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PT1991266E - Novas composições adjuvantes glicolipídicas - Google Patents

Novas composições adjuvantes glicolipídicas Download PDF

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PT1991266E
PT1991266E PT77055309T PT07705530T PT1991266E PT 1991266 E PT1991266 E PT 1991266E PT 77055309 T PT77055309 T PT 77055309T PT 07705530 T PT07705530 T PT 07705530T PT 1991266 E PT1991266 E PT 1991266E
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PT
Portugal
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acid
glycolipid
pka
formula
weak
Prior art date
Application number
PT77055309T
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English (en)
Inventor
Paul Joseph Dominowski
Ramasamy Mannar Mannan
Sangita Mediratta
Original Assignee
Zoetis P Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Description

1
DESCRIÇÃO "NOVAS COMPOSIÇÕES ADJUVANTES GLICOLIPÍDICAS"
DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas composições de adjuvantes glicolipídicos, métodos de utilização e preparação das mesmas. As novas composições da presente invenção são estáveis por um longo período sem floculação. São particularmente úteis na administração de vários medicamentos, incluindo vacinas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As vacinas são tipicamente utilizadas para proteger seres humanos e animais contra doenças infecciosas provocadas por bactérias, vírus e organismos parasitas. Entre os antigénios utilizados em vacinas pode contar-se uma variedade de agentes, mas estas são tipicamente constituídas por organismos patogénicos mortos, organismos patogénicos que estão vivos, mas que foram modificados ou atenuados, proteínas, proteínas recombinantes ou fragmentos destas. Seja qual for a fonte do antigénio, é frequentemente necessário adicionar um adjuvante para intensificar a resposta imunitária do hospedeiro ao antigénio. Os adjuvantes sao utilizados para alcançar dois objectivos: diminuem a velocidade da libertação dos antigénios desde o local da injecçao e estimulam o sistema imunitário. 2 0 primeiro adjuvante descrito na literatura foi o Adjuvante Completo de Freund (Freund's Complete Adjuvant -FCA). 0 FCA contém uma emulsão água em óleo e extractos de micobactérias. Os extractos de micobactérias fornecem moléculas imunoestimulantes sob forma em bruto. A emulsão água em óleo actua de forma a criar um efeito de depósito, em que os antigénios são libertados lentamente. Infelizmente o FCA é mal tolerado e pode provocar inflamações descontroladas. Desde a descoberta do FCA, há 80 anos, têm sido desenvolvidos esforços para reduzir os efeitos secundários indesejados dos adjuvantes.
Conhecem-se agora análogos de glicolípidos que compreendem uma nova classe de compostos com propriedades adjuvantes. A patente norte-americana n.° 4 855 283 (doravante '283) apresenta a síntese de análogos glicolipídicos, incluindo N-glicosilamidas, N-glicosilureias, N-glicosilcarbamatos, e especificamente: Acetato N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-p-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida (conhecido por Bay R1005, O Lockhoff, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1991) 30:1611-1620. Os compostos descritos na patente '283 são particularmente adequados para utilização como adjuvantes.
As formulações adjuvantes glicolipídicas têm de ser fáceis de produzir e estáveis quando armazenadas por períodos prolongados sem sinais de floculação do componente lipídico. As formas não-acetato das amidas glicolipídicas ou glicosilamidas são muito insolúveis e tipicamente floculam, separando-se da solução durante o armazenamento, seja à temperatura ambiente ou a temperaturas baixas. 3
As soluções e os adjuvantes que compreendem as glicosilamidas apresentadas neste documento apresentam fraca floculação e são muito estáveis. São fáceis de produzir e podem ser preparadas a uma escala comercial. As formulações adjuvantes glicolipídicas líquidas podem ser utilizadas como um diluente para re-hidratar uma preparação de antigénios liofilizada. São também apresentados os métodos para testar a estabilidade destas formulações em tempo real e através de protocolos de ensaios de estabilidade acelerados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não seja abrangida pelas reivindicações é apresentada exclusivamente a título informativo. A presente invenção compreende a composição e o método de preparação ou produção tanto da solução mãe de glicosilamida e da solução adjuvante glicolipidica. A solução mãe de glicosilamida é preparada mediante dissolução de um glicolípido da fórmula 1 num álcool e combinação desta com uma quantidade apropriada de um ácido fraco mais um surfactante "não iónico". 0 ácido fraco é adicionado à solução de glicolípido álcool, com um excesso molar de ácido fraco relativamente ao glicolípido. Numa forma de realização, o glicolípido é hidroacetato de N- (2-desoxi-2-L-leucilamino-3-D-gulucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida. Numa realização o álcool é etanol. Numa realização, o ácido fraco é ácido acético. Numa realização, os surfactantes não iónicos são vários sorbitanos (Span®) ou polioxietilenossorbitanos (Tween®), 4 em particular os monolauratos de sorbitano (Span 20®) e monolauratos de polioxietilenossorbitanos (Tween 20®) . A solução adjuvante glicolipídica é preparada por meio de introdução de uma quantidade apropriada da solução mãe de glicosilamida num "tampão adequado". O pH das soluções adjuvantes glicolipidicas estáveis finais descritas deve oscilar entre cerca de 6 e cerca de 8. É preferido o pH final entre cerca de 6 e cerca de 7. É descrito um pH final entre cerca de 6,3 e cerca de 6,4. Devem ser evitadas elevadas concentrações salinas do adjuvante glicolipidico, em excesso de 30 mM de NaCl.
Estas duas soluções encontram-se exemplificadas mais detalhadamente seguidamente: A solução mãe de glicosilamida é uma composição que compreende: a) um glicolípido da fórmula I, em que a fórmula I é
em que R1 é hidrogénio ou um radical alquilo saturado com até 20 átomos de carbono; X é -CH2-, -0- ou NH-; R2 é hidrogénio ou um radical alquilo saturado com até 20 átomos de carbono; 5 R3, R4 e R5 são independentemente hidrogénio -S042 , - P042^, -COalquilCi-io; R6 é L-alanil, L-alpha-aminobutil, L-arginil, L-asparginil, L-aspartil, L-cisteinil, L-glutamil, L-glicil, L- histidil, L-hidroxipropil, L-isoleucil, L-leucil, L-lisil, L-metionil, L-omitinil, L-fenilalanil, L-prolil, L-seril, L-treonil, L-tirosil, L-triptofanil e L-valil ou os respectivos isómeros D; sob a forma de um sal, em que a forma salina é derivada de um ácido fraco; b) um álcool em que o álcool é HO-alquiloCi_3; c) um ácido fraco, em que 1) o ácido fraco está em excesso mola relativamente ao teor de glicolípidos e 2) é qualquer ácido com um índice pKa entre cerca de 1,0 e cerca de 9,5 aplicando os quadros ou valores normalizados, e d) um surfactante não-iónico, em que o surfactante não iónico é um agente que reduz a tensão superficial do material em que se encontra dissolvido e possui um componente que é hidrofóbico e outro componente que é hidrofílico. A solução adjuvante glicolipídica é uma composição que compreende: a) uma solução mãe de glicosilamida e b) um tampão adequado, em que o tampão é apropriado para uso veterinário ou médico e pode manter um pH relativamente constante numa solução aquosa, entre cerca de 6,0 e cerca de 8,0. 6
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Salvo indicação em contrário, os termos seguintes utilizados na especificação e reivindicações têm os significados indicados seguidamente: 0 termo "álcool" refere-se a um composto da fórmula: HO alquil-Ci-3; pode ser metanol, etanol ou propanol sob qualquer forma, tal como n-propanol ou iso-propanol. É preferido o etanol. 0 termo "alquilo" significa fracções hidrocarboneto saturadas de cadeia tanto linear como ramificada. 0 termo "glicolípidos" refere-se as compostos da fórmula I seguinte. Estes compostos encontram-se descritos na patente norte-americana 6,290,971 e na patente norte-americana n.° 4, 855,283 publicada a 8 de Agosto de 1989. Ambas as patentes norte-americanas 6,290,971 e 4,855,283 são incluídas por referência na íntegra. Um glicolípido descrito em particular nesta publicação, quando sob a sua forma acetato, possui a designação comercial Bay R1005® e o nome químico "acetato N-(2-desoxi-2-L-leucilamino^-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida". A forma amida deste composto possui a designação comercial Bay 15-1583® e o nome químico "N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-p-D- glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida".
Os glicolípidos da fórmula I são:
7 em que R1 é hidrogénio ou um radical alquilo saturado com até 20 átomos de carbono; X é -CH2-, -O- ou NH-; R2 é hidrogénio ou um radical alquilo saturado com até 20 átomos de carbono; R3, R4 e R5 representam independentemente hidrogénio, — SO4 , — PO4 , — COalqui IC1-10; R6 é L-alanil, L-alfa-aminobutil, L-arginil, L-asparginil, L-aspartil, L-cisteinil, L-glutamil, L-glicil, L- histidil, L-hidroxipropil, L-isoleucil, L-leucil, L-lisil, L-metionil, L-omitinil, L-fenilalanil, L-prolil, L-seril, L-treonil, L-tirosil, L-triptofanil e L-valil ou os respectivos isómeros D ou um respectivo sal farmaceuticamente aceitável;
Outra realização especificada descreve os glicolípidos da fórmula 1, em que: R1 é hidrogénio ou alquil C12-18 saturado; R2 é hidrogénio ou alquilo c7-n saturado; X é -CH2; R4 e R5 representam independentemente hidrogénio; R6 é seleccionado de L-leucil;
As variáveis da fórmula I são separadas e independentes e todas as combinações de variáveis encontram-se descritas e reivindicadas no presente documento. 8
Numa outra concretização, os glicolípidos são os descritos pela fórmula II (a) : 8
Fórmula II(a)
Numa outra concretização, os glicolípidos são os descritos pela fórmula II (b) :
alquil C1_7 Fórmula 11(b)
Numa outra concretização, os glicolípidos possuem a estrutura da fórmula III: 9
Um composto da fórmula III pode existir seja sob a forma de amida ou sob a forma acetato. A forma amida deste composto possui a designação comercial Bay 15-1583®. A forma acetato possui a designação comercial Bay R1005®.
Os glicolipidos da fórmula I podem ser preparados recorrendo aos procedimentos seguintes, recolhidos da patente norte-americana n° 4,855,283.
Como se pode ver na fórmula 1, os compostos de acordo com a invenção baseiam-se numa 2-amino-2-desoxi-hexose substituída. Estes açúcares encontram-se sempre ligados N-glicosidicamente através de C-l, o átomo de carbono anomérico, ao grupo acilamido, carbamido ou alcoxicarbonilamido CO—X—R2 / \ R> (I)
Com os significado anteriormente referidos para R1, R2 e X. 0 grupo 2-amino dos açúcares amino nos compostos de acordo com a invenção, da fórmula I, apresenta uma ligação amida a um α-aminoácido ou um derivado α-aminoácido. 10
Os aminoácidos são os aminoácidos L naturais, tais como a glicina, sarcosina, ácido hipúrico, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteina, metionina, ornitina, citrulina, arginina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, fenilalanina, tirosina, prolina, triptofano e histidina. São também descritos aminoácidos D, tais como D-alanina ou ácidos aminocarboxilicos, tais como ácido alfa-aminobutirico, ácido α-aminovalérico, ácido α-aminocapróico ou ácido a-amino-heptanóico, tanto na forma D como na forma L, para agirem como substituintes do açúcar amino. São também apresentados os processos de preparação de compostos de acordo com a fórmula I. Este implica partir da um derivado de 2-amino-2-desoxiglicopiranose (fórmula IV) , que é protegido no grupo amino,
em que R10 representa um grupo protector para a protecção dos grupos amino que é conhecido da síntese de peptídeos e, onde for apropriado, pode ser eliminado selectivamente.
Constituem exemplos de grupos protectores adequados os grupos acilo, tais como os grupos trifluoroacetil ou tricloroacetil, o-nitrofenilsulfenil, 2,4-dinitrofenilsulfenil ou alcoxicarbonil inferior opcionalmente substituído, tal como metoxicarbonil, t- 11 butiloxicarbonil, benziloxicarbonil, p-metoxibenziloxicarbonil ou 2,2,2-tricloroetiloxicarbonil. São conhecidos derivados de amino-hexose N-protegidos adequados. Por exemplo, M. Bergmann e L. Zervas, Ber. 64, 975 (1931); D. Horton, J. Org. Chem. 29, 1776 (1964); P. H. Gross e R. W. Jeanloz, J. Org. Chem. 32, 2759 (1967) ; M. L,
Wolfrom e Η. B. Bhat, J. Org. Chem. 32, 1821 (1967); geral: J. F. W. McOmie (Editor). Prot. Groups. Org. Chem, Plenum Press (1973); Geiger in "The Peptides" Vol. 3, p 1-99, (1981) Academic Press; e literatura citada). Os grupos protectores amino preferidos para a preparação dos compostos de acordo com a fórmula I são o grupo BOC (terc. butiloxicarbonil) ou o grupo Z (benziloxicarbonil).
Os derivados de açúcar amino bloqueados (IV) são feitos reagir numa primeira fase da reacção com aminas (fórmula V), H2N-R1 (V) em que R1 possui o significado anteriormente indicado, para proporcionar glicosilaminas (fórmula VI)
As preparações de glicosilamina deste tipo são conhecidas em principio (ELLIS, Advances in Carbohydrate Chemistry 10, 95 (1955)) e encontram-se descritas especificamente na DE-OS (especificação alemã publicada) n.° 3,213,650. Na segunda fase da reacção, as glicosilaminas (VI) são feitas reagir ou com derivados do 12 ácido carboxílico adequados (fórmula VII), tais como halogenetos de carboxilo ou anidridos carboxilicos, R11-CO-CH2-R4 (VII) possuindo R2 o significado anterior e representando R11 halogéneo, tal como, por exemplo, cloro ou representando -O-CO-R2 com o significado anteriormente indicado para R2 ou representando alquilo inferior -0-C0-0-. Deste modo são obtidas as glicosilamidas (fórmula VIII(
em que R1 e R2 possuem os significados indicados e R10 é igual a R6 e X representa -CH2-. As condições para as N-acilações deste tipo são indicadas na DE-OS (especificação alemã publicada) n.° 3,213,650.
Numa realização preferida as glicosilaminas da fórmula VI são feitas reagir com um a dois equivalentes de um cloreto de carbonilo (fórmula VII) ou com um ou dois equivalentes de um anidrido misto que foi obtido a partir do ácido carboxílico R2-CH2-C02 relevante H e cloroformiato de etilo ou cloroformiato de isobutilo, na presença de uma base orgânica auxiliar, através de métodos conhecidos da literatura, para proporcionar a glicosilamida da fórmula VIII com X=-CH2-.
Este processo é executado em solventes orgânicos ou aquoso-orgânicos, entre 0o C e 50° C, sempre que apropriado na presença de uma base inorgânica ou orgânica. Diluentes adequados são álcoois tais como metanol, etanol, 1-propanol 13 ou 2-propanol ou éteres, tais como éter dietílico, tetra-hidrofurano ou 1,4-dioxano, ou hidrocarbonetos halogenados, tais como diclorometano, triclorometano ou 1,2-diclorometano, ou N,N-dimetilformamida.
Quando as glicosilaminas (VI) que são obtidas na primeira fase são feitas reagir com os ésteres de ácidos halogenofórmicos (IX) R12-C0-0-R2 (IX) representando R12 halogéneo, tal como, por exemplo, cloro ou bromo e possuindo R2 o significado anteriormente indicado, obtendo-se os glicosilcarbamatos (VIII), representando X na fórmula III oxigénio.
Numa realização, as glicosilaminas da fórmula VIII são feitas reagir com um a dois equivalentes de um éster clorocarbónico IX para proporcionar o glicosilcarbamato. Este processo é preferencialmente executado em solventes orgânicos ou aquoso-orgânicos, entre 0o C e 50° C mas mais preferencialmente à temperatura ambiente. Os solventes adequados são álcoois, éteres, hidrocarbonetos halogenados ou dimetilformamida, tal como os anteriormente referidos.
Quando as glicosilaminas (VI) que são obtidas na primeira fase são feitas reagir com um a dois equivalentes de um isocianato orgânico (fórmula X) R2-NCO (X) possuindo R2 o significado anteriormente referido, são obtidas glicosilureias da fórmula VIII e X significa -NH-. Esta reacção de acilação, como as reacções anteriormente referidas, é preferencialmente executada em solventes orgânicos, a temperaturas de reacção entre -20° C e 60° C, 14 de preferência entre 0o C e 25° C. Os solventes adequados são os álcoois, éteres, hidrocarbonetos halogenados ou dimetilformamidas anteriormente referidos.
As glicosilamidas (fórmula VII, X=-CH2-) , gl icosilcarbamatos (fórmula VIII, X=-0-) ou glicosilureias (fórmula VIII, X=NH-) obtidas deste modo são isoladas sob a forma de sólidos cristalinos ou amorfos, através de processos conhecidos em si e, se necessário, são purificados através de procedimentos normalizados, tais como recristalização, cromatografia, extração, etc.
Em muitos casos, é também vantajoso executar, em paralelo com ou em vez das fases de purificação já referidas, uma derivatização química que conduz a um derivado de glicosilamidas, glicosilcarbamatos e glicosilureias da fórmula VIII, que apresentam boas propriedades de cristalização. As derivatizações químicas deste tipo são, no caso de glicosilamidas, glicosilcarbamatos e glicosilureias de acordo com a invenção, por exemplo reacções de esterificação dos grupos hidroxilo dos resíduos açúcar. Constituem exemplos dos grupos éster adequados os grupos acetilo, benzoílo ou p-nitrobenzoílo. Para preparar os derivados de tri-O-acilo das glicosilamidas, glicosilureias ou glicosilcarbamatos, os trióis correspondentes (fórmula VIII) são feitos reagir com agentes de acilação na presença de bases auxiliares inorgânicas ou orgânicas. Os agentes de acilação adequados são cloretos do ácido, tais como cloreto de acetilo, cloreto de benzoílo ou cloreto de p-nitrobenzilo, ou anidridos, tais como, por exemplo, anidrido acético. Em resultado dá-se a formação dos ésteres de acordo com a fórmula XI 15
possuindo R1, R2, R10 e X os significados anteriormente referidos e representando R13 acetilo, benzoilo ou p-nitrobenzoílo.
As reacções de O-acilação são preferencialmente executadas em solventes orgânicos inertes. Os solventes gue podem ser utilizados são hidrocarbonetos halogenados, tais como diclorometano, triclorometano ou 1,2-dicloroetano, éteres, tais como tetra-hidrofurano, ou 1,4-dioxano, ésteres, tais como acetato de etilo e amidas, tais como dimetilformamida. É também possível indicar como solventes adequados bases orgânicas, tais como trietilamina ou piridina. As bases que podem ser utilizadas são todas as bases utilizadas em química orgânica para O-acilações. De preferência, utilizam-se trietilamina, piridina ou a mistura de piridina/4-dimetilaminopiridina. Os triésteres (fórmula XI) podem ser facilmente cristalizados a partir de solventes orgânicos. São particularmente preferidos para a cristalização solventes polares tais como álcoois de cadeia curta, isto é metanol, etanol, n-propanol ou isopropanol. Outros solventes adequados para a cristalização dos triésteres (fórmula XI) são misturas de solventes orgânicos com solventes inorgânicos ou orgânicos polares, por exemplo, tetra-hidrofurano-metanol, tetra-hidrofurano-água, etanol-água e isopropanol-água. Os triésteres (fórmula XI) 16 que foram purificados por meio de recristalização simples ou, onde apropriado, múltipla, são devolvidos aos trióis (fórmula VIII) por meio de hidrólise ou transesterificação dos três grupos O-acetilo. Uma multiplicidade de tipos de clivagens éster são conhecidas em química orgânica. Para a preparação dos trióis (fórmula VIII) a partir dos triésteres (fórmula XI) pode-se fazer referência à transesterificação dos grupos acilo na presença de metanol e quantidades catalíticas de metanolato de sódio, que é conhecido por hidrólise ZEMPLEN em química orgânica. A terceira fase de reacção na preparação dos compostos da fórmula I de acordo com a invenção compreende a clivagem selectiva do grupo protector do grupo 2-amino do açúcar nos compostos da fórmula VIII. Nesta reacção, deve-se ter particular cuidado em evitar a eliminação simultânea do grupo 1-amido ou 1-carbamido ou 1- (alcoxicarbonilamido) no açúcar, nos compostos da fórmula VIII. 0 grupo benziloxicarbonilo que é preferencialmente utilizado em C-2 dos amino-hexanos pode ser clivado quantitativamente e selectivamente, com retenção do grupo 1-amido, 1-carbamido oui 1-alcoxicarbonilamido, nas condições de hidrogenólise. A hidrogenólise proporciona as glicosilamidas, glicosilureias ou glicosilcarbamatos com um grupo 2-amino livre no açúcar com a seguinte fórmula estrutural (XII)
NHi HO (XII) 17 com os significados anteriormente referidos para R1, R2 e X.
Exemplos de catalisadores adequados para a hidrogenólise são os metais nobres como a platina ou paládio, que são adsorvidos em carvão activado. Utiliza-se preferencialmente paládio/carvão (5% ou 10%). A hidrogenólise pode ser executada à pressão atmosférica ou sob pressão elevada, num recipiente sob pressão adequado. Os solventes inertes são adequados para a hidrogenação, tal como, por exemplo, álcoois tais como metanol, etanol ou propanol, éteres tais como tetra-hidrofurano ou 1,4-dioxano ou ácidos carboxilicos tais como ácido acético ou misturas destes. Quando apropriado, o solvente é misturado com água ou ácidos diluídos, tal como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. Evidentemente, quando são adicionadas estas amidas, os 2-amino-2-desoxiglicosilamidas, 2-amino-2-desoxicarbamatos e 2-amino-2-desoxiureias de acordo com a fórmula XII são obtidos como os sais amónio destes ácidos. O grupo protector t-butiloxicarbonilo, que é igualmente utilizado preferencialmente nos compostos da fórmula VIII, pode ser clivado por meios de métodos conhecidos da literatura, utilizando ácidos minerais, tais como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. Também neste caso os 2-amino-2-desoxiglicosilamidas, 2-amino-2-desoxicarbamatos e 2-amino-2-desoxiureias da fórmula XII são obtidos selectivamente como os sais amónio dos ácidos utilizados na clivagem. A quarta fase de reacção para a síntese dos compostos da fórmula I de acordo com a invenção compreende a ligação das aminoglicosilamidas, amidas, aminoglicosilcarbamatos ou aminoglicosilureias de acordo com a fórmula XII ou os 18 respectivos sais com um derivado de aminoácido adequado. Os derivados de aminoácido adequados são aminoácidos N-bloqueados (fórmula XIII) HCfcC—CH—N—Ru (XII) it7 á* possuindo R7 o singificado anteriormente referido, R8 representa hidrogénio ou metilo e R14 representa um grupo protector que é habitualmente utilizado na síntese dos peptídeos e pode ser selectivamente eliminado novamente, retendo a ligação peptídeo.
Os grupos protectores para o grupo amino na fórmula XIII que são preferencialmente utilizados são os anteriormente referidos e os grupos benziloxicarbonilo ou t-butiloxicarbonilo são particularmente preferidos. A ligação dos 2-amino-2-desoxiglicosilamida, 2-amino-2-desoxicarbamato ou 2-amino-2-desoxiureia da fórmula XII com um derivado aminoácido da fórmula XIII pode ser executada mediante métodos convencionais da síntese dos peptídeos (E. Wunsch et al. : Synthese von Peptiden (Synthesis of peptides) in: Methoden der Org. Chemie (Methods of org. chemistry) (Houben-Weyl) (E. Muller, Editor), Vol XV/1 e XV/2, 4a edição, publicado por Thieme, Estugarda (1974).
Exemplos de processos convencionais são a condensação do grupo amino no composto da fórmula XII com um derivado de aminoácido da fórmula XIII na presença de agentes desidratantes, por exemplo diciclo-hexilcarbodiimida ou diisopropilcarbodiimida. 19 A condensação dos compostos da fórmula XII com os da fórmula XIII pode também ser efectuada quando o grupo carboxilo é activado. Um grupo carboxilo activado possível é, por exemplo, um anidrido ácido, de preferência um anidrido misto, tal como um acetato do ácido ou uma amida do ácido, tal como uma imidazolida ou um éster activado. Constituem exemplos dos ésteres activados o ésteres de cianometilo, ésteres de pentaclorofenilo e ésteres de N-hidroxiftalimida. Os ésteres activados podem também ser obtidos a partir do ácido (fórmula XIII) e N- hidroxisuccinimida ou 1-hidroxibenzotiazol na presença de um agente desidratante, tal como a carbodiimida. Os derivados dos aminoácidos são conhecidos e podem ser preparados de um modo conhecido. A condensação dos compostos amino da fórmula XII com os compostos carboxilo opcionalmente activados da fórmula XIII proporciona os peptidoglicolípidos da fórmula XIV.
com os significados anteriormente referidos para R1, R2, R7, R8, R14 e X.
Numa fase final do processo para a preparação dos compostos de acordo com a fórmula I, o grupo protector R14 nos compostos da fórmula XIV é eliminado. Durante esta fase deve-se ter o devido cuidado para não clivar os outros grupos amida, uretano ou ureia nos compostos da fórmula 20 XIV. Os grupos protectores R14 que são preferencialmente utilizados nos compostos da fórmula XIV, o grupo N-carbobenzoxi e o grupo N-terc.-butiloxicarbonilo podem ser eliminados mantendo o grupo amida, uretano ou ureia. O grupo carbobenzoxi pode ser eliminado selectivamente por hidrogenólise na presença de um metal nobre tal como, por exemplo, paládio em carbono, num solvente adequado tal como etanol, metanol, ácido acético glacial ou tetra-hidrofurano. Os solventes podem ser utilizados como o solvente puro ou combinados com um outro ou com água. A reacção pode ser efectuada à pressão atmosférica ou sob alta pressão. O grupo terc.-butiloxicarbonilo R14 nos compostos da fórmula XIV pode ser eliminado por processos acidolíticos. Exemplos de condições adequadas são o uso de cloreto de hidrogénio em solventes adequados, tais como, por exemplo, ácido acético glacial, éter dietilico, dioxano ou acetato de etilo à temperatura ambiente. Os processos deste tipo para a clivagem dos t-butilo carbamatos são conhecidos em principio. As peptidoglicosilamidas, peptidoglicosilcarbamatos ou peptidoglicosilureias da fórmula I que são obtidas deste modo são isoladas sob a forma de sólidos cristalinos ou amorfos, através de processos conhecidos em si e, se necessário, são purificados através de procedimentos normalizados, tais como recristalização, cromatografia, extração, etc.
Os compostos da fórmula I de acordo com a invenção podem também ser preparados através de uma segunda via de síntese com resultados igualmente bons. Esta segunda via de síntese difere da primeira, que se encontra descrita anteriormente, na medida em que a sequência da ligação do aminoácido amino açúcar sintão, amina R1-NH2 e ácido 21
carboxílico R2-CH2-C02-H, ou derivado de ácido carbónico R2-O-CO-halogéneo ou R2-NCO, com os significados anteriormente referidos para R1 e R2, é diferente. Nesta segunda via de síntese, são utilizados como componente de partida 2-N-(aminoacilo)aminoaçúcares da fórmula XV 21
com o significado anteriormente indicado para R7 e R8 em em que R14 representa um grupo protector amino conhecido na química dos peptídeos, de preferência o grupo benziloxicarbonilo ou t-butiloxicarbonilo. Os compostos da fórmula XV que são obtidos deste modo são depois condensados com os compostos amino da fórmula III para proporcionar glicosilaminas da fórmula geral XVI HO—CH2 HO—^—NH—R* HO NH—CO—CH—N—Rw R? R» (XVI) possuindo R , R , R e R os significados consistentes com a fórmula I e a definição de R6.
Todos os processos descritos anteriormente para a preparação dos compostos da fórmula geral VI podem ser utilizados para a preparação dos compostos da fórmula geral XVL. Os compostos da fórmula XVI são depois feitos reagir 22 seja com os derivados do ácido carboxilico referidos anteriormente (fórmula VII) ou com ésteres halogenofórmicos (fórmula IX) ou com isocianatos orgânicos (fórmula X) para produzir as 2-(aminoacil)-aminoglicosilamidas da fórmula XIV (com X=-CH2—) ou os 2-(aminoacil)-aminoglicosilcarbamatos da fórmula XIV (com X=-0-) ou as ureias da fórmula XIV (com X=MH-). Estas reacções de acilação podem ser geralmente executadas pelos processos anteriormente descritos para a reacção das glicosilaminas com derivados do ácido carboxilico ou carbónico.
Os intermediários (fórmula XIV) que são obtidos desta forma podem ser purificados através do método de purificação fisica já referido. No entanto, é preferível converter os compostos da fórmula XIV através dos métodos de O-acilação anteriormente descritos nos tri-O-acetatos ou nos tri-O-benzoatos da fórmula geral XVII
(XVII) com os significados das variáveis consistentes com a fórmula 1.
Estes compostos podem ser facilmente cristalizados, de preferência a partir de solventes polares, tais como metanol ou etanol, sendo assim purificados. Os derivados cristalinos purificados da fórmula XVII são depois convertidos nos trióis da fórmula XIV através dos métodos anteriormente referidos de hidrólise do éster, que são 23 amplamente utilizados, em especial na química do açúcar. A eliminação final dos grupos de protecção no aminoácido, nos compostos da fórmula XIV foi já descrita anteriormente para a preparação dos compostos da fórmula L. A invenção refere-se também aos sais dos compostos da fórmula I. Estes são principalmente os sais não-tóxicos que podem ser habitualmente utilizados em farmácia, por exemplo cloretos, acetatos e lactatos ou sais inertes dos compostos da fórmula I. 0 termo "ácido fraco" significa qualquer ácido com um índice pKa (o log de Ka) entre cerca de 1,0 e cerca de 9,5, utilizando tabelas ou valores padrão. Sem pretensões de limitar a presente invenção, os exemplos seguintes dos ácidos fracos encontram-se descritos por nome, fórmula e pKa apropriado. Ácido acético, H(C2H302) (pKa 4,7 6); ácido ascórbico (1), H2 (C6H606) (pKa 4,10); ácido acetilsalicílico, H8(C904) , (pKa 3,5); ácido butanóico H (C4H7O2) (pKa 4,83); ácido carbónico, H2C03, (pKa 4,83 forma 1); ácido crómico, HCrOÁ (pKa 6,49 forma 2); ácido cítrico, H3 (C6H507) , (pKa 3,14 forma 1); ácido cítrico, H2C6H507_, (pKa 4,77 forma 2); ácido cítrico, (HC6H507)~, (pKa 6,39 forma 3); ácido fórmico, H(CH02), (pKa 3,75); ácido fumárico, H4 (C4O4) (pKa 3,03); ácido heptanóico, H(C7Hi302), (pKa 4,89); ácido hexanóico, H(C6Hn02), (pKa 4,84); ácido fluorídrico, HF, (pKa 3,20); isocitrato, H8(C607) (pKa 3,29); ácido láctico, H(C3H503), (pKa 3,08); ácido maleico, H4(C404) (pKa 1,83); ácido nicotínico, H5(C6N02) (pK3,39); ácido oxálico, H2 (C204) , (pKa 1,23 forma 1); ácido oxálico, (HC204)_, (pKa 4,19 forma 2); ácido pentanóico, H(C5H902), (pKa 4,84); ácido fosfórico, H3P04, (pKa 2,16 forma 1); ácido propanóico, H(C3H502), (pKa 4,86); ácido pirúvico, 24 Η4 (C303) (pKa 2,39) e ácido succínico H6(C404) (pKa 4,19). Quaisquer combinações destes ácidos encontram-se também exemplificadas. É preferido o ácido acético. 0 ácido acetilsalicilico, o ácido cítrico, o ácido fórmico, o ácido fluorídrico, o isocitrato, o ácido maleico, o ácido nicotínico, ácido fosfórico, ácido pirúvico, ácido succínico e ácido tricloroacético são os ácidos fracos mais comuns que são individualmente concretizados em combinação e em conjunto. o termo "surfactante não-iónico" significa um surfactante que é uma substância que reduz a tensão superficial do material em que se encontra dissolvido e não-iónico significa que possui um grupo polar sem carga eléctrica. 0 termo surfactante amfífilico significa um surfactante em que uma parte da molécula surfactante é hidrofóbica e uma parte é hidrofílica. Serão surfactantes adequados todos aqueles que são não-iónicos e anfífilicos e aceitáveis para uso veterinário ou médico. Um perito na técnica pode determinar com facilidade se um surfactante não-iónico em particular é aceitável para uso médico ou veterinário. Existem muitos surfactantes não-iónicos adequados que podem ser utilizados com a presente invenção e numerosos exemplos são apresentados abaixo.
Dois tipos de surfactantes não-iónicos bem conhecidos encontram-se concretizados no presente documento. São conhecidos como sorbitanos, vulgarmente comercializados sob a marca registada Span® e sorbitanos de polioxietileno, vulgarmente vendido sob a marca registada Tween®, especificamente concretizado no presente documento são os seguintes: 25
Monolaurato de sorbitano (Span 20®), monopalmitato de sorbitano (Span 40®), monostearato de sorbitano (Span 60®), tristearato de sorbitano (Span 65®). Monoleato de sorbitano (Span 80®), trioleato de sorbitano (Span 85®), monostearato de polioxietilenossorbitano (Tween 20®), monopalmitato de polioxietilnossorbitano (Tween 40®), monoestearato de polioxietilenossorbitano (Tween 60®), monooleato de polioxietilenossorbitano (Tween 80) e 20 trioleato de polioxietilenossorbitano (Tween 85). Pretende-se que estas descrições incluam os ingredientes com designação comercial ou ingredientes equivalentes, segundo as listas nos catálogos de fornecedores destes surfactantes. Os surfactantes podem ser utilizados individualmente ou em qualquer combinação. São descritos em particular o monolaurato de sorbitano (Span 20®), monolaurato de polioxietilenossorbitano (Tween 20®), monooleato de sorbitano (Span 80®), trioleato de sorbitano (Span 85®), monooleato de polioxietilenossorbitano (Tween 80), trioleato de polioxietileossorbitano (Tween 85). O termo "tampão adequado" significa um tampão que é apropriado para uso veterinário ou médico e pode manter um pH relativamente constante numa solução aquosa, entre cerca de 6 e cerca de 8. Os tampões de fosfato são uma realização presentemente descrita. Uma grande variedade de tampões de fosfato podem ser executados a um pH especifico através da mistura de sais monobásicos e dibásicos de fosfato de sódio e/ou fosfato de potássio em diferentes proporções. A produção e utilização de variados tampões de sódio e potássio é bem conhecida dos especialistas na técnica.
Outros exemplos de tampões são os seguintes: 26 ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico (também conhecido como MES; ácido 3-(N-morfolino)propanossulfónico (também conhecido como MOPS); ácido n-[tris(hidroximetil)]-2-aminoetanossulfónico (também conhecido como TES) ; ácido 4-(2-hidroxetil)piperazina-l-etanossulfónico (também conhecido como HEPES); ácido [tris(hidroximetil)metil]glicina (também conhecido como TRIS);
Parte L Preparação das soluções.
As novas formulações apresentadas são 1) soluções mãe de glicosilamida e 2) soluções adjuvantes glicolipidicas. 1) Uma solução mãe de glicosilamida é preparada por meio da dissolução de um glicolípido num álcool e combinando quantidades apropriadas de um ácido fraco. 0 ácido fraco é adicionado à solução de glicolípido álcool, com um excesso molar de ácido fraco relativamente ao glicolípido. É adicionado um surfactante não-iónico à mistura álcool glicolipídico ácido para criar uma solução mãe de glicosilamida. 0 glicolípido exemplificado é acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino^-D-gulucopiranosil)-N- octadecildodecanoilamida. 0 álcool exemplificado é etanol. 0 ácido fraco exemplificado é ácido acético. Os surfactantes não-iónicos encontram-se descritos anteriormente.
Preparação de soluções mãe de glicosilamida. 0 ácido fraco é adicionado a uma solução alcoólica contendo um glicolípido. 0 ácido fraco é adicionado em excesso molar 27 com referência ao teor de glicolípido. 0 componente ácido fraco deve ser adicionado numa quantidade entre 1,25 e 5 vezes a quantidade do glicolipido em equivalentes molares relativamente ao glicolipido. Nalgumas realizações, recomendam-se as seguintes quantidades relativas de ácido. 0 ácido fraco deve ser 2,0 vezes, 2,5 vezes, 2,7 vezes, 3,0 vezes e 5,0 vezes e mais preferivelmente 2,7 vezes tantas moles e ácido quantas moles de glicolipido. É adicionado um surfactante não-iónico à mistura álcool glicolipidico anterior, antes ou depois da adição do ácido fraco, para criar uma solução mãe de gllcosilamlda final.
Na presença do ácido fraco, a glicosilamida é convertida na forma acetado do glicolipido. Os glicolípidos da fórmula I não são totalmente solúveis quando são simplesmente introduzidos diretamente nas soluções aquosas tamponadas. A solução obtida tipicamente a partir da dissolução de um glicolípido da fórmula I numa solução aquosa tamponada é uma mistura leitosa. Anteriormente, outros investigadores tentaram fazer estas soluções de misturas homogéneas por meio de sonicação de misturas homogéneas por meio de sonicação da solução leitosa. No entanto, a sonicação não assegura que a solução permaneça homogénea durante um período de armazenamento. A abordagem química com a suspensão destes compostos resulta numa solução totalmente solúvel, quase transparente à vista, de glicolípido tamponado aquoso a pH apropriado. Quando se adiciona um ácido fraco em quantidade excedentária, comparativamente com o glicolípido, este assegura que a totalidade do glicolípido é convertida em forma solúvel, evitando a sua reversão para forma não-solúvel. 28 0 ácido fraco converte o glicolípido num sal farmaceuticamente aceitável. Os sais preferidos são sais não-tóxicos que são habitualmente utilizados em preparações farmacêuticas e biológicas. Por exemplo, cloretos, acetatos, lactatos e sais inertes dos compostos da fórmula I são obtidos com os ácidos fracos descritos.
Os álcoois utilizados para dissolver o glicolípido podem ser metanol, etanol, qualquer forma isomérica de propanol ou qualquer combinação destes. A solução de álcool glicolipídico resultante será opticamente transparente. Qualquer reacção química que pode reconverter a forma acetato do glicolípido em forma não-acetato provocaria a floculação dos glicolípidos na solução aquosa. Quando a floculação do glicolípido ocorre, as moléculas de glicolípido separam-se da solução sob a forma de flocos finos que se depositam no fundo do recipiente. A concentração inicial do ácido fraco na solução mãe de gllcosllamlda de glicolípido e álcool determina se haverá qualquer floculação do glicolípido. 0 ácido fraco deve encontrar-se em excesso molar com referência ao glicolípido para evitar a floculação.
2) Soluções adjuvantes glicolipídicas são preparadas por meio de introdução de uma quantidade apropriada da solução mãe de glicosilamida num "tampão adequado". 0 pH das soluções adjuvantes glicolipídicas estáveis finais descritas deve oscilar entre cerca de 6 e cerca de 8. É preferido o pH final entre cerca de 6 e cerca de 7. É descrito um pH final entre cerca de 6,3 e cerca de 6,4. A solução mãe de glicosilamida contém ácido em excesso, de forma que deve ser tamponada para utilização 29 como um adjuvante. Por exemplo, um tampão de fosfato pode ser executado a um pH específico, dentro de um intervalo amplo, através da mistura de sais monobásicos e dibásicos de fosfato de sódio e/ou fosfato de potássio em diferentes proporções. Se um tampão de fosfato for utilizado pode ser efectuado a cerca de 20 mM e este possui um pH de cerca de 7,8. Quando a solução mãe de glicosilamida é adicionada ao tampão, o pH do tampão baixa. Uma solução tamponada com fosfato a pH 7,8 resulta numa solução adjuvante glicolipídica com um pH de cerca de 6,4. Os ajustes finais do pH podem ser executados mas tipicamente não são necessários. A solução mãe de glicosilamida que contém um ácido fraco e um glicolípido possui um pH muito baixo. Pode ser necessário aumentar o pH para um nível aceitável. Deve-se evitar uma base forte para este fim porque a adição de uma base forte pode reconverter a forma salina do glicolípido na forma não-salina, resultando em precipitação (floculação) da forma não-salina no ambiente aquoso. No entanto, se for desejada uma base forte, só devem ser utilizadas pequenas quantidades. Por exemplo, recomenda-se que não sejam utilizados mais de 100 mM de NaOH, enquanto 4,0 mM ou inferior é o ideal. A solução tampão pode incluir opcionalmente algum NaCl, mas não é necessário. Concentrações e NaCl podem oscilar desde cerca de 1 a cerca de 50 mM. Quantidades inferiores de NaCl são preferidas em relação a quantidades maiores. Os exemplos apresentados ou não possuem qualquer NaCl ou possuem 15 mM de NaCl. 100 mM de NaCl não é adequado dado que ocorre floculação. Não se prevê qualquer floculação com concentrações de NaCl de 15 mM ou 30 inferiores. Não se prevê qualquer floculação com concentrações de NaCl de 30 mM ou inferiores. Não se prevê qualquer floculação com concentrações de NaCl de 50 mM ou inferiores.
Parte II. Caracterização da solução adjuvante de glicolípido. A estabilidade da solução adjuvante de glicolípido durante o armazenamento pode ser controlada através de simples observação visual ou através de instrumentos analíticos apropriados. As moléculas glicolipídicas formam micelas quando se encontram em solução aquosa e é possível determinar o tamanho das micelas com precisão, com um difractómetro laser. Esta medição pode ser utilizada para determinar se existe floculação de moléculas de glicolípido.
Uma abordagem alternativa à medição da estabilidade em tempo real consiste em executar ensaios de estabilidade acelerados. Com os ensaios de estabilidade acelerados, a solução adjuvante é sujeita a uma temperatura de cerca de 37° C durante cerca de sete dias, seguido de incubação a cerca de 4o C durante cerca dois dias sob agitação constante. A incubação a cerca de 37° C durante cerca de sete dias representa um armazenamento a cerca 4 o C por um período de cerca de um ano. A incubação a cerca de 4o C durante cerca de dois dias, com agitação constante, representa a condição de stress que a solução adjuvante de glicolípido pode ser sujeita durante o transporte.
Para determinar se a solução adjuvante de glicolípido é isotónica com o citoplasma, pode ser determinada a osmolaridade. Concentrações diferentes de cloreto de sódio 31 podem ser adicionadas e a osmolaridade da solução resultante pode ser determinada recorrendo a um osmómetro. Quantidades crescentes de cloreto de sódio, para além de aumentar a osmolaridade, tendem também a turvar a solução. Pensa-se que a turvação é causada pela agregação das micelas em partículas maiores. As soluções que são difíceis ou impossíveis de filtrar com um filtrado de 0,2 pm são geralmente aceitáveis para uso comercial porque a filtração terminal é frequentemente utilizada para assegurar a esterilidade das soluções adjuvantes preparadas a uma escala comercial. Uma análise ao microscópio electrónico pode ser utilizada para determinar se existe uma agregação das micelas em resultado do excesso de sal.
Adjuvantes não-glicolípidos adicionais podem ser utilizados na solução adjuvante de glicolípido, em combinação com os descritos anteriormente. Foram adicionadas moléculas imunoestimulantes adicionais à solução adjuvante glicolípida. As moléculas imunoestimulantes são bem conhecidas na técnica e incluem saponinas, Quil A, brometo de dioctadecilamónio (DDA) e Carbopol.
Quil A é um extracto purificado da casca da árvore sul-americana Quillaja saponaria. Quil A induz respostas tanto humorais como mediadas por células. Quil A é frequentemente utilizado com colesterol porque o colesterol elimina menos efeitos secundários desejáveis quando adicionados nas proporções adequadas. O colesterol forma complexos insolúveis com Quil A, que formam estruturas helicoidais assim que o colesterol se liga ao Quil A, expondo assim as unidades açúcar da molécula que ajudam a estimular a resposta imunitária. 32 0 brometo de dimetildioctadecilamónio, DDA, é um surfactante catiónico com 18 carbono na cadeia alquilo. É uma amina quaternária amfifilica. A interacção directa de DDA e antiqénio é necessária para obter uma resposta imunitária óptima, porque o DDA funciona como veiculo do antigénio através de ligação directa do antigénio e a interface óleo/água. Estimula respostas imunitárias tanto humorais como mediadas por células.
Carbopol é outra molécula imunoestimulante útil que pode ser utilizada com a presente invenção. É um homopolimero de ácido acrílico que é reticulado com éter polialcenílico.
Parte III. Utilizações da solução adjuvante de glicolípido. A solução adjuvante de glicolípido, numa salina farmaceuticamente aceitável, pode ser misturada com um antigénio. Os antigénios convenientes incluem: proteínas microbianas patogénicas, glicoproteínas, lipoproteínas, peptídeos, glicopeptídeos, lipopeptídeos, toxóides, hidratos de carbono e antigénios específicos de tumores. Os antigénios podem ser derivados a partir de uma variedade de fontes. Os antigénios de agentes patogénicos microbianos incluem bactérias causadoras de doenças, vírus e organismos parasitas. Podem ser empregues misturas de dois ou mais antigénios. 0 antigénio pode ser morto, atenuado naturalmente, modificado vivo ou um extrato proteico, proteínas produzidas por recombinação, um peptídeo sintetizado quimicamente ou outros que estimulem uma resposta imunitária. 0 antigénio peptídeo pode existir como um peptídeo livre ou conjugado com o glicolípido ou 33 conjugado com outros epítopos de células B ou células T conhecidos. A solução adjuvante de glicolípido estável pode ser combinada com adjuvantes adicionais ou componentes que são conhecidos por possuírem propriedades adjuvantes. Adjuvantes adicionais que podem ser combinados com a solução adjuvante de glicolípido incluem polímeros, compostos terpenóides naturais e respectiva forma em bruto ou parcialmente purificada, aminas quaternárias anfífilicas, derivados de materiais da parede celular bacteriana e análogos sintéticos da parede celular bacteriana ou componentes de ADN. A solução adjuvante de glicolípido pode ser utilizada com ou combinada com um ou mais agentes, tais como antibióticos ou diferentes antigénios. Os antigénios bacterianos ou virais tanto podem ser mortos como modificados vivos. Os antigénios virais mortos são preparados através do desenvolvimento de vírus em culturas de tecidos e inactivando os vírus através de tratamentos químicos. Alguns vírus podem ser desenvolvidos em ovos com embrião. 0 antigénio virai morto pode ser adicionado a solução contendo solução adjuvante de glicolípido e a solução resultante pode ser utilizada para vacinar os animais para alcançar protecção contra as infecções virais.
Numa forma de realização desta invenção, a solução adjuvante glicolipídica pode ser utilizada como diluente para antigénios virais vivos modificados. Os agentes patogénicos virais podem ser atenuados quanto à sua virulência, passando-os por cultura de tecido por várias gerações ou através de manipulações específicas do genoma virai. Estas estirpes atenuadas de vírus podem ser 34 desenvolvidas até títulos muito elevados em cultura de tecidos e podem ser utilizadas como antigénios de vacina. As estirpes virais atenuadas são referidas como antigénios virais vivos modificados. Enquanto estas estirpes são menos virulentas são ainda muito imunogénicas quando são utilizadas como antigénio na vacina e oferecem protecção contra a infecção por estirpes virulentas. Se a solução adjuvante de glicolípido for utilizada como diluente para antigénios virais vivos modificados, a solução adjuvante de glicolípido deve ser testada para assegurar que não tem qualquer efeito viricida naquele vírus específico. A propriedade viricida da solução adjuvante de glicolípido em antigénios virais vivos modificados pode ser determinada através de uma experiência in vitro. Antigénios virais liofilizados são re-hidratados com a solução adjuvante de glicolípido ou com água. As soluções de vírus resultantes são semeadas em placas numa monocamada de células permissivas. 0 título do antigénio virai é determinado por contagem do número de placas formadas na monocamada. A diferença dos títulos virais obtida entre as amostras re-hidratadas com água e a solução adjuvante de glicolípido pode ser utilizada para determinar o efeito viricida, caso haja, da solução adjuvante de glicolípido em qualquer vírus vivo.
Antigénios virais vivos modificados podem ser liofilizados e fornecidos em bolos liofilizados numa preparação de vacina comercial. Em geral, estes bolos liofilizados de antigénios virais vivos modificados são re-hidratados com uma solução diluente e utilizados para vacinação por via parentérica. Exemplos de diluentes incluem uma solução em água contendo solução salina 35 tamponada com fosfato. Se a solução diluente contém uma molécula imunoestimulante conhecida, a eficiência da vacinação com os antigénios virais vivos modificados pode ser comprovada. Numa forma de realização desta invenção, a solução adjuvante glicolipidica pode ser utilizada como solução diluente. EXEMPLOS.
Exemplo 1. Preparação de uma composição de glicosilamida insolúvel com concentração igual de Bay 15-5831® e ácido acético.
Quadro 1. Uma composição inadequada para uso comercial.
Reagente Quantidade (200 ml) Etanol (100%) 176,1 ml Tween 20 4,Oml , Ácido acético 1,5 ml glacial Bay 15-5831® 18,4 gm
Bay 15-5831® encontra-se registado pela Bayer Company, é a designação comercial de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-p-D-gulucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida. Quando este composto é utilizado para fazer uma solução adjuvante utilizando as composições descritas no quadro 1 anterior, onde o ácido acético é utilizado numa concentração molar igual ao glicolípido e o glicolipido se encontra na sua forma básica livre, o glicolípido é insolúvel e flocula.
Exemplo 2. Uma solução mãe de glicosilamida utilizando os mesmos componentes do exemplo 1 mas com um aumento da 36 concentração de ácido acético relativamente à concentração de glicolipido resulta numa solução mãe de glicosilamida.
Quadro 2. Composição da solução mãe de glicosilamida.
Reagente Quantidade (50 ml) Etanol (60% 44, 64 ml v/vol) Tween 20 1, 12 ml Ácido acético 0,68 ml glacial Bay 15-5831® 3,49 gm este caso utilizou-se 60% de etanol (v/v) e a proporção molar de ácido acético para glicolipido foi 2,0. 0 etanol puro do exemplo 1 foi substituído por etanol água 60%. A solução mãe de glicosilamida resultante era transparente à vista e não se verificou sedimentação no fundo do recipiente. A solução mãe de glicosilamida foi adicionada a vários tampões para preparar uma solução adjuvante glicolipidica no exemplo 3 abaixo.
Exemplo 3. Preparação de soluções adjuvantes de glicolipido. Foram preparadas soluções tampão fosfato a diferentes pH. Uma solução mãe de 2 M de solução de fosfato de sódio monobásica foi preparada por dissolução de 138 gramas de sal de NaH2P04H20 em 250 mL de água desionizada (Dl) num gobelé e perfazendo o volume final até 500 mL. De modo idêntico, uma solução mãe de 2 M de solução de fosfato de sódio dibásica foi preparada por dissolução de 142 gramas de sal de NaH2P04H20 em 300 mL de água desionizada (Dl) num gobelé e perfazendo o volume final até 500 mL. 37
Ambas as soluções mãe foram esterilizadas por filtração com um filtro de 0,2 micrones.
Quadro 3. Composições de solução mãe 1M de solução de tampão fosfato de sódio a pH diferentes. pH calculado Solução de Na2BP04 (ml) Solução de NaH2P04H20 (ml) Volume total de solução mãe 2M (ml) Água Dl estéril (ml) adicionada Volume total de solução mãe 1M (ml) 6, 0 87,7 12,3 100 100 200 6, 5 68,5 31,5 100 100 200 7,0 39, 0 O s—1 kD 100 100 200 7,5 16, 0 CO O 100 100 200 7,8 8,5 91,5 100 100 200
Foram preparados volumes diferentes de 2M de solução mãe de soluções de fosfato de sódio monobásico e fosfato de sódio dibásico, como apresentado no quadro 3, depois obtiveram-se 1M de solução mãe das soluções tampão de fosfato de sódio a pH diferentes. As soluções tampão fosfato 1M foram depois diluídas 50X para se obter 20 mM de tampões fosfato.
Foram preparadas soluções adjuvante glicolipidicas utilizando estes tampões mãe e as soluções mãe de gl icosilamida do exemplo 2. A 96 mL de cada uma destas soluções de fosfato 20 mM adicionaram-se 5 mL de solução mãe de glicosilamida, segundo a preparação do exemplo 2. A solução adjuvante glicolipídica resultante continha 12,5 mM de ácido acético 38 e 6,33 mM de glicolípido. 0 glicolípido encontra-se então sob a forma de acetato.
Exemplo 4. Importância do pH final da solução adjuvante de glicolípido.
Noutro conjunto de experiências, foi analisada a importância do pH final de várias soluções para avaliar como o pH afecta a floculação. Foi preparado um fosfato de fosfato de 20 mM a um pH inicial de 7,8. O quadro 4 mostra o adjuvante glicolipídico preparado utilizando a glicosilamida preparada como no exemplo 1, em que o glicolípido e o ácido acético foram utilizados em concentrações molares iguais. Atenção, o pH final não diminuiu muito (quadro 4), indicando a eficácia do tampão. As concentrações de NaCl variavam. As leituras em densidade óptica (D. O.) a 600 nm, no quadro 4 foram comparadas com leituras similares no quadro 5, tendo as soluções adjuvantes glicolipídicas sido preparadas com soluções mãe de glicosilamida, contendo o dobro da proporção molar de ácido acético para glicolípido, conforme a preparação do exemplo 2. A utilização da maior concentração ou quantidade de ácido acético resulta em floculação mínima. A floculação foi maior na amostra sem filtração do que nas amostras filtradas. Além disso, com o aumento da concentração de NaCl, não se verificou um aumento da floculação e mesmo da precipitação. A solução adjuvante glicolipídica descrita no quadro 5 foi preparada com um tampão fosfato, com um pH inicial de 8,0; o pH final da solução adjuvante glicolipídica situava-se entre 6,8 e 7,0. Uma maior diminuição do pH final da solução adjuvante glicolipídica pode resultar numa solução adjuvante glicolipídica com menor turvação e sem floculação. 39
Quadro 4. Preparação de composições de glicosilamida contendo uma quantidade equimolar de ácido acético e glicolipidos. (ver exemplo 1.)
Concentração de NaCl (mM) . Volume de tampão (ml) Volume de composições mãe glicolipidicas (ml) pH final O.D. a 600 nm 0 480 25 7,42 1, 693 15 480 25 7,39 1, 873 100 480 25 7,33 2, 742 Quadro 5. Preparação da solução adjuvante glicolipídica utilizando uma solução mãe de glicosilamida contendo o dobro da quantidade molar de ácido acético como glicolipido. (ver exemplo 2).
Concentração de NaCl (mM) . Volume de tampão (ml) Volume de solução mãe de glicosilamida (ml) pH final 0, D, a 600 nm 0 480 25 6, 93 0, 146 15 480 25 6, 88 0, 487 100 480 25 6, 84 2, 826
Uma densidade óptica (O.D.) inferior a 0,1 representa uma solução translúcida. Uma densidade óptica entre 0,1 e 0,5 é homogénea com uma ligeira turvação, uma densidade óptica de 0,5 a 0,5 apresenta alguma turvação, uma densidade óptica de 1,0 a 1,0 é considerada turva. Uma densidade óptica superior a 1,5 é turva e com pouca probabilidade de ser filtrável com um filtro de 0,2 40 mícrones. Este último seria considerado em geral como comercialmente adequado.
Exemplo 5. Titulação do adjuvante glicolipídico com ácido acético para demonstrar que a floculação pode ser invertida. Para determinar a possibilidade de inversão da floculação de um adjuvante glicolipídico com floculação mediante adição de uma quantidade crescente de ácido acético, preparou-se um adjuvante glicolipídico como descrito no exemplo 1. O adjuvante glicolipídico apresentou floculação mesmo na ausência de NaCl. Uma concentração crescente de ácido acético foi adicionada a esta mistura de adjuvante glicolipídico floculada. O ácido acético foi diluído 16,6 vezes com água para se obter uma concentração da solução de trabalho de 1 molar. Depois, 15 μΐ desta solução 1M foram adicionados a 15 ml de mistura adjuvante glicolipídica para aumentar a concentração de ácido acético em 1 mM. Com a crescente concentração de ácido acético, o pH do adjuvante glicolipídico diminuiu e os floculados dissolveram-se. No entanto, o adjuvante glicolipídico permaneceu um pouco turbo. Esta observação confirma que a concentração crescente de ácido acético converte a base livre de Bay 15-5381 numa forma acetato que é mais solúvel em solução aquosa.
Quadro 7. A titulação do adjuvante glicolipídico com ácido acético.
Volume de adjuvante Volume de ácido acético pH da glicolipídico IN adicionado solução 15 mL 0 7,25 15 mL 15 μΐ (1 mM) 7,21 15 mL 30 μΐ (2 mM) 7, 10 41
Volume de adjuvante Volume de ácido acético pH da glicolipidico IN adicionado solução 15 mL 60 μΐ (4 mM) 6, 97 15 mL 150 μΐ (10 mM) 6,44 15 mL 750 μΐ (50 mM) 4,57
Exemplo 6. Preparação de uma segunda solução adjuvante glicolipidica com e sem NaCl. Depois de estabelecida a importância de um aumento da quantidade de ácido acético na manutenção da estabilidade das soluções glicolipidicas, decidiu-se utilizar a composição apresentada no quadro 8 para preparar primeiro uma solução mãe de glicosilamida e depois utilizar esta para preparar outra solução adjuvante glicolipidica tanto com como sem NaCl. A solução mãe de glicosilamida é similar à solução do exemplo 2, com 4 vezes o volume total e quantidades relativamente maiores de ácido acético e Tween 20.
Quadro 8. Composição da solução mãe de glicosilamida.
Reagente Quantidade (200 ml) Etanol 60% (v/v) 179 ml Tween 20 i—1 £ o Ácido acético 3,0 ml Bay 15-5381 13,96 gramas
Três soluções adjuvante glicolipidicas diferentes, com diferentes concentrações de NaCl, foram preparadas utilizando o tampão fosfato do exemplo 3 e a solução mãe de glicosilamida preparada como no quadro 8.
Como a formulação do exemplo 4, quadro 5, foi feita a solução adjuvante de glicolípido contendo 0 mM, 15 mM e 100 42 mM de NaCl. As soluções de 0 mM e 15 de NaCl puderam ser filtradas através de um filtro de 0,2 micrones. As solução adjuvante glicolipídica contendo 100 mM de NaCl não pôde ser filtrada através de um filtro de 0,2 micrones.
Quadro 9. Preparação de uma solução adjuvante glicolipidica estável com e sem NaCl.
Concentração de cloreto de sódio (mM). Volume de tampão (ml) Volume de solução mãe de glicosilamida (ml) pH final 0 .D. a 6 0 0 nm 0 465 35 6, 3g 0, 03g 15 465 35 6, 37 0, 073 100 465 35 6, 2g 0,43g 2 0 mL de cada uma das soluções adjuvantes glicolipídicas foram colocados em frascos de vidro de 30 ml e incubados à temperatura ambiente e a 4o C. Procedeu-se a observações visuais a intervalos regulares. Inicialmente a solução adjuvante glicolipidica com 0 mM de NaCl apresentava-se transparente à vista. A solução adjuvante glicolipidica contendo 15 mM de NaCl encontrava-se ligeiramente turva e apresentava uma D.O. de 0,073 a 600 nm. A solução adjuvante glicolipidica contendo 100 mM de NaCl encontrava-se ligeiramente turva e apresentava uma D.O. de 0,073 a 600 nm. Quadro 9. Nenhuma das soluções adjuvante glicolipídicas revelaram quaisquer sinais de floculação tanto à temperatura ambiente como a 4o C. Estas soluções adjuvantes glicolipídicas foram observadas por um período de um ano sem quaisquer alterações quanto ao aspecto. 43
Exemplo 7. Titulação de uma solução adjuvante glicolipídica estável com NaOH.
Inicialmente obteve-se uma solução adjuvante glicolipídica estável e transparente à vista sem NaOH. A fim de estabelecer que a eliminação ou uso de uma quantidade mínima de NaOH era essencial para prevenir a floculação, é necessário mostrar que uma adição gradual de NaOH induziria a floculação numa mistura glicolipídica que seria estável de contrário. Adicionaram-se volumes apropriados de NaOH 1 N a 15 mL de solução adjuvante glicolipídica sem qualquer NaCl adicionado, como se preparou no quadro 10 abaixo. Aumentou-se gradualmente o NaOH de 1 mM para 12 mM (Quadro 10) A solução adjuvante glicolipídica utilizada nesta experiência foi preparada com a solução mãe de glicosilamida descrita no exemplo 6. Com o aumento da concentração de NaOH na solução adjuvante glicolipídica, o pH da formulação aumentou gradualmente juntamente com o aparecimento de floculação.
Quadro 10. Titulação de uma solução adjuvante glicolipídica estável com NaOH.
Volume de adjuvante glicolipídico Volume de NaOH IN adicionado (mM) pH da solução 15 ml 0 6,21 15 ml 15 μΐ (1 mM) 6,38 15 ml 30 μΐ (2 mM) 6,48 15 ml 60 μΐ (4 mM) 6, 68 15 ml 150 μΐ (10 mM) 7,11 15 ml 750 μΐ (50 mM) 12,17
Exemplo 8. A quantificação do componente glicolipídico utilizando HPLC. 44 A metodologia seguinte foi utilizada na análise por HPLC de Bay 15-583®. Foram aplicados os parâmetros HPLC descritos no quadro 11.
Quadro 11. Resumo dos parâmetros utilizados no método HPLC para a quantificação de Bay 15-5381.
Parâmetro Detalhes Coluna Hamilton PRP-1, 7 mícrones, 250 x 4,6 mm Fluxo 1,5 ml/min Volume de injecção 10 μΐ Comprimento de onda do detector 210 nm Fase móvel A Ácido perclórico 0,4% v: v Fase móvel B Acetonitrilo Gradiente 0 min 40% A / 60% B 15 min 30% A / 70% B 20 min 30% A / 70% B 35 min 10% A/ 90% B 50 min 10% A / 90% B 51 min 40% A Tempo processamento 65 min Tempo de retenção Bay 15-5381 Aproximadamente 25 minutos
Quadro 12. Padrões do Bay 15-5831®.
padrão Concentração 1 0,103 mM 2 0,206 mM 3 0,412 mM 45
4 0,618 mM 5 0,824 mM 6 1,03 mM
Os padrões entre 0,10 e 1,03 mM foram preparados e injectados num HPLC. Encontra-se um resumo dos padrões no quadro 12. As amostras foram aquecidas à temperatura ambiente e invertidas 5 vezes antes da utilização. Um ml de amostra foi adicionado a 6 ml de metanol num balão volumétrico de 10 ml. As amostras foram sonicadas durante 10 minutos e depois foram diluídas até atingir o volume e misturadas. Foi executada uma regressão linear dos padrões com áreas pico registadas relativamente à concentração. As amostras foram depois calculadas comparativamente com a curva.
Exemplo 9. Produção à escala de trinta (30) litros.
Foi preparado um lote de 30 litros da solução adjuvante glicolipidica com uma composição igual à descrita no exemplo 6. Este lote continha 15 mM de NaCl.
Utilizando esta preparação de 30 L, foram elaboradas cinco sub-soluções diferentes com uma concentração crescente de NaOH. A concentração de NaOH aumentou de 0 mM para 1 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM e 12 mM. Recolheram-se aliquotas da amostra de cada concentração de NaOH para medição do pH e observação visual. Com quantidades crescentes NaOH, o pH do adjuvante glicolipidico aumentou conjuntamente com um aumento da floculação. A floculação começou a surgir a uma concentração de 2 mM de NaOH à temperatura ambiente e a 4o C a floculação começou a surgir a 4 mM de NaOH. 46
Quadro 13. Características do lote de 30 L do adjuvante glicolipidico de com concentração crescente de NaOH.
Amostra Descrição Concentração 0. D. a PH N° . medida (mM) 600 nM Amostra 1 15 mM NaCl, 6,21 0,218 6, 42 30 L 0 mM NaOH Amostra 2 15 mM NaCl, 6, 3 0, 137 6, 52 30 L 1 mM NaOH Amostra 3 15 mM NaCl, 6,24 0, 137 6, 59 30 L 2 mM NaOH Amostra 4 15 mM NaCl, 6, 17 0, 15 6, 80 30 L 4 mM NaOH Amostra 5 15 mM NaCl, 6,26 0,129 7,06 30 L 8 mM NaOH Amostra 6 15 mM NaCl, 6, 15 0, 062 7, 54 30 L 12 mM NaOH A quantidade de Bay 15-5381 em todas as seis amostras apresentadas no quadro 13 foi quantificada pelo método HPLC descrito no exemplo 8. As amostras com diferentes pH revelaram a mesma concentração de Bay 15-5381 sugerindo que o componente adjuvante não sofre degradação durante o aumento do pH, com a adição de NaOH e floculação concomitante.
Exemplo 10. Avaliações de estabilidade utilizando ensaios de stress acelerados. Este exemplo descreve os métodos e resultados dos ensaios de stress acelerado na solução adjuvante glicolipídica. Três lotes de soluções adjuvantes glicolipídicas, como descrito no exemplo 6, foram preparadas a uma escala de 500 L. Todos os três lotes 47 apresentavam 15 mM de NaCl e não continham NaOH. As soluções adjuvantes glicolipidicas destes três lotes de 500 L foram utilizadas para estudar a estabilidade do glicolípido, utilizando um ensaio de estabilidade acelerado.
Para o ensaio de stress acelerado, a solução adjuvante glicolipidica foi sujeita a agitação durante sete dias a 37 °C, seguido de agitação a 4o C durante dois dias. Os setes dias de agitação a 37° C representam o envelhecimento a 4o C, durante um ano. A agitação a 4o C durante dois dias representa o stress durante o transporte.
Um conjunto de solução adjuvante glicolipidica foi mantida estática a 37° C durante 7 dias, depois foi agitada a 100 rpm a 4o C durante mais 2 dias. Em quatro momentos, isto é, T = 0, 3, 7 e 9 dias, foram registadas as observações e imagens fotográficas. Em 2 momentos, isto é, T = 0 e 9 dias, foram executadas análises do índice refractivo e dimensão de partícula. O segundo conjunto de solução adjuvante glicolipidica foi agitada a 100 rpm, a 37° C durante 7 dias, depois foi agitada a 100 rpm a 4o C durante mais 2 dias. Em quatro momentos, isto é, T = 0, 3, 7 e 9 dias, foram registadas as observações e imagens fotográficas. Em 2 momentos, isto é, T = 0 e 9 dias, foram executadas análises do índice refractivo e dimensão de partícula. O terceiro conjunto de solução adjuvante glicolipidica foi mantida estática a 4o C durante 9 dias como controlo. Em quatro momentos, isto é, T = 0, 3, 7 e 9 dias, foram registadas as observações e imagens fotográficas. Em 2 48 momentos, isto é, T = 0 e 9 dias, foram executadas análises do índice refractivo e dimensão de partícula. Não se verificaram alterações na dimensão de partícula em resultado do ensaio de stress. Todas as amostras mantiveram uma dimensão de partícula submicrónica, como foi possível observar nas amostras imediatamente depois da sua preparação. Além disso, uma medição HPLC do componente Bay 15-5831® nas amostras mantidas a 4o C ou sujeitas a stress a 37° C durante sete dias não revelou qualquer alteração na quantidade de Bay 15-5831®.
Quadro 15. Quantificação do Bay 15-5831® depois do ensaios de stress. Número do lote da solução adjuvante de glicolipido e tratamento. Concentração medida (mM) Lote 1 - 4o C 6,23 Lote 1 - 37° C Agitação 6,29 Lote 2 - 4o C 6,32 Lote 2 - 37° C Agitação 6,30 Lote 3 - 4o C 6,28 Lote 3 - 37° C Agitação 6,29
No quadro 15, as amostras de controlo foram mantidas a 4o C durante sete dias, enquanto as amostras de ensaio foram agitadas a 37° C durante sete dias. As amostras agitadas a 37° C durante sete dias possuem concentrações similares às guardadas a 4o C.
Exemplo 11. Ensaios viricidas da solução adjuvante de glicolipido.
Foram conduzidos ensaios viricidas na solução adjuvante de glicolipido preparada a uma escala de 30 L, 49 como descrito anteriormente no exemplo 9. Esta solução adjuvante glicolipidica continha 15 mM de NaCl e não continha NaOH. 0 adjuvante glicolipidico foi testado quanto à sua adequação para uso como diluente com vírus vivos modificados. Foram preparados antigénios virais vivos modificados sob a forma de tampão liofilizado. Com a re-hidratação destes tampões com uma solução adjuvante glicolipidica adequada confirmou-se que a solução adjuvante glicolipidica utilizada não mata os vírus modificados. A solução adjuvante glicolipidica foi testada contra três antigénios virais bovinos: 0 vírus sincicial respiratório bovino (Bovine Respiratory Synctial virus - BRSV), vírus da para-influenza tipo 3 (PI3) e vírus da rinotraqueite infecciosa bovina (Infectious Bovine Rhinotrachetis - IBR).
Os tampões virais foram re-hidratados com a solução adjuvante glicolipidica. Depois da incubação à temperatura ambiente (TA) durante 1 hora, as amostras foram colocadas em placas, numa monocamada de uma linhagem de células permissiva com uma diluição em série. Através da contagem do número de tampões virais que aparecem na monocamada, obteve-se o valor da dose infecciosa para 50% da cultura de tecidos por ml (TCID50/ml) para cada antigénio virai re-hidratado com água estéril ou solução adjuvante glicolipidica. Nesta experiência, encarou-se como viricida uma diminuição do título de 0,7 após a re-hidratação com uma solução adjuvante glicolipidica. Os resultados encontram-se apresentados no quadro 16. A solução adjuvante glicolipidica não apresentou qualquer efeito viricida nestes três vírus de bovino. 50
Quadro 16. Experiência viricida da solução adjuvante de glicolípido. Vírus Título original Título final com adjuvante glicolipídico Título final com água estéril Perda de título tsIBR 7,3 ± 7, 08 7,49 0, 42 0, 5 051404 tsPl3 7,6 ± 7, 74 7,49 -0,25 052604 0, 5 BRSV 6,4 ± 6, 57 6, 82 0,25 081103 0, 5
Este exemplo revela que a solução adjuvante glicolipídica pode ser utilizada numa formulação comercial de uma vacina para a saúde animal. Rispoval® contém três doenças virais bovinas diferentes, utilizando 3 antigénios virais modificados. Estes antigénios virais bovinos são o virus do herpes bovino modificado, vírus sincicial respiratório bovino vivo modificado e vírus para-influenza tipo 3 vivo modificado. Estes antigénios virais são produzidos em agregados liofilizados e a solução adjuvante glicolipídica produzida através desta invenção pode ser utilizada como solução diluente para estes antigénios. 0 glicolípido utilizado foi o acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino^-D-gulucopiranosil) -N-octadecildodecanoilamida.
Os exemplos são apresentados para ilustrar a presente invenção. Estes não devem ser considerados como limitativos do âmbito da invenção. Será evidente para os peritos na 51 51 outras técnica muitas alterações, variações, modificações utilizações e aplicações da presente invenção. 52
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.
Patentes de invenção citadas na descrição « US 48552S3 A [0005] [0014] [0019] , OE 3213550 [0023] [0S24Í * US 5290S71 B [0014]
Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição O LOGKHOFF, Angew. Cf»m. fnf. Ed. Erigi., 1981, VOS. 30, 1811-1620 [0005] - M. BERGMANN ; L. ZERVAS. Ser,, 1931, voi. «4, 975 [0023] • D. NORTON. J. Org. Chem., 1964, voi. 29, 1776 [0023] • P. H. GROSS ; R. W. JEAMLOZ, J. Org. CItsm.. 1967. voi. 32, 2750 [0023] ' M.L, WOLFROM; Η. B.8HAT. J. Org. Ctmn., 1987, voi. 32, 1821 [0023]
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Syriífisse von Pepíitisn. E. WUNSCH et ai. Meth-oden der 0¾. Chemie. Thtetne, 1874 [0030]

Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição que compreende: a) um glicolípido da fórmula I, em que a fórmula I é
em que R1 e R2 são independentemente hidrogénio ou um radical alquilo saturado com até 20 átomos de carbono; X é -CH2-, -O- ou NH-; R3, R4 e R5 são independentemente hidrogénio -S042~, -P042-, -COalquiloCi-10; R6 é L-alanil, L-alfa-aminobutilo, L-arginil, L-asparginil, L-aspartil, L-cisteinil, L-glutamil, L-glicil, L- histidil, L-hidroxipropil, L-isoleucil, L-leucil, L-lisil, L-metionil, L-omitinil, L-fenilalanil, L-prolil, L-seril, L-treonil, L-tirosil, L-triptofanil e L-valil ou os respectivos isómeros D; sob a forma de um sal, em que a forma salina é derivada de um ácido fraco; b) um álcool em que o álcool é HO-alquiloCi-3; c) um ácido fraco, em que o ácido fraco é, 1) uma quantidade entre 1,25 e 5,0 vezes a quantidade do glicolípido em equivalentes molares relativamente ao glicolípido e 2 2) qualquer ácido com um índice pKa (o -log de Ka) entre cerca de 1,0 e cerca de 9,5, utilizando tabelas ou valores padrão. d) um surfactante não iónico, em que o surfactante não iónico é um agente que reduz a tensão superficial do material em que se encontra dissolvido e possui um componente que é hidrofóbico e outro componente que é hidrofílico.
2. Composição da reivindicação 1 em que o glicolípido é um composto da fórmula II (a)
Fórmula II(a) e o ácido fraco é selecionado de entre um ou qualquer combinação dos seguintes ácidos fracos, ácido acético, H (C2H302) (pKa 4,76); ácido ascórbico (1), H2 (C6H606) (pKa 4,10); ácido acetilsalicílico, H8(C904), (pKa 3,5); ácido butanóico H(C4H702) (pKa 4,83); ácido carbónico, H2C03, (pKa 4,83, forma 1); ácido crómico, HCrCq” (pKa 6,49, forma 2); ácido cítrico, H3(C5H507), (pKa 3,14, forma 1); ácido cítrico, (H2C6H507)“, (pKa 4,77, forma 2); ácido cítrico, (HC6H507)=, (pKa 6,39, forma 3); ácido fórmico, H(CH02), (pKa 3,75); ácido fumárico, fMC^) (pKa 3,03); ácido heptanóico, H (C7Hi302) , (pKa 4,89); ácido hexanóico, H(C6Hn02), (pKa 3 4,84); ácido fluorídrico, HF, (pKa 3,20); isocitrato, H8 (C607) (pKa 3,29); ácido láctico, H (C3H503) , (pKa 3,08); ácido maleico, H4 (C404) (pKa 1,83); ácido nicotinico, H5(C6N02) (pKa 3,39); ácido oxálico, H2 (C204) , (pKa 1,23 forma 1); ácido oxálico, (HC204)~, (pKa 4,19 forma 2); ácido pentanóico, H(C5H902), (pKa 4,84); ácido fosfórico, H3P04, (pKa 2,16, forma 1); ácido propanóico, H(C3H502), (pKa 4,86); ácido pirúvico, H4 (C303) (pKa 2,39) e ácido succinico H6(C404) (pKa 4,19) .
3. Composição da reivindicação 2 em que o glicolipido é um composto da fórmula II (b)
alqu.il C1-7 Fórmula 11(b) e o ácido fraco é selecionado de entre um ou qualquer combinação dos seguintes ácidos fracos: ácido acético, ácido acetilsalicilico; ácido cítrico, ácido fórmico; ácido fumárico, ácido fluorídrico, isocitrato; ácido maleico, ácido nicotinico; ácido fosfórico, ácido pirúvico e ácido succinico. 4
4. Composição da reivindicação 3, em que o glicolipido é acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-β-D- glucopiranosil)-N-octadecildodecanamida com uma estrutura da fórmula III:
Formula III e o ácido fraco é ácido acético.
5. Composto da reivindicação 2 em que o ácido fraco é seleccionado do grupo constituído por: ácido acético, ácido acetilsalicílico; ácido cítrico, forma 1; ácido cítrico, forma 2; ácido cítrico, forma 3; ácido fórmico; ácido fumárico, ácido fluorídrico, isocitrato; ácido maleico, ácido nicotínico; ácido fosfórico, forma 1, ácido pirúvico e ácido succínico.
6. Composto de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o referido ácido fraco se encontra numa quantidade superior, multiplicada pelos valores indicados, relativamente ao equivalente molar do glicolipido; a) 1,25 vezes maior, b) 2,0 vezes maior, c) 2,5 vezes maior, d) 2,7 vezes maior, 5 e) 3,0 vezes maior, equivalente molar do f) 5,0 vezes maior, relativamente à quantidade glicolípido.
7. Composto de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que o álcool é um álcool etilico.
8. Composto de qualquer uma das reivindicações 1-7, em que o referido surfactante não iónico é selecionado de qualquer ou de uma combinação do grupo constituído por: monolaurato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, triestearato de sorbitano, monooleato de sorbitano, trioleato de sorbitano, monolaurato de polioxietilenossorbitano, monopalmitato de polioxietilenossorbitano, monoestearato de polioxietilenossorbitano, monooleato de polioxietilenossorbitano, trioleato de polioxietilenossorbitano e outros sorbitanos e polioxietilenossorbitanos vulgarmente utilizados em vacinas.
9. Composto da reivindicação 1, em que o ácido fraco é ácido acético e ainda em que o ácido acético se encontra numa quantidade que é 2,0 vezes maior do que a quantidade equivalente molar do glicolípido.
10. Composto da reivindicação 1, em que o ácido fraco apresenta um índice pKa (o -log de Ka) entre 1,23 e 6,49, utilizando tabelas ou valores padrão. 6
11. Composição que compreende: a) um glicolípido da fórmula I, em que a fórmula I é
em que R1 e R2 são independentemente hidrogénio ou um radical alquilo saturado com até 20 átomos de carbono; X é -CH2-, -O- ou NH-; R3, R4 e R5 são independentemente hidrogénio -S042~, -P042~, -COalquiloCi-io; R6 é L-alanil, L-alfa-aminobutil, L-arginil, L-asparginil, L-aspartil, L-cisteinil, L-glutamil, L-glicil, L-histidil, L-hidroxipropil, L-isoleucil, L-leucil, L-lisil, L-metionil, L-ornitinil, L-fenilalanil, L-prolil, L-seril, L-treonil, L-tirosil, L-triptofanil e L-valil ou os respectivos isómeros D; sob a forma de um sal, em que a forma salina é derivada de um ácido fraco, b) um álcool em que o álcool é HO-alquiloCi-3; c) um ácido fraco, em que o ácido fraco 1) perfaz uma quantidade entre 1,25 e 5,0 a quantidade: do glicolípido, em equivalentes molares relativamente ao glicolípido e 7 2) qualquer ácido com um índice pKa (o -log de Ka) entre cerca de 1,0 e cerca de 9,5, utilizando tabelas ou valores padrão. d) um surfactante não iónico, em que o surfactante não iónico é um agente que reduz a tensão superficial do material em que se encontra dissolvido e possui um componente que é hidrofóbico e outro componente que é hidrofílico; e e) um tampão aquoso, em que o tampão adequado é adequado para uso em vacinas e pode manter o pH dos outros ingredientes entre pH 6 e 8, desde que não se utilize mais de 50 mM de NaCl.
12. Composto da reivindicação 11, em que o pH da solução é ajustado a um pH relativamente constante numa solução aquosa entre 6 e 7 e o tampão é seleccionado do grupo constituído por tampões fosfato com um de ou ambos sais monobásico e dibásico de fosfato de sódio e/ou fosfato de potássio em proporções iguais ou diferentes.
13. Composto de acordo com a reivindicação 11, em que é o referido tampão é seleccionado do grupo constituído por: a) ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico (também conhecido como MES); b) ácido 3-(N-morfolino)propanossulfónico (também conhecido como MOPS); c) ácido n-[tris(hidroximetil)]-2-aminoetanossulfónico (também conhecido como TES) ; d) ácido 4-(2-hidroxetil)piperazina-l-etanossulfónico (também conhecido como HEPES) e e) ácido [tris(hidroximetil)metil]glicina (também conhecido como TRIS); ou qualquer combinação dos mesmos.
14. Composto de qualquer uma das reivindicações 1-13 compreendendo ainda um antigénio seleccionado do grupo ou qualquer combinação destes, consistindo no vírus do herpes bovino vivo modificado, vírus sincicial respiratório bovino vivo modificado e vírus para-influenza tipo 3 vivo modificado.
15. Composição que compreende: a) acetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-p-D-gulucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida com uma estrutura da fórmula III:
Fórmula III b) etanol; c) ácido acético, em que o ácido acético se encontra numa quantidade entre 1,25 e 5,0 vezes a quantidade do glicolípido em equivalentes molares relativamente ao glicolípido; d) surfactante não iónico, seleccionado de entre; monolaurato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, 9 triestearato de sorbitano, monooleato de sorbitano, trioleato de sorbitano, monolaurato de polioxietilenossorbitano, monopalmitato de polioxietilenossorbitano, monoestearato de polioxietilenossorbitano, monooleato de polioxietilenossorbitano, trioleato de polioxietilenossorbitano, e) um tampão aquoso, em que o pH da solução é ajustado a um pH relativamente constante, numa solução tampão aquosa entre 6 e 7 e o tampão é seleccionado do grupo de; a) ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico (também conhecido como MES; b) ácido 3-(N-morfolino)propanossulfónico (também conhecido como MOPS); c) ácido n-[tris(hidroximetil)]-2- aminoetanossulfónico (também conhecido como TES); d) ácido 4-(2-hidroxetil)piperazina-l-etanossulfónico (também conhecido como HEPES) e e) ácido [tris(hidroximetil)metil]glicina (também conhecido como TRIS); ou qualquer combinação destes, desde que não seja utilizado mais de 15 mM de NaCl; e f) um antigénio que consiste essencialmente no virus do herpes bovino modificado, virus sincicial respiratório bovino vivo modificado e virus para-influenza tipo 3 vivo modificado.
16. Processo de preparação de uma composição compreendendo a mistura dos seguintes: a) um glicolipido da fórmula I; 10 b) um álcool em que o álcool é HO-alquiloCi-3; c) um ácido fraco, em que o ácido fraco é, 1) uma quantidade entre 1,25 e 5,0 vezes a quantidade do qlicolípido em equivalentes molares relativamente ao glicolípido e 2) qualquer ácido com um índice pKa (o -log de Ka) entre cerca de 1 e cerca de 9,5, utilizando tabelas ou valores padrão; e d) um surfactante não iónico.
17. Processo de preparação de uma composição compreendendo a mistura dos seguintes: a) um glicolípido da fórmula I; b) um álcool em que o álcool é HO-alquiloCl-3; c) um ácido fraco, em que o ácido fraco é, 1) uma quantidade entre 1,25 e 5,0 vezes a quantidade do glicolípido em equivalentes molares relativamente ao glicolípido e 2) qualquer ácido com um índice pKa (o -log de Ka) entre cerca de 0,7 e cerca de 9,5, utilizando tabelas ou valores padrão. d) um surfactante não iónico; seguido da adição de e) um tampão adequado.
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