PT731834E

PT731834E - Estabilizacao de enzimas por copolimeros em bloco

Info

Publication number: PT731834E
Application number: PT95904182T
Authority: PT
Inventors: James C Lee
Original assignee: Buckman Labor Inc
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 2000-09-29
Also published as: WO1995015371A1; ES2148479T3; EP0731834A1; ATE193319T1; CN1064074C; CZ154996A3; ZA949653B; SK68996A3; DE69424683D1; CA2177997A1; BR9408185A; US5780283A; NO962263L; CN1136823A; CA2177997C; JPH09506127A; DE69424683T2; FI962304L; FI118341B; EP0731834B1

Description

DESCRIÇÃO "ESTABILIZAÇÃO DE ENZIMAS POR COPOLÍMEROS EM BLOCO" Área Técnica A área da invenção é a estabilização de enzimas através de um tensoactivo copolimero em bloco de poliéter-poliol não-iónico.

Estado da Técnica

De um modo geral as enzimas são formuladas em composições enzimáticas liquidas de base aquosa para um processo particular. Estas composições enzimáticas liquidas, no entanto, têm historicamente sido importunadas com problemas tais como instabilidade quimica, que pode resultar na perda de actividade enzimática, particularmente durante a armazenagem. Este problema crítico de perda de actividade enzimática durante a armazenagem tem afectado particularmente a indústria dos detergentes líquidos. Não é incomum ter produtos industriais, tais como composições enzimáticas líquidas, armazenadas em armazéns em vários climas à volta do mundo em que o produto é sujeito a uma temperatura que pode variar desde a temperatura de congelação até acima dos 50°C durante períodos prolongados. Depois de uma armazenagem a temperaturas extremas variando desde 0o até 50°C durante muitos meses, a maioria das composições enzimáticas líquidas perde desde 20 até 100 por cento da sua actividade enzimática devido à instabilidade das enzimas. 1

Têm sido feitas várias tentativas para estabilizar enzimas contidas em composições enzimáticas liquidas. As tentativas para aumentar a estabilidade de composições enzimáticas líquidas utilizando formulações contendo álcoois, gliceróis, éteres de dialquilglicol, e misturas destes e outros compostos têm tido apenas um sucesso marginal, mesmo em gamas de temperatura de armazenagem moderadas.

Na Patente U.S. NQ 4,801,544, de Munk, utilizou-se como estabilizador um sistema de etileno glicol e tensoactivo de álcool linear etoxilado não-iónico com solvente hidrocarboneto e foi descrita a encapsulação de enzimas em micelas na mistura de solvente/tensoactivo. O teor de água da composição foi mantido a menos de 5 por cento, e a estabilidade da enzima foi verificada a 35°, 70° e 100°F. A estabilização de uma preparação enzimática aquosa utilizando certos ésteres foi descrita por Shaer na Patente U.S. NS 4,548,727. O éster utilizado como estabilizador tem a fórmula, RCOOR', em que R é um alquilo com desde um até três carbonos ou hidrogénio, e R' é um alquilo com desde um a seis carbonos. O éster está presente na preparação enzimática aquosa numa quantidade desde 0,1 até cerca de 2,5% em peso. O ingrediente enzimático que é utilizado de acordo com o titular da patente é uma preparação enzimática comercial vendida na forma de um pó seco, solução ou suspensão contendo desde cerca de 2 por cento até cerca de 80 por cento de enzimas activas e um veículo tal como sulfato de sódio ou de cálcio, cloreto de sódio, glicerol, tensoactivos não-iónicos ou misturas destes como os 20 por cento até 98 por cento restantes.

Letton et ai., na Patente U.S. no 4,318,818, descrevem um sistema estabilizador para composições enzimáticas aquosas em que o sistema estabilizador compreende iões cálcio e um ácido carboxílico de baixo peso molecular ou um seu sal. O pH do sistema estabilizador é desde cerca de 6,5 até cerca de 10. 2

Guilbert et al., na Patente U.S. NQ 4,243,543, descrevem a estabilização de composições de detergentes liquidas contendo enzimas proteoliticas. As composições de detergente são estabilizadas por adição de um antioxidante e um poliol hidrofilico à composição enquanto se estabiliza o pH da composição.

Weber, na Patente U.S. Nfi 4,169,817, descreve uma composição liquida para limpeza contendo enzimas estabilizadas. A composição é uma solução aquosa contendo desde 10% até 50% em peso de sólidos e incluindo estruturantes de detergentes, agentes tensoactivos, um sistema enzimático derivado de Bacillus subtilus e um agente estabilizador de enzimas. Os agentes estabilizadores compreendem sais de sódio ou de potássio altamente solúveis em água e/ ou hidroxi álcoois solúveis em água e permitem que a solução seja armazenada durante periodos prolongados sem desactivação das enzimas.

Dorrit et al., na Patente Europeia NQ 0 352 244 A2, descrevem composições de detergente liquidas estabilizadas utilizando um tensoactivo anfotérico.

Kaminsky et al., na Patente U.S. no 4,305,837, descrevem composições aquosas de enzima estabilizada contendo um sistema estabilizador de iões cálcio e um ácido carboxílico ou sal de baixo peso molecular e um álcool de baixo peso molecular. Esta enzima estabilizada é utilizada numa composição detergente. A composição pode incluir tensoactivos não-iónicos de fórmula RA(CH2CH20)nH em que R é uma unidade hidrofóbica, A é baseado num grupo que possui um átomo de hidrogénio reactivo e n representa o número médio de unidades de óxido de etileno. R tipicamente contém desde cerca de 8 até cerca de 22 átomos de carbono mas pode ser formado pela condensação de óxido de propileno com um composto de baixo peso molecular enquanto n geralmente varia desde cerca de 2 até cerca de 24. 0 álcool de 3

baixo peso molecular utilizado tanto pode ser um álcool monohidrico contendo desde 1 até 3 átomos de carbono como um poliol contendo desde 2 até cerca de 6 átomos de carbono e desde 2 até cerca de 6 grupos hidroxilo. Kaminsky et al. chamam a atenção para o facto de os polióis poderem conferir estabilidade enzimática melhorada e incluem propileno glicol, etileno glicol e glicerina.

Tai, na Patente U.S. NQ 4,404,115, descreve uma composição aquosa enzimática liquida para limpeza que contém como um estabilizador da enzima, um pentaborato de metal alcalino, opcionalmente com um sulfito de metal alcalino e/ ou um poliol. O poliol contém desde 2-6 grupos hidroxilo e inclui materiais tais como 1,2-propano diol, etileno glicol, eritritano, glicerol, sorbitol, manitol, glucose, frutose, lactose, e outros semelhantes.

Boskamp, na Patente U.S. Na 4,462,922, descreve também uma composição detergente enzimática aquosa com um estabilizador baseado numa mistura de ácido bórico ou um sal de ácido bórico com um poliol ou composto amino polifuncional juntamente com um sal de metal alcalino redutor. São utilizados substancialmente os mesmos polióis que em Kaminsky et al.. A presente invenção é dirigida a um método para proporcionar enzimas estabilizadas e uma composição enzimática estabilizada na qual são ultrapassadas as desvantagens anteriores e outras. As vantagens procuradas de acordo com a presente invenção são proporcionar um método inovador para estabilizar enzimas bem como uma composição enzimática estabilizada.

Descrição da Invenção A presente invenção é dirigida a uma composição inovadora que elimina substancialmente um ou mais dos problemas 4

e desvantagens da da invenção serão segue, e em parte precedentes e outros devidos a limitações técnica relacionada.

Caracteristicas e vantagens adicionais apresentadas mais adiante na descrição que tornar-se-ão claras pela descrição, ou podem ser aprendidas através da prática da invenção. As vantagens da invenção serão concretizadas e obtidas pela composição em causa, particularmente, as apontadas na descrição escrita e reivindicações anexas. A fim de alcançar estas e outras vantagens e de acordo com o objecto da invenção, tal como realizada e genericamente descrita, é proporcionada uma composição enzimática inovadora estabilizada contra a perda de actividade a temperaturas elevadas ou resultante da presença de água, consistindo a referida composição em água, uma enzima e uma quantidade estabilizadora de um tensoactivo não-iónico de copolímero em bloco de poliol-poliéter, opcionalmente dissolvido num solvente, em que o referido tensoactivo não-iónico de copolimero em bloco de poliol-poliéter é um copolimero em bloco de bloco único, bloco-hetérico, hetérico-bloco ou hetérico-hetérico de éter de polioxialcileno glicol em que as referidas unidades de alcileno têm desde 2 até 4 átomos de carbono.

Nos casos em que a enzima é estabilizada contra desactivação a temperaturas elevadas o tensoactivo é seleccionado de modo a ter um ponto de turvação mais elevado do que essas temperaturas. 0 tensoactivo não-iónico de copolimeros em bloco de poliéter-poliol é um copolímero em bloco de bloco único, bloco-hetérico, hetérico-bloco ou hetérico-hetérico de éter de polioxialcileno glicol em que as referidas unidades de alcileno têm desde 2 até 4 átomos de carbono e especialmente aqueles tensoactivos que contêm blocos hidrofóbicos e hidrofílicos em 5

que cada bloco se baseia em pelo menos grupos oxietileno ou grupos oxipropileno ou misturas destes grupos. É de notar que tanto a descrição geral anterior como a descrição pormenorizada que se segue são exemplificativas e explicativas e destinam-se a propocionar mais explicações sobre a invenção tal como é reivindicada.

Melhor Forma de Realização da Invenção A presente invenção é dirigida a uma composição para estabilizar uma enzima contra a perda de actividade, quer a temperaturas elevadas quer pela presença de água, combinando a enzima com um tensoactivo não-iónico de copolimero em bloco de poliéter-poliol opcionalmente dissolvido num solvente, em que o referido tensoactivo não-iónico de copolimero em bloco de poliéter-poliol é um copolimero em bloco de bloco único, bloco-hetérico, hetérico-bloco ou hetérico-hetérico de éter de polioxialcileno glicol em que as referidas unidades alcileno têm desde 2 até 4 átomos de carbono. A utilização de enzimas e composições enzimáticas liquidas na indústria e no mercado comercial cresceu rapidamente ao longo destes últimos anos. Tal como é bem conhecido, as enzimas podem ser ácidas, alcalinas ou neutras, dependendo da gama de pH em que são activas. Pode ser utilizada apenas lipase ou uma enzima compreendendo lipase, isto é, lipase em qualquer combinação com as enzimas seguintes. Todos estes tipos de enzimas estão contemplados como sendo úteis em relação com a invenção aqui revelada.

Muitas enzimas e composições enzimáticas liquidas têm sido associadas a detergentes líquidos e têm mostrado utilidade como formulações para solubilização e limpeza. Além da sua associação a detergentes líquidos, as enzimas e composições enzimáticas 6

liquidas têm também mostrado utilidade em várias áreas comerciais e industriais nas quais é agora utilizada uma grande variedade de classes de enzimas.

As proteases são uma classe de enzimas bem conhecida frequentemente utilizada numa grande variedade de aplicações industriais em que actuam para hidrolizar ligações peptidicas em proteínas e substratos proteicos. As proteases são utilizadas para auxiliar a remover nódoas baseadas em proteínas tais como manchas de sangue ou de ovo. As composições enzimáticas líquidas que contêm proteases alcalinas têm também mostrado ser úteis como dispersantes de películas bacterianas e tapetes de algas ou fungos em águas de torres de refrigeração e contentor para confinamento de fluidos de trabalhos com metais.

As proteases podem ser caracterizadas como proteases ácidas, neutras ou alcalinas dependendo da gama de pH em que são activas. As proteases ácidas incluem os coalhos microbianos, a renina (quimosina), a pepsina, e as proteases ácidas fúngicas. As proteases neutras incluem tripsina, papaína, bromeleína/ficina, protease neutra bacteriana. As proteases alcalinas incluem subtilisina e proteases relacionadas. Estão disponíveis composições enzimáticas líquidas comerciais contendo proteases sob os nomes Rennilase®, "PTN" (Tripsina Pancreática NOVO), "PEM" (Mistura de Enzimas Proteolíticas), Neutrase®, Alcalase®, Esperase®, e Savinase™, que são todas fornecidas por

Novo Nordisk Bioindustrials, Inc. de Danbury, CT. Uma outra protease comercial está disponível sob o nome HT-Proteolytic fornecida por Solvay Enzyme Products.

As amilases, uma outra classe de enzimas, também têm sido utilizadas em muitos processos industriais e comerciais nos quais actuam para catalisar ou acelerar a hidrólise do amido. Como classe as amilases incluem a-amilase, β-amilase, amiloglicosidase (glicoamilase), amilase fúngica, e pululanase. Estão disponíveis composições enzimáticas líquidas comerciais 7

contendo amilases sob o nome BAN, Termamyl®, AMG, Fungamyl®, e Promozyme ™ , que são fornecidas por Novo Nordisk, e Diazyme L- 200, um produto de Solvay Enzyme Products.

Outras classes de enzimas com valor comercial são as que afectam a hidrólise de fibras. Estas classes incluem celulases, hemicelulases, pectinases, e β-glucanases. As celulases são enzimas que degradam a celulose, um polímero linear de glucose que ocorre nas paredes das células das plantas. As hemicelulases estão envolvidas na hidrólise da hemicelulose que, tal como a celulose, é um polissacárido encontrado nas plantas. As pectinases são enzimas envolvidas na degradação da pectina, um hidrato de carbono cujo principal componente é um ácido de açúcar. As β-glucanases são enzimas envolvidas na hidrólise dos β-glucanos, que são também semelhantes à celulose no sentido em que são polímeros lineares de glucose.

Colectivamente, as celulases incluem endocelulase, exocelulase, exocelo-biohidrolase e celobiase e, para o fim a que esta invenção se destina, incluirão também hemicelulase. Estão disponíveis composições enzimáticas líquidas comerciais contendo celulases sob os nomes de Celuclast® e Novozyrní®188 que são ambas fornecidss por Novo Nordisk.

As hemicelulases que podem ser utilizadas incluem as xilanases. o produto pulpzym®, disponível de Novo Nordisk, e o produto ECOPULP®, da Alko Biotechnology, são dois exemplos de composições enzimáticas líquidas disponíveis comercialmente contendo enzimas baseadas em xilanase.

Como uma classe, as hemicelulases incluem misturas de hemicelulase e galactomananase. Estão disponíveis composições enzimáticas líquidas comerciais contendo hemicelulases como PULPZYM® da Novo, ECOPULP® da Alko Biotechnology e Novozym®280 e Gamanase™, que são ambos produtos da Novo Nordisk. 8

As pectinases que podem ser utilizadas compreendem endopoligalacturonase, exopoli-galacturonase, endopectato liase (transeliminase), exopectato liase (transeliminase), e endopectina liase (transeliminase). Estão disponíveis composições enzimáticas liquidas comerciais contendo pectinases sob os nomes Pectinex™ ultra SP e Pectinex™*, ambas fornecidas por Novo Nordisk.

As β-glucanases que podem ser utilizadas compreendem liquenosas, laminarinase, e exoglicanase. Estão disponíveis composições enzimáticas líquidas comerciais contendo β- glucanases sob os nomes Novozym®234, Cereflo®, BAN, Finizyra®, e Ceremix®, todas elas fornecidas pela Novo Nordisk.

Além das lipases, também podem ser utilizadas fosfolipases. As lipases e as fosfolipases são enzimas esterases que hidrolizam gorduras e óleos atacando as ligações éster nestes compostos. As lipases actuam sobre os triglicéridos, enquanto que as fosfolipases actuam sobre os fosfolípidos. No sector industrial, as lipases e as fosfolipases representam esterases disponíveis comercialmente. A Novo Nordisk comercializa duas preparações de lipase líquidas sob os nomes Resinase™ A e Resinase™ A 2X.

Estão disponíveis composições enzimáticas líquidas comerciais contendo lipases. Por exemplo, essas composições estão disponíveis sob os nomes comerciais Lipolase 100, Greasex 50L, Palatase™ A, Palatase™ M, e Lipozyme™ que são todas fornecidas pela Novo Nordisk.

Outra classe de enzimas com valor comercial são as isomerases que catalisam reacções de conversão entre isómeros de compostos orgânicos. 0 produto Sweetzyme™ é uma composição enzimática líquida contendo glucose isomerase que é fornecida pela Novo Nordisk. 9

As enzimas redox são enzimas que actuam como catalisadores em reacções químicas de oxidação/redução e, consequentemente, estão envolvidas na ruptura e síntese de muitos compostos bioquímicos. Actualmente, muitas enzimas redox não conseguiram um lugar proeminente na indústria uma vez que a maioria das enzimas redox requer a presença de um co-factor. No entanto, nos casos em que os co-factores fazem parte integrante de uma enzima ou não têm de ser fornecidos, as enzimas redox são comercialmente úteis.

Podem ser utilizadas as enzimas redox glucose oxidase, e lipoxidase (lipoxigenase). Outras enzimas redox têm aplicações possíveis variando desde as sínteses enzimáticas de derivados de esteróides até à utilização em testes de diagnóstico. Estas enzimas redox incluem peroxidase, superóxido dismutase, álcool oxidase, polifenol oxidase, xantina oxidase, sulfidril oxidase, hidroxilases, colesterol oxidase, lacase, álcool dehidrogenase, e esteróide desidrogenases.

Dos vários tensoactivos não-iónicos de copolímeros em bloco de poliéter-poliol disponíveis, os materiais utilizados na invenção compreendem éteres de polioxialcileno glicol que contêm blocos hidrofóbicos e hidrofílicos, de preferência sendo cada bloco baseado em pelo menos opcionalmente grupos oxietileno ou grupos oxipropileno ou misturas destes grupos. O método mais comum para obter estes tensoactivos é fazer reagir óxido de etileno como material hidrofóbico que contém pelo menos um hidrogénio reactivo. vias alternativas incluem a reacção do hidrófobo com um poliglicol pré-formado ou a utilização de cloridrina de etileno em vez de óxido de etileno. 0 hidrófobo reagente deve conter pelo menos um hidrogénio activo preferencialmente álcoois, e opcionalmente ácidos, amidas, mercaptans, alquil fenóis e outros semelhantes. Também podem ser utilizadas aminas primárias. 10

Os tensoactivos não-iónicos especialmente preferidos são os que são obtidos através de técnicas de polimerização em bloco. Pelo controlo cuidado da alimentação de monómero e das condições de reacção, pode ser preparada uma série de tensoactivos nos quais características como o equilíbrio hidrófilo—lipófilo (HLB), a capacidade molhante e de formação de espuma podem ser controlados de perto e de forma reprodutível. A natureza química do componente inicial utilizado na formação do bloco de polímero inicial geralmente determina a classificação dos tensoactivos. 0 componente inicial não tem de ser hidrofóbico uma vez que a hidrofobicidade será derivada de um ou dois blocos de polímero. A natureza química do componente inicial na formação do primeiro bloco de polímero geralmente determina a classificação dos tensoactivos. Materiais de partida típicos ou componentes iniciais incluem álcoois monohídricos tais como metanol, etanol, propanol, butanol e outros semelhantes, bem como materiais dihídricos tais como glicol, glicerol, polióis de peso molecular mais elevado, etileno diamina e outros semelhantes.

As várias classes de tensoactivos preferidos, adequados para a prática da presente invenção, foram descritas por Schmolka em "Non-Ionic Surfactants", Surfactant Science Series Vol. 2, Schick, M.J., Ed. Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1967, Capítulo 10. A primeira e mais simples é aquela em que cada bloco é homogéneo, o que equivale a dizer que é utilizado um único óxido de alcileno na alimentação de monómero durante cada passo da preparação. Esses materiais são designados como tensoactivos de bloco único. As classes seguintes são denominadas bloco-hetérico e hetérico-bloco, nas quais uma porção da molécula (isto é, quer a hidrófoba quer a hidrófila) é composta por um único óxido de alcileno enquanto a outra é uma mistura de dois ou mais destes materiais, um dos quais pode ser o mesmo que o da porção de bloco homogénea da molécula. Na preparação desses materiais, a porção hetero da molécula será 11 ( totalmente aleatória. As propriedades destes não-iónicos serão inteiramente distintas das dos tensoactivos de bloco puros. A outra subclasse é aquela em que ambos os passos da preparação do hidrófobo e hidrófilo envolvem a adição de misturas de óxidos de alcileno e é definida como um copolimero em bloco hetérico-hetérico. 0 tensoactivo de polímero de bloco é tipificado por um material de partida monofuncional tal como um álcool monohídrico, ácido, mercaptano, amina secundária ou amidas N-substituídas. Esses materiais podem geralmente ser ilustrados pela fórmula seguinte: í—[Am-Bn]x em que I é a molécula do material de partida tal como descrita anteriormente. A porção A é um hidrófobo compreendendo uma unidade de óxido de alcileno na qual pelo menos um hidrogénio foi substituído por um grupo alquilo ou um grupo arilo, e m é o grau de polimerização que é geralmente maior do que cerca de 6. A unidade B é um grupo solubilizante aquoso tal como um oxietileno com n sendo de novo o grau de polimerização. O valor de x é a funcionalidade de I. Deste modo, nos casos em que I é um álcool monofuncional ou amina, x é 1; nos casos em que I é material de partida polifuncional tal como um diol (por exemplo, propileno glicol) x é 2 como é o caso com os tensoactivos Pluronic®. Nos casos em que I é um material de partida tetrafuncional tal como etilenodiamina, x será 4 como é o caso com os tensoactivos Tetronic®. Os tensoactivos preferidos deste tipo são os copolímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno.

Também podem ser utilizados materiais de partida multifuncionais para preparar os tensoactivos de bloco homogéneos. 12

Nos materiais bloco-hetérico e hetérico-bloco quer A quer B será uma mistura de óxidos sendo o bloco remanescente um bloco homogéneo. Um bloco irá ser o hidrófobo e o outro o hidrófilo. Qualquer das duas unidades poliméricas servirá como unidade solubilizante mas as caracteristicas irão diferir dependendo de qual é utilizada. Também podem ser utilizados materiais de partida multifuncionais em materiais deste tipo.

Os copolimeros em bloco hetérico-hetérico são preparados essencialmente da mesma maneira tal como foi discutido anteriormente sendo a diferença principal que a alimentação de monómero para o óxido de alcileno em cada passo é composta por uma mistura de dois ou mais materiais. Os blocos serão portanto copolimeros aleatórios da alimentação de monómero com as caracteristicas de solubilidade determinadas pelas proporções relativas de materiais potencialmente solúveis em água e insolúveis em água. 0 peso molecular médio dos copolimeros em bloco de éter de polioxialcileno glicol utilizados de acordo com a presente invenção é desde 500 até 30.000 especialmente desde 800 até 25.000 e preferencialmente desde 1.000 até 12.000. A proporção de peso do hidrófobo para o hidrófilo variará também desde 0,4:1 até 2,5:1, especialmente desde 0,6:1 até 1,8:1 e preferencialmente desde 0,8:1 até 1,2:1.

Numa forma de realização especialmente preferida, estes tensoactivos têm a fórmula geral:

RX(CH2CH20)nH em que o hidrófobo do copolímero em bloco tem um peso molecular médio desde 500 até 2.500, especialmente desde 1.000 até 2.000 e preferencialmente desde 1.200 até 1.500 e em que R é geralmente um grupo hidrofóbico de tensoactivo tipico mas pode também ser um poliéter tal como um grupo polioxipropileno ou uma mistura de 13

grupos polioxipropileno e polioxietileno. Na fórmula acima X é tanto oxigénio ou azoto como outra funcionalidade capaz de ligar a cadeia de polioxietileno ao hidrófobo. Na maior parte dos casos, η, o número médio de unidades de oxietileno no grupo hidrofilico, tem de ser maior do que cerca de 5 ou cerca de 6 para conferir suficiente solubilidade em água a fim de tornar os materiais úteis. 0 ponto de turvação é uma das caracteristicas mais distintivas para a maioria dos tensoactivos não-iónicos e depende do número de grupos oxietileno, oxipropileno, e/ou oxibutileno feitos reagir na formação dos copolimeros em bloco do tensoactivo da presente invenção. O ponto de turvação é também afectado por outros componentes em solução, pela concentração de tensoactivos, e pelos solventes, se alguns, que estão no sistema. 0 ponto de turvação foi definido como a formação súbita de turbidez de uma solução de tensoactivo não-iónico por aumento de temperatura. Quando o tensoactivo não-iónico é dissolvido em água, crê-se em teoria que um aumento da temperatura aumentará a actividade das moléculas de água, que provocam a desidratação de oxigénios de éter no grupo polioxietileno do tensoactivo não-iónico. As moléculas com maiores percentagens de grupos oxietileno têm uma maior capacidade de hidratação, e têm por isso um ponto de turvação mais elevado. Isto é importante na estabilização de enzimas em solução, uma vez que a estabilidade da enzima a longo prazo é avaliada a uma temperatura de 50°C. Se o ponto de turvação de um tensoactivo não-iónico é menor do que 50°C, quando a solução atinge essa temperatura, a enzima hidrata-se enquanto o tensoactivo coalesce e se torna menos solúvel em água. 0 ponto de turvação foi também descrito como aquela caracteristica dos tensoactivos não-iónicos em que exibem uma relação inversa de temperatura-solubilidade na água, o que equivale a dizer que à medida que a temperatura da solução aumenta, a solubilidade do tensoactivo diminui. Este fenómeno 14

foi atribuído a uma rutura de interacções especificas tais como ligação hidrogénio entre a água e as unidades de polioxietileno da molécula. A temperatura à qual os componentes do tensoactivo de polioxietileno começam a precipitar da solução foi também definida como o "ponto de turvação". Em geral, o ponto de turvação de uma dada família de tensoactivos aumentará com o número médio de grupos oxietileno. 0 ponto de turvação dos polímeros tensoactivos de éter de polioxialcileno glicol da presente invenção é superior à temperatura à qual a enzima ou sistema de enzimas se degrada e situa-se algures desde 0°C até 110°C, especialmente desde 10°C até 100°C e preferencialmente desde 20°C até 95°C. Estes pontos de turvação são para uma solução a 1% em peso do tensoactivo em água.

Embora os inventores não queiram estar limitados por qualquer teoria, crê-se que os tensoactivos não-iónicos da presente invenção contribuem para a estabilidade da enzima aumentando a viscosidade da água na formulação. Geralmente, uma viscosidade elevada levará a um transporte pobre para as zonas ricas em Ca++ em enzimas tais como protease, ou a uma transferência de iões mais lenta. Isto ajuda também a manter a matriz da enzima intacta, embora em alguns dos casos descritos de acordo com a presente invenção, a elevada viscosidade possa não ser necessária para a estabilidade.

Os agentes quelantes geralmente desactivam as enzimas, diminuindo a compacidade molecular da enzima e causando deformação da enzima. Os tensoactivos não-iónicos não são influenciados pelo efeito electrostático, isto é, pelos grupos carregados na enzima, e assim não têm impacto na estrutura específica da enzima.

Um copolímero em bloco de éter de polioxialcileno glicol que pode ser usado de acordo com a presente invenção contém um 15

hidrófobo baseado numa unidade de hidrocarboneto de um álcool monohidrico alifático contendo desde 1 até cerca de 8 átomos de carbono, onde a unidade de hidrocarboneto se ligou a este através de uma ligação oxigénio de éter, uma cadeia hetérica mista de grupos oxietileno e 1,2-oxipropileno. A proporção em peso de grupos oxietileno para grupos 1,2-oxipropileno no hidrófobo é desde 5:95 até 15:85 e o peso molecular médio do hidrófobo é desde 1.000 até 2.000. Um hidrófilo está ligado à cadeia mista e baseia-se em grupos oxietileno. A proporção em peso de hidrófilo para hidrófobo situa-se algures desde 0,8:1 até 1,2:1. Este éter de polioxialcileno glicol é definido adiante por Steele, Júnior, et ai., na Patente U.S. NQ 3,078,315.

Um dos éteres de polioxialcileno glicol preferidos é Tergitol XD produzido de acordo com o método de Steele, Jr., et al. na Patente U.S. NS 3,078,315 e disponível de Union Carbide. Este é um copolimero em bloco não-iónico tendo um ponto de turvação de cerca de 7 6°C como uma solução 1% em água e um peso molecular de cerca de 3120 com base no seu número de hidroxilo.

Podem ser utilizados outros copolimeros não-iónicos em bloco de éter de polioxialcileno glicol tais como os produzidos pela BASF Wyandotte Corporation incluindo os tipos Pluronic® e Tetronic®. Os tensoactivos de poliol Pluronic® e Tetronic® variam desde líquidos móveis até sólidos capazes de formar flocos e aqueles que têm teor elevado de óxido de etileno não exibem nenhum ponto de turvação da solução mesmo a 100°C. Podem ser utilizados outros tensoactivos não-iónicos de copolimero em bloco de éter de polioxialquileno glicol semelhantes tais como os produzidos pela Dow Chemical Company e pela Witco Chemical Corporation.

Os tensoactivos Pluronic® que podem também ser utilizados de acordo com a presente invenção são preparados sintetizando um hidrófobo de peso molecular desejado pela adição controlada de 16

óxido de propileno aos dois grupos hidroxilo de propileno glicol. Adiciona-se então óxido de etileno a ambas as extremidades do hidrófobo para formar cadeias oxietileno que constituem desde cerca de 10% em peso até cerca de 80% em peso da molécula final, o peso molecular médio do tensoactivo Pluronic® é desde 1.100 até 12.600 e o HLB (equilíbrio hidrófobo lipófobo) é desde cerca de 1-7 até cerca de 18-23 ou maior do que cerca de 24. 0 Pluronic® P-105 utilizado de acordo com a presente invenção tem um peso molecular médio de cerca de 6.500, um ponto de fusão de cerca de 35°C, um ponto de turvação de cerca de 91°C e um HLB de cerca de 12-18. Os tensoactivos Tetronic® que podem também ser utilizados de acordo com a invenção são copolimeros em bloco tetra-funcionais derivados da adição sequencial de óxido de propileno e depois de óxido de etileno a etileno-diamina. O peso molecular médio destes tensoactivos é desde 1.650 até 30.000 e têm um HLB desde cerca de 1-7 até cerca de 18-23 ou maior do que cerca de 24. 0 Tetronic® 1304 utilizado de acordo com a invenção tem um peso molecular médio de cerca de 10.500, um ponto de fusão de cerca de 59°C, um ponto de turvação maior do que cerca de 100°C e um HLB maior do que cerca de 24. A enzima e o tensoactivo podem também ser usados em combinação com um solvente orgânico compatível com a enzima e que actuará também como solvente para o tensoactivo não-iónico de copolímero em bloco de poliéter-poliol. O solvente preferencialmente é hidrofilico tal como um poliol ou uma mistura de polióis onde o poliol tem desde 2 até 6 átomos de carbono e desde 2 até 6 grupos hidroxilo e inclui materiais tais como 1,2-propano diol, etileno glicol, eritritano, glicerol, sorbitol, manitol, glicose, fructose e lactose. A composição enzimática estabilizada de acordo com a presente invenção contém uma enzima numa quantidade desde cerca de 2 até cerca de 95 partes em peso, especialmente desde cerca de 5 até cerca de 90 partes em peso e preferencialmente desde 17

cerca de 10 até cerca de 80 partes em peso, água numa quantidade desde cerca de 1 até cerca de 90 partes em peso e especialmente desde cerca de 2 até cerca de 85 partes em peso e preferencialmente desde cerca de 5 até cerca de 80 partes em peso, um solvente desde cerca de 0 até cerca de 70 partes em peso e especialmente desde cerca de 2 até cerca de 60 partes em peso e preferencialmente desde cerca de 3 até cerca de 55 partes em peso e o tensoactivo não-iónico de copolimero em bloco de poliéter-poliol numa quantidade desde cerca de 0,2 até cerca de 40 partes em peso e especialmente desde cerca de 0,8 até cerca de 30 partes em peso e preferencialmente desde cerca de 1 até cerca de 25 partes em peso.

Os exemplos seguintes são ilustrativos.

Exemplo 1 A composição listada abaixo foi feita a partir de Pulpzyme HB, uma suspensão enzimática aquosa, disponível comercialmente de Novo Nordisk Bioindustrials, inc. que é uma preparação de xilanase com origem bacteriológica. Também foi utilizado Tergitol XD tal como descrito acima, o glicerol utilizado é um material 96% puro onde a impureza é água. Pode também ser utilizado um glicerol de maior pureza. O glicerol actua como um solvente para o Tergitol xd, que é um sólido à temperatura ambiente. A viscosidade da formulação é de 2.200 cps, medidos utilizando um viscoslmetro Brookfield modelo número LVT, a 30 rpm, haste número 4 à temperatura ambiente (20°C). A formulação dissolve-se facilmente em água. A actividade das enzimas, UI por mL, foi medida de acordo com o método de Bailey, M.J. et al., J. Blotech. 23, 257—270, 1992. Este método obriga a uma incubação de cinco minutos da enzima xilanase (adequadamente diluída em tampão de citrato com pH 5,3) com um substrato de xilano de madeira de bétula 1%. Após incubação, os açúcares libertados são determinados por uma reacção durante 5 minutos com o reagente DNS original de Sumner (1921). A absorvância é medida a 540 nm 18

contra um branco de reagente constituído por substrato, reagente DNS e tampão. As leituras das enzimas são corrigidas subtraindo um branco de enzima constituído por substrato e reagente DNS ao qual a enzima diluída é adicionada com desenvolvimento de cor/diluição imediatos em vez de incubação.

Componente Pulpzyme HB Glicerol Tergitol XD

Percentagem em peso 75 5 20 A Tabela 1 abaixo mostra a excelente estabilidade desta formulação. 0 aumento da actividade das enzimas está dentro dos parâmetros do erro experimental.

Tabela 1

Estabilização das Enzimas no Exemplo 1 Actividade Enzimática fUI por ml·!*

Amostra Original Temperatura Ambiente 8°C 50°C 9170 9130 9820 10900 * Trinta dias nas condições indicadas. Exemplo 2 0 Exemplo 1 foi repetido utilizando Pulpzyme HB, no entanto, o Tergitol XD foi substituído por Pluronic® P-105® que é um copolímero em bloco não-iónico comercial disponível de BASF Wyandotte Corporation. 0 ponto de turvação deste copolímero é de 91°C (solução a 1% em água) e 94°C (solução a 10% em água). 0 peso molecular médio do tensoactivo é de cerca de 6.500. 19

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A Tabela 2 apresenta, dentro dos parâmetros do erro experimental, a redução na estabilidade desta formulação guando comparada com o Exemplo 1 que parece ser uma função do Pluronic® P-105 comparado com o Tergitol XD. A estabilidade é, no entanto, melhor do que a das enzimas sem Pluronic® P-105. A enzima perderá rapidamente a sua actividade nestas condições sem a estabilização conferida pelo Pluronic® P-105.

Tabela 2

Estabilização das Enzimas no Exemplo 2 Actividade Enzimática (UI por mL)*

Amostra Original Temperatura Ambiente 8°C 50°C 8400 8280 8970 7370 * Trinta dias nas condições indicadas.

Exemplo 3 O Exemplo 1 foi repetido utilizando uma enzima protease da Solvay Enzymes, Inc. ou uma enzima lipase da Novo Nordisk Bioindustrials, Inc., estando os resultados apresentados na Tabela 3. 20

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Tabela 3

ComDonente % em Peso HT-Proteolytic L-175® 70 100 (protease) Glicerol (superior a 96%) 20 Tergitol XD 10 Actividade Í14 dias) a 50°C 45 24 À Temperatura Ambiente 90 91 {20°C) Componente % em Peso Resinase A2X™ (lipase) 85 85 85 85 Glicerol (superior a 96% ) 5 — 5 5 Tergitol XD 10 — — — Água — 15 — — Pluronic® PI05 — - — 10 Tetronic 1304® — — — 10 Wyandotte BASF Actividade í30 dias) a 50°C 0,049 0,033 0,047 0,0553 À Temperatura Ambiente 0,048 0,067 0,054 0,0472 (2 0°C)

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição enzimática estabilizada contra a perda de actividade a temperaturas elevadas ou resultante da presença de água, em que a referida composição consiste em água, uma enzima e uma quantidade estabilizadora de um tensoactivo não-iónico de um copolimero em bloco de poliéter-poliol opcionalmente dissolvido num solvente, em que o referido tensoactivo não-iónico de copolimero em bloco de poliéter-poliol é um copolimero de éter de polioxialcileno glicol em bloco único, bloco-hetérico, hetérico-bloco ou hetérico-hetérico em que as referidas unidades alcileno têm desde 2 até 4 átomos de carbono.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida enzima é estabilizada contra a decomposição a temperaturas elevadas por um tensoactivo não-iónico de um copolimero em bloco de poliéter-poliol que tem um ponto de turvação desde 0°C até 110°C.
3. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que o referido tensoactivo não-iónico de copolimero em bloco de poliéter-poliol está dissolvido num solvente orgânico compativel com a referida enzima.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que o referido solvente é hidrofílico.
5. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que o referido solvente é um poliol ou uma mistura de polióis.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o referido poliol tem desde 2 até 6 átomos de carbono e desde 2 até 6 grupos hidroxilo. 1
7. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que as referidas enzimas são protease, amilase, celulase, hemicelulase, pectinase, β-glucanase, lipase, fosfolipase, glucose isomerase, glucose oxidase e lipoxidase.
8. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o referido éter de polioxialcileno glicol contém blocos hidrofóbicos e hidrofilicos, sendo cada bloco baseado em pelo menos grupos oxietileno, ou grupos oxipropileno ou misturas dos referidos grupos.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que o peso molecular médio do referido polioxialcileno glicol é desde 500 até 30.000, a proporção em peso do hidrófobo para hidrófilo do referido éter de polioxi glicol é desde 0,4:1 até 2,5:1 e o ponto de turvação do referido éter de polioxialcileno é desde 0°C até 110°C.
10. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 7, em que o referido copolimero em bloco de poliéter-poliol é um copolimero em bloco de éter de polioxialcileno glicol tendo um hidrófobo baseado numa unidade de hidrocarboneto de um álcool monohídrico alifático contendo desde 1 até 8 átomos de carbono, em que a unidade de hidrocarboneto tem ligada a si, através de uma ligação oxigénio de éter, uma cadeia mista hetérica de grupos oxietileno e 1,2-oxipropileno, em que a proporção em peso de grupos oxietileno para grupos 1,2-oxipropileno no hidrófobo é desde 5:95 até 15:85 e o peso molecular médio do hidrófobo é desde 1.000 até 2.000, estando um hidrófilo baseado em grupos oxietileno ligado à cadeia mista e sendo a proporção em peso de hidrófilo para hidrófobo desde 0,8:1 até 1,2:1. 2
11. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 7, em que o referido copolimero em bloco de poliéter-poliol é um copolimero em bloco de éter de polioxialcileno glicol tendo um hidrófobo baseado num aduto de óxido de propileno de propileno glicol em que o propileno glicol tem ligado a si, através de uma ligação oxigénio de éter, grupos oxipropileno, estando um hidrófilo baseado em grupos oxietileno ligado ao hidrófobo, sendo o peso molecular médio do tensoactivo desde 1.100 até 12.600, sendo o HLB desde 1 até 23 ou maior do que 24.
12. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 7, em que o referido copolimero em bloco de poliéter-poliol é um copolimero em bloco de éter de polioxialcileno glicol tendo um hidrófobo baseado num aduto de óxido de propileno de etileno diamina em que a etilenodiamina tem ligada a si, através de uma ligação oxigénio de éter, grupos 1,2-oxipropileno, estando um hidrófilo baseado em grupos oxietileno ligado à cadeia mista, sendo o peso molecular médio do tensoactivo desde 1.650 até 30.000, sendo o HLB desde 1 até 23 ou maior do que 24.
13. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 12, em que o referido solvente é glicerol e as referidas enzimas são amilase, protease ou lipase. i I Lisboa, 29 de Maio de 2000

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