PT1790655E

PT1790655E - PéPTIDOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS

Info

Publication number: PT1790655E
Application number: PT07000950T
Authority: PT
Inventors: Wai Ming Wong; Kong Lam
Original assignee: Cms Peptides Patent Holding Co
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-11
Publication date: 2010-07-09
Also published as: EP1478659A2; KR20040019058A; PL211884B1; RU2004104335A; EP1790655A2; ES2345842T3; KR100889992B1; JP4213581B2; JP4316651B2; EP1947109A2; EP1790655A3; IL159827A0; WO2003006492A2; EP1790655B1; NZ544079A; NZ529879A; DE60229883D1; JP2007312785A; IL184227A; ATE414099T1

Description

ΡΕ1790655 1

DESCRIÇÃO "PEPTIDOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS"

CAMPO DO INVENTO O presente invento está relacionado com a área da imunologia. Em particular, o presente invento é dirigido a péptidos e suas composições farmacêuticas capazes de modularem respostas imunes.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Na área são conhecidos péptidos para o tratamento de doenças e suas composições farmacêuticas. Por exemplo, a Patente U.S. N° 6191113 descreve um péptido possuidor de actividade inibidora do crescimento de células do músculo liso e que, portanto, é útil na prevenção e tratamento de condições patológicas associadas ao crescimento de células do músculo liso, tais como arterosclerose, restenose após angioplastia, estenose luminal após enxerto de vasos sanguíneos e sarcoma do músculo liso. A patente US 6184208 descreve um outro péptido que modula processos fisiológicos tais como actividade de aumento de peso da zona de crescimento epitelial e do crescimento de cabelo.

Karelin C.S. (Peptides, vol. 16, N° 4, 693-697 2 ΡΕ1790655 1995) descreve fragmentos de alfa-hemoglobina (33-38) e (33-46) tendo respectivamente actividade imunomoduladora e de libertação de ACTH. US5861483 descreve o fragmento de alfa-hemoglobina (1-97) tendo actividade imunomoduladora.

SUMÁRIO DO INVENTO É assim um objectivo do presente invento identificar polipéptidos biologicamente activos. Foram sintetizados muito péptidos por métodos químicos convencionais e testados relativamente à sua actividade biológica. Aos péptidos foram atribuídos códigos tendo as letras CMS seguidas de um número. Um total de 30 péptidos foi identificado como tendo actividade biológica in vivo. Na Tabela A estão apresentadas as sequências e os correspondentes números ID destes péptidos biologicamente activos.

Tabela A

Listagem de sequências ID N2 Péptido e nome Sequência peptídica 1 CMS001 Pro Tre Tre Lis Tre Tir Fen Pro His Fen 2 CMS002 Vai Vai Tir Pro Trp Tre Gin Arg Fen 3 CMS008 Lis Ala Vai Gli His Leu Asp Asp Leu Pro Gli Ala Leu 4 CMS010 Vai Ala Pro Glu Glu His Pro Tre Leu Leu Tre Glu Ala Pro Leu Asn Pro Lis 5 CMS012 Leu Gli Met Glu Ala Cis Gli Ile His Glu Tre Tre Tir 6 CMS013 Leu Arg Vai Ala Pro Glu Glu His Pro Vai Leu 7 CMS014 Ala Ala His His Pro Asp Asp Fen Asn Pro Ser Vai 8 CMS015 Pro Ser Ile Vai Gli Arg Pro Arg His Gin Gli Vai Met 9 CMS016 Ile Gli Met Glu Ser Ala Gli Ile His Glu Tre Tre Tir 3 ΡΕ1790655 (continuação)

Listagem de sequências ID Ne Péptido e nome Sequência peptidica 10 CMS018 Vai Gli Met Gli Glu Lis Asp Ser Tir 11 CMS019 Vai Gli Met Gli Gin Lis Ser Tir 12 CMS020 Vai Gli Met Gli Gin Lis Asp Ser Tir Vai 13 CMS021 Met Ala Tre Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu 14 CMS022 Tir Ser Fen 15 CMS023 Ala Ala Fen 16 CMS024 Tir Ser Leu 17 CMS026 Tre Tre Tir Asn Ser Ile Met 18 CMS027 Fen Glu Glu Asn Met 19 CMS028 Fen Glu Pro Ser Fen 20 CMS029 Fen Asn Glu Glu 21 CMS030 Fen Glu Glu Met 22 CMS032 Fen Glu Glu Glu 23 CMS033 Fen Glu Ser Fen 24 CMS034 Pro Glu Asn Fen 25 CMS035 Fen Vai Asn Asp 26 CMS036 Fen Gin Pro Ser Fen 27 CMS003 Fen Asn Fen Vai Pro Pro 28 CMS007 Ala Gli Asp Asp Ala Pro Arg Ala Vai Fen 29 CMS009 Leu Arg Vai Ala Pro Glu Glu His Pro Tre Leu 30 CMS011 Arg Vai Ala Pro Glu Glu His Pro Tre Leu

Assim, um aspecto do presente invento está relacionado com um péptido substancialmente puro tendo uma sequência identificada como sequência ID N°l. Assim, o presente invento está relacionado com um péptido substancialmente puro consistindo numa sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1. Numa realização especifica, o péptido pode modular, mas não estar limitado à modulação, um ou mais do seguinte: actividade imune; hepatite 4 ΡΕ1790655 infecciosa, incluindo mas não estando limitado a infecção pelo virus da hepatite B; nefrite; o crescimento de um tumor, incluindo mas não estando limitado a sarcoma, cancro do fígado, leucemis e melanoma; e peso do corpo.

Ainda, um outro aspecto do presente invento está relacionado com uma composição farmacêutica compreendendo um péptido substancialmente puro consistindo numa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l.

Ainda, um outro aspecto do presente invento está relacionado com um método de fabrico de uma composição farmacêutica compreendendo o fornecimento de um péptido substancialmente puro consistindo numa sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 e a mistura do referido péptido substancialmente puro com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Ainda num outro aspecto, o invento proporciona um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 para usar em terapia. O invento também proporciona a utilização de um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 para a produção de um medicamento para a modulação de actividades imunes, hepatite virai ou o crescimento de um cancro.

De forma semelhante, o invento proporciona um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de 5 ΡΕ1790655 aminoácidos de SEQ ID NO:l para usar na modulação de actividades imunes, hepatite virai ou o crescimento de um cancro.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os péptidos podem ser facilmente sintetizados por métodos de síntese convencionais a partir de L-aminoácidos, mas podem também ser sintetizados através de métodos de engenharia genética usando ácidos nucleicos que têm sequências codificadoras dos péptidos individuais. I. Actividade biológica

Para investigar a possível actividade biológica dos péptidos, avaliámos o efeito imunológico dos péptidos num modelo animal, usando procedimentos regidos pelos Princípios de Investigação Pré-clínica de Novos Fármacos ("Principies of Pre-clinical Research of New Drugs") publicado pelo Ministério da Saúde da República Popular da China [1]. 0 teste da transformação de linfócitos T, o teste de actividade citotóxica das células NK e o teste de secreção de IL-2 e IFN-γ por linfócitos T foram usados para detectar qualquer possivel efeito dos péptidos na função imune celular específica. 0 teste da eliminação de partículas de carbono foi usado para detectar qualquer possível efeito dos péptidos na função imune celular não 6 ΡΕ1790655 específica. O teste da hemólise de eritrócitos de carneiro ("SRBC") foi usado para detectar qualquer possível efeito dos péptidos na função imune humoral. 0 teste do peso dos órgãos relacionados com a imunidade foi usado para detectar qualquer possível efeito dos péptidos ao nível dos órgãos.

Neste estudo, o grupo do soro fisiológico foi usado como controlo negativo, enquanto que os grupos de IL-2 e IFN-γ foram usados como controlos positivos, uma vez que IL-2 e IFN-γ são imuno-estimulantes bem estudados [10]. Neste estudo foram usadas quatro concentrações arbitrárias dos péptidos a testar, para cobrir uma gama de dosagens de 1000 vezes. Devido à complexidade intrínseca da resposta imunológica in vivo e à ausência de conhecimento prévio da função dose versus resposta, qualquer diferença estatisticamente significativa relativamente ao controlo negativo, em quaisquer dos grupos de dosagem, foi considerada actividade biológica positiva.

Os resultados deste estudo foram os seguintes: 1. Encontrou-se que os péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS019, CMS021, CMS029 e CMS034 são capazes de efectuar a transformação de linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. Também se observou que os péptidos CMS014 e CMS036 são capazes de inibir a transformação de linfócitos T, tendo diferença estatis- 7 ΡΕ1790655 ticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. 2. Encontrou-se que os péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS 0 0 8, CMS009, CMS 010, CMS 011, CMS 012, CMS013, CMS015, CMS 016, CMS 02 0, CMS 021, CMS 0 2 2, CMS023, CMS024, CMS026, CMS 0 2 7, CMS 02 8, CMS 02 9, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS036 são capazes de aumentar a actividade citotóxica das células NK, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. Observou-se igualmente que os péptidos CMS008 e CMS012, na concentração adequada, são capazes de baixar a actividade citotóxica das células NK, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. 3. Encontrou-se que os péptidos CMS001, CMS003, CMS007, CMS 0 0 9, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS020, CMS022 e CMS034 são capazes de aumentar a secreção de interleucina-2 (IL-2) pelos linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. 4. Encontrou-se que os péptidos CMS001, CMS003, CMS009, CMS 010, CMS 011, CMS012, CMS013, CMS016, CMS021, CMS022 e CMS028 são capazes de aumentar a secreção de IFN pelos linfócitos T, tendo diferença estatisticamente 8 ΡΕ1790655 significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. 5. Encontrou-se que os péptidos CMS001, CMS002, CMS003,

CMS07, CMS008, CMS009, CMS 010, CMS 011, CMS 012, CMS 013, cms014, CMS 015, CMS016, CMS 018, CMS 019, CMS 020, CMS 021, CMS 02 2, CMS023, CMS 02 4, CMS 0 2 6, CMS 0 2 7, CMS 028, CMS 02 9, CMS030, CMS032, CMS033 , CMS03 4, CMS 03 5 e CMS036 são capazes de aumentar a síntese de anticorpos anti-RBC quando da exposição ao antigénio, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. Observou-se que os péptidos CMS 0 02, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS 013, CMS 014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS02 8, CMS 029, CMS030, CMS034 e CMS036, numa concentração adequada, são capazes de inibir a síntese de anticorpos anti-RBC quando da exposição ao antigénio, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. 6. Observou-se que os péptidos CMS003, CMS008, CMS009, CMS 010, CMS 011, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS024, CMS027, CMS030, CMS035 e CMS036 são capazes de aumentar a actividade fagocítica de fagócitos mononucleares, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. 9 ΡΕ1790655 7. Encontrou-se que os péptidos CMS001, CMS002, CMS008, CMS009, CMS010, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS036 são capazes de aumentar o peso da glândula do timo, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. 8. Observou-se que os péptidos CMS019, CMS020 e CMS030 são capazes de aumentar o peso do baço, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal. Os péptidos CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS 013, CMS 014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, CMS029 e CMS036, numa concentração adequada, foram também capazes de baixar o peso do baço, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico normal.

Os materiais e métodos usados para analisar o efeito dos péptidos no murganho estão descritos abaixo.

Materiais 1. Animal experimental

Murganhos BALB/c, 18-22 g de peso, 50% fêmeas e 50% machos, fornecidos pelo Experimental Animal Center, National Institute of Medicai Science, RP da China. 10 ΡΕ1790655 2. Administração grupo do IFN-γ de murganho recombinante (rmlFN-γ): 3 x 105 UI/Kg/dia grupo do IL recombinante humana (rIL)-2 recombinante: 3 x 105 UI/Kg/dia grupo do soro fisiológico: 0,5 ml/cada/dia grupo I da dose do péptido: 500 μg/Kg/dia grupo II da dose do péptido: 50 μρ/Κρ^ί3 grupo III da dose do péptido: 5 μρ/Κρ^ί3 grupo IV da dose do péptido: 0,5 μρ/ΚρΜί3

As substâncias atrás referidas foram todas dissolvidas em 0,5 ml de soro fisiológico e injectadas intra-peritonealmente (i.p.) durante 15 dias contínuos, uma vez por dia. 3. Principais reagentes

Os péptidos foram produzidos por encomenda pela American Peptide Company, Inc., USA

Soro fetal bovino e meio de culturas celulares RPMI-1640, Gibco, USA

MTT e ConA, Sigma, USA rmIFN-γ, Beijing Biotech Inc., China 11 ΡΕ1790655 rhIL-2, Shangai Huaxin Biotech Inc., China

Solução de separação de linfócitos, Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medicai Science, RP dChina

Virus da estomatite vesicular (VSV), IFN-γ e amostra padrão de IL-2, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, RP da China Células HT-2 e células L929, oferta do Prof. WF Chen do Departamento de Imunologia da Universidade de Pequim, RP da China. Método 1. Efeito dos péptidos na imunidade celular

Os murganhos BALB/c foram distribuídos ao acaso pelos grupos de péptido, IFN, IL-2 e soro fisiológico. Dez murganhos por grupo. No dia após a administração da última substância a testar, os murganhos foram mortos por deslocamento cervical. 0 baço foi isolado assepticamente e disperso manualmente em solução de D-Hank fria usando uma agulha de injecção. A suspensão de células dispersas foi ainda passada por um crivo de aço inoxidável de 100 gauge, 150 μιη de diâmetro. Após centrifugação a 200 g durante 10 12 ΡΕ1790655 minutos, o sobrenadante foi rejeitado. 0 sedimento de células foi ressuspenso em 10 volumes de tampão Tris-NH4C1 e depois mantido em repouso durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células suspensas foram colhidas por centrifugação a 150 g durante 10 minutos. As células foram lavadas 2-4 vezes com solução de D-Hank fria através da ressuspensão e colheita por centrifugação nas condições descritas atrás. As células lavadas foram então diluídas para as densidades celulares pretendidas com meio de cultura RPMI-1640, contendo 10% de soro fetal bovino. 1.2 O efeito dos péptidos na transformação de linfócitos t[1,2] Células do baço, a uma densidade lxl06/ml, foram colocadas numa placa de cultura de células de 96 alvéolos, 100 μΐ/alvéolo, três alvéolos em paralelo para cada amostra a testar e amostra controlo por murganho. Aos alvéolos do ensaio, adicionou-se 100 μΐ/alvéolo de ConA em RPMI-1640, e 100 μΐ/alvéolo de RPMI-1640 completo foi usado nos controlos. As células foram incubadas durante 66 hrs a 37°C, 5% C02. As células foram então sedimentadas por centrifugação a 150 g durante 10 minutos. O sobrenadante foi colhido e guardado a -20°C para determinação das citocinas IL-2 e interferão. 50 μΐ/alvéolo de MTT a 1 mg/ml em RPMI-1640 foi adicionado ao sedimento de células e as células 13 ΡΕ1790655 ressuspensas por agitação durante 2 minutos. A incubação continuou durante 4 horas. 0 sobrenadante foi rejeitado após centrifugação a 150 g durante 10 minutos. 120 μΐ de HCl2-propanol 40 mM foi adicionado ao sedimento de células e agitado durante 3 minutos para se obter a D057onm de cada alvéolo referenciado a 360 nm. Usou-se um leitor de placas de ELISA. Cálculo:

Cada murganho contribuiu com três alvéolos do ensaio e três alvéolos controlos. O índice de Estimulação (SI) de cada murganho foi obtido calculando primeiro a DO média dos três alvéolos paralelos, depois dividindo o valor dos alvéolos do ensaio pelos alvéolos controlos. 1.3 O efeito dos péptidos na actividade das células NK[3,4]

Prepararam-se células do baço de murganho para 4 x 106/ml como descrito na secção 1.1 atrás. As células alvo YAC-1 cresceram até à fase logarítmica e foram ajustadas a 1 x 105/ml. Usando uma placa de cultura de 96 alvéolos, 100 μΐ de células do baço de murganho e 100 μΐ de meio de cultura foram adicionados ao alvéolo controlo contendo apenas células do baço; 100 μΐ de células alvo e 100 μΐ de meio de cultura foram adicionados ao alvéolo controlo contendo apenas células alvo; 100 μΐ de células do baço de 14 ΡΕ1790655 murganho e 100 μΐ de células alvo foram adicionados ao alvéolo do ensaio de actividade NK. Foram preparadas três séries paralelas por murganho.

As amostras foram centrifugadas a 150 g durante 10 minutos para colher as células. O sobrenadante foi rejeitado e adicionou-se 50 μΐ/alvéolo de MTT a 1 mg/ml. A mistura de reacção foi então agitada durante 2 minutos e incubada a 37°C, 5% CO2 durante 4 horas. O sobrenadante foi rejeitado após centrifugação a 150 g durante 10 minutos. Adicionou-se 120 μΐ de HCl-2-propanol 40 mM e agitou-se durante 3 minutos. Usou-se um leitor de ELISA para obter a DO570 nm de cada alvéolo referenciada a 630 nm. Cálculo:

Para cada um dos murganhos foram usados 9 alvéolos: como controlo usou-se 3 alvéolos apenas com células do baço e 3 alvéolos apenas com células alvo e 3 alvéolos foram usados para os testes com células do baço e com células alvo. O indice de actividade de células NK de cada murganho foi calculado obtendo primeiro a DO média de três alvéolos paralelos para cada combinação, depois aplicando esta DO média à seguinte fórmula: índice de actividade de células NK = [1 - (DO média dos alvéolos com células do baço e alvo - DO média dos alvéolos com apenas células do baço) (DO média de alvéolos apenas com células alvo)] x 100%. 15 ΡΕ1790655 1.4 O efeito dos péptidos na actividade de linfócitos T na secreção de IL-2[5] Células HT-2 na fase logarítmica foram colhidas por centrifugação a 150 g durante 10 minutos e lavadas três vezes com solução de Hank fria por ressuspensão e centrifugação. As células HT-2 colhidas foram suspensas em RPMI-1640 e incubadas a 37°C, 5% C02 durante 30 minutos. As células foram ainda lavadas duas vezes com RPMI-1640 através de ressuspensão e centrifugação e suspensas para uma concentração final de 2xl05/ml com RPMI-1640. O sobrenadante obtido na secção 1.2 foi diluído para a seguinte percentagem com RPMI-1640: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% e 3,125%. rIL-2 foi diluída com RPMI-1640 para as seguintes concentrações: 500 Ul/ml, 250 Ul/ml, 125 Ul/ml, 62,5 Ul/ml, 31,25 Ul/ml e 15,5 Ul/ml.

Uma placa de cultura de células de 96 alvéolos foi montada com três alvéolos paralelos por combinação:

Controlo negativo; 100 μΐ de RPMI-1640 + 100 μΐ de suspensão de HT-2 16 ΡΕ1790655

Padrao de rIL-2: 100 μΐ de solução de rIL-2 + 100 μΐ da suspensão de células HT-2

Alvéolos da amostra a testar: 100 μΐ de sobrenadante diluído + 100 μΐ de suspensão de células HT-2 A placa foi incubada a 37°C, 5% de C02 durante 68 horas, depois centrifugada a 150g durante 15 minutos e o sobrenadante removido. Adicionou-se a cada alvéolo 100 μΐ de MTT a 0,5 mg/ml em RPMI-1640 sem fenolsulfoftaleina. Após agitação durante 3-4 minutos, para ressuspender as células, continuou-se a incubação durante mais 4 horas. As amostras foram então centrifugadas a 150 g durante 15 minutos e o sobrenadante foi removido. A cada alvéolo, foi adicionado 120 μΐ de HCl-2-propanol 40 mM, misturou-se durante 3-4 minutos e a DO analisada a 570 nm, referenciada a 630 nm com um leitor de placas de ELISA. Cálculo: A DO média de três alvéolos paralelos de cada diluição foi registada e representada em função da concentração num papel semi-logarítmico, a concentração no eixo do X. A concentração a 50% da saturação da DO foi obtida para o sobrenadante a testar e para rIL-2. 17 ΡΕ1790655

Actividade de IL-2 na amostra = (diluição da amostra a 50% da acti-vidade máxima -s- diluição padrão de rIL-2 a 50% da actividade máxima) x actividade do padrão de rIL-2 a 50% de actividade máxima (Ul/ml). 1.5. 0 efeito dos péptidos na actividade de linfócitos T na secreção de interferão (IFN)[6] 0 sobrenadante da secção 1.2 foi diluído com meio de cultura RPMI-1640 para as seguintes percentagens: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% e 3,125%. 0 padrão de interferão recombinante (rIFN) foi diluído com RPMI-1640 para as seguintes concentrações: 500 Ul/ml, 250 UI/ml, 125 Ul/ml, 62,5 Ul/ml, 31,25 Ul/ml e 15,5 Ul/ml.

As células alvo L929 na fase logarítmica foram ajustadas a 2 xl05/ml com RPMI-1640, com o mesmo tratamento descrito para as células HT-2 descritas na secção 1.4. O stock de VSV foi igualmente ajustado a 100 TCD50 com RPMI-1640 .

Numa placa de cultura de 96 alvéolos estabeleceu-se três alvéolos paralelos por combinação:

Alvéolo do controlo negativo: 150 μΐ de RPMI-1640 + 100 μΐ de L929 18 ΡΕ1790655

Alvéolo do controlo positivo: 100 μΐ de RPMI-1640 + 100 μΐ de L929 + 50 μΐ de VSV

Alvéolo da actividade de rIFN: 100 μΐ do padrão de rIFN + 100 μΐ de L929 + 50 μΐ de VSV

Alvéolo da amostra a testar: 100 μΐ de

sobrenadante diluído + 100 μΐ de L929 + 50 μΐ de VSV

As amostras foram incubadas a 37°C, 5% de C02 durante 24 horas. Os alvéolos dos controlos positivos foram observados periodicamente ao microscópio invertido para confirmar a lise celular, depois colhidos e lida a DO de todos alvéolos como descrito na secção 1.4. Cálculo:

Obtiveram-se as concentrações correspondentes a 50% do máximo de actividade como na secção 1.4. Calculou-se a actividade de IFN das amostras como segue:

Actividade de IFN da amostra = (diluição da amostra correspondente a 50% de actividade máxima -s- diluição do padrão de rIFN correspondente a 50% da actividade máxima) x actividade de rIFN padrão correspondente a 50% de actividade máxima (Ul/ml) 19 ΡΕ1790655 2. O efeito dos péptidos na formaçao de anticorpos [7]

Prepararam-se eritrócitos de carneiro (SRBC) colhendo sangue da veia cervical e colocaram-se num frasco estéril com esferas de vidro. 0 frasco foi agitado durante 3 minutos e o sangue foi então misturado com solução de Alsever (2,05 g de glucose, NaCl 0,4 g, citrato de sódio, ajustar a 100 ml com água destilada) e guardado a 4°C. Imediatamente antes de usar, as amostras foram centrifugadas a 130g, 5 minutos, para colher os SRBCs. As células foram lavadas duas vezes através da ressuspensão e centrifugação em soro fisiológico normal. Em seguida o sedimento de células foi colhido por centrifugação a 180 g durante 10 minutos e ressuspenso em soro fisiológico para se obter a suspensão de SRBC de trabalho final, 2% (v/v).

Preparou-se o complemento através da adição de 10 volumes de soro Cavy fresco a um volume de SRBCs sedimentados por centrifugação e depois suavemente agitados durante 30 minutos a 4°C. O SRBC foi removido por centrifugação a 200 g durante 10 minutos. Adicionou-se então 10 volumes de soro fisiológico normal para se obter a solução de trabalho do complemento.

Os murganhos BALB/c foram distribuídos ao acaso pelo grupo de péptido, grupo de IFN, grupo de IL-2 e grupo do soro fisiológico, 10 murganhos por grupo. Os compostos a testar foram administrados como descrito na secção 1.1, seguido de injecção intraperitoneal de 0,2 ml de SRBC por 20 ΡΕ1790655 murganho no dia 12. No dia a seguir à última administração da substância a testar (dia 16), o sangue foi colhido do canto do olho e deixado à temperatura ambiente, durante uma hora, para a exsudação do soro. Após centrifugação a 200 g durante 10 minutos, o soro foi diluído 500 vezes com soro fisiológico normal. A 1 ml de soro de murganho diluído de cada murganho, adicionou-se 0,5 ml da suspensão de SRBC. Depois adicionou-se 1 ml da solução de trabalho do complemento e incubou-se a 37°C, num banho-maria, durante 10 minutos. As reacções foram paradas por arrefecimento em gelo. As amostras foram então centrifugadas a 200g durante 10 minutos para se obter o sobrenadante. A 1 ml deste sobrenadante, adicionou-se 3 ml de solução de Drabkin e deixou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos. Leu-se a DO540nm. Cálculo: A DO540nm de referência foi obtida misturando 0,25 ml da suspensão de SRBC com solução de Drabkin para 4 ml e colocada à temperatura ambiente durante 10 minutos antes da leitura da D054onm· índice da amostra de soro = (DO540mi. da amostra a testar DO540nm de referência) x 500 21 ΡΕ1790655 3. O efeito dos péptidos na função de fagocitose de fagócitos mononucleares e no peso dos órgãos do sistema imunitário[8'91

No dia a seguir à última administração a testar (dia 16), os murganhos foram injectados com 0,1 ml/Kg de peso do corpo de tinta da China (diluição de 5 vezes com soro fisiológico normal) na veia da cauda.

Um minuto e cinco minutos após a injecção da tinta da China, colheu-se 20 μΐ de sangue a partir do canto do olho com um tubo heparinizado. O sangue foi misturado com 2 ml de Na2CC>3 a 0,1% p/v e depois lida a DOesonm· O índice K foi calculado pela seguinte fórmula: K = (IgAi-IgA2)H-(t2-tl)

Chave: AI: DO680nm no primeiro minuto A2 : DO680nm no quinto minuto 12 : 5 minutos 12 : 1 minuto

Um dia após a última administração da substância a testar (dia 16), o fígado, o baço e a glândula do timo foram separados secos com papel de filtro e pesados. O índice de fagocitose α foi calculado como se mostra abaixo: α = (Vk) (Wh-wls) 22 ΡΕ1790655 chave : W: peso do corpo WLS: peso do fígado mais baço índice da glândula do timo (%) = (peso do timo/peso do corpo) x 100% índice do baço (%) = (peso do baço/peso do corpo) x 100%

Resultados

Devido à grande quantidade de dados envolvidos, apenas são apresentados os resultados finais compilados. Os grupos sem diferença estatisticamente significativa relativamente ao controlo negativo de soro fisiológico são igualmente omitidos.

1. O efeito de péptidos na transformação de linfócitos T A 500 μg/Kg/dia, encontrou-se que CMS002, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS012, CMS015, CMS019, CMS021 e CMS029 são capazes de aumentar a transformação de linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico (p<0,05). Entre estes péptidos, encontrou-se que CMS010 e CMS015 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e ao grupo de IL-2 (p<0,05) como se mostra na Tabela 1 abaixo. ΡΕ1790655 23

Tabela 1

Grupo N X ± DP (indice de estimulação) CMS002 8 1,8+0,3* CMS007 9 1,6+0,1* CMS 0 0 8 9 1,7+0, 1* CMS009 10 1,7+0,2* CMS010 9 2,0+0,3*@Λ CMS012 9 1,6+0,2* CMS015 9 1,9±0,3*@Λ CMS019 9 1,8+0,3* CMS021 10 1,6+0,1* CMS029 9 1, 7+0,3* IFN-γ 10 1,6+0,2* IL-2 10 1, 7+0,2* Soro fisiológico 10 1,38+0,1* comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 A comparaçao com o grupo IL-2 P<0,05 A 50 μg/Kg/ciia, encontrou-se que CMS001, CMS002 e CMS003 são capazes de estimular a transformação de linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico, ao grupo de IFN-γ e ao grupo de IL-2 (P<0,05) . Observou-se que CMS014 e CMS036 são capazes de inibir a transformação de linfócitos, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05). Os resultados estão detalhados na Tabela 2 abaixo. ΡΕ1790655 - 24 -

Tabela 2

Grupo N X ± DP (índice de estimulação) CMS 0 01 10 2,2+0,5*@Λ CMS 0 0 2 10 2,6+0,3*@Λ CMS003 8 2,2+0,5*@Λ CMS 014 9 1,0+0,1* CMS 036 9 1,0+0,1* IFN-γ 9 1,7+0,2* IL-2 10 1,8+0,2* Soro fisiológico 10 1,3+0,1 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com 0 grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo TL- -2 P<0,05 A 5 μg/Kg/dia , observou-se que CMS001, CMS003, CMS0 0 7 e CMS034 sao capazes de estimular a transformaçao de linfócitos T , tendo diferença estatisticamente significa- tiva relativamente ao grupo do soro fisiológico, (P<0,05), como se mostra na Tabela 3 . Tabela 3 Grupo N X ± DP (índice de estimulação) CMS 0 01 10 1,7+0,2* CMS003 10 1,6+0,2* CMS 0 0 7 8 1,7+0, 1* CMS 034 9 1,5+0,2* IFN-γ 10 1,6+0,2* IL-2 9 1,6+0,1* Soro fisiológico 10 1,3+0,1* comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 25 ΡΕ1790655 A 0,5 μg/Kg/dia, observou-se que CMS008, CMS0010, e CMS011 são capazes de estimular a transformação de linfó-citos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico, (P<0,05), como se mostra na Tabela 4.

Tabela 4

Grupo N X ± DP (índice de estimulação) CMS008 10 1,7+0,3* CMS 010 9 1,7+0,3* CMS 011 10 1,6+0, 4* IFN-y 10 1,6+0,2* IL-2 10 1,6+0,1* Soro fisiológico 10 1,3+0,1* comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05

2. O efeito do péptido na actividade citotóxica de células NK A 500 μg/Kg/dia, encontrou-se que CMS010, CMS013, CMS 016, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS036 são capazes de aumentar a actividade citotóxica de células NK, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico (p<0,05). Entre estes péptidos, encontrou-se que CMS010, CMS016 e CMS030 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de 26 ΡΕ1790655 IFN-γ e ao grupo de IL-2 (p<0,05) como se mostra na Tabela 5.

Tabela 5

Grupo N X ± DP (%) CMS 010 9 91±4*@Λ CMS013 8 84+9* CMS016 9 91±7*@Λ CMS 0 23 10 79+12* CMS 0 2 4 10 89+8* CMS 0 2 6 10 89+7* CMS 0 2 7 10 88+8* CMS028 10 90+5* CMS 0 2 9 10 87+4* CMS 03 0 10 91±5*@/\ CMS 032 10 87+5* CMS 033 9 89+8* CMS 034 11 85+9* CMS 035 8 90+10* CMS 036 10 88+7* IFN-γ 10 77+8* IL-2 10 77+8* Soro fisiológico 8 63+9* comparação com 0 grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 50 μg/Kg/dia, encontrou-se gue CMS001, CMS003 27 ΡΕ1790655 CMS015, CMS021 e CMS035 são capazes de aumentar a activi-dade citotóxica de células NK, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS021 possui diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico, ao grupo de IFN-γ e ao grupo de IL-2 (P<0,05). Observou-se que CMS021 é capaz de inibir a actividade citotóxica das células NK, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05). Os resultados estão detalhados na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6

Grupo N X ± DP (%) CMS 0 01 10 85+10* CMS003 10 85+6* CMS 012 9 40+9* CMS015 8 78+8* CMS021 8 88±12*@Λ CMS 02 6 10 76+9* CMS 035 10 72+9* IFN-γ 10 73+10* IL-2 10 74+8* Soro fisiológico 10 56+8 comparação com 0 grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com 0 grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com 0 grupo IL-2 P<0,05 28 ΡΕ1790655 A 5 μg/Kg/dia, encontrou-se que CMS008, CMS009, CMS 010, CMS 011, CMS012, CMS020, CMS024, CMS034 e CMS036, são capazes de aumentar a actividade citotóxica de células NK, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS008 e CMS009 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e ao grupo de IL-2 (P<0,05). Os resultados estão apresentados na Tabela 7.

Tabela 7

Grupo N X ± DP (%) CMS008 10 92±4*@Λ CMS 0 0 9 8 92±6*@Λ CMS 010 10 82+9* CMS 011 10 76+10* CMS 012 10 85+7* CMS020 9 91+6* CMS024 9 78+3* CMS034 8 90+5* CMS036 10 75+9* IFN-γ 10 80+8* IL-2 10 80+8* Soro fisiológico 10 60+9* comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 29 ΡΕ1790655 A 0,5 μg/Kg/dia, encontrou-se que CMS002, CMS011, CMS012, CMS022, CMS028 e CMS035, são capazes de aumentar a actividade citotóxica de células NK, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico (P<0,05). Observou-se que CMS008 é capaz de inibir a actividade citotóxica de células NK, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05) . Os resultados estão detalhados na Tabela 8 abaixo.

Tabela 8

Grupo N X ± DP (%) CMS002 8 76+9* CMS008 10 46+12* CMS011 9 79+3* CMS 012 9 77+6* CMS022 10 73±11* CMS028 8 79+3* CMS 035 10 76+10* IFN-γ 10 72+9* IL-2 10 74+10* Soro fisiológico 11 58±7 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 3. O efeito de péptidos na actividade de linfó-citos T na secreção de IL-2 A 500 μg/Kg/dia, encontrou-se que CMS007, CMS009, 30 ΡΕ1790655 CMS010 e CMS015 são capazes de promover a secreção de IL-2 por linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico (p<0,05). Entre estes péptidos, encontrou-se que CMS007, e CMS015 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (p<0,05). E encontrou-se que CMS009 e CMS010 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e ao grupo de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 9.

Tabela 9

Grupo N X ± DP (UI) CMS 0 0 7 9 86±15*Λ CMS 0 0 9 10 114±13*@Λ CMS 010 9 125+17*@Λ CMS 015 9 85+17*Λ IFN-γ 10 100+18* IL-2 10 70+13* Soro fisiológico 10 39+10 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL- -2 P<0,05 A 50 μq/Kq/dia, encontrou-se que CMS001 e CMS003 são capazes de promover a actividade de secreção de IL-2 por linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico (p<0,05). Entre estes péptidos, encontrou-se que CMS007 possui diferença 31 ΡΕ1790655 estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (p<0,05) como se mostra na Tabela 10.

Tabela 10

Grupo N X ± DP (UI) CMS 0 01 10 60+10* CMS003 8 8 6+9 *A IFN-γ 9 99+16* IL-2 10 72+12* Soro fisiológico 10 39+10 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 5 μg/Kg/dia, encontrou-se que CMS007, CMS012 e CMS020 são capazes de promover a secreção de IL-2 por linfócitos T, tendo diferença < estatisticamente significa- tiva relativamente ao grupo do soro fisiológico (p<0,05) como se mostra na Tabela 11. Tabela 11 Grupo N X ± DP (UI) CMS007 8 64+12* CMS 0012 9 65+16* CMS020 8 63+11* IFN-γ 10 96+14* IL-2 10 77+13* Soro fisiológico 10 3 7+9 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 32 ΡΕ1790655 A 0,5 μg/Kg/dia, encontrou-se que CMS010, CMS011, CMS012, CMS022 e CMS034 são capazes de promover a secreção de IL-2 por linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, encontrou-se que CMS034 possui diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 10. E, encontrou-se que CMS011 e CMS022 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e ao grupo de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 12 .

Tabela 12

Grupo N X ± DP (UI) CMS010 9 66+11 CMS011 10 101±19*@Λ CMS012 8 59+13* CMS022 9 10 9±14*@Λ CMS034 10 85±10*Λ IFN-γ 10 87+15* IL-2 10 73+13* Soro fisiológico 10 38+13* comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com 0 grupo IL-2 P<0,05 33 ΡΕ1790655

4. O efeito de péptidos na actividade de secreção de IFN por linfócitos T A 500 μg/Kg/dia, encontrou-se que CMS010, CMS013 e CMS016 são capazes de promover a secreção de interferão (IFN) por linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico, de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 13.

Tabela 13

Grupo N X ± DP (UI) CMS010 9 16 7±13*@Λ CMS013 9 154±15*@Λ CMS 016 6 162±19*@Λ IFN-γ 10 139+16* IL-2 10 120+13* Soro fisiológico 10 65+11 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 50 μq/Kq/d±a, encontrou-se que CMS001, CMS003 e CMS021 são capazes de promover a secreção de IFN por linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico. Entre estes péptidos, encontrou-se que CMS021 possui diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 14. ΡΕ1790655 34

Tabela 14

Grupo N X ± DP (UI) CMS001 10 110+15* CMS003 8 106+16* CMS 0 21 8 143+17*@Λ IFN-γ 9 125+18* IL-2 10 113±17*Λ Soro fisiológico 10 61+11 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 5 μg/Kg/clia, encontrou-se que CMS009 e CMS012 são capazes de promover a secreção de IFN por linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico. Entre estes péptidos, encontrou-se que CMS009 possui diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (p<0,05) como se mostra na Tabela 15.

Tabela 15

Grupo N X + DP (UI) CMS009 10 121+15*Λ CMS012 9 86±16* IL-2 9 105+14* Soro fisiológico 10 66+10 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 A comparação com o grupo de IL-2 P<0,05 35 ΡΕ1790655 A 0,5 μg/Kg/clia, encontrou-se que CMS010, CMS011, CMS022 e CMS028 são capazes de promover a secreção de IFN por linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo do soro fisiológico. Entre estes péptidos, encontrou-se que CMS010 e CMS022 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (p<0,05) como se mostra na Tabela 16.

Tabela 16

Grupo N X ± DP (UI) CMS 010 9 142±18*@Λ CMS011 10 89+18* CMS022 9 145±13*@Λ CMS028 10 96+13* IFN-γ 10 124±16*Λ IL-2 10 107+13* Soro fisiológico 10 64+13 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 5. O efeito dos péptidos na formação de anticorpos A 500 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS 0 02, CMS 003, CMS 0 7, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, 36 ΡΕ1790655 CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS033 e CMS035 são capazes de promover a síntese de anticorpos anti-RBC quando da exposição ao antigénio, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que os péptidos CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS013, CMS019, CMS024 e CMS035 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ (P<0,05). E, encontrou-se também que CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS014, CMS015, CMS016, CMS020, CMS023, CMS029 e CMS033 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 17.

Tabela 17

Grupo N X ± DP (UI) CMS002 10 87±18*@ CMS 0 03 10 96±18*@ CMS 0 0 7 10 6 9+17*@ CMS 0 0 8 10 8 2+15*@ CMS009 10 113±22*@Λ CMS010 10 112±30*@Λ CMS011 8 188±16*@Λ CMS012 8 141±21*@Λ CMS 013 10 80±16*@ CMS 014 10 13 0+2 4*@Λ CMS 015 10 136±22*@Λ 37 ΡΕ1790655 (continuação)

Grupo N X ± DP (UI) CMS016 8 143+3 8*@Λ CMS018 10 66+16* CMS019 10 91±26*@ CMS020 6 155±35*@Λ CMS 0 2 2 8 6 8±31* CMS 0 23 9 110+45* CMS 02 4 8 75±29*Λ CMS029 8 115±22*@Λ CMS033 10 143+2 7*@Λ CMS035 10 88±16*@ IFN-γ 9 3 7+10 IL-2 10 71+11* Soro fisiológico 10 32+7 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 50 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS003, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS 021, CMS 02 2, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS 036 sao capazes de promover a síntese de anticorpos anti-RBC quando da exposição ao antigénio, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que os péptidos CMS011, CMS013 e CMS015 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ (p<0,05). E, encontrou-se 38 ΡΕ1790655

Tabela CMS0 23, CMS 0 2 6, CMS027, CMS034, CMS035 e CMS036 significativa (P<0,05). de também que CMS021, CMS022, CMS 03 0, CMS 03 2 , CMS033, diferença estatisticamente grupo de IFN-γ e de IL-2 capaz de inibir a formação diferença estatisticamente grupo de soro fisiológico estão apresentados na CMS 0 2 9, possuem relativamente ao Observou-se que CMS009 é anticorpos anti-SRBC, tendo significativa relativamente ao (P<0,05). Os dados detalhados 18 .

Tabela 18

Grupo N X ± DP (Unidade) CMS003 10 52+11* CMS009 8 13+5* CMS 011 9 6 7±9*@ CMS 012 8 50+14* CMS013 8 70±9*@ CMS 015 10 54±9*@ CMS 021 9 9 4+2 0*@Λ CMS 02 2 9 110±16*@Λ CMS 0 23 8 84±11*@ CMS 0 2 6 9 98±9*@λ CMS 0 2 7 9 93+11*@Λ CMS 0 2 9 10 143±13*@λ CMS 03 0 10 141±33*@Λ CMS 032 9 131+2 4*@Λ CMS 033 8 112+15*@Λ CMS 034 10 136±31*@Λ CMS 035 8 9 7+10*@Λ 39 ΡΕ1790655 (continuação)

Grupo N X ± DP (Unidade) CMS036 10 118±11*@Λ IFN-γ 9 37±10 IL-2 10 71+11* Soro fisiológico 10 32+7 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 comparação com o grupo IL- -2 P<0, 05 A 5 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS 0 01, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS011, CMS012, CMS 013, CMS 015, CMS016, CMS019, CMS020, CMS021, CMS023, CMS 02 4, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS 036 sao capazes de promover a síntese de anticorpos anti-RBC quando da exposição ao antigénio, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que os péptidos CMS003, CMS008, CMS009, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS020 e CMS021 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ (p<0,05). E, encontrou-se também que CMS001, CMS0 0 7, CMS011, CMS019, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS036 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 19. ΡΕ1790655 40

Tabela 19

Grupo N X ± DP (Unidade) CMS 0 01 9 110+2 4*@ CMS003 9 91+2 4*@ CMS 0 0 7 9 122±12*@Λ CMS 0 0 8 9 97±26*@ CMS009 8 79+18*@ CMS 011 10 115+2 7*@Λ CMS 012 10 81±22*@ CMS013 10 93+2 8*@ CMS 015 8 9 4+3 7*@Λ CMS 016 9 93±32*@ CMS019 10 118+2 0*@Λ CMS 0 2 0 10 8 9+2 4*@ CMS 0 21 9 82±30*@ CMS 0 23 10 16 6+2 7*@Λ CMS 02 4 7 171±39*@λ CMS 0 2 6 9 191+1 7*@Λ CMS 0 2 7 9 11 7±45*@Λ CMS028 10 121±48*@Λ CMS 0 2 9 9 14 7±23*@Λ CMS 03 0 9 15 8+3 7*@Λ CMS 032 9 15 7+3 7*@λ CMS 033 7 128±39*@Λ CMS 034 8 1 72+3 7*@λ CMS 035 9 176±39*@Λ CMS 036 8 179±34*@Λ IFN-γ 9 37+10 IL-2 10 71+11* Soro fisiológico 10 32+7 comparação com o grupo do soro fisiológico Ρ<0,05 @ comparaçao com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 41 ΡΕ1790655 A 0,5 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS021, CMS023, CMS024, CMS027 e CMS033 são capazes de promover a síntese de anticorpos anti-RBC quando da exposição ao antigénio, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que os péptidos CMS021 e CMS033 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ (p<0,05). E, encontrou-se também que CMS023, CMS024 e CMS027 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05. Igualmente observou-se que CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS19, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034 e CMS036 são capazes de inibir a formação de anticorpos anti-SRBC, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05). Os dados detalhados estão apresentados na Tabela 20 abaixo.

Tabela 20

Grupo N X ± DP (Unidade) CMS002 9 4+1* CMS003 9 2+1* CMS009 9 2+1* CMS 010 10 10+3* CMS011 10 5+3* CMS013 10 7+1* 42 ΡΕ1790655 (continuação)

Grupo N X ± DP (Unidade) CMS 014 10 15+6* CMS 015 9 13+4* CMS018 9 3+1* CMS 019 9 12+3* CMS 0 2 0 9 10+3* CMS 0 21 9 57+9* CMS 0 23 10 10 8+21*@Λ CMS 02 4 10 9 8±6*@Λ CMS026 10 19+6* CMS 0 2 7 10 9 9+14*@Λ CMS 0 2 8 10 18+5* CMS 0 2 9 9 18+7* CMS030 9 19+7* CMS033 9 78±12*@ CMS 034 10 20+2* CMS 036 9 20+6* IFN-γ 9 37+10 IL-2 10 71+11* Soro fisiológico 10 32+7 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com 0 grupo IL-2 P<0,05 6. O efeito dos péptidos na actividade fagocitica de fagócitos mononucleares 43 ΡΕ1790655 A 500 encontrou-se que os péptidos CMS 0 03, CMS00 8, CMS020, CMS022 e CMS024 são capazes de aumentar actividade fagocítica dos fagócitos mononucleares, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS022 possui diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e ao grupo de IL-2 (P<0,05 ) como se mostra na Tabela 21. Tabela 21 Grupo N X ± DP (índice fagocítico) CMS 0 03 10 6,6+0,7* CMS008 10 6,5+1,2* CMS020 10 6, 4+0,6* CMS022 10 7, 4+0,6*@Λ CMS 02 4 10 6, 4+1,0* IFN-γ 10 6,4+0,9* IL-2 9 5,7+0,8 Soro fisiológico 10 5,1+0,6 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 50 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS019, CMS024 e CMS030 são capazes de aumentar actividade fagocítica dos fagócitos mononucleares, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo 44 ΡΕ1790655 de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS019 possui diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 22.

Tabela 22

Grupo N X ± DP (índice fagocítico) CMS019 9 6, 7+0,9*Λ CMS024 8 6,6+0,7* CMS030 10 6,3+0,5* IFN-γ 10 6,4+0,9* IL-2 9 5,7+0,8 Soro fisiológico 10 5,1+0,6 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 5 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS11, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019 e CMS035 são capazes de aumentar actividade fagocitica dos fagócitos mononucleares, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS003, CMS009, CMS010, CMS016, CMS019 e CMS035 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e ao grupo de IL-2 (p<0,05) como se mostra na Tabela 23. ΡΕ1790655 45

Tabela 23

Grupo N X + DP (índice faqocítico) CMS003 9 6,9±0, 9*Λ CMS 0 0 8 9 6,4±0,5* CMS 0 0 9 9 6,9+0, 9*Λ CMS010 10 7, 1+0,7*Λ CMS 011 10 6, 4+1,1* CMS013 10 6,7+0,2* CMS 016 9 6,9+0,8*Λ CMS 018 8 6,7+1,2* CMS 019 8 6,8+0,6*Λ CMS 035 9 6,9+0,9*Λ IFN-y 10 6,4+0, 9* IL-2 9 5, 7+0,8 Soro fisiológico 10 5, 1+0,6 comparação com o grupo do soro fisiológico Ρ<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 Ρ<0,05 A 0,5 Hg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS024, CMS027 e CMS036 são capazes de aumentar actividade fagocítica dos fagócitos mononucleares, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS024 possui diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (p<0,05) como se mostra na Tabela 24. ΡΕ1790655 46

Tabela 24

Grupo N X ± DP (índice fagocítico) CMS 02 4 10 6, 7±0,5*Λ CMS 0 2 7 10 6,4+0,6* CMS 036 9 6,2+0,3* IFN-γ 10 6,4+0,9* IL-2 9 5, 7+0,8 Soro fisiológico 10 5, 1+0,6 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 7. O efeito dos péptidos no peso dos órgãos imunes A 500 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS008, CMS 010, CMS016, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026, CMS 02 7, CMS 028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS036 são capazes de aumentar o peso da glândula do timo, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que os péptidos CMS027 e CMS034 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (P<0,05). E, encontrou-se também que CMS008, CMS022, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033 e CMS035 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 25. ΡΕ1790655 - 47 -

Tabela 25

Grupo N X ± DP (%) CMS 0 0 8 8 0,21+0,03*@Λ CMS 010 10 0,19+0,04* CMS 016 9 0,18+0,05* CMS 019 10 0,19+0,02* CMS020 10 0,19+0,04* CMS 0 2 2 9 0,26+0, 05*@Λ CMS 0 2 6 10 0,20+0,03*Λ CMS 0 2 7 8 0,20+0,03*Λ CMS028 10 0,19+0,02* CMS 0 2 9 10 0,22+0, 04*@Λ CMS030 8 0,30+0, 03*@Λ CMS 032 8 0,25+0, 03*@Λ CMS 033 9 0,25+0, 04*@Λ CMS 034 9 0,20+0, 05*Λ CMS 035 10 0,21+0,03*@Λ CMS 036 9 0,18+0,02* IFN-γ 10 0,15+0,04 IL-2 9 0,14+0,03 Soro fisiológico 9 0,12+0,02 comparação com o grupo do soro fisiológico Ρ<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ Ρ<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 Ρ<0,05 A 500 μg/Kg/dia encontrou-se que o péptido CMS009 é capaz de aumentar o peso do baço, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05) como se mostra na Tabela 26. 48 ΡΕ1790655

Observou-se que os péptidos CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMS 011, CMS 013, CMS014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027 e CMS036 são capazes de diminuir o peso do baço, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05). Os dados estão detalhados na Tabela 26 abaixo.

Tabela 26

Grupo N X ± DP (%) CMS001 10 0,43+0, 07* CMS003 8 0, 40+0, 04* CMS 0 0 7 9 0,32+0,05* CMS 0 0 9 9 0,41+0,03* CMS 011 9 0,41+0,04* CMS013 10 0,44+0,07* CMS 014 10 0,40+0,03* CMS 015 9 0,36+0,07*Λ CMS019 9 0,63+0,082* CMS 0 21 9 0,36+0, 04* CMS 0 23 9 0,36+0,06* CMS 0 2 4 9 0,34+0,05* CMS 02 7 10 0,37+0,03* CMS 036 10 0,40+0,03* Soro fisiológico 10 0,53+0,05* comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 péptidos CMS 019, CMS 0 2 8, A 50 μq/Kq/dia encontrou-se que os CMS 0 0 2, CMS 008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CMS 0 2 0, CMS 022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS 0 2 9, CMS030 CMS032, CMS033, CMS034 e CMS036 são capazes 49 ΡΕ1790655 de aumentar o peso da glândula do timo, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS034 possui diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (P<0,05). E, encontrou-se também que CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS030, CMS032 e CMS036 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 27.

Tabela 27

Grupo N X ± DP (%) CMS 0 02 10 0,21+0,03*@Λ CMS008 10 0,20+0,04*@Λ CMS012 10 0,26+0,02*@Λ CMS014 10 0,21+0,02*@Λ CMS016 10 0,20+0,03*@Λ CMS018 10 0,23+0,02*@Λ CMS019 10 0,20+0,03*@Λ CMS020 10 0,30+0,03*@Λ CMS022 10 0,20+0,02*@Λ CMS023 10 0,27+0,02*@Λ CMS024 10 0,27+0,02*@Λ CMS026 10 0,27+0,02*@Λ CMS027 8 0,21+0,03*@Λ CMS028 10 0,18+0, 04* CMS029 9 0,18+0,05* CMS030 10 0,25+0, 04*@Λ CMS032 10 0,27+0, 03*@Λ 50 ΡΕ1790655 (continuação)

Grupo N X ± DP (%) CMS033 9 0,18+0,03* CMS 034 8 0,19+0,0 4*Λ CMS 036 9 0,22+0, 02*@Λ IFN-γ 10 0,15+0,04 IL-2 9 0,14+0,04 Soro fisiológico 9 0,12+0,02 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 50 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS 0 0 8, CMS 010 e CMS 0 2 9 sao capazes de diminuir o peso do baço, tendo diferença estatisticamente significa relativa- mente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Os dados estão detalhados abaixo na Tabela 28. Tabela 28 Grupo N X ± DP (%) CMS008 10 0,39+0,08* CMS 010 10 0,38+0,05* CMS 0 2 9 10 0,42+0,04* IFN-γ 10 0,50+0,04 IL-2 9 0,62+0,07 Soro fisiológico 9 0,53+0,05 comparaçao com o grupo do soro fisiológico P<0,05 51 ΡΕ1790655 A 5 μρ/Κρ/άί3 encontrou-se que os péptidos CMS001, CMS002, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS036 são capazes de aumentar o peso da glândula do timo, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS002, CMS014, CMS024 e CMS030 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (P<0,05). E, encontrou-se também que CMS010, CMS012, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS032, CMS034 e CMS036 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 29.

Tabela 29

Grupo N X ± DP (%) CMS 0 01 10 0,22+0,05* CMS002 9 0,24+0, 05*Λ CMS010 9 0,2 7+0, 05*@Λ CMS011 10 0,22+0,04* CMS012 10 0,27+0, 0β*@Λ CMS013 10 0,21+0,05* CMS 014 10 0,23+0,06*Λ CMS 015 9 0,20+0,08* CMS016 10 0,22+0, 06* 52 ΡΕ1790655 (continuação)

Grupo N X ± DP (%) CMS 018 10 0,24+0, 0 4*@Λ CMS019 10 0,24+0, 02*@Λ CMS 02 0 10 0,24+0, 07*@Λ CMS 0 21 9 0,20+0,06* CMS 0 2 2 9 0,25+0, 04*@Λ CMS 0 23 10 0,23+0,06* CMS 0 2 4 9 0,23+0,06*Λ CMS026 10 0,31+0, 05*@Λ CMS028 10 0,28+0, 06*@Λ CMS 0 2 9 10 0,21+0,03* CMS030 10 0,23+0,07*Λ CMS 032 10 0,29+0, 04*@Λ CMS 033 10 0,20+0,02* CMS 034 9 0,27+0, 0 6*@Λ CMS 035 10 0,21+0,04* CMS 036 10 0,25+0, 04*@Λ IFN-γ 10 0,15+0,04 IL-2 9 0,14+0,04 Soro fisiológico 9 0,12+0,02 comparação com o grupo do soro fisiológico Ρ<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ Ρ<0,05 Λ comparação com 0 grupo IL-2 Ρ<0,05 A 5 μg/Kg/dia encontrou-se que o péptido CMS030 é capaz de aumentar o peso do baço, tendo diferença esta- 53 ΡΕ1790655 tisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Encontrou-se que o péptido CMS015 é capaz de reduzir o peso do baço, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Os dados estão detalhados abaixo na Tabela 30.

Tabela 30

Grupo N X ± DP (%) CMS 015 9 0,38+0,15* CMS030 10 0,64+0,09* Soro fisiológico 10 0,53+0,05 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 A 0,5 μg/Kg/dia encontrou-se que os péptidos CMS002, CMS008, CMS010, CMS012, CMS014, CMS018, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS030 e CMS032 são capazes de aumentar o peso da glândula do timo, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Entre estes péptidos, observou-se que CMS008 e CMS012 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IL-2 (p<0,05). E, encontrou-se também que CMS002, CMS020 e CMS030 possuem diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05) como se mostra na Tabela 31. ΡΕ1790655 54

Tabela 31

Grupo N X ± DP (%) CMS002 8 0,26+0,06*@Λ CMS 0 0 8 10 0,22+0, 0 7*Λ CMS 010 9 0,21+0,03* CMS 012 10 0,22+0,06*Λ CMS 014 10 0,20+0,04* CMS 018 10 0,20+0,03* CMS 0 2 0 9 0,23+0, 05*@Λ CMS 0 2 2 10 0,21+0,06* CMS026 9 0,21+0,05* CMS 0 2 8 10 0,20+0,06* CMS030 8 0,24+0, 05*@Λ CMS 032 10 0,21+0,06* IFN-γ 10 0,15+0,04 IL-2 9 0,14+0,04 Soro fisiológico 9 0,12+0,02 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 Λ comparação com o grupo IL-2 P<0,05 A 0,5 μg/Kg/dia encontrou-se que o péptido CMS020 é capaz de aumentar o peso do baço, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico, de IFN-γ e de IL-2 (P<0,05). Encontrou-se que o péptido CMS001 é capaz de reduzir o peso do baço, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (P<0,05). Os dados estão detalhados abaixo na Tabela 32. ΡΕ1790655 55

Tabela 32

Grupo N X ± DP (%) CMS001 10 0,40+0,05* CMS020 8 0,68+0,09*@Λ Soro fisiológico 10 0,53+0,05 IFN-γ 10 0,50+0,04 IL-2 10 0,62+0,07 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 @ comparação com o grupo de IFN-γ P<0,05 comparação com o grupo IL-2 P<0,05

Resumindo, encontrámos que os péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS 012, CMS 013, CMS 014, CMS 015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS 02 0, CMS 0 21, CMS 0 2 2, CMS 023, CMS 0 2 4, CMS026, CMS027, CMS 02 8, CMS 0 2 9, CMS 03 0, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 e CMS 036 possuem actividades biológicas no modelo animal testado.

II. 0 EFEITO ANTIVIRAL IN VIVO DOS PEPTIDOS

Para saber se estes péptidos possuem possível efeito terapêutico nas infecções virais usámos o modelo animal de pato da infecção por hepatite B neste estudo para testar os efeitos in vivo dos péptidos acima referidos nos animais doentes. 56 ΡΕ1790655 O modelo de hepatite B em pato Chongqing foi estabelecido e os animais tratados com péptidos por injecção intraperitoneal (50 μρ/Κρ^ί3, uma vez por dia) durante 4 semanas. 0 nível sérico de DNA de DHBV foi analisado por hibridação de pontos em membrana do soro.

Como controlo positivo e negativo foram usados, respec-tivamente, o tratamento com soro fisiológico normal e lamivudina. Observou-se que o péptido CMS001 é capaz de reduzir o nível sérico de DNA de DHBV na 4a semana do tratamento, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo de soro fisiológico (p<0,05). Concluiu-se que CMS001 no nível de dosagem adequado pode ser usado como parte, ou na sua totalidade, para o tratamento da infecção por hepatite virai.

Materiais e métodos 1. Os péptidos foram sintetizados por encomenda pela American Peptide Company, Inc., USA, a partir de L-aminoácidos. 2. Modelo animal111

Patos Chongqing com um dia de idade foram inoculados com 0,1 ml de stock de soro positivo para o DNA do vírus da hepatite B do pato (DHBV) (5 x 107 cópias/ml) por injecção intraperitoneal. Uma semana mais tarde colheram-se amostras de sangue da veia jugular externa e a infecção foi confirmada por hibridação de pontos em 57 ΡΕ1790655 membrana com sonda de DNA de DHBV marcada com digoxina[2] . Os patos foram mantidos durante 2 semanas para entrarem no estudo. 3. Distribuição por grupos e tratamento

Patos infectados com DHBV foram distribuídos ao acaso pelos seguintes grupos: a) Grupo do controlo negativo (n=9): Soro fisiológico normal foi administrado em quantidades de 1 ml por pato através de injecção intraperitoneal, uma vez por dia. b) Grupo de Lamivudina (n=8): Como controlo positivo foi dada Lamivudina141 a 50 mg/Kg/dia por administração oral, uma vez por dia. c) Grupo péptido (n=9): 50 μg/Kg/dia de péptido (ajustado a um volume final de 0,5 ml a 1 ml com soro fisiológico normal) foi administrado uma vez por dia por injecção intraperitoneal. O tratamento durou 4 semanas e a observação continuou durante mais uma semana após terminado o tratamento. Amostras de 1 ml de sangue foram colhidas da veia jugular externa dos patos nos dias 0, 7, 14, 21, 28 e 35 quando o tratamento começou. 0 soro das amostras de sangue foi isolado imediatamente[3] e guardado a -20°C até à análise. 4. Determinação do nível de DNA de DHBV sérico 58 ΡΕ1790655 A sonda de DNA de DHBV foi marcada com fluorescência de acordo com o protocolo do kit de marcação fornecido pelo fabricante do kit (Amersham Pharmacia Biotech Co.)· 40 μΐ de soro de pato foi sujeito colocado em pontos (1 ponto em duplicado por amostra) em membrana de nitrocelulose e hibridado com sonda de DNA de DHBV marcada com fluorescência para quantificação[2] . Após completada a hibridação, os pontos na membrana foram revelados em reagente de fluorimetria CDP-Star RPN3690 e varrido com Vuego Scan (Brisa-620st). Usou-se o programa ImageMaster TotalLab vl.ll.Ink para análise quantitativa dos pontos. A análise estatística foi realizada de acordo com o teste t pareado usando o programa SPSS.

Resultados

Tabela II. 1 tratamento Título de DNA de DHBV sérico antes e após Nivel de DNA de DHBV (Média+desvio padrão, 103 unidades) Dia 0 Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 28 Dia 35 Soro fisioló - 26+12 45+31 49+23 102+66 60+3 8 50+43 gico normal Lamivudina 21+9 6+4 * 7+6* 8+7* 8+5* 2 0+19 CMS001 21+18 11+13 2 0+18 14+14 5+3* 18+16 Teste t pareado, comparaçao com o dia 0 dos mesmos animais:*P<0,' 05 59 ΡΕ1790655 O grupo de controlo negativo (soro fisiológico normal) e positivo (lamivudina) demonstraram o estabelecimento com êxito do modelo animal de hepatite. A 50 μg/Kg/dia, encontrou-se que o péptido CMS001 é capaz de baixar o titulo de DNA de DHBV sérico após 4 semanas de tratamento, tendo diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre o valor antes do tratamento dos mesmos animais. Quando do fim do tratamento, o título de DNA de DHBV no soro voltou para um valor sem diferença estatisticamente significativa relativamente a antes do tratamento, mostrando que o efeito do péptido CMS001 pode ser reversível e/ou necessitar de um período de tratamento mais longo para a erradicação do vírus.

Discussão O modelo animal de hepatite do pato[1] é um modelo experimental bem estabelecido para os estudos de patogénese da hepatite B humana e para o rastreio de agentes terapêuticos contra a hepatite B. Neste estudo, encontrou-se que CMS0 01 é capaz de baixar o título sérico de DNA do DHBV após 4 semanas de tratamento, indicando que o péptido CMS001 num nível de dosagem adequado e com um esquema de aplicação apropriado, pode ser útil por si só ou em combinação com outras substâncias como um agente para o controlo da hepatite B humana. 60 ΡΕ1790655

No presente estudo, foi testada a administração por injecção intraperitoneal, mas isto não exclui a possível eficácia do péptido se administrado através de outras vias alternativas. Os péptidos podem também ser administrados por injecção intravenosa, injecção intramuscular, injecção subcutânea e implantação subcutânea, com ou sem sistema facilitador da libertação, como sejam lipossomas, protecção para libertação controlada, etc. 0 péptido pode também ser administrado em qualquer forma de administração oral como seja comprimido, cápsula, suspensão, solução etc, na forma usual sem modificação ou na forma de libertação controlada, ou com ou sem protecção gastro-entérica. 0 péptido pode ainda ser aplicado em qualquer forma de aplicação tópica como seja pomada, creme, gel, etc., com ou sem sistema facilitador transdérmico, ou como pó para inalação, dissolvido ou na forma protegida de lipossoma. 0 péptido pode também ser considerado na sua forma genética e clonado num sistema de expressão, por si só ou em combinação com outras sequências peptídicas, para gerar uma molécula peptídica resultante para usar a actividade do péptido como descrito nesta descrição, com ou sem purificação do péptido resultante.

Tabela II.2 Péptidos eficazes contra a Hepatite B Código CMS SEQ ID NO. CMS 0 01 1 61 ΡΕ1790655

Referências 1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al. Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model.

Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2):89-91 2. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al.

Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medicai Sciences. 1994; 19(4):295-297 3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001;9(1):13-15. 4. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan, et al. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4):209-211. III. Efeito dos péptidos na nefrite

Com o objectivo de verificar se estes péptidos possuem possível efeito terapêutico sobre a nefrite, usámos o modelo animal de nefrite em rato Masugi neste estudo para testar os efeitos in vivo dos péptidos referidos em animais doentes [3,4] 62 ΡΕ1790655 O objectivo deste estudo é investigar o efeito terapêutico in vivo de péptidos na glomerulonefrite crónica. 0 modelo de nefrite do rato Masugi foi conseguido através da injecção de IgG anti-cortex renal de rato em ratos Sprague Dawley saudáveis e depois tratados imediatamente com injecção intraperitoneal de péptidos a 50 μρ/Κρ,Μί3, uma vez por dia durante 3 semanas. Usou-se hidrocortisona como controlo positivo. Encontrou-se que a proteinúria, nível de creatinina do soro e índice do baço dos ratos tratados com CMS014, CMS018, CMS030 e CMS036 foram baixados comparativamente com o grupo controlo, com significância estatística (p<0,05). O exame microscópico post mortem do rim mostrou que o efeito terapêutico destes péptidos foi semelhante ao tratamento com hidrocortisona. Concluiu-se que CMS014, CMS018, CMS030 e CMS036 podem ser usados como meio para o controlo de nefrite crónica.

Materiais

Ratos machos Sprague Dawley (SD), pesando 120+20 g, foram do Center of Experimental Animal, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine e também de First Military Medicai University. Coelhos Chinchil com 3 Kg de peso foram do Center of Experimental Animal, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine.

Os péptidos, com L-aminoácidos, foram sintetizados por encomenda pela American Peptide Company, Inc, USA e foram diluídos para 10 μρ/ιηΐ em soro fisiológico 63 ΡΕ1790655 normal estéril. A hidrocortisona foi da Yangzhou Pharmaceutical Factory, China. 0 kit para determinação do nível de creatinina sérica foi da Shangai Rongsheng Biological Technique Company, PR China. Métodos 1. Preparação de anti-soro de coelho anti- cortex renal de rato111 : 20 ratos SD saudáveis foram anestesiados com injecção intravenosa de pentobarbital sódico a 3%, 40 mg/Kg. A aorta abdominal foi exposta e os rins foram sujeitos a perfusão com soro fisiológico normal até limpeza do sangue. O córtex renal foi isolado, homogeneizado em 5 volumes de tampão Tris-HCl 0,01M, pH 8,1 e filtrado através de um filtro de aço inoxidável de 140 gauge. O filtrado foi colhido e misturado com adjuvante de Freund completo ou incompleto GIBCO-RRE a 1:1 e emulsionado para se obter a solução de trabalho para imunização.

Dez coelhos saudáveis foram imunizados com as soluções de imunização, na primeira vez com adjuvante completo de Freund e subsequentemente com o incompleto. O antigénio foi injectado hipodermicamente em seis pontos ao acaso, 0,1 ml por ponto, uma vez cada dez dias. A partir da 6a semana em diante, colheu-se sangue da veia auricular e o título de anticorpo foi determinado pelo método de dupla difusão[2]. Na 8a semana após início da imunização, os coelhos foram anestesiados com injecção intravenosa de 64 ΡΕ1790655 pentobarbital sódico a 3%, 20 mg/Kg, e o sangue foi colhido da artéria carótida. O anti-soro foi então exsudado e isolado.

Colheu-se sangue total a partir de 15 ratos SD saudáveis. Os eritrócitos foram isolados e lavados três vezes com soro fisiológico normal. Os eritrócitos lavados foram misturados com 250 ml de anti-soro de coelho e incubado a 4°C durante a noite. Após incubação, as células do sangue foram removidas por centrifugação e o sobrena-dante foi ainda inactivado a 56°C durante 30 minutos. Após centrifugação para remover qualquer precipitado, IgG bruto foi isolado e parcialmente purificado a partir do sobrenadante por precipitação com (NH4)2S04 três vezes (50%, 33% e depois 33%) [5] . A IgG bruta foi redissolvida em 125 ml de água duplamente destilada e dialisada para eliminar o sulfato de amónio. O titulo de anticorpos anti-cortex renal de rato foi determinado pelo método de dupla difusão1. 1 A indução de glomerulonefrite de rato[5]: 0,25 ml de solução de imunização (contendo cerca de 4 mg de IgG de coelho não especifica com adjuvante completo de Freund) foi injectado intraperitonealmente em ratos SD saudáveis para estimular os ratos cinco dias antes da indução. Com excepção do grupo controlo saudável normal que recebeu soro fisiológico normal, todos os grupos foram subsequentemente induzidos por injecção intraperitoneal de 1 ml de IgG de coelho anti-cortex renal de rato preparado como descrito na secção Método 1. 65 ΡΕ1790655 3. Formação de grupos e administração: ratos SD machos foram distribuídos ao acaso por grupos controlo saudável normal (normal), controlo de tratamento da nefrite com placebo (placebo), tratamento de nefrite com péptidos e controlo tratamento de nefrite com hidrocortisona (hidrocortisona), 12 por grupo. O tratamento começou no dia da indução. Os péptidos 50 μq/Kq/diar hidrocortisona 3,3 mg/Kg/dia e soro fisiológico normal foi usado como placebo, todos administrados intraperitonealmente uma vez por dia e durou 3 semanas. 4. Parâmetros monitorizados141: (a) nível proteico da urina: cada rato foi mantido individualmente numa gaiola. Foi fornecida água de beber adequada. A urina foi colhida uma vez por semana, 24 horas de cada vez. O teor proteico da urina foi determinado pelo método de azul Coomassie. (b) nível de creatinina sérica: colheu-se sangue após três semanas de tratamento e procedeu-se à determinação do nível de creatinina sérica. O kit de creatinina foi fornecido pela Shangai Rongsheng Biological Technique Company. (c) índice do peso do baço: o índice do peso do baço foi determinado pela seguinte fórmula: índice de peso do baço = peso médio do baço h- peso médio do corpo 66 ΡΕ1790655 (d) Exame patológico ao microscópio do rim: 6 rins mais pesados foram escolhidos de cada grupo para exame patológico.

Análise estatística

Usou-se o teste t para as comparações inter-grupo, com limiar estabelecido em p<0,05. Para todos os grupos, os dois ratos com níveis mais baixos de proteína na urina foram excluídos da análise estatística.

Resultado 1. O efeito do tratamento com péptido no nível de proteína da urina

Tabela III. 1 O efeito de tratamento com péptido no nível de proteína da urina (unidade:mg)

Grupos n Semana 1 Semana 2 Semana 3 CMS 014 10 5,5±4,0* 6,3+6,8* 2,8+1,9* CMS018 10 7,0±3,7* 5,5+7,9* 3,3+3,4* CMS030 10 5,4+3,4* 9,5+16,2 2,4+1,5* CMS036 10 7,9+5,8* 5,0+7,1* 1,3+0,9* Hidrocortisona 10 3,1+2,0* 7,5+7, 7 7,6+7,1* Placebo 10 22,9+22 17,2+14,5 20,2+29,0 normal 9 1,7+1,3* 2,3+1,1* 0,4+0,2* Comparação com placebo, * p<0,05 67 ΡΕ1790655

Encontrou-se que os péptidos CMS014, CMS018, CMS030 e CMS036 a 50 μq/Kq/dia uma vez por dia pode baixar o nível de proteína da urina no modelo de nefrite do rato Masugi, com diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo tratado com placebo, p<0,05. Também se observou que a velocidade de crescimento dos grupos CMS014, CMS030, CMS036 e hidrocortisona possuem velocidades de crescimento mais lentas que o normal. A velocidade de crescimento do grupo de hidrocortisona baixou até um grau que após a primeira semana, a dose de tratamento teve de ser reduzida a metade para evitar intolerância grave. 2. O efeito do tratamento com péptidos no nível de creatinina sérica

Tabela III.2 A influência de péptidos no nível de creatinina sérica

Grupos n Nível de creatinina sérica (|iimol/L) CMS014 10 159+1 CMS018 10 67+1* CMS030 10 93+1* CMS036 10 80+1* Placebo 10 265+212 hidrocortisona 10 239+107 Normal 9 80+1* Comparação com ratos com nefrite que receberam tratamento com placebo (placebo), *p<0,05 68 ΡΕ1790655 O nível de creatinina sérica de ratos Masugi com nefrite receberam tratamento com placebo foi mais elevado do que o grupo controlo normal, mostrando que a função renal dos ratos com nefrite era anormal. Encontrou-se que os péptidos CMS014, CMS018, CMS030 e CMS036 a 50 μg/Kg/dia uma vez por dia foram capazes de baixar o nível de creatinina sérica, com diferença estatisticamente significativa relativamente aos ratos com nefrite tratados com placebo. 3. O efeito de péptidos nos índices do baço (xl0~3) Tabela III.2 O efeito de péptidos nos índices do baço (xl0~3)

Grupos n índice do baço CMS014 10 3,6±1,3 * CMS018 10 3,3±0,8 * CMS030 10 3,0+0,5* CMS 036 10 3,4+0,8* Placebo 10 4,8+1,1 hidrocortisona 10 4,5+1,4 Normal 9 2,4+0,1* Comparação com ratos com nefrite que receberam tratamento com placebo (placebo) , *p<0,05

Os baços de todos os ratos induzidos ficaram aumentados comparativamente com ratos normais, mostrando 69 ΡΕ1790655 que a indução de nefrite estava relacionada com a resposta imune. Encontrou-se que os péptidos CMS014, CMS018, CMS030 e CMS036 a 50 μρ/Κρ/^ί3 uma vez por dia foram capazes de baixar o índice do baço, com diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de ratos com nefrite que receberam tratamento com placebo, p<0,05. Isto sugeriu que os péptidos devem exercer o seu efeito corrector contra nefrite através de mecanismos de imuno-supressão. 4. Os efeitos dos péptidos no exame microscópico da patologia renal

Comparando com ratos normais, os ratos com nefrite que receberam tratamento com placebo (grupo placebo) mostraram sinais de formação de tecido fibroso na cápsula glomerular, hiperplasia do epitélio glomerular, formação de crescentes, dilatação e congestão dos capilares glomerulares, edema do epitélio do túbulo proximal e formação de cilindros no túbulo distai e no tubo colector. Estas alterações patológicas confirmaram a indução bem sucedida de nefrite. Observou-se que no grupo CMS014, houve apenas um rato com sinais de formação de tecido fibroso na cápsula glomerular e hiperplasia do epitélio glomerular. Outros parâmetros do mesmo rato e outros ratos do mesmo grupo possuem essencialmente a mesma histologia renal que os ratos normais. Nos grupos CMS018, CMS030 e CMS036, todos os parâmetros patológicos de todos os ratos eram normais. 70 ΡΕ1790655

Conclusão

Concluiu-se que os péptidos CMS014, CMS018, CMS030 e CMS036 a 50 μq/Kq/à.ia, uma vez por dia, administrados intraperitonealmente podem ter efeito terapêutico no modelo de rato Masugi com nefrite. A proteinúria, a excreção de creatinina e a histologia renal dos ratos tratados foram corrigidos por estes péptidos, com diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo controlo que recebeu tratamento com placebo. Estes péptidos podem actuar através de mecanismos imunológicos como indicado pela sua influência no índice de peso do baço, mas não exclui a possibilidade das suas acções através de outros mecanismos.

Discussão

Os péptidos CMS014, CMS018, CMS030 e CMS036 podem ser úteis como parte, ou por si sós, no controlo de nefrite no Homem. Por exemplo, os péptidos podem ser usados para corrigir proteinúria ou para restaurar as funções excretoras dos doentes com nefrite. Os péptidos podem também ser usados para evitar mais redução da função renal nos doentes com nefrite. Os péptidos podem ser usados por si sós, em combinações de dois ou mais péptidos, ou em combinação com outros fármacos ou suplementos alimentares como um tratamento total para o controlo de nefrite. 71 ΡΕ1790655

Tabela III.4 Péptidos eficazes contra nefrite Código CMS SEQ ID NO. CMS 014 7 CMS 018 10 CMS030 21 CMS036 26

Referências 1. SDA (State Drug Administration, P.R. China). The guideline of preclinical researches of new drugs. 1994, the lst edition, p. 96 2. Xu Shuyun et al., The methodology of pharmacological experiment, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, the 2nd edition, 1991:1071. 3. Chen Qi, et al., The methdology of pharmacological researches of traditional Chinese medicine, the Peoples's sanitation Publishing Company, Beijing, the lst edition. 1993:390. 4. Du Guanhua. The guideline for pharmacological experiment the discovery and pharmacological evaluation of new drugs, Science Publishing Company, Beijing, the lst edition, 2001:598. 5. Wang Shuxian. Nephrology, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, the llth edition, 1987:244. 72 ΡΕ1790655

IV. EFEITO DE PÉPTIDOS CMS NO CANCRO

Para testar se estes péptidos poderão ter aplicação terapêutica no cancro, usámos neste estudo vários modelos padrão de cancro em animais para testar os efeitos biológicos dos péptidos descritos em animais doentes.

Materiais 1. Animais experimentais

Murganhos BALB/c, murganhos C57BL/6 e murganhos DBA/2, pesando 18-22g do China Medicai Science Institute, RP da China. 2. Linhas celulares Células Sisó de sarcoma de murganho, células B16 e células L1210, do Câncer Research Department, China Medicai Science Institute. As células YAC-1, foram oferta do Prof. Yao Zhi, Tianjin Medicai University. 3. Principais fármacos e reagentes

Os péptidos usados neste estudo foram sintetizados por encomenda pela American Peptide Company, Inc., USA. 73 ΡΕ1790655

Soro fetal bovino, meio de cultura celular RPMI-1640, da Gibco, USA. MTT, ConA, da Sigma, USA.

Interferão-γ recombinante de murganho (rmIFN-γ) , da Beijing Biotech Inc., PR China.

Interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2), da Shanghai Huaxin Biotech Inc., PR China.

Solução de separação de linfócitos, do Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medicai Science, RP da China.

Ciclofosfamida, da 12th Pharmaceutical Factory de Shanghai, PR China. Métodos 1. Administração da substância a testar

Injecção intraperitoneal, uma vez ao dia. Com excepção do grupo da ciclofosfamida, todos os grupos iniciaram o tratamento 5 dias antes do transplante das células cancerosas. Os grupos de ciclofosfamida foram tratados no dia seguinte ao transplante das células cancerosas. O tratamento de todos os grupos com a substância a 74 ΡΕ1790655 testar durou 30 dias ou até o animal morrer, a menos que de outra forma seja justificado. 2. 0 efeito dos péptidos na velocidade de crescimento das células de sarcoma Siso transplantadas em murganhos BALB/c e na função imunológica do hospedeiro

Os murganhos BALB/c foram distribuídos ao acaso pelo grupo de péptido, grupo de ciclofosfamida, grupo de rmIFN-γ, grupo de rhIL-2 e grupo de soro fisiológico, 20 animais por grupo.

As células stock de sarcoma Siso foram incubadas em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 37°C, 5% CO2 durante 72 hrs, depois lavadas 3-4 vezes com solução de Hank à temperatura ambiente. O ajuste da concentração celular a 1-2 x 109 por litro com solução de Hank. 0,2 ml de suspensão celular foi implantado em vários murganhos BALB/c através da axila durante 10-12 dias. Os murganhos foram sacrificados por deslocamento cervical. As massas tumorais em forte crescimento e intactas foram colhidas e lavadas com soro fisiológico. O tecido foi disperso em soro fisiológico até se obter uma suspensão celular homogénea, numa proporção de 1 g de tecido para 4 ml de soro fisiológico. O modelo de murganho portador de sarcoma foi preparado com uma injecção de 0,2 ml de suspensão de células através da axila111 . A administração do tratamento com a substância a testar foi iniciado como descrito na secção Método 1. 75 ΡΕ1790655 2.1 O efeito de péptidos na função fagocítica dos fagócitos mononucleares em murganhos com sarcoma Siso12,31 foi analisado através da injecção de murganhos na veia da cauda com 0,1 ml/10 g de peso de corpo de tinta da China (diluição 1:5 com soro fisiológico) no segundo dia após a última administração da substância a testar. Um minuto e cinco minutos após a injecção, colheu-se 20 μΐ de sangue a partir do canto do olho com um tubo heparinizado. O sangue foi misturado com 2 ml de 0,1% p/v de Na2C03 e depois feita a leitura da DCúsonm. O índice K foi calculado pela seguinte fórmula: K = (Ig Ai-Ig A2) -s- (t2-tl)

Chave: AI: DOesonm no primeiro minuto A2: DOesonm no quinto minuto t2: 5 minutos t2: 1 minuto

Após o estudo do índice de fagocitose, os murganhos foram mortos por deslocamento cervical. 0 fígado, baço e tecido canceroso foram dissecados, secos e pesados. 0 índice de fagocitose α foi calculado como abaixo: α = (Vk)x(WtWls) chave: 76 ΡΕ1790655 W: peso do corpo WLs: peso do fígado mais baço 2.2 0 índice de inibição do crescimento de tumores foi calculado de acordo com a seguinte fórmula índice de inibição do crescimento de tumores = (peso médio do tumor do grupo controlo - peso médio do tumor do grupo de tratamento) h- peso médio do tumor do grupo controlo 3. 0 efeito dos péptidos na sobrevivência de murganhos BALB/c com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado

Murganhos BALB/c foram distribuídos ao acaso pelo grupo de péptido, grupo de ciclofosfamida, grupo de rmlFN-γ, grupo de rhIL-2 e grupo de soro fisiológico, 20 animais por grupo.

As células H22 stock foram incubadas em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 37°C/5%C02 durante 72 horas, depois lavadas 3-4 vezes com solução de Hank à temperatura ambiente. A concentração celular foi ajustada a 1-2 x 109 por litro com solução de Hank. 0,2 ml da suspensão celular foi implantada na cavidade abdominal de vários murganhos BALB/c durante 6-8 dias [1]. Os murganhos foram mortos por deslocamento cervical. O fluido ascítico dos murganhos foi colhido assepticamente e a concentração celular ajustada a 1 x 106 77 ΡΕ1790655 por ml com solução de Hank. 0,2 ml da suspensão celular foi implantado na cavidade abdominal de murganhos saudáveis para gerar cancro do fígado tipo fluido ascítico. A administração da substância a testar começou como descrito na secção Método 1. Registaram-se os dados de sobrevivência dos murganhos. No caso do animal sobreviver mais do que a duração da experiência, os dias de sobrevivência foram registados como a duração da experiência. O número médio de dias de sobrevivência foi obtido pelo método de Kaplan-meier na opção de Sobrevivência do programa SPSS. O índice de sobrevivência foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: índice de sobrevivência = (dias médios de sobrevivência no grupo de tratamento - dias médios de sobrevivência do grupo controlo) -s- dias médios de sobrevivência do grupo controlo x 100% 4. O efeito dos péptidos na imunidade celular de murganhos BALB/c com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado 4.1 Preparação de suspensão de células do baço[1'41

Murganhos BALB/c saudáveis foram distribuídos ao acaso pelo grupo de péptido, grupo de rmIFN-γ, grupo de rhIL-2 e grupo de soro fisiológico, 15 animais por grupo e preparados para o modelo de murganhos portadores de H22 78 ΡΕ1790655 como descrito na secção Método 3. Após implante das células do cancro, as substâncias a testar foram administradas durante 15 dias, os murganhos foram mortos por deslocamento cervical. 0 baço foi isolado assepticamente e disperso manualmente em solução de D-Hank fria usando uma agulha de injecção. A suspensão de células dispersas foi ainda passada através de um crivo em aço inoxidável de 100 gauge, 150 μιη de diâmetro. Após centrifugação a 200g durante 10 minutos, o sobrenadante foi rejeitado. 0 sedimento de células foi ressuspenso em 10 volumes de tampão Tris-NH4C1 e depois mantido em repouso durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células suspensas foram colhidas por centrifugação a 150 g durante 10 minutos. As células foram lavadas 2-4 vezes com solução de D-Hank fria ressuspendendo e colhendo por centrifugação como descrito atrás. As células lavadas foram então diluídas para as densidades celulares pretendidas com meio de cultura RPMI-1640, contendo 10% de soro fetal bovino. 4.2 O efeito dos péptidos na transformação de linfócitos T em murganhos com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico[1,41

As células do baço de densidade 1 x 106/ml foram colocadas numa placa de cultura de 96 alvéolos, 100 μΐ/alvéolo, três alvéolos paralelos para cada amostra a testar e amostra controlo por murganho. Aos alvéolos do ensaio, adicionou-se 100 μΐ/alvéolo de ConA a 100 μg/ml em 79 ΡΕ1790655 RPMI-1640 e 100 μΐ/alvéolo de meio RPMI-1640 completo foi usado para os controlos. As células foram incubadas durante 66 horas a 37°C, 5% C02. As células foram então sedimentadas por centrifugação a 150 g durante 10 minutos. 0 sobrenadante foi colhido e guardado a -20°C para determinação das citocinas IL-2 e IFN.

Adicionou-se 50 μΐ/alvéolo de MTT a 1 mg/ml em RPMI-1640 ao sedimento de células e as células foram ressuspensas por agitação durante 2 minutos. A incubação continuou durante 4 horas. O sobrenadante foi rejeitado após centrifugação a 150 g durante 10 minutos. Adicionou-se 120 μΐ de HCl-2-propanol 40 mM ao sedimento de células e agitou-se durante 3 minutos. A utilização de um leitor de ELISA para se obter a D057onm de cada alvéolo com a referência a 630 nm.

Cada um dos murganhos originou três alvéolos de ensaio e três alvéolos controlo. O índice de estimulação (SI) de cada murganho foi obtido estimando primeiro a DO média dos três alvéolos em paralelo, depois dividindo o valor dos alvéolos do ensaio pelos alvéolos controlo. 4.3 O efeito dos péptidos na actividade de células NK em murganhos com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico [5,6] Células de baço de murganho foram preparadas para 80 ΡΕ1790655 4 χ 106/ml como descrito na secção 4.1 atrás. As células alvo YAC-1 foram levadas até à fase logarítmica e ajustadas a 1 x 105/ml. Usando uma placa de cultura celular de 96 alvéolos, 100 μΐ de células do baço de murganho e 100 μΐ de meio de cultura foram adicionados ao alvéolo do controlo contendo apenas as células do baço; 100 μΐ de células alvo e 100 μΐ de meio de cultura foram adicionados ao alvéolo de controlo contendo apenas células alvo; 100 μΐ de células do baço de murganho e 100 μΐ de células alvo foram adicionados ao alvéolo do ensaio de actividade NK. Três séries paralelas do que foi referido foram preparadas por murganho. Em seguida, as placas de cultura de 96 alvéolos foram incubadas durante 4 hrs a 37°C, 5% CO2.

As amostras foram centrifugadas a 150 g durante 10 minutos para colher as células. O sobrenadante foi rejeitado e adicionado 50 μΐ/alvéolo de MTT a 1 mg/ml. A mistura de reacção foi então agitada durante 2 minutos e incubada a 37°C, 5% CO2 durante 4 horas. O sobrenadante foi rejeitado após centrifugação a 150 g durante 10 minutos. Adicionou-se 120 μΐ de HCl-2-propanol 40 mM e agitou-se durante 3 minutos. Usou-se um leitor de ELISA para se obter a DO570nm de cada alvéolo referenciada a 630 nm.

Cada murganho deu origem a 9 alvéolos: três para o controlo de apenas células do baço, três para o controlo de apenas células alvo e três para a substância a testar. O índice de actividade de células NK de cada murganho foi 81 ΡΕ1790655 obtido estimando primeiro a DO média de três alvéolos paralelos para cada combinação, depois aplicando esta DO média à seguinte fórmula: índice de actividade de células NK = [l-(DO média dos alvéolos de células do baço e células alvo - DO dos alvéolos de apenas células do baço) (DO média dos alvéolos de apenas células alvo)] x 100% 5. Efeito de péptidos na sobrevivência de murganhos DBA/2 com leucemia Lmo transplantada

Murganhos DBA/2, de 6-8 semanas de idade, foram distribuídos ao acaso pelo grupo de péptido, grupo de ciclofosfamida, grupo de rmIFN-γ, grupo de rhIL-2 e grupo de soro fisiológico, 15 animais por grupo

As células stock L1210 foram incubadas em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 37°C/5% CO2 durante 72 horas, depois lavadas 3-4 vezes com solução de Hank e ajustadas a 1 x 105 células por litro. 0,1 ml de suspensão celular foi implantado na cavidade abdominal de vários murganhos DBA saudáveis durante 6-8 dias. Os murganhos foram então mortos por deslocamento cervical a o seu fluido ascítico colhido assepticamente. A concentração celular do fluido ascítico colhido foi ajustada a 1 x 105 por ml com solução de Hank. 0,1 ml da suspensão celular foi implantado em cada um dos animais a testar e registados os dados de sobrevivência dos animais. O tratamento foi iniciado nos animais a testar como descrito na secção Método 1. A média dos dias de sobrevivência foi obtida pelo 82 ΡΕ1790655 método de Kaplan-meier na opção Sobrevivência do programa SPSS. No caso do animal sobreviver mais do que a duração da experiência, os dias de sobrevivências foram considerados como a duração da experiência. 0 índice de sobrevivência foi calculado de acordo com a fórmula seguinte: índice de sobrevivência = (média dos dias de sobrevivência do grupo de tratamento - média dos dias de sobrevivência do grupo controlo) + média dos dias de sobrevivência do grupo controlo 6. 0 efeito dos péptidos na imunidade humoral de murganhos C57BL/6 portadores de melanoma Βίε transplantado e no potencial metastático das células de melanoma inoculadas

Murganhos C57BL/6, com 6-8 semanas de idade, peso de corpo de 18-22 g, foram distribuídos ao acaso pelo grupo de péptido, grupo de ciclofosfamida, grupo de rmIFN-γ, grupo de rhIL-2 e grupo de soro fisiológico, 20 animais por grupo.

As células stock de melanoma B16 foram incubadas em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 37°C, 5% CO2 durante 72 hrs, depois lavadas 3-4 vezes com solução de Hank. A concentração celular foi ajustada a 1 x 105 por litro com solução de Hank e 0,1 ml da suspensão celular foi injectado na veia da cauda nos animais a testar para dar origem ao modelo animal portador de melanoma Bi6 [7,8]. O tratamento com a substância a testar foi iniciado como descrito na secção Método 1. 83 ΡΕ1790655 6.1 O efeito de péptidos na imunidade humoral de murganhos C57BL/6 portadores do melanoma Bi6 transplantado [9]

Prepararam-se eritrócitos de carneiro (SRBC) através da colheita de sangue da veia cervical e colocando-o em frascos estéreis com esferas de vidro. O frasco foi então agitado durante 3 minutos e o sangue depois misturado com solução de Alsever (glucose 2,05g, NaCl 0,4 g, citrato de sódio 0,8g, ajustar a 100 ml com água destilada) e guardado a 4°C. Imediatamente antes de usar, as amostras foram centrifugadas a 130g, 5 minutos, para colher os SRBCs. As células foram lavadas duas vezes por centrifugação e ressuspensão em soro fisiológico normal. Em seguida o sedimento de células foi colhido por centrifugação a 180 g, durante 10 minutos e ressuspenso em soro fisiológico para se obter uma suspensão de trabalho final de SRBCs de 2% (v/v).

Preparou-se o complemento através da adição de 10 volumes de soro Cavy fresco num volume de SRBCs sedimentados por centrifugação e depois agitado suavemente durante 30 minutos a 4°C. Os SRBCs foram removidos por centrifugação a 200g durante 10 minutos. Adicionou-se 10 volumes de soro fisiológico normal para se obter a solução de trabalho do complemento. 84 ΡΕ1790655

Nos animais a testar, no dia 27° do tratamento da substância a testar, 0,2 ml da suspensão de trabalho de células SRBC foi injectado em cada um dos animais para induzir anticorpos. No dia a seguir à última administração a testar, colheu-se sangue do canto do olho e deixou-se à temperatura ambiente durante uma hora para exsudação do soro. Após centrifugação a 200g durante 10 minutos, o soro colhido foi diluído 500 vezes com soro fisiológico normal. A 1 ml de soro de murganho diluído de cada um dos murganhos, adicionou-se 0,5 ml da suspensão de SRBC. Arrefeceu-se em gelo. Depois, adicionou-se 1 ml de solução de trabalho do complemento e incubou-se num banho-maria a 37°C durante 10 minutos. As reacções foram paradas por arrefecimento em gelo. As amostras foram então centri-fugadas a 200g durante 10 minutos para se obter o sobrena-dante. A 1 ml deste sobrenadante, adicionou-se 3 ml de solução de Drabkin e deixou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos. Fez-se a leitura da D054onm· A referência da DOs40nm foi obtida misturando 0,25 ml da suspensão de SRBCs com solução de Drabkin para 4 ml e colocou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos antes de ser lida a DO540nm. índice de hemólise = (DO540nm da amostra a testar referência da DO540nm) x 500 85 ΡΕ1790655 6.2 Após o estudo da imunidade humoral, os murganhos foram mortos por deslocamento cervical. Realizou-se o exame post mortem dos animais. As alterações patológicas foram registadas e os números de focos de metástases de melanoma no pulmão foram contados.

Resultados 1. 0 efeito de péptidos na fagocitose celular em murganhos BALB/c com sarcoma Siso transplantado (Método 2.1)

Tabela IV.1. 0 efeito de péptidos na fagocitose celular em murganhos BALB/c com sarcoma Siso transplantado

Grupo Dose N índice de fagocitose CMS001 50 μρ/Kg 20 6,24+0,33*Λ CMS001 5 μρ/Kg 19 6,67+0,43*Λ CMS034 5 μg/Kg 19 6,20±0,44*Λ CMS034 0,5 μρ/Kg 20 6,35+1,02* IL-2 3 x 105 UI/Kg 19 6,96+1,37* IFN-γ 3 x 105 UI/Kg 17 5,45+0,71 Ciclofosfamida 20 mg/Kg 19 5,92+2,47 Soro fisiológico 0,5 ml 19 5,38+0,85 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0,05 Λ comparação com o grupo rmIFN-γ P<0, 05

Observou-se que CMS001 a 50 μg/Kg/dia e 5 86 ΡΕ1790655 μg/Kg/dia e CMS034 a 5 μg/Kg/clia e 0,5 μg/Kg/dia são capazes de aumentar o índice de fagocitose, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico. 2. O efeito do péptido na velocidade de crescimento de sarcoma Siso transplantado em murganhos BALB/c (Método 2.2)

Tabela IV.2. O efeito de péptidos no crescimento de tumor Siso transplantado

Grupo Dose N Peso do tumor (g) índice de inibição de tumor (%) CMS 010 500 μρ/Kg 20 0,67+0,35* 48, 4 CMS03 4 0,5 μg/Kg 20 0,83+0,48* 35,9 CMS035 5 μρ/Kg 20 0, 71+0,37* 44, 6 IL-2 3 x 105 UI/Kg 20 0,69+037* 46,2 IFN-γ 3 x 105 UI/Kg 18 0,96+0,45 25,3 Ciclofosfamida 20 mg/Kg 20 0,68+0,32* 47,3 Soro fisiológico 0,5 ml 20 1,29+0,50 comparação com o grupo do soro fisiológico P<0 , 05

Observou-se que CMS010 a 500 μρ/ΚρΜί3 e CMS034 a 0,5 μg/Kg/dia e CMS035 a 5 μg/Kg/dia são capazes de reduzir o crescimento do sarcoma Si8o transplantado, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico. 87 ΡΕ1790655 3. O efeito de péptidos na sobrevivência de murganhos BALB/c com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado (Método 3)

Tabela IV.3. 0 efeito de péptidos no índice de sobrevivência de murganhos BALB/c com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado

Grupo Dose N Dias de índice de sobrevivência sobrevivência CMS008 5 pg/Kg 20 50, 7±20, 9*s 67, 8 CMS011 5 μg/Kg 20 36, 4±22, 2*s 60,2 CMS024 50 μg/Kg 20 36,3+12, 7*s$ 38, 4 CMS024 5 μg/Kg 19 40, 6+14, 6*s$ 54, 8 CMS024 0,5 μg/Kg 19 46, 4+14, 8*λ4$ 76,9 CMS032 0,5 μg/Kg 20 42, 8+12,2*aS$ 63,3 rhIL-2 3 x 105 UI/Kg 18 13,6+0,5 rmIFN-γ 3 x 105 UI/Kg 20 27,8+7,5 6,1 Ciclofosfamida 20 mg/Kg 20 24,7+10,2 Soro fisiológico 0,5 ml 19 26,2+6,8 *: comparação com 0 grupo de soro fisiológico P<0,05 A: comparação com 0 grupo de rmIFN-γ, P<0 , 05 4: comparação com 0 grupo de rhIL- -2, P<0, 05 5: comparação com 0 grupo de ciclofosfamida, P<0,05

Observou-se que CMS008 a 5 μg/Kg/dia, CMS011 a 5 pg/Kq/dia, CMS02 4 a 50 μg/Kg/dia e CMS032 a 0,5 \ig/Kg/dxa. são capazes de prolongar a sobrevivência de murganhos BALB/c com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05) . Foi igualmente observado que no grupo CMS024 a 0,5 μg/Kg/dia, mais de 30% (n=6) de murganhos sobreviveram mais de 90 dias (dois meses após terminada a experiência). O exame post 88 ΡΕ1790655 mortem dos murganhos não revelou sinais de estabelecimento de tumores. Assim, CMS024 a 0,5 μg/Kg/dia pode interferir com o crescimento de H22 transplantado através da interferência com o seu estabelecimento ou indução da cura total do cancro estabelecido. 4. 0 efeito de péptidos na transformação de linfócitos T em murganhos BALB/c com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado (Método 4.2)

Tabela IV.4 0 efeito de péptidos na transformaçao de

linfócitos T

Dose N índice de estimulação CMS010 500 μρ/Kg 20 1, 45+0, 21*$ CMS019 0,5 μρ/Kg 19 1,50+0, 19*$ CMS 02 4 0,5 μρ/Kg 19 1,46+0, 19*$ CMS 024 5 μg/Kg 20 1,45+0, 21*$ CMS034 0,5 μρ/Kg 20 1,37+0, 10*$ CMS034 0,5 μρ/Kg 20 1, 40+0, 13*$ CMS035 5 μg/Kg 20 1,46+0, 16*$ rhIL-2 3 x 105 UI/Kg 19 1,46+0,21* rmIFN-γ 3 x 105 UI/Kg 18 1,27+0,14 Ciclofosfamida 20 mg/Kg 19 1,01+2,23* Soro fisiológico 0,5 ml 20 1,25+0,07 comparação com 0 grupo do soro fisiológico, P<0,05 comparação com 0 grupo de ciclofosfamida, P<0,05

Observou-se que CMS010 a 500 μρ/Κρ/άί3, CMS019 a 0,5 μg/Kg/dia, CMS024 a 0,5 μg/Kg/dia e 5 μρ/Κρ^ί3, CMS035 89 ΡΕ1790655 a 0,5 μg/Kg/dia e 5 μg/Kg/dia são capazes de aumentar o índice de estimulação de linfócitos T, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05). 5. O efeito de péptidos na actividade de células NK em murganhos BALB/c com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado (Método 4.3)

Tabela IV. 5 0 efeito de péptidos no índice da actividade citotóxica de células NK

Grupo Dose N índice de actividade NK (%) CMS003 500 μq/Kq 17 37, 9+14, 5*Λ$ CMS014 0,5 μρ/Kg 17 40, 7+19, 7*$ CMS024 0,5 μρ/Kg 18 39,3+18, 7*$ CMS024 5 μρ/Kg 20 34,9+12,1*Λ$ CMS024 50 μρ/Kg 20 43,6+13, 9*Λ$& CMS032 5 μg/Kg 20 52,6+12, 5*Λ$& CMS032 50 μρ/Kg 19 41, 0+18, 7*Λ$& CMS034 50 μρ/Kg 20 57,3+17, 9*Λ$& IL-2 3 x 105 UI/Kg 19 26,0+9,0 IFN-γ 3 x 105 UI/Kg 18 20,9+3,3 Ciclofosfamida 20 mg/Kg 19 16,5+7,2* Soro fisiológico 0,5 ml 20 24,0+8,2 comparação com o grupo do soro fisiológico , Ρ<0,05 Λ: comparação com comparação com comparação com o grupo de IFN-γ, P<0,05 o grupo de IL-2, P<0,05 o grupo de ciclofosfamida, Ρ<0,05 90 ΡΕ1790655

Observou-se que CMS003 a 500 μg/Kg/clia, CMS014 a 0,5 μg/Kg/dia, CMS024 a 0,5 μg/Kg/clia, 5 μg/Kg/clia e 50 μ-g/Kq/dia, CMS032 a 5 μg/Kg/clia e 50 μg/Kg/clia e CMS034 a 50 μg/Kg/dia são capazes de aumentar a actividade citotóxica de células NK no modelo animal testado, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05). 6. O efeito de péptidos na sobrevivência de murganhos DBA/2 com leucemia Li2io transplantada (Método 5)

Tabela IV.6 0 efeito de péptidos no índice de sobrevivência de animais testados

Grupo Dose N Dias de sobrevivência índice de , vivência CMS019 0,5 μg/Kg 20 21,1+5,8* 26, 8 CMS035 0,5 μg/Kg 20 29,3+15,4* 76, 1 IL-2 3 x 105 UI/Kg 20 32,0+13,7* 92, 3 IFN-γ 3 x 105 UI/Kg 20 15,6+2,2 Ciclofosfamida 20 mg/Kg 20 24,0+5,3* 44, 2 Soro fisiológico 0,5 ml 21 16,6+5,3* comparaçao com o grupo do soro fisiológico, P<0,05

Observou-se que CMS019 a 0,5 μg/Kg/dia e CMS035 a 0,5 μρ/ί^/όί3 são capazes de prolongar a sobrevivência de murganhos DBA/2 com leucemia L1210 transplantada, tendo diferença estatisticamente significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05). 91 ΡΕ1790655 7. O efeito de péptidos na imunidade humoral de murganhos C57BL/6 com melanoma B16 transplantado (Método 6.1)

Tabela IV. 7 0 efeito de péptidos no índice de hemólise de murganhos C57BL/6 com melanoma B16 transplantado

Grupo Dose N índice de hemólise CMS 0 01 0,5 μq/Kq 20 51,0+16,2*$ CMS001 5 μq/Kq 20 41,3+17, 7*$ CMS 0 01 50 μq/Kq 19 45, 0+31,9*$ CMS 0 01 500 μq/Kq 20 36,0+10,2*$ CMS003 0,5 μq/Kq 20 61,6+26,9*$ CMS003 5 μq/Kq 20 37,2+15, 9*$ CMS003 50 μq/Kq 20 38, 7+13,5*$ CMS003 500 μq/Kq 20 35, 9+13,0*$ CMS 0 0 8 0,5 μq/Kq 19 42, 7+18, 4*$ CMS 0 0 8 5 μq/Kq 20 38,9+12,0*$ CMS 0 0 8 50 μq/Kq 20 37, 1+16, 7*$ CMS 0 0 8 500 μq/Kq 20 50,1+17, 8*$ CMS 010 0,5 μq/Kq 18 34, 9+10,5*$ CMS 010 5 μq/Kq 20 51,0+14,6*$ CMS 010 50 μq/Kq 20 39,6+7, 7*$ CMS 010 500 μq/Kq 20 50,1+16, 7*$ CMS 011 0,5 μq/Kq 20 32,0+14,7* CMS011 500 μq/Kq 20 34,4+19,4* CMS016 500 μq/Kq 20 43,3+29,9* 92 ΡΕ1790655 (continuação)

Grupo Dose N índice de hemólise CMS019 0,5 μρ/Kg 20 42, 0+12,0*$ CMS 019 5 μρ/Kg 20 35, 4+15, 1*$ CMS 019 50 μρ/Kg 20 28,3+7,6* CMS 0 2 4 0,5 μρ/Kg 20 43,0+10, 7*$ CMS 02 4 5 μρ/Kg 20 42,2+11, 8*$ CMS 0 2 4 50 μρ/Kg 20 27,8+9,1* CMS 0 2 4 500 μρ/Kg 18 30,1+10,0* CMS 034 0,5 μρ/Kg 18 50,8+18, 4*$ CMS 034 5 μρ/Kg 19 43,0+11, 7*$ CMS 034 50 μρ/Kg 20 30,2+10,9* CMS 035 5 μρ/Kg 20 38,9+21,2*$ CMS 035 50 μρ/Kg 20 44, 7+22, 7*$ CMS 035 500 μρ/Kg 19 40,5+25,8* rhIL-2 3 x 105 UI/Kg 19 49,3+24,7* rmIFN-γ 3 x 105 UI/Kg 19 60,5+17, 4* Ciclofosfamida 20 mg/Kg 19 20,7+19,1 Soro fisiológico 0,5 ml 20 19,0+9,1 comparação com 0 grupo do soro fisiológico, P<0,05 Λ: comparação com comparação com comparação com 0 grupo de IFN-γ, P<0,05 0 grupo de IL-2, P<0,05 0 grupo de ciclofosfamida, P<0,05

Observou-se que CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034 e CMS035 são capazes de aumentar a resposta humoral (aumento do Índice de hemólise) de murganhos C57BL/6 com melanoma B16 nas dosagens mostradas na Tabela IV.7, tendo diferença estatisticamente 93 ΡΕ1790655 significativa relativamente ao grupo de soro fisiológico (P<0,05). 8. O efeito de péptidos na sobrevivência de células de melanoma B16 inoculadas em murganhos C57BL/6 (Método 6.2) A avaliação post mortem de animais, após terminado o tratamento com a substância a testar, não revelou qualquer sinal da existência de focos metásticos B16 no pulmão de murganhos tratados com CMS008 a 0,5 μg/Kg/dia, 5 μg/Kg/dia e 50 μg/Kg/dia e CMS016 a 5 μς/Κς e 500 μg/Kg/dia. II. Conclusão

De acordo com as Orientações da Pesquisa Pré-clinica de Novos Fármacos publicadas pelo "Branch of Drug Administration", Department of Health, RP da China em 1993, foram estudados os efeitos de péptidos em murganhos com células de cancro transplantadas. Concluiu-se que 1. CMS010, CMS034 e CMS035 em dosagem adequada podem inibir significativamente o desenvolvimento de sarcoma Siso transplantado em murganhos; 2. CMS 0 01 e CMS034 em dosagem adequada podem aumentar as actividades imunes fagociticas de murganhos com sarcoma Siso transplantado; 94 ΡΕ1790655 3. CMS008, CMS011, CMS024 e CMS032 em dosagem adequada podem prolongar a sobrevivência de murganhos com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado; 4. CMS0010, CMS019, CMS024, CMS034 e CMS035 em dosagem adequada podem aumentar a transformação de linfócitos T em murganhos com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado; 5. CMS003, CMS014, CMS024, CMS032 e CMS034 em dosagem adequada podem aumentar a actividade citotóxica de células NK em murganhos com cancro do fígado H22 tipo fluido ascítico transplantado; 6. CMS019 e CMS035 na dosagem adequada podem prolongar a sobrevivência de murganhos com leucemia L210 transplantada; 7. CMS008 e CMS016 na dosagem adequada podem o desenvolvimento de melanoma B16 transplantado em murganhos; 8. CMS 0 01, CMS 0 03, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034 e CMS035 em dosagem adequada podem aumentar a resposta imune humoral de murganhos transplantados com melanoma B16.

Discussão CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, CMS035 podem ser 95 ΡΕ1790655 úteis como parte, ou por si sós, no tratamento de cancro no Homem. Por exemplo, CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034 e CMS035 podem ser usados para aumentar a imunidade de doentes com cancro. CMS008, CMS010, CMS016, CMS034 e CMS035 podem ser usados para interferir com o crescimento de células cancerosas em doentes. CMS008, CMS011, CMS019, CMS024, CMS032 e CMS035 podem ser usadas para prolongar a esperança de vida de doentes com cancro. Os péptidos podem ser usados por si sós, em combinações de dois ou mais péptidos ou em combinação com outros fármacos ou suplementos alimentares para o tratamento de cancro.

Tabela IV.8 Péptidos eficazes contra o cancro Código de CMS SEQ ID NO. CMS 0 01 1 CMS003 27 CMS008 3 CMS010 4 CMS011 30 CMS 14 7 CMS016 9 CMS019 11 CMS024 16 CMS032 22 CMS034 24 CMS035 25 96 ΡΕ1790655

Referências 1. Principies of Pre-clinical Research of New

Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:137-143 2. Principies of Pre-clinical Research of New

Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:128-129 3. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138. 4. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234. 5. Principies of Pre-clinical Research of New

Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:140 6. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction methid testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6):356-358 7. Yaoqin Yang, Huchuan Yang, Huihong Tao, et al., The synergic effect of Tween-80 on the antitumor of hypertermia-Experimental studies of mouse melanoma. Câncer research on Prevention and treatment. 1999, 26(4):8-12 8. Jian Fu, Jie Zheng, Weigan Fang, et al. 97 ΡΕ1790655

Interleulin-12 gene transfection into murine B16 melanoma cells suppresses tumorigenicity and decreases metastatic potential. National Medicai Journal of China. 1998, 78(8):627-629 9. Qian Wang. Modern medicai experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483. 10. Qichao Pan, Nin Xu. Câncer pharmacology and chemotherapy. Henan Medicai University Publishing House. 2000, 66-69 11. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 131. A utilização dos péptidos atrás identificados em formulações farmacêuticas pode ser empregue como possível tratamento para alterações imunológicas ou doença tendo efeito secundário na imunidade, e.g. cancro. As formulações podem conter os péptidos misturados com outros constituintes activos ou inactivos, incluindo outros péptidos, por exemplo dois ou mais (e.g., 3-5) dos péptidos referidos podem ser adicionados à mesma formulação, com ou sem outros ingredientes. Como alternativa, o péptido pode ser usado para preparar a formulação juntamente com péptidos não referidos aqui. Podem ser administrados na forma intravenosa, intramuscular, intracutânea, subcutânea ou intra-dérmica. O modo de administração pode ser igualmente 98 ΡΕ1790655 injecção intra-arterial, a qual conduz directamente ao órgão atingido. Outros modos de administração são o transdérmico, inalação como pó ou spray, e outras formas de libertação conhecidas na área. A formulação pode ser tomada oralmente e pode conter veículos que podem ser usados para prevenir a digestão gástrica do péptido após ingestão oral ou quaisquer outros veículos conhecidos na área (para formulação transdérmica como seja em lipossomas). A formulação farmacêutica pode incluir qualquer um dos veículos farmacêuticos conhecidos. Exemplos de veículos adequados incluem qualquer um dos veículos farmaceuticamente aceitáveis convencionais conhecidos dos familiarizados com a matéria. Estes incluem, mas não estão limitados a solução de soro fisiológico, água, emulsões, incluindo misturas de óleo e água ou emulsões de triglicéridos e outros tipos de agentes, agentes de enchimento, comprimidos revestidos e cápsulas. 0 veículo adequado pode ser seleccionado com base no modo de administração da composição farmacêutica. 0 péptido pode ser administrado por injecção intravenosa, injecção intramuscular, injecção intraperi-toneal, injecção subcutânea e implantes subcutâneos. Os péptidos podem também ser administrados em qualquer forma de administração oral tipo comprimido, cápsula, suspensão, solução, etc, na forma usual sem modificação ou na forma de libertação controlada, ou com ou sem protecção gastro-enté- 99 ΡΕ1790655 rica. O péptido pode ainda ser aplicado em qualquer forma de aplicação tópica tipo pomada, creme, gel, etc., com ou sem um sistema que facilite a administração transdérmica. 0 péptido pode também ser transformado na sua sequência genética e clonado num sistema de expressão, por si só ou em combinação com outras sequências peptídicas, para gerar uma molécula peptídica resultante para fazer uso da actividade do péptido como descrito nesta descrição. A dose de cada péptido pode ser 1 ng - 10 g por Kg de peso de corpo. Uma dose preferida é 10 ng - 10 mg por Kg, e mais preferencialmente 1 μρ - 1 mg por Kg para injecção como modo de administração. No entanto, a dose eficaz pode ser tão baixa quanto 1 ng por Kg por peso de corpo, uma vez que um ou mais dos péptidos podem operar através de receptores que induzirão uma cascata de resposta fisiológica normal. Como alternativa, um ou mais péptidos podem ser apenas um iniciador para uma cascata global de reacção global. Para ingestão oral, a quantidade pode ser 1 ng - 10 g por dia por Kg de peso de corpo, mais de preferência 0,1 μρ - 1 g por dia por Kg de peso de corpo e mesmo, mais de preferência 1 μρ 10 mg por dia.

V. O EFEITO NO PESO DO CORPO

Murganhos saudáveis foram alimentados com uma dieta de elevado valor nutritivo durante 5 semanas, com ou sem tratamento simultâneo com péptido (intramuscular 300 100 ΡΕ1790655 μg/Kg/dia). Os ratos numa dieta normal com injecção de soro fisiológico foram usados como controlo negativa. Após 5 semanas de tratamento, a injecção foi parada e a mesma dieta foi mantida durante mais três semanas. Os dados sobre o peso do corpo foram colhidos uma vez por semana. O comportamento dos ratos foi igualmente observado. Observou-se que os ratos que receberam o péptido CMS015 possuíam, de forma estatisticamente significativa, peso do corpo mais baixo comparativamente com o controlo no decurso do tratamento com o péptido. Esta tendência de decréscimo do peso do corpo foi gradualmente reduzida após cessação do tratamento com CMS015. Concluiu-se que CMS015 num nível de dosagem adequado pode controlar de forma reversível o desenvolvimento de obesidade induzido por excesso de alimentação.

Materiais

Ratos Sprague-Dawley (SD) , com 145+10 g de peso, foram fornecidos pelo Center of Exeperimental Animal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, PR China (certificado N°: 2000A019). Os péptidos (com L-aminoácidos) foram sintetizados pela American Peptide Company, Inc., USA, e foram diluídos para 10 μρ/ιηΐ em soro fisiológico normal. As dietas com valor nutritivo elevado e normal foram preparadas de acordo com as orientações de pesquisa pré-clínica de fármacos anti-obesidade, publicado pela DAS (State Drug Administration) , PR China[1] . 101 ΡΕ1790655 Métodos

Ratos saudáveis foram distribuídos ao acaso por grupos do fármaco a testar, controlo positivo e controlo negativo. 10 ratos por grupo, metade machos e metade fêmeas. O grupo de ratos do fármaco a testar foi alimentado com um dieta de elevado valor nutritivo durante 5 semanas com injecção intramuscular simultânea de 300 μg/Kg/dia de péptido, uma vez por dia. O grupo controlo positivo recebeu a mesma dieta nutritiva mas injecção do soro fisiológico placebo, enquanto o grupo controlo negativo, usado para demonstrar o estabelecimento bem sucedido do modelo de obesidade, recebeu uma dieta nutritiva normal e injecção de soro fisiológico placebo. Após 5 semanas de tratamento, foram paradas as injecções e a mesma dieta foi mantida durante mais 3 semanas. Os ratos foram pesados uma vez por semana. O comportamento dos ratos foi igualmente observado.

Estatística

Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. Para a comparação intergrupos e intragrupos foi usado o teste t pareado ou ANOVA simples. O limiar de significância estatística foi em P<0,05.

Resultados

1. Efeito do péptido no peso corporal de ratos SD 102 ΡΕ1790655

Tabela V.l Efeito do péptido no peso corporal de ratos SD

Grupo Controlo Positivo (g) Grupo tratamento CMS015 (g) Machos n=5 Fêmeas n=5 Machos n=5 Fêmeas n=5 Pré-tratamento 145,6 ± 13,6 133,6 ± 4,6 145,6 ± 8,5 129,2 ± 3,3 Semana 1 194,4 ± 14,5 164,4 ± 8,7 183,8 ± 10,6 157,8 ± 8,3 Semana 2 239,6 ± 13,4 188,0 ± 6,4 220,6 ± 12,2 176,0 ± 11,2 Semana 3 265,0 ± 11,8 208,8 ± 8,2 239,0 ± 16,0 196,0 ± 10,5 Semana 4 287,4 ± 17,7 227,2 ± 8,2 258,2 ± 18,1 212,0 ± 13,5 Semana 5 299,4 ± 21,2 236,6 ± 10,9 268,8 ± 17,7 221,4 ± 13,2 Semana 6 333,4 ± 27,1 249,4 ± 16,3 299,4 ± 21,2 235,6 ± 16,3 Semana 7 349,2 ± 13,4 310,4 ± 25,9 242,2 ± 25,9 242,2 ± 18,8 Semana 8 374,4 ± 37,2 255,6 ± 11,5 337,4 ± 30,6 252,8 ± 22,5 Comparativamente com o grupo controlo positivo; p<0,05

Na dose de 300 \iq/Kq/ú\ei, encontrou-se que CMS015 é capaz de militar o aumento de peso dos ratos com obesidade induzido por excesso de alimentação, tendo diferença estatisticamente significa relativamente ao grupo controlo (p<0,05). A diferença entre os grupos controlo e de tratamento aumentou com a duração do tratamento. Quando da cessação do tratamento com o péptido CMS015 no grupo de tratamento, a diferença entre os grupos de tratamento e controlo reduziu gradualmente e tornou-se estatisticamente insignificante após três semanas, mostrando que o efeito do péptido no peso do corpo dos ratos SD é reversivel.

Durante toda a experiência, observou-se que o apetite e actividade de todos os grupos de ratos se mantiveram normais. 103 ΡΕ1790655

Concluiu-se que CMS015 num nível de dosagem adequado pode limitar o desenvolvimento de obesidade induzida por excesso de alimentação. 0 péptido poderá ser usado com seres humano para controlo da obesidade. Os péptidos podem ser usados por si sós, em combinações de dois ou mais péptidos, ou combinados com outros fármacos ou suplementos alimentares como um todo para a gestão de obesidade.

No presente estudo, foi testada a administração por injecção intramuscular, mas esta não exclui a possível eficácia do péptido quando administrado por outras vias alternativas. Os péptidos podem ser administrados por injecção intravenosa, injecção intramuscular, injecção intraperitoneal, injecção subcutânea e implantação subcutânea, com ou sem um sistema que facilitador da entrega, como sejam lipossomas, protecção com libertação controlada, etc. 0 péptido pode também ser administrado em qualquer forma de administração oral como sejam comprimidos, cápsulas, suspensões, soluções, na forma habitual sem modificação ou na forma de libertação controlada ou com ou sem protecção gastroentérica. 0 péptido pode ainda ser aplicado em qualquer uma das formas para aplicação tópica como seja pomada, creme, gel, etc, com ou sem um sistema facilitador transdérmico, ou como inalador de pó, dissolvido ou como forma protegida por lipossoma. 0 péptido pode também ser interpretado como a sua sequência genética e clonado num sistema de expressão, por si só ou em 104 ΡΕ1790655 combinação com outras sequências peptidicas, para gerar uma molécula peptídica resultante que utiliza a actividade do péptido como descrito nesta descrição, com ou sem purificação do péptido resultante.

Tabela V.2 Péptidos eficazes contra a obesidade Código CMS SEQ ID NO: CMS015 8

Referências 1. DAS, PR China. The guideline for pré-clinical research of new drugs. 1993 "Péptido substancialmente puro" refere-se a péptidos que são pelo menos 10% p/p puros, mais de preferência 20%, mesmo mais preferencialmente 40% e muito mais de preferência 60% e de longe muito mais de 90% puro. Na realização mais preferida, a pureza é superior a 99%.0 péptido substancialmente puro pode ser usado para preparar formulações farmacêuticas e nutritivas que podem ser misturas complexas como descrito abaixo. A utilização do péptido atrás referido em formulações farmacêuticas podem ser empregues como possível tratamento de perturbações ou doenças imunológicas tendo efeito secundário na imunidade e.g. cancro ou infecções ou qualquer uma das condições atrás referidas. As formulações 105 ΡΕ1790655 podem conter o péptido misturado com outros constituintes activos ou inactivos, incluindo outros péptidos, e.g. dois ou vários (e.g. 3-5) dos péptidos atrás apresentados podem ser adicionados à mesma formulação com ou sem outros ingredientes. Como alternativa, o péptido pode ser usado para preparar a formulação conjuntamente com péptidos não apresentados aqui. Eles podem ser administrados na forma intravenosa, intramuscular, intracutânea, subcutânea ou intradérmica. O modo de administração pode também ser injecção intra-arterial que leva directamente ao órgão do problema. Outros modos de administração são a transdérmica, inalação de pó ou spray e outras formas de entrega conhecidas dos familiarizados com a matéria. A formulação pode também ser tomada oralmente e pode conter outros veículos que podem ser usados para evitar a digestão gástrica do péptido após ingestão oral ou quaisquer outros veículos conhecidos na área (para a administração transdérmica, como sejam lipossomas) A formulação farmacêutica pode incluir qualquer um dos veículos farmacêuticos conhecidos. Exemplos de veículos adequados incluem qualquer um dos veículos convencionais farmaceuticamente aceites conhecidos dos familiarizados com a matéria. Estes incluem mas não estão limitados a solução de soro fisiológico, água, emulsões, incluindo misturas de óleo e água ou emulsões de triglicéridos e outros tipos de agentes, agentes de enchimento, comprimidos revestidos e cápsulas. O veículo adequado pode ser seleccionado com base no modo de administração da composição farmacêutica. 106 ΡΕ1790655 O péptido pode ser administrado via injecção intravenosa, injecção intramuscular, injecção intraperi-toneal, injecção subcutânea e implantação subcutânea. O péptido pode ser também administrado em qualquer forma de administração oral, como sejam comprimidos, cápsulas, suspensões, soluções, etc., na forma usual sem modificação ou na forma de libertação controlada ou com ou sem protecção qastro-entérica. O péptido pode ainda ser aplicado em qualquer forma de aplicação tópica tipo pomada, creme, gel, etc. com ou sem sistema facilitador transdérmico. O péptido pode também ser interpretado na sua sequência genética e clonado num sistema de expressão, por si só ou em combinação com outras sequências peptidicas, para gerar uma molécula peptídica resultante que utiliza a actividade do péptido como descrito nesta descrição. A dose de cada péptido pode ser 1 ng-10 g por Kg de peso de corpo. Uma dose preferida é 10 ng-10 mg por Kg, e mais de preferência 1 μρ-l mg por Kg para um modo de administração por injecção. No entanto, a dose eficaz pode ser tão baixa quanto 1 ng por Kg de peso do corpo, uma vez que um ou mais dos péptidos pode operar através de receptores que induzirão uma cascata de resposta fisiológica normal. Como alternativa, um ou mais dos péptidos pode ser um iniciador para a totalidade de uma cascata de reacções. Para uma ingestão oral, a quantidade pode ser 1 ng-lOg por dia por Kg de peso de corpo, mais de preferência 0,1 pg-lg por dia por Kg de peso de corpo e mesmo mais de preferência 1 μρ-10 mg por dia. 107 ΡΕ1790655 VI. Terapia génica e método de tratamento A terapia génica baseada na descoberta de sequências peptídicas é realizada através da projecção de uma sequência de ácido nucleico que codifique o péptido. O ácido nucleico pode ser sintetizado quimicamente e ligado operacionalmente a um promotor e clonado num vector de expressão. 0 vector de expressão foi então administrado no corpo humano como forma de terapia génica para a expressão na célula humana. 0 termo "vectores genéticos" como aqui usado inclui estes vectores de expressão. Os vectores que podem ser usados para terapia genica incluem virus adeno-associados (Mizuno M. et al., (1998). Jpn J Câncer Res 89, 76-80), vectores LNSX (Miller, A.D. et al., (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) e lentivirus (Goldman, M.J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268).

Outros veículos para a administração de péptidos incluem vectores de expressão codificadores do péptido pretendido que podem ser transferidos para um organismo e que se podem replicar no organismo hospedeiro a que se pretende administrar o péptido, sem efeitos prejudiciais significativos na saúde do organismo hospedeiro. Por exemplo, os vectores de expressão podem ser transferidos para um organismo que não seja patogénico para o organismo hospedeiro a que se pretende administrar o péptido. 0 vector de expressão produz o péptido pretendido num organismo bacteriano ou fúngico que não tenha efeitos 108 ΡΕ1790655 secundários na saúde do organismo hospedeiro a que administra o péptido. Por exemplo, o vector de expressão codificador do péptido pretendido pode ser um vector de expressão que produz o péptido pretendido num organismo como sejam bactérias do ácido láctico, E. coli ou levedura. O vector de expressão produz o péptido pretendido num microrganismo normalmente encontrado no tubo digestivo de mamífero ou um microrganismo tolerado pelo tubo digestivo de mamífero. Algumas das espécies microbianas em que o péptido pretendido pode ser expresso incluem, mas não estão limitadas a espécies de Lactobacillus, tais como L. acidophillus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus ou outros; espécies de Bifidobacterium, tais como B. adolescentis, B. animalus, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum ou outros; Enterococcus faecalis ou Ent. facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus sutilis ou Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibecterium freudenreichii; ou Saccharomyces cerevisiae ou Sacharomyces boulardii.

As sequências de ácido nucleico que codificam o péptido do presente invento, obtidas por síntese química ou produzidas por outros meios, incluindo mas não estando limitado a transcrição reversa de mRNA para produzir moléculas de cDNA, são introduzidas em vectores de expressão para a transferência de genes para os organismos pretendidos pelos métodos de engenharia genética conhecidos dos familiarizados com a matéria. Os vectores de expressão 109 ΡΕ1790655 podem ser vectores de DNA ou vectores de RNA. Por exemplo, os vectores de expressão podem ser baseados em plasmídeo ou em elementos genéticos virais. Os vectores de expressão podem ser vectores que se replicam extracromossomicamente ou vectores que se integram no cromossoma.

Os vectores de expressão compreendem um promotor ligado operacionalmente a um ácido nucleico codificador de um péptido do presente invento. 0 promotor pode ser um promotor regulável, como seja um promotor induzivel ou um promotor constitutivo. Nalgumas realizações, o promotor pode ser seleccionado para proporcionar um nível pretendido de expressão do péptido. Ainda, caso se pretenda, os vectores de expressão podem compreender outras sequências para promover a produção, apresentação e/ou secreção de péptidos. Nalgumas realizações, um ácido nucleico codificador de um péptido do presente invento é ligado operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que dirige a secreção do péptido. Por exemplo, o ácido nucleico codificador do péptido do presente invento pode ser operacionalmente ligado a um ácido nucleico codificador de um péptido sinal.

Nalgumas realizações, os vectores de expressão que são manipulados para codificarem o péptido do presente invento podem ser vectores de expressão adaptados para a expressão do péptido do presente invento numa espécie bacteriana que faça arte da flora normal de mamíferos, tais como espécies de Lactobacillus e Bacillus subtilis. 110 ΡΕ1790655

Exemplos de tais vectores de expressão podem ser encontrados nas Patentes U.S. N° 6100388, de Casas e N° 5728571, de Bellini, respectivamente. Estes documentos são assim expressamente incorporados como referência na sua totalidade. Será óbvio que pode ser usado qualquer vector de expressão que facilite a expressão de um péptido do presente invento num organismo que não seja prejudicial para a saúde do organismo hospedeiro a que se administra o péptido.

Nalgumas realizações, os vectores de expressão que são manipulados para codificarem o péptido do presente invento podem ser vectores de expressão que sejam adequados à expressão do péptido do presente invento numa espécie de levedura que seja bem tolerada pelo tubo digestivo do mamífero, como seja Saccharomyces cerevisiae; ou, de preferência, Saccharomyces boulardii, que pode colonizar o tubo digestivo humano e que é usada para tratar determinadas formas de diarreia. Podem ser usados os vectores de expressão de levedura que constitutivamente expressem proteínas e péptidos heterólogos, são altamente estáveis, sendo portanto bem transmitidos às células filhas durante a mitose e a meiose e podem compreender a sequência codificadora de um péptido sinal ou péptidos que dirigem níveis elevados de secreção da proteína recombinante. Um exemplo de tal vector de levedura está apresentado na Patente US N° 6391585 de Jang et al.

Os vectores de expressão codificadores do pétido 111 ΡΕ1790655 do presente invento podem ser introduzidos no organismo em que se pretende que sejam expressos os péptidos através de técnicas conhecidas na área. Estas técnicas incluem métodos tradicionais de transformação de bactérias, leveduras ou outros microrganismos, através da utilização de células bacterianas quimicamente competentes, electroporação ou transformação com acetato de lítio (para levedura) por exemplo, assim como avanços recentes na transformação de espécies bacterianas resistentes à transformação por estas técnicas. Os vectores de expressão são introduzidos nas bactérias do ácido láctico conhecidas como sendo difíceis de transformar usando o método descrito por Leer et ai. (WO 95/35389). As sequências introduzidas podem ser inseridas no DNA cromossómico microbiano ou podem permanecer como elementos de DNA extracromossómico.

Este microrganismo geneticamente manipulado contendo o vector de expressão pode então ser inoculado no canal alimentar, vagina, traqueia, etc. para se conseguir imunoterapia controlada. Os organismos que expressam os péptidos são ingeridos numa forma inactiva ou, de preferência, na forma viva. No tubo digestivo, estes microrganismos produzem os referidos péptidos, libertam-nos para o lúmen através de secreção ou através de lise dos microrganismos ou de outra forma apresentam os péptidos ao hospedeiro, pelo que os péptidos produzem o seu efeito pretendido no organismo hospedeiro. Os péptidos são apresentados ao hospedeiro na membrana mucosa das passagens nasais, vagina ou do intestino delgado. 112 ΡΕ1790655

Um outro método do tratamento é a utilização de lipossomas como meio de introduzir o ácido nucleico específico nas células do corpo humano. 0 ácido nucleico (como seja um vector de expressão contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica péptidos da sequência ID N° 16) é lançado num ambiente que estimula a internalização celular e a incorporação cromossómica como descrito em Gao, X. e Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 e US 6207456.

Como alternativa, o próprio péptido pode ser encapsulado no lipossoma e libertado directamente, usando um método descrito em US 6245427.

As sequências de ácido nucleico úteis para a terapia génica atrás referida e o método de tratamento incluem sequências que codificam este péptido. Pode ser usada qualquer uma das numerosas sequências de ácido nucleico para codificar este péptido baseado no sistema de codões degenerados.

Referências: 1. Principies of Prec-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:134-135 2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Republic of China. 1991, 1221-1234 113 ΡΕ1790655 3. Principie of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7:140 4. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction methid testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6):356-358 5. Qian Wang. Modern medicai experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483. 6. Principie of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7:141 issued 7. Principie by Ministry of of new Health, drug research in pre-clinic People's Republic of China. 1993, 7:132-133 issued 8. Principie by Ministry of of new Health, drug research in pre-clinic People's Republic of China. 1993, 7:128-129 9. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138. 10. Jiatai Li, Clinicai Pharmacology (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 1338- 1339 . ΡΕ1790655 114 EXEMPLO 1

Administração de péptidos através de espécies bacterianas de Lactobacillus manipuladas geneticamente

Segue-se a exemplificação de um método para administrar o péptido usado neste invento a um hospedeiro, como descrito atrás. Uma sequência de DNA que codifica o péptido foi sintetizada por métodos químicos e a sua sequência de DNA foi inserida num vector de expressão usando técnicas convencionais de engenharia genética, conhecidas dos familiarizados com a área. 0 vector de expressão seleccionado contem um promotor constitutivo funcional em Lactobacilli, um local de clonagem múltipla para a introdução de sequências de DNA numa orientação 5' para 3' especifica, assim como uma marca seleccionável que confere resistência a um antibiótico (para ajudar nos procedimentos de clonagem) e pode compreender outras sequências que ajudem a produção e/ou secreção dos péptidos, tais como sequências de péptidos sinal. A Patente US N° 5592908 de Pavla proporciona um exemplo de tal vector. Resumidamente, esta patente discute vários promotores conhecidos que funcionam em espécies de Lactobacillus, assim como um método para a descoberta de novos promotores nas referidas bactérias, qualquer um deles pode ser ligado operacionalmente a um ácido nucleico codificador de um péptido usado no presente invento para expressar o péptido em Lactobacilli. Um ácido nucleico 115 ΡΕ1790655 codificador de um péptido sinal, como sejam péptidos compreendendo 16 a 35 dos aminoácidos mais hidrofóbicos que são activos em Lactobacillus lactis descritos na Patente US N° 5529908, referido atrás, é interposto entre o promotor e o ácido nucleico codificador do péptido usado no presente invento, de forma que o ácido nucleico codificador do péptido sinal fique na mesma grelha de leitura aberta do ácido nucleico codificador do péptido.

Para além da sequência codificadora do péptido, a sequência de DNA sintetizada pode compreender sequências que ajudem na ligação e clonagem do referido DNA no vector de expressão. Por exemplo, os locais de reconhecimento por enzimas de restrição que correspondem aos encontrados no local de clonagem múltipla do vector podem ser incorporados no DNA sintetizado nos extremos 5' e 3' da sequência, de forma que a sequência seja clonada na orientação adequada dentro do vector. Tanto o vector como o DNA sintetizado foram digeridos com as enzimas de restrição particulares, depois purificados. As reacções de ligação com o vector e o DNA sintetizado foram seguidas de transformação numa estirpe adequada de E. coli. As bactérias transformadas foram semeadas em meio contendo o antibiótico ao qual o vector confere resistência. Uma colónia de bactérias transformadas foi seleccionada para crescimento de culturas e para procedimentos de plasmídeos; a presença do DNA sintetizado na orientação correcta foi confirmada. 116 ΡΕ1790655

Este vector de expressão foi então usado para transformar uma célula hospedeira bacteriana de uma espécie de Lactobacillus, como seja L. lactobacillus. As células transformadas foram seleccionadas de acordo com a marca seleccionável encontrada na sequência do vector e a secreção do péptido pode ser verificada realizando uma transferência Western em membranas, electroforese em gel dos péptidos presentes no meio de crescimento ou outras técnicas convencionais. Uma colónia de bactérias transformadas foi escolhida e usada para preparar culturas em larga escala das bactérias geneticamente manipuladas. Uma cultura das bactérias geneticamente manipuladas expressando o péptido pretendido foi crescida e pelo menos uma porção da mesma foi administrada ao tubo digestivo, vagina, traqueia ou outra área do organismo hospedeiro em que as bactérias são capazes de se replicar. Caso se pretenda, as culturas bacterianas podem ser tratadas numa variedade de formas para produzir um suplemento para consumo entérico pelo hospedeiro. Estes tratamentos incluem liofilização ou outros métodos de preservação das bactérias, para além da combinação de bactérias com agentes veículos, tais como soluções, solventes, meios de dispersão, agentes de libertação, emulsões e similares. A utilização destes agentes para preparar suplementos é conhecida na área. Por exemplo, a bactéria pode ser usada para preparar produtos lácteos ou outros produtos alimentares para consumo humano, de forma que o organismo expressando o péptido colonize o tubo digestivo do organismo hospedeiro. Uma série de métodos diferentes para 117 ΡΕ1790655 incorporação de estirpes especificas de bactérias do ácido láctico em alimentos, tais como iogurte, legumes fermentados coreanos, queijo e manteiga estão descritos na Patente US N° 6036952 de Oh. Quando do consumo das bactérias através de qualquer uma de uma série de vias, os organismos manipulados podem colonizar o tubo digestivo e permitir a apresentação e/ou absorção dos péptidos deste invento ao nivel da camada mucosa do tubo digestivo. EXEMPLO 2

Administração de péptidos através de uma forma geneticamente manipulada de Bacillus subtilis

Proporciona-se a seguir um exemplo de outro método para administrar o péptido útil neste invento num hospedeiro, como descrito atrás. Uma sequência de DNA que codifica o péptido foi sintetizada por meios químicos e esta sequência de DNA foi inserida num vector de expressão através de técnicas de manipulação genética, todas as técnicas sendo conhecidas na área. 0 vector de expressão seleccionado compreende um vector vai-vem, como seja pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ) , capaz de ser propagado em E. coli e B. subtillis e contendo um gene de resistência a antibióticos para selecção das colónias de bactérias transformadas. Este vector pode conter um promotor constitutivo activo em B. subtillis, como seja um promotor derivado do gene Sac B de B. subtillis assim como uma 118 ΡΕ1790655 sequência nucleotídica codificadora de um péptido sinal activo em B. subtillis que dirige a exportação eficiente de proteínas heterólogas expressas a partir da célula bacteriana. Um exemplo de tal vector está descrito na Patente US N° 6268169 de Fahnestock. Resumidamente, como detalhado atrás, o DNA codificador de um péptido será sintetizado com locais para enzimas de restrição e/ou outras sequências para facilitar a clonagem do DNA através de técnicas conhecidas dos familiarizados com a matéria. Após transformação de E. coli, sementeira, selecção e propagação do plasmídeo para criar um stock de plasmídeo, o plasmídeo foi então usado para transformar B. subtillis e os transformantes seleccionados relativamente à resistência a um antibiótico no meio de cultura. A produção de péptidos em B. subtillis geneticamente manipulados e a sua secreção foi verificada por técnicas conhecidas dos familiarizados com a matéria, tais como marcação radioactiva dos péptidos para detecção autor-radiográfica após análise por SDS-PAGE ou transferência Western.

Uma cultura de bactérias geneticamente manipuladas foi crescida e pelo menos uma porção da mesma administrada no canal alimentar, vagina, traqueia ou outra área do organismo hospedeiro em que as bactérias são capazes de se replicarem. ΡΕ1790655 119 EXEMPLO 3

Administração de péptidos através de espécies da levedura Saccharomyces manipuladas geneticamente

Segue-se um outro exemplo de um método para administrar o péptido usado neste invento a um hospedeiro como descrito atrás. Uma sequência de DNA que codifica o péptido foi sintetizada por meios químicos e esta sequência de DNA foi inserida num vector de expressão através de técnicas de engenharia genética, todas as técnicas sendo conhecidas na área. 0 vector de expressão seleccionado compreende um vector de expressão de proteínas estavelmente mantido em leveduras, compreendendo um promotor constitutivo de levedura como seja pADHl, locais para a replicação do vector em leveduras e em E. coli, um gene ou genes que conferem prototrofia a um mutante de levedura auxotrófico para fins de selecção, um local de clonagem múltiplas (MCS) e, caso se pretenda, sequências que codificam um péptido sinal. Vectores tais como este podem ser comprados e são bem conhecidos na área ou podem ser facilmente construídos usando técnicas convencionais. Após inserção do DNA sintetizado no vector de levedura, transformação de E. coli, sementeira de E. coli transformada em meio selectivo, selecção de uma colónia bacteriana transformada e preparação de DNA de plasmídeo a partir de uma cultura de bactérias da referida colónia, o vector foi usado para transformar Saccharomyces cerevisiae através de técnicas bem conhecidas, tais como transformação 120 ΡΕ1790655 com acetato de lítio ou por electroporação. A estirpe de Saccharomyces cerevisiae seleccionada para transformação é uma estirpe mutante auxotrófica que requer um gene no plasmideo para crescer em placas de meio mínimo. As colónias de levedura transformadas foram isoladas através de sementeira das leveduras em meio de crescimento sem o gene presente no vector. Apenas as leveduras que receberam o vector e o seu gene selectivo e que expressam o produto do gene serão capazes de crescer e originar colónias no meio mínimo. A verificação da secreção do péptido pode ser conseguida fazendo transferência Western em membrana, realizando electroforese em gel dos péptidos presentes no meio de crescimento ou outras técnicas convencionais.

Uma colónia transformada de levedura foi escolhida e usada para preparar culturas em larga escala. Uma cultura de levedura manipulada geneticamente expressando o péptido pretendido foi crescida e pelo menos uma porção foi administrada ao tubo digestivo, vagina, traqueia ou outra área do organismo hospedeiro em que as bactérias são capazes de se replicarem. Caso se pretenda, as culturas de levedura podem ser tratadas numa variedade de formas para produzir um suplemento para consumo entérico pelo hospedeiro. Estes tratamentos incluem liofilização ou outros métodos de preservação de leveduras, para além da combinação das bactérias com outros agentes veículo, tais como soluções, solventes, meios de dispersão, agentes de retardação, emulsões e similares. A utilização destes agentes para preparar suplementos é bem conhecida na área. 121 ΡΕ1790655 A levedura transformada pode também ser usada na criação de produtos alimentares, tais como produtos lácteos fermentados, como seja iogurte e quefir, por técnicas conhecidas dos familiarizados com a matéria. Tal como as culturas bacterianas do ácido láctico nestes alimentos, as leveduras transformadas colonizam o tubo digestivo pelo menos transitoriamente e servem para apresentar péptidos ao hospedeiro através do lúmen intestinal.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> CMS Peptides Patent Holding Company Limited <120> PÉPTIDOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS

<130> PO01.03DIVEP <150> 10/237,405 <151> 2001-07-13 <150> 10/178,684 <151> 2002-06-20 <150> 09/904,492 <151> 2001-07-13 <160> 30 <170> Patentln Versão 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 1

Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe 15 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 2 ΡΕ1790655 122

Vai Vai Tyr Pro Trp Thr Gin Arg Phe 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 3

Lys Ala Vai Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu 15 10 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 4

Vai Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn 15 10 15

Pro Lys <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 5

Leu Gly Met Glu Ala Cys Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr 15 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 6

Leu Arg Vai Ala Pro Glu Glu His Pro Vai Leu 15 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 7

Ala Ala His His Pro Asp Asp Phe Asn Pro Ser Vai. 15 10

<210> 8 <211> 13 <212> PRT 123 ΡΕ1790655 <213> Sus scrofa <400> 8 Pro Ser Ile Vai Gly Arg Pro Arg His Gin Gly Vai Met 15 10 <210> <211> 9 13 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 9 Ile Gly Met Glu Ser Ala Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr 15 10 <210> <211> 10 9 <212> <213> PRT Sus scrofa <400> 10 Vai Gly Met Gly Glu Lys Asp Ser Tyr 1 5 <210> <211> 11 9 <212> <213> PRT Sus scrofa <400> 11 Vai Gly Met Gly Gin Lys Asp Ser Tyr 1 5 <210> <211> 12 10 <212> <213> PRT Sus scrofa <400> 12 Vai Gly Met Gly Gin Lys Asp Ser Tyr Vai 15 10 <210> <211> 13 10 <212> <213> PRT Sus scrofa <400> 13 Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu 15 10 124 ΡΕ1790655 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213>Sus scrofa <40 0> 14

Tyr Ser Phe 1 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 15

Ala Ala Phe 1 <210> 16 <211> 3 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 16

Tyr Ser Leu 1 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 17

Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 18

Phe Glu Glu Asn Met 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 19

Phe Glu Pro Ser Phe 1 5 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 20 ΡΕ1790655 125

Phe Asn Glu Glu 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 21

Phe Glu Glu Met 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 22

Phe Glu Glu Glu 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 23

Phe Glu Ser Phe 1 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 24

Pro Glu Asn Phe 1 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 25

Phe Vai Asn Asp, 1 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 2 6

Phe Gin Pro Ser Phe 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Sus scrofa 126 ΡΕ1790655 <400> 27

Phe Asn Phe Vai Pro Pro 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 28

Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Vai Phe 15 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 29

Leu Arg Vai Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu 15 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 30

Arg Vai Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu 15 10

Lisboa, 1 de Julho de 2010

Claims

ΡΕ1790655 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1.
2. 0 péptido de acordo com a reivindicação 1 em que o referido péptido modula pelo menos uma das sequintes condições: actividades imunes, hepatite infecciosa, infecção pelo vírus da hepatite B e o crescimento de um cancro.
3. Uma composição farmacêutica compreendendo um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1.
4. Um método para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se obter um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l e mistura do referido péptido com um veículo farmaceuticamente aceitável.
5. Um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l para usar em terapia.
6. Utilização de um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 para a produção de um medicamento para a modulação actividades imunes, hepatite virai ou crescimento de cancro. 2 ΡΕ1790655
7. Um péptido substancialmente puro consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1 para usar na modulação actividades imunes, hepatite virai ou crescimento de cancro. Lisboa, 1 de Julho de 2010