PT816506E - Sistema para a expressao de antigenios heterologos como proteinas de fusao - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SISTEMA PARA A EXPRESSÃO DE ANTIGÉNIOS HETERÓLOGOS COMO PROTEÍNAS DE FUSÃO"

Sector Técnico [0001] A invenção está relacionada com o campo da Biotecnologia e da engenharia genética, e em particular com a expressão de proteínas heterólogas num hospedeiro microbiano através da sua fusão com peptídeos bacterianos, usando a tecnologia do DNA recombinante. Técnica Anterior [0002] A utilidade da tecnologia do DNA recombinante em produzir proteínas de qualquer origem em E. coli, tem sido extensivamente demonstrada. Para tal tem sido desenvolvido uma importante quantidade de vectores, apesar de serem necessárias novas variantes devido ao facto de, frequentemente cada gene a clonar e a expressar representar um caso individual (Denhardt, D.T. e Colasanti, J; Vectors, Butterworths, Stoneham, M pp.17911987 e Lukacsovich, T et al., Journal of Biotechnology, 13,24311990).

[0003] A síntese intracelular tem sido a estratégia mais utilizada para a obtenção de polipetídeos heterólogos em E. coli, devido aos elevados níveis de expressão alcançáveis (Goedel, D.V., Methods Enzymol., 185, 3-7, 1990). No entanto, factores tais como a sensibilidade a proteases do hospedeiro ou a toxicidade do proteína expressada podem reduzir significativamente os referidos níveis, -2- independentemente do uso de sequências regulatórias de elevada eficiência (Reads, C.A. e Saier, M.H., J. Bacteriol. 153, 685-692; Gwyn, G. W. Menbranbe Protein Expression Systems: To User’s Guide, Portland Press, London U.K. 29-82).

[0004] A clonagem de sequências nucleotídicas codificantes de proteínas de interesse em vectores apropriados, alinhadas com sequências de ácido nucleíco que codificam polipeptídeos estáveis na célula hospedeira, dá origem à expressão de produtos híbridos no citoplasma, conhecidos por proteínas de fusão (Marston, F.A.O., Biochem. J. 240, 11986). Tais polipeptídeos são geralmente menos sensíveis à degradação proteolítica pelo hospedeiro ou menos tóxicas devido à formação de corpos de inclusão, o que resulta em níveis mais elevados de expressão do que aqueles obtidos com a utilização do peptídeo estabilizador (Itakura, K et al, Science, 198,10561977).Adicionalmente, este tipo de expressão facilita e toma menos dispendioso as etapas inicias de purificação se estiverem disponíveis métodos diferentes para a renaturação da proteína recombinante. (Fischer, B., Summer, I. e Goodenough, P. Biotecnol. Bioeng., 41 3-13).

[0005] Os corpos de inclusão são agregados proteicos insolúveis que aparecem como corpos electrodensos no citosol, durante a expressão de muitas proteínas recombinantes em E. coli (Rinas, Or, e Balfey, J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 37,609-614). Eles são o resultado da interacção entre polipeptídeos parcialmente enrolados, cuja agregação é termodinamicamente favorecida devido à exposição, no seu seio, dos resíduos hidrofóbicos ao solvente (Kiefhaber, T., Rudolph, R., et al Biotechnology, 9, 825-829). O enrolamento lento de muitas proteínas eucarióticas no citosol baterias, devido á abundância de aminoácidos formadores de pontes bisulfídicas (Cisteína) ou de aminoácidos formadores de voltas beta (Prolina) tem estimulado o seu uso abundante como peptídeos estabilizadores. Um exemplo do anterior consiste na utilização, com este fim, de polipeptídeos

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-3- com actividade de ligação a anticorpos, vindo da globulina da gordura do leite humano (HMFG), de acordo com o Pedido de Patente Internacional PCT N° WO 9207939 A2 920514; a partir das regiões constantes das imunoglobulinas tal como descrito na Pedido de Patente Europeia N° EP 0464533 AI 920108; a partir da angiogenina humana (Pedido de Patente Europeia N° EP 0423641 A2 910424), da hormona de crescimento (EP 0429586 AI 910605) a glutationa-S-tranferase (WO 8809372 AI 881201) da adenil cinase suína (EP 0423641 A2 910424 e EP 0412526 A2 910213).

[0006] No entanto, a utilização de polipeptídeos estabilizadores que constituem uma parte significativa da proteína de fusão tem algumas desvantagens, se a anterior for candidata a uma vacina, uma vez que a presença de sequências estranhas pode alterar a ordem natural dos epítopos das células B e T. (Denton, G., Hudeckz, F., Kajtár, J et al, Peptide Research, 7, 258-264) ou o processamento do mesmo pelas células apresentadoras do antigénio (Del Vai, M. Schlicht, H. Ruppert, T. et al Cell 66, 1145-1153), sendo mesmo capazes de afectar seriamente a imunogenicidade do candidato a vacina através do fenómeno de supressão específica do epítopo (Etlinger, H., Immonol. Today, 13,52-55).

[0007] Como resultado do fenómeno acima mencionado, em alguns casos tem vinda a ser tentada a definição de pequenos fragmentos que estabilizam a expressão. Por exemplo o Pedido de Patente Alemã N° 35 41 856 Al (Hoechst AG) relata a possibilidade de utilizar um peptídeo estabilizador conformacionado por pelo menos os primeiros 95 aminoácidos do terminal-N da proteína humana interleucina (IL-2) para a obtenção de proteínas de fusão na forma insolúvel sintetizados em E. coli. De um modo semelhante, nas Aplicações de Patente Europeia N° 0 416 673 A2 e N° 229 998 da mesma companhia, é utilizado um peptídeo estabilizador constituído pelos primeiros 58 ou 38 aminoácidos da referida proteína. Na Patente europeia N° 416 673 Bl, os primeiros 58 -4- aminoácídos da 1L-2 são também usados, e uma estratégia similar é seguida a este propósito, no caso da utilização fragmentos N-terminais da albumina sérica humana (Pedido de Patente Europeia N° EP 0423641 AI 920212); o peptídeo activador ΠΙ do tecido conjuntivo (WO 90136647 AI 901115) e fragmentos da calicraína humana (EP 0381433 AI 900808). Estas invenções fornecem a solução para os problemas anteriores, mas os peptídeos de fusão obtidos não podem ser incluídos em preparações vacinais para utilização humana, devido à possibilidade de indução de doenças autoimunes pela presença neles de sequências idênticas ou homólogas às das proteínas humanas.

[0008] A alternativa à utilização de polipeptídeos estabilizadores de origem bacteriana - e portanto sem reactividade cruzada com antigénios de origem humana - para a expressão intracelular tem também sido explorada com sucesso. Uma das proteínas mais usadas com este fim tem sido a b-galactosidase de E. coli (Itakura, K et al., Science, 198, 10561977) ou porções da mesma (Pedido de Patente Alemã N° EP 0235754 A2 870909, da companhia Hoechst AG). A principal desvantagem deste sistema é o elevado tamanho desta proteína qoe provoca que o peptídeo desejado represente apenas uma pequena porção do total da proteína híbrida (Flowers, N. et al., Appl Microbiol. Biotechnol. 25 2671986; Goeddel, D.V. et al, P.N.A.S. USA, 76, 106). A utilização do fragmento C do toxoíde do tétano e da exotoxina de Pseudomonas sp., tem apresentado problemas semelhantes (Pedido de Patente internacional PCT WO 9403615 Al 940217 e Pedido de Patente Europeia EP 0369316 A2 900523). Uma variante de expressão muito promissora é a utilização de fusões com a tioredoxina de E. coli (Pedido de Patente PCT N° WO 9402502 Al 940203),q uen utiliza a propriedade de ser libertada da célula por stress osmótico (Elyaagoubi, A. Kohiyama, M. Richarme, G., J. Bacteriol., 176, 7074-7078) para facilitar a purificação. No entanto este perfil não é funcional para a obtenção de corpos de inclusão, uma vez que os mesmos não são libertados através deste procedimento. -5-

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[0009] Muitos destes problemas têm sido resolvidos com a concepção de proteínas de fusão modulares. Nestas, o peptídeo estabilizador está separado da proteína de interesse por um braço espaçador que permite o enrolamento independente de ambas, e cuja sequência de aminoácidos o toma susceptível de ataque por endopeptidases específicas. Se existir um ligando que reconheça o estabilizador escolhido, é possível purificar o polipeptídeo de fusão por cromatografia de afinidade e finalmente separá-lo do estabilizador através do tratamento com diferentes proteases (Cress, D. Shultz, J. E Breitlow, S. Promega you Note, 42, 2-7) Uma vantagem adicional é a possibilidade de explorar esta interacção molecular para o acompanhamento das etapas intermédias de purificação, sem a necessidade de anticorpos para cada uma das proteínas a expressar. Um exemplo bem conhecido é o da utilização da afinidade da histidina (Hys) com alguns metais tais como níquel (Ni) e o zinco (Zn) em sistemas compostos por um estabilizador com 6 Hys em sequência linear e uma matriz de afinidade de quelatos de níquel, de acordo com o é descrito na Pedido de Patente PCT N° WO 9115589 al 911017 da Upjohn Co. A pesar de tudo isto, este tipo de sistema de expressão não funciona em todos os casos, uma vez que, de entre outras razões, a proteína de interesse pode ter locais de restrição para a protease escolhida, ou estar enrolada tal que o braço espaçador está acessível ao solvente (Uhlen, Μ. E Moks, T., Meth. Enzymol. 185, 129-140; Cress, D. Shultz, J. E Breitlow, S. Promega you Note, 42, 2-7), para interferir com a ligação entre o estabilizador e a matriz de afinidade (New England Biolabs, The NEB Transcript, 3, 14) ou simplesmente porque é necessário para a purificação, condições, que afectam a sua actividade biológica. Por estas razões é desejável ter diversas variantes, uma vez que cada proteína a expressar pode representar um caso particular. Com este propósito, têm vindo a ser desenvolvidos peptídeos estabilizadores baseados na proteína de ligação à maltose de E. coli (Mal IE), que têm afinidade para com resinas de amilose (Pedido de Patente Europeia EP

«4 -6- 0426787 AI 910515); nas enzimas cloranfenicol acelillransferase (Pedido dc Patente Europeia N° EP 0131363 AI 850116) ou a glutatião-S-tranferase (Pedido de Patente Europeia N° EP 0293249 AI 88130 da Amrad Corp.Ltd.) obtidas com matrizes do substrato imobilizado; na proteína A de Staphylococcus aureus, de acordo com o Pedido de Patente PCT WO 9109946 al 910711; e a subunidade de 12,5kDa do complexo da transcarboxilase de Propionóbacterium shermani, que é biotinilado in vivo e permite a purificação baseada na afinidade da biotina pela avidina (Cress, D., Shulz, J., e Breitlow, S. Promega Notes, 42, 2-7, Pedido de • Patente N° EP 0472658 Al 920304 ou WO 9014431 Al 901129).

[0010] De particular interesse resulta o método descrito na Pedido de Patente Europeia EP 0472658 Al 920304 ou WO 9014431 Al 901129, desenvolvido pela “Biotechnology Research and Development Corporation, em conjunto com a Universidade de Illinois, EUA. Nesta Pedido de Patente é descrito um sistema de expressão que usa o domínio de ligação do ácido lipóico da di-hidrolipoamida acetiltransferase (E.C. 2.3.1.12), também conhecida por subunidade E2 do complexo piruvato desidrogenase de E. coli. Este domínio é modificado pós-translacionalmente in vivo pela adição de uma molécula de ácido lipóico a um ^ azoto de uma das suas lisinas (Guest, J.R., Angier, J.S. e Russel, G.C. Ann N.Y.

Acad. Sei., 573,76-99), o que é explorado para a purificação e identificação da proteína de fusão a si ligada, através da utilização de um anticorpo que reconhece apenas domínios lipoílato.

[0011] Este método, no entanto, apresenta uma série de desvantagens. Primeiro que tudo, é conhecido que a sobre-expressão de proteínas contendo domínios de ligação ao ácido lipóico excede a capacidade celular de lipoilação, produzindo como consequência domínios não-lipoílato. (Thousands, J.S. e Guest, J.R. Biochem J., 245, 869-874; Ali, S.T. e Guest, J.R. Biochem. J. 271, 139-145) ou octanoílatos (Ali, S.T. Moir, A.J. Ashton, P.R. et al Mol Micrbiol., 4, 943-950;

Dardel, F. Packman, L.C. e Perham, R.N. FEBS Lett. 295, 13-16, υ que pode reduzir o rendimento durante a purificação por imunoafinidade. Em segundo lugar, existe um grupo de doenças com uma origem supostamente autoimune, que possuem como factor comum a presença de anticorpos que reconhecem especificamente o ácido lipóico no contexto destes domínios. De entre elas temos a Cirrose biliar primária, uma doença crónica caracterizada pela inflamação e progressiva obstrução dos duetos intrabiliares hepáticos (Tuaillon, N., Andre, C., Briand, J.P. et al J. ImmunoL, 148, 445-450);e a hepatite provocado pelo halotano, um anestésico de uso generalizado que derivatisou algumas proteínas através da formação de trifluoroacetil-lisina (Gut, J., Christen, Or., Frey, N. et al Toxicology, 97 199-224). O soro dos pacientes com esta doença reconhece os referidos complexos, cuja estrutura molecular é mimetizada pelo ácido lipóico no contexto das di-hidrolipoamida acetiltransferases (Gut, J., Christen, Or., Frey, N. et al Toxicology, 97 199-224). Por esta razão é desejável evitar a presença de ácido lipoico em tais peptídeos, se as proteínas de fusão que o contêm constituem candidatos a vacinas para uso humano.

Descrição da Invenção.

[0012] Esta invenção fornece uma proteína de fusão contendo um peptídeo estabilizador fusionado com a proteína de interesse, onde o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos do terminal N do antigénio P64K de Neisseria meningitidis e tem a sequência (SEQID NO:6) 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.

[0013] Esta invenção fornece também um método para produzir proteínas de interesse como proteínas de fusão em Escherichia coli, em que um peptídeo é fusionado com a referida proteína como um estabilizador para a sua expressão e é -8- usado um anticorpo monocional específico para o estabilizador para a imunodetecção de qualquer proteína com ele em fusão e onde o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos do terminal N do antigénio P64K de Neisseria meningitidis e tem a sequência (SEQID NO:6) 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.

[0014] Para além disto, esta invenção fornece um anticorpo monocional que é específico para um peptídeo estabilizador e que é útil para a imunodetecção e purificação de qualquer proteína com ele em fusão, onde o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos do terminal N do antigénio P64K de Neisseria meningitidis e tem a sequência (SEQ ID NO:6) 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.

[0015] Esta invenção fornece também um vector de expressão para proteínas de fusão em Escherichia coli, que contem uma sequência codificadora para o peptídeo estabilizador sob o controlo do promotor de triptofano de Escherichia coli, seguido pelos locais de restrição Xbal, EcoRV e BamHI, para a clonagem, em grelha, de fragmentos de DNA codificantes de polipeptídeos de interesse e o terminador de fago T4 como sinal de terminação transcripcional, assim como o gene de resistência à ampicilina como marcador selectivo, onde o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos do terminal N do antigénio P64K de Neisseria meningitidis e tem a sequência (SEQ ID NO:6) 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.

[0016] Para além disto esta invenção fornece um estirpe recombinante de

Escherichia coli, que produz uma proteína de fusão contendo um peptídeo estabilizador fusionado a uma proteína de interesse, onde o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos do terminal N do antigénio P64K de Neissería meningitidis e tem a sequência (SEQID NO:6) 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.

[0017] Esta invenção fornece também a utilização de uma proteína de fusão tal como aqui definida, para a manufactura de preparações de vacinas para uso humano e veterinário; e uma preparação de vacina que contem a proteína de fusão tal como aqui definida assim como um adjuvante adequado.

[0018] É objecto da presente invenção um procedimento para a expressão a elevados níveis de proteínas heterólogas com polipeptídeos de fusão em E. coli, que se baseia na utilização de tuna sequência estabilizadora derivada dos primeiros 47 aminoácidos do antigénio P64K de N. meningitidis B:4;P1.15 (Pedido de Patente Europeia N° 0 474313 A2), o que lhes confere a capacidade de serem expressas como corpos de inclusão. A referida sequência, a pesar de apresentar homologia com parte do domínio de ligação do ácido lipoico das di-hidrolipoamida acetiltransferases, foi geneticamente manipulada para eliminar a possibilidade de modificação por si própria a apresenta a vantagem de ser reduzidamente imunogénica. Este procedimento inclui também a utilização de um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente o estabilizador mencionado, permitindo a imunodetecção de qualquer proteína em fusão com o mesmo.

[0019] Particularmente, na presente invenção, é usado um plasmídeo recombinante como vector de expressão que transporta a referida sequência sob o controlo do promotor de triptofano (ptrip) de E. coli, seguido pelos locais de -10- restrição Xbal, EcoRV e BamHI. Estes permitem a clonagem em grelha de fragmentos de DNA codificantes de polipeptídeos de interesse Este vector inclui também um terminador de transcrição do gene 32 do bacteriófago T4 e um gene de resistência à ampicilina como marcador selectivo.

[0020] este procedimento toma também possível a inclusão do polipeptídeo de fusão obtido em preparações vacinais destinadas a uso humano; e a natureza do peptídeo estabilizador empregue permite a geração de uma resposta imune protectora contra a proteína estranha ou o contra o peptídeo multiepitópico a ele ligado.

[0021] Constitui uma novidade da presente invenção a manipulação genética e a utilização de um peptídeo estabilizador homólogo com parte do domínio de ligação do ácido lipóico das di-hidrolipoamida acetiltransferases, para a produção de proteínas de fusão pela tecnologia do DNA recombinante em E. coli. Particularmente, constitui novidades da presente invenção a utilização, com o objectivo prévio, de um peptídeo estabilizador derivado dos primeiros 47 aminoácidos do antigénio P64K de N. meningitidis B:4;P1.15 (Pedido de Patente Europeia N° 0 474313 A2), e um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente o estabilizador. EXEMPLOS: % EXEMPLO 1: [0022] O antigénio LpdA de N. meningitidis (P64K, LpdA) é uma proteína de 594 aminoácidos que pertence à família das di-hidrolipoamida desidrogenases (EC 1.8.1.4) e especificamente, a um novo subgrupo de entre elas, caracterizadas por possuírem um domínio de ligação ao ácido lipoico, análogo àquele presente -11- nas di-hidrolipoamida acetiltransferases na sua região N-terminal (Kruger, N Opperman, F.B. Lorenzl, H e Steinbôchel, A., J. Bacteriol., 176, 3614-3630, 1994; Hein, S. Steinbiichel, A., J. Bacteriol., 176, 4394-4408, 1994). A proteína LpdA foi clonada e sobre expressa em E. coli, com a adição de 5 aminoácidos (MLDKR) na sua extremidade N-teiminal (Pedido de Patente Europeia N° 0 474 313 A2-, Figura 1). Apesar de as denominações LpdA e P64K serem equivalentes, o nome P64K será usado para referência à proteína recombinante.

[0023] De modo a determinar a imunogenicidade dos diferentes fragmentos do referido antigénio e para analisar a possibilidade de utilizar os menos imunogénicos como peptídeos estabilizadores, os epítopos para as células B presentes em P64K foram localizados através da avaliação da reactividade de um soro policlonal anti-P64K contra peptídeos sintéticos.

[0024] Com este fim a proteína P64K foi purificada (Pedido de Patente Europeia N° 0474 313 A2) por cromatografia hidrofóbica de Butil-TSK e por filtração em gel; e foi desnaturada por precipitação com ácido tricloroacético (TCA), neutralizando-os com NaOH e equilibrando-os em tampão fosfato por cromatografia de filtração em gel. Esta preparação foi usada para imunizar 30 ratinhos Balb/c por via subcutânea com doses de 20mg adjuvadas com 2mg de hidróxido de alumínio (dia 0), que sofreram em seguida um reforço com o mesmo antigénio 7 e 21 dias depois. Os soros foram recolhidos 28 dias após a primeira extracção Os soros obtidos foram combinados, e a mistura resultante foi alíquotadâ e armazenada a -20°C.

[0025] Para além disso, 59 peptídeos de 20 aminoácidos (a.a.) cada um cobrindo a sequência completa da proteína recombinante e sobrepostos por 10 a.a. foram sintetizados usando um kit comercial para síntese em fase sólida (Multipin Peptide Synthesis System, Chairon Mimotope Pty., Ltd. USA) em placas com o -12-

Mh^rb

formato de 96 poços e seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Estes foram subsequentemente numerados a partir do extremidade N-terminal da proteína. A reactividade do soro antiP64K contra estes peptídeos foi determinada utilizando uma diluição 1:2000 do mesmo, e o formato do imunoensaio usado foi o mesmo que o recomendado pelo fabricante do kit comercial prévio.

[0026] Os resultados estão apresentados na Figura 2, em são representados os valores de absorvância para cada peptídeo. É evidente que os primeiros 110 aminoácidos (representados pelos peptídeos 1 a 11) formam um segmento fracamente imunogénico, a pesar da desnaturação do imunogénio, que pode até expor epítopos crípticos. Este segmento inclui essencialmente o domínio de ligação ao ácido lipóico e a região espaçadora rica em Prolina e Alanina que ligam ao resto da proteína. Este resultado demonstra que o peptídeo estabilizador (ou fragmentos dele derivados) podem ser usados vantajosamente como peptídeos estabilizadores devido à pequena influência que teriam na imunogeni-cidade dos polipeptídeos com os quais estão em fusão. Esta vantagem é especialmente importante se o polipeptídeo de fusão constituir um candidato a vacina. EXEMPLO 2: [0027] De modo a expressar diferentes proteínas heterólogas em E. coli, através da sua fusão com o domínio de ligação ao ácido lipóico do antigénioP64K de N. meningitidis B:4:P1.15, o vector de expressão pM83 foi construído, em que foi introduzida a sequência codificante do peptídeo estabilizador, derivada dos primeiros 47 aminoácidos da referida proteína. (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 1) Esta sequência é clonada sob o controlo do promotor do triptofano de E. coli, incluindo o terminador do bacteriofago T4 como sinal para terminação transcripcional, e o gene de resistência à ampicilina como marcador selectivo. -13- c ! *-Λ [0028] Para obter o vector de expressão PM-83, o peptídeo estabilizador foi primeiro amplificado usando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) (Randall, K. et al., Science, 42394, 487-491, 1988) a partir do plasmídeo pM-6, que transporta a sequência nucleotídica codificante do antigénio P64K (Pedido de Patente Europeia N° 0 474 313 A2-, Figura 1). Para este propósito foram usados, os iniciadores oligonucleótidicos 1573 e 1575, que introduzem os locais de restrição Ncol e Xbal, no fragmento de DNA amplificado que corresponde com os aminoácidos das extremidades dos terminais carboxílicos do estabilizador por ele codificado:

Ncol

1573: 5' TTCCATGGTAGATAAAAG 3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 2)

Xbal

1575: 5' TTTCTAGATCCAAAGTAA 3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 3) [0029] A sequência de aminoácidos codificada pelo estabilizador resultante é mostrada na Figura 3 (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 6) A introdução do local de restrição NcoL muda a Leucina 2 pela Valina; e o iniciador 1575 elimina a sequência ETD (posição 45-47), introduzindo no seu lugar a sequência DEL. Deste modo a Lisina de ligação do ácido lipoico (posição 48) não faz parte do estabilizador, e a sua vizinhança, que se encontra altamente conservada nestes domínios (Russel, G.C., Guest, J.R. Biochim BioPhys Record., 1076, 225-232) é alterada. Tudo isto garante a eliminação das possibilidades de lipoilação pós-translaeional das proteínas dc fusão que contêm estes domínios, e a geração, durante a imunização com estas proteínas, de auto anticorpos de especificidade semelhante àquelas presentes em pacientes com cirrose biliar primária (Tuaillon, N., Andre, C., Briand, J.P. et al J. Immunol., 148,445-450); [0030] O plasmídeo ρΜ-83 foi construído através da clonagem deste fragmento (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 5) previamente digerido com Xbal/Ncol no plasmídeo pILM-29 (Guillén, G., Loyal, M., Alvarez, A., et ah, Acta Biotecnológica, 15, 97-106, 1995). O plasmídeo pILM29 contem o gene para a proteína Opc (5c) de N. meningitidis em fusão com um peptídeo estabilizador consistente nos primeiros 58 aminoácidos da IL-2 humana, tal que esta clonagem remove o fragmento de IL-2 e coloca em fusão o Opc com o estabilizador das proteína P64K (Figura 4). A partir do plasmídeo resultante designado por pM-80 o gene opc foi excisado utilizando as enzimas Xball e BamHI, e em seu lugar foi clonado um adaptador formado pela hibridização dos oligonucelótidos 1576 e 1577, que introduzem os locais de restrição Xball, EcoRV e BamHI no extremo 3’ do fragmento estabilizador: 1576 5' CTAGATTTGATATCAG 3' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 7) 1577 3' TAAACTATAGTCCTAG 5' (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 8) [0031] Este plasmídeo foi designado por pM-83 (Figura 4). A inserção de todos os fragmentos de DNA e também de oligonucleótidos, assim como a manutenção da correcta grelha de leitura, foram verificados por sequenciação de Sanger F. et al., (PNAS, USA 74: 546311977). EXEMPLO 3: [0032] E importante que o estabilizador não contenha regiões de alta homologia com proteínas humanas se a resultante proteína de fusão é candidata a uma vacina. A determinação da similaridade do peptídeo estabilizador com o pM-83 (EXEMPLO 2) com proteínas humanas foi alcançada através de uma busca de homologias em bases de dados da Biblioteca de Dados da EMBL V. 38 (Curl, -15- C.M. Fuches, R. Higgins, D.G., Nucl. Acids, Beast. 21, 2967-3971, 1993) dc sequências nucleotídicas, e SWISS-PROT v.38 (Bairoch, A. E Boeckmann, B. Nucl. Acids Beast. 21, 3093-3096, 1993) das sequências de aminoácidos, ambas as versões de Março de 1994. Para esta busca foram usados dois dos programas BLAST (Alschul, S.F. Gish, W. Miller, W., Myers, e W. Lipman, D.J., J. Mol.Biol., 215:403-410): BLASTP, que compara uma sequência de um aminoácido contra uma base de sequências de proteínas (neste caso SWISS-PROT) e TBLASTN, que compara uma sequência de aminoácidos contra todas as translações em ambas as direcções e em todas as grelhas de leitura de uma base de sequências nucleotídicas, como neste caso a Biblioteca de Dados do EMBL; em ambos os casos foi usada uma matriz de valorização PAM120 [Dayhoff, M.O. Schwartz, R.M. e Orcutt, B.B., in Dayhoff, M.Or. (of.) Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, supl. 3, 345-352, Nation. Biomed. Beast. Found. Washington, 1978].

[0033] O resultado pode ser observado nas figuras 5 e 6, em que as folhas dos respectivos resultados do BLASTP e de TBLASTN são mostradas (sequências homologas de procariótas e de eucariótas inferiores foram omitidas para uma melhor apreciação). É óbvio que nenhuma proteína humana ou de qualquer outro mamífero apresentam semelhanças significativas com o estabilizador derivado a partir do P64K; Uma vez que as homologias detectadas por ambos os algoritmos (nas cinases do purivato humanas e de rato; e na extremidade C-terminal das mucinas humana e canina) apresentam um mais elevada probabilidade de ocorrência casual (como ponto de comparação , a mesma probabilidade, para o caso da di-hidrolipoamida desidrogenase de Azotobacter vinelandii, é de 3,7 X IO'5).

[0034] De tudo o que foi acima referido pode-se concluir que a utilização do referido estabilizador em candidatos a vacinas é absolutamente segura. - 16- Μ CL —Λ» ( EXEMPLO 4: [0035] A capacidade de o presente estabilizador no pM-83 permitir a síntese intracelular em elevados níveis e na forma de corpos de inclusão foi avaliada, comparando a expressão de várias proteínas em fusão com os 22 ou 58 aminoácidos da interleucina-2 humana (IL-2), um peptídeo de fusão muito utilizado para este fim, ou em fusão com os primeiros 47 a.a. do antigénio P64K modificado de acordo com o descrito no EXEMPLO 2.

[0036] Para este propósito, os genes codificadores das proteínas da membrana externa de N. meningitidis B:4P1.15 Por A e Opc foram clonados nos vectores pFP15 (WL2-58); Patente Europeia N° 416 673 B!) ou pM-83 (P64K-47); e nos vectores pISL31 (hIL-2-22), Castellanos-Sierra, L.R. Hardy, E., Ubieta, R. et al artigo submetido) oupM-83, os genes codificantes de um polipeptídeo multiepitópico (MEP) que inclui regiões imunogénicas de vários isolados do vírus da imunodefíciência humana, HIV. Os resultantes plasmídeos de expressão são: pILM-28 (IL-2-58 Por A; Guillén, G. Alvarez, A. Lion, L., et al., 494-498 in: Conde-González, C.J. Morse, S. Rice, P et al, (eds.)., Pathobiology and Immunobiology of Neisseriaceae, Instituto de Salud Pública Nacional. Cuemavaca, México, 1994), pM-82 (P64K-47 PorA: Niebla, O. Alvarez A. Gonzáles, S. et al 85-86 in Evans, J.S. Yost, S. e Maiden, MCJ et al (eds.). Neisseria 94: Proceedings of the IX International Pathogenic Neisseria Conference, Winchester, England, 1994), pILM-29 (IL-2-29 OPC: Guillén, G. Leal, M. Alvarez, A. Et al., Acta Biotecnológica. 15, 97-106, 1995). PM-80 (EXEMPLO 2, Figura 4), pTAB4 (IL2-22 + MEP) e pTAB9 (P64K-47 MEP).

[0037] As proteínas TAB4 e TAB9 são polipeptídeos multiepitópicos (MEP) que incluem várias cópias da parte central da região variável 3 (V3) da proteína - 17-

gpl20 do HIV-1. Para a construção destes MEP, foram seleccionados 15 aminoácidos centrais da região V3 dos seguintes isolados: LR150: SRGIRIGPGRAILAT {NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 9) JY1: RQSTPIGLGQALYTT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 10) RF: RKSITKGPGRVIYAT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 11) MN: RKRIHIGPGRAFTYTT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 12) BRVA: RKRITMGPGRVYYTT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 13) IIIB: SIRIQRGPGRAFVTI (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 14)

Estas regiões estão ligadas por um peptídeo espaçador de cinco aminoácidos, coma sequência AGGGA (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 17).

[0038] Para alcançar isto, a sequência de DNA codificante dos epítopos V3 ligadas pelo peptídeo espaçador foi obtida por síntese química (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 21) e foi clonado sob o controlo do promotor da triptofano, em fusão com os primeiros 22 aminoácidos da IL-2 humana (Figura 7) A partir do plasmídeo resultante, designado por pTAB3, um fragmento contendo o gene de MEP o promotor do triptofano e o terminador T4, foi excisado por digestão com as enzimas Seal e HindIII, e é clonado em pUC19 (Yanish-Perron, C. Et al., 1985, Gene 33, 103-119)para obter o pTAB4 (Figura 7). Finalmente, o pTAB9 foi construído eliminando a sequência codificante do estabilizador derivado a partir da IL-2 humana por digestão com as enzimas Ncol e Xbal,e clonado. No seu lugar, um fragmento codificante dos primeiros 47 aminoácidos do antigénio P64K obtido pela reacção em cadeia da polimerase (PCR), tal como descrito no EXEMPLO 2. A sequência do MEP resultante é mostrada na Figura 8, e a sua organização na Figura 9A. -18- [0039] As estirpes hospedeiras de E. coli K-12 usada para lodos estes plasmídcos foi a W3110 (Hill, C.W. e Hamish, B.W. Proc. Natl. Acad. Sei. 78, 7069, 1981; Jensen, K.F., J. Bacteriol., 175, 3401-3407, 1993) para pILM-28, pILM-29, pM-80 e pM-82; e a W3110 trpA905, para pTAB4 e pTAB9. A expressão foi alcançada em todos os casos inoculando uma cultura de 5mL de meio LB (Sambrock, J. Fritsch, Y.F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Manual láboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York, USA) com ampicilina (Ap) até 50mg/mL e triptofano (w) até lOOmg/mL, que foi crescida 12 h a 37°C. A referida cultura foi usada para inocular uma cultura de 50 mL de LB-Αρ (pTAB4 e pTAB9) ou um meio definido composto por sais M9 (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972, New York, USA), glucose a 1%, hidrolisado de caseína a 1%, CaCL 0,lmM, MgCl2 lmM e Ap até 50mg/mL (pILM-28, pILM-29, pM-80, pM82), aqueles que foram crescidos 12h a 37°C e 250 r.p.m. Após este tempo, foram colhidas amostras de proteína total e analisadas por electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), Laemmli, O.K. Nature, 277, 680, 1970) e corado com Comassie Brilliant Blue R-250. A percentagem de expressão foi analisada num densitómetro de laser Bromma-LKB. A sua localização celular foi determinada, lisando as células através de tratamento combinado com lisozima e ultrasons, depois de algum tempo as proteínas solúveis foram separadas daquelas insolúveis por centrifugação. A insolubilidade da proteína foi usada como critério para assumir a sua expressão como corpos de inclusão, uma vez que as condições sob as quais eles podem exibir o referido comportamento (associação com membranas ou peptidoglicano) são improváveis de ocorrer neste caso.

[0040] Um sumário dos resultados pode ser visto na Figura 10A. Em todos os casos a expressão sob o estabilizador derivado do P64K é comparável com a expressão obtida quando em fusão com peptídeos de IL-2 no que diz respeito a proteína heteróloga: proteína celular total (ver Figura 10B para o caso de MEP), -19-

quc confirma a capacidade do pM-83 scr usado como vcctor para a expressão de peptídeos de fusão. Vale a pena notar que estes polipeptídeos são difíceis de expressar em E. coli se não estiverem em fusão, quer pelo seu pequeno tamanho e sensibilidade a proteases do hospedeiro, como o MEP, ou pela sua toxicidade no caso da proteína PorA e as porinas bacterinas em geral (Carbonetti, N. Η. E Sparling, P.F. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.., 84, 9084-9088). Em todos os casos o produto foi obtido como corpos de inclusão, como é exemplificado para o pTAB9 (Figura 10C).

[0041] Em conclusão, é possível delinear que a utilização de um estabilizador derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos do antigénio P64K de N. meningitidis (P64K-47) resulta numa eficiência de expressão de proteínas heterólogas como corpos de inclusão, comparáveis com os de outros sistemas (Aplicações de patentes europeias N° 0416 673 A2 e N° 229 998, Hoechst AG; Patente Europeia N° 0416 673 Bl; Castellanos-Sierra, L.R. Hardy, E. Ubieta, R., et al, manuscrito submetido), com o beneficio adicional de o produto poder ser usado directamente (isto é, sem o separar do estabilizador) devido à ausência de homologia significativa com antigénios de origem humana. EXEMPLO 5: [0042] A disponibilidade de um ligando que reconhece especificamente o estabilizador (por exemplo um anticorpo, um cofactor enzimático, etc.) é uma característica desejável em qualquer sistema de expressão de proteínas recombinantes. Isto é devido ao facto de o anterior poder permitir, por exemplo, a concepção de eficientes planos de purificação por afinidade se o referido ligando estiver imobilizado numa resina cromatográfica; e mesmo - no caso de anticorpos - o acompanhamento das etapas intermediárias da purificação através de técnicas imunológicas, independentemente da identidade da proteína heteróloga expressada. -20-

[0043] Tal objectivo foi alcançado imunizando ratinhos com a proteína TAB13 (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 20) de modo a obter anticorpos monoclonais (Mab) contra o estabilizador. TAB13 é um MEP derivado a partir de TAB9 que é diferente do anterior pela presença de duas regiões V3 adicionais (Figura 9B): - C6: TSITIGPGQVFYRTG (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 15) - C8: RQRTSIGQGQALYTT (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 16) [0044] Este MEP foi expressado (EXEMPLO 4) e purificado (EXEMPLO 6) de uma maneira análoga à descrita para TAB4 e TAB9.

[0045] Então, ratinhos Balb/c foram imunizados por via subcutânea com 3 doses de 20mg de TAB13 adjuvado em hidróxido de alumínio em 15 dias de intervalo. O animal foi reforçado por via interperitoneal com 20mg do mesmo antigénio em tampão fosfato, 20 dias depois da última dose. As células de baço foram fundidas com o mieloma X63 Ag( 653 e os hibridomas resultantes foram isolados e testados de acordo com métodos estabelecidos (Gavilondo, J. V. (ed.), Monoclonal Antibodies: Theory ans Practical, Elfos Scientiae, 1995, The Havana, Cuba).

[0046] A reactividade dos anticorpos segregados pelos hibridomas isolados foi avaliada por ELISA, revestindo as placas com MEP TAB13, a proteína P64K ou peptídeos sintéticos que rcpresentamas diferentes regiões V3 presentes em TAB13. Foram obtidos, no total, 18 clones positivos, um dos quais, designado por 448/30/7, reconheceu TAB13, bem como 64K, mas nenhum dos peptídeos de gp 120. -21- Ath^rb [0047] A especificidade deste Mab pelo peptídeo estabilizador do pM-83 e a possibilidade do seu uso para a detecção imunológica de proteínas que o contenham, foi determinada por Western blotting, utilizando diferentes amostras, proteínas heterólogas em fusão com o estabilizador derivado a partir de P64K (P64K-47), ou a mesma proteína em fusão com os primeiros 58 aminoácidos de IL-2 (IL-2-58). Para alcançar isto, a estirpe de E. coli MM294 foi transformada (Sambrock, J. Fritsch, Y.F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: To Manual Laboratoiy, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, New York, USA) com os seguintes plasmídeos: pILM-28 (IL2-58 + porA), pM-82(P64K-47 + porA), pTAB13 (P64K-47 + MEP), pM-6 (p64K) e pFP15 (IL-2). O plasmídeo de expressão pM-134 foi também usado, que contem os primeiros 120 aminoácidos de P64K, que inclui o domínio de ligação ao ácido lipóico sob o controlo dos mesmos sinais reguladores como nos plasmídeos anteriores. Este segmento foi amplificado por PCR utilizando o iniciador 1573 (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 2) e 2192 (NÚMERO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA: 4); foi digerido com as enzimas Ncol e BamHI, e foi clonado no plasmídeo pFP15 (ver EXEMPLO 4) digerido de modo idêntico. A expressão destes transformantes foi conseguida em condições de crescimento especificadas no EXEMPLO 4 para pTAB4 e para pTAB9.

[0048] Os resultados obtidos estão representados na Figura 11. Como pode ser observado, Mab 448/30/7 reconhece um epítopo provavelmente linear incluído no estabilizador P64K-47, devido à sua reactividade com as amostras dos plasmídeos pM-6, pM-82, pTAB13 e pM134, a pesar de todas estas proteínas serem antigenicamente diferentes. Esta experiência demonstra que em caso algum esta reactividade é devida à proteína em fusão com o estabilizador (por exemplo os plasmídeos pILM-28 e< pM-82: ambos albergam o gene porA sob diferentes estabilizadores) o que evidencia a especificidade do reconhecimento deste MAb. -22- £2-..—*.( vi [0049] Em conclusão, este sistema de expressão formado pelo estabilizador P64K-47, os plasmídeos que o contêm e o Máb 448/30/7 permitem a síntese eficaz e na forma de corpos de inclusão de uma grande variedade de proteínas, e a sua detecção sem a disponibilidade prévia de sondas imunológicas contra o polipeptídeo a expressar. EXEMPLO 6: [0050] A ausência de efeitos prejudiciais na resposta imune contra o polipeptídeo em fusão com o estabilizador é um factor importante a levar em conta após a selecção de um sistema de expressão para candidatos a vacinas. Uma das vantagens do sistema de expressão baseado no estabilizador P64K-47 é precisamente a sua reduzida imunogenicidade (EXEMPLO 1) o que garante o à frente descrito. A pesar de tudo, a influência do estabilizador P64K-47 na resposta imune contra a proteína em fusão foi avaliada qualitativamente através da comparação da resposta de anticorpos contra os diferentes peptídeos da região V3 presentes em ΜΕΡ TAB4 (IL2-22) e TAB9 (P64K-47).

[0051] Para a expressão e purificação de TAB4 e TAB9, a biomassa da estirpe W3110 trpA905 + pTAB4 e W3110 trpA905 + pTAB9 foi obtida tal como descrito no EXEMPLO 4. Esta biomassa foi rompida combinando o tratamento com lisozima com tratamento de ultrasons na presença de fluoreto de fenil-metilsulfonoil (PMSF) e do detergente não-iónico Triton-X-100;os corpos de inclusão foram obtidos por centrifugação diferencial, e os MEP foram parcialmente purificados e solubilizados por dois ciclos sucessivos de lavagens dos corpos de inclusão com agentes caotrópicos e detergentes (TAB4: 1. Ureia 4M Triton-x-100 1%, 2. Ureia 8M. TAB9: 1. Ureia 8M Triton-x-100 1% cloreto de guanidilo 6M). Os sobrenadantes obtidos foram fmalmente purificados através de um gradiente de 20 a té 80% de acetonitrilo numa coluna C4 YYDAC de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), sendo alcançada uma pureza de aproximadamente 90%.

[0052] As proteínas recombinantes purificadas foram adjuvadas num gel de hidróxido de alumínio usando uma relação de 60 mg de adjuvante por mg de proteína. Estas preparações foram usadas para imunizar 5 grupos de coelhos por via subcutânea com 200 mg/dose. A resposta imunológica foi avaliada por ELISA, utilizando placas de poliestireno de 96 poços (High binding, Costar, USA), com as paredes revestidas com o MEP usado para a imunização, ou com peptídeos correspondentes a cada uma das regiões V3 nele presentes. Os títulos foram calculados como a diluição máxima de cada soro com um valor de absorvância duas vezes mais elevado do que uma mistura de soros pré-imunes. Todos os soros foram analisados em duplicado.

[0053] Os valores obtidos (Figura 12) mostram que os títulos contra as regiões V3 são semelhantes entre os variados IL2-22 +MEP, (TAB4) e P64-47 + MEP (TAB9). Apesar de a frequência de reconhecimento dos peptídeos ser ligeiramente superior para TAB9, esta diferença não é estatisticamente significativa (p<0,05). Em conclusão, a imunogenicidade da proteína heteróloga é afectada pelo estabilizador P64K-47 de um modo mínimo, e comparável com outros sistemas de expressão correntemente em utilização.

Descrição das Figuras: [0054] Figura 1: Sequência nucleotídica do gene IpdA codificante de P64K. A sequência adicionada ao plasmídeo pM-6 é mostrada em itálico (Pedido de Patente Europeia N° o 474 313 A2), originalmente ausente no gene IpdA.

[0055] Figura 2: Reactividade do soro policlonal de ratinho contra peptídeos de P64K. Foi escolhido um valor mínimo de 0,4 unidades de densidade óptica para considerar o resultado como positivo.

[0056] Figura 3: Sequência de aminoácidos do estabilizador, deduzida a partir da sequência de DNA amplificada por PCR a partir do +plasmídeo pM-6 As sequências sublinhadas correspondem aos iniciadores ologonucleotídicos.

[0057] Figura 4: Estratégia para a construção do plasmídeo pM-83.

[0058] Figura 5: Resultados da busca de homologia entre as sequências do estabilizador (“Quety”) e aquelas presentes na base SWISS-PROT (“Sbjct”), utilizando o programa BLAST. Apenas é mostrado o resultado daquelas correspondentes às humanas ou de mamífero. P(N) representa a probabilidade de encontrar N alinhamentos iguais dentro da base composta por sequências aleatórias; a significância da homologia diminui com o valor de P(N). Resíduos idênticos são representados pelos seus códigos de uma letra; as substituições conservadas com um “+” e as diferenças não estão indicadas.

[0059] Figura 6; resultados da busca de homologia entre as sequências do estabilizador (“Query”) e todas as possíveis traduções de sequências da biblioteca de dados do EMBL (“Sbjct”), usando o programa TBLASTN. Apenas é mostrado o resultado daquelas correspondentes às humanas ou de mamífero. P(N) representa a probabilidade de encontrar N alinhamentos iguais dentro da base composta por sequências aleatórias; a significância da homologia diminui com o valor de P(N). Resíduos idênticos são representados pelos seus códigos de uma letra; as substituições conservadas com um “+” e as diferenças não estão indicadas. -25-

[0060] Figura 7: Estratégia para a construção dos plasmídeos pTAB4 e pTAB9.

[0061] Figura 8: Sequências nucleotídicas e de aminoácidos de ΜΕΡ TAB9.

[0062] Figura 9: A: Estrutura geral de ΜΕΡ TAB4 e TAB9. B: Estrutura geral de ΜΕΡ TAB13 [0063] Figura 10: Comparação da expressão dos genes por A, opc e MEP sob estabilizadores derivados a partir daIL-2 humana ou dos primeiros 27 aminoácidos do antigénio P64K. A: Tabela comparativa WL2-58 refere-se aos primeiros 58 aminoácidos da IL-2 humana, hIL2-22 aos primeiros 22 e p64k-47 ao estabilizador derivado dos primeiros 47 aminoácidos do antigénio P64K. B: Análise comparativa por SDS-PAGE da expressão de MEP nos plasmídeos TAB4 e TAB9, Coluna A: marcadores de peso molecular. B: proteínas totais da estirpe W3110 trpA905\ C. Proteínas totais de W3110 trpA905 + pTAB4; D: TAB4 purificado; E: proteínas totais de W3110 trpA905 pTAB9; F: TAB9 purificado. C: Expressão de TAB9 em corpos de inclusão. A: proteínas solúveis da amostra, B: proteínas insolúveis ou da membrana.

[0064] Figura 11: Western Blotting utilizando Mab 448/30/7 com amostras de proteína total de E. coli MM294 transformada com: 1 controlo negativo, 2: pM-6 (P64K), 3:pM-82 (p64K-47 + por A), 4: pTAB13 (p64K-47 + MEP), 5:pFP15 -26- (EL-2), 6: pM-134 (P64K-120), 7: pILM-28 (1L2-58 + por A). Os indicadores de peso molecular estão indicados à esquerda.

[0065] Figura 12: Recíproco do valor do título por ELISA dos coelhos imunizados com TAB4 e TAB9. MG: Média geométrica do recíproco dos títulos anti V3; R: Percentagem de reactividade com os peptídeos V3.

Lisboa, 3 de Abril de 2001 C_

ALBERTO CANELAS Agente Oficia! da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (14)

1. - 1 - Ij*. Kl"7 ( «Ί REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão contendo um peptídeo estabilizador em fusão com uma proteína de interesse, em que o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos da extremidade N-terminal do antigénio P64K de Neisseria meningitiâis e tem a sequência (SEQID N°:6): 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.
2. 2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de interesse é uma proteína da membrana externa de Neisseria meningitidis.
3. 3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 2, em que a proteína de interesse é uma proteína da membrana externa Opc(5c) ou a proteína da membrana externa PorA de Neisseria meningitidis.
4. 4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de interesse é um polipeptídeo multiepitópico (MEP) que inclui várias cópias da parte central da região V3 da proteína gp 120 do HIV-1.
5. 5. Método para produzir proteínas de interesse como proteínas de fusão em Escherichia coli, em que o peptídeo está em fusão com a referida proteína como estabilizador para a sua expressão e é usado um anticorpo monoclonal específico para a imunodetecção de qualquer proteína com ele em fusão, em que o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos da extremidade N-terminal do antigénio P64K de Neisseria meningitidis e tem a sequência (SEQ ID N°:6): -2- Μ ^ *ιμι>·4 I *ri. 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a proteína de interesse é qualquer proteína que possa ser empregue como imunogénio numa preparação vacinai.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a proteína de interesse é um polipeptídeo multiepitópico (MEP) que inclui várias cópias da parte central da região V3 da proteína gp 120 do HIV-1, ou uma proteína da membrana externa Opc(5c) ou PorA de Neisseria meningitidis.
8. 8. Anticorpo monoclonal que é específico para um peptídeo estabilizador e é útil para a imunodetecção e purificação de qualquer proteína em fusão com ele, em que o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos da extremidade N-terminal do antigénio P64K de Neisseria meningitidis e tem a sequência (SEQID N°:6): 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.
9. 9. Vector de expressão para proteína de fusão em Escherichia coli que contem a sequência codificante para um peptídeo estabilizador sob o controlo do promotor de triptofano de Escherichia coli seguido pelos locais de restrição Xbal, EcoRV e BamHI para a clonagem em grelha de fragmentos de DNA codifícantes de polipeptídeos de interesse e do terminador do fago T4 como sinal de terminação da transcrição, assi como o gene de resistência á ampicilina como marcador selectivo, em que o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos da extremidade N-terminal do antigénio P64K de Neisseria meningitidis e tem a sequência (SEQ ID N°:6): 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE. -3-
10. 10. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 9 para a clonagem em grelha, de fragmentos de DNA codificando proteínas da membrana externa de Neisseria meningitidis.
11. 11. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 9 para a clonagem em grelha de fragmentos de DNA codificantes de um polipeptídeo multiepitópico (MEP) que inclui várias cópias da parte central da região V3 da proteína gp 120 do HIV-1.
12. 12. Estirpe recombinante de Escheríchia coli que produz uma proteína de fusão contendo um peptídeo estabilizador em fusão com uma proteína de interesse, em que o referido peptídeo estabilizador é derivado a partir dos primeiros 47 aminoácidos da extremidade N-terminal do antigénio P64K de Neisseria meningitidis e tem a sequência (SEQID N°:6): 10 20 30 40 47 MVDKRMALVE LKVPDIGGHE NVDIIAVEVN VGDTIAVDDT LITLDLE.
13. 13. Utilização de uma proteína de fusão de cada qualquer uma das reivindicações 1 até 4 na manufactura de preparações vacinais para uso humano ou veterinário.
14. 14. Preparações vacinais que contêm uma proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 até 4 assim como um adjuvante adequado. Lisboa, 3 de Abril de 2001 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industriai· RUA VICTOR CORDON, 14, 1200 LISBOA*