PT2241325E

PT2241325E - Utilização de oligonucleótidos cpg no tratamento de infecção com vírus da hepatite c

Info

Publication number: PT2241325E
Application number: PT10166710T
Authority: PT
Inventors: Joerg Vollmer; Heather L Davis; Navneet K Ahluwalia; Susan M Efler
Original assignee: Coley Pharm Gmbh; Coley Pharm Group Inc
Priority date: 2002-10-29
Filing date: 2003-10-29
Publication date: 2012-04-12
Also published as: ATE544466T1; ZA200503511B; AU2010203015B2; US20060003962A1; AU2010203015A2; EP2241325A1; WO2004039829A3; NZ540098A; EP1556077A2; CA2503693A1; KR20050089799A; AU2003283647B2; US7998492B2; EP2241325B1; CN1753687A; SI2241325T1; EA200500733A1; EA008777B1; WO2004039829A2; ES2381224T3

Description

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE OLIGONUCLEÓTIDOS CPG NO TRATAMENTO DE INFECÇÃO COM VÍRUS DA HEPATITE C"

Campo da Invenção A invenção proporciona ácidos nucleicos imunoestimuladores CpG classe C compreendendo a sequência TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N°: 13), que pode ser utilizada para o tratamento de indivíduos cronicamente infectados com vírus da hepatite C.

Antecedentes da Invenção 0 vírus da hepatite C (HCV) é um vírus de ARN de cadeia simples positiva da família Flavivirus que infecta hepatócitos de humanos e de alguns outros primatas. Caracterizado inicialmente em 1989 (1), o HCV possui um genoma de 9,5 kb que codifica para três proteínas estruturais: núcleo e duas glicoproteínas do envelope (EI e E2), assim como várias proteínas não estruturais (NS) que estão envolvidas na replicação virai e interacção com a célula hospedeira (2). 0 HCV é uma séria preocupação de saúde pública que causa >90% da hepatite parentérica não-A, não-B (1). Desde 0,4 a 1,5% da população mundial está infectada (3, 4) , incluindo cerca de 300000 Canadianos (Health Canada). As estatísticas epidemiológicas são difíceis de compilar uma vez que a grande 1 maioria das infecções agudas são subclinicas; contudo é estimado que 50-80% dos indivíduos infectados por HCV não conseguem eliminar os vírus e, muitos destes, tornam-se portadores de vida longa. Cerca de 50% de portadores desenvolvem hepatite crónica e 20% destes desenvolverão cirrose hepática, muitos dos quais desenvolverão subsequentemente carcinoma hepatocelular (5-9). A hepatite C causa cerca de 8000 a 10000 mortes anualmente nos Estados Unidos (CDC).

Nos Estados Unidos e Canadá existem dois regimes diferentes que foram aprovados como terapia para a hepatite C: monoterapia com interferão alfa e terapia de combinação com interferão alfa e ribavirina. Embora mais dispendioso e associado com mais efeitos secundários, a terapia de combinação produz consistentemente taxas mais elevadas de resposta sustentável do que a monoterapia.

Estão disponíveis várias formas de interferão alfa (alfa-2a, alfa-2b e interferão de consenso (Alfacon)). Estes interferões são administrados tipicamente subcutaneamente três vezes por semana. O interferão peguilado, i. e., interferão alfa modificado por adição de polietilenoglicol (PEG) de modo a aumentar a duração em circulação, é outro interferão, e é administrado apenas uma vez por semana. A ribavirina, em contraste, é um agente oral antiviral que é administrado duas vezes por dia em cápsulas de 200 mg.

Os efeitos secundários do interferão alfa incluem: fatiga, dores musculares, dores de cabeça, náuseas e vómitos, irritação da pele no sítio de injecção, febre baixa, perda de peso, irritabilidade, depressão, suicídio, supressão ligeira da medula 2 óssea e perda de cabelo (reversível) . Para a ribavirina os efeitos secundários incluem; anemia fatiga e irritabilidade, prurido, problemas de pele, congestão nasal, sinusite e tosse. 0 tratamento com interferão isolado ou em combinação com interferão e ribavirina leva a melhoras rápidas nos niveis séricos ALT em 50-75% de doentes e o desaparecimento de ARN de HCV detectável do soro em 30-50% dos doentes. As melhoras a longo prazo na doença hepática ocorrem normalmente apenas se o ARN de HCV desaparecer durante a terapia e permanecer indetectável durante, pelo menos, 6 meses após ter terminado a terapia. O tratamento de combinação resulta numa taxa superior de perda de ARN de HCV no tratamento e uma taxa inferior de recaída quando o tratamento fica completo. Contudo, os resultados dependem fortemente do genótipo do vírus, com melhores resultados a serem obtidos para os genótipos 2 e 3 (cerca de 90% com 1 ano de tratamento com IFN-α peguilado e ribavirina), mas piores resultados (cerca de 40% de resposta prolongada) para o genótipo 1 de HCV. A maioria dos portadores de HCV crónicos na América do Norte são agora do genótipo 1. A duração óptima do tratamento varia dependendo se for utilizada monoterapia com interferão ou terapia de combinação é utilizada, assim como do genótipo de HCV. Tipicamente, a duração varia de 6 a 12 meses. Não existe presentemente vacina contra o HCV ou uma terapia altamente eficaz para a infecção crónica. Deste modo, existe uma necessidade urgente para um tratamento eficaz que possa ser utilizado para tratar portadores crónicos. 3

Sumário da Invenção A invenção baseia-se parcialmente em várias observações surpreendentes, incluindo a observação de que podem ser utilizados ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores para tratar indivíduos que são cronicamente infectados com vírus da hepatite C (HCV) e que não respondem a terapias não CpG previamente administradas. A invenção baseia-se ainda, em parte, na observação de que pode ser obtida uma resposta sinérgica nestes indivíduos a partir da utilização combinada de ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores e um agente antiviral, tal como IFN-alfa.

Num aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C compreendendo a sequência TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N°: 13).

Em formas de realização, o ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C compreende a sequência TCGTCGTTTTACGGC-GCC -GTGCCG (SEQ ID N°: 13), TCGTCG-TTTTAC- GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID N° : 14) OU TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID N° : 15 ) , em que as ligações inter-nucleótido apresentadas como sao fosfodiéster e as restantes são fosforotioato, ou possuem uma sequência de bases consistindo em TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N°: 13).

Noutro aspecto, os ácidos nucleicos imunoestimuladores CpG de classe C do primeiro aspecto são para utilização no tratamento de infecção crónica com HCV num indivíduo. 4

Noutro aspecto, os ácidos nucleicos imunoestimuladores CpG de classe C do primeiro aspecto são para utilização num tratamento de um indivíduo possuindo uma infecção crónica de HCV que não foi tratada com sucesso utilizando uma terapia prévia não CpG incluindo interferão-α, compreendendo o referido tratamento a administração de uma quantidade eficaz do referido ácido nucleico CpG imunoestimulador ao referido indivíduo para tratar a infecção.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 apresenta a indução de secreção de IFN-α a partir de PBMC infectadas com HCV e normais após estimulação com 3 classes de CpG. As PBMC normais ou de indivíduos infectados com HCV foram incubadas com diferentes classes de CpG durante 48 h. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados quanto a secreção de IFN-α através de kits comerciais de ELISA. A secreção de IFN-α média para 10 indivíduos normais e 10 indivíduos infectados com HCV são apresentadas pelas barras pretas. A Figura 2 apresenta a análise de citometria de fluxo de PBMC isoladas de fresco a partir de portadores de HCV crónicos e indivíduos normais. As PBMC foram isoladas a partir do sangue de indivíduos infectados com HCV e de dadores saudáveis normais e imunocoradas com anticorpos anti-células dendríticas plasmacitóides marcadas de modo fluorescente (PDC). As células foram analisadas num citómetro de fluxo e os resultados foram comparados com os dados de secreção de IFN-α nos mesmos indivíduos quando estimulados com CpG. 5 A Figura 3 apresenta a indução de IFN-α por estimulação de PBMC com oligonucleót idos de classe C e C ligeiros. As PBMC de indivíduos normais ou infectados com HCV foram incubadas com diferentes classes de CpG durante 48 h. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados para a secreção de IFN-a através de kits comerciais de ELISA. A secreção de IFN-α média para 10 indivíduos normais e 10 indivíduos infectados com HCV é apresentada pelas barras pretas. A Figura 4 apresenta a indução de IFN-α após estimulação com um painel de CpG de classe C semi-maleável. As PBMC isoladas de 5 indivíduos infectados com HCV foram incubadas com um painel de oligonucleótidos durante 48 h. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados para secreção de IFN-α através de kits comerciais ELISA. A secreção de IFN-α média para 5 indivíduos infectados com HCV é apresentada pelas barras pretas. A Figura 5 apresenta a secreção de TFN-γ após estimulação com três classes de CpG. As PBMC de indivíduos normais ou infectados com HCV foram incubadas com diferentes classes de CpG durante 48 h. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados para a secreção de IFN-γ através de kits comerciais de ELISA. A secreção de IFN-γ média para 10 indivíduos normais e 10 indivíduos infectados por HCV é apresentada pelas barras pretas. A Figura 6 apresenta a indução de IFN-γ após estimulação com um painel de CpG de classe C semi-maleável. As PBMC isoladas de 5 indivíduos infectados com HCV foram incubadas com um painel de oligonucleótidos CpG de classe C semi-maleável durante 48 h. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados para a 6 secreção de IFN-γ por kits comerciais de ELISA. A secreção de IFN-γ média para 5 indivíduos HCV é apresentada pelas barras pretas. A Figura 7 apresenta a secreção de IP-10 após estimulação com três classes de CpG. As PBMC de indivíduos normais ou infectados com HCV foram incubadas com diferentes classes de CpG durante 48h. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados para secreção de IP-10 por kits comerciais de ELISA. A secreção de IP-10 média para 10 indivíduos normais e 10 indivíduos infectados por HCV é apresentada pelas barras pretas. A Figura 8 apresenta o efeito de CpG na proliferação de células B. As PBMC de dadores infectados com HCV ou normais foram incubadas com CpG de classe A, B ou C durante 5 dias. As células foram então pulsadas com 3H-timidina durante 16 a 18 horas, antes da medição da radioactividade. Os valores são representados como índices de estimulação em comparação com meio controlo (SI = cpm incubados com CpG/cpm de células incubadas apenas com meio). A Figura 9 apresenta o efeito de CpG de classe C semi-maleável na proliferação de células B. As PBMC de 5 indivíduos infectados com HCV foram incubadas com CpG de classe A, B, C e C semi-maleável durante 5 dias. As células foram então pulsadas com 3H-timidina durante 16 a 18 horas antes da medição a radioactividade. Os valores são representados como índices de estimulação em comparação com meio controlo (SI = cpm incubados com CpG/cpm de células incubadas apenas com meio). A Figura 10 apresenta a secreção de IL-10 após estimulação com três classes de CpG.As PBMC de indivíduos normais ou infectados 7 por HCV foram incubadas com diferentes classes de CpG durante 48 h. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados para a secreção de IL-10 por kits comerciais de ELISA. A secreção de IL-10 média para 10 indivíduos normais e 10 indivíduos infectados por HCV é apresentada pelas barras pretas. A Figura 11 apresenta a secreção de IFN-α após estimulação de células infectadas com HCV com ribavirina e CpG isolados ou em combinação com Intron A. As PBMC de 10 indivíduos infectados com HCV e 10 dadores normais saudáveis foram incubadas com Intron A, Ribavirina ou CpG classe C isolado e também com e sem Intron A (uma fonte exógena purificada de IFN-α) durante 48 horas. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados parar secreção de IFN-α por kits comerciais de ELISA. A quantidade IFN-α medida para Intron A isolado e para cada indivíduo, foi considerada ruído de fundo e foi subtraída de Intron A, ribavirina + Intron A e classe C + Intron A para estes mesmos indivíduos antes dos dados serem incluídos no gráfico. Os valores médios para os indivíduos normais e HCV são indicados por barras pretas e brancas respectivamente.

Figura 12. Efeito Sinérgico de CpG combinado com Intron A na secreção de IFN-α por células infectadas com HCV. As PBMC de 15 indivíduos infectados com HCV foram incubadas com CpG classe C isolado ou em conjunto com Intron A (uma fonte exógena purificada de IFN-α) durante 48 horas. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e ensaiados para a secreção de IFN-a por kits comerciais de ELISA. A quantidade de IFN-α medida para Intron A isolado para cada indivíduo, foi subtraído de CpG + Intron A para estes mesmos indivíduos antes dos dados serem incluídos no gráfico. 8

Deve ser entendido que as figuras não sao necessárias para concretizar a invenção reivindicada.

Descrição Detalhada da Invenção

Foi observado que os oligonucleótidos CpG podem activar PBMC de doentes cronicamente infectados com HCV, incluindo os que não tiveram sucesso com a terapia anterior com interferão-alfa (IFN-a), de uma forma semelhante às PBMC de indivíduos saudáveis.

Foi observado que a secreção de IFN-oí endógena foi fortemente induzida a partir de células dendríticas plasmacitóides (PDC), que se pensa serem infectadas por HCV resultando na sua disfunção e capacidade reduzida para responder a outros estímulos. Em alguns casos, foi verificado que as classes A e C de CpG, que induzem níveis elevados de IFN-α em PBMC de voluntários saudáveis, induziam os maiores níveis de IFN-α de PDC. Foi ainda observado que os ODN CpG de classe C semi-maleável são também particularmente úteis para este efeito. Estes ODN podem ser preferidos uma vez que não se acumulam no rim com dosagem repetida.

Foi ainda observado que nem IFN-α (Intron A) nem a ribavirina exógenos possuem quaisquer efeitos imunoestimuladores directos detectáveis em PBMC de indivíduos normais ou portadores crónicos de HCV, quando utilizados isolados ou em conjunto. Contudo, quando Intron A e ODN CpG (e. g. , classes B ou C) são 9 utilizados em conjunto, é então observada uma forte sinergia para a produção de IFN-α endógeno.

Estes resultados indicam que os ODN CpG são um tratamento eficaz, isolado ou em conjunto com IFN-α, para tratar infecção crónica de HCV. A presente divulgação proporciona métodos e produtos para prevenir e tratar infecção por HCV, com base nestas observações. A infecção crónica parece ser devida, pelo menos em parte, à rápida taxa de mutação de HCV, resultando na produção de quasi-espécies que podem escapar à vigilância imunitária (10, 11). Ambas as respostas imunitárias humoral e mediada por células (CMI) podem ser detectadas em indivíduos cronicamente infectados. Embora os anticorpos neutralizantes sejam críticos para a protecção contra infecção, a imunidade mediada por células (CMI) parece desempenhar o importante papel na eliminação virai uma vez estabelecida a infecção.

Num aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C compreendendo a sequência TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N° : 13). O ácido nucleico CpG imunoestimulador pode ser utilizado num método de tratamento de um indivíduo infectado com vírus da hepatite C (HCV) que não é tratado de uma forma bem sucedida com uma terapia não CpG prévia. 0 método compreende a administração a um indivíduo não responsivo com necessidade desse tratamento de um ácido nucleico CpG imunoestimulador compreendendo a sequência em SEQ ID N°: 13 numa quantidade eficaz para inibir a infecção. 10

Uma terapia não CpG, como aqui utilizado, é uma terapia que utiliza compostos activos ou inactivos que não são ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores. A terapia não CpG inclui o interferão-alfa. 0 IFN-alfa peguilado é normalmente administrado a indivíduos HCV (e. g., doentes humanos com HCV) , de um modo preferido em combinação com ribavirina e opcionalmente amantadina. 0 interferão-alfa pode ser o interferão-alfa-2b, interferão-alfa-2a ou interferão-alfa de consenso. Todos os tratamentos anteriores com interferão-alfa são incluídos na definição de terapia não CpG.

Um indivíduo que não é tratado de forma bem sucedida com uma terapia prévia não CpG é um indivíduo que, apesar do tratamento anterior, possui uma carga virai detectável na sua corrente sanguínea 6 meses após a cessação da terapia. Estes indivíduos incluem os que podem responder a uma terapia anterior não CpG, mas que falharam no controlo da infecção e subsequentemente recaíram como indicado pela carga virai detectável. Como aqui utilizado e em prol da simplicidade, estes indivíduos são referidos como "não-responsivos", contudo este termo deve ser entendido como aqui definido, e não como definido num sentido clínico. Por outras palavras, embora num sentido clínico um "não-responsivo" define apenas esse estreito subconjunto de indivíduos que falham em conseguir mostrar alguma resposta a um tratamento, a invenção é dirigida para uma categoria mais vasta de indivíduos que embora por vezes responda a alguns níveis a um tratamento prévio, não são ainda tratados com sucesso. Um indivíduo que é tratado com sucesso é um que não tenha uma carga virai detectável na sua corrente sanguínea 6 meses após a cessação do tratamento. 0 tratamento bem sucedido significa o tratamento que leva a um nível indetectável da carga virai na 11 corrente sanguínea que é prolongada durante, pelo menos, 6 meses após cessação do tratamento. Deve ser entendido que um não responsivo, como aqui utilizado, é também implicitamente um infectado cronicamente com HCV.

Como aqui utilizado, no que se refere ao tratamento utilizando ácidos nucleicos CpG, os métodos são utilizados para conseguir um tratamento bem sucedido de indivíduos. 0 tratamento bem sucedido de indivíduos utilizando o tratamento CpG é definido como uma redução da carga virai a níveis não detectáveis na corrente sanguínea 6 meses após a cessação da terapia. Interessantemente, as cargas virais podem não ser observadas a diminuir durante ou imediatamente após tratamento com CpG, mas em vez disso, pode apenas diminuir com o tempo após tratamento, com o resultado final que é não existir vírus detectáveis na corrente sanguínea destes indivíduos 6 meses após a cessação do tratamento. Tratar uma infecção significa, deste modo, reduzir a carga virai a um nível não detectável na corrente sanguínea de um indivíduo e suster esse nível durante 6 meses após a cessação do tratamento. São deste modo administradas quantidades eficazes de agentes para conseguir este resultado final.

Os potenciais não responsivos podem ser identificados prospectivamente (i. e., antes do tratamento real in vivo com uma terapia não CpG) e a presente divulgação proporciona métodos não apenas para a identificação destes indivíduos mas também para o seu tratamento. Os potenciais não responsivos podem ser identificados avaliando a sua capacidade para responder a ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores, particularmente de classe A e classe C. A capacidade para responder a ácidos nucleicos CpG 12 imunoestimuladores será avaliada pela quantidade de interferão-alfa que é produzida por PDC em indivíduos infectados com HCV. Foi observado, que os indivíduos infectados com HCV que não teriam probabilidade para responder a terapia não CpG, tal como a terapia IFN-alfa, podiam ser identificados antes de receberem este tratamento. A capacidade para identificar estes indivíduos antes da terapia in vivo elimina o tratamento desnecessário e coloca os indivíduos numa posição terapeuticamente vantajosa para o tratamento com os ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores da invenção isolados ou em combinação com outras terapias anti-HCV incluindo mas não limitado a IFN-alfa. Estes indivíduos sofrerão de menos citotoxicidade e o período de tempo para o crescimento virai será reduzido mas não sofrendo um tratamento que não será bem sucedido. Os indivíduos possuindo abaixo de um nível razoável de indução de IFN-alfa por PDC não terão provavelmente um tratamento bem sucedido com IFN-alfa e deste modo, devem ser tratados utilizando os métodos aqui proporcionados. A medição da indução de IFN-alfa e números de PDC são descritos em mais detalhe nos Exemplos.

Deve ser entendido que um indivíduo infectado com HCV que é tratado de forma bem sucedida com qualquer dos agentes terapêuticos e métodos aqui discutidos, terão provavelmente ainda vírus no seu corpo. Contudo, enquanto o indivíduo não é capaz de erradicar completamente o vírus, é capaz de controlar a carga virai (a níveis não detectáveis) . Embora não se pretenda estar ligado a qualquer teoria particular, espera-se que a manutenção não detectável das cargas virais nestes indivíduos envolve um sistema imunitário que é capaz de controlar a replicação e disseminação virai. 13

Um técnico com conhecimento geral, dados os ensinamentos aqui proporcionados, será capaz de determinar se um indivíduo tem probabilidade de ser um "não-responsivo" a terapia IFN-alfa. Como um exemplo, se a indução de IFN-alfa foi efectuada com um ácido nucleico de classe A, tal como o ácido nucleico designado SEQ ID N° 1, sob as condições de cultura descritas nos Exemplos, então, uma resposta normal indicativa da capacidade para responder a terapia IFN-alfa será de, pelo menos, 1 pg/mL por PDC. Uma quantidade inferior a esta é indicativa de alguma disfunção de PDC. Quantidades inferiores a 0,5 pg/mL por PDC correlaciona-se com um maior probabilidade de não resposta ao tratamento IFN-alfa. Um especialista normal será capaz de determinar estes limiares para o tipo particular de ácido nucleico utilizado no ensaio e será deste modo capaz de identificar indivíduos que se espera não serem tratados de forma bem sucedida com a terapia IFN-alfa (pelo menos) antes de tratar estes indivíduos dessa forma. O método de identificar um indivíduo que é provavelmente um não responsivo a terapia não CpG (e. g., terapia IFN-alfa) pode ainda incluir a identificação do genótipo de HCV com que ele/ela está infectado. É mais provável que um indivíduo infectado com um genótipo 1 de HCV não seja tratado com sucesso com terapia IFN-alfa, for exemplo. Deste modo, Além da avaliação da produção de IFN-alfa por DC nestes indivíduos, o seu genótipo de HCV pode também ser determinado (utilizando métodos conhecidos na técnica) e esta combinação de informação pode ser utilizada para identificar um indivíduo que é provavelmente não responsivo a terapia IFN-alfa. 14

Deverá ser entendido ainda que em alguns aspectos, a presente divulgação proporciona um método para identificar um indivíduo que é não é provavelmente tratado com sucesso utilizando uma terapia não CpG (sem tratar realmente o indivíduo com a terapia não CpG) e, depois, trata o indivíduo utilizando ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores isolados ou em combinação com um agente antiviral, tal como, mas não limitado a, IFN-alfa.

Os métodos acima podem também ser utilizados para pesquisar indivíduos quanto à sua resposta a ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores particulares.

Os métodos podem envolver o passo adicional de identificar indivíduos que receberam terapia prévia não CpG mas que não foram tratados com sucesso. Os especialistas normais, dado os ensinamentos aqui proporcionados, serão capazes de identificar estes indivíduos. Como um exemplo, estes indivíduos terão cargas virais detectáveis na sua corrente sanguínea 6 meses após a cessação de tratamento. Estes indivíduos podem também demonstrar uma redução na carga virai imediatamente após tratamento, mas esta redução não é prolongada.

Verificou-se que os indivíduos tratados sem sucesso com uma terapia não CpG prévia podem ser tratados utilizando, inter alia, ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores isolados ou em combinação com outros agentes activos, tal como os previamente descritos para a infecção por HCV. Como amplamente definido, os ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores são ácidos nucleicos possuindo, pelo menos, um motivo dinucleótido CpG em que, pelo menos, o C do dinucleótido é não metilado. Os ácidos nucleicos 15

CpG imunoestimuladores incluem, mas não estão limitados a ácidos nucleicos imunoestimuladores CpG de classe A, classe B e classe C, como descrito aqui em mais detalhe e na patente e pedidos de patente aqui citados. Estas classes de ácido nucleico CpG imunoestimulador têm propriedades e perfis de activação que as diferenciam.

De acordo com a presente invenção, o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico imunoestimulador de classe C. Verificou-se surpreendentemente que os ácidos nucleicos imunoestimuladores de classe C eram preferidos, ainda que estes ácidos nucleicos possuíssem propriedades intermédias entre a classe A e classe B. Os Exemplos aqui proporcionados demonstram que, apesar de a PDC de indivíduos cronicamente infectados tratados sem sucesso com um terapia prévia não CpG são eles próprios infectados com HCV e deste modo disfuncionais em alguns aspectos, a exposição destas células a ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores e, em particular ácidos nucleicos imunoestimuladores de classe C, restaura a sua função. É também preferido que os ácidos nucleicos imunoestimuladores de classe C sejam uma variedade "maleável" ou "semi-maleável", como aqui descrito em maior detalhe. De um modo preferido, o CpG imunoestimulador é um ácido nucleico de classe C semi-malável.

Os ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores podem ser utilizados em combinação com agentes activos que, de um modo preferido, incluem os previamente descritos para tratamento de HCV. De particular importância é a utilização de ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores com interferão-α (e. g., Intron A). Os interferões que podem ser utilizadas em combinação com os ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores da invenção incluem, mas 16 não são limitados ao interferão-alfa-2b, interferão-alfa-2a ou interferão-alfa de consenso. Outros anti-virais são aqui descritos. Como um exemplo, foi inesperadamente observado que, de acordo com a invenção, embora o interferão-a exogenamente administrado falhe no tratamento bem sucedido destes indivíduos, quando combinado com ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores é terapeuticamente eficaz. 0 ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico imunoestimulador de classe C. De um modo preferido, é um ácido nucleico de classe C semi-maleável. 0 tempo de administração do ácido nucleico CpG e agente antiviral (e. g. , interferão-alfa) pode variar dependendo do indivíduo e gravidade da infecção. 0 ácido nucleico CpG pode ser administrado substancialmente em simultâneo com o agente antiviral. Isto significa que os dois agentes podem ser combinados antes da administração ou podem ser combinados no processo de administração (e. g., com ambos alimentados por uma linha intravenosa num indivíduo), ou estes podem ser administrados separadamente num período de tempo que levará alguém a realizar duas administrações (e. g., o tempo para injectar um indivíduo duas vezes). Independentemente de se os agentes são administrados substancialmente em simultâneo ou de uma forma faseada, a ordem pode variar. De acordo com o exposto, o ácido nucleico CpG imunoestimulador pode ser administrado antes de um agente antiviral, tal como IFN-alfa enquanto outros podem ser administrados após o agente antiviral.

Quando os ácidos nucleicos CpG são utilizados em conjunto com outros anti-virais (e. g., IFN-alfa), estes compostos podem ser administrados numa quantidade combinada que é terapeuticamente eficaz. A quantidade de qualquer composto pode, 17 deste modo, ser subterapêutico ou supraterapêutico (i. e., abaixo ou acima da quantidade que será terapeuticamente eficaz quando administrado isolado). Alternativamente, os compostos podem ser, cada um, administrado numa quantidade terapêutica, mas a combinação destes agentes produz um beneficio terapêutico, tal como uma redução de efeitos secundários. Se o antiviral é IFN-alfa, é, de um modo preferido, administrado numa quantidade terapêutica. Independentemente das quantidades reais administradas, a combinação de agentes pode ser sinérgica. Uma resposta sinérgica é uma que é maior do que a resposta aditiva esperada pela combinação dos agentes.

De acordo com a descrição acima proporcionada, a presente divulgação proporciona métodos para a pesquisa de ácidos nucleicos CpG com a capacidade de estimularem células imunitárias isoladas de um indivíduo cronicamente infectado com HCV e tratado sem sucesso com a terapia não CpG ou que provavelmente era não responsivo a terapia não CpG. Estes métodos de pesquisa são geralmente realizadas in vitro pelo contacto de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) com um ácido nucleico CpG imunoestimulador numa quantidade eficaz suficiente para estimular uma resposta imunitária. A resposta imunitária pode ser medida por qualquer número de marcadores, incluindo a produção de IFN-alfa, estimulação de células B, secreção de citocinas tal como IL-6, IL-10, IL- 12, interferão-gama, interferões tipo 1 (alfa + beta), secreção de quimiocinas, tal como IP-10, actividade de NK, expressão de moléculas coestimuladoras (e. g., CD80, CD 86) e moléculas de maturação (e. g., CD83) e sobre-regulação da expressão de MHC de classe II. 18

As células imunitárias podem ser células dendríticas, e, de um modo preferido, células dendríticas plasmacitóides (PDC) e os marcadores de resposta imunitária podem ser específicos deste tipo de células. Estas incluem, mas não se limitam a, expressão de moléculas coestimuladoras (e. g., CD80 e CD86), expressão de moléculas de maturação (e. g., CD83), expressão e/ou secreção de IL-12 e interferões do tipo 1 (alfa + beta), e sobre-regulação da expressão de MHC de classe II. Deve ser entendido que estes ensaios in vitro não são dependentes do isolamento de células dendríticas tal como PDC dos restantes PBMC. Deste modo, os ensaios podem ser efectuados em populações homogéneas de PBMC. A presente divulgação proporciona um método para identificar um indivíduo possuindo uma infecção virai da hepatite crónica C para ser tratado com um ácido nucleico CpG imunoestimulador. 0 método envolve a exposição das células mononucleares de sangue periférico recolhidas de um indivíduo possuindo uma infecção virai da hepatite C crónica a i) um ácido nucleico CpG imunoestimulador, e ii) um ácido nucleico CpG imunoestimulador e um antiviral (e. g., interferão-alfa) e a medição da resposta das células mononucleares de sangue periférico após exposição. Uma resposta a um ácido nucleico CpG imunoestimulador é indicativa de um indivíduo a ser tratado com um ácido nucleico CpG imunoestimulador após, ou em vez, da terapia não CpG (como descrito acima, mas apenas após identificar um indivíduo que é provavelmente não responsivo a uma terapia não CpG). Uma resposta a um ácido nucleico CpG imunoestimulador em conjunto com um agente antiviral (e. g., interferão-alfa) que é superior à resposta ao ácido nucleico CpG imunoestimulador isolado é indicativo de um indivíduo a ser tratado com a combinação. Como aqui descrito, o agente antiviral pode ser um interferão-alfa 19 incluindo, mas não limitado a interferão-alfa-2b, interferão-alfa-2a ou interferão-alfa de consenso. De um modo preferido, as células mononucleares de sangue periférico compreendem células dendriticas, tal como células dendriticas plasmacitóides. A invenção refere-se ao tratamento de indivíduos identificados tal como descrito utilizando ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores isolados ou em combinação com um agente antiviral (e. g., IFN-α), dependendo do resultado do ensaio de rastreio.

As estratégias clinicas compreendem a administração local e sistémica in vivo destes ácidos nucleicos, assim como estratégias ex vivo em que as PDC isoladas de indivíduos não responsivos infectados com HCV são activadas in vitro com ácidos nucleicos imunoestimuladores e depois submetidos novamente a infusão no doente localmente ou sistemicamente. Estas estratégias terapêuticas podem incluir a combinação com outros factores de crescimento (IL-3, GM-CSF, flt3-ligando, etc.) assim como com outros estímulos (superantigénios, produtos virais). Uma vez que o IFN-α natural é uma família de mais do que uma dúzia de produtos de genes separados, aos quais produtos individuais têm perfis de actividade únicos, a utilização clínica do interferão natural pode ser preferida em comparação com um IFN-α recombinante derivado de um único gene de IFN-oí recombinante. A presente divulgação proporciona ainda um método de activação de PDC de um indivíduo infectado com Hepatite C. 0 método envolve isolamento de PDC do indivíduo em necessidade deste tratamento, cultura das PDC isoladas in vitro, contacto das PDC in vitro com uma quantidade eficaz de um ácido nucleico imunoestimulador isolado e recolocação das células que estiveram 20 em contacto no indivíduo. As células podem também ser postas em contacto in vitro com um factor de crescimento ou com uma citocina. Os ácidos nucleicos imunoestimuladores e as condições que pedem o tratamento com IFN-α, de acordo com este aspecto, são como descritos acima. 0 próprio IFN-alfa representa uma família de mais do que uma dúzia proteínas relacionadas, homólogas (isoformas, ver Tabela 1 a seguir), cada uma codificada por um único gene e exibindo cada uma um único perfil de actividade. As actividades das diferentes espécies de alfa-interferão em vírus pode variar tanto quanto vinte vezes ou mais. Os produtos de IFN-alfa em utilização clínica são proteínas recombinantes ou proteínas naturais altamente purificadas de uma única isoforma. Nos Estados Unidos o IFN-α está disponível como IFN-a2a humano recombinante (ROFERON-A), IFN-a2b humano recombinante (INTRON A) e como IFN-an3 natural purificado (ALFERON N). Fora dos Estados Unidos, o IFN-α está também disponível como IFN-αηΙ natural purificado (WELLFERON).

Tabela 1. Família de IFN-α Humano IFN-OíA (lFN-a2a) IFN-0(2 (IFN-0(2b) IFN-a4b (IFN-CX4) IFN-aB2 (IFN-0í8) IFN-aC (IFN-alO) IFN-aD (IFN-al) IFN-aF (IFN-a21) IFN-aG (IFN-a5) 21 IFN-CXH2 (IFN-oí14) IFN-αΙ (IFN-al7) IFN-aJl IFN-αΚ (IFN-a7) (IFN-a6) IFN-aMl

IFN-aN

IFN-aWA (IFN-al6)

Alguns dos métodos da presente divulgação requerem a medição das respostas imunitárias incluindo a detecção da presença de IFN-α. Os ensaios para IFN-α são bem conhecidas na técnica. Estes incluem testes directos, e. g., ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) especifico para, pelo menos, um IFN-α, e testes indirectos, e. g., testes funcionais incluindo activação de células NK/citotoxicidade (Trinchieri G Adv Immunol 47:187-376 (1989) e fenotipagem por análise de selecção de células activadas por fluorescência (FACS) de MHC de classe I. os métodos de ensaio específicos adicionais bem conhecidos na técnica podem ser particularmente úteis nos casos em que é de interesse a concentração local ou a presença local de IFN-a. Estes métodos incluem, por exemplo, imuno-histoquímica, hibridação de ácidos nucleicos (e. g., transferência de

Northern), transferência de Western, transcriptase reversa/reacção de polimerase em cadeia (RT/PCR) e RT/PCR in situ. 0 IFN-α intracelular pode também ser detectada utilizando citometria de fluxo.

Os métodos da presente divulgação em alguns aspectos envolvem a medição activação de PDC. A activação de PDC pode ser ensaiada de várias formas. Estas incluem produção de IFN-oí, expressão de moléculas coestimuladoras (e. g., CD80 e CD86), 22 expressão de moléculas de maturação (e. g., CD83), expressão de IL-12 e sobre-regulação da expressão de MHC de classe II. Ao contrário da administração de IFN-α exógeno, activação de PDC leva à produção de várias, se não todas, as formas de IFN-a, assim como outros tipos de IFN I, tal como IFN-β. Deste modo, as PDC são activadas como medido pela sua capacidade para produzir interferões do tipo I incluindo IFN-a. A presente divulgação proporciona vários métodos gue envolvem ácidos nucleicos imunoestimuladores. Um ácido nucleico imunoestimulador é uma molécula de ácido nucleico gue, após entrar em contacto com as células do sistema imunitário, é ele próprio capaz de induzir gue as células contactadas do sistema imunitário proliferem e/ou fiquem activadas. 0 contacto pode ser directo ou indirecto, e. g., o ácido nucleico imunoestimulador pode directamente estimular um primeiro tipo de célula imunitária para expressar um produto que pode, por sua vez, estimular um segundo tipo de célula imunitária que não foi exposta a, ou não é responsiva ao, ácido nucleico imunoestimulador. 0 efeito imunoestimulador do ácido nucleico imunoestimulador é separado de qualquer produto que pode ser codificado por uma sequência do ácido nucleico imunoestimulador. Do mesmo modo, o efeito imunoestimulador de um ácido nucleico imunoestimulador é distinto de e não se baseia em qualquer mecanismo anti-sentido.

Apenas certos ácidos nucleicos são ácidos nucleicos imunoestimuladores. Originalmente acreditou-se que certas sequências palindrómicas eram imunoestimuladoras. Tokunaga T et al. Microbiol Immunol 36:55-66 (1992); Yamamoto T et al. Antisense Res Dev 4:119-22 (1994). Outro trabalho demonstrou que 23 sequências não palindrómicas são também imunoestimuladoras desde que os dinucleótidos CpG contidos no contexto da sequência particular (motivos CpG). Krieg AM et al. Nature 374:546-9 (1995).

Os ácidos nucleicos imunoestimuladores podem ser de cadeia única ou cadeia dupla. Geralmente, as moléculas de ácido nucleico de cadeia dupla são mais estáveis in vivo, enquanto as moléculas de ácido nucleico de cadeia única aumentaram a actividade imunitária. Deste modo, em algumas formas de realização da invenção, é preferido que o ácido nucleico imunoestimulador seja de cadeia única e noutros aspectos é preferido que o ácido nucleico imunoestimulador seja de cadeia dupla.

Os produtos proporcionados de acordo com a invenção são oligonucleótidos CpG. 0 ODN CpG desencadeou a proliferação da maior parte das células B (>95%), a secreção de imunoglobulina (Ig), IL-6 e IL-12, e protecção de apoptose. Além disso, o ODN CpG causa a maturação de DC e também a activação directa de DC, monócitos, e macrófagos para segregar IFN-α/β, IL-6, IL-12, GM-CSF, quimiocinas e TNF-α. Estas citocinas estimulam as células assassinas naturais (NK) a segregar IFN-γ e aumentaram a actividade lítica. Globalmente, o CpG induz um forte padrão do tipo Thl de produção de citocina dominada por IL-12 e IFN-γ com pouca secreção de citocinas Th2.

Além da indução de respostas imunitárias inatas, o ADN CpG também aumenta as respostas específicas para antigénio devido a (i) uma forte sinergia entre as vias de sinalização de células B desencadeadas através do receptor do antigénio de células B e 24 por CpG, (ii) as citocinas de tipo Thl que substitui ou aumenta auxiliares T especificas para antigénio aumentando as respostas de células B e T específicas para o antigénio e (iii) sobre-regulação de moléculas co-estimuladora que são necessárias para as respostas celulares.

Os ODN CpG foram apresentados como sendo um adjuvante potente para HBsAg em murganhos BALB/c com claras respostas do tipo Thl (predominantemente anticorpos IgG2a e CTL forte) (49). Verificou-se que o ODN CpG era superior a outros adjuvantes Thl, tal como monofosforil lípido A (MPL, Corixa) ou mesmo o adjuvante completo de Freund (CFA) que é demasiado tóxico para utilização humana. Os resultados semelhantes foram reportados utilizando o ODN CpG com uma variedade de outros antigénios (47, 50-53). Foi também reportado que o ODN CpG que redireccionava uma resposta Th2 previamente estabelecida por imunização com um antigénio Th2 (i. e., antigénio de superfície de Schistosomiasis) (54) ou um adjuvante Th2 (i. e., alúm).

Existem, pelo menos, três classes básicas de ODN CpG que se verificou serem eficazes na estimulação de PBMC humanas saudáveis (Tabela 1) . Isto tem efeitos diferenciais que são provavelmente associados com os diferentes modos pelos quais os ODN CpG podem estimular as células imunitárias.

A classe B de ODN CpG é sintetizada com estruturas de fosforotioato resistente a nucleases e são geralmente caracterizadas por células B boas e activação de DC, levando à produção de IL-12 e anticorpo, mas apenas activação limitada de células NK. Esta classe de ODN funciona bem como um adjuvante de vacina, como foi já demonstrado num ensaio clínico de fase I/II 25 que testa CpG (um membro desta classe) (SEQ ID N°: 2) como um adjuvante para uma vacina comercial para a hepatite B (60). A classe A de ODN CpG é sintetizada com uma estrutura quimérica em que as extremidades 5' e 3' são fosforotioato e a região central de motivo CpG é fosfodiéster. Estes ODN são caracterizados por células B boas e activação de DC levando a uma maior produção de TFN-α mas limitada activação de células B. A classe C de ODN CpG é sintetizada com uma estrutura fosforotioato e tem propriedades estimuladoras intermédias das outras duas classes de ODN CpG (e. g., boa activação de células B assim como activação de células NK e DC).

Tabela 1:

Padrão de activação imunitária in vitro induzida pelas três diferentes classes de CpG ODN Classe Estrutura Células B Células Células IFN-a Assassinas dendríticas naturais A "sõs2 + ++++ ++++ ++++ B SI + + + + + + ++++ + C SI + + + + + + + + + +++ 26 iS-ODN são preparados com uma estrutura de fosforotioato 2SOS-ODN são preparados com uma estrutura quimérica em que a região central contendo CpG tem ligações fosfodiéster e as extremidades 3' e 5' do ODN sao preparadas com ligações fosforotioato

Os métodos da presente divulgação podem incluir a utilização da classe A, classe B e ácidos nucleicos imunoestimuladores CpG classe C. Como para os ácidos nucleicos CpG, foi recentemente descrito que existem diferentes classes de ácidos nucleicos CpG. Uma classe é potente para activação de células B mas é relativamente fraca na indução de IFN-α e activação de células NK; esta classe foi denominada classe B. Os ácidos nucleicos CpG classe B são tipicamente totalmente estabilizado e incluem um dinucleótido CpG não metilado em certos contextos de bases preferida. Ver, e. g., Patente U. S. N°s 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; e 6339068. Outra classe é potente para a indução de IFN-α e activação de células NK mas é relativamente fraca na estimulação células B; esta classe foi denominada a classe A. A classe A de ácidos nucleicos CpG estabilizaram tipicamente sequências poli-G nas extremidades 5' e 3' e uma sequência palindrómicas contendo dinucleótido CpG fosfodiéster de, pelo menos, 6 nucleótidos. Ver, por exemplo, pedido de patente publicado PCT/US00/26527 (documento WO 01/22990) . Apesar de outra classe de ácidos nucleicos CpG activar células B e células NK e induzir IFN-α; esta classe foi denominada a classe C. Os ácidos nucleicos CpG de classe C, como primeiro caracterizados, são tipicamente totalmente estabilizados, incluem uma sequência tipo classe B e um palindroma rico em GC ou palindroma próximo. Esta classe foi 27 descrita no pedido de patente U.S. provisório 60/313273, apresentado em 17 de Agosto de 2001, documento US10/224523 apresentado em 19 de Agosto de 2002.

Os ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores de "classe A" foram descritos no Pedido de Patente U.S. Não Provisório N° de Série: 09/672126 e pedido PCT publicado PCT/US00/26527 (documento WO 01/22990), ambos apresentados em 27 de Setembro de 2000. Estes ácidos nucleicos são caracterizados pela capacidade de induzir níveis elevados de interferão-alfa embora possuindo efeitos mínimos na activação de células B. O ácido nucleico CpG imunoestimulador classe A não contém necessariamente um palindroma hexâmero GACGTC, AGCGCT ou AACGTT descritos por Yamamoto e colegas. Yamamoto S et al. J Immunol 148:4072-6 (1992) .

As sequências exemplificativas de ácidos nucleicos imunoestimuladores de classe A são descritos no Pedido de Patente U.S. Não Provisória N° de Série: 09/672126 e pedido PCT publicado PCT/US00/26527 (documento WO 01/22990), apresentados em 27 de Setembro de 2000.

Os ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores classe B activam fortemente células B humanas mas têm efeitos mínimos que induzem o interferão-α. Os ácidos nucleicos CpG imunoestimuladores classe B foram descritos nas USP 6194388 BI e 6239116 Bl, emitidas em 27 de Fevereiro de 2001 e 29 de Maio de 2001 respectivamente.

Os oligonucleótidos CpG da invenção são oligonucleótidos que incluem, pelo menos, um dinucleótido CpG não metilado. Um 28 oligonucleótido contendo, pelo menos, um dinucleótido CpG não metilado é uma molécula de ácido nucleico que contém uma sequência de dinucleótido citosina-guanina não metilado (i. e., "ADN CpG" ou ADN contendo uma citosina 5' seguida por guanina 3' e ligada através de uma ligação fosfato) e activa o sistema imunitário. Todo o oligonucleót ido CpG pode ser não metilado ou porções podem ser não metilado mas, pelo menos, o C do 5' CG 3' deve ser não metilado. Os termos oligonucleótido CpG ou ácido nucleico CpG como aqui utilizado refere-se a um oligonucleótido CpG imunoestimulador ou um ácido nucleico a menos que indicado o contrário.

Os oligonucleótidos CpG classe B podem ser representados por, pelo menos, a fórmula: 5' X1X2CGX3X4 3' em que Xi, X2, X3, e X4 são nucleótidos. X2 pode ser adenina, guanina ou timina. X3 pode ser citosina, adenina ou timina.

Um oligonucleótido CpG isolado de classe B pode ser representado por, pelo menos, a fórmula: 5 ' ISPX3X2CGX3X4N2 3' em que Xlr X2, X3 e X4 são nucleótidos e N é qualquer nucleótido e Ni e N2 são sequências de ácido nucleico composto de cerca de 0-25 N cada. X1X2 pode ser um dinucleótido seleccionado do grupo consistindo em: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT e TpG; e X3X4 pode ser a dinucleótido seleccionado do grupo consistindo em: TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, 29 ΤρΑ, ΑρΑ e CpA. De um modo preferido, X1X2 é GpA ou GpT e X3X4 é TpT. Xi ou X2 ou ambos, podem ser purinas e X3 ou X4 ou ambos podem ser pirimidinas ou XxX2 pode ser GpA e X3 ou X4 ou ambos podem ser pirimidinas. De um modo preferido, X]X2 é um dinucleótido seleccionado do grupo consistindo em: TpA, ApA, ApC, ApG e GpG. X3X4 pode ser um dinucleótido seleccionado do grupo consistindo em: TpT, TpA, TpG, ApA, ApG, GpA e CpA. XiX2 pode ser um dinucleótido seleccionado do grupo consistindo em: TpT, TpG, ApT, GpC, CpC, CpT, TpC, GpT e CpG; X3 pode ser um nucleótido seleccionado do grupo consistindo em A e T e X4 é um nucleótido, mas em que quando XiX2 é TpC, GpT ou CpG, X3X4 não é TpC, ApT ou ApC.

De um modo preferido, o oligonucleótido CpG possui uma sequência 5' TCNiTXiX2CGX3X4 3' (SEQ ID N°:26). Os oligonucleótidos CpG incluem, opcionalmente, XiX2 seleccionado do grupo consistindo em GpT, GpG, GpA e ApA e X3x4 pode ser seleccionado do grupo consistindo em TpT, CpT e TpC.

As sequências de ácido nucleico CpG classe B são os amplamente descritos acima assim como divulgado nos Pedidos de Patente PCT Publicados PCT/US95/01570 e PCT/US97/19791, e USP 6194388 BI e USP 6239116 Bl, concedidas em Fevereiro de 2001 e 29 de Maio de 2001 respectivamente.

Os ácidos nucleicos imunoestimuladores de classe C contendo, pelo menos, dois motivos distintos têm efeitos únicos e estimuladores desejáveis em células do sistema imunitário.

Alguns destes ODN possuem ambos uma tradicional sequência "estimuladora" CpG e um motivo "rico em GC" ou "neutralizante de célula B". Este motivo de combinação de ácidos nucleicos tem 30 efeitos de estimulação imunitária que se enquadram algures entre os efeitos associados com ODN CpG tradicionais de "classe B", que são fortes indutores de activação de células B e activação de células dendriticas (DC), e estes efeitos associados com uma classe de ácidos nucleicos estimuladores de imunidade (ODN CpG "classe A") mais recentemente descrita que são fortes indutores de IFN-α e activação de células assassinas naturais (NK) mas indutores relativamente pobres de células B e activação de DC. Krieg AM et ai. (1995) Nature 374:546-9; Bailas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5 ; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6. Enquanto os ODN CpG classe B preferidos têm frequentemente estruturas fosforotioato e os ODN CpG classe A preferidos têm estruturas mistas ou quiméricas, os ácidos nucleicos estimuladores de imunidade de classe C com motivo de combinação podem ser estabilizados, e. g., estruturas fosforotioato, quiméricos ou fosfodiéster, e em algumas formas de realização preferidas, estas têm estruturas semi-maleáveis. A invenção proporciona ácidos nucleicos estimuladores de imunidade pertencentes a esta nova classe de ácidos nucleicos estimuladores de imunidade com motivos de combinação. O domínio estimulador de células B é definido por uma fórmula: 5'XxDCGHX2 3', D é outro nucleótido que não C. C é citosina. G é guanina. H é outro nucleótido que não G.

Xx e X2 são qualquer sequência de ácido nucleico de 0 a 10 nucleótidos de comprimento. Χχ pode incluir um CG, caso em que é, de um modo preferido, um T que precede imediatamente este CG. DCG pode ser TCG. Χχ é, de um modo preferido, de 0 a 6 nucleótidos de comprimento. X2 pode não conter quaisquer motivo 31 poli G ou poli A. 0 ácido nucleico imunoestimulador pode ter uma sequência poli-T na extremidade 5' ou na extremidade 3'. Como aqui utilizado, "poli-A" ou "poli-T" deve referir-se a uma cadeia de quatro ou mais A ou T consecutivos, respectivamente, e. g., 5' AAAA 3' ou 5' TTTT 3'.

Como aqui utilizado, "extremidade poli-G" deve referir-se a uma cadeia de quatro ou mais G consecutivos, e. g., 5' GGGG 3', que ocorrem na extremidade 5' ou na extremidade 3' de um ácido nucleico. Como aqui utilizado, "ácido nucleico poli-G" deve referir-se a um ácido nucleico possuindo a 'fórmula 5' X1X2GGGX3X4 3' em que Xi, X2, X3 e X4 são nucleótidos e, de um modo preferido, pelo menos, um de Y3 e X4 é um G.

Algumas concepções preferidas para o domínio estimulador de células B sob esta fórmula compreendem TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT. 0 segundo motivo do ácido nucleico é referido como P ou N e é posicionada imediatamente 5' a Xi ou imediatamente 3' a X2. N é uma sequência que neutraliza células B que começa com um trinucleótido CGG e tem, pelo menos, 10 nucleótidos de comprimento. Um motivo de neutralização de células B inclui, pelo menos, uma sequência CpG em que o CG é precedido por um C ou seguido por um G (Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95:12631-12636) ou é uma sequência de ADN contendo CG em que o C do CG é metilado. Como aqui utilizado, "CpG" deve referir-se a uma 5' citosina (C) seguida por uma guanina 3' (G) e ligada por uma ligação fosfato. Pelo menos, o C do 5' CG 3' deve ser não metilado. Os motivos neutralizantes são motivos que possuem 32 alguns graus de capacidade imunoestimuladora quando presente no motivo e de outro modo não estimulador, mas, que quando presente no contexto de outros motivos imunoestimuladores serve para reduzir o potencial imunoestimulador dos outros motivos. P é uma sequência contendo um palindroma rico em GC com, pelo menos, 10 nucleótidos de comprimento. Como aqui utilizado, "palindroma" e, equivalentemente, "sequência palindrómica" deve referir-se a uma repetição invertida, i. e., uma sequência, tal como ABCDEE 'D 'C 'B Ά' em que A e A', B e B', etc., são bases capazes de formar os pares de bases de Watson-Crick usuais.

Como aqui utilizado, "palindroma rico em GC" deve referir-se a um palindroma possuindo uma composição de bases de, pelo menos, dois terços de G e C. O domínio rico em GC é, de um modo preferido, 3' em relação ao "domínio estimulador de células B". No caso de um palindroma rico em GC de 10 base de comprimento, o palindroma contém assim pelo menos 8 G e C. No caso de um palindroma rico em GC de 12 bases de comprimento, o palindroma também contém pelo menos 8 G e C. No caso de um palindroma rico em GC de 14 mero, pelo menos, dez bases do palindroma são G e C. O palindroma rico em GC pode ser produzido exclusivamente de G e C. O palindroma rico em GC pode possuir uma composição base de, pelo menos, 81 porcento de G e C. No caso desse palindroma rico em GC de 10 bases de comprimento, o palindroma é por isso produzido exclusivamente de G e C. No caso de um tal palindroma rico em GC de 12 bases de comprimento, é preferido que, pelo menos, dez bases (83 porcento) do palindroma sejam G e C. De um modo preferido, um palindroma rico em GC de 12 bases de 33 comprimento é produzido exclusivamente de G e C. No caso de um palindroma rico em GC de 14 mero, pelo menos doze bases (86 porcento) do palindroma são G e C. De um modo preferido, um palindroma rico em GC de 14 bases de comprimento é produzido exclusivamente de G e C. Os C' s de um palindroma rico em GC podem ser não metilados ou podem ser metilados.

Em geral, este domínio possui, pelo menos, 3 C e G, de um modo mais preferido 4 de cada, e de um modo muito preferido 5 ou mais de cada. 0 número de C e G neste domínio não precisa de ser idêntico. É preferido que os C e G sejam arranjados de modo a que sejam capazes de formar um duplex auto-complementar, ou palindroma, tal como CCGCGCGG. Este pode ser interrompido por A ou T, mas é preferido que a auto-complementaridade seja, pelo menos, parcialmente preservada como por exemplo nos motivos CGACGTTCGTCG (SEQ ID N° : 27) ou CGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N° : 28).

Quando a complementaridade não é preservada, é preferido que os pares de bases não complementares sejam TG. De um modo preferido, existem não mais do que 3 bases consecutivas que não são parte do palindroma, de um modo preferido, não mais do que 2 e, de um modo muito preferido, apenas 1. 0 palindroma rico em GC pode incluir pelo menos um trímero CGG, pelo menos um trímero CCG, ou pelo menos um tetrâmero CGCG. 0 palindroma rico em GC pode não ser CCCCCCGGGGGG (SEQ ID: N° : 29) ou GGGGGGCCCCCC

(SEQ ID N°: 30), CCCCCGGGGG (SEQ ID N°: 31) ou GGGGGCCCCC (SEQ ID N°: 32) .

Pelo menos um dos G's da região rica em GC pode ser substituído por uma inosina (I) . P pode incluir mais do que uma I. 34 0 ácido nucleico imunoestimulador pode possuir uma das fórmulas seguintes 5' NXíDCGHXz 3', 5' X!DCGHX2N 3', 5' PXiDCGHX2 3', 5' XiDCGHX2P 3', 5' X^CGt^PXs 3', 5' X1DCGHPX3 3', 5' DCGHX2PX3 3', 5' TCGHX2PX3 3', 5' DCGHPX3 3' ou 5' DCGHP 3'.

Noutros aspectos a presente divulgação proporciona ácidos nucleicos estimuladores de imunidade que são definidos por uma fórmula: 5' N2PyGN2P 3'. Ni é qualquer sequência de 1 até 6 nucleótidos de comprimento. Py é uma pirimidina. G é guanina. N2 é qualquer sequência de 0 até 30 nucleótidos de comprimento, P é uma sequência contendo um palindroma rico em GC de, pelo menos, 10 nucleótidos de comprimento.

Ni e N2 podem conter mais do que 50% de pirimidinas e, de um modo mais preferido, mais do que 50% de T. Ni pode incluir um CG, em cujo caso existe, de um modo preferido, um T imediatamente antes deste CG. N2PyG pode ser TCG (tal como ODN 5376, que possui um 5' TCGG) e, de um modo mais preferido, um TCGN2, em que o N2 não é G.

NiPyGN2P pode incluir um ou mais nucleótidos de inosina (I). Quer o C ou o G em Ni podem ser substituídos por inosina, mas o Cpl é preferido ao IpG. Para substituições de inosina, tal como IpG, a actividade óptima pode ser alcançada com a utilização de uma estrutura "semi-mole" ou quimérica, em que a ligação entre o IG ou o Cl é fosfodiéster. Ni pode incluir pelo menos um motivo Cl, TCI, IG ou TIG.

NiPyGN2 pode ser uma sequência seleccionada do grupo consistindo em TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, e TCGTCGT. 35

Alguns exemplos não limitantes de ácidos nucleicos de Classe C incluem:

Especificamente, a presente invenção proporciona um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C compreendendo a sequência TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N°: 13). Em formas de realização, o ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C compreende a sequência TCGTCGTTTTAC-GGC-GCC-GTGCCG (SEQ ID N° : 13), TCGTCG-TTTTACGGCGCC-GTGCCG (SEQ ID N° : 14) ou TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID N°: 15), em que as ligações internucleótido apresentadas como são fosfodiéster e as restantes são fosforotioato. Opcionalmente, o ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C possui uma sequência de bases que consiste em TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N°: 13).

Para facilitar a incorporação nas células, os ácidos nucleicos imunoestimuladores, incluindo oligonucleótidos contendo CpG estão, de um modo preferido, no intervalo de 8 até 36 100 bases de comprimento. Contudo, os ácidos nucleicos de qualquer tamanho superior a 8 nucleótidos (ainda mais kb de comprimento) são capazes de induzir uma resposta imunitária de acordo com a invenção se estiverem presentes motivos imunoestimuladores suficientes, uma vez que são degradados ácidos nucleicos maiores nos oligonucleótidos dentro das células. De um modo preferido, o ácido nucleico imunoestimulador está no intervalo entre 8 e 100 nucleótidos de comprimento. De um modo preferido, os ácidos nucleicos imunoestimuladores está entre 12 e 40 nucleótidos de comprimento. De um modo preferido, os ácidos nucleicos imunoestimuladores estão entre 8 e 30 nucleótidos de comprimento. De um modo preferido, os ácidos nucleicos imunoestimuladores estão entre 8 e 24 nucleótidos de comprimento. "Sequência palindrómica" significará uma repetição invertida, i. e., uma sequência, tal como ABCDEE'D'C'B'A' em que A e A', B e B', C e C', D e D', e E e B' são bases capazes de formar os pares de bases de Watson-Crick normais. In vivo, essas sequências palindrómicas podem formar estruturas de cadeia dupla. Os oligonucleótidos CpG podem conter uma sequência palindrómica. Uma sequência palindrómica utilizada neste contexto refere-se a um palindroma no qual CpG é parte do palindroma e, de um modo preferido, é o centro do palindroma. Os oligonucleótidos CpG podem ser isentos de um palindroma. Um oligonucleótido CpG que está isento de um palindroma é aquele em que os dinucleótidos CpG não fazem parte de um palindroma. Um tal oligonucleótido pode incluir um palindroma em que o CpG não é o centro do palindroma. 37

Os oligonucleótidos imunoestimuladores da invenção incluem motivos imunoestimuladores que são "dinucleótidos CpG". Um dinucleótido CpG pode ser metilado ou não metilado. Um ácido nucleico imunoestimulador contendo, pelo menos, um dinucleótido CpG não metilado é uma molécula de ácido nucleico que contém uma sequência de dinucleótido não metilado citosina-guanina (i. e., uma citidina não metilada 5' seguida por uma guanosina 3' e ligada por uma ligação fosfato) e que activa o sistema imunitário; um tal ácido nucleico imunoestimulador é um ácido nucleico CpG. Ácidos nucleicos CpG foram descritos em várias patentes emitidas, pedidos de patente publicados, e outras publicações, incluindo as Patentes U. S. N° 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; e 6339068. Um ácido nucleico imunoestimulador contendo, pelo menos, um dinucleótido CpG metilado é um ácido nucleico que contém uma sequência de dinucleótido de citosina-guanina metilado (i. e., uma citidina 5' metilada seguida por uma guanosina 3' e ligadas por uma ligação fosfato) e que activa o sistema imunitário. Os oligonucleótidos imunoestimuladores podem ser isentos de dinucleótidos CpG. Estes oligonucleótidos que são isentos dos dinucleótidos CpG são referidos como oligonucleótidos não CpG, e possuem motivos imunoestimuladores não CpG. A presente descrição, por isso, também compreende ácidos nucleicos com outros tipos de motivos imunoestimuladores, que podem ser metilados ou não metilados. Os oligonucleótidos imunoestimuladores da presente divulgação, podem ainda incluir qualquer combinação de motivos imunoestimuladores CpG e não CpG metilados e não metilados.

As moléculas de ácido nucleico imunoestimulador da presente invenção podem possuir uma estrutura quimérica. Para os 38 objectivos da presente descrição, uma estrutura quimérica refere-se a uma estrutura parcialmente estabilizada, em que, pelo menos, uma ligação de internucleótido é fosfodiéster ou de tipo fosfodiéster, e em que pelo menos uma outra ligação de internucleótido é uma ligação de internucleótido estabilizada, em que a, pelo menos uma, ligação fosfodiéster ou de tipo fosfodiéster e a, pelo menos uma, ligação estabilizada são diferentes. Uma vez que as ligações de boranofosfonato foram relatadas como sendo estabilizadas em relação às ligações fosfodiéster, para objectivos da natureza quimérica da estrutura, as ligações boranofosfonato podem ser classificadas como de tipo fosfodiéster ou como estabilizadas, dependendo do contexto. Por exemplo, uma estrutura quimérica de acordo com a presente divulgação pode, numa forma de realização, incluir pelo menos uma ligação fosfodiéster (fosfodiéster ou de tipo fosfodiéster) e, pelo menos, uma ligação boranofosfonato (estabilizado). Uma estrutura quimérica de acordo com a presente divulgação pode incluir boranofosfonato (fosfodiéster ou de tipo fosfodiéster) e ligações fosforotioato (estabilizado). Uma "ligação de internucleótido estabilizado" pode significar uma ligação de internucleótido que é relativamente resistente a degradação in vivo (e. g., através de uma exo- ou endo-nuclease), em comparação com uma ligação de internucleótido fosfodiéster. Ligações de internucleótido estabilizado preferidas incluem, sem limitação, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, e metilfosforotioato . Outras ligações de internucleótido estabilizadas incluem, sem limitação: péptido, alquilo, desfosfo e outros como descrito acima. 39

Estruturas modificadas, tal como fosforotioatos, podem ser sintetizadas utilizando técnicas automatizadas que empregam químicas de fosforamidato ou H-fosfonato. Aril- e alquil-pliosfonatos pode ser produzidos, e. g., como descrito na Patente U.S. N° . 4 469 863; e alquilfosfotriésteres (em que a unidade de oxigénio carregado é alquilada como descrito na Patente U.S. N° 5023243 e a Patente Europeia N° 092574) podem ser preparados através da síntese em fase sólida automatizada utilizando reagentes disponíveis comercialmente. Foram descritos métodos para produzir outras modificações e substituições da estrutura de ADN. Uhlmann B et al. (1990) Chem Rev 90:544;

Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. São também conhecidos métodos para preparar oligonucleótidos quiméricos. Por exemplo, as patentes emitidas a Uhlmann et al descreveram essas técnicas. ODN modificado de estrutura mista pode ser sintetizado utilizando um sintetizador de ADN disponível comercialmente e química de fosforamidite convencional. (F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, RU, 1991, e M. D. Matteucci e Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)) Após acoplamento, as ligações PS são introduzidas através de sulfurização utilizando o reagente Beaucage (R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan e S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) (0,075 M em acetonitrilo) ou persulfureto de fenil acetilo (PADS) seguido por protecção com anidrido acético, 2,6-lutidina em tetra-hidrofurano (1:1:8; v:v:v) e N-metilimidazole (16% em tetra-hidrofurano). Este passo de protecção é realizado após a reacção de sulfurização para minimizar a formação de ligações fosfodiéster indesejadas (PO) nas posições onde deve estar 40 localizada uma ligação fosforotioato. No caso da introdução de uma ligação fosfodiéster, e. g. num dinucleótido CpG, o intermediário fósforo-III é oxidado através de tratamento com uma solução de iodo em água/piridina. Após clivagem a partir do suporte sólido e desprotecção final por tratamento com amónia concentrada (15 h a 50 °C) , os ODN são analisados por HPLC numa coluna Gen-Pak Fax (Millipore-Waters) utilizando um gradiente de NaCl (e. g. tampão A: 10 mM NaH2P04 em acetonitrilo/água l:4/v:v pH 6,8; tampão B: 10 mM NaH2P04, 1,5 M NaCl em acetonitrilo/água = l:4/v:v; 5 até 60% de B em 30 minutos a 1 mL/min) ou através de electrof orese em gel em capilar. O ODN pode ser purificado por HPLC ou por FPLC numa coluna Source High Performance (Amersham Pharmacia). As fracções homogéneas por HPLC são combinadas e dessalinizadas através de uma coluna C18 ou por ultrafiltração. O ODN foi analisado por espectrometria de massa MALDI-TOF para confirmar a massa calculada.

Os ácidos nucleicos da invenção podem também incluir outras modificações. Estes incluem análogos de ADN não iónicos, tais como alquil- e aril-fosfatos (em que o fosfonato de oxigénio carregado é substituído por um grupo alquilo ou arilo), fosfodiéster e alquilfosfotriésteres, em que a unidade de oxigénio carregada é alquilada. Os ácidos nucleicos que contêm diol, tal como tetraetilenoglicol ou hexaetilenoglicol, em qualquer um ou em ambos os terminais, também foram apresentados como sendo substancialmente resistentes à degradação pela nuclease.

Em algumas formas de realização os oligonucleótidos podem ser oligonucleótidos maleáveis ou semi-maleáveis. Um oligonucleótido maleável é um oligonucleótido imunoestimulador 41 possuindo uma estrutura parcialmente estabilizada, em que as ligações internucleótido fosfodiéster ou de tipo fosfodiéster ocorrem apenas dentro de pelo menos um dinucleótido pirimidina-purina interno (YZ) e imediatamente adjacente a este. De um modo preferido, YZ é YG, um dinucleótido de pirimidina-guanosina (YG). 0, pelo menos um, próprio dinucleótido YZ interno possui uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster. Uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster que ocorre imediatamente adjacente ao, pelo menos um, dinucleótido YZ interno pode estar 5', 3', ou ambos 5' e 3' em relação ao, pelo menos um, dinucleótido YZ interno.

Em particular, as ligações internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster envolvem "dinucleótidos internos". Um dinucleótido interno, em geral, significa qualquer par de nucleótidos adjacentes ligados por uma ligação internucleótido, em que nenhum dos nucleótidos no par de nucleótidos é um nucleótido terminal, i. e., nenhum nucleótido no par de nucleótidos é um nucleótido que define a extremidade 5' ou 3' do oligonucleótido. Assim, um oligonucleótido linear que tem n nucleótidos de comprimento possui um total de n-1 dinucleótidos e apenas n-3 dinucleótidos internos. Cada ligação internucleótido num dinucleótido interno é uma ligação internucleótido interna. Assim, um oligonucleótido linear que tem n nucleótidos de comprimento possui um total de n-1 ligações internucleótido e apenas n-3 ligações internucleótido internas. As ligações internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster colocadas estrategicamente, por isso, referem-se às ligações internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster posicionadas entre qualquer par de nucleótidos na sequência de ácido nucleico. Em algumas formas de realização as ligações 42 internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiésteres não estão posicionadas entre qualquer par de nucleótidos mais próximos da extremidade 5' ou 3'.

De um modo preferido, uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster que ocorre imediatamente adjacente ao, pelo menos um, dinucleótido YZ interno é ela própria uma ligação internucleótido interna. Assim, para uma sequência Ni YZ N2, em que Ni e N2 são cada um, independente do outro, qualquer nucleótido único, o dinucleótido YZ possui uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster, e além disso (a) Ni e Y estão ligados por uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster quando Ni é um nucleótido interno, (b) Z e N2 estão ligados por uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster quando N2 é um nucleótido interno, ou (c) N2 e Y estão ligados por uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster quando N2 é um nucleótido interno e Z e N2 estão ligados por uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster quando N2 é um nucleótido interno.

Crê-se que os oligonucleótidos maleáveis de acordo com a presente invenção sejam relativamente susceptiveis à clivagem pela nuclease em comparação com os oligonucleótidos completamente estabilizados. Sem pretender estar limitado por uma teoria ou mecanismo particular, crê-se que os oligonucleótidos maleáveis da invenção são cliváveis em fragmentos com actividade imunoestimuladora reduzida ou inexistente em relação a oligonucleótidos maleáveis de comprimento total. Crê-se que a incorporação de, pelo menos, uma ligação internucleótido sensível à nuclease, particularmente 43 próximo do meio do oligonucleótido, proporciona um "interruptor para desligar" que altera a farmacocinética do oligonucleótido de modo a reduzir a duração da actividade imunoestimuladora máxima do oligonucleótido. Isto pode ser de particular valor em tecidos e em aplicações clinicas em que é desejável evitar lesões relacionadas com inflamação local crónica ou imunoestimulação, e. g., o rim.

Um oligonucleótido semi-maleável é um oligonucleótido imunoestimulador possuindo uma estrutura parcialmente estabilizada, em que as ligações internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster ocorre apenas dentro de, pelo menos, um dinucleótido de pirimidinapurina (YZ) interno. Oligonucleótidos semi-maleáveis geralmente possuem potência imunoestimuladora aumentada em relação a oligonucleótidos imunoestimuladores correspondentes totalmente estabilizados. Devido à potência maior de oligonucleótidos semi-maleáveis, podem ser utilizados oligonucleótidos semi-maleáveis em alguns casos, a concentrações eficazes mais baixas e possuir doses eficazes mais baixas do que os oligonucleótidos imunoestimulador totalmente estabilizados convencionais de modo a alcançar um efeito biológico desejado.

Crê-se que as propriedades anteriores dos oligonucleótidos semi-maleáveis geralmente aumentam com o aumento da "dose" de ligações internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster envolvendo dinucleótidos YZ internos. Assim, crê-se, por exemplo, que geralmente para uma dada sequência de oligonucleótido com cinco dinucleótidos YZ internos, um oligonucleótido com cinco ligações internucleótido interno fosfodiéster ou tipo fosfodiéster YZ é mais imunoestimulador do que um oligonucleótido com quatro ligações internucleótido 44 interno fosfodiéster ou tipo fosfodiéster YG, que por sua vez é mais imunoest imulador do que um oligonucleót ido com três ligações internucleótido internas fosfodiéster ou tipo fosfodiéster YZ, que por sua vez é mais imunoestimulador do que um oligonucleótido com duas ligações internucleótido internas fosfodiéster ou tipo fosfodiéster YZ, que por sua vez é mais imunoestimulador do que um oligonucleótido com uma ligação internucleótido interna fosfodiéster ou tipo fosfodiéster YZ. Um caso importante, crê-se que a inclusão mesmo de uma única ligação internucleótido interno fosfodiéster ou tipo fosfodiéster YZ seja vantajosa em relação à ligação internucleótido interna fosfodiéster ou tipo fosfodiéster YZ. Além disso do número de ligações internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster, a posição ao longo do comprimento do ácido nucleico pode também afectar a potência.

Os oligonucleótidos maleáveis e semi-maleáveis irão geralmente incluir, além das ligações internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster nas posições internas preferidas, extremidades 5' e 3' que são resistentes à degradação. Essas extremidades resistentes à degradação podem envolver qualquer modificação adequada que resulta numa resistência aumentada contra a digestão de exonuclease em relação às extremidades correspondentes não modificadas. Por exemplo, as extremidades 5' e 3' podem ser estabilizadas através da inclusão de pelo menos uma modificação fosfato da estrutura. Numa forma de realização preferida, a, pelo menos uma, modificação de fosfato da estrutura em cada extremidade é independentemente uma ligação internucleótido fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato ou metilfosforotioato. Noutra forma de realização, a extremidade resistente à degradação 45 inclui uma ou mais unidades de nucleótido ligadas por ligações peptidicas ou amida na extremidade 3'.

Uma ligação internucleótido fosfodiéster é o tipo de ligação caracteristica dos ácidos nucleicos que se encontram na natureza. Como apresentado na Figura 20, uma ligação internucleótido fosfodiéster inclui um átomo de fósforo flanqueado por dois átomos de oxigénio em ponte e ligados também por dois átomos de oxigénio adicional, um carregado e o outro não carregado. A ligação internucleótido fosfodiéster é particularmente preferida quando é importante reduzir a semi-vida do tecido do oligonucleótido.

Uma ligação internucleótido tipo fosfodiéster é um grupo de ligação contendo fósforo que é quimicamente e/ou diastereomericamente semelhante ao fosfodiéster. Medidas de semelhança ao fosfodiéster incluem susceptibilidade à digestão com nuclease e a capacidade para activar a ARNase H. Assim, por exemplo os oligonucleótidos de fosfodiéster, mas não de fosforotioato, são susceptíveis à digestão com nuclease, embora ambos os oligonucleótidos fosfodiéster e fosforotioato activem a ARNase H. Numa forma de realização preferida, a ligação internucleótido tipo fosfodiéster é a ligação boranofosfato (ou equivalentemente, boranofosfonato). Patente U.S. N° 5177198; Patente U.S. N° 5859231; Patente U.S. N° 6160109; Patente U.S. N° 6207819; Sergueev et al., (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27. Noutra forma de realização preferida uma ligação internucleótido tipo fosfodiéster é fosforotioato Rp diasteromericamente pura. Crê-se que o f osf orotioato Rp diasteromericamente puro é mais susceptivel à digestão por nuclease e é melhor na activação da ARNase H do que o f osf orotioato Sp misturado ou 46 diastereomericamente puro. Os estereoisómeros de oligonucleótidos CpG são o tema do pedido de patente U.S. co-pendente 09/361575 apresentado em 27 de Julho de 1999, e o pedido PCT publicado PCT/US99/17100 (documento WO 00/06588). Deve ser referido que para os objectivos da presente divulgação, o termo "ligação internucleótido de tipo fosfodiéster" exclui especificamente as ligações internucleótido fosforoditioato e metilfosfonato.

Como descrito acima os oligonucleótidos maleáveis e semi-maleáveis da invenção podem possuir ligações de tipo fosfodiéster entre C e G. Um exemplo de uma ligação de tipo fosfodiéster é uma ligação fosforotioato numa conformação Rp. A quiralidade p do oligonucleótido pode ter efeitos aparentemente opostos sobre a actividade imunitária de um oligonucleótido CpG, dependendo do ponto de tempo no qual a actividade é medida. A um ponto de tempo precoce de 40 minutos, o estereoisómero Rp mas não o Sp do oligonucleótido fosforotioato CpG induz a fosforilação JNK em células de baço de murganho. Em contraste, quando ensaiados a um ponto de tempo tardio de 44 h, o estereoisómero Sp mas não o Rp é activo na estimulação da proliferação de células do baço. Esta diferença na cinética e na bioactividade dos estereoisómeros Rp e Sp não resulta de qualquer diferença na incorporação pela célula, mas em vez disso, muito provavelmente é devida aos papéis biológicos opostos da p-quiralidade. Primeiro, a actividade intensificada os estereoisómero Rp em comparação com o Sp para a estimulação das células imunitárias a pontos de tempo precoces indica que o Rp pode ser mais eficaz na interacção com o receptor CpG, TLR9, ou induzindo as vias de sinalização a jusante. Por outro lado, a degradação mais rápida dos oligonucleótidos Rp PSem comparação 47 com os resultados Sp numa duração mais curta de sinalização a montante, de modo que os oligonucleótidos Sp PS parecem ser mais activos biologicamente quando testados em pontos de tempo mais tardios.

Um efeito surpreendentemente forte é alcançado pela p-quiralidade no próprio dinucleótido CpG. em comparação com um oligonucleótido CpG estéreo-aleatório o congénere em que o dinucleótido CpG simples foi ligado em Rp foi ligeiramente mais activo, embora o congénere contendo uma ligação Sp foi quase inactivo para a indução da proliferação de células do baço. 0 tamanho (i. e., o número de resíduos de nucleótidos ao longo do comprimento do ácido nucleico) do oligonucleótido imunoestimulador pode também contribuir para a actividade estimuladora do oligonucleótido. Para facilitar a incorporação nas células os oligonucleótidos imunoestimuladores, de um modo preferido, possuem um comprimento mínimo de 6 resíduos de nucleótidos. Os ácidos nucleicos de qualquer tamanho superior a 6 nucleótidos (mesmo de vários kb de comprimento) são capazes de induzir uma resposta imunitária se estiverem presentes motivos imunoestimuladores suficientes, uma vez que os ácidos nucleicos maiores são degradados dentro das células. As presentes requerentes acreditam que oligonucleótidos semi-maleáveis tão curtos como 4 nucleótidos também podem ser imunoestimuladores se puderem ser distribuídos para o interior da célula. De um modo preferido, os oligonucleótidos imunoestimuladores têm entre 4 e 100 nucleótidos de comprimento. Os oligonucleótidos imunoestimuladores têm, de um modo preferido, entre 6 e 40 nucleótidos de comprimento. De um modo preferido, os 48 oligonucleótidos imunoestimuladores têm entre 6 e 19 nucleótidos de comprimento.

Os oligonucleótidos imunoestimuladores possuem geralmente um comprimento no intervalo ente 4 e 100 e, em algumas formas de realização 10 e 40. O comprimento pode estar no intervalo entre 16 e 24 nucleótidos.

Os termos "ácido nucleico" e "oligonucleótido" também compreendem ácidos nucleicos ou oligonucleótidos com substituições ou modificações, tal como nas bases e/ou açúcares. Por exemplo, eles incluem ácidos nucleicos possuindo açúcares estruturais que são ligados covalentemente a grupos orgânicos de baixo peso molecular diferentes de um grupo hidroxilo na posição 2' e diferentes de um grupo fosfato ou grupo hidroxilo na posição 5'. Os ácidos nucleicos assim modificados podem incluir um grupo ribose 2'-Oalquilado. Além disso, ácidos modificados incluem açúcares, tais como arabinose ou 2'-fluoroarabinose em vez de ribose. Assim, os ácidos nucleicos podem ser heterogéneos na composição estrutural contendo desse modo qualquer combinação possível de unidades de polímero ligadas em conjunto, tal como péptido-ácidos nucleicos (que possuem uma estrutura de aminoácidos com bases de ácido nucleico).

Os ácidos nucleicos também incluem purinas e pirimidinas substituídas, tal como as bases modificadas C-5 propina pirimidina e 7-desaza-7-purina substituída. Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. As purinas e pirimidinas incluem, mas não estão limitadas a adenina, citosina, guanina, timina, 5-metilcitosina, 5-hidroxicitosina, 5-fluorocitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, 49 hipoxantina e outras nucleobases que ocorrem naturalmente e não naturalmente, unidades aromáticas substituídas e não substituídas. Outras tais modificações são bem conhecidas dos especialistas na técnica.

Os oligonucleótidos imunoestimuladores da presente invenção podem englobar várias modificações e substituições químicas, em comparação como ARN ou ADN natural, que envolvem uma ponte internucleótido fosfodiéster, uma unidade β-D-ribose e/ou uma base de nucleótido natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracilo). Exemplos de modificações químicas são conhecidas de um especialista e são descritas, por exemplo, em Uhlmann E et ai. (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993 ; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129 ; e Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Um oligonucleótido de acordo com a invenção pode possuir uma ou mais modificações, em que cada modificação está localizada numa ponte internucleótido fosfodiéster particular e/ou numa unidade β-D-ribose particular e/ou numa posição de base de nucleótido natural particular em comparação com um oligonucleótido da mesma sequência que é composta de ADN ou ARN natural.

Por exemplo, a invenção refere-se a um oligonucleótido que pode compreender uma ou mais modificações e em que cada modificação é, independentemente seleccionada de: a) a substituição de uma ponte internucleótido fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleótido através de uma ponte internucleótido modificada, 50 b) a substituição de ponte fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleótido através de uma ponte desfosfo, c) a substituição de uma unidade de fosfato de açúcar a partir da estrutura de fosfato do açúcar por outra unidade, d) a substituição de uma unidade β-D-ribose por uma unidade de açúcar modificada, e e) a substituição de uma base de nucleótido natural por uma base de nucleótido modificada.

Exemplos mais detalhados para a modificação química de um oligonucleótido são como se segue.

Uma ponte internucleótido fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleótido pode ser substituída por uma ponte internucleótido modificada, em que a ponte internucleótido modificada é, por exemplo, seleccionada de f osf orotioato, f osf oroditioato, NR.1R.2-f osf oramidato, boranofosfato, α-hidroxibenzil fosfonato, éster de fosfato-(Ci-C2i) -O-alquilo, éster de fosfato-[ (C6-Ci2) aril-(Ci-C2i)-0-alquilo] , (Ci-C8) alquilf osf onato e/ou ligações (C6-Ci2) arilfosfonato, (C7-C12)-α-hidroximetil-arilo (e. g., divulgado no documento WO 95/01363), em que (C6-C12) arilo, (C6-C20) arilo e (C6-Ci4)arilo são opcionalmente substituídos por halogénio, alquilo, alcoxilo, nitro, ciano e, em que Ri e R2 são, independentemente um do outro, hidrogénio, (Ci-C18)-alquilo, (C6-C20)-arilo, (C6-Ci4)-aril-(Ci-C8) alquilo, de um modo preferido hidrogénio, (Ci-C8) -alquilo, de um modo preferido, (C1-C4)-alquilo e/ou metoxietilo, ou Ri e R2 formam, em conjunto com o átomo de azoto que os contêm, um anel heterocí clico de 5-6 membros que 51 pode conter adicionalmente um outro heteroátomo do grupo 0, S e N. A substituição de uma ponte fosfodiéster localizada na extremidade 3' e/ou 5' de um nucleótido através de uma ponte desfosfo (as pontes desfosfo são descritas, por exemplo, em Uhlmann E e Peyman A em "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capitulo 16, pp. 355 ff), em que uma ponte desfosfo é, por exemplo, seleccionada a partir das pontes desfosfo formacetal, 3'-tioformacetal, metil-hidroxilamina, oxima, metilenodimetil-hidrazo, dimetileno-sulfona e/ou grupos sililo.

Uma unidade de fosfato de açúcar (i. e., uma ponte β-D-ribose e internucleótido fosfodiéster em conjunto formando um unidade de fosfato de açúcar) a partir da estrutura de fosfato de açúcar (i. e., uma estrutura de fosfato de açúcar é composta de unidades de fosfato de açúcar) pode ser substituída por outra unidade, em que a outra unidade é por exemplo adequada para construir um oligómero "derivado de morfolino" (como descrito, por exemplo, em Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), que é, e. g., a substituição por uma unidade derivada de morfolino; ou para construir um ácido nucleico de poliamida ("PNA"; como descrito por exemplo, em Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), que é, e. g., a substituição por uma unidade de estrutura PNA, e. g., através de 2-aminoetilglicina.

Uma unidade de β-ribose ou uma unidade de β-ϋ-2'- desoxirribose pode ser substituída por uma unidade de açúcar 52 modificada, em que a unidade de açúcar modificada é, por exemplo, seleccionada a partir de β-D-ribose, oí-D-2 ' -desoxirribose, L-2 ' -desoxirribose, 2 ' -F-2 ' -desoxirribose, 2'-F-arabinose, 2'-0-(Ci-, C6)alquil-ribose, de um modo preferido 2'-0-(Ci-Cê) alquil-ribose é 2'-O-metilribose, 2'-0-(C2-C6) alquenil-ribose, 2 ' - [0- (Ci-C6) alquil-0- (Οι-Οε) alquil] -ribose, 2'-NH2-2'-desoxirribose, β-D-xilo-furanose, a-arabinofuranose, 2,4-didesoxi-β-D-eritro-hexo-piranose e carbociclico (descritos, por exemplo, em Froehler J (1992) Am Chem Soc 114: 8320) e/ou análogos de açúcar de cadeia aberta (descritos, por exemplo, em Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) e/ou análogos de bicicloaçúcar (descritos, por exemplo, em Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481) .

De um modo preferido, o açúcar é 2'-O-metilribose, particularmente para um ou para ambos os nucleótidos ligados por uma ligação internucleótido fosfodiéster ou tipo fosfodiéster.

Os ácidos nucleicos também incluem purinas e pirimidinas substituídas tais como as bases modificadas C-5 propina pirimidina e 7-desaza-7-purina substituída. Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. As purinas e pirimidinas incluem, mas são estão limitadas a adenina, citosina, guanina, e timina e outras nucleobases que ocorrem naturalmente e não naturalmente, unidades aromáticas substituídas e não substituídas.

Uma base modificada é qualquer base que é quimicamente distinta das bases que ocorrem naturalmente, que se encontram tipicamente no ADN e ARN tais como T, C, G, A e U, mas que partilham estruturas químicas básicas com estas bases que 53 ocorrem naturalmente. A base nucleotídica modificada pode ser, por exemplo, seleccionada a partir de hipoxantina, uracilo, di-hidrouracilo, pseudouracilo, 2- tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-(Ci-C6) -alquiluracilo, 5-(C2-C6)-alqueniluracilo, 5-(C2-Ce)-alquiniluracilo, 5-(hidroximetil) uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-(Ci-C6)-alquilcitosina, 5-(C2-C6)-alquenilcitosina, 5-(C2-C6)-alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, uma 7-desazapurina substituída, de um modo preferido 7-desaza-7-substituída e/ou 7-desaza-8-purina substituída, 5-hidroximetilcitosina, N4-alquilcitosina, e. g., N4-etilcitosina, 5-hidroxidesoxicitidina, 5-hidroximetildesoxi-citidina, N4-alquildesoxiritidina, e. g., N4-etildesoxicitidina, 6-tiodesoxiguanosina e desoxirribonucleótidos de nitropirrole, C5-propinilpirimidina, e diaminopurina e. g. , 2,6-diaminopurina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina ou outras modificações de uma base de nucleótido natural. Esta lista pretende ser exemplar e não deve ser interpretada como sendo limitante.

Em fórmulas particulares aqui descritas, é definido um conjunto de bases modificadas. Por exemplo, a letra Y é utilizada para se referir a um nucleótido contendo uma citosina ou uma citosina modificada. Uma citosina modificada, como aqui utilizada é um análogo da base pirimidina de citosina que ocorre naturalmente ou não naturalmente que pode substituir esta base sem prejudicar a actividade imunoestimuladora do oligonucleótido. Citosinas modificadas incluem, mas não estão limitadas a citosinas 5-substituídas (e. g. 5-metil-citosina, 54 5-fluoro-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-iodo-citosina, 5-hidroxicitosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina, e 5-alquinil-citosina não substituída ou substituída), citosinas 6-substituídas, citosinas N4-substituídas (e. g. N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina com sistemas de anel condensados (e. g. N,N'-propilenocitosina ou fenoxazina) e uracilo e seus derivados (e. g. 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-bromovinil-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-hidroxi-uracilo, 5-propinil-uracilo). Algumas das citosinas preferidas incluem 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, e N4-etil-citosina. A base citosina pode ser substituída por uma base universal (e. g., 3-nitropirrole, P-base), um sistema de anel aromático (e. g., fluorobenzeno ou difluorobenzeno) ou um átomo de hidrogénio (dSpacer). A letra Z é utilizada para se referir a guanina ou uma base de guanina modificada. Uma guanina modificada como aqui utilizada é um análogo de base de purina que ocorre naturalmente ou não naturalmente de guanina que pode substituir esta base sem prejudicar a actividade imunoestimuladora do oligonucleótido. Guaninas modificadas incluem, mas não estão limitadas a 7-desazaguanina, 7-desaza-7-guanina substituída (tal como 7- desaza-7-(C2-C6)alquilnilguanina), 7-desaza-8-guanina substituída, hipoxantina, guaninas N2-substituídas (e. g., N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidina-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indole, adenina, adeninas substituídas (e. g. N6-metil-adenina, 8-oxo-adenina) guanina 8-substituída (e. g., 8- hidroxiguanina e 8-bromoguanina) e 6-tioguanina. A base de 55 guanina pode ser substituída por uma base universal (e. g., 4-metil-indole, 5-nitro-indole, e K-base), um sistema de anel aromático (e. g.r benzimidazole ou dicloro-benzimidazole, amida de ácido 1-metil-lH-[1,2,4]triazole-3-carboxílico) ou um átomo de hidrogénio (dSpacer).

Os oligonucleótidos podem possuir uma ou mais extremidades 5' acessíveis. É possível criar oligonucleótidos modificados possuindo duas dessas extremidades 5'. Isto pode ser alcançado, por exemplo ligando dois oligonucleótidos através de uma ligação 3'-3' para criar um oligonucleótido possuindo uma ou duas extremidades 5' acessíveis. A ligação 3'3' pode ser um fosfodiéster, fosforotioato ou qualquer outra ponte internucleótido modificada. São conhecidos na técnica métodos para realizar estas ligações. Por exemplo, essas ligações foram descritas em Seliger, H.; et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of virai gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10 (1-3), 469-77 e Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.

Adicionalmente, os ácidos nucleicos ligados em 3'3' nos quais a ligação entre os nucleótidos 3'-terminal não é um fosfodiéster, fosforotioato ou outra ponte modificada, podem ser preparados utilizando um espaçador adicional, tal como unidade tri- ou tetraetilenoglicol fosfato (Durand, M. et al, Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204 , Patente US N° 5658738 e Patente US N° 5668265). Alternativamente, o ligante não 56 nucleotídico pode ser derivado de etanodiol, propanodiol, ou a partir de uma unidade de desoxirribose abásica (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polinucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22 (11), 2022-7) utilizando a química da fosforamidite convencional. Os ligantes não-nucleotídicos podem ser incorporados uma vez ou várias vezes, ou combinados uns com os outros permitindo qualquer distância desejável entre as extremidades 3' das duas ODN a serem ligados.

Para utilização na presente invenção, os oligonucleótidos da invenção podem ser sintetizados de novo utilizando qualquer um de vários processos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o método de b-cianoetil fosforamidite (Beaucage, S.L., e Caruthers, M.H., Tet. Let. 22:1859, 1981); método do nucleótido H-fosfonato (Garegg et al., Tet. Let. 2 7:4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986; Garegg et al., Tet. Let. 2 7:4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). Estas químicas podem ser realizadas através de uma variedade de sintetizadores automatizados de ácido nucleico disponíveis no mercado. Estes oligonucleótidos são referidos como oligonucleótidos sintéticos. Um oligonucleótido isolado refere-se de um modo geral a um oligonucleótido que é separado dos componentes a que está normalmente associado na natureza. Como um exemplo, um oligonucleótido isolado pode ser um que esteja separado de uma célula, de um núcleo, de mitocôndria ou de cromatina.

Os oligonucleótidos são parcialmente resistentes à degradação (e. g., são estabilizados). Uma "molécula de 57 oligonucleótido estabilizado" deve significar um oligonucleótido que é relativamente resistente à degradação in vivo (e. g. através de uma exo- ou endonuclease) . A estabilização do ácido nucleico pode ser realizada através de modificações da estrutura. Oligonucleótidos possuindo ligações fosforotioato proporcionam a actividade máxima e protegem o oligonucleótido da degradação através de exo e endonucleases intracelulares. Outros oligonucleótidos modificados incluem ácidos nucleicos fosfodiéster modificados, combinações de ácido nucleico fosfodiéster e fosforotioato, metilfosfonato, metil-fosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi e suas combinações.

Estruturas modificadas, tais como fosforotioatos podem ser sintetizadas utilizando técnicas automatizadas empregando as químicas de fosforamidato ou H-fosfonato. Podem ser preparados aril e alquil-fosfonatos, e. g., como descrito na Patente U.S. N° 4469863; e podem ser preparados alquilfosfotriésteres (em que a unidade de oxigénio carregado é alquilado como descrito na Patente U.S. N° 5023243 e Patente Europeia N° 092574) através de síntese em fase sólida automatizada utilizando reagentes comercialmente disponíveis. Métodos para produzir outras modificações e substituições de estrutura de ADN foram descritas (e. g., Uhlmann, E. e Peyman, A., Chem. Rev. 90:544,1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165, 1990).

Outros oligonucleótidos estabilizados incluem: análogos de ADN não iónico, tais como alquil e aril-fosfatos (em que o oxigénio de fosfonato carregado é substituído por um grupo alquilo ou arilo), fosfodiéster e alquilfosfotriésteres, em que a unidade de oxigénio carregado é alquilado. Os ácidos nucleicos que contêm diol, tal como tetraetilenoglicol ou 58 hexaetilenoglicol, em qualquer um ou em ambos os terminais também foram apresentados como sendo substancialmente resistentes à degradação da nuclease.

Os oligonucleótidos imunoestimuladores podem também conter uma ou mais ligações não usuais entre o nucleótido ou unidades de análogos de nucleótido. A ligação internucleosídica habitual é a ligação 3'5'. Todas as outras ligações são consideradas como ligações internucleosídicas não usuais, tais como ligações 2'5', 5'5', 3'3', 2'2', 2'3'. Por isso, a nomenclatura 2' para 5' é seleccionada de acordo com o átomo de carbono da ribose. Contudo, se forem empregues unidades de açúcar não naturais, tais como análogos de açúcar expandidos em anel (e. g. hexanose, cilo-hexeno ou piranose) ou análogos de açúcar bi- ou triciclico, então estas alterações de nomenclatura de acordo com a nomenclatura do monómero. Em análogos de 3'-desoxi-β-ϋ-ribopiranose (também denominados p-ADN), os mononucleótidos são e. g., ligados através de uma ligação 4'2'.

Se o nucleótido contém uma ligação 3'3', então este análogo de oligonucleótido possuirá duas extremidades 5' não ligadas. Do mesmo modo, se o nucleótido contém uma ligação 5'5', então este análogo oligonucleótido possuirá duas extremidades não ligadas 3'. A acessibilidade de extremidades não ligadas de nucleótidos pode ser melhor acedida pelos seus receptores. Ambos os tipos de ligações não habituais (3'3' e 5'5') foram descritos por Ramalho Ortigao et al. (Antisense Research and Development (1992) 2, 129-46), em que os oligonucleótidos possuindo uma ligação 3'3' foram relatados para apresentar estabilidade aumentada em relação à clivagem por nucleases. 59

Diferentes tipos de ligações também podem ser combinados numa molécula que pode conduzir à ramificação do oligómero. Se uma parte do oligonucleótido é ligada à extremidade 3'- através de uma ligação 3'3' a uma segunda parte do oligonucleót ido e na extremidade 2' através de uma ligação 2'3' a uma terceira parte da molécula, isto resulta e. g.f num oligonucleótido ramificado com três extremidades 5'- (3'3'r 2'3' ramificado).

Em principio, as ligações entre diferentes partes de um oligonucleótido ou entre diferentes oligonucleótidos, respectivamente, podem ocorrer através de todas as partes da molécula, desde que isto não interfira negativamente com o reconhecimento pelo seu receptor. De acordo com a natureza do ácido nucleico, a ligação pode envolver a unidade de açúcar (Su), a nucleobase heterocíclica (Ba) ou a estrutura de fosfato (Ph) . Assim, as ligações do tipo Su-Su, Su-Ph, Su-Ba, Ba-Ba, Ba-Su, Ba- Ph, Ph-Ph, Ph-Su e Ph-Ba são possíveis. Se os oligonucleótidos forem ainda modificados através de certos substituintes não nucleotídicos, a ligação pode também ocorrer através das partes modificadas dos oligonucleótidos. Estas modificações incluem também ácidos nucleicos modificados, e. g., PNA, LNA, ou análogos de Morfolino Oligonucleótido.

As ligações são, de um modo preferido, compostas por C, H, N, 0, S, B, P e Halogénio, contendo 3 a 300 átomos. Um exemplo com 3 átomos é uma ligação acetal (ODN 1-3'-0-CH2-0-3'-0DN2; Froehler e Matteucci) ligando e. g.o grupo 3'-hidroxilo de um nucleótido com o grupo 3'-hidroxilo de um segundo oligonucleótido. Um exemplo com cerca de 300 átomos é PEG-40 (tetraconta polietilenoglicol). As ligações preferidas são fosfodiéster, fosforotioato, metilfosfonato, fosforamidato, 60 boranofosfonato, amida; éter, tioéter, acetal, tioacetal, ureia, tioureia, sulfonamida, Base de Schiff e ligações persulfureto. Outra possibilidade é a utilização do Solulink BioConjugation System (www.trilinkbiotech.com).

Se o oligonucleótido for composto por duas ou mais partes de sequência, estas partes podem ser idênticas ou diferentes. Deste modo, num oligonucleótido com uma ligação 3'3', as sequências podem ser idênticas 5'-0DN1-3'3'-0DN1-5' ou diferentes 5'-0DNl-3'3'-ODN2-5'. Além disso, a modificação química das várias partes de oligonucleótido assim como o ligante que as liga podem ser diferentes. Uma vez que a incorporação de oligonucleótidos curtos parece ser menos eficiente do que a dos oligonucleótidos longos, a ligação de duas ou mais sequências curtas resulta na estimulação imunitária melhorada. 0 comprimento dos oligonucleótidos curtos é, de um modo preferido, 2-20 nucleótidos, de um modo mais preferido, 3-16 nucleótidos, mas, de um modo muito preferido, 5-10 nucleótidos. São preferidos oligonucleótidos ligados que possuem duas ou mais extremidades 5' não ligadas.

As sequências parciais de oligonucleótido podem também ser ligadas por ligantes não nucleotídicos, em particular ligantes abásicos (dSpacers), unidades de trietilenoglicol ou unidades de hexaetilenoglicol. Outros ligantes preferidos são ligantes alquilamino, tal como os aminoligantes C3, C6, C12 e também ligantes alquiltiol, tais como os ligantes tiol C3 ou C6. Os oligonucleótidos podem também ser ligados por resíduos aromáticos que podem ser ainda substituídos por alquilo ou grupos alquilo substituídos. Os oligonucleótidos podem também conter uma unidade Doubler ou Trebler (www.glenres.com), em 61 particular os oligonucleótidos com uma ligação 3'3'. A ramificação dos oligonucleótidos por múltiplo doubler, trebler, ou outras unidades multiplicativas leva a dendrimeros que são uma outra forma de realização desta invenção. Os oligonucleótidos podem também conter unidades de ligação resultando de reagentes de modificação de péptidos ou reagentes de modificação de oligonucleótido (www.glenres.com). Além disso, podem conter um ou mais resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais que são conectados por ligações peptídicas (amida).

Outra possibilidade para a ligação de oligonucleótidos é através da reticulação das bases heterocíclicas (Verma e Eckstein; Annu. Rev. Biochem. (1998) 67: 99-134; página 124). Ainda outra possibilidade é uma ligação entre a unidade de açúcar de uma parte da sequência com a base heterocíclica de outra parte da sequência (Iyer et al. Curr. Opin. Mol. Therapeutics (1999) 1: 344-358; página 352).

Os diferentes oligonucleótidos são sintetizados por métodos estabelecidos e podem ser ligados em conjunto em tempo real durante a síntese de fase sólida. Alternativamente, estes podem ser ligandos em conjunto pós-síntese das sequências parciais individuais.

Em um aspecto da presente invenção, os ácidos nucleicos imunoestimuladores CpG classe C da invenção são para utilização no tratamento de infecção crónica de HCV num indivíduo.

Um "indivíduo" deve significar um humano ou animal vertebrado incluindo mas não limitado a um cão, gato, cavalo, vaca, porco, ovelha, cabra, galinha, primata não humano (e. g., 62 macaco), peixe (espécies de aquacultura, e. g., salmao), coelho, rato e murganho.

Um "indivíduo possuindo uma infecção virai" é um indivíduo que foi exposto a um vírus e possui manifestações agudas ou crónicas ou níveis detectáveis do vírus no corpo. Em um aspecto da invenção, o indivíduo é um possuindo uma infecção virai crónica, de um modo mais preferido, uma infecção crónica de hepatite C. Em importantes aspectos da invenção, o indivíduo é um que é não responsivo à terapia anterior para a infecção com hepatite C. Por exemplo, um indivíduo nao responsivo inclui um que foi previamente tratado para a infecção por hepatite C com, por exemplo, IFN-α (e. g. , Intron A), mas este tratamento não foi bem sucedido, como aqui descrito. A invenção refere-se ao tratamento de indivíduos que não são responsivos e, em alguns casos, refere-se à identificação de indivíduos que serão não responsivos de modo a seleccionar o tratamento eficaz.

Os ácidos nucleicos imunoestimuladores podem ser eficazes em qualquer vertebrado. Os diferentes ácidos nucleicos imunoestimuladores podem causar estimulação imunitária óptima dependendo da espécie de mamífero. Deste modo, um ácido nucleico imunoestimulador que causa estimulação óptima ou inibição em humanos não pode causar estimulação óptima ou inibição num murganho, e vice-versa. Um especialista na técnica pode identificar os ácidos nucleicos imunoestimuladores mais apropriados úteis para uma espécie de mamífero particular de interesse, utilizando os ensaios de rotina aqui descritos e/ou conhecidos na técnica, utilizando as directivas aqui fornecidas. 63 0 ácido nucleico imunoestimulador pode ser directamente administrado ao indivíduo ou pode ser administrado em conjunto com um complexo de distribuição de ácido nucleico. Um "complexo de distribuição de ácido nucleico" deve significar uma molécula de ácido nucleico associada com (e. g., ionicamente ou covalentemente ligado a, ou encapsulado em) um meio de direccionamento (e. g., uma molécula que resulta em afinidade superior para a ligação a uma célula alvo (e. g., PDC ou células B) e/ou incorporação celular aumentada pelas células alvo. Os exemplos de complexos de distribuição de ácido nucleico incluem ácidos nucleicos associados com: um esterol (e. g., colesterol), um lípido (e. g., um lípido catiónico, virossoma ou lipossoma) ou um agente de ligação específica a uma célula alvo (e. g., um ligando reconhecido por um receptor específico da célula alvo). Os complexos preferidos podem ser suficientemente estáveis in vivo para evitar o não acoplamento significativo antes da internalização pela célula alvo. Contudo, o complexo pode ser clivável sob condições apropriadas na célula de modo que o ácido nucleico seja libertado numa forma funcional. 0 ácido nucleico imunoestimulador ou outros terapêuticos podem ser administrados isolados (e. g., em solução salina ou tampão) ou utilizando quaisquer veículos de distribuição conhecidos na técnica. Por exemplo, foram descritos os veículos de distribuição que se seguem: cocleatos; emulssomas; ISCOMs; lipossomas; vectores bacterianos vivos (e. g., Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guerin, Shigella, Lactobacillus); vectores virais vivos (e. g., Vaccinia, adenovírus, Herpes Simplex); microesferas; vacinas de ácido nucleico; polímeros (e. g., carboximetilcelulose, quitosano); anéis de polímero; Proteossomas; fluoreto de sódio; plantas transgénicas; virossomas; partículas do tipo vírus. Os especialistas da técnica reconhecerão que outros veículos de distribuição que são conhecidos na técnica podem também ser utilizados.

Combinada com os ensinamentos aqui proporcionados, escolhendo de entre os vários compostos activos e factores de peso, tais como potência, biodisponibilidade relativa, peso corporal do doente, gravidade de efeitos secundários adversos e o modo de administração preferido, pode ser planeado um regime terapêutico eficaz de tratamento que não cause toxicidade substancial e ainda seja inteiramente eficaz para tratar o indivíduo particular como descrito acima. A quantidade eficaz para qualquer aplicação particular pode variar dependendo destes factores como a doença ou estado a ser tratado, sendo o ácido nucleico imunoestimulador particular administrado (e. g., a classe de ácido nucleico CpG imunoestimulador, o número de motivos CpG não metilados ou a sua localização no ácido nucleico, o grau de quiralidade do oligonucleótido, etc.), se um antigénio for também administrado e a natureza deste antigénio, o tamanho do indivíduo ou a gravidade ou estado da doença. Um normal especialista da técnica pode empiricamente determinar a quantidade eficaz de ácidos nucleicos imunoestimuladores particulares e/ou outros agentes terapêuticos sem necessitar de realizar experimentação.

Para indivíduos adultos humanos, as doses dos compostos de ácidos nucleicos imunoestimuladores aqui descritos variam tipicamente desde cerca de 50 pg/dose a 20 mg/dose, mais tipicamente desde cerca de 80 pg/dose a 8 mg/dose, e ainda mais tipicamente desde cerca de 800 pg/dose a 4 mg/dose. Nos termos 65 do peso corporal do indivíduo, as dosagens típicas variaram desde cerca de 0,5 a 500 pg/kg/dose, mais tipicamente desde cerca de 1 a 100 pg/kg/dose e, muito tipicamente de cerca de 10 a 50 pg/kg/dose. As doses dependerão de factores incluindo a via de administração, e. g., a administração oral pode necessitar de uma dose substancialmente maior do que a administração subcutânea.

As formulações da presente divulgação são administradas em soluções farmaceuticamente aceitáveis, que podem rotineiramente conter concentrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes tampão, conservantes, veículos compatíveis, adjuvantes, e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.

Os ácidos nucleicos imunoestimuladores podem ser dados em conjunto com outros agentes conhecidos na técnica como sendo úteis no tratamento de infecções virais. De particular importância é a combinação de ácidos nucleicos imunoestimuladores com agentes anti-virais, tal como IFN-α, como demonstrado na secção de Exemplos, para proporcionar uma resposta sinérgica. Os ácidos nucleicos imunoestimuladores podem ser utilizados como um substituto para Ribavirina, que é normalmente administrado em conjunto com IFN-α. Os exemplos destes outros agentes normalmente utilizados ou sob investigação para utilização em combinação com IFN-α incluem amantadina,e citocinas, incluindo IL-2, IL-10, IL-12 e IFN-γ.

Os agentes antivirais são compostos que evitam a infecção de células por vírus ou replicação do vírus na célula. Existem menos fármacos antivirais do que fármacos antibacterianos porque o processo de replicação virai é tão parecido com o de 66 replicação de ADN na célula hospedeira, que os agentes antivirais não específicos são frequentemente tóxicos para o hospedeiro. Existem vários estádios no processo de infecção virai que podem ser bloqueados ou inibidos por agentes antivirais. Estes estádios incluem, a ligação dos vírus à célula hospedeira (imunoglobulina ou péptidos de ligação), descapsulação do vírus (e. g. , amantadina), síntese ou tradução do ARNm, incluindo a iniciação de tradução (e. g., interferão, antisentido e ribozimas), enzimas de vírus (e. g., proteases de serina não estruturais, polimerases de ARN, transcriptases reversas e helicases), replicação de ARN ou ADN virai (e. g., análogos de nucleósidos), maturação de novas proteínas de vírus (e. g. , inibidores de protease, tal como inibidor de protease de serina BILN2061ZW de Boehringer Ingelheim), anti-oxidantes, tal como Livfit (documento USP 6136316), e formação de vesículas e libertação do vírus. Outros agentes anti-virais são descritos nos documentos USP 6130326, e 6440985, e pedido de patente US publicado 20020095033. Os análogos de ribavirina são também agentes anti-virais abrangidos pela invenção.

Os análogos de nucleótido são compostos sintéticos que são semelhantes a nucleótidos, mas que têm um grupo desoxirribose incompleto ou anormal ou ribose. Uma vez que os análogos de nucleótido estão na célula, estes são fosforilados, produzindo o trifosfato formado que compete com nucleótidos normais para incorporação no ADN ou ARN virai. Uma vez que a forma de trifosfato do análogo de nucleótido é incorporado na cadeia crescente de ácido nucleico, provoca associação irreversível com a polimerase virai e, deste modo, com terminação de cadeia. 67 A terapia com imunoglobulina é tipicamente utilizada para a prevenção de infecção virai, mas pode também ser utilizada para reduzir níveis de vírus circulante e evitar que as novas células que se formam sejam infectadas. A terapia com imunoglobulina para infecções virais é diferente da das infecções bacterianas, porque em vez de ser específica para o antigénio, a terapia com imunoglobulina funciona por ligação a viriões extracelulares e evita que se liguem a estas e entrem nas células que são susceptíveis de infecção virai. A terapia é útil para a redução de viremia durante o período de tempo em que os anticorpos estão presentes no hospedeiro. Em geral existem dois tipos de terapias com imunoglobulina, terapia com imunoglobulina normal e terapia com hiperimunoglobulina. A terapia com globulina imunitária normal utiliza um produto de anticorpo que é preparado a partir do soro de dadores de sangue normais e misturado. Este produto misturado contém títulos baixos de anticorpo para uma vasta gama de vírus humanos, tais como da hepatite A, parvovírus, enterovírus (especialmente em neonatos). Para utilização normal de terapia com globulina imunitária para HCV, o soro deveria ter sido obtido de pessoas que já tinham sido previamente infectados com HCV e que eliminaram com sucesso a infecção, espontaneamente ou com algumas formas de terapia. A terapia com globulina hiper-imunitária utiliza anticorpos que são preparados a partir do soro de indivíduos que tinham títulos elevados de um anticorpo para um vírus particular. Estes anticorpos são então utilizados contra um vírus específico. Para o HCV, as globulinas hiper-imunitárias podem ser produzidas por vacinação de voluntários com proteínas HCV recombinantes para produzir globulina imunitária contra a hepatite C. 68

Outros anti-virais adequados nos métodos aqui descritos são preparados por Triangle Pharmaceuticals, Inc., Gilead, ICN, Procter and Gamble e ViroPharma Incorporated.

Para utilização em terapia, uma quantidade eficaz do ácido nucleico imunoestimulador pode ser administrada ao indivíduo por qualquer modo que distribua os ácidos nucleicos imunoestimuladores no sítio desejado, e. g., mucosa, sistémico. A "administração" da composição farmacêutica da presente divulgação pode ser conseguida por qualquer meio conhecido do técnico especialista. As vias de administração preferida incluem mas não estão limitadas a oral, parentérica, intralesão, tópica, transdérmica, intramuscular, intranasal, intratraqueal, por inalação, ocular, vaginal e rectal.

Para administração oral, os compostos (i. e., ácidos nucleicos imunoestimuladores ou outros agentes terapêuticos) podem ser formulados rapidamente por combinação com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Estes veículos permitem que os compostos da invenção a ser formulados como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, sedimentos, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um indivíduo a ser tratado. As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas como excipiente sólido, opcionalmente moagem de uma mistura resultante e processamento da mistura de grânulos, após adicionar auxiliares adequados, se desejado, para obter núcleos de comprimidos ou drageias. Os excipientes adequados, em particular, enchimentos, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de 69 arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes, tais como a polivinilpirrolidona reticulada, agar ou ácido alginico ou um seu sal, tal como alginato de sódio. Opcionalmente, as formulações orais podem também ser formuladas em solução salina ou tampões para neutralizar as condições de acidez interna ou podem ser administrados sem quaisquer veículos.

Os núcleos das drageias são proporcionados com revestimentos adequados. Para este propósito, podem ser utilizadas as soluções de açúcar concentradas, que podem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de lacagem, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Os enchimentos ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drageias para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de composto activo.

As preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, assim como cápsulas moles seladas, feitas de gelatina e um plasticizante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes activos em mistura com enchimento, tal como lactose, ligantes, tal como amidos e/ou lubrificantes tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou ressuspensos em líquidos adequados, tal como óleos gordos, parafina líquida, ou polietilenoglicóis líquidos. Além disso, os estabilizantes podem 70 ser adicionados. As microesferas formuladas para administração oral podem também ser utilizadas. Estas microesferas foram bem definidas na técnica. Todas as formulações para administração oral devem estar em dosagens adequadas para a sua administração.

Para administração bocal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas formulados de um modo convencional.

Para administração por inalação, os compostos para utilização de acordo com a presente invenção podem ser convenientemente distribuídos na forma de uma apresentação em aspersão de aerossol em pacotes pressurizados ou um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado, e. g., diclorodifluorornetano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outros gases adequados. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para distribuir uma quantidade medida. As cápsulas e cartuchos de e. g., gelatina para utilização num inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

Os compostos, quando é desejável distribuí-los sistemicamente, podem ser formulados para administração parentérica por injecção, e. g., por injecção de bólus ou infusão contínua. As formulações para injecção podem ser apresentadas numa forma de unidade de dosagem, e. g., em ampolas ou em recipientes multi-dose, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas, tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter 71 agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

As formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos na forma solúvel em água. Adicionalmente, as suspensões dos compostos activos podem ser preparadas como suspensões oleosas de injecção apropriadas. Os solventes lipofilicos adequados ou veiculos incluem óleos gordos, tal como óleo de sésamo, ou ésteres de ácido gordo sintéticos, tais como oleato de etilo ou triglicéridos ou lipossomas. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Alternativamente, os compostos activos podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, e. g., água estéril isenta de pirogénio, antes da utilização.

Os compostos podem também ser formulados em composições rectais ou vaginais, tais como supositórios ou enemas de retenção, e. g., contendo bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Além das formulações descritas previamente, os compostos podem também ser formulados como uma preparação depósito. Estas formulações de longa actuação podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma 72 emulsão num óleo aceitável) ou resinas de troca iónica ou como derivados pouco solúveis, por exemplo, como um sal pouco solúvel.

As composições farmacêuticas também podem compreender veículos ou excipientes adequados sólidos ou em fase gel. Os exemplos destes veículos ou excipientes incluem, mas não são limitados a carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros tal como polietilenoglicóis.

As formas de preparação farmacêutica líquida ou sólida adequadas são, por exemplo, soluções aquosas ou salinas para inalação, microencapsuladas, enclausurado, revestimento de partículas microscópicas de ouro, contidas em lipossomas, nebulizadas, aerossóis, pastilhas para implantação na pele ou secas num objecto afiado para ser raspado na pele. As composições farmacêuticas também incluem grânulos, pós, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, suspensões, cremes, drageias ou preparações com libertação prolongada de compostos activos, em cuja preparação os excipientes e aditivos e/ou auxiliares, tais como desintegrantes, ligantes, agentes de revestimento, agentes de inchaço, lubrificantes, aromatizantes, adoçantes ou solubilizantes são normalmente utilizados como descrito acima. As composições farmacêuticas são adequadas para utilização numa variedade de sistemas de distribuição de fármacos. Para uma breve revisão de métodos para distribuição de fármacos, ver Langer Science 249:1527 (1990). 73

Os ácidos nucleicos imunoestimuladores podem ser administrados per se (isolados) ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando utilizados em medicina, os sais devem ser f armaceut icamente aceitáveis, mas os sais não farmaceuticamente aceitáveis podem convenientemente ser utilizados para preparar os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Estes sais incluem, mas não são limitados aos, preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluenossulfónico, tartárico, cítrico, metanossulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico, e benzenossulfónico. Estes sais podem, também, ser preparados como sais de metal alcalino ou alcalino-terroso, tais como sais de sódio, potássio ou cálcio do grupo ácido carboxílico.

Os agentes tampão adequados incluem: ácido acético e um sal (1-2 porcento p/v); ácido cítrico e um sal (1-3 porcento p/v) ; ácido bórico e um sal (0,5-2,5 porcento p/v); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2 porcento p/v) . os conservantes adequados incluem cloreto de benzalcónio (0,003-0,03 porcento p/v); clorobutanol (0,3-0,9 porcento p/v); parabenos (0,01-0,25 porcento p/v) e timerosal (0,004-0,02 porcento p/v).

As composições farmacêuticas da presente divulgação contêm um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um ou mais sólidos compatíveis ou enchimentos líquidos, diluentes ou substâncias de encapsulação que são adequadas para administração a um humano ou outro animal vertebrado. O termo "veículo" denota um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o 74 ingrediente activo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas também são capazes de ser misturados com os compostos da presente invenção, e com cada um, de uma forma em que não existe interacção que possa substancialmente impedir a eficiência farmacêutica desejada.

Estão disponíveis várias vias de administração. 0 modo particular seleccionado dependerá, obviamente, dos adjuvantes particulares ou antigénio seleccionado, sendo o estado particular tratado e da dosagem necessária para eficácia terapêutica. Os métodos desta divulgação podem, falando de forma geral, ser praticados utilizando qualquer modo de administração que é medicamente aceitável, significando qualquer modo que produza níveis eficazes de uma resposta imunitária sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. Os modos de administração preferidos são discutidos acima.

Como as composições podem convenientemente ser apresentadas numa forma de dosagem unitária e podem ser preparados por qualquer dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Todos os métodos incluem o passo de levar os compostos em associação com um veiculo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas levando uniformemente e intimamente os compostos em associação com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido ou ambos, e depois, se necessário, modelar o produto. As unidades de dose líquidas são frascos ou ampolas. As unidades de dose sólidas são comprimidos, cápsulas e supositórios. Para o tratamento de um doente, dependendo da actividade do composto, o modo de administração, propósito da imunização (i. e., profiláctica ou terapêutica) , natureza e gravidade do distúrbio, idade e peso 75 corporal do doente, diferentes doses podem ser necessárias. A administração de uma determinada dose pode ser efectuada através de uma única administração na forma de uma unidade de dose individual ou outras várias unidades de dose pequenas.

Outros sistemas de distribuição podem incluir sistemas de distribuição de libertação imediata, libertação retardada ou libertação prolongada. Estes sistemas podem evitar administrações repetidas dos compostos, aumentando a conveniência para o indivíduo e para o médico. Muitos tipos de sistema de distribuição de libertação estão disponíveis e conhecidas dos especialistas da técnica. Estes incluem sistemas com base em polímeros, tais como poli(lactído-glicolido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido poli-hidroxibutírico e polianidridos. As microcápsulas dos polímeros anteriores contendo fármacos são descritas em, por exemplo, Patente U.S. 5075 09. Os sistemas de distribuição também incluem sistemas não polímero que são: lípidos incluindo esteróis, tal como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos gordos ou gorduras neutrais tais como mono-, di- e tri-glicéridos; os sistemas de libertação hidrogel; sistemas silásticos; sistemas com base em péptido; revestimentos de cera; os comprimidos comprimidos utilizando ligantes convencionais e excipientes; implantes parcialmente fundidos; e semelhantes. Os exemplos específicos incluem, mas não são limitados a: (a) sistemas de erosão em que um agente da invenção está contida numa forma numa matriz tal como os descritos nas Patentes U. S. N° 4452775, 4675189; e 5736152, e (b) sistemas de difusão em que um componente activo se torna permeável a uma taxa controlada de um polímero tal como descrito nas Patentes U.S. N° 3854480, 5133974 e 5407686. Além disso, podem ser 76 utilizados os sistemas de distribuição comandados à base de bomba, alguns dos quais são adaptados para implante.

Em alguns aspectos, o ácido nucleico imunoestimulador é modificado. Em certos aspectos, o ácido nucleico imunoestimulador possui uma estrutura modificada com, pelo menos, uma ligação internucleótido resistente a nuclease. Uma ligação internucleótido resistente a nuclease pode ser seleccionada a partir do grupo que inclui uma ligação fosforotioato, uma ligação fosforoditioato, uma ligação metilfosfonato e uma ligação peptidica. Em certos aspectos, um ácido nucleico imunoestimulador modificado inclui, pelo menos, um análogo nucleótido ou, pelo menos, um análogo nucleótido. 0 ácido nucleico imunoestimulador é um palindroma em certos aspectos enquanto noutros aspectos, o ácido nucleico imunoestimulador não é um palindroma. De um modo preferido, o ácido nucleico imunoestimulador está entre 8 e 100 nucleótidos de comprimento, enquanto noutros aspectos preferidos, o ácido nucleico imunoestimulador está entre 12 e 40 nucleótidos de comprimento. Os tamanhos, sequências e modificações preferidas são descritos em mais detalhe a seguir.

Os exemplos que se seguem são incluídos com propósitos de ilustração e não pretendem limitar o âmbito da invenção.

Exemplos O propósito deste estudo foi avaliar a capacidade de diferentes classes de ODN CpG de estimulação de PBMC de portadores crónicos de HCV. As PBMC foram isoladas a partir de 77 sangue total recolhido de voluntários saudáveis, normais, e de portadores crónicos de HCV e foi avaliada a capacidade das diferentes classes de ODN CpG, assim como moléculas maleáveis e semi-maleáveis para estimular a proliferação de células B, secreção de citocinas (IFN-g, TNF-α., IL-10 e IFN-a) e secreção de quimiocinas (IP-10) in vitro.

Foram também avaliados os efeitos imunitários estimuladores de IFN-oí exógeno-2b (Intron A) e ribavirina, isolados, em combinação com cada um, e em combinação com ODN CpG (classes B e C) . MATERIAIS E MÉTODOS Oligonucleótidos

Todos os stocks de oligonucleótidos foram ressuspensos em tampão TE a pH 8,0 (OmniPer®; EM Science, Gibbstown, NJ) . As diluições de vários ODN foram preparadas em meio RPMI 1640 completo (Gibco BRL, Grand Island, NI) contendo 10% de soro AB humano normal inactivado pelo calor (Wisent Inc, St. Bruno, QC) e 1% penicilina/estreptomicina (Gibco BRL, Grand Island, NI) mesmo antes da sua utilização em ensaios celulares. Para as experiências de sinergia com IFN-α exógeno, Intron A (Interferon Alfa-2b, DIN 02223406, Schering Canada Inc., Pointe-Claire, Quebec, Canadá) foi adicionado às soluções ODN para dar concentrações finais de 125 ou 1000 IU/mL. Ribavirina (CAS 36791-04-5, Calbiochem, CN Biosciences Inc., La Jolla, CA, EUA) foi reconstituído com água destilada estéril para produzir um stock de 500 pm e diluído em meio como descrito acima, para 78 produzir uma concentração final de 5 pm nos poços. As células foram incubadas a 37 °C com 5% de CO2. Após 48 h, os sobrenadantes celulares foram recolhidos de cada poço e congelados a -80 °C.

Os ODN utilizados nas experiências são apresentados na tabela que se segue:

Tabela 2: Sequências de oligos utilizada em experiências

SEQ ID N°: CLASSE SEQUÊNCIA 1 A G-G-GGACGACGTCGTGG-G-G-G-G-G 2 B TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT 3 Controlo para Classe B TGC TGC TTT TTG CTG GCT TTT T 4 C TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 5 B TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 6 B TCG TCG TTT TTC GTG CGT TTT T 7 C Maleável TCGTCGTTT-T-C-G-G-CGGCCGCCG 8 B semi-maleável TC-GTC-GTTTT-GTC-GTTTTGTC-GTT 9 C Semi-maleável TCGTC-GTTTTCGGC-GGCCGCCG 10 C Semi-maleável TCGTCGTTTTC-GGCGGCC-GCCG 11 C Semi-maleável TCGTCG-TTTTC-GGCGCGC-GCCG 12 C Semi-maleável TCGTC-GTTTTC-GGC-GCGC-GCCG 79 (continuação) SEQ ID N°: CLASSE SEQUÊNCIA 13 C Semi- TCGTCGTTTTAC-GGC-GCC-GTGCCG maleável 14 C Semi- TCGTCG-TTTTAC-GGCGCC-GTGCCG maleável 15 C Semi- TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTGCCG maleável 16 C Semi- TCGTC-GTTTTC-GGCGGCC-GCCG maleável *Uma ligação fosfodiéster que substitui uma ligação fosforotioato no interior da estrutura do oligonucleótido é indicada por (-)

Isolamento de PBMC

Foi recolhido sangue total (200 mL) por punção venosa em vacurrecipientes de tampa verde heparinizados de dez (10) indivíduos normais, saudáveis, adultos e de quinze (15) indivíduos adultos cronicamente infectados com HCV que tinham tido uma terapia prévia de 6 meses de duração com base em IFN-a e eram um tratamento falhado ou um responsivo em recaída. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram purificadas por centrifugação em Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) a 400 x g durante 35 min. As células foram ressuspensas a uma concentração de 10xl06/mL em meio RPMI completo contendo 10% de soro humano normal AB (inactivado por calor) e 1% penicilina/estreptomicina. 80

Proliferação de células B

As células foram isoladas como descrito acima e ressuspensas a lxl06/mL em meio RPMI completo. 100 pL de células foram adicionadas a cada poço de placas de 96 poços de fundo redondo. As soluções de ODN (100 pL) foram adicionadas a poços para dar a gama seleccionada das concentrações finais (1, 3, 6 pg/mL). As células foram cultivadas durante 5 dias e depois pulsadas com 3H-Timidina (1 pCi/poço) durante 18 h, antes da recolha em papel de filtro para a medição de radioactividade. Os resultados são reportados como índice de estimulação (SI) no que respeita ao meio controlo não tratado.

Ensaios de Citocinas PBMC isoladas de fresco foram ressuspensas a 10xl06/mL (2x concentração final) e 100 pL de células foram adicionadas a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano contendo um igual volume de solução de ODN (2x concentração final desejada). Foi testada uma gama de concentrações (1, 3, 6 pg/mL) para cada ODN. As células foram incubadas a 37 °C com 5% de C02. Após 48 h, os sobrenadantes celulares foram recolhidos de cada poço e congelados a -80 °C até serem testados.

Os níveis de IFN-α, IP-10, IL-10 e IFN nos sobrenadantes foram medidos utilizando Kits ELISA comerciais (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA; IP-10, Cat N° DIP 100, IL-10, Cat N° D1000, IFN-g Cat N° DIF50 ou PBL Biomedical, IFN-q Cat N° 4110S). Quando os valores medidos em ELISA estavam abaixo do limite de detecção do kit como especificado pelo fabricante, foi 81 inserido na tabela de dados um valor igual ao menor limite detectável.

RESULTADOS

As PBMC isoladas de sangue recolhido de 15 indivíduos cronicamente infectados com HCV e 10 normal voluntários saudáveis foram incubados a 37° C com diferentes classes de CpG (e. g. , classe A, B, C, C maleável, B semi-maleável e C semi-maleável) e sobrenadantes celulares foram avaliados quanto à presença de citocina, indicativa de secreção de citocina durante o período de incubação. Os resultados destas experiências são apresentadas a seguir.

Indução da secreção de IFN-α por PBMC

Quando as três classes de ODN CpG foram testadas em PBMC de voluntários normais, foram produzidos níveis muito elevados de IFN-α pela classe A (CpG SEQ ID N°. 1), níveis moderadamente

elevados pela classe C (CpG SEQ ID N°. 4) e apenas níveis baixos foram induzidos pela classe B (CpG SEQ ID N°. 2) (Figura 1) . A principal fonte celular de IFN-α é PDC.

Com a PBMC obtida de portadores crónicos de HCV, todas as três classes de CpG podem induzir secreção de IFN-α. Os níveis com as classes B e C foram as mesmas obtidas com As PBMC normais. Em contraste, a classe A induziu apenas cerca de 50% do nível normal (Figura 1), sugerindo que a disfunção das PDC infectadas com HCV tem algum impacto na eficácia do CpG de 82 classe A para induzir IFN-α, mas não a classe C. Deste modo, o CpG de classe A ou C pode ser utilizado para tratar portadores crónicos de HCV, mas em alguns casos a classe C pode ser preferida. 0 número de PDC foi determinado por análise FACS. Foi efectuada uma regressão linear contra esta em comparação com a quantidade IFN-α secretada com o ODN CpG de classe A e C e foi encontrada uma razoável correlação para os indivíduos normais (e. g. , R=0,43 e 0,58, respectivamente) . Foi ainda verificado que a correlação era ligeiramente melhor para os ODN de classe C. Em contraste, não foi observada correlação entre o número de PDC e quantidade de IFN-α secretada para os indivíduos infectados com HCV (R=0,02 e 0,08, respectivamente) (Figura 3). Os infectados com HCV DC são no entanto capazes de segregar IFN-α em resposta ao ODN CpG. O efeito de alterações maleável e semi-maleável destes ODS foi também analisado. Foram sintetizadas moléculas maleáveis que tinham uma linha de ligações fosfodiéster na região central da molécula. Foram sintetizadas moléculas semi-maleáveis que tinham um ou mais ligações fosfodiéster individuais que estavam entre os nucleótidos de citosina e guanina dos motivos CpG. Ambos os ODN CpG de classe C maleáveis (Figura 3) e semi-maleáveis (Figura 4) foram capazes de estimulação de secreção de IFN-α em PBMC normais ou com HCV de uma forma semelhante ao original ODN CpG de classe C. Muitos dos ODN CpG de classe C semi-maleáveis foram ainda mais potentes que o CpG de classe C regular SEQ ID N°. 4 (Figura 4) . Isto pode ser porque a molécula é ainda suficiente estável para possuir uma estimulação imunitária 83 máxima e o fosfodiéster no meio do motivo CpG ? massa? Aumenta a sua actividade.

Indução da secreção de IFN-γ por PBMC A Figura 5 compara a capacidade de diferentes classes de CpG para induzir a secreção da citocina Thl, IFN-γ. A classe A induziu níveis baixos de IFN-γ enquanto em comparação, a classe B produziu quantidades moderadas e CpG de classe C estimulou concentrações elevadas de IFN-γ. As PBMC infectadas com HCV e normais apresentaram uma resposta semelhante a resposta Thl a todas as três classes de CpG. Resultados semelhantes foram obtidos com ODN CpG classe C semi-maleável (Figura 6).

Indução de secreção de IP-10 por PBMC A IP-10, uma quimiocina associada com a produção de interferões do tipo 1 e 2, é também induzida por ODN CpG. Os níveis mais elevados são induzidos com classe A, a seguir a mais elevada com classe C e a mais baixa com ODN CpG classe B. Independentemente da classe de ODN CpG, níveis semelhantes de IP-10 foram induzidas com PBMC de indivíduos normais e portadores crónicos de HCV (Figura 7).

Estimulação de células B por ODN CpG

0 efeito de CpG na estimulação de células B foi também investigado. Como apresentado nas Figuras 8 e 9, o CpG Classe A 84 foi um fraco estimulador de células B para populações infectadas com HCV e normais. Pelo contrário, as classes B, C e CpG C semi-maleáveis activam fortemente as células B. não existiram diferenças entre PBMC de indivíduos normais e infectados com HCV.

Secreção de IL-10 de PBMC após estimulação com ODN CpG A produção de citocina IL-10 após estimulação com CpG foi também avaliada e estes resultados são apresentados na Figura 10. Para ambos, os infectados com HCV e indivíduos normais, todas as classes de CpG induziram significativa secreção de IL-10 e não existiram diferenças entre As PBMC de voluntários normais e os de portadores crónicos de HCV. Vários tipos de células podem produzir IL-10 após incubação com CpG; contudo uma vez que as células B são os principais produtores desta citocina, a produção de IL-10 pode ser utilizada como um indicador do nível de activação de células B.

Efeitos de Intron A e ribavirina O efeito in vitro de ribavirina e IFN-α exógeno Intron A, isolado ou em combinação com CpG foi testado em células infectadas com HCV. Nem a ribavirina nem Intron A, por si só ou em conjunto, resultaram na indução de secreção de IFN-α por PBMC infectados com HCV (Figura 11).

Como foi discutido acima, ODN CpG de classe A e C resultam na forte indução de secreção de IFN-α em PDC de indivíduos 85 normais e infectados com HCV. Além disso, quando CpG e Intron-A foram utilizados em conjunto, existiu uma resposta sinérgica para a maioria (60%) dos indivíduos (Figura 12).

DISCUSSÃO

Os ODN CpG são capazes de induzir DC em doentes cronicamente infectados com HCV, a segregar IFN-α, com níveis mais elevados utilizando CpG de Classe A e C e níveis inferiores de ODN CpG de Classe B. Os níveis de IFN-α secretado são comparáveis aos observados com células de voluntários saudáveis normais. Do mesmo modo, o IP-10 é induzido em PBMC HCV estimuladas, indicando deste modo uma activação imunitária do tipo Thl.

As respostas imunitárias específicas para o antigénio HCV estão já presentes em pessoas cronicamente infectadas com HCV. Estas são enviesadas para Th2 e deste modo não podem realizar a eliminação das células infectadas com HCV. As respostas tipo Thl serão necessárias para a eliminação virai. O aumento dos níveis sistémicos de citocinas Thl, sem antigénios adicionais, permite que as pessoas cronicamente infectadas com HCV desenvolvam respostas imunitárias específicas para HCV do tipo Thl que são instrumentais na eliminação virai. Todas as classes de CpG (A, B e C) são capazes de estabelecer respostas do tipo Thl. Estas respostas tipo Thl são essenciais para a eliminação a longo prazo da infecção crónica de HCV, embora sejam difíceis de induzir com a terapia de IFN-α exógeno, que tem efeitos anti-virais directos mas não efeitos directos no sistema imunitário. 0 ODN CpG pode ser, deste modo, utilizado em 86 combinação com IFN-α exógeno para tratar portadores crónicos de HCV.

Alternativamente, o ODN CpG pode também ser utilizado isolado. Devido à indução de citocinas tal como IFN-α e IFN-γ, o ODN CpG por si só possui efeitos anti-virais directos, além da indução de respostas imunitárias especificas para HCV tipo Thl. Em alguns casos, as moléculas de classe A e C são preferidas uma vez que estas induzem níveis mais elevados de IFN. Dependendo da caracterí st ica da sua sequência, o ODN CpG pode, de um modo preferido, estimular funções PDC, maturação e produção de IFN tipo I (Krug, A et al. , Eur J Immunol, 2001; 31:2154-2163) . Embora de acordo com a invenção tenham sido apresentadas duas classes de ODN CpG como sendo superiores na estimulação da produção de IFN-α, qualquer ODN CpG, independentemente da estrutura ou sequência CpG, pode ser utilizada no tratamento de HCV crónico. A libertação controlada de diferentes isoformas de IFN tipo I por ODN CpG específicos in vivo é superior ao devido à administração sistémica de IFN tipo I recombinante que é de um subtipo único (e. g., Intron A é apenas IFN-α 2b) . As versões maleável e semi-maleável dos ODN CpG são capazes de estimulação de níveis semelhantes de IFN-α como as suas moléculas parentais. As versões maleável e semi-maleável de ODN CpG, especialmente a classe C, serão, de um modo preferido, utilizadas para o tratamento de HCV crónico, uma vez que são mais facilmente degradadas e não se deve, deste modo, esperar que se acumulem nos orgãos, especificamente no fígado, baço e rim.

Pelo menos, 50% dos indivíduos HCV falharam na resposta a terapia com IFN-α exógeno, contudo o ODN CpG (especialmente classe A e C) foram capazes de induzir secreção de IFN-a 87 in vitro a níveis comparáveis aos de voluntários saudáveis normais em todos os indivíduos. 0 ODN CpG pode, deste modo, ser utilizado para tratar doentes que falharam na resposta a terapia com IFN-oí exógeno, se o IFN é ou não peguilado e se o tratamento também inclui ou não Ribavirina. As classes de ODN CpG que induzem níveis elevados de IFN-oí serão preferidos e, ainda mais preferidos, para tratamento a longo prazo serão as versões semi-maleáveis.

Nem o Intron-A (IFN-a-2b) comercial nem ribavirina, isolado ou em combinação, foram capazes de induzir a secreção de IFN-oí por PBMC de indivíduos normais ou infectados com HCV in vitro. Contudo quando foi utilizado o ODN CpG em combinação com Intron-A, foi observado um efeito sinergístico na secreção de IFN-oí por PBMC de indivíduos infectados com HCV. Os ODN de classe C foram apresentados como tendo sinergia com IFN-oí exógeno; contudo o tratamento com qualquer classe de ODN CpG e alfa-interferões comerciais pode ser terapeuticamente eficaz. Como mencionado previamente, devido à relativa facilidade de degradação em metabolitos não estimuladores, podem ser utilizadas versões semi-maleáveis do ODN CpG para o tratamento crónico sem receio de acumulação em órgãos finais, tal como o rim. É suposto a ribavirina ter efeitos Thl, mas nestes estudos não teve actividade imunoestimuladora em PBMC humanas. Mesmo em combinação com Intron A, Ribavirina não estimulou a produção endógena de IFN-oí. Deste modo, a substituição de ribavirina na terapia de combinação para HCV por um ODN CpG aumenta a proporção de respostas virais sustidas. Quando combinados com ODN CpG, ribavirina reduziu a eficácia de CpG. 0 ODN CpG deve, 88 deste modo, ser dado em combinação com alfa-interferões na ausência de ribavirina. 0 ODN CpG foi administrado IM, SC e IV a indivíduos humanos e foi determinado que eram bem tolerados e seguros (estudo clinico, em realização). Qualquer via eficaz de administração seria aceitável, tal como SC, IM, IV, inalação etc. Contudo a administração subcutânea pode ser a via seleccionada. 0 ODN CpG foi diluído em tampão TE e adicionado a PBMC, contudo, o ODN CpG pode ser também formulado em sistemas de distribuição, tais como polímeros bioadesivos (Sha et al., 1999), cocleatos (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996), dendrímeros (Kukowska-

Latallo et al., 1996, Qin et al, 1998), cápsulas de revestimento entérico (Czerkinsky et al., 1987, Levine et al., 1987), emulssomas (Vancott et al ., 1998, Lowell et al. , 1997), ISCOMs (Mowat et al., 1993, Morein et al., 1999, Hu et al., 1998, Carlsson et al., 199 D , lipossomas (Childers et al., 1999,

Michalek et al., 1989, 1992), microesferas (Gupta et al., 1998,

Maloy et al., 1994, Eldridge et al., 1989), nanoesferas (Roy et al., 1999), anéis de polímero (Wyatt et al., 1998), proteossomas (Lowell et al., 1988, 1996) e virossomas (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998).

Para tratamento de portadores crónicos de HCV, o ODN CpG pode ser administrado numa base de repetição desde uma vez por dia até uma vez por mês, mas, de um modo preferido, todos os 3-10 dias e, de um modo muito preferido, semanalmente, durante um período prolongado. Este período pode ser de um mês a dois anos, mas, de um modo preferido, de 3 a 12 meses e, de um modo muito preferido, durante 6 meses. Deste modo, a terapia mais optimizada deve ser dada duas vezes por semana ou semanalmente 89 durante 6 meses. Pode também ser dada mais frequentemente durante uma fase indutiva (diariamente ou todos os outros dias ou duas vezes por semana ou semanalmente nos primeiros 1-3 meses), depois menos frequentemente para manutenção (semanalmente, ou de duas em duas semanas, ou mensalmente durante vários meses).

Para terapia de combinação, o CpG e alfa-interferões (peguilado ou não) pode ser potencialmente (i) misturado em conjunto e dado ao mesmo tempo e pela mesma via (subcutânea), (ii) dada ao mesmo tempo e pela mesma via mas não misturada, (iii) dada ao mesmo tempo mas por vias diferentes (e. g., o alf a-interf erão pode ser dado SC e o CpG pode ser IV, IM, ID, oralmente ou topicamente), (iv) dada em diferentes tempos e horários pela mesma via ou diferente, ou (v) dadas consecutivamente. Neste ultimo caso, de um modo preferido, o IFN-oí será dado primeiro de modo a reduzir a carga virai, depois o ODN CpG será dado depois de induzir e manter imunidade adaptativa do tipo Thl durante um longo tempo de controlo.

Referências 1. Choo, Q. L., G. Kuo, A. J. Weiner, L. R. Overby, D. W.

Bradley, M. Houghton. 1989. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B virai hepatitis genome. Science. 244: 359-62. 2. Choo, Q. L., K. H. Richman, J. H. Han, K. Berger, C. Lee, C.

Dong, C. Gallegos, D. Coit, R. Medina-Selby, P. J. Barr, et ai. 90 1991. Genetic organization and diversity of the hepatitis C vírus. Proc Natl Acad Sei USA. 88: 2451-5. 3. van der Poel, C. L., Η. T. Cuypers, H. W. Reesink. 1994. Hepatitis C virus six years on. Lancet. 344: 1475-9. 4. van der Poel, C. L. 1994. Hepatitis C virus. Epidemiology, transmission and prevention. Curr Stud Hematol Blood Transfus: 137-63. 5. Kiyosawa, K., T. Sodeyama, E. Tanaka, Y. Gibo, K. Yoshizawa, Y. Nakano, S. Furuta, Y. Akahane, K. Nishioka, R H. Purcell, et al. 1990. Interrelationship of blood transfusion, non-A, non-B hepatitis and hepatocellular carcinoma: analysis by detection of antibody to hepatitis C virus. Hepatology. 12: 671-5. 6. Alter, M. J., H. S. Margolis, K. Krawczynski, F. N. Judson, A. Mares, W. J. Alexander, P. Y. Hu, J. K. Miller, Μ. A. Gerber, R. E. Sampliner, et ai. 1992. The natural history of community-acguired hepatitis C in the United States. The Sentinel Counties Chronic non-A, non-B Hepatitis Study Team. N Engl J Med. 327: 1899-905. 7. Alter, M. J. 1994. Transmission of hepatitis C virus-route, dose, and titer. N Engl J Med. 330: 784-6. 8. Alter, M. J. 1994. Review of serologic testing for hepatitis C virus infection and risk of posttransfusion hepatitis C. Arch Pathol Lab Med. 118: 342-5. 91 9. Alter, M. J., E. E. Mast 1994. The epidemiology of virai hepatitis in the United States. Gastroenterol Clin North Am. 23: 437-55. 10. Weiner, A. J., Η. M. Geysen, C. Christopherson, J. E. Hall, T. J. Mason, G. Saracco, F. Bonino, K. Crawford, C. D. Marion, K. A. Crawford, et al. 1992. Evidence for immune selection of hepatitis C virus (HCV) putative envelope glycoprotein variants: potential role in chronic HCV infection. Proc Natl Acad Sei U S A. 89: 3468-72. 11. Kato, N., Y. Ootsuyama, H. Sekiya, S. Ohkoshi, T. Nakazawa, M. Hijikata, K. Shimotohno. 1994. Genetic drift in hypervariable region 1 of the virai genome in persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 68: 4776-84. 12. Diepolder, Η. M., R. Zachoval, R. M. Hoffmann, E.A.

Wierenga, T. Santantonio, M. C. Jung, D. Eichenlaub, G. R. Pape. 1995. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to non-

structural protein 3 in virai clearance in acute hepatitis C virus infection. Lancet. 346: 1006-7. 13. Missale, G., R Bertoni, V. Lamonaca, A. Valli, M. Massari, C. Mori, M. G. Rumi, M. Houghton, F. Fiaccadori, C. Ferrari. 1996. Different clinicai behaviors of acute hepatitis C virus infection are associated with different vigor of the antiviral cell-mediated immune response. J Clin Invest. 98: 706-14. 14. Tsai, S. L., Y. F. Liaw, Μ. H. Chen, C. Y. Huang, G. C. Kuo.

1997. Detection of type 2-like T-helper calls in hepatitis C 92 virus infection: implications for hepatitis C vírus chronicity. Hepatology. 25: 449-58. 15. Rehermann, B., K. M. Chang, J. G. McHutchison, R. Kokka, M. Houghton, F. V. Chisari. 1996. Quantitative analysis of the peripheral blood cytotoxic T lymphocyte response in patients with chronic hepatitis C virus infection. Journal of Clinicai Investigation. 98: 1432-1440 16. Erickson, A. L. , M. Houghton, Q. L. Choo, A. J. Weiner, R. Ralston, E. Muchmore, C. M. Walker. 1993. Hepatitis C virus-specific CTL responses in the liver of chimpanzees with acute and chronic hepatitis C. J Immunol. 151: 4189-99. 17. Chen, Μ., M. Sallberg, A. Sonnerborg, O. Weiland, L.

Mattsson, L. Jin, A. Birkett, D. Peterson, D. R. Milich. 1999 .

Limited humoral immunity in hepatitis C virus infection.

Gastroenterology. 116: 135-43. 18. Nagler, A., L. L. Lanier, J. H. Phillips. 1988. The effects of IL-4 on human assassinas naturais cells. A potent regulator of IL-2 activation e proliferation. J Immunol. 141: 2349-51. 19. Martinez, O. M., R. S. Gibbons, M. R. Garovoy, F. R.

Aronson. 1990. IL-4 inhibits IL-2 receptor expression and IL-2-dependent proliferation of human T-cells. J Immunol. 144: 2211-5. 20. Moore, K. W., O. G. A, R. de Waal Malefyt, P. Vieira, T. R.

Mosmann. 1993. Interleukin-10. Annu Rev Immunol. 11: 165-90. 93 21. de Waal Malefyt, R., J. Haanen, H. Spits, M. G. Roncarolo, A. te Velde, C. Figdor, K. Johnson, R. Kastelein, H. Yssel, J. E. de Vries. 1991. Interleukin 10 (IL-10) and virai IL-10 strongly reduce antigen-specific human T-cell proliferation by diminishing the antigen-presenting capacity of monocytes via downregulation of class II major histocompatibility complex expression. J Exp Med. 174: 915-24. 22. Fiorentino, D. F., A. Zlotnik, P. Vieira, T. R. Mosmann, M. Howard, K. W. Moore, O. G. A. 1991. IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Thl cells. J Immunol. 146: 3444-51. 23. Schlaak, J. F., T. Pitz, H. F. Lohr, K. H. Meyer zum Buschenfelde, G. Gerken. 1998. Interleukin 12 enhances deficient HCV-antigen-induced Thl-type immune response of peripheral blood mononuclear cells. J Med Virol. 56: 112-7. 24. Cacciarelli, T. V., O. M. Martinez, R. G. Gish, J. C. Villanueva, S. M. Krams. 1996. Immunoregulatory cytokines in chronic hepatitis C virus infection: pre- and posttreating with interferon alfa. Hepatology. 24: 6-9. 25. Kuzushita, N., N. Hayashi, K. Katayama, T. Ramada. 1995. [Histological features and HLA-DNA types in HCV carriers with persistently normal ALT leveis]. Nippon Rinsho. 53: 576-81. 26. Kanto, T., N. Hayashi, T. Takehara, T. Tatsumi, N. Kuzushita, A. Ito, Y. Sasaki, A. Kasahara, M. Hori. 1999. Impaired allostimulatory capacity of peripheral blood dendritic 94 cells recovered from hepatitis C virus -infected individuais. J Immunol. 162: 5584-91. 27. Bain, C., A. Fatmi, F. Zoulim, J. P. Zarski, C. Trepo, G. Inchauspe. 2001. Impaired allostimulatory function of dendritic cells in chronic hepatitis C infection. Gastroenterology. 120: 512-24. 28. Sansonno, D., C. Lotesoriere, V. Cornacchiulo, M. Fanelli, P. Gatti, G. Iodice, V. Racanelli, F. Dammacco. 1998. Hepatitis C virus infection involve CD34(+) hematopoietic progenitor cells in hepatitis C virus chronic carriers. Blood. 92: 3328-37. 29. Auffermann-Gretzinger, S., E. B. Keeffe, S. Levy. 2001. Impaired dendritic cell maturation in patients with chronic, but not resolved, hepatitis C virus infection. Blood. 97: 3171-6. 30. Kruse, M., O. Rosorius, F. Kratzer, G. Stelz, C. Kuhnt, G. Schuler, J. Hauber, A. Steinkasserer. 2000 . Mature dendritic cells infected with herpes simplex virus type 1 exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity. J Virol. 74: 7127-36. 31. Fugier-Vivier, I., C. Servet-Delprat, P. Rivailler, M. C. Rissoan, Y. J. Liu, C. Rabourdin-Combe. 1997. Measles virus suppresses cell-mediated immunity by interfering with the survival and functions of dendritic and T-cells. J Exp Med. 186: 813-23. 32. Sarobe et. al. 2002, Journal of Virology 76:10, 5062-5070 Chisari, F. V., C. Ferrari. 1995. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Annu Rev Immunol. 13: 29-60 95 33. Chisari, F. V. 1997. Cytotoxic T-cells and virai hepatitis. Journal of Clinicai Investigation. 99: 1472-1477 34. Marianneau, P., A. M. Steffan, C. Royer, Μ. T. Drouet, D. Jaeck, A. Kirn, V. Deubel. 1999. Infection of primary cultures of human Kupffer cells by Dengue virus: no virai progeny synthesis, but cytoquine production is evident. J Virol. 73: 5201-6 . 35. Krieg, A. Μ., A. K. Yi, S. Matson, T. J. Waldschmidt, G. A. Bishop, R. Teasdale, G. A. Koretzky, D. M. Klinman. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct activation of B cells. Nature. 374: 546-9 36. Yi, A. K., P. Hornbeck, D. E. Lafrenz, A. M. Krieg. 1996 . CpG DNA rescue of murine B lymphoma cells from anti-IgM-induced growth arrest and programmed cell death is associated with increased expression of c-myc e bcl-xL. J Immunol. 157: 4918-4925 37. Yi, A. K., J. H. Chace, J. S. Cowdery, A. M. Krieg. 1996. IFN-gamma promotes IL-6 e IgM secreção in response to CpG motifs in bacterial DNA and oligodeoxynucleotides. Journal of Immunology. 156: 558-64 38. Klinman, D. M., A. K. Yi, S. L. Beaucage, J. Conover, A. M. Krieg. 1996. CpG motifs present in bactéria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, e interferon gamma. Proc Natl Acad Sei USA. 93: 2879-2883 96 39. Klinman, D. M., D. Verthelyi, F. Takeshita, K. J. Ishii. 1999 . Immune recognition of foreign DNA: a cure for bioterrorism? Immunity. 11: 123-9 40. Halpern, M. D., R. J. Kurlander, D. S. Pisetsky. 1996 . Bacterial DNA induces murine interf eron-gainma production by stimulation of interleukin-12 e tumor necrosis factor-alfa. Cell Immunol. 167: 72-8 41. Cowdery, J. S., J. H. Chace, A. K. Yi, A. M. Krieg. 1996 . Bacterial DNA induces NK cells to produce IFN-gamma in vivo and increases the toxicity of lipopolisaccharides. J Immunol. 156: 4570-4575 42. Schwartz, D. A., T. J. Quinn, P. S. Thorne, S. Sayeed, A. K. Yi, A. M. Krieg. 1997. CpG motifs in bacterial DNA cause inflammation in the lower respiratory tract. Journal of Clinicai Investigation. 100: 68-73 43. Yamamoto, S., T. Yamamoto, T. Kataoka, E. Kuramoto, O. Yano, T. Tokunaga. 1992. Unique palindromic sequences in synthetic oligonucleotides are required to induce IFN [correction of INF] and augment IFN-mediated assassinas naturais activity. J Immunol. 148: 4072-6. 44. Bailas, Z. K., W. L. Rasmussen, A. M. Krieg. 1996. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides e bacterial ADN. J Immunol. 157: 1840-1845 45. Chace, J. Η., N. A. Hooker, K. L. Mildenstein, A. M. Krieg, J. S. Cowdery. 1997. Bacterial DNA-induced NK cell IFN-gamma 97 production is dependent on macrophage secreção of IL-12. Clinicai Immunology & Immunopathology. 84: 185-93 46. Roman, Μ., E. Martin-Orozco, J. S. Goodman, M. D. Nguyen, Y. Sato, A. Ronaghy, R. S. Kornbluth, D. D. Richman, D. A. Carson, E. Raz. 1997. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-l-promoting adjuvants [ver comentários]. Nat Med. 3: 849-54 47. Krieg, A. M., S. Matson, K. Cheng, E. Fisher, G. A. Koretzky, J. G. Koland. 1997. Identification of an oligodeoxynucleotide sequence motif that specifically inhibits phosphorylation by protein tyrosine kinases. Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 1: 115-23 48. Davis, H. L., R. Weeranta, T. J. Waldschmidt, L. Tygrett, J. Schorr, A. M. Krieg. 1998 . CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. Journal of Immunology. 160: 870-6 49. Moldoveanu, Z., L. Love-Homan, W. Q. Huang, A. M. Krieg. 1998. CpG DNA, a novel immune enhancer for systemic and mucosal immunization with influenza virus. Vaccine. 16: 1216-24 50. Chu, R. S., O. S. Targoni, A. M. Krieg, P. V. Lehmann, C. V. Harding. 1997. CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Thl) immunity. Journal of Experimental Medicine. 186: 1623-31

51. Lipford, G. B., M. Bauer, C. Blank, R. Reiter, H. Wagner, K. Heeg. 1997. CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B 98 and cytotoxic T-cell responses to protein antigen: a new classe of vaccine adjuvants. Eur J Immunol. 27: 2340-4 52. Weiner, G. J., Η. M. Liu, J. E. Wooldridge, C. E. Dahle, A. M. Krieg. 1997. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94: 10833-7 53. Kline, J. N., T. J. Waldschmidt, T. R. Businga, J. E.

Lemish, J. V. Weinstock, P. S. Thorne, A. M. Krieg. 1998. Modulation of airway inflammation by CpG oligodeoxynucleotides in a murine model of asthma. J Immunol. 160: 2555-9 54. Krieg, A. M. 2001. Now I know my CpG. Trends Microbiol. 9: 249-52. 55. Krieg, A. M., L. Love-Homan, A. K. Yi, J. T. Harty. 1998 . CpG DNA induces sustained IL-12 expression in vivo and resistance to Listeria monocytogenes challenge. J Immunol. 161: 2428-34 56. Walker, P. S., T. Scharton-Kersten, A. M. Krieg, L. Love-

Homan, E. D. Rowton, M. C. Udey, J. C. Vogel. 1999.

Immunostimulatory oligodeoxynucleotides promote protective immunity and provide systemic therapy for leishmaniasis via IL-12- and IFN-gamma-dependent mechanisms. Proc Natl Acad Sei USA. 96: 6970-5 57. Gramzinski, R. A., D. L. Doolan, M. Sedegah, H. L. Davis, A. M. Krieg, S. L. Hoffman. 2001. Interleukin-12- and gamma 99 interferon-dependent protection against malaria conferred by CpG oligodeoxynucleotide in mice. Infect Immun. 69: 1643-9. 58. Roffi, L., G. C. Mels, G. Antonelli, G. Bellati, F. Panizzuti, A. Piperno, M. Pozzi, D. Ravizza, G. Angeli, F. Dianzani, et al. 1995. Breakthrough during recombinant interferon alfa therapy in patients with chronic hepatitis C virus infection: prevalence, etiology, and management. Hepatology. 21: 645-9. 59. Imai, Y., S. Kawata, S. Tamura, I. Yabuuchi, S. Noda, M. Inada, Y. Maeda, Y. Shirai, T. Fukuzaki, I. Kaji, H. Ishikawa, Y. Matsuda, M. Nishikawa, K. Seki, Y. Matsuzawa. 1998. Relation of interferon therapy and hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis C. Osaka Hepatocellular Carcinoma Prevention Study Group. Ann Intern Med. 129: 94-9. 60. Davis HL CC, Morris ML, Efler SM, Cameron DW, Heathcote J. 2000. ODN CpG is safe and highly effective in humans as adjuvant to HBV vaccine: Preliminary results of Phase I trial with ODN CpG SEQ ID N°. 2. Apresentado no The Third Annual Conference on Vaccine Research. S25: 47.

Declarações sumárias (Esta secção da especificação faz parte da descrição, não das reivindicações.) possuindo uma utilizando uma 1. Um método de tratamento de um indivíduo infecção por HCV que não foi tratado com sucesso 100 terapia não CpG prévia compreendendo a administraçao a um indivíduo em necessidade deste tratamento um ácido nucleico CpG imunoestimulador numa quantidade eficaz para tratar a infecção. 2. 0 método descrito no parágrafo 1, em que a terapia não CpG inclui interferão-alfa. 3. 0 método descrito no paráqrafo 2, em que o interferão-alfa é interferão-alfa-2b, interferão-alfa-2a ou interferão-alfa de consenso. 4. 0 método descrito no parágrafo 2, em que a terapia não CpG inclui interferão-alfa e Ribavirina. 5. 0 método descrito no parágrafo 2, em que a terapia não CpG inclui interferão-alfa e ribavirina peguilados. 6. 0 método descrito no parágrafo 1, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe A. 7. 0 método descrito no parágrafo 1, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico CpG imunoestimulador de B classe. 8. 0 método descrito no parágrafo 1, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C. 9. 0 método descrito no parágrafo 1, compreendendo ainda o passo de uma a administração de interferão-alfa para o indivíduo. 101 10. O método descrito no parágrafo 9, em que o interferão-alfa é interferão-alfa-2b, interferão-alfa-2a ou interferão alfa consenso. 11. O método descrito no parágrafo 9, em que o interferão-alfa é administrado substancialmente em simultâneo com o ácido nucleico CpG imunoestimulador. 12. O método descrito no parágrafo 1, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador compreende uma modificação de estrutura. 13. O método descrito no parágrafo 12, em que a modificação de estrutura é uma modificação de estrutura de fosforotioato. 14. 0 método descrito no parágrafo 1, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador compreende uma estrutura semi-maleável. 15. Um método de tratamento de um indivíduo possuindo uma infecção por HCV e que é, provavelmente, não responsivo para uma terapia não CpG compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade deste tratamento de um ácido nucleico CpG imunoestimulador numa quantidade eficaz para tratar a infecção. 16. O método descrito no parágrafo 15, compreendendo ainda identificar um indivíduo que é, provavelmente, não responsivo a uma terapia não CpG. 17. 0 método descrito no parágrafo 16, em que o indivíduo é identificados como provavelmente sendo não responsivo com base num ensaio de interferão-alfa produzido por células dendríticas. 102 18. 0 método descrito no parágrafo 16, em que o indivíduo é identificado como provavelmente sendo não responsivo com base no genótipo de HCV. 19. 0 método descrito no parágrafo 15, em que a terapia não CpG inclui interferão-alfa. 20. O método descrito no parágrafo 15, em que a terapia não CpG inclui interferão-alfa e Ribavirina. 21. O método descrito no parágrafo 20, compreendendo ainda a administração ao indivíduo de um agente antiviral. 22. O método descrito no parágrafo 21, em que o agente antiviral é interferão-alfa. 23. O método descrito no parágrafo 22, em que o interferão-alfa é interferão-alfa-2b, interferão-alfa-2a ou interferão alfa de consenso. 24. O método descrito no parágrafo 21, em que o interferão-alfa administrado numa quantidade subterapêutica. 25. O método descrito no parágrafo 15, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C. 26. O método descrito no parágrafo 15, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador compreende uma estrutura semi-maleável. 103 27. Um método para pesquisa de ácidos nucleicos imunoestimuladores CpG úteis no tratamento da infecção virai da hepatite C crónica compreendendo o contacto de células mononucleares de sangue periférico de um indivíduo possuindo uma infecção virai de hepatite C crónica, com um ácido nucleico CpG imunoestimulador, e medição de uma resposta de teste das células mononucleares do sangue após exposição, em que o indivíduo não foi tratado com sucesso utilizando uma terapia prévia. 28. 0 método descrito no parágrafo 27, em que a resposta de teste é seleccionada do grupo consistindo em estimulação de células B, secreção de IL-6, secreção de IL-10, secreção de IL-12, secreção de interferão-gama, secreção de interferões do tipo 1 (alfa + beta), secreção de IP-10, actividade de NK, expressão de CD80, expressão de CD86, expressão de CD83 e sobre-regulação da expressão de MHC de classe II. 29. 0 método descrito no parágrafo 27, em que as células mononucleares de sangue periférico compreendem células dendríticas. 30. O método descrito no parágrafo 29, em que as células dendríticas compreendem células dendríticas plasmacitóides. 31. O método descrito no parágrafo 29, em que a resposta de teste é seleccionada do grupo consistindo em secreção de IL-12, secreção de interferões do tipo 1, expressão de CD80, expressão de CD 86, expressão de CD83 e sobre-regulação da expressão de MHC de classe II. 104 32. 0 método descrito no parágrafo 29, em que o contacto ocorre in vitro. 33. 0 método descrito no parágrafo 32, em que as células mononucleares de sangue periférico são cultivadas. 34. 0 método descrito no parágrafo 33, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é adicionado às células mononucleares de sangue periférico em cultura. 35. 0 método descrito no parágrafo 29, em que a terapia prévia é uma terapia não CpG. 36. 0 método descrito no parágrafo 29, em que a terapia prévia é a terapia com um ácido nucleico CpG de uma diferente sequência ou classe. 37. 0 método descrito no parágrafo 29, compreendendo ainda a pesquisa do ácido nucleico CpG imunoestimulador quanto a capacidade para estimular uma resposta de controlo das células mononucleares de sangue periférico de um indivíduo normal. 38. 0 método descrito no parágrafo 29, compreendendo ainda o contacto de células mononucleares de sangue periférico com interferão-alfa substancialmente em simultâneo com o ácido nucleico imunoestimulador CpG. 39. 0 método descrito no parágrafo 29, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico CpG imunoestimuladorde classe C. 105 40. Um método para identificar um indivíduo possuindo uma infecção por HCV e que é, provavelmente, não responsivo com uma terapia não CpG compreendendo a exposição de células mononucleares de sangue periférico recolhidas de um indivíduo possuindo uma infecção virai de hepatite C com um ácido nucleico imunoestimulador CpG, medição de interferão-alfa produzida a partir das células, e determinando uma quantidade de interferão-alfa produzida por células dendríticas, em que uma quantidade que é abaixo de 1,0 pg/mL é indicativo de um indivíduo que é provavelmente não responsivo a uma terapia não CpG. 41. O método descrito no parágrafo 40, em que uma quantidade que é abaixo de 0,5 pg/mL é indicativo de um indivíduo que é provavelmente não responsivo a uma terapia não CpG. 42. O método descrito no parágrafo 40, em que a terapia não CpG compreende o interferão-alfa. 43. O método descrito no parágrafo 42, em que a terapia não CpG compreende Ribavirina. 44. O método descrito no parágrafo 42, em que o IFN-alfa é interferão-alfa peguilado. 45. O método descrito no parágrafo 40, em que o ácido nucleico CpG imunoestimuladoré um classe A ou um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C. 46. O método descrito no parágrafo 40, em que as células mononucleares de sangue periférico são ainda expostas a um 106

agente antiviral em conjunto com um ácido nucleico CpG imunoestimulador. 47. 0 método descrito no parágrafo 46, em que o agente antiviral é o interferão-alfa. 48. 0 método descrito no parágrafo 47, em que o interferão-alfa é o interferão-alfa-2b, interferão-alfa-2a ou interferão alfa de consenso. 49. 0 método descrito no parágrafo 40, em que as células mononucleares de sangue periférico compreendem as células dendriticas. 50. O método descrito no parágrafo 49, em que as células dendriticas compreendem células dendriticas plasmacitóides. 51. O método descrito no parágrafo 40, em que a infecção virai com hepatite C é uma infecção aguda com vírus da hepatite C. 52. O método descrito no parágrafo 40, compreendendo ainda a determinação de um genótipo de HCV. 53. Um método de tratamento de um indivíduo possuindo uma infecção com vírus da hepatite C compreendendo a administração a um indivíduo identificado de acordo com o método da

reivindicação 40 de uma molécula de ácido nucleico CpG imunoestimuladornuma quantidade eficaz para tratar a infecção. 54. O método descrito no parágrafo 53, compreendendo ainda a administração ao indivíduo de interferão-alfa. 107 55. 0 método descrito no parágrafo 54, em que o interferão-alfa é o interferão-alfa-2b, interferão-alfa-2a ou interferão-alfa de consenso. 56. 0 método descrito no parágrafo 53, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe A. 57. 0 método descrito no parágrafo 53, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe B. 58. 0 método descrito no parágrafo 53, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C. 59. 0 método descrito no parágrafo 53, em que o ácido nucleico

CpG imunoestimulador compreende uma modificação de estrutura. 60. O método descrito no parágrafo 59 em que a modificação de estrutura é uma modificação de estrutura fosforotioato. 61. O método descrito no parágrafo da reivindicação 53, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador compreende uma estrutura semi-maleável. 62. O método descrito no parágrafo 53, em que a infecção virai da hepatite C é uma infecção virai da hepatite C crónica. 108 63. 0 método descrito no parágrafo 53, em que a infecçao virai de hepatite C é uma infecção virai aguda com hepatite C. 64. Um método de tratamento de um indivíduo possuindo uma infecção por HCV que não foi tratado com sucesso utilizando uma terapia prévia não CpG compreendendo a administração a um indivíduo, em necessidade desse tratamento, de um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C possuindo uma estrutura semi-permeável numa quantidade eficaz para tratar a infecção. 65. Um método de tratamento de um indivíduo possuindo uma

infecção por HCV e que é, provavelmente, não responsivo a uma terapia não CpG compreendendo a administração a um indivíduo, em necessidade desse tratamento, de um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C possuindo uma estrutura semi-permeável numa quantidade eficaz para tratar a infecção. 66. Um método para identificar um indivíduo possuindo uma infecção por HCV e que é, provavelmente, não responsivo a uma terapia não CpG compreendendo a exposição de células mononucleares de sangue periférico, recolhidas a partir de um indivíduo possuindo uma infecção virai com hepatite C, a um ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe A ou de classe C, uma medição do interferão-alfa produzida a partir das células, e determinação de uma quantidade de interferão-alfa produzido pelas células dendríticas, em que uma quantidade que está abaixo de 1,0 pg/mL é indicativa de um indivíduo que é provavelmente não responsivo a uma terapia não CpG. 67. Um método de tratamento de um indivíduo possuindo uma infecção por HCV que não foi tratado com sucesso utilizando uma 109 terapia prévia não CpG compreendendo o contacto de células mononucleares de sangue periférico de um indivíduo em necessidade desse tratamento, com um ácido nucleico CpG imunoestimulador numa quantidade eficaz para estimular uma resposta imunitária e re-infusionando as células no indivíduo. 68. 0 método mononucleares dendríticas. descrito no de sangue parágrafo 67, periférico em que as compreendem células células 69. 0 método descrito no parágrafo 68, em que as células dendríticas compreendem células dendríticas plasmacitóide. 70. O método descrito no parágrafo 67, em que o ácido nucleico CpG imunoestimulador é um ácido nucleico imunoestimulador de classe C. 71. O método descrito no parágrafo 70, em que o ácido nucleico imunoestimulador de classe C possui uma estrutura semi-maleável. 110

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> COLEY PHARMACEUTICAL GROUP LTD COLEY PHARMACEUTICAL GmbH

<120> MÉTODOS E PRODUTOS RELACIONADAS COM O TRATAMENTO E PREVENÇÃO DE INFECÇÃO POR VÍRUS DA HEPATITE C <130> 45265EP3 <141> 2003-10-29 <150> US 60/421987 <151> 2002-10-29 <160> 32 <170> Patentln version 3.2

<210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 1 ggggacgacg tcgtgggggg g 21 111 <210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 2 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonuclç sótido <400> 3 tgctgctttt tgctggcttt tt 22

<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido 112 <400> 4 22 tcgtcgtttt cggcggccgc cg

<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 5 tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 6 tcgtcgtttt tcgtgcgttt tt 22 <210> 7 <211> 22 113

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 7 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 8 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 9 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 114 <210> 10

<211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 10 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 11 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial 115 <22 0>

<223> Oligonucleótido <40 0> 12 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg <210> 13 <211 > 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <40 0> 13 tcgtcgtttt acggcgccgt gccg <210> 14 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <4 0 0> 14 tcgtcgtttt acggcgccgt gccg <210> 15 <211> 24 <212> ADN 116 <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 15 tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 16 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 16 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 17 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 17 tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22 117 <210> 18 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 18 tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23 <210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 19 tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21 <210> 20 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial 118 <220> <223> Oligonucleótido <400> 20 tcggacgttc ggcgcgccg 19 <210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 21 tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20 <210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 22 tcgacgttcg gcgcgcgccg 20 119 <210> 23

<211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 23 tcgacgttcg gcgcgccg 18 <210> 24 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 24 tcgcgtcgtt cggcgccg 18

<210> 25 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido 120 <4Ο0> 25 tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22 <210> 26 <211> 10 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <220> <221> característica_misc <222> (3)..(3) <223> n é a, c, g ou t <220> <221> característica_misc <222> (5) .. (6) <223> n é seleccionado de GpT, GpG, GpA ou ApA <220> <221> característica misc <222> (9)..(10) <223> n é seleccionado de TpT, CpT ou TpC <400> 26

Tcntnncgnn 10 <210> 27 <211> 12 121

<212> ADN

<213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 27 CGACGTTCGT CG <210> 28 <211> 13 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 28 CGGCGCCGTG CCG <210> 29 <211> 12 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido 122 <4Ο0> 29 CCCCCCGGGG GG 12

<210> 30 <211> 12 <212> ADN <213> Sequência artificial <2 2 0> <223> Oligonucleótido <400> 30 GGGGGGCCCC CC 12 <210> 31 <211> 10 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 31 CCCCCGGGGG 10

<210> 32 <211> 10 <212> ADN 123 <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 32

GGGGGCCCCC

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C compreendendo a sequência TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N°: 13).
2. Ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C como reivindicado na reivindicação 1, compreendendo a sequência: (a) TCGTCGTTTTAC-GGC-GCC-GTGCCG (SEQ ID N°: 13); (b) TCGTCG-TTTTAC-GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID N°: 14); ou (c) TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTGCCG (SEQ ID N°: 15); em que as ligações inter-nucleótido apresentadas como são fosfodiéster e os restantes são fosforotioato.
3. Ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C como reivindicado na reivindicação 1 ou reivindicação 2, com uma sequência de bases consistindo em TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG (SEQ ID N°: 13).
4. Ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-3, para utilização no tratamento de uma infecção crónica de HCV num indivíduo.
5. Ácido nucleico CpG imunoestimulador de classe C como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-3, para utilização num tratamento de um indivíduo possuindo uma 1 infecção crónica de HCV que foi tratada sem sucesso utilizando uma terapia não CpG prévia incluindo interferão-alfa, compreendendo o referido tratamento a administração de uma quantidade eficaz do referido ácido nucleico CpG imunoestimulador ao referido indivíduo para tratar a infecção. Lisboa, 30 de Março de 2012 2