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PT1991563E - Sequências de peptídeos e composições - Google Patents

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PT1991563E
PT1991563E PT07712678T PT07712678T PT1991563E PT 1991563 E PT1991563 E PT 1991563E PT 07712678 T PT07712678 T PT 07712678T PT 07712678 T PT07712678 T PT 07712678T PT 1991563 E PT1991563 E PT 1991563E
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drb1
polypeptide
hla
quot
influenza
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PT07712678T
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Gregory Alan Stoloff
Wilson Romero Caparros-Wanderley
Original Assignee
Peptcell Ltd
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Description

DESCRIÇÃO
SEQUÊNCIAS DE PEPTÍDEOS E COMPOSIÇÕES A invenção refere-se sequências de peptideos, composições compreendendo as sequências de peptideos, e em em particular vacinas contra a gripe compreendendo as sequências e as composições, e uso das sequências. A presente invenção está especialmente preocupada com as vacinas que protegem contra uma pluralidade de estirpes de virus da gripe, incluindo virus existentes entre espécies diferentes (por exemplo, protecção contra a gripe humana e aviária), bem como virus futuros que se transformaram a partir de virus existentes (como um forma mutante futura da gripe aviária que é facilmente transmissível de humano para humano, o que poderia dar origem a uma pandemia de gripe). A defesa contra a doença é fundamental para a sobrevivência de todos os animais, e o mecanismo de defesa utilizado para esse efeito é o sistema imunológico dos animais. A compreensão do sistema imunológico é, portanto, a chave para compreender o desenvolvimento de tratamentos novos e mais sofisticados para os seres humanos e animais. 0 mecanismo de funcionamento do sistema imunológico tem sido investigado desde há muitos anos. 0 sistema é composto de um número de tipos de células e uma variedade de moléculas, tornando-se extremamente complexo. Mesmo depois de muitos anos de estudo, a extensão total dos 1 componentes do sistema imunológico, e sua a interacção uns com os outros, é mal compreendida. Há muitos anos, foi reconhecido que uma pessoa que se recupera de uma doença particular pode adquirir alguma protecção no futuro contra aquela doença, mas não contra uma doença que a pessoa ainda não contraiu. Este aspecto fundamental do sistema imunológico foi interpretado na época através da consideração de que o sistema imunológico adquiria uma espécie de 'memória' contra certos patógenos após ter ocorrido a exposição a esses patógenos, que a memória seria especifica para uma determinada doença.
Aos poucos, tornou-se conhecido que a exposição a variações menos nocivas de um patógeno poderia induzir a protecção contra as variantes mais prejudiciais (como a exposição à variola bovina para proteger contra a varíola, ou a exposição a um antraz inactivado para proteger contra o antraz activo). Assim, surgiu a ideia da vacinação contra a doença.
Sabe-se agora que o sistema imunológico tem pelo menos duas divisões: a imunidade inata e imunidade adaptativa. 0 sistema inato é totalmente funcional antes de um patógeno entrar no sistema, enquanto o sistema adaptativo é ligado após o patógeno entrar no sistema. Em seguida, desenvolve um ataque específico para o patógeno. 0 sistema inato é composto por um número de componentes, incluindo fagócitos como macrófagos, que (como o nome sugere) 'comem' ou engolem os corpos estranhos, como patógenos. 2
Normalmente, mas não exclusivamente, a presente invenção está relacionada com o sistema imunológico adaptativo, e a menos que especificamente indicado de outra forma "sistema imunológico", no presente contexto refere-se ao sistema imunológico adaptativo. A fim de melhor compreender como funciona o sistema imunológico, o papel dos seus componentes individuais deve ser cuidadosamente considerado. Em relação ao sistema imunológico adaptativo, é bem sabido que a imunidade contra patógenos é fornecida pela acção de linfócitos, que constituem o tipo celular mais comum no sistema imunológico. Existem dois tipos de linfócitos: os linfócitos B e os linfócitos T. Estes são geralmente denominados células B e células T, respectivamente.
As células B têm a capacidade de se desenvolver em células plasmáticas, que fabricam anticorpos. Os anticorpos são componentes muito importantes do sistema imunológico dos animais. Eles são produzidos em resposta a alguma parcela do patógeno invasor (um antigeno do patógeno - antigenos sendo aqui definido como qualquer substância estranha reconhecida pelo sistema imunológico) e geralmente são específicos para esse patógeno. No entanto, se dois patógenos são muito semelhantes, ou pelo menos contêm o mesmo antigeno, então anticorpos produzidos contra um, no entanto, podem ser eficazes contra o outro (eles podem "reagir de forma cruzada").Isso explica por que a inoculação com varíola bovina pode proteger contra a varíola. É importante perceber que os anticorpos "reconhecem" apenas uma pequena parte da molécula 3 antigénica do patógeno, em vez de o patógeno como um todo. Essas partes são chamadas de epitopos.
As células T não possuem ou produzem anticorpos. Em vez disso, elas reconhecem fragmentos (i.e. epitopos) do complexo antigeno estranho com maior complexo de histocompatibilidade (MHC) (ou no caso dos humanos, o antigeno leucocitário humano (HLA)) através de um receptor especializado conhecido como TCR (receptor da célula T) . As células T são divididas em subconjuntos, que podem ter tanto uma função reguladora como uma função efectora. As células efectoras estão envolvidas com o "efectuar" a remoção de substâncias estranhas. Por exemplo, as células T citotóxicas (CTL) são células efectoras que são capazes de matar as células infectadas, assim como outras espécies indesejáveis, tais como as células tumorais. As células T reguladoras, por outro lado, desempenham um papel em ajudar as células T efectoras e B a se tornarem mais eficazes. Devido a esta função, estas células T reguladoras são frequentemente chamadas de células T "auxiliares". Outras células T reguladoras, denominadas de células T supressoras, são pensadas para inibir as respostas imunes, mas estas são menos conhecidas. As células T reguladoras podem também interagir com os componentes do sistema imunológico inato para aumentar a sua actividade.
Num indivíduo normal e saudável, os linfócitos do sistema imunológico permanecem num estado inactivo de "repouso" até que ser accionada uma resposta imune. Quando uma resposta imunológica é necessária, os linfócitos são activados, proliferam e começam a exercer as suas funções designadas. 4
Por exemplo, qualquer célula T em repouso exibindo na sua superfície um TCR que reconhece um epítopo do patógeno invasor complexado com uma molécula de MHC é activada, prolifera (isso sendo denominado expansão clonal) e a descendência resultante começa a cumprir activamente as suas funções efectoras pré-determinadas necessárias para combater os organismos invasores.
Quando a resposta imune é concluída, (ou seja, os agentes patogénicos e/ou células infectadas foram eliminados) os linfócitos revertem, mais uma vez, para um estado de repouso. Este estado de repouso não é, contudo, o equivalente ao estado inactivo inicial de repouso. Activados, mas em repouso, os linfócitos, podem ser rapidamente recrutados e induzidos a proliferar em resposta a uma infecção pelo mesmo patógeno, ou intimamente relacionado, num momento posterior.
Esta capacidade dos linfócitos activados em repouso, para dar uma resposta mais rápida e mais poderosa na sequência de um segundo encontro com um patógeno invasor, efectivamente fornece o sistema imunológico, com 'memória'. A exploração da memória do sistema imunológico é a base para todos os fármacos imunoprofilácticos de longo prazo (vacinas, por exemplo) e continua a ser o objectivo de grande parte de desenvolvimento de medicamentos imunoterápicos a longo prazo.
Para que as células desempenhem as suas funções dentro dos sistemas complexos de um animal, as células precisam de ter 5 "receptores" nas suas superfícies. Esses receptores são capazes de "reconhecer" substâncias específicas que controlam vários processos essenciais como a activação, proliferação e adesão a outras células ou substratos. Por exemplo, no caso do sistema imunológico, os receptores nas células T e B permitem-lhes não só reconhecer o antígeno, mas também interagir com cada um, outro e, assim, regular as suas actividades. Sem esses receptores, as células não teriam um meio essencial de comunicação e seriam incapazes de agir eficazmente na forma concertada que é essencial para o sistema imunológico de um organismo multicelular. A fim de ser capaz de reconhecer especificamente e lidar com a ampla gama de patógenos presentes no ambiente, o sistema imunológico desenvolveu dois tipos de receptores de antígeno altamente variáveis em linfócitos: os anticorpos em células B e receptores de células T, ou TCRs, em células T . Há um grande número de diferentes receptores de antígens possíveis presentes no corpo, para activar o sistema imunológico para reconhecer uma grande variedade de patógenos invasores. De facto há aproximadamente 1012 células B diferentes e receptores de células T num indivíduo. Cada célula B individual tem apenas um tipo de receptor, e assim para lidar com um determinado patógeno, deve ser seleccionada uma célula B com o receptor que "encaixe melhor" para um antígeno de esse patógeno. Este processo é chamado de "selecção clonal". Em teoria, apenas um único clone pode responder (a resposta monoclonal) ou vários (uma resposta oligoclonal) ou muitos (uma resposta 6 policlonal), dependendo do número de antígenos/epítopos expostos pelo patógeno, e a especificidade das várias células B seleccionadas para essas antigenos/epitopos. Há uma grande diferença entre os tipos de antigeno que podem ser reconhecidos pelas células B e células T. Tanto quanto se sabe, apenas os receptores na superfície dos linfócitos B (ou seja, anticorpos) são capazes de reconhecer antígenos directamente tais como proteínas de vírus e bactérias, ou moléculas estranhas dissolvidas em fluidos corporais. Os anticorpos também podem ser produzidos numa forma solúvel pelas células B quando elas são activadas e se desenvolvem em células plasmáticas. Os anticorpos também são denominados imunoglobulinas (abreviado para Ig) . Os receptores de células T, por outro lado, reconhecem apenas pequenos peptídeos, também conhecidos como epítopos de células T, na superfície das células do corpo. Estes epítopos de células T são produzidos por degradação de proteínas maiores que são auto (ou seja, proteínas naturais do corpo) ou não-auto (isto é, derivadas organismos estranhos infecciosos do corpo). Apenas os derivados de proteínas estranhas, ou seja, os antígenos, são normalmente capazes de induzir uma resposta imune do corpo. Uma vez produzidos, esses epítopos são ligados a um tipo especial de molécula, o MHC (complexo principal de histocompatibilidade) e o complexo resultante é então apresentado na superfície da célula para a ligação do receptor de células T. destrutiva da apenas contra
Deve ficar claro que, devido à natureza resposta imune, a resposta tem de agir 7 patógenos estranhos, e não contra células do próprio corpo ou proteínas. Assim, o sistema imunológico precisa de distinguir entre "auto" e "não-auto". Tem sido proposto que, apesar serem produzidos clones de linfócitos reagindo contra auto, eles são excluídos antes de qualquer reacção possa ocorrer. Este processo é denominado "apagamento clonal". Também foi proposto que qualquer linfócito auto-reagente poderia ser mantido, mas apenas num "estado desligado". Esse mecanismo é chamado de "anergia clonal". Qualquer que seja o processo considerado, ainda não está claro qual é o mecanismo exacto que permite aos tecidos linfóides subjacentes, tais como o timo, identificar clones de células T individuais reagindo contra o auto partir do tanque de linfócitos T reagindo apenas contra o não-auto. Os presentes inventores investigaram mais plenamente o mecanismo de discriminação auto/não-auto, o que levou ao desenvolvimento da presente invenção. Os inventores estabeleceram um método de prever a imunogenicidade de uma substância como um peptídeo, o que permitiu uma mais rápida a identificação de sequências de peptídeo imunogénico dentro de grandes proteínas. Já é conhecido há muitos anos que o complexo principal de histocompatibilidade (MHC) desempenha um papel fundamental no sistema imunológico dos animais. As moléculas MHC permitem que as células T reconheçam antígenos, como já foi discutido acima. Existem três tipos gerais de molécula de MHC, classe I, classe II e classe III. As moléculas MHC da classe I e classe H são glicoproteínas que estão presentes na superfície da célula, enquanto as da classe III são geralmente moléculas solúveis presentes no interior da célula. Há um grande número de diferentes tipos de molécula de MHC. Por exemplo, em seres humanos (onde MHC é 8 denominado HLA, antigeno leucocitário humano), há várias centenas de diferentes alelos dos genes que codificam para as moléculas de MHC, o que significa que na população humana, existem muitos tipos diferentes de HLA. 0 MHC de diferentes espécies é geralmente nomeado de acordo com diferentes convenções, assim o MHC para o rato é chamado de H-2, para a ratazana RT1 e para o coelho RLA. As regiões do gene diferentes que codificam para diferentes moléculas de MHC num indivíduo são geralmente individualmente nomeadas, como HLA-A, HLA-C etc. em humanos. A molécula de MHC é uma molécula crítica do sistema imunológico, uma vez que é esta molécula que apresenta os epítopos dos antígenos para o sistema imunológico. Por exemplo, se uma célula T vai responder a um determinado patógeno, o patógeno deve ter pelo menos um antigeno (tal como uma proteína) que tem pelo menos um epítopo (como uma parcela de peptídeo da proteína) que pode ligar a uma molécula de MHC na superfície de uma célula e, assim, interagir com uma célula T que se liga ao complexo MHC-peptídeo. Assim, a resposta imune é dependente da capacidade do MHC para se ligar a um epítopo. Se não houver um epítopo que o MHC vai ligar, ou se não há células T que se ligam ao complexo MHC-peptídeo, então não irá ocorrer resposta imune.
Em relação a proteínas "auto", no entanto, um dos vários epítopos podem ser capazes de se ligar à molécula de MHC e, portanto, potencialmente induzir uma resposta imune. Nessas ocasiões, um "sinal" específico deve ser fornecido 9 aos clones de linfócitos auto-reagentes para serem excluídos ou "desligados".
Uma vez que, como indicado acima, tanto os peptídeos auto como os estranhos (i.e. não-auto) se podem se ligar a moléculas de MHC, a ligação de vários peptídeos às moléculas MHC recebeu especial escrutínio no campo da imunologia. Muitas investigações têm buscado calcular ou prever a força de ligação entre certos tipos de MHC (particularmente HLA e H-2) e sequências de peptídeos, para tentar dar conta de respostas imunes, ou a falta delas (ou seja, o "sinal" necessário para a discriminação entre as auto e as estranhas). Exemplos destes incluem o seguinte:
Altuvia Y, Schueler 0, Margalit H. 1995. "Ranking potential binding peptides to MHC molecules by a computational threading approach". J. Mol. Biol., 249:244-250.
Altuvia Y, Sette A, Sidney J, Southwood S, Margalit H. 1997. "A structure-based algorithm to predict potential binding peptides to MHC molecules with hydrophobic binding pockets". Hum. Immunol. 58:1-11. G.E. Meister, C.G.P. Roberts, J.A. Berzofsky, De Groot A.S., "Two novel T cell epitope prediction algorithms based on MHC-binding motifs; comparison of predicted and published epitopes from Mycobacterium tuberculosis and HIV protein sequences" Vaccine, 13:581-591, (1995).
Gulukota K, Sidney J, Sette A, DeLisi C. 1997. "Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules". J. Mol. Biol. 267:1258-1267 . 10
Pamer EG, Harty JT, Bevan MJ. "Precise prediction of a dominant class I MHC-restricted epitope of Listeria monocytogenes". Nature 1991; 353:852-855.
Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE. 1994. "Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains". J. Immunol. 152:163-175.
Rammensee HG, Friede T, Stevanoviic S. 1995. "MHC ligands and peptide motifs: First listing", Immunogenetics 41:178-228 .
Ruppert J, Sidney J, Celis E, Kubo RT, Grey HM, Sette A. 1993. "Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2.1 molecules". Cell 74:929-937.
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Geralmente, as tentativas da técnica anterior para prever a imunogenicidade de peptideos em particular através do cálculo da força de ligação entre o peptideo e o ambiente de ligação conhecido de uma molécula de MHC particular. O ambiente de ligação envolve uma 'bolsa' na molécula de MHC que é adaptada para aceitar um peptideo de um determinado comprimento (tal como 7-15 aminoácidos) . A estrutura da bolsa já pode ser conhecida a partir de estudos de raio-X cristalográfico anteriores. Esta força pode ser calculada matematicamente usando algoritmos apropriados para a interacção atómica e molecular. Alternativamente, a técnica anterior pode tentar 'pontuar' a força vinculativa de um peptideo com base em motivos existentes no peptideo, tais aminoácidos especiais estarem presentes em posições especificas num peptideo de um determinado comprimento, por exemplo, prolina presente na posição 3 num peptideo de aminoácido 8 que se liga a uma molécula de HLA particular conhecida. Geralmente estas abordagens tiveram um sucesso limitado. 13
Os presentes inventores acreditam ter melhorado as teorias acima para um melhor entendimento de como as células T reagem contra as auto-substâncias tais como as auto-proteínas que são identificadas antes da sua eliminação (supressão clonal) ou silenciamento (anergia clonal). Assim, os inventores têm sido capazes de identificar sequências específicas de peptídeo imunogéico que pode fornecer protecção contra patógenos específicos, e têm desenvolvido vacinas para esses patógenos, utilizando as sequências identificadas. No caso da presente invenção, os inventores desenvolveram peptídeos úteis em vacinas contra a gripe provocando uma resposta das células T.
Anteriormente, as vacinas contra a gripe foram desenvolvidas por meio da identificação de uma estirpe de vírus da gripe existente e, em seguida, produzindo uma vacina específica para esse vírus. Geralmente, as vacinas têm sido baseadas numa resposta de célula B (anticorpo), sendo o anticorpo reactivos com os antígenos de superfície (i.e. Hemaglutinina e Neuraminidase) da estirpe específica do vírus da gripe contra as quais tinha sido desenvolvido. Tipicamente, as proteínas de superfície que compreendem os antígenos são variáveis de uma estirpe do vírus da gripe para a próxima, já que a mutação do vírus para produzir um novo vírus tende a ocorrer nas proteínas de superfície. A consequência disso é que as vacinas contra a gripe convencionais, geralmente protegem apenas contra uma estirpe do vírus específico, e não protegem contra uma nova estirpe, que resulta de uma mutação. Assim, uma nova vacina é necessária para a protecção contra uma estirpe emergente. 0 problema claro com esta abordagem é que há um período de tempo entre a emergência da nova estirpe do vírus, e o desenvolvimento da vacina, durante o qual não há 14 protecção disponível contra o vírus. Se o vírus é particularmente prejudicial, isso pode levar a muitos milhões de mortes, como ocorreu nas grandes pandemias de gripe do século passado.
Tem sido conhecido há algum tempo gue os linfócitos citotóxicos T podem dar uma resposta imune a estirpes do vírus da gripe. Estudos recentes têm mostrado gue a resposta CTL em seres humanos pode ser direccionada para múltiplos epítopos. Tem sido sugerido gue há uma resposta dominante para a HLA-A2 restrita ao epítopo M-l 58-66. Tais estudos incluem AC Boon et al, J. Virol, Jan. 2002, 582-90; S. Tamura et al Jpn. J. Infect. Dis., Dez. 2004, 236-47; Deliyannis G. et al J. Virol, Maio 2002, 4212-21;
Gianfrani C. et al Hum. Immunol, Maio 2000, 438-52; e J.
Jameson et al J. Immunol, Junho 1999, 7578-83.
Recentemente, tem sido também feita investigação em peptídeos imunogénicos específicos que podem ser úteis no desenvolvimento de uma vacina contra a gripe provocando uma resposta das células T. Normalmente, esse trabalho tem envolvido investigação da resposta CTL para testar os peptídeos da gripe, por exemplo, em ratos transgénicos. Os peptídeos testados tendem a ter sequências curtas que podem ser reactivas a um tipo de MHC (ou HLA) , e são tomados a partir de uma estirpe de teste específica da gripe. Por exemplo, em Vaccine, 2005, 5231-44, N. Hu et al divulga um teste com o peptídeo de tipo selvagem Ml 58-66 em ratos HLA Tg expressando HLA-A2,-B7 ou -B27. Os resultados mostram que o peptídeo é um epítopo da gripe reconhecido por ratos transgénicos expressando HLA-A2. Em Clin. Exp. Immunol., 15
Outubro 2005, 45-52, AC Boon et al divulga peptídeos da gripe A Ml 58-66 e 44-52 NP como epitopos reconhecidos por HLA-A* 0101 e HLA-A * 0201 individuais. Em Cell Immunol., Abril 2005, 110-123, E. Cheuk et al divulgam um peptideo de gripe A NP 383-391 como um epitopo reconhecido em ratos deficientes HLA-B27/H2 classe I. Usando programas de predição de epitopos, os autores identificaram mais três epitopos de gripe A restritos, BP-2 702-710, PB-1 571-579 e PB-2 368-376. Em J. Immunol. Fev. 2004, 2453-60, AC Boon et al divulgam clones humanos CTL específicos para as variantes naturais de epitopo restrito de HLA-B* 3501 em NP 418-426. Em J. Immunother, Jan-Fev 2003, 41-6, A. Trojan et al divulgam HLA-A3 restrito 9-mer RLEDVFAGK que é capaz de induzir reactividade CTL específica. O peptideo de vírus matriz de gripe A HLA-A2 restrito GILGFVFTL também é divulgado. Em J. Gen. Virol., Julho 2001, 1749-1755, S. Tourdot et al identifica um epitopo restrito derivado D(k) murino da proteína de polimerase PB-1 da estirpe do vírus de gripe A A/PR/8/34, correspondente aos resíduos de aminoácidos 349-357 (ARLGKGYMF). Em J. Immunol., Abril 2001, 4627-33, G.T. Belz et al identifica um peptideo imunogénico (SSYRRPVGI) da proteína polimerase PB-1 da gripe, correspondente aos resíduos de aminoácidos 703-711 e um mimotope (ISPLMVAYM) da polimerase PB-2. A PCT/US2005/002954 divulga epitopos CTL compreendendo NP 265-273, tendo a sequência ILRGSVAHK, e também epitopos compreendendo NP 305-313. Finalmente, a US 6,740325 divulga dois epitopos CTL: NP 335-350 e NP 380-393.
Na WO 2005/120564 são divulgados métodos para desenvolver a apresentação antigénica, ou melhorar a imunogenicidade de um polipeptídeo. É descrita uma composição de vacina, que faz uso de um elemento disruptivo (tal como a eliminação, 16 substituição ou inserção) para melhorar a apresentação antigénica através da degradação mais eficiente da proteína. A proteína modificada empregue pode ser a proteína da gripe NP ou a proteína Ml.
Outros estudos têm mostrado que os dados de ratos transgénicos fornecem um modelo confiável para a investigação de respostas CTL em seres humanos. Em Int. t. Immunol., Abril 1995, 597-605, S. Man et al mostraram que o epítopo dominante da gripe A reconhecido pelos linfócitos T citotóxicos restritos de HLA-A2.1 de ratos transgénicos HLA-A2.1 foi a peptídeo de epítopo da proteína de matriz 1 (MI) que é imunodominante nas respostas CTL humanas. Mais estudos nessa área têm sido realizados por E.J. Bernhard et al (J. Exp. Med., Setembro 1998, 1157-1162) e E. Cheuk et al (J. Immunol., Novembro 2002, 5571-80).
No entanto, apesar de epítopos conhecidos terem sido estudadas extensivamente, nenhum foi ainda satisfatório para formar a base de uma vacina contra a gripe que seja capaz de proteger contra mais de que uma única estirpe do vírus da gripe. Além disso, as vacinas baseadas nesses epítopos únicos, mesmo que fornecessem alguma protecção, provavelmente seriam específicos para um HLA particular, tornando-os ineficazes para uma grande proporção da população humana.
Assim, um problema significativo com vacinas conhecidas dependendo de uma resposta de células B ou células T é que elas só protegem contra uma estirpe do vírus existente, e 17 não fornecem protecção contra possíveis estirpes futuras que poderão desenvolver-se. Com o surgimento da estirpe H5N1 altamente perigosa na população aviária, a necessidade de uma vacina com antecedência de uma pandemia humana baseada numa mutação posterior da cepa H5N1 tornou-se mais aguda. Além disso, as vacinas baseadas em peptídeos conhecidos provocando respostas das células T podem não ser eficazes em grande parte da população.
Assim, é um objectivo da presente invenção para resolver os problemas associados com a técnica conhecida acima referida. É um outro objectivo da presente invenção fornecer um polipeptídeo que seja capaz de provocar uma resposta CTL imune em vertebrados contra uma pluralidade de estirpes de gripe e/ou numa pluralidade de indivíduos expressando diferentes MHCs (HLAs). É um outro objectivo da presente invenção fornecer uma vacina contra a gripe usando o polipeptídeo da invenção. De preferência a vacina será capaz de proteger contra uma pluralidade de estirpes da gripe e/ou será eficaz numa pluralidade de indivíduos expressando diferentes MHCs (HLAs).
Assim, a presente invenção fornece um polipeptídeo não tendo mais de 40 aminoácidos, o qual compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de homologia com a SEQ ID 1:
SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP em que o polipeptídeo é imunogénico num vertebrado expressando um alelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC), e o qual é imunogénico para uma pluralidade de estirpes do vírus da gripe. 18
Assim, o polipeptideo é aquele que pode incluir a totalidade da acima mencionada sequência, mas não pode ter mais de 40 resíduos de aminoácidos no total. O polipeptideo também deve ser imunogénico num vertebrado expressando um alelo MHC (HLA em humanos). Um polipeptideo imunogénico é entendido no presente contexto significar um polipeptideo que provoca uma resposta imune num vertebrado, pela ligação a uma MHC de vertebrado e fazendo-a reagir com um linfócito citotóxico de células T. Um método para determinar se um polipeptideo possui imunogenicidade consta da Experiência 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não se limita a esses métodos, e um perito na técnica pode escolher qualquer método conhecido para determinar a imunogenicidade, conforme desejado. O polipeptideo pode ser composto por dois ou mais resíduos de epítopos que reagem com um ou mais MHCs e assim provocam uma ampla resposta CTL. A resposta pode estar num único indivíduo ou pode ser em pelo menos dois indivíduos diferentes (e os indivíduos podem ser da mesma espécie ou de espécies diferentes). Assim, o polipeptideo pode incluir pelo menos dois resíduos de epítopos diferentes ou mais, cada qual individualmente proporciona uma resposta a um sujeito diferente. Um epítopo no contexto da presente invenção é uma parte de um polipeptideo que é capaz de se ligar a um MHC de vertebrados num vertebrado, de preferência induzindo uma resposta imune, tais como, causando com que o complexo de MHC-epítopo reaja com um CTL. Um método para determinar se um polipeptideo é ou contém um epítopo é estabelecido na Experiência 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não se limita a esses métodos, e um perito na técnica pode escolher qualquer 19 método conhecido para determinar se um polipeptideo é ou contém um epitopo, conforme desejado.
Os presentes inventores descobriram que as sequências acima compreendem uma pluralidade de epitopos CTL, o que pode proteqer contra a gripe para uma ampla variedade de vertebrados numa população. Além disso, os inventores têm analisado todas as sequências de estirpe do vírus conhecidas em todas as espécies, e descobriram que as sequências especificadas são muito conservadas em todas as estirpes do vírus da gripe conhecidas. Como tal, é muito improvável que estas sequências sejam significativamente alteradas em novas variedades resultantes da mutação das estirpes existentes. Assim, os epitopos dentro dessas sequências que fornecem procteção são altamente susceptíveis de estar presentes na forma inalterada em novas estirpes, uma vez que a mutação não ocorre normalmente nessas regiões. Consequentemente, esses epitopos fornecem excelente oportunidade não só para fornecer protecção contra as estirpes da gripe existentes (como a estirpe H5N1 do vírus da "gripe das aves"), mas também protegendo contra estirpes ainda desconhecidas (como uma forma mutante do vírus H5N1 que poderia passar facilmente de humano para humano e formar a base de uma pandemia).
Como discutido acima, as sequências foram identificadas após a análise de todas as sequências conhecidas do vírus da gripe em todas as espécies. As sequências são, portanto, sequências de consenso obtidas a partir da análise acima. Apesar de serem sequências de consenso, as 20 sequências correspondem, em alguns casos, exactamente às sequências naturais em algumas das estirpes do vírus da gripe conhecidas. Devido à conservação notável nas sequências em todos os vírus em todas as espécies, as sequências de consenso, mesmo quando diferentes de sequências actuais, só diferem num pequeno número de resíduos, e, portanto, contêm muitos epítopos menores (8-mers, 9-mers, 10-mers etc.) para os quais não há diferenças a partir das sequências naturais. As sequências de consenso acima como um todo, contêm, portanto, muitos epítopos eficazes que são os mesmos que os epítopos naturais, bem como epítopos eficazes que diferem apenas ligeiramente de epítopos naturais. Será aparente a uma pessoa qualificada que a invenção se estende não só para as sequências de consenso e seus epítopos, mas também para as sequências reais correspondentes em quaisquer estirpes de vírus da gripe. Assim, sequências com alguma homologia com as sequências de consenso também estão dentro do escopo da invenção. Tais substituições são, de preferência, substituições conservadoras em conformidade com regimes de substituição conhecidos. A presente invenção será descrita em mais detalhes a título de exemplo apenas com referência às figuras a seguir, em que: A Figura IA a 1F mostram a produção de IFN-γ em culturas primárias de esplenócitos em ratos vacinados FLU-v e NRP estimulados com Con A (10 pg/ml), lisozima solúvel (5 pg/ml), polipeptídeos solúveis purificados (Pl (Figura IA) , P2 (Figura 1B) , P3 (Figura 1C) , P4 (Figura 1D) , P5 (Figura 1E) e P6 (Figura 1F), 5 pg/ml) e HLA compatível TI (Tl) e células humanas Jurkat incompatíveis (Ju) transfectadas 21 tanto com lisozima, Pl, P2, P3, P4, P5 ou P6 de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1 abaixo (razão entre células transfectadas e esplenócitos é 10:1). A produção de IFN-γ é representada como o diferencial entre o nivel de produção em resposta ao antigeno considerado menos o IFN-γ produzido em resposta a qualquer lisozima solúvel ou a células correspondentes transfectadas com lisozima. Níveis de base de produção mediada de lisozima de IFN-γ foram para o antigeno solúvel 25 ± 10 pg/ml, para o antigeno em TI 316 ± 43 pg/ml, e para antigeno em Jurkat 19+6 pg/ml; A Figura 2 mostra a produção de IFN-γ em culturas primárias de esplenócitos em ratos vacinados FLU-v e NRP estimulados com Con A (10 pg/ml), lisozima solúvel (5 pg/ml), preparação polipeptídeo solúvel purificado FLU-v (Pl, P2, P3, P4, P5 e P6 todos juntos a 5 pg/ml) e HLA compatível TI (Tl) e células humanas Jurkat incompatíveis (Ju) infectadas com estirpes da gripe A/New_Caledonia/20/99, A/NYMC/X-147 ou B/Johannesburg/5/99 ou transfectadas com lisozima de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1 abaixo (razão entre as células infectadas/transfectadas e esplenócitos é 10:1); a produção de IFN-γ é representada como o diferencial entre o nível de produção em resposta ao antigeno considerado menos o IFN-γ produzido em resposta à lisozima solúvel ou às células correspondentes transfectadas com lisozima; níveis de base de produção mediada lisozima de IFN-γ foram para o antigeno solúvel 25 ± 10 pg/ml, para antigeno em Tl 316 ± 43 pg/ml, e para antigeno em Jurkat 19 ± 6 pg/ml; e
As Figuras 3A e 3B mostram a sobrevivência dos animais na sequência de um desafio letal com Gripe A/PR/8/34; os animais foram imunizados por via subcutânea com FLU-v ou NRP-v, nos dias 1 e 15 e no dia 20 todos foram desafiados por via intranasal com 45 pl do vírus (5xl07 pfu por dose), 22 sob anestesia; os animais na Fig. 3A foram inoculados intraperitonealmente com 100 pg de soro de rato anti-rato CD8 nos dias 19 e 22; os animais na Fig. 3B foram inoculados intraperitonealmente com um soro de ratos irrelevante nos dias 19 e 22; a seta indica a data do desafio intranasal, enquanto os diamantes indicam a data em que os animais foram inoculados com o soro anti-CD8. O polipeptideo acima descrito compreende tipicamente um ou mais (de preferência dois ou mais) epitopos. Esses epitopos são, de preferência, epitopos de células T, como os epitopos de linfócitos T citotóxicos (CTL). Geralmente o polipeptideo é imunogénico para pluralidade de estirpes do virus da gripe. No presente contexto, um polipeptideo imunogénico a uma estirpe do virus da gripe é entendido como um polipeptideo que é parte de uma proteína do vírus da gripe e que provoca uma resposta do sistema imunológico, tais como, exibindo reactividade CTL quando ligado a um MHC. Um método para determinar se um polipeptideo possui imunogenicidade consta da Experiência 1 abaixo. No entanto, a presente invenção não se limita a esses métodos, e um perito na técnica pode escolher qualquer método conhecido para determinar a imunogenicidade, conforme desej ado.
Na presente invenção, o polipeptideo pode compreender duas ou mais sequências como descrito acima. Normalmente, duas, três, quatro, cinco ou mais sequências podem estar presentes no polipeptideo, se desejado. Quanto mais epitopos estiverem presentes, maior a amplitude de 23 protecção dentro de uma população de seres humanos e/ou indivíduos animais com diferentes HLAs ou MHCs.
Na presente invenção, a estirpe da gripe não é especialmente limitada, e os polipeptídeos podem ser imunogénicos contra, e/ou derivados de qualquer estirpe de gripe conhecida. De preferência, no entanto, a estirpe em causa é uma estirpe de gripe A ou gripe B. Estipes da gripe futuras que se transformaram a partir de qualquer dessas estirpes existentes também podem ser aquelas contra os quais os polipeptídeos são imunogénicos, ou a partir das quais os polipeptídeos são derivados.
As proteínas dentro das quais as sequências que definem os polipeptídeos da presente invenção estão situadas são seleccionadas a partir proteínas Ml de qualquer estirpe do vírus da gripe (especialmente estirpes A e B) (as sequências de consenso de todas as sequências analisadas, ou alternativamente, as posições das quais dentro da proteína, são descritas acima). As seguintes proteínas específicas foram analisadas pelos inventores, e de preferência as proteínas do vírus da gripe que se referea invenção são seleccionadas a partir dessas proteínas específicas, ou mutações dessas proteínas. Assim, as sequências específicas homólogas à SEQ ID 1 descritas acima são de preferência aquelas que estão nas posições adequadas nas seguintes proteínas. Da mesma forma, as sequências da presente invenção definidas pelas posições de resíduo dentro das proteínas a partir de qualquer estirpe de gripe, ou seja, resíduos de proteína 36-75 Ml (especialmente gripe A Ml) , são preferencialmente aqueles que estão dentro das 24
seguintes proteínas específicas. A lista está na forma [número da versão (número gi) | Número de identificação do banco de dados (por exemplo gb para GenBank) | número de adesão NCBI | mais informações opcionais (por exemplo, o número de adesão da sequência de nucleotídeos a partir da qual a sequência da proteína é derivada). As sequências e estirpes de gripe correspondentes das quais derivam podem ser encontradas a partir do banco de dados público de proteína NCBI, o que pode ser acedido on-line na seguinte endereço URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/querv/static/help/helpdo c.html#Protein. 0 banco de dados de proteínas contem dados de sequência das regiões de codificação traduzidas a partir de sequências de ADN no GenBank, EMBL, e DDBJ, assim como sequências de proteínas submetidos à Protein Information Resource (PIR), SWISS-PROT, Protein Research Foundation (PRF) e Protein Data Bank (PDB) (sequências de estruturas resolvidas).
Proteínas Ml 25 ]27530653)dbj|B AC54009.1); 1275306341dbjlBAC5399S.lj; |538297l9f$>jAAU94746.lj; (538297Í6jgbjAAtl94?44,1|; |$38297l3j#(ÀA094?42.!|; j53829710jgbjAAU94?4«,l|; i53829707|gb(ÀÀU9473S,11: j53S29?Q4ígbjAAU94?36,lS; (53829701 jgb|AA094?34,ll; j53829698(gb (AAIJ94732.11; (53$29695|gbjAAÍJ94730.í|; |53829602|gb(AÂO94728.l|; )53829689jgbjAAU94726,l |538^686^ίΑΑ094724.1|; (53829683jgblAAU94?22.1|; (84861 éOjreíMP J156664.1 f; |30466242|rdpsTJ486S9 J (; {30349250^>(AAP22121.Í|; (3046621 l|reílNPm848672,í|; ' “ j303492l9;gbjAAP22104.íj; (4761025igbiAAI>29208.1(ÀF100392 lf; !4761022(gbjAAD292O6.1iAFlOO391„l(; (4761019!gbjAAD29204.1 j AF100390 í|; (4761O16{gbiAAD292O2.Í|AFlO0389„l(; |4?61013lgb(AAD29200. 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As estirpes de gripe preferidas referidas na presente invenção, por exemplo, contra a qual os polipeptídeos presentes devem ser imunogénicos, são aquelas que contêm essas proteínas específicas. Os números de adesão acima especificam explicitamente a identidade da estirpe além da sequência da proteína específica. A percentagem de homologia de uma primeira sequência de polipeptídeos para uma segunda sequência polipeptídica, tal como referido no contexto da presente invenção, é definida como o número de resíduos de aminoácidos na segunda sequência em que correspondem tanto em posição e identidade aos da primeira sequência, dividido pelo número total de resíduos de aminoácidos no segundo polipeptídeo (ambos os primeiro e segundo polipeptídeos devem ter o mesmo número de resíduos de aminoácidos) e multiplicado por 100. Na presente invenção, é preferível que a homologia de polipeptídeos para as sequências definidas seja de 95% ou mais, ou de preferência 100% (ou substancialmente 100%).
Os epítopos dentro das sequências definidas acima não são especialmente limitados, desde que contenham 7 resíduos de aminoácidos ou mais. De preferência os epítopos são de um tamanho que é apropriado para epítopos CTL numa espécie particular de vertebrados, como num ser humano, tendo um MHC específico. Normalmente os epítopos contêm 8, 9, 10 ou 11 resíduos de aminoácidos, mas podem conter mais, se desejado. Geralmente um epítopo apropriado é aquele que é um epítopo CTL num vertebrado, como um ser humano. 34 0 polipeptídeo da invenção compreende até 10 aminoácidos e, de preferência mais de 35 aminoácidos. O tamanho não deve ser tão grande que epitopos úteis sofram com a competição com os epitopos não-protectores do sistema imunológico (por esta razão as proteínas totais não estão incluídas), nem o tamanho deve ser tão pequeno que apenas uma faixa muito estreita de protecção seja oferecida. É particularmente preferido que o polipeptídeo consista numa sequência seleccionada da SEQ ID 1.
Também fornecido pela invenção é uma composição de polipeptídeo compreendendo dois ou mais polipeptídeos diferentes como definido na reivindicação. Assim, a composição polipeptídica pode incluir qualquer número de polipeptídeos da presente invenção juntos na mesma mistura ou formulação. A presença de uma pluralidade de polipeptídeos em conjunto é útil, pois cada um pode provocar a sua própria resposta imune, ampliando o efeito protector da composição. É particularmente preferido que a composição contenha todas as sequências de SEQ ID 1-6 ou cada uma num peptídeo separado ou vários num número menor de peptídeos (por exemplo, 3 combinados num peptídeo maior e os outros três 3 em outro peptídeo maior, etc.) A presente invenção também fornece um polipeptídeo como definido anteriormente para uso em medicina. Também é fornecido um medicamento ou composição da vacina contra a gripe, compreendendo um polipeptídeo como definido acima, e um ou mais excipientes apropriados e/ou adjuvantes. 35 0 excipiente ou adjuvante não é especialmente limitado, e qualquer um dos excipientes ou adjuvantes utilizados em medicamentos e vacinas podem ser empregues. 0 medicamento ou composição de vacina podem ser produzidos de acordo com qualquer método conhecido devidamente adaptado à presente invenção, como pela mistura de um polipeptideo da invenção com um excipiente apropriado.
Um método de produzir um polipeptideo como definido acima também é fornecido pela invenção. 0 método não está particularmente limitado e, normalmente, compreende a junção de dois ou mais epitopos para formar o polipeptidio. 0 polipeptideo pode, no entanto, ser sintetizado por síntese química directa (por exemplo, incorporando um aminoácido de cada vez até que o polipeptideo completo seja formado) ou por métodos recombinantes. Tais métodos gerais são bem conhecidos pelos peritos na técnica e podem ser adaptados à presente invenção, conforme desejado. Em alguns casos, o polipeptideo da presente invenção pode incluir sequências de aminoácidos adicionais em um ou ambos os términos para ajudar na síntese do polipeptideo. Essas sequências adicionais são preferencialmente de 1-5 aminoácidos de comprimento. Tipicamente estão envolvidos 3 aminoácidos. A invenção prevê ainda o uso de um polipeptideo ou composição como definido acima, na fabricação de um medicamento ou vacina, eficaz no tratamento ou prevenção da gripe. Também é fornecido um método de tratar ou prevenir a gripe, que compreende a administração de um polipeptideo, uma composição, um medicamento ou uma vacina como definida 36 acima a um vertebrado. 0 método de administração não é especialmente limitado, e pode incluir administração subcutânea, intramuscuscular, intra-venosa, intra-dérmica, ou intra-nasal, ou pode ser administrado por via oral (por exemplo, na forma de um comprimido ou uma preparação liquida) , ou pode ser na forma de um supositório, se desejado. A forma de administração de tais preparações não é especialmente limitada, e as formas conhecidas podem ser empregues com as modificações apropriadas que serão aparentes para um perito na técnica. A dosagem não é especialmente limitada e pode variar de 1 pg a 100 g do polipeptideo por indivíduo, dependendo do tamanho, peso e espécie do indivíduo envolvido. A invenção pode ser aplicada a qualquer vertebrado, já que o sistema imunológico dos vertebrados funciona de uma forma relacionada. Normalmente, o vertebrado a que se refere o presente contexto é um mamífero, pássaro, réptil ou um peixe. É especialmente preferível que o vertebrado seja um ser humano, um animal doméstico (como um cão ou um gato), um animal de quinta (como um porco ou um cavalo); um bovino (como gado, ou uma vaca) ou aves (como uma ave doméstica, um pássaro, ou um pássaro de competição). Quando o vertebrado é um pássaro, é de preferência uma galinha, um peru, um pato ou um ganso.
Exemplos de MHCs humanos (HLA) que podem ser empregues com a presente invenção incluem o seguinte: 37
HLA-A À*010101, A*0101Q2, A*010103, A*0102» A*0103, A*0104N, A*0106, A*O107, À*01O8, À*Ô109, A*OJ10, A*02OlO101, A*O20ÍO1O2L} A*O20102, A*020103, A*020104, A*020105, A*fl201Q6, A*G20107, Α*020108, Â*020109, A*02Õli0, Α*020Π1, A*O202» A*O20301, A*020302, A*0204, A*02OS, A*02C60I, A*G2Q602, A*G20603, A*02Q7, Â*Ô208> A*Q209, À*0210, Α*02Π, A*0212, A*0213, A*0214, A*0215N, A*02J6, A*Ô21701, A*O21702, A*Q218, A*Q219, A*02200l, A*022ÔQ2, À*022l, A*0222, A*0224, A*0225, A*0226, A*0227, A*0228, A*0229, A*023O, A*Q231, A*0232H, Â*0233, A*0234, A*023501, Â*0235Q2, A*0236, A*0237, À*0238, A*Q239, À*0240, A*G241, A*0242, A*0243N, A*G244, A*0245, À*0246s A*0247, A*«248, A*0249, A*025O, A*0251, A*0252, A*0253N, A*0254, A*0255, A*0256, A*0257, A*0258, A*0259, A*0260, A*Q261, A*0262, Α*02δ3, A*0264, A*0265, A*0266, À*0267, A*0268, A*0269, A*0270, A*0271, A*0272, A*0273, A*03Q10101, A*Q301O102N, A*03010103» A*03O102, A*030!03, A*03Q2, Α*03Ο3Ν, A*0304, A*0305, A*0306s A*0307, Â*Q3085 A*0309, A*0310, A*Ô3ilN, A*0312, A*03I3, A*03Í4, Α'ΗΙΟίϋί, A*1.10102, A* 1102. A*1103, À*11Ô4, A*1105, A* 1106, A*1107, A* 1108, An 109, A* 1110, A*UU, A*1U2, Á*U13, À*ni4, A*1115, A* 1116, Α*Π17, A* 1118, A*IU9, A*230í, A*2302, A*2303, À*2304, A*2305, A*2306, A*2307N, A*2308N, À*23Ô9, A*2310, A*2311N, A*2312> A#2402010i, A*2402O1Ó2L5 A*2402Q2, á*2402035 A*2402Q4S A*24Ô205! À*240206, A*24030J, A*24O302, A*2404, À*2405, Α*2406, À*24Q7, A*2408, A*2409N, A*2410, A*2411N, À*2413, A*24i4, A*2415, A*2417, A*2418, À*2419, A*2420, A*2421, A*2422, A*2423, A*2424, A*2425, A*2426, A*2427, A*2428, A*2429, A*2430, A*2431, A*2432, A*2433, 38
Α*2434, Α*2435> Α*2436Ν» Α*2437, Α*2438, Α*2439, Α*2440Ν, Α*2441, Α*2442, Α*2443, Α*2444, Α*2445Ν, Α*2446, Α*250101, Α*250Ϊ02, Α*2502, Α*2503, Α*2504, Α*260ΐ, Α*2602, Α*2603, Α*2604, Α*2ό05, À*2&)6, A*2607Ô1, Α*2607Ο2, Α*2608, Α*2609, Α*2610, Α*26ΠΝ, Α*26Ι2, Α*2613, Α*2614, Α*26Ι5, Α*2616, Α*2617, Α*2618, Α*2δ19, Α*2620, A*262l, A*2622, Α*2623, Α*2901010Ι, Α*290Ι0102Ν, À*290201» Α*290202, À*2902G3, Â*29Q3, Α*2904, Α*2905, Α*2906, Α*2907, Α*2908Ν» Α*2909, Α*2910, Α*2911, Λ*30ΟΙΟ1, A*3Ô0ÍÔ2» Α*3Ο02Ο1» Α*300202, Α*3003, Α·3Ο04, Α*300ό, Α*3007, Α*3008, Α*3009, Α*30ί0, Α*30Π, Α*3032, ΑΑ310102, Α*3102, Α*3103, Α*3104, Α*3105, Α*310δ> Α*3107, Α*3108, Α*3109, Α*3Ϊ10, Α*3201, Α*3202, Α*3203, Α·3204, Α*3205, Α*3206, Α*3207, Α*3208, Α*330Ι, Α*330301, Α*330302, Α*3304, Α*3305, Α*3306, Α*3307, Α*34«, Α*3402, Α*3403, Α*3404, Α*3405, Α*3406, Α*3601» À*36Q2, Α*3603, Α*3604, ΑΜ301, Α*6601, Α*6602, Α*6603, Α*6604, Α*68Ο101» Α*680102> Α*680103, Α*6802, Α*6Κ»01, Α*680302, Α*6804, Α*680$, Α*6806, Α*6807, Α*6808, Α*6809, Α*6810, Α*6811Ν, Α*6812, Α*6813, Α*6814, Α*6815, Α*6816, A*<S817, Α*68!8Ν, A*6S19, Α*6820, A*682l> Α*6822, Α*6823, Α*6824, A*6S25, Α*682δ, Α*6827, Α*6901, Λ*7401, Α*7402, Α*7403, Α*?404, Α*7495, Α*7406, Α*7407, Α*7408, Α*7409, Α*7410, A*800L
HLÀ-B »*070201, »*070202, »*070203, »*070204, »*0703, »*0704, »*0705, Β*0706, »*0707, Β*0708, »*0709, Β*0710, 3*0711, »*0712, »*0713, »*0714, »*0715, »*0716, Β*0?17, »*0718, »*0719, Β*0720, »*0721, »*0722, »*0723, »*0724, »*0725, »*0726, Β*0727, Β*0728, Β*0729, »*0730, 3*0731, »*0732, »*0733, »*0734, »*0735, »*0736, »*0737, Β*0738, »*0801, »*0802, »*0803, »*0804, »*0805, »*0806, »*0807, Β*0808Ν, »*0809, »*0810, »*0811, δ*0812, »*0813, »*0814, »*0815, »*0816, »*0817, »*0818, Β*0819Κ, »*0820, »*0821, »*0822, »*1301, »*1302, Β*1303, »*1304, »*1306, Β*1307Ν, »*1308, »*1309, .8*1310, »*1311, »*1312, »*1313, »*1401, »*1402, 8*1403, »*1404, »*1405, »*140601, »*140602, 8*15010101, Β*ί5Ο1Ο102Ν, »*150102, Β*150103, 8*150104, Β*150105, 8*1502, »*1503, »*1504, Β*1505, Β*1506, Β*1507, »*1508, »*1509,8*1510, »*151101, 8*151102, 8*1512, Β*1513, »*1514, .8*1515, »*1516, »*15170101, 8*15170102, Β*1518, »*1519, 8*1520, 8*1521, 8*1523, 8*1524, Β*1525, Β*1526Ν, »*1527, »*1528, 8*1529, 8*1530, »*1531, »*1532, »*1533, 8*1534, 8*1535, 8*1536, 39 Β*1537, ΒΠ538, Β*1539, Β*1540, 8*1542, ΒΉ543, Β*1544, Β*1545, 8*1546, 8*154?, Β* 1548, 8*1549, Β*1550, 8*1551, 8*1552, 8*1553, Β*1554, Β*1555, Β*ί556, Β*1557, Β*1558, Β*Ι5€0, 8*1561, Β*1562, ΒΗ563, Β*1564, 8*1565, 8*1566, B*Í567,- Β*1568, 8*1569, Β*1570, Β*157ί, Β*ί5?2, Β*1573, 0*1574, Β*ί575, 3*1576, .8*1577, Β*157$, Β*15?9Ν, Β* 15-80, B*IS8I, Β*1582, 8*1583, Β*1584, 8*1585, Β*1586, »*1587, Β*1588, 6*1589, 8*1590, Β*1591, Β*15.92, Β*1593, Β*ί594Ν, »*180101, 8*180102, 8*1802, 8*1803, Β*1804, 8*1805, Β*1806, Β*1807, Β*1808, 8*1809, Β*1810, Β*1811, 8*1812, Β*1813, 8*1814, 8*1815, Β*1817Ν, 8*1818,8*1819, B*ÍS20, 8*2701, Β*2702, Β*2703, 8*2704, 8*270502, 8*270503, 8*270504, Β*270505, Β*2?05Οό, Β*270507, Β*2706, Β*2707, 8*2708, Β*2?09, Β*2710, Β*2711, 8*2712, Β*2713, Β*2?14, Β*2?15, 8*2716, Β*2717, Β*2718,8*2719,8*2720,0*2721, Β*2?23, Β*2724, Β*2725,8*2726, Β*350101, Β*350102, Β*3502, 8*3503, 8*3504, Β*3505, Β*3506, Β*3507, Β*3508, Β*350901, 8*350902, Β*3510, Β*35Ι1, Β*3512, 8*3513, Β*351401, Β*351402, Β*3515, Β*3516, Β*3517, Β*3518, Β*3519, B*3S20, B*3S21, Β*3522, Β*3523, Β*3524, B*352S, Β*3526, 8*3527, 8*3528, Β*3529, Β*3530> Β*3531, Β*3532, Β*3533, Β*3534, Β*3535, Β*3536, Β*3537, Β*3538,8*3539, Β*3540Ν, 8*3541, Β*3542, 8*3543, Β*3544, Β*3545, Β*3546, Β*3547, Β*3548> Β*3549, 8*3550, 8*3551, Β*3552, Β*3553Ν, Β*370ϊ, Β*3702, Β*3?03Ν, Β*3704, Β*3705, Β*3706, Β*3707, Β*3$01, Β*380201, Β*3Β0202, 8*3803, 8*3804, Β*3805, 8*3806, Β*3807, Β*3808, 8*3809, Β*3810, 8*390101, Β*390103, Β*390104, 8*390201, 8*390202, 8*3903, Β*3904, Β*390$, Β*390601, Β*390602, 8*3907, 8*3908, 8*3909, Β*3910, Β*3911, 8*3912, Β*3913, Β*3914, Β*3915, 8*3916, 8*3917, 8*3918, 8*3919, Β*3920,8*3922,8*3923, Β*3924, Β*3925Ν, Β*392β, 8*3927, Β*3928, 8*3929, 8*3930, 8*3931, Β*3932,8*400101, »*400102, 8*400103, Β*400Ι04, »*400105, 8*40020.1, 8*400202, Β*4003, 8*4004, Β*4005, .8*40060101, 8*40060102, Β*4007, »*4008, Β*4009, »*4010, Β*40Π, Β*4012, Β*4013, 8*401401, Β*401402, ΒΉ01403, 8*4015, 8*4016, 8*4018, Β*4019, Β*4020, 8*4021, Β*4022Ν, Β*4023, 8*4024, 8*4025, Β*4026, .8*4027, .8*4028, Β*4029, 8*4030, Β*4031, Β*4032, 8*4033, 8*4034, 8*4035, 8*4036, Β*4037, Β*4038, 8*4039, Β*404Ο, δ*4042, 8*4043, 8*4044, »*4045, 8*4046, Β*4047, 8*4048, Β*4049, Β*4050, 8*4051, B*4Q52, 8*4053, Β*4054, 8*4055, Β*4056, 8*4057, Β*4101, 8*4102, Β*4103, Β*4104, 8*4105, Β*4106, Β*4201, 8*4202, 8*4204, 8*420501, »*420502, 8*4206, .8*44020101, B*440201Ô2S, Β*440202, 8*440203, 8*440301, 8*440302, 8*4404, δ*4405. 8*4406, 8*4407, B*440S, 8*4409, 40 Β*441ϋ, 8*4411, Β*4412, 3*4413, 8*4414, Β*4415, 8*4416, 8*4417, 8*4418, Β*44Ι9Ν, Β*4420, Β*442·1, 8*4422, Β*4423Ν, 8*4424, Β*4425, Β*4426, Β*4427» Β*4428, 8*4429, Β*4430, 8*4431, Β*4432, 8*4433, ©*4434, 8*4435, Β*4436, 8*4437, Β*4438, 8*4439, 8*4440, Β*4501, 8*4502, Β*4503, Β*4504, 8*4505, 8*4506, Β*4507, Β*460Ι, Β*4602» Β*4603, 8*4604, Β*47010101, Β*47010102, 8*4702, 8*4703, 8*4704, 8*4705, Β*4801» 8*4802, 8*4803, 8*481)4, Β*4805, 8*4806, 8*4807, 8*4808, Β*4809, Β*4810, Β*4903, 8*4902, 8*4903, 8*5001, 8*5002, 8*5004, 8*510101, 8*510102, 8*510103, 8*510104, 8*510105, 8*510201, 8*510202, 8*5103, Β*5104, 8*5105, 8*5106, 8*3107, 8*5108, Β*5109, .8*5110, 8*5111Ν, Β*5112, 8*511301» 8*511302, 8*5114, 8*5115, Β*3116, Β*5117,8*511», Β*5119, Β*5120, 8*5121,8*5122,8*5123, 8*5324, 8*5126, Β*5127Ν, Β*5128, Β*512.9, Β*5130, 8*5131, 8*5132, 8*5133, 8*5134,8*5135,8*5136,8*520101, 8*520102, Β*520103, 8*520104, 8*5202, 8*5203, 8*5204, 8*5205, .8*5206, 8*530101, 8*530102,8*5302, 8*5303, Β*5304,8*5305, Β*5306,8*5307, Β*5308,8*5309,8*5401, 8*5402, .8*5501, Β*5502, 8*5503, 8*5504, Β*5505, 8*5507, .8*5508, 8*5509, 8*5510, 8*5511, 8*5512, .8*5513, 8*5514, 8*5515, Β*5516, 8*5601, Β*5δ02, 8*5603, Β*5604, 8*560501, 8*560502, 8*5606, 8*5607, 8*5608, Β*5609, 8*5610, 8*5611, Β*56Ϊ2, 8*5613, Β*5614, Β*570101, 8*570102, 8*5.702, 8*570301, 8*570302, 8*5704, 8*5705, 8*5706, 8*5707, 8*5708, 8*5709, 8*5801, 8*5802, Β*5804, 8*5805, Β*5806, 8*5807, '8*5808, Β*5809, Β*5810Ν, Β*590ί, 8*670101, 8*670102, 8*6702, 8*7301, 8*7301, 8*780201, 8*780202, 8*7803, 8*7804, 8*7805, 8*8101, 8*8102, 8*8201, 8*8202, Β*8301.
HLA-C €w*O1O20I, Cw*010202, 0**0103, Cw*0104, Cw*0105, Cw*0106, Cw*0107, Cw*Q1Q8, Cw*Q.?09, Cw*0110, Cvr*020201, Cw*020202, Cw*02G2O3» Cw*0202Q4, Cw*020205, Cw*0203, Cw*02Ô4, Or*020$, Cw*0206, 0*0207, Cw*0208, Cw*0209s Cw*0302ÔÍ, Cw*03O2Q2, Cw*03030í, Cw*030302, Cw*030303, Cw*O303O4, 0*030401,0*030402, 0*030403, 0*0305, Cw*0306, 0*0307, 0*0308, Cw*0309, 0*0310, 0*0311, 0*0312, 0*0313, 0*0314, Cw*Q3I5, 0*0316» 0*0317» 0*0318» 0*04010101, 0*04010102, Cw*040102, Cw*0403, 0*040401, 0*040402, 0*0405» 0*0406, 0*0407, 0*0408, 0*.0409N, 0*0410, Cw*0411, 0*0412, 0*0413, 0*0414, 0*0415, 0*05010.1, 0*050102, 0*0502, 0*0503, 0*0504, 0*0505,0*0506, 41
Cv*0507N, Cw*0508, Cw*0509, Cw*05l0, Cw*0602, 0*0603, Cw*06Q4, 0*0605, 0^0606, Cw*O607, Cw*0608, 0*0609, Cw*G610, 0*0611, 0*070101, 0*070102, Cw*070J03, 0*07020101, 0*07020102, 0*07020103, Cw*0703; 0*070401, 0*070402, Cw*0705, Cw*0?06, 0*0707, 0*0708, 0*0709,' 0*0710, 0*0711,-0*0712, 0*0713, 0*0714, 0*0715, 0*0716, 0*0717, 0*0718, 0*9719, 0*0720, 0*0721, Cw*0722, 0*0723, 0*0724, 0*0725, 0*0726,. Cw*0727, 0*0728, 0*0729, 0*080101, 0*080102, 0*0802, 0*0803, 0*0804, Cw*08QS, 0*0806, 0*0807, 0*0808, 0*0809, 0*0810, 0*0811, 0*0812,. 0*120201,. Cw* 120202, 0*120203, 0*120301,0*120302,0*120303,0*120401, 0*120402, 0*1205, 0*1206, 0*1207, 0*1208, <0*1209, Cw*l2l0, 0*1211; <0*1212, 0*1213, <0*1214, <0*1215, 0*140201, 0*140202, Cw*í40203, 0*1403, 0*1404, 0*1405, 0*150201, 0*150202, 0*1503, 0*1504, 0*150501, 0*150502, 0*150503, 0*150504, 0*1506, 0*1507, 0*1508, 0*1509, 0*1510, 0*1511, 0*1512, 0*1601, 0*1602, 0*160401, 0*1606, 0*1701, 0*1702,0*1703,0*1.801,0*1802.
HLA-B
E*0101, E*010301, B*010302, E*010303, E*0104 HtA-F F*010101,F*010102.
HLA-G G*010101,0*010102, <3*010103, <3*010104, <3*010105,0*010106, <3*010107,0*010108, <3*0102,.0*0103, G*010401, <3*010402, <3*010403, G*01Q5N, <3*0106. *.
HLA-DRA DRA*010I,DRA*010201,DRA*010202. BLA-HRBl &RBl*01010), DRB 1*010102, BRB1*O101O3, BRB1 *010201, DRSI*0102Ô2, DRB1*010203, D.RB1*0Í0204S DRB1*OÍ03, 1>SB1*0104, DRB1*0105, BKB1*0106, 42 BRBPÕ107, 0RB1*OÍO8, ’ D&Bt*0109,-DRB1*0U0, DRBPOIÍI, 0RBPQ3OIOI, DRB1*Ô301Ô2/.DRB1*030201,DRBl *930202, DRBl *0303, BRBPO304, DRBPO3OS01, DRB 1*030502^ DRBP0306, DRBl*93G7/. BRBPO30S, DRBl *0309, DRBP031O, DRBP0311; 9Σ)Κδ1'*β312, ' X3RBl*Ô3|3r' 1DRBP0314; DRBP0315, DRB1*031<5, DRBP0317, DRB.P0313, DRBl *0319, DRBP0320, DRB 1*0321, DRBl *0322, DRBP0323, DRBP0324, 0881*0325, :BKBP0326, DRBl *0327, DRBP0328, DRBP04G101, DRB l *040102, DRBI*0402, DRB 1*049301, DBBP040302, DRBPQ404, DRB1 *040501, DRB1*040502, 'DRBÍ *0405(33,. DRBl *040504, DRB1*0406, DRBl *040701, BRBP04D702, DRBl *040703,. DRB í*0408, DRBP0409, DRB 1*0410, 0RBPO411, DRBP0412, BSBP0413; DRBl *0414, DRB 1*0415, DRB 1*0416, DRBPG417, .DRBP041S, .DRBP0419/ DRBP0420, DRBP0421, DRBl *0422, DRBl *0423, DRB1*0424, DKBP0425, BKBP0426, DRBP0427, DRBl *0428, DRBP0429, DRB 1*0430, DRB l *0431, DRBP0432, DRBP0433, DRBP0434, 0RBPO435, DRBD-0436, DRBl *0437, DRBPQ438, DRBl *0439, DRB1*0440, DRB J *0441, DRBl *0442, DRBl *0443, DRB1*0444, DRBP0445, DRBP0446, DRB1*0447, DRBl *0448, DRB1*0449, DRB1*0450, DRB1 *070101, DRBP07ÔÍ02, DRBP0703, DRBPO704, DRB 1*0705, DRBP07Ô6, DRB1*0707, DRBP0708, DRB1*080101, DRSI*O8O102, DRBl*O8Ô201, DRBP080202, DRBP080203, DRB 1 *030302, DRB1 *080401, DRB 1*080402, DRB 1*080403, DRB 1*080404, DRB 1*0805, DRB 1*0806, DRB 1*0807, DKBP08Q8, DRB 1*0809, DRB 1*0810, DRBP08U, DRBP0812, DRBP0S13,' DRBl *0814, DRBP081S, DRBPG816, DRB 1*0817, DRBl *0818, DRRT*0S19, DRB 1*0820, DF,RI *0821, DRB 1*0822, 0881*0823, DRB1*ÔS24, DRBP0825, DRB1*0826, DRB 1*0827, DRB 1*0828, BRRP0829,, DRBP09O102, DRB1*0901D3', DRBP0902, DRBP0903, DRBPIOOIOI, DRBl *100102» DRBl *110101/ DRBl *110102, DRB1*110103, DKBI*110104, DRBl* 110105, DRBl *1102, DRBP1103, DRBl* 110401, DRB D110402, DRBP1105, DRB 1*110601, DRBl *110602, DRBl* 1107, DRB 1*110801, DRBP110802, DRBP1109, DRBPlllO, BSRinin, DRBPtmO!/ DRBl*111202, PRB1*1113, DRB1*1114 DRB 1*1135, DRBPUÍ6» DRBPlli?, DRBl*! 118, DRBl* 1119, DR81*l!20, DRBl*! 121, DKBP1122, DRBP1123, DRBM124, DRBP1125, DRBl*1126, DRBl* 112701/ .DSB1*.U2702; DRBl*1128, BRB1*1129, DRBP1130, DRBP1131» DRBP1B2, DRBP1133, ·'DRBPH34, DRBP1135, DRBl *1136, DRBP1137, 43 DRB1*1138» DRB1*1139, DRB 1*1140, DRBmi4l, 0ΚΒΙ*Π42, BRBini43, DRB1*1144» DRB 1^1145, DRBI*ÍI46, DKB1*1147, BRBl*ÍI4Ss DKBDM149, DRBI*1150, DKBÍ*II51, DRB1*U52, DRB1H153, DRB í* 1154, DRB 1*12010], DRS1 *120102, DRB 1*320201, DRBI*I2O202, DRB1*120302, DRBl*1204, DRBt*l20S, DRBl%120ó, JDKB1*1207»· DRBP12Q8, DRB1*1209, DRB1*1210, DSB1*130101, 0R81 *130102, · 0ΚΒ1*13Ο103, DSBI*130201,' DR8Í*13O202S' BRBl.*130301, D&B1 *130302, 0ΚΒί*Χ304, DRB 1*1305, DRB1*13S6, DRB1*13O701, DRBin3Q7G2, DRB1*1308, DRB 1*1309, DRB1*1310, 0RB1*1311, DRB 1*1312, DRB 1*1313, DRSÍ*131401, , DRB1*131402, DRB1*131: 5, DRB1 *13 í 6, DKBÍ*I317, DRBÍ*131S, DRB1*B19, DRBÍ*1320, DRB 1*1321, DRB 1*1322, BRBl *1323, DRB1*1324, DRB1*1325, DRB 1*1326. BRB1*1327, DRBl*1328, DRBl*1329f DRB1*3330, 05181*1331, 0RB1*1332, DRB1*1333, DRB1*1334, DRBl*i335, »RB1*Í336, DRB1*1337, .DRB1*133S, DRBl*1339, DRB1*1340, DRBD1341, DRBP1342, DSB1*1343, DRB 1*1344, DKBÍ*1345S DRB1H346, DRB1*1347, DRB01343, DRB1*1349, DRB1*1350, DRB1*1351, DRB1*1352, BRBD1353, DRB 1*1354, DRB 1*1355, DRB1*1356, DRB1*1357, DRB1*1358, DRBD1359, DRBD1360, DRB 1*1361, DRB 1*1362, DRBI*1363, DSB1M364, DRB1*13655 DRB 1*140101, DRB1*140102, DRBI*14Ô2, DRB 1*140301, DRB1*140302, DRB1*Í404, DRBI*14Õ501, DRB1*140502, DRB1*1406, DRB1 *140701, DRB 1*140702, DRB1*1408, DRB1*1409, DRB 1*1410, DR8l*l411, DRB1*1412, DRB1*1413, DRBt*1414, DRB1*14I5, DRBÍ*14Í6, DRB 1*1417, DRBI*14lg, DRB1*I419, DRB1 * 1420, DRBl*142l, DRB 1*1422, DRB1* 1423, DKB1*1424, DRB1 *1425, DRBD I426,. DRB1*1427, DRB1*142S, DRB1*1429, DRB1*1430, DRB1*1431, DRBt*1432, DRB 1*1433, DRB1*Í434/ DRB1*1435, DRBP1436, DRB1*1437, DRBD143S, DKB 1*3.439, DRB1*1440, DRB 1*1441, DRB1*1442, DRB1*1443, DRB1*1444, DRB 1*1445, .DRB 1*1446, DRB1M447, DRBX*144S, DRBl*15010l, DKBP15Q102, DRB1M5O103, 011131*150104, DRB1*1S0ÍÔ5, BEBI *150201, DRBM50202, DBBV15O203, DRBl*1503, DRB 1*1,504, DRB1*15Q5, DRB1*I506, DRBP15Ô7, HRB1*1508, DRBÍ*Í509, DRB1*1510, DRBt*ISIl, DRB1*1512, DRB1*1513, DRB1*1S14# DRB1*Í515, DRB1*1516, DRBl*l60101, DSBD160102, DRB1*1602QÍ, DRB1*160202, DRB} *1603, DRB1*Í604, DRB1* 160501, DKB1*160502, DRBM607, DRB1*1608. 44 HLA-DRB2-9 . . DRB2*G1.0k £KB3*01010Í, DHB3*OÍ01G20J, DRB3*0 101O2O2, DRB3*0ÍO1O3, DRB3*010Í04> D«B3*01Q2, DBB3*0103, D.SB3*0I.G4, DSB3*0105, DRB3*O106, DRB3*0107, £«83*0108,· £RB3*0Í09, . DRB3*G110, DRB3*0U1, DRB3*0201, £RB3*020201, £«»3*02(3202, DRB3*020203, £RB3*020204, DRB3*0203, £RB3*O204, DRB3*02O5, £«»3*0206, £RB3*0207, £«»3*0208, £KB3*0209, DRB3*O210, DRB3*0211, DRB3*G2Í2» DBB3*Q2Í3, DKB3*0214, DRB3*0215, DRB3*G216, DRB3*0217, DRB3*0218, DRB3*0219, DBB3*0301Ô1, DRB3*030!Ô2, £1183*0302, DSB3*0303» £«»4*01010101, DRB4*0102, £RB4*01Ô30101, BRB4*01030102N, DRB4*010302, £SB4*010303, DBB4*010304» DRB4*0104, DKB4*0105, 01184*0106, £RB4*0107, DRB4*0201N, fíRB4*0301N, £RB5*01Q10l, DRB5*01OÍQ2, DRB5*0102, DRB5*O103, £«B5*0104, BRB5*0105, DRB5*01Q6, £RB5*Q1Q7, DRB5*0108N, £RB5*0109, DRBS*0U0N, DRB5*0U1, DRB5*0il2, DRB5*QU3, £«»5*0202, DRB5*Q203, DRB 5*0204, £KB5*Q205, DRB6*0101, DRB6*Q201, BSB6*0202, BRB7*0101Gl, DKB7*010102, DRB8*0101, BRB9*OÍ01. HLA-DQAl DQA1*010101, DQA1 *010102, £QA1 *010201, DQAi *010202, DQA1*O103, DQA1*01Ô401, DQAP010402, DQÀ1*0105, BQÁ1*Ô106, BQA1*0107, DQA1*020L BQAl*Q30ÍOl, DQAI *03 02, DQA1*0303, DQA1*040101, DQAP040102, £QA1*04Q2, DQA1*0403N, DQÀ1*04O4, .DQAI *050101, DQAI *050102, DOAI *0502, DQÀ1*0503, DQA1*0504, £QA1*0505, £QA1*060101, DQA1*060102, DQA1*O602. HIA-BQBl DQB1*Q201Q1., DQBl *020102, DQBl *0202,0031*0203, DQB!*030ÍQ1, £QB1*03Ô102, DQB 1*030201, DQM*Q3Ô2Ô2} DQB 1*030302, DQB1*03O3O3, DQBl *0304, £QB1 *030501, DQB1*030502, DQBl *030503, DQBl*0306, DQBl*030?, DQBÍ*0308, DQB1*0309, DQBF03I0, BQBD0311, BQB1*0312, DQB1*0313, £QB1*0401, DQBl *0402, DQB 1*050101, DQBl *050102, DQB 1*050201, DQB £050202, DQBl *050301, DQB1*050302, DQBl *0504. DQB1*Ô60Í01, £QB1*0601Ô2, DQSÍ *060103, DQB 1*0602, DQB 1*0603, DQB 1 *060401, DQB1 *060402, DQBl *060501, .DQB1*060502, £QB1*0606, DQBl·*0607, DQB1*0608, DQBl*0609, DQBl *0610, 45 DQB1*OS1101, DQBÍ*061102, DQSl''k06I2, DQBi*Õ613» DQBi*0614. DQBt*06Í5, DQB1*06I6, DQB.DQÓ17, DQBPQ618, DQB 1*0619, DQBD062Q, DQBPOfâl, DQBl *0622, DQB1*0623, . HLA-DFAÍ DPAPQ10301, DPA1*0ÍO3O2, DFAPÕ1O303, DPÀ1*0104S DPAP01Ô5, DPAi*í)lÔ& DPAi*0107, DPAPOIOS, DPÁ1*02O1O1, DPAÍ*020102, DPAI*G2Ô1Ô3, DPA1 *020104,. DPAÍ *020105, DPA1*O2O106, DPAFO2020I, DPA3 *020202, DPA 1*020203, DPA1*0203, DPAl*030i, DPA1*0302, BFÀl*0303,DPAPO401. HLA-BPBl DPB1*01Ô1O1, DPB1AQ10102,DPB1 *010103, DPBP01O2, DPSl *020102, DPB1*Ô20ÍO3, DPB1!S02Ô104, DPBD020I05, DPB1*020106, BPB1*0202, DPBt*0203, DPB1*03C1O1, ΡΡΒ1*03Ο102, DPB1 --()302. DPB1*Ô401.01, DPBF04Ô1Ô2, DPB1*0402, DPB1*05Ô1, DPB1*06O1, DPBP080I, DPB 1*0901, BPB1*I0OÍ, DPBiniOÍOlO DPB1*110102, DFB1*1301, DPBD140I, DPBD150L ΌΡΒΡ1601, DPB 1*1901, DPB1*20O1O1, DPB 1*200102 DPB 1*2401, DPBD2501, DPB1*260101 DPB1*2901, DPB1*3O0I, DP81*360i, DPB 1*8501, DPB1*860 S, DPBÍ*910Í, DPB1*9201, DPB1*9301) DPB1*9701, DPBÍ*9801, DPB1*9901< DPS1*5801, DPB1 *640114, DPBl *6501, DPBP3S0L DPBP4101, DPB1*4901, DPB 1*5501, I>PBI*S1QIH, DPB 1*6701, DPBP730L DPB 1*7901, DPB1*4401, DPB1*5001, I)PS1*560Í, DPB1*620I DPB 1*6801, DPBl*74iU, DPBl*80Oi, DPB1*3101, DPBI*3?01., DPB 1*450 ls :DPB1*510K DPBI*5?01, DPB 1*6301, ΟΡΒΙ*6901, DPBW50Í, DPBI*8101S DBBÍ*8?01, DPB!*2101, BPB1*26O102, DPB1*3201, 1>ΡΒ1*3801, DPB1*460L DPB1*5201, DPBÍ*7G0Í, DPB1*760Í» DPBÍ*8201, DPB 1*8801, DPB 1*9401, DPB1*Í70Í, DPBl*220l, DPBP2701, DFBP3301, DPB1*390!} DPB1*4701, DPB1*5301, DPBI*59G1, DPBi*7ÍOI, DPB1*7701, DPBI*S301, DPB! *8901, D?Bf*950Ís DPBl*lS01f DPM*230Í, DPBi*2S0t, DPB1*3401, DPB1*40O1, DPB1*4801, DPB1*54ÔÍ, DPB1*6001, DPB1*6601, DPBÍ*7201, DPBÍ*7S01, DPB 1*8401, DPBl*S001, DPB1*9601, 46 HIA-BMÀ
DMà*OXOi; DMA*0102, DMA*0103; X>MÁ*Ô1Q4'.-HI.A-DMB DMB*010I, DMB*0Í02, DMB*01O3, DMB*0ID4, DMB*01055 »MB*OÍ06.
HLÀ-DOA DOA*01010I, DOA*0Í01Q201, DOA*01Í)50202, DQA*G 1010203, DOA*010103, DOA*01010401, DOA*0l010402, DOA*0J0105.
HJLA-DOB DQB*O10101.01, FX3B*01010102, DOB*O1O102, ΒΟΒ*Ο102Ο1, DGB*01Q2Q2, BOB*01Ô3, 008*01040101, DOB^O1040102. 1 H-33», H-ZDd, H-2Dk, B~2Dq, H-2KK H-2IC4 H-2Kk, H-214, H-2M3, H-2Ad, H~2Ag?, H-2Ak, H2-Àb, H-2E4 H-2Ek, H-2B*fc, H-2F, B-2I, H-2?, H-2R, H-2S, H-2Sxá, H-2T4, H.~ 21). • 2 I-Ah» I-Ad, I-Ag?, FAk, frAp, l-Aq, FAr, I-As, BA», Ϊ-Av, FEa, FEb, FBd, FBk, I-Bs» FBu, H-2Q, H-2Q&-2, H-2Qa«2a, Qa-lâ, Qa-ife. A invenção não está limitada a tais moléculas MHC e HLA, e pode ser adaptada para tais moléculas recém-descobertas, se desejado, bastando estabelecer a reactividade de substâncias como peptideos com as moléculas. Isto pode ser facilmente obtido utilizando técnicas conhecidas que são padrão no campo. Alelos HLA particularmente preferidos para uso com a presente invenção incluem os seguintes 47
HLA Classe I
HL A A A*6802 A*6801 A*6601 A*3303 A*33Q1 A*3201 A*310102 A*3002 Á*3001 A*2902 A*2608 A*2601 A*2501 A*2402 A*2301 A*1101 A*0302 A*0301 A*0205 A*0201 A*0101
HLAB B*5801 B*5701 B*5501 B*5201 B*5101 B*5001 B*4901 B*4501 B*4403 B*4402 B*4101 B*4002 B*4001 B*3901 B*3801 B*3701 B*3503 B*3501 B*2705 B*1801 B*1501 B*1402 B*1401 B*1302 B*0801 B*0705 B*0702 HLA Cw
Cw*1701
Cw*1601
Cw*1502
Cw*1402
Cw*1203
Cw*0802
Cw*0801
Cw*0704
Cw*0703
Cw*0702
Cw*0701
Cw*0602
Cw*0501
Cw*0401
Cw*0304
Cw*0303
Cw*0202
Cw*0102 48
HLA Classe II
HLA DPB HLA DOA HIAPOB HLA DRB DPB1*1701 DQAI*0505 DQB1*0604 DKBl*160l DPB1*1301 DQAl*050l DQB1*0603 DRBl*1501 DPB1*1001 DQA1*0401 DQB1*0602 DRB1*1401 DPB 1*0601 DQA1*0303 DQB1»0503 DRB1*1302 DPB1*0501 DQAP0302 DQB1*0502 DRB1*1301 DPB1*0402 DQAl*03Ol DQB1*0501 DRB1*12Q1 DPB1*0401 DQA1*0201 DQB1*0402 DRBl*1104 DPB1*0301 DQA1*0104 DQB1*0303 DRBiniOl DPB1*0201 DQAl*0103 DQB1*0302 DRB1*0801 DPB1*0101 DQA1*0102 DQB1*0301 DRB1*0701 DQA1*0101 DQB1*0202 DRBl*0404 DQB1*0201 DRBl*0401 DRB1*0301 DRB1*0103 DKB1*0102 DRB1*0101
Os alelos mais preferidos de acordo com a invenção são os seguintes: BLA"A*O201, HIA-AH>206, H.LA-A*030L HLA.-A*1101, HLA-A*2402» HLA-A*340l. HLA-B*0702, HtA-B*08Ol. HLA-B*13Q], BLA~B*27, Η1Α-Β*4002, HLA-B*5101, HLA~Cw*03, HLA-cW*07 HLA-DRB1*0301, HLA-DRB1*0401> HLA-DRBl *0701, HLA-PRBP1501, HLA-DRBl*! 104 HLÀ-BRBÍ*! 101, HLA.-DRB4*0101 HLA-DQAl*01, HLAA>QA1*025 HLA-DQAP05 HLÀ'DQB!*03, HLA-DQB1*04, HLA-BQBP05, HLA.~»QB1*0<5 HLA-DPÂ1*0R HLA-DPAPD2 HLA-DPB1*02, HLA-DRBl *04 49 A invenção será agora descrita a titulo de exemplo, apenas, com referência às seguintes modalidades especificas.
EXEMPLOS EXPERIÊNCIA 1 - Reactividade de polipeptídeos contra antigénios da gripe 0 objectivo do estudo foi demonstrar a reactividade dos polipeptídeos da gripe acima descritos e a sua capacidade de induzir uma resposta de citocinas tipo Thl específicas contra proteínas da gripe processadas naturalmente e apresentadas no contexto da HLA humana (HLA A*0201).
Como pano de fundo para as experiências, é útil entender que as respostas Thl e Th2 são definidas pelo padrão de citocinas produzidas pelas células T auxiliares envolvidas. 0 que, no entanto, não significa que os linfócitos restantes (células T e B) envolvidos nessas respostas específicas não possam também produzir citocinas que ajudam a conduzir o padrão característico de resposta em que estão envolvidos. Desta forma, uma resposta do tipo Thl é caracterizada pela produção de IFN-γ e IL-2, levando à estimulação de uma resposta CD8+ CTL e uma resposta associada (em ratos) de anticorpos IgG2a. A resposta IFN-γ pode ser produzida tanto pelas células T CD4+ auxiliares, bem como pelas células T CD8+, que também fazem parte dela. Neste caso, foi investigado o componente IFN-γ da resposta produzida pelas células T CD8+. Isto foi porque a experiência foi principalmente a investigação de epítopos 50 de células T CD8+ e era desejável para provar que a resposta encontrada foi causada por essas células. Uma vez que as células T CD8+ reagem a epítopos somente em moléculas MHC classe I, foram utilizadas as células humanas que compartilham com o rato transgénico apenas uma molécula MHC classe I (i.e. HLA-A*0201). Uma resposta do tipo Th2 é caracterizada pela produção de IL-4 e IL-10, levando à estimulação de uma resposta de anticorpos IgGE, IgGl e (em ratos) IgG2b. Ambas as respostas são antagónicas com IFN-γ e IL-10 desregulando a produção um do outro.
Todas as experiências descritas a seguir foram realizadas em duplicado.
Materiais e métodos
Peptídeos e proteínas recombinantes
Todos os polipeptideos utilizado neste estudo (ou seja, Pl: aminoácido (aa) MIA 36-75 (SEQ ID 1); P2: MIB aa 124 a 158 (SEQ ID 2); P3: NPA aa 255 a 275 (SEQ ID 3); P4: NPB aa 306 a 326 (SEQ ID 4); P5: PB1 aa 395 a 428 (SEQ ID 5); P6: M2 aa 32 a 55 (SEQ ID 6) e NRP: um polipeptídeo de controlo não relevante foi sintetizado pela química Frnoc e ressuspenso em 10% de DMSO em PBS. 51
Linhas celulares e vírus
As linhas de células Tl e Jurkat são linhas linfoblastóides humanas derivadas de HLA-A*0201, tendo e não tendo os indivíduos, respectivamente. Tl foi mantida em meio IMDM (Invitrogen), enquanto Jurkat foi mantida em meio RPMI-1640 (Sigma) contendo 10 mM HEPES e 1 mM de piruvato de sódio. Ambos os meios foram suplementados com 50 IU/50 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Sigma) e, como meio completo, 10% FCS. As culturas de células foram mantidas a 37°C em atmosfera húmida de 5% de CO2.
Os esplenócitos primários foram mantidos em meio IMDM (Invitrogen) suplementado com 0.02 mM [β-mercaptoetanol (Sigma), 50 IU/50 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Sigma) e 10% FCS (Sigma) a 37°C em atmosfera húmida de 5% de C02.
As estirpes de gripe A New_Caledonia/20/99, NYMC/X-147 e estirpe de B Johannesburg/5/99 foram obtidos a partir de NIBSC como lotes liofilizados e utilizados para a infecção de linhas de células humana (Jurkat) singeneicas (Tl) e alogénicas. 52
Preparação de células-alvo para análise de citocinas
As culturas de células em fase exponencial foram colhidas por centrifugação (250 g, 5 min) e ressuspendidas a uma densidade de 106 células/ml em meio livre de soro. Aliquotas das suspensões de células foram transfectadas com uma gama de antigenos de polipeptideos numa concentração de 5 pg por 106 células usando Lipofectin (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante e incubadas em meio completo por 80-10 horas antes do tratamento com mitomicina C (MMC). Alternativamente, aliquotas das suspensões de células foram infectadas com uma variedade de vírus da gripe vivo (MOI de 5-10) por uma hora, lavadas duas vezes em meio livre de soro e incubadas em meio completo por 24 horas antes do tratamento MMC.
Para o tratamento MMC, as células foram colhidas por centrifugação (250 g, 5 min) e ressuspendidas em meio livre de soro IMDM contendo 50 pg/ml de mitomicina C (Sigma) . Após 45 min de incubação a 37°C, as suspensões de células foram lavadas quatro vezes em meio livre de soro IMDM (250 g, 5 min) e, finalmente ressuspensas em meio completo IMDM.
Imunizações
Ratos transgénicos C57BL/6-Tg (HLA-A2.1)lEnge/J (HLA-A*0201), de sete a dez semanas de idade num ambiente C57/BL6 (Jackson Labs) foram imunizados por via subcutânea com uma dose de 200 μΐ da preparação do antígeno por rato. 53
No grupo de teste, cada dose da preparação do antigeno continha 60 nmol de uma mistura equimolar de todos os seis peptideos (10 nmol cada) preparadas em IFA (Sigma), de acordo com as instruções do fabricante (preparação FLU-v). No grupo controlo, cada dose da preparação do antigeno continha uma dose equivalente do polipeptideo não-relevante preparada em IFA (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante (preparação NRP).
No dia 14 pós-imunização, todos os animais receberam uma imunização de reforço com as mesmas doses e via de administração usada originalmente. Finalmente, no dia 21 ou 22, todos os animais foram abatidos e seus os baços recolhidos. 0 protocolo de imunização pode ser representado esquematicamente da seguinte forma: 54
Esquema 1 - inoculação & Ρβ
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Análise estatística
As diferenças estatisticamente significativas na produção de resposta IFN-γ a diferentes antigenos entre FLU-v e animais vacinados NRP foram estabelecidas através de análise não-paramétrica Mann-Whitney das amostras. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas se o valor p for inferior a 0,05. 55
Citocinas ELISA
Os baços dos ratos pertencentes ao mesmo grupo experimental foram agrupados, delicadamente pressionados através de filtros de células e células vermelhas do sangue removido por tratamento com tampão de lise de células vermelhas (nove partes de 0,16 M NH4C1 e uma parte de 0,17 M Tris, pH 7,2). Suspensões de esplenócitos de cada grupo experimental foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 4 x 106 células/poço contendo uma gama de antígenos de polipeptideos (5 pg/ml) ou, alternativamente, linhas celulares tratadas com MMC (razão de esplenócitos para células (S:C) de 10:1) ou transfectadas com antígenos de polipeptideos ou infectados com diferentes vírus da gripe vivos como descrito acima.
Depois de 4 dias de incubação a 37°C, o sobrenadante foi recolhido e analisado para IFN-γ e IL-4 por uma sanduíche de citocinas ELISA de acordo com o protocolo do fabricante (PharMingen). Os limites de detecção mais baixos para o ensaio foram 9,77 pg/ml para IL-4 e 39,06 pg/ml para IFN-γ.
Resultados
Cada peptídeo de polipeptídeo individual descrito neste pedido de patente (incluindo Pl, P2, P3, P4, P5 e P6 testados neste exemplo) tem sido definido como contendo epítopos de células T reactivas em múltiplas moléculas HLA humanas, entre eles o HLA-A*0201. O objectivo deste estudo 56 é, portanto, avaliar a capacidade dos polipeptideos acima descritos para induzir uma resposta imunológica de multi-antígeno especifico de tipo Thl (ou seja,IFN-Y mediada), bem como a capacidade desta resposta reagir especificamente com antigenos da gripe naturalmente processados e apresentados de várias estirpes patogénicas não relacionadas aos seres humanos no contexto de células de infecção humana HLA A*0201.
Reactividade do peptídeo 1
Após o processamento interno do polipeptideo pelas células apresentadoras de antigenos (APCs) dos ratos transgénicos, os epitopos de células T CD8+ especificas contidas seria apresentado na superfície da APC em associação com as moléculas HLA-A*0201 onde iriam proceder à activação de células T CD8+ ingénuas e induzir uma resposta imunológica específica do PI do tipo Thl.
Para confirmar isso, linhas de células humanas HLA-A*0201 de suporte (Tl) e de não suporte (Jurkat) estavam carregados intracelularmente com PI por meio de um veiculo lipídico (Lipofectin, Invitrogen).Esplenócitos de animais imunizados com a preparação de polipeptideo da gripe (FLU-v) foram encontrados produzir níveis significativamente elevados de IFN-γ em comparação com esplenócitos de animais imunizados NRP quando co-cultivados com células portadoras humano MMC tratadas com HLA-A*0201 (Tl) transfectadas com Pl, mas não quando células portadoras humano co-cultivadas com não-HLA-A*0201 (Jurkat) tratadas da mesma forma (ver 57
Figura IA, os dados para os quais é apresentada a Tabela 1 abaixo). TABELA 1 Δ IFN-γ para Lys (pg/ml) FLU-v NRP Con A 2395,6±45,9 2257,7129,8 Peptideo FLU (sol) 119,3±7,1 <39 Tl-FLU pep (pro) 228,4±16,6 55,817 Ju-FLU pep (pro) <39 51,211,6
Nota: "Lys" significa o ambiente do controle negativo sobre o qual todos os valores são calculados. "Sol" significa o peptideo solúvel apresentado à população de esplenócitos primários. "Pro" significa que o peptideo está a ser apresentado complexado com moléculas das células HLA após o processamento interno e carregamento dos epitopos resultantes nas moléculas MHC. Os valores representam a média ± erro padrão de Δ IFN-γ para Lys (pg/ml). 58 A experiência pode ser representada esquematicamente da seguinte forma:
Esquema 2 - teste de controlo de TI e JURKAT IFN-γ) D IFN-γ) ÂPC{HLA)-P1 d
V AP €(»Oíi HLÁ)-P 1 r
V 59
Esquema 3 - Resultados do teste FLU-v para TI e JURKAT
AKXnon-HL A> P I + FLU-v
Como os ratos transgénicos utilizados nessas experiências não apresentam qualquer outra HLA humana e a capacidade das suas células T CD8+ reconhecerem especificamente epitopos derivados PI no contexto de outras HLAs humanas que eles nunca tenham encontrado é baixa, estes resultados mostram claramente que resposta IFN-γ observada é especificamente causada por células T CD8+ preparadas para reconhecer epitopos derivados PI em associação com moléculas HLA-A* 02 01. É também importante notar que nenhuma resposta IL-4 foi detectada contra as células transfectadas Pl em qualquer dos animais imunizados com FLU-v ou PNR (dados não 60 mostrados). Desde que IL-4 é antagónica à produção de IFN-γ e, consequentemente, para a criação de respostas do antigeno específico das células T CD8+, a falta de produção de IL-4 em ambos os grupos mostra claramente que a imunização com FLU-v induz uma resposta específica do tipo TI ao componente PI da preparação.
Um nível significativamente aumentado na produção IFN-γ é também observado nos grupos imunizados com FLU-v em comparação com NRP quando o antigeno solúvel PI é simplesmente adicionado à cultura de esplenócitos (na ausência de células TI ou JURKAT). No entanto, o nível global da resposta IFN-γ é menor que a observada quando o antigeno foi apresentado através de células portadoras TI HLA-A*0201. A explicação para essa observação é que PI foi definido com base de epítopos contidos que são basicamente reactivos, no contexto de HLAs humano e não rato. Os ratos transgénicos aqui utilizados contêm um conjunto completo de moléculas MHC de rato, além de moléculas HLA-A*0201, portanto, o PI solúvel capturado pela população APC presente nas culturas primárias de esplenócitos também pode ser processado em vias em MHC de rato classe I e II (Peachman KK, Rao M, Alving CR, Palmer DR, Sun W, Rothwell SW. "Human dendritic cells and macrophages exhibit diferente intracellular processing pathways for soluble and liposome-encapsulated antigens" Immunobiology. 2005;210(5):321-33), que medeiam respostas de células T CD8+ e CD4+ H-2D restritas, respectivamente. Como resultado, se PI contendo múltiplos epítopos murino, seria esperado que a resposta IFN-γ ao PI solúvel seria igual ou superior à observada para o caso de apresentação de células humanas mediadas por um grupo muito maior de células T CD4+ e células CD8+ que seriam capazes de reagir ao estímulo. 61
Como isto não é observado e do nivel de uma resposta imune in vitro é determinada principalmente pela disponibilidade de antígeno, segue-se claramente que os linfócitos T CD8+ específicos PI detectados nas experiências de co-cultura TI seriam simplesmente incapazes de responder ao mesmo nível, devido à reduzida quantidade de antígeno que está presente no correcto contexto de HLA-A*0201.
Reactividade do peptídeo 2
Os esplenócitos de animais imunizados com FLU-v foram encontrados produzir níveis significativamente elevados de IFN-γ em comparação com esplenócitos de animais imunizados com NRP quando co-cultivados com células portadoras humanas (Tl) MMC tratadas com HLA-A*0201 transfectadas com P2, mas não quando co-cultivadas com células portadoras humanas (JURKAT) não-HLA-A*0201 tratadas da mesma forma (ver Figura 1B, os dados que constam Tabela 2 abaixo) . Como era o caso para PI estes resultados mostram claramente que a resposta IFN-γ observada é especificamente causada por células T CD8+ reconhecendo epítopos derivados P2 em associação com moléculas HLA-A*0201. Da mesma forma, como a produção de IL-4 é antagónica à IFN-γ e, consequentemente, para o desenvolvimento de células T CD8+, a falta de uma resposta IL-4 contra células transfectadas P2 tanto em animais imunizadas com FLU-v ou NRP (dados não mostrados) mostra claramente que a imunização com FLU-v induz uma resposta específica P2 do tipo Thl. 62 TABELA 2 Δ IFN-γ para Lys (pg/ml) FLU-v NRP Con A 2395,6145,9 2257,7129,8 Peptideo 2 FLU (sol) 976,9+24,1 468,4114,7 Tl-FLU pep 2 (pro) 372,916,4 154,5110,7 Ju-FLU pep 2 (pro) <39 <39
Nota: "Lys" significa o ambiente do controle negativo sobre o qual todos os valores são calculados. "Sol" significa o peptideo solúvel apresentado à população de esplenócitos primários. "Pro" significa que o peptideo está a ser apresentado complexado com moléculas das células HLA após o processamento interno e carregamento dos epítopos resultantes nas moléculas MHC. Os valores representam a média ± erro padrão de Δ IFN-γ para Lys (pg/ml).
Um aumento significativo da produção IFN-γ foi também observado noS grupos imunizados com FLU-v em comparação com NRP quando P2 foi simplesmente adicionado à cultura de esplenócitos. Em contraste com Pl, no entanto, o nivel global da resposta IFN-γ foi maior para o antígeno solúvel do que a apresentada pelas células de suporte HLA-A*0201. Esta observação poderia indicar que P2 abriga não só fortes epítopos HLA-A.*0201 mas também fortes epítopos do rato (H-2D) 63
Reactividade dos peptídeos 3, 4 e 5
Como foi o caso de P2, a produção significativamente aumentada de IFN-γ pode ser observada os entre grupos imunizados com FLU-v e NRP quando P3, P4 e P5 são simplesmente adicionados à cultura, bem como quando eles são apresentados através de linhas de células humanas (Tl) transfectadas HLA combinadas) , mas não quando eles são apresentados através de linhas de células humanas (JURKAT) HLA incompatíveis (ver Figuras 1C, ID e IE, os dados estão nas Tabelas 3-5 abaixo) . Nos três casos, o incremento na produção de IFN-γ é maior quando os esplenócitos são co-cultivados com células humanas transfectadas e não quando o antígeno solúvel é simplesmente adicionado ao meio. Estes resultados, devido aos mesmos argumentos desenvolvidos para o caso de P2 indicam que P3, P4 e P5 contêm um número de fortes epítopos de células T do rato, além dos humanos. TABELA 3 Δ IFN-γ para Lys (pg/ml) FLU-v NRP Con A 2395,6±45,9 2257,7129,8 Peptídeo 3 FLU (sol) 1734,1±57,2 268,0111,0 Tl-FLU pep 3 (pro) 587,5±14,9 <39 Ju-FLU pep 3 (pro) 148,5+3,0 146,5117,6 64 TABELA 4 Δ IFN-γ para Lys (pg/ml) FLU-v NRP Con A 2395,6±45,9 2257,7129,8 Peptideo 4 FLU (sol) 1170,5+27,8 693,8+5,6 Tl-FLU pep 4 (pro) 229,9±35,2 84,6111,6 Ju-FLU pep 4 (pro) <39 <39 TABELA 5 Δ IFN-γ para Lys (pg/ml) FLU-v NRP Con A 2395,6+45,9 2257,7+29,8 Peptideo 5 FLU (sol) 1067,7+7,3 220,5+6,6 Tl-FLU pep 5 (pro) 405,6+11,8 <39 Ju-FLU pep 5 (pro) <39 <39
Nota: "Lys" significa o ambiente do controle negativo sobre o qual todos os valores são calculados. "Sol" significa o peptideo solúvel apresentado à população de esplenócitos primários. "Pro" significa que o peptideo está a ser apresentado complexado com moléculas das células HLA após o processamento interno e carregamento dos epitopos resultantes nas moléculas MHC. Os valores representam a média ± erro padrão de Δ IFN-γ para Lys (pg/ml). 65
Finalmente, como todos os três peptideos deixam de induzir a produção de IL-4 (dados não mostrados) , é claro que a resposta imune induzida por vacinação com a preparação FLU-v induz uma resposta do tipo Thl de cada um destes três polipeptideos.
Reactividade do peptídeo 6
Como foi o caso de Pl, o aumento significativo da produção IFN-γ pode ser observada entre grupos imunizados com FLU-v e NRP quando P6 é simplesmente adicionado à cultura, bem como quando é apresentado através de linhas de células humana (Tl) transf ectadas compatíveis com HLA, mas não quando ela é apresentada através de linhas de células humanas (JURKAT) incompatíveis com HLA (ver Figura IF, os dados são definidos na Tabela 6 abaixo). Novamente como para Pl, a maior resposta é observada para o antígeno solúvel, indicando que P6 não contém epítopos fortes H-2D. Como as causas para estas observações já foram explicadas para o caso de Pl não serão desenvolvidas aqui. 66 TABELA 6 Δ IFN-γ para Lys (pg/ml) FLU-v NRP Con A 2395,6145,9 2257,7129,8 Peptideo 6 FLU (sol) 496,2+11,8 105,517,0 Tl-FLU pep 6 (pro) 1210,5111,5 817,618,9 Ju-FLU pep 6 (pro) <39 <39
Nota: "Lys" significa o ambiente do controle negativo sobre o qual todos os valores são calculados. "Sol" significa o peptideo solúvel apresentado à população de esplenócitos primários. "Pro" significa que o peptideo está a ser apresentado complexado com moléculas das células HLA após o processamento interno e carregamento dos epitopos resultantes nas moléculas MHC. Os valores representam a média ± erro padrão de Δ IFN-γ para Lys (pg/ml). A falha de estimulação com P6 para induzir qualquer produção de IL-4 (dados não mostrados) , mostra claramente que a resposta imune induzida por vacinação com FLU-v induz uma resposta do tipo Thl para P6. 67
Reactividade de FLU-V para as estirpes de gripe não relacionadas
As experiências descritas até este ponto claramente mostram que a imunização com FLU-v induz uma resposta IFN-γ especifica de células T CD8+ contra cada um dos seis polipeptideos constituintes. No entanto, como esses polipeptideos foram definidos como contendo epitopos de células T CD8+ reactivas sujeitas a um baixo nivel de variabilidade de sequência dentro da população do virus da gripe analisada, foi também desejável estabelecer se os ratos vacinados com FLU-v foram capazes de reconhecer e, portanto, induzir uma resposta imune especificas do tipo Thl, os epitopos de células T naturalmente processados e apresentados após a infecção com diferentes estirpes de gripe não relacionadas. Essa análise fornece uma indicação clara da potencial eficácia da mistura FLU-v polipeptideo como uma vacina contra a gripe que, em virtude do direccionamento de epitopos de células T de baixa variabilidade de sequência entre a população com gripe humana e animal, ofereceria protecção contra todas as estirpes actuais como bem como as que possam surgir no futuro de recombinação espontânea entre estirpes altamente patogénicas animais com estirpes humanas atuais.
Para esta análise, culturas primárias de esplenócitos de animais transgénicos imunizados com FLU-v ou NRP foram co-cultivados com várias células humanas infectadas com gripe suportadas (Tl) HLA-A*0201 e não-suportadas (JURKAT). As três estirpes de gripe usadas para infecção (A/New_Caledonia/20/99, A/NYMC/X-147 e B/Johannesburg/5/99) 68 são patogénicas para o homem e foram obtidos a partir do repositório da gripe da OMS, baseado em NIBSC (Reino Unido). Como um antigeno especifico de controlo positivo foi usada uma preparação equimolar solúvel dos seis polipeptideos adicionados à preparação primária de esplenócitos.
Os esplenócitos de animais vacinados com FLU-v produziram um nível significativamente mais elevado de IFN-γ em comparação com aqueles de animais vacinados com NRP, quando co-cultivadas com células portadoras humanas (Tl) infectadas com MMC gripe tratadas com HLA-A*0201 transfectadas, mas não quando co-cultivadas com células portadoras humanas (JURKAT) não-HLA-A*0201 tratadas da mesma forma (ver Figura 2, os dados estão definidos na Tabela 7 abaixo). Nenhuma resposta IL-4 foi detectada em nenhum dos ratos vacinados contra qualquer antigeno polipeptídeo solúvel ou as células infectadas com gripe (dados não mostrados). Estes resultados mostram claramente que a resposta IFN-γ observada é especificamente causada pela preparado de células T CD8+ reconhecendo os epitopos contidos na preparação FLU-v e que também são naturalmente processados e apresentados em associação com moléculas HLA-*0201 em células humanas infectadas com gripe. 69 TABELA 7 Δ IFN-γ para Lys (pg/ml) FLU-v NRP Con A 2395,6145,9 2257,7129, 8 Mistura de peptideo FLU (sol) 1440,2+44,9 678,3129, 2 Tl-FLU A/NC/20/99 2146,4123,7 1282,114,8 Ju-FLU A/NC/20/99 1246,9148,8 1206,4110,9 Tl-FLU A/NYMC/X147 1949,4137,9 110115,9 Ju-FLU A/NYMC/X147 1342,3114,5 1248,618,3 Tl-FLU B/Johannesburg/5/99 1769,0133,6 1196116, 2 Ju-FLU B/Johannesburg/5/99 257,613,0 257,018,3
Nota: "Lys" significa o ambiente do controle negativo sobre o qual todos os valores são calculados. "Sol" significa o peptideo solúvel apresentado à população de esplenócitos primários. "Pro" significa que o peptideo está a ser apresentado complexado com moléculas das células HLA após o processamento interno e carregamento dos epitopos resultantes nas moléculas MHC. TI é a linha celular humana portadora HLA-A *0201. "Ju" refere-se a JURKAT que é a linha celular humana não portadora HLA-A*0201. A/NC/20/99 (i.e. A/New_Caledonia/20/99), A/NYMC/X-147 e B/Johannesburg/5/99 são, respectivamente, as duas estirpes de gripe A e uma estirpe de gripe B utilizadas para a infecção das linhas de células humanas. Os valores representam a média 1 erro padrão de Δ IFN-γ para Lys (pg/ml). 70
Curiosamente, a produção de fundo de IFN-γ para todos os grupos infectados com gripe era maior do que a observada quando análises semelhantes foram realizadas utilizando antigeno purificado do polipeptídeo. Esta observação, no entanto, muito provavelmente reflecte a incapacidade do tratamento MMC inactivar plenamente o vírus presente na preparação de células. Este, por sua vez, resultaria em vírus de gripe viável para infectar as células do rato sensíveis nas culturas primárias de esplenócitos, levando a uma resposta primária in vitro. Essa interpretação é sustentada pela observação de que as estirpes de vírus da gripe mais usadas induziram um mesmo nível de resposta IFN-Y independentemente da linha de células humanas infectadas e grupo vacinado considerado. A única excepção a esta regra é a muito reduzida produção de IFNy observada em células JURKAT infectadas com B/Johannesburg/5/99. No entanto, como até mesmo neste caso produção de IFN-γ para ambos os animais vacinados com FLU-v e NRP é equivalente, parece que a diferença observada é causada mais pela susceptibilidade reduzida das células JURKAT à infecção por Gripe B/Johannesburg/5/99, do que por qualquer causa intrinsecamente associada aos regimes de vacinação diferentes. Seja qual for o caso, esta observação, não diminui o facto evidente de que a vacinação com FLU-v leva ao reconhecimento de epítopos de gripe específicos naturalmente processados apresentados em associação com moléculas HLA-A*0201 após a infecção de células humanas com várias estirpes não-relacionadas do vírus da gripe infecciosa. Portanto, a FLU-v constitui uma preparação de vacina eficaz para a protecção contra estirpes de gripe múltiplas, eliminando assim a necessidade para o ano actual de protocolos de re-vacinação. 71 EXPERIÊNCIA 2 - Efeito protector de polipeptídeos ratos 0 objectivo deste estudo foi demonstrar que a imunização com uma dose baixa dos identificados poliepitopos de peptideos de células T conservadas da gripe (FLU-v) induz protecção, mediada por células T CD 8+, contra o desafio com o virus letal da gripe.
Materiais e métodos
Peptideos e anti-soros contra vírus: A preparação da vacina candidata (FLU-v) testada neste estudo é composto de vários peptideos (i. e. Pl: aminoácido MLA (aa) 36 a 75 (SEQ ID 1); P2: MIB aa 124 a 158 (SEQ ID 2); P3: NPA aa 255 a 275 (SEQ ID 3); P4: NPB aa 306 a 326 (SEQ ID 4); P5: PBL aa 395 a 428 (SEQ DD 5); P6: M2 aa 32 a 55 (SEQ ID 6) ) , que foram todos sintetizados pela química Fmoc e ressuspensos em DMSO em PBS (a concentração de DMSO na preparação final foi inferior a 5%). Foi usada Lisozima (Sigma) desnaturada por fervura como preparação de controlo não relevante (NRP-v).
Foi obtida IgGIa rato anti-rato CD8 purificada (clone YTS 169.4) em AbD Serotec (UK) , enquanto os vírus da gripe infecciosa A/PR/8/34 foram obtidos em MBSC como lote padrão liofilizado. 72
Imunizações
No dia 1, ratos transgénicos C57BL/6-Tg (HLA-A2.1)lEnge/J com sete a 10 semanas de idade (HLA-A*0201 sobre um fundo C57/BL6, Jackson Labs) foram imunizados por via subcutânea na base da cauda com uma dose de 200 μΐ da preparação do antigeno emulsificado em IFA (Sigma). No grupo de teste (n = 14), cada dose da preparação do antigeno continha 60 nmol de uma mistura equimolar de todos os seis peptideos (10 nmol cada), enquanto no grupo de controlo (n = 14), cada dose da preparação do antigeno continha uma dose equivalente do polipeptideo não relevante.
No dia 15 todos os animais receberam uma imunização de reforço com as mesmas doses e via usada originalmente.
No dia 16 ambos os grupos de teste e de controlo foram divididos em dois subgrupos iguais (n = 7 cada; i.e. Ctrol-1, Ctrol-2, Teste-1 e Teste 2).
No dia 19, todos os animais nos grupos Ctrol-1 e Teste-1 receberam uma injecção intraperitoneal de 200 μΐ de soro CD8 rato anti-rato (100 pg) , enquanto todos os animais nos grupos Ctrol-2 e Teste-2 receberam uma injecção equivalente de soro não relacionado. 73
No dia seguinte (dia 20), todos os grupos foram desafiados por via intranasal sob anestesia com uma grande dose letal (aproximadamente 1.5xl07 UFP) da gripe A/PR/8/34.
No dia 22, os animais foram novamente injectados intraperitonealmente com soro CD 8 rato anti-rato, ou não relacionado, como descrito acima. A partir do dia 20 todos os animais foram monitorizados diariamente para os sintomas da gripe (por exemplo, espirros e febre), bem como perda de peso.
Todos os animais ainda vivos no dia 27 foram abatidos e o estudo foi terminado.
Resultados A fim de avaliar a eficácia da preparação FLU-v como uma candidata a vacina para a gripe era desejável a criação de um estudo de desafio em animais imunizados com NRP-v e FLU-v com a estirpe Influenza A/PR/8/34. Normalmente, uma dose intranasal de aproximadamente 1,5 x 107 UFP vai matar os ratos C57BL/6-Tg (HLA-A2.1) lEnge/J não imunizados no dia 4 ou 5 após o desafio (dados não mostrados). 74
Como mostrado na Figura 3A, a maioria dos animais imunizados com preparações de peptideo FLU-v ou NRP-v, mas sujeitos à depleção de CD8, sucumbiram à infecção por Influenza A/PR/8/34 no 7o dia após o desafio intranasal (71% vs 100%, respectivamente). Em contraste, como mostrado na Figura 3B e na ausência de depleção de CD8, os animais imunizados com a preparação FLU-v mostraram uma redução significativa (p <0,05) na sua taxa de mortalidade em comparação com os animais imunizados com a preparação NRP-v (28% vs 100%).
Os resultados deste estudo indicam claramente que a vacinação com a preparação de peptideos FLU-v, mesmo com uma dose baixa de cada um dos seus peptideos constituintes activos (10 nmol), induz um nivel significativo de protecção contra o desafio letal com Influenza. Estes peptideos, como indicado anteriormente, onde identificados in sílico principalmente pela sua reactividade das células T no contexto de HLA humana Classe I. Os resultados corroboram o facto de que as células T CD 8+ estimuladas pela vacinação com a preparação de peptideos FLU-v desempenham um papel significativo em conferir protecção contra a infecção Influenza. 75

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipeptídeo consistido em até 40 aminoácidos, compreendendo uma sequência de homologia tendo pelo menos 95% de homologia com a SEQ ID 1: SEQ ED 1 DLEAIMEWLKlKPILSPLTKQfLGFVFn-TVP em que o polipeptídeo é imunogénico num vertebrado expressando um alelo de complexo principal de histocompatibilidade (MHC), e é imunogénico para uma pluralidade de estirpes de vírus da gripe.
  2. 2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 compreendende um epítopo linfócitos T citotóxicos (CTL).
  3. 3. Polipeptídeo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores consistindo em até 35 resíduos de aminoácidos.
  4. 4. Composição polipeptídica compreendendo um ou mais polipeptideos como definidos nas reivindicações anteriores, tendo não mais de 100 aminoácidos, compreendendo os polipept ideos: uma sequência, tendo pelo menos 85% de homologia com qualquer das SEQ ID 2-6; ou compreendendo dois ou mais epítopos tendo 7 aminoácidos ou mais, cada epítopo tendo pelo menos 85% d.e homologia com uma sub-sequência de qualquer das SEQ ID 2-6 que tenha o mesmo comprimento que o epítopo: SEQ ID 2 SEQ ID 3 SEQ ID 4 SEQID5 SEQ ID 6 LI DLJFLA5LSÀLILRGSVÂHKSC PGIABIEDLTLMRSMVWRP IXíDGTÂSl,SPGNLMMGMFNIvíI,STVLGVSILK'LGQ líGILHLILWILDRLFFKCIYRLF 1 conforme
  5. 5. Polipeptídeo ou composição de polipeptídeo, definido em qualquer das reivindicações anteriores para uso na medicina.
  6. 6. Método de produzir um polipeptídeo como definido em qualquer das reivindicações 1-5, compreendendo a combinação de dois ou mais epitopos para formar o polipeptidio.
  7. 7. Medicamento ou composição da vacina contra a gripe, compreendendo um polipeptídeo ou composição polipeptídica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-5, e opcionalmente um excipiente apropriado e/ou adjuvante.
  8. 8. Método de produzir um medicamento ou composição de vacina como definidos na reivindicação 7, compreendendo misturar um polipeptídeo, ou uma composição de polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-5 com um excipiente apropriado e/ou adjuvante.
  9. 9. Uso de um polipeptídeo, uma composição de polipeptídeo ou um medicamento ou uma composição de vacina, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1-5 e 7 na fabricação de um medicamento ou vacina, eficaz no tratamento ou prevenção da gripe.
  10. 10. Polipeptídeo, método, medicamento, vacina, ou uso de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a gripe é uma estirpe da gripe A ou uma estirpe da gripe B. 2
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