CZ154996A3

CZ154996A3 - Enzyme stabilization process by making use of block polymers

Info

Publication number: CZ154996A3
Application number: CZ961549A
Authority: CZ
Inventors: James C Lee
Original assignee: Buckman Labor Inc
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 1996-10-16
Also published as: FI962304L; BR9408185A; NO962263L; ZA949653B; US5780283A; ATE193319T1; FI962304A0; WO1995015371A1; NO962263D0; CN1064074C; PT731834E; DE69424683D1; EP0731834A1; ES2148479T3; SK68996A3; CA2177997C; FI118341B; JPH09506127A; CA2177997A1; DE69424683T2

Description

Předmětem vynálezu je stabilizace enzymů neionogenním povrchově aktivním blokovým kopolymerem polyether-polyolu.

Dosavadní stav techniky

Enzymy jsou obecně umisťovány do vodných kapalných enzymových přípravků navržených pro určitý postup. Tyto kapalné enzymové přípravky jsou historicky postihovány problémy jako je chemická nestálost, která může vést ke ztrátě enzymové aktivity zvláště při skladování. Tento kritický problém ztráty enzymové aktivity skladováním byl zvláště ovlivněn průmyslem kapalných detergentů.

Není výjimečné, že průmyslový produkt, jako je kapalný enzymový přípravek, je skladován ve skladišti v různých klimatických podmínkách na světě, kde je produkt vystaven teplotám, které mohou hraničit od mrazu do asi 50°C po dlouhá období . Po skladování po mnoho měsíců při teplotních extrémech od 0°C do 50°C většina kapalných enzymových přípravků ztrácí 20 až 100 % své enzymové aktivity v důsledku nestability enzymu.

Byly činěny různé pokusy stabilizovat enzymy obsažené v kapalných enzymových přípravcích. Pokusy zvýšit stabilitu kapalných enzymových přípravků použitím přípravků obsahujících alkoholy, glyceroly, dialkylglykolethery a směsi těchto látek s jinými sloučeninami měly pouze okrajový úspěch a to dokonce v rozmezí mírných teplot skladování.

Munk v U. S. Patentu č. 4,801,544 popsal systém ethylenglykolu a neionogenního tenzidu, ethoxylovaného lineárního alkoholu, s uhlovodíkovým rozpouštědlem, použitý jako stabilizátor, a enkapsulaci enzymů v micelách směsí rozpouštědlo

- tenzid. Obsah vody v přípravku byl udržován na méně než 5 procentech, enzymová stabilita byla ověřována při 1,7°, 21,1° a 37,8°C.

Stabilizaci vodného enzymového přípravku jistými estery popsal Shaer v U. S. Patentu č. 4,587,727. Ester použitý jako stabilizátor má vzorec, RCOOR’, kde R je alkyl s jedním až třemi uhlíky nebo vodík, a R’ je alkyl s jedním až šesti uhlíky. Ve vodném enzymovém přípravku je ester obsažen v množství 0.1 až 2.5 hmotnostních %. Použitou enzymovou složkou podle přihlašovatele je obchodní enzymový přípravek dodávaný ve formě prášku, roztoku nebo suspenze obsahujíc! od asi 2 procent do asi 80 procent aktivních enzymů, a nosič jako je síran sodný nebo vápenatý, chlorid sodný, glycerol, neionogenní tenzid nebo jejich směsi, jakožto zbývajících 20 procent do 98 procent.

Letton a spol. v U. S. Patentu č. 4,318,818 popisují stabilizační systém pro vodné enzymové přípravky, kde stabilizační systém zahrnuje vápenaté ionty a nízkomolekulární karboxylovou kyselinu nebo její sůl. Stabilizační systém má pH od asi 6,5 do asi 10.

Guilbert a spol. v U. S. Patentu č. 4,243,543 popisují stabilizaci kapalných detergentních přípravků obsahujících proteolytický enzym. Detergentní přípravky jsou stabilizovány přídavkem antioxidantu a hydrofilního polyolu k přípravku, přičemž se stabilizuje pH přípravku.

Veber v U. S. Patentu č. 4,169,817 popisuje kapalný čistící přípravek obsahující stabilizované enzymy. Přípravek je vodný roztok obsahující od 10 do 50 hmotnostních % tuhých látek a zahrnuje detergentové složky, povrchově aktivní činidla, enzymový systém odvozený od Bacillus subtilis a enzym stabilizující činidlo. Stabilizační činidla zahrnují vysoce ve vodě rozpustné sodné nebo draselné sole a/nebo ve vodě rozpustné hydroxyalkoholy a umožňují skladování roztoku po prodlouženou dobu bez deaktivace enzymů.

Dorrit a spol. v Evropském Patentu č. 0 352 244 A2 popisují stabilizované kapalné detergentní přípravky používající amfoterní tenzid.

Kaminsky a spol. v U. S. Patentu č. 4,305,837 popisují stabilizovaný vodný enzymový přípravek obsahující stabilizační systém vápenatých iontů, nízkomolekulární karboxylové kyseliny nebo soli a nízkomolekulárního alkoholuJ^Tento stabilizovaný enzym je používán v detergentních přípravcích. Přípravky mohou zahrnovat neionogenní tenzídy se vzorcem RA(CH2CH2)_nH, kde R je hydrofobní zbytek, A je založena na skupině nesoucí reaktivní vodíkový atom a n představuje průměrný počet ethylenoxidových jednotek. R má typicky 8 až 22 atomů uhlíku, ale může být připraven kondenzací propylenoxidu s nízkomolekulární sloučeninou, kdy n je obvykle v mezích asi 2 až asi 24. Použitým nízkomolekulárním alkoholem může být buď jednosytný alkohol s 1 až 3 uhlíkovými atomy nebo polyol s 2 až 6 uhlíkovými atomy a s 2 až 6 hydroxylovými skupinami. Kaminsky a spol. uvádějí, že polyoly mohou zajistit zvýšenou stabilitu enzymu a zahrnují propylenglykol, ethylenglykol a glycerol.

Tai v U. S. Patentu č. 4,404,115 popisuje vodný enzymový kapalný čistící prostředek, který obsahuje stabilizátor enzymu, pentaborát alkalického kovu, popřípadě se siřičitanem alkalického kovu a/nebo polyolem. Polyol má 2-6 hydroxylových skupin a zahrnuje látky jako je 1,2-propandiol, ethylenglykol, erythritan, glycerol, sorbitol, mannitol, glukosu, fruktosu, laktosu a podobně.

Boskamp v U. S. Patentu č. 4,462,922 také popisuje vodný enzymový detergentový přípravek se stabilizátorem založeným na směsi kyseliny borité nebo soli kyseliny borité s polyolem nebo polyfunkční aminosloučeninou společně s redukující solí alkalického kovu. V podstatě jsou použity tytéž polyoly jako u Kaminského a spol.

Předložený vynález je zaměřen na způsob pro poskytnutí stabilizovaných enzymů a stabilizovaného enzymového přípravku, ve kterých budou překonány předcházející a jiné nevýhody.

Vyhledávanými výhodami podle tohoto vynálezu je poskytování nového způsobu stabilizace enzymů a rovněž stabilizovaného enzymového přípravku.

Podstata vynálezu £>

Předložený vynález je zaměřen na nový způsob a přípravek, který v podstatě odstraňuje dříve uvedené a jiné problémy dané omezeními a nevýhodami souvisejícího stavu techniky.

Dodatečné vlastnosti a výhody vynálezu budou uvedeny v následujícím popisu a zčásti budou zřejmé z popisu nebo mohou být získány používáním vynálezu. Výhody vynálezu budou realizovány a získávány způsobem a složením látky zvláště vytčených v zde uvedeném popisu a nárocích.

K dosažení těchto a j iných výhod a v souladu s účelem vynálezu, jak je obsažen a široce popsán, je uveden nový způsob stabilizace enzymu vůči ztrátě aktivity při zvýšených 5 teplotách nebo vodou, který zahrnuje spojení enzymu se stabilizujícím množstvím neionogenního povrchově aktivního blokového kopolymeru polyether-polyolu.

Je-li enzym stabilizován proti deaktivaci při zvýšených teplotách, vybraný tenzid má teplotu zakalení vyšší než tyto teploty. 1

V jednom provedení je neionogenní povrchově aktivní blokový kopolymer polyether-polyolu celoblok (all-block), blok-hetero (block-heteric), hetero-blok (heteric-block) nebo hetero-hetero (heteric-heteric) blokovým kopolymerem polyoxyalkylenglykoletheru, kde alkylenové jednotky mají od 2 do asi 4 uhlíkových atomů a zvláště ty tenzidy, které obsahují hyd- I rofobní a hydrofilní bloky, kde každý blok je založen na přinejmenším oxyethylenových skupinách nebo oxopropylenových skupinách nebo směsích těchto skupin.

Vynález rovněž zahrnuje složení látky založené na dříve uvedeném enzymu a tenzidu.

Je třeba mít na vědomí, že jak předcházející obecný popistak i následující podrobný popis jsou pouze příklady a vysvětlení a jsou určeny k poskytnutí dalších vysvětlení vynálezu, jak je nárokován.

Nej lepší způsob provedení vynálezu

Předložený vynález je zaměřen na způsob stabilizace enzymu vůči ztrátě aktivity, buď zvýšenou teplotou nebo vodou, spojením enzymu s neionogenním povrchově aktivním blokovým kopolymerem polyether-polyolu.

Použití enzymů a kapalných enzymových přípravků v průmyslu a na obchodním trhu rychle vzrůstá v posledních několika letech. Jak je dobře známo, enzymy mohou být kyselé, alkalické nebo neutrální, v závislosti na rozsahu pH, ve kterém jsou aktivní. Lipasa samotná nebo enzym zahrnující lipasu, t.j. lipasa je jakákoliv kombinace s následujícími enzymy, které mohou být použity. Všechny tyto typy enzymů jsou považovány za použitelné v souvislosti s vynálezem zde uvedeným.

S kapalnými detergenty je svázáno mnoho enzymů a kapalných enzymových přípravků, které prokázaly užitné vlastnosti jako rozpouštěcí a čistící přípravky. Navíc k aplikacím v kapalných detergentech enzymy a kapalné enzymové přípravky prokázaly použitelnost v řadě různých obchodních a průmyslových oblastí, ve kterých se nyní široký rozsah tříd enzymů používá .

Proteasy jsou dobře známou třídou enzymů často používanou v širokém rozmezí průmyslových aplikací, kde hydrolyzují peptidové vazby proteinů a proteinových substrátů. Pomoci proteas se používá k odstraňování skvrn způsobených proteiny, jako jsou skvrny od krve nebo vajec. Kapalné enzymové přípravky obsahující alkalické proteasy rovněž prokázaly použi6 telnost jako dispergační prostředky bakteriálních filmů a povlaků řas a hub ve vodách chladících věží nebo nádržích kapalin v kovoprůmyslu.

Proteasy mohou být charakterizovány jako kyselé, neutrální nebo alkalické proteasy v závislosti na rozmezí pH, ve kterém jsou aktivní. Kyselé proteasy zahrnují mikrobiální rennety, rennin (chymotrypsin), pepsin a kyselé proteasy hub. Neutrální proteasy zahrnují trypsin, papain, bromelain/ficin a bakteriální neutrální proteasy. Alkalické proteasy zahrnují subtilisin a příbuzné proteasy. Komerční kapalné enzymové přípravky obsahující proteasy jsou dostupné pod názvy Rennilase®, PTN (pankreatický trypsin NOVO), PEM (směs proteolytických enzymů), Neutrase®, Alcalase®, Esperase® a Savinase®, které všechny dodává Novo Nordisk Bioindustrials, lne. z Danbury, CT. Jiná obchodní proteasa je dostupná pod názvem HT-Proteolytic dodávaná Solvay Enzyme Product.

Amylasy, jiná třída enzymů, jsou rovněž používány v mnoha průmyslových a obchodních postupech, ve kterých katalyzuji nebo urychlují hydrolýzu škrobu. Třída amylas zahrnuje a-amylasu, β-amylasu, amyloglukosidasu (glukoamylasu), amylasu z hub a pullulanasu. Obchodní kapalné enzymové přípravky obsahující amylasy jsou dostupné pod názvy BAN, Termamyl®, AMG, Fungamyl® a Promozyme®, které dodává Novo Nordisk, a Diazyme L-200, produkt Solvay Enzyme Product.

Další obchodně cenné třídy enzymů jsou ty, které ovlivňují hydrolýzu vláken. Tyto třídy zahrnuji celulasy, hemicelulasy, pektinasy a β-glukanasy. Celulasy jsou enzymy, které odbourávají celulosu, lineární polymer glukosy obsažený v buněčných stěnách rostlin. Hemicelulasy jsou zapojeny v hydrolýze hemicelulos, které obdobně celulose jsou rostlinnými polysacharidy. Pektinasy jsou enzymy, které se účastní odbourání pektinu, glycidu, jehož hlavní složkou je kyselina cukrová. β-Glukanasy jsou enzymy, které se účastní hydrolýzy β-glukanů, které jsou rovněž podobné celulose v tom, že jsou lineárními polymery glukosy.

Souhrnně celulasy zahrnují endocelulasu, exocelulasu, exocelo-biohydrolasu, celobiasu a pro účely předloženého vynálezu rovněž budou zahrnovat hemicelulasu. Komerční kapalné enzymové přípravky obsahující celulasy jsou dostupné pod názvy Celluclasl® a Novozyní^L88 , které oba dodává Novo Nordisk.

Hemicelulasy, které mohou být použity, zahrnují xylanasy. Výrobek PULPZYří), dostupný od Novo Nordisk, a výrobek ECOPULF® od Alko Biotechnology jsou dvěma příklady komerčně dostupných kapalných enzymových přípravků obsahuj ících enzymy na bázi xylanasy.

Hemicelulasy jako třída zahrnují směs hemicelulas a galaktomananasu. Komerční kapalné enzymové přípravky obsahující hemicelulasy jsou dostupné jako PULPZY^ od Novo, ECOPULP® od

Alko Biotechnology, Novozym®280 a Gamanase^, kdy oba jsou produkty Novo Nordisk.

Pektinasy, které mohou být použity, zahrnují endopolygalakturonasu, exopolygalakturonasu, endopektátlyasu (transeliminasa), exopektátlyasu (transeliminasa) a endopektin lyasu (transeliminasa). Komerční kapalné enzymové směsi obsahující TM pektinasy jsou dostupné pod názvy Pectinex Ultra SP a Pectinex™*, oba dodávané Novo Nordisk.

β-Glukanasy, které mohou být použity, zahrnují lišejníkovou β-glukanasu, laminarinasu a exoglukanasu. Komerční kapalné enzymové přípravky obsahující β-glukanasy jsou dostupné pod názvy Novozym®234, Cereflo®, BAN, Finizym® a Ceremix®, které všechny dodává Novo Nordisk.

Vedle lipas mohou být také použity fosfolipasy. Lipasy a fosfolipasy jsou esterasové enzymy, které hydrolyzují tuky a oleje napadáním esterových vazeb v těchto sloučeninách. Lipasy působí na triglyceridy, zatímco fosfolipasy působí na fosfolipidy. V oblasti průmyslu představují lipasy a fosfolipasy komerčně dostupné esterasy. Novo Nordisk nabízí dva kapalné lipasové přípravky pod názvy Resinase A a

Resinase¹^ a 2X.

Jsou dostupné komerční kapalné enzymové přípravky obsahující lipasy. Takové přípravky jsou například dostupné pod obchodními názvy Lipolase 100, Greasex 50L, Palatase^A, Parrrvr TM lataseⁱⁿM a Lipozyme¹ , které všechny dodává Novo Nordisk.

Jinou komerčně ceněnou třídou enzymů jsou isomerasy, které katalyzují konverzní reakce mezi isomery organických ’ΤΜΓ sloučenin. Výrobek Sweetzyme^lfl je kapalným enzymovým přípravkem obsahujícím glukosoisomerasu a dodává jej Novo Nordisk.

Redoxní enzymy jsou enzymy, které působí jako katalyzátory v chemických oxidačně/redukčních reakcích a tedy jsou zapojeny v rozkladu a syntéze řady biochemikálií. V současné době mnoho redoxních enzymů nezískalo významné místo v průmyslu, neboť většina redoxních enzymů vyžaduje přítomnost kofaktoru. Ovšem jsou-li kofaktory integrální součástí enzymu nebo nemusí být dodávány, jsou redoxní enzymy komerčně použitelné.

Mohou být použity redoxní enzymy glukosooxidasa a lipoxidasa (lipoxygenasa). Další redoxní enzymy mají možné použití hraničící od enzymové syntézy steroidních derivátů po použití v diagnostických testech. Tyto redoxní enzymy zahrnují peroxidasu, superoxiddismutasu, alkoholoxidasu, polyfenoloxidasu, xanthinoxidasu, sufhydryloxidasu, hydroxylasy, cholesteroloxidasu, lakasu, alkoholdehydrogenasu a steroidní dehydrogenasy.

Z různých dostupných neionogenních povrchově aktivních blokových kopolymerů polyether-polyolů výhodné materiály zahrnují polyoxyalkylenglykolethery, které obsahují hydrofobní a hydrofilní bloky, každý blok je výhodně založen přinejmenším popřípadě na oxyethylenových skupinách nebo oxypropylenových skupinách nebo směsích těchto skupin.

Nej běžnější metodou získání těchto povrchově aktivních látek je reakce ethylenoxidu s hydrofobním materiálem, který obsahuje nejméně jeden reaktivní vodík. Alternativní způsob zahrnuje reakci hydrofobní látky s předem připraveným polyglykolem nebo použití ethylenchlorhydrinu namísto ethylenoxidu.

Reagující hydrofobní látka musí obsahovat alespoň jeden aktivní vodík, výhodně se jedná o alkoholy, popřípadě kyseliny, amidy, merkaptany, alkylfenoly a podobně. Rovněž mohou být použity primární aminy.

Zvláště výhodné jsou neionogenní tenzidy získané technikami blokové polymerace. Pečlivou kontrolou přidávání monomeru a reakčnich podmínek lze připravit řadu tenzidů, u nichž lze přesně a reprodukovatelně kontrolovat takové charakteristiky, jako jsou hydrofilně-lipofilní rovnováha (hydrophile-’ lipophile balance) (HPL), smáčení a pěnivost. Chemická povaha výchozích složek použitých při vytváření počátečního polymerního bloku obecně určuje klasifikaci tenzidů. Výchozí složka nemá být hydrofobní, neboř hydrofobicita bude odvozena od jednoho ze dvou polymernich bloků. Chemická povaha výchozí složky při vytváření prvního polymerního bloku obecně určuje klasifikaci tenzidů. Typické výchozí materiály nebo výchozí složky zahrnují jednosytné alkoholy jako je methanol, ethanol, propanol, butanol a podobně, rovněž dvojsytné složky jako je glykol, glycerol, vyšší polyoly, ethylendiamin a podobv ne.

Různé třídy výhodných tenzidů, vhodných pro aplikaci předloženého vynálezu popsal Schmolka v Non-Ionic Surfactants, Surfactant Science Series Vol. 2, Schick, M.J., Ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1967, Kapitola 10, která je zde zařazena jako odkaz. První a nejjednodušší jsou ty, kde každý blok je homogenní, což znamená že jediný alkylenoxid je použit jako dodávaný monomer v průběhu každého kroku přípravy. Takové materiály jsou nazývány celoblok (all-block) tenzidy. Další třídy jsou označovány jako blok-hetero (block-heteric) a hetero-blok (heteric-block), v nichž jedna část molekuly (t.j., buď hydrofobní nebo hydrofilní) je tvo10 řena jedním alkylenoxidem, zatímco druhá je směsí dvou nebo více takovýchto složek, z nichž jedna může být shodná se složkou homogenního bloku, který je částí molekuly. Při přípravě takovýchto materiálů, hetero-část molekuly bude zcela nahodilá. Vlastnosti těchto neionogenních tenzidů budou zcela odlišné od vlastností čistě blokových tenzidů. Jinou podtřídou jsou ty kopolymery, kde oba kiSwky přípravy hydrofóbní a hydrofilní části zahrnují přidáváni směsi alkylenoxidů a jsou definovány jako hetero-hetero (heteric-heteric) blokové kopolymery.

Blokově polymerní tenzid je typizován monofunkčním výchozím materiálem jako je jednosystný alkohol, kyselina, merkaptan, sekundární amin nebo N-substituované amidy. Tyto látky lze obecně popsat následujícím vzorcem:

^Am-Bnlx kde I je molekula výchozí složky popsané dříve. Část A je hydrofóbní, zahrnující alkylenoxidovou jednotku, v níž alespoň jeden vodík byl nahrazen alkylovou nebo arylovou skupinou, a m je polymerační stupeň, jenž je obvykle větší než asi

6. Zbytek B je skupina solubilizující ve vodě, jako je oxyethylenová skupina, kde n je znovu polymerační stupeň. Hodnota x je funkcí I. Tedy, je-li I jednosytný alkohol nebo amin, x je 1; je-li I polyfunkční výchozí látka jako je diol (např. propylenglykol) x je 2, jako je tomu v případě tenzidů Pluronic®. Je-li I tetrafunkční výchozí látka jako je ethylendiamin, x bude 4, jako je tomu v případě tenzidů Tetronic®. Výhodnými tenzidy tohoto typu jsou polyoxypropylen-polyoxyethylen blokové kopolymery.

Multifunkční výchozí látky lze též použít k přípravě homogenních blokových tenzidů.

V blok-hetero a hetero-blok materiálech bude buď A nebo B směs oxidů a zbývající blok bude homogenní. Jeden blok bude hydrofóbní a druhý hydrofilní. Jedna ze dvou polymerních jednotek bude sloužit jako solubilizační jednotka, ale cha11 rakteristiky se budou lišit v závislosti na způsobu použití. Multifunkční výchozí látky mohou být také použity v materiálech tohoto typu.

Hetero-hetero (heteric-heteric) blokové kopolymery se připravují nezbytně stejným způsobem, který byl dříve diskutován, s velkým rozdílem v tom, že monomer přiváděný pro alkylenoxid je v každém kroku složen ze směsi dvou a nebo více látek. Bloky pak budou nahodilé kopolymery dodaných monomerů s rozpouštěcími charakteristikami danými relativními poměry potencionálně ve vodě rozpustných a nerozpustných složek.

Průměrná molekulová hmotnost polyoxyalkylenglykolether blokových kopolymerů použitých v souladu s tímto vynálezem je od asi 500 do asi 30.000, zvláště od asi 800 do asi 25.000 a výhodně od asi 1.000 do asi 12.000. Hmotnostní poměr hydrofobní části k hydrofilní části se bude též pohybovat od asi 0,4:1 do asi 2,5:1, zvláště od asi 0,6:1 do asi 1,8:1 a výhodně od asi 0,8:1 do asi 1,2:1.

Ve zvláště výhodném provedení tyto tenzidy maj i obecný vzorec:

RX(CH₂CH₂O)_nH kde hydrofobní část blokového kopolymeru ma průměrnou molekulovou hmotnost od asi 500 do asi 2.500, zvláště od asi 1.000 do asi 2.000, výhodně od asi 1.200 do asi 1.500, a kde R je obvykle typická povrchově aktivní hydrofobní skupina, ale může se též jednat o polyether, jako je polyoxypropylenová skupina nebo směs polyoxypropylenových a polyoxyethylenových skupin. Ve výše uvedeném vzorci je X buď kyslík nebo dusík nebo jiná funkční skupina schopná vázat polyoxyethylenový řetězec k hydrofobní části. Ve většině případů n, průměrný počet polyoxyethylenových jednotek v hydrofilní skupině, musí být větší než asi 5 nebo asi 6 , aby zprostředkoval dostatečnou rozpustnost ve vodě a učinil materiál užitným.

Polyoxyalkylenglykolethery jsou výhodné neionogenní povrchově aktivní blokové kopolymery polyether-polyolu. Ovšem jinými neionogennimi povrchově aktivními blokovými kopolymery použitelnými v předloženém vynálezu mohou být modifikované blokové kopolymery při použití dále uvedených výchozích látek: (a) alkoholů, (b) mastných kyselin, (c) derivátů alkylfenolů, (d) glycerolu a jeho derivátů, (e) mastných aminů, (f) 1,4-sorbítanových derivátů, (g) ricinového oleje a jeho derivátů, (h) derivátů glykolu.

Bod zakalení je jednou z nejvýznačnějších charakteristik pro většinu neionogenních tenzidů a závisí na počtu oxyethylenových, oxypropylenových a/nebo oxybutylenových skupin, které reagovaly při přípravě povrchově aktivního blokového kopolymerů, který je předmětem předloženého vynálezu. Bod zakalení je také ovlivněn jinými složkami v roztoku, koncentrací tenzidů a rozpouštědly, jsou-li v systému. Bod zakaleni byl definován jako náhlý začátek zákalu roztoku neionogenního tenzidů při vzrůstu teploty. Pokud je neionogenní tenzid rozpuštěn ve vodě, uvažuje se, že vzrůst teploty zvýší aktivitu molekul vody, což způsobí dehydrataci etherických kyslíkových atomů polyoxyethylenové skupiny neionogenního tenzidů. Molekuly s vyšším zastoupením oxyethylenových skupin máji vyšší hydratační kapacitu a tedy mají i vyšší bod zakalení. Toto je důležité pro stabilizaci enzymů v roztoku, neboť dlouhodobá stabilita enzymů se vyhodnocuje při teplotě 50°C. Pokud, je bod zakalení neionogenního tenzidů nižší než 50°C a roztok dosáhne této teploty, enzym bude hydratován, avšak dojde ke koalescenci tenzidů, který se stane ve vodě méně rozpustným.

Bod zakalení byl rovněž popsán jako charakteristika neionogenních tenzidů, v níž vykazují inverzní závislost rozpustnosti ve vodě na teplotě, což znamená, že s nárůstem teploty roztoku rozpustnost tenzidů klesá. Tento jev je připisován přerušení specifických interakcí, jako jsou vodíkové můstky mezi vodou a polyoxyethylenovými jednotkami molekuly. Teplota, při které se začínají složky polyoxyethylenového tenzidů vylučovat z roztoku byla také definována jako bod zakalení. Obecně bod zakalení dané rodiny tenzidů bude vzrůstat s průměrným počtem oxyethylenových skupin.

Bod zakalení neionogenního povrchově aktivního blokového kopolymerů polyether-polyolu a zvláště polyoxyalkylenglykoletherových povrchově aktivních polymerů předloženého vynálezu je vyšší než teplota, při které se enzym nebo enzymový systém odbourává a může být kdekoliv od asi 0°C do asi 110°C, zvláště od asi 10°C do asi 100°C a výhodně od asi 20°C do asi 95°C. Tyto body zakalení jsou pro roztoky obsahující 1 hmotnostní % tenzidů ve vodě.

Ačkoliv přihlašovatelé nechtějí být omezováni žádnou teorií, předpokládá se, že neionogenní tenzidy předloženého vynálezu přispívají ke stabilitě enzymu vzrůstem viskozity vody v přípravku. Obecně vyšší viskozita vody povede k špatnému transportu v Ca⁺⁺ bohatých zónách v enzymech, jako je proteasa, nebo k pomalejšímu přenosu iontů. To také pomáhá udržovat enzymovou matrici intaktní, ačkoliv v některých z případů popsaných v souladu s předloženým vynálezem vyšší viskozita nemusí být nezbytná pro stabilitu.

Chelatační činidla obecně deaktivují enzymy, klesá molekulární kompaktnost enzymu a dochází k deformaci enzymu. Neionogenní tenzidy nejsou ovlivněny elektrostatickými efekty, t.j. nabitými skupinami enzymu, a nepůsobí tak na speciální strukturu enzymu.

Vhodný blokový kopolymer polyoxyalkylenglykoletheru, který může být použit v souladu s předloženým vynálezem, obsahuje hydrofóbní část založenou na uhlovodíkovém zbytku alifatického jednosytného alkoholu obsahující 1 až asi 8 atomů uhlíku, kde uhlovodíkový zbytek má k tomu připojenu vazbou etherickým kyslíkem heterický smíšený řetězec oxyethylenových a 1,2-oxypropylenových skupin. Hmotnostní poměr oxyethylenových skupin k 1,2-oxypropylenovým skupinám v hydrofóbní části je od asi 5:95 do asi 15:85 a průměrná molekulová hmotnost hydrofóbní části je od asi 1.000 do asi 2.000. Hydrofilní část je připojena k smíšenému řetězci a je založena na óxyethylenových skupinách. Hmotnostní poměr hydrofilní části k hydrofóbní je kdekoliv mezi asi 0,8:1 do asi 1,2:1. Tento polyoxyalkylenglykolether dále určili Steele, Junior a spol.,

U.S.Patent č. 3,078,315, který je zde zahrnut jako odkaz.

Jedním z výhodných polyoxyalkylenglykoletherů je Tergitol XD, vyráběný podle postupu Steele, Jr, a spol. v U.S.Patentu č. 3,078,315 a dostupný z Union Carbide. Je to neionogenní blokový kopolymer s bodem zakalení asi 76°Cpro 1% roztok ve vodě a s molekulovou hmotností asi 3120 danou jeho hydroxylovým číslem.

Mohou být použity jiné neionogenní polyoxyalkylenglykoletherové blokové kopolymery, jako jsou ty vyráběné BASF Vyandotte Corporation, které zahrnují typy Pluronic^ a Tetroni áS Polyolové tenzidy Pluronic® a Tetronic^ jsou pohyblivé kapaliny až vločkovité tuhé látky a ty s vysokými obsahy ethylenoxidu nevykazují bod zakalení roztoku dokonce při 100°C. Mohou být použity jiné podobné neionogenní polyoxyalkylenglykoletherové povrchově aktivní blokové kopolymery, jako jsou ty vyráběné Dow Chemical Company a Vitco Chemical Corporation.

(R)

Tenzidy Pluronic^, které mohou být rovněž použity v souladu s předloženým vynálezem, se připravují syntézou hydrofobní části požadované molekulové hmotnosti kontrolovanou adicí propylenoxidu na dvě hydroxylové skupiny propylenglykolu. Poté se na oba konce hydrofóbní části aduje ethylenoxid za vzniku oxyethylenových řetězců, které tvoří od asi 10 hmotnostních % do asi 80 hmotnostních % konečné molekuly. Průměrná molekulová hmotnost tenzidu Pluronic® je od asi 1.100 do asi 12.600 a HLB (hydrofilně lipofilní rovnováha) je od asi 1-7 do asi 18-23 nebo větší než asi 24. Pluronic® P-105 použitý v souladu s předloženým vynálezem měl průměrnou molekulovou hmotnost asi 6.500, teplotu tání asi 35°C, bod zakalení asi 91°C

HLB asi 12-18. Tenzidy Tetroni změněné strany (15) které rovněž mohou být použity v souladu s předloženým vynálezem, jsou tetrafunkční blokové kopolymery odvozené ze sekvenční adice propylenoxidu a pak ethylenoxidu ne ethylendiamin. Průměrná molekulová hmotnost těchto tenzidů je od asi 1.650 do asi 30.000 a mají HLB od asi 1-7 do asi 12-23 a větO si nez asi 24. Tetronic 1304 použitý v souladu s předloženým vynálezem měl průměrnou molekulovou hmotnost asi 10.500, teplotu tání asi 59°C, bod zakalení vyšší než asi 100°C a HLB vyšší než asi 24.

Enzym a tenzid mohou být také použity v kombinaci s organickým rozpouštědlem kompatibilním s enzymem, které bude rovněž působit jako rozpouštědlo pro neionogenní povrchově aktivní blokový kopolymer polyether-polyolu. Výhodné rozpouštědlo je hydrofilní, jako je polyol nebo směs polyolů, kde polyol má od 2 do asi 6 uhlíkových atomů a od 2 do asi 6 hydroxylových skupin a zahrnuje látky jako 1,2-propandiol, ethylenglykol, erythritan, glycerol, sorbitol, mannitol, glukosu, fruktosu, laktosu a podobně.

Stabilizovaný enzymový přípravek podle tohoto vynálezu tedy může obsahovat enzym v množství od asi 2 do asi 95 hmotnostních dílů, zvláště od asi 5 do asi 90 hmotnostních dílů a výhodně od asi 10 do asi 80 hmotnostních dílů, vodu ve množství od asi 1 do asi 90 hmotnostních dílů, zvláště od asi 2 do asi 85 hmotnostních dílů a výhodně od asi 5 do asi 80 hmotnostních dílů, rozpouštědlo od asi 0 do asi 70 hmotnostních dílů, zvláště od asi 2 do asi 60 hmotnostních dílů a výhodně od asi 3 do asi 55 hmotnostních dílů a neionogenní povrchově aktivní blokový kopolymer polyether-polyolu v množství od asi 0,2 do asi 40 hmotnostních dílů, zvláště od asi 0,8 do asi 30 hmotnostních dílů a výhodně od asi 1 do asi 25 hmotnostních dílů.

15a změněné strany (15a)

Vynález také zahrnuje způsob stabilizace enzymu a rovněž stabilizovaný enzymový přípravek obsahující od asi 1 do asi 90 hmotnostních % vody, vztaženo na uvedený enzym a vodu v kombinaci s uvedeným neionogenním povrchově aktivním blokovým kopolymerem polyether-polyolu. V jinén^ provedení vynález také zahrnuje způsob stabilizace enzymu a rovněž stabilizovaný enzymový přípravek obsahuj ící více než asi 20 hmotnostních % vody, vztaženo na uvedený enzym a vodu v kombinaci s uvedeným neionogenním povrchově aktivním blokovým kopolymerem polyether-polyolu.

Následující příklady jsou ilustrativní.

Příklady provedení vvnálezu

Příklad 1

Dále uvedený přípravek byl vyroben z Pulpzyme HB, vodné enzymové suspenze, komerčně dostupné od Novo Nordisk Bioindustrials, lne., která je ^cylanasovým přípravkem bakteriálního původu. Rovněž byl použit výše popsaný Tergitol XD. Použitý glycerol měl čistotu 96%, nečistotou byla voda. Lze použít též glycerol vyšší čistoty. Glycerol slouží jako rozpouštědlo Tergitolu XD, který je tuhý při pokojové teplotě. Vizkozita přípravku, 0,22 Pa^-s, byla měřena na Brookfieldově vikozimetru model číslo LVT při 30 otáčkách za minutu, vřeteno číslo 4 při pokojové teplotě (20°C). Přípravek se snadno rozpouští ve vodě. Enzymová aktivita, IU na ml, byla měřena podle metody, kterou popsali Bailey, M.J. a spol., J. Biotech. 23, 257-270, 1992. Tato metoda zahrnuje pětiminutovou inkubaci enzymu xylanasy (vhodně naředěném v pH 5,3 citrátovém pufru) s 1% xylanovým substrátem z březového dřeva. Po inkubaci byly uvolněné cukry stanoveny pětiminutovou reakcí s původním DNS činidlem Sumnera (1921). Absorbance se slepému pokusu činidla zahrnujícího a pufr. Enzymový odečet se koriguje odpočtením enzymového slepého pokusu složeného ze substrátu a DNS činidla, ke kterému se přidá zředěný enzym s okamžitým vznikem zbarvení/ukončením reakce místo inkubace.

Složka Hmotnostní procenta měří při 540 nm proti substrát, DNS činidlo

Pulpzyme HB 75

Glycerol 5

Tergitol XD 20

Tabulka 1 dále uvedená ukazuje vynikající stabilitu tohoto přípravku. Nárůst aktivity enzymu je v rámci experimentální chyby.

Tabulka 1

Stabilizace enzymu v Přikladu 1

Enzymová aktivita (IU na ml)*

původní vzorek	pokojová teplota	8°C	50°C
9170	9130	9820	10900
* Třicet dnů v	uvedených podmínkách.

Příklad 2

Příklad 1 byl opakován s použitím Pulpzymu HB, ovšem Tergitol XD byl nahrazen přípravkem Pluronic® P-105, který je neionogenním blokovým kopolymerem dodávaným BASF Vyandotte Corporation. Bod zakalení tohoto kopolymerů je 91°C (1% vodný roztok) a 94°C (10% vodný roztok). Průměrná molekulová hmotnost tenzidu je asi 6.500.

Tabulka 2 ukazuje v mezích experimentální chyby snížení stability tohoto přípravku v porovnání s Příkladem 1, což se zdá být vlastnost Pluronictl® P-105 v porovnání s Tergitolem XD. Stabilita je nicméně lepší než u enzymů bez Pluronicu^ P-105. Enzym bude rychle ztrácet svou aktivitu za těchto podmínek bez stabilizace poskytnuté přípravkem Pluronic® P-105.

Tabulka 2

Stabilizace enzymu v Příkladu 2

Enzymová aktivita (IU na ml)*

původní vzorek	pokojová teplota	8°C	50°C
8400	8280	8970	7370

* Třicet dnů v uvedených podmínkách.

Příklad 3

Příklad 1 byl opakován s použitím proteasového enzymu od Solvay Enzymes, lne. nebo Upasového enzymu od Novo Nordisk Bioindustrials,lne. a výsledky jsou uvedeny dále v Tabulce 3.

Tabulka 3 složka hmotnostní %

HT-Proteolytic L-175® (proteasa) glycerol (96% plus) Tergitol XD	70 20 10	100
aktivita	(14 dnů)	při	50°C	45	24
	při pokojové	teplotě	(20°C)	90	91
složka				hmotnostní %
Resinase	A2X^ (lipasa)	85	85	85	85
glycerol	(96% plus)	5		5	5
Tergitol	XD	10	--	--
voda			15
Pluronic® P105			10
Tetronic	1304® BASF Vyandotte				10
aktivita	(30 dnů) při 50°C	0.049	0.033	0.047	0.0553
při pokojové teplotě (20°C)	0.048	0.067	0.054	0.0472

Odborníku v oboru bude zřejmé, že lze provádět modifikace a variace způsobů a přípravků předloženého vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od povahy nebo rozsahu tohoto vynálezu. Určuje se, že tyto modifikace a variace a jejich ekvivalenty jsou zahrnuty jako část tohoto vynálezu, což zajišťuje, že spadají do rozsahu připojených nároků.

Claims

1. Způsob stabilizace enzymového přípravku obsahujícího více než 20 hmotnostních % vody vůči ztrátě aktivity při zvýšených teplotách nebo vodou, vyznačující se tím, že se spojuje uvedený enzym se stabilizujícím množstvím neionogenního povrchově aktivního blokového kopolymeru polyetherpolyolu, přičemž uvedený neionogenni povrchově aktivní blokový kopolymer polyether-polyolu je celoblok, blok-hetero, hetero-blok nebo hetero-hetero blokový kopolymer polyoxyalkylenglykoletheru, kde uvedené alkylenové jednotky mají od 2 do 4 uhlíkových atomů.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený enzym je stabilizován vůči rozkladu při zvýšených teplotách uvedeným neionogenním povrchově aktivním blokovým kopolymerem polyether-polyolu, který má bod zákalu vyšší než uvedené teploty.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedené teploty jsou od 0°C do 100°C.

4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedený neionogenni povrchově aktivní blokový kopolymer polyether-polyolu je rozpuštěn v organickém rozpouštědle kompatibilním s uvedeným enzymem.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený neionogenni povrchově aktivní blokový kopolymer polyether-polyolu je rozpuštěn v organickém rozpouštědle kompatibilním s uvedeným enzymem.

— —. --- < xO ď ř²' tn 2 O -< jn Z £ — r- P o o o ΓΓΛ < □= o

ÍO· cr>

: tn ι σ-.

o změněné strany

6. Způsob podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se t i m, že uvedené rozpouštědlo je hydrofilní.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvedené rozpouštědlo je polyoi nebo směs polyolů.

W

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedený polyoi má od 2 do 6 uhlíkových atomů a od 2 do šesti hydroxylových skupin.

9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedenými enzymy jsou proteasa, amylasa, celulasa, hemicelulasa, pektinasa, β-glukanasa, lipasa, fosfolipasa, glukosoisomerasa, glukosooxidasa a lipoxidasa.

10. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že uvedený polyoxyalkylenglykolether obsahuje hydrofobní a hydrofilní bloky založené přinejmenším na oxyethylenových, oxypropylenových skupinách nebo směsích těchto skupin.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že průměrná molekulární hmotnost uvedeného polyoxyalkylenglykoletheru je od 500 do 30.000, hmotnostní poměr hydrofobní k hydrofilní části uvedeného polyoxyalkylenglykoletheru je od 0,4:1 do 2,5:1 a bod zákalu uvedeného polyoxyalkylenglykoletheru je od 0°C do 110°C.

změněné strany

12. Enzymový přípravek obsahující více než 20 hmotnostních % vody stabilizovaný vůči ztrátě aktivity při zvýšených teplotách nebo vodou, vyznačující se tím, že uvedený přípravek je enzym v kombinaci se stabilizujícím * množstvím neionogenního povrchově aktivního blokového kopolymeru polyether-polyolu, kde uvedený%heionogenní povrchově aktivní blokový kopolymer polyether-polyolu je celoblok, blok-hetero, hetero-blok nebo hetero-hetero blokový kopolymer polyoxyalkylenglykoletheru, v němž uvedené alkylenové jednot ky mají od 2 do 4 uhlíkových atomů.

13. Přípravek podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedený enzym je stabilizován vůči rozkladu při zvýšených teplotách uvedeným neionogenním povrchově aktivním blokovým kopolymerem polyether-polyolu, který má bod zákalu vyšší než uvedené teploty.

14. Přípravek podle nároku 13, vyznačující se ΐ í m, že uvedené teploty jsou od 0°C do 110°C.

15. Přípravek podle nároku 12 nebo 13, vyznačuj ící se ΐ í m, že uvedený neionogenní povrchově aktivní blokový kopolymer polyether-polyolu je rozpuštěn v organickém rozpouštědle kompatibilním s uvedeným enzymem.

16. Přípravek podle nároku 15, vyznačující se ΐ í m, že uvedené rozpouštědlo je hydrofilní.

*

17. Přípravek podle nároku 16, vyznačující se ' » t í m, že uvedené rozpouštědlo je polyol nebo směs polyolů.

Λ u

změněné strany

18. Přípravek podle nároku 17, vyznačující se tím, že uvedený polyol má od 2 do 6 uhlíkových atomů a od 2 do 6 hydroxylových skupin.

19. Přípravek podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedenými enzymy jsou proteasa, amylasa, celulasa, hemicelulasa, pektinása, β-glukanasa, lipasa, fosfolipasa, glukosoisomerasa, glukosooxidasa a lipoxidasa.

20. Přípravek podle nároku 13 nebo 14, vyznačující se t i m, že uvedený polyoxyalkylenglykolether obsahuje hydrofobní a hydrofilní bloky, každý blok je založen nejméně na oxyethylenových skupinách nebo oxypropylenových skupinách ne bo směsích těchto skupin.

21. Přípravek podle nároku 20, vyznačující se tím, že průměrná molekulová hmotnost uvedeného polyoxyalkylenglykolu je od 500 do 30.000, hmotnostní poměr hydrofobní k hydrofilní části uvedeného polyoxyglykoletheru je od 0,4:1 do 2,5:1 a bod zákalu uvedeného polyoxyalkylenetheru je od 0°C do 110°C.