PT1732949E

PT1732949E - Métodos de tratamento da dor associada ao cancro ósseo através da administração de um antagonista do factor de crescimento nervoso

Info

Publication number: PT1732949E
Application number: PT05777592T
Authority: PT
Inventors: David L Shelton; Mantyh Patrick William
Original assignee: Univ Minnesota; Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2004-04-07
Filing date: 2005-04-07
Publication date: 2010-03-23
Also published as: HK1111425A1; HUE037549T2; EP3372614A1; EP2206728B1; IL178226A0; EP1732949A2; JP2008500970A; NO343065B1; EP3372614B1; EP2206728A1; KR20120123621A; MXPA06011463A; JP2012229238A; KR101504729B1; SI2206728T1; US20050265994A1; US20080081040A1; EP1732949B1; SI1732949T1; US8557245B2

Description

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Descrição "Métodos de tratamento da dor associada ao cancro ósseo através da administração de um antagonista do factor de crescimento nervoso"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito à utilização de um anticorpo antagonista do Factor de Crescimento Nervoso (NGF) para prevenção, atenuamento ou tratamento da dor associada ao cancro ósseo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 Factor de Crescimento Nervoso (NGF) foi a primeira neurotrofina a ser identificada, e o seu papel no desenvolvimento e sobrevivência dos neurónios periféricos e centrais foi já bem caracterizado. Comprovou-se que o NGF é um factor crítico para a sobrevivência, manutenção e desenvolvimento de neurónios simpáticos periféricos e de neurónios sensoriais embrionários, e dos neurónios colinérgicos do cérebro anterior (Smeyne, et al., Nature 368: 246-249 (1994); Crowley, et al., Cell 76:1001-1011 (1994)) . -Ι Ο NGF regula positivamente a expressão de neuropéptidos nos neurónios sensoriais (Lindsay, et al., Nature 337:362-364 (1989)) e a sua actividade é mediada por dois receptores diferentes ligados a membranas, o receptor tirosina cinase TrkA e o receptor p75, estruturalmente relacionado com outros membros da familia de receptores do factor de necrose tumoral (Chao, et al., Science 232:518-521 (1986)). Além dos seus efeitos no sistema nervoso, o NGF tem vindo a ser implicado em processos externos ao sistema nervoso. Por exemplo, concluiu-se que o NGF optimiza a permeabilidade vascular em ratos (Otten, et al., Eur. J. Pharmacol. 106:199-201 (1984)), optimiza as respostas imunológicas das células T e B (Otten et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10059-10063 (1989)), induz a diferenciação linfocitária e a proliferação de mastócitos e provoca a libertação de sinais biológicos solúveis dos mastócitos (Matsuda, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:6508-6512 (1988), Pearce, et al., J. Physiol. 372: 379-393 (1986), Bischoff, et al., Blood 79:2662-2669 (1992), Horigome, et al., J. Biol. Chem., 268: 14881-14887 (1993)). Embora se tenha concluído que o NGF exogenamente adicionado provoca todos estes efeitos, é importante salientar que ainda não foi totalmente comprovado que o NGF endógeno é importante em qualquer um destes processos in vivo (Torcia et al., Cell. 85(3):345-56 (1996)). Assim, não é claro qual seria o efeito provocado pela inibição da bioactividade do NGF endógeno. -3- 0 NGF é produzido por vários tipos de células, incluindo os mastócitos (Leon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 3739-3743 (1994)), os linfócitos B (Torcia et al., Cell 85:345-356 (1996), os queratinócitos (Di Marco, et al., J. Biol. Chem. 268:22838-22846), as células dos músculos lisos (Ueyama, et al., J. Hypertens., 11:1061-1065 (1993)), os fibroblastos (Lindholm, et al., Eur. J. Neurosci., 2:795-801 (1990)), as células epiteliais brônquicas (Kassel, et al., Clln. Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), células renais mesangiais (Steiner, et al., Am. J. Physiol. 261:F792—798 (1991)) e miotubos do músculo esquelético (Schwartz, et al., J. Photochem. Photobiol. B 66:195-200 (2002). Os receptores do NGF foram detectados em vários tipos de células externas ao sistema nervoso. Por exemplo, a presença do TrkA foi detectada nos monócitos, nos linfócitos T e B2 e nos mastócitos humanos.

Foi observada uma associação entre níveis aumentados de NGF e várias condições inflamatórias, em pacientes humanos e em vários modelos animais. Tais condições incluem o lúpus eritematoso sistémico (Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), esclerose múltipla (Bracci-Laudiero, et al., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), psoríase (Raychaudhuri, et al., Acta Derm. venereol. 78:84-86 (1998)), artrite (Falcimi, et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), cistite intersticial (Okragly, et al., J. -4-

Urology 161:438-441 (1991)), asma (Braun, et al., Eur. J.

Immunol. 28 :3240-3251 (1998)), pancreatite e prostatite. Sistematicamente, um nível elevado do NGF nos tecidos periféricos é associado à inflamação e tem sido observado em várias formas de artrite. O líquido sinovial de pacientes afectados pela artrite reumatóide apresenta elevados níveis de NGF, enquanto que em líquido sinovial não inflamado, o NGF não foi detectado (Aloe, et al., Arch. Rheum. 35:351-355 (1992)). Resultados semelhantes foram registados em ratos com artrite reumatóide induzida (Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992), Halliday et al., Neurochem. Res. 23:919-22 (1998)). Níveis elevados de NGF foram registados em ratos transgénicos artríticos, juntamente com um aumento no número de mastócitos (Aloe, et al., J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)) .

Tratamento com NGF endógeno conduz a um aumento da dor e da sensibilidade à dor. Tal facto é comprovado pelo facto de aquela injecção de NGF conduzir a um aumento significativo da dor e da sensibilidade à dor em modelos animais (Lewin et al., J. Neurosci. 13:2136-2148 (1993), Amann, et al.,

Pain 64, 323-329 (1996), Andreev, et al., Pain 63, 109-115 (1995) e humanos (Dyck, et al., Neurology 48, 501-505 (1997), Petty, et al., Annals Neurol. 36, 244-246 (1994)). O NGF parece actuar através de múltiplos mecanismos que incluem a indução da neurotrofina BDNF (Apfel, et al., Mol. -5-

Cell. Neurosci. 7(2), 134-142 (1996), Michael, et al., J. Neurosci. 17, 8476-8490 (1997)) que, por sua vez, altera o processamento dos sinais de dor na espinal medula (Hains, et al., Neurosci. Lett. 320(3), 125-8 (2002), Milletic, et al., Neurosci. Lett. 319(3), 137-40 (2002), Thompson, et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 96(14), 7714-8 (1999)), induzindo alterações nas ligações periféricas e centrais dos neurónios sensoriais e outros neurónios transmissores da dor na medula espinal (Lewin, et al., European Journal of Neurosclence 6, 1903-1912 (1994), Thompson, et al., Pain 62, 219-231 (1995)), induzindo alterações no crescimento axonal (Lindsay, R.M., J. Neurosci. 8(7), 2394-405 (1998)), induzindo a expressão do receptor bradicinina (Peterson et al., Neurosclence 83:161-168 (1998)), induzindo alterações na expressão de genes responsáveis pela activação e condução nervosa, tal como os canais iónicos (Boettger, et al., Brain 125 (Pt 2), 252-63 (2002), Kerr, et al., Neuroreport 12(14), 3077-8 (2001) , Gould, et al., Brain Res. 854 (1- -2), 19-29 (2000), Fjell, et al. , J.

Neurophysiol. 81:803-810 (1999)), potenciando o receptor relacionado com a dor trpv (Chuang, et al., Nature 411 (6840), 957-62 (2001), Shu e Mendell, Neurosci. Lett. 274:159-162 (1999) e provocando alterações patológicas nos músculos (Foster, et al., J. Pathol. 197(2), 245-55 (2002)). Muitas destas alterações ocorrem directamente nos neurónios sensoriais transmissores da dor e aparentemente -6- não dependem de inflamação concomitante. Além disso, existem pelo menos dois outros tipos de células que respondem ao NGF e que podem estar envolvidos nas alterações da sensação ou sensibilidade à dor. As primeiras destas células (os mastócitos) parecem responder ao NGF com desgranulação (Yan, e tal., Clin. Sei. (Lond) 80:565-569 (1991)) ou, noutros estudos, parecem provocar ou aumentar a produção de mediadores ou a libertação em colaboração com outros agentes (Pearce e Thompson, J. Physiol. 372:379-393 (1986), Kawamoto et al., J Immunol. 168:6412-6419 (2002)). Foi claramente comprovado no rato que as respostas à dor mediadas pelo NGF são, pelo menos parcialmente mediadas por mastócitos (Lewis, et al., Eur. j. Neurosci. 6:1903-1912 (1994), Woolf, et al., J. Neurosci. 16:2716-2723 (1996), embora a potencial relevância deste facto permaneça ainda indeterminada em seres humanos. Os neurónios simpáticos primários também são conhecidos por responder ao NGF e por estarem envolvidos na sinalização da dor (Aley, et al., Neuroscience 71:1083-1090 (1996)). É óbvio que a remoção da inervação simpática modifica a hiperalgesia normalmente verificada em resposta ao tratamento com NGF (Woolf, et al., J. Neurosci. 16:2716-2723 (1996)).

Foi já descrito o uso de antagonistas do NGF, como o anticorpo anti-NGF, no tratamento de vários tipos de dor. Veja-se, por exemplo, as patentes de invenção norte- americanas n.os 10/682331, 10/682638, 10/682332 (Pub. n. -7- 2004/0131615), 10/783730 (Pub. n.° 2004/0253244), 10/745775 (Pub. n.° 2004/0237124), 10/791162, PCT/US03/32089 (WO 04/032870), PCT/US03/32083 (WO 2005/000194), PCT/US03/32113, PCT/US2004/05162 (WO 04/073653), PCT/US03/41252 (WO 04/058184). A dor associada ao cancro ósseo pode surgir nos seres humanos a partir de tumores ósseos primários ou, mais frequentemente, a partir de metástases ósseas (tais como a partir de carcinomas da mama, próstata e pulmão). Veja-se Luger et ai., Pain 99:397-406 (2002). Desenvolveu-se um modelo de dor associada ao cancro ósseo em rato, e este modelo de dor espelha a dor registada em seres humanos com dor associada ao cancro ósseo moderada a avançada. Veja-se Luger et al., Pain 99:397-406 (2002), Clohisy et ai., Clinicai Orthopaedics and Related Research 415S:S279-S288 (2003), Schwel et al., J. Neurosci. 19:10886-10897 (1999), Honore et ai., Nat. Med. 6: 521-529 (2000). Estudos por Honore et ai. e Schwei et al. referem que a assinatura neuroquimica das alterações observadas na medula espinal e o GDH de animais detentores de cancro ósseo é único e distinguível da típica dor inflamatória ou neuropática, embora neste modelo aparentemente existam componentes com uma assinatura bioquímica idêntica para os estados de dor inflamatória e neuropática clássicas. Honore et ai., J. Neurosci.

Neuroscience 98:585-598 (2000), Schwei et al., -8- 19:10886-10897 (1999), Luger et ai., Pain 99:397-406 (2002) .

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por base a descoberta de que os antagonistas do NGF, tais como um anticorpo anti-NGF, são eficazes no tratamento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea. O tratamento aborda um ou mais aspectos da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea, conforme descrito.

Num aspecto, a invenção descreve o uso de um anticorpo antagonista anti-NGF na produção de um medicamento destinado à prevenção ou tratamento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea (também designada de "dor metastática óssea"). Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um anti-inflamatório não esteróide (ΑΙΝΕ). Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide e com um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti- NGF não deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. -9-

Num outro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um anticorpo antagonista anti-NGF na produção de um medicamento destinado a reduzir a incidência da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea, a atenuar a dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea, a aliviar a dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea e/ou a protelar o desenvolvimento ou progressão da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea num indivíduo. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide e com um αίνε. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ.

Nalgumas variantes, a dor associada ao cancro ósseo deriva de um cancro originado no osso. Nalgumas variantes, a dor associada ao cancro ósseo deriva de um osteosarcoma. Nalgumas variantes, a dor associada ao cancro ósseo advém de um cancro metastizado para os ossos. Nalgumas variantes, a metástase óssea deriva do cancro da próstata metastizado -10- para o osso. Nalgumas variantes, a metástase óssea deriva do cancro da mama metastizado para o osso. Nalgumas variantes, a metástase óssea deriva de um cancro do pulmão metastizado para o osso. Nalgumas variantes, a metástase óssea consiste num sarcoma metastizado para o osso. Nalgumas variantes, a metástase óssea deriva de um cancro dos rins metastizado para o osso. Nalgumas variantes, a metástase óssea deriva de um mieloma múltiplo metastizado para o osso. Nalgumas variantes, a dor oncológica tratada é ligeira a aguda.

Um anticorpo antagonista anti-NGF adequado para utilização na invenção podem directa ou indirectamente resultar na redução da actividade biológica do NGF. Nalgumas variantes, um anticorpo antagonista anti-NGF liga-se (interage fisicamente com) o NGF. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF liga-se ao NGF (por exemplo, hNGF) e não se liga significativamente a outras neurotrofinas associadas, como NT-3, NT4/5 e/ou BDNF. Noutras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é humanizado (por exemplo, sob a forma do anticorpo E3 descrito). Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é o anticorpo E3 (conforme descrito). Noutras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é o anticorpo E3 (conforme descrito). Noutras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF inclui uma ou mais CDR' s do anticorpo E3 (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco ou, nalgumas variantes, as seis CDR's do E3). -11-

Noutras variantes, o anticorpo é humano. Nalgumas variantes, o anticorpo inclui três CDR's da cadeia longa do E3. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF inclui a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada apresentada no Quadro 1 (SEQ ID N0:1). Ainda em outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF inclui a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve apresentada no Quadro 2 (SEQ ID N0:2). Ainda em outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF inclui a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada apresentada no Quadro 1 (SEQ ID N0:1) e a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve apresentada no Quadro 2 (SEQ ID N0:2). Noutras variantes, o anticorpo inclui uma região constante modificada, como sendo uma região constante imunologicamente inerte, por exemplo, não despoleta a lise mediada pelo complemento, ou não estimula a citotoxicidade mediada por células e dependente do anticorpo (ADCC). Noutras variantes, a região constante é modificada conforme descrito in Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624, no pedido de patente de invenção n.° PCT/GB99/01441 e/ou no pedido de patente inglesa n.° 9809951.8.

Noutras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF liga-se especificamente ao NGF (por exemplo, NGF humano). Noutras variantes, o anticorpo liga-se essencialmente ao mesmo epítopo 6 do NGF como um anticorpo seleccionado de um ou -12- mais dos seguintes anticorpos monoclonais murinos: MAb 911, MAb 912 e MAb 938 (Veja-se Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Nalgumas variantes, o antagonista NGF liga-se ao receptor trkA. O anticorpo antagonista anti-NGF pode ser um anticorpo monoclonal NGF anti-humano (anti-hNGF) com a capacidade de se ligar ao hNGF e inibir eficazmente a ligação do hNGF ao TrkA humano (hTrkA) e/ou inibir eficazmente a activação do receptor TrkA humano. A afinidade de ligação a um anticorpo anti-NGF ao NGF (tal como o hNGF) pode ser de cerca de 0,10 a cerca 1,0 nM, de cerca de 0,10 nM a cerca de 0,80 nM, de cerca de 0,15 a cerca de 0,75 nM e de cerca de 0,18 a cerca de 0,72 nM. Noutra variante, a afinidade de ligação situa-se entre cerca de 2 pM e 22 pM. Numa variante, a afinidade de ligação é de cerca de 10 nM. Noutras variantes, a afinidade de ligação é de cerca de 0,1 nM ou de cerca de 0,07 nM. Noutras variantes, a afinidade de ligação é qualquer uma entre cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM ou cerca de 50 pM até qualquer uma entre cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM ou cerca de 40 pM. Nalgumas variantes, a afinidade de ligação é de cerca de 100 nM, é de cerca de 50 nM, é de cerca de 10 nM, é de cerca de 1 nM, é de cerca de 500 pM, é de cerca de 100 pM ou é de cerca de 50 pM, ou inferior a cerca de 50 pM. Nalgumas variantes, a afinidade de ligação é inferior a -13- cerca de 100 nM, de cerca de 50 nM, de cerca de 10 nM, de cerca de 1 nM, de cerca de 500 pM, de cerca de 100 pM ou de cerca de 50 pM. Noutras variantes, a afinidade de ligação é de cerca de 2 pM, de cerca de 5 pM, de cerca de 10 pM, de cerca de 15 pM, de cerca de 20 pM, de cerca de 40 pM ou

superior a cerca de 40 pM. Como é do conhecimento dos especialistas da arte, a afinidade de ligação pode ser expressa em KD, ou constante de dissociação, e uma maior afinidade de ligação corresponde a um KD reduzido. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal anti-NGF 911 murino (Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000) ao NGF humano é de cerca de 10 nM, e a afinidade de ligação do anticorpo anti-NGF E3 humanizado (descrito na presente invenção) ao NGF humano é de cerca de 0,07 nM. As afinidades de ligação do anticorpo 911 e E3 foram medidas usando os seus fragmentos Fab (antigen binding fragment) . O anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado antes, durante e/ou depois de o indivíduo ter sido diagnosticado com cancro ósseo ou o cancro ter metastizado para o osso. A administração de um anticorpo antagonista anti-NGF pode ser realizada através das vias conhecidas, incluindo a administração oral, intravenosa, subcutânea, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intra-espinal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular, sublingual e/ou transdérmica. Nalgumas variantes, a administração é realizada através de uma ou mais das -14- seguintes vias: intravenosa, subcutânea, por inalação, intra-arterial, intramuscular, intracardiaca, intraventricular e intraperitoneal. A administração pode ser sistémica, por exemplo intravenosa, ou local.

Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é administrado numa dose de cerca de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, e noutras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é administrado numa dose de cerca de 0,3 a 2,0 mg/kg de peso corporal.

Noutro aspecto, a invenção inclui uma composição destinada ao tratamento e/ou prevenção da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea, que inclui uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um analgésico opióide nem com um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF liga-se especificamente à molécula do NGF.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS -15- Ά Figura 1 diz respeito a um gráfico que representa a dor prolongada conforme avaliada através de tensão espontânea e tremor espontâneo durante um período de observação de 2 minutos nos 10.° e 14.° dias após injecção de sarcoma. "Simples" refere-se a animais sem qualquer injecção. "Falso + veie." refere-se a animais injectados com um meio α mínimo essencial na cavidade medular do fémur e, posteriormente, injectados com soro fisiológico. "Sare. + veie." refere-se a animais injectados com sarcoma na cavidade medular do fémur e posteriormente injectados com soro fisiológico. "Sare. + Anti-NGF" refere-se a animais injectados com sarcoma na cavidade medular e posteriormente injectados com anticorpo 911 anti-NGF. A Figura 2 é um gráfico que representa a dor em ambulatório conforme avaliada através do registo do uso dos membros e tensão ambulatória forçada (rota-rod) nos 10.° e 14.° dias após injecção de sarcoma. "Simples" refere-se a animais sem qualquer injecção. "Falso + veíc." refere-se a animais injectados com um meio α mínimo essencial na cavidade medular do fémur e, posteriormente, injectados com soro fisiológico. "Sare. + veíc." refere-se a animais injectados com sarcoma na cavidade medular do fémur e posteriormente injectados com soro fisiológico. "Sare. + Anti-NGF" refere-se a animais injectados com sarcoma na cavidade medular e posteriormente injectados com anticorpo 911 anti-NGF. -16- A Figura 3 é um gráfico que representa a dor induzida pelo toque, conforme avaliada através do registo de tensão induzida pela palpação e tremor induzido pela palpação durante um período de observação de 2 minutos nos 10.° e 14.° dias após a injecção de sarcoma. "Simples" refere-se a animais sem qualquer injecção. "Sham + veie." refere-se a animais injectados com um meio α minimo essencial na cavidade medular do fémur e, posteriormente, injectados com soro fisiológico. "Sare. + veie." refere-se a animais injectados com sarcoma na cavidade medular do fémur e posteriormente injectados com soro fisiológico. "Sare. + Anti-NGF" refere-se a animais injectados com sarcoma na cavidade medular e posteriormente injectados com anticorpo 911 anti-NGF. A Figura 4 apresenta fotografias que demonstram que o anticorpo anti-NGF não teve qualquer efeito sob a progressão da doença no osso ao 14.° dia (dl4) após a injecção de tumor. Os animais sham (n=8), aos quais se administrou um veiculo (sham + veículo), são apresentados em (a) e (d), os animais injectados (n=13) com sarcoma (transfectados com gfp), aos quais foi administrado um veículo (sarcoma + veículo) são apresentados em (b) e (e), e os animais injectados (n=8) com sarcoma (transfectados com GFP), aos quais foi administrado o anticorpo anti-NGF (sarcoma + anti-NGF), são apresentados em (c) e (f). As

Figuras 4a, 4b e 4c são radiografias que mostram a presença -17- ou ausência de destruição óssea. As Figuras 4d, 4e e 4f são fotografias que mostram ensaio de coloração imunológica ("immunostaining") com anticorpo anti-GFP. Escala das barras: 1 mm. A Figura 5 mostra fotografias que comprovam que o tratamento com anticorpo anti-NGF não teve qualquer efeito observável sobre a inervação sensorial da pele. As amostras de pele de patas traseiras dos ratos injectados com sarcoma (a, b) e simples (c, d) foram manchados sujeitos a coloração imunológica quanto à presença de péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), que marca as fibras nervosas sensoriais amielinizadas. É apresentada a marcação do CGRP das amostras de pele das patas traseiras dos ratos injectados com sarcoma e tratados com veiculo (a, n=3), dos ratos injectados com sarcoma e tratados com anticorpo anti-NGF (b, n=8), dos ratos simples e tratados com veiculo (c, n=8) e dos ratos simples e tratados com anticorpo anti-NGF (d, n=8). Escala das barras: 50 pm. A Figura 6 mostra gráficos que comprovam que o tratamento com anti-NGF atenuou a dor associada ao cancro ósseo. O tempo passado em tensão e o número de tremores espontâneos do membro em que se injectou o sarcoma, ao longo de um periodo de observação de 2 minutos, foi usado como medição da dor continua nos 8.°, 10.°, 12.° e 14.° dias após injecção, e confinamento das células do sarcoma ao fémur esquerdo (a, b). Os parâmetro da dor evocada pelo movimento -18- incluíram a quantificação do tempo passado em tensão e o número de tremores ao longo de um periodo de observação de 2 minutos, após palpação normalmente inofensiva do fémur injectado com sarcoma (c, d). "#" indica P<0,05 vs. sham + veiculo, e indica P<0,05 vs. sarcoma + veiculo. A Figura 7 apresenta gráficos que comprovam que o tratamento com anti-NGF não teve qualquer efeito sobre os limiares térmicos ou mecânicos de referência e não apresentou maior eficácia do que a morfina (MS) na redução da dor associada ao cancro ósseo. As Figuras 7a e 7b mostram a sensibilidade térmica (a, n=8 em ratos simples+veiculo, n=8 em ratos simples+anti-NGF) medida mediante latência da retirada da pata perante estímulo térmico, e a sensibilidade mecânica (b, n=8 em ratos simples+veiculo, n=8 em ratos simples+anti-NGF) medida mediante limiar de 50% de estímulo mecânico do tratamento com anti-NGF (10 mg/kg, i.p., a cada 5 dias) em ratos simples. As Figuras 7c e 7d mostram os comportamentos de dor contínua avaliados mediante registo de tensão espontânea (c) ao longo de um periodo de observação de 2 minutos, e mediante dor evocado por movimento, avaliada mediante a medição do tempo passado em tensão (d) durante um período de observação de 2 minutos seguida de palpação normalmente inofensiva do fémur distai. São apresentados os valores da tensão espontânea (c) e da tensão induzida por palpação (d) em ratos simples, sham e tratados com veiculo, -19-

injectados com sarcoma e tratados com morfina (n=8, 10 mg/kg i.p. administrados 15 minutos antes do teste) , injectados com sarcoma e tratados com morfina (n=8, 30 mg/kg i.p. administrados 15 minutos antes do teste) e injectados com sarcoma e tratados com anticorpo anti-NGF (η=8, 10 mg/kg i.p. administrados do 6.° ao 14.° dias após a injecção de tumor). As barras de erro representam E.P.M. "#" indica P<0,05 vs. sham + veiculo (n=8), indica P<0,05 vs. sarcoma + veiculo, e "+" indica P<0,05 vs. sarcoma + morfina. A Figura 8 mostra fotografias que demonstram que o tratamento com anticorpo antagonista anti-NGF reduziu as alterações neuroquímicas e a infiltração de macrófagos nos gânglios das raizes dorsais (DRG) dos animais portadores de tumores. As Figuras 8a e 8b mostram a coloração imunofluorescente do factor 3 activador da transcrição (ATF-3) no DRG da L2 ipsilateral de animais com tumores tratados com veículo (a, n=8) e tratados com anticorpo anti-NGF (b, n=8) catorze dias após a implantação do tumor. O painel inferior mostra a coloração imunofluorescente de CD-68 que indica a densidade de macrófagos activados e infiltrados em redor dos neurónios sensoriais lesionados no interior do DRG ipsilateral de animais detentores de tumores tratados com veículo (c, n=7) e tratados com anticorpo anti-NGF (d, n=7). Escala das barras a-d = 5 pm. -20- A Figura 9 mostra micrografias que demonstram que as alterações neuroquímicas associadas à sensibilização central foram atenuadas pela administração de anti-NGF. As Figuras 9A e 9B mostram a coloração imunológica de dinorfina do corno dorsal da espinal-medula de rato injectado com sarcoma e tratado com veiculo (A, n=9) e de rato injectado com sarcoma e tratado com anticorpo anti-NGF (B, n=4) . As Figuras 9C e 9D mostram imagens confocais representativas de neurónios que expressam c-Fos da espinal-medula em rato injectado com sarcoma e tratado com veiculo (C, n=4) e rato injectado com sarcoma e tratado com anticorpo anti-NGF (D, n=4) após palpação normalmente inofensiva dos membros portadores de tumores. Escala da barra: 150 pm em A e B, 200 pm em C e D, A Figura 10 mostra gráficos que demonstram que a terapia com anti-NGF atenuou a dor associada ao cancro ósseo e da próstata induzida por tumores. O tratamento com anti-NGF (10 mg/kg, i.p., administrados nos 7.°, 12.° e 17.° dias após injecção de tumor) atenuou comportamentos de dor prolongada associada ao cancro ósseo com inicio no 7.° dia após injecção do tumor e ao longo da progressão da doença. Os registos do tempo gasto em tensão e do número de tremores espontâneos em fémures injectados com ACE-1 ao longo do período de observação de 2 minutos foram utilizados como medidas de dor prolongada (A, B) . O anti- NGF (quadrado preenchido) reduziu significativamente os -21- comportamentos de dor prolongada em animais injectados com tumor, comparativamente com ACE-1 + veiculo (quadrado não preenchido), e reduziu-se para valores próximos dos niveis do sham ao 9.° dia em todos os parâmetros (circulo). Quer a tensão, quer o tremor nos animais que receberam sham + veiculo foram significativamente diferentes daqueles registados nos animais que receberam ACE-1 + veículo, ao longo da progressão da doença. 0 tratamento com anti-NGF não apresentou qualquer efeito sob as respostas basais térmicas ou mecânicas medidas através do registo da latência da retirada da para perante um estímulo térmico ou aumento do limiar de estímulo mecânico (C, D). 0 tratamento com anti-NGF produziu uma maior redução dos comportamentos de dor prolongada no 19.° dia do que com 10 mg/kg ou 30 mg/kg de morfina (i.p., 15 minutos antes do teste) (E, F) . A dor evocada por movimento foi medida através da quantificação do tempo passado em tensão e do número de tremores ao longo de um período de observação de 2 minutos, após palpação normalmente inofensiva do fémur injectado com ACE-1 (G, H) . As barras de erro representam E.P.M. Nas Figs. 10A-F, "#" indica P<0,05 vs. sham + veículo, indica P<0,05 vs. ACE-1 + veículo e "+" indica P<0,05 vs. ACE-1 + morfina. Nas Figs. 10G e 10H, "*" indica P<0,01 vs. sham e "#" indica P<0,01 vs. ACE-1 + veículo. A Figura 11 corresponde a fotografias que demonstram que o tratamento com anticorpo anti-NGF não apresentou qualquer -22- efeito sobre o peso do tumor ou sobre a renovação óssea induzida pelo tumor. Animais sham, aos quais foi dado o veículo (A) , não apresentaram qualquer destruição óssea visível por radiografia ou histologia (H e E) (D) ao 19.° dia, enquanto que os animais aos quais se administrou ACE-1 + veículo (B, E) e os animais aos quais se administrou ACE-1 + anti-NGF (C, F) não apresentaram um crescimento tumoral ou remodelação óssea significativos aquando do exame radiológico e histológico. H= células hematopoiéticas, T= tumor, WB= formação óssea induzida por ACE-1, Escala da barra = 1,5 mm. A Figura 12 consiste em imagens que demonstram que a terapia com anti-NGF não reduziu significativamente a osteoclastogénese induzida por tumor. Imagens de coloração de trap de animais sham + veículo (A) e ACE-1 + veículo (B) e ACE-1 + anti-NGF (C) demonstram que a ocorreu proliferação neste modelo ao longo das regiões do osso induzido com tumor, com um aumento no número de osteoclastos por mm2 de área intramedular diafisária em ambos os animais tratados com anti-NGF e com veículo, comparativamente com os animais sham + tratados com veículo e com os animais simples + veículo. Não se verificou qualquer diferença visível na aparência histológica dos osteoclastos ao longo da interface tumor/osso ou macrófagos ao longo do tumor quando se procedeu à comparação dos animais tratados com anti-NGF (C) com os animais tratados -23- com veículo (B). Os animais sham + veículo (A) apresentaram um número e morfologia de osteoclastos, e macrófagos que não eram significativamente diferentes dos animais simples. Setas= osteoclastos, triângulos= macrófagos, MB= osso mineralizado, H= células hematopoiéticas, T= tumor, Escala da barra: 50 μπι. A Figura 13 consiste em fotografias que demonstram que a terapia com anti-NGF não influenciou a densidade das fibras sensoriais imunoreactivas de péptido relacionado com o gene da calcitonina (calcitonin gene-related peptide immunoreactive (CGRP-IR) sensory fibers) . Não se observou qualquer diferença nos níveis da imunofluorescência ou densidade das fibras de CGRP-IR entre os animais tratados com ACE-1 + veículo (A) e os animais tratados com ACE-1 + anti-NGF (B). É também de referir que houve uma manutenção das fibras CGRP-IR com a terapia anti-NGF. T= tumor, Escala da barra: 50 pm. A Figura 14 consiste em fotografias que demonstram que a terapia com anti-NGF não influenciou a densidade das fibras sensoriais imunoreactivas de péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP-IR) da pata traseira. Não se observou qualquer diferença nos níveis da imunofluorescência ou densidade das fibras de CGRP-IR da pele entre os animais simples tratados com veículo (A) e os animais simples tratados com anti-NGF (B). Da mesma forma, não se verificou qualquer diferença nos níveis de imunofluorescência ou -24- densidade das fibras CGRP-IR entre os animais tratados com ACE-1 + veiculo (C) e os animais tratados com ACE-1 + anti-NGF (D) . É também de referir que não se verificou qualquer diferença entre as fibras CGRP-IR dos animais simples e os animais injectados com ACE-1 (A, B vs. C, D). Escala da barra: 50 pm.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO A presente invenção tem por base a descoberta de que a administração in vivo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal anti-NGF pode ser usada para tratar a dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea. A invenção baseia-se em observações num modelo de rato com cancro ósseo, no qual a administração de um anticorpo antagonista anti-NGF foi significativamente eficaz na redução da dor prolongada e evocada por movimento associada ao cancro ósseo. A invenção diz respeito à prevenção ou tratamento da dor associada ao cancro ósseo, A presente invenção tem por base a descoberta de que os antagonistas do NGF, tais como um anticorpo anti-NGF, são eficazes no tratamento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea num indivíduo (humano ou não humano) através da administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-NGF, por exemplo, um anticorpo monoclonal -25- NGF humano (anti-hNGF). Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ.

Num outro aspecto, a invenção proporciona a atenuação, protelação do desenvolvimento e/ou prevenção da progressão da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea, incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF a um indivíduo. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. A invenção também descreve composições destinadas ao tratamento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea, incluindo a administração de um anticorpo anti-NGF, por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-NGF, para utilização em qualquer um dos -26- métodos proporcionados. Nalgumas variantes, o anticorpo anti-NGF tem a capacidade de inibir eficazmente a ligação do NGF ao(s) seu(s) receptor(es) TrkA e/ou p75 e/ou eficazmente inibir o NGF de activar o(s) seu(s) receptor(es) TrkA e/ou p75. Técnicas gerais A prática da presente invenção utilizará, excepto se indicado em contrário, técnicas convencionais da biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, inseridas na esfera de conhecimentos dos especialistas destas áreas. Tais técnicas são inteiramente descritas na literatura, tais como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al.r 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. j. Gait, ed., 1984), Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (j. E. Cellis, ed. 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather e P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths e D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley & Sons; Methods in Enzymology (Acadmeic Press, Ind.); Handbook of Experimental

Immunology (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds.); Gene -27-

Transfer Vector for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al.f eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis, et al., eds. 1994)); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds. 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley & Sons, 1999); Immunology (C. A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty, ed. IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D. Lane) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definições

Um "anticorpo" (usado também na forma do plural) é uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar especificamente a um alvo, tal como um hidrato de carbono, um polinucleótido, um lipido, um polipéptido, etc., através de pelo menos um local de reconhecimento do antigénio, situado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme usado, o termo inclui não apenas os anticorpos intactos policlonais e monoclonais, mas também fragmentos (como Fab, Fab' F(ab')2, Fv), (ScFv) de cadeia única -28- mutantes dos mesmos, proteínas de fusão que incluem uma porção do anticorpo, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, diabodies, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única, anticorpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e qualquer outra configuração molecular da imunoglobulina que inclua um local de reconhecimento de antigénios com a necessária especificidade. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, como sendo lgG, IgA ou lgM (ou suas subclasses), e o anticorpo não necessita de ser de uma determinada classe. Dependendo do domínio constante das cadeias longas da sequência de aminoácido do anticorpo, as imunoglobulinas podem ser classificadas com diferentes classes. Existem cinco classes de imunoglobulinas principais: IgA, lgD, lgE, lgG e lgM, e algumas destas podem ser divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, lgGl, lgG2, lgG3, lgG4, IgAl e lgA2. Os domínios constantes de cadeia longa que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são designados por alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são já conhecidas.

Um "anticorpo monoclonal" refere-se a uma população homogénea de anticorpos em que o anticorpo monoclonal é constituído por aminoácidos (de ocorrência natural e não natural) envolvidos na ligaçao selectiva de um antigénio. -29-

Uma população de anticorpos monoclonais é altamente específica, direccionando-se a um só local antigénico. O termo "anticorpo monoclonal" engloba não só anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais full-length, mas também fragmentos dos mesmos (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , cadeias únicas (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão que incluem uma porção do anticorpo, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos e qualquer outra configuração molecular da imunoglobulina que inclua um local de reconhecimento de antigénios com a necessária especificidade e com a capacidade de se ligar a um antigénio. Não se pretende qualquer limitação no que respeita à fonte do anticorpo ou à forma como este é produzido (por exemplo, por hibridoma, selecção fágica, expressão recombinante, animais transgénicos, etc.).

Conforme utilizado, os termos "factor de crescimento nervoso" e "NGF" dizem respeito ao factor de crescimento nervoso e variantes do mesmo que retenham pelo menos uma parte da actividade do NGF. Conforme usado, NGF engloba todas as espécies de sequências nativas de NGF de mamíferos, incluindo seres humanos, cães, felinos, equídeos ou bovinos. 0 termo "receptor de NGF" diz respeito a um polipéptido ligado por ou activado pelo NGF. Os receptores de NGF incluem o receptor TrkA e o receptor p75 de qualquer -30- espécie de mamífero, incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os seres humanos, cães, felinos, equídeos, primatas ou bovinos.

Um "antagonista do NGF" refere-se a uma molécula que bloqueia, suprime ou reduz (incluindo significativamente) a actividade biológica do NGF, incluindo as vias a jusante mediadas pela sinalização do NGF, tais como a ligação e/ou desencadeamento de uma resposta celular do receptor ao NGF. O termo "antagonista" não implica qualquer mecanismo especifico de acção biológica, e inclui e engloba expressamente todas as interacções farmacológicas, fisiológicas e bioquimicas possíveis com o NGF, sejam elas directas ou indirectas, ou em interacção com o NGF, com o seu receptor ou através de qualquer outro mecanismo, sendo que as suas consequências podem ser atingidas através de um conjunto de composições diferentes e quimicamente divergentes. Exemplos de antagonistas do NGF incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, um anticorpo anti-NGF, uma molécula anti-sense direccionada a um NGF (incluindo uma molécula anti-sense dirigida a um ácido nucleico que codifica o NGF), um composto de inibição do NGF, um análogo estrutural do NGF, uma mutação dominante negativa de um receptor TrkA que se liga a um NGF, uma imunoadesina TrkA, um anticorpo anti-TrkA, um anticorpo anti-p75, e um inibidor da cinase. No âmbito da presente invenção, o termo "antagonista" engloba todos os termos -31- títulos, estados funcionais e caracteristicas previamente identificados, em que o próprio NGF, uma actividade biológica do NGF (incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a sua capacidade para mediar qualquer aspecto da dor oncológica associada à metástase óssea), ou as consequências da actividade biológica, são substancialmente anuladas, reduzidas ou neutralizadas a qualquer nivel significativo. Nalgumas variantes, um antagonista do NGF (por exemplo, um anticorpo) liga-se (interage fisicamente com) ao NGF, liga-se a um receptor do NGF (tal como o receptor TrkA e/ou o receptor p75), reduz (impede e/ou bloqueia) a sinalização a jusante do receptor do NGF e/ou inibe (reduz) a sintese, produção ou libertação do NGF. Noutras variantes, um antagonista do NGF liga-se ao NGF e impede a dimerização do receptor TrkA e/ou a auto-fosforilação do TrkA. Noutras variantes, o antagonista do NGF inibe ou reduz a sintese e/ou produção (libertação) do NGF. São proporcionados exemplos de tipos de antagonistas do NGF.

Conforme utilizado, o termo "anticorpo anti-NGF" diz respeito a um anticorpo com a capacidade de se ligar ao NGF e inibir a actividade biológica do NGF e/ou a(s) via(s) a jusante mediada(s) pela sinalização do NGF.

Uma "imunoadesina TrkA" diz respeito a uma molécula quimérica solúvel que inclui um fragmento de um receptor

TrkA, por exemplo, o domínio extracelular de um receptor -32-

TrkA e uma sequência de imunoglobulina, que retém a especificidade de ligação do receptor TrkA. A "actividade biológica" do NGF geralmente refere-se à capacidade de ligação dos receptores do NGF e/ou activação das vias de sinalização do receptor do NGF. A actividade biológica inclui, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, qualquer um ou mais dos seguintes: a capacidade de ligar a um receptor de NGF (como o p75 e/ou TrkA), a capacidade de promover a dimerização e/ou auto-fosforilação do receptor TrkA, a capacidade de activar uma via de sinalização do receptor do NGF, a capacidade para promover a diferenciação, proliferação, sobrevivência, crescimento, migração celular e outras alterações da fisiologia celular incluindo (no caso dos neurónios, incluindo neurónios periféricos e centrais) alteração da morfologia, sinaptogénese, função sináptica, libertação de neurotransmissores e/ou neuropéptidos e regeneração após lesões, e a capacidade de mediar a dor oncológica associada às metástases ósseas.

Conforme utilizado, o termo "tratamento" consiste numa abordagem para obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados. No âmbito da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, um ou mais dos seguintes: melhoria de qualquer aspecto da dor incluindo a redução da severidade, alívio de um ou mais sintomas -33- associados à dor do cancro ósseo (por exemplo, dor oncológica associada à metástase óssea) incluindo qualquer aspecto da dor associada ao cancro ósseo (tal como a redução da duração da dor e/ou redução da sensibilidade ou sensação da dor).

Uma "quantidade eficaz" diz respeito a uma quantidade suficiente para a obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados, incluindo o alivio ou redução da dor. No âmbito da presente invenção, uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF é uma quantidade suficiente para tratar, melhorar, reduzir a intensidade de ou prevenir a dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada à metástase óssea. Nalgumas variantes, a "quantidade eficaz" pode reduzir a intensidade da dor contínua e/ou repentina (incluindo a dor em ambulatório e a dor evocada pelo toque), e pode ser administrada antes, durante e/ou depois de o cancro ter metastizado para o osso. Nalgumas variantes, a "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para protelar o desenvolvimento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor oncológica associada às metástases ósseas. "Reduzir a incidência" da dor diz respeito a quaisquer meios para reduzir a severidade (que pode incluir a redução da necessidade de e/ou quantidade de (por exemplo, exposição a) outros fármacos e/ou terapias geralmente usadas no tratamento destas condições), duração e/ou -34- frequência (incluindo, por exemplo, protelando ou aumentando o tempo até surgir dor oncológica óssea, incluindo a dor oncológica associada às metástases ósseas num indivíduo) . Tal como é do conhecimento na arte, os indivíduos podem variar em termos das suas respostas ao tratamento e, por isso, por exemplo, um "método de redução da incidência da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas num indivíduo" diz respeito à administração do anticorpo antagonista anti-NGF descrito, com base na expectativa razoável de que tal administração possa provocar uma redução da incidência nesse mesmo indivíduo. "Aliviar" a dor associada ao cancro ósseo (tal como a dor oncológica associada às metástases ósseas) ou um ou mais sintomas da dor associada ao cancro ósseo significa a redução ou melhoria de um ou mais sintomas da dor associada ao cancro ósseo comparativamente à não administração de um anticorpo antagonista anti-NGF. "Aliviar" também inclui a diminuição ou redução da duração de um sintoma. "Atenuar" a dor associada ao cancro ósseo (tal como a dor oncológica associada às metástases ósseas) ou um ou mais sintomas da dor associada ao cancro ósseo significa reduzir o grau de uma ou mais manifestações clínicas indesejadas da dor associada ao cancro ósseo num indivíduo ou população de indivíduos com um anticorpo antagonista anti-NGF, de acordo com a invenção. -35-

Conforme usado, "protelar" o desenvolvimento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas significa retardar, impedir, retardar, estabilizar e/ou adiar a progressão da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas. Este adiamento pode estender-se por vários periodos de tempo, dependendo dos antecedentes da doença e/ou dos indivíduos sob tratamento. Como é do conhecimento dos especialistas da arte, um adiamento suficiente ou significativo por, de facto, incluir a prevenção, já que o individuo não desenvolve dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas. Um método que "retarda" o desenvolvimento do sintoma é um método que reduz a probabilidade de desenvolver o sintoma num determinado intervalo de tempo, comparativamente à não utilização do método. Tais comparações são tipicamente baseadas em estudos clínicos, usando um número de objectos suficiente para se obter um resultado estatisticamente relevante. "Desenvolvimento" e "progressão" da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas diz respeito a manifestações iniciais e/ou progressão consequente da doença. 0 desenvolvimento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas, pode ser detectável e avaliada através das técnicas clínicas de referência, conhecidas na arte. No entanto, -36- também diz respeito à progressão que pode ser indetectável. No âmbito da presente invenção, desenvolvimento ou progressão dizem respeito ao curso biológico dos sintomas. "Desenvolvimento" inclui a ocorrência, recorrência e surto. Conforme utilizado, os termos "surto" ou "ocorrência" da dor associada ao cancro ósseo (tal como a dor associada às metástases ósseas) inclui o surto inicial e/ou recorrência. Conforme utilizado, o termo "co-administração" inclui a administração simultânea e/ou administração em diferentes momentos. A co-administração também engloba a administração sob a forma de co-formulação (ou seja, o anticorpo antagonista anti-NGF e um agente estão presentes na mesma composição) ou a administração sob a forma de composições separadas. Conforme utilizado, a co-administração engloba qualquer circunstância em que um agente e um anticorpo antagonista anti-NGF são administrados a um indivíduo, o que pode ocorrer em simultâneo e/ou separadamente. Conforme discutido, entende-se que o anticorpo antagonista anti-NGF e um agente podem ser administrados em diferentes frequências de dosagem ou intervalos. Por exemplo, um anticorpo anti-NGF pode ser administrados semanalmente, enquanto que o agente pode ser administrado com maior frequência. Entende-se que o anticorpo antagonista anti-NGF e um agente podem ser administrados usando a mesma via de administração ou vias de administração diferentes. -37- 0 termo "analgésico opióide" diz respeito a todos os fármacos, naturais ou sintéticos, com acção semelhante à da morfina. Os analgésicos sintéticos e semi-sintéticos são derivados de cinco classes químicas de compostos: fenantrenos, fenilheptilaminas, fenilpiperidinas, morfinas e benzomorfanos, todos eles inseridos no âmbito do termo. Exemplos de analgésicos opióides incluem a codeína, dihidrocodeína, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanil, buprenorfina, butorfanol, fentanil, sufentanil, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno e pentazocina, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. 0 termo "ΑΙΝΕ" refere-se a um composto anti-inflamatório não esteróide. Os AINE's são categorizados de acordo com a sua capacidade de inibir a ciclo-oxigenase. A ciclo-oxigenase 1 e a ciclo-oxigenase 2 são as duas principais isoformas da ciclo-oxigenase e os aine's mais comuns são inibidores mistos das duas isoformas. Os AINE's mais comuns inserem-se numa das cinco categorias estruturais seguintes: (1) derivados de ácido propiónico como o ibuprofeno, naproxeno, naprosin, diclofenac e cetoprofeno; (2) derivados do ácido acético, tal como o tolmetin e o sulindac; (3) derivados do ácido fenâmico, como o ácido mefenâmico e o ácido meclofenâmico; (4) derivados do ácido bifenilcarboxilico, como o diflunisal e flufenisal; e (5) oxicams, como o piroxim, sudoxicam e isoxicam. -38-

Foi também descrita uma outra classe de AlNE's que inibem selectivamente a ciclo-oxigenase 2. Os inibidores da cox-2 foram descritos, por exemplo, nas patentes de invenção norte-americanas n.os 5616601, 5604260, 5593994, 5550142, 5536752, 5521213, 5475995, 5639780, 5604253, 5552422, 5510368, 5436265, 5409944 e 5130311. Alguns exemplos de inibidores da COX-2 incluem o celecoxib (SC-58635), DUP-697, flosulide (CGP-28238), meloxicam, ácido 6-metoxi-2-naftilacético (6-MNA), rofecoxib, MK-966, nabumetona (pró-fármaco do 6-MNA), nimesulide, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614 ou combinações dos mesmos.

Um "indivíduo" é um mamífero, mais preferivelmente um ser humano. Mamíferos incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, animais de exploração agrícola, animais de desporto, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos e ratos. Métodos da invenção

No que respeita aos métodos descritos, a referência a um anticorpo antagonista anti-NGF também inclui composições que incluem um ou mais destes agentes. Estas composições podem também incluir excipientes adequados, tais como excipientes (veículos) farmaceuticamente aceitáveis que incluem tampões, já conhecidos na arte. A presente invenção -39- também pode ser usada individualmente ou em combinação com outros métodos de tratamento convencionais. Métodos de prevenção ou tratamento da dor associada ao cancro ósseo incluindo a dor associada às metástases ósseas A presente invenção é útil para o tratamento, adiamento da evolução e/ou prevenção da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas, num indivíduo, humano ou não humano. A qualidade de vida em indivíduos com cancro ósseo pode ser melhorada.

As metástases ósseas podem ser associadas à formação ou destruição óssea. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF destina-se a ser utilizado no tratamento da dor associada ao cancro ósseo com formação óssea (actividade osteoblástica), como sendo o tratamento da dor associada às metástases ósseas do cancro da próstata. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF destina-se a ser utilizado no tratamento da dor associada ao cancro com destruição óssea (actividade osteolítica), como sendo o tratamento da dor das metástases ósseas do sarcoma.

Consequentemente, num aspecto, a invenção proporciona o uso de um anticorpo antagonista anti-NGF na produção de um medicamento destinado ao tratamento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases -40- ósseas num indivíduo. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide e com um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, a quantidade do analgésico opióide e/ou do ΑΙΝΕ administrados para alívio da dor é reduzida, comparativamente com a quantidade administrada na ausência do anticorpo antagonista anti-NGF. Os efeitos adversos provocados pelo analgésico opióide e/ou pelo ΑΙΝΕ podem ser reduzidos ou eliminados quando estes são co-administrados com o anticorpo antagonista anti-NGF. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deve ser co-administrado com um analgésico opióide e/ou com um ΑΙΝΕ.

Noutro aspecto, a invenção proporciona o uso de um anticorpo antagonista anti-NGF na produção de um medicamento destinado à prevenção, alívio e/ou prevenção do desenvolvimento ou progressão da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co- -41- administrado com um analgésico opióide. Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um ΑΙΝΕ. Nalgumas outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não deverá ser co-administrado com um analgésico opióide nem com um ΑΙΝΕ. É de realçar que, embora se faça referência ao tratamento ou prevenção da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas, o anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado antes de um evento ou condição com um risco aumentado de dor associada ao cancro ósseo.

Um anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado em conjugação com outras terapias do cancro ósseo, tal como a rádio- e a quimioterapias. 0 anticorpo antagonista anti-NGF também pode ser administrado em conjunção com outros analgésicos utilizados no tratamento da dor associada ao cancro ósseo. Exemplos de tais analgésicos incluem bisfosfonatos (por exemplo, alendronato), gabapentina e radiação. A quantidade destes analgésicos administrados para o alivio da dor associada ao cancro ósseo pode ser reduzida, comparativamente à quantidade administrada na ausência do anticorpo antagonista anti-NGF. Os efeitos adversos provocados por estes analgésicos podem ser reduzidos ou eliminados quando são co-administrados com o anticorpo antagonista anti-NGF. -42- 0 diagnóstico ou avaliação da dor estão já descritos na arte. A avaliação pode ser realizada com base numa medição objectiva, tal como a observação de comportamentos como a reacção a estímulos, expressões faciais e semelhantes. A avaliação pode também basear-se em medições subjectivas, como a caracterização da dor por parte do paciente usando várias escalas de dor. Veja-se, por exemplo, Katz et al., Surg. Clin. North Am. (1999) 79(2):231-52, Caraceni et al., J. Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55.

Antagonistas do NGF A invenção utiliza um anticorpo antagonista anti-NGF. Um antagonista anti-NGF diz respeito a qualquer molécula que bloqueie, suprima ou reduza (incluindo significativamente) a actividade biológica do NGF, incluindo vias a jusante mediadas pela sinalização do NGF, tal como a ligação ao receptor e/ou desencadeamento de uma resposta celular ao NGF. O termo "antagonista" não implica qualquer mecanismo específico de acção biológica, e inclui e engloba expressamente todas as interacções farmacológicas, fisiológicas e bioquímicas possíveis com o NGF, sejam elas directas ou indirectas, ou em interacção com o NGF, com o seu receptor ou através de qualquer outro mecanismo, sendo que as suas consequências podem ser atingidas através de um conjunto de composições diferentes e quimicamente -43- divergentes. No âmbito da presente invenção, o termo "antagonista" engloba todos os termos, títulos, estados funcionais e características previamente identificados, em que o próprio NGF, uma actividade biológica do NGF (incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a sua capacidade para mediar qualquer aspecto da dor oncológica associada à metástase óssea), ou as consequências da actividade biológica, são substancialmente anuladas, reduzidas ou neutralizadas a qualquer nível significativo. Nalgumas variantes, o anticorpo anti-NGF é humanizado (como o anticorpo E3 descrito). Nalgumas variantes, o anticorpo anti-NGF é um anticorpo E3 (conforme descrito). Noutras variantes, o anticorpo anti-NGF inclui uma ou mais CDR(s) do anticorpo E3 (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou, nalgumas variantes, as seis CDR's do E3) . Noutras variantes, o anticorpo é humano. Nalgumas variantes, o anticorpo é um anticorpo anti-NGF humano neutralizante descrito na patente de invenção WO 2005/019266. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF inclui a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada apresentada no Quadro 1 (SEQ ID NO:l). Ainda em outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF inclui a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve apresentada no Quadro 2 (SEQ ID NO:2). Ainda em outras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF inclui a sequência de aminoácido da região -44- variável da cadeia pesada apresentada no Quadro 1 (SEQ ID N0:1) e a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve apresentada no Quadro 2 (SEQ ID NO:2). Noutras variantes, o anticorpo inclui uma região constante modificada, como sendo uma região constante imunologicamente inerte, por exemplo, não despoleta a lise mediada pelo complemento, ou não estimula a citotoxicidade mediada por células e dependente do anticorpo (ADCC). Noutras variantes, a região constante é modificada conforme descrito in Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624, no pedido de patente de invenção n.° PCT/GB99/01441 e/ou no pedido de patente inglesa n.° 9809951.8.

Anticorpos anti-NGF O anticorpo anti-NGF tem de apresentar uma ou mais das seguintes caracteristicas: (a) ligar a um NGF e inibir a

actividade biológica do NGF e/ou vias a jusante mediadas pela função de sinalização do NGF; (b) prevenir, melhorar ou tratar qualquer aspecto da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas; (c) bloquear ou reduzir a activação do receptor do NGF (incluindo a dimerização e/ou auto-fosforilação do receptor TrkA); (d) aumentar a depuração do NGF; (e) inibir (reduzir) a síntese, produção ou libertação do NGF. -45-

Os anticorpos anti-NGF são conhecidos na arte, veja-se, por exemplo, as publicações de patentes de invenção PCT n.os WO 01/78698, WO 01/64247, as patentes de invenção norte-americanas n.os 5844092, 5877016 e 6153189, Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000); Cell. Molec. Biol. 13:559-568 (1993); GenBank Accession n.os U39608, L17078 ou L17077. Nalgumas variantes, o anticorpo anti-NGF é um anticorpo monoclonal anti-NGF de rato humanizado, designado por anticorpo "E3" (patente de invenção PCT n.° WO 04/058184), que inclui a região constante da cadeia pesada lgG2a humana contendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácidos com referência à sequência wíldtype lgG2a; veja-se Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613- 2624), a região constante da cadeia leva kapa humana, e as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves apresentadas nos Quadros 1 e 2.

Quadro 1: Região variável da cadeia pesada QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWG DGTTDYNSAVKSRVTISK- DTSKNQFSLKSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDY WGQGTLVTVS (SEQ ID NO:l).

Quadro 2: Região variável da cadeia leve -46- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSR FHSGVPSRFSGSGS-GTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRT (SEQ ID NO:2).

Os seguintes polinucleótidos que codificam a região variável da cadeia pesada ou leve foram depositados no ATCC no dia 8 de Janeiro de 2003:

Material Accession no. ATCC Data de depósito Vector Região variável da PTA-4893 8 Janeiro 2003 Eb.911.3E cadeia leve E3 Vector Região variável da PTA-4894 8 Janeiro 2003 Eb.pur.3E cadeia leve E3 Vector Região variável da PTA-4895 8 Janeiro 2003 Db.911.3E cadeia pesada E3 O vector Eb.911.3E é um polinucleótido que codifica a região variável da cadeia leve apresentada no Quadro 2; o vector Eb.pur.911.3E é um polinucleótido que codifica a região variável da cadeia leve apresentada no Quadro 2 e o vector Db.911.3E é um polinucleótido que codifica a região variável da cadeia pesada apresentada no Quadro 1. Estes polinucleótidos também codificam domínios constantes. Existem pelo menos duas técnicas para a determinação de CDS's: (1) uma abordagem com base na variabilidade de sequências interespecíficas (por exemplo, Kabat et al., -47-

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., 1991, National Institute of Health, Bethesda MD), e (2) uma abordagem com base em estudos cristalográficos de complexos antigénio-anticorpo (Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)) . Conforme utilizado, uma CDR pode referir-se a CDR' s definidas em qualquer uma das abordagens ou a uma combinação de ambas as abordagens.

Numa outra variante, o anticorpo anti-NGF inclui uma ou mais CDR' s de anticorpo E3 (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou, nalgumas variantes, as seis CDR's do E3) . A determinação das regiões insere-se na esfera de conhecimentos dos especialistas da arte. As CDR's podem ser Kabat, Chothia ou uma combinação de Kabat e Chothia.

Os anticorpos úteis na presente invenção podem incluir anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecificos, anticorpos heteroconjugados, cadeias únicas (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão que incluem uma porção do anticorpo, anticorpos humanizados e qualquer outra configuração molecular da imunoglobulina que inclua um local de reconhecimento de antigénios com a necessária especificidade, incluindo as variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequências de aminoácidos de anticorpos e anticorpos covalentemente modificados. Os -48- anticorpos podem ser murinos, de ratos, humanos ou de qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados). No âmbito da presente invenção, o anticorpo reage com o NGF de forma a inibir o NGF e/ou as vias a jusante mediadas pela função de sinalização do NGF. Numa variante, o anticorpo é um anticorpo humano que reconhece um ou mais epitopos no NGF humano. Numa outra variante, o anticorpo é um anticorpo de rato que reconhece um ou mais epitopos no NGF humano. Numa outra variante, o anticorpo reconhece um ou mais epitopos num NGF seleccionado entre um grupo constituído por epitopos primatas, caninos, felinos, equídeos e bovinos. Numa variante, o anticorpo inclui uma região constante modificada, tal como uma região constante imunologicamente inerte, por exemplo, não despoleta a lise mediada pelo complemento, ou não estimula a citotoxicidade mediada por células e dependente do anticorpo (ADCC). A actividade ADCC pode ser avaliada através dos métodos descritos na patente de invenção norte-americana n.° 5500362. Noutras variantes, a região constante é modificada conforme descrito in Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624, no pedido de patente de invenção n.° PCT/GB99/01441 e/ou no pedido de patente inglesa n.° 9809951.8. A afinidade de ligação a um anticorpo anti-NGF ao NGF (tal como o hNGF) pode ser de cerca de 0,10 a cerca 1,0 nM, de cerca de 0,10 nM a cerca de 0,80 nM, de cerca de 0,15 a cerca de 0,75 nM e de cerca de 0,18 a cerca de 0,72 nM. -49-

Noutra variante, a afinidade de ligação situa-se entre cerca de 2 pM e 22 pM. Numa variante, a afinidade de ligação é de cerca de 10 nM. Noutras variantes, a afinidade de ligação é de cerca de 0,1 nM ou de cerca de 0,07 nM. Noutras variantes, a afinidade de ligação é qualquer uma entre cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM ou cerca de 50 pM até qualquer uma entre cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM ou cerca de 40 pM. Nalgumas variantes, a afinidade de ligação é de cerca de 100 nM, é de cerca de 50 nM, é de cerca de 10 nM, é de

cerca de 1 nM, é de cerca de 500 pM, é de cerca de 100 pM ou é de cerca de 50 pM, ou inferior a cerca de 50 pM. Nalgumas variantes, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 100 nM, de cerca de 50 nM, de cerca de 10 nM, de cerca de 1 nM, de cerca de 500 pM, de cerca de 100 pM ou de cerca de 50 pM. Noutras variantes, a afinidade de ligação é de cerca de 2 pM, de cerca de 5 pM, de cerca de 10 pM, de cerca de 15 pM, de cerca de 20 pM, de cerca de 40 pM ou superior a cerca de 40 pM.

Uma forma de determinar a afinidade de ligação de anticorpos ao NGF consiste na medição da afinidade de ligação de fragmentos Fab monofuncionais do anticorpo. Para obter fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, lgG) pode ser clivado com papaina ou expressa de forma recombinante. A afinidade de um fragmento Fab anti- -50- NGF de um anticorpo pode ser determinada através de ressonância plasmónica superficial (sistema de ressonância plasmónica superficial (SPR) Bl Acore3000™, BlAcore, INC, Piscaway, NJ). Os chips CM5 podem ser activados com cloridrato de N-etil-N' -(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O NGF humano (ou qualquer outro NGF) pode ser diluido em 10 mM de acetato de sódio (pH 4.0) e injectado sobre o chip activado a uma concentração de 0,005 mg/ml. Usando um tempo de caudal variável ao longo dos canais dos chips, podem atingir-se duas gamas de densidade do antigénio: 100-200 unidades de resposta (RU) nos estudos cinéticos detalhados e 500-600 nos ensaios de detecção. O chip pode ser bloqueado com etanolamina. Estudos de regeneração comprovaram que uma mistura de tampão de eluição da Pierce (Produto n.° 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) e 4 M de NaCl (2:1) remove eficazmente o Fab ligado, ao mesmo tempo que mantém a actividade do hNGF no chip ao longo de cerca de 200 injecções. É utilizado tampão HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7.4, 0,15 NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de tensioactivo P20) como tampão continui nos ensaios com o sistema BlAcore. Diluições em série (0,1-10 x KD estimado) de amostras de Fab purificado são injectadas durante 1 minuto a 100 μΐ/min., permitindo-se tempos de dissociação de até 2 horas. As concentrações das proteínas Fab são determinadas -51- por ensaio ELISA e/ou electroforese SDS-PAGE usando um Fab de concentração conhecida (conforme determinadas por análise de aminoácidos) como padrão. As velocidades de associação cinética (Kon) e velocidades de dissociação (Koff ) são obtidas em simultâneo através da introdução dos dados num modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karisson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BIAevaluation. Os valores da constante de dissociação de equilíbrio (KD) são calculados como Kon/Koff. Este protocolo é adequado para utilização na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo a qualquer NGF, incluindo o NGF humano, o NGF de qualquer outro vertebrado (nalgumas variantes, mamíferos) (tais como o NGF de rato, o NGF de primata), bem como para utilização com outras neurotrofinas, como as neurotrofinas NT3, NT4/5 e/0U BDNF.

Nalgumas variantes, o anticorpo liga-se ao NGF humano, e não se liga significativamente a um NGF de outra espécie de vertebrado (nalgumas variantes, mamíferos). Nalgumas variantes, o anticorpo liga-se ao NGF humano bem como a um ou mais NGF de outras espécies de vertebrados (nalgumas variantes, mamíferos). Noutras variantes, o anticorpo liga-se ao NGF e não reage significativamente com outras neurotrofinas (tais como neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5 e/ou BDNF). Nalgumas variantes, o anticorpo liga-se ao NGF bem como a pelo menos outra neurotrofina. Nalgumas -52- variantes, o anticorpo liga-se a um NGF de uma espécie de mamífero, tal como um cavalo ou cão, mas não se liga significativamente a NGF de outra espécie de mamífero. 0(s) epitopo(s) pode(m) ser continuo (s) ou descontinuo (s) . Numa variante, o anticorpo liga-se essencialmente aos mesmos epitopos hNGF como qualquer anticorpo seleccionado entre o grupo constituído por Mab 911, Mab 912 e Mab 938, conforme descrito em Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000) . Numa outra variante, o anticorpo liga essencialmente o mesmo epitopo que Mab 909 (Hongo et al.r supra) . Por exemplo, o epitopo pode incluir um ou mais entre: residuos K32, K34 e E35 ena região variável 1 (aminoácidos 23-35) do hNGF, residuos F79 e T81 na região variável 4 (aminoácidos 81-88) do hNGF, residuos H84 e K88 na região variável 5, resíduo R103 entre a região variável 5 (aminoácidos 94-98) do hNGF e no terminal carboxílico (aminoácidos 111-118) do hNGF, resíduo Eli na região pré-variável 1 (aminoácidos 10-23) do hNGF, Y52 entre a região variável 2 (aminoácidos 40-49) do hNGF e a região variável 3 (aminoácidos 59-66) do hNGF, resíduos L112 e S113 no terminal carboxílico do hNGF, resíduos R59 e R69 na região variável 3 do hNGF ou resíduos V18, V20 e G23 na região pré-variável 1 do hNGF. Além disso, um epitopo podem incluir uma ou mais entre a região variável 1, a região variável 2, a região variável 3, a região variável 4, a região variável 5, a região N-terminal e/ou a região C- -53- terminal do hNGF. Ainda numa outra variante, o anticorpo reduz significativamente a acessibilidade do resíduo R102 do hNGF. Torna-se evidente que, embora os epítopos supra descritos dizem respeito ao NGF humano, os especialistas da arte poderão alinhar as estruturas do NGF humano com o NGF de qualquer outra espécie e identificar homólogos destes epítopos.

Num aspecto, os anticorpos (por exemplo, humanos, humanizados, rato, quiméricos) que podem inibir o NGF podem ser produzidos usando imunogénios que expressam uma sequência full length ou parcial do NGF. Num outro aspecto, pode utilizar-se um imunogénio que inclui uma célula que sobre-expressa o NGF. Um outro exemplo de um imunogénio que pode ser usado é a proteína NGF que contém NGF full length ou uma porção da proteína NGF.

Os anticorpos anti-NGF podem ser produzidos através de qualquer método conhecido. A via e horário da imunização do animal hospedeiro são, geralmente, aqueles que sigam as técnicas estabelecidas e convencionais para a estimulação e produção de anticorpos, conforme descrito. As técnicas gerais da produção de anticorpos humanos e de rato são conhecidas e descritas.

Qualquer mamífero, incluindo seres humanos, ou células produtoras de anticorpos dos mesmos, pode ser manipulado de forma a servir como base para a produção de linhas celulares de mamíferos incluindo linhas celulares -54- hibridoma de seres humanos. Tipicamente, o animal hospedeiro é inoculado por via intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutânea, intraplantar e/ou intradérmica com uma quantidade de imunogénio, incluindo conforme descrito.

Os hibridomas podem ser preparados a partir de linfócitos e imortalizados com células de mieloma usando a técnica geral de hibridização somática celular de Kohler, B. e Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 ou conforme modificado por Buck, D. W. et ai., In Vitro 18:377-381 (1982). Linhas de mieloma disponíveis incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a X63-Ag8.653 e aquelas obtidas no Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, também podem ser utilizadas na hibridização. Geralmente, a técnica envolve a fusão das células de mieloma com células linfóides, usando um fusogen como o polietilenoglicol, ou através de métodos eléctricos conhecidos. Após a fusão, as células são separadas do meio de fusão e crescidas num meio de crescimento selectivo, como o meio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar células-mãe não hibridizadas. Quaisquer meios descritos, suplementados com ou sem soro, podem ser usados na cultura de hibridomas para segregar anticorpos monoclonais. Numa outra alternativa à técnica de fusão celular, podem ser usadas células B imortalizadas com EBV para produzir os anticorpos monoclonais anti-NGF da -55- presente invenção. Os hibridomas são expandidos e sub-clonados, se desejado, e os sobrenadantes são analisados quanto à sua actividade anti-imunogénio através de procedimentos de ensaios imunológicos convencionais (por exemplo, radioimunoensaio, ensaio imunoenzimático ou imunofluorescência) .

Os hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorpos incluem todas as células derivadas dos hibridomas-mãe que produzem anticorpos monoclonais específicos do NGF, ou porção destes.

Os hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser crescidos in vitro ou in vivo através de procedimentos conhecidos. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados do meio de cultura ou fluidos corporais através de procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, como a precipitação de sulfato de amónio, a electroforese em gel, a diálise, a cromatografia e a ultrafiltração, se desejado. No caso de ocorrência de actividade indesejada, esta pode ser removida, por exemplo, sujeitando o preparado a adsorventes produzidos a partir do imunogénio fixo a uma fase sólida e eluindo ou libertando os anticorpos desejados fora do imunogénio. A imunização de um animal hospedeiro com NGF humano, ou fragmento contendo a sequência de aminoácido desejada, conjugado com uma proteína imunogénica na espécie a ser imunizada, por exemplo, KLH (keyhole limpet hemocyanin), albumina sérica, -56- tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina da soja, usando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugação pelos seus resíduos cisteína), N-hidroxisuccinimida (pelos seus resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, S0C12 ou RlN=C=NR, em que R e Rl são grupos alquilo diferentes, podendo render uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais).

Se desejado, o anticorpo anti-NGF (monoclonal ou policlonal) de interesse pode ser sequenciado e a sequência de polinucleótidos pode, depois, ser clonada num vector para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo pode ser mantida no vector numa célula hospedeira e esta pode, depois, ser expandida e congelada para utilização futura. Numa alternativa, a sequência de polinucleótidos pode ser utilizada para manipulação genética para "humanizar" o anticorpo ou optimizar a afinidade ou outras características do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser modificada para se assemelhar às regiões constantes humanas, de forma a evitar uma resposta imunitária se o anticorpo for usado em ensaios clínicos e tratamentos com seres humanos. Poderá ser desejável manipular geneticamente a sequência de anticorpo para obter uma maior afinidade ao NGF e uma maior eficácia na inibição do NGF. Será notório que poderão ser efectuadas -57- uma ou mais alterações de polinucleótidos ao anticorpo anti-NGF e, ainda assim, manter a sua capacidade de ligação ao NGF.

Anticorpos "humanizados" geralmente dizem respeito a uma molécula com um local de ligação ao antigénio substancialmente derivada de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, e a restante estrutura da imunoglobulina da molécula com base na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. 0 local de ligação ao antigénio pode incluir domínios variáveis completos fundidos em domínios constantes, ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR' s) enxertadas nas regiões adequadas dos domínios variáveis. Os locais de ligação do antigénio podem ser wild type ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos, por exemplo, modificados de forma a assemelhar-se a imunoglobulina humana. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequências das CDR (por exemplo, um anticorpo de rato humanizado que contém todas as seis CDR's dos anticorpos de rato). Outras formas de anticorpos humanizados possuem uma ou mais CDR's (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que são alteradas relativamente ao anticorpo original. Nalguns exemplos, os resíduos da região framework (FR) ou outros resíduos da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados -58- podem incluir resíduos não presentes no anticorpo receptor ou no anticorpo dador.

Os passos gerais para humanizar um anticorpo monoclonal são quatro: (1) determinar a sequência do nucleótido e a previsível sequência de aminoácido dos domínios variáveis leves e pesados do anticorpo inicial, (2) conceber o anticorpo humanizado, ou seja, decidir qual a região framework do anticorpo a usar durante o processo de humanização, (3) as próprias metodologias/técnicas de humanização, e (4) a transfecção e expressão do anticorpo humanizado. Veja-se, por exemplo, as patentes de invenção norte-americanas n.os 4816567, 5807715, 5866692, 6331415, 5530101, 5693761, 5693762, 5585089, 6180370 e 6548640. Já foram descritas várias moléculas de anticorpos "humanizados", incluindo um local de ligação do antigénio derivado de uma imunoglobulina não humana, incluindo anticorpos quiméricos com regiões V de roedores ou roedores modificados e suas regiões determinantes de complementaridade (CDR/s) associadas fundidas a domínios constantes humanos. Veja-se, por exemplo, Winter et al., Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J. Immunol. 138 :4534-4538 (1987) e Brown et al. Câncer Res. 47 :3577-3583 (1987). Outras referências descrevem CDR's de roedores nxertadas numa região framework (FR) humana antes da fusão com um domínio constante do anticorpo humano adequado. -59-

Veja-se, por exemplo, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) e

Jones et al. Nature 321:522-525 (1986). Outra referência descreve CDR's de roedor suportadas por regiões framework laminadas de forma recombinante. Veja-se, por exemplo, a publicação de patente de invenção europeia n.° 0519596.

Estas moléculas "humanizadas" são concebidas de forma a minimizar as respostas imunológicas indesejadas relativamente às moléculas do anticorpo anti-humano de roedor, que limita a duração e eficácia das aplicações terapêuticas destas fracções em receptores humanos. Por exemplo, a região constante do anticorpo pode ser concebida de forma a ser imunologicamente inerte (por exemplo, não desencadeia a lise do complemento). Veja-se, por exemplo, o pedido de patente PCT n.° PCT/GB99/01441, a patente de invenção inglesa n.° 9809951.8. Outros métodos de humanização de anticorpos que também podem ser utilizados são descritos em Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) e nas patentes de invenção n.os 6180377, 6054297, 5997867, 5866692, 6210671 e 6350861 e na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 01/27160. A humanização também pode incluir a maturação de afinidade. Veja-se, por exemplo, a patente de invenção norte-americana n.° 10/745775 e PCT/US03/41252.

Numa outra alternativa, anticorpos totalmente humanos podem ser obtidos através do recurso a ratos comerciais que podem -60- ser modificados para expressar determinadas proteínas humanas de imunoglobulina. Os animais transgénicos que são concebidos para produzir uma resposta imunitária mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos) ou mais robusta, também podem ser utilizados na produção de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos de tal tecnologia incluem Xenomouse™ da Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e HuMab-Mouse® e TC Mouse™ da Medarex, Inc. (Princeton, NJ) .

Numa alternativa, os anticorpos podem ser produzidos recombinantemente e expressos usando qualquer método conhecido. Numa alternativa, os anticorpos podem ser produzidos recombinantemente por tecnologia de phage display. Veja-se, por exemplo, as patentes de invenção norte-americanas n.os 5565332, 5580717, 5733743 e 6265150, e Winter et al., Annu. Ver. Immunol. 12:433-455 (1994). Em alternativa, a tecnologia de phage display (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) também pode ser usada para produzir anticorpos e fragmentos de anticorpos humanos in vitro, a partir de repertórios genéticos de domínio variável (V) de imunoglobulina de dadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de anticorpo com domínio V são clonados in-frame num gene de proteína maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como o Ml3 ou fd, e apresentados como fragmentos funcionais de anticorpo na superfície do fago. Já que a partícula filamentosa -61- contém uma cópia de ADN de cadeia única do genoma fágico, as selecções com base nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na selecção do gene que codifica o anticorpo que exibe tais propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula B. A técnica de phage display pode ser realizada em vários formatos. Para análise, veja-se, por exemplo, Johnson, Kevin e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993) . Podem ser usadas várias fontes de segmentos de genes V na técnica de phage display. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) isolaram uma ampla variedade de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados do baço de ratos imunizados. Pode ser construído um repertório de genes v de dadores humanos não imunizados e podem ser isolados anticorpos para uma ampla diversidade de antigénios (incluindo auto-antigénios) através das técnicas descritas por Mark et al. J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou por Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Numa resposte imunitária natural, os genes do anticorpo acumulam mutações a uma velocidade elevada (hipermutação somática). Algumas alterações introduzidas conferem uma maior afinidade, e as células B que apresentam imunoglobulina com superfície de elevada afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante os subsequentes desafios ao antigénio. Este processo natural pode ser mimetizado -62- através do recurso à técnica conhecida por "chain shuffling". Marks, et ai. Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). Neste método, a afinidade de anticorpos humanos "primários" obtidos por phage display pode ser optimizada através da substituição sequencial dos genes da região V das cadeias pesadas e leves por repertórios de variantes de ocorrência natural (repertórios) de genes do dominio V obtidos de dadores não imunizados. Esta técnica permite a produção de anticorpos e de fragmentos de anticorpos com afinidades na gama pM-nM. Uma estratégia para a produção de repertórios de anticorpos fágicos muito extensos (também conhecidos como "the mother-of-all-libraries") foi descrita por Waterhouse et al. Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). O shuffling genético também pode ser utilizado para derivar anticorpos humanos de anticorpos de roedores, nos casos em que o anticorpo humano possui afinidades e especificidades idênticas às do anticorpo de roedor original. De acordo com este método, que também pode ser designado de "impressão de epítopos", o gene do dominio V de cadeia pesada ou leve de anticorpos de roedores obtidos através da técnica de phage display é substituído por um repertório de genes humanos de domínio V, criando quimeras de roedor-humano. A selecção de antigénios resulta no isolamento de regiões variáveis humanas capazes de repor um local funcional de ligação de antigénio, ou seja, o epítopo dirige (imprime) a escolha do parceiro. Quando o processo é repetido de forma a -63- substituir o restante domínio V do roedor, obtém-se um anticorpo humano (veja-se a publicação de patente de invenção PCT n.° WO 93/06213, publicada no dia 1 de Abril de 1993) . Ao contrário do que acontece na humanização tradicional de anticorpos de roedor por enxerto de CDR, esta técnica proporciona anticorpos totalmente humanos sem resíduos de framework ou CDR de origem em roedor. É notório que, embora os dados acima apresentados sejam aplicáveis a anticorpos humanizados, os princípios gerais discutidos são aplicáveis a anticorpos adaptados para utilização, por exemplo, em cães, gatos, primatas, equídeos e bovinos. Além disso, é notório que um ou mais aspectos da humanização de anticorpos descrita podem ser combinados, por exemplo, com as técnicas de enxerto de CDR, mutação de framework e mutação de CDR.

Os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante isolando os anticorpos e as células produtoras de anticorpos dos animais hospedeiros, obtendo a sequência genética, e usando a sequência genética para expressar o anticorpo de forma recombinante nas células hospedeiras (por exemplo, células CHO). Um outro método que pode ser utilizado para expressar a sequência do anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgénico. Os métodos para expressão recombinante dos anticorpos em plantas ou leite já foram descritos. Veja-se, por exemplo,

Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001), Lonberg, N. e D. -64-

Huszar Int. Ver. Immunol. 13:65 (1995) e Pollock et al., J. Immunol. Methods 231:147 (1999). Os métodos para produção de derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeia única, etc., são já conhecidos na arte.

Os ensaios imunológicos e as técnicas de citometria de fluxo, como a separação de células activada pela fluorescência (FACS), também podem ser utilizados para isolar anticorpos específicos do NGF.

Os anticorpos podem ser ligados por vários veículos distintos. Os veículos podem ser activos e/ou inertes. Exemplos de veículos conhecidos incluem o polipropileno, polistireno, dextrano, nylon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetite. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel. Os especialistas da arte conhecerão outros veículos adequados para a ligação de anticorpos, ou serão capazes de inferir tais conhecidos através de experiências de rotina. 0 ADN que codifica os anticorpos monoclonais é rapidamente isolado e sequenciado através de procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleótidos capazes de se ligar especificamente a genes que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como fonte preferida para tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão (tais como os vectores de -65- expressão descritos na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 87/04462), que são depois transfectados em células hospedeiras, como as células de E. coli, células COS simio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, noutro caso, não produziriam proteina imunoglobulina, para obter a sintese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Veja-se, por exemplo, a publicação de patente de invenção PCT n.° WO 87/04462. O ADN também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência codificante dos dominios constantes de cadeia pesada e leve em vez das sequências homólogas murinas, Morrison et al.f Proc. Nat . Acad. Sei. 81:6851 (1984), ou juntando covalentemente à sequência codificante da imunoglobulina toda ou parte da sequência codificante de um polipéptido não imunoglobulina. Desta forma, são preparados anticorpos '"quiméricos" ou "híbridos" com uma especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal anti-NGF descrito.

Os anticorpos anti-NGF podem ser caracterizados usando métodos conhecidos. Por exemplo, um método consiste na identificação do epítopo que ao qual este se liga, ou "mapeamento de epítopos". Existem muitos métodos conhecidos para o mapeamento e caracterização da localização de epítopos nas proteínas, incluindo a resolução da estrutura cristalina de um complexo anticorpo-antigénio, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmentos génicos e -66- ensaios sintéticos baseados em péptidos, conforme descrito, por exemplo, no Capitulo 11 de Harlow e Lane, Using

Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1999. Num exemplo adicional, o mapeamento de epitopos também pode ser utilizado para determinar a sequência à qual o anticorpo anti-NGF se liga. 0 mapeamento de epitopos está disponível comercialmente em várias origens, por exemplo, na Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad,

Holanda) . 0 epítopo pode ser um epítopo linear, ou seja, contido numa só porção de aminoácidos, ou um epítopo conformacional formados por uma interacção tridimensional de aminoácidos que podem não necessariamente ser contida numa só porção (sequência linear da estrutura primária). Péptidos de várias extensões (por exemplo, com o comprimento de pelo menos 4-6 aminoácidos) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, de forma recombinante) e usados em ensaios de ligação com o anticorpo anti-NGF. Noutro exemplo, o epítopo ao qual o anticorpo anti-NGF se liga pode ser determinado por rastreio sistemático usando péptidos sobrepostos derivados da sequência de NGF e determinando a ligação do anticorpo anti-NGF. De acordo com os ensaios de expressão de fragmentos génicos, a grelha de leitura aberta ("open reading trame") que codifica o NGF é fragmentada aleatoriamente ou por determinadas construções genéticas e -67- é determinada a reactividade dos fragmentos expressos do NGF com o anticorpo testado. Os fragmentos génicos podem, por exemplo , ser produzidos por PCR e transcritos e traduzidos em proteínas in vitro, na presença de aminoácidos radioactivos. A ligação do anticorpo a fragmentos de NGF radioactivamente marcados é, depois, determinada através de imunoprecipitação e electroforese em gel. Determinados epitopos podem ser identificados através do uso de grandes bibliotecas de sequências peptidicas aleatórias apresentadas na superfície de partículas fágicas (bibliotecas fágicas). Em alternativa, uma determinada biblioteca de fragmentos peptídicos sobrepostos pode ser testada quanto à ligação ao anticorpo de teste num ensaio de ligação simples. Num exemplo adicional, podem realizar-se ensaios de mutagénese de um dominio de ligação antigénico, experiências de troca de dominios e mutagénese da alanina para identificar os residuos indispensáveis, suficientes e/ou necessários para a ligação do epítopo. Por exemplo, as experiências de troca de dominios podem ser realizadas usando um NGF mutante no qual foram substituídos (trocados) vários fragmentos do polipéptido NGF por sequências de uma proteína mais próxima mas antigenicamente distinta (tal como um outro membro da família das neurotrofinas). Ao avaliar a ligação do anticorpo ao NGF mutante, poderá avaliar-se a importância de determinado fragmento de NGF para a ligação do anticorpo. -68-

Um outro método que pode ser usado para caracterizar o anticorpo anti-NGF consiste na utilização de ensaios de competição com outros anticorpos que se sabe ligarem ao mesmo antigénio, ou seja, vários fragmentos de NGF, para determinar se o anticorpo anti-NGF liga ao mesmo epitopo que os outros anticorpos. Os ensaios de competição são perfeitamente conhecidos. Exemplos de anticorpos que podem ser usados em ensaios de competição na presente invenção incluem o Mab 911, 912 e 938, conforme descrito por Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Outros antagonistas do NGF

Os antagonistas do NGF que não os anticorpos anti-NGF são descritos com propósitos meramente comparativos. Um antagonista do NGF pode ser pelo menos uma molécula anti-sense com a capacidade de bloquear ou reduzir a expressão de um NGF funcional. As sequências de nucleótidos do NGF são conhecidas e são disponíveis a partir de bases de dados de acesso público. Veja-se, por exemplo, Borsani et al., Nuc. Acids Res. 1990, 18, 4020, Accession n.° NM 002506; Ullrich et al., Nature 303:821-825 (1983). É comum preparar moléculas de oligonucleótidos anti-sense que especificamente se ligam ao mRNA do NGF sem qualquer reacção cruzada com outros polinucleótidos. Exemplos de locais alvo incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de -69- limitação, o codão de iniciação, as cinco regiões regulatórias, a sequência codificante e as 3 regiões não traduzidas. Os oligonucleótidos podem ter o comprimento de entre cerca de 10 e 100 nucleótidos, entre cerca de 15 a 50 nucleótidos, entre cerca de 18 a 25 nucleótidos, ou mais. Os oligonucleótidos podem incluir modificações dorsais como, por exemplo, ligações fosforotioato e modificações 2' -O açúcar conhecidas. Exemplos de moléculas anti-sense incluem as moléculas anti-sense do NGF descritas na publicação norte-americana n.° 20010046959, veja-se, também, o website http://www.ma-tec.com/repair.htm.

Um antagonista do NGF pode pelo menos ser uma molécula anti-sense com a capacidade de bloquear ou reduzir a expressão de um receptor funcional de NGF (tal como TrkA e/ou p75). Woolf et al., J. Neurosci. (2001) 21(3):1047-55, Taglialetela et al., J. Neurochem. (1996) 66(5): 1826-35. As sequências de nucleótidos de TrkA e p75 são conhecidas e disponíveis a partir de bases de dados públicas.

Em alternativa, a expressão de NGF e/ou libertação e/ou expressão do receptor de NGF podem ser reduzidas usando o silenciamento de genes, inactivação por oligonucleótidos morfolino, RNAi ou ribozimas, métodos perfeitamente conhecidos. Veja-se http://www.macalester.ed/-montgomery/RNAi.html; http://pub32.ezboard.com/morpholinosfrml9.showMessage?topic ID=6.topic; hrlp://www.highveld.com/ribozyme.html. -70-

Um antagonista do NGF pode, pelo menos, ser um composto inibidor do NFG. Conforme usado, o termo "composto inibidor do NGF" diz respeito a um composto que não um anticorpo anti-NGF que, directa ou indirectamente, reduz, inibe, neutraliza ou abole a actividade biológica do NGF. Um composto inibidor do NGF deverá apresentar uma ou mais das seguintes caracteristicas: (a) ligar a um NGF e inibir a

actividade biológica do NGF e/ou vias a jusante mediadas pela função de sinalização do NGF; (b) prevenir, melhorar ou tratar qualquer aspecto da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas; (c) bloquear ou reduzir a activação do receptor do NGF (incluindo a dimerização e/ou auto-fosforilação do receptor TrkA); (d) aumentar a depuração do NGF; (e) inibir (reduzir) a síntese, produção ou libertação do NGF.

Exemplos de compostos inibidores do NGF incluem os inibidores do NGF de pequena molécula descritos na publicação de patente norte-americana n.° 20010046959, os compostos que inibem a ligação dos NGF's ao p75, conforme descrito na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 00/69829, e PD90780, ácido [ 7-(benzolilamino)-4,9-dihidro-4-metil-9-oxo-pirazolo[5,1—b]quinazolina-2-carboxílico] conforme descrito por Colquhoun et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 310(2)505-11 (2004), os compostos que inibem a ligação do NGF ao TrkA e/ou ao p75, conforme descrito na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 98/17278. -71 -

Exemplos adicionais de compostos inibidores de NGF incluem os compostos descritos na publicação de patente de invenção PCT n.os WO 02/17914 e WO 02/20479, e nas patentes de invenção norte-americanas n.os 5342942, 6127401 e 6359130. Outros exemplos de compostos inibidores do NGF dizem respeito aos compostos que são inibidores competitivos do NGF. Veja-se a patente de invenção norte-americana n.° 6291247. Além disso, os conhecedores da arte poderão preparar outras pequenas moléculas de compostos inibidores do NGF.

Um composto inibidor do NGF liga-se ao NGF. Exemplos de locais alvo incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a porção do NGF que se liga ao receptor TrkA e/ou ao receptor p75, e aquelas porções do NGF que são adjacentes à região de ligação do receptor e que são responsáveis, em parte, pela correcta forma tridimensional da porção de ligação do receptor. Um composto inibidor do NGF pode ligar-se a um receptor do NGF (tal como o TrkA e/ou p75) e inibir uma actividade biológica do NGF. Exemplos de locais alvo incluem aquelas porções do TrkA e/ou do p75 que se ligam ao NGF.

Uma pequena molécula pode apresentar um peso molecular de cerca de 100 a 20 000 daltons, entre 500 e 15 000 daltons, ou entre 1000 e 10 000 daltons. As bibliotecas de pequenas moléculas encontram-se disponíveis no mercado. As pequenas moléculas podem ser administradas através das vias -72- conhecidas, incluindo por inalação, por via intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratecal, intraventricular, oral, entérica, parentérica, intranasal ou dérmica. No geral, quando o antagonista do NGF, de acordo com a invenção, é uma pequena molécula, este deverá ser administrado a um regime de 0,1 a 300 mg/kg de peso do paciente, dividido em uma a três ou mais doses. Para um paciente adulto de peso normal, podem ser administradas doses variáveis entre 1 mg a 5 mg por dose.

Um antagonista do NGF pode ser pelo menos um análogo estrutural do NGF. Os "análogos estruturais do NGF" dizem respeito a compostos com uma estrutura tridimensional idêntica como parte do NGF e que se liga a um receptor do NGF sob condições fisiológicas in vivo e in vitro, em que a ligação inibe, pelo menos parcialmente, uma actividade biológica do NGF. Um análogo estrutural do NGF pode ligar-se a um receptor TrkA e/ou a um receptor p75. Exemplos de análogos estruturais do NGF incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os péptideos bicíclicos descritos na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 97/15593, os péptidos biciclicos descritos na patente de invenção norte-americana n.° 6291247, os compostos cíclicos descritos na patente de invenção norte-americana n.° 6017878, e os péptidos derivados de NGF descritos na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 89/09225. Os análogos estruturais do NGF também podem ser concebidos e -73- sintetizados através de modelagem molecular da ligação do NGF ao receptor, por exemplo, através do método descrito na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 98/06048. Os análogos estruturais do NGF podem ser monómeros ou dimeros/oligómeros em qualquer combinação desejada com a mesma ou diferentes estruturas para obter afinidades e efeitos biológicos optimizados.

Um antagonista do NGF pode ser pelo menos um mutante dominante negativo do receptor TrkA e/ou receptor p75. Os conhecedores da arte podem preparar mutantes dominante negativo, por exemplo, do receptor TrkA, de forma que o receptor ligue ao NGF e, assim, actue como um "escoadouro" para capturar os NGF's. No entanto, os mutantes dominantes negativos não possuem a bioactividade normal do receptor TrkA após ligação ao NGF. Exemplos de mutantes dominantes negativos incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os mutantes descritos nas seguintes referências:

Li et al. ,, Proc. Natl. Acad. Set. USA 1998, 35, 10884, Eide et al., J. Neurosci. 1996, 16, 3123, Liu et al., J. Neurosci. , 1997, 17, 8749, Klein et al., Cell 1990, 61, 647,

Valenzuela et al., Neuron 1993, 10, 963, Tsoulfas et al., Neuron 1993, 10, 975, e Lamballe et al., EMBO J. 1993, 12, 3083. Os mutantes dominantes negativos podem ser administrados sob a forma de proteínas ou sob a forma de um vector de expressão de maneira que o mutante dominante negativo, por exemplo, o receptor mutante TrkA, é expresso -74- in vivo. A proteína ou vector de expressão podem ser administrados através de quaisquer métodos conhecidos, tais como por via intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratecal, intraventricular, oral, entérica, parentérica, intranasal, dérmica ou por inalação. Por exemplo, a administração de vectores de expressão inclui a administração local ou sistémica, incluindo injecção, administração oral, administração por pistola de partículas, administração por cateter e administração tópica. Os conhecedores da arte estarão familiarizados com a administração de vectores de expressão para obter a expressão de uma proteína exógena in vivo. Veja-se, por exemplo, as patentes de invenção norte-americanas n.os 6436908, 6413942 e 6376471.

Também pode utilizar-se a libertação direccionada das composições terapêuticas contendo polinucleótidos anti-sense, vector de expressão ou polinucleótidos subgenómicos. As técnicas de libertação de ADN mediadas pelo receptor são descritas, por exemplo, por Findeis et al.r Trends Biotechnol. (1993) 11:202, Chiou et al., Gene Therapeutícs: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (j. A. Wolff, ed.) (1994), Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621, Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269 :5 4 2, Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87 :3655, Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266 :338. Composições terapêuticas contendo um polinucleótido são administradas -75- numa gama entre cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de ADN para administração local num protocolo de terapia génica. As gamas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 pg a cerca de 2 mg, cerca de 5 pg a cerca de 500 pg, e cerca de 200 pg a cerca de 100 pg de ADN ou mais, também podem ser usadas durante um protocolo de terapia génica. Os polinucleótidos e polipéptidos terapêuticos podem ser libertados usando veículos de libertação de genes. O veículo de libertação de genes pode ser de origem virai ou não virai (veja-se, com carácter geral, Jolly, Câncer Gene Therapy (1994) 1:51, Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845, Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185, e Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). A expressão de tais sequências codificantes pode ser induzida usando promotores e/ou facilitadores endógenos ou heterólogos de mamíferos. A expressão da sequência codificante pode ser constitutiva ou regulada.

Os vectores virais para libertação de um polinucleótido desejado e expressão numa célula desejada são conhecidos na arte. Exemplos de veículos virais incluem, sem que tal constitua qualquer limitação, os retrovírus recombinantes (veja-se, por exemplo, as publicações de patentes de invenção PCT n .os WO 90/07936, WO 94/03622 , WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, as patentes de invenção norte -americanas n.os 5219740 e 4777127, a patente de invenção inglesa n.° 2200651 e a -76- patente EP n.° 0345242), vectores com base em alfavírus (por exemplo, vectores de vírus Sindbis, vírus da floresta de Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), vírus do rio Ross (ATCC VR-373, ATCC VR-1246) e o vírus da encefalite equina venezuelana (ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR 1249, ATCC VR-532)) e vectores virais adeno-associados (veja-se, por exemplo, as publicações de patente de invenção n.os WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984 e WO 95/00655). A administração de ADN ligado a adenovírus morto, conforme descrita in Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 também pode ser utilizada.

Os veículos e métodos de libertação não virais também podem ser utilizados, incluindo, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, ADN policatiónico condensado ligado ou não a adenovírus morto (veja-se, por exemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147), ADN ligado a ligando (veja-se, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985), veículos celulares de células eucariotas (veja-se, por exemplo, a patente de invenção norte-americana n.° 5814482, as publicações de patentes de invenção PCT n.os WO 95/07994, wo 96/17072, wo 95/30763 e WO 97/42338) e a neutralização de carga nucleica ou fusão com membranas celulares. Também pode utilizar-se ADN livre (’’naked ADN"). Exemplos de métodos de introdução de ADN livre são descritos na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 90/11092 e na 5580859. Os patente de invenção norte-americana n. -77- lipossomas que podem actuar como veículos de libertação génica são descritos na patente de invenção norte-americana n.° 5422120, nas publicações de patentes de invenção PCI n.os WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 e na patente de invenção EP n.° 0524968. Outras abordagens são descritas em Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, e em Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:1581.

Também será óbvio que um vector de expressão também pode ser usado para direccionar a expressão de quaisquer antagonistas do NGF com base em proteínas descritos adiante (por exemplo, anticorpo anti-NGF, imunoadesina TrkA, etc.). Por exemplo, outros fragmentos do receptor TrkA capazes de bloquear (bloqueio parcial a completo) o NGF e/ou uma actividade biológica do NGF, são já conhecidos.

Um antagonista do NGF pode ser pelo menos uma imunoadesina TrkA. As imunoadesinas TrkA, conforme utilizadas, dizem respeito a moléculas quiméricas solúveis que incluem o domínio extracelular de um receptor TrkA e de uma sequência de imunoglobulina, que retém a especificidade de ligação do receptor TrkA (substancialmente retém a especificidade de ligação do receptor TrkA) e tem a capacidade de se ligar ao NGF .

As imunoadesinas TrkA são conhecidas na arte, e concluiu-se que bloqueiam a ligação do NGF ao receptor TrkA. Veja-se, por exemplo, a patente de invenção norte-americana n.° 6153189. Brennan et al. relataram a administraçao de -78- imunoadesina TrkA num modelo de rato com dor pós-operatória. Veja-se Society for Neuroscience Abstracts 24 (1-2) 880 (1998) . A imunoadesina TrkA pode incluir uma fusão de uma sequência de aminoácido do receptor TrkA (ou uma porção da mesma) a partir de um domínio extracelular do TrkA capaz de se ligar ao NGF (por exemplo, uma sequência de aminoácido que retém substancialmente a especificidade de ligação do receptor TrkA) e uma sequência de imunoglobulina. O receptor TrkA também pode ser uma sequência de receptor TrkA humano, e a fusão dá-se com uma sequência de domínio constante da imunoglobulina. A sequência de domínio constante da imunoglobulina pode ser uma sequência de domínio constante da imunoglobulina de cadeia pesada. A associação de duas fusões entre o receptor TrkA e as cadeias pesadas de imunoglobulina (por exemplo, através de ligação covalente por ligação(ões) dissulfito pode resultar numa estrutura homodimérica idêntica a imunoglobulina. Uma cadeia leve de imunoglobulina pode também ser associada a uma ou ambas as quimeras receptor TrkA-imunoglobulina no dímero ligado por dissulfito, obtendo-se uma estrutura homotrimérica ou homotetramérica. Exemplos de imunoadesinas TrkA adequadas incluem aquelas descritas na patente de invenção norte-americana n.° 6153189.

Um antagonista do NGF pode ser pelo menos um anticorpo anti-TrkA capaz de bloquear, suprimir, alterar e/ou reduzir -79- a interacção física do NGF com o receptor TrkA e/ou a sinalização a jusante, sendo que uma actividade biológica do NGF é reduzida e/ou bloqueada. Os anticorpos anti-TrkA são conhecidos. Exemplos de anticorpos anti-TrkA incluem aqueles descritos na publicação de patente de invenção PCT n.os WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15924 e na patente de invenção norte-americana n.° 20010046959.

Um antagonista do NGF pode ser pelo menos um anticorpo anti-p75 capaz de bloquear, suprimir e/ou reduzir a interacção física do NGF com o receptor p75 e/ou a sinalização a jusante, sendo que uma actividade biológica do NGF é reduzida e/ou bloqueada.

Um antagonista do NGF pode ser pelo menos um inibidor da cinase capaz de inibir a sinalização da cinase a jusante associada com a actividade do receptor TrkA e/ou p75. Um exemplo de um inibidor da cinase é o K252a ou K252b, já conhecidos e descritos em Knusel et al., J. Neurochem. 59:715-722 (1992), Knusel et al., J. Neurochemistry 57:955-962 (1991), Koizumi et al., J. Neuroscience 8 :715-721 (1988), Hirata et al., Chemical Abstracts 111 :728, o XP00204135, veja-se o resumo e o índice da 12th Collective Chemical Substance Index, pág. 34237, c.3 (5-7), 55-60, 66-69), p. 34238, c.l (41-44), c.2 (25-27, 32-33), p. 3423, c.3 (48-50, 52-53), e a patente de invenção norte-americana n.° 6306849. -80- É expectável que várias outras categorias de antagonistas do NGF sejam identificadas, se necessário, pelo especialista.

Identificação de anticorpo antagonista anti-NGF

Os anticorpos anti-NGF podem ser identificados ou caracterizados através de métodos conhecidos, sendo que a redução, melhoria ou neutralização de uma actividade biológica do NGF é detectada e/ou medida. Os métodos descritos na publicação de patente de invenção PCT n.° WO 04/065560 também podem ser utilizados. Outro método, por exemplo, um ensaio de activação do receptor da cinase (KIRA) descrito nas patentes de invenção norte-americanas n.os 5766863 e 5891650, pode ser usado para identificar os antagonistas do NGF. Este ensaio tipo ELISA é adequado para a medição qualitativa ou quantitativa da activação da cinase através da medição da auto-fosforilação do domínio cinase de um receptor da proteína tirosina cinase (adiante designada por "rPTK"), por exemplo, o receptor TrkA, bem como para a identificação e caracterização de potenciais antagonistas de um rPTK seleccionado, por exemplo, TrkA. A primeira fase do ensaio envolve a fosforilação do domínio cinase de um receptor da cinase, por exemplo, um receptor da TrkA, em que o receptor está presente na membrana celular de uma célula eucariota. O receptor pode ser um -81- receptor endógeno ou ácido nucleico codificando o receptor, ou uma construção do receptor, que pode ser transformado em célula. Tipicamente, uma primeira fase sólida (por exemplo, um poço de uma primeira placa de ensaio) é revestida com uma população substancialmente homogénea das referidas células (geralmente uma linha celular de mamífero), de forma que as células aderem à fase sólida. Com frequência, as células são aderentes e, por isso, aderem naturalmente à primeira fase sólida. Se for utilizada uma "construção do receptor", esta geralmente inclui uma fusão do receptor da cinase e um polipéptido flag. 0 polipéptido flag é reconhecido pelo agente de captura, muitas vezes um anticorpo de captura, na parte ELISA do ensaio. Um analito, tal como um candidato a anticorpo anti-NGF ou outros antagonistas do NGF, é depois adicionado, juntamente com o NGF, aos poços com células aderentes, de forma que o receptor da tirosina cinase (por exemplo, o receptor da TrkA) é exposto (ou colocado em contacto com) o NGF e com o analito. Este ensaio permite a identificação de anticorpos (ou outros antagonistas do NGF) que inibem a activação do TrkA por parte do seu ligando NGF. Após a exposição ao NGF e ao analito, as células aderentes são solubilizadas usando um tampão de lise (que inclui um detergente solubilizante) e agitação suave, libertando assim o lisato que pode ser directamente sujeito à parte ELISA do ensaio, sem a -82- necessidade de concentração ou clarificação do lisato celular. 0 lisato celular preparado desta forma está, assim, pronto para ser sujeito à fase ELISA do ensaio. Como primeiro passo da fase ELISA, uma segunda fase sólida (geralmente um poço de uma placa para microtitulação para ensaio ELISA) é revestida com um agente de captura (geralmente um anticorpo de captura) que se liga especificamente ao receptor da tirosina cinase ou, no caso de uma construção de receptor, ao polipéptido flag. 0 revestimento da segunda fase sólida é realizado de forma que o agente de captura adere à segunda fase sólida. 0 agente de captura é geralmente um anticorpo monoclonal mas, conforme descrito nos exemplos, os anticorpos policlonais também podem ser utilizados. O lisato celular obtido é, depois, exposto ou colocado em contacto com o agente de captura aderente, de forma que o receptor ou construção de receptor adere (ou é capturado) na segunda fase sólida. De seguida, é realizado um passo de lavagem, para remover o lisato celular não ligado, abandonando o receptor ou construção de receptor capturado. 0 receptor ou construção de receptor é depois exposto a, ou colocado em contacto com, um anticorpo anti-fosfotirosina, que identifica os residuos de tirosina fosforilados no receptor da tirosina cinase. Numa variante, o anticorpo anti-fosfotirosina é conjugado (directa ou indirectamente) a uma enzima que catalisa uma alteração da cor de um -83- reagente de cor não radioactivo. Assim sendo, a fosforilação do receptor pode ser medida através de uma subsequente alteração de cor do reagente. A enzima pode ser ligada ao anticorpo anti-fosfotirosina directamente, ou uma molécula conjugada (por exemplo, biotina) pode ser conjugada com o anticorpo anti-fosfotirosina e a enzima pode ser subsequentemente ligada ao anticorpo anti-fosfotirosina através de uma molécula conjugante. Por fim, é medida a ligação do anticorpo anti-fosfotirosina ao receptor ou construção de receptor capturados, por exemplo, através da alteração da cor no reagente. 0 anticorpo antagonista anti-NGF também pode ser identificado através da incubação de um agente candidato com NGF e da monitorização de uma ou mais das seguintes caracteristicas: (a) ligar a um NGF e inibir a actividade biológica do NGF e/ou vias a jusante mediadas pela função de sinalização do NGF; (b) prevenir, melhorar ou tratar qualquer aspecto da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas; (c) bloquear ou reduzir a activação do receptor do NGF (incluindo a dimerização e/ou auto-fosforilação do receptor TrkA); (d) aumentar a depuração do NGF; (e) inibir (reduzir) a sintese, produção ou libertação do NGF. Nalgumas variantes, um antagonista do NGF é identificado através da incubação de um agente candidato com NGF e monitorização da ligação e redução ou neutralização de uma -84- actividade biológica do NGF. 0 ensaio de ligação pode ser realizado com polipéptido(s) de NGF purificado(s), ou com células que naturalmente expressam, ou transfectadas para expressar, polipéptido(s) de NGF. Numa variante, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação de competição, em que se avalia a capacidade de um anticorpo candidato competir com um antagonista de NGF conhecido. 0 ensaio pode ser realizado em vários formatos, incluindo o formato ELISA. Noutras variantes, um antagonista do NGF é identificado através da incubação de um agente candidato com NGF e monitorização da inibição da dimerização e/ou auto-fosforilação do receptor TrkA.

Após a identificação inicial, a actividade do anticorpo antagonista anti-NGF candidato pode ser posteriormente confirmada e refinada por meio de ensaios biológicos, que testam as actividades biológicas específicas. Em alternativa, os ensaios biológicos podem ser usados para seleccionar directamente os candidatos. Por exemplo, o NGF promove uma série de alterações morfologicamente visíveis nas células que respondem. Estes incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, a promoção da diferenciação das células PC 12 e a optimização do crescimento de neuritos a partir destas células (Greene e Tischler, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 73:2424-2428 (1976), Urfer et al., Biochem 36:4775-4781 (1997), Tsouflas et al.,

Neuron 10:975-990 (1993)), a promoção de prolongamentos -85- neuríticos de explantes de gânglios sensoriais e simpáticos (Levi-Montalcini, R. e Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48, 534-569 (1968) e a promoção da sobrevivência de neurónios dependentes do NGF, tais como os gânglios das raizes dorsais, os gânglios trigeminais ou os neurónios dos gânglios simpáticos (por exemplo, Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711 (1977), Buchman & Davies, Development 118:989-1001 (1993). Assim, o ensaio de inibição da actividade biológica do NGF envolve a cultura de células que respondem ao NGF com NGF mais um analito, tal como um anticorpo anti-NGF candidato ou um candidato a antagonista do NGF. Após um período de tempo adequado, a resposta celular será ensaiada (diferenciação celular, crescimento de neuritos ou sobrevivência celular). A capacidade de um anticorpo antagonista anti-NGF candidato em bloquear ou neutralizar uma actividade biológica do NFG pode ser avaliada através da monitorização da capacidade do agente candidato em inibir a sobrevivência mediada pelo NGF nos gânglios das raízes dorsais de ratos, conforme descrito por Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Composições para utilização nos métodos da invenção

As composiçoes para utilização na invenção incluem uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-NGF e, nalgumas variantes inclui também um excipiente -86- farmaceuticamente eficaz. Nalgumas variantes, a composição destina-se a ser utilizada em qualquer uma das terapias descritas. Exemplos de tais composições, bem como os métodos para as formular, também são descritos numa secção anterior e adiante. Numa variante, a composição inclui um anticorpo antagonista anti-NGF. Numa outra variante, a composição inclui um ou mais anticorpo antagonista anti-NGF. Em algumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF liga-se ao NGF e não provoca reacções cruzadas significativas com as neurotrofinas associadas (tais como NT3, NT4/5 e/ou BDNF). Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não é associado a uma resposta imunológica adversa. Noutras variantes, o anticorpo anti-NGF reconhece o NGF humano. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é humano. Ainda noutras variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é humanizado (tal como o anticorpo E3 descrito). Ainda noutra variante, o anticorpo antagonista anti-NGF inclui uma região constante que não desencadeia uma resposta imunológica indesejada, tal como a lise mediada pelo anticorpo ou ADCC. Noutras variantes, o anticorpo anti-NGF inclui uma ou mais CDR('s) do anticorpo E3 (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou, nalgumas variantes, as seis CDR's do E3). É evidente que as composições podem inclui mais do que um anticorpo antagonista anti-NGF. Por exemplo, uma composição pode incluir mais do que um membro de uma classe de -87- antagonista do NGF (por exemplo, uma mistura de anticorpos anti-NGF que reconhecem diferentes epitopos do NGF), bem como membros de diferentes classes de antagonistas do NGF (por exemplo, um anticorpo anti-NGF e um composto inibidor do NGF). Outros exemplos de composições incluem mais do que um anticorpo anti-NGF que reconhecem o(s) mesmo(s) epitopo(s), diferentes espécies de anticorpos anti-NGF que se ligam a diferentes epitopos do NGF, ou diferentes compostos inibidores do NGF. A composição usada na presente invenção pode também incluir veiculos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a ed. (2000) Lippincott Williams e Wilkins, Ed. K. E. Hoover), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizantes são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, e podem incluir tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes incluindo o ácido ascórbico e a metionina, conservantes como cloreto de benzildimetil(octadecil)amónio, cloreto hexametónio, cloreto benzalcónio, cloreto de benzetónio, fenol, butilo ou álcool benzílico, parabenos alquilo como o parabeno metilo ou propilo, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol), polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos), proteínas como a albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas -88- polímeros hidrófilos como a polivinilpirrolidona, aminoácidos como a glicina, glutamina, aspargina, histidina, arginina ou lisina, monossacarideos, dissacarideos e outros hidratos de carbono incluindo a glicose, manose ou dextranos, agentes quelantes como a EDTA, açúcares como a sacarose, manitol, trealose ou sorbitol, contra-iões formadores de sais como o sódio, complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteinas Zn) e/ou tensioactivos não iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são adiante descritos. O anticorpo antagonista anti-NGF e composições dos mesmos também podem ser usados em conjunção com outros agentes que servam para optimizar e/ou complementar a eficácia dos agentes. Nalgumas variantes, o outro agente é um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o outro agente é um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o outro agente não é um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o outro agente não é um ΑΙΝΕ.

Kits

Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes que incluem um anticorpo antagonista anti-NGF, tal como o anticorpo E3 humanizado descrito) e, nalgumas variantes, incluem também as intruções para utilização de acordo com qualquer um dos métodos da invenção descritos. Nalgumas -89- variantes, o kit inclui um anticorpo antagonista anti-NGF (tal como o anticorpo E3 descrito) . Noutras invenções, o kit inclui um anticorpo anti-NGF que inclui uma ou mais CDR('s) do anticorpo E3 (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou, nalgumas variantes, as seis CDR's do E3). Nalgumas variantes, o kit inclui um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o kit inclui um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o kit não inclui um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o kit não inclui um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, as instruções incluídas incluem uma descrição da administração do anticorpo antagonista anti-NGF para tratar, melhorar ou prevenir a dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas de acordo com qualquer um dos métodos descritos. 0 kit pode incluir uma descrição da selecção de um indivíduo adequado para tratamento com base na identificação se o indivíduo apresenta dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas, ou se o indivíduo está em risco de desenvolver dor associada ao cancro ósseo incluindo a dor associada às metástases ósseas. Ainda noutras variantes, as instruções incluem uma descrição da administração de um anticorpo antagonista anti-NGF para tratar, prevenir e/ou melhorar a dor associada ao cancro ósseo incluindo a dor associada às metástases ósseas. Ainda noutras variantes, as instruções incluem uma descrição da administração de um anticorpo antagonista anti-NGF a um indivíduo em risco de desenvolver -90- dor associada ao cancro ósseo incluindo a dor associada às metástases ósseas. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é co-administrado com um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF é co-administrado com um analgésico opióide e com um ΑΙΝΕ. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não é co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF não é co-administrado com um ΑΙΝΕ.

As instruções relacionadas com a utilização de um anticorpo antagonista anti-NGF geralmente incluem informações acerca da dosagem, horário de dosage e via de administração do tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens avulsas (por exemplo, embalagens multi-dose) ou doses sub-unitárias. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas numa etiqueta ou bula da embalagem (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas também são aceitáveis instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções presentes num disco de armazenamento magnético ou óptico) . A etiqueta ou bula da embalagem indica que a composição é usada no tratamento, melhoria e/ou prevenção da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às -91- metástases ósseas. As instruções podem ser proporcionadas na realização de qualquer um dos métodos descritos.

Os kits da presente invenção encontram-se numa embalagem adequada. As embalagens adequadas incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os frascos, garrafas, boiões, embalagens flexiveis (por exemplo, sacos selados de Mylar ou plástico) e semelhantes. Também são contempladas as embalagens para utilização em combinação com um determinado dispositivo, como um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão, como uma mini-bomba. Um kit pode possuir uma porta de acesso esterilizada (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa que pode ser perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). Pelo menos um agente activo na composição é um anticorpo antagonista anti-NGF. O recipiente pode também incluir um segundo agente farmaceuticamente activo.

Os kits podem, opcionalmente, proporcionar componentes adicionais como tampões e informações interpretativas. Normalmente, o kit inclui um recipiente e uma etiqueta ou bula no interior ou associada ao recipiente.

Nalgumas variantes, a invenção proporciona artigos de produção que incluem os conteúdos dos kits supra descritos. Nalgumas variantes, os kits incluem um anticorpo antagonista anti-NGF com informação relacionada com a -92- utilização no tratamento da dor associada ao cancro ósseo, incluindo a dor associada às metástases ósseas.

Administração de um anticorpo antagonista anti-NGF e avaliação do tratamento 0 anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado a um indivíduo através de qualquer via adequada. Por exemplo, o anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado por via oral, intravenosa, sublingual, subcutânea, intra-arterial, intrasinovial, intravescicular (tal como através da bexiga), intramuscular, intracardíaca, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular, por inalação, através de supositório e transdérmica. Os anticorpos antagonistas anti-NGF podem ser administrados por via oral, por exemplo, sob a forma de comprimidos, drops, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas, rebuçados, pastilha elástica ou semelhante, preparados através de procedimentos conhecidos. Será óbvio a um conhecedor da arte que os exemplos descritos não são limitativos da invenção, mas sim meramente ilustrativos das técnicas disponíveis.

Assim, nalgumas variantes, o anticorpo anti-NGF é administrado a um indivíduo de acordo com métodos conhecidos, como a administração venosa, por exemplo, sob a forma de bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, ou por via intramuscular, -93- intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, por inalação ou por via tópica. Os nebulizadores comerciais para formulações liquidas, incluindo nebulizadores de jacto e nebulizadores ultrasónicos, são úteis para a administração. As formulações liquidas podem ser directamente nebulizadas e o pó liofilizado pode ser nebulizado após a reconstituição. Em alternativa, o anticorpo antagonista anti-NGF pode ser pulverizado usando uma formulação de fluorcarbono e um inalador-doseador, ou inalado sob a forma de pó liofilizado e moido.

Numa variante, o anticorpo antagonista anti-NGF é administrado através de técnicas de libertação local ou direccionada. Exemplos de técnicas de libertação local ou direccionada incluem várias fontes de libertação retardada implantáveis do anticorpo antagonista anti-NGF ou cateteres de libertação local, tais como cateteres de infusão, cateteres permanentes ou cateter de agulha, enxertos sintéticos, compressas, shunts e stents advenctícios ou outros dispositivos implantáveis, veículos específicos, injecção directa ou aplicação directa. Veja-se, por exemplo, a publicação de patente de invenção PCT n.° WO 00/53211 e a patente de invenção norte-americana n.° 5981568. Várias formulações de um anticorpo antagonista anti-NGF podem ser usadas para administração. Nalgumas variantes, um -94- anticorpo antagonista anti-NGF pode ser administrado de forma pura. Nalgumas variantes, o anticorpo antagonista anti-NGF pode estar presente em várias formulações, incluindo formulações que incluem um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos, e dizem respeito a substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar formar ou consistência, ou actuar como diluente. Excipientes adequados incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, agentes estabilizantes, agentes humidificantes e emulsionantes, sais de várias osmolaridades, agentes de encapsulamento, tampões e optimizadores da penetração na pele. Excipientes, bem como formulações para libertação de fármacos parentérica e não parentérica, são descritos em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20.a ed., Mack Publishing (2000).

Nalgumas variantes, estes agentes são formulados para serem administrados por injecção (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular, etc.). Assim, estes agentes podem ser combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis como o soro fisilógico, solução de Ringer, solução de dextrose, e semelhantes. O regime de dosagem, ou seja, dose, horário e repetição, dependerá do próprio indivíduo e dos seus antecedentes médicos. -95-

Um anticorpo anti-NGF pode ser administrado através de qualquer método, incluindo por injecção (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular, etc.). Os anticorpos anti-NGF também podem ser administrados por inalação, conforme descrito. Geralmente, na administração de anticorpos anti-NGF, a dosagem diária típica será de cerca de 2 mg/kg. No âmbito da presente invenção, uma dosagem típica diária poderá variar entre 0,1 pg/kg a 3 pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg a 30 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores supra mencionados. No caso de administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer a desejada supressão dos sintomas ou até serem obtidos níveis terapêuticos suficientes para reduzir a dor oncológica associada às metástases ósseas. Um exemplo de regime de dosagem inclui a administração de uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguida de uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpo anti-NGF, ou seguida de uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg em semanas alternadas. No entanto, podem ser úteis outros regimes de dosagem, dependendo do padrão de declínio farmacocinético que o médico especialista pretende obter. Por exemplo, é contemplada uma dosagem de uma a quatro vezes por semana. Nalgumas variantes, podem ser usadas dosagens que variam entre 3 pg/mg a cerca de 2 mg/kg (como sendo cerca de 3 -96- pg/mg, cerca de 10 pg/mg, cerca de 30 pg/mg, cerca de 100 pg/mg, cerca de 300 pg/mg, cerca de 1 mg/kg e cerca de 2 mg/kg). Nalgumas variantes, a frequência da dosagem é de uma vez por semana, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 4 semanas, uma vez a cada 5 semanas, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 7 semanas, uma vez a cada 8 semanas, uma vez a cada 9 semanas ou uma vez a cada 10 semanas, ou uma vez por mês, uma vez a cada 2 meses ou uma vez a cada 3 meses, ou mais. A evolução da terapia é facilmente monitorizada através de técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o anticorpo antagonista anti-NGF usado) pode variar ao longo do tempo. No âmbito da presente invenção, a dosagem adequada de um anticorpo antagonista anti-NGF dependerá do anticorpo antagonista anti-NGF (ou composições do mesmo) utilizado, do tipo e severidade da dor a tratar, do facto de o agente ser administrado com fins preventivos ou terapêuticos, de anteriores terapias, dos antecedentes clínicos do paciente e sua resposta do agente, e da opinião do próprio médico especialista. Geralmente, o médico especialista administra um anticorpo anti-NGF até obter uma dosagem que atinja os resultados desejados.

Considerações empíricas, como a meia-vida, geralmente contribuem para a determinação da dosagem. Por exemplo, os anticorpos compatíveis com o sistema imunitário humano, tais como anticorpos humanizados ou anticorpos totalmente -97- humanos, podem ser usados para prolongar a meia-vida do anticorpo e impedir que o anticorpo seja atacado pelo sistema imunitário do hospedeiro. A frequência de administração pode ser desterminada e ajustada no decorrer da terapia, e geralmente, mas não necessariamente, com base no tratamento e/ou supressão e/ou melhoria e/ou retardar da dor. Em alternativa, podem ser adequadas formulações de libertação contínua e prolongada. São conhecidas várias formulações e dispositivos para a obtenção de libertação controlada.

Numa variante, as dosagens de um anticorpo antagonista anti-NGF podem ser determinadas de forma impirica em indivíduos que receberam uma ou mais administrações de um anticorpo antagonista anti-NGF. Os indivíduos recebem dosagens progressivas de um anticorpo antagonista anti-NGF. Para avaliar a eficácia de um anticorpo antagonista anti-NGF, pode seguir-se um indicador de dor. A administração de um anticorpo antagonista anti-NGF, de acordo com o método na presente invenção, pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, do facto de a administração ser terapêutica ou profilática, e outros factores conhecidos. A administração de um anticorpo antagonista anti-NGF pode essencialmente ser contínua ao longo de um período de tempo pré-seleccionado ou pode consistir numa série de dosagens espaçadas, por exemplo, antes, durante ou depois do -98- desenvolvimento da dor. A administração pode ser efectuada antes, durante e/ou depois de o cancro ter metastizado para o osso, e qualquer outro evento que possa originar dor associada às metástases ósseas.

Nalgumas variantes, podem estar presentes mais do que um antagonista do NGF, tal como um anticorpo antagonista anti-NGF. Os antagonistas podem ser os mesmos ou diferentes entre si. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco antagonistas do NGF podem estar presentes. Geralmente, esses antagonistas do NGF têm actividades complementares que não se afectam adversamente entre si. Os antagonistas do NGF também podem ser utilizados em conjunção com outros agentes que servem para optimizar e/ou complementar a eficácia dos agentes. Nalgumas variantes, o antagonista do NGF não é co-administrado com um analgésico opióide. Nalgumas variantes, o antagonista do NGF não é co-administrado com um ΑΙΝΕ.

As formulações terapêuticas do anticorpo antagonista anti-NGF usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento através da mistura de um anticorpo com o desejado grau de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20.a ed. Mack Publishing (2000)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos aos receptores -99- nos níveis de dosagem e concentrações utilizadas, e podem incluir tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos, sais como o cloreto de sódio, antioxidantes incluindo o ácido ascórbico e a metionina, conservantes como cloreto de benzildimetil(octadecil)amónio, cloreto hexametónio, cloreto benzalcónio, cloreto de benzetónio, fenol, butilo ou álcool benzílico, parabenos alquilo como o parabeno metilo ou propilo, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol), polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos), proteínas como a albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas, polímeros hidrófilos como a polivinilpirrolidona, aminoácidos como a glicina, glutamina, aspargina, histidina, arginina ou lisina, monossacarídeos, dissacarídeos e outros hidratos de carbono incluindo a glicose, manose ou dextranos, agentes quelantes como a EDTA, açúcares como a sacarose, manitol, trealose ou sorbitol, contra-iões formadores de sais como o sódio, complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteínas Zn) e/ou tensioactivos não iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).

Os lipossomas contendo o anticorpo antagonista anti-NGF são preparados através de métodos conhecidos, tais cmo aquele

descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985), Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4030 (1980) e nas patentes de invenção norte-americanas -100- n.os 4485045 e 4544545. Os lipossomas com tempos de circulação optimizados são descritos na patente de invenção norte-americana n.° 5013556. Lipossomas particularmente úteis podem ser produzidos através do método de evaporação de fase reversacom uma composição lipidica que inclua fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE) . Os lipossomas são extrudidos por filtros com poros de dimensões definidas, dando origem a lipossomas com o desejado diâmetro.

Os ingredientes activos também podem ser retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metil-metacrilato), respectivamente, em sistemas de libertação coloidal de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20.a ed. Mack Publishing (2000).

Podem produzir-se preparados de libertação controlada. Exemplos adequados de preparados de libertação controlada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos hidrófobos, matrizes estas sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação controlada incluem poliésteres, -101- hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinilico), polilactideos (patente de invenção norte-americana n.° 3773919), copolimeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, acetato vinil etileno não degradável, copolimeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolide), isobutirato de acetato de sacarose e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico.

As formulações a serem utilizadas na administração in vivo deverão ser esterilizadas. Tal é prontamente atingivel, por exemplo, através de filtração por membranas de filtração esterilizada. As composições terapêuticas de anticorpos anti-NGF são geralmente colocadas num recipiente com uma porta de acesso esterilizada, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa que pode ser perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica.

As composições de acordo com a presente invenção podem encontrar-se so a forma de dosagens unitárias, como comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões, ou supositórios, ou para administração oral, parentérica ou rectal, ou administração por inalação ou insuflação.

Na preparação de composições sólidas como comprimidos, o principal ingrediente activo é misturado com um veículo farmacêutico, por exemplo, ingredientes de produção de -102 - comprimidos convencionais, como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato dicálcio ou gomas, e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma pré-formulação sólida contendo uma mistura homogénea de um composto da presente invenção, ou um sal não tóxico farmaceuticamente aceitável do mesmo. Ao qualificar as composições da pré-formulação de "homogéneas", significa que o ingrediente activo é disperso de forma equivalente ao longo da composição, de forma que esta pode ser subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes, como comprimidos, pílulas e cápsulas. Esta composição de pré-formulação sólida é, depois, subdividida em formas de dosagem unitárias do tipo supra descrito, contendo de 0,1 a cerca de 500 mg de ingrediente activo da presente invenção. Os comprimidos ou pílulas da presente composição podem ser revestidos ou compostos de forma a proporcionar uma forma de dosagem com a vantagem de conferir uma acção prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílua inclui um componente de dosagem interna e um componente de dosagem externa, encontrando-se o último sob a forma de um envelope em volta do primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permitir que o componente passe intacto pelo duodeno ou seja libertado de forma controlada. Podem ser utilizados vários materiais em tais camadas entéricas ou -103- revestimentos, como sendo materiais que incluem vários ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com tais materiais, como sendo a goma-laca e o acetato de celulose.

Agentes de superfície activa adequados incluem, em especial, os agentes não iónicos, como os polioxietileno-sorbitanos (por exemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 ou 85) e outros sorbitanos (por exemplo, Span™ 20, 40, 60, 80 ou 85) . Composições com um agente de superfície activa incluem, convenientemente, entre 0,05 e 5% de agente de superfície activa, e pode situar-se entre 0,1 e 2,5%. Será notório que podem ser adicionados outros ingredientes, por exemplo, manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, se necessário.

Podem preparar-se emulsões adequadas usando emulsões gordas comerciais, como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ e Lipiphysan™. O ingrediente activo pode ser diluído numa composição de emulsão previamente misturada ou pode ser diluída num óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de sementes de algodão, óleo de sésamo, óleo de milho ou óleo de amêndoas) e numa emulsão formada após mistura com um fosfolípido (por exemplo, fosfolípidos de ovo, fosfolípidos de soja ou lecitina de soja) e água. Será notório que podem ser adicionados outros ingredientes, por exemplo, glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. As emulsões adequadas tipicamente contêm até -104 - 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão gorda pode incluir goticulas gordas entre 0,01 e 1,0 pm, em especial 0,1 e 0,5 pm, e apresentam um pH entre 5.5 a 8.0. As composições de emulsões podem ser aquelas preparadas através da mistura de um antagonista do factor de crescimento nervoso com Intralipid™ ou componentes do mesmo (óleo de soja, fosfolipidos de ovo, glicerol e água).

As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, ou misturas dos mesmos, e pós. As composições liquidas ou sólidas podem conter os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, conforme supra definidos. Nalgumas variantes, as composições são administradas por via oral ou nasal para um efeito local ou sistémico. As composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis preferivelmente estéreis podem ser nebulizados através de gases. As soluções nebulizadas podem ser directamente inspiradas a partir do dispositivo nebulizador ou este pode encontrar-se fixo numa máscara facial, tenda ou máquina de ventilação por pressão positiva intermitente. Podem ser administradas composições de soluções, suspensões ou pós, preferivelmente por via oral ou nasal, através de dispositivos que libertam a formulação de forma adequada. A eficácia do tratamento pode ser avaliada através de métodos conhecidos. -105 -

EXEMPLOS São proporcionados os seguintes Exemplos sem quaisquer fins limitativos, mas sim meramente ilustrativos.

Exemplo 1

Anticorpo monoclonal anti-NGF eficaz no tratamento da dor oncológica associada às metástases ósseas

Utilizou-se um modelo murino de cancro ósseo para avaliar a eficácia do tratamento com anticorpo anti-NGF 911 (um anticorpo monoclonal de rato; veja-se Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Este modelo murino de dor associada ao cancro ósseo é desenvolvido por injecção intramedular de células de sarcoma osteoliticas no fémur do rato e o orificio da agulha é repleto com amálgama dentária para confinar o tumor ao osso. Veja-se Schwei et ai., J. Neuroscience 19:10886-10897 (1999) e Luger et al., Pain 99:397-406 (2002). Realizaram-se as experiências num rato adulto macho C3H/HeJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) . No dia 0, realizou-se uma artrotomia após indução de anestesia geral com pentobarbital sódico (50 mg/kg, intraperitoneal (i.p.)). Inseriu-se uma agulha no canal medular para criar uma via para as células de sarcoma. Fez-se uma depressão usando uma peça dentária pneumática de -106 - alta velocidade. Para além dos animais simples (n=5), gerou-se animais sham (n=5) com uma injecção de meio essencial a-minímo (20 μΐ, Sigma, St. Louis, MO) no espaço intramedular do fémur (designado sham), enquanto que os animais com sarcoma (n=5 para cada condição testada) foram injectados com meio contendo 105 2472 células de sarcoma osteolitico (designado sarcoma ou sare) (20 μΐ, ATCC, Rockville, MD) . Em todos os animais, selou-se o local da injecção com amálgama dentária para confinar as células ou meio injectada no interior do canal medular, seguido de irrigação com água esterilizada (solução hipotónica). Por fim, fechou-se a incisão com agrafos. Removeram-se os agrafos no 5.° dia de forma a não interferir com o teste comportamental. Um segundo grupo de animais injectados com sarcoma foi tratado com anti-NGF (10 mg/kg, i.p.) nos dias 6 e 13.

Análise comportamental. Testaram-se os animais quanto a comportamentos relacionados com a dor nos 10.° e 14.° dias após implantação do tumor. Os animais foram testados comportamentalmente usando os seguintes testes: dor continua (tensão espontânea e tremor), dor ambulatória (uso de membros e rotarod) e dor evocada por movimento (tensão evocada por palpação e tremor evocado por palpação). Colocaram-se os animais numa caixa de plástico transparente com uma base de malha de rede e permitiu-se que se familiarizassem durante um período de 30 minutos. Após -107 - adaptação, avaliaram-se os comportamentos de tensão espontânea, tremor espontâneo, uso de membros durante ambulação normal em campo aberto, e tensão durante ambulação forçada. Mediu-se a tensão induzida por palpação e tremor após o período de 2 minutos de palpação normalmente inofensiva do fémur distai dos animais injectados com sarcoma e dos animais sham.

Registou-se simultaneamente, durante o período de observação de 2 minutos, o número de tremores espontâneos e o tempo passado em tensão, representativos de comportamento nociceptivo. Definiu-se tensão como o tempo em que se manteve a pata elevada durante a locomoção, e os tremores como o número de vezes que o animal manteve a pata erguida. Registou-se a utilização normal dos membros durante a locomoção espontânea numa escala de 5 a 0: (5) utilização normal, e (0) total inexistência do uso de membros. Determinou-se a tensão forçada em locomoção usando um rotarod (Columbus Instruments, Columbus, OH) . A máquina rotarod consistia de um aparelho rotativo equipado com controlos de velocidade, aceleração e sensibilidade. Colocaram-se os animais no aparelho rotativo na velocidade X4, aceleração 8.0, e sensibilidade 2.5. Classificou-se a tensão forçada em locomoção numa escala de 5-0: (5) uso normal, e (0) inexistência total de uso.

Após uma palpação normalmente inofensiva do fémur distai em animais a cada segundo, durante 2 minutos, colocaram-se os -108- animais na caixa de observação e mediu-se a tensão induzida por palpação e os tremores induzidos por palpação, durante um período adicional de 2 minutos.

Tratamento com anticorpo anti-NGF. Nos 6.° e 13.° dias, os animais injectados com sarcoma foram injectados por via intraperitoneal (i.p.) com anticorpo anti-NGF 911 a 10 mg/kg (sare + anti-NGF, n=5), ou os animais injectados com sarcoma e sham foram injectados (i.p.) com soro fisiológico (sham + veie. ou sare + veie., n=5 para cada condição). Todos os animais foram analisados quanto ao comportamento nos 10.° e 14.° dias.

Avaliação de comportamentos de dor contínua. Conforme mostrado na Figura 1, os animais injectados com sarcoma (administrado com soro fisiológico) desenvolveram comportamentos de dor contínua, conforme avaliado pelo registo de tensão espontânea e tremor espontâneo (ambos p<0,05, ANOVA) comparativamente aos animais injectados com sham (administrado com soro fisiológico). A Figura 1 também mostra que a administração i.p. de anticorpo anti-NGF 911 reduziu significativamente a tensão espontânea e o tremor espontâneo em rato injectado com sarcoma nos 10.° e 14.° dias após implantação do sarcoma, comparativamente à administração de soro fisiológico em ratos injectados com sarcoma (p<0,05, ANOVA, na tensão espontânea e tremor espontâneo). Estes resultados indicam que o anticorpo anti- -109 - NGF 911 reduz a dor contínua em ratos injectados com sarcoma.

Avaliação de comportamentos de dor ambulatória. Conforme mostrado na Figura 2, os animais injectados com sarcoma (administrado com soro fisiológico) desenvolveram comportamentos de dor ambulatória, conforme avaliado pela utilização dos membros e tensão forçada em locomoção (rotarod) (ambos p< 0,05, ANOVA) comparativamente aos animais injectados com sham (administrado com soro fisiológico). A Figura 2 também mostra que a administração i.p. do anticorpo anti-NGF 911 aumentou significativamente (até perto do normal) o registo de uso dos membros e o registo de tensão forçada em locomoção em ratos injectados com sarcoma nos 10.° e 14.° dias após implantação do sarcoma, comparativamente à administração de soro fisiológico a ratos injectados com sarcoma (p< 0,05, ANOVA, no uso de membros e tremor forçado em locomoção). Estes resultados indicam que o anticorpo anti-NGF 911 reduz a dor ambulatória em ratos injectados com sarcoma.

Avaliação de comportamentos de dor evocada por toque. Conforme mostrado na Figura 3, os animais injectados com sarcoma (administrado com soro fisiológico) desenvolveram comportamentos evocados pelo toque, conforme avaliado pelo registo de tensão induzida pela palpação e tremor induzido por palpação (ambos p< 0,05, ANOVA), comparativamente a animais injectados com sham (administrado com soro -110- fisiológico). A Figura 3 também mostra que a administração i.p. do anticorpo anti-NGF 911 reduziu significativamente a tensão induzida pela palpação e o tremor induzido por palpação em rato injectado com sarcoma nos 10.° e 14.° dias após implantação do sarcoma, comparativamente à administração de soro fisiológico em rato injectado com sarcoma (p< 0,05, ANOVA, quer na tensão induzida pela palpação quer no tremor induzido por palpação).

Estes resultados indicam que o anticorpo anti-NGF 911 reduz a dor evocada pelo toque em rato injectado com sarcoma.

Exemplo 2

Anticorpo monoclonal anti-NGF é eficaz no tratamento da dor associada ao cancro ósseo e reduz várias alterações neuroquímicas associadas à sensibilização periférica e central nos gânglios das raízes dorsais e na espinal-medula Métodos

Animais. Realizaram-se experiências num total de 158 ratos adultos machos C3H/HeJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), pesando entre 20 e 25 g. Os ratos foram enjaulados de acordo com as directrizes do National Institute of Health, sob específicas condições isentas de patogénios (SPF) em jaulas com autoclave mantidas a 22°C com um ciclo de 12 -111 - horas alternado de luz e escuridão, tendo-lhes sido fornecido alimento e água ad libitum.

Cultura e injecção de células tumorais. Obtiveram-se células de sarcoma osteoliticas de murino (NCTC 2472, ATCC, Rockville, MD) , estavelmente transfectadas com proteína fluorescente verde (PGF) e mantidas conforme previamente descrito por Sabino et al., Câncer Res. 62:7343-9 (2002). Procedeu-se à injecção de células tumorais conforme descrito. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000), Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000), Luger et al., Câncer Research 61 :4038-4047 (2001). Resumidamente, após indução de anestesia geral com pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.), realizou-se uma artrotomia expondo os côndilos do fémur distai. Injectou-se solução salina de Hank (HBSS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; 20 μΐ, sham, n=4) ou meio contendo 105 células de sarcoma osteoliticas de murino (20 μΐ, NCTC 2472, ATCC, Rockville, MD, sarcoma, n=90) no espaço intramedular do fémur do rato e selou-se o local de injecção com amálgama dentária (Dentsply, Milford, DE), seguido de irrigação com água esterilizada. Utilizou-se uma meta de 14 dias, já que este é o ponto em que o tumor ainda se encontra confinado ao osso e existe máxima apresentação de comportamentos de dor associada ao cancro e máximas alterações na expressão dos marcadores neuroquimicos de sensibilização periférica e central. Os animais sham foram utilizados para análise de controlo de -112 - alterações neuroquímicas e histologia óssea, já que os animais simples não apresentaram diferenças comportamentais, neuroquímicas e histológicas.

Tratamento com anticorpo anti-NGF. Para avaliar o efeito do tratamento com anticorpo anti-NGF sobre os comportamentos associados à dor, às alterações neuroquímicas, ao crescimento tumoral e à destruição óssea, administrou-se o anticorpo anti-NGF (mAb 911, descrito em Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)) (10 mg/kg/a cada 5 dias, i.p.) com início 6 dias após injecção quando se observou visível destruição óssea e fim 14 dias após a injecção, quando se verificou destruição significativa do osso e se observaram comportamentos de dor. As doses utilizadas no actual estudo não provocaram quaisquer efeitos adversos, tais como hipoalgesia, nos ratos simples. Para monitorizar o estado de saúde geral dos ratos, procedeu-se ao registo dos pesos no início e no final das experiências.

Colocaram-se os ratos aleatoriamente em grupos de tratamento que receberam soro fisiológico (sham + veículo: n=28, sarcoma + veículo: n=35, 1,4 μΐ/g/a cada 5 dias, i.p.) ou um anticorpo anti-NGF (sham + anti-NGF, n=4, sarcoma + anti-NGF: n=23, 10 mg/kg/a cada 5 dias, i.p.) semanalmente. Para comparação comportamental do anticorpo anti-NGF com o sulfato de morfina, os ratos receberam uma dose de morfina 15 minutos antes do teste comportamental (simples: n=6, sham + veículo: n=8, sarcoma + veículo: n=8 -113- sarcoma + anti-NGF: n=8, sarcoma + morfina, 10 mg/kg, i.p.: n=8, sarcoma + morfina, 30 mg/kg, i.p.: n=8). Para teste da sensibilidade térmica e mecânica e avaliação da inervação da pele da pata traseira, dividiram-se os ratos em dois grupos de tratamento que receberam soro fisiológico (simples + veiculo: n=ll) ou anticorpo anti-NGF (simples + anti-NGF: n=ll, 10 mg/kg/a cada 5 dias, i.p.) semanalmente, durante 2 semanas.

Caracterização do anticorpo anti-NGF. O anticorpo antagonista anti-NGF (mAb 911) é eficaz no bloqueio da ligação do NGF aos receptores do NGF TrkA e p75 e na inibição da auto-fosforilação do TrkA e no bloqueio da sobrevivência dos neurónios sensoriais dos gânglios da raiz dorsal dependente do NGF. Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Eutanásia e análise tecidual. Os ratos foram sacrificados no 14.° dia após injecção do tumor e analisaram-se os tecidos por técnica imunohistoquímica da medula espinal, dos gânglios da raiz dorsal (DRG) conforme anteriormente descrito, e da pele da pata traseira. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000), Luger et al., Câncer Research 61: 4038-4047 (2001) . Resumidamente, os ratos receberam um estimulo mecânico normalmente inofensivo do joelho injectado 1 hora e meia antes da eutanásia para indução da expressão do c-Fos. Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000), Hunt et al., Nature 328: 632-634 (1987). -114 -

Depois desta manipulação, os ratos foram eutanizados com CO2 e sujeitos a perfusão intracardiaca com 12 ml 0,1 M de tampão fosfato (PBS) seguido de 25 ml de uma solução de 4% de formaldeido/12,5% de ácido picrico.

Os segmentos da espinal-medula (L2-L4), dos DRG (L1-L5) e da pele plantar foram removidos, fixados em fixador de perfusão e crioprotegidos em 30% de sacarose durante 24 horas. Cortes em série congelados de medula-espinal e pele, com 60 pm de espessura, foram cortados em micrótomo de carreto, recolhidos em PBS e analisados sob a forma de cortes flutuantes. Cortes em série de DRG, com a espessura de 15 pm, foram cortados em criostato e colocados sob gelo em lâminas revestidas com gelatina para posterior análise. Após o corte, as secções de DRG, espinal-medula e pele plantar foram rapidamente lavadas em PBSe incubadas em solução de bloqueio (3% de soro de burro (NDS) e 0,3% de Triton X-100 em PBS) durante 1 hora, seguido de incubação durante a noite no anticorpo primário. Os cortes de espinal-medula foram sujeitos a coloração imunológica quanto à proteina c-Fos (1:2000, Oncogen Research, San Diego, CA) e dinorfina (anti-dinorfina de porquinho-da-índia policlonal, 1:1000, Neuromics, Minneapolis, MN). As secções de DRG foram sujeitas a coloração imunológica quanto ao factor de activação de activação da transcrição (ATF-3) (coelho policlonal anti-ATF-3, 1:500, Santa Cruz

Biotechnologies, Santa Cruz, CA) e CD68 (ED-1, anti-CD68 de -115- rato policlonal, 1:5000, Serotec, Raleigh, NC). As secções de pele foram sujeitas a coloração imunológica quanto ao péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) (1:15000, Sigma, St. Louis, MO), tirosina hidroxilase (TOH) (anti-TOH de coelho policlonal, 1:2000, Chemicon, Temecula, CA) e neurofilamento H (clone RT97) (anti-RT-97 de coelho policlonal, 1:2500, Chemicon, Temecula, CA).

Após incubação em anticorpo primário, as secções foram lavadas em PBS e incubadas na solução de anticorpo secundário durante 3 horas. Os anticorpos secundários, conjugados com Cy3 ou biotina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) foram usados em razões de 1:600 ou 1:500, respectivamente. Para detectar anticorpos secundários conjugados com biotina: após incubação secundária, as secções foram lavadas com PBS e incubadas em estreptavidina conjugada com Cy3 (1:4000, Jackson ImmunoResearch) durante 45 minutos. Para confirmar a especificidade dos anticorpos primários, os controlos incluíram omissão do anticorpo primário ou pré-absorção com o péptideo sintético correspondente. Após procedimentos de coloração imunológica, as secções foram colocadas sob gelo em lâminas revestidas com gelatina. De seguida, as secções foram desidratadas em gradientes de álcool (70, 90, 100%), limpos em xileno e montaram-se laminulas com DPX (Fluka, Suiça). Após análise radiológica, no 14.° dia, fémures do lado direito (controlo interno) e do lado esquerdo (com tumor) -116- foram fixados em ácido picrico e 4% de formalina a 4°C durante a noite, e descalcificados em 10% de EDTA (Sigma, St. Louis, MO) durante menos de 14 dias. Os ossos foram embebidos em parafina. Cortaram-se secções femorais com 5 pm de espessura no plano lateral e sujeitaram-se a coloração com fosfatase ácida resistente ao tartrato (TRAP) e hematoxilina e eosina (H&E) para verificação das caracteristicas histológicas da medula óssea, tumor, osteoclastos e macrófagos. Para visualizar as células de sarcoma usando microscopia de fluorescência, as secções femorais com 5 pm de espessura foram sujeitas a coloração com um anticorpo crescido contra proteína verde fluorescente (GFP) (anti-GFP de coelho, 1:6000, Molecular Probes, Eugene, OR) . A coloração da GFP foi realizada com um sistema TSA-Plus Cyanine 3 System (PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, MA), conforme previamente descrito por Sevcik et al., Pain 111:169-80 (2004). A análise imunohistoquímica dos fémures com sham e cancerosos foi realizada em secções em série descalcificadas, embebidas em parafina e com 14 pm. Utilizou-se o sistema de amplificação de sinal da tiramina (TSA) (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) para amplificar anticorpos marcados com Cy3. As peroxidases endógenas foram embebidas através da incubação das secções em 2% de peróxido de hidrogénio durante 1 hora. As secções foram lavadas três vezes com PBS durante 10 minutos e -117 - bloqueadas em tampão de bloqueio TSA durante 1 hora. Adicionou-se antisoro primário após remoção do tampão de bloqueio e deixou-se incubar à temperatura ambiente. Fibras nervosas primárias aferentes e amielinizadas, e fibras nervosas sensoriais pouco mielinizadas, foram marcadas usando um anticorpo crescido contra péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) de coelho policlonal (1:15000, Sigma). As secções foram depois lavadas três vezes com tampão TSA durante 10 minutos. Aplicou-se tiramina conjugada com Cy3 (1:600) aos fémures durante 7 minutos, lavou-se duas vezes com tampão TSA e uma vez com PBS. Por fim, as secções foram secas ao ar livre, desidratadas com gradiente de álcool (70, 90 e 100%), limpas com xileno e montadas com DPX (Fluka).

Analise de radiografias e análise da proliferação de osteoclastos e macrófagos no osso. Obtiveram-se radiografias (Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL) dos fémures dissecados no 14.° ponto temporal para avaliar de forma óptima o nivel de destruição óssea. As imagens foram capturadas em película de mamografia Kodak Min-R2000 (Eastman Kodak Co., Rochester, NY; definições de exposição: 7 seg., 21 kVp). A extensão da destruição femoral induzida pelo tumor foi avaliada por radiologia no plano lateral das imagens do osso com uma magnificação de 5X usando uma escala de 0 a 5 (0, osso normal sem sinais de destruição e 5, perda óssea da total espessura bicortical). Honore et -118- al., Nat. Med. 6:521-8 (2000), Honore et al., Neuroscience 98: 585-598 (2000), Luger et al., Câncer Research 61 : 4038-4047 (2001).

Determinou-se a proliferação de osteoclastos e macrófagos associada ao tumor (TAM's) através da quantificação do número de TRAP + osteoclastos ou TAM's em secções femorais manchadas com TRAP, conforme previamente descrito. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000), Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000). Resumidamente, os TAM's são diferenciados histologicamente em relação aos osteoclastos nas secções femorais manchadas com TRAP, sob a forma de TRAP + células livre e multidimensionalmente dispersas pela massa tumoral. Os macrófagos no interior do osso são activados graças aos factores libertados pelo tumor, que estimulam as células, e a aparência celular destes TAM's activados é marcada pela sua superfície altamente irregular, múltiplas lamelas citoplasmáticas (lamelipodia) e vacúolos fagociticos. Os osteoclastos são histologicamente diferenciados sob a forma de células que apresentam TRAP e intimamente associadas às regiões de ressorção óssea Estas células são multinucleadas e encontram- se ao longo do osso cortical e trabecular. Os resultados expressos como número médio de osteoclastos por mm ou TAM's por mm2, respectivamente.

Quantificação do crescimento tumoral. Fémures contendo células de sarcoma que expressavam GFP foram sujeitos a -119 - imagiologia usando um filtro de emissão amarelo de 515 nm num microscópio de fluorescência Nikon E600 equipado com uma câmara digital SPOT II com software de captura de imagem SPOT (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). A área total do espaço intramedular e a percentagem de espaço intramedular ocupado pelo tumor foram calculadas usando o software Image Pro Plus v3.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Sabino et al., Câncer Res. 62: 7343-9 (2002), Sevcik et al., Pain 111: 169-80 (2004). As características tumorais das células de sarcoma transfectadas com GFP, tais como velocidades de crescimento, velocidade de ressorção óssea e capacidade de indução de comportamentos de dor associada ao cancro ósseo, foram temporal, comportamental e fisicamente idênticos aos das células de sarcoma não transfectadas. Sabino et al., Câncer Res. 62: 7343-9 (2002).

Quantificação das fibras sensoriais no osso. Determinou-se o número de fibras nervosas sensoriais conforme supra descrito. Mach et al., Neuroscience 113:155-66 (2002). Resumidamente, quantificou-se número de fibras positivas de CGRP em três regiões ósseas (proximal, distai e diafisária) e em três tecidos ósseos (periósteo, osso mineralizado e medula). Apenas se incluíram na análise fibras nervosas com um comprimento superior a 30 pm. Analisaram-se seis secções por animal, e as fibras contadas foram expressas sob a forma de fibras por área de osso total. -120 -

Quantificação de espinal-medula, gânglios da raiz dorsal e pele da pata traseira.

Cortes de espinal-medula marcada por fluorescência, DRG e tecido da pele foram analisados usando um sistema de microscópio confocal MRC 1024 (Bio-Rad, Filadélfia, PA), ou uma câmara digital SPOT II instalada num microscópio de fluorescência Olympus BX-60 com software de captura de imagem SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.). O número de neurónios dos DRG que expressam o factor activador da transcrição 3 (ATF-3) contados sob magnificação 200x com ocular de 1 cm2. Determinou-se o número total de neurónios (pequenos, médios e grandes) através da contagem dos corpos celulares neuronais marcados e não marcados (os corpos celulares neuronais não marcados apresentam uma marcação de background que pôde ser examinada por rodamina ou filtro para FITC) e os resultados foram expressos sob a forma de percentagem de número total de neurónios que expressam a imunoreactividade (IR) da ATF-3. Para impedir a contagem duplicada dos corpos celulares neuronais, as contagens foram realizadas em cada quarta secção em série para cada marcador. Para quantificar os macrófagos activados ou infiltrados em DRG, obtiveram-se imagens em escala cinzenta através da câmara SPOT num mínimo de quatro secções de DRG ipsilaterais e contralaterais por animal e analizaram-se usando software -121-

Image Pro Plus versão 3.0 (Media Cybernetics) . Em cada imagem, definiram-se as regiões dos DRG contendo apenas corpos celulares neuronais sensoriais (excluindo o nervo periférico). Ao observar o monitor, definiram-se os limiares superiores e inferiores de densidade de forma que apenas os perfis celulares CD68-IR foram discriminados do background no DRG delineado. Contou-se automaticamente o número de perfis celulares por secção. Os resultados da câmara SPOT foram calibrados em Image Pro Plus de forma que a poder determinar-se a área real de cada região delineada no conjunto das imagens adquiridas. Os valores das secções dos perfis celulares e áreas delineadas do CD68-IR foram somados para cada um dos animais e apresentaram-se os resultados sob a forma do número total de perfis celulares CD68-IR por área unitária (mm2) .

Procedeu-se à quantificação das secções de espinal-medula nos niveis lombares L2-L4, já que estes segmentos medulares recebem um input aferente significativo por parte dos DRG's da L1-L3, que são os principais gânglios a fornecer um input aferente ao fémur de rato. Edoff et al., Cell & Tissue Research 299:193-200 (2000), Molander C., J. Comp. Neurol. 260:246-255 (1987), Puigdellivol-Sanchez A. et al., The Anatomical Record 260: 180-188 (2000), Puigdellivol-Sanchez A. et al., Neurosci. Lett. 251 : 169-172 (1998). A quantificação dos níveis de dinorfina das secções de espinal-medula foi obtida a partir de 4 secções aleatórias -122 - de espinal-medula coronal L2-L4 por animal. 0 número de neurónios IR por dinorfina nas lâminas III-IV da espinal-medula foi contado a uma ampliação de lOOx e expressos sob a forma de número médio de neurónios por secção L2-L4 de 60 pm por animal. Contou-se o número de neurónios IR à c-Fos nas lâminas III-IV do corno dorsal em 8 secções de espinal-medula L3-L4 aleatoriamente seleccionadas por cada animal. Para se considerar imunoreactiva à c-Fos, o limiar da imunofluorescência do perfil nuclear definiu-se em três vezes o background médio do nível de imunofluorescência da secção de tecido. Os resultados são apresentados sob a forma de número médio de neurónios imunireactivos à c-Fos por secção de espinal-medula. A quantificação da densidade da inervação epidérmica foi realizada em 4 secções aleatoriamente seleccionadas de pele de pata traseira por animal. O número total de fibras nervosas CGRP, TOH e RT97-IR foi contado com uma ampliação de 200x. As normas de contagem foram estabelecidas de forma a contar apenas fibras individuais intra-epidérmicas e não feixes múltiplos da mesma fibra. McCarthy et al., Neurology 45: 1848-55 (1995). Mediu-se o comprimento total de epiderme de todas as secções quantificadas através de uma ocular de 1 cm2. Contaram-se apenas as fibras nervosas com pelo menos 25 pm de comprimento, e projectadas na epiderme superficial. Os resultados são apresentados sob a forma de -123 - número médio de fibras nervosas intra-epidérmicas por mm de comprimento por animal.

Análise comportamental. Os ratos foram testados quanto a comportamentos relacionados com a dor associada ao cancro ósseo 10 e 14 dias depois das injecções sham ou de tumor, altura em que os comportamentos de dor são significativamente evidentes para avaliar a eficácia do tratamento anti-NGF. O tratamento com anti-NGF foi comparado com o tratamento com morfina (Baxter, Deerfield, IL; 10 mg/kg, i.p.) e foi administrado 15 minutos antes do teste comportamental de forma a assegurar que os animais eram testados dentro da janela terapêutica da acção do fármaco. Hasselstrom et al., Pharmacology & Toxicology 79: 40-6 (1996).

Os ratos também foram testados 8, 10, 12 e 14 dias após as injecções sham ou de tumor, por forma a avaliar a eficácia do tratamento anti-NGF (10 mg/kg/a cada 5 dias, i.p.) na atenuação dos comportamentos associados à dor no decorrer da doença. Os animais foram observados ao longo de um periodo de 2 minutos e analisaram-se os comportamentos de dor continua e evocada pela palpação associada ao cancro ósseo, conforme supra descrito. Luger et al., Paín 99: 397-406 (2002), Sabino et al., Câncer Res. 62: 7343-9 (2002), Sabino et al., International Journal of Câncer 104:550-558 (2003) . Resumidamente, registaram-se o número de tremores da pata traseira e o tempo passado em tensão enquanto -124 - medidas de dor contínua, já que estes se assemelham aos pacientes em cenário clínico com cancro ósseo, que protegem ou elevam o seu membro afectado por tumor. Neste modelo, a dor evocada pelo movimento provocada pela palpação do membro injectado foi avaliada usando testes previamente validados. Luger et al., Câncer Research 61: 4038-4047 (2001), Sabino et al., International J. of Câncer 104:550-558 (2003), Sevcik et al., Pain 111: 169-80 (2004). Os comportamentos de dor evocados por palpação foram examinados nos casos em que os animais receberam palpação normalmente inofensiva do membro injectado com tumor ou sham durante 2 minutos antes da observação. Luger et al., Câncer Research 61: 4038-4047 (2001), Sevcik et al., Pain 111: 169-80 (2004). Os ratos foram monitorizados ao longo de um período de 2 minutos, e registou-se o número de tremores e tempo em tensão. Desenvolveram-se testes de comportamento de dor evocada por palpação para verificação da condição clínica nos casos em que os pacientes sentem dor associada ao cancro ósseo após movimento normalmente inofensivo do membro com tumor.

Após um período de 15 minutos de adaptação, mediram-se as sensibilidades térmica e mecânica em animais simples e animais simples + anti-NGF, por forma a avaliar se o limiar normais de respostas à dor eram alteradas com o tratamento anti-NGF. Mediu-se a sensibilidade térmica com um estimulador Thermal Paw Stimulator (Universidade da -125 -

Califórnia, San Diego, San Diego, CA) . A intensidade do calor irradiado foi ajustada de forma a que os animais simples respondessem ao calor através da elevação da pata traseira aproximadamente nove segundos depois do inicio do calor. Choi et al., Life Sei. 73: 471-85 (2003). Os ratos puderam descansar durante 5 minutos entre cada ensaio. Um só ensaio consistiu em 4 medições por pata traseira, ignorou-se a latência mais prolongada e fez-se a média das 3 restantes medições. Mediu-se a sensibilidade mecânica através do método previamente validado. Chaplan et al., J. Neuroscience Methods 53: 55-63 (1994). Aplicaram-se filamentos Von Frey (Stoelting Co., Wood Dale, IL) na pata traseira dos animais, e determinou-se o limiar de retirada da pata aumentando e reduzindo a intensidade do estímulo entre 0,2 e 15,1 equivalentes de gramas de força. Verificou-se uma resposta positiva se a pata era rapidamente retirada.

Análise de RT por PCR dos níveis de mRNA na linha celular 2472. Preparou-se ARN total a partir de amostras triplicadas de tecido de rato ou de células de sarcoma 2472, de acordo com as instruções do fabricante, usando o micro kit RNeasy (Qiagen), e quantificou-se o ARN usando reagente Ribogreen (Molecular Probes). Realizou-se transcriptase-reversa associada à reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) de duas fases usando o kit de RT-PCR

TaqMan Gold (Applied Biosystems). Sujeitou-se o ARN a -126 - transcrição reversa usando hexâmeros aleatórios, e amplificou-se o cDNA com um conjunto de primer/sonda especifico para NGF (muNGF-187F: GGGCTGGATGGCATGCT (SEQ ID NO:3), muNGF-256R: GCGTCCTTGGCAAAACCTT (SEQ ID N0:4), muNGF-208T: CCAAGCTCACCTCAGTGTCTGGGCC (SEQ ID N0:5)). As amostras foram analisadas em duplicado ao nível da RT e normalizadas ao input do ARN total.

Análise estatística. Utilizou-se um pacote informático de estatística SPSS versão 11 (SPSS, Chicago, IL) para realizar as análises estatísticas. Utilizou-se um modelo de regressão linear de efeitos mistos para analisar os dados de medições repetidas, que pode acomodar objectos medidos em intervalos de tempo distintos, incluindo covariáveis fixas e variáveis no tempo, e pode estimar as taxas individuais de alteração. Cada resultado variável dependente foi comparado ao longo dos grupos usando uma análise de variância paramétrica (Kruskal-Wallis) . As análises Kruskal-Wallis significativas foram seguidas por comparações não paramétricas post-hoc entre pares de grupos usando o teste U de Mann-Whitney. Os resultados eram considerados estatisticamente significativos com P<0,05. Em todos os casos, o investigador ignorou o estatuto experimental de cada animal.

Resultados - ΙΤΙ Α administração de anti-NGF não surtiu qualquer efeito na progressão da doença ou infiltração de macrófagos no osso. Os efeitos do tratamento com anti-NGF na destruição óssea, proliferação de osteoclastos e crescimento tumoral foram examinados no 14.° dia após a injecção de tumor. Os ratos injectados com sham não apresentaram uma destruição óssea significativa (níveis ósseos 0,9±0,4; Figura 4a), proliferação de osteoclastos (4,6±0,4 osteoclastos/mm) ou crescimento tumoral (Figura 4d) , conforme avaliado por análises radiológicas TRAP e H&E/GFP, respectivamente, comparativamente com os ratos injectados com sarcoma. Nos ratos injectados com sarcoma + veículo, verificou-se extensa destruição óssea, observada e caracterizada por radiolucências multifocais (níveis ósseos 3,5±0,2; Figura 4b), aumento marcado do número de osteoclastos (4,0±0,7 osteoclastos/mm) e o tumor preencheu totalmente o espaço intramedular (100±0,0 de espaço intramedular; Figura 4e). O tratamento de ratos com tumor com anti-NGF desde o 6.° ao 14.° dia após injecção de tumor não resultou numa alteração significativa da ressorção óssea (3,1±0,6; Figura 4c), não resultou em redução da proliferação de osteoclastos induzida por sarcoma (3,5±0,1 osteoclastos/mm) nem crescimento tumoral (98, 0±0,9 de espaço intramedular; Figura 4f), comparativamente com os animais injectados com sarcoma + veículo. -128 -

Catorze dias depois da injecção de tumor, os ratos inectados com sarcoma + veiculo apresentaram uma regulação de TAM's (39,8±12,6 TAM's/mm2) comparativamente aos ratos de controlo injectados com sham + veiculo (0,0±0,0 TAM's/mm2). 0 tratamento com anti-NGF de ratos injectados com sarcoma (29,5±7,3 TAM's/mm2) não alterou significativamente esta infiltração de TAM, conforme verificado nos ratos injectados com sarcoma + veículo. 0 tratamento com anti-NGF não surtiu efeitos observáveis na inervação sensorial ou simpática do osso ou pele. Fibras nervosas sensoriais peptidérgicas ligeiramente mielinizadas ou amielinizadas foram marcadas com um anticorpo crescido contra péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP). Encontraram-se fibras nervosas imunoreactivas ao CGRP ao longo de todo o osso (periósteo, osso mineralizado e medula óssea) de animais simples + veículo (12,2±0,3 fibras/mm) e animais simples + anti-NGF (13,0±0,8 fibras/mm) .

Fibras nervosas sensoriais peptidérgicas ligeiramente mielinizadas ou amielinizadas (CGRP-IR), fibras sensoriais mielinizadas (RT97-IR) ou fibras nervosas simpáticas noradrenérgicas (TOH-IR) foram analisadas na pele plantar da pata traseira por anticorpos crescidos contra CGRP, RT97 e TOH, respectivamente. Não se verificou qualquer diferença significativa entre a intensidade ou densidade das fibras positivas de CGRP nas amostras de pele da pata traseira de -129 -

animais tratados com sarcoma + veiculo (12,0±0,8 fibras/mm) e sarcoma + anti-NGF (12,5±0,6 fibras/mm) (Figuras 5a e 5b) . Da mesma forma, não se verificou qualquer na intensidade ou densidade das fibras positivas de CGRP nas amostras de pele da pata traseira de ratos simples + veiculo (Figura 5c, n=8) e ratos simples + anti-NGF (Figura 5d, n=8) . Não se verificou qualquer alteração no número de fibras nervosas a expressar CGRP em rats injectados com sarcoma e ratos simples (a, b vs. c, d). Diferenças na densidade e intensidade das fibras RT97-positivas e ΊΌΗ-positivas também se mostraram indetectáveis em animais injectados com sarcoma + veículo (7,3±0,7 RT97+ fibras/mm; 3,1±0,7 TOH+ fibras/mm) e animais tratados com sarcoma + anti-NGF (7,3±0,7 RT97+ fibras/mm; 3,6±0,7 TOH+ fibras/mm). Da mesma forma, não se verificou qualquer diferença na intensidade ou densidade das fibras positivas de CGRP nas amostras de pele da pata traseira de ratos simples + veículo (12,5±0,5 fibras/mm) e ratos simples + anti-NGF (11,9+0,7 fibras/mm) (Figuras 5c e 5d). Diferenças na densidade e intensidade das fibras RT97-positivas e ΊΌΗ-positivas também se mostraram indetectáveis em animais simples + veículo (10,4±0,4 RT97+ fibras/mm; 3,4±0,4 TOH+ fibras/mm) e animais simples + anti-NGF (11,9±0,7 RT97+ fibras/mm; 3,0±0,8 TOH+ fibras/mm). Não se verificou qualquer diferença significativa na intensidade ou densidade das fibras CGRP positivas, RT97 positivas ou TOH -130 - positivas nas amostras de pele de animais injectados com sarcoma + veiculo e animais simples + veiculo e animais simples + anti-NGF. A terapia com anticorpo anti-NGF reduziu significativamente os comportamentos de dor associada ao cancro ósseo. Ratos injectados com sarcoma + veiculo demonstraram um maior tempo em tensão comparativamente com os controlos sham + veiculo (Figura 6a) . Além disso, os ratos injectados com sarcoma + veiculo exibiram um maior número de tremores comparativamente aos controlos sham + veiculo (Figura 6b) . A administração de anti-NGF (do dia 6 ao dia 14) em ratos injectados com sarcoma atenuou significativamente a tensão espontânea comparativamente aos ratos injectados com sarcoma + veículo (Figura 6a) . O tratamento com anti-NGF reduziu significativamente o tremor espontâneo em ratos injectados com sarcoma (Figura 6b).

Analisou-se a dor evocada por movimento através da medição das respostas induzidas pela palpação. Os ratos injectados com sarcoma + veículo demonstraram um maior tempo em tensão após palpação comparativamente aos controlos sham + veículo (Figura 6c) . Os ratos injectados com sarcoma + veículo exibiram um maior número de tremores após palpação comparativamente aos controlos sham + veículo (Figura 6d). O tratamento com anti-NGF reduziu significativamente a tensão evocada por palpação (Figura 6c) e o tremor evocado por palpaçao (Figura 6d). Em estudos preliminares, nao se -131- verificaram diferenças comportamentais ou efeitos secundários entre animais sham que receberam veiculo ou anti-NGF. A Figura 6 mostra que o tratamento com anti-NGF (n=8) nos dias 6 a 14 após injecção do tumor (triângulo) reduziu significativamente os comportamentos de dor continua e evocada por palpação nos 10.°, 12.° e 14.° dias comparativamente aos animais injectados com sarcoma + veículo (n=8) (quadrado) e reduziu significativamente os níveis de sham no 10.° dia em todos os parâmetros (losangos) . Em todos os pontos, os animais sham + veículo (n=8) são significativamente diferentes dos animais com sarcoma + veículo. Assim, o tratamento com anti-NGF (10 mg/kg, i.p ., a cada 5 dias) atenuou os comportamentos de dor contínua e evocada pelo movimento associada ao cancro ósseo no decorrer da doença. O tratamento com anti-NGF não surtiu qualquer efeito sobre os limiares de referência térmicos e mecânicos e mostrou-se comparável à eficácia da morfina na redução da dor associada ao cancro ósseo. Não houve um aumento significativo na latência de retirada da pata mediante estímulo térmico ou um aumento no limiar do estímulo mecânico com a administração do anti-NGF, comparativamente aos limiares de dor normais. O tratamento anti-NGF não surtiu qualquer efeito sobre a resposta normal ao calor (Figura 7a) comparativamente ao estímulo mecânico dos -132 - animais simples + veiculo ou ao estimulo mecânico normal (Figura 7b) comparativamente aos animais simples + veiculo. Os animais foram testados de forma a comparar a eficácia do sulfato de morfina (MS) e do anticorpo anti-NGF na redução dos comportamentos de dor associada ao cancro ósseo. A avaliação comportamental nos 10.° e 14.° dias revelou que os animais injectados com sarcoma + veículo apresentaram estatisticamente um maior tempo em tensão (Figura 7c) e um maior tempo em tensão em resposta à palpação (Figura 7d) do membro injectado, comparativamente aos animais sham + veículo. O tratamento com anti-NGF (10 mg/kg/a cada 5 dias, i.p.) ou com sulfato de morfina (10 mg/kg ou 30 mg/kg, i.p.) reduziu significativamente os comportamentos de tensão contínua e evocada por movimento nos 10.° e 14.° dias após injecção de tumor (Figura 7c, 7d), comparativamente aos ratos injectados com sarcoma + veículo. O tratamento anti-NGF atenuou significativamente os comportamentos de dor associada ao cancro ósseo de forma mais eficaz se comparada com as doses de 10 mg/kg ou 30 mg/kg de morfina (P<0,05 vs. sarcoma + anti-NGF). O tratamento com anti-NGF modulou alterações periféricas induzidas pelo cancro ósseo nos DRG. Já se demonstrou anteriormente que o factor de activação da transcrição 3 (ATF-3), da família do ATF/CREB, é sobre-representado num modelo de lesão do nervo periférico, Tsujino et al.r

Molecular & Celular Neurosciences 15:170-82 (2000). Esta -133 - sobre-representação verifica-se nos corpos celulares dos neurónios sensoriais e motores, e é conhecida por marcar os neurónios lesionados. Verificou-se um aumento significativo na percentagem de neurónios ATF-3-IR desde o L2 ipsilateral do DRG ao fémur injectado com sarcoma (14,0±5,9% de neurónios totais no ATF-3 expresso pelo L2; Figura 8a) comparativamente com os animais sham + veiculo (1,6±0,5 de neurónios totais em ATF-3 expresso pelo L2) . 0 tratamento com anti-NGF atenuou significativamente a expressão de ATF-3 (2,6±1,0% de neurónios totais no ATF-3 expresso pelo L2; Figura 8b) 14 dias após a injecção de tumor.

Comprovou-se que infiltração de macrófagos é sobre-representada devido a lesões do nervo periférico. Abbadie et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100: 7947-52 (2003), Myers et al., Exp. Neurol. 141 :94-101 (1996), Tofaris et al., J. Neurosci. 22 :6696-703 (2002). Utilizou-se um anticorpo crescido contra CD68 (ED-1), uma proteina lisossomal expressa por macrófagos activados pelo tecido,

para avaliar a infiltração de macrófagos em ratos injectados com sarcoma. Verificou-se uma sobre- representação do número de neurónios CD68-IR no DRG ipsilateral de ratos injectados com sarcoma + veiculo (119,6+12,1 perfis celulares/DRG do L2 ipsilateral, Figura 8c) comparativamente a animais sham + veiculo (80,6±6,0 perfis celulares/DRG do L2 ipsilateral). O tratamento com anti-NGF reduziu significativamente a sobre-representaçao -134 - dos neurónios CD68-IR no DRG ipsilateral (92,0±9,9 perfis celulares/DRG do L2 ipsilateral, Figura 8d) em ratos injectados com sarcoma, indicando uma redução significativa do número de macrófagos activados e infiltrados no interior do DRG do L2 ipsilateral de animais detentores de tumores. 0 tratamento com anti-NGF modulou alterações centrais induzidas por cancro ósseo na espinal-medula. A expressão de dinorfina mostrou estar envolvida na manutenção da dor crónica. Vanderah et al., Pain 92: 5-9 (2001). Também se comprovou que a expressão de dinorfina é sobre-representada no corno dorsal da espinal-medula em vários estados de dor persistente. Iadarola et al., Brain Res. 455: 205-212 (1988), Noguchi et al., Molecular Brain Research 10: 227-233 (1991), Schwei et al., J. Neurosci. 19:10886-97 (1999). Em ratos injectados com sham + veiculo, uma pequena quantidade de neurónios espinais expressaram dinorfina nas lâminas espinais profundas (2,3±1,1 neurónios dyn-IR/secção L3/L4). Pelo contrário, os ratos injectados com sarcoma + veículo expressaram neurónios significativamente mais dinorfina-IR (6,0±0,5 neurónios dyn-IR/secção L3/L4, Figura 9A) . O tratamento anti-NGF reduziu significativamente a sobre-representação da expressão de dinorfina (2,0±0,6 neurónios dyn-IR/secção L3/L4, Figura 9B) em ratos injectados com sarcoma. A activação imediata de genes foi impedida pelo tratamento com anti-NGF. A expressão de c-Fos no corno dorsal profundo -135 - (lâminas III-IV) foi utilizada como marcador da sensibilização central em estados de dor associada ao cancro ósseo e induzida por sarcoma. Honore et al., Nat . Med. 6:521-8 (2000), Honore et al., Neurosclence 98:585-598 (2000) , Luger et al., Câncer Research 61 : 4038-4047 (2001) , Schwei et al., J. Neurosci. 19 : 10886-97 (1999). Palpação normal e inofensiva dos animais operados por sham resultou numa expressão mínima de c-Fos nas lâminas profundas. Sabino et al., Câncer Res. 62: 7343-9 (2002). No estado de cancro ósseo, os ratos injectados com sarcoma + veículo apresentaram um maior número de neurónios c-Fos-IR (27,7±4,9 neurónios c-Fos-IR/secção L3/L4, Figura 9C) e o tratamento com anti-NGF reduziu significativamente esta expressão (11,1±1,9 neurónios c-Fos-IR/secção L3/L4, Figura 9D) .

Resultados da RT por PCR. Com o objectivo de verificar se as células tumorais de sarcoma eram uma possível fonte de NGF, 2472 células crescidas em cultura foram avaliadas quanto ao seu nível de mRNA do NGF por transcriptase reversa associada à reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) . Estes níveis foram comparados com vários tecidos normais do rato, bem como com o nível de mRNA do NGF da glândula salivar de um rato macho, fonte aberrante de NGF exócrino. Conforme apresentado no Quadro 3, as 2742 células de sarcoma in vitro continham mRNA de NGF rapidamente detectável. Este nível encontra-se no intervalo dos níveis -136 - de mRNA de NGF obtidos em tecidos normais que expressavam niveis elevados de mRNA de NGF, tal como iris. Shelton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:7951-5 (1984). No entanto, este nivel encontra-se bastante abaixo do nivel de mRNA de NGF presente na glândula salivar de rato macho.

Quadro 3 Dados da RT por PCR que apresentam os níveis de expressão do NGF

Tipo de tecido Unidades arbitrárias Cérebro 1,2 ± 0,8 Átrios 1,9 ± 0,7 Células 2472 8 ± 1,1 íris 8,8 ± 3,6 Glândula submaxilar 1359,1 ± 583,7

Exemplo 3

Efeito do anticorpo monoclonal anti-NGF no tratamento da dor associada ao cancro ósseo em modelo murino desenvolvido por injecção intramedular de células tumorais osteoblásticas prostáticas no fémur Métodos

Modelo murino prostático de dor associada ao cancro ósseo. Utilizou-se um modelo murino prostático de dor associada ao -137 - cancro ósseo para avaliar a eficácia do tratamento com anticorpo anti-NGF 911 (um anticorpo monoclonal de rato, veja-se Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Células osteoblásticas de carcinoma canino (ACE-1, cedidas pelo Dr. Thomas J. Rosol, Universidade do Estado do Ohio) foram mantidas e realizaram-se injecções de células tumorais conforme supra descrito. Sabino et al., Câncer Res. 62:7343-7349, 2002, Honore et al., Nature Medicine 6: 521-528, 2000, Honore et al., Prog. Brain Res. 129: 389-397, 2000, Luger et al., Câncer Research 61: 4038-4047, 2001. Resumidamente, células ACE-1 foram crescidas em meio a 37°C e 5% de C02. As células foram crescidas em frascos T75 (7,5 cm2) e efectuou-se passagem a 80-90% de confluência, duas vezes por semana. Apenas as passagens entre 3 e 11 foram utilizadas neste estudo. No dia 0, após indução de anestesia geral com pentobarbital de sódio (50 mg/kg, i.p.), procedeu-se a uma artrotomia expondo os côndilos do fémur distai. Injectou-se solução salina de Hank (HBSS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 20 μΐ; sham, n=7) ou meio contendo 105 células osteoblásticas caninas (20 μΐ, ACE-1, n=60) no espaço intramedular do fémur do rato e selou-se o local da injecção com amálgama dentária (Dentsply, Milford, DE) , seguido de irrigação com água esterilizada filtrada. As experiências foram realizadas num total de 89 ratos adultos machos atimicos com 8-10 semanas de idade (Harlan Laboratories, Madison, wi) com 20-32 g. Os -138 - ratos foram enjaulados de acordo com as directrizes do National Institute of Health, sob específicas condições isentas de patogénios (SPF) em jaulas com autoclave mantidas a 22°C com um ciclo de 12 horas alternado de luz e escuridão, tendo-lhes sido fornecido alimento e água ad 1ibitum.

Utilizou-se uma meta de 19 dias após injecção, já que este é o ponto em que o tumor ainda se encontra confinado ao osso e existe máxima apresentação de comportamentos de dor associada ao cancro e máxima remodelação óssea. Os animais sham foram utilizados para análise de controlo de comportamento e alterações neuroquímicas e histologia óssea, já que os animais simples não se mostraram significativamente diferentes, em termos comportamentais, dos animais sham 9 dias após injecção de tumor.

Tratamento com anti-NGF ou morfina. Nos dias 7, 12 e 17 após a injecção de tumor, os animais injectados com ace-1 foram injectados por via intraperitoneal (i.p.) com anticorpo anti-NGF 911 a 10 mg/kg (ACE-1 + anti-NGF, n=9) , os animais injectados com ACE-1 foram injectados por via i.p. com soro fisiológico (ACE-1 + veie., n=21, 1,4 μΐ/kg), e os animais injectados com sham foram injectados por via i.p. com soro fisiológico (sham + veie., n=7). O comportamento de todos os animais foi analisado entre os dias 7 e 19. -139 -

Para comparação comportamental do anticorpo anti-NGF com o sulfato de morfina, os ratos receberam uma dose de morfina 15 minutos antes do teste comportamental (simples: n=6, sham: n=7, ACE-1 + veiculo: n=7, ACE-1 + anti-NGF: n=7, ACE-1 + morfina, 10 mg/kg, s.c.: n=8, ACE-1 + morfina, 30 mg/kg, s.c.: n=8). Para teste da sensibilidade térmica e mecânica e avaliação da inervação da pele da pata traseira, dividiram-se os ratos simples em dois grupos de tratamento que receberam soro fisiológico (simples + veículo: n=8) ou anticorpo anti-NGF (simples + anti-NGF: n=8, 10 mg/kg/i.p.) .

Análise comportamental. Testaram-se os animais quanto a comportamentos relacionados com a dor antes de e nos dias 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 após implantação do tumor ou injecção de sham. Os animais foram testados comportamentalmente usando os seguintes testes: dor contínua (tensão espontânea e tremor) e dor evocada por movimento (tensão evocada por palpação e tremor evocado por palpação). Colocaram-se os animais numa caixa de plástico transparente com uma base de malha de rede e permitiu-se que se familiarizassem durante um período de 30 minutos. Após adaptação, avaliaram-se os comportamentos de tensão espontânea e tremor espontâneo. Mediu-se a tensão e tremor induzidos por palpação após o período de 2 minutos de palpação normalmente inofensiva do fémur distai dos animais -140 - injectados com ACE-1 e animais sham. Estes testes foram realizados conforme descrito nos Exemplos 1 e 2.

Eutanásia e análise tecidual. Os ratos foram sacrificados no 19.° dia após injecção do tumor e analisaram-se os tecidos por técnica imunohistoquímica dos fémures e da pele da pata traseira conforme anteriormente descrito. Honore et al., Prog. Brain Res. 129 :389-397, 2000, Honore et al.,

Nat. Med. 6:521-8 (2000), Luger et al., Câncer Research 61: 4038-4047 (2001). Os ratos foram eutanizados com C02 e sujeitos a perfusão intracardíaca com 12 ml 0,1 M de tampão fosfato (PBS) seguido de 25 ml de uma solução de 4% de formaldeído/12,5% de ácido pícrico.

Removeu-se pele plantar da pata traseira, fixou-se em fixador de perfusão e crioprotegeu-se em 30% de sacarose durante 24 horas. Cortes em série de pele, com 60 pm de espessura, foram cortados em micrótomo de carreto, recolhidos em PBS e analisados sob a forma de cortes flutuantes. Após o corte, as secções de pele plantar foram rapidamente lavadas em PBS e incubadas em solução de bloqueio (3% de soro de burro (NDS) e 0,3% de Triton X-100 em PBS) durante 1 hora, seguido de incubação durante a noite no anticorpo primário. As secções de pele foram sujeitas a coloração imunológica quanto ao péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) (1:15000, Sigma, St. Louis, MO), tirosina hidroxilase (TOH) (anti-TOH de coelho policlonal, 1:2000, Chemicon, Temecula, CA) e -141- neurofilamento H (clone RT97) (anti-RT-97 de coelho policlonal, 1:2500, Chemicon, Temecula, CA).

Após incubação em anticorpo primário, as secções foram lavadas em PBS e incubadas na solução de anticorpo secundário durante 3 horas. Os anticorpos secundários, conjugados com Cy3 ou biotina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) foram usados em razões de 1:600 ou 1:500, respectivamente. Para detectar anticorpos secundários conjugados com biotina: após incubação secundária, as secções foram lavadas com PBS e incubadas em estreptavidina conjugada com Cy3 (1:4000, Jackson ImmunoResearch) durante 45 minutos. Para confirmar a especificidade dos anticorpos primários, os controlos incluiram omissão do anticorpo primário ou pré-absorção com o péptideo sintético correspondente. Após procedimentos de coloração imunológica, as secções foram colocadas sob gelo em lâminas revestidas com gelatina. De seguida, as secções foram desidratadas em gradientes de álcool (70, 90, 100%), limpas em xileno e montaram-se lamínulas com DPX (Fluka, Buchs, Suiça).

Após análise radiológica, no 19.° dia após injecção do tumor, fémures do lado direito (controlo interno) e do lado esquerdo (com tumor) foram fixados em ácido picrico e 4% de formalina a 4°C durante a noite, e descalcifiçados em 10% de EDTA (Sigma) durante não mais de 14 dias. Os ossos foram embebidos em parafina. Cortaram-se secções femorais com 5 -142 - μιη de espessura no plano lateral e sujeitaram-se a coloração com fosfatase ácida resistente ao tartrato (TRAP) e hematoxilina e eosina (H&E) para verificação das caracteristicas histológicas da medula óssea normal, do tumor, dos osteoclastos, dos osteoblastos e dos macrófagos (MS) .

A análise imunohistoquimica dos fémures com sham e cancerosos foi realizada em secções em série descalcifiçadas, embebidas em parafina e com 14 pm. AS peroxidases endógenas foram embebidas através da incubação das secções em 2% de peróxido de hidrogénio durante 1 hora. As secções foram lavadas três vezes com PBS durante 10 minutos e bloqueadas em tampão de bloqueio TSA (TSA-Plus Cyanine 3 System, Perkin Elmer Life Sciences, Inc., Boston, MA) durante 1 hora. Adicionou-se antisoro primário após remoção do tampão de bloqueio e deixou-se incubar à temperatura ambiente durante a noite. Fibras nervosas primárias aferentes e amielinizadas, e fibras nervosas sensoriais pouco mielinizadas, foram marcadas usando um anticorpo crescido contra péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP) de coelho policlonal (1:15000, Sigma). As secções foram depois lavadas três vezes com tampão TSA durante 10 minutos. Aplicou-se tiramina conjugada com Cy3 (1:600) aos fémures durante 7 minutos, lavou-se duas vezes com tampão TSA e uma vez com PBS. Por fim, as secções foram secas ao ar livre, desidratadas com gradiente de álcool -143 -

(70, 90 e 100%), limpas com xileno e montadas com DPX (Fluka).

Análise de radiografias ósseas. Obtiveram-se radiografias (Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL) dos fémures dissecados no 19.° ponto temporal para avaliar o nivel de destruição óssea. As imagens foram capturadas em película de mamografia Kodak Min-R2000 (Eastman Kodak Co., Rochester, NY; definições de exposição: 7 seg., 21 kVp). A extensão da destruição femoral induzida pelo tumor foi avaliada por radiologia no plano lateral das imagens do osso com uma ampliação de 5X. Fémures com e sem tumores (n=8 para animais simples + veículo, sham + veículo, ACE-1 + veículo e ACE-1 + anti-NGF) foram analisados usando imageJ (Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD) de forma idêntica ao protocolo previamente descrito. Corey et al., Prostate 52:20-33, 2002. Resumidamente, utilizaram-se películas radiográficas "limpas" e uma mesa padrão (Eastman Kodak Co.) para desenvolver uma curva de calibração. Utilizou-se o programa ImageJ para medir a densidade óptica e subsequentemente converteu-se em transmissão da seguinte forma: transmissão= 1/(antilogio [densidade óptica]). Os dados são determinados a partir de uma imagem negatica, logo, a transmissão é uma reprsentação directa da densidade óssea. Utilizou-se um scanner HP ScanJet 7400c para capturar as radiografias femorais sub-saturação, e as leituras foram registadas em -144 - duplicado para cada fémur. Os resultados são apresentados sob a forma de média normalizada ± SE.

Análise histológica de osteoblastos, osteoclastos e macrófafos, crescimento tumoral e remodelação óssea. Analisou-se a proliferação de osteoblastos quantificando o número de osteoblastos imediatamente em contacto com regiões da nova formação óssea induzida pelo tumor contidas no interior do fémur e do osso cortical ao longo do espaço intramedular diafisário em animais simples, animais injectados com sham e animais detentores de tumores. 0 espaço intramedular diafisário definiu-se como prolongando-se das trabéculas proximais distais às trabéculas distais proximais e seleccionou-se para quantificação, já que a predominante remodelação óssea activa ocorre nesta região. Os osteoblastos foram identificados como aquelas células em contacto directo com a nova matriz óssea em progressão e dispostas em camada epitelial tipicamente cuboidal ou colunar e ligadas entre si através de um processo identificável sob elevada ampliação (200x ou superior). Os resultados são apresentados sob a forma do número de osteoblastos/mm2 de espaço intramedular diafisário em ratos simples, injectados com sham e detentores de tumor.

Determinou-se a proliferação de osteoblastos através da quatificação do número de TRAP + osteoclastos na interface osso/tumor e na interface normal medula/osso em ratos simples, injectados com sham e injectados com ACE-1 nas -145 - secções femorais marcadas, conforme supra descrito. Honore et al., Nat. Med. 6: 521-528 (2000). Resumidamente, os osteoclastos são células histologicamente diferenciadas sob a forma de TRAP+ e intimamente associadas a regiões de ressorção óssea. Estas células são multinucleadas e encontram-se nas lacunas de Howship ao longo do osso cortical e trabecular. Fawcett, D. W., A Textbook of Hístology. in D. Dreibelbis (ed.), Bone 11.a edição, pp. 211-213. Filadélfia, PA: W. B. Saunders Company, 1986. A proliferação de macrófagos (Ms) determinou-se através da quantificação do número de células TRAP+ dispersas ao longo do tumor e na medula normal e não associados com a superfície endostal do osso mineralizado. Os macrófagos no interior do osso foram activados graças aos factores libertados pelo tumor que estimulam as células, e a aparência destes Ms activados caracteriza-se pela sua superfície altamente irregular, pelas múltiplas lamelas citoplasmáticas (lamelipodia) e vacúolos fagocíticos. Os resultados são expressos sob a forma de número médio de osteoclastos por mm2 ou Ms por mm2 de espaço intramedular diafisário, respectivamente. Fémures contendo células ACE-1 foram sujeitos a imagiologia usando microscopia sobre fundo claro com microscópio de fluorescência Nikon E600 equipado com câmara digital SPOT II que utilizava software de captura de imagem SPOT (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). A área -146 - total do espaço intramedular e a percentagem de espaço intramedular ocupado pelo tumor, formação óssea e células hematopoiéticas remanescentes foram calculados usando o software Image Pro Plus v3.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Sabino et al., Câncer Res. 62: 7343-7349 (2002), Sevcik et al., Pain 111: 169-180 (2004). A formação óssea foi analisada usando as mesmas secções de fémur manchado com H&E utilizadas para quantificar o crescimento tumoral. As secções de fémur foram observadas sob luz polarizada para identificar regiões de formação óssea embrionária ("woven bone") e lamelar. As regiões de formação óssea embrionária foram observadas através da câmara digital SPOT II e quantificadas usando o software Image Pro Plus v3.0. Os resultados são apresentados sob a forma de área do tumor, formação óssea induzida por tumor, e células hematopoiéticas remanescentes, sob a forma de percentagem de área intramedular total.

Quantificação das fibras sensoriais no osso e pele. Determinou-se o número de fibras nervosas sensoriais conforme supra descrito. Mach et al., Neuroscience 113:155-166 (2002) . Resumidamente, o número de fibras imunoreactivas a CGRP em três regiões ósseas (proximal, distai e diafisária) e em três tecidos ósseos (periósteo, osso mineralizado e medula) foi identificado usando um sistema de imagem confocal MRC-1024 (Bio-Rad, Richmond, CA) equipado com uma objectiva de 20x. A contagem de fibras -147 - nervosas foi realizada através da visualização de seis secções de fémur por rato através de um microscópio de fluorescência Olympus BH-2. Apenas se incluíram na análise fibras nervosas com um comprimento superior a 30 pm. Para medir a área de superfície total (mm2) de cada osso, analisaram-se as mesmas secções de fémur de cada contagem de fibras nervosas obtidas. A área total de osso foi medida em imagens digitais das secções de fémur adquiridas através da câmara digital SPOT II e do software Image Pro Plus v.3.0. Os resultados são apresentados sob a forma de número de fibras contadas por área total de osso.

Procedeu-se à quantificação da densidade da inervação epidérmica em 4 secções de pele plantar da pata traseira por rato. O número total de fibras nervosas de CGRP, TOH e RT97-IR foi contado com uma ampliação de 200x. As normas de contagem foram definidas de forma a contar apenas fibras individuais intra-epidérmicas e não feixes múltiplos da mesma fibra. McCarthy et âl., Neurology 45: 1848-1855 (1995). Mediu-se o comprimento total de epiderme de todas as secções quantificadas através de uma ocular de 1 cm2. Contaram-se apenas as fibras nervosas com pelo menos 25 pm de comprimento, e projectadas na epiderme superficial. Os resultados são apresentados sob a forma de número médio de fibras nervosas intra-epidérmicas por mm de comprimento por animal. -148-

Análise de RT por PCR dos níveis de mRNA de NGF em células ACE-1. Preparou-se ARN total a partir de células tumorais ACE-1 cerebrais caninas ou células tumorais prostáticas caninas, de acordo com as instruções do fabricante, usando o micro kit RNeasy (Qiagen), e quantificou-se o ARN usando reagente Ribogreen (Molecular Probes) . Realizou-se transcriptase-reversa associada à reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) de duas fases usando o kit de RT-PCR TaqMan Gold (Applied Biosystems). Sujeitou-se o ARN a transcrição reversa usando hexâmeros aleatórios, e amplificou-se o cDNA com um conjunto de primer/sonda especifico para NGF (LB041: AACAGGAC T CACAGGAGCAA (SEQ ID NO:6), LB042: CGGCACTTGGTCTCAAAGAA (SEQ ID NO:7) e LB045: AATGTTCACCTCTCCCAGCACCATCA (SEQ ID N0:8)). As amostras foram analisadas em duplicado ao nível da RT e normalizadas ao input do ARN total.

Analise estatística. Utilizou-se um pacote informático de estatística Statview (SAS Institute, Cary, NC) para realizar os testes estatísticos. Utilizou-se uma análise de variância simples ("one-way ANOVA") para comparar os resultados comportamentais, os resultados histológicos dos ossos e as medições imunohistoquímicas entre os grupos experimentais. Para comparações múltiplas, utilizou-se o teste post-hoc Fisher's PLSD ("protected least significant difference") . Os resultados eram considerados -149 - estatisticamente significativos com P<0,05. 0 investigador ignorou o estatuto experimental de cada animal.

Resultados A terapia com anti-NGF atenuou a dor associada ao cancro numa maior extensão do que o sulfato de morfina, mas não afectou os limiares térmicos ou mecânicos de referência. Analisou-se a dor continua através da medição da tensão espontânea e tremor ao longo de um periodo de 2 minutos. Os ratos injectados com ACE-1 + veiculo passaram um maior periodo de tempo em tensão (7,7±0,8 seg., dia 19) comparativamente aos controlos com sham + veículo (0,6±0,3 seg., dia 19, Figura 10A). Alem disso, os ratos injectados com ACE-1 + veículo apresentaram maior número de tremores (11,9±1,2 seg., dia 19) comparativamente aos controlos com sham + veículo (1,0±0,4 seg., dia 19, Figura 10B). A administração de anti-NGF em ratos injectados com ACE-1 atenuou significativamente a tensão espontânea (1,2±0,4 seg., dia 19) comparativamente aos ratos injectados com ACE-1 + veículo (Figura 10A). O tratamento com anti-NGF também reduziu significativamente os tremores espontâneos em ratos injectados com ACE-1 (2,1±0,7, dia 19) comparativamente aos animais injectados com ACE-1 + veículo (Figura 10B). Em estudos preliminares, não foram observadas quaisquer diferenças comportamentais ou efeitos secundários -150- entre os controlos operados com sham que receberam veículo ou anti-NGF. A terapia com anti-NGF não surtiu qualquer efeito sob a resposta térmica normal (10,2±0,4 seg., dia 19) comparativamente aos animais simples + veículo (11,2±0,4 seg., dia 19, Figura 10C) ou sob a resposta mecânica normal (5,4±0,3 seg., dia 19) comparativamente aos animais simples + veículo (5,2±0,4 seg., dia 19, Figura 10D).

Os animais foram testados por forma a comparar a eficácia do sulfato de morfina (MS) com a eficácia do anticorpo anti-NGF na redução dos comportamentos de dor associada ao cancro ósseo. A avaliação comportamental nos dias 11 e 19 após injecção de tumor revelou que os animais injectados com ACE-1 + veiculo passaram um período de tempo estatisticamente mais prolongado com o membro injectado em tensão (6,0±1,0 e 7,6±1,2 seg., dias 11 e 19, respectivamente), comparativamente a ratos injectados com sham + veículo (0,4±0,2 e 0,6±0,3 seg., dias 11 e 19, respectivamente, Figura 10E). Os animais injectados com ACE-1 + veículo também demonstraram um número estatisticamente maior de tremores do membro injectado (8,6±1,2 e 11,7±1,7, dias 11 e 19, respectivamente) comparativamente aos animais injectados com sham + veículo (0,7±0,3 e 1,0±0,4 seg., dias 11 e 19, respectivamente, Figura 10F). A tensão contínua foi significativamente reduzida através de tratamento crónico com anti-NGF -151- (2,1±1,1 e 1,4±0,4 seg., dias 11 e 19, respectivamente), ou com 10 mg/kg de sulfato de morfina (3,5±0,3 e 4,0±0,5 seg., dias 11 e 19, respectivamente) ou com 30 mg/kg de sulfato de morfina (2,2±0,3 e 2,0±0,4 seg., dias 11 e 19, respectivamente), comparativamente aos ratos injectados com ACE-1 + veículo (Figura 10E). Os tremores contínuos também foram significativamente reduzidos através de tratamento crónico com anti-NGF (3,4±1,7 e 2,6±0,6 seg., dias 11 e 19, respectivamente), com 10 mg/kg de sulfato de morfina (5,6±0,5 e 6,8±0,7 seg., dias 11 e 19, respectivamente) ou com 30 mg/kg de sulfato de morfina (3,6±0,5 e 3,5±0,7 seg., dias 11 e 19, respectivamente), comparativamente aos ratos injectados com ACE-1 + veículo (Figura 10F). A terapia com anti-NGF atenuou significativamente os comportamentos de dor associada ao cancro ósseo de forma mais eficaz do que 10 mg/kg de sulfato de morfina. Não se observaram quaisquer diferenças nos pesos terminais entre os animais sham + veiculo (27±1 g) , ACE-1 + veiculo (27±1 g) e ACE-1 + anti-NGF (26±1 g). Nestes estudos, não se verificaram diferenças comportamentais ou efeitos secundários significativos, tais como ataxia, mal-estar ou letargia, entre animais que receberam veículo ou anti-NGF. A terapia anti-NGF atenuou a dor associada ao cancro ósseo evocada pelo toque. Também se avaliou a dor associada ao cancro ósseo evocada pelo toque. Mediram-se a tensão e tremor induzidos pela palpação após o período de 2 minutos -152 - de palpação normalmente inofensiva do fémur distai em animais injectados com ACE-1 e com sham. Conforme apresentado nas Figuras 10G e 10H, os animais injectados com ACE-1 (administrado com soro fisiológico) desenvolveram comportamentos de dor evocada pelo toque no 7.° dia, conforme avaliado por tensão evocada por palpação (Fig. 10G) e tremor induzido por palpação (Fig. 10H) (p<0,01, ANOVA), comparativamente aos animais injectados com sham (administrado com soro fisiológico) . As Figuras 10G e 10H também mostram que a administração i.p. do anticorpo 911 anti-NGF reduziu significativamente a tensão induzida por palpação (Fig. 10G) e o tremor induzido por palpação (Fig. 1 OH) em ratos injectados com ACE-1, desde o dia 11 ao dia 19 após implantação do tumor ACE-1, comparativamente à administração de soro fisiológico em ratos injectados com ACE-1 (p<0,01, anova, quer na tensão induzida por palpação, quer no tremor induzido por palpação). Estes resultados indicam que o anticorpo 911 anti-NGF reduz a dor evocada pelo toque em ratos injectados com ACE-1. A terapia com anti-NGF não surtiu qualquer efeito sob os marcadores da progressão da doença ou formação óssea induzida por tumor. Os efeitos da terapia com anti-NGF sobre a formação e destruição ósseas, crescimento tumoral (Figura 11) e proliferação de osteoclastos (Figura 12) foram analisados 19 dias depois da injecção de tumor (Quadro 4, infra). Os ratos injectados com sham não -153 - apresentaram uma significativa remodelação óssea (valor de transmissão normal de 115±2%) (Figura 11A), uma proliferação de osteoclastos ao longo de todo o espaço intramedular (16±10 osteoclastos/mm2 de área intramedular diafisária) (Figura 12A) ou células tumorais (0±0%) (Figura 11D), conforme avaliado por análise radiológica, TRAP e H&E, respectivamente, comparativamente com ratos injectados com ACE-1. Nos ratos injectados com ACE-1 + veiculo, houve formação e destruição ósseas extensivas mas praticamente equivalente, conforme observado e caracterizado por "bridging" e radiolucências multifocais diafisárias (valor de transmissão normalizado de 109±5%) (Figura 11B), um aumento marcado do número de osteoclastos (Figura 12B) e osteoblastos ao longo da área intramedular diafisária (47±3 osteoclastos/mm2 e 127±7 osteoblastos/mm2) e o tumor preencheu grande parte do espaço intramedular (60±7% do espaço intramedular) (Figura 10E) . O tratamento de ratos com tumor com anticorpo anti-NGF desde o 7.° dia após injecção de tumor não resultou numa alteração significativa da remodelação óssea (valor de transmissão normalizado de 106±9%; Figura 11C), não resultou em redução da proliferação de osteoclastos induzida por ACE-1 (Figura 12C) nem proliferação de osteoblastos ao longo da área intramedular diafisária (47±5 osteoclastos/mm2 e 118±5 osteoblastos/mm2), ou crescimento tumoral (57±6% de espaço -154 - intramedular), comparativamente com os animais injectados com ACE-1 + veiculo (Figura 11F).

Quadro 4: Quantificação histológica e radiológica da remodelação óssea e progressão tumoral em animais tratados com anti-NGF e em animais tratados com ACE-1 Simples + veículo Sham + veículo ACE-1 + veículo ACE-1 + anti-NGF 1. Histomorfometria óssea Osteoclastos (#OC/mm2 espaço intramed. diafis.) 7±1 16±10 47±3 a,b 47±5 a'b Osteoblastos (#OB/mm2 espaço intramed. diafis.) 81±4 72±5 127±7 a'b 118±15 a'b Macrófagos (Ms) (Ms/mm2 espaço intramed. diafis.) 2±1 2±1 27±2 a'b 24±3 a,b Formação óssea induzida por tumor (% esp.intramed. diafis. ocupado) 0±0 0±0 14±2 a'b 13±1 a'b Células tumorais (% esp.intramedular ocupado) 0±0 0±0 60±7 a'b 57±6 a'b Células hematopoiéticas (% esp.intramedular ocupado) 100±0 100±0 26±8 a'b 30±6 a'b 2. Valor radiológico de remodelação óssea 100% x ( (% Transmissão Normalizada (1/antilog[Densidade Optica])/(Transmissão naif)) 100±2 115±2 109±5 106±9 a P<0,05 versus simples b P<0,05 versus sham (análise de variância simples, PLSD de Fisher). -155 -

Dezanove dias após injecção do tumor, os ratos injectados com ACE-1 + veículo apresentaram um aumento dos macrófagos (Ms) (27+3 Ms/mm2 de área intramedular diafisiária) comparativamente com os ratos de controlo injectados com sham + veículo (2+1 Ms/mm2) . 0 tratamento com anti-NGF de ratos injectados com ACE-1 (24±3 Ms/mm2) não alterou significativamente a infiltração de Ms, conforme verificado nos ratos injectados com ACE-1 + veículo (Quadro 4). A terapia com anti-NGF não surtiu qualquer efeito observável sobre a inervação sensorial ou simpática no osso ou pele. Fibras nervosas sensoriais peptidérgicas ligeiramente mielinizadas ou amielinizadas (CGRP-IR), fibras sensoriais mielinizadas (RT97-IR) e fibras nervosas simpáticas noradrenérgicas (TOH-IR) foram analisadas nos fémures injectados com ACE-1 ou na pele plantar da pata traseira por imunohistoquímica usando anticorpos crescidos contra CGRP, RT97 e TOH, respectivamente. As fibras nervosas de CGRP-IR foram encontradas ao longo de todo o osso (periósteo, osso mineralizado, medula óssea e tumor) dos animais injectados com ACE-1 + veículo (23,5±1,9 fibras/mm2) e animais injectados com ACE-1 + anti-NGF (24,0±1,9 fibras/mm2), bem como em animais injectados com sham + veículo (28,2±1,5 fibras/mm2) e animais simples + veículo (24,6±2,4 fibras/mm2) ou animais simples + anti-NGF (23,1±1,9 fibras/mm2) (Figura 14). Não se verificou qualquer diferença significativa entre a intensidade ou -156- densidade das fibras de CGRP-IR nas amostras de pele plantar de animais tratados com ACE-1 + veiculo (13,9±0,5 fibras/mm) e ACE-1 + anti-NGF (15,2±0,7 fibras/mm) (Figuras 13A e 13B). Da mesma forma, não se verificou qualquer na intensidade ou densidade das fibras CGRP-IR nas amostras de pele da pata traseira de ratos simples + veiculo (14,4±0,4 fibras/mm) e ratos simples + anti-NGF (14,2±1,3 fibras/mm) (Figuras 14A e B). Diferenças na densidade e intensidade das fibras RT97-IR e TOH-IR também se mostraram indetectáveis em animais simples + veiculo (4,2±2,2 RT97 fibras/mm, 1β,0±2,7 TOH+ fibras/mm) e animais simples + anti-NGF (8,0±0,6 RT97+ fibras/mm; 12,8±1,1 TOH+ fibras/mm). Não se verificaram diferenças significativas entre a intensidade ou densidade das fibras de CGRP, RT97 ou TOH-IR nas amostras de pele de ratos injectados com ACE-1 + veículo e ACE-1 + anti-NGF versis ratos simples + veículo e ratos simples + anti-NGF. Nível de expresão de mRNA em células ACE-1. Realizou-se a comparação entre a expressão de NGF em células cerebrais caninas e em células ACE-1. Analisaram-se cinco amostras independentes de ACE-1, e em cada uma delas, a expressão de NGF encontrava-se abaixo do nível de detecção do ensaio PCR. 0 NGF cerebral canino ultrapassou o limiar no ciclo 35,2 de uma experiência de 40 ciclos, enquanto que as amostras de ACE-1 não ultrapassaram o limiar após os 40 ciclos. Assim, a expressão de mRNA nas amostras de ACE-1 -157 - foi de, pelo menos 27,8 vezes inferior à expressão cerebral.

Exemplo 4

Efeitos analgésicos do anticorpo anti-NGF E3 em pacientes com dor moderada a aguda associada às metástases ósseas provocadas por cancro da próstata ou da mama

Num estudo aleatorizado, controlado por placebo e em dupla ocultação, os efeitos analgésicos (incluindo tempo para surgimento de sintomas, tempo de pico, duração e alivio da dor, conforme medidos por escala visual analógicas (VAS)) de doses intravenosas (100 pg/kg, 300 pg/kg ou 1000 pg/kg) de anticorpo anti-NGF E3 são comparados com placebo em pacientes com dor moderada a aguda associada às metástases ósseas provocadas por cancro da próstata ou da mama. Adultos de ambos os sexos (com idades compreendidas entre os 35 e os 75 anos) que sentem dor moderada a aguda associada às metástases ósseas provocadas por cancro da próstata ou da mama, são incluídos no estudo. Durante o período de rastreio, é pedido aos pacientes que registem o seu nível de dor quatro vezes por dia e que registem também o uso de outra medicação analgésica durante 14 dias antes da administração do anticorpo anti-NGF E3. -158- São admitidos duzentos e oitenta pacientes no estudo. A administração de anticorpo anti-NGF E3 ocorre durante as manhãs do dia 1 ao dia 29, após registo de duas semanas do nível de dor base, da utilização de outros analgésicos e da existência de efeitos adversos. Os duzentos e oitenta pacientes são divididos em quatro grupos, cada grupo com setenta pacientes. Os pacientes de cada grupo são tratados com placebo, 100 pg/kg, 300 pg/kg ou 1000 pg/kg de anticorpo anti-NGF E3.

Os efeitos analgésicos são avaliados quatro vezes ao dia, durante catorze dias, antes da administração e durante um período de seis meses após a administração do anticorpo E3. O resultado é avaliado mediante alteração do valor base do rastreio (nível de dor médio durante catorze dias antes da administração de placebo ou anticorpo E3). Qualquer redução dos níveis de dor e/ou redução da utilização de outros analgésicos em um ou mais grupos de pacientes tratados com anticorpo E3 anti-NGF comparativamente ao placebo demonstra eficácia do tratamento com anticorpo anti-NGF E3. -159 -

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • US 10682331 B [0008] • US 10682638 B [0008] • US 10682332 B [0008] • US 20040131615 A [0008] • US 10783730 B [0008] • US 20040253244 A [0008] • US 10745775 B [0008] [0091] • US 20040237124 A [0008] • US 10791162 B [0008] • US 0332089 W [0008] • WO 04032870 A [0008] • US 0332083 W [0008] • WO 2005000194 A [0008] • US 0332113 W [0008] • US 200405162 W [0008] • WO 04073653 A [0008] • US 0341252 W [0091] • WO 04058184 A [0070] • GB 9901441 W [0014][0067][0077] [0091] • GB 9809951 [0014][0067][0077][0091] • US 5616601 A [0057] • US 5593994 A [0057] -160 -

-160 - us 5550142 A us 5536752 A us 552121 : 3 A us 5475995 A us 5639780 A us 5604253 A us 5552422 A us 5510368 A us 5436265 A us 5409944 A us 5130311 A wo 2005019266 wo 0178698 A wo 0164247 A us 5844092 A us 5877016 A us 6153189 A us 5500362 A us 4816567 A us 5807715 A us 5866692 A us 6331415 B us 5530101 A us 5693761 A us 5693762 A us 5585089 A us 6180370 B us 6548640 B EP 0519596 A us 6180377 B us 6054297 B us 5997867 B us 5866692 B us 6210671 B 0057] 0057] [0057] 0057] 0057] 0057] 0057] 0057] 0057] 0057] 0057] A [0067] 0069] 0069] 0069] 0069] 0069][0114] 0077] 0090] 0090] 0090] 0090] 0090] 0090] 0090] 0090] 0090] 0090] 0091] 0091] 0091] 0091] 0091] 0091] -161- us 6350861 B [0091] wo 0127160 A [0091] us 5565332 A [0093] us 5580717 A [0093] us 5733743 A [0093] us 6265150 A [0093] wo 9306213 A [0093] wo 8704462 A [0098] us 20010046959 [0101][0104][0115] wo 0069829 A [0104] wo 9817278 A [0104] wo 0217914 A [0104] wo 0220479 A [0104] us 5342942 A [0104] us 6127401 A [0104] us 6359130 A [0104] us 6291247 B [0104][0107] wo 9715593 A [0107] us 6017878 A [0107] wo 8909225 A [0107] wo 9806048 A [0107] us 6436908 B [0108] us 6413942 B [0108] us 6376471 B [0108] wo 9007936 A [0110] wo 9403622 A [0110] wo 9325698 A [0110] wo 9325234 A [0110] wo 9311230 A [0110] wo 9310218 A [0110] wo 9102805 A [0110] us 5219740 A [0110] us 4777127 A [0110] GB 2200651 A [0110] -162 -

-162 - • ΕΡ 0345242 A • WO 9412649 A • WO 9303769 A • WO 9319191 A • WO 9428938 A • WO 9511984 A • WO 9500655 A • us 5814482 A • WO 9507994 A • WO 9617072 A • WO 9530763 A • WO 9742338 A • WO 9011092 A • us 5580859 A • us 5422120 A • WO 9513796 A • WO 9423697 A • WO 9114445 A • EP 0524968 A • WO 9721732 A • WO 0073334 4 • WO 0215924 A • us 6306849 B • WO 04065560 • us 5766863 A • us 5891650 A • WO 0053211 A • us 5981568 A • us 4485045 A • us 4544545 A • us 5013556 A • us 3773919 A • us 3773919 A

[0110] [0110] [0110] [0110] [0110] [0110] [0110] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0115] [0115] [0115] [0117] [0119] [0119] [0119] [0136] [0136] [0146] [0146] [0146] [0148] [0148] -163 -

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Lisboa, 15/03/2010

Claims

-1- Reivindicações 1. Uso de um antagonista do factor de crescimento nervoso (NGF) na produção de um medicamento destinado ao tratamento da dor associada ao cancro ósseo num indivíduo, em que o antagonista do NGF é um anticorpo antagonista anti-NGF.
2. Uso da reivindicação 1, em que a dor associada ao cancro ósseo advém de um cancro originado no osso.
3. Uso da reinvindicação 2, em que a dor associada ao cancro ósseo advém de um osteosarcoma.
4. Uso da reinvindicação 1, em que a dor associada ao cancro ósseo advém de um cancro metastizado para o osso.
5. Uso da reinvindicação 4, em que o cancro metastizado para o osso é seleccionado entre o cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão, sarcoma e cancro renal.
6. Uso de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo antagonista anti-NGF é um anticorpo monoclonal.
7. Uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o -2- anticorpo antagonista anti-NGF é um anticorpo humanizado.
8. Uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o anticorpo antagonista anti-NGF é um anticorpo humano.
9. Uso de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o anticorpo antagonista anti-NGF se liga a NGF humano.
10. Uso da reivindicação 9, em que o anticorpo antagonista anti-NGF se liga a NGF de roedor.
11. Uso da reivindicação 9, em que o anticorpo antagonista anti-NGF se liga a NGF humano com um KD de cerca de 0,1 nM ou inferior a cerca de 0,1 nM.
12. Uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7, ou qualquer uma das reivindicações 9 a 11, se dependente de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7, em que a região variável da cadeia pesada do anticorpo antagonista anti-NGF inclui uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1.
13. Uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 7 ou 12, ou qualquer uma das reivindicações 9 a 11, se dependente de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7, em que a região variável da cadeia leve do anticorpo antagonista anti-NGF -3- inclui uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:2.
14. Uso de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o antagonista do NGF não deve ser co-administrado com um analgésico opióide.
15. Anticorpo antagonista anti-NGF para utilização no tratamento da dor associada ao cancro ósseo num indivíduo. Lisboa, 15/03/2010 -1/15- φ > + φ m > > ιή if5 o p d d v y o, a, * t

Φ > + Tensão espontânea

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151

-11/15-

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14/15 Figura Ο

15/15 Figura 14