PT2371391E

PT2371391E - Utilização terapêutica de anticorpos anti-cs1

Info

Publication number: PT2371391E
Application number: PT101833770T
Authority: PT
Inventors: Yun J Tso; Marna Williams; David B Powers; Gao Liu; Nicolas F Landolfi
Original assignee: Abbvie Biotherapeutics Inc
Priority date: 2003-05-08
Filing date: 2004-05-10
Publication date: 2014-10-30
Also published as: CN1805755A; DK1624892T3; HK1089374A1; CY1115671T1; US20090238827A1; JP2007503465A; AU2010214661B2; CA2523001A1; AU2010214661A1; CN1805755B; JP2014139187A; US10442859B2; PL1624892T3; JP6042834B2; EP1624892A4; SI1624892T1; US20120064083A1; US20100168397A1; WO2004100898A3; SI2853272T1

Description

ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Utilização terapêutica de anticorpos anti-CSl"

CAMPO DO INVENTO 0 invento refere-se ao campo dos antagonistas e anticorpos no tratamento de doenças, incluindo doenças relacionadas com auto-imunidade e cancro, e a métodos para detectar, identificar e modular essas doenças.

ANTECEDENTES DO INVENTO A expressão aumentada de imunoglobulina é uma caracteristica de muitas doenças. A excreção de imunoglobulina em níveis elevados provoca uma variedade de doenças incluindo síndrome de hiperviscosidade, uma doença debilitante que resulta em fadiga, dores de cabeça, falta de ar, confusão mental, dores no peito, danos e insuficiência renal, problemas de visão e fenómeno de Raynaud (má circulação sanguínea especialmente nos dedos das mãos e dos pés, nariz e orelhas) . A doença de aglutinina fria, crioglobulinemia mista, hipergamaglobulinemia, síndrome de Sjogren, líquen mixedematoso e a doença de Gaucher são exemplos de doenças associadas com expressão aumentada de imunoglobulinas. A expressão aumentada de imunoglobulinas tendo como alvo auto-proteínas é uma marca distintiva de doenças auto-imunes. A doença auto-imune é uma falha do sistema imunitário em reconhecer auto-antigénios como próprios. Nas doenças auto-imunes o sistema imunitário ataca-se a si próprio por engano tendo como alvo células, tecidos e órgãos, resultando eventualmente na destruição de sistemas fisiológicos. A autoimunidades e as doenças auto-imunes são de origem multi-factorial e estando implicados a predisposição genética, os factores do hospedeiro (e.g. debilidade de controlos de regulação imunitária, defeitos nas células T supressoras ou estimulação policlonal de células B resistente a controlos), os factores ambientais e os mecanismos dirigidos por antigénio 2 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ no desenvolvimento de auto-imunidade e produção de auto-anticorpos contra auto-antigénios.

As doenças gastrointestinais e o lúpus eritematoso sistémico (SLE) são dois exemplos de doenças auto-imunes. As doenças inflamatórias do intestino (IBD), um subgrupo das doenças gastrointestinais, constituem um grupo de doenças incuráveis que afectam aproximadamente 4 milhões de indivíduos no mundo inteiro. A etiologia da doença inflamatória do intestino recorrente é actualmente desconhecida. As teorias incluem uma destruição mediada por auto-imunidade de células gastrointestinais incluindo linfócitos. A agregação homotípica anómala em modelos de doença inflamatória do intestino hereditária foi anteriormente demonstrada e provou-se que as mutações em N0D2, um gene implicado em doenças auto-imunes, predispõem os doentes à doença de Crohn. Ni, J. et al., Immunological abnormality in C3H/HeJ mice with heritable inflammatory bowel disease, Cell Immunol. 169:7-15 (1996);

Ogura, Y. et al., A frameshift mutation in N0D2 associated com susceptibility to Crohn'' s Disease,Nature 411: 603-606 (2001).

As IBD afectam mais habitualmente o intestino delgado e o cólon mas podem envolver qualquer parte do tracto gastrointestinal. Existem mais de 1 milhão de pessoas diagnosticadas com IBD apenas nos Estados Unidos, com mais de 10 000 novos casos diagnosticados anualmente. Devido ao efeito drástico na qualidade de vida de doentes com IBD, dezenas de milhares de horas são perdidas anualmente que equivalem a mil milhões de dólares de dias de trabalho perdidos anualmente. A IBD produz uma gama de sintomas gastrointestinais e extra-intestinais, incluindo diarreia, hemorragia rectal, dor abdominal, perda de peso, doenças da pele e dos olhos e atraso de crescimento e de maturação sexual em crianças. Dois tipos de IBD são colite ulcerosa e doença de Crohn, que partilham sintomas e manifestações fisiológicas semelhantes mas diferem no modo pelo qual afectam o tracto digestivo. A colite ulcerosa caracteriza-se por inflamação ulcerativa da totalidade ou de parte da mucosa do cólon, incluindo muito 3 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ frequentemente ο recto. Os seus sintomas incluem hemorragia e urgência rectais, tenesmus e diarreia. A colite ulcerosa é acompanhada por complicações graves a curto e longo prazo. As complicações de curto prazo mais graves são colite fulminante, megacólon tóxico e perfuração. As complicações de longo prazo graves incluem osteoporose e cancro colo-rectal. A doença de Crohn é uma inflamação transmural crónica que pode afectar qualquer parte do tracto gastrointestinal desde a boca ao ânus. A doença de Crohn é descontinua, intercalando as áreas não afectadas com uma ou mais áreas envolvidas. Nos estágios tardios da doença, a mucosa desenvolve uma aparência de empedrado que resulta de ulcerações longitudinais profundas interlaçadas com mucosa normal interveniente. A maioria dos doentes de doença de Crohn apresenta sintomas de dor e sensibilidade abdominal, diarreia crónica ou nocturna, hemorragia rectal, perda de peso e febre. A doença de Crohn evolui desde uma doença primordialmente inflamatória para um de dois padrões clínicos: estenosante (obstrutivo) ou penetrante (fistulizante). Na forma estenosante a inflamação transmural produz proliferação fibromuscular na parede do intestino seguida de estreitamento luminal. Os sintomas de obstrução tornam-se comuns à medida que a doença de Crohn progride. Na forma penetrante formam-se tractos sinusoidais como túneis inflamatórios através da parede do intestino e rompem a superfície serosa, fistulizando para tecidos adjacentes e mesmo através da pele. A colite ulcerosa e a doença de Crohn são geralmente diagnosticadas utilizando critérios clínicos, endoscópicos e histológicos. Contudo, até ao momento as técnicas tradicionais de diagnóstico estabeleceram que apenas um sintoma não é diagnóstico absoluto para uma doença ou outra. Além disso, aproximadamente 20% dos doentes têm um perfil clínico que se situa entre a doença de Crohn e a colite ulcerosa. Diz-se que os doentes que se incluem neste perfil têm colite indeterminada. 4 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Os sintomas de IBD podem ter um grande impacto no bem-estar, na qualidade de vida e na capacidade do doente ter uma vida normal. Os períodos inflamatórios são prolongados e frequentes e dependendo da gravidade, podem afectar grandemente a qualidade de vida. Devido à IBD ser crónica e ter tipicamente início antes dos 30 anos de idade, os doentes normalmente necessitam de tratamento durante toda a vida. A elucidação de um papel para novas proteínas e compostos em estados de doença para identificação de alvos potenciais e marcadores de diagnóstico é valiosa para melhorar o tratamento actual de doentes com doença inflamatória do intestino. O SLE caracteriza-se pela produção de auto-anticorpos contra uma variedade de moléculas ubíquas que podem ter consequências patogénicas incluindo danos a vários órgãos e tecidos, incluindo pele, rim, cérebro e coração. Os tratamentos presentemente aprovados para SLE envolvem imunossupressão não específica e controlo dos sintomas através de esteróides, fármacos imunossupressores, imunomoduladores e fármacos anti-malária. Contudo, estas abordagens de tratamento resultam em riscos de toxicidade renal e mortalidade precoce. Assim, pretende-se desenvolver uma nova abordagem que interfere especificamente com a activação de linfócitos e produção de auto-anticorpos.

Outras doenças auto-imunes nas quais o aumento de expressão de imunoglobulina e/ou células B desempenha uma papel significativo incluem púrpura trombocitopénica idiopática, artrite reumatóide (RA), anemia hemolítica auto-imune e miastenia grave. A evidência para o papel de células B e/ou imunoglobulina aumentada provém de estudos com doentes tratados com esteróides, agentes imunossupressores e/ou anticorpos anti-CD20 (que têm como alvo células B). A melhoria de sintomas nestas doenças correlaciona-se com uma diminuição de células B e/ou imunoglobulina sérica, sublinhando o papel fundamental desempenhado pelas células B em várias doenças auto-imunes. 5 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ A expressão aumentada de imunoglobulina pode também ser observada em doenças malignas. Tal como nas doenças auto-imunes a etiologia do cancro tem igualmente uma origem multi-factorial. 0 cancro representa a segunda principal causa de morte nos Estados Unidos e tem sido ligado a mutações no ADN que causam crescimento celular descontrolado. A predisposição genética desempenha um papel importante no desenvolvimento de muitos cancros em combinação com factores ambientais tais como fumar e mutagénese guímica.

0 cancro pode ocorrer em gualguer tecido ou órgão do corpo. As neoplasias de células plasmáticas, incluindo o mieloma múltiplo, o mieloma "solitário" dos ossos, o plasmocitoma extramedular, a leucemia das células plasmáticas, a macroglobulinemia (incluindo a macroglobulinemia de Waldenstrom), doença da cadeia pesada, amiloidose primária, gamopatia monoclonal de significado indeterminado (MGUS) estão associadas com expressão aumentada de imunoglobulinas. A leucemia linfocitica crónica (CLL), uma neoplasia de células não plasmáticas, está também associada com níveis elevados de expressão de imunoglobulina.

Os mielomas ou doença de Kahler são tumores de células plasmáticas derivadas de um único clone gue têm origem tipicamente em tecido linfóide secundário gue seguidamente migra e reside no tecido da medula óssea. Os mielomas afectam habitualmente a medula óssea e estruturas ósseas adjacentes com sintomas primários de dor nos ossos e fracturas ou lesões patológicas (lesões ósseas osteolíticas), hemorragia anómala, anemia e susceptibilidade aumentada a infecções. Os estágios avançados da doença incluem insuficiência renal, deformidades do esqueleto, compactação da espinal medula e hipercalcemia. 0 mieloma afecta as células ósseas induzindo reabsorção óssea por osteoclastos, dizimando assim a estrutura óssea e aumentando a concentração de cálcio no plasma. A etiologia dos mielomas é presentemente desconhecida. Foram postuladas ligações a danos pela radiação, mutações em oncogenes, causas familiares e expressão anómala de IL6. 6 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Os mielomas múltiplos são tumores de células plasmáticas com várias origens. Os mielomas múltiplos são responsáveis por aproximadamente 10% de todas as malignidades de células plasmáticas e são o cancro de tumor ósseo mais comum em adultos com uma taxa de incidência anual de 3 a 4 casos por 100 000 pessoas. Nos Estados Unidos, os mielomas múltiplos são a segunda malignidade hematológica mais comum depois do linfoma não Hodgkin com aproximadamente 50 000 casos apenas nos Estados Unidos e aproximadamente 13 500 novos casos relatados anualmente. A perspectiva de prognóstico para doentes diagnosticados com mielomas múltiplos é muito fraca com apenas alguns meses a um ano para doentes com formas avançadas da doença.

As regiões de tratamento tradicional para mieloma e mielomas múltiplos (doravante referidos como "mieloma") consistem em quimioterapia, radioterapia e cirurgia. Adicionalmente recomenda-se transplante de medula óssea para doentes sem complicações de saúde adicionais. A taxa de cura para doentes aproxima-se de 30% e é o único método conhecido que pode curar mielomas. Contudo, para indivíduos mais velhos ou que não podem tolerar procedimentos de transplante de medula óssea, a quimioterapia é o mais adequado.

Os procedimentos de diagnóstico actuais incluem raios-X, aspiração de medula óssea, testes de sangue e urina (para detectar a presença de proteína Bence Jones) e o ensaio de velocidade de sedimentação de eritrócitos. Foram também identificados marcadores de superfície celular potenciais em células plasmáticas com mieloma, incluindo CD38, CD9, CD10, HLA-DR e CD20. Ruiz-Arugelles GJ e San Miguel JF, Cell Surface Markers in Multiple Myeloma, Mayo Clin. Proc. 69:684-90 (1994). Outros marcadores de linhagens celulares não B incluem CD2, CD4, CD13, CD14, CD15, CD23, CD 24, CD25, CD33, CD39, CDw40, CD41, CD45R, CD54, CD56 e CD71, assim como antigénios não agregados, Rl-3, PCA-1, PCA-2, PCI, 62B1, 8A, 8F6 e MM4) . Ruiz-Arugelles, supra; Leo R, et al., Multiparameter analysis of normal and malignant human plasma cells, Ann. Hematol. 64:132-9 (1992) . Adicionalmente, o aparecimento de anticorpos 7 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ anómalos, conhecidos como proteína M, é um indicador de mieloma múltiplo. A produção aumentada de proteína M foi relacionada com síndrome de hiperviscosidade em mielomas múltiplos causando efeitos secundários debilitantes incluindo fadiga, dores de cabeça, falta de ar, confusão mental, dor no peito, danos e insuficiência renal, problemas de visão e fenómeno de Raynaud (circulação sanguínea dificultada, nomeadamente nos dedos das mãos e dos pés, no nariz e nas orelhas). A crioglobulinemia ocorre quando a proteína M do sangue forma partículas em condições frias. Essas partículas podem bloquear vasos sanguíneos pequenos e causar dor e dormência nos dedos das mãos, dos pés e noutras extremidades durante o tempo frio. Foram também estudados indicadores de prognóstico tais como deleções cromossómicas, níveis elevados de beta-2 microglobulina, níveis de creatinina sérica e isotipagem de IgA. Tricot G, et ai., Poor prognosis in Multiple Myeloma, Blood 86:4250-2 (1995). A CS1 (SLAMF7, 19A; número de acesso Genbank NM_021181.3, Ref. Boles e Mathew (2001) Immunogenetics 52:302-307; Bouchon et al. , (2001) J. Immunol. 167:5517-5521; Murphy et al., (2002) Biochem. J. 361:431-436) é um membro do subconjunto CD2 da superfamília das imunoglobulinas. As moléculas da família CD2 estão envolvidas numa vasta gama de funções imunomoduladoras, tal como co-activação, proliferação, diferenciação e adesão de linfócitos, assim como excreção de imunoglobulina, produção de citoquina e citotoxicidade de células NK. Vários membros da família CD2, tal como CD2, CD58, e CD150, desempenham ou propôs-se que desempenham um papel em várias doenças auto-imunes e inflamatórias, tal como psoríase, artrite reumatóide e esclerose múltipla. A CS1 (também conhecida como CRACC, 19A, APEX-1 e FOAP12) foi isolada e clonada por Boles, K. et al. (consultar Immunogenetics 52: 302-307 (2001)). Relatou-se que CS1 desempenha um papel na citotoxicidade mediada por células NK e adesão de linfócitos (Bouchon, A., et al., J. of Immuno.5511-5521 (2001); Murphy, J. et al., Biochem. J. 361: 431-436 (2002)). 8 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ A publicação PCT W0 01/46260 divulga um anticorpo monoclonal contra APEX-1 e a sua utilização para detectar o domínio extracelular recombinante de APEX-1 produzida. Contudo, ainda não foram desenvolvidos e divulgados nas publicações anteriormente referidas anticorpos capazes de inibir produção de imunoglobulina por células B e/ou proliferação e/ou desenvolvimento de mielomas. De igual modo, ainda não foi desenvolvida ou divulgada nas publicações anteriormente referidas evidência de sobre-expressão de CS-1 em doença auto-imune ou cancro.

SUMÁRIO DO INVENTO A elucidação de um papel para novas proteínas e compostos em estados de doença para identificação de alvos potenciais e marcadores de diagnóstico é útil para melhorar o tratamento presentemente disponível para doentes de auto-imunidade e de cancro, incluindo doentes com IBD, SLE, RA e mieloma. Assim, descrevem-se aqui alvos moleculares para tratamento e diagnóstico destas doenças, nomeadamente CS1. Além disso, proporcionam-se aqui antagonistas que se ligam a CS1 e a neutralizam, incluindo anticorpos neutralizantes anti-CSl. 0 presente invento baseia-se em parte na nossa constatação da ausência de expressão significativa de proteína CS1 em plaquetas, eritrócitos, células endoteliais (HuVEC), células de rim, células das vias aéreas dos brônquios, células das pequenas vias aéreas, células de próstata, células de fígado ou células de mama. A expressão de CS 1 é específica de células linfóides e detecta-se em células de doentes incluindo células plasmáticas de mieloma múltiplo e células plasmáticas de doentes de leucemia. Detecta-se expressão apenas em células plasmáticas e não se detecta a níveis significativos noutros tipos de células de amostras de medula óssea. Assim, o presente invento demonstrou a possibilidade de utilizar anticorpos anti-CSl como agentes terapêuticos para o tratamento de cancro, incluindo entre outras, neoplasias de células plasmáticas, incluindo mieloma, mieloma múltiplo, 9 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ mieloma "solitário" do osso, plasmacitoma extramedular, leucemia de células plasmáticas, macroglobulinemia (incluindo macroglobulinemia de Waldenstrom), doença da cadeia pesada, amiloidose primária, gamopatia monoclonal de significado indeterminado (MGUS). Adicionalmente, as neoplasias de células não plasmáticas associadas com expressão aumentada de imunoglobulina, incluindo leucemia linfocitica crónica (CLL), beneficiarão igualmente da terapia anti-CSl.

Adicionalmente, estudos anteriores não divulgaram expressão de proteína CS1 em células B de sangue periférico activado por PWM (mitogénio de fitolaca) por subconjuntos de linfócitos B e T de sangue periférico de memória/efectores contra virgens ou monócitos/macrófagos CD14+ de sangue periférico in vitro. Estudos anteriores também não divulgaram o papel de CS1 na produção de imunoglobulina. Em resultado, a correlação entre CS1 e doenças auto-imunes não foi anteriormente estabelecida. 0 presente invento também se baseia em parte na nossa constatação de que a expressão de ARN e proteína CS1 são fortemente reguladas positivamente em células B de sangue periférico activadas, o subconjunto de células responsáveis por produção de auto-anticorpo e pensa-se que desempenham um papel significativo no desenvolvimento de doenças auto-imunes. Além disso, revela-se aqui que a expressão do ARN de CS1 em linfócitos B de sangue periférico de doentes com SLE está aumentada comparativamente com células B de adultos saudáveis da mesma idade assim como em doentes com IBD. Revela-se igualmente que a CS-1 é expressa em células plasmáticas infiltrantes na sinóvia em artrite reumatóide (RA) . 0 presente invento revelou também que a CS1 está envolvida em produção de anticorpos e que os anticorpos contra CS1 diminuem a IgM e a IgG excretadas por células B em adultos saudáveis e doentes com lúpus. Subsequentemente, os dados do presente invento sugerem que a CS1 desempenha um papel importante no estabelecimento de doenças auto-imunes, especialmente SLE, IBD e RA. Outras doenças associadas com um aumento de imunoglobulina, células B e/ou produtos de células B beneficiariam também de tratamento anti-CSl, incluindo doença de aglutinina fria, doenças imunobolhosas 10 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ (incluindo penfigóide bolhoso, pênfingo, dermatite herpetiforme, doença por IgA linear e epidermólise bolhosa adquirida), crioglobulinemia mista, hipergamaglobulinemia, sindrome de Sjogren, anemia auto-imune, asma, miastenia grave, esclerose múltipla, inflamação do miocárdio ou do pericárdio, dermatite atópica, psoríase, líquen mixedematoso e doença de Gaucher.

Além disso, não foram anteriormente efectuados estudos para examinar a possibilidade de utilizar anticorpos anti-CSl para tratar doenças auto-imunes e cancros de células plasmáticas, incluindo mieloma e leucemia de células plasmáticas. Um anticorpo terapêutico ideal deve ligar-se principalmente às células alvo. A ligação a outras células e tecidos pode causar danos potenciais a essas células e tecidos e/ou esgotar o anticorpo terapêutico de modo a que seja necessária a entrega de uma quantidade excessiva do anticorpo ao doente de modo a atingir a eficácia de tratamento pretendida. Mais importante, um anticorpo que se liga a plaquetas pode ter efeitos secundários tal como activação de plaquetas (que pode levar a coagulação excessiva) ou esgotamento de plaquetas (que pode levar a insuficiência na coagulação sanguínea). Assim, não é habitualmente possível utilizar um anticorpo como um agente terapêutico se o anticorpo se liga a células e tecidos múltiplos, especialmente caso se ligue a plaquetas. O presente invento baseia-se parcialmente na nossa constatação de que não se detecta expressão significativa de proteína CS1 em plaquetas, eritrócitos, HuVEC, células de rim, células das vias aéreas dos brônquios, células das pequenas vias aéreas, células de próstata, células de fígado ou células de mama. Assim, o presente invento demonstrou a possibilidade de utilizar anticorpos anti-CSl como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças auto-imunes e cancros de células plasmáticas, incluindo mieloma e leucemia de células plasmáticas.

Assim, o presente invento refere-se à reivindicação 1. O presente invento refere-se também à reivindicação 11. Os 11 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ anticorpos neutralizam pelo menos uma actividade biológica de CS1, em que os referidos anticorpos se ligam a CS1 e são susceptíveis de possuir pelo menos uma das actividades seleccionadas do grupo que consiste em: (a) inibir a excreção e/ou a produção de imunoglobulinas por linfócitos; e (b) induzir lise de células que expressam CS1. 0 anticorpo ou fragmentos de anticorpo do presente invento compreendem uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 85% de identidade com qualquer uma de SEQ ID NO :3-2 6. 0 presente invento refere-se também a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo, em que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo se ligam a substancialmente o mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO :3-2 6. A presente divulgação refere-se também a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4. 0 presente invento também se refere a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5 e uma região variável de cadeia leve madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6. A presente divulgação também se refere a um anticorpo ou ao seu fragmento de ligação ao antigénio em que o referido anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8. A presente divulgação refere-se também a uma região determinante da complementaridade (CDR) de cadeia pesada de um 12 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS 9, 10, 11, 15, 16, 17, 21, 22 ou 23. A presente divulgação refere-se também a uma região determinante da complementaridade (CDR) de cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 13, 14, 18, 19, 20, 24, 25 ou 26. A presente divulgação também se refere a um anticorpo ou ao seu fragmento de ligação ao antigénio em que o referido anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:27 e uma região variável de cadeia leve madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28. A presente divulgação refere-se também a uma região determinante da complementaridade (CDR) de cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:30. O presente invento refere-se também a uma região determinante da complementaridade (CDR) de cadeia leve de um anticorpo anti-CSl aqui descrito. A presente divulgação refere-se também a um anticorpo humanizado ou ao seu fragmento de ligação ao antigénio, em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:41 e uma região variável de cadeia leve madura compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:44. O presente invento refere-se também a uma região determinante da complementaridade (CDR) de cadeia pesada de um anticorpo humanizado compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:31. O presente invento também se refere a anticorpos para utilização no tratamento de mieloma ou mieloma múltiplo que se ligam a substancialmente o mesmo epítopo de um anticorpo monoclonal produzido por uma linha celular de hibridoma Luc90 com número de acesso ATCC PTA-5091 ou se ligam a uma epítopo 13 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ não sobreponível de um anticorpo monoclonal produzido por uma linha celular de hibridoma com número de acesso ATCC PTA-5091.

Em algumas concretizações os anticorpos do invento ligam-se a substancialmente o mesmo epitopo de um anticorpo monoclonal produzido por uma linha celular de hibridoma Luc63 depositada junto de ATCC a 6 de Maio de 2004 ou que se ligam a um epitopo não sobreponível de um anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma Luc63. O presente invento também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo reivindicado e um transportador farmacêutico.

Um método para reduzir a excreção de imunoglobulina por linfócitos compreende por os leucócitos ou linfócitos em contacto com uma quantidade eficaz de anticorpo anti-CSl.

Um método para induzir citotoxicidade de células que expressam CS1 compreendendo colocar em contacto as referidas células com uma quantidade eficaz de um anticorpo contra CS1.

Os anticorpos anti-CSl ou fragmentos de ligação ao antigénio anti-CSl do presente invento podem ser utilizados em métodos para evitar ou tratar doenças auto-imunes, tais como SLE e IBD e cancro, tal como mieloma, num indivíduo que os necessite, compreendendo administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de CS1. De preferência, estes anticorpos ligam-se a substancialmente o mesmo epitopo de um anticorpo monoclonal produzido por uma linha celular de hibridoma com número de acesso ATCC PTA-5091 ou com a designação Luc63.

Os métodos para determinar a presença ou ausência de uma célula patológica num doente associada com doenças auto-imunes e cancro compreendem detectar um ácido nucleico compreendendo uma sequência pelo menos 80% idêntica, preferentemente 90% idêntica, com maior preferência 95% idêntica a uma sequência tal como descrita na tabela 2, doravante referida como CS1, 14 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ numa amostra biológica do doente determinando assim a presença ou ausência da célula patológica. A amostra biológica compreende ácidos nucleicos isolados em que os ácidos nucleicos pode ser ARNm, ADN ou outros ácidos nucleicos. A amostra biológica é tecido de um órgão que é afectado pela patologia, incluindo doenças auto-imunes, incluindo SLE, RA e IBD e cancro, tal como mieloma e leucemia de células plasmáticas. Uma etapa adicional pode incorporar a amplificação de ácidos nucleicos antes da etapa de detecção do ácido nucleico. A detecção é de uma proteína codificada pelo ácido nucleico, compreendendo ácido nucleico uma CS1. A etapa de detecção pode ser efectuada por utilização de uma sonda de ácido nucleico marcado. A etapa de detecção pode utilizar um biochip compreendendo uma sequência pelo menos 80% idêntica a uma sequência CS1, preferentemente 90% idêntica, com maior preferência 95% idêntica ou detectar um polipéptido codificado pelo ácido nucleico. A amostra biológica pode ser derivada de um doente que está a ser submetido a um regime terapêutico para tratar a patologia ou que se suspeita ter uma doença auto-imune ou patologia de cancro incluindo mieloma e leucemia de células plasmáticas.

Também se descrevem composições, e.g., uma molécula isolada de ácido nucleico compreendendo uma sequência CS1, incluindo, e.g., as que estão marcadas; um vector de expressão compreendendo tal ácido nucleico; uma célula hospedeira compreendendo tal vector de expressão; um polipéptido isolado que é codificado por tal molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência CS1; ou um anticorpo que liga especificamente o polipéptido. Em concretizações particulares o anticorpo está: conjugado com uma componente efectora, conjugado com um marcador detectável (incluindo, e.g., um marcador fluorescente, um radioisótopo, um composto químico citotóxico) ou é um anticorpo humanizado. 15 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS

TABELAS A tabela 1 apresenta os resultados que mostram actividades de ligação específica de um painel de anticorpos monoclonais CS1. A tabela 2 apresenta as sequências de ácido nucleico e aminoácidos para CS-1. A tabela 3A e 3B apresentam os resultados de tratamento anti-CSl na redução da produção de IgG in vitro por linfócitos de células B activados. A tabela 4 apresenta sequências de aminoácidos de uma região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO:3) e região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 4) de Luc90; as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO:5) e região variável de cadeia leve (SEQ ID NO:6) de Luc63; e as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 7) e região variável de cadeia leve (SEQ ID NO:8) de Luc34. As SEQ ID NO:9, 10 e 11 apresentam as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da cadeia pesada de Luc90. As SEQ ID NO:12, 13 e 14 apresentam as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da cadeia leve de Luc90. As SEQ ID NO:15, 16 e 17 apresentam as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da cadeia pesada de Luc63. As SEQ ID NO:18, 19 e 20 apresentam as sequências de aminoácidos de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da cadeia leve de Luc63. As SEQ ID NO:21, 22 e 23 apresentam as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da cadeia pesada de Luc34. As SEQ ID NO:24, 25 e 26 apresentam as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, da cadeia leve de Luc34. A tabela 5 apresenta sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO:27) e região variável de 16 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ cadeia leve (SEQ ID NO:28) de Luc63. As SEQ ID NO:30-32 e SEQ ID NO :35-37 apresentam as CDR da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve, respectivamente. A SEQ ID NO: 33 apresenta a mutação de aminoácido único de NYT para NYA (em itálico) na CDR2 da região variável de cadeia pesada de Luc63. A tabela 6 apresenta sequências de aminoácidos da cadeia pesada de ratinho de Luc63 (SEQ ID NO:38), ADNc da região variável de cadeia pesada humana (SEQ ID NO:39), ADNc de JH1 humano (SEQ ID NO:40) e região variável de cadeia pesada de Luc63 humanizada (SEQ ID NO:41). Também se apresentam sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve de ratinho (SEQ ID NO:42), ADNc de região variável de cadeia leve humana (SEQ ID NO:43) e região variável de cadeia leve de Luc63 humanizada (SEQ ID NO:44). A tabela 7 proporciona um alinhamento das sequências de aminoácidos da região VH. As sequências de aminoácidos das regiões VH de MuLuc63 e HuLuc63 (SEQ ID NO:45 e 47, respectivamente) e o ADNc humano dos segmentos E55 3-14 e JH1 (SEQ ID NO:46) apresentam-se no código de uma letra. As sequências de CDR com base na definição de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) estão sublinhadas na sequência VH de MuLuc63; a numeração também é de acordo com Kabat. As sequências de CDR do segmento VH humano estão omissas na figura. Previu-se que os aminoácidos únicos sublinhados na sequência VH de HuLuc63 estivessem em contacto com as sequências CDR e foram assim substituídos pelos resíduos de ratinho correspondentes. A mutação de treonina (T) para alanina (A) efectuada em CDR2 para eliminar o potencial local de glicosilação ligado a N (NYT) é indicada por sublinhado duplo. A tabela 8 apresenta um alinhamento das sequências de aminoácidos das regiões VL. As sequências de aminoácidos das regiões VL de MuLuc63 e HuLuc63 (SEQ ID NO:48 e 50, respectivamente) e a sequência do ADNc de III-2R humano (SEQ ID NO:49) apresentam-se no código de uma letra. As sequências 17 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ de CDR com base na definição de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) estão sublinhadas na sequência VL de MuLuc63; a numeração é também de acordo com Kabat. As sequências de CDR do segmento VL humano estão omissas na figura. Prevê-se que os aminoácidos com sublinhado simples na sequência VL de HuLuc63 estejam em contacto com as sequências CDR e foram assim substituídos pelo resíduo correspondente em ratinho. A tabela 9 lista os oligonucleótidos utilizados para a clonagem dos genes VH e VL de HuLuc63

FIGURAS A figura IA apresenta expressão de CS1 predominantemente no plasma e em células B de memória. A figura 1B apresenta expressão de CS1 em amostras de tecido de rim, coração, gânglio linfático, fígado, intestino delgado, cérebro, medula óssea, músculo-esquelético, baço e pulmão. A figura 2A apresenta expressão de CS1 em leucócitos e outros tecidos adultos normais. A figura 2B apresenta expressão de CS1 aumentada em populações de leucócitos activadas múltiplas. A figura 3 apresenta os resultados de ensaios de competição de anticorpos monoclonais anti-CSl. A figura 4 apresenta a afinidade relativa de anticorpos monoclonais anti-CSl. A figura 5A apresenta a coloração imuno-histológica de células que expressam CS1 com três dos anticorpos monoclonais anti-CSl (Luc 23, Luc 38 e Luc63). 18 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ A figura 5Β apresenta a coloração imuno-histológica de uma amígdala inflamada com anticorpos monoclonais anti-CSl e anti-CD138. A figura 5C apresenta a coloração imuno-histológica de tecido da articulação sinovial de um doente com artrite reumatóide com anticorpos monoclonais anti-CSl e anti-CD138. A figura 6 apresenta coloração de superfície celular de células mononucleares de sangue periférico tratadas com mitogénio de fitolaca relativamente a células mononucleares de sangue periférico não estimuladas com três dos anticorpos monoclonais anti-CSl (Luc63, Luc34, e Luc 38.) A figura 7 apresenta a actividade de ligação de Luc63 humanizado (NYT de tipo selvagem comparativamente com a mutação de NYA desglicosilada) em ensaios de ligação de CS1 baseados em ELISA. A figura 8 apresenta um modelo tridimensional da região variável de Luc63 humanizada. A figura 9 apresenta a regulação positiva da expressão de CS1 em linfócitos B e T de sangue periférico activados ensaiada por análise de PCR em tempo real. A figura 10 apresenta o aumento de expressão de CS1 em linfócitos B de sangue periférico de doente SLE comparativamente com adultos humanos da mesma idade ensaiada por análise de PCR em tempo real. A figura 11 apresenta uma representação gráfica da expressão de CS-1 comparativamente com células epiteliais de cólon adulto normal em experiências de micromatriz: a expressão de CS1 aumenta em doentes com colite ulcerosa (n=4) e doença de Crohn (n=5) comparativamente com células epiteliais de cólon adulto normal. Os números por cima das barras indicam o número de vezes dessa alteração 19 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ comparativamente com células epiteliais de cólon adulto normal para cada amostra. A figura 12 apresenta a regulação positiva da expressão de CS1 em doentes de doença inflamatória do intestino com quantificação por PCR em tempo real. A expressão de CS-1 aumenta em doentes com colite ulcerosa (n=2) e doença de Crohn (n=3) comparativamente com conjuntos de amostras de tecido de intestino grosso adulto normal. Os números por cima das barras indicam o número de vezes dessa alteração comparativamente com tecido de intestino grosso adulto normal para cada amostra. A figura 13 apresenta a expressão predominante de CS1 em células de mieloma. A figura 14A-14H apresenta a expressão de CS1 em células plasmáticas de medula óssea de doentes de mieloma múltiplo. A figura 141 apresenta a expressão de CS1 em células de sangue periférico de um doente com leucemia de células plasmáticas. A figura 15 apresenta a expressão de CS1 em subtipos de células da medula óssea. A figura 16 apresenta a inibição da excreção de IgM in vitro de PBMC activadas por anticorpos monoclonais anti-CSl. A figura 17 apresenta a inibição da excreção de IgM in vitro de linfócitos por anticorpos monoclonais anti-CSl comparativamente com anticorpos monoclonais anti-CD2. A figura 18 apresenta a inibição da excreção de IgG in vitro de linfócitos de adultos saudáveis e doentes de auto- imunidade por anticorpos monoclonais anti-CSl. A figura 19A apresenta a inibição da produção de IgG humana in vivo no modelo de ratinho SCID-HuPBMC por anticorpos monoclonais anti-CSl. 20 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ A figura 19Β apresenta uma comparação da inibição da produção de IgG humana in vivo no modelo de ratinho SCID-HuPBMC pelos anticorpos monoclonais anti-CSl Luc 90 e 63. A figura 19C apresenta um resumo da inibição da produção de IgG humana in vivo no modelo de ratinho SCID-HuPBMC por anticorpos monoclonais anti-CSl. A figura 20 apresenta a indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpo pelos anticorpos monoclonais anti-CSl Luc90 e Luc63. A figura 21A apresenta a indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpo pelos anticorpos monoclonais anti-CSl quiméricos Luc90, que aumenta com anticorpos quiméricos com níveis diminuídos de fucose. A figura 21B apresenta a indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpo de células OPM2 de mieloma múltiplo com anticorpos monoclonais quiméricos anti-CSl Luc90. A figura 21C apresenta a indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpo de células L363 de mieloma múltiplo com anticorpos monoclonais quiméricos anti-CSl Luc90. A figura 22 apresenta volumes de tumor diminuídos em modelos de mieloma múltiplo de enxerto de ratinho com anticorpos anti-CSl Luc 90 e Luc63 comparativamente com anticorpos de controlo de isotipo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

De acordo com os objectivos anteriormente detalhados, descrevem-se aqui novos métodos para tratamento de várias doenças, e.g., doenças auto-imunes e várias doenças cancerosas definidas, incluindo várias formas de mieloma. Também se descrevem métodos para a avaliação em diagnóstico e prognóstico de tais doenças assim como métodos para rastrear 21 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ composições que modulam tais doenças. Descrevem-se também métodos para monitorizar a eficácia terapêutica de tal tratamento, incluindo a monitorização e rastreio de marcadores que se expressam selectivamente nas referidas doenças.

Nomeadamente, a identificação de marcadores que se expressam selectivamente em doenças auto-imunes tais como SLE, RA e IBD e doenças cancerosas tais como mieloma e leucemia de células plasmáticas, permite a utilização dessa expressão em métodos diagnósticos, prognósticos ou terapêuticos. Desse modo, o invento define várias composições, e.g., polipéptidos e anticorpos que serão úteis para identificar selectivamente esses marcadores. Os marcadores podem ser úteis para caracterização molecular de subconjuntos das doenças, cujos subconjuntos podem necessitar concretamente de tratamentos muito diferentes. Além disso, os marcadores podem também ser importantes em doenças relacionadas com doenças auto-imunes, mieloma e leucemia de células plasmáticas, e.g., que afectam tecidos semelhantes aos dessas doenças ou que apresentam mecanismos semelhantes de indução/manutenção. Por exemplo, podem também ser alvos os processos ou caracteristicas de tumor. Disponibilizam-se as utilizações de diagnóstico e prognóstico, e.g., para doenças relacionadas dentro do mesmo subconjunto, embora diferentes, para diferenciar estágios das doenças auto-imunes mieloma ou leucemia de células plasmáticas ou para determinar a estratégia de tratamento de tais doenças. Os métodos de detecção podem basear-se em ácido nucleico, e.g., PCR ou técnicas de hibridação ou proteína, e.g., ELISA, imagem, IHC, etc. 0 diagnóstico pode ser qualitativo ou quantitativo e pode detectar aumento ou diminuição dos níveis de expressão.

Definições A expressão "proteína CS1" ou "polinucleótido CS1" ou "produto de transcrição associado a CS1" refere-se a variantes polimórficas, alelos, mutantes e homólogos interespécies de ácido nucleico e polipéptido, que: (1) têm uma sequência de nucleótido que tem mais de cerca de 60% de identidade de 22 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ sequência de nucleótidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferentemente cerca de 92%, 94%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou maior identidade de sequência de nucleótidos, preferentemente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais nucleótidos, com uma sequência de nucleótidos do gene CS1 ou com ela associada (tabela 2), ligação do gene CS1 (tabela 2) a parceiros de ligação, e.g., anticorpos policlonais desenvolvidos contra um imunogénio compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleótidos do gene CS1 ou com ela associada (tabela 2) e seus mutantes modificados conservativamente; (3) híbrida especificamente em condições de hibridação rigorosas com uma sequência de ácido nucleico ou com a sua complementar de CS1 (tabela 2) e seus mutantes modificados conservativamente; ou (4) tem uma sequência de aminoácidos que tem mais de cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, preferentemente 90%, 91%, 93%, 95%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos, preferentemente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais aminoácidos, com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleótidos do gene CS1 ou com ela associada (tabela 2). Uma sequência de polinucleótido ou polipéptido é tipicamente de um mamífero incluindo, entre outros, primatas, e.g., humano; roedor, e.g., rato, ratinho, hamster; vaca, porco, cavalo, ovelha ou outro mamífero. Um "polipéptido CS1" e um "polinucleótido CS1" incluem tanto a forma de ocorrência natural como a recombinante.

Uma proteína ou ácido nucleico CS1 "completo" refere-se a um polipéptido ou uma sequência de polinucleótidos CS1 ou uma sua variante, que contém elementos normalmente incluídos em uma ou mais sequências de polinucleótido ou polipéptido de ocorrência natural de CS1 de tipo selvagem. O "completo" pode ser antes ou após várias etapas de processamento ou splicing após tradução incluindo splicing alternativo. "Amostra biológica" tal como aqui utilizado é uma amostra de tecido ou fluido biológico que contém ácidos nucleicos ou 23 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ polipéptidos, e.g., de uma proteína, polinucleótido ou produto de transcrição CS1. Tais amostras incluem, entre outras, tecido isolado de primatas, e.g., humanos ou roedores, e.g., ratinhos e ratos. As amostras biológicas podem também incluir secções de tecidos tais como amostras de biopsias e autopsias, secções congeladas retiradas com objectivos histológicos, amostras de arquivo, sangue, plasma, soro, esputo, fezes, lágrimas, muco, cabelo, pele, etc. As amostras biológicas também incluem explantes e culturas de células primárias e/ou transformadas derivadas de tecidos doentes. Uma amostra biológica é tipicamente obtida de um organismo eucariótico, com maior preferência um mamífero tal como um primata, e.g., chimpanzé ou humano; vaca; cão; gato; um roedor, e.g., porquinho-da-índia, rato, ratinho; coelho; ou um pássaro; réptil; ou peixe. 0 gado e os animais domésticos são interessantes. "Proporcionar uma amostra biológica" significa obter uma amostra biológica para utilização nos métodos aqui descritos. Frequentemente, tal será efectuado por remoção de uma amostra de células de um animal mas pode também efectuar-se por utilização de células previamente isoladas (e.g., isoladas por outra pessoa noutra altura e/ou com outros objectivos) ou efectuando os métodos do invento in vivo. Serão especialmente úteis tecidos ou materiais em arquivo com uma história de tratamento ou resultado.

As expressões "idêntica" ou percentagem de "identidade" no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de polipéptido referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma ou têm uma percentagem específica de resíduos de aminoácidos ou de nucleótidos que são os mesmos (e.g., cerca de 70% de identidade, preferentemente 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 93%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior identidade ao longo de uma região especificada, em comparação e alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação ou região designada) tal como medido utilizando, e.g., algoritmos de comparação de sequência BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros implícitos seguidamente 24 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ descritos ou por alinhamento manual e inspecção visual. Diz-se então que tais sequências são ''substancialmente idênticas". Esta definição também se refere, ou pode ser aplicada, à complementar de uma sequência de ensaio. A definição também inclui sequências que têm deleções e/ou inserções, substituições e variantes de ocorrência natural, e.g., variantes polimórficas ou alélicas e variantes produzidas pelo homem. Tal como descrito seguidamente, os algoritmos preferidos podem contabilizar falhas e semelhantes. De preferência, a identidade existe ao longo de uma região que tem um comprimento de pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleótidos ou com maior preferência ao longo de uma região que tem cerca de 50-100 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento.

Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência actua como uma sequência de referência contra a qual se comparam as sequências de ensaio. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequência, entram-se sequências de ensaio e de referência num computador, designam-se as coordenadas de subsequência, caso necessário e designam-se parâmetros de programa de algoritmo de sequência. De preferência, podem utilizar-se parâmetros de programa implícitos ou podem designar-se parâmetros alternativos. O algoritmo de comparação de sequências calcula então as percentagens de identidade de sequência para as sequências de ensaio relativamente à sequência de referência com base nos parâmetros de programa.

Tal como aqui utilizado, uma "janela de comparação" inclui referência a um segmento de posições contíguas seleccionadas do grupo que consiste tipicamente em desde cerca de 20 a 600, habitualmente cerca de 50 a 200, mais habitualmente cerca de 100 a 150, na qual se pode comparar uma sequência com uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas após alinhamento óptimo das duas sequências. São bem conhecidos métodos de alinhamento de sequências para comparação. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser efectuado, e.g., pelo algoritmo de homologia local de 25 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, pelo método de busca por semelhança de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2444-2448, por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA do Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinhamento manual e inspecção visual (consultar, e.g., Ausubel, et al. (ed. 1995 e suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley).

Os exemplos preferidos de algoritmos gue são adeguados para determinar a percentagem de identidade de sequência e a similaridade de sequência incluem os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que se descrevem em Altschul, et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 e Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Utilizam-se BLAST e BLAST 2.0 com os parâmetros aqui descritos para determinar a percentagem de identidade de sequência para as proteínas do invento. O utilitário para efectuar análises BLAST está publicamente disponível através de National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve inicialmente identificar pares com elevada pontuação de sequência (HSP) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de busca, que são semelhantes ou que satisfazem alguma pontuação limite com valor positivo T quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência de base de dados. Refere-se T como pontuação limite de palavra de vizinhança (Altschul, et al., supra). Estes acertos de palavras de vizinhança iniciais actuam como núcleos para iniciar buscas para revelar HSP mais longas que as contenham. Os acertos de palavras estendem-se em ambos os sentidos ao longo de cada sequência desde que a pontuação de alinhamento acumulado possa ser aumentada. As pontuações acumuladas são calculadas utilizando, e.g., como sequências de nucleótidos, os parâmetros M (prémio de pontuação para um par de resíduos equivalentes; sempre >0) e N (penalidade de pontuação para resíduos não equivalentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos utiliza-se uma matriz de pontuação para calcular a pontuação acumulada. 26 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Param-se as extensões dos acertos de palavras em cada sentido, quando: a pontuação de alinhamento acumulada decai da quantidade X relativamente ao valor máximo que atinge; a pontuação acumulada desce para zero ou menos devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou se atinge o final de qualquer das sequências. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) utiliza como valores implícitos um comprimento de palavra (W) de 11, um valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como valores implícitos um comprimento de palavra de 3 e um valor esperado (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915-919) alinhamentos (B) de 50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST também efectua uma análise estatística da similaridade entre duas sequências. Consultar, e.g., Karlin e Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 90:5873-5787. Uma medida de similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade de uma equivalência entre duas sequências de nucleótidos ou aminoácidos ocorrer por acaso. Por exemplo, considera-se que um ácido nucleico é semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade da menor soma numa comparação do ácido nucleico de ensaio com um ácido nucleico de referência for menor que cerca de 0,2, com maior preferência menor que cerca de 0,01 e com a maior preferência menor que cerca de 0,001. Os valores de logaritmos podem ser valores elevados e negativos, e.g., 5, 10, 20, 30, 40, 40, 70, 90, 110, 150, 170, etc.

Uma indicação que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico tem reacção imunológica cruzada com os anticorpos desenvolvidos contra o polipéptido codificado pelo segundo ácido nucleico. Assim, um polipéptido é tipicamente 27 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ substancialmente idêntico a um segundo polipéptido, e.g., quando os dois péptidos diferirem apenas por substituições conservativas. Outra indicação que as duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou as suas complementares hibridam entre si em condições rigorosas. Ainda outra indicação de que as duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que se podem utilizar os mesmos iniciadores para amplificar as sequências.

Uma "célula hospedeira" é uma célula de ocorrência natural ou uma célula transformada que contém um vector de expressão e sustenta a replicação ou expressão do vector de expressão. As células hospedeiras podem ser células cultivadas, explantes, células in vivo e semelhantes. As células hospedeiras podem ser células procarióticas tal como E. coli ou células eucarióticas tal como células de levedura, de insecto, de anfíbio ou de mamífero tal como CHO, HeLa e semelhantes (consultar, e.g., o catálogo ou o portal na Internet de

American Type Culture Collection) .

As expressões "isolado", "purificado" ou "biologicamente puro" referem-se a material que está substancial ou essencialmente isento de componentes que o acompanham normalmente quando no seu estado nativo. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas utilizando técnicas de química analítica tais como electroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. Uma proteína ou ácido nucleico que é a espécie predominante presente numa preparação está substancialmente purificada. Nomeadamente, separa-se um ácido nucleico isolado de alguns quadros de leitura aberta que flanqueiam naturalmente o gene e codificam proteínas diferentes da proteína codificada pelo gene. A expressão "purificado" nalgumas concretizações denota que a proteína dá origem a essencialmente uma banda num gel de electroforese. De preferência, significa que a proteína está pelo menos cerca de 85% pura, com maior preferência pelo menos 95% pura e com a maior preferência pelo menos 99% pura. "Purificar" ou "purificação" noutras concretizações significa 28 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ remover pelo menos um contaminante ou componente da composição a purificar. Neste sentido a purificação não necessita que o composto purificado seja homogéneo, e.g., 100% puro.

As expressões "polipéptido", "péptido" e "proteína" são aqui utilizadas indiferentemente em referência a um polímero de resíduos de aminoácidos. As expressões aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são compostos miméticos químicos artificiais de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como de polímeros de aminoácidos de ocorrência natural ou que contêm resíduos modificados e polímeros de aminoácidos de ocorrência não natural. A expressão "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, assim como análogos de aminoácidos e compostos que mimetizam aminoácidos que funcionam de modo semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são os codificados pelo código genético, assim como os aminoácidos que são posteriormente modificados, e.g., hidroxiprolina, -carboxiglutamato e O-fosfosserina. Análogos de aminoácidos referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que os aminoácidos de ocorrência natural, e.g., um carbono ligado a um hidrégio, um grupo carboxilo, um grupo amino e um grupo R, e.g., homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfónio de metionina. Tais análogos podem conter grupos R modificados (e.g., norleucina) ou esqueletos de péptido modificados, mas manter a mesma estrutura química básica do que um aminoácido de ocorrência natural. Um composto mimético de aminoácido refere-se a um composto químico que tem uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido mas que funciona de modo semelhante a outro aminoácido.

Os aminoácidos podem ser aqui referidos através dos seus símbolos de três letras habitualmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela comissão de nomenclatura bioquímicas da UPAC-IUB. De igual modo, os 29 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ nucleótidos podem ser referidos pelos seus símbolos de código de uma letra comummente aceites. "Variante modificada conservativamente" aplica-se a sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos. Relativamente a sequências de ácidos nucleicos específicas, as variantes modificadas conservativamente referem-se a ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou nas quais o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos para sequências essencialmente idênticas ou associadas, e.g., naturalmente contíguas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica a maioria das proteínas. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam cada um o aminoácido alanina. Assim, em cada posição na qual uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado para outro dos codões correspondentes descritos sem alterar o polipéptido codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas" que são uma espécie de variações modificadas conservativamente. Cada sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipéptido também descreve variações silenciosas do ácido nucleico. Em determinados contextos cada codão num ácido nucleico (excepto AUG, que é habitualmente o único codão para metionina e TGG, que é habitualmente o único codão para triptofano) pode ser modificado para proporcionar uma molécula funcionalmente semelhante. Assim, uma variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipéptido está implícita numa sequência descrita relativamente ao produto de expressão mas não necessariamente relativamente às sequências de sonda efectivas.

Relativamente às sequências de aminoácidos, o perito na especialidade reconhecerá que as substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência de ácido nucleico, péptido, polipéptido ou proteína que alterem, adicionem ou deletem um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante modificada conservativamente" em que a alteração resulta na substituição 30 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. São bem conhecidas tabelas de substituições conservativas que proporcionam aminoácidos semelhantes funcionalmente. Tais variantes modificadas conservativamente são adicionais a variantes polimórficas, homóloqos interespécies e alelos do invento e não os excluem. Tipicamente as substituições conservativas incluem, entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido qlutâmico (E) ; 3) Asparaqina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T); e 8) Cisteina (C), Metionina (M) (consultar, e.g., Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties, Freeman).

As estruturas macromoleculares tais como estruturas de polipéptido podem ser descritas em termos de diferentes niveis de organização. Para uma discussão geral desta organização, consultar, e.g., Alberts, et ai. (ed. 2001) Molecular Biology of the Cell (4a ed.) Garland; e Cantor e Schimmel (1980) Biophysical Chemistry part I: The Conformation of Biological Macromolecules, Freeman. "Estrutura primária" refere-se à sequência de aminoácidos de um péptido especifico. "Estrutura secundária" refere-se a estruturas tridimensionais e ordenadas localmente no interior de um polipéptido. Estas estruturas são habitualmente conhecidas como dominios. Os dominios são partes de um polipéptido que muitas vezes formam uma unidade compacta do polipéptido e têm um comprimento de tipicamente 25 a aproximadamente 500 aminoácidos. Os dominios tipicos são constituídos por secções de menor organização tal como troços de folhas e éhices . "Estrutura terciária" referse à estrutura tridimensional completa de um monómero de polipéptido. "Estrutura quaternária" refere-se à estrutura tridimensional formada habitualmente pela associação não covalente de unidades terciárias independentes. Os termos anisotrópicos são também conhecidos como termos de energia. "Ácido nucleico" ou "oligonucleótido" ou "polinucleótido" ou equivalentes gramaticais aqui utilizados significa pelo 31 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ menos dois nucleótidos ligados conjuntamente de forma covalente. Os oligonucleótidos são tipicamente de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50 ou mais nucleótidos de comprimento até cerca de 100 nucleótidos de comprimento. Os ácidos nucleicos e polinucleótidos são polímeros de qualguer comprimento, incluindo comprimentos maiores, e.g., 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10 000, etc. Um ácido nucleico conterá geralmente ligações fosfodiéster apesar de nalguns casos se incluírem análogos de ácidos nucleicos que podem ter pelo menos uma ligação diferente, e.g., ligações fosforamidato, fosforotiolato, fosforoditiolato ou 0- metilfosforamidito (consultar Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach Oxford Univ. Press); e esqueletos e ligações de ácidos nucleicos peptídicos. Outros análogos de ácidos nucleicos incluem aqueles com esqueletos positivos; esqueletos não iónicos e esqueletos não ribose, incluindo os descritos nas patentes U.S. N2 5 235 033 e 5 034 506 e capítulos 6 e 7 de Sanghvi e Cook (ed. 1994)

Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS Symposium Series 580. Os ácidos nucleicos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos estão também incluídos numa definição de ácidos nucleicos. As modificações do esqueleto ribose-fosfato podem ser efectuadas por várias razões, e.g., para aumentar a estabilidade e meia-vida de tais moléculas em ambientes fisiológicos ou como sondas num biochip. Podem fazer-se misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural e análogos; alternativamente podem fazer-se misturas de análogos de ácidos nucleicos diferentes e misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural e de análogos. Várias referências divulgam tais análogos de ácido nucleico, incluindo, e.g., fosforamidato (Beaucage, et ai. (1993) Tetrahedron 49:1925-1963 e suas referências; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800-3803; Sprinzi, et ai. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579-589; Letsinger, et ai. (1986) Nucl. Acids

Res. 14:3487-499; Sawai, et ai. (1984) Chem. Lett. 805,

Letsinger, et ai. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470-4471; e Pauwels, et ai. (1986) Chemica Scripta 26:141-149), fosforotiolato (Mag, et ai. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437- 32 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 441; e patente U.S η2 5 644 048), fosforoditiolato (Brill, et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321-2322), ligações 0- metilfosforamidito (consultar Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford Univ. Press) e esqueletos e ligações de ácidos nucleicos peptidicos (consultar Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897; Meier, et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008-1010; Nielsen (1993) Nature 365:566-568; Carlsson, et al. (1996) Nature 380:207). Outros análogos de ácidos nucleicos incluem aqueles com esqueletos positivos (Denpcy, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:6097-101; esqueletos não iónicos (patentes U.S. n2 5 386 023, 5 637 684, 5 602 240, 5 216 141 e 4 469 863; Kiedrowski, et al. (1991) Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423-426; Letsinger, et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470-4471; Letsinger, et al. (1994) Nucleoside and

Nucleotide 13:1597; capítulos 2 e 3 em Sanghvi e Cook (ed. 1994) Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS Symposium Series 580; Mesmaeker, et ai. (1994) Bioorganic and Medicinal Chem. Lett. 4:395-398; Jeffs, et ai. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Horn, et al. (1996) Tetrahedron Lett. 37:743) e esqueletos não ribose, incluindo os descritos nas patentes U.S. n2 5 235 033 e 5 034 506 e capítulos 6 e 7 em Sanghvi e Cook (ed. 1994) Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS Symposium Series 580. Também se incluem ácidos nucleicos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos numa definição de ácidos nucleicos (consultar Jenkins, et al. (1995) Chem. Soc. Rev. p. 169-176) .

Descrevem-se vários análogos de ácidos nucleicos em Rawls (página 35, 2 de Junho de 1997) C&E News. São especialmente preferidos ácidos nucleicos peptidicos (PNA) que incluem análogos de ácidos nucleicos peptidicos. Os ácidos nucleicos peptidicos têm esqueletos constituídos por unidades repetitivas N-(2-aminoetil)glicina ligadas por ligações peptídicas. As diferentes bases (purinas e pirimidinas) estão ligadas ao esqueleto por ligações metileno carbonilo. Estes esqueletos são substancialmente não iónicos em condições neutras, contrariamente ao esqueleto fosfodiéster altamente carregado dos ácidos nucleicos de ocorrência 33 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ natural. Tal resulta em pelo menos duas vantagens. 0 esqueleto de PNA apresenta cinética de hibridação melhorada resultando em ligação mais forte entre as cadeias PNA/ADN do que entre as cadeias PNA e as cadeias de ADN. Os PNA têm maiores alterações na temperatura de fusão (Tm) para pares de bases não emparelhados relativamente a pares de bases perfeitamente emparelhados. 0 ADN e o ARN apresentam tipicamente uma queda de 2-4 °C na Tm para um não emparelhamento interno. Com o esqueleto não iónico do PNA a queda é próxima de 7-9 °C. De igual modo, devido à sua natureza não iónica, a hibridação das bases ligadas a esses esqueletos é relativamente insensível à concentração de sal. Adicionalmente, os PNA não são degradados por enzimas celulares e podem portanto ser mais estáveis.

Os ácidos nucleicos podem ser em cadeia simples ou em cadeia dupla, tal como especificado ou podem conter partes de sequência tanto em cadeia dupla como em cadeia simples. A representação de uma cadeia simples também define a sequência da cadeia complementar; assim as sequências aqui descritas também proporcionam o complementar da sequência. 0 ácido nucleico pode ser ADN, tanto genómico com ADNc, ARN ou um híbrido no qual o ácido nucleico pode conter combinações de desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos e combinações de bases incluindo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina, isoguanina, etc. "Produto de transcrição" refere-se tipicamente a um ARN de ocorrência natural, e.g., um pré-ARNm, ARNhn ou ARNm. Tal como aqui utilizada, a expressão "nucleósido" inclui nucleótidos e nucleósidos e análogos de nucleótidos e nucleósidos modificados tal como nucleósidos com modificação amino. Adicionalmente, "nucleósido" inclui estruturas análogas que não ocorrem naturalmente. Assim, e.g., as unidades individuais de ácidos nucleicos peptídicos, contendo uma base cada uma, são aqui referidas como um nucleósido.

Um "marcador" ou uma "parte detectável" é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, fisiológicos, químicos ou outros meios físicos. De um modo geral, os marcadores podem 34 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ classificar-se em três classes: a) marcadores isotópicos, que podem ser radioactivos ou isótopos pesados; b) marcadores imunológicos, que podem ser anticorpos, antigénios ou marcadores de epítopo; e c) corantes coloridos ou fluorescentes. Os marcadores podem ser incorporados em ácidos nucleicos, proteínas e anticorpos CS1. Por exemplo, o marcador deve ser capaz de produzir, directa ou indirectamente, um sinal detectável. A parte detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I, reagentes de elevada densidade electrónica, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina ou uma enzima (e.g., tal como habitualmente utilizado numa ELISA), biotina, digoxigenina ou haptenos e proteínas ou outras entidades que possam ser tornadas detectáveis tais como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano. Conhecem-se métodos para conjugar o anticorpo ao marcador. Consultar, e.g., Hunter, et ai. (1962) Nature 144:945; David, et al. (1974) Biochemistry 13:1014-1021; Pain, et al. (1981) J. Immunol. Meth. 40:219-230; e Nygren (1982) J. Histochem. and Cytochem. 30 :407-412 .

Um "efector" ou "parte de efector" ou "componente de efector" é uma molécula que está ligada (ou conjugada), covalentemente através de um ligando ou uma ligação química ou não covalentemente através de ligações iónicas, de van der Waals, electrostáticas ou de ligações de pontes de hidrogénio a um anticorpo. O "efector" pode ser uma de várias moléculas incluindo, e.g., partes de detecção incluindo compostos radioactivos, compostos fluorescentes, enzimas ou substratos, marcadores tais como marcadores de epítopo, toxinas; partes activáveis, agentes quimioterapêuticos; lipases; antibióticos; partes quimioatractoras, moduladores imunitários (micA/B) ou radioisótopos, e.g., emitindo radiação beta "dura".

Uma "sonda ou oligonucleótido de ácido nucleico marcado" é aquela que está ligada, e.g., covalentemente através de um ligante ou uma ligação química ou não covalentemente através de ligações iónicas, de van der Waals, electrostáticas ou de 35 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ pontes de hidrogénio a um marcador de modo a que a presença da sonda possa ser detectada por detecção da presença do marcador ligado à sonda. Alternativamente, os métodos utilizando interacções de alta afinidade podem atingir os mesmos resultados em que um de um par de parceiros de ligação se liga ao outro, e.g., biotina, estreptavidina.

Tal como aqui se utiliza, uma "sonda ou oligonucleótido de ácido nucleico" é um ácido nucleico capaz de se ligar a um ácido nucleico alvo de sequência complementar através de um ou mais tipos de ligações químicas, habitualmente através de emparelhamento de bases complementares, e.g., através de formação de pontes de hidrogénio. Tal como aqui utilizado, uma sonda pode incluir bases naturais (e.g., A, G, C ou T) ou modificadas (7-diazaguanosina, inosina, etc.). Adicionalmente, podem unir-se as bases numa sonda através de uma ligação diferente de uma ligação fosfodiéster, preferentemente uma ligação que não interfira funcionalmente com a hibridação. Assim, e.g., as sondas podem ser ácidos nucleicos peptídicos cujas bases constituintes estão unidas por ligações peptídicas em vez de ligações fosfodiéster. As sondas podem ligar sequências alvo isentas de complementaridade completa com a sequência sonda dependendo do rigor das condições de hibridação. As sondas são preferentemente marcadas directamente, e.g., com isótopos, cromóforos, luminóforos, cromogénios ou marcadas indirectamente, e.g., com biotina à qual se ligar pode mais tarde um complexo de estreptavidina. Por ensaio da presença ou ausência da sonda, pode detectar-se a presença ou ausência da sequência ou subsequência seleccionada. 0 diagnóstico ou prognóstico pode basear-se no nível genómico ou no nível de expressão de ARN ou de proteína. A expressão "recombinante" quando utilizada com referência, e.g., a uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vector indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vector foi modificada pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativos ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, e.g., as células recombinantes 36 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ expressam genes que não se encontram na forma nativa (não recombinante) da célula ou que expressam genes nativos que seriam de outro modo anomalamente expressos, subexpressos ou que não são expressos. A expressão "ácido nucleico recombinante" significa aqui ácido nucleico, originalmente formado in vitro, geralmente através da manipulação de ácido nucleico, e.g., utilizando polimerases e endonucleases numa forma que não se encontra normalmente na natureza. Deste modo obtém-se ligação operacional de diferentes sequências. Assim um ácido nucleico isolado numa forma linear ou um vector de expressão formado in vitro por ligação de moléculas de ADN que não estão normalmente ligadas, são ambos considerados recombinantes para os objectivos deste invento. Considera-se que uma vez construído um ácido nucleico recombinante e reintroduzido numa célula ou organismo hospedeiro, este replicar-se-á de forma não recombinante, e.g., utilizando a maquinaria celular in vivo da célula hospedeira e não manipulações in vitro; contudo, tais ácidos nucleicos, uma vez produzidos recombinantemente e apesar de serem subsequentemente replicados de forma não recombinante, são ainda considerados recombinantes para os objectivos do invento.

Igualmente, uma "proteína recombinante" é uma proteína produzida utilizando técnicas recombinantes, e.g., através da expressão de um ácido nucleico recombinante tal como representado anteriormente. Uma proteína recombinante distingue-se de uma proteína de ocorrência natural em pelo menos uma ou mais características. A proteína pode ser isolada ou purificada de algumas ou da maioria das proteínas e compostos com os quais se encontra normalmente associada no seu hospedeiro de tipo selvagem e assim pode ser substancialmente pura. Uma proteína isolada não está acompanhada por pelo menos algum do material com o qual está normalmente associada no seu estado natural, preferentemente constituindo pelo menos cerca de 0,5%, com maior preferência pelo menos cerca de 5% em peso da proteína total numa dada amostra. Uma proteína substancialmente pura compreende pelo menos cerca de 75% em peso da proteína total com pelo menos 37 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ cerca de 80% sendo preferido e pelo menos cerca de 90% sendo especialmente preferido. A definição inclui a produção de uma proteína CS1 de um organismo num organismo ou célula hospedeira diferentes. Alternativamente, a proteína pode ser produzida a uma concentração significativamente mais elevada do gue é normalmente observada através da utilização de um promotor indutível ou promotor de expressão elevada, de modo a gue a proteína seja produzida a níveis de concentração aumentados. Alternativamente, a proteína pode estar numa forma gue não é normalmente encontrada na natureza tal como na adição de um marcador de epítopo ou substituições, inserções e deleções de aminoácidos, tal como discutido seguidamente. A expressão "heterólogo" guando utilizada em referência a partes de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que não são normalmente encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de forma recombinante com duas ou mais sequências, e.g., de genes não relacionados arranjados de forma a produzir um novo ácido nucleico funcional, e.g., uma forma de promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra origem. De forma semelhante, uma proteína heteróloga referir-se-á muitas vezes a duas ou mais subsequências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza (e.g., uma proteína de fusão).

Um "promotor" é tipicamente uma matriz de sequências de controlo de ácidos nucleicos que coordenam a transcrição de um ácido nucleico. Tal como aqui utilizado, um promotor inclui necessariamente sequências de ácido nucleico perto do local de início da transcrição, tal como, no caso de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui opcionalmente elementos de facilitador ou repressor distais, que podem estar localizados a vários milhares de pares de bases do local de início de transcrição. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é activo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "indutível" é activo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. A expressão "ligado operacionalmente" 38 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de controlo de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor ou matriz de locais de ligação ao factor de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, e.g., em que a expressão de sequências de controlo dirige transcrição do ácido nucleico correspondente à segunda sequência.

Um "vector de expressão" é uma construção de ácido nucleico gerada de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem transcrição de um ácido nucleico especifico numa célula hospedeira. 0 vector de expressão pode ser parte de um plasmideo, virus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, o vector de expressão inclui um ácido nucleico a ser transcrito em ligação operacional a um promotor. A frase "híbrida selectiva (ou especificamente) com" refere-se à ligação, formação de cadeia dupla ou hibridação de uma molécula selectivamente com uma sequência de nucleótidos específica em condições de hibridação rigorosas quando essa sequência está presente numa mistura complexa (e.g., ADN ou ARN celular total ou de biblioteca). A frase "condições de hibridação rigorosas" refere-se a condições nas quais uma sonda hibridará com a sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácidos nucleicos, mas com nenhumas outras sequências. As condições rigorosas dependem da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As sequências mais longas hibridam especificamente a temperaturas mais elevadas. Encontra-se um guia extenso da hibridação de ácidos nucleicos em "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" em Tijssen (1993) Hybridization with Nucleic Probes (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) (vol. 24) Elsevier. De um modo geral, seleccionam-se as condições rigorosas como 5-10 °C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica a uma força iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (a uma força iónica, pH e concentração de ácido nucleico definidos) à qual 50% das 39 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ sondas complementares com o alvo hibridam com a sequência alvo no equilíbrio (por as sequências alvo estarem presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio). As condições rigorosas serão aquelas às quais a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de ião sódio, tipicamente cerca de 0,01-1,0 M de concentração de ião sódio (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (e.g., cerca de 10-50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (e.g., maiores que cerca de 50 nucleótidos). Podem também atingir-se condições rigorosas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Para hibridação selectiva ou específica, um sinal positivo é tipicamente pelo menos duas vezes o sinal de base, preferentemente 10 vezes a hibridação basal. Seguem-se exemplos de condições de hibridação rigorosa: formamida a 50%, 5x SSC e SDS a 1%, incubação a 42 °C ou 5x SSC, SDS a 1%, incubação a 65 °C com lavagem em 0,2x SSC e SDS a 0,1% a 65 °C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36 °C é típica para amplificação em condições pouco rigorosas, apesar das temperaturas de hibridação poderem variar entre cerca de 32 °C a 48 °C dependendo do comprimento do iniciador. Para amplificação por PCR em condições muito rigorosas, é típica uma temperatura de cerca de 62 °C, apesar das temperaturas de hibridação em condições muito rigorosas poderem variar desde cerca de 50-65 °C, dependendo do comprimento e especificidade do iniciador. As condições típicas de ciclo para condições de amplificação tanto pouco como muito rigorosas incluem uma fase de desnaturação de 90-95 °C durante 30-120 s, uma fase de hibridação que dura 30-120 s e uma fase de extensão a cerca de 72 °C durante 1-2 min. Proporcionam-se protocolos e orientações para reacções de amplificação pouco e muito rigorosas, e.g., em Innis, et ai. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY.

Os ácidos nucleicos que não hibridam entre si em condições rigorosas são ainda substancialmente idênticos se os polipéptidos que codificam forem substancialmente idênticos. Tal ocorre, e.g., quando se cria uma cópia de um ácido nucleico utilizando a degenerescência máxima de codões 40 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos nucleicos hibridam tipicamente sob condições de hibridação moderadamente rigorosas. Os exemplos de "condições de hibridação moderadamente rigorosas" incluem uma hibridação num tampão de formamida a 40%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em IX SSC a 45 °C. Uma hibridação positiva é tipicamente pelo menos duas vezes o valor basal. Podem utilizar-se condições de hibridação e de lavagem alternativas para proporcionar condições com rigor semelhante. Proporcionam-se orientações adicionais para determinar parâmetros de hibridação em várias referências, e.g., Ausubel, et al. (ed. 1991 e suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley. A frase "alterações na morfologia celular" ou "alterações em características celulares" refere-se a qualguer alteração nas caracteristicas de morfologia ou proliferação celular in vitro ou in vivo, tal como viabilidade celular, crescimento celular, excreção de factores de quimiocina, alterações na morfologia celular, perda ou ganho de marcadores específicos de inflamação, capacidade de induzir ou suprimir inflamação quando injectado em hospedeiros animais adequados e/ou indução de um estado de doença em hospedeiros adequados, e.g. doenças auto-imunes e doenças cancerosas. Consultar, e.g., p. 231-241 em Freshney (1994) Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (2a ed.) Wiley-Liss. "Células doentes" refere-se a alterações fenotípicas espontâneas ou induzidas que não envolvem necessariamente a absorção de novo material genético. Por exemplo, apesar da formação de mieloma poder advir de infecção com um vírus de transformação e incorporação de novo ADN genómico ou absorção de ADN exógeno, esta pode também ocorrer espontaneamente ou após exposição a um agente induzindo assim expressão ou alteração de um gene existente. O crescimento de tumor está associado com alterações fenotípicas e de expressão de proteína, tal como alterações morfológicas, crescimento celular aberrante e/ou alterações não morfológicas. Consultar, Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic 41 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Technique (4a ed.) Wiley-Liss. De igual modo, as células afectadas por processos de doença auto-imune estão também associadas com alterações fenotipicas e de expressão de proteína.

Uma quantidade "eficaz" de uma molécula ou de um anticorpo ou de um fármaco ou agente farmacologicamente activo ou formulação farmacêutica significa uma quantidade suficiente da molécula, anticorpo, fármaco, agente ou formulação para proporcionar o efeito pretendido.

Utiliza-se aqui "indivíduo" ou "doente" indiferentemente para referir um vertebrado, preferentemente um mamífero, com maior preferência um humano.

Tal como aqui utilizada, a expressão "anticorpo" ou "imunoglobulina" refere-se a uma proteína consistindo em um ou mais polipéptidos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa, gama (IgGi, IgG2, IgG3, IgGí) , delta, épsilon e mu, assim como a miríade de genes de região V variável de imunoglobulina (tal como indicado seguidamente há genes V para as cadeias H -pesada - e L - leve -) . As "cadeias leves" de imunoglobulina completas (cerca de 25 Kd ou 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável, V-capa ou V-lambda no terminal NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e, respectivamente, um gene de região constante capa ou lambda no terminal COOH. As "cadeias pesadas" de imunoglobulina completas (cerca de 50 Kd ou 446 aminoácidos) são de igual modo codificadas por um gene de região variável (cerca de 116 aminoácidos) e um dos outros genes de região constante anteriormente mencionados, e.g., gama (que codificam cerca de 330 aminoácidos).

Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina apresentando cada par uma cadeia leve e uma cadeia pesada. Em cada par, as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia 42 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ pesada são conjuntamente responsáveis por ligação a um antigénio e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efectoras do anticorpo. Adicionalmente aos anticorpos tetraméricos, as imunoglobulinas podem existir numa variedade de outras formas incluindo, por exemplo, Fv, Fab e (Fab')2, assim como anticorpos híbridos bifuncionais (e.g., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) e em cadeias simples (e.g., Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) e Bird et al. Science, 242, 423- 426 (1988)). (Consultar, de um modo geral, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2a ed. (1984) e Hunkapiller e Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)).

Os anticorpos também existem, e.g., como vários fragmentos bem caracterizados produzidos pela digestão com várias peptidases. Assim, e.g., as digestões com pepsina de um anticorpo abaixo das ligações dissulfureto na região de dobra para produzir F(ab)'2, um dímero de Fab que é ele próprio uma cadeia leve ligada a Vh-Ch1 por uma ligação dissulfureto. O F(ab)'2 pode ser reduzido em condições moderadas de modo a quebrar a ligação dissulfureto na região de dobra convertendo assim o dímero F(ab)f2 num monómero Fab' . O monómero Fab' é essencialmente Fab com parte da região de dobra (consultar Paul (ed. 1999) Fundamental Immunology (4a ed.) Raven. Apesar de se definirem vários fragmentos de anticorpos em termos da digestão de um anticorpo intacto, o perito na especialidade considerará que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo quer quimicamente quer por utilização de metodologia de ADN recombinante. Assim, a expressão anticorpo, tal como aqui utilizada, também inclui fragmentos de anticorpos quer produzidos pela modificação de anticorpos completos, quer aqueles que são sintetizados de novo utilizando metodologias de ADN recombinante (e.g., Fv em cadeia simples) ou aqueles que se identificam utilizando bibliotecas de disposição de fagos (consultar, e.g., McCafferty, et al. (1990) Nature 348:552-554) .

Um "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpo na qual (a) a região constante, ou uma sua parte, é alterada, 43 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ substituída ou permutada de modo a que o local de ligação ao antigénio (região variável) esteja ligado a uma região constante de uma classe e/ou espécie diferente ou alterada ou uma molécula inteiramente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, e.g., uma enzima, toxina, hormona, factor de crescimento, fármaco, função efectora, quimioatractor, modulador imunitário, etc.; ou (b) a região variável ou uma sua parte é alterada, substituída ou permutada com uma região variável com uma especificidade de antigénio diferente ou alterada. A expressão "anticorpo humanizado" ou "imunoglobulina humanizada" refere-se a uma imunoglobulina compreendendo um esqueleto humano, pelo menos uma e preferentemente todas as regiões determinantes da complementaridade (CDR) de um anticorpo não humano no qual qualquer região constante presente é substancialmente idêntica à região constante de uma imunoglobulina humana, i.e., pelo menos cerca de 85-90%, preferentemente pelo menos 95% idêntica. Assim, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, com a excepção possível das CDR, são substancialmente idênticas às partes correspondentes de uma ou mais sequências de imunoglobulina humana nativa. Consultar, e.g. Queen et al., patente U.S. n2 5 5301 101; 5 585 089; 5 693 762; e 6 180 370.

Para a preparação de anticorpos, e.g., anticorpos recombinantes, monoclonais ou policlonais, são conhecidas muitas técnicas. Consultar, e.g., Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, et al. (1983) Immunology Today 4:72; Cole, et al. (1985) p. 77-96 em Reisfeld e Sell (1985) Monoclonal Antibodies and Myeloma Therapy, Liss; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology, Lippincott; Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; e Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2a ed.) Academic Press. As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples (patente U.S 4 946 778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos contra polipéptidos deste invento. Podem igualmente utilizar-se ratinhos transgénicos ou outros organismos tais como outros mamíferos para expressar 44 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ anticorpos humanizados. Alternativamente pode utilizar-se tecnologia de disposição de fagos para identificar anticorpos e fragmentos Fab heteroméricos que se ligam especificamente a antigénios seleccionados. Consultar, e.g., McCafferty, et al. (1990) Nature 348:552-554; Marks, et al. (1992) Biotechnology 10:779-783. A expressão "epítopo" refere-se a qualquer parte (determinante) de uma proteína que é capaz de desencadear uma resposta imunitária e ligar-se especificamente a um anticorpo. Os determinantes de epítopo consistem habitualmente em agrupamentos de moléculas com superfície activa tais como aminoácidos ou cadeias laterais GAG e têm habitualmente características estruturais tridimensionais específicas assim como características de carga específicas. Diz-se que dois anticorpos se ligam a substancialmente o mesmo epítopo de uma proteína (ou a um epítopo sobreposto numa proteína) se as mutações do aminoácido na proteína que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo também reduzirem ou eliminarem a ligação do outro anticorpo e/ou se os anticorpos competirem pela ligação à proteína, i.e., a ligação de um anticorpo à proteína reduz ou elimina a ligação do outro anticorpo. Pode determinar-se se dois anticorpos se ligam a substancialmente o mesmo epítopo por métodos conhecidos na especialidade, tais como um ensaio competitivo. Ao efectuar um estudo de competição de anticorpos entre um anticorpo de controlo (por exemplo, um dos anticorpos anti-CSl aqui descritos) e qualquer anticorpo de ensaio, pode primeiramente marcar-se o anticorpo de controlo com um marcador detectável, tal como biotina, enzimático, marcador radioactivo ou marcador fluorescente para permitir a identificação subsequente. Um anticorpo de ensaio (não marcado) que se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo de controlo (marcado) deve ser capaz de bloquear a ligação do anticorpo de controlo e assim deve reduzir a ligação do anticorpo de controlo.

Num exemplo de uma concretização, se um anticorpo se ligar a substancialmente o mesmo epítopo que um anticorpo monoclonal anti-CSl do presente invento, o anticorpo deve-se ligar a um 45 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ epítopo de CS1 que se sobrepõe ao epítopo de CS1 ao qual se liga o anticorpo monoclonal Luc. A região de sobreposição pode variar entre um residuo de aminoácido e várias centenas de residuos de aminoácido. Este anticorpo deve então competir com a ligação do anticorpo monoclonal Luc a CS1 e/ou bloquear essa ligação e assim diminuir a ligação do anticorpo monoclonal Luc a CS1, preferentemente em pelo menos cerca de 50% num ensaio competitivo. A expressão "derivado de" significa "obtido de" ou "produzido por" ou "descendente de".

Antigénios e anticorpos CS1 A SEQ ID NO:2 representa as sequências de aminoácidos de um CS1 humano de tipo selvagem completo. Um fragmento ou derivado CS1 "funcionalmente activo" apresenta uma ou mais actividades funcionais associadas com uma proteína CS1 de tipo selvagem completa tal como actividade antigénica ou imunogénica, capacidade de ligar substratos celulares naturais, etc. A actividade funcional de proteínas, derivados e fragmentos CS1 pode ser ensaiada por diferentes métodos conhecidos do perito na especialidade (Current Protocols in Protein Science, Coligan et al., ed., John Wiley & Sons, Inc., Somerset, New Jersey (1998)). Para os presentes objectivos, os fragmentos activos funcionalmente também incluem os fragmentos que compreendem um ou mais domínios estruturais de um polipéptido CS1, tal como um domínio de ligação. Os domínios de proteína podem ser identificados utilizando o programa PFAM (Bateman A., et ai., Nucleic Acids Res. 27: 260-2 (1999)).

Os derivados de polipéptido CS1 partilham tipicamente um certo grau de identidade de sequência ou de semelhança de sequência com SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento. Os derivados CS1 podem ser produzidos por vários métodos conhecidos na especialidade. As manipulações que resultam na sua produção podem ocorrer ao nível do gene ou da proteína. Por exemplo, pode clivar-se uma sequência de gene CS1 clonada (e.g. SEQ ID NO:l) em locais apropriados com endonuclease(s) de restrição 46 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ (Wells et al., Philos. Trans. R. Sot. London SerA 317: 415 (1986)), seguido por modificação enzimática adicional, caso pretendido e seguidamente isolado e ligado in vitro e expresso para produzir o derivado pretendido. Alternativamente, pode mutar-se um gene CS1 in vitro ou in vivo para criar e/ou destruir sequências de tradução, iniciação e/ou terminação ou para criar variações em regiões de codificação e/ou para formar novos locais de endonuclease de restrição ou destruir outros já existentes para facilitar adicionalmente a modificação in vitro. Conhecem-se na especialidade várias técnicas de mutagénese tal com mutagénese química, mutagénese dirigida ao local in vitro (Cárter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331(1986)) ou a utilização de ligantes TAB (disponíveis de Pfizer, Inc.).

Num aspecto, os anticorpos do presente invento neutralizam pelo menos uma ou preferentemente todas as actividades biológicas de CS1. As actividades biológicas de CS1 incluem: 1) actividades de ligação dos seus substratos celulares, tal como os seus ligandos (por exemplo, esses anticorpos neutralizantes devem ser capazes de competir com a ligação de CS1 ou de bloquear completamente essa ligação a pelo menos um e preferentemente todos os seus ligandos); 2) actividades de transdução de sinalização; e 3) respostas celulares induzidas por CS1.

Existem as seguintes linhas celulares de hibridoma: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63 ou Luc90. A linha celular de hibridoma Luc90 foi depositada junto de American Type Culture Collection (ATCC) em P. 0. Box 1549, Manassas, VA 20108, com o número de acesso PTA 5091. O depósito desta linha celular de hibridoma foi recebido por ATCC a 26 de Março de 2003. A linha celular de hibridoma Luc63 foi também depositada junto de ATCC na morada anteriormente apresentada. O depósito do anticorpo Luc63 foi recebido por ATCC a 6 de Maio de 2004.

Descrevem-se aqui anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridoma: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc22, 47 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63 ou Luc90 (número de acesso ATCC PTA 5091) . Estes anticorpos monoclonais denominam-se doravante como os anticorpos: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63 e Luc90, respectivamente. O presente invento proporciona anticorpos monoclonais que se ligam a substancialmente o mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos monoclonais Luc do invento aqui descrito. A presente divulgação proporciona anticorpos monoclonais que não se ligam a substancialmente o mesmo epítopo que um ou mais dos anticorpos monoclonais Luc do invento.

Podem utilizar-se vários ensaios de rastreio imunológico para a avaliação de competição do anticorpo para identificar os anticorpos que se ligam a substancialmente o mesmo epítopo de um anticorpo do presente invento ou se ligam a um epítopo diferente de um anticorpo do presente invento.

Ao efectuar um estudo de competição de anticorpos entre um anticorpo de controlo e qualquer anticorpo de ensaio (independentemente da espécie ou isotipo), pode primeiramente marcar-se o controlo com um marcador detectável tal como biotina ou um marcador enzimático (ou mesmo radioactivo) para permitir identificação subsequente. Neste caso, proceder-se-ia à pré-mistura ou incubação do anticorpo não marcado com células que expressam a proteína CS1. O anticorpo marcado é então adicionado às células pré-incubadas. Mede-se a intensidade do marcador ligado. Se o anticorpo marcado competir com o anticorpo não marcado pela ligação a um epítopo sobreposto, a intensidade diminuirá relativamente à ligação por anticorpo não marcado de controlo negativo (um anticorpo conhecido não liga CS 1) . O ensaio pode ser qualquer um de uma gama de ensaios imunológicos baseados em competição de anticorpos e os anticorpos de controlo seriam detectados através da detecção 48 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ do seu marcador, e.g., utilizando estreptavidina no caso dos anticorpos biotinilados ou utilizando um substrato cromogénico no caso de um marcador enzimático (tal como substrato 3,3'5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) com enzima peroxidase) ou simplesmente por detecção de um marcador radioactivo ou um marcador fluorescente. Um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que os anticorpos de controlo será capaz de competir eficazmente pela ligação e assim reduzirá significativamente (por exemplo, em pelo menos 50%) a ligação do anticorpo de controlo, tal como evidenciado por uma redução no marcador ligado. A reactividade dos anticorpos de controlo (marcados) na ausência de um anticorpo completamente irrelevante seria o valor elevado de controlo. 0 valor baixo de controlo seria obtido por incubação dos anticorpos de ensaio não marcados com células que expressam CS1 e seguidamente incubar a mistura célula/anticorpo com anticorpos de controlo marcados exactamente do mesmo tipo, quando ocorreria competição e redução da ligação dos anticorpos marcados. Num ensaio de teste, uma redução significativa da reactividade do anticorpo marcado na presença de um anticorpo de ensaio é indicativa de um anticorpo de ensaio que reconhece substancialmente o mesmo epitopo.

Incluem-se no presente invento anticorpos contra CS1 de todas as espécies de origens. Os exemplos não limitativos de anticorpos naturais incluem anticorpos derivados de humanos, galinhas, cabras e roedores (e.g., ratos, ratinhos, hamster e coelhos), incluindo roedores transgénicos concebidos racionalmente por engenharia genética para produzir anticorpos humanos, (consultar, e.g., Lonberg et al., W093/12227; patente U.S n2 5 545 806; e Kucherlapati, et al., WO91/10741; patente U.S n2 6 150 584) . Os anticorpos naturais são anticorpos produzidos por um animal hospedeiro após imunização com um antigénio, tal como um polipéptido, preferentemente um polipéptido humano. Numa concretização preferida, o anticorpo do presente invento é um anticorpo natural isolado que se liga a CS1 e o neutraliza. 49 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Os anticorpos anti-CSl alterados geneticamente devem ser funcionalmente equivalentes aos anticorpos naturais anteriormente mencionados. Preferem-se anticorpos modificados que proporcionem estabilidade ou/e eficácia terapêutica melhoradas. Os exemplos de anticorpos modificados incluem aqueles com substituições conservativas de resíduos de aminoácidos e uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alterem significativamente de forma prejudicial a utilidade de ligação do antigénio. As substituições podem variar desde alterar ou modificar um ou mais resíduos de aminoácidos para conceber de novo uma região desde que seja mantida a utilidade terapêutica. Os anticorpos deste invento podem ser modificados após a tradução (e.g., acetilação e/ou fosforilação) ou podem ser modificados sinteticamente (e.g., ligação de um grupo de marcação). Os anticorpos alterados geneticamente são anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. 0 anticorpo quimérico é um anticorpo com uma região variável e uma região constante derivada de dois anticorpos diferentes, preferentemente derivado de espécies diferentes. De preferência, a região variável do anticorpo quimérico é derivada de uma espécie murina e a região constante é derivada de humano.

Numa concretização, as regiões variáveis murinas são derivadas de qualquer um dos anticorpos monoclonais do invento aqui descritos. De modo a produzir os anticorpos quiméricos, as partes derivadas de duas espécies diferentes (e.g., região constante humana e região variável ou de ligação murina) podem ser ligadas entre si quimicamente por técnicas convencionais ou podem ser preparadas como proteínas contíguas utilizando técnicas de engenharia genética. As moléculas de ADN que codificam as proteínas das partes de cadeia leve e de cadeia pesada do anticorpo quimérico podem ser expressas como proteínas contíguas. 0 método para produzir anticorpos quiméricos é divulgado na patente U.S n2 5 677 427; patente U.S n2 6 120 767; e patente U.S n2 6 329 508. 50 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Os anticorpos alterados geneticamente do presente invento incluem anticorpos humanizados que se ligam a CS1 e o neutralizam. Numa concretização, o referido anticorpo humanizado compreende a CDR de uma imunoglobulina dadora de ratinho e os esqueletos de cadeia pesada e de cadeia leve e as regiões constantes de uma imunoglobulina aceitadora humana. Num exemplo, os anticorpos humanizados são as versões humanizadas de qualquer um dos anticorpos do invento aqui descritos. O método para produzir anticorpo humanizado é divulgado nas patentes U.S n2 : 5 530 101; 5 585 089; 5 693 761; 5 693 762; e 6 180 370.

Também se incluem no presente invento anticorpos anti-CSl completamente humanos. Numa concretização preferida do presente invento, os referidos anticorpos completamente humanos são anticorpos humanos isolados que neutralizam as actividades de CS1 aqui descritas.

Produzem-se anticorpos completamente humanos contra CS1 através de várias técnicas. Um exemplo é a metodologia trioma. Descrevem-se a abordagem básica e um exemplo de parceiro de fusão celular, SPAZ-4, para utilização nesta abordagem em Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, patente U.S n2 4 634 664; e Engleman et al., patente U.S n2 4 634 666.

Também se podem produzir anticorpos humanos contra CS1 produzidos de animais transgénicos não humanos com transgenes que codificam pelo menos um segmento do local da imunoglobulina humana. A produção e as propriedades dos animais com estas propriedades são descritas detalhadamente em, consultar, e.g., Lonberg et al., W093/12227; patente U.S n2 5 545 806; e Kucherlapati, et al., WO91/10741; patente U.S n2 6 150 584.

Podem também utilizar-se várias tecnologias de biblioteca de anticorpos recombinantes para produzir anticorpos completamente humanos. Por exemplo, uma abordagem é rastrear uma biblioteca de ADN de células B humanas de acordo com o 51 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ protocolo geral delineado por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Seleccionam-se anticorpos que ligam CS1 ou um seu fragmento. Clonam-se e amplificam-se então sequências que codificam tais anticorpos (ou fragmentos de ligação). 0 protocolo descrito por Huse torna-se mais eficaz em combinação com tecnologia de apresentação de fagos. Consultar, e.g., Dower et al., WO 91/17271 e McCafferty et al., WO 92/01047; patente U.S n2 5 969 108. Nestes métodos, produzem-se bibliotecas de fagos nas quais os membros apresentam diferentes anticorpos nas suas superfícies externas. Os anticorpos são habitualmente apresentados como fragmentos Fv ou Fab. As apresentações por fagos de anticorpos com uma especificidade pretendida são seleccionadas por enriquecimento de afinidade para com CS1 ou um seu fragmento.

Também se podem utilizar ribossomas eucarióticos como meio de apresentar uma biblioteca de anticorpos e isolar os anticorpos humanos de ligação por rastreio contra o antigénio alvo, tal como CS1, tal como descrito em Coia G, et al., J. Immunol. Methods 1:254 (1-2): 191-7 (2001); Hanes J. et al.,

Nat. Biotechnol. 18 (12):1287-92 (2000); Proc. Natl. Acad.

Sei. U.S.A. 95 (24):14130-5 (1998); Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94 (10):4937-42 (1997). O sistema de levedura é também adequado para rastrear proteínas de superfície celular ou excretadas, tal como anticorpos. As bibliotecas de anticorpos podem ser apresentadas à superfície de células de levedura com o objectivo de obter os anticorpos humanos contra um antigénio alvo. Esta abordagem é descrita por Yeung, et al., Biotechnol. Prog. 18(2):212-20 (2002); Boeder, E.T., et al., Nat.

Biotechnol. 15(6):553-7 (1997). Alternativamente podem expressar-se intracelularmente bibliotecas de anticorpos humanos e rastrear-se através do sistema de dois híbridos de levedura (W00200729A2).

Incluem-se também no presente invento fragmentos de anticorpos anti-CSl, que retêm a especificidade de ligação para CS1. Os exemplos desses fragmentos de ligação ao 52 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ antigénio incluem, entre outros, cadeias pesadas ou cadeias leves, região variáveis ou regiões CDR, parciais ou completas, de quaisquer anticorpos anti-CSl do invento aqui descrito.

Numa concretização preferida do invento, os fragmentos de anticorpos são cadeias truncadas (truncadas na extremidade carboxilo). De preferência, estas cadeias truncadas apresentam uma ou mais actividades de imunoglobulina (e.g., actividade de fixação de complemento). Os exemplos de cadeias truncadas incluem, entre outras, fragmentos Fab (consistindo nos domínios VL, VH, CL e CHI); fragmentos Fd (consistindo nos domínios VH e CHI); fragmentos Fv (consistindo nos domínios VL e VH de uma única cadeia de anticorpo); fragmentos dab (consistindo num domínio VH); regiões CDR isoladas; fragmentos (Fab')2, fragmentos bivalentes (compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de dobra). As cadeias truncadas podem ser produzidas por técnicas bioquímicas convencionais, tal como clivagem enzimática ou técnicas de ADN recombinante, ambas conhecidas na especialidade. Estes fragmentos de polipéptido podem ser produzido por clivagem proteolítica de anticorpos intactos por métodos bem conhecidos na especialidade ou por inserção de codões de paragem nas localizações pretendidas nos vectores utilizando mutagénese dirigida ao local, tal como após CHI para produzir fragmentos Fab ou após a região de dobra para produzir fragmentos (Fab')2. Podem produzir-se anticorpos de cadeia simples por ligação das regiões de codificação de VL e de VH com um ADN que codifica um ligante peptídico que liga os fragmentos de proteína VL e VH.

Dado que os genes relacionados com imunoglobulina contêm regiões funcionais independentes, tendo cada um uma ou mais actividades biológicas distintas, os genes dos fragmentos de anticorpos podem ser fundidos a regiões funcionais de outros genes (e.g., enzimas, patente U.S n^ 5 004 692) para produzir proteínas de fusão (e.g., imunotoxinas) ou conjugados com novas propriedades. 53 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Os anticorpos anti-CSl do invento podem ser utilizados em imunotoxinas. Os conjugados que são imunotoxinas incluindo anticorpos têm sido amplamente descritos na especialidade. As toxinas podem ser acopladas aos anticorpos por técnicas convencionais de acoplamento ou podem produzir-se imunotoxinas contendo partes de proteína toxina como proteínas de fusão. Os conjugados do presente invento podem ser utilizados de uma forma correspondente para obter tais imunotoxinas. São exemplos ilustrativos de tais imunotoxinas as descritas por Byers, B.S. et ai., Seminars Cell Biol 2:59-70 (1991) e por

Fanger, M.W. et ai., Immunol Today 12:51-54 (1991).

Podem utilizar-se técnicas de ADN recombinante para produzir os anticorpos anti-CSl recombinantes, assim como os anticorpos anti-CSl quiméricos ou humanizados ou quaisquer outros anticorpos anti-CSl alterados geneticamente e os seus fragmentos ou conjugados em quaisquer sistemas de expressão incluindo sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos, tal como bactérias, leveduras, células de insecto, células de planta e células de mamífero (por exemplo, células NSO).

Uma vez produzidos, podem purificar-se os anticorpos completos e os seus dímeros, cadeias pesadas e leves individuais ou outras formas de imunoglobulina do presente invento de acordo com procedimentos padrão na especialidade incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, electroforese em gel e semelhantes (consultar, de um modo geral, Scopes, R., Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y.,1982)). Para utilizações farmacêuticas preferem-se imunoglobulinas substancialmente puras com pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade, sendo o mais preferido 98 a 99% ou mais de homogeneidade. Uma vez purificadas, parcialmente ou até à homogeneidade tal como pretendido, os polipéptidos podem então ser utilizados terapeuticamente (incluindo fora do corpo) ou no desenvolvimento e execução de procedimentos de ensaio, coloração imunofluorescente e semelhantes. (Consultar, de um modo geral, Immunological Methods, Vol. I e II (Lefkovits e Pernis, ed., Academic Press, NY, 1979 e 1981) . Os anticorpos 54 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ anti-CSl isolados ou purificados podem ser adicionalmente rastreados para a sua capacidade de neutralizar as actividades biológicas de CS1 tal como descrito nos exemplos.

Utilização de ácidos nucleicos CS1

Tal como anteriormente descrito, as sequências CS1 são inicialmente identificadas por homologia substancial de sequência de ácidos nucleicos e/ou sequência de aminoácidos ou ligação às sequências CS1 da tabela 2. Tal homologia pode basear-se na sequência total de ácidos nucleicos ou de aminoácidos e é geralmente determinada utilizando programas de homologia ou condições de hibridação. Tipicamente encontram-se na mesma molécula sequências ligadas num ARNm. A percentagem de identidade de uma sequência pode ser determinada utilizando um algoritmo tal como BLAST. Um método preferido utiliza o módulo BLASTN de WU-BLAST-2 para os parâmetros implícitos, com gama de sobreposição e fracção de sobreposição de 1 e 0,125, respectivamente. O alinhamento pode incluir a introdução de falhas nas sequências a alinhar. Adicionalmente, para sequências que contêm mais ou menos nucleótidos do que os nucleótidos presentes nos ácidos nucleicos descritos, pode determinar-se a percentagem de homologia com base no número de nucleósidos homólogos em relação ao número total de nucleósidos. Assim, e.g., determinar-se-ão homologias de sequências mais curtas do que as presentes nas sequências identificadas utilizando o número de nucleósidos na sequência mais curta. A homologia de ácidos nucleicos pode ser determinada através de estudos de hibridação. Assim, e.g., os ácidos nucleicos que hibridam em condições altamente rigorosas com um ácido nucleico descrito ou com o seu complementar ou que se encontram também em ARNm de ocorrência natural consideram-se uma sequência homóloga. Alternativamente utilizam-se condições de hibridação menos rigorosas; e.g., podem utilizar-se condições de hibridação com rigor moderado ou baixo; consultar Ausubel, supra e Tijssen, supra. 55 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ A sequência de ácidos nucleicos CS1, e.g., as sequências na tabela 2 podem ser fragmentos de genes maiores, e.g., podem ser segmentos de ácido nucleico. "Genes" neste contexto incluem regiões de codificação, regiões de não codificação e misturas de regiões de codificação com regiões de não codificação. Assim, utilizando as sequências aqui proporcionadas podem obter-se sequências extensas, em qualquer sentido, dos genes CS1 utilizando técnicas bem conhecidas para clonar sequências mais longas ou as sequências completas; consultar Ausubel, et al., supra. Pode fazer-se muito trabalho através de meios informáticos e podem agrupar-se muitas sequências para incluir sequências múltiplas correspondentes a um único gene, e.g., sistemas tal como UniGene.

Os ácidos nucleicos CS1 utilizam-se de várias formas. Numa das formas, produzem-se sondas de ácido nucleico contra CS1 e ligam-se a biochips para serem utilizados em métodos de rastreio e diagnóstico, tal como descrito seguidamente ou para administração, e.g., para terapia génica, vacinas, ARNi e/ou aplicações anti-sentido. Alternativamente podem inserir-se ácidos nucleicos CS 1 que incluem regiões de codificação de proteína CS1 em vectores de expressão para a expressão de proteína CS1, mais uma vez com objectivos de rastreio ou para administração a um doente.

Podem produzir-se sondas de ácido nucleico para ácido nucleico CS1 (as sequências de ácidos nucleicos e/ou as suas complementares são apresentadas nas figuras). As sondas de ácido nucleico ligadas ao biochip são concebidas para serem substancialmente complementares ao ácido nucleico CS1, e.g., à sequência alvo (quer seja à sequência alvo da amostra ou a outras sequências sonda, e.g., em ensaios em sanduíche) de tal modo que ocorra hibridação da sequência alvo e das sondas. Tal como seguidamente descrito não é necessário que esta complementaridade seja perfeita; pode ocorrer um número qualquer de falhas de emparelhamento de pares de bases que interferirão com a hibridação entre a sequência alvo e os ácidos nucleicos em cadeia simples. Contudo, se o número de 56 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ mutações for tão elevado que não possa ocorrer hibridação mesmo sob condições de hibridação o menos rigorosas possível, a sequência não é uma sequência alvo complementar. Assim, "substancialmente complementar" significa aqui que as sondas são suficientemente complementares às sequências alvo para hibridarem em condições de reacção normais, particularmente condições de rigor elevado, tal como aqui descrito na generalidade.

Uma sonda de ácido nucleico é geralmente em cadeia simples mas pode ser parcialmente em cadeia simples e parcialmente em cadeia dupla. 0 facto de a cadeia ser simples ou dupla é ditado pela estrutura, composição e propriedades da sequência alvo. De um modo geral, o comprimento das sondas de ácido nucleico varia entre cerca de 8-100 bases, sendo preferido cerca de 10-80 bases e sendo especialmente preferido desde cerca de 30-50 bases. Ou seja, geralmente não se utilizam genes completos. Algumas vezes podem utilizar-se ácidos nucleicos muito mais longos, até centenas de bases.

Pode utilizar-se mais que uma sonda por sequência, utilizando-se sondas sobrepostas ou sondas para diferentes secções do alvo. Ou seja, utilizam-se duas, três, quatro ou mais sondas, sendo três as preferidas, para construir uma redundância para um alvo específico. As sondas podem estar sobrepostas (e.g., ter alguma sequência em comum) ou podem ser independentes. Nalguns casos, podem utilizar-se iniciadores de PCR para amplificar o sinal para maior sensibilidade.

Podem ligar-se ou imobilizar-se ácidos nucleicos a um suporte sólido numa grande variedade de formas. "Imobilizado" e seus equivalentes gramaticais significam aqui que a associação ou ligação entre a sonda de ácido nucleico e o suporte sólido é suficiente para ser estável nas condições de ligação, lavagem, análise e remoção tal como geralmente descrito. A ligação pode ser tipicamente covalente ou não covalente. "Ligação não covalente" e seus equivalentes gramaticais significam aqui uma ou mais interacções electrostáticas, hidrofílicas e hidrofóbicas. Inclui-se na 57 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ ligação não covalente a ligação covalente de uma molécula, e.g., estreptavidina a um suporte e a ligação não covalente da sonda biotinilada à estreptavidina. "Ligação covalente" e seus equivalentes gramaticais significam aqui que as duas partes, o suporte sólido e a sonda, estão ligadas por pelo menos uma ligação química, incluindo ligações sigma, ligações pi e ligações de coordenação. As ligações covalentes podem formar-se directamente entre a sonda e o suporte sólido ou podem formar-se por um agente de reticulação ou por inclusão de um grupo reactivo específico no suporte sólido ou na sonda ou em ambas as moléculas. A imobilização pode também envolver uma combinação de interacções covalentes e não covalentes.

De um modo geral, ligam-se as sondas ao biochip numa grande variedade de formas. Tal como aqui descrito, os ácidos nucleicos podem ser primeiramente sintetizados com subsequente ligação ao biochip ou podem ser sintetizados directamente no biochip. 0 biochip compreende um substrato sólido adequado. "Substrato" ou "suporte sólido" ou outros equivalentes gramaticais aqui significa um material que pode ser modificado para a ligação ou associação das sondas de ácido nucleico e pode ser utilizado em pelo menos um método de detecção. Muitas vezes o substrato pode conter locais discretos individuais adequados para partição e identificação individual. O número de substratos possíveis é muito elevado e inclui, entre outros, vidro e vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TeflonJ, etc.), polissacáridos, nylon ou nitrocelulose, resinas, sílica ou materiais baseados em sílica incluindo silício e silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, plásticos, etc. De um modo geral, os substratos permitem detecção óptica e não fluorescem apreciavelmente. Consultar WO 0055627.

Geralmente o substrato é plano, apesar de poderem ser igualmente utilizadas outras configurações de substratos. Por 58 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ exemplo, podem colocar-se as sondas na superfície interior de um tubo para análise de amostra em caudal para minimizar o volume de amostra. De igual modo, o substrato pode ser flexível, tal como uma espuma flexível, incluindo espumas de célula fechada fabricadas com plásticos específicos. A superfície do biochip e a sonda podem ser derivatizadas com grupos guímicos funcionais para ligação subsequente de ambos. Assim, e.g., derivatiza-se o biochip com um grupo funcional químico incluindo, entre outros, grupos amino, grupos carboxilo, grupos oxo e grupos tiol, sendo os grupos amino especialmente preferidos. Utilizando estes grupos funcionais, as sondas podem ser ligadas utilizando grupos funcionais nas sondas. Por exemplo, podem ligar-se ácidos nucleicos contendo grupos amino a superfícies compreendendo grupos amino, e.g., utilizando ligantes; e.g., são bem conhecidos ligantes homo-bifuncionais ou hetero-bifuncionais (consultar catálogo 1994 Pierce Chemical Company, secção técnica em agentes de reticulação, páginas 155-200). Adicionalmente, nalguns casos podem utilizar-se ligantes adicionais tal como grupos alquilo (incluindo grupos substituídos e grupos heteroalquilo).

Sintetizam-se oligonucleótidos e seguidamente ligam-se à superfície do suporte sólido. Pode ligar-se o terminal 5' ou 3' ao suporte sólido ou a ligação pode ser através da ligação de um nucleósido interno. A imobilização ao suporte sólido pode ser muito forte e contudo não ser covalente. Por exemplo, podem produzir-se oligonucleótidos biotinilados que se ligam a superfícies revestidas com uma camada covalente de estreptavidina, resultando em ligação. e

Alternativamente podem sintetizar-se os oligonucleótidos à superfície. Por exemplo, utilizam-se técnicas de fotoactivação que utilizam compostos de fotopolimerização. Podem sintetizar-se os ácidos nucleicos no local utilizando técnicas conhecidas de fotolitografia, tal como as descritas em WO 95/25116; WO 95/35505; patente U.S n2 5 700 637 e 5 445 934; 59 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ referências aí citadas; estes métodos de ligação são a base da tecnologia Affymetrix GENECHIP® (chip de micromatriz de ADN).

Muitas vezes, efectuam-se ensaios baseados em amplificação para medir o nível de expressão das sequências associadas a CS1. Estes ensaios são tipicamente efectuados em conjunto com transcrição inversa. Em tais ensaios, uma sequência de ácidos nucleicos associada a CS1 actua como um molde numa reacção de amplificação (e.g., reacção de polimerização em cadeia ou PCR) . Numa amplificação quantitativa, a quantidade de produto de amplificação será proporcional à quantidade de molde da amostra original. A comparação com controlos adequados proporciona uma medida da quantidade de ARN associado a CS1. São bem conhecidos métodos de amplificação quantitativa. Proporcionam-se protocolos detalhados para PCR quantitativo, e.g., em Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

Pode utilizar-se um ensaio baseado em TAQMAN® (uma sonda oligonucleótido fluorogénica) para medir expressão. Os ensaios baseados em TAQMAN® utilizam uma sonda de oligonucleótido fluorogénica que contém um corante fluorescente a 5' e um agente de extinção a 3'. A sonda híbrida com um produto de PCR mas não pode ela própria ser estendida devido ao agente de bloqueio na extremidade 3' . Quando se amplifica o produto de PCR em ciclos subsequentes a actividade de nuclease 5' da polimerase, e.g., AMPLITAQ® (ADN polimerase) resulta na clivagem da sonda TAQMAN®. Esta clivagem separa o corante fluorescente a 5' do agente de extinção a 3' resultando num aumento de fluorescência em função da amplificação (consultar, e.g., literatura proporcionada por Perkin-Elmer).

Outros métodos de amplificação adequados incluem, entre outros, reacção de ligase em cadeia (LCR) (consultar Wu e Wallace (1989) Genomics 4:560-569, Landegren, et al. (1988)

Science 241:1077-1080 e Barringer, et al., (1990) Gene 89:117-122), amplificação de transcrição (Kwoh, et al. (1989) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 86:1173-1177), replicação de sequência auto-sustentada (Guatelli, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. 60 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Sei. USA 87:1874-1878), PCR dot, PCR de adaptação de ligante, etc.

Expressão de proteína CS1 a partir de ácidos nucleicos O ácido nucleico CS1, e.g., que codifica proteína CS1, pode ser utilizado para produzir vários vectores de expressão para expressar proteína CS1, que pode então ser utilizada no desenvolvimento de reagentes para ensaios de diagnóstico, tal como descrito seguidamente. Os vectores de expressão e a tecnologia de ADN recombinante são bem conhecidos (consultar, e.g., Ausubel, supra, e Fernandez e Hoeffler (ed. 1999) Gene Expression Systems Academic Press) para expressar proteínas. Os vectores de expressão podem ser vectores extracromossómicos de auto-replicação ou vectores que se integram num genoma de hospedeiro. Em geral, estes vectores de expressão incluem ácido nucleico de regulação de transcrição e tradução ligado operacionalmente ao ácido nucleico que codifica a proteína CS 1. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN utilizadas para a expressão de uma sequência de codificação ligada operacionalmente num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, e.g., incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora e um local de ligação ao ribossoma. São bem conhecidas células eucarióticas que utilizam promotores, sinais de poliadenilação e facilitadores. O ácido nucleico está "ligado operacionalmente" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou líder de excreção está ligado operacionalmente a ADN para um polipéptido se é expresso como uma pré-proteína que participa na excreção do polipéptido; um promotor ou facilitador está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se afecta a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se está posicionado de modo a facilitar a tradução. Em geral, "ligado operacionalmente" significa que as sequências de ADN que estão ligadas são contíguas e, no caso 61 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ de um líder de excreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os facilitadores não têm que ser contíguos. A ligação é tipicamente conseguida por ligação em locais de restrição adequados. Se tais locais não existirem, utilizam-se adaptadores de oligonucleótido sintéticos ou ligantes de acordo com a prática convencional. 0 ácido nucleico de regulação de transcrição e tradução será em geral adequado à célula hospedeira utilizada para expressar a proteína CS1. São conhecidos numerosos tipos de vectores de expressão adequados e sequências de regulação apropriadas para uma variedade de células hospedeiras.

Em geral, as sequências de regulação de transcrição e tradução podem incluir, entre outros, sequências promotoras, locais de ligação a ribossomas, sequências de início e paragem de transcrição, sequências de início e paragem de tradução e sequências facilitadoras ou de activação. As sequências de regulação podem incluir um promotor e sequências de início e paragem de transcrição.

As sequências promotoras podem ser promotores constitutivos ou indutíveis. Os promotores podem ser quer promotores de ocorrência natural, quer promotores híbridos. Os promotores híbridos, que combinam elementos de mais do que um promotor, são também conhecidos e são úteis no presente invento.

Um vector de expressão pode incluir elementos adicionais. Por exemplo, o vector de expressão pode ter dois sistemas de replicação, permitindo assim que seja mantido em dois organismos, e.g., células de mamífero ou de insecto para expressão e num hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação. Além disso, para vectores de expressão de integração, o vector de expressão contém frequentemente pelo menos uma sequência homóloga ao genoma da célula hospedeira e preferentemente duas sequências homólogas que flanqueiam a construção de expressão. 0 vector de integração pode ser dirigido a um local específico na célula hospedeira por selecção da sequência homóloga adequada para inclusão no 62 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ vector. Estão disponíveis construções para vectores de integração. Consultar, e.g., Fernandez e Hoeffler, supra; e Kitamura, et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 92:9146- 9150 .

Adicionalmente, o vector de expressão pode conter um gene marcador seleccionável para permitir a selecção de células hospedeiras transformadas. São bem conhecidos genes de selecção e variarão com a célula hospedeira utilizada. A proteína CS1 é usualmente produzida por cultura de uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão contendo ácido nucleico que codifica uma proteína CS1, nas condições adequadas para induzir ou causar expressão da proteína CS1. As condições adequadas para expressão de proteína CS1 variarão com a escolha do vector de expressão e da célula hospedeira e serão facilmente estabelecidas através de experiências de rotina ou optimização. Por exemplo, a utilização de promotores constitutivos no vector de expressão necessitará da optimização do crescimento e proliferação da célula hospedeira, enquanto a utilização de um promotor indutível requer as condições de crescimento adequadas para indução. Adicionalmente, por vezes o tempo de recolha é importante. Por exemplo, os sistemas de baculovírus utilizados na expressão em células de insecto são vírus líticos e assim a selecção do tempo de recolha pode ser crucial para o rendimento de produto.

As células hospedeiras adequadas incluem leveduras, bactérias, arquebactérias, fungos e células de insecto e animais, incluindo células de mamífero. São de particular interesse Saccharomyces cerevisiae e outras leveduras, E. coli, Bacillus subtilis, células Sf9, células CL29, células 293, Neurospora, BHK, CHO, COS, células HeLa, HUVEC (células endoteliais de veia umbilical humana), células THPl (uma linha celular de macrófago) e várias outras células e linhas celulares humanas. 63 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

As proteínas CS1 podem ser expressas em células de mamífero. Podem ser utilizados sistemas de expressão de mamífero e incluem sistemas retrovíricos e adenovíricos. Um sistema de vector de expressão é o sistema de vector retrovírico tal como é descrito na generalidade em WO 97/27212 e WO 97/27213. São de particular utilização como promotores de mamífero, os promotores de genes víricos de mamífero, dado que os genes víricos são frequentemente altamente expressos e têm uma gama alargada de hospedeiros. Os exemplos incluem o promotor precoce SV40, promotor LTR de vírus de tumor mamário de ratinho, promotor tardio major de adenovírus, promotor de vírus herpes simplex e o promotor CMV (consultar, e.g., Fernandez e Hoeffler, supra). Tipicamente, as sequências de terminação de transcrição e poliadenilação reconhecidas por células de mamífero são regiões de regulação localizadas a 3' do códão de paragem de tradução e assim, conjuntamente com os elementos de promotor, flanqueiam a sequência de codificação. Os exemplos de terminador de transcrição e sinais de poliadenilação incluem os derivados de SV40.

Encontram-se disponíveis métodos para introduzir ácido nucleico exógeno em hospedeiros mamíferos, assim como em outros hospedeiros e variarão com a célula hospedeira utilizada. As técnicas incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, electroporação, infecção vírica, encapsulação do(s) polinucleótido(s) em lipossomas e microinjecção directa do ADN nos núcleos. A proteína CS1 pode ser expressa em sistemas bacterianos. Também podem ser utilizados promotores para bacteriófagos. Adicionalmente são também úteis promotores sintéticos e promotores híbridos; e.g., o promotor tac é um híbrido das sequências promotoras trp e lac. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores de ocorrência natural de origem não bacteriana que têm a capacidade de ligar ARN polimerase bacteriana e iniciar transcrição. Adicionalmente à sequência de promotor funcional, pretende-se um local de ligação ao ribossoma eficiente. 0 vector de expressão pode 64 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ também incluir uma sequência de péptido de sinalização que proporciona excreção da proteína CS1 em bactérias. A proteína é excretada para o meio de crescimento (bactérias Gram-positivas) ou para o espaço periplasmático, localizado entre a membrana interna e externa da célula (bactérias Gram-negativas). 0 vector de expressão bacteriano pode também incluir um gene marcador seleccionável para permitir a selecção de estirpes bacterianas que foram transformadas. Os genes de selecção adequados incluem genes que tornam as bactérias resistentes a fármacos tal como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, canamicina, neomicina e tetraciclina. Os marcadores seleccionáveis também incluem genes biossintéticos, tal como os das vias biossintéticas de histidina, triptofano e leucina. Estes componentes são montados em vectores de expressão. São bem conhecidos os vectores de expressão para bactérias e incluem vectores para Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris e

Streptococcus lividans, entre outros (e.g., Fernandez e Hoeffler, supra). Os vectores de expressão bacterianos são transformados para células hospedeiras bacterianas utilizando técnicas tal como tratamento com cloreto de cálcio, electroporação e outras. A proteína CS1 pode ser produzida em células de insecto utilizando, e.g., vectores de expressão para a transformação de células de insecto e, em particular, vectores de expressão baseados em baculovírus.

Também se pode produzir uma proteína CS1 em células de levedura. São bem conhecidos os sistemas de expressão em levedura e incluem vectores de expressão para Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans e C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis e K. lactis, Pichia guillerimondii e P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. A proteína CS1 pode também ser preparada como uma proteína de fusão, utilizando técnicas disponíveis. Assim, e.g., para a criação de anticorpos monoclonais, caso o epítopo pretendido 65 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ seja pequeno, a proteína CS1 pode ser fundida a uma proteína transportadora para formar um imunogénio. Alternativamente, a proteína CS1 pode ser preparada como uma proteína de fusão para aumentar a expressão ou por outros motivos. Por exemplo, quando a proteína CS1 é um péptido CS1, o ácido nucleico que codifica o péptido pode ser ligado a outro ácido nucleico para objectivos de expressão. Pode efectuar-se fusão com marcadores de epítopo de detecção, e.g., com FLAG, His6, myc, HA, etc. A proteína CS1 pode ser purificada ou isolada após expressão. A proteína CS1 pode ser isolada ou purificada de várias formas dependendo dos outros componentes presentes na amostra e dos requisitos para o produto purificado, e.g., conformação natural ou desnaturado. Os métodos padrão de purificação incluem precipitação com sulfato de amónio, técnicas electroforéticas, moleculares, imunológicas e cromatográficas, incluindo cromatografia de permuta iónica, hidrofóbica, de afinidade e HPLC de fase inversa e electrofocagem. Por exemplo, a proteína CS1 pode ser purificada utilizando uma coluna de anticorpo anti-proteína CS1 padrão. São também úteis as técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunção com concentração de proteína. Consultar, e.g., Walsh (2002) Proteins: Biochemistry and Biotechnology, Wiley; Hardin, et al. (ed. 2001) Cloning, Gene Expression and Protein Purification, Oxford Univ. Press; Wilson, et al. (ed. 2000) Encyclopedia of Separation Science Academic Press; e Scopes (1993) Protein Purification, Springer-Verlag. O grau de purificação necessário variará dependendo da utilização da proteína CS1. Em alguns casos não será necessária qualquer purificação.

Uma vez expressa e, caso necessário, purificada, as proteínas e ácidos nucleicos CS1 são úteis em várias aplicações. Podem ser utilizados como reagentes de imunosselecção, como reagentes de vacina, como agentes de rastreio, entidades terapêuticas, para produção de anticorpos, como inibidores de transcrição ou tradução, etc. 66 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Variantes de proteínas CS1

Entre as proteínas CS1 encontram-se variantes de aminoácidos das sequências de ocorrência natural, tal como aqui determinadas. De preferência, as variantes são preferentemente mais de 75% homólogas à sequência de tipo selvagem, com maior preferência mais que cerca de 80%, ainda com maior preferência mais que cerca de 85% e com a maior preferência mais que 90%. Algumas vezes a homologia será tão elevada quanto cerca de 93-95% ou 98%. Relativamente aos ácidos nucleicos, a homologia neste contexto significa semelhança ou identidade de sequência, sendo preferida a identidade de sequência. Esta homologia será determinada utilizando técnicas padrão tal como anteriormente descrito para homologias de ácido nucleico. A proteína CS1 pode ser mais curta ou mais longa do que as sequências de aminoácidos de tipo selvagem. Assim, numa concretização, incluem-se aqui no âmbito da definição de proteínas CS1 partes ou fragmentos das sequências de tipo selvagem. Adicionalmente, tal como anteriormente descrito, pode utilizar-se o ácido nucleico CS1 para obter regiões de codificação adicionais e assim sequências de proteína adicionais.

As proteínas CS1 podem ser derivados ou variantes de proteínas CS1 comparativamente com a sequência de tipo selvagem. Ou seja, tal como descrito mais detalhadamente seguidamente, o péptido CS1 derivado conterá frequentemente pelo menos uma substituição, deleção ou inserção de aminoácidos, sendo as substituições de aminoácidos especialmente preferidas. As substituições, inserções ou deleções de aminoácidos podem ocorrer em muitas posições de resíduos no interior do péptido CS1.

Também se descrevem no âmbito das proteínas CS1 as variantes de sequências de aminoácidos. Estas variantes podem classificar-se tipicamente em uma ou mais de três classes: variantes de substituição, de inserção ou de deleção. Estas 67 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ variantes são habitualmente preparadas por mutagénese especifica do local de nucleótidos no ADN que codifica a proteína CS1, utilizando mutagénese por cassetes ou mutagénese por PCR ou outras técnicas para produzir ADN que codifica a variante e seguidamente expressar o ADN em cultura de células recombinantes tal como geralmente descrito anteriormente. Contudo, os fragmentos de proteína CS1 variante e contendo até cerca de 100-150 resíduos podem preparar-se por síntese in vitro utilizando técnicas estabelecidas. As variantes de sequência de aminoácidos caracterizam-se pela natureza predeterminada da variação, uma característica que as diferencia de variações alélicas ou interespécies de ocorrência natural da sequência de aminoácidos da proteína CS1. As variantes apresentam tipicamente uma actividade biológica qualitativamente semelhante ao análogo de ocorrência natural, apesar de poderem também ser seleccionadas variantes que têm características modificadas.

Apesar do local ou região para introduzir uma variação de sequência de aminoácidos ser muitas vezes predeterminado, não é necessário que a mutação seja predeterminada. Por exemplo, de modo a optimizar o desempenho de uma mutação num dado local, pode efectuar-se mutagénese aleatória no codão ou região alvo e rastreiam-se as variantes CS1 expressas para a combinação óptima da actividade pretendida. São bem conhecidas técnicas para fazer mutações por substituição em locais predeterminados no ADN com uma sequência conhecida, e.g, mutagénese com iniciador M13 e mutagénese por PCR. O rastreio de mutantes é muitas vezes efectuado utilizando ensaios de actividades de proteína CS1.

As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos; as inserções serão habitualmente na ordem desde cerca de 1-20 aminoácidos apesar de poderem ser toleradas inserções consideravelmente maiores. As deleções são geralmente na gama desde cerca de 1-20 resíduos apesar de nalguns casos as deleções poderem ser muito maiores. 68 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Podem utilizar-se substituições, deleções, inserções ou suas combinações para chegar a um derivado final. De um modo geral estas alterações são efectuadas em poucos aminoácidos para minimizar a alteração da molécula. Podem contudo tolerar-se maiores alterações em determinadas circunstâncias. Quando se pretendem pequenas alterações nas caracteristicas da proteína CS1, efectuam-se geralmente substituições de acordo com as relações de substituição de aminoácidos descritas.

As variantes exibem, tipicamente, essencialmente a mesma actividade biológica qualitativa e desencadearão a mesma resposta imunitária do que o análogo de ocorrência natural, apesar de também serem seleccionadas variantes para modificar as caracteristicas das proteínas CS1 tal como necessário. Alternativamente podem conceber-se as variantes de modo a que a actividade biológica da proteína CS1 seja alterada. Por exemplo, podem adicionar-se, alterar-se ou remover-se locais de glicosilação.

Algumas vezes fazem-se alterações substanciais na função ou identidade imunológica por selecção de substituições que são menos conservativas do que as anteriormente descritas. Por exemplo, podem fazer-se substituições que afectam mais significativamente a estrutura do esqueleto de polipéptido na área da alteração, por exemplo a estrutura em hélice alfa ou folha beta; a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo; ou o volume da cadeia lateral. As substituições que geralmente se esperam que produzam as maiores alterações nas propriedades dos polipéptidos são aquelas em que (a) se substitui um resíduo hidrofílico, e.g., serina ou treonina por (ou com) um resíduo hidrofóbico, e.g., leucina, isoleucina, fenilalanina, valina ou alanina; (b) se substitui uma cisteína ou prolina por (ou com) outro resíduo; (c) se substitui um resíduo com uma cadeia lateral electropositiva, e.g., lisina, arginina ou histidina por (ou com) um resíduo electronegativo, e.g., ácido glutâmico ou aspártico; (d) se substitui um resíduo com uma cadeia lateral volumosa, e.g., fenilalanina, por (ou com) outro sem cadeia lateral, e.g., glicina; ou (e) 69 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ se incorpora ou substitui um residuo de prolina que altera no grau de liberdade rotacional da ligação peptidilo.

As variantes apresentam tipicamente uma actividade biológica qualitativa semelhante e desencadearão a mesma resposta imunitária do que o análogo de ocorrência natural, apesar de também serem seleccionadas variantes para modificar as caracteristicas das proteinas CS1 da pele tal como necessário. Alternativamente, a variante pode ser concebida de modo a que a actividade biológica da proteína CS1 seja alterada. Por exemplo, podem alterar-se ou remover-se locais de glicosilação.

Podem efectuar-se modificações covalentes de polipéptidos CS1. Um tipo de modificações covalentes inclui fazer reagir resíduos de aminoácidos alvo do polipéptido CS1 com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou os resíduos do terminal N ou C do polipéptido CS1. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticular polipéptidos CS1 com uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para utilizar num método para purificar anticorpos anti-polipéptido CS1 ou ensaios de rastreio, tal como se descreve mais detalhadamente em seguida. Os agentes de reticulação de uso comum incluem, e.g., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres N-hidroxissuccinimida, e.g., ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres dissuccinimidilo tal como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais tal como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes tal como metil-3-((p-azidofenil)ditio)propioimidato.

Outras modificações incluem desamidação de resíduos glutaminilo e asparaginilo aos resíduos glutamilo e aspartilo correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serinilo, treonilo ou tirosilo, metilação dos grupos amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (e.g., p. 79-86, Creighton (1992) Proteins: Structure and Molecular Properties 70 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Freeman), acetilação da amina N-terminal e amidação do grupo carboxilo C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente do polipéptido CS1 compreende alterar o padrão de glicosilação nativo do polipéptido. "Alterar o padrão de glicosilação nativo" pretende significar para estes objectivos deletar uma ou mais partes de hidrato de carbono presentes na sequência nativa de polipéptido CS 1 e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes na sequência do polipéptido CS 1 nativo. Os padrões de glicosilação podem ser alterados de várias formas. A expressão de sequências associadas a CS1 em diferentes tipos de células pode resultar em diferentes padrões de glicosilação. A adição de locais de glicosilação aos polipéptidos CS 1 pode também conseguir-se por alteração da sua sequência de aminoácidos. Pode fazer-se a alteração, e.g., pela adição ou pela substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência nativa do polipéptido CS 1 (para locais de glicosilação ligados a 0). A sequência de aminoácidos CS1 pode ser opcionalmente alterada através de alterações ao nível do ADN, nomeadamente por mutação do ADN que codifica o polipéptido CS1 em bases pré-seleccionadas de modo a se gerarem codões que se traduzirão nos aminoácidos pretendidos.

Outro meio de aumentar o número de partes de hidrato de carbono no polipéptido CS1 é por acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao polipéptido. Consultar, e.g., WO 87/05330; p. 259-306 em Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. A remoção de partes de hidrato de carbono presentes no polipéptido CS1 pode conseguir-se química ou enzimaticamente ou por substituição por mutação de codões que codificam para os resíduos de aminoácidos que servem com alvos para glicosilação. São aplicáveis técnicas de desglicosilação química. Consultar, e.g., Sojar e Bahl (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52-57 e Edge, et al. (1981) Anal. Biochem. 71 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 118:131-137. A clivagem enzimática de partes de hidrato de carbono em polipéptidos pode conseguir-se pela utilização de uma variedade de endoglicosidades e exoglicosidades. Consultar, e.g., Thotakura, et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350-359.

Outro tipo de modificação covalente de polipéptidos CS1 compreende ligar o polipéptido CS1 a um de vários polímeros não proteináceos, e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos do modo estabelecido nas patentes U.S n2 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192 ou 4 179 337.

Podem também modificar-se polipéptidos CS1 de modo a formar moléculas quiméricas compreendendo um polipéptido CS1 fundido com outro polipéptido ou sequência de aminoácidos heterólogos. Num exemplo, tal molécula quimérica compreende uma fusão de um polipéptido CS1 com um polipéptido marcador que proporciona um epítopo contra o qual se pode ligar selectivamente um anticorpo anti-marcador. O epítopo marcador é geralmente colocado no terminal amino ou no terminal carboxilo do polipéptido CS1. A presença de tais formas de epítopo de marcador de um polipéptido CS1 pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Igualmente, a preparação de um epítopo de marcador permite que o polipéptido CS1 seja facilmente purificado por purificação por afinidade utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao epítopo de marcador. Alternativamente, a molécula quimérica pode compreender uma fusão de um polipéptido CS1 com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente de uma molécula quimérica tal fusão poderia ser com a região Fc de uma molécula de IgG.

Estão disponíveis vários polipéptidos marcadores e seus anticorpos respectivos. Os exemplos incluem marcadores poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); marcadores HIS6 e de quelação de metal, o marcador polipéptido HA da gripe e seu anticorpo 12CA5 (Field, et al. (1988) Mol. 72 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Cell Biol. 8:2159-2165); ο marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan, et al. (1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616); e o marcador de glicoproteína D do vírus de herpes simplex (gD) e o seu anticorpo (Paborsky, et ai. (1990) Proteln Engineering 3(6) :547-553) . Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido Flag (Hopp, et al. (1988) BioTechnology 6:1204-1210); o péptido de epítopo KT3 (Martin, et al. (1992) Science 255:192-194); o péptido de epítopo de tubulina (Skinner, et ai. (1991) J. Biol. Chem. 266:15163-15166); e o marcador peptídico da proteína do gene 10 de T7 (Lutz-Freyermuth, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6393-6397).

Também se incluem proteínas CS1 de outros organismos, que são clonadas e expressas tal como geralmente descrito seguidamente. Assim, podem utilizar-se sequências de sonda ou de iniciador de reacção de polimerização em cadeia (PCR) degeneradas para encontrar outras proteínas CS1 relacionadas de humanos ou outros organismos. São particularmente úteis sequências de sonda e/ou sequências de iniciador de PCR que incluem as áreas únicas da sequência de ácido nucleico CS1. Os iniciadores de PCR preferidos são desde cerca de 15- 35 nucleótidos de comprimento sendo preferido com desde cerca de 20-30 e podem conter inosina tal como necessário. As condições da reacção de PCR têm sido bem descritas (e.g., Innis, PCR Protocols, supra).

Adicionalmente podem produzir-se proteínas CS1 que são mais compridas do que as codificadas pelos ácidos nucleicos da tabela 2, e.g., pela elucidação das sequências extensas, a adição de marcadores de epítopo ou de purificação, a adição de outras sequências de fusão, etc.

As proteínas CS1 também podem ser identificadas como sendo codificadas por ácidos nucleicos CS1. Assim, as proteínas CS1 são codificadas por ácidos nucleicos que hibridarão com as sequências das listagens de sequências ou com os seus complementares, tal como aqui geralmente descrito. 73 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Parceiros de ligação a proteínas CS1 Anticorpos CSl

Os anticorpos CSl do invento ligam-se especificamente a proteínas CSl. "Ligar especificamente" significa aqui que os anticorpos se ligam à proteína com um Kd de pelo menos cerca de 0,1 mM, mais habitualmente pelo menos cerca de 1 μΜ, preferentemente pelo menos cerca de 0,1 μΜ ou melhor e com a maior preferência, 0,01 μΜ ou melhor. A selectividade da ligação ao alvo específico e não a sequências relacionadas é muitas vezes também importante.

Numa concretização, quando se pretende utilizar a proteína CSl para gerar parceiros de ligação, e.g., anticorpos para imunodiagnóstico, a proteína CSl deve partilhar pelo menos um epítopo ou determinante com a proteína completa. "Epítopo" ou "determinante" significa aqui tipicamente uma parte de uma proteína que gerará e/ou se ligará a um anticorpo ou receptor de células T no contexto do MHC. Assim, na maioria dos casos, os anticorpos desenvolvidos contra uma proteína CSl mais pequena serão capazes de se ligar à proteína completa, nomeadamente a epítopos lineares. Noutra concretização, o epítopo é único; ou seja, anticorpos gerados contra um epítopo único apresentam pouca ou nenhuma reactividade cruzada. Ainda noutra concretização, o epítopo é seleccionado de uma sequência de proteína apresentada na tabela.

Existem métodos para preparar anticorpos policlonais (e.g., Coligan, supra; e Harlow e Lane, supra). Podem desenvolver-se anticorpos policlonais num mamífero, e.g., por uma ou mais injecções de um agente imunizante e, caso pretendido, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou adjuvante será injectado no mamífero por injecções subcutâneas ou intraperitoneais múltiplas. O agente imunizante poderá incluir uma proteína codificada por um ácido nucleico da tabela 2 ou seu fragmento ou uma sua proteína de fusão. Poderá ser útil conjugar o agente imunizante a uma proteína que se sabe ser imunogénica no mamífero que está a ser imunizado. Os exemplos de tais proteínas imunogénicas incluem 74 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ entre outros hemocianina de lapa gigante, albumina de soro, tiroglobulina bovina e inibidor de tripsina de soja. Os exemplos de adjuvantes que podem ser utilizados incluem adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil-lipido A, dicorinomicolato de trealose sintético). Podem utilizar-se vários protocolos de imunização.

Os anticorpos podem alternativamente ser anticorpos monoclonais. Podem preparar-se anticorpos monoclonais utilizando métodos de hibridoma, tais como os descritos por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Num método de hibridoma, imuniza-se tipicamente um ratinho, hamster ou outro animal hospedeiro apropriado com um agente imunizante para desenvolver linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, podem imunizar-se os linfócitos in vitro. 0 agente imunizante incluirá tipicamente um polipéptido codificado por um ácido nucleico da tabela ou por um seu fragmento ou uma sua proteína de fusão. De um modo geral, utilizam-se linfócitos de sangue periférico ("PBL") caso se pretendam células de origem humana, ou utilizam-se células de baço ou células de gânglios linfáticos caso se pretendam fontes de mamífero não humano. Fundem-se então os linfócitos com uma linha celular imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (e.g., p. 59-103 em Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice,

Academic Press). As linhas celulares imortalizadas são habitualmente células de mamífero transformadas, nomeadamente células de origem de roedor, de bovino ou humanas.

Habitualmente utilizam-se linhas celulares de rato ou de ratinho. Podem cultivar-se células de hibridoma num meio de cultura adequado que contém preferentemente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Por exemplo, se as células parentais forem isentas da enzima hipoxantina guanina fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, 75 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ aminopterina e timidina ("meio HAT") cujas substâncias evitam o crescimento de células deficitárias em HGPRT.

Numa concretização os anticorpos são anticorpos biespecificos. Os anticorpos biespecificos são anticorpos monoclonais, preferentemente humanos ou humanizados, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes ou que têm especificidades de ligação para dois epitopos no mesmo antigénio. Uma das especificidades de ligação é para uma proteína codificada por um ácido nucleico da tabela 1 ou um seu fragmento, sendo a outra para outro antigénio e preferentemente para uma proteína ou receptor ou subunidade de receptor de superfície celular, preferentemente que seja específico de CS1. Alternativamente, a tecnologia de tipo tetrâmero pode criar reagentes multivalentes.

Noutra concretização, os anticorpos têm níveis reduzidos ou estão isentos de fucose. Os anticorpos sem fucose têm sido correlacionados com actividade ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpo) aumentada, especialmente a doses reduzidas de anticorpo. Shields, R.L., et ai., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-267 40; Shinkawa, T. et ai., (2003), J. Biol. Chem. 278:3466. Os métodos para preparar anticorpos sem fucose incluem crescer células de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662). As células YB2/0 expressam níveis reduzidos de ARNm de FUT8, que codifica uma enzima ( Ιτ-fucosiltransf erase) necessária para fucosilação de polipéptidos.

Os métodos alternativos para aumentar actividade ADDC incluem mutações na parte Fc de um anticorpo CS1, nomeadamente mutações que aumentam a afinidade do anticorpo para com um receptor Fc R. Demonstreae uma correlação entre ligação aumentada de Fc R cofflc mutada utilizando ensaios baseados em células de citotoxicidade com alvo. Shields, R.L. et ai. (2001) J. Biol. Chem 27 6:6591-6604; Presta et al. (2002), Biochem Soc. Trans. 30:487-490. Os métodos para aumentar actividade ADCC através de mutações específicas da região Fc incluem variantes de Fc compreendendo pelo menos uma substituição de aminoácido numa posição seleccionada do grupo 76 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ que consiste em : 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262 , 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325 , 327, 328, 329, 330 e 332 em que a numeração dos resíduos na região Fc é segundo o índice EU tal como em Kabat. Numa concretização preferida, as referidas variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição seleccionada do grupo que consiste em L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239T, S239H, S239Y, V240I, V240A, V240T, V240M, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L, F243Y, F243R, F243Q, P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264Y, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266I, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, A298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, W313F, N325Q, N325L, N325I, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, A327N, A327L, L328M, L328D, L328E, L328N, L328Q, L328F, L328I, L328V, L328T, L328H, L328A, P329F, A330L, A330Y, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, I332D, I332E, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y e I332A em que a numeraçao dos resíduos na região Fc é segundo o índice EU tal como em Kabat. As variantes de Fc também podem ser seleccionadas do grupo que consiste em V264L, V264I, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V264I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V2 62E/V2 64R, F241E/F243Q/ V262T/V264E, F241R/F243Q/V2 62T/V2 64R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E,L328F, I332E, L3238M/I332E, P244H, P245A, P247V, W313F, P244H/P24 5A/P2 4 7V, P247G, V264I/I332E, F241E/F243R/ V262E/V264R/I332E, F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241R/F243Q/ V2 62T/V2 64R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/1332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, A330Y, I332D, N297S, N297D, N297S/I332E, N297D/I332E, N297E/I332E, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, D265F/N297P/I332E, 77 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ L328I/I332E, L328Q/I332E, Ι332Ν, I332Q, V264T, V264F, V240I, V263I, V266I, Τ299Α, T299S, T299V, N325Q, N325L, Ν325Ι, S239D, S239N, S239F, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/ I332D, S239N/I332E, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332D, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D, Υ296Ν, F241Y/F243Y/V262T/ V264T/N297D/I332E, Α330Υ/Ι332Ε, V264I/A330Y/I332E, A330L/ Ι332Ε, V264I/A330L/I332E, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239T, S239H, S239Y, V240A, V240T, V240M, V263A, V263T, V263M, V264M, V264Y, V266A, V266T, V266M, Ε269Η, Ε269Υ, E269F, E269R, Y296S, Υ296Τ, Y296L, Υ296Ι, Α298Η, Τ299Η, A330V, Α330Ι, A330F, A330R, Α330Η, N325D, Ν325Ε, Ν325Α, Ν325Τ, N325V, Ν325Η, L328D/I332E, L328E/I332E, L328N/I332E, L328Q/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328H/ Ι332Ε, L328I/I332E, L328A, Ι332Τ, Ι332Η, Ι332Υ, Ι332Α, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/ Ι332Ε, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, S239D/D265L/N297D/I332E, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265Y/ N297D/I332E, S239D/D265Η/Ν297D/I332Ε, S239D/D265Τ/Ν297D/Ι332Ε, V264B/N297D/I332E, Υ296D/N297D/I332Ε, Υ296Ε/Ν297D/Ι332Ε, Y296N/N297D/I332E, Y296Q/N297D/I332E, Y296H/N297D/I332E, Y296T/N297D/I332E, Ν297D/T299V/I332Ε, N297D/T299I/I332E, N297D/T299L/I332E, N297D/T299F/I332E, N297D/T299H/I332E, N297D/T299E/I332E, N297D/A330Y/I332E, N297D/S298A/Α33 ΟΥ/Ι332Ε, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E e S239D/264I/A330L/I332E em que a numeração dos resíduos na região Fc é segundo o índice EU tal como em Kabat. Consultar também PCT WO 2004/029207 de 8 de Abril de 2004. A actividade ADCC associada a anticorpos pode ser monitorizada e quantificada através da medição da libertação de lactato-desidrogenase (LDH) para o sobrenadante, que é rapidamente libertada após danos na membrana plasmática. 78 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Outras concretizações alternativas para promover citotoxicidade de células com tratamento de anticorpo incluem estimulação de sinalização de cascatas mediadas por anticorpo que resultam em morte celular da célula com anticorpo ligado. Adicionalmente a estimulação mediada por anticorpo do sistema imunitário inato (e.g. através de células NK) pode resultar também na morte de células de tumor ou infectadas por vírus.

Detecção da sequência CS1 para aplicações de diagnóstico

Podem determinar-se os níveis de expressão de ARN de genes para diferentes estados celulares na doença auto-imune ou cancerosa, e.g. mieloma, fenótipo. Avaliam-se os níveis de expressão de genes no tecido normal (e.g., sem estar doente) e em tecido doente (e nalguns casos, para diferentes gravidades de doenças que se relacionam com prognóstico, tal como geralmente descrito seguidamente) para proporcionar perfis de expressão. Um perfil de expressão de gene de um determinado estado celular ou ponto de desenvolvimento é essencialmente uma "impressão digital" do estado da célula. Apesar de dois estados poderem ter expressão semelhante de um gene específico, a avaliação do número de genes simultaneamente permite a geração de um perfil de expressão de gene que reflecte o estado da célula. Comparando perfis de expressão de células em diferentes estados obtém-se informação relativa sobre quais os que genes são importantes (incluindo genes com regulação positiva e negativa) em cada um desses estados. Assim, o diagnóstico pode ser efectuado ou confirmado para determinar se uma amostra de tecido tem o perfil de expressão de gene de tecido normal ou doente. Tal proporcionará diagnóstico molecular de doenças relacionadas. "Expressão diferencial" ou seus equivalentes gramaticais tal como aqui utilizado, refere-se a diferenças qualitativas ou quantitativas nos padrões de expressão temporais e/ou celulares de gene no interior de células e tecidos e entre estes. Assim, um gene com expressão diferencial pode ter a sua expressão qualitativamente alterada, incluindo uma activação ou inactivação em, e.g., tecido normal relativamente a tecido 79 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ doente. Os genes podem ser ligados ou desligados num estado especifico relativamente a outro estado permitindo assim comparação de dois ou mais estados. Um gene com regulação qualitativa apresentará um padrão de expressão num estado ou tipo de célula que é detectável por técnicas padrão. Alguns genes serão expressos num estado ou tipo de célula mas não em ambos. Alternativamente, a diferença em expressão pode ser quantitativa, e.g., em que a expressão é aumentada ou diminuída; e.g., a expressão génica é regulada positivamente resultando numa quantidade aumentada de produto de transcrição ou regulada negativamente resultando numa quantidade diminuída de produto de transcrição. 0 grau de diferença de expressão precisa apenas de ser suficientemente elevado para quantificar através de técnicas de caracterização padrão tal como geralmente descrito seguidamente, tal como pela utilização de matrizes de expressão Affymetrix GENECHIP® (microchip de matriz de ADN). Consultar, Lockhart (1996) Nature

Biotechnology 14:1675-1680. Outras técnicas incluem, entre outros, PCR com transcriptase inversa quantitativo, análise "Northern" e protecção de ARNase. Tal como geralmente descrito anteriormente, preferentemente a alteração de expressão (e.g., regulação positiva ou negativa) é pelo menos cerca de 50%, com maior preferência pelo menos cerca de 100%, com maior preferência pelo menos cerca de 150%, com maior preferência pelo menos cerca de 200%, com especial preferência desde 300 a pelo menos 1000%. A avaliação pode ser no produto de transcrição do gene ou ao nível da proteína. A quantidade de expressão de gene pode ser monitorizada utilizando sondas de ácido nucleico para o equivalente de ARN ou ADN do produto de transcrição do gene e a quantificação dos níveis de expressão de gene ou alternativamente pode monitorizar-se o próprio produto génico final (proteína), e.g., com anticorpos para proteína CS1 e imunoensaios padrão (ELISA, etc.) ou outros técnicas, incluindo ensaios de espectrometria de massa, ensaios de electroforese em gel 2D, etc. As proteínas correspondentes a CS1, e.g., as identificadas como sendo importantes num fenótipo de doença, podem ser avaliadas num ensaio de 80 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ diagnóstico de doença. Noutra situação, a monitorização da expressão génica é efectuada simultaneamente em vários genes. Pode também efectuar-se monitorização de expressão múltipla de proteina.

Podem ligar-se as sondas de ácido nucleico CS1 a biochips tal como aqui geralmente descrito para a detecção e quantificação de sequências CS1 numa célula especifica. Os ensaios são adicionalmente descritos seguidamente no exemplo. Podem utilizar-se técnicas de PCR para proporcionar maior sensibilidade.

Podem detectar-se ácidos nucleicos que codificam CS1. Apesar de se poder detectar o ADN ou ARN que codifica proteina CS1, são de especial interesse os métodos em que se detecta um ARNm que codifica uma proteina CS1. As sondas para detectar ARNm podem ser sondas de nucleótido/desoxinucleótido que são complementares e que hibridam com o ARNm e incluem, entre outros, oligonucleótidos, ADNc ou ARN. As sondas também deveriam conter um marcador detectável tal como aqui definido. Num método detecta-se o ARNm após imobilização do ácido nucleico a analisar num suporte sólido tal como membranas de nylon e hibridação da sonda com a amostra. Após lavagem para remover a sonda ligada não especificamente detecta-se o marcador. Noutro método, efectua-se a detecção do ARNm in situ. Neste método põe-se em contacto células ou amostras de tecido permeabilizadas com uma sonda de ácido nucleico marcada para detecção durante tempo suficiente para permitir que a sonda hibride com o ARNm alvo. Após lavagem para remover a sonda ligada não especificamente detecta-se o marcador. Por exemplo, detecta-se uma ribossonda (sonda de ARN) marcada com digoxigenina que é complementar ao ARNm que codifica uma proteina de mieloma por ligação da digoxigenina a um anticorpo secundário anti-digoxigenina e revela-se com azul nitro de tetrazólio e fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo. São utilizadas várias proteínas das três classes de proteínas tal como aqui descrito (proteínas excretadas, transmembranares ou intracelulares) em ensaios de diagnóstico. 81 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

As proteínas CS1, anticorpos, ácidos nucleicos, proteínas modificadas e células contendo sequências CS1 são utilizados em ensaios de diagnóstico. Tal pode ser efectuado num gene individual ou a nível de polipéptido correspondente. Os perfis de expressão podem ser utilizados, preferentemente em conjunção com técnicas de rastreio de elevado rendimento, para permitir monitorizar o perfil de expressão de genes e/ou polipéptidos correspondentes.

Tal como aqui descrito e definido, a proteína CS1 pode ser utilizada como um marcador de doença para doenças auto-imunes, tal como SLE, RA e IBD, e doenças cancerosas, tal como mieloma e leucemia de células plasmáticas. Além disso, CS1 pode ser utilizada como um marcador para objectivos de prognóstico ou diagnóstico. A detecção destas proteínas em tecido supostamente doente permite a detecção, prognóstico ou diagnóstico de tais doenças e a selecção de estratégia terapêutica. Numa concretização, utilizam-se anticorpos para detectar CS1. Um método preferido separa proteínas de uma amostra por electroforese num gel (tipicamente um gel de proteína desnaturante e redutor, mas pode ser outro tipo de gel, incluindo géis de focagem isoeléctrica e semelhantes. Após separação de proteínas, detecta-se CS1, e.g., por imunotransferência com anticorpos desenvolvidos contra CS1.

Num outro método, utilizam-se anticorpos para CS1 em técnicas de imagem in situ, e.g., em histologia. Consultar, e.g., Asai, et al. (ed. 1993) Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology (vol. 37) Academic Press. Neste método, põe-se em contacto células com um ou muitos anticorpos para a(s) proteína (s) de mieloma. Após lavagem para remoção de ligação de anticorpo não específica, detecta-se a presença do anticorpo ou anticorpos. 0 anticorpo pode ser detectado por incubação com um anticorpo secundário que contém um marcador detectável. Num outro método, o anticorpo primário para CS1 contém um marcador detectável, e.g., um marcador de enzima que pode actuar num substrato. Num outro método, cada um dos múltiplos anticorpos primários contém um marcador detectável distinto. Este método é particularmente útil em rastreio 82 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ simultâneo para CS1 conjuntamente com outros marcadores das doenças supramencionadas. Também se proporcionam aqui muitas outras técnicas de imagem histológica. 0 marcador pode ser detectado num fluorimetro que tem a capacidade de detectar e distinguir emissões de diferentes comprimentos de onda. Adicionalmente, pode utilizar-se no método um separador de células activado por fluorescência (FACS).

Numa outra concretização, os anticorpos podem ser utilizados no diagnóstico de doenças auto-imunes, tal como SLE, RA, e IBD, e cancro, tal como mieloma e leucemia de células plasmáticas, a partir de amostras de sangue, soro, plasma, fezes e outras amostras. Assim, tais amostras são úteis como amostras para serem sondadas ou ensaiadas para a presença de CS1. Podem utilizar-se anticorpos para detectar CS1 pelas técnicas de imunoensaio previamente descritas incluindo ELISA, imunotransferência (transferência "Western"), imunoprecipitação, tecnologia BIACORE e semelhantes. Contrariamente, a presença de anticorpos pode indicar uma resposta imunitária contra uma proteína CS1 endógena.

Num outro método, efectua-se hibridação in situ de sondas de ácido nucleico CS1 marcadas com matrizes de tecido. Por exemplo, preparam-se matrizes de amostras de tecidos, incluindo tecido doente e/ou tecido normal. Efectua-se então hibridação in situ (consultar, e.g., Ausubel, supra). Pode fazer-se um diagnóstico, um prognóstico ou uma previsão com base nas evidências proporcionadas por comparação da impressão digital entre um indivíduo e um padrão. Também se deve entender que os genes que indicam o diagnóstico podem diferir dos que indicam o prognóstico e a obtenção do perfil molecular da doença das células pode levar a distinção entre doenças sensíveis ou refractárias ou pode prever resultados.

Numa concretização, utilizam-se anticorpos CS1 em ensaios de prognóstico. Tal como anteriormente, podem gerar-se perfis de expressão génica que se correlacionam com um estado de 83 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ doença, clínico, patológico ou outra informação, em termos de prognóstico a longo prazo. Uma vez mais, tal pode ser efectuado a nível de proteína ou gene, sendo preferível a utilização de genes. Podem ser úteis genes simples ou múltiplos em várias combinações. Tal como anteriormente, podem ligar-se sondas CS1 a biochips para a detecção e guantificação de sequências CS1 num tecido ou doente. Os ensaios efectuam-se como descrito geralmente anteriormente para diagnóstico. 0 método de PCR pode proporcionar uma quantificação mais sensível e exacta.

Os genes úteis em ensaios de prognóstico são genes que são expressos diferencialmente de acordo com o estágio da doença do doente. Num método, os genes podem ser expressos unicamente de acordo com o estágio do doente. Num outro método, os genes podem ser expressos a níveis diferenciais de acordo com o estágio do doente. Por exemplo, em mieloma, os doentes são classificados em três estágios diferentes de acordo com a extensão e localização da doença: estágios I, II e III. No estágio I, os sintomas são moderados ou não existentes, com muitos doentes não apresentando sintomas de mieloma. Um diagnóstico positivo é a presença de células de tumor; no entanto, o número de eritrócitos é normal ou ligeiramente inferior à gama normal, não há qualquer aumento detectável do cálcio no sangue, há níveis muito baixos de proteína M no sangue ou urina e não se pode verificar qualquer dano ósseo em raios X. No estágio II, as células de cancro são prevalentes em números elevados. A função renal pode ser afectada, o que piora o diagnóstico de prognóstico da maioria dos doentes. 0 estágio III acarreta anemia, hipercalcemia, danos ósseos avançados e níveis elevados de proteína M no sangue e urina. A correlação entre a expressão de proteína nos diferentes estágios na doença auto-imune poderia também ser útil para determinar o prognóstico de tais doenças. A correlação de genes expressos nos diferentes estágios, quer expressos unicamente ou com níveis de expressão diferenciais de acordo com o estágio, pode ser utilizada para determinar a viabilidade de induzir remissão num doente. Tal poderia ser especialmente útil nos estágios precoces da doença, em que os 84 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ doentes de mieloma apresentam poucos sintomas. Adicionalmente, os genes que são expressos indicam o inicio de complicações a longo prazo, tal como beta-2 microglobulina (indicador de danos renais), assim como elevados níveis de albumina sérica e lactato-desidrogenase, podem também ser úteis como uma ferramenta de prognóstico. A correlação de genes expressos em diferentes estágios, quer expressos unicamente, quer com níveis de expressão diferenciais de acordo com o estágio, pode também ser monitorizada para determinar a eficácia do tratamento utilizando os agentes terapêuticos divulgados no presente invento. Por exemplo, os doentes tratados com antagonistas do presente invento podem ser monitorizados para eficácia terapêutica dos referidos antagonistas através de monitorização de marcadores, incluindo por exemplo, CS1 ou CS1 em combinação com marcadores específicos de doença (e.g. a monitorização de proteína M para tratamento de mieloma. A monitorização destes marcadores específicos será importante para determinar a eficácia do invento terapêutico, assim como para determinar a dosagem e considerar o método de tratamento para as diferentes indicações do presente invento.

Indução de doença como sistemas modelo in vivo Doença inflamatória do intestino

Desenvolveram-se modelos experimentais in vivo para a investigação de processos patológicos da doença inflamatória do intestino. Sartor RB, Aliment. Pharmacol. Ther. 11:89-96 (1997) . Por exemplo, podem preparar-se ratinhos transgénicos knock-out, nos quais se quebra o gene de doença inflamatória do intestino ou no qual se insere um gene de doença inflamatória do intestino. Podem preparar-se ratinhos transgénicos knock-out por inserção de um gene marcador ou outro gene heterólogo no local do gene endógeno de doença inflamatória do intestino no genoma de ratinho via recombinação homóloga. Tais ratinhos podem também ser preparados por substituição do gene endógeno de doença inflamatória do intestino por uma versão mutada do gene de 85 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ doença inflamatória do intestino ou por mutação do gene endógeno de doença inflamatória do intestino, e.g., por exposição a carcinogéneos.

Introduz-se uma construção de ADN nos núcleos de células estaminais embrionárias. Injectam-se as células contendo a lesão genética concebida racionalmente de novo num embrião de ratinho hospedeiro, gue é reimplantado numa fêmea recebedora. Alguns destes embriões desenvolvem-se em ratinhos quiméricos que possuem células germinais parcialmente derivadas da linha celular mutante. Assim, por reprodução dos ratinhos quiméricos é possível obter uma nova linhagem de ratinhos contendo a lesão genética introduzida (consultar, e.g., Capecchi, et al. (1989) Science 244:1288-1292). Os ratinhos alvo quiméricos podem ser derivados de acordo com Hogan, et al. (1988) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, CSH Press; e Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.

Podem construir-se outros modelos utilizando manipulação não genética de modelos animais. Em particular, tem sido utilizado extensamente um modelo em rastreio de moléculas pequenas. Este modelo induz colite em ratos ou ratinhos através de uma única provocação intracolónica com uma solução do hapteno ácido 2,4-trinitrobenzenossulfónico (TNBS). Morris GP et al., Gastroenterology 96:795-803 (1989); Boughton-Smith

NK, Br. J. Pharmacol. 94:65-72 (1988) . O tratamento com TNBS produz uma resposta inflamatória local intensa que atinge o seu pico após 2 a 3 dias e pode durar até 21 dias, dependendo da gravidade da provocação.

Considera-se que a resposta inflamatória produzida por tratamento com TNBS reproduz muitas das características macroscópicas, histológicas e imunológicas da doença de Crohn. Grisham MB et al., Gastroenterology 101:540-547 (1991); Yamada Y et al., Gastroenterology 102:524-534 (1992); Torres MI et al., Dig. Dis. Sei 44:2523-29 (1999); Neruath M, Fuss I,

Strober W, Int. Rev. Inununol. 19:51-62 (2000). Verificam-se úlceras abertas, com inflamação transmural e espessamento da 86 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ parede do intestino. As caracteristicas histológicas incluem arquitectura distorcida da cripta, atrofia da cripta, granulomas, células gigantes, agregados linfóides basais e a presença de um infiltrado inflamatório. 0 modelo tem sido utilizado para estudar e validar inflamação do cólon e para considerar aspectos de doença inflamatória do intestino. Hoffman P et al., Gut 41:195-202 (1997); Jacobson K, McHugh K, Collins SM, Gastroenterology 112:156-62 (1997).

Outros modelos animais incluem ratos transgénicos HLA-B27 (Hammer RE et ai., Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and Human b2M: An animal model of HLA-B27 associated human disorders, Cell 63:1088-1112 (1990)), ratinhos deficientes em IL-2 transgénicos (Baumgart DC et ai., Mechansisms of intestinal epithelial cell injury and colitis in interleukin 2 deficient mice, Cell Immunol. 187:52-66 (1998)), ratinhos deficientes em mdrla (Panwala CM et al., A Novel Model of Inflammatory Bowel Disease: Mice deficient for the multiple drug resistance gene, mdrla, spontaneously develop colitis, J. Immunol. 161:5733-44 (1998)) e ratinhos deficientes em IL 10 (Freeman HJ, Studies on the interleukin-10 gene in animal models of colitis, Canadian Gastroenterology (2003)) .

Mieloma

Desenvolveram-se modelos experimentais in vivo para a investigação de processos patológicos de mieloma. Sartor RB, Aliment. Pharmacol. Ther. 11:89-96 (1997). Por exemplo, podem preparar-se ratinhos transgénicos knock-out, nos quais se quebra o gene de mieloma ou no qual se insere um gene de mieloma. Podem preparar-se ratinhos transgénicos knock-out por inserção de um gene marcador ou outro gene heterólogo no local do gene endógeno de mieloma no genoma do ratinho através de recombinação homóloga. Tais ratinhos também podem ser preparados por substituição do gene endógeno de mieloma por 87

ΕΡ 2 371 391/PT uma versão mutada do gene de mieloma ou por mutação do gene endógeno de mieloma, e.g., por exposição a carcinogéneos.

Introduz-se uma construção de ADN nos núcleos de células estaminais embrionárias. As células contendo a lesão genética concebida racionalmente de novo são injectadas num embrião de ratinho hospedeiro, que é reimplantado numa fêmea recebedora. Alguns destes embriões desenvolvem-se em ratinhos quiméricos que possuem células germinais parcialmente derivadas da linha celular mutante. Assim, por reprodução dos ratinhos quiméricos é possível obter uma nova linha de ratinhos contendo a lesão genética introduzida (consultar, e.g., Capecchi, et al. (1989)

Science 244:1288-1292). Os ratinhos alvo quiméricos podem ser derivados de acordo com Hogan, et al. (1988) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, CSH Press; e Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.

Podem construir-se outros modelos utilizando manipulação não genética de modelos animais. Por exemplo, a injecção de ratinhos C57BL/6J com tumores de células B (e.g. células LLC) pode induzir metástases de pulmão. Outros modelos animais utilizam ratinhos SCID e a injecção de linhas de tumor de células B (e.g. células HsSultan (ATCC) ou linhas de mieloma múltiplo, (por exemplo, entre outras, L363, LP-1, OPM-2 ou RPMI 8226) para induzir características do tipo mieloma. Ainda outros modelos animais incluem um modelo de ratinho NOD/SCID para mieloma múltiplo humano gerado por implante de ossos fetais humanos (FB) em locais subcutâneos de ratinhos NOD/SCID, seguido por inoculação com células mononucleares de medula óssea primários de doentes com mieloma múltiplo nos FB. Consultar Shang-Yi H., et al., Amer. J. Invest. Pathol. 164:747-756 (2004). Também podem ser utilizados os modelos de plasmacitoma de ratinho, cuja formação é induzida através de tratamento com óleo de pristano (2,6,10,12- tetrametilpentadecano). Adicionalmente, também podem ser utilizados modelos de ratinhos em que se injectam células de mieloma directamente na medula óssea (modelo de injecção ortotópica) de ratinhos SCID, SCID/beige ou NOD/SCID. 88 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

As células em transformação, tal como as células de mieloma, libertam uma quantidade aumentada de determinados factores (doravante "marcadores específicos de mieloma") do que as células correspondentes normais. Por exemplo, a expressão de CD38, CD9, CD10, HLA-DR e CD20 é aumentada em células de mieloma. Ruiz-Arugelles GJ e San Miguel JF, Cell Surface Markers in Multiple Myeloma, Mayo Clin. Proc. 69:684-90 (1994) .

Descrevem-se várias técnicas que medem a libertação destes factores em Freshney (1998), supra. Consultar também Unkeless, et al. (1974) J. Biol. Chem. 249:4295-4305; Strickland e Beers (1976) J. Biol. Chem. 251:5 694-57 02; Whur, et al. (1980) Br. J. Câncer 42:305-312; Gullino "Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth" p. 178-184 em Mihich (ed. 1985) Biological Responses in Câncer, Plenum; Freshney (1985) Câncer Res. 5:111-130. Métodos terapêuticos Tratamento de doença auto-imune

Um método para reduzir a proliferação, adesão, diferenciação, activação e/ou co-activação de leucócitos compreende pôr em contacto os leucócitos com um antagonista de CS1 aqui descrito.

Um método para reduzir a excreção (ou produção) de imunoglobulina por linfócitos (tal como células B) compreende pôr em contacto os linfócitos com um antagonista de CS1 aqui descrito. Os antagonistas do presente invento podem reduzir a produção de imunoglobulina (tal como, IgM, IgG, IgD, IgA e IgE) em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%. A alteração percentual é calculada por subtracção da concentração de imunoglobulina antes da administração da primeira dose do anticorpo (dia 0) da concentração de imunoglobulina após a dose (dia x) , dividindo pela concentração de imunoglobulina antes da primeira dose (dia 0) e multiplicando por 100, e.g., [(dia x - dia 0)/ dia 0] X 100. 89 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Um método para induzir apoptose ou citólise de células que expressam CS1 compreende pôr em contacto as células com um anticorpo contra CS1 aqui descrito. De preferência, atinge-se indução através de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em geral, os anticorpos do presente invento ligam antigénios na superfície de células alvo (células que expressam CS1) na presença de células efectoras (tal como células assassinas naturais ou macrófagos). Os receptores Fc nas células efectoras reconhecem os anticorpos ligados. A reticulação de receptores Fc representa um sinal para as células efectoras mataram as células alvo por citólise ou apoptose. A citólise pode ser detectada através de detecção de libertação de marcador ou de lactato-desidrogenase das células lisadas, ou detecção de diminuição da viabilidade celular das células alvo (e.g. ensaio de anexina). Os ensaios para apoptose podem ser efectuados por ensaio de marcação terminal de corte com digoxigenina-11-dUTP (TUNEL) mediado por desoxinucleotidil-transferase terminal (Lazebnik et ai., Nature: 371, 346 (1994) . A citotoxicidade também pode ser detectada directamente com kits de detecção conhecidos na especialidade, tal como o kit de detecção de citotoxicidade de Roche Applied Science (Indianapolis, IN). De preferência, os anticorpos do presente invento induzem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou 80% de citotoxicidade das células alvo. A percentagem é calculada pelos métodos divulgados nos exemplos.

Os antagonistas podem entrar em contacto com os leucócitos in vitro (tal como por adição dos antagonistas a um ambiente de cultura de células em que se cultivam os leucócitos) , ex vivo ou in vivo (por exemplo, por administração dos antagonistas a um indivíduo).

Numa concretização preferida, os leucócitos são a) linfócitos activados, tal como células B e/ou células T, preferentemente células B CD19+ e/ou células T CD3+; b) células CD14+ activadas e/ou virgens; c) células dendríticas activadas e/ou não activadas; e/ou c) células NK CD56+ e/ou NKT. 90 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Um método para reduzir a excreção de imunoglobulina por células B, num indivíduo com essa necessidade, compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de CS1 ao referido indivíduo.

Um método para induzir citotoxicidade, citólise e/ou apoptose de células que expressam CS1 num indivíduo com essa necessidade compreende administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo de CS1 ao referido indivíduo.

Os antagonistas, preferentemente anticorpos do presente invento, podem ser utilizados para a prevenção ou tratamento de doenças auto-imunes, incluindo, entre outras, doença de Addison, doenças auto-imunes do ouvido, doenças auto-imunes do olho, tal como uveíte, hepatite auto-imune, doença de Crohn, diabetes (tipo I), epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, lúpus eritematoso sistémico (SLE), esclerose múltipla, miastenia grave, pênfigo vulgar, psoríase, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerodermia, psoríase, síndrome de Sjogren, espôndilo-artropatias, tiroidite, colite ulcerosa e/ou vasculite.

Numa concretização preferida, a doença auto-imune que pode ser evitada e/ou tratada com o presente invento é SLE, RA ou IBD. Após serem administrados a um indivíduo que desenvolveu os sintomas de SLE, RA ou IBD, os anticorpos anti-CSl devem ser capazes de reduzir a gravidade dos sintomas. Alternativamente podem administrar-se os anticorpos anti-CSl a um indivíduo antes do indivíduo desenvolver quaisquer manifestações clínicas de SLE, RA ou IBD. Tal administração preventiva dos anticorpos deve evitar completamente que o indivíduo desenvolva quaisquer sintomas de SLE, RA ou IBD ou pelo menos evitar que o indivíduo desenvolva sintomas tão graves como na doença sem tratamento com anticorpo. A gravidade de sintomas de SLE, RA ou IBD pode ser medida por ensaios clínicos padrão para SLE, RA ou IBD conhecidos na 91 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ especialidade, tal como nível sérico de anticorpos anti-ADN, proteinúria e a taxa de mortalidade dos doentes.

Os métodos terapêuticos são usualmente aplicados a doentes humanos mas podem ser aplicados a outros mamíferos.

Tratamento de cancro

Também se incluem métodos terapêuticos para reduzir a proliferação de células de mieloma, compreendendo pôr em contacto células de mieloma com um antagonista de uma proteína de mieloma, preferentemente um anticorpo ou outro antagonista, tal como os anticorpos CS1 aqui descritos. Por exemplo, os anticorpos podem estabelecer contacto com células de mieloma in vitro (tal como, por adição dos antagonistas a um ambiente de cultura celular em que se cultivam células de mieloma) , ex vivo ou in vivo (por exemplo, por administração dos antagonistas a um indivíduo). Um método para reduzir a proliferação de células de mieloma compreende administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de proteína de mieloma ao referido indivíduo.

Num aspecto, os antagonistas, preferentemente anticorpos do presente invento, podem ser utilizados para a prevenção ou tratamento de mieloma. Após serem administrados a um indivíduo que desenvolveu os sintomas de mieloma, os anticorpos ou antagonista devem ser capazes de reduzir a gravidade dos sintomas. Alternativamente, os anticorpos do presente invento podem ser administrados a um indivíduo antes do indivíduo desenvolver quaisquer manifestações clínicas de mieloma. A gravidade dos sintomas de mieloma pode ser medida por ensaio clínico padrão para mieloma conhecido na especialidade, tal como análise por raios X da densidade óssea, níveis de beta-2 microglobulina ou hipercalcemia. Os métodos terapêuticos são usualmente aplicados a doentes humanos mas podem ser aplicados a outros mamíferos.

Um método para induzir apoptose ou citólise de células que expressam CS1 compreende pôr em contacto as células com um 92 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ anticorpo contra CS1 aqui descrito. Num método preferido, consegue-se indução através de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em geral, os anticorpos do presente invento ligam-se a antigénios na superfície celular de células alvo (células que expressam CS1) na presença de células efectoras (tal como células assassinas naturais ou macrófagos). Os receptores Fc nas células efectoras reconhecem os anticorpos ligados. A reticulação de receptores Fc representa um sinal para as células efectoras para matar as células alvo por citólise ou apoptose. A citólise pode ser detectada através de detecção da libertação de marcador ou de lactato-desidrogenase das células Usadas ou detecção da viabilidade reduzida das células alvo (e.g. ensaio de anexina). Os ensaios para apoptose podem ser efectuados por ensaio de marcação terminal de corte com digoxigenina-ll-dUTP mediada por desoxinucleotidil-transferase (TUNNEL) (Lazebnik et al., Nature: 371, 346 (1994). A citotoxicidade também pode ser detectada directamente com kits de detecção conhecidos na especialidade, tal como o kit de detecção de citotoxicidade de Roche Applied Science (Indianapolis, IN). De preferência, os anticorpos do presente invento induzem pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou 80% de citotoxicidade das células alvo. A percentagem é calculada pelos métodos divulgados nos exemplos.

Os antagonistas podem também entrar em contacto com os leucócitos in vitro (tal como por adição dos antagonistas a um ambiente de cultura de células em que se cultivam os leucócitos) , ex vivo ou in vivo (por exemplo, por administração dos antagonistas a um indivíduo).

Numa concretização preferida, os leucócitos são a) linfócitos activados, tal como células B e/ou células T, preferentemente células B CD19+ e/ou células T CD3+; b) células CD14+ activadas e/ou virgens; c) células dendríticas activadas e/ou não activadas; e/ou c) células NK CD56+ e/ou NKT.

Um método para reduzir a excreção de imunoglobulina por células B, num indivíduo com essa necessidade compreende 93 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ administrar uma quantidade eficaz de um antagonista de CS1 ao referido indivíduo. Tal redução da excreção de imunoglobulina pelas células B pode ajudar a aliviar as complicações de mieloma, incluindo síndrome de hiperviscosidade.

Administração de agentes terapêuticos Há vários métodos para administrar os antagonistas, por exemplo, anticorpos do presente invento. É preferida a administração parentérica. 0 anticorpo pode ser administrado a um doente intravenosamente como um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo; ou pelas vias intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intra-cerebrospinal. Também se incluem no presente invento as vias oral, tópica, de inalação ou outros meios de administração conhecidos dos peritos na especialidade.

As composições farmacêuticas do presente invento compreendem usualmente uma solução de antagonistas (por exemplo, anticorpos), ou uma sua mistura dissolvida num transportador aceitável, preferentemente um transportador aquoso. Podem utilizar-se vários transportadores aquosos, e.g., água para injecção (WFI) ou água tamponada com fosfato, citrato, acetato, etc. com um pH tipicamente de 5,0 a 8,0, mais frequentemente 6,0 a 7,0 e/ou contendo sais tal como cloreto de sódio, cloreto de potássio, etc. para a tornar isotónica. O transportador pode também conter excipientes tal como albumina de soro humana, polissorbato 80, açúcares ou aminoácidos para proteger a proteína activa. A concentração de um antagonista (por exemplo, anticorpo) nestas formulações varia largamente desde cerca de 0,1 a 100 mg/ml, mas é frequentemente na gama de 1 a 10 mg/ml. O anticorpo monoclonal formulado é particularmente adequado para administração parentérica e pode ser administrado como uma infusão 94 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ intravenosa ou por injecção subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Os métodos práticos para preparar composições de administração parentérica são conhecidos ou perceptíveis para os peritos na especialidade e são descritos mais detalhadamente em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). O presente invento proporciona uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos aqui descritos.

As composições podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos, compreendendo inibir as interacções entre uma CS1 e o seu substrato celular, inibir a adesão de células doentes ou evitar e/ou reduzir os sintomas clínicos das doenças anteriores. Uma quantidade apropriada para atingir qualquer um destes efeitos pretendidos é definida como uma "quantidade eficaz". Os anticorpos podem ser administrados a um doente em administrações simples ou múltiplas.

Para o objectivo de tratamento de doença, a dosagem adequada dos antagonistas (por exemplo, anticorpos) dependerá da gravidade e decurso da doença, da história clínica e sensibilidade do doente, da toxicidade dos anticorpos e do critério do médico assistente. Os antagonistas são administrados adequadamente ao doente numa toma única ou ao longo de uma série de tratamentos. A dosagem candidata inicial pode ser administrada a um doente. A dosagem e regime de tratamento adequados podem ser estabelecidos por monitorização do progresso da terapia utilizando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na especialidade.

Além disso, o antagonista (tal como anticorpos) pode ser utilizado sozinho numa forma substancialmente pura ou conjuntamente com agentes terapêuticos para doenças auto-imunes conhecidos do perito na especialidade. As outras terapias que podem ser utilizadas conjuntamente com tratamento com os anticorpos incluem administração de moléculas de ácido nucleico anti-sentido ou produtos biológicos, tais como anticorpos terapêuticos adicionais. Assim, o tratamento do 95 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ presente invento é formulado de uma forma a permitir a sua administração em série ou em combinação com outro agente para o tratamento de doenças auto-imunes. Para tratar doenças auto-imunes e mieloma, o anticorpo será frequentemente administrado após ou em combinação com um ou mais outros fármacos imunossupressores e imunomoduladores.

Kits para utilização em aplicações de diagnóstico e/ou prognóstico

Para utilização em aplicações de diagnóstico e de investigação sugeridas anteriormente, também se proporcionam aqui kits. Em aplicações de diagnóstico e investigação, tais kits podem incluir pelo menos um dos seguintes: reagentes de ensaio, tampões, ácidos nucleicos ou anticorpos específicos de CS1, sondas de hibridação e/ou iniciadores, polinucleótidos anti-sentido, ribozimas, polipéptidos ou polinucleótidos CS1 dominantes negativos, inibidores de sequências associadas a CS1 que são moléculas pequenas, etc.

Além disso, os kits podem incluir material informativo contendo instruções (e.g, protocolos). Embora os materiais informativos compreendem tipicamente materiais escritos ou impressos, não estão limitados a tal. Contempla-se aqui um meio capaz de armazenar tais instruções e comunicá-las ao utilizador final. Tais meios incluem, entre outros, meios de armazenagem electrónica (e.g., discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), meios ópticos (e.g., CD ROM) e semelhantes. Tais meios podem incluir endereços de locais da internet que proporcionam tais materiais informativos.

Também se proporcionam kits para rastreio de moduladores de sequências associadas a CS1. Tais kits podem ser preparados a partir de materiais e reagentes facilmente disponíveis. Por exemplo, tais kits podem compreender um ou mais dos seguintes materiais: um polipéptido ou polinucleótido associado a CS1, tubos reaccionais e instruções para ensaiar a actividade associada a CS1. Opcionalmente, o kit contém proteína CS1 activa biologicamente. Pode preparar-se uma vasta variedade de kits e componentes, dependendo do utilizador pretendido do kit 96 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ e das necessidades particulares do utilizador. 0 diagnóstico envolveria tipicamente a avaliação de vários genes ou produtos. Os genes serão tipicamente seleccionados com base em correlações com parâmetros importantes da doença que podem ser identificados em dados da história ou do resultado.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Isolamento e identificação de CS1

Identificou-se CS1 a partir de uma biblioteca de subtracção de ADNc de subconjuntos de células B (células B virgens vs. células B de memória + de plasma) de sangue periférico de adultos saudáveis normais. CS1 foi expressa preferentemente em células B de memória e de plasma. Produziram-se bibliotecas de subtracção seguindo o protocolo descrito seguidamente:

Isolamento de subconjuntos de células B:

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de nove dadores adultos saudáveis com gradientes padrão de Ficoll-hypaque. Isolaram-se as células B a partir das PBMC seguindo um protocolo padrão de selecção negativa. Incubaram-se as PBMC com uma mistura de anticorpos purificados de ratinho anti-CD2, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD56, anti-CD66 e anti-glicoforina A humanos. Após incubação e lavagem, adicionou-se pérolas Dynal magnéticas cabra-anti-ratinho a 7-10 pérolas por célula. Subsequentemente, isolaram-se as células ligadas a anticorpo com um suporte magnético padrão Dynal, deixando os sobrenadantes enriquecidos em células B. Lavaram-se os sobrenadantes recolhidos com RPMI + soro fetal bovino a 10% (FBS).

Selecção de subconjuntos de células B (células B virgens vs. células B de memória + de plasma):

Coraram-se as células B enriquecidas por Dynal com IgD-FITC, CD38-cicromo, CD19-APC e CD27-PE seguindo protocolos de coloração padrão. Seleccionaram-se as duas populações 97 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ independentes de células B virgens (IgD+CDl 9+CD38int/_CD27_) relativamente a células B de memória e de plasma (IgD-CD19+CD38in/+CD27+) num citómetro de fluxo MLS de elevado desempenho MoFlo, equipado com um laser de árgon arrefecido a ar de spectra physics (488 nm) e um laser de diodo de 635 nm e com filtros para detecção de FITC a 530/40 nm, PE a 580/30 nm, APC a 670/20 nm e cicromo (PE-Cy5) a 670/30 nm. As células B seleccionadas foram analisadas no citómetro MoFlo relativamente a pureza e verificou-se que eram 97% (células B de memória e de plasma) e 98% (células B virgens) puras. As células seleccionadas foram colocadas em Trizol e armazenadas a -70 °C.

Produção de biblioteca de ADNc:

As bibliotecas de subtracção de ADNc foram preparadas a partir dos subconjuntos de células B seleccionadas utilizando um protocolo de análise de diferença representacional por hibridação subtractiva padrão. As bibliotecas de subtracção incluíram a biblioteca de ADNc de células B de memória + plasma, em que o ADNc virgem foi subtraído duas vezes, e a biblioteca de ADNc de células B virgens, em que o ADNc de memória + plasma foi subtraído duas vezes. Utilizando técnicas padrão de biologia molecular, ligou-se a biblioteca de subtracção de ADNc num vector de plasmídeo padrão e transformaram-se células E. coli (DH-10B) electrocompetentes. As células de E. coli transformadas foram plaqueadas em placas de LB-ágar-ágar na presença de antibióticos de selecção. Amplificaram-se colónias bacterianas individuais, cada qual representado uma inserção específica, utilizando PCR de colónias padrão.

Rastreio e confirmação de expressão diferencial:

Desnaturaram-se as inserções de bibliotecas de subtracção de ADNc, transferiram-se para 2 filtros de nylon idênticos e hibridaram-se separadamente com duas sondas desnaturadas marcadas com diferentes ADNc (memória + plasma) - virgem (subtraído duas vezes) e ADNc virgem - (memória + plasma) (subtraído duas vezes). Considerou-se que a inserção da 98 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ biblioteca de ADNc de subtracção era positiva nos casos em que a inserção hibridou selectiva e preferencialmente com uma das duas sondas. Os clones de ADNc para CS1 hibridaram preferencialmente com a sonda de ADNc de (memória + plasma) -virgem (subtraído duas vezes.)

Identificação de CS1:

Cultivaram-se células bacterianas transformadas com clones positivos e isolou-se ADN com um kit Qiagen® Mini-Prep (preparações de diagnóstico in vitro) seguindo o protocolo do fabricante (Qiagen, Valência, Califórnia). Os plasmídeos purificados foram sequenciados e determinou-se a identidade da sequência de ADN por busca das bases de dados NCBI.

Caracterização e confirmação da expressão génica de CS1:

Confirmou-se a expressão preferencial dos clones positivos seleccionados, incluindo CS1, por análise de transferência dot. Transferiram-se quantidades iguais de ADNc (não subtraído) (20 ng) isolado de células B seleccionadas virgens relativamente a células B de memória + plasma para filtros de nylon e hibridaram-se com inserção de ADNc marcada para o clone positivo. Para estes ensaios, sintetizou-se ADNc de subconjuntos de células B de sangue periférico obtidos de 2 selecções independentes (n=9 adultos saudáveis e n=10 adultos saudáveis, pureza > 97% e > 98%, respectivamente) .

Lavaram-se os filtros e detectou-se o sinal das sondas hibridadas por auto-radiografia. Considerou-se um clone positivo no caso do ADNc hibridar preferencialmente com o ADNc de células B de memória + plasma em ambos os conjuntos de células B seleccionadas virgens relativamente a células B de memória + plasma. Tal como apresentado na figura IA, os dados indicaram que CS1 é expressa predominantemente em células B de plasma e de memória. CSI é expressa principalmente em tecido linfóide:

Prepararam-se transferências dot blot a partir de ADNc sintetizado de ARN poliA+, que foi adquirido a Clontech (Paio 99 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Alto, Califórnia) e preparados a partir dos seguintes tecidos: baço, gânglio linfático, medula óssea, intestino delgado, cérebro, pulmão, músculo-esquelético, coração, rim e fígado. Sondaram-se as transferências dot com ADN de CS1 marcado com digoxigenina (DIG) e visualizaram-se por quimioluminescência (anticorpo anti-DIG marcado com fosfatase alcalina e CDP-Star) seguindo as recomendações do fabricante (kit DIG de

Boehringer-Mannheim). Tal como apresentado na figura 1B, os resultados indicam que CS1 é expressa principalmente em tecidos linfóides (baço, gânglio linfático, medula óssea e intestino delgado-possivelmente devido a linfócitos residuais em placas de Peyer) e está ausente ou em baixa quantidade em outros órgãos não linfóides (cérebro, pulmão, músculo-esquelético, coração, rim e fígado).

Exemplo 2: Expressão diferencial de CS1 Células humanas:

Obtiveram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) por isolamento com gradientes padrão de Ficoll-hypaque. Ressuspenderam-se então PBMC isoladas a 2 x 106 células/ml num meio de cultura fresco. Estimularam-se PBMC com fito-hemaglutinina (PHA) a uma concentração de 3 pg/ml durante 3 dias ou com mitogénio de fitolaca (PWM) a uma concentração de 10 pg/ml durante 8 dias. Prepararam-se PBMC de controlo não estimuladas sem qualquer estímulo. As células foram cultivadas a 37 °C em CO2 a 7% em meio RPMI com FBS a 10%, penicilina, estreptomicina e aditivos de glicose. Células de ratinho:

Obtiveram-se baços de dois ratinhos Balb/c. Colocaram-se os baços num filtro de 100 micra. Desagregaram-se as células e lavaram-se com PBS e centrifugaram-se a 1500 rpm durante 10 minutos. Lisaram-se eritrócitos com 2 ml de tampão de lise a 37 °C durante 2 minutos. Lavaram-se as células duas vezes, ressuspenderam-se em 10 ml de meio e contaram-se. Congelou-se directamente uma parte das células não estimuladas. As células restantes foram estimuladas com con A a uma concentração de 100 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 5 yg/ml durante 3 dias, ou com LPS a uma concentração de 1 yg/ml durante 3 dias. Cultivaram-se as células num meio DMEM com FBS a 10%, antibióticos e aditivos de glicose.

Linfócitos B de doente de lúpus relativamente a indivíduos saudáveis com idade comparável:

Seleccionaram-se células B de células mononucleares de sangue periférico de doente de lúpus e de indivíduos saudáveis, por coloração de células com anticorpo anti-CD 19 humano marcado com FITC. As células foram seleccionadas num citómetro de fluxo MLS de elevado desempenho MoFlo, tal como descrito no exemplo 1. Recolheram-se as células em meio estéril para síntese de ARN.

Isolamento de ARN total para PCR em tempo real:

Lavaram-se as células uma vez e colocaram-se em Trizol™ (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland) e isolou-se ARN total seguindo o protocolo do fabricante. Tratou-se ARN total com ADNase isento de ARNase (GenHunter, Nashville, Tennessee). Extraiu-se ARN digerido com ADNase com fenol/clorofórmio e precipitou-se durante a noite com etanol. Lavou-se ARN com etanol a 75% e dissolveu-se com água isenta de nuclease. O ARN isolado foi quantificado e a sua integridade foi analisada num gel de agarose. PCR em tempo real:

Efectuou-se transcrição inversa de ARN total (2 yg) de linfócitos B seleccionados do doente de lúpus relativamente a indivíduos saudáveis em 100 μΐ de mistura reaccional, utilizando reagentes padrão de transcrição inversa Taqman (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). Estabeleceram-se reacções de PCR utilizando uma mistura de primário de PCR de verde SYBR de Applied Biosystems. Incorporaram-se iniciadores de CS1 na mistura para analisar os níveis de expressão de CS1 em ADNc de doente de lúpus e de indivíduos saudáveis. Os iniciadores de CS1 foram concebidos a partir de sequências publicadas (número de acesso Genbank XM-001635, 101 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ AF390894). Utilizaram-se iniciadores de -actina e ARNr 18S como controlos para normalização. Os iniciadores foram concebidos utilizando o utilitário Primer Express adquirido a Applied Biosystems. Os produtos de PCR amplificados foram de 85 pb para os iniciadores CS1, 84 pb para os iniciadores de -actina e 61 pb para os iniciadores de ARNr 18S. Efectuou-se PCR em tempo real num sistema GeneAmp 57 00 SDS de Applied Biosystems, utilizando o protocolo recomendado. PCR em tempo real de novo Ly9 de ratinho:

Efectuou-se transcrição inversa de ARN total (2 pg) a partir de conA, LPS e amostras não estimuladas em 100 μΐ de mistura reaccional, utilizando reagentes padrão de transcrição inversa Taqman (Applied Biosystems). Estabeleceu-se uma reacção de PCR utilizando uma mistura de primário de PCR de verde SYBR de Applied Biosystems. Conceberam-se iniciadores específicos para novo Ly9 de ratinho a partir da sequência publicada (número de acesso Genbank AF467909) e incorporaram-se na mistura para analisar os níveis de expressão em amostras de ADNc estimulado relativamente a não estimulado. Utilizaram-se iniciadores de ARNr 18S para normalização. Os iniciadores foram concebidos utilizando o utilitário Primer Express adquirido a Applied Biosystems. Os produtos amplificados por PCR foram de 65 pb para os iniciadores de Ly9 de ratinho e de 61 pb para os iniciadores de ARNr 18S. Efectuou-se PCR em tempo real num sistema de detecção de sequência GeneAmp 5700 de Applied Biosystems, utilizando o protocolo recomendado.

Ensaios de micromatriz: preparação de amostra, marcação de microchips e impressões digitais

Determinaram-se os perfis de expressão de populações de leucócitos activados e não activados e analisaram-se utilizando chips de gene. A micromatriz de oligonucleótidos preparada especialmente Affymetrix GeneChip® permite a interrogação de aproximadamente 35000 produtos de transcrição de ARNm únicos. 102 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Isolou-se ARN e efectuou-se análise em chip de gene tal como descrito (Consultar Henshall et al. (2003) Câncer Research 63:4196-4203; Henshall et al. (2003) Oncogene 22:6005-12; Glynne, et al. (2000) Nature 403:672-676; Zhao, et al. (2000) Genes Dev. 14:981-993. • Purificação de ARNm poli A+ a partir de ARN total ou ARN total limpo com o kit RNEASY® (purificação de ARNm poli A+ a partir de ARNm total) de Qiagen

Aqueceu-se a suspensão oligotex a 37 °C e misturou-se imediatamente antes de adicionar ao ARN. Incubou-se o tampão de eluição a 7 0 °C. Note-se que se pode aquecer o tampão de ligação 2 x a 65 °C se aparecer um precipitado no tampão. Misturou-se ARN total com água tratada com DEPC, tampão de ligação 2 x e Oligotex, de acordo com a tabela 2 da página 16 do manual Oligotex. Incubou-se a mistura durante 3 minutos a 65 °C e seguidamente incubou-se durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Centrifugaram-se os tubos durante 2 minutos de 14000 a 18000 g. Note-se que caso a centrífuga tenha uma especificação "suave", esta deve ser utilizada. Removeu-se o sobrenadante sem perturbar o sedimento Oligotex. Pode deixar-se uma pequena quantidade de solução para reduzir as perdas de Oligotex. Deve guardar-se o sobrenadante até estar seguro de ter ocorrido ligação e eluição satisfatórias de ARNm poli A+.

Ressuspendeu-se suavemente o sedimento em tampão de lavagem OW2 e pipetou-se para a coluna de centrifugação. Centrifugou-se a coluna de centrifugação à velocidade máxima (se possível com especificação suave) durante 1 minuto. Após centrifugação, transferiu-se a coluna de centrifugação para um novo tubo de recolha e ressuspendeu-se suavemente em tampão de lavagem OW2 e recentrifugou-se tal como aqui descrito.

Transferiu-se a coluna de centrifugação para um novo tubo e eluíu-se com 20 a 100 μΐ de tampão de eluição pré-aquecido 103 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ (70 °C). Ressuspendeu-se suavemente a resina Oligotex pipetando e dispensando e seguidamente centrifuga-se, tal como anteriormente. Repetiu-se o procedimento de eluição com tampão de eluição fresco. Caso contrário, caso seja necessário um volume de eluição pegueno, pode utilizar-se apenas o primeiro eluato.

Leu-se a absorvância, utilizando tampão de eluição diluído como branco. • Precipitação com etanol

Antes de proceder à síntese de ADNc, precipitou-se o ARNm. Alguns resquícios de componentes ou no tampão de eluição do procedimento de purificação com Oligotex inibirão as reacções enzimáticas do ARNm a jusante.

Adicionou-se ao eluato 0,4 vol. de NH4OAc 7,5 M + 2,5 vol. de etanol a 100% frio. Precipitou-se a solução a -20 °C durante 1 hora até durante a noite (ou 20-30 min. a -70 °C) . Centrifugou-se a solução precipitada a 14000-16000 x g durante 30 minutos a 4 °C. Lavou-se o sedimento com 0,5 ml de etanol a 80% (-20 °C) e seguidamente centrifugou-se a 14000-16000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetiu-se IX a lavagem com etanol a 80%. Secou-se o sedimento na hotte. (Não utilizar SpeedVac). Suspendeu-se o sedimento em H2O DEPC a uma concentração de 1 ug/μΐ. ♦ Limpeza de ARN total utilizando o kit RNeasy da Qiagen Não se deve adicionar mais de 100 pg de ARN a uma coluna RNeasy. Ajustou-se o volume de amostra a 100 μΐ com água isenta de ARNase e adicionou-se à amostra 350 μΐ de tampão RLT e seguidamente 250 μΐ de etanol (100%). Misturou-se a solução por pipetagem (não centrifugar) e seguidamente aplicou-se a amostra a mini-coluna de centrifugação RNeasy. Centrifugou-se a mini-coluna de centrifugação durante 15 s a >10 000 rpm. Caso haja preocupações relativamente ao rendimento, pode reaplicar-se o primeiro eluído à coluna e centrifugar novamente. 104 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Transferiu-se a coluna para um novo tubo de recolha de 2 ml e adicionou-se 500 μΐ de tampão RPE e centrifugou-se durante 15 s a >10 000 rpm. Rejeitou-se o eluido. Adicionou-se novamente 500 μΐ de tampão RPE à mini-coluna de centrifugação e centrifugou-se durante 15 s a >10 000 rpm. Rejeitou-se novamente o eluido, seguidamente centrifugou-se durante 2 min à velocidade máxima para secar a membrana da coluna. Transferiu-se a coluna para um novo tubo de recolha de 1,5 ml e aplicou-se directamente 30-50 μΐ de água isenta de ARNase à membrana da coluna. A coluna foi centrifugada durante 1 min a >10 000 rpm e repetiu-se a eluição.

Efectuou-se uma leitura de absorvância. Caso necessário, pode precipitar-se o eluido com acetato de amónio e 2,5 X volume de etanol a 100%.

Preparação de ADNc utilizando o kit "SUPERSCRIPT® Choice System for cDNA Synthesis" da Gibco • Síntese de ADNc da primeira cadeia

Utilizou-se 5 ug de ARN total ou 1 ug de ARNm poliA+ como material de partida. Para o ARN total, utilizou-se 2 μΐ de SUPERSCRIPT® RT (kit com transcriptase inversa para síntese de ADNc) (para ARNm poliA+, utilize 1 μΐ de SUPERSCRIPT® RT) . O volume final da mistura da síntese de primeira cadeia deve ser 20 μΐ. O ARN deve estar num volume não superior a 10 μΐ. Incubou-se o ARN com 1 μΐ de 100 pmol de oligo T7-T24 durante 10 min a 70 2C. Adicionou-se, em gelo, 7 μΐ de: 4 μΐ de 5X tampão de primeira cadeia, 2 μΐ de DTT 0,1 M e 1 μΐ de mistura dNTP 10 mM. Incubou-se a mistura a 37 2C durante 2 min, seguidamente adicionou-se SUPERSCRIPT® RT.

Incubou-se a mistura a 37 °C durante 1 hora. • Síntese da segunda cadeia

Colocaram-se as reacções da Ia cadeia em gelo. 105 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Adicionou-se à mistura:

91 μΐ de H20 DEPC 30 μΐ de 5X tampão de 2a cadeia

3 μΐ de mistura dNTP 10 mM 1 μΐ de ADN ligase de E. coli a 10 U/ μΐ 4 μΐ de ADN polimerase de E. coli a 10 U/ μΐ 1 μΐ de ARNase H a 2 υ/μΐ

Deve preparar-se a solução anterior numa mistura caso haja mais de 2 amostras. A mistura adicionada foi incubada durante 2 horas a 16 2C.

Adicionou-se 2 μΐ de T4 ADN polimerase e incubou-se adicionalmente durante 5 min a 16 2C. Adicionou-se 10 μΐ de EDTA 0,5 M para parar a reacção. • Limpeza de ADNc

Limpou-se o ADNc utilizando purificação com fenol:clorofórmio:álcool isoamilico (25:24:1) em tubos de gel:

Centrifugaram-se os tubos PLG (gel de bloqueio de fase) durante 30 segundos à velocidade máxima e transferiram-se para um novo tubo PLG. Adicionou-se um volume igual de fenol:clorofórmio:álcool isoamilico e agitou-se vigorosamente (não sujeitar a vórtex). Centrifugaram-se os tubos durante 5 minutos à velocidade máxima. Transferiu-se a camada aquosa do topo para um novo tubo. Precipitou-se a solução aquosa com etanol por adição de 7,5 X NH40ac 5 M e 2,5 X volume de etanol a 100%. Centrifugaram-se imediatamente os tubos à temperatura ambiente durante 20 min, à velocidade máxima. Removeu-se o sobrenadante e lavou-se o sedimento 2X com etanol a 80% frio. Remova tanto quanto possível o etanol de lavagem e seguidamente deixe o sedimento secar ao ar. O sedimento foi ressuspendido em 3 μΐ de água isenta de ARNase. 106 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ • Transcrição in vitro (IVT) e marcaçao com biotina

Pipetou-se 1,5 μΐ de ADNc para um tubo de PCR de paredes finas. Adicionou-se mistura de marcação NTP à temperatura ambiente ao tubo de PCR.

Mistura de marcaçao NTP:

mM) (Ambion mM) (Ambion mM) (Ambion mM) (Ambion mM mM 2 μΐ 2 μΐ 1.5 μΐ 1.5 μΐ 3,75 μΐ 0,75 μΐ 2 μΐ 2 μΐ Τ7 1ΟχΑΤΡ (75 Τ7 lOxGTP (75 Τ7 lOxCTP (75 Τ7 lOxUTP (75 Bio-11-CTP 10 Bio-16-UTP 10 T7 (Ambion) (Ambion) ΙΟχ tampão de transcrição 10χ mistura enzimática T7 O volume final da reacção total foi de 20 μΐ. Os tubos foram incubados durante 6 horas a 37 °C numa máquina de PCR.

Limpeza com RNeasy do produto de IVT Consultar o procedimento anterior. O ARNc marcado é precipitado com etanol e ressuspenso num volume compatível com a etapa de fragmentação. ♦ Fragmentaçao

Fragmentou-se aproximadamente 15 ug de ARN marcado utilizando a seguinte técnica. O volume da reacção de fragmentação foi minimizado para um volume de aproximadamente 10 μΐ, mas não mais de 20 μΐ devido a problemas de precipitação de magnésio com o tampão de hibridação. O ARN foi fragmentado por incubação a 94 °C durante 35 minutos num tampão de fragmentação 1 x.

Tampão de fragmentação 5x:

Tris-acetato, pH 8,1, 200 mM KOAc 500 mM MgOAc 150 mM 107 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ Ο produto de transcrição de ARN marcado foi analisado antes e após fragmentação. As amostras foram aquecidas a 65 °C durante 15 minutos e sujeitas a electroforese em géis de agarose a 1%/TBE para ter uma ideia aproximada da gama de tamanhos dos produtos de transcrição. • Matriz de microchip A matriz de microchip EOS Hu03 utilizada em todas as experiências é uma matriz de oligonucleótidos Affymetric GENECHIP® feita especialmente compreendendo 59680 conjuntos de sondas representativos de 46000 sequências únicas, incluindo tanto os exões conhecidos como os previstos por FGENESH que se basearam no primeiro projecto do genoma humano. Os conjuntos de sondas Hu03 consistem em sondas de emparelhamento perfeito apenas, em que a maioria dos conjuntos de sondas tem 6 ou 7 sondas. • Matriz de hibridação em microchip

Pipetou-se 200 μΐ (10 ug de ARNc) de mistura de hibridação para o chip. Caso se pretenda fazer hibridações múltiplas (tal como ciclos através de um conjunto de 5 chips) é então recomendável preparar uma mistura de hibridação inicial de 300 μΐ ou mais.

Mistura de hibridação: ARN marcado fragmentado (concentração final de 50 ng/μΐ)

oligo de controlo de 948 b, 50 pM

BioB 1,5 pM

BioC 5 pM

BioD 25 pM

CRE 100 pM ADN de esperma de arenque a 0,1 mg/ml BSA acetilada a 0,5 mg/ml até 300 μΐ com tampão de hibridação MES lx.

Os sinais de hibridação foram visualizados utilizando estreptavidina conjugada a ficoeritrina. 108 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ ♦ Normalização dos dados de expressão génica

Os dados de expressão génica foram normalizados por ajuste dos dados de intensidade de nível de sonda de cada matriz a uma distribuição fi^autilizando uma função inversa para mapear a distribuição cumulativa empírica de intensidades à distribuição pretendida. Este procedimento é semelhante a outros procedimentos de normalização por chip, tal como fixação da média e DP de cada chip a um valor padrão, excepto por ser mais rigoroso, já que fixa a distribuição de intensidades completa, em vez de um ou dois parâmetros. O objectivo da normalização por chip é remover variações entre chips, assumindo que tal é atribuível a factores não biológicos, i.e. ruído técnico. O parâmetro de escala para a distribuição foi escolhido para obter uma distribuição com um valor médio arbitrário de 300 e escolheu-se um parâmetro de forma de 0,81 para reproduzir a forma típica da distribuição empírica verificada em amostras boas.

Calculou-se uma única medida de intensidade média para cada conjunto de sondas utilizando a trimédia de Tukey da intensidade das sondas constituintes. A trimédia é uma medida da tendência central que é resistente aos efeitos de valores isolados. Finalmente aplicou-se uma subtracção de linha de base a cada medida de intensidade média para corrigir a hibridação não específica. A medida da intensidade média de um conjunto de sondas "nulo" consistindo em 491 conjuntos de sondas com sequência misturada foi subtraída de todos os outros conjuntos de sondas no chip.

Protocolo de marcação aqui proporcionado Reacção de hibridação:

Início com IVT não biotinilado (purificado em colunas RNeasy) (consultar o exemplo 1 para as etapas de tecido a IVT) ARN anti-sentido IVT; 4 pg: μΐ

Hexâmeros aleatórios (1 pg/pl): 4 μΐ H20: μΐ

Volume total: 14 μΐ 109 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Incubar a 70 °C, 10 min. Colocar em gelo.

Transcrição inversa:

Tampão de primeira cadeia (BRL) 5X: DTT 0,1 M: Mistura dNTP 50X: H20: Cy3 ou Cy5 dUTP (1 mM): SS RT II (BRL): Volume total: 6 μΐ 3 μΐ 0,6 μΐ 2,4 μΐ 3 μΐ 1 μΐ 16 μΐ - Adicionar à reacção de hibridação. - Incubar 30 min., 42 °C. - Adicionar 1 μΐ de SSII e deixar em repouso durante mais uma hora.

Colocar em gelo. - mistura dNTP 50X (dATP, dCTP e dGTP frio 25 mM, dTTP 10 mM: 25 μΐ de cada dATP, dCTP e dGTP 100 mM; 10 μΐ de dTTP 100 mM para 15 μΐ de H20)

Degradação de ARN: - Adicionar 1,5 μΐ de NaOH 1 M/EDTA 2 mM, incubar a 65 °C, 10 min. H20 86 μΐ

NaOH 10 N 10 μΐ EDTA 50 mM 4 μΐ U-Con 30 500 μΐ de TE/amostra centrifugar a 7000 g durante 10 min, guardar o eluído para purificação

Purificação em Qiagen:

- Suspender o material recuperado de u-con em 500 μΐ de tampão PB - Efectuar o protocolo Qiagen normal Digestão com ADNase: - Adicionar 1 μΐ de uma diluição 1/100 de ADNase/30 μΐ de reacção e incubar a 37 °C durante 15 min. - 5 min a 95 °C para desnaturar a enzima 110 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Preparação da amostra: - Adicionar: ADN Cot-1: 10 μΐ dNTP 50X: 1 μΐ _SSC 20X: 2,3 μΐ

Pirofosfato de Na: 7,5 μΐ ADN de esperma de arenque a 10 mg/ml 1 μΐ de diluição 1/10 Volume final: 21,8 μΐ - Secar em SpeedVac. - Ressuspender em 15 μΐ de H2O. - Adicionar 0,38 μΐ de SDS a 10%. - Aquecer a 95 °C, 2 min. - Arrefecer lentamente até à temperatura ambiente durante 20 min.

Colocar numa lâmina e hibridar durante a noite a 64 °C. Lavagem após a hibridação:

SSC 3X/SDS a 0,03%: 2 min. 37,5 ml de SSC 20X + 0,75 ml de SDS a 10% em 250 ml de H2O SSC IX: 5 min. 12,5 ml de SSC 20X em 250 ml de H20 SSC 0,2X: 5 min. 2,5 ml de SSC 20X em 250 ml de H2O Secar as lâminas na centrífuga, 1000 RPM, 1 min.

Rastreie utilizando as especificações adequadas para o tubo fotomultiplicador e canais de fluorescência. CS1 é sobre-expressa em leucócitos mas não em vários tipos de tecidos não linfóides

Para avaliar o perfil de expressão de CS1, analisou-se ARNm isolado de leucócitos e outros tecidos por PCR em tempo real. Tal como apresentado na figura 2A, o nível de expressão de ARNm foi muito superior em leucócitos do que na maioria dos outros tecidos adultos normais. Outros tecidos de adulto normais que não apresentaram expressão de CS1 superior aos níveis de base incluem tecido adiposo, glândula supra-renal, aorta, válvula aórtica, apêndice, artéria coronária, bexiga, osso, medula óssea, peito, brônquio, cérvix, cérebro, espinal-medula, diafragma, endométrio, epidídimo, esófago, vesícula biliar, gânglio, coração, laringe, lábio, fígado, pulmão, 111 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ músculo, miométrio, nervo vago, omento, mucosa oral, ovário, pâncreas, paratiróide, mucosa da faringe, placenta, próstata, retina, glândula salivar, pele, estômago, sinóvia, testículo, timo, tiróide, língua, traqueia, cordão umbilical, uréter, útero, vagina ou veia. 0 ARNm de CS1 foi expresso em amostras seleccionadas de cólon (2/11), rim (1/20), intestino delgado (1/3), baço e amígdala (2/4). Os resultados indicam que CS1 é expressa principalmente em leucócitos e deve ser um bom alvo para doenças auto-imunes. A expressão de CS1 aumenta em populações de leucócitos com activação múltipla

Para avaliar a correlação entre a expressão de CS1 e a activação de leucócitos, analisou-se a expressão de ARNm de CS1 em populações de leucócitos com activação múltipla e não activados. Tal como apresentado na figura 2B, a expressão de CS1 aumentou em células B activadas, células DC maduras, células CD3 activadas (aumento baixo a moderado), células CD4 activadas (baixo aumento de nível) e células CD8 activadas (aumento baixo a moderado, dependendo do dador) em comparação com as suas populações correspondentes de controlo não activadas. Estes resultados indicaram que a sobrexpressão de CS1 está correlacionada com a activação de vários subconjuntos de leucócitos.

Exemplo 3: Produção de antigénios para gerar anticorpos monoclonais contra CS1

Cl onagem:

Isolou-se o domínio extracelular (ECD) de CS1 a partir de células Raji, utilizando iniciadores que flanqueiam o domínio extracelular de CS1 (CS1 ECD). O produto de PCR foi purificado em gel e ligado a um vector que codifica a região constante de IgG3 (Fc- 3 humano). Purificou-se o plasmídeo contendo CS1 ECD-Fc 3 em alta escala e confirmou-se por sequenciação de ADN. 112 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Transfecção estável de CS1 ECD-Fc :3

Linearizou-se 50 pg de plasmídeo CS1 ECD-Fc 3 com enzima Fspl e precipitou-se o ADN com etanol, lavou-se e ressuspendeu-se em 500 μΐ de PBS estéril. Lavaram-se duas vezes células NSO em PBS frio e ressuspenderam-se a 2 x 107 por um ml de PBS. Utilizou-se uma quantidade de 1 x 107 células para transfecção.

Combinaram-se 500 μΐ de células NSO com 500 μΐ de ADN em PBS. Sujeitaram-se as células a electroporação a 1,5 V e 3 pF com um gerador de impulsos BioRad Gene. Adicionaram-se as células a 100 ml de meio completo DMEM e plaquearam-se para dez placas de 96 poços. Adicionou-se meio de selecção micofenólico a 1 pg/ml 24 horas após a transfecção.

Rastrearam-se os produtos de transfecção positivos após o dia 10 e expandiram-se para placas de 48 e 24 poços. Os produtos de transfecção positivos foram novamente rastreados e os produtores de alto nível foram expandidos para purificação de proteína.

Purificação de proteína CS1 ECD-Fc :3

Expandiram-se os produtos de transfecção estáveis que expressam a proteína de fusão CS1 ECD Fc 3 para 600 ml de meio completo DMEM com aditivos de glicose durante cinco dias. A proteína de fusão foi purificada numa coluna de proteína G Sepharose e dialisada contra lx PBS. Analisaram-se as formas reduzidas e não reduzidas de CS1 ECD-Fc 3 por Coomassie. Analisou-se também CS1 ECD Fc 3 por hibridação"Western" utilizando anti-HuIgG e confirmou-se por sequenciação do terminal N. Utilizou-se a proteína de fusão CSl-Fc- 3 purificada para imunizar ratinhos.

Produção de proteína de fusão CS1 ECD-myc-GPI:

Isolou-se o domínio extracelular (ECD) de CS1 de células Raji, utilizando iniciadores que flanqueiam o domínio extracelular de CS1. O produto de PCR foi purificado em gel e ligado a um vector que expressa o marcador myc e a ligação 113 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ glicosilfosfatidilinositol para expressão de superfície celular (vector myc-GPI). 0 plasmídeo contendo CS1 ECD-myc-GPI foi purificado em larga escala e confirmado por sequenciação de ADN.

Transfecção estável de CS1 ECD-myc-GPI:

Linearizou-se 50 pg de plasmídeo CS1 ECD-myc-GPI com enzima Fspl e precipitou-se o ADN com etanol, lavou-se e ressuspendeu-se em 500 μΐ de PBS estéril. Lavaram-se células NSO duas vezes em PBS frio e ressuspenderam-se a 2 x 108 por um ml de PBS. Utilizou-se uma quantidade de 1 x 108 células para transfecção.

Combinaram-se 500 μΐ de células NSO com 500 μΐ de ADN em PBS. Sujeitaram-se as células a electroporação a 1,5 V e 3 pF com um gerador de impulsos Biorad Gene. Cultivaram-se as células a 37 °C em CO2 a 5% com selecção micofenólica a 1 pg/ml e posteriormente foram subclonadas em placas de 96 poços. Os produtos de transfecção positivos foram rastreados com anticorpo anti-myc. Seleccionaram-se os produtores de alto nível dos produtos de transfecção CS1 ECD-myc-GPI e expandiram-se para ensaios in vitro.

Exemplo 3: Produção de anticorpos monoclonais anti-CSl Imunogénios para CS1 humana:

Utilizou-se a proteína de fusão CS1 ECD- 3 recombinante humana purificada para imunizar ratinhos Balb/c através das almofadas das patas (CS1 ECD refere-se ao domínio extracelular de CS1 descrito anteriormente). Sucintamente imunizaram-se ratinhos nas almofadas das patas traseiras com 10 pg de proteína com um volume igual de adjuvante Ribi num volume total de 25 pl. As imunizações nas almofadas das patas foram efectuadas 4 vezes a intervalos de 4 ou 5 dias. a. Fusão celular:

Sacrificaram-se dois ratinhos imunizados com CS1 ECD- 3. Removeram-se os gânglios femorais poplíteos e linfáticos do 114 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ sacro dos ratinhos. Isolaram-se os linfócitos dos tecidos e geraram-se hibridomas por procedimentos padrão. Sucintamente geraram-se hibridomas através de fusão mediada por polietilenoglicol (PEG) 1500 entre linfócitos e uma linha celular de mieloma murino (células NSO). As células fundidas foram plaqueadas para placas de 96 poços a uma densidade de 107 células por placa. A selecção de células fundidas foi efectuada utilizando meio HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). b. Rastreio de hibridomas

Determinou-se a especificidade de anticorpos excretados por hibridomas por um ensaio de ligação baseado em citometria de fluxo (FACS) para células que expressam CS1. Efectuou-se o ensaio FACS utilizando protocolos padrão. Ressuspenderam-se os produtos de transfecção estável NSO que expressam superficialmente o domínio extracelular de CS1 (2xl05) em 50 μΐ de PBS gelado com 50 μΐ de sobrenadante de cultura de hibridoma em gelo durante 1 hora. Após lavagem extensiva, incubaram-se as células com anticorpos específicos de IgG de cabra anti-ratinho conjugados com ficoeritrina durante 1 hora em gelo. Lavaram-se novamente as células e detectaram-se os anticorpos ligados à superfície celular por FACS utilizando um FACScan Becton Dickinson. Tal como apresentado na tabela 1, os anticorpos: Luc2, Luc3, Lucl5, Luc20, Luc22, Luc23, Luc29, Luc32, Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc39, Luc56, Luc60, Luc63 ou Luc90 ligaram-se fortemente às células NSO-CS1 transfectadas com CS1, mas não a NSO-FcRn. Os anticorpos anti-CS1 humanos ligaram-se a células K562 e Daudi (que se sabe que expressam CS1 nativa) mas não às células Jurkat de controlo negativo. Os dados evidenciam que os anticorpos anti-CSl produzidos são capazes de se ligar especificamente a CS1. Também se apresentam na tabela os resultados do ensaio (por ELISA) de ligação de anticorpos Luc à proteína de fusão CS1- 3 relativamente a controlo negativo AR-G3 (proteína de fusão 3). Os anticorpos Luc ligam-se especificamente a CS1-e não ao controlo negativo de proteína de fusão AR- 3. 115 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Tabela 1. MAB anti-CSl humano gerados a partir da fusão 342 Resultados FCAS (MFI) ELISA (captura) MAB NSO-CS1 NSO-FcRn K562 Daudi Jurkat CS1-G3 AR-G3 Subclones Ig ISO de ratinho 1 Luc2 162 <5 13, 4 10, 5 <5 1,0 0,2 Luc2-1 IgGl 2 Luc3 377 < 5 25, 7 7,8 < 5 0,9 0,5 Luc3-F IgGl, G2b 3 Lucl5 110 < 5 14,0 12, 4 < 5 1,1 0,3 Lucl5-1 ND 4 Luc20 89 < 5 8,0 12, 6 < 5 1,2 0,2 Luc20-1 ND 5 Luc22 228 < 5 14,7 6,1 < 5 0, 6 0,2 Luc22-1 IgG2b 6 Luc23 164 < 5 19, 6 10, 2 < 5 0, 6 0,2 Luc2 3-1 IgGl 7 Luc2 9 86 < 5 24,1 11, 9 < 5 0,9 0,2 Luc29-D6, C8 IgGl 8 Luc32 201 < 5 9,8 10, 7 < 5 0,8 0,2 Luc32-1 IgG2b 9 Luc34 127 < 5 26,2 10, 3 < 5 1,2 0,3 Luc34-1, 34-3 IgGl 10 Luc35 184 < 5 10, 6 29, 7 < 5 0,7 0,2 Luc35-1 IgG2a 11 Luc37 366 < 5 12,8 7,2 < 5 0, 6 0,2 Luc37-C12,Fll IgG2b 12 Luc38 112 < 5 31,4 11, 6 < 5 0,8 0,2 Luc38-1 IgG2b 13 Luc39 117 < 5 12,0 17, 5 < 5 0,4 0,2 Luc39-E10 IgG2a 14 Luc56 132 < 5 12, 6 9,7 < 5 1,0 0,2 Luc56-1 IgG2a 15 Luc60 230 < 5 14, 6 10, 4 < 5 0,9 0,3 Luc60-2 IgG2b 16 Luc63 214 < 5 15, 8 12, 7 < 5 0, 6 0,2 Luc63-1 IgG2a 17 Luc90 237 < 5 9,7 10, 1 < 5 0,8 0,1 Luc90-Hl, D9 IgG2b Controlo ISO 14 3 5, 41 6, 02 < 5 0,16 0,14 Anti-Myc 193 335 6, 62 6, 85 < 5 0,19 0,15

Sequências de aminoácidos dos anticorpos anti-CSl monoclonais produzidos

Clonaram-se as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo utilizando técnicas padrão. Sucintamente, utilizou-se o ARN total de 1-5 x 106 células para preparar ADNc utilizando um kit de amplificação de ADNc SMART RACE (BD Biosciences Clontech) e amplificaram-se por PCR as regiões variáveis utilizando iniciadores específicos de gene complementares às regiões constantes da cadeia leve e pesada de ratinho.

As sequências de aminoácidos da cadeia pesada madura e da cadeia leve madura dos anticorpos Luc90, Luc63 e Luc34 apresentam-se na tabela 4. 116 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Exemplo 4: Caracterização de anticorpos CS1

Utilizou-se um ensaio competitivo por citometria de fluxo para determinar a especificidade de epítopo de 15 anticorpos monoclonais anti-CSl diferentes. Incubaram-se produtos de transfecção estável com NSO que expressam CS1 de superfície (2xl05) em gelo durante 1 hora com 50 μΐ de anticorpos anti-CSl, incluindo combinações em pares de Luc23, Luc29 Luc34, Luc35, Luc37, Luc38, Luc63 e Luc90. Paralelamente, utilizou-se anticorpo de controlo de isotipo (AIP-13) como controlo negativo. Incubaram-se anticorpos monoclonais anti-CSl (Luc23, Luc34, Luc37, Luc38, Luc63 e Luc90) biotinilados a 1 yg/ml com a mistura célula/anticorpo durante mais 30 minutos em gelo. Após lavagem extensa, incubaram-se as células com estreptavidina conjugada com ficoeritrina durante 1 hora em gelo. Lavaram-se as células e detectaram-se anticorpos biotinilados ligados à superfície celular por FACS utilizando um FACScan Becton Dickinson.

Ensaiaram-se os anticorpos não marcados: Luc23, Luc34, Luc37, Luc38, Luc63 e Luc90 quanto à sua capacidade para competir uns com os outros a uma concentração de 15 pg/ml, 3 pg/ml e 0,6 pg/ml e adicionaram-se os anticorpos de competição ou de bloqueio a 1 pg/ml. Utilizou-se AIP-13 como controlo negativo, dado que este anticorpo não se liga a CS1, nem compete com qualquer dos anticorpos Luc. Apresenta-se na figura o nível de fluorescência (intensidade de fluorescência média) (MFI) dos anticorpos biotinilados. Uma diminuição significativa da MFI indica competição para CS1 de superfície celular de MAB anti-CSl biotinilado relativamente a Mab anti-CSl não marcado, pelo menos de 50% comparativamente com a MFI do anticorpo de controlo. A figura 3 apresenta um exemplo de um resultado dos ensaios competitivos entre os anticorpos Luc quando se utilizam anticorpos monoclonais Luc de bloqueio a uma concentração de 15 pg/ml e 3 mg/ml. Os ensaios competitivos indicaram que vários dos anticorpos Luc contactam epítopos distintos. Luc38 contacta um epítopo distinto dos epítopos de 117 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Luc37, Luc23, Luc90 e Luc63. Luc63 contacta um epítopo separado não sobreponível que é distinto dos epítopos de Luc37, Luc23, Luc90 e Luc38. Luc90 contacta um epítopo diferente não sobreponível distinto dos epítopos de Luc37, Luc23, Luc63 e Luc38. Luc 23 contacta outro epítopo não sobreponível, distinto dos epítopos de Luc90, Luc63 e Luc38. Luc37 contacta um epítopo não sobreponível adicional, distinto dos epítopos contactados por Luc90, Luc63 e Luc38. Luc63 contacta um epítopo que se sobrepõe com o epítopo de Luc34 e Luc90 contacta um epítopo que se sobrepõe com Luc34. Luc37 contacta um epítopo que se sobrepõe ao epítopo de Luc23. Luc34 bloqueia ou diminui significativamente a ligação de todos os anticorpos Luc e pode contactar um epítopo vasto e exposto ou pode apresentar uma afinidade mais elevada para com CS1. Luc37, Luc23 e Luc38 não bloqueiam a ligação a CS1 pelo anticorpo Luc34. Os epítopos para Luc37, Luc23 e Luc38 podem estar "submersos" na estrutura secundária de CS1 ou a afinidade para com CS1 pode ser inferior à afinidade do anticorpo Luc34.

As afinidades relativas dos três anticorpos monoclonais foram também ensaiadas por análise em Biacore. Efectuaram-se análises cinéticas de MAb de CS1 por medições SPRKinetics entre proteína de fusão CSl-Fc humana e anticorpos monoclonais de ratinho anti-CSl humana Luc34.1, 63.2 e 90H1 utilizando BIAcore 2000 (BIAcore, Suécia). As condições de regeneração foram estabelecidas por imobilização de mais de 10 000 RU de cada anticorpo em diferentes células de fluxo e injectando CSl-Fc ao longo da superfície, seguido por ensaio de uma série de diferentes tampões até se encontrar o melhor para optimizar a depuração de CSl-Fc de cada anticorpo. Verificou-se que um tampão de glicina 10 mM, pH 2,0 é um óptimo tampão de regeneração e foi imediatamente ensaiado para a sua reprodutibilidade ao longo de 10 ciclos de injecção de CSl-Fc e regeneração de tampão. Verificou-se que o tampão é adequado para regenerar a superfície de anticorpo reprodutivelmente. Assim, utilizou-se glicina 10 mM, pH 2,0 como o tampão de regeneração para as experiências de Biacore com CSl-Fc e anticorpo. 118 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ Ο anticorpo CS1 produzido no presente laboratório foi imobilizado a baixas unidades de resposta (RU) na gama de 99,4 RU a 133,7 RU no chip sensor CM5 de qualidade para investigação pelos agentes de acoplamento de amina da BIAcore (N-etil-N'-dimetilaminopropilcarbodiimida, EDC; N-hidroxis-succinimida, NHS; e etanolamina HC1, pH 8,5). Efectuaram-se os ensaios a um caudal de 30 ul/min à temperatura ambiente. Após uma fase de associação de CSl-Fc de três minutos, seguiu-se uma injecção de dez minutos de tampão de corrida (Hepes 10 mM, cloreto de sódio 300 mM, EDTA 3 mM, P-20 a 0,05%, pH 7,4) para monitorizar a dissociação para cada ciclo de ligação, com diferentes concentrações de CSl-Fc por ciclo. A superfície de regeneração foi regenerada com glicina 10 mM, pH 2,0. Calculou-se a cinética de ligação de cada par CSl-Fc e anticorpo a partir de uma análise global dos dados de sensorgrama recolhidos a doze concentrações diferentes de CSl-Fc (1024 nM, 512 nM, 256 nM, 128 nM, 64 nM, 32 nM, 16 nM, 8 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM) em duplicado, utilizando o programa BIAevaluate. Aplicou-se referenciação dupla em cada análise para eliminar respostas de ruído de fundo da superfície de referência e do controlo apenas com tampão. A afinidade de ligação (KD) foi obtida por ajuste simultâneo das fases de associação e dissociação do sensorgrama da série de concentrações de analito, utilizando o modelo de analito bivalente do utilitário BIAevaluate. A experiência foi efectuada três vezes para estudar o desvio padrão dos dados.

As afinidades de ligação de Luc 90.Hl, Luc63.2 e Luc43.1 encontram-se resumidas na figura 4. Luc90.Hl apresenta a afinidade de ligação mais elevada entre estes três anticorpos. A afinidade de ligação de Luc90.Hl é 5,5 vezes superior à de Luc63.2 e 28 vezes superior à de Luc34.1. 119 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Coloração imuno-histológica com anticorpos anti-CSl:

As células transfectadas com CS1 foram também analisadas por coloração imuno-histológica com anticorpos anti-CSl. Adicionou-se uma quantidade de 10 pg/ml de anticorpo monoclonal anti-CSl primário às células transfectadas com CS1. As células foram então bloqueadas com soro e incubadas com biotina-IgG-anti-ratinho. Misturou-se então avidina-peroxidase com as células e revelou-se com AEC (um reagente padrão de peroxidase). A cor vermelha de AEC indica a coloração positiva enquanto os núcleos das células ensaiadas foram contra-corados com hematoxilina (azul). Os dados indicaram que as células transfectadas com CS1 foram coradas positivamente com os anticorpos anti-CSl, evidenciando que os anticorpos anti-CSl produzidos são capazes de ligarem CS1 expressa na superfície celular (figura 5A) . Assim, os anticorpos anti-CSl são adequados para utilização não só para detectar expressão na superfície de células de sangue periférico em solução, mas também para detecção imuno-histoquímica (IHC), que é tipicamente utilizada para analisar secções de tecido (por exemplo, gânglios linfáticos ou biopsias de tecidos de doentes). A figura 5B apresenta a coloração imuno-histológica de amígdala inflamada com dois anticorpos anti-CSl, Luc90 e Luc63. Os painéis C e D na figura 5B apresentam a coloração com CD138 que cora células de plasma e células epiteliais. Os painéis superiores (figura 5B, painéis A e B) apresentam coloração de secções em série com anticorpos anti-CSl. A partir do padrão de sobreposição de coloração, é evidente que os anticorpos CS1 coram células de plasma em amígdala inflamada. A figura 5C apresenta coloração imuno-histológica de tecido sinovial da articulação de um doente com artrite reumatóide com Luc63 anti-CSl. Ocorreu infiltração de células de plasma na sinóvia tal como se pode constatar pela coloração com CD138 (direita, painel superior). A partir do padrão de sobreposição da coloração (compare o painel superior do lado 120 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ direito com ο painel superior do lado esquerdo), é evidente que os anticorpos anti-CSl coram células de plasma nas articulações de doentes com artrite reumatóide.

Padrão de expressão de proteína CS1: A expressão da proteína CS1 foi analisada adicionalmente com os anticorpos Luc produzidos, através de análise FACS (figura 6) . Isolaram-se PBMC de indivíduos saudáveis e de doentes de lúpus com um procedimento de centrifugação padrão com gradiente Ficoll Hypaque.

Coraram-se PBMC com anticorpos tal como indicado seguindo os procedimentos padrão. Para activação de PBMC com mitogénio de fitolaca (PWM), adicionou-se PWM a uma diluição 1:100 às PBMC, que foram subsequentemente colocadas a 37 °C em CO2 a 7% durante 8 dias. Recolheram-se as células estimuladas com PWM e lavaram-se antes de coloração com anticorpo. Os anticorpos de ratinho anti-CSl aqui utilizados são Luc90 (IgG2b) , Luc63, Luc38 e outros anticorpos Luc anti-CSl produzidos. Os anticorpos de controlo de isotipo foram anticorpos IgG de ratinho com isotipo correspondente.

Os resultados indicaram que CS1 foi expressa positivamente em células B activadas, células T CD8+ (tanto activadas, como virgens) , células NK (CD3-CD56+) , células NKT (CD56+CD3+) , leucócitos CD14+/lo (monócitos e/ou macrófagos) e células T CD4+ (baixo nível em células activadas in vitro) . CSI foi expressa nestas populações celulares tanto em adultos saudáveis como em doentes de lúpus. Não se detectou qualquer expressão significativa de proteína CSI em células T CD4+ não activadas de adultos saudáveis, plaquetas, HuVEC, células renais, células das vias aéreas dos brônquios, células das vias aéreas pequenas, células da próstata, células do fígado e células da mama.

Na figura 6 apresenta-se a coloração de amostra de células B activadas, em que se apresenta a coloração de PBMC activadas com PWM como a linha grossa, e a coloração de 121 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ controlo de isotipo e de PBMC não activadas apresenta-se a linha pontilhada subjacente. 0 padrão de expressão de CS1 é significativo, porque o anticorpo terapêutico idealmente liga-se principalmente às células alvo e não se liga a outras células e tecidos, especialmente plaquetas. Os dados sugerem que os anticorpos anti-CSl são candidatos adequados a anticorpos terapêuticos.

Exemplo 5: Humanização de anticorpos CS1

Este exemplo descreve a humanização do anticorpo monoclonal murino anti-CSl Luc63 (MuLuc63). A humanização de MuLuc63 foi efectuada essencialmente de acordo com o procedimento de Queen, C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033 (1989)). Primeiramente, identificaram-se segmentos de VH e VL humanos com elevada homologia com, respectivamente, as sequências de aminoácidos de VH e VL de MuLuc63. Seguidamente, ligaram-se as sequências de CDR, conjuntamente com os aminoácidos de esqueleto importantes para manter as estruturas das CDR, às sequências de esqueleto humanas seleccionadas. O anticorpo monoclonal humanizado (HuLuc63) resultante foi expresso na linha celular NSO de mieloma de ratinho. O anticorpo humanizado HuLuc63 ligou-se a CS1 recombinante humana num ensaio de ELISA com um valor de EC50 de 70,1 ng/ml, semelhante ao valor de EC50 de 66,1 ng/ml determinado para MuLuc63 no mesmo ensaio, indicando que HuLuc63 manteve elevada afinidade de ligação para com CS1 humana.

Clonagem e sequenciação dos ADNc da região variável de MuLuc63

Extraiu-se ARN total de aproximadamente 5 x 107 células de hibridoma que produzem MuLuc63 utilizando reagente TRIzol (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). Sintetizou-se ADNc em cadeia dupla utilizando o kit de amplificação de ADNc SMART RACE (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) seguindo o protocolo do fabricante. Amplificaram-se os ADNc de região variável das cadeias pesada e leve por reacção de

polimerização em cadeia (PCR) utilizando iniciadores 3' que hibridam respectivamente com as regiões de ratinho da cadeia C 122 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ gama e capa e um iniciador universal 5' proporcionado no kit de amplificação de ADNc SMARTRACE. Para PCR de VH, o iniciador 3' tem a sequência 5'-AGCTGGGAAGGTGTGCACAC-3' (SEQ ID N0:51). Para PCR de VL, o iniciador 3' tem a sequência 5'-TTCACTGCCATCAATCTTCC-3' (SEQ ID NO:52). Subclonaram-se os ADNc de VH e VL no vector pCR4Blunt-T0P0 (Invitrogen

Corporation, Carlsbad, CA) para determinação de sequência. A sequenciação de ADN foi efectuada por reacções de sequenciação de ciclo de PCR com terminadores de cadeia didesóxido fluorescentes (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Sequenciaram-se quatro clones de plasmideo para cada uma das cadeias pesada e leve. Identificaram-se sequências únicas homólogas à região variável típicas de cadeias pesada e leve de ratinho. As sequências de aminoácidos deduzidas do ADNc das regiões V de cadeia pesada e leve de MuLuc63 apresentam-se nas tabelas 5 e 6.

Concepção de regiões V de HuLuc63 A humanização de regiões V de anticorpo foi efectuada tal como geralmente descrita por Queen, C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989)). Primeiramente, construiu-se um modelo molecular das regiões variáveis de MuLuc63 com a ajuda dos programas de computador ABMOD e ENCAD (Levitt, M., J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983)). Seguidamente, com base na busca de homologia contra sequências de ADNc de anticorpos humanos, seleccionou-se a sequência de VH humana B55 3-14 (Cuisinier et al, Eur. J. Imm. 23:110-118 (1993)) e o segmento J, JH1 (Ravetch, J.V. et al, Cell 27: 583-591 (1981)), para proporcionar os esqueletos para a região variável da cadeia pesada de HuLuc63. Para a região variável da cadeia leve de HuLuc63, utilizou-se a sequência de ADNc de VL m-2R (Manheimner-Lory et al, J. Exp. Med. 174:1639-1652 (1991)). A identidade dos aminoácidos de esqueleto entre VH de MuLuc63 e dos esqueletos humanos aceitadores foi de 81,6% (71/87), enquanto a identidade entre VL de MuLuc63 e os esqueletos humanos aceitadores foi de 76,3% (61/80) . 123 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Nas posições de esqueleto em que o modelo computacional sugeriu contacto significativo com as CDR, os aminoácidos de esqueleto humano originais foram substituídos pelos aminoácidos das regiões V de MuLuc63. Tal foi efectuado nos resíduos 28, 48, 49, 66 e 68 da cadeia pesada (tabela 7). Para a cadeia leve, a substituição foi efectuada no resíduo 60 (tabela 8). Note-se que o sistema de numeração aqui utilizado é o de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Adicionalmente, a inspecção da sequência de aminoácidos de MuLuc63 revelou um local para potencial glicosilação ligada a N em CDR2 da região VH. Tais locais de glicosilação ligada a N têm a sequência geral N-X-T/S (em que N = asparagina, X = qualquer aminoácido e S/T = serina ou treonina) . Dado que a presença de locais de glicosilação ligada N no domínio variável poderia ter efeitos indesejáveis durante o desenvolvimento de HuLuc63 como um anticorpo terapêutico, o potencial local de glicosilação em CDR2 (N-Y-T) foi eliminado por substituição de treonina com mutação de alanina (N-Y-A) na concepção humanizada.

Os alinhamentos das sequências de aminoácidos de VH e VL de MuLuc63, HnLuc63 e do aceitador humano apresentam-se nas tabelas 7 e 8, respectivamente.

Construção dos genes de VH e VL de HuLuc63

Concebeu-se um gene que codifica cada VH e VL de HuLuc63 como um mini-exão incluindo um péptido de sinalização, um sinal de dador de splicing e locais adequados de enzimas de restrição para subsequente clonagem num vector de expressão de mamífero. Os sinais de dador de splicing nos mini-exões de VH e VL foram derivados das sequências JH6 e JK4, respectivamente, da correspondente linha germinal humana. As sequências de péptido de sinalização nos mini-exões de VH e VL de HuLuc63 foram derivadas das sequências VH e VL correspondentes de MuLuc63, respectivamente. As sequências de 124 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ aminoácidos deduzidas dos genes de VH e VL de Luc63 apresentam-se nas tabelas 5 e 6.

Os genes VH e VL de HuLuc63 foram construídos por extensão de oligonucleótidos sintéticos com sobreposição na gama de comprimento de 33 a 43 bases e amplificação por PCR. (Stemmer et al, Gene 164:49-53 (1995)). Apresenta-se na tabela 9 uma lista dos oligonucleótidos para a síntese dos genes de VH e VL de HuLuc63.

Os fragmentos amplificados por PCR foram purificados com o kit de purificação de PCR Qiaquick (Qiagen) e digeridos com MluI e Xbal. 0 gene de VH de HuLuc63 foi subclonado em pHuHCgl.D para criar o plasmídeo pHuHCgl.D-HuLuc63. 0 gene de VL de HnLuc63 foi subclonado em pHuCkappa.rgpt.dE, um derivado do vector de expressão de cadeia leve capa pOKT3.Vk.rg (Cole, M.S. et al. J. Immunol. 159:3613-3621 (1997)), para criar o plasmídeo pHuCkappa.rgpt.dE-HuLuc63.

Expressão de HuLuc63

Produziu-se o anticorpo HuLuc63 IgGl/ por transfecção transitória de células em cultura de tecido. Manteve-se a linha celular de rim embrionário humano 293-H (Invitrogen,

Carlsbad, CA) em DMEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) contendo FBS a 10% (HyClone, Logan, UT) e aminoácidos não essenciais (Invitrogen). Plaquearam-se células 293-H a lxlO6 células por poço num volume de 2,5 ml, numa placa de 6 poços, no dia anterior à transfecção utilizando meio regular (DMEM + FBS a 10% + aminoácidos não essenciais) . No dia da transfecção, diluiu-se 4 pg de ADN de plasmídeo por poço em 250 μΐ de Hibridoma-SFM (H-SFM, Invitrogen). Diluiu-se 10 μΐ de reagente de lipofectamina 2000 (LF2000, Invitrogen) por poço em 250 μΐ de H-SFM. Combinou-se o ADN diluído com LF2000 diluído e incubou-se durante 20 minutos para permitir a formação de complexos ADN-LF2000. Adicionou-se 500 μΐ de complexos ADN-LF2000 a cada poço e misturou-se por agitação da placa. Incubaram-se as células durante 5 dias antes da recolha de sobrenadante para análise. 125 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Mediu-se a expressão de HuLuc63 por ELISA em sanduíche. Revestiram-se placas Immulon 4 HBX (Thermo Labsystems,

Franklin, MA) durante a noite a 4 °C com 100 μΐ/poço de anticorpos policlonais de cabra específicos anti-cadeia Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) a 1,8 yg/ml em tampão de carbonato de sódio- bicarbonato 0,2 M, pH 9,4, lavaram-se com tampão de lavagem de PBS contendo Tween 20 a 0,1%) e bloquearam-se durante 30 min à temperatura ambiente com 150 μΐ/poço de tampão de bloqueamento SuperBlock em TBS (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) .

Após lavagem com tampão de lavagem, diluíram-se adequadamente as amostras contendo HuLuc63 em tampão de ELISA (PBS contendo BSA a 1% e Tween 20 a 0,1%) e aplicou-se 100 μΐ/poço às placas de ELISA. Como padrão utilizou-se anticorpo monoclonal humanizado anti-CD33 IgGl/ , HuM195 (Co, M.S.et ai., J. Immunol., 148: 1149-1154 (1992). Após incubar as placas

durante 1 h à temperatura ambiente e lavar com tampão de lavagem, detectaram-se os anticorpos ligados utilizando 100 μΐ/poço de uma diluição 1:1000 de anticorpos policlonais de cabra anti-cadeia capa humana conjugados com HRP (SouthernBiotech, Birmingham, AL) . Após incubar durante 1 h à temperatura ambiente e lavar com tampão de lavagem, efectuou-se a revelação da cor por adição de 100 μΐ/poço de substrato ABTS (KPL, Inc., Gaithersburg, MD). Parou-se a revelação de cor por adição de 100 μΐ/poço de ácido oxálico a 2%. Leu-se a absorvância a 415 nm utilizando um leitor de microplacas VersaMax (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA).

Propriedades de ligação de MuLuc63 e HuLuc63

Analisaram-se as afinidades de MuLuc63 e HuLuc63 para com CS — 1 humana por ELISA de ligação directa. Revestiram-se os poços de placas de ELISA de 96 poços (placas Immulon 4 HBX, Thermo Labsystems, Franklin, MA) com 100 μΐ de proteína de fusão CS1 humana solúvel - Fc 3 humana a 1 pg/ml em PBS durante a noite à temperatura ambiente. Após lavagem com tampão de lavagem, bloquearam-se os poços com 150 μΐ de tampão de bloqueamento Superblock durante 30 minutos à temperatura 126 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ ambiente. Diluiu-se adequadamente anticorpo HuLuc63 expresso transitoriamente ou anticorpo MuLuc63 purificado em tampão de ELISA e aplicou-se a placas de ELISA (100 μΐ por poço) . Incubaram-se as placas de ELISA durante 1 hora à temperatura ambiente e lavaram-se os poços com tampão de lavagem. Seguidamente adicionou-se 100 μΐ de anticorpo de cabra anti-C humano conjugado a HRP ou anticorpo de cabra anti-C de ratinho conjugado a HRP (ambos de Southern Biotech) diluídos 1:1000 em tampão de ELISA a cada poço das placas de HuLuC63 e MuLuc63, respectivamente, e incubaram-se à temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavagem com tampão de lavagem, adicionou-se 100 μΐ de substrato ABTS (KPL) a cada poço. Parou-se a revelação de cor por adição de 100 μΐ de ácido oxálico a 2% por poço. Leu-se a absorvância a 415 nm utilizando um leitor de microplacas VERSAmax. Os resultados das experiências de ligação de ELISA apresentam-se na figura 7. MuLuc63 e HuLuc63 ligam-se a CS-l-Fc 3 humana de uma forma dependente da concentração. O valor de ECso de HuLuc63, obtido utilizando o utilitário de computador GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), foi de 70,1 ng/ml. Tal é semelhante ao valor de EC50 de 66, 1 ng/ml obtido para muLuc63, indicando que a humanização do anticorpo monoclonal anti-CSl de ratinho MuLuc63 foi bem-sucedida: HuLuc63 manteve elevada afinidade de ligação para com CS1 humana. Apresenta-se um modelo da região variável de Luc63 humanizado na figura 8.

Exemplo 6: Papel de CS1 em doenças auto-imunes CS1 é altamente expressa em células T e B estimuladas comparativamente com células não estimuladas:

Para determinar a expressão de CS1, estabeleceu-se um ensaio in vitro para estimular linfócitos B e T de sangue periférico, utilizando como estimulantes mitogénio de fitolaca (PWM) e fito-hemaglutinina (PHA). Preparou-se paralelamente um controlo não estimulado de células mononucleares de sangue periférico sem estimulação. Isolou-se ARNm PoliA+ e sintetizou-se ADNc a partir destas amostras utilizando técnicas padrão. Amplificou-se o gene CS1 por PCR utilizando 127 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ iniciadores de oligonucleótidos específicos de CS1 (consultar anteriormente) e quantificou-se a expressão utilizando Biorad Gel Doc 2000. Normalizaram-se as intensidades do sinal com controlo de -actina humana. A análise por PCR em tempo real indicou que CS1 apresentou uma regulação positiva cerca de 23 vezes maior em células B de sangue periférico activadas e uma regulação positiva cerca de 30 vezes maior em linfócitos T de sangue periférico activados, comparativamente com células não estimuladas (figura 9). CS1 é regulada positivamente em linfócitos B de sangue periférico de doentes de lúpus comparativamente com os de adultos saudáveis de idades comparáveis:

Para avaliar a expressão de CS1 em doentes de lúpus comparativamente com indivíduos saudáveis, isolaram-se linfócitos B de sangue periférico por selecção celular de células CD19+ de um doente de lúpus relativamente a um conjunto de adultos saudáveis. Isolou-se ARNm poliA+ e sintetizou-se ADNc utilizando técnicas padrão. A expressão de CS1 foi avaliada por PCR em tempo real utilizando iniciadores de oligonucleótidos específicos para CS1. Os dados de PCR em tempo real indicaram que CS1 é regulada positivamente cerca de 2 vezes em linfócitos B do doente de lúpus comparativamente com indivíduos saudáveis. Após normalização com -actina, o gene CS1 aumentou 2,3 vezes no ADNc de linfócitos B do doente de lúpus comparativamente com o ADNc de indivíduos saudáveis. Quando normalizado com iniciadores de ARNr 18S, CS1 aumentou 1,8 vezes nas respectivas amostras de ADNc (figura 10).

Regulação positiva de novo Ly9 de ratinho em células B activadas e células T activadas: O novo Ly9 de ratinho é um ortólogo proposto de CS1 humana (Tovar et al.r Immunogenetics 54: 394-402 (2002)). Analisou-se a expressão de novo Ly9 de ratinho em células B activadas e células T activadas por PCR em tempo real. Os dados demostraram que o novo Ly9 de ratinho é regulado positivamente em células B activadas e em células T activadas. 128 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Analisou-se a expressão do novo Ly9 de ratinho com um sistema de detecção de sequência ABI GeneAmp 5700 (consultar exemplo 2) . Após normalização com iniciadores de ARNr 18S, o gene Ly9 aumentou 3 vezes no ADNc estimulado com conA e foi regulado positivamente 6 vezes em ADNc estimulado com LPS comparativamente com ADNc esplénico não estimulado.

Regulação positiva de CS1 em tecido de doença inflamatória do intestino A expressão de proteína (s) moduladora (s) de doença inflamatória do intestino (IBD) em tecido de IBD (tanto doença de Crohn, como colite ulcerosa) relativamente a tecido normal foi determinada em matrizes de microchip tal como descrito anteriormente. Interrogaram-se micromatrizes de oligonucleótidos com ARNc derivados de vários tecidos. Mais especificamente, geraram-se ARNc por ensaios de transcrição in vitro (IVT) de nove espécimes de IBD e nove espécimes correspondentes de intestino normal adjacente e 24 amostras de epitélio de cólon. Mediu-se a hibridação de ARNc com as micromatrizes de oligonucleótidos pela intensidade de fluorescência média (AI), que é directamente proporcional ao nível de expressão do gene.

Analisaram-se os dados comparando os níveis de expressão génica em IBD com os de tecidos e órgãos de adulto não patogénicos. CS1 foi um dos genes que se identificou como tendo um aumento significativo na expressão génica em tecido de doen inflamatória do intestino comparativamente com tecido normal. A figura 11 é uma representação gráfica da análise de micromatriz, evidenciando que a expressão génica de CS1 aumenta em colite ulcerosa e em doença de Crohn, comparativamente com células epiteliais de cólon de adulto saudável. Para avaliar adicionalmente a expressão de CS1 em doentes de doença inflamatória do intestino comparativamente com indivíduos saudáveis, desagregaram-se amostras de secções doentes de intestino grosso de 2 doentes de doença de Crohn e 3 doentes de colite ulcerosa relativamente a amostras de 129 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ intestino grosso normal de 3 adultos saudáveis, lavaram-se e colocaram-se em TRIZOL®. Isolou-se ARN total seguindo o protocolo do fabricante. Tratou-se o ARN total com ADNase isenta de ARnase (GenHunter). 0 ARN digerido com ADNase foi extraído com fenol/clorofórmio e precipitado durante a noite com etanol. Lavou-se o ARN com etanol a 75% e dissolveu-se em água isenta de nuclease. Quantificou-se o ARN e analisou-se a integridade do ARN num gel de agarose. Os dados de PCR em tempo real (figura 12) indicaram que CS1 é regulada positivamente 7 vezes e 6 vezes em intestino grosso doente de pacientes de doença de Crohn (n=2) e 13 vezes, 14 vezes e 46 vezes em intestino grosso doente de pacientes de colite ulcerosa (n=3) comparativamente com intestino normal recolhido conjuntamente de indivíduos saudáveis (n=3).

Exemplo 7: Expressão de CS1 em células de cancro Padrão de expressão de proteína CS1: A expressão de proteína CS1 foi analisada adicionalmente com os anticorpos Luc produzidos através de análise FACS. Incubaram-se linhas celulares com anticorpos anti-CSl Luc90.Hl ou anticorpos de controlo de isotipo IgG2b de ratinho durante 30 minutos em gelo. Lavaram-se as células com PBS e adicionou-se às células anti-Ig de ratinho conjugado a ficoeritrina (PE) e incubaram-se durante 30 minutos em gelo. Lavaram-se as células e analisaram-se por citometria de fluxo num FACS Caliber (Becton Dickinson). Os gráficos de histograma apresentam-se na figura 13, em que se apresenta o sinal de anticorpos Luc90.Hl como a linha a grosso sobreposta. As linhas subjacentes incluem controlos negativos (células não coradas, anticorpo secundário (anti-Ig de ratinho-PE sem anticorpo primário) ou anticorpo de controlo de isotipo). Estes dados evidenciam que CS1 é expressa em células de linha de leucemia ARH-77, linhas celulares linfoblastóides B CESS e IM9 e linhas celulares de mieloma L363, LP1 e OPM2.

Incubaram-se amostras de doentes com mieloma múltiplo (n=21 amostras de medula óssea), um doente com MGUS (gamopatia monoclonal de significado indeterminado; n=l), um doente com 130 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ leucemia de células de plasma (n=l), células estaminais CD34+ mobilizadas de medula óssea (n=5), células de medula normais (n=3), tecido de gânglio linfático normal (n=l), doentes com leucemia linfoblástica crónica (CLL; n=15), doentes com leucemia mielóide aguda (AML; n=ll), um doente com linfoma não Hodgkin (NHL; n=l) e um doente com linfoma de Hodgkin (n=l) com anticorpos para CS1 (Luc90 ou Luc63) conjugados com FITC, CD45-PerCP, CD38-PE e/ou CD138-PE e processaram-se tal como descrito detalhadamente anteriormente para análise FACS de células de mieloma (consultar figura 14) . Os anticorpos anti-CS1 de ratinho aqui utilizados são Luc90 (IgG2b), Luc63 (IgG2a), Luc38 (IgG2b) e outros anticorpos Luc anti-CSl produzidos. Os anticorpos de controlo de isotipo foram anticorpos IgG de ratinho com isotipo correspondente.

Obtiveram-se aspirados de medula óssea de vários doentes de mieloma de Cleveland Clinic. Coraram-se linhas celulares de mieloma (LP1, L363, OPM2, NCI-H929, RPMI 8226 e U266 Bl), a linha celular de leucemia ARH-77, linhas linfoblastóides B (IM9, CESS) e células de medula óssea com anticorpos monoclonais anti-CSl relativamente a anticorpos de controlo de isotipo (Becton Dickinson) seguindo um protocolo de coloração padrão. Lavaram-se as células, colocaram-se em tampão de coloração (RPMI, FBS a 10% para células humanas ou DMEM, FBS a 10%) e adicionou-se anti-CSl relativamente a anticorpos de controlo de isotipo a 0,5-1 ug de anticorpo por milhão de células num volume final de 0,1 ml. Para amostras de doentes, lisaram-se eritrócitos e sedimentaram-se as células numa centrífuga e ressuspenderam-se em tampão de coloração. Para anticorpos que não estavam conjugados directamente a FITC, adicionaram-se anticorpos de segundo estágio a 0,5-1 ug de anticorpo por milhão de células num volume final de 0,1 ml. Lavaram-se as células e ressuspenderam-se em tampão de coloração para análise FACS num FACSCaliber Becton Dickinson utilizando o utilitário CellQuest. Para distinguir as células de plasma, coraram-se as células de medula óssea de mieloma múltiplo com anticorpos monoclonais anti-CD45, anti-sindecano-1 (CD138) e anti-CD38. Anti-sindecano-1 (CD138) cora especificamente células de plasma e não outros leucócitos. 131 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Os resultados evidenciam que CS1 é altamente expressa em células de plasma (eg células CD138+) de doentes de mieloma múltiplo (figuras 14A-14H), células de plasma de um doente de leucemia de células plasmáticas (figura 141) e em várias linhas celulares de mieloma (L363, LP1 e 0PM2; consultar figura 13). Ensaiaram-se um total de 21 amostras diferentes de medula óssea de doentes de mieloma múltiplo por fluxo e, em todas as 21 amostras, virtualmente todas as células de plasma de medula óssea expressam CS1. CS1 também é expressa em células de leucemia ARH-77 e linhas celulares linfoblastóides B (IM9 e CESS) (consultar figura 13).

Exemplo 8 - Expressão de CS1 em células de plasma de doente de mieloma

Coraram-se amostras de medula óssea de um doente de mieloma múltiplo com CD138-PE, CD45PerCP, Luc90-FITC e/ou IgG2b-FITC (anticorpo de controlo de isotipo) e analisaram-se por FACS tal como descrito detalhadamente anteriormente (consultar exemplo 5) . As células canalizadas são as seguintes: canal RI contém linfócitos ("Rl"), canal R2 contém monócitos ("R2"), canal R3 contém granulócitos ("R3"), canal R4 contém células eritróides ("R4"), canal R5 contém células de plasma ("R5") e canal R6 contém blastos ("R6"). A figura 15 evidencia que CS1 é expressa em células de plasma (eg células CD138+) do doente de mieloma múltiplo.

Exemplo 9: 0 anticorpo monoclonal anti-CSl diminui a excreção de IgM por células B de sangue periférico activadas

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico de um adulto normal com um gradiente de Ficoll padrão, incubaram-se com mitogénio de fitolaca a 10 yg/ml (GIBCO/BRL, Inglaterra, Reino Unido) e plaquearam-se numa placa de 24 poços num volume total de 1 ml. Adicionou-se anticorpo monoclonal (anti-CSl humano de ratinho (Luc63) ou de controlo de isotipo IgG de ratinho) aos poços de amostra a 100 pg/ml ou 10 pg/ml. Incubaram-se as células e o anticorpo a 37 °C em CO2 132 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ a 7% durante 8 dias. Isolaram-se os sobrenadantes de cultura e ensaiou-se IgM por ELISA tal como descrito anteriormente. Tal como apresentado na figura 16, o anticorpo Luc63 a 100 pg/ml ou 10 pg/ml (PwLuclOO e PwLuclO, respectivamente) diminuiu a excreção de IgM das células mononucleares de sangue periférico comparativamente com a excreção de IgM por células incubadas com o controlo de isotipo a 100 yg/ml ou 10 pg/ml (PwIglOO e PwIglO, respectivamente) ou sem anticorpo (Pw(-)). 0 anticorpo monoclonal anti-CSl diminui a excreção de IgM por células B de sangue periférico activadas de um doente com doença auto-imune:

Isolaram-se os sobrenadantes de culturas de células mononucleares de sangue periférico tal como descrito detalhadamente anteriormente e ensaiaram-se por ELISA. Revestiram-se placas Immulon-1 com 100 μΐ de anticorpo monoclonal de ratinho anti-IgM humano a 1 pg/ml (n2 de catálogo 05-4900, Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Califórnia) em PBS. Bloquearam-se as placas durante 1 hora com tampão de ELISA (' EB' = PBS + BSA a 0,1% + Tween 20 a 0,05%) . Adicionaram-se os sobrenadantes de cultura a várias diluições (em EB) a 100 μΐ/poço. Incubaram-se os sobrenadantes e IgM humano padrão (n2 de catálogo 009-000-012, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) durante 1-2 horas à temperatura ambiente. Revelou-se o IgM humano capturado com anticorpo policlonal de cabra anti-IgM humano-HRP (n2 de catálogo 2020-05, Southern Biotech Association, Birmingham, Alabama) e substrato HRP, seguindo o protocolo do fabricante.

Visualizou-se IgM ligado por espectrofotometria (DO 405 nm) num leitor de placas de ELISA padrão. Tal como apresentado na figura 17, a quantidade de IgM excretado pelas PBMC do doente de lúpus diminuiu pelo tratamento com anticorpos anti-CSl (Luc90Hl) comparativamente com controlo de isotipo. Um controlo positivo de anticorpo anti-CD2 (GLOl) evidenciou que anti-CSl é ainda mais robusto a reduzir a produção de IgM do que o anticorpo anti-CD2. 133 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ Ο anticorpo monoclonal anti-CSl diminui a produção de IgG por células B de sangue periférico de adultos saudáveis e de doentes de doença auto-imune.

Analisou-se a produção de IgG de células B de sangue periférico de adultos saudáveis e doentes de doença auto-imune (lúpus) de forma análoga à da produção de IgM. Tal como apresentado na figura 18, a produção total por células mononucleares de sangue periférico de adultos saudáveis 9 dias após o tratamento com o anticorpo anti-CSl (Luc90H.l) diminuiu cerca de 23% comparativamente com o isotipo de controlo IgG2b. A produção total de IgG por células mononucleares de sangue periférico de doentes de lúpus 9 dias após o tratamento com anticorpo anti-CSl (Luc90H.l) diminuiu cerca de 56%

comparativamente com o isotipo de controlo IgG2b. As tabelas 3A e B resumem a inibição da produção de IgG por vários anticorpos anti-CSl gerados. Tal como apresentado na tabela 3A, Luc90.Hl reduziu cerca de 40% a produção de IgG por PBMC activadas com lipopolissacárido ou mitogénio de fitolaca. Luc34.1 reduziu cerca de 38% a produção de IgG por PBMC activadas com mitogénio de fitolaca. Tal como apresentado na tabela 3B, Luc 90.Hl reduziu a produção de IgG das PBMC de um adulto saudável e de uma linha de células B maduras (células IM9) em cerca de 48%. Luc 34.1 reduziu a produção de IgG de PBMC de adulto saudável em cerca de 53%. Luc63.2 reduziu a produção de IgG de PBMC e de células IM9 em cerca de 47%.

Destas experiências, é evidente gue Luc 90H.1, Luc34.1 e Luc63.2 são os melhores anticorpos funcionais. A partir de mapeamento de epitopo, Luc90 e Luc63 apresentam epítopos não sobrepostos. 134 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ TABELA 3Α. ANTI-CS-1 DIMINUI A PRODUÇÃO DE IG Por células B activadas in vitro

Diminuição percentual média comparativamente com o controlo de isotipo PBMC activadas in vitro MAB ANTI-CS-1 Diminuição % média HuIgG ± EP Lipopolissacárido Luc90.Hl 41% ±8% (n = 3) Mitogénio de fitolaca Luc 90.Hl 39% ±9% (n = 4) Mitogénio de fitolaca Luc 34.1 38% ±7% (n = 4)

Tabela 3B. Resumo dos ensaios de produção de Ig com o painel de anticorpos anti-CS-1 ALTERAÇÃO PERCENTUAL MÉDIA EM IG COMPARATIVAMENTE COM 0

CONTROLO DE ISOTIPO

Mab ΑΝΤΙ- PBMC PBMC IM9 Alteração % CS1 Dador 55 Dador 705 média em Ig Luc90H.1 -44% -56% -43% -48% Luc37 + 11% -43% -11% -14% Luc23 -13% -4% + 6 % -4% Luc63.2 -55% -51% -36% -47% Luc34.1 -64% -49% -45% -53% Luc38.1 -22% -44% -21% -29% Luc29D6 -43% -44% -25% -37%

Diminuição relativa na produção de Ig:

Grupo A (>45% diminuição): Luc90, 63, 34 GRUPO B (29-37% DIMINUIÇÃO):LUC38, 29D6 GRUPO C (4-14% DIMINUIÇÃO): LUC 37, 23

Os resultados experimentais indicam que os anticorpos anti-CSl diminuem a produção de ambas, IgG e IgM, por células B de sangue periférico in vitro. 135 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Exemplo 10: Redução in vivo de IgG por anticorpos monoclonais CS1 num modelo de ratinho SCID-HuPBMC.

Modelo de ratinho SCID-HuPBMC

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humanas por gradientes de densidade Ficoll-paque (Amersham Biosciences) padrão e ressuspenderam-se em solução tamponada de fosfato (PBS) a 2 X 107 PBMC/ml. Injectaram-se intraperitonealmente (i.p.) as PBMC ressuspendidas (1 ml) em ratinhos C.B-17 SCID. Duas a três semanas após injecção de PBMC, recolheram-se amostras de soro de ratinhos e ensaiaram-se quanto a IgG humana por ELISA. Os ratinhos enxertados (produzindo >1 yg/ml de IgG humano no soro) foram atribuídos aleatoriamente a grupos de tratamento e seguidamente tratados com anticorpos monoclonais anti-CS-1 humanos (Luc90.Hl ou Luc63.2.22), anticorpos de controlo de isotipo de ratinho (IgG2b ou IgG2a, respectivamente) ou PBS. Administraram-se doses aos ratinhos de 200 ug de anticorpo em 500 μΐ de PBS de 3 em 3 ou de 4 em 4 dias com 3 ou 4 doses de anticorpo. O soro de ratinho foi analisado quanto a IgG humana por ELISA utilizando protocolos padrão. A alteração percentual de IgG humana no soro foi calculada para cada ratinho por subtracção da concentração de IgG humana no soro antes da primeira dose de anticorpo (dia 0) à concentração de IgG humana pós dose (dia x) , dividindo pela concentração de IgG humana antes da primeira dose (dia 0) e multiplicando por 100, e.g., [(dia x - dia 0)/ dia 0] X 100.

Os dados são apresentados como alteração percentual média com o erro padrão para cada grupo de ratinhos. As concentrações de IgG humana são a concentração média com o erro padrão para cada grupo de ratinhos. Utilizou-se o teste t de 2 amostras de Welch para comparar a alteração percentual em IgG humana ao longo dos grupos de tratamento.

Os anticorpos anti-CSl diminuem a produção de IgG humana in vi vo 136 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Os dados evidenciam que os anticorpos anti-CSl do presente invento diminuem a produção de imunoglobulina humana substancialmente no modelo de transferência SCID-HuPBMC. Tal como apresentado na figura 19A, Luc90.Hl parou o aumento da produção de IgG em PBS e controlo de isotipo desde logo o dia 4 (4 dias após o tratamento com a primeira dose de anticorpo). Esta diminuição continuou até às 7 semanas (dia 32) do período de ensaio. Por exemplo, no dia 18, a produção de IgG humano aumentou 225% no controlo de isotipo

IgG2b, 181% no controlo de PBS, enquanto a produção de IgG humana diminuiu 14% com tratamento com Luc90H.l. Luc90H.l não só impediu o aumento de 181-225% da produção de IgG humana nos grupos de controlo, como também resultou numa diminuição adicional de 14% na produção de IgG. No dia 25, Luc90H.l não só impediu o aumento de 3 vezes da produção de IgG humana nos grupos de controlo, como também proporcionou uma diminuição adicional de 24% na produção de IgG humana.

Luc63.2 também diminuiu eficazmente a produção de IgG in vivo. Tal como apresentado na figura 19B, Luc63.2 impediu o aumento de 37 - 4 6% da produção de IgG humana nos grupos de controlo (PBS e controlo de isotipo IgG2a) e originou uma diminuição adicional de 59% na produção de IgG. Neste mesmo estudo, comparou-se Luc90.Hl com Luc63.2 e Luc90.Hl impediu o aumento de 37-114% dos grupos de controlo (PBS e controlo de isotipo IgG2b) e proporcionou uma diminuição adicional de 14% da produção de IgG em ratinhos enxertados com células mononucleares de sangue periférico humanas (PBMC). A figura 19C resume adicionalmente a diminuição da produção de Ig por tratamento com Luc90 e Luc63 no modelo SCIDHUPBMC. Além de impedir o aumento da produção de IgG em ratinhos tratados com controlos de isotipo e PBS, Luc90 provocou uma diminuição adicional na produção de IgG de 14%, 22%, 24% e 39%, e Luc63 apresentou uma diminuição adicional de 40% e 59%. Assim, podemos concluir que o tratamento anti-Luc de ratinhos SCID enxertados com PBMC humanas (SCID-HuPBMC) não só impede completamente o aumento na imunoglobulina humana normalmente observado no soro destes animais, como também 137 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ proporciona uma diminuição adicional comparativamente com os níveis de pré-tratamento.

Exemplo 11: Actividades ADCC de anticorpos anti-CSl

Preparação de células efectoras:

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) humanas (células efectoras) de sangue completo utilizando gradientes de densidade Ficoll-Paque padrão (Amersham Biosciences). Lavaram-se as células e ressuspenderam-se em meio RPMI suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 1%.

Preparação de células alvo:

Lavaram-se células com transfecção estável que expressam CS — 1 na superfície celular (células alvo) e ressuspenderam-se em meio RPMI suplementado com BSA a 1%. Plaquearam-se as células a 100000 células/poço num volume total de 50 μΐ. Adicionaram-se anticorpos monoclonais anti-CS-1 humanos de ratinho (Luc90.Hl ou Luc63.2.22) ou anticorpos de controlo de isotipo (IgG2b ou IgG2a de ratinho, respectivamente) a várias concentrações de células alvo num volume final de 100 μΐ e incubaram-se durante 30 minutos à temperatura ambiente.

Após incubação, adicionou-se 100 μΐ de PBMC efectoras às células alvo a uma razão de 20:1 num volume final de 200 μΐ. Incubaram-se as células alvo e efectoras a 37 °C durante 5 horas ou durante a noite. Centrifugaram-se as células a 350 X g durante 5 minutos e recolheram-se 100 μΐ/poço de sobrenadante e transferiram-se para uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo plano, opticamente transparente.

Ensaio de lactato-desidrogenase:

Para determinar a actividade de lactato-desidrogenase (LDH) contida nos sobrenadantes, adicionou-se a cada poço 100 μΐ de mistura reaccional do kit de detecção de 138 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ citotoxicidade (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a cada poço e incubaram-se as amostras durante até 30 minutos a 15-25 °C. Durante este período de incubação, protegeu-se a placa de microtitulação da luz. A absorvância das amostras foi medida a 490 nm utilizando um leitor de ELISA.

Para determinar a percentagem de citotoxicidade mediada por célula, calculou-se a absorvância média das amostras e subtraíram-se os controlos de linha de base utilizando a seguinte eguação:

Citotoxicidade = de -sRalTO χ 10Q SR: Libertação espontânea MR: Libertação máxima

Os controlos experimentais foram a libertação espontânea apenas das células alvo ou apenas das células efectoras. Ensaiaram-se as células alvo em solução de Triton-X 100 a 2% (1:1) :

Os anticorpos anti-CSl induzem citotoxicidade derivada de anticorpo (ADCC) A experiência evidenciou que os anticorpos anti-CSl Luc63.2 e Luc90 induziram citotoxicidade derivada de anticorpo (ADCC) em células que expressam CS1 na presença de PBMC (as células efectoras). Tal como se apresenta na figura 20, Luc90 induz citotoxicidade de uma forma dependente da dosagem. Uma quantidade de 50 pg/ml de Luc90 induziu quase 50% de citotoxicidade das células alvo. Luc63.2 induziu em geral 60-80% de citotoxicidade das células alvo com uma gama de dose de 10-50 yg/ml. Obtiveram-se resultados semelhantes em experiências realizadas com dois dadores adicionais. 139 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Exemplo 12: Actividade ADCC com anticorpos CS1 com baixo teor de fucose

Clonagem de ADNc da região variável de Luc90

As regiões variáveis murinas (sequência ID N2 3 e N2 4) foram clonadas da linha celular de hibridoma Luc90 por métodos padrão. Sucintamente, extraiu-se o ARN total e sintetizou-se ADNc em cadeia dupla utilizando o kit de amplificação de ADNc SMART 5'-RACE (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) seguindo o protocolo do fabricante. Clonaram-se os fragmentos de PCR dos ADNc da região variável no vector pCR4Blunt-T0P0 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) para determinação de sequência. Sequenciaram-se vários clones de plasmídeo para cada uma das cadeias pesada e leve. Identificaram-se sequências homólogas únicas típicas de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de ratinho.

Construção de vectores de expressão de VH e VL de Luc90 quiméricos

Concebeu-se um gene que codifica cada uma das VH e VL de Luc90 como um mini-exão incluindo um péptido de sinalização, um sinal de dador de splicing, sequência de iniciação Kozak e locais adequados de enzimas de restrição para clonagem subsequente num vector de expressão de mamífero. Conceberam-se iniciadores de modo a conterem locais de restrição adequados e complementaridade para PCR a partir de vectores TOPO contendo os genes de VH ou VL. Purificaram-se os fragmentos amplificados por PCR utilizando um kit de purificação Qiaquick PCR (Qiagen) e digeriram-se com MluI e Xbal. Subclonou-se o gene de VH de Luc90 em pHuHCgl.D (tipo selvagem) ou pHuHCgl.D.AA (mutante BS) para criar os plasmídeos pChiHuHCgl.D-MuLuc90VH e pChiHuHCgl.D.AA-MuLuc90VH, respectivamente. 0 mutante BS contém duas alterações de aminoácidos (L234A/L235A) na região CH2 de IgGl, para eliminar a ligação a receptores Fc (Xu et ai., (2000) Cell Immunol. 200:16-26) . Subclonou-se o gene de VL de Luc90 em pVK para criar o plasmídeo pChiVk-MuLuc90VL. Criaram-se vectores de 140 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ expressão de plasmídeo único de modo a poder expressar os genes de cadeia pesada e leve a partir de um único plasmídeo.

Os vectores de cadeia pesada foram diferidos com EcoRI para remover a região de cadeia pesada completa e subclonou-se num único local EcoRI no vector de cadeia leve. Combinou-se o mutante BS de cadeia pesada com o fragmento de vector pChiVk-MuLuc90VL para criar o plasmídeo pChiLuc90-BSK, enquanto se subclonou a cadeia pesada de tipo selvagem no vector pChiVk-MuLuc90VL para criar o plasmídeo pChiLuc90-glK.

Expressão de Luc90 quimérico

Produziram-se anticorpos quiméricos Luc90 IgGl/ de tipo selvagem e BS por transfecção estável de células Sp2/0 com os vectores pChiLuc90-glK e pChiLuc90-BSK, respectivamente. Produziu-se um anticorpo de baixo teor de fucose por transfecção estável de células YB2/0 com o vector pChiLuc90-glK. Seleccionaram-se clones positivos com ácido micofenólico e rastrearam-se por ELISA. Seleccionaram-se para expressão elevada o clone AH4 de tipo selvagem, o mutante BS HG12 e o clone de baixo teor de fucose 5E4, adaptaram-se a meio de hibridoma isento de soro Gibco com soro bovino fetal com baixo teor de Ig a 2%. Cultivaram-se dois litros de culturas em frascos de rotação para purificação. Purificaram-se os anticorpos por cromatografia em coluna de afinidade de proteína G padrão.

As figuras 21A-C apresentam dados sobre o efeito de anticorpos de baixo teor de fucose em ensaios de citotoxicidade. Trataram-se células que expressam CS1 (produtos de transfecção estável e linhas celulares de mieloma múltiplo humano) com anticorpos quiméricos anti-CSl Luc90 (tanto de tipo selvagem como anticorpos modificados com níveis diminuídos de fucose). Os anticorpos quiméricos anti-CSl Luc90 estimulam citotoxicidade celular dependente de anticorpo de células que expressam CS1. (A figura 21A apresenta a citotoxicidade de uma linha celular estável que expressa CS1 humana; as figuras 21 B e 21C apresentam a citotoxicidade de duas linhas celulares de mieloma humano, OPM2 (figura 21B) e 141 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ L363 (figura 21C) . Em cada caso, a citotoxicidade é aumentada significativamente por anticorpos que apresentam baixos níveis de fucose (através de cultura em células YB2/0, tal como descrito detalhadamente anteriormente).

Exemplo 13: Tratamento de mieloma com anticorpos anti-CSl

Efectuou-se tratamento com anticorpo anti-CSl in vivo num modelo de tumor de mieloma em ratinho por injecção de anticorpo intraperitonealmente no indivíduo de ensaio. Tal como apresentado na figura 22, o tratamento com anticorpo anti-CSl (Luc63 e Luc90) diminui o tamanho do tumor comparativamente com animais tratados com controlo de isotipo. Neste estudo, in jectaram-se i.p. 1 X 107 células de mieloma (linha celular de mieloma L363) em ratinhos CB.17 SCID. Duas semanas mais tarde; quando o tamanho do tumor atingiu ~80 mm3, distribuíram-se aleatoriamente os ratinhos em 4 grupos com 8 ratinhos por grupo. Trataram-se os ratinhos com anticorpos anti-CSl (Luc63 ou Luc90) ou anticorpos de controlo de isotipo (IgG2a de ratinho ou IgG2b de ratinho). Administraram-se aos ratinhos doses de 200 pg de anticorpo/ratinho durante 8 doses a 3 doses por semana. Os resultados evidenciam que os ratinhos tratados com anticorpos anti-CSl apresentam volumes de tumor diminuídos significativamente comparativamente com ratinhos tratados com anticorpo de controlo de isotipo. No dia 25 do estudo (após 5 doses), os ratinhos tratados com Luc63 apresentaram um tamanho médio de tumor de -100 mm3 comparativamente com ratinhos tratados com anticorpo de controlo de isotipo IgG2a (tamanho de tumor médio -800 mm3.) Os ratinhos tratados com Luc 90 apresentam tamanho médio de tumor de -400 mm3 comparativamente com ratinhos tratados com anticorpo de controlo de isotipo IgG2b (que apresentam tamanho médio de tumor de -950 mm3.) Os ratinhos tratados com anti-CSl Luc63 não apresentam tumores mensuráveis até 2,5 semanas após o tratamento, indicativo da notável eficácia do anticorpo a eliminar células tumorígenas.

Os sistemas modelo adicionais de mieloma incluem ratinhos SCID com implante intravenoso (i.v.), intraperitoneal (i.p.) 142

ΕΡ 2 371 391/PT ou com injecção directa no osso (ortotopicamente) com linhas de células B marcadas fluorescentemente ou de mieloma não marcadas ou maduras, e.g. ARH77, CESS, IM9, L363, LP1 e 0PM2. Estas linhas serão utilizadas para ensaiar os efeitos do tratamento antagonista em sistemas de modelos animais de mieloma. Estas linhas celulares expressam o antigénio reconhecido por anticorpos anti-CSl humanos. Distribuem-se aleatoriamente os animais em grupos e atribui-se um regime de tratamento com anticorpos anti-CSl humanos ou anticorpos de controlo (por exemplo, anticorpos de controlo de isotipo). Administram-se os anticorpos a vários níveis de dosagem, por exemplo uma dose de 1-10 mg/kg para um total de 9-10 doses administradas intraperitonealmente de 3 em 3 ou de 4 em 4 dias. Mede-se o tamanho de tumor duas vezes por semana durante 35-40 dias para cada grupo de tratamento. Anotaram-se as manifestações clínicas de mieloma. Anotaram-se as datas de morte de cada ratinho.

Também se iniciaram estudos animais para determinar potenciais sinergias entre tratamento com anticorpo anti-CSl e quimioterapia. Deixam-se crescer tumores enxertados até atingirem um tamanho aproximado entre 50-100 mm3 e, para os ratinhos injectados i.v., i.p. ou ortotopicamente, deixa-se que as células de cancro se enxertem nos animais. Nessa altura, distribuem-se aleatoriamente os animais em grupos e atribuem-se a um regime de tratamento com anticorpos anti-CSl humanos ou anticorpos de controlo (por exemplo, anticorpos de controlo de isotipo). Alternativamente, podem atribuir-se os animais a tratamento com anticorpos anti-CSl humanos ou anticorpos de controlo (por exemplo, anticorpos de controlo de isotipo) em combinação com tratamento com agentes quimioterapêuticos padrão, incluindo combinações de prednisona e melfalano ou outros agentes alquilantes (e.g. ciclofosfamida ou clorambucilo), ou vincristina, doxorrubicina e dexametasona de alta dose (VAD), ou outros regimes de quimioterapia conhecidos dos peritos na especialidade. Administram-se os anticorpos a vários níveis de dosagem, por exemplo uma dose de 1-10 mg/kg durante um total de 9-10 doses administradas intraperitonealmente de 3 em 3 ou de 4 em 4 dias. Administra- 143 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ se quimioterapia intraperitonealmente de 3 em 3 ou de 4 em 4 dias a uma concentração eficaz, por exemplo 1 mg/kg ou outra dose eficaz conhecida dos peritos na especialidade. Mede-se o tamanho do tumor (para animais injectados s.c.) duas vezes por semana durante 35-40 dias para cada grupo de tratamento. Anotam-se as manifestações clinicas de mieloma, incluindo imunoglobulina no soro em ratinhos injectados com linhas celulares que excretam imunoglobulina humana (IM9, CESS, ARH-77 e LP-1) . Anotam-se as datas de morte de cada ratinho. Avaliar-se-á a eficácia de tratamento com anticorpo na presença e na ausência de quimioterapia. 144 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ TABELA 2 SEQ ID NO:1

Chave principal PDL:433671 Sequência de ADN N2 de acesso de ácido nucleico: NM_021181 família GI: 19923571|ref|NM_021181.3|Homo sapiens membro 7 da SLAM (SLAMF7) ARNm 1 cttccagaga gcaatatggc tggttcccca acatgcctça ccctcatcta hatcctttgg si cagetcacag ggtcagcagc ctctggaccc gtgaaagagc tggtcggttc cgttggtggg 121 gcegtgaett tccccctgaa gtecaaagta aagcaagttg aetetattgt ctggacette 181 aacacaaccc ctcttgtcac catacagcca gaagggggca ctatcatagt gac^caaaat 241 cgtaataggg agagagtaga cttcccagat ggaggctact ecctgaagct cagcaaactg 301 aagaagaaLg actcagggat cLactatgtg gggatataca gctcatcact ccagcagccc 351 tecacccagg agtacgtgct geatgtctac gagcacctgt caaagcctaa agtcaccatg 421 ggtetgcaga gcaataagaa tggcacctgt gtgaceaate rgacatgctg catggaacat 481 ggggaagagg atgtgatnta tacctggaag gccctggggc aagcagccaa tgagtcccat 541 aatgggtcca tcctccccat ctcctggaga tggggagaaa gtgatatgac cttcatctge 601 gttgccagga accctgtcag cagaaacltc tcaagcccca tccttgccag gaagctctgt 651 gaaggtgctg ctgatgaccc agattcctcc atggtcctcc tgtgtatcct gttggtgccc 721 ctcctgctca gtctctttgt actggggcta tttctttggt ttctgaagag agagagacaa 781 gaagagtaca ttgaagagaa gaagagagtg gacatttgtc gggaaactcc taacatatgc 841 ccccattctg gagagaacac agagtacgac acaatccctc acactaatag aaeaatccta 901 aaggaagatc cagcaaatac ggtutactco actgtggaaa taocgaaaaa gatggaaaat 961 ccceacteac tgctcacgat gccagacana ccaaggctat ttgcctatga gaatgttatc 1021 tagacagcag tgcactcccc taagtctctg ctcaaaaaaa aaacaattct cggcccaaag 1081 aaaacaatca gaagaattca ctgatttgac tagaaacatc aaggaagaaL gaagaacgtt 1141 gacttttttc caggataaat tatctctgat gcttctttag atttaagagt tcataattce 1201 atccactgct gagaaatctc ctcaaaccca gaaggtttaa tcacttcatc ccaaaaatgg 1261 gattgtgaat gtcagcaaac cataaaaaaa gtgcttagaa gtattcctat agaaatgtaa 1321 atgcaaggtc acacatatta atgacagcct gttgtattaa tgatggctcc aggtcagtgt 1381 ctggagtttc attccatccc agggcttgga tgtaaggatt ataccaagag tottgctacc 1441 aggagggcaa gaagaccaaa acagacagac aagtccagca gaagcagatg cacetgaaaa 1501 aaatggatgt attaattggc tctataaact atgtgcccag cactatgctg agcttacact 1561 aattggtcag acgtgctgt.c tgceeteaeg aaattggctc caaatgaatg aactactttc 1621 atgagoagtt gtagcaggcc tgaocaoaga ttcccagagg gccaggtgtg gatocacagg 1681 actegaaggt caaagttcac aaagatgaag aatcagggta gctgaccatg tttggcagat 1741 actataatgg agacacagaa gtgtgoatgg cccaaggaaa aggaccccca gccaggcttc 1801 atttatgcac ttgtgctgoa aaagaaaagt ctaggtttta aggctgtgcc agaacccatc 1861 ccaataaaga gaccgagtct gaagtcacafc tgtaaatcta gtgtaggaga cttggagtca 1921 ggcagtgaga ctggtggggc acggggggca gtgggtactfc gtaaaccttt aaagatggtt 1981 aattcattca atagatattt attaagaaoc tatgcggccc ggcatggtgg ctcacacctg 2041 taatcccagc actttgggag gccaaggtgg gtgggtcatc tgaggtcagg agttca.agac 2101 cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctactaaaga tacaaaaatt tgctgagogt 2161 ggtggtgtgc acctgtaatc ccagctactc gagacgccaa ggcatgagaa tcgcttgaac 2221 ctgggaggtg gaggttgcag tgagctgaga tggcaccact gcactccggc ctaggcaacg 2281 agagcaaaac tccaatacaa acaaacaaac aaacacctgt gctaggtcag tctggcacgt 2341 aagatgaaca tccctaccaa cacagagctc accatctctt atacttaagt gaaaaacatg 2401 gggaagggga aaggggaatg gctgcttttg atatgttccc tgacacatat cttgaatgga 2461 gacctcccta ccaagtgatg aaagtgttga aaaacttaat aacaaatgct tgttgggcaa 2521 gaatgggatt gaggattatc ttctctcaga aaggcattgt gaaggaattg agccagatct 2581 ctctccctac tgcaaaaccc tattgtagta aaaaagtctt ctitactatc ttaataaaac 2641 agatattgtg agattcaaaa aaaaaaaaaa aa 145 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ SEQ ID ΝΟ:2

Sequência de aminoácido - CS1 GI: 19923571|ref|NM_021181.3|Homo sapiens membro 7 da família SLAM (SLAMF7)

M AG£ F TCLTLIYILVIQLT GSAASGPVKELVGSVGGAVTFP1KS KVKQVD SIVWTFNTT?LVTIQPEGGTIIVT QNRERERVDF PDGC Y S LKLS KL KKKD SGIYYVGIYSSSLQQPSTQEYVLHVYEHLΞ KPKVTMGLQSNKNGTCV THLCC CME HG3 EDVIYTWKALG QAÃNE SHHGS1L PI SWRWGESDM TF IC VAENPV E RN? Ξ Ξ PI LARKL CEGAA DDPD Ξ SMVLLCLL LVPLIiLS LFVLGL F LWPLKRhI R.QEE YIEEKKRVDICRETPNICPHSGEWTEYDTIPHTNR TILKEDPANTVYSTVEIPKKM3NPHSLLTMPDTPRLFAYENVI 146 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Tabela 4: Sequências de aminoácidos de anticorpos CS1

Luc-90 VII - SEP IP NO:3

QVQLQQPGAELVRPG^VKLSCKASGYSFTTYWMNWVKQRPGQGIjEWIGMTHPSDSETRLNQ SBO ID MO'.3 SBC ili Njilú KFKDKATLTVDKSSSTATMQLaSFTSEDSAVYYCAKSTMIATRAMDYWGQGTSyTy-S 8 SEQ ID NO:11

Luc-90 VL - SEP ΤΌ NO:4 '

DIVMT QSQKSMS T S VGD KV SITCKAS QDVITGVAWY QQKP GQ S PKL· LI Y S AS YRYTGVPDRF 3¾ ID NO: 12 SEQ ΙΓ

TSSGSGTDFTFTISNVQAEDL AVYYCgQHYSTPLTFGAGTKLELK CEO ID SOiH " _ "

Luc-63 VH - SEP ID NO:5 ΕνΚίΡΕΒΟΟΰίνΰΡΰΒΞΡΚίΞΟΑΑΞΰΡΡΡΒΚΥνΓΜΒΝνΕΟΑΡΟΚΕίΕνίΙΟΕΙΝΡΡΞΒΊΊΝΥΤΡ SEO ID NO 515 SEP IC K0:1£

SLKDKF11S RDNAKNTLYl· QMS KVR S EDTALYY C ARFDGNYWY FDVWGAGTTVTV S S SEQ ID NO:17

Liic-63 VL - SEP 1L> NO:6

DIVMTQSHKFMSTSVGDRV5ITCK&SQDVGIAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTKHTGVPDRF SEQ ID NO:IS SEQ ID NO:19

TG SGSGTD FTL TISNVQSEDLADYFCQQYS SYPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:2 0

Ltic-34 VH - SEP ID NO:7

C;VQLC!C!SGAELARPGASVK:LSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGI.EWIGAIYFGDGDTRYTQ SEQ ID NO:2I SEQ ID NO:22

KFKOKATLTADKB SSTAYMQL S SLASEDSAVYYCARGKVYYGSNPFAYWQQGTLVTVSA SEQ ID NO:23

Liic-34 VL - SEP IP lNO:8

DIQtlTQSSBYLSVSI.GGRVTITCKASDHmNW.AWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRF SEQ ID »0:24 SSQ ID M0:25

S G S G S GKD YTIiS IT S D QTEDVATYYCQQYW S TP WTFQ GQTKL· EIK SEQ ID NO:26 147 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Tabela 5: Suposto local de glicosilação da região variável de cadeia pesada de anti-CSl Luc63 fruo-<3 VH (SBQ m 110.871 HDggLIgFI™T.T.gg«QraainfT»-M<Mfg.ffOPagaTmBefcAflgffiigHKaM8WgBaiÍPgEB SBQ ID HO:29 SBQ IS NO:30 IMgaHBHlBflTpt^wnÍÍlgFnBBluaMILIÍgHaBIMBWMiltlCMtBigWllilf SBQ ID NO:31 SBQ ID N0;32

NBA (SBQ ID NO:33)

UWMWVWM 28

Iiuo-63 VL· (SBQ IP ΝΟ:3*ί MBTBBOVyVIMMiWLBOVSaPXTItrQgHICWlSTBV gDSVSITCKAflQPVPXAV 6SQ ID NO:34 SBQ XO NO:35 BOTQQPOQSFBIiMlWMCTgWWyMggOMflOTDMMCTSIIVQSBDIIiMCT ” SBQ ID HO:3£ oaanaa ιγγιμγοοοτκιβικ SBQ ID NO:37 148 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ TABELA 6: Humanização de Luc63 (NYA) - Alinhamento das regiões VH de MuLuc63 (SEQ ID NO:38), sequência de aminoácidos deduzida do ADNc da região variável humana (SEQ ID NO:39), ADNc de JH1 humano (SEQ ID NO: 40) e HuLuc63 (SEQ ID NO: 41) e regiões VL de MuLuc63 (SEQ ID NO:42), sequência de aminoácidos deduzida do ADNc da região variável humana (SEQ ID NO:43) e huLuc63 (SEQ ID NO:44). CDR2 de VH de HuLuc63 é SEQ ID NO:95.

HuLuc - 63 VH EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFS RYWMS ADNc de VH humano EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS HuLuc -63 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFS RYWMS MuLuc - 63 VH WVRQAPGKGLEWIG KINPDSSTINYTPSLKD ADNc de VH humano WVRQAP GKGLEWVA HuLuc-63 VH WVRQAPGKGLEWIG EINFDSSTINYAPSLKD HuLuC-63 VH KFIISRDNAKNTLYQMSKVRSEDTALYYCAR ADNc de JH1 humano RFTISRDNAKNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR HuLuc- 63 VH KFI_I SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR MuLuc-63 VH PDGNYWYFDV WGAGTTVTVSS ADNc de JH1 humano

HuLuc -63 VH PDGXWYFDV WGQGTLVTVSS MuLuc-63 VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVGIAVA ADNc de VL humano DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC HuLuc-63 VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVGIAVA MuLuc-63 VL WYQQKPGQSFKLLIY WASTRHT ADNc de VL humano WYQQKPGQSFKLLIY HuLuc-63 VL WYQQKPGQSFKLLIY WASTRHT MuLuc-63 VL GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFC ADNc de VL humano GVPSRFSGSGSQTDFTLTISSLQFPEKVATYYC HuLuc-63 VL GVFDRFSGSGSTDFTLTSSLQPEDVATYYC MuLuc-63 VL QQYSSYPYT FGGGTKLEIK ADNc de VL humano FGQGTKVEIK HuLuc-63 VL QQYSSYPYT FGQGTKVEIK 149 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ TABELA 7: Alinhamento das regiões VH de MuLuc63 (SEQ ID NO:45), E55 3-14 (SEQ ID NO:46), HuLuc63 (SEQ ID NO:47)

MuLuc63 Ξ55 3-14 HuLuc63

MuLuc-63 E55 3-14 HuLuc-63

12 3 4 0 0 0 0 EV KL L E 5GGGL VO P G G S LIGjS CAA5 GFSFS PYE7M S ΐ-TVRQAP G EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS-----WVRQAPG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAAS G FD F S RY WM S WVRQAPG 5 6 7 8 0 a 0 0 0 a KGLEWIGEINPPSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMS KGLEKVA-----------------RFTISRDNAKNS LYLQMN KGLEWIGE1NPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNSLYLQMN

MuXjUC-63 E55 3-14/JH1 HuliUC-63

1 1 9 0 1 bc O Oab O KVRSEDTALYY CARPDGNYWYFDVWGAGTTVTVSS SLRAEDTAVYYCAR----------WGQGTLVTVSS SLRAE DTAVY Y CARPDGNYWYFDVWGQGT L VT VS S 150 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Tabela 8: Alinhamento das sequências de aminoácidos da região VL de anticorpo de MuLuc63 (SEQ ID NO:48), III-2R (SEQ ID NO:49) e HuLuc63 (SEQ ID NO:50) 12 3 4

MuLUCEj3 III-2R HuLuc63

0 0 0 0 DlVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGIAVÃWY QQKPG Q

DIQMTQS PS SLSAS VGDRVTI TC-----------WYQQKPGK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGIAVAWYQQKPGK 5 6 7 8

0 0 0 Q

MULUCS3 SPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGEGSGTDFTLTISNVQSBDLA

ITI-2R VPKTiTiTY-------GVP SRFSGS GSGTDFTLTIΞ SLQPEDVA

Hul>uc63 VPKLLI YtíAS TRHTGVPDRF SGEGSGTDFTLUSSLQ? ED VA 1 9 0 0 0

MULUC63 DY FCQQY S S YPYT FGGGTKLiE IK

111 - 2 R TYYC---------FGQGTKVE1K

HuIiUC63 rYYCQQYSSYPYTFGQGTKVBIK 151 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Tabela 9: Oligonucleótidos utilizados para a síntese do gene de VH e de VL de HuLuc63

Gene de VH de HuLuc63

Oligonucleótido 1 (SEQ ID NO:53) 5' -TTTACGCGTCCACCATGCATTTTGGGCTGATTT-3'

Oligonucleótido 2 (SEQ ID NO:54) 5' -TTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAGGT-3'

Oligonucleótido 3 (SEQ ID NO:55) 5'-GCAGCTTGTCGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGA-3'

Oligonucleótido 4 (SEQ ID NO:56) 5' -GGATCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATT-3'

Oligonucleótido 5 5' -TTAGTAGATATTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGG-3' Oligonucleótido 6 5'-GAAAGGGC TAGAAT GGAT T GGAGAAAT TAAT C CAGATAGC-3' Oligonucleótido 7 5' -AGTACGATAAACTATGCTCCATCTCTAAAGGATAAATTCA-3' Oligonucleótido 8 5'-TCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATAGCCTGTACCTGCA-3' Oligonucleótido 9 5' -AATGAACAGCCTCAGAGCTGAGGACACAGCCGTTTATTAC-3' Oligonucleótido 10 5'-TGTGCAAGACCGGACGGAAACTACTGGTACTTCGATGTCT-3' Oligonucleótido 11 5' -GGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAA-3' Oligonucleótido 12 5, -TTTTCTAGAGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGT-3' Oligonucleótido 13 5' -GACGAGGGTCCCCTGGCCCCAGACATCGAAGTACCAGTAG -3' Oligonucleótido 14 5' -TTTCCGTCCGGTCTTGCACAGTAATAAACGGCTGTGTCCT-3' Oligonucleótido 15 5' -CAGCTCTGAGGCTGTTCATTTGCAGGTACAGGCTATTTTT-3' Oligonucleótido 16 5' -GGCGTTGTCTCTGGAGATGATGAATTTATCCTTTAGAGAT -3' 152 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Oligonucleótido 17 5' -GGAGCATAGTTTATCGTACTGCTATCTGGATTAATTTCTC-3' Oligonucleótido 18 5'-CAATCCATTCTAGCCCTTTCCCTGGAGCCTGCCGGACCCA-3' Oligonucleótido 19 5'-ACTCATCCAATATCTACTAAAATCGAATCCTGAGGCTGCA-3' Oligonucleótido 20 5' -CAGGAGAGTCTCAGGGATCCTCCAGGCTGCACCAGGCCAC-3' Oligonucleótido 21 5'-CTCCAGACTCGACAAGCTGCACCTCACACTGGACCCCTTT-3' Oligonucleótido 22 5'-TAAAAGAGCAACAATAAAAAAAAT CAGC C CAAAAT C CAT G- 3'

Gene de VL de HuLuc63

Oligonucleótido A

5'-TTTACGCGTCCACCATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGTATA-3' Oligonucleótido B

5'-CATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAAGGAGACATTCAG-3' Oligonucleótido C

5' -ATGACCCAGTCTCCTTCATCACTTTCCGCATCAGTAGGAG-3' Oligonucleótido D

5'-ACAGAGTCACTATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGG-3' Oligonucleótido E

5' -TATTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGTA-3' Oligonucleótido F

5'-CCTAAACTATTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTG-3' Oligonucleótido G

5' -GAGTCCCTGATCGATTCTCAGGCAGTGGATCTGGGACAGA-3' Oligonucleótido H

5'-TTTCACTCTCACCATTAGCTCACTACAGCCTGAAGACGTG-3' Oligonucleótido I

5'-GCAACTTATTACTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCATACA-3' Oligonucleótido J

5' -CGTTCGGACAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTAAGTG-3' Oligonucleótido K 5'-TTTTCTAGATTAGGAAAGTGCACTTACGTTTGATTTCCAC-3' 153 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ

Oligonucleótido L

5' -CTTGGTCCCCTGTCCGAACGTGTATGGATAGCTGCTATAT-3' Oligonucleótido M

5' -TGCTGACAGTAATAAGTTGCCACGTCTTCAGGCTGTAGTG-3' Oligonucleótido N 5'-AGCTAATGGTGAGAGTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCC-3' Oligonucleótido 0

5'-TGAGAATCGATCAGGGACTCCAGTGTGCCGGGTGGATGCC-3' Oligonucleótido P

5' -CAGTAAATCAATAGTTTAGGTACTTTCCCTGGTTTCTGTT-3' Oligonucleótido Q

5'-GATACCAGGCTACAGCAATACCCACATCCTGACTGGCCTT-3' Oligonucleótido R

5' -GCAGGTGATAGTGACTCTGTCTCCTACTGATGCGGAAAGT-3' Oligonucleótido S

5'-GATGAAGGAGACTGGGTCATCTGAATGTCTCCTTCAACAC-3' Oligonucleótido T 5' -CAGACAAC CACAGCAACATGTATACAAAGACC TGAGAAT G-3'

PARÁGRAFOS RELEVANTES 1. Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, em que o referido anticorpo se liga a CS1 e inibe a excreção de imunoglobulina. 2. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 1, em que o referido anticorpo inibe a proliferação de leucócitos. 3. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 1, em que o referido anticorpo inibe a proliferação de células de cancro. 4. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 1, em que o referido anticorpo desencadeia efeitos citotóxicos sobre células que expressam CS1 ou melhora a citotoxicidade mediada por células imunitárias. 154 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 5. Ο anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio do Parágrafo 4, em que o referido anticorpo desencadeia citotoxicidade mediada por ADCC de células que expressam CS1. 6. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 1, em que o referido anticorpo se liga a substancialmente o mesmo epítopo que o anticorpo produzido por uma linha celular de hibridoma com o número de acesso na ATCC PTA-5091 ou um anticorpo Luc63. 7. 0 anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 1, em que o referido anticorpo é produzido por uma linha celular de hibridoma com o número de acesso na ATCC PTA-5091. 8. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 1, em que o referido anticorpo é produzido por uma linha celular de hibridoma que expressa o anticorpo Luc63. 9. 0 anticorpo de acordo com o Parágrafo 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal. 10. O anticorpo de acordo com o Parágrafo 9, em que o referido anticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo completamente humano. 11. O anticorpo de acordo com o Parágrafo 1, em que o referido anticorpo está conjugado com um agente citotóxico. 12. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, em que o referido anticorpo se liga a substancialmente o mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO :3-2 6. 13. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, em que o referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO :3-2 6. 14. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 13, em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada 155 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4. 15. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 13, em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6. 16. 0 anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio de acordo com o Parágrafo 13, em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8. 17. Uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, 10, 11, 15, 16, 17, 21, 22 ou 23. 18. Uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 13, 14, 18, 19, 20, 24, 25 ou 2 6. 19. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, em que o referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO:27-44. 20. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio do Parágrafo 19, em que o referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:28. 21. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, em que a referida região variável de cadeia pesada compreende uma CDR de SEQ ID NO:33. 156 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 22. Uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia pesada de um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:29, 30, 31, 32 ou 33. 23. Uma região determinante de complementaridade (CDR) da cadeia leve de um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 34, 35, 36 ou 37. 24. Uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmacêutico e o anticorpo de acordo com o Parágrafo 1. 25. Um método de inibição da proliferação de células que expressam CS-1 compreendendo o contacto das referidas células com uma quantidade eficaz de um antagonista de CS1. 26. O método de acordo com o Parágrafo 25, em que as referidas células que expressam CS-1 são células de cancro de células plasmáticas. 27. O método de acordo com o Parágrafo 26, em que os referidos cancros de células plasmáticas são seleccionados do grupo que consiste em mieloma múltiplo, mieloma do osso, plasmacitoma extramedular, macroglobulinemia (incluindo macroglobulinemia de Waldenstrom), doença da cadeia pesada, amiloidose primária e gamopatia monoclonal de significado indeterminado. 28. O método de acordo com o Parágrafo 25, em que as referidas células que expressam CS-1 são derivadas de células de cancro de células não plasmáticas. 29. O método de acordo com o Parágrafo 28, em que o referido cancro de células não plasmáticas é leucemia linfocítica crónica. 30. O método de acordo com o Parágrafo 25, em que as referidas células que expressam CS-1 são derivadas de leucócitos. 31. O método de acordo com o Parágrafo 30, em que os referidos leucócitos são células T ou células B activadas. 157 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 32. Ο método de acordo com o Parágrafo 31, em que os referidos leucócitos são derivados de um paciente que sofre de SLE. 33. 0 método de acordo com o Parágrafo 25, em que o referido antagonista inibe a excreção de imunoglobulina. 34. 0 método de acordo com o Parágrafo 33, em que a referida imunoglobulina é IgG ou IgM. 35. 0 método de acordo com o Parágrafo 34, em que o referido antagonista é uma proteína que interactua directamente com a CS1. 36. 0 método de acordo com o Parágrafo 25, em que a referida proteína é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio que se ligam a CS1. 37. 0 método de acordo com o Parágrafo 36, em que o referido anticorpo é monoclonal. 38. 0 método de acordo com o Parágrafo 37, em que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo completamente humano. 39. 0 método de acordo com o Parágrafo 37, em que o referido anticorpo está conjugado com um agente citotóxico. 40. 0 método de acordo com o Parágrafo 37, em que o referido anticorpo tem níveis diminuídos de fucose ou está mutado para aumentar a afinidade do anticorpo para com um receptor Fc R. 41. O método de acordo com o Parágrafo 37, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal produzido por uma linha celular de hibridoma com o número de acesso na ATCC PTA-5091. 42. O método de acordo com o Parágrafo 37, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal produzido por uma linha celular de hibridoma que expressa Luc63. 43. O método de acordo com o Parágrafo 25, em que o referido antagonista inibe a expressão de CS1. 158 ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 44. Ο método de acordo com o Parágrafo 25, em que o referido antagonista é um ácido nucleico anti-sentido de uma sequência de ácido nucleico que codifica CS1 ou uma sua porção. 45. Um método para inibição da excreção de imunoglobulina compreendendo a administração de um antagonista que se liga especificamente a um polipéptido codificado por SEQ ID NO:2. 46. Um método para o tratamento de um indivíduo com cancro de células plasmáticas compreendendo a administração de um antagonista que se liga especificamente a um polipéptido codificado por SEQ ID NO:2. 47. 0 método do Parágrafo 46, em que o referido antagonista é o anticorpo do Parágrafo 1. 48. 0 método do Parágrafo 46, em que o referido anticorpo tem níveis diminuídos de fucose ou está mutado para aumentar a afinidade do anticorpo para com um receptor Fc R. 49. 0 método de acordo com o Parágrafo 46, em que o referido cancro de células plasmáticas é mieloma ou mieloma múltiplo. 50. Um método para o tratamento de um indivíduo com doença inflamatória do intestino compreendendo a administração de um antagonista que se liga especif icamente a um polipéptido codificado por SEQ ID NO:2. 51. Um método para aumentar a actividade ADCC do anticorpo do Parágrafo 1, em que o referido anticorpo tem níveis diminuídos de fucose ou está mutado para aumentar a afinidade do anticorpo para com um receptor Fc R.

Lisboa, 2014-10-20

Claims

ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl que é um antagonista de CS1 e que se liga a uma proteína codificada por SEQ ID N0:1, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio: (a) compreende uma região variável da cadeia pesada com sequências de região determinante de complementaridade (CDR) possuindo sequências de aminoácidos que partilham 85% a 100% de identidade de sequências com as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17 como mostrado na Tabela 4; e/ou (b) compreende uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos que partilham 85% a 100% de identidade de sequências com as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20 como mostrado na Tabela 4; e ainda em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compete pela ligação à referida proteína com um anticorpo de controlo, em que o anticorpo de controlo compreende uma região VH compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma região VL compreendendo SEQ ID NO:6.
2. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl da reivindicação 1 que diminui em pelo menos 50%, num ensaio de ligação competitiva, a ligação do anticorpo de controlo à proteína.
3. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, que compreende uma região variável da cadeia pesada com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17; e uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.
4. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 2/4 aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:6 como mostrado na Tabela 4.
5. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, que compreende uma região variável da cadeia pesada com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 95 (a sequência de aminoácidos EINPDSSTINYAPSLKD), e SEQ ID NO:17; e uma região variável da cadeia leve com sequências de CDR possuindo sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.
6. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl de qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 5, que tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:47 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:50 como mostrado nas Tabelas 7 e 8.
7. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl de qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 5, que é humanizado.
8. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl de qualquer uma das reivindicações precedentes, que é uma IgGl.
9. Anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes para utilização no tratamento de cancro.
10. Anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o cancro é mieloma ou mieloma múltiplo.
11. Anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl que é um antagonista de CS1 e que se liga a uma proteína codificada por SEQ ID NO:l para utilização no tratamento de mieloma ou mieloma múltiplo. ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 3/4
12. Anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio compete pela ligação à referida proteína com um anticorpo de controlo, e ainda em que o anticorpo de controlo compreende uma região VH compreendendo SEQ ID NO:5 e uma região VL compreendendo SEQ ID NO:6.
13. Anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com a reivindicação 11 ou a reivindicação 12, em que o referido anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl é humanizado e/ou é uma IgGl
14. Anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13 por administração após, ou em combinação com, um ou mais fármacos imunossupressores e imunomoduladores.
15. Anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13 por administração após, ou em combinação com, um imunomodulador.
16. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl das reivindicações 1 a 8, ou anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com as reivindicações 9 a 15, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio está conjugado com uma porção efectora.
17. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl da reivindicação 16, ou anticorpo anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a referida porção efectora é um marcador detectável tal como um marcador fluorescente, um radioisótopo ou um químico citotóxico.
18. Anticorpo monoclonal anti-CSl ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl da reivindicação 16, ou anticorpo anti- ΕΡ 2 371 391/ΡΤ 4/4 CS1 ou fragmento de ligação ao antigénio anti-CSl para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a referida porção efectora é uma porção de detecção, uma porção activável, um agente quimioterapêutico, uma lipase, um antibiótico, um agente quimioatractor, um imunomodulador ou um radioisótopo. Lisboa, 2014-10-20