir de 1609C, os espectros de NMR e de massa estão em sintonia com a fórmula dada.

EXEMPLO 18

Fmoc-NH-(CH₂

Ponto de fusão: decomposição a partir de 1549C, os espectros de NMR e de massa estão em sintonia com a fórmula dada.

EXEMPLO 19

Fmoc-NH-(CH₂)

ί r

A síntese processa-se de modo anãlo go ao do Exemplo 2

Ponto de fusão: 115-1189C, os espectros de NMR e de massa estão de acordo com a formula dada.

EXEMPLO 20

prepara-se pelo método descrito no Exemplo 3.

Ponto de fusão: 184-1879C decomposição, os espectros de NMR e de massa estão de acordo com a fórmula dada acima.

EXEMPLO 21

Fmoc-Phe-NH-(CHg)g-NH-CO-O-CH

A síntese efectua-se de modo análo go ao do Exemplo 4.

Ponto de fusão: decomposição a partir de 1209C, os espectros de NMR e de massa estão de acordo com a fórmula dada acima.

composto de formula I na

Processo para a preparação de um

(I) qual significa hidrogénio ou um grupo aminoprotector reactivo em meio básico ou reactivo em face de ácidos fracos, significa um grupo de aminoácidos, iguais ou diferentes, significa alquileno-(C^-C^₂) ou aril-(Οθ-Ο^θ)-alquileno-(C^γ\ Y , Υ^ e Y^ são iguais ou diferentes e significam hidrogénio, metilo, metoxi ou nitro, significando pelo grupos hidrogénio, significa hidrogénio ou um grupo protector significa um grupo - ou -0-/Cíl^7_n- _r ê 0 ou 1, é um número inteiro de 0 a 6 e ê um número inteiro de 0 a 5, menos um destes

P caracterizado por

a) composto de formula II se fazer reagir um

R

de carboxilo, (II) w, t

ê um grupo de protecção de carboxilo e 12 3 4

Y , Y , Y e Y definem-se como anteriormente, com um composto de fórmula III

V

A-ZB7_p-NH-/X7_m-NH₂ (III) na qual

A é um grupo aminoprotector reactivo em meio bãsico ou reactivo em presença de ácidos fracos e

Β, X, p e m definem-se como anteriormente, e se remover, conforme o caso, no composto de formula I protegido obtido, um ou ambos os grupos protectores A e/ou V com formação dos grupos NH₂ e/ou COOH livres, ou

b) se fazer reagir um composto de fórmula I, na qual

A significa hidrogénio e

3 4

Β, X, Υ , Υ , Υ , Υ , V W, m, n e p se definem como anteriormente , com um composto de fórmula IV,

-OH (IV) na qual

A, B e p se definem como anteriormente, mas A não significa hidrogénio, ou com os respectivos ésteres activos, halogenetos ou azidas, e, no caso de V 7 hidrogénio, se remover conforme o caso, um grupo protector de carboxilo, V, com formação do grupo carboxilo.

Processo para a preparaçao de um composto de fórmula I, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por p ser igual a 0, 1 ou 2.

Claims

Processo para a preparação de um . composto de fórmula I, de acordo com as reivindicações 1 ou
2, - caracterizado por m ser igual a 1.

Processo para a preparação de um composto de formula I,
3, caracterizado por X teiro de 1 a 12.

de acordo com uma das significar ^e reivindicações 1 a q ser um número in- composto de fórmula I, de
4, caracterizado por pelo nifiçarem hidrogénio.

Processo para a preparação de um acordo com uma das reivindicações 1 a 12 3 4 menos 2 dos grupos Υ , Y , Y e Y siç[

Processo para a preparação de um péptido da fórmula I

P-NH-/V_m~NH₂ (V) na qual p ê um grupo peptídico de o<-aminoãcidos com q<p+leX, me p se definem como anteriormente, pelo método da síntese em fase solida, caracterizado por se acoplar um composto de fórmula I em que A não significa hidrogénio e V ê hidrogénio, a uma resina, se remover o grupo de protecção A, se acoplar em passos sucessivos q-p (X-aminoácidos, eventualmente na forma dos seus derivados activados, protegidos temporariamente por grupos aminoprotectores reactivos em meio básico ou reactivos em presença de ácidos fracos, e se libertar da resina, após a síntese, o péptido de fórmula V, por meio de tratamento com um ácido moderado a forte, removendo-se simultaneamente, ou i

por técnicas adequadas posteriormente, os grupos protectores das cadeias laterais temporariamente introduzidos.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 21 de Outubro de 1986, sob ο N9. P 36 35 670.0.

Lisboa, 20 de Outubro de 1987.

PROCESSO PARA A SÍNTESE DE AMINOALQUILAMIDAS PEPTÍDICAS E DE HIDRAZIDAS PEPTÍDICAS PELA TÉCNICA DA FASE SÓLIDA

A invenção refere-se para a preparação de um composto de fórmula I a um processo

A“ZV_p-NH-/x7_m-NH-CO-O-CH₂ que compreende:

(I)

a) fazer-se reagir um composto de fórmula II (II) com um composto de fórmula III

A-ZB7_p-NH-ZV_m-NH₂ (III) em presença de ácidos fracos e se remover, conforme o caso, no composto de fórmula I protegi do obtido, um ou ambos os grupos protectores A e/ou V, com formação dos grupos NH₂ e/ou COOH livres, ou

b) fazer-se reagir um composto de fórmula I, com um composto de fórmula IV,

A-/B7₅_p-OH (IV) ou com os respectivos esteres activos, halogenetos ou azidas, e, no caso de V / hidrogénio, se remover, conforme o caso, um grupo protector de carboxilo, V, com formação do grupo carboxilo.