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PT1781705E - Anticorpos contra recetor i do interferão alfa e as suas utilizações - Google Patents

Anticorpos contra recetor i do interferão alfa e as suas utilizações Download PDF

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PT1781705E
PT1781705E PT57877433T PT05787743T PT1781705E PT 1781705 E PT1781705 E PT 1781705E PT 57877433 T PT57877433 T PT 57877433T PT 05787743 T PT05787743 T PT 05787743T PT 1781705 E PT1781705 E PT 1781705E
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PT
Portugal
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antibody
variable region
seq
amino acids
set forth
Prior art date
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PT57877433T
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Alison Witte
Josephine M Cardarelli
Mohan Srinivasan
Original Assignee
Medarex Llc
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Publication date
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Description

ΕΡ1781705Β1
DESCRIÇÃO
ANTICORPOS CONTRA RECETOR I DO INTERFERÃO ALFA E AS SUAS
UTILIZAÇÕES
Antecedentes da Invenção
Os interferões Tipo I (IFN) (IFN-a, IFN-β, IFN-ω, IFN--t) são uma família de citoquinas relacionadas estruturalmente que têm efeitos antivirais, antitumorais e imunomoduladores (Hardy et al. (2001) Blood 97:473; Cutrone e Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140) . O locus do IFNa humano inclui duas subfamílias. A primeira subfamília consiste em 14 genes não alélicos e 4 pseudogenes que têm pelo menos 80% de homologia. A segunda subfamília, all ou ómega (ω) , contém 5 pseudogenes e 1 gene funcional que exibe 70% de homologia com os genes do IFNa (Weissmann e Weber (1986) Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 33:251-300). Os subtipos de IFNa têm diferentes atividades específicas mas possuem o mesmo espetro biológico (Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2848) e têm o mesmo recetor celular (Agnet M. et al. em "Interferon 5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983). O interferão β (IFN β) é codificado por um único gene que tem aproximadamente 50% de homologia com os genes do IFNa. O interferão gama, que é produzido pelos linfócitos ativados, não possui qualquer homologia com os interferões alfa/beta e não reage com os seus recetores.
Todos os interferões humanos tipo I ligam-se a um recetor da superfície celular (recetor de IFN alfa, IFNAR) que consiste em duas proteínas transmembranares, IFNAR-1 e IFNAR-2 (Uze et. al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391) . O IFNAR-1 é essencial para a ligação de alta afinidade e especificidade diferencial do complexo do IFNAR (Cutrone, 2001, supra). Enquanto as diferenças 1 ΕΡ1781705Β1 funcionais para cada subtipo de IFN tipo I não foram identificadas, acredita-se que possam existir diferentes interações com os componentes do recetor IFNAR que levam a resultados de sinalização potencialmente diversos (Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:13448). Particularmente, estudos utilizando formas mutantes do IFNAR1 e IFNAR2 sugeriram que os interferões alfa e beta sinalizam de forma diferente através do recetor através da interação diferente com as respetivas cadeias (Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282 : 585) .
Estudos funcionais anteriores dos IFNs tipo I focaram-se na defesa inata contra infeções virais (Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154:199; Lindenmann et al. (1981)
Methods Enzymol. 78:181). Estudos mais recentes, contudo, implicam os IFNs tipo I como potentes citoquinas imunorreguladoras na resposta imune adaptativa.
Especificamente, os IFNs tipo I têm demonstrado facilitar a diferenciação de células T naive ao longo da via do Thl (Brinkman et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1655), potenciar a produção de anticorpos (Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1179) e suportar a atividade funcional e sobrevivência de células T de memória (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777; Tough et al. 1996 +- 272 (1947)
Trabalho recente realizado por uma série de grupos sugere que o IFN-α poderá potenciar a maturação ou ativação de células dendriticas (DCs) (Santini, et al. (2000) J.
Exp. Med. 191:1777; Luft et al. (1998) J. Immunol. 161:1947; Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367; Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499) . Além disso, a expressão aumentada dos interferões tipo I tem sido descrita em inúmeras doenças autoimunes (Foulis et al. (1987) Cell 2:1423; Novick et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192; Hopkins e Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88; 2 ΕΡ1781705Β1
Arvin e Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582). Os exemplos mais estudados disto são a diabetes mellitus dependente da insulina (IDDM) (Foulis (1987) supra) e o lúpus eritematoso sistémico (LES) (Hooks (1982) supra) as quais estão associadas com níveis elevados de IFN-α, e a artrite reumatóide (AR) (Hertzog (1988), Hopkins e Meager (1988), Arvin e Miller (1984), supra) na qual o IFN-β pode desenvolver um papel mais significante.
Para além disso, relatou-se que a administração do interferão α exacerba a doença subjacente em pacientes com psoríase e esclerose múltipla e induz uma síndrome do tipo LES em pacientes sem uma história prévia de doença autoimune. Também tem sido mostrado que o interferão α induz glomerulonefrite em ratos normais e acelera o início da doença autoimune espontânea de ratos NZB/W. Além disso, a terapêutica com o IFN-α tem demonstrado em alguns casos levar a efeitos secundários indesejáveis, incluindo febre e distúrbios neurológicos. Assim, existem situações patológicas nas quais a inibição da atividade do IFN Tipo I pode ser benéfica para o paciente e existe uma necessidade para agentes eficazes na inibição da atividade do IFN Tipo I. 0 documento de patente US 6.713.609 BI descreve vários anticorpos murinos anti-IFNAR-1. O documento WO 2004/094473 A2 descreve anticorpos humanizados anti-IFNAR-1 derivados a partir do anticorpo monoclonal murino 64G12 o qual contém as CDRs do 64G12 ou derivativos do mesmo e se ligam ao mesmo epítopo que o 64G12.
Goldman et al., J INF CYTO RES vol. 19, n° . 1, 1999, páginas 15 - 26, descrevem anticorpos murinos direcionados ao IFNAR-1 humano. Um dos ditos anticorpos, ο EA12, inibe a ligação e a atividade do IFNa2a e do IFNa2b. A especificidade do epítopo do EA12 foi estudada utilizando uma quimera humana-bovina do IFNAR-1. Encontrou-se que o EA12 tem um padrão complexo de reconhecimento de epítopos e 3 ΕΡ1781705Β1 reage moderadamente com a quimera HHBB. A quimera HHBB contém os domínios extracelulares SD1 e SD2 do IFNAR-1 humano. Goldman et al. afirmam adicionalmente que o anticorpo monoclonal murino 64G12 se liga à metade do N-terminal do domínio extracelular do IFNAR-1, ou seja, SD1 e SD2, resíduos 27 a 230.
Sumário da Invenção A presente invenção refere-se ao assunto definido nas reivindicações.
Assim, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais humanos isolados que se ligam ao IFNAR-1 e inibem a atividade biológica do interferão tipo I, preferivelmente múltiplos interferões tipo I. Além disso, os anticorpos não se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo murino anti-IFNAR-1, o 64G12.
Num aspeto, a invenção refere-se a um anticorpo humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, em que o anticorpo se liga especificamente ao IFNAR-1 e exibe uma ou mais das seguintes propriedades: a) liga-se ao IFNAR-1 com uma KD de 1 x 10 7 M ou mais de afinidade; b) inibe r a atividade biológica de múltiplos interferões Tipo I; c) inibe a atividade de IFN α 2b num ensaio de proliferação de células de Daudi; d) inibe a atividade de IFN ómega num ensaio de proliferação de células de Daudi; e) inibe a secreção de IP-10 pelas células mononucleares do sangue periférico induzida pelo IFN oí 2b; f) inibe a secreção de IP-10 pelas células mononucleares do sangue periférico induzida pelo IFN ómega; g) inibe o desenvolvimento de células dendríticas mediada pelo plasma do Lúpus Eritematoso Sistémico; e 4 ΕΡ1781705Β1 h) liga-se a um epítopo diferente do que o anticorpo monoclonal 64G12 (ECACC Depósito N°. 92022605).
Anticorpos preferidos da invenção ligam-se especificamente ao recetor 1 do interferão alfa humano e ligam-se com uma KD de 1 x IO-8 M ou mais de afinidade, ou 1 x 10~9 M ou mais de afinidade, ou 5 x 10_1° M ou mais de afinidade ou 2 x 10“10 M ou mais de afinidade.
Num aspeto, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de, ou derivada a partir de, um gene humano de VH 4-34 ou 5-51, em que o anticorpo se liga especificamente ao recetor 1 do interferão alfa. Noutro aspeto, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivada a partir, de um gene humano de VK L18 ou A27, em que o anticorpo se liga especif icamente ao recetor 1 do interferão alfa. Ainda noutro aspeto, a invenção refere-se a um anticorpo humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que é o produto de, ou derivada a partir de, um gene humano de VH 4-34 ou 5-51; e (b) uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivada a partir de, um gene humano de VK LI8 ou A27; em que o anticorpo se liga especificamente ao recetor 1 do interferão alfa humano. Em formas de realização preferidas, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene humano de VH 4-34 e uma região variável de cadeia leve de um gene humano VK L18 ou o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene humano de VH 5-51 e uma região variável de cadeia leve de um gene 5 ΕΡ1781705Β1 humano de VK A2.
Noutro aspeto, a invenção refere-se a um anticorpo humano monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, gue compreende uma região variável de cadeia pesada humana e uma região variável de cadeia leve humana, em que: (a) a região variável de cadeia pesada humana compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 25, 26 e 28; (b) a região variável de cadeia leve humana compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 29, 30 e 32; (c) o anticorpo liga-se especificamente ao recetor 1 do interferão alfa humano com uma afinidade de ligação de pelo menos lxlO-8 M ou mais de afinidade; e (d) o anticorpo inibe a atividade biológica de pelo menos um interferão Tipo I.
Outras formas de realização preferidas da invenção incluem anticorpos monoclonais humanos, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 25, 26 e 2 8; e (b) uma região variável de cadeia leve humana que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 29, 30 e 32; em que o anticorpo se liga especificamente ao recetor 1 do interferão alfa humano com uma afinidade de ligação de pelo 6 ΕΡ1781705Β1 menos 1χ1(Γ8 M ou maior afinidade.
Combinações preferidas de cadeias pesadas e leves incluem as seguintes:
(a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:25; e (b) uma região variável de cadeia leve humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 9. (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 6; e (b) uma região variável de cadeia leve humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:30. (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende a sequência NO:2 8; e de aminoácidos de SEQ ID (b) uma região variável de cadeia leve humana que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:32. Em determinadas formas de realização, a invenção proporciona um anticorpo humano, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, em que o anticorpo não se liga ao mesmo epitopo que (ou seja, não faz competição cruzada) o anticorpo monoclonal murino 64G12 (N° de Depósito de ECACC 92022605).
Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer isotipo. Anticorpos preferidos são do isotipo IgGl, IgG3 ou IgG4. Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos de comprimento completo que compreendem regiões variáveis e constantes, ou podem ser fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos, tais como um anticorpo de cadeia única, ou um fragmento Fab ou Fab'2. A invenção também proporciona um imunoconjugado que 7 ΕΡ1781705Β1 compreende um anticorpo da invenção, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioativo. A invenção também proporciona uma molécula biespecífica que compreende um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção, ligado a uma segunda fração funcional tendo um especificidade de ligação diferente do dito anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo.
As composições que compreendem um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, ou imunoconjugado ou molécula biespecífica da invenção e um portador farmaceuticamente aceitável também são proporcionadas.
Moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, da invenção são também englobadas pela invenção, bem como os vetores de expressão que compreendem os tais ácidos nucleicos e células hospedeiras que compreendem tais vetores de expressão. Para além disso, a invenção proporciona um ratinho transgénico que compreende transgenes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana, em que o ratinho expressa um anticorpo da invenção, bem como hibridomas preparados a partir do tal ratinho, em que o hibridoma produz o anticorpo da invenção. A invenção proporciona também os anticorpos, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, para utilização num método de tratamento de uma doença ou distúrbio mediado pelo interferão tipo I num sujeito com necessidade de tratamento que compreende a administração ao sujeito do anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção, de tal forma que a doença mediada por interferão tipo-I no sujeito é tratada. A doença mediada por interferão tipo I pode ser, por exemplo, uma doença mediada pelo interferão alfa.
Exemplos de doenças ou distúrbios que podem ser tratados utilizando os métodos da invenção incluem lúpus 8 ΕΡ1781705Β1 eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependente da insulina, doença intestinal inflamatória, esclerose múltipla, psoriase, tiroidite autoimune, artrite reumatóide, glomerulonefrite, infeção por VIH, SIDA, rejeição de transplantes e doença do enxerto contra hospedeiro.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura IA mostra a seguência de nucleótidos (SEQ ID NO: 33) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 3F11. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 1) , CDR2 (SEQ ID NO: 5) e CDR3 (SEQ ID NO: 9) são delineadas. A Figura 1B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 37) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 29) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 3F11. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 13) , CDR2 (SEQ ID NO: 17) e CDR3 (SEQ ID NO: 21) são delineadas. A Figura 2A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 34) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 4G5. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 2) , CDR2 (SEQ ID NO: 6) e CDR3 (SEQ ID NO: 10) são delineadas. A Figura 2B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 38) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 30) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 4G5. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 14) , CDR2 (SEQ ID NO: 18) e CDR3 (SEQ ID NO: 22) são delineadas. A Figura 3A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 35) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 27) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 11E2. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 9 ΕΡ1781705Β1 3) , CDR2 (SEQ ID NO: 7) e CDR3 (SEQ ID NO: 11) são delineadas. A Figura 3B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 39) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 31) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 11E2. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 15) , CDR2 (SEQ ID NO: 19) e CDR3 (SEQ ID NO: 23) são delineadas. A Figura 4A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 36) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 28) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 9D4. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 4) , CDR2 (SEQ ID NO: 8) e CDR3 (SEQ ID NO: 12) são delineadas. A Figura 4B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 40) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 32) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 9D4. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 16) , CDR2 (SEQ ID NO: 20) e CDR3 (SEQ ID NO: 24) são delineadas. A Figura 5 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do 3F11 com a sequência de aminoácidos da VH 4-34 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 41). A Figura 6 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do 4G5 com a sequência de aminoácidos da VH 4-34 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 41). A Figura 7 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do 11 E2 e 9D4 com a sequência de aminoácidos da VH 5-51 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 42). A Figura 8 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do 3F11 com a sequência de aminoácidos da VK L18 da linha 10 ΕΡ1781705Β1 germinal humana (SEQ ID NO: 43). A Figura 9 mostra o alinhamento da seguência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do 4G5 com a seguência de aminoácidos da Vk L18 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 43). A Figura 10 mostra o alinhamento da seguência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do 11 E2 e 9D4 com a seguência de aminoácidos da VK A27 da linha germinal humana (SEQ ID NO: 44). A Figura 11 é um gráfico que mostra os resultados das experiências demonstrando que o anticorpo monoclonal humano, 3F11, direcionado contra o IFNAR-1 humano, não compete com o anticorpo monoclonal de ratinho 64G12 para se ligar ao IFNAR-1.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isolados que se ligam ao recetor 1 do interferão alfa (IFNAR-1) e que são capazes de bloquear a ação dos interferões tipo I. A invenção proporciona anticorpos isolados, métodos para fazer tais anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecificas que compreendem tais anticorpos e composições farmacêuticas que contêm os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecificas da invenção. Além disso, métodos de utilização dos anticorpos para a inibição da ligação de um interferão tipo I ao IFNAR-1 numa célula que expressa o IFNAR-1, por exemplo, no tratamento de distúrbios imunomediados, incluindo distúrbios autoimunes, rejeição de transplantes e Doença do Enxerto Contra Hospedeiro (GVHD), num sujeito, conforme descrito no presente documento.
Para que a presente invenção possa ser mais rapidamente entendida, determinados termos são definidos em primeiro lugar. Definições adicionais são estabelecidas ao longo da descrição detalhada.
Os termos "Recetor 1 do interferão alfa", "IFNAR-1" e 11 ΕΡ1781705Β1 "antigénio do IFNAR-1" são utilizados indistintamente, e incluem variantes, isoformas, homólogos de espécies do IFNAR-1 humano, e análogos tendo pelo menos um epítopo comum com o IFNAR-1. Consequentemente, os anticorpos humanos da invenção podem, em determinados casos, reagir de forma cruzada com o IFNAR-1 de espécies gue não sejam humanas, ou outras proteínas gue estão estruturalmente relacionadas com o IFNAR-1 humano (por exemplo, homólogos do IFNAR-1 humano). Noutros casos, os anticorpos podem ser completamente específicos para o IFNAR-1 humano e não exibir reatividade cruzada de espécies ou outros tipos. A sequência completa de cADN do IFNAR-1 humano tem o número de acesso do Genbank NM_000629. 0 termo "interferão tipo I" conforme utilizado no presente documento destina-se a referir-se a membros da família de moléculas do interferão tipo I que são ligandos para o IFNAR-1 (ou seja, membros da família de moléculas do interferão tipo I que são capazes de se ligar ao IFNAR-1). Exemplos de ligandos dos interferões tipo I são interferão alfa 1, 2a, 2b, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 21, interferão beta e interferão ómega. O termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentadoras de antigénio, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células anteriores ou no fígado (incluindo anticorpos, citoquinas e complemento) que resulta no dano seletivo a, destruição de, ou eliminação a partir do corpo humano de patógenos invasores, células ou tecidos infetados com patógenos, células cancerígenas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.
Uma "via de transução de sinal" refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinais que desempenham um papel na transmissão de um sinal a partir de uma porção de uma célula para outra 12 ΕΡ1781705Β1 porção de uma célula. Conforme utilizado no presente documento, a frase "recetor da superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e da transmissão do tal sinal através da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de "recetor da superfície celular" da presente invenção é o recetor IFNAR-1. 0 termo "anticorpo" conforme referido no presente documento, inclui anticorpos inteiros e qualquer fraqmento de ligação a antigénio (ou seja, "porção de ligação a antigénio") ou cadeias únicas dos mesmos. Um "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas através de pontes de dissulfito, ou uma porção de ligação a antigénio da mesma. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CHi, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes da complementaridade (CDR), intercalas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir de um amino-terminal até um carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (por 13 ΕΡ1781705Β1 exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complemento clássico. 0 termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção do anticorpo"), conforme utilizado no presente documento, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantém a capacidade para se ligar especificamente a um antigénio (por exemplo, IFNAR-1) . Tem sido mostrado que a função de ligação a antigénio de um anticorpo pode ser realizada através de fragmentos ou de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos dominios VL, VH, CL e CHi; (ii) um fragmento F(ab')2r um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfito na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos dominios VH e CHi; (iv) um fragmento Fv que consiste nos dominios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al.r (1989) Nature 341:544-546), que consiste num domínio VH; e (vi) uma região determinante da complementariedade (CDR) isolada. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser juntos, utilizando métodos recombinantes, através de um ligante sintético que lhes permite serem feitos como uma cadeia de proteínas única na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); ver por exemplo, Bird et ai. (1988) Science 242:423-426; e Huston et ai. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única também se destinam a ser englobados dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas para aqueles peritos na especialidade, e os 14 ΕΡ1781705Β1 fragmentos são analisados para a utilidade da mesma forma do que os anticorpos intactos.
Um "anticorpo isolado", conforme utilizado no presente documento, destina-se a referir-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigénicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao IFNAR-1 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antigénios que não sejam o IFNAR-1). Um anticorpo isolado que se liga especificamente ao IFNAR-1, contudo, tem reatividade cruzada com outros antigénios, tais como moléculas do IFNAR-1 de outras espécies. Para além disso, um anticorpo isolado podem ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" conforme utilizados no presente documento referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de ligação e afinidade para um epítopo particular.
0 termo "anticorpo humano", conforme utilizado no presente documento, destina-se a incluir anticorpos que têm regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais como as regiões CDR são derivadas a partir de sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada a partir de sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados através de sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica de um local in vitro ou através da mutação somática in vivo) . Contudo, não se pretende que o termo "anticorpo humano", conforme utilizado no presente documento, inclua anticorpos nos quais sequências de CDR 15 ΕΡ1781705Β1 derivadas a partir da linha germinal de outras espécies de mamíferos, tais como um ratinho, tenham sido enxertadas em sequências estruturais humanas. 0 termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação única que têm regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais como as regiões CDR são derivadas a partir de sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana. Numa forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos através de um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgénico, por exemplo, um ratinho transgénico, tendo um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humano e um trangene de cadeia leve fundidos numa célula imortalizada. 0 termo "anticorpo recombinante humano", conforme utilizado no presente documento, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um ratinho) que é transgénico ou transcromossómico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir delas (descrito mais abaixo), (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca recombinante, combinatória de anticorpos humanos, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de quaisquer outros meios que envolvam splicing de sequências de genes de imunoglobulina humana para outras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões estruturais e CDR são derivadas a partir de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Contudo, em algumas formas de realização, os tais anticorpos humanos 16 ΕΡ1781705Β1 recombinantes podem ser sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando um animal transgénico para as sequências de Ig humana é utilizado, mutagénese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto são derivadas a partir de, e relacionadas com, sequências de VH e VL da linha germinal humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinal de anticorpos humanos in vivo.
Conforme utilizado no presente documento, "isotipo" refere-se à classe do anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que está codificado pelos genes de região constante de cadeia pesada.
Conforme utilizado no presente documento, "ligação especifica" refere-se à ligação do anticorpo a um antigénio predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma constante de dissociação (KD) de 1CT7 M ou menos, e liga-se ao antigénio predeterminado com uma KD que é pelo menos duas vezes menos do que a sua KD para ligação com um antigénio não especifico (por exemplo, BSA, caseína) que não seja o antigénio predeterminado ou um antigénio estreitamente relacionado. As frases "um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo específico para um antigénio" são utilizadas indistintamente no presente documento com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio". 0 termo "Kassoc" ou "Ka", conforme utilizado no presente documento, destina-se a referir-se à taxa de associação de uma interação anticorpo-antigénio particular, enquanto o termo "Kdis" ou "Kd, " conforme utilizado no presente documento, destina-se a referir-se à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio particular. 0 termo "KD", conforme utilizado no presente documento, destina-se a referir-se à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (ou seja, Kd/Ka) e é expressa 17 ΕΡ1781705Β1 como uma concentração molar (M) . Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método preferido para determinar a KD de um anticorpo é através da utilização de ressonância de plasmon de superfície, preferivelmente utilizando um sistema de biossensor tal como um sistema Biacore®.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "alta afinidade" para um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo que tem uma KD de 10~8 M ou menos, mais preferivelmente 10“9 M ou menos e ainda mais preferivelmente 1CT10 M ou menos. Contudo, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpos. Por exemplo, a ligação de "alta afinidade" para um isotipo de IgM refere-se a um anticorpo que tem uma KD de IO-7 M ou menos, mais preferivelmente 1CT8 M ou menos.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "sujeito" inclui qualquer humano ou animal não humano. 0 termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.. Vários aspetos da invenção são descritos em detalhe adicional nas seguintes subseções.
Anticorpos Anti_IFNAR-l
Os anticorpos da invenção são caracterizados por características ou propriedades funcionais particulares dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos ligam-se especificamente ao IFNAR-1, preferivelmente ao IFNAR-1 humano. Adicionalmente, os anticorpos podem ter reação cruzada com o IFNAR-1 de um ou mais primatas não humanos, tais como um macaco cinomolgo e/ou macaco reso. Preferivelmente, um anticorpo da invenção liga-se ao IFNAR-1 com alta afinidade, por exemplo com uma KD de IO-7 M ou menos, mais preferivelmente com uma KD de 1CT8 M ou menos ou 18 ΕΡ1781705Β1 10-9 M ou menos ou mesmo 5 x 10~10 M ou menos ou 2 x IO-10 M ou menos.
Além disso, os anticorpos da invenção são capazes de inibir a atividade biológica dos interferões tipo 1. Os anticorpos inibem a atividade biológica de pelo menos um interferão tipo I, e preferivellmente inibem a atividade biológica de múltiplos interferões tipo I (ou seja, pelo menos dois, mais preferivelmente pelo menos três, ou pelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, ou pelo menos sete, ou pelo menos oito, ou pelo menos nove, ou pelo menos dez, ou pelo menos 11, ou pelo menos 12, ou pelo menos 13 ou pelo menos 14 ou pelo menos 15 subtipos diferentes de interferão tipo I). Numa forma de realização preferida, o anticorpo inibe a atividade biológica dos seguintes tipos de interferões tipo I: al, a 2a, α 2b, a 4, α 5, α 6, α 7, α 8, α 10, α 14, α 16, α 17, α 21, beta e ómega. Noutras formas de realização preferidas, o anticorpo inibe a atividade do IFN linf oblastóide e/ou IFN leucocitário. A capacidade de um anticorpo para inibir a atividade biológica dos interferões tipo I pode ser examinada num ou mais ensaios estabelecidos na técnica. Exemplos não limitantes incluem a inibição da proliferação de células de Daudi mediada pelo IFN Tipo I, inibição da expressão de IP-10 pelas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) induzida pelo IFN Tipo I, inibição do desenvolvimento de células dendríticas mediado por plama de Lúpus Eritematoso Sistémico (LES), e inibição da atividade antiviral do IFN Tipo I. Um anticorpo "inibe a atividade biológica dos interferões tipo I" se inibe a atividade em pelo menos 20%, mais preferivelmente em pelo menos 30%, ainda mais preferivelmente pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, quando comparado com um anticorpo de controlo, não especifico. 19 ΕΡ1781705Β1
Em formas de realização preferidas, o anticorpo inibe a atividade do IFN α 2b num ensaio de proliferação de células de Daudi, inibe a atividade do IFN ómega num ensaio de proliferação de células de Daudi, inibe a secreção de IP-10 pelas PBMC induzida pelo IFN α 2b e IFN ómega, e/ou inibe o desenvolvimento de células dendriticas mediado por plasma de LES.
Noutra forma de realização preferida, o anticorpo não compete de forma cruzada com (isto é, liga-se a um epítopo diferente de) o anticopo murino anti-IFNAR-1 64G12 (depositado como o N° de Depósito de ECACC 92022605) .
Ensaios para avaliar as atividades funcionais dos anticorpos anti-IFNAR são descritos em maior detalhe nos Exemplos. Anticorpos preferidos da invenção exibem pelo menos uma, mais preferivelmente duas, três, quatro, cinco ou mais, das seguintes propriedades: a) liga-se especificamente ao IFNAR1 (preferivelmente IFNAR1 humano); b) liga-se ao IFNAR-1 com alta afinidade, tal como uma KD de 1 x 10 8 M ou : mais de afinidade; c) inibe a atividade biológica de múltiplos interferões Tipo I; d) inibe a atividade de IFN α 2b num ensaio de proliferação de células de Daudi; e) inibe a atividade de IFN ómega num ensaio de proliferação de células de Daudi; f) inibe a secreção de IP-10 pelas células mononucleares do sangue periférico induzida pelo IFN α 2b; g) inibe a secreção de IP-10 pelas células mononucleares do sangue periférico induzida pelo IFN ómega; h) inibe o desenvolvimento de células dendriticas mediada pelo plasma do Lúpus Eritematoso Sistémico; e i) liga-se a um epítopo diferente do (ou seja, não 20 ΕΡ1781705Β1 compete de forma cruzada com) anticorpo murino anti-IFNAR-1 64G12 (número de Depósito de ECACC 92022605).
Qualquer combinação das caracteristicas funcionais descritas anteriormente, e/ou caracteristicas funcionais conforme descritas nos Exemplos, podem ser exibidas por qualquer anticorpo da invenção.
Anticorpos Monoclonais 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4
Anticorpos preferidos da invenção são os anticorpos monoclonais humanos 3F11, 4G5 e 9D4, isolados e caracterizados estruturalmente conforme descrito nos Exemplos. As sequências de aminoácidos da VH do 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 são mostradas nas SEQ ID NOs: 25, 26, 27 e 28, respetivamente. As sequências de aminoácidos da VL do 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 são mostradas nas SEQ ID NOs: 29, 30, 31 e 32, respetivamente.
Dado que cada um destes anticorpos pode ligar-se ao IFNAR-1, as sequências das VH e VL podem ser "misturadas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação anti-IFNAR-1, a ligação ao IFNAR-1 dos tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos no presente documento (por exemplo, ELISAs) e/ou utilizando os ensaios de inibição funcional do IFN tipo I descritos nos Exemplos. Preferivelmente, quando as cadeias das VH e VL são misturadas e combinadas, uma sequência de VH a partir de um emparelhamento VH/VL em particular é substituída com uma sequência de VH estruturalmente semelhante. Da mesma forma, preferivelmente uma sequência de VL a partir de um emparelhamento VH/VL particular é substituída com uma sequência de VL estruturalmente semelhante. Por exemplo, as sequências das VH e VL do 3F11 e 4G5 são particularmente passíveis de mistura e combinação, uma vez que estes anticorpos utilizam sequências das VH e VL derivadas a partir das sequências da mesma linha germinal (VH 4-34 e Vk L18) e por isso elas elas exibem semelhança estrutural. 21 ΕΡ1781705Β1
Adicionalmente, as sequências das VH e VL do 11E2 e 9D4 são particularmente passíveis de mistura e combinação, uma vez que estes anticorpos utilizam sequências das VH e VL derivadas a partir das sequências da mesma linha germinal (VH 5-51 e Vk A24) e por isso elas elas exibem semelhança estrutural.
Combinações preferidas de cadeias leves e pesadas incluem: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; ou (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; ou (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 . A invenção proporciona anticorpos que compreendem as CDRls, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada e cadeia leve de 3F11, 4G5, e 9D4, respetivamente.
As sequências de aminoácidos das CDRls da VH do 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 são mostradas nas SEQ ID NOs: 1,2, 3 e 4.
As sequências de aminoácidos das CDR2s da VH do 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 são mostradas nas SEQ ID NOs: 5, 6, 7 e 8. As sequências de aminoácidos das CDR3s da VH do 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 são mostradas nas SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12. As sequências de aminoácidos das CDRls da Vk do 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 são mostradas nas SEQ ID NOs: 13, 14, 15 e 16.
As sequências de aminoácidos das CDR2s da Vk do 3F11, 4G5, 22 ΕΡ1781705Β1 11Ε2 e 9D4 são mostradas nas SEQ ID NOs: 17,18, 19 e 20. As sequências de aminoácidos das CDR3s da Vk do 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 são mostradas nas SEQ ID NOs: 21, 22, 23 e 24. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) .
Dado que cada um destes anticorpos se pode ligar ao IFNAR-1 e que a especificidade de ligação ao antigénio é fornecida primariamente pelas regiões CDR1, 2 e 3, as sequências CDR1, 2 e 3 da VH e sequências CDR1, 2 e 3 da Vk podem ser "misturadas e combinadas" (ou seja, as CDRs de diferentes anticorpos podem ser misturadas e combinadas, apesar de que cada anticorpo deve conter uma CDRl, 2 e 3 da VH e uma CDRl, 2 e 3 da Vk) para criar outras moléculas de ligação ao IFNAR-1. A ligação dos tais anticorpos "misturados e combinados" ao IFNAR-1 pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos anteriormente e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Preferivelmente, quando as sequências CDR da VH são misturadas e combinadas, as sequências CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência da VH particular é substituída por uma ou várias sequências CDR estruturalmente semelhantes. Da mesma forma, quando as sequências CDR da Vk são misturadas e combinadas, as sequências CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência da Vk particular é substituída por uma ou várias sequências CDR estruturalmente semelhantes. Por exemplo, as CDRsl da VH do 3F11 e 4G5 partilham alguma semelhança estrutural e portanto são passíveis de mistura e combinação. Como outro exemplo, as CDRsl da VH de 11E2 e 9D4 partilham alguma semelhança estrutural e portanto são passíveis de mistura e combinação. Ainda como outro exemplo, as CDRls e CDR2s da Vk do 3F11 e 4G5 partilham alguma semelhança estrutural. Ainda como outro exemplo, as CDRls e CDR2s da VH do 11E2 e 9D4 partilham alguma semelhança estrutural. Será 23 ΕΡ1781705Β1 imediatamente aparente para o perito que novas sequências das VH e VL podem ser criadas através da substituição de uma ou mais sequências de região CDR da VH e/ou VL com sequências estruturalmente semelhantes a partir das sequências de CDR divulgadas no presente documento para os anticorpos monoclonais 3F11, 4G5 , 11E2 e 9D4. Numa forma de realizaçao preferida, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 1; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 5; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 9; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 13 r (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 17 ; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 21 • Noutra forma de realização preferida, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 2; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 6; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 10 r (d) uma região variável de cadeia leve CDRl que compreende a SEQ ID NO: 14 r (d) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 18 ; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 22 • Noutra forma de realização preferida, o anticorpo 24 ΕΡ1781705Β1 compreende : (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 4; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 8; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 12 r (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende a SEQ ID NO: 16 r (d) uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende a SEQ ID NO: 20 ; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende a SEQ ID NO: 24
Anticorpos que se Ligam ao mesmo Epítopo que o 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4
Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo no IFNAR-1 humano do que os anticorpos monoclonais 3F11, 4G5 ou 9D4 (que têm sequências de VH conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 25, 26 e 28 respetivamente e sequências VL conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 29, 30, 32, respetivamente), podem ser identificados com base na sua capacidade para competir de forma cruzada com o 3F11, 4G5, ou 9D4 em ensaios padrão de ligação com o IFNAR-1. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação do 3F11, 4G5 ou 9D4 ao IFNAR-1 humano demonstra que o anticorpo de teste pode competir com o 3F11, 4G5 ou 9D4 pela ligação ao IFNAR-1 humano e liga-se assim ao mesmo epítopo no IFNAR-1 humano que o 3F11, 4G5 ou 9D4. O anticorpo que se liga ao mesmo epítopo no IFNAR-1 humano que 3F11, 4G5 ou 9D4 pode ser um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados conforme descrito nos Exemplos.
Noutra forma de realização preferida, o anticorpo liga-se a um epítopo diferente do (ou seja, não realiza competição cruzada com) anticorpo monoclonal de ratinho 25 ΕΡ1781705Β1 64G12 (N° de Depósito de ECACC 92022605).
Anticorpos que têm Sequências de Linha Germinal Particulares
Em determinadas formas de realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada a partir de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de uma linha germinal particular e/ou uma região variável de cadeia leve a partir de um gene de imunoglobulina de cadeia leve de uma linha germinal particular.
Por exemplo, numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-IFNAR-1 isolado, ou uma porção de ligação a antigénio da mesma, em que o anticorpo: (a) compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene humano de VH 4-34 ou 5-51; (b) compreende uma região variável de cadeia leve de um gene humano de Vk LI8 ou A27; e (c) o anticorpo liga-se especificamente ao IFNAR-1.
Exemplos de anticorpos contendo VH e VK de VH 4-34 e
Vk L18, respetivamente, incluem o 3F11 e 4G5. Exemplos de anticorpos contendo VH e VK de VH 5-51 e Vk A27, respetivamente, incluem ο 11E2 e 9D4.
Conforme utilizado no presente documento, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve "de" ou "derivadas a partir de" uma sequência de linha germinal particular se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas a partir de um sistema que utiliza genes de imunoglobulina da linha germinal humana. Tais sistemas incluem imunizar um ratinho transgénico que transporta genes de imunoglobulina humana com o antigénio de interesse ou analisar uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana de interesse exibida em fago com o antigénio de interesse. Um anticorpo humano que é "de" ou "derivado a partir de" ou "o produto de" uma sequência de imunoglobulina da linha germinal humana pode ser 26 ΕΡ1781705Β1 identificado como tal através da comparação da sequência de aminoácidos do anticorpo humano com as sequências de aminoácidos das imunoglobulinas da linha germinal humana e da seleção da sequência de imunoglobulina da linha germinal humana que mais se parece em sequência (ou seja, maior % de identidade) à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "de" ou "derivado a partir de" ou "o produto de" uma sequência de imunoglobulina da linha germinal humana particular pode conter diferenças de aminoácidos quando comparado com a sequência da linha germinal, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutação dirigida a um local. Contudo, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico na sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina da linha germinal humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as sequências de aminoácidos de imunoglobulina da linha germinal de outras espécies (por exemplo, sequências da linha germinal murina). Em determinados casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95%, ou até pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinal. Tipicamente, um anticorpo humano derivado a partir de uma sequência da linha germinal humana particular exibirá não mais do que 10 diferenças nos aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinal humana. Em determinados casos, o anticorpo humano pode exibir não mais do que 5, ou ainda não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferenças nos aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linha germinal.
Anticorpos Homólogos
Ainda noutra forma de realização, um anticorpo da 27 ΕΡ1781705Β1 invenção compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve que compreendem sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências de aminoácidos dos anticorpos preferidos descritos no presente documento, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção. Por exemplo, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: (a) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 25, 26 e 28; (b) a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 29, 30 e 32; (c) o anticorpo liga-se especificamente ao IFNAR-1 e exibe pelo menos uma das propriedades funcionais descritas no presente documento, preferivelmente várias das propriedades funcionais descritas no presente documento.
Noutras formas de realização, as sequências de aminoácido de VH e/ou VL podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às sequências estabelecidas anteriormente. Um anticorpo tendo regiões de VH e VL tendo alta (ou seja, de 80% ou mais) homologia com as regiões VH e VL das sequências estabelecidas anteriormente, pode ser obtido através de mutagénese (por exemplo, mutagénese direcionada a um local ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codificam as SEQ ID NOs: 33, 34, 36, 37, 38 ou 40, seguido de testagem do anticorpo alterado codificado para a função retida (ou seja, as funções estabelecidas em (c), (d) e (e) acima) utilizando os 28 ΕΡ1781705Β1 ensaios funcionais descritos no presente documento.
Conforme utilizado no presente documento, a percentagem de homologia entre duas seguências de aminoácidos, é equivalente à percentagem de identidade entre as duas sequências. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (ou seja, % de homologia = n° de posições idênticas/n0 total de posições x 100), tendo em conta o número de intervalos e o comprimento de cada intervalo, os quais necessitam de ser introduzidos para o alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação das sequências e determinação da percentagem de identidade entre as duas sequências pode ser alcançada através da utilização de um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitantes abaixo. A percentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de peso de resíduos PAM 120, uma penalização do comprimento de intervalo de 12 e uma penalização de intervalo de 4. Adicionalmente, a percentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando ambas uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 , e um peso de intervalo de 16, 14, OO O \—1 CM 1—1 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Adicionalmente ou alternativamente, as sequências de proteínas da presente invenção podem ser utilizadas adicionalmente como uma "sequência de consulta" para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. As tais 29 ΕΡ1781705Β1 pesquisas podem ser realizadas utilizando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas BLAST de proteínas podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de anticorpos da invenção. Para obter alinhamentos intervalados para propósitos de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST os parâmetros predefinidos dos respetivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser utilizados. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Anticorpos com Modificações Conservadoras
Um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que estas sequências de CDR compreendem sequências de aminoácidos específicos baseadas nos anticorpos preferidos descritos no presente documento (por exemplo 3F11, 4G5 e 9D4) . Anticorpos adicionais que retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção podem compreender modificações conservadoras das ditas CDRs.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "modificações de sequências conservadoras" destina-se a referir-se a modificações dos aminoácidos que não afetam significativamente as características de ligação do anticorpo que contém a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em qualquer anticorpo da invenção através de técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagénese direcionada a um local ou mutagénese mediada por PCR. As substituiçõs de aminoácidos conservadoreas são aquelas nas 30 ΕΡ1781705Β1 quais o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, lisina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais dos resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado para a função retida (ou seja, as funções estabelecidas em (c), (d) e (e) acima) utilizando os ensaios funcionais descritos no presente documento.
Anticorpos Manipulados e Modificados
Um anticorpo da invenção podem ser adicionalmente preparado utilizando um anticorpo tendo uma ou mais das sequências de VH e/ou VL divulgadas no presente documento como material de iniciação para manipular um anticorpo modificado, anticorpo modificado o qual pode ter propriedades alteradas do anticorpo inicial. Um anticorpo pode ser manipulado através da modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (ou seja, VH e/ou VL) , por exemplo dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões estruturais. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser manipulado através da modificação de resíduos dentro da(s) 31 ΕΡ1781705Β1 região(ões) constante(s) , por exemplo para alterar a função(ões) efetora(s) do anticorpo.
Um tipo de manipulação da região variável que pode ser realizada é o enxerto de CDR. Os anticorpos interagem com antigénios alvo predominantemente através de residuos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeia pesada e leve. Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversificadas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. Porque as sequências CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizam as propriedades de anticorpos específicos que ocorrem naturalmente através da construção de vetores de expressão que incluem sequências CDR de um anticorpo específico que ocorre naturalmente enxertado em sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Patente U.S. N°. 5.225.539 para Winter e Patentes U.S. N°s. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.)
Consequentemente, outra forma de realização da invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que contém as sequências CDR da VH e VL dos anticorpos monoclonais 3F11, 4G5 ou 9D4 ainda podem conter sequências estruturais diferentes destes anticorpos.
Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dados de ADN públicas ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos da linha germinal. Por exemplo, as sequências de AND da linha germinal para genes de região variável de cadeia pesada e leve humanos podem ser encontradas na base de dados de 32 ΕΡ1781705Β1 sequências da linha germinal humana "VBase" (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase) , bem como em Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hyper-variable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; os conteúdos de cada uma, os quais são expressamente incoporados como referência no presente documento.
Sequências estruturais preferidas para utilização nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente semelhantes às sequências estruturais utilizadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, semelhantes às sequências estruturais da VH 4-34 e VL L18 utilizadas pelos anticorpos monoclonais 3F11 e 4G5, ou as sequências estruturais da VH 5-51 e VL A27 utilizadas pelo anticorpo monoclonal 9D4. As sequências CDR1, 2 e 3 da VH dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, e as sequências CDR1, 2 e 3 da VL dos SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 podem ser enxertadas em regiões estruturais que têm a mesma sequência que a que é encontrada no gene de imunoglobulina da linha germinal a partir da qual deriva a sequência estrutural, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões estruturais que contêm uma ou mais mutações quando comparadas com as sequências da linha germinal. Por exemplo, encontrou-se que em determinados casos, é benéfico mutar resíduos dentro das regiões estruturais para manter ou melhorar a capacidade de ligação do anticorpo ao antigénio (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N°s 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et 33 ΕΡ1781705Β1 ãl.) .
Outro tipo de modificação da região variável é mutar os resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da VH e/ou VL para melhorar assim uma ou mais das propriedades de ligação (por exemplo, a afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagénese direcionada a um local ou a mutagénese mediada por PCR podem ser realizadas para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito na ligação do anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada em ensaios in vitro ou in vivo conforme descritos no presente documento e proporcionados nos Exemplos. As modificações preferivelmente conservadoras (conforme descritas anteriormente) são introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos, mas são preferivelmente substituições. Para além disso, tipicamente não mais de cinco resíduos são alterados dentro de uma região CDR.
Os anticorpos manipulados da invenção incluem aqueles nos quais as modificações foram feitas nos resíduos estruturais dentro da VH e/ou VL, por exemplo para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações estruturais são feitas para diminuir a imunogenecidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem consiste em realizar uma "retromutação" de um ou mais resíduos estruturais para a sequência da linha germinal correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que foi submetido a mutação somática pode conter resíduos estruturais que diferem da sequência da linha germinal a partir da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados através da comparação das sequências estruturais do anticorpo com as sequências da linha germinal a partir da qual o anticorpo é derivado. Por exemplo, para o 3F11, o resíduo de aminoácido n°43 (dentro de FR2) da VH é uma treonina enquanto este resíduo na sequência da linha germinal da VH 4-34 é uma alanina (ver 34 ΕΡ1781705Β1
Figura 5). Para fazer voltar as sequências de região estrutural à sua configuração da linha germinal, as mutações somáticas podem ser "retromutadas" para a sequência da linha germinal através de, por exemplo mutagénese direcionada a um local ou mutagénese mediada por PCR (por exemplo, o resíduo 43 da VH do 3F11 pode ser "retromutado" de treonina a alanina). Como outro exemplo, para o 4G5, o resíduo de aminoácido n°81 (dentro de FR3) da VH é uma asparagina enquanto este resíduo na sequência da linha germinal da VH 4-34 é uma lisina (ver Figura 6). Para fazer voltar as sequências de região estrutural à sua configuração da linha germinal, as mutações somáticas podem ser "retromutadas" de asparagina a lisina. Como outro exemplo, para ο 11E2 e 9D4, o resíduo de aminoácido n°28 (dentro de FR1) da VH é uma isoleucina enquanto este resíduo na sequência da linha germinal da VH 5-51 é uma serina (ver Figura 7) . Para fazer voltar as sequências de região estrutural à sua configuração da linha germinal, as mutações somáticas podem ser "retromutadas" de isoleucina a serina. Os tais anticorpos "retromutados" destinam-se também a ser englobados pela invenção.
Outro tipo de modificação estrutural envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região estrutural, ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de células T para reduzir assim a potencial imunogenicidade do anticorpo. Esta abordagem é também é referida como "desimunização" e é descrita em detalhe adicional na Publicação de Patente U.S. N° 20030153043 por Carr et al.
Em adição ou alternativa às modificações feitas nas regiões estruturais ou CDR, os anticorpos da invenção podem ser manipulados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como semi-vida no soro, fixação do complemento, ligação ao recetor Fc, e/ou 35 ΕΡ1781705Β1 citotoxicidade celular dependente de antigénio. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais frações químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar a sua glicosilação, uma vez mais para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas formas de realização é descrita em detalhe adicional abaixo. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU de Kabat.
Numa forma de realização, a região de dobradiça do CHI é modificada de tal forma que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é adicionalmente descrita na Patente U.S. N° 5.677.425 por Bodmer et al. 0 número de resíduos de cisteína na região de dobradiça do CHI é alterada para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias pesada e leve ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.
Noutra forma de realização, a região de dobradiça Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a semi-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações dos aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH1-CH3 do fragmento de dobradiça Fc de tal forma que o anticorpo tem uma ligação comprometida à proteína A Estafilocócica (SpA) em relação à ligação à SpA do domínio de dobradiça Fc nativo. Esta abordagem é descrita em detalhe adicional na Patente U.S. N° 6.165.745 por Ward et al.
Noutra forma de realização, o anticorpo é modificado para aumentar a sua semi-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na Patente U.S. N° 6.277.375 para Ward. Alternativamente, para aumentar o tempo de semi-vida biológico, o anticorpo pode ser alterado dentro da região 36 ΕΡ1781705Β1 CHI ou CL para conter um epítopo de ligação a um recetor selvagem tomado a partir de duas ansas de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes U.S. N°s 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al..
Ainda noutras formas de realização, a região Fc é alterada através da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de tal forma que o anticorpo possui uma afinidade alteradas para um ligando efetor mas retém a capacidade de ligação a antigénio do anticorpo mãe. O ligando efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um recetor Fc ou o componente Cl do complemento. Esta abordagem é descrita em detalhe adicional nas Patentes U.S. N° 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter et al..
Noutro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de tal forma que o anticorpo possui uma ligação a Clq alterada e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) reduzida ou abolida. Esta abordagem é descrita em detalhe adicional na Patente U.S. N° 6.194.551 por Idusogie et al..
Noutro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das posições de aminoácidos 231 e 239 são alterados para alterar assim a capacidade do anticorpo para fixar o complemento. Esta abordagem é adicionalmente descrita na Publicação do PCT WO 94/29351 por Bodmer et al..
Ainda noutro exemplo, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um recetor Fcy através da modificação de um ou mais aminoácidos nas 37 ΕΡ1781705Β1 seguintes posiçoes: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388 389, 398, 414, 416, 419 , 430 , 434 , 435 , 437, 438 ou 439
Esta abordagem é adicionalmente descrita na Publicação do PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os locais de ligação na IgGl humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (ver Shields, R.L. et ai. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Mostrou-se que mutações especificas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 melhoram a ligação ao FcyRIII. Adicionalmente, mostrou-se que os seguintes mutantes de combinação melhoram a ligação ao FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.
Ainda noutra forma de realização, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (ou seja, o anticorpo não tem glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo pelo antigénio. Tais modificações de carbohidratos podem ser alcançadas através de, por exemplo, a alteração de um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas que resultem na eliminação de um ou mais locais de glicosilação da estrutura de região variável para eliminar deste modo, a glicosilação nesse local. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antigénio. Tal abordagem é descrita em detalhe adicional nas Patentes U.S. N°s 5.714.350 e 6.350.861, ambas por Co et al. .
Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo que tem um tipo alterado de glicosilação pode ser feito, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosilo ou um anticorpo tendo 38 ΕΡ1781705Β1 estruturas GlcNac bissetoras aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterada foram demonstrados como aumentando a capacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações de carbohidratos podem ser alcançadas através de, por exemplo, expressão do anticorpo numa célula hospedeira com uma maquinaria de glicosilação alterada. Células com uma maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser utilizadas como células hospedeiras para nelas expressar anticorpos recombinantes da invenção para produzir deste modo um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, o documento EP 1.176.195 por Hanai et al. descreve uma linha celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, o qual codifica uma transferase fucosilo, de tal forma que os anticorpos expressos na dita linha celular exibem hipofucosilação. A Publicação do PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linha celular CHO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida para anexar fucose a carbohidratos ligados a Asn(297), resultando também na hipofucosilação dos anticorpos expressos nessa célula hospedeira (ver também Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740) . A Publicação do PCT WO 99/54342 por Umana et al. descreve linhas celulares manipuladas para expressar glicosil transferares modificadoras de glicoproteinas (por exemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de tal forma que os anticorpos expressos nas linhas celulares manipuladas exibem estruturas GlcNac bissetoras aumentadas o que resulta numa atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (ver também Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).
Outra modificação dos anticorpos do presente documento que é contemplada pela invenção é a peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado para, por exemplo, aumentar a semi-vida biológica (por exemplo, sérica) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do 39 ΕΡ1781705Β1 mesmo, é tipicamente reagido com polietilenoglicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivativo de aldeído do PEG, sob condições nas quais um ou mais grupos PEG se tornam anexados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peguilação é levada a cabo através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula PEG reativa (ou um polímero hidrossolúvel análogo). Conforme utilizado na presente invenção, o termo "polietilenoglicol" destina-se a englobar qualquer uma das formas de PEG que foram utilizadas para derivatizar outras proteínas, tais como polietilenoglicol alcoxi ou ariloxi (C1-C10) ou polietilenoglicol maleimida. Em determinadas formas de realização, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilar proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Ver por exemplo, os documentos EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.. Métodos de Manipulação de Anticorpos
Assim, noutro aspeto da invenção, as características estruturais de anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção, por exemplo o 3F11, 4G5 e 9D4 são utilizadas para criar anticorpos anti-IFNAR-1 estruturalmente relacionados que retêm pelo menos, uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como a ligação ao IFNAR-1. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR do 3F11, 4G5, ou 9D4, ou mutações das mesmas, podem ser combinadas de forma recombinante com regiões estruturais conhecidas e/ou outras CDRs para criar, anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção adicionais, manipulados de forma recombinante, conforme discutido anteriormente. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na secção anterior. O material de iniciação para o método de manipulação é uma ou mais das sequências da VH e/ou VL proporcionadas no presente documento, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Para criar o anticorpo manipulado, não é necessário, na verdade, preparar (ou seja, expressar 40 ΕΡ1781705Β1 como uma proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das sequências da VH e/ou VL proporcionadas no presente documento, ou uma ou mais das regiões CDR das mesmas. Em vez disso, a informação contida na(s) sequência(s) é utilizada como o material de iniciação para criar uma ou mais sequências de "segunda geração" derivadas a partir da(s) sequência(s) original(ais) e depois a(s) sequência(s) de "segunda geração" é(são) preparada(s) e expressa(s) como uma proteína.
Consequentemente, um método para a preparação do tal anticorpo anti-IFNAR-1 manipulado compreende: (a) proporcionar: (i) uma sequência de região variável de cadeia pesada da invenção e (ii) uma sequência de região variável de cadeia leve da invenção; (b) alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da primeira sequência do anticorpo e/ou da segunda sequência do anticorpo para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e (c) preparar a sequência de anticorpo alterada; (d) expressar a sequência de anticorpo alterada como uma proteína. Técnicas de biologia molecular padrão podem ser utilizadas para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada.
Preferivelmente, o anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) é um que retém uma, algumas ou todas as propriedades funcionais do anticorpos anti-IFNAR-1 descritos no presente documento, propriedades funcionais as quais incluem, mas não estão limitadas a: (i) ligação ao IFNAR-1; (ii) inibição da ligação de interferões tipo I ao IFNAR-1; (iii) ligação a células vivas que expressam o IFNAR-1 humano; 41 ΕΡ1781705Β1 (iv) ligação ao IFNAR-1 humano com uma KD de IO-8 M ou menos (por exemplo 1CT9 M ou IO-10 M ou menos) ; (v) ligação a um epítopo único no IFNAR-1 (para eliminar a possibilidade de gue anticorpos monoclonais com atividades complementares, guando utilizados em combinação, compitam pela ligação ao mesmo epítopo).
As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser analisadas utilizando ensaios padrão disponíveis na técnica e/ou descritos no presente documento. Por exemplo, a capacidade do anticorpo para se ligar ao IFNAR-1 pode ser determinada utilizando ensaios de ligação padrão, tais como aqueles estabelecidos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).
Em determinadas formas de realização dos métodos de manipulação de anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas ao acaso ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência codificadora de anticorpo anti-IFNAR-1 (por exemplo, sequências codificadoras do 3F11, 4G5 ou 9D4) e os anticorpos anti-IFNAR-1 modificados resultantes podem ser rastreados para atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais conforme descrito no presente documento. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, a Publicação do PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para criar e rastrear mutações de anticorpos utilizando mutagénese de saturação, montagem de ligação sintética, ou uma combinação das mesmas.
Alternativamente, a Publicação do PCT WO 03/074679 por Lazar et al. descreve métodos de utilização de métodos de rastreamento computacional para otimizar as propriedades físico-químicas dos anticorpos.
Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Anticorpos da Invenção
Outro aspeto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da invenção. Os 42 ΕΡ1781705Β1 ácidos nucleicos podem estar presentes em células totais, num lisado celular, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, através de técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandeamento de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Ver, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, ADN ou ARN e pode ou não conter sequências intrónicas. Numa forma de realização preferida, o ácido nucleico é uma molécula de cADN.
Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de ratinhos transgénicos que transportam genes de imunoglobulinas humanas conforme descrito adicionalmente mais abaixo), os cADNs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo feito pelo hibridoma podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cADN. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulinas (por exemplo, utilizando técnicas de exibição de fagos), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado a partir da biblioteca.
Moléculas de ácido nucleico preferidas da invenção são aquelas que codificam as sequências VH e VL dos anticorpos monoclonais 3F11, 4G5 e 9D4. As sequências de ADN que codificam as sequências da VH e VL do 3F11 são mostradas nos SEQ ID NOs: 33 e 37, respetivamente. As sequências de ADN que codificam as sequências da VH e VL do 4G5 são mostradas nos SEQ ID NOs: 34 e 38, respetivamente. As 43 ΕΡ1781705Β1 sequências de ADN que codificam as sequências da VH e VL do 11E2 são mostradas nos SEQ ID NOs: 35 e 39, respetivamente. As sequências de ADN que codificam as sequências da VH e VL do 9D4 são mostradas nos SEQ ID NOs: 36 e 40, respetivamente.
Uma vez que os fragmentos de ADN que codificam segmentos da VH e VL são obtidos, estes fragmentos de ADN podem ser adicionalmente manipulados através de técnicas padrão recombinantes de ADN, por exemplo, para converter os genes de regiões variáveis em genes de cadeia de anticorpos completos, em genes de fragmento Fab ou num gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de ADN codificante de uma VL ou VH é operacionalmente ligado a outro fragmento de ADN que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operacionalmente ligado", conforme utilizado neste contexto, destina-se a significar que os dois fragmentos de ADN são juntos de tal forma que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de ADN permanecem na estrutura. O ADN isolado que codifica a região VH pode ser convertido num gene de cadeia pesada de comprimento completo operacionalmente ligando o ADN codificador da VH a outra molécula de ADN que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3) . As sequências dos genes de região constante de cadeia pesada humanos são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de ADN que englobem estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas mais preferivelmente é uma região constante de IgGl ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento 44 ΕΡ1781705Β1
Fab, o ADN codificador da VH pode ser operacionalmente ligado a outra molécula de ADN que codifique apenas a região constante CHI de cadeia pesada. 0 ADN isolado que codifica a região VL pode ser convertido num gene de cadeia leve de comprimento completo (bem como um gene de cadeia leve Fab) operacionalmente ligando o ADN codificador da VL a outra molécula de ADN que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes de região constante de cadeia leve humanos são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de ADN que englobem estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda, mas mais preferivelmente é uma região constante kappa.
Para criar um gene scFv, os fragmentos de ADN que codificam a VH e VL são operacionalmente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de tal forma que as sequências de VH e VL podem ser expressas como uma proteína contígua de cadeia única, com as regiões VL e VH juntas pelo ligante flexível (ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Produção de Anticorpos Monoclonais da Invenção
Anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpos monoclonais convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de células somáticas padrão de Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Embora os procedimentos de hibridização de células somáticas sejam preferidos, em princípio, outras técnicas 45 ΕΡ1781705Β1 para a produção de anticorpos monoclonais podem ser empregues, por exemplo, transformação virai ou oncogénica de linfócitos B. 0 sistema animal preferido para a preparação de hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridomas no ratinho é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são bem conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células do mieloma murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.
Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murino preparado conforme descrito anteriormente. 0 AND que codifica as imunoglobulinas de cadeia leve e pesada pode ser obtido a partir do hibridoma murino de interesse e manipulados para conter sequências de imunoglobulinas não murinas (por exemplo, humanas) utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas a regiões constantes humanas utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.816.567 para Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas numa estrutura humana utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a patente U.S. N° 5.225.539 para Winter, e Patentes U.S. N°s 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.) .
Numa forma de realização preferida, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais direcionados contra o IFNAR-1 podem ser gerados utilizando ratinhos transgénicos ou transcromossómicos que transportam partes do sistema imunitário humano em vez do sistema de ratinho. Estes 46 ΕΡ1781705Β1 ratinhos transgénicos e transcromossómicos incluem ratinhos referidos no presente documento como ratinhos HuMab e ratinhos KM, respetivamente, e são coletivamente referidos no presente documento, como "ratinhos de Ig humana". 0 ratinho HuMab® (Medarex, Inc.) contém miniloci de genes de imunoglobuilinas humanas que codificam sequências de imunoglobulinas de cadeia pesada (μ e γ) e leve κ humanas não rearranjadas, juntamente com mutações alvo que inativam os loci de cadeia μ e κ endógenos (ver, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Consequentemente, os ratinhos exibem uma expressão reduzida de IgM ou κ de ratinho, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos são submetidos a uma mudança de classe e mutação somática para gerar IgGx monoclonal humana de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad Sei. 764:536-546). A preparação e utilização de ratinhos HuMab, e das modificações genómicas transportadas pelos tais ratinhos, são adicionalmente descritas em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851.
Ver adicionalmente, as Patentes U.S. N°s 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. N° 5.545.807 para Surani et al.; Publicações do PCT N°s WO 92/03918, WO 93/12227, WO 47 ΕΡ1781705Β1 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação do PCT N° WO 01/14424 para Korman et al. .
Noutra forma de realização, os anticorpos humanos da invenção podem ser desenvolvidos utilizando um ratinho que transporta sequências de imunoglobullinas humanas em trasngenes e trasncromossomas, tal como um ratinho que transporta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossomda de cadeia leve humano. Tais ratinhos, referidos no presente documento como "ratinhos KM", são descritos em detalhe na Publicação do PCT WO 02/43478 para Ishida et al..
Ainda adicionalmente, sistemas animais transgénicos alternativos que expressam genes de imunoglobulinas humanas estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para desenvolver anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção. Por exemplo, um sistema trasgénico alternativo referido como o Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser utilizado; tais ratinhos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati et al..
Para além disso, sistemas animais transcromossómicos alternativos que expressam genes de imunoglobulinas humanas estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para desenvolver anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção. Por exemplo, ratinhos que transportam tanto um transcromssoma de cadeia pesada humano como um transcromossoma de cadeia leve humano, referidos como "ratinhos TC" podem ser utilizados; tais ratinhos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727. Além disso, vacas que transportam transcromossomas de cadeia pesada e leve humanos foram descritas na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser utilizadas para desenvolver anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção. 48 ΕΡ1781705Β1
Os anticorpos monoclonais da invenção podem também ser prepados utilizando métodos de exibição de fagos para rastrear bibliotecas de genes de imunoglobulinas humanas. Os tais métodos de exibição de fagos para o isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Ver por exemplo: Patentes U.S. N°s 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 para Ladner et al.; Patentes U.S. N°s 5.427.908 e 5.580.717 para Dower et al.} Patentes U.S. N°s 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al.; e Patentes U.S. N°s 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths et al..
Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem também ser preparados utilizando ratinhos SCID nos quais células imunitárias humanas foram reconstituídas de tal forma que uma resposta de anticorpos humanos pode ser gerada após a imunização. Tais ratinhos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.476.996 e 5.698.767, para Wilson et al. .
Imunização de Ratinhos de Ig Humana
Quando ratinhos de Ig humana são utilizados para desenvolver os anticorpos humanos da invenção, tais ratinhos podem ser imunizados com uma preparação de antigénio de IFNAR-1 purificada ou enriquecida e/ou células que expressam o IFNAR-1, conforme descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicação do PCT WO 98/24884 e WO 01/14424. Preferivelmente, os ratinhos terão 6-16 semanas de idade após a primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou enriquecida (5-50 pg) de antigénio de IFNAR-1 pode ser utilizada para imunizar por via intraperitoneal os ratinhos de Ig humana. No caso das imunizações utilizando uma preparação de antigénio de IFNAR-1 purificada ou enriquecida não resultarem em anticorpos, os ratinhos podem também ser imunizados com células que expressam o IFNAR-1, 49 ΕΡ1781705Β1 por exemplo, uma linha de células T humanas, para promover as respostas imunes.
Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais completamente humanos para o IFNAR-1 são descritos no Exemplo 1 abaixo. Experiência cumulativa com vários antigénios mostrou que os ratinhos transgénicos respondem quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antigénio em adjuvante de Freund completo, seguidos de imunizações IP semana sim, semana não (até um total de 6) com antigénio em adjuvante de Freund incompleto. Contudo, outros adjuvantes para além do de Freund são também considerados eficazes. Adicionalmente, células totais na ausência do adjuvante são consideradas como sendo altamente imunogénicas. A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas através de hemorragias retro-orbitárias. 0 plasma pode ser rastreado através de ELISA (conforme descrito abaixo), e ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-IFNAR-1 podem ser utilizados para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados por via intravenosa com antigénio, 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que 2-3 fusões por cada imunização possam ter de ser realizadas. Entre 6 e 24 ratinhos são tipicamente imunizados para cada antigénio. Normalmente são utilizadas ambas as estirpes HCo7 e HC012. Adicionalmente, ambos os transgenes HCo7 e HCol2 podem ser produzidos juntos num único ratinho tendo dois transgenes de cadeia pesada humanos diferentes (HCo7/HCol2).
Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos da Invenção
Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos da invenção, células de esplenócitos e/ou linfonodos de ratinhos imunizados podem ser isoladas e fundidas numa linha celular imortalizada apropriada, tal 50 ΕΡ1781705Β1 como uma linha celular de mieloma murino. Os hibridomas resultantes podem ser rastreados para a produção de anticorpos específicos para antigénios. Por exemplo, suspensões de células únicas de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados podem ser fundidas num sexto do número de células de mieloma murino não secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com PEG a 50%. As células são colocadas em placas a aproximadamente 2 x 105 em placas de microtitulação de fundo plano, seguidas de uma incubação de duas semanas em meio seletivo contento Soro de Clone fetal a 20%, meios condicionado "653" a 18%, origen (IGEN) a 5%, L-glutamina a 4 mM, piruvato de sódio a 1 mM, HEPES a 5 mM, 2-mercaptoetanol a 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina e HAT IX (Sigma, o HAT é adicionado 24 horas depois da fusão). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas num meio no qual o HAT é substituído com HT. Poços individuais podem então ser rastreados através de ELISA para anticorpos IgM e IgG monoclonais humanos. Uma vez que o crescimento extensivo do hibridoma ocorre, o meio pode ser observado normalmente depois de 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos podem ser colocados em placas novamente, rastreados novamente, e se ainda forem positivos para a IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes através de diluição limitante. Os subclones estáveis podem depois ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo no meio de cultura de tecidos para caracterização.
Para purificar anticorpos monoclonais humanos, hibridomas selecionados podem ser cultivados em balões de vidro giratórios de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) . A IgG eluída pode ser verificada através de 51 ΕΡ1781705Β1 eletroforese em gel e cromatografia líguida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de DO280 utilizando o coeficiente de extinção 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em aliquotas e armazenados a -80 °C.
Geração de Transfectomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos da Invenção
Os anticorpos da invenção podem também ser produzidos num transfectoma de célula hospedeira, utilizando por exemplo, uma combinação de técnicas recombinantes de ADN e métodos de transfecção de genes conforme é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229.1202) .
Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, ADNs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento completo, podem ser obtidos através de técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de cADN utilizando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os ADNs podem ser inseridos em vetores de expressão de tal forma que os genes operacionalmente ligados a sequências de controlo da transcrição e da tradução. Neste contexto, o termo "operacionalmente ligados" destina-se a significar que um gene de anticorpo está ligado num vetor de tal forma que as sequências de controlo da transcrição e da tradução dentro do vetor servem a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controlo da expressão são escolhidas de formas a serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes 52 ΕΡ1781705Β1 de anticorpos são inseridos no vetor de expressão através de métodos padrão (por exemplo, ligação de locais de restrição de complementaridade no fragmento do gene do anticorpo e vetor, ou ligação de extremidades cegas se não estiverem presentes nenhuns locais de restrição). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos descritos no presente documento podem ser utilizadas para criar genes de anticorpos de comprimento completo de qualquer isotipo de anticorpo inserindo-os em vetores de expressão que já codificam regiões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia leve do isotipo de tal forma que o segmento de VH está operacionalmente ligado ao (s) segmento (s) CH dentro do vetor e o segmento VL está operacionalmente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um péptido sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de tal forma que o péptido sinal está ligado em estrutura ao amino terminal do gene de cadeia do anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (ou seja, um péptido sinal de uma proteína não imunoglobulina).
Adicionalmente aos genes de cadeia de anticorpos, os vetores de expressão recombinantes da invenção transportam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeias de anticorpos numa célula hospedeira. 0 termo "sequências reguladoras" destina-se a incluir promotores, potenciadores e outros elementos de controlo da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. As tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)) . Será apreciado por aqueles peritos na especialidade que o 53 ΕΡ1781705Β1 desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção das sequências reguladoras, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão da proteína desejado, etc. Sequências reguladoras preferidas para a expressão de células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteínas em células de mamíferos, tais como promotores e/ou potenciadores derivados a partir do citómegalovirus (CMV), Virus Símio 40 (SV40), adenovirus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP) e polioma. Alternativamente, as sequências reguladoras não virais podem ser utilizadas, tal como o promotor da ubiquitina ou o promotor da β-globina. Ainda adicionalmente, elementos reguladores compostos por sequências a partir de diferentes fontes, tal como o sistema promotor de SRa, o qual contém sequências do promotor precoce de SV40 e a repetição terminal longa do vírus de tipo 1 da leucemia de células T humana (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472) .
Adicionalmente aos genes de cadeia de anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem transportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens da replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, Patentes U.S. N°s 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel et al.) . Por exemplo, o gene marcador selecionável confere tipicamente resistência aos fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) (para utilização em células 54 ΕΡ1781705Β1 hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o neo gene (para a seleção de G418).
Para a expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor (s) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada e leve é(são) transfectado(s) numa célula hospedeira através de técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" destinam-se a englobar uma ampla variedade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de AND exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e semelhantes. Apesar de ser teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção seja em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão dos anticorpos em células eucarióticas, e mais preferivelmente células hospedeiras de mamíferos, é a mais preferida porque tais células eucarióticas, e em particular células de mamíferos, são mais propensas, do que as células procarióticas, a montar e secretar um anticorpo imunologicamente ativo e devidamente dobrado. A expressão procariótica de genes de anticorpos foi relatada como sendo ineficaz para a produção de grandes rendimentos de anticorpos ativos (Boss, Μ. A. e Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Células hospedeiras de mamíferos preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, utilizadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para utilização com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão do gene GS nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de expressão 55 ΕΡ1781705Β1 recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos através da cultura de células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo para o meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteínas padrão.
Caracterização da Ligação do Anticorpo ao Antigénio
Os anticorpos da invenção podem ser testados para a ligação ao IFNAR-1 através de, por exemplo, ELISA padrão. Brevemente, as placas de microtitulação são revestidas com IFNAR-1 purificado a 0,25 pg/ml em PBS, e depois bloqueadas com albumina sérica bovina a 5% em PBS. As diluições do anticorpo (por exemplo, diluições de plasma de ratinhos imunizados com IFNAR-1) são adicionadas a cada poço e incubadas e incubadas durante 1-2 horas a 37 °C. As placas são lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com um reagente secundário (por exemplo, para anticorpos humanos um reagente policlonal específico de cabra anti-Fc de IgG humana) conjugado com fosfatase alcalina durante 1 hora a 37 °C. Depois da lavagem, as placas são reveladas com substrato pNPP (1 mg/ml), e analisadas a uma DO de 405-650. Preferivelmente, os ratinhos que desenvolvem os títulos mais altos serão utilizados para fusões.
Um ensaio de ELISA conforme descrito acima pode também ser utilizado para rastrear hibridomas que mostram uma reatividade positiva com o imunogénio de IFNAR-1. Os hibridomas que se ligam com alta avidez ao IFNAR-1 são subclonados e adicionalmente caracterizados. Um clone de cada hibridoma, o qual retém a reatividade das células mãe (através de ELISA), pode ser escolhido para fazer um banco de células de 5-10 frascos armazenados a -140 °C, e para 56 ΕΡ1781705Β1 purificação de anticorpos.
Para purificar anticorpos anti-IFNAR-1, os hibridomas selecionados podem ser cultivados em balões de vidro giratórios para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . A IgG eluída pode ser verificada através de eletroforese em gel e cromatografia liquida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de D02so utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotas e armazenados a -80 °C.
Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-IFNAR-1 selecionados se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). Estudos de competição utilizando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados utilizando placas de ELISA revestidas com IFNAR-1 conforme descrito acima. A ligação de mAb biotinilado pode ser detetada com uma sonda de estreptavidina-fosfatase alcalina.
Para determinar o isotopo dos anticorpos purificados, ELISAs de isotipo podem ser realizadas utilizando reagentes específicos para anticorpos de um isotipo particular. Por exemplo, para determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, os poços das placas de microtitulação podem ser revestidas com 1 pg/ml de imunoglobulina anti-humana durante a noite a 4 °C. Depois do bloqueio com BSA a 1%, as placas são reagidas com 1 pg/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste ou controlos de isotipos purificados, à temperatura ambiente durante uma ou duas horas. Os poços podem então ser reagidos tanto com sondas de IgGl humana ou sondas de IgM humana conjugadas com 57 ΕΡ1781705Β1 fosfatase alcalina específica. As placas são reveladas e analisadas conforme descrito acima.
Para demonstrar a ligação dos anticorpos monoclonais a células vivas que expressam o IFNAR-1, pode ser utilizada a citometria de fluxo. Brevemente, as linhas celulares que expressam o IFNAR-1 (crescem sob condições de crescimento padrão) são misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendo BSA a 0,1% e soro de bezerro fetal, e incubadas a 37 °C durante 1 hora. Depois da lavagem, as células são reagidas com anticorpo anti-IgG humana marcado com fluoresceína sob as mesmas condições da coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas através de um instrumento FACScan utilizando propriedades de luz e dispersão lateral para aceder a células individuais. Um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência pode ser utilizado (adicionalmente a ou em vez do) ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exatamente conforme descrito acima e examinadas através de microscopia de fluorescência. Este método permite a visualização de células individuais, mas poderá ter uma sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antigénio.
As IgGs humanas anti-IFNAR-1 podem ser adicionalmente testadas para a reatividade com o antigénio de IFNAR-1 através de Western blotting. Brevemente, os extratos celulares a partir de células que expressam o IFNAR-1 podem ser preparados e submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio. Depois da eletroforese, os antigénios separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro de bezerro fetal a 10%, e sondados com os anticorpos monoclonais a ser testados. A ligação de IgG humana pode ser detetada utilizando anti-IgG humana conjugado com fosfatase alcalina e revelada com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.). 58 ΕΡ1781705Β1
Imunoconjugados
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-IFNAR-1, ou um fragmento do mesmo, conjugado com uma fração terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são referidos no presente documento como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para (ou seja, que mata) as células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitocina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracenodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidroxitestosterona, glucocorticóides, procaina, tetracaína, lidocaina, propanolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Os agentes terapêuticos também incluem, por exemplo, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina, agentes alquilantes (por exemplo, meclorotamina, tiotepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfona, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiaminoplatina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).
Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas com um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas e derivativos das mesmas. Um exemplo de um conjugado de anticorpo e caliqueamicina está comercialmente 59 ΕΡ1781705Β1 disponível (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
As citotoxinas podem ser conjugadas com os anticorpos da invenção utilizando tecnologia de ligantes disponível na técnica. Exemplos de tipos de ligantes gue têm sido utilizados para conjugar uma citotoxina com um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfitos e ligantes gue contêm péptidos. Pode ser escolhido um ligante gue é, por exemplo, suscetível à clivagem pelo baixo pH dentro do compartimento dos lisossomas ou suscetível à clivagem pelas proteases, tais como proteases preferivelmente expressas em tecido tumoral tais como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).
Para discussão adicional dos tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugação de agentes terapêuticos com anticorpos, ver também Saito, G. et ai. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Câncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Câncer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Câncer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
Anticorpos da presente invenção podem também ser conjugados com um isotopo radioativo para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isotopos radioativos gue podem ser conjugados com anticorpos para utilização diagnóstica ou terapêutica incluem, mas não estão limitados a, iodo131, índio111, ítrio90 e lutétio177. Métodos para preparar radioimunoconjugados são estabelecidos na técnica. Exemplos de radoimunoconjugados estão comercialmente disponíveis, incluindo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) , e métodos semelhantes podem ser utilizados para preparar radioimunoconjugados utilizando os anticorpos da invenção.
Os conjugados de anticorpos da invenção podem ser 60 ΕΡ1781705Β1 utilizados para modificar uma dada resposta biológica, e a fração do fármaco não deve ser construída como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fração do fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido que processa uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou um fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ou toxina diftérica; uma proteína tal como o fator de necrose tumoral ou interferão-γ; ou modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulador de colónias de macrógafos granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulador de colónias de granulócitos ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento. Técnicas para a conjugação da tal fração terapêutica com anticorpos são bem conhecidas, ver, por exemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer
Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss,
Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987);
Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84:
Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future
Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer
Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Moléculas Biespecíficas
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona 61 ΕΡ1781705Β1 moléculas biespecíficas que compreendem um anticorpo anti-IFNAR-1, ou fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro péptido ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligando para um recetor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois locais de ligação diferentes ou moléculas alvo. 0 anticorpo da invenção pode, de fato, ser derivatizado ou ligado a mais do que uma molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais do que dois locais de ligação e/ou moléculas alvo; tais moléculas multiespecíficas destinam-se também a ser englobadas pelo termo "molécula biespecífica" conforme utilizado no presente documento. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais moléculas de ligação, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, péptido ou mimético de ligação, de tal forma que resulta uma molécula biespecífica.
Consequentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem pelo menos uma primeira especificidade de ligação para o IFNAR-1 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Numa forma de realização particular da invenção, o segundo epítopo alvo é um recetor Fc, por exemplo FcyRI humano (CD64) ou um recetor Fca humano (CD89). Desta forma, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de se ligar a células efetoras que expressam tanto FcyR, FcaR ou FcDR (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)), e a células alvo que expressam o IFNAR-1. Estas moléculas biespecíficas marcam como alvo células que expressam o IFNAR-1 para células efetoras e desencadeiam atividades das células efetoras mediadas pelo 62 ΕΡ1781705Β1 recetor Fc, tais como fagocitose de células que expressam o IFNAR-1, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), libertação de citoquinas, ou geração de anião superóxido.
Numa forma de realização da invenção na qual a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula podem incluir adicionalmente uma terceira especificidade de ligação, adicionalmente a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-IFNAR-1. Numa forma de realização, a terceira especificidade de ligação é uma porção anti-fator potenciador (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e que aumenta assim a resposta imune contra a célula alvo. A "porção anti-fator potenciador" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligando que se liga a uma dada molécula por exemplo, um antigénio ou um recetor, e que resulta assim numa potenciação do efeito dos determinantes de ligação para o recetor Fc ou antigénio da célula alvo. A "porção anti-fator potenciador" pode ligar-se a um recetor Fc ou um antigénio da célula alvo. Alternativamente, a porção anti-fator potenciador pode ligar-se a uma entidade que é diferente da entidade à qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção anti-fator potenciador pode ligar-se a uma célula T citotóxica (por exemplo, através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD 4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imune que resulta numa resposta imune aumentada contra a célula alvo).
Numa forma de realização, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação, pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou uma cadeia simples de Fv. 0 anticorpo pode ser também um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo tal como um Fv ou um vetor de 63 ΕΡ1781705Β1 cadeia única conforme descrito em Ladner et al. Patente U.S. N° 4.946.778, os conteúdos da qual são expressamente incorporados como referência.
Numa forma de realização, a especificidade de ligação para um recetor Fcy é fornecida por um anticorpo monoclonal, a ligação do qual não é bloqueada pela imunoglobulina G (IgG) humana. Conforme utilizado no presente documento, o termo "recetor de IgG" refere-se a qualquer um dos genes de oitenta cadeias γ localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas de recetores trasnmembranares ou solúveis que estão agrupados em três classes de recetores Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) e FcyRIII (CD16). Numa forma de realização preferida, o recetor Fcy é um FcyRI de alta afinidade humano. 0 FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, a qual demonstra alta afinidade para a IgG monomérica (108 - 109 M-1) . A produção e caracterização de determinados anticorpos monoclonados anti-FcY preferidos são descritas por Fanger et al. na Publicação do PCT WO 88/00052 e na Patente U.S. N° 4.954.617, os ensinamentos das quais são incorporados na sua totalidade no presente documento como referência. Estes anticorpos ligam-se a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII num local que é diferente do local de ligação a Fcy do recetor e, assim, a sua ligação não é substancialmente bloqueada por niveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis nesta invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O hibridoma que produz mAb 32 está disponível a partir de American Type Culture Collection, N° de Acesso ATCC HB9469. Noutra forma de realização, o anticorpo anti-recetor Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22) . A produção e caracterização do anticorpo H22 estão descritas em Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10) : 4996-5002 e Publicação do PCT WO 94/10332. A linha celular que produz 64 ΕΡ1781705Β1 o anticorpo Η22 foi depositada na American Type Culture Collection sob a designação HA022CL1 e tem o N° de acesso CRL 11177.
Ainda noutras formas de realização preferidas, a especificidade de ligação para um recetor Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um recetor de IgA humana, por exemplo, um recetor Fc-alfa (FcaRI (CD89)), a ligação do qual é preferivelmente não bloqueada pela imunoglobulina A (IgA) humana. 0 termo "recetor IgA" destina-se a incluir o produto de gene de um gene-alfa (FcaRI) localizado no cromossoma 19. Este gene é conhecido como codificador de várias isoformas transmembranares alternativamente cortadas de 55 a 110 kDa. O Fca RI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofilicos e neutrofilicos, mas não em populações celulares não efetoras. O FcaRI tem uma afinidade média (¾ 5 x 107 M-1) tanto para a IgAl como para a IgA2, a qual é aumentada após a exposição a citoquinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C et al. (1996) Criticai Reviews in Immunology 16:423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos para o FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, os quais se ligam ao FcaRI fora do dominio de ligação do ligante de IgA, foram descritos (Monteiro, R.C et al. (1992) J. Immunol. 148:1764) . O FcaRI e FcyRI são recetores desencadeadores preferidos para utilização nas moléculas biespecificas da invenção porque são (1) expressos primariamente em células imunes efetoras, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) expressos em altos níveis (por exemplo 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose); (4) mediadores da apresentação antigénica de antigénios, incluindo auto-antigénios, direcionados para eles.
Enquanto os anticorpos monoclonais humanos são 65 ΕΡ1781705Β1 preferidos, outros anticorpos que podem ser empregues nas moléculas biespecificas da invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.
As moléculas biespecificas da presente invenção podem ser preparadas através da conjugação das especificidades de ligação constituintes, por exemplo especificidades de ligação anti-FcR e anti-IFNAR-1, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugada uma à outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação podem ser utilizados para a conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiímida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridildítio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375) . Agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis a partir de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Quando as especificidades de ligação são anticorpos, elas podem ser conjugadas através de ligação de sulfidrilo das regiões de dobradiça do C-terminal das duas cadeias pesadas. Numa forma de realização particularmente preferida, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrilo, preferivelmente um, antes da conjugação.
Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas 66 ΕΡ1781705Β1 na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou proteína de fusão ligando x Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única que compreende um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única que compreende dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para a preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. Número 5.260.203; Patente U.S. Número 5.455.030; Patente U.S. Número 4.881.175; Patente U.S. Número 5.132.405; Patente U.S. Número 5.091.513; Patente U.S. Número 5.476.786; Patente U.S. Número 5.013.653; Patente U.S. Número 5.258.498; e Patente U.S. Número 5.482.858. A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada através de, por exemplo, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento), ou ensaio Western Blot. Cada um destes ensaios deteta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo de interesse particular empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detetados utilizando por exemplo, um anticorpo ligado a enzima ou um fragmento de anticorpo o qual reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detetados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioativamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, o 67 ΕΡ1781705Β1 qual é incorporado como referência no presente documento). 0 isotopo radioativo pode ser detetado através de meios como a utilização de um contador γ ou um contador de cintilação ou através de autoradiografia.
Composições Farmacêuticas
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, que contém um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou porção (ões) de ligação a antigénio dos mesmos, da presente invenção, formulados em conjunto com um portador farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais) anticorpos diferentes, ou imunoconjugados ou moléculas biespecificas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecificos) que se ligam a epítopos diferentes no antigénio alvo ou que têm atividades complementares.
As composições farmacêuticas da invenção podem também ser administradas em terapêutica de combinação, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapêutica de combinação pode incluir um anticorpo anti-IFNAR-1 da presente invenção combinado com pelo menos outro agente imunossupressor.
Conforme utilizado no presente documento, "um portador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o portador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exemplo, através de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, ou seja, anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecifica, podem ser 68 ΕΡ1781705Β1 revestidos de um material para proteger o composto da ação dos ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto.
Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto mãe e não confere quaisquer efeitos toxicológicos não desejados (ver, por exemplo, Berge, S.M. et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos dos tais sais incluem sais de adição de ácidos e sais de adição de bases. Os sais de adição de ácidos incluem aqueles derivados a partir de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhante, bem como a partir de ácidos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono e dicarboxílicos, ácidos alcanoicos substituídos por fenilo, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos. Sais de adição de bases incluem aqueles derivados a partir de metais terrosos alcalinos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
Uma composição farmacêutica da invenção pode também conter um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes hidrossolúveis, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metais, tais como 69 ΕΡ1781705Β1 ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.
Exemplos de portadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tal como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula adequado no caso das dispersões, e através da utilização de tensioativos.
Estas composições podem conter adicionalmente adjuvantes tais como conservantes, agentes humectantes, agentes de emulsificação e agentes de dispersão. A prevenção da presença de micro-organismos pode ser assegurada tanto através de procedimentos de esterilização, supra, como através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e semelhantes nas composições. Adicionalmente, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção tal como monoestearato de alumínio e gelatina.
Os portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, a utilização dos mesmos nas composições farmacêuticas está 70 ΕΡ1781705Β1 contemplada. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.
As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para uma concentração de fármaco elevada. 0 portador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliól (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol liquido, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula adequado no caso das dispersões e através da utilização de tensioativos. Em muitos casos, será preferível incluir nas composições agentes isotónicos, por exemplo: açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada através da inclusão na composição, de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto ativo na quantidade necessária num solvente apropriado com um ou em combinação dos ingredientes enumerados anteriormente, conforme necessário, seguida de esterilização por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do composto ativo num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação das soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos da preparação são secagem por vácuo e secagem por gelo (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução 71 ΕΡ1781705Β1 previamente filtrada dos mesmos. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material portador para produzir uma forma farmacêutica única irá variar dependendo do sujeito a ser tratado e do modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material portador para produzir uma forma farmacêutica única irá geralmente ser aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem porcento, esta quantidade irá variar entre cerca de 0,01 porcento até cerca de noventa e nove porcento de ingrediente ativo, preferivelmente desde cerca de 0,1 porcento até cerca de 70 porcento, mais preferivelmente desde cerca de 1 porcento até cerca de 30 porcento de ingrediente ativo em combinação com um portador farmaceuticamente aceitável.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica) . Por exemplo, um bólus único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições farmacêuticas parentéricas sob a forma de formas farmacêuticas unitárias para facilidade da administração e uniformidade da dosagem. Forma farmacêutica unitária conforme utilizada no presente documento refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de um composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portador farmacêutico necessário. A especificação para as formas farmacêuticas unitárias da invenção são ditadas por e, diretamente dependentes, (a) das caracteristicas únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser 72 ΕΡ1781705Β1 alcançado, e (b) das limitações inerentes à técnica de compor tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em individuos.
Para administração do anticorpo, a dosagem varia entre cerca de 0,0001 até 100 mg/kg, e mais comumente de 0,01 até 5 mg/Kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro do intervalo de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar implica a administração uma vez por semana, uma vez cada duas semanas, uma vez cada três semanas, uma vez cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez cada três meses ou uma vez cada três a 6 meses. Os regimes de dosagem para o anticorpo anti-IFNAR-1 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal através de administração intravenosa, com o anticorpo a ser dado utilizando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) cada quatro semanas durante seis dosagens, depois cada três meses; (ii) cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada três semanas.
Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso no qual, a dosagem de cada anticorpo administrado dentro dos intervalos indicados. O anticorpo é normalmente administrado em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanais, mensais, cada três meses ou anuais. Os intervalos podem também se irregulares conforme indicado através da medição dos niveis sanguíneos do anticorpo para o antigénio alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração plasmática de anticorpo de cerca de 1-1000 pg/ml e em alguns métodos cerca de 25-300 pg/ml. 73 ΕΡ1781705Β1
Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação prolongada, caso no qual, é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam dependendo da semi-vida do anticorpo no paciente. Geralmente, os anticorpos humanos demonstram a semi-vida mais prolongada, seguidos dos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Nas aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente pouco frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto das suas vidas: Nas aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é por vezes necessária até que o progresso da doença seja reduzido ou travado, e preferivelmente até que o paciente mostre melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. Subsequentemente, o paciente pode ser administrado com um regime profilático. Níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de forma a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem ser tóxico para o paciente. 0 nível de dosagem selecionado irá depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregues, ou do éster, sal ou amida das mesmas, da via de administração, do tempo da administração, da taxa de excreção do composto particular a ser empregue; da duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica prévia do 74 ΕΡ1781705Β1 paciente a ser tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos na técnica médica.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-IFNAR-1 da invenção resulta preferivelmente numa diminuição da severidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livres de sintomas de doença, ou uma prevenção da deficiência ou incapacidade devido à aflição da doença. No caso de, por exemplo, Lúpus Eritematoso Sistémico (LES), uma dose terapeuticamente eficaz preferivelmente previne a deterioração adicional dos sintomas físicos associados com o LES, tais como, por exemplo, dor, fadiga ou fraqueza. Uma dose terapeuticamente eficaz previne também ou atrasa o início do LES, tal como pode ser desejável quando os sinais precoces ou preliminares da doença estão presentes. Da mesma forma, inclui atrasar a progressão crónica associada com o LES. Testes laboratoriais utilizados no diagnóstico do LES incluem bioquímicas, hematologia, serologia e radiologia. Consequentemente, qualquer ensaio clínico ou bioquímico que monitoriza qualquer dos anteriores pode ser utilizado para determinar se um tratamento particular consiste numa dose eficaz para o tratamento do LES. Um perito na especialidade será capaz de determinar tais quantidades baseando-se em fatores tais como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição e via de administração particulares selecionadas.
Uma composição da presente invenção pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração utilizando um ou mais da variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo perito, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. As vias de administração de anticorpos da invenção preferidas incluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras vias de administração parentéricas, por exemplo 75 ΕΡ1781705Β1 através de injeção ou infusão. A frase "administração parentérica" conforme utilizada no presente documento significa modos de administração para além da administração entérica ou tópica, normalmente através de injeção, e inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbitária, intracardiaca, intradérmica, intraperitonial, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoideia, intraespinal, epidural e intraesternal e infusão.
Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado através de uma via de administração não parentérica, tal como uma via tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
Os compostos ativos podem ser preparados com portadores que irão proteger o composto contra a rápida libertação, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, pensos trasndérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompativeis, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos para aqueles peritos na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa forma de realização preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgado nas Patentes U.S. N°s 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 76 ΕΡ1781705Β1 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. N° 4.487.603, a qual divulga uma bomba de microinfusão implantável para distribuir medicação numa taxa controlada; Patente U.S. N° 4.486.194, a qual divulga um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. N° 4.447.233, a qual divulga uma bomba de infusão de medicação para distribuir medicação a um ritmo de infusão preciso; Patente U.S. N° 4.447.224, a qual divulga um aparelho de infusão de fluxo variável implantável para distribuição contínua de fármacos; Patente U.S. N° 4.439.196, a qual divulga um sistema de distribuição de fármacos osmótico tendo compartimentos com câmaras múltiplas; e Patente U.S. N° 4.475.196, a qual divulga um sistema de distribuição de fármacos osmótico. Estas patentes são incorporadas no presente documento como referência. Muitos outros implantes, sistemas de distribuição e módulos deste tipo são conhecidos para aqueles peritos na especialidade.
Em determinadas formas de realização, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para assegurar uma distribuição in vivo apropriada. Por exemplo, a barreia hemato-encefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessam a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabrico de lipossomas, ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.522.811; 5.374.548 e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais frações que são seletivamente transportadas para células ou orgãos específicos, melhorando assim a distribuição de fármacos direcionada (ver, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Frações de direcionamento exemplares incluem folato e biotina (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.416.016 para Low et al.); manósidos (Umezawa et al., 77 ΕΡ1781705Β1 (1988) Biochem. Biophis. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); recetor da proteína A tensioativa (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Utilizações e Métodos da Invenção
Os anticorpos (e imunoconjugados e moléculas biespecíficas) da presente invenção possuem utilidades diagnósticas e terapêuticas in vitro e in vivo. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, por exemplo in vitro ou ex vivo, ou a um sujeito, por exemplo in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. O termo "sujeito" conforme utilizado no presente documento destina-se a incluir animais humanos e não humanos. Os animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis. Os métodos são particularmente adequados para tratar pacientes humanos tendo um distúrbio associado com a expressão aberrante ou inapropriada do interferão Tipo I (por exemplo, superexpressão).
Quando os anticorpos para o IFNAR-1 são administrados juntamente com outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente. Por exemplo, um anticorpo anti-IFNAR-1 da invenção pode ser utilizado em combinação com um ou mais dos seguintes agentes: anticorpo anti-IFNa, anticorpo anti-recetor do IFNy, recetor do IFNy solúvel, anticorpo anti-TNF, anticorpo anti-recetor do TNF e/ou recetor do TNF solúvel (ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.888.511). Além disso, um anticorpo anti-IFNAR-1 da invenção pode ser 78 ΕΡ1781705Β1 utilizado em combinação com um antagonista do ligando Flt3 (ver, por exemplo, o Pedido U.S. N° 2002/0160974) .
Numa forma de realização, os anticorpos (e imunoconjugados e moléculas biespecificas) da invenção podem ser utilizados para detetar os níveis de IFNAR-1, ou níveis de células que expressam o IFNAR-1. Isto pode ser alcançado, por exemplo, contactando uma célula (tal como uma amostra in vitro) e uma amostra controlo com o anticorpo anti-IFNAR-1 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e o IFNAR-1. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e o IFNAR-1 são detetados e comparados na amostra e no controlo. Por exemplo, métodos de deteção padrão, bem conhecidos na técnica, tais como ELISA e ensaios de citometria de fluxo, podem ser realizados utilizando as composições da invenção.
Consequentemente, num aspeto, a invenção proporciona adicionalmente métodos para detetar a presença do IFNAR-1 (por exemplo, antigénio de IFNAR-1 humano) numa amostra, ou para medir a quantidade de IFNAR-1, compreendendo o contacto da amostra, e de uma amostra controlo, com um anticorpo da invenção, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente ao IFNAR-1 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo, ou porção do mesmo, e o IFNAR-1. A formação de um complexo é então detetada, em que uma diferença na formação de complexos entre a amostra comparada com a amostra controlo é indicativa da presença do IFNAR-1 na amostra.
Também são descritos kits que compreendem as composições (por exemplo, anticorpos, anticorpos humanos, imunoconjugados e moléculas biespecificas) da invenção e intruções para a utilização. O kit pode conter adicionalmente pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo tendo uma atividade complementar que se liga a um 79 ΕΡ1781705Β1 epítopo no antigénio alvo diferente do primeiro anticorpo). Os kits tipicamente incluem uma etiqueta indicando a utilização pretendida para os conteúdos do kit. 0 termo etiqueta inclui qualquer inscrição, ou material gravado fornecido no ou com o kit, ou que de outra forma, acompanha o kit. 0 IFNAR-1 é parte do recetor celular para os interferões Tipo I, e os interferões Tipo I são conhecidos por ser citoquinas imunoreguladoras que estão envolvidas, inter alia, na difereciação de células T, produção de anticorpos e atividade e sobrevivência de células T de memória. Além disso, a expressão aumentada dos interferões Tipo I tem sido descrita em numerosas doenças autoimunes, infeção por VIH, rejeição de transplantes e doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD). Consequentemente, os anticorpos anti-IFNAR-1 (e imunoconjugados e moléculas biespecíficas) da invenção, que inibem a atividade funcional dos interferões Tipo I, podem ser utilizados numa variedade de indicações clinicas que envolvem a atividade aberrante ou indesejada do interferão Tipo I. Assim sendo, a invenção proporciona os anticorpos, ou porção de ligação a antigénio dos mesmo, da invenção para utilização num método de inibir uma doença ou distúrbio mediados pelo interferão Tipo I, em que o método compreende a administração de um anticorpo, ou porção de ligação do mesmo, da invenção (ou imunoconjugado ou molécula biespecifica da invenção) de tal forma que uma doença ou distúrbio mediados pelo interferão Tipo 1 são tratados. Exemplos específicos de condições autoimunes nas quais os anticorpos da invenção podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, os seguinte: lúpus eritematoso sistémico (LES), diabetes mellitus dependente da insulina (IDDM), doença intestinal inflamatória (IBD) (incluindo a doença de Crohn, Colite Ulcerativa e Doença Celíaca), esclerose múltipla (EM), psoríase, tiroidite autoimune, 80 ΕΡ1781705Β1 artrite reumatóide (AR) e glomerulonefrite. Além disso, as composições de anticorpos da invenção podem ser utilizadas para inibir ou prevenir a rejeição de transplantes ou no tratamento da doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD) ou no tratamento da infeção por VIH/SIDA.
Altos niveis de IFNa foram observados no soro de paciente com lúpus eritematoso sistémico (LES) (ver, por exemplo, Kim et al. (1987) Clin. Exp. Immunol. 70:562-569) . Além disso, a administração do IFNa, por exemplo no tratamento de cancro ou infeções virais, demonstrou induzir LES (Garcia Porrua et al. (1998) Clin. Exp. Rheumatol. 16:107-108). Consequentemente, noutra forma de realização, os anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção podem ser utilizados no tratamento do LES através da administração do anticorpo a um sujeito com necessidade de tratamento. O anticorpo pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com outros angentes anti-LES, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), analgésicos, corticosteroides (por exemplo, prednisona, hidrocortisona), imunossupressores (tais como ciclofosfamida, azatioprina e metotrexato), antimaláricos (tais como hidroxicloroquina) e fármacos biológicos que inibem a produção de anticorpos dsADN (por exempl, LJP 394). O IFNa também tem sido implicado na patologia da diabetes Tipo I. Por exemplo, a presença do IFNa imunoreativo nas células beta pancreáticas em pacientes com diabetes tem sido relatada (Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423-1427) . A utilização prolongada do IFNa na terapêutica antiviral tem demonstrado induzir diabetes Tipo I (Waguri et al. (1994) Diabetes Res. Clin. Pract. 23:33-36). Consequentemente, noutra forma de realização, os anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção podem ser utilizados no tratamento da diabetes Tipo I através da administração do anticorpo a um sujeito com necessidade de tratamento. O anticorpo pode ser utilizado isoladamente ou em combinação 81 ΕΡ1781705Β1 com outros agentes anti-diabéticos, tais como insulina.
Os anticorpos para o IFNAR-1 têm demonstrado ser eficazes num modelo animal de doeça intestinal inflamatória (ver o Pedido de Patente US 60/465.155). Assim, os anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção podem ser utilizados no tratamento da doença intestinal inflamatória (IBD) , incluindo a colite ulcerativa e doença de Crohn, através da administração do anticorpo a um sujeito com necessidade de tratamento. O anticorpo pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com outros agentes anti-IBD, tais como fármacos contendo mesalamina (incluindo sulfasalazina e outros agentes contendo ácido 5-aminossalicilico (5-ASA), tais como olsalazina e balsalazida) , fármacos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) , analgésicos, corticosteroides (por exemplo, prednisona, hidrocortisona), inibidores do TNF (incluindo adilimumab (Humira®), etanercept (Enbrel®) e infliximab (Remicade®)), imunosupressores (tais como 6-mercaptopurina, azatioprina e ciclosporina A) e antibióticos. 0 tratamento com o IFNa também tem sido observado como indutor de tiroidite autoimune (Monzani et al. (2004) Clin. Exp. Med. 3:199-210; Prummel e Laurberg (2003) Thyroid 13:547-551). Consequentemente, noutra forma de realização, os anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção podem ser utilizados no tratamento de doença da tiroide autoimune, incluindo hipotiroidismo primário autoimune, doença de Grave, tiroidite de Hashimoto e tiroidite destrutiva com hipotiroidism, através da administração do anticorpo a um sujeito com necessidade de tratamento. O anticorpo pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com outros agentes ou tratamentos, tais como fármacos anti-tiróide, iodo radioativo e tiroidectomia subtotal.
Niveis aumentados de interferões Tipo I, especialmente de IFB-β, têm sido observados no soro de pacientes com AR (ver, por exemplo, Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. 82 ΕΡ1781705Β1
Immunopath. 48:192). Assim, numa forma de realização, os anticorpos anti-IFNAR-1 da presente invenção podem ser utilizados no tratamento da AR através da administração do anticorpo a um sujeito com necessidade de tratamento. 0 anticorpo pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes anti-AR, tais como um fármaco anti-inflamatório não esteroide (AINEs), um inibidor da COX-2, um analgésico, um corticosteroide (por exemplo, prednisona, hidrocortisona), ouro, um imunossupressor (por exemplo, metotrexato), um agente de depleção de células B (por exemplo, Rituxan™) , um agonista de células B (por exemplo, LymphoStat-B™) e um agente anti-TNF-α (por exemplo, EMBREL™, HUMIRA® e REMICADE™). A administração do IFNa foi relatada como exarcebando a psoriase. Consequentemente, noutra forma de realização, os anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção podem ser utilizados no tratamento da psoriase e da artrite psoriática através da administração do anticorpo a um sujeito com necessidade de tratamento. 0 anticorpo pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais tratamentos anti-psoriase tal como fototerapia, terapia tópica (por exemplo, glucocorticoides tópicos), ou terapia sistémica (por exemplo, metotrexato, um retinóide sintético, ciclosporiana), um agente anti-TNF-α (por exemplo, EMBREL™, HUMIRA® e REMI-CADE™) e um inibidor de células T (e.g., Raptiva™).
Altos níveis de IFNa também têm sido observados na circulação de pacientes com infeção por VIH e a sua presença é um marcador preditivo da progressão da SIDA (DeStefano et al. (1982) J. Infec. Disease 146:451; Vadhan-Raj et al. (1986) Câncer Res. 46:417). Assim, noutra forma de realização, os anticorpos anti-IFNAR-1 da invenção podem ser utilizados no tratamento da infeção com VIH ou SIDA através da administração do anticorpo a um sujeito com necessidade de tratamento. 0 anticorpo pode ser utilizado 83 ΕΡ1781705Β1 isoladamente ou em combinação com outros agentes anti-VIH, tais como inibidores da transcriptase reversa nucleósidos, inibidores da transcriptase reversa não-nucleósidos, inibidores da protease e inibidores de fusão.
Os anticorpos para o IFNAR-1 demonstraram ser eficazes na inibição da rejeição de aloenxertos e no prolongamento da sobrevivência de aloenxertos (ver, por exemplo, Tovey et al. (1996) J. Leukoc. Biol. 59:512-517; Benizri et al. (1998) J. Interferon Cytokine Res. 18:273-284). Conseguentemente, os anticorpos da invenção podem também ser utilizados em recetores de transplantes para inibir a rejeição de aloenxertos e/ou prolongar a sua sobrevivência. A invenção proporciona métodos para inibir a rejeição de transplantes através da administração do anticorpo anti-IFNAR-1 da invenção a um recetor de transplante com necessidade de tratamento. Exemplos de transplantes teciduais que podem ser tratados incluem, mas não estão limitados a, fígado, pulmão, rim, coração, intestino delgado e ilhotas pancreáticas, bem como o tratamento da doença do transplante vs hospedeiro (GVHD). 0 anticorpo pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com outros agentes para a inibição da rejeição de transplantes, tais como agentes imunossupressores (por exemplo, ciclosporina, azatioprina, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, microfenolato mofetilo, sirílimo, rapamicina, tacrólimo), agentes anti-ineficazes (por exmeplo, aciclovir, clotrimazole, ganciclovir, nistatina, trimetropimsulfametoxazol) , diuréticos (por exemplo, bumetadina, furosemida, metolazona) e medicações para úlceras (por exemplo, cimetidina, farnotidina, lansoprazol, omeprazol, ranitidina, sucralfato). A presente invenção está adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser constituídos como adicionalmente limitantes da invenção conforme definida nas reivindicações. 84 ΕΡ1781705Β1
Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos Contra 0 IFNAR-1
Antiqénio IFNAR-1 solúvel, contendo o domínio extracelular do IFNAR-1 foi gerado através de métodos recombinantes e utilizado como antigénio para imunização.
Ratinhos HuMab Transgénicos
Anticorpos monoclonais totalmente humanos para o IFNAR-1 foram preparados utilizando as estirpes HCo7, HCol2, e HCo7 x HCol2 de ratinhos transgénicos HuMab, cada uma das quais expressa genes de anticorpos humanos. Em cada uma destas estirpes de ratinhos, o gene endógeno de ratinho de cadeia leve kappa foi homozigoticamente interrompido conforme descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 e o gene endógeno de ratinho de cadeia pesada foi homozigoticamente interrompido conforme descrito no Exemplo 1 da Publicação do PCT WO 01/09187. Cada uma destas estirpes de ratinhos transporta um transgene humano de cadeia leve kappa, KCo5, conforme descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. A estirpe HCo7 transporta o transgene humano de cadeia pesada HCo7 conforme descrito nas Patentes U.S N°s 5.545.806; 5.625.825 e 5.545.807. A estirpe HCol2 transporta o transgene humano de cadeia pesada HCol2 conforme descrito no Exemplo 2 da Publicação do PCT WO 01/09187. A estirpe HCo7 x HCol2 transporta ambos os trangenes HCo7 e HCol2 e foi feita através do cruzamento das duas estirpes.
Imunizações de Ratinhos HuMab:
Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para o IFNAR-1, os ratinhos HuMab foram imunizados com IFNAR-1 recombinante purificado como antigénio. Os esquemas de imunização geral para os ratinhos HuMab estão descritos em Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474) : 856-859;
Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e Publicação do PCT WO 98/24884. Os ratinhos tinham 6-16 85 ΕΡ1781705Β1 semanas de idade após a primeira infusão do antigénio. Uma preparação recombinante purificada (5-50 pg) de antigénio de IFNAR-1 solúvel foi utilizada para imunizar os ratinhos HuMab por via intraperitoneal, subcutânea (Sc) ou através de injeção na almofada plantar.
Os ratinhos transgénicos foram imunizados duas vezes com antigénio em adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Ribi, guer por via intraperitonal (IP), subcutânea (Sc) ou através da almofada plantar (FP) seguindo-se 3-21 dias de imunização por via IP, Sc ou FP (até um total de 11 imunizações) com o antigénio em adjuvante incompleto de Freund ou Ribi. A resposta imune foi monitorizada através de hemorragias retro-orbitárias. O plasma foi rastreado através de ELISA (conforme descrito abaixo), e ratinhos com titulos suficientes de imunoglobulina humana anti-IFNAR-1 foram utilizados para fusões. Os ratinhos foram reforçados por via intravenosa com antigénio, 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Tipicamente, foram realizadas 10-35 fusões por cada antigénio. Várias dúzias de ratinhos foram imunizadas para cada antigénio.
Seleção de Ratinhos HuMab Produtores de Anticorpos Anti-IFNAR-1:
Para selecionar ratinhos HuMab produtores de anticorpos gue se ligam ao IFNAR-1, soros de ratinhos imunizados foram testados através de ELISA conforme descrito por Fishwild, D. et al. (1996) . De forma breve, placas de microtitulação foram revestidas com IFNAR-1 recombinante purificado a partir de E. coli a 1-2 pg/ml em PBS, 50 μΐ/poço incubados a 4 °C durante a noite e depois blogueados com 200 μΐ/poço de soro de galinha a 5% em PBS/Tween (0,05%). Diluições de plasma a partir de ratinhos imunizados com IFNAR-1 foram adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com um conjugado de anticorpo de cabra policlonal anti-Fc de 86 ΕΡ1781705Β1
IgG humana conjugado com peroxidase de rábano (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a lavagem, as placas foram reveladas com substrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) e analisadas através de espectrofotómetro a uma DO 415-495. Os ratinhos que desenvolveram os titulos mais elevados de anticorpos anti-IFNAR-1 foram utilizados para fusões. As fusões foram realizadas conforme descrito abaixo e os sobrenadantes de hibridomas foram testados para a atividade anti-IFNAR-1 através de ELISA.
Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos para o IFNAR-1:
Os esplenócitos dos ratinhos, isolados a partir de ratinhos HuMab, foram fundidos com PEG numa linha celular de mieloma murino com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então rastreados para a produção de anticorpos específicos para antigénios. Suspensões de células únicas de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados foram fundidas num quarto do número de células de mieloma murino não secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) com PEG a 50% (Sigma) . As células foram colocadas em placas a aproximadamente 1 x 105/poço em placas de microtitulação de fundo plano, seguidas de uma incubação de cerca de duas semanas em meio seletivo contento soro fetal bovino a 10%, meio condicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) a 10%, origen (IGEN) a 3-5% em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com glucose alta, L-glutamina e piruvato de sódio) mais HEPES a 5 mM, 2-mercaptoetanol a 0,055 mM, 50 mg/ml de gentamicina e HAT IX (Sigma, CRL P-7185) . Depois de 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído com HT. Poços individuais foram então rastreados através de ELISA (descrito anteriormente) para anticorpos IgG monoclonais anti-IFNAR-1 humanos. Uma vez que o crescimento extensivo do hibridoma ocorreu, o meio foi monitorizado normalmente depois de 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos foram colocados em 87 ΕΡ1781705Β1 placas novamente, rastreados novamente, e se ainda eram positivos para a IgG humana, os anticorpos monoclonais podem foram subclonados pelo menos duas vezes através de diluição limitante. Os subclones estáveis foram depois cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização adicional.
Os clones de hibridomas 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 foram selecionados para análise adicional.
Exemplo 2: Caracterização Estrutural dos Anticorpos Monoclonais Humanos 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4
As sequências de cADN que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos monoclonais 3F11, 4G5, 11E2, e 9D4 foram obtidas a partir dos hibridomas de 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4, respetivamente, utilizando técnicas de PCR padrão e foram sequenciadas utilizando técnicas de sequenciação de ADN padrão.
As sequências de nucleótidos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada do 3F11 são mostradas na Figura IA. e na SEQ ID NO: 33 e 25, respetivamente.
As sequências de nucleótidos e aminoácidos da região variável de cadeia leve do 3F11 são mostradas na Figura 1B. e na SEQ ID NO: 37 e 29, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina de cadeia pesada do 3F11 com as sequências de imunoglobulina da linha germinal humana de cadeia pesada conhecidas demonstram que a cadeia pesada do 3F11 utiliza um segmento da VH da VH 4-34 da linha germinal humana, um segmento D não determinado e um segmento JH do JH 6b da linha germinal humana. 0 alinhamento da sequência da VH do 3F11 com a sequência da VH 4-34 da linha germinal é mostrado na Figura 5. A análise adicional da sequência da VH do 3F11 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada conforme mostrado nas Figuras IA e 5, e nos SEQ ID NOs: 1, 5 e 9, 88 ΕΡ1781705Β1 respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina de cadeia leve do 3F11 com as sequências de imunoglobulina da linha germinal humana de cadeia leve conhecidas demonstram que a cadeia leve do 3F11 utiliza um segmento da VL da VK L18 da linha germinal humana, e um segmento JK do JK 5 da linha germinal humana. 0 alinhamento da sequência da VL do 3F11 com a sequência da VK L18 da linha germinal é mostrado na Figura 8. A análise adicional da sequência da VL do 3F11 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme mostrado nas Figuras 1B e 8, e nos SEQ ID NOs: 13, 17 e 21, respetivamente.
As sequências de nucleótidos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada do 4G5 são mostradas na Figura 2A. e na SEQ ID NO: 34 e 26, respetivamente.
As sequências de nucleótidos e aminoácidos da região variável de cadeia leve do 4G5 são mostradas na Figura 2B. e na SEQ ID NO: 38 e 30, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina de cadeia pesada do 4G5 com as sequências de imunoglobulina da linha germinal humana de cadeia pesada conhecidas demonstram que a cadeia pesada do 4G5 utiliza um segmento da VH da VH 4-34 da linha germinal humana, um segmento D não determinado e um segmento JH do JH 4b da linha germinal humana. O alinhamento da sequência da VH do 4G5 com a sequência da VH 4-34 da linha germinal é mostrado na Figura 6. A análise adicional da sequência da VH do 4G5 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme mostrado nas Figuras 2A e 6, e nos SEQ ID NOs: 2, 6 e 10, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina de cadeia leve do 4G5 com as sequências de imunoglobulina da linha germinal humana de cadeia leve conhecidas demonstram que a 89 ΕΡ1781705Β1 cadeia leve do 4G5 utiliza um segmento da VL da VK L18 da linha germinal humana e um segmento JK da linha germinal humana JK 2. 0 alinhamento da sequência da VL do 4G5 com a sequência da VK L18 da linha germinal é mostrado na Figura 9. A análise adicional da sequência da VL do 4G5 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme mostrado nas Figuras 2B e 9, e nos SEQ ID NOs: 14, 18 e 22, respetivamente.
As sequências de nucleótidos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada do 11E2 são mostradas na Figura 2A. e na SEQ ID NO: 35 e 27, respetivamente.
As sequências de nucleótidos e aminoácidos da região variável de cadeia leve do 11E2 são mostradas na Figura 3B. e na SEQ ID NO: 39 e 31, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina de cadeia pesada do 11E2 com as sequências de imunoglobulina da linha germinal humana de cadeia pesada conhecidas demonstram que a cadeia pesada do 11E2 era derivada de, ou é altamente semelhante com, um segmento da VH a partir da VH 5-51 da linha germinal humana, um segmento D não determinado e um segmento JH do JH 4b da linha germinal humana. 0 alinhamento da sequência da VH do 11E2 com a sequência da VH 5-51 da linha germinal é mostrado na Figura 7. A análise adicional da sequência da VH do 11E2 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levouao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada conforme mostrado nas Figuras 3A e 7, e nos SEQ ID NOs: 3, 7 e 11, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina de cadeia leve do 11E2 com as sequências de imunoglobulina da linha germinal humana de cadeia leve conhecidas demonstram que a cadeia leve do 11E2 utiliza um segmento da VL da VK A27 da linha germinal humana e um segmento JK a partir da linha germinal humana JK 5. 0 alinhamento da sequência da VL do 90 ΕΡ1781705Β1 11Ε2 com a sequência da VK A27 da linha germinal é mostrado na Figura 10. A análise adicional da sequência da VL do 11E2 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme mostrado nas Figuras 3B e 10, e nos SEQ ID NOs: 15, 19 e 23, respetivamente.
As sequências de nucleótidos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada do 9D4 são mostradas na Figura 4A. e na SEQ ID NO: 36 e 28, respetivamente.
As sequências de nucleótidos e aminoácidos da região variável de cadeia leve do 9D4 são mostradas na Figura 4B. e na SEQ ID NO: 40 e 32, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina de cadeia pesada do 9D4 com as sequências de imunoglobulina da linha germinal humana de cadeia pesada conhecidas demonstram que a cadeia pesada do 9D4 era derivada de, ou é altamente semelhante com, um segmento da VH a partir da VH 5-51 da linha germinal humana, um segmento D não determinado e um segmento JH do JH 4b da linha germinal humana. O alinhamento da sequência da VH do 9D4 com a sequência da VH 5-51 da linha germinal é mostrado na Figura 7. A análise adicional da sequência da VH do 9D4 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR levouao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada conforme mostrado nas Figuras 4A e 7, e nos SEQ ID NOs: 4, 8 e 12, respetivamente.
A comparação da sequência da imunoglobulina de cadeia leve do 9D4 com as sequências de imunoglobulina da linha germinal humana de cadeia leve conhecidas demonstram que a cadeia leve do 9D4 utiliza um segmento da VL da VK A27 da linha germinal humana e um segmento JK a partir da linha germinal humana JK 5. O alinhamento da sequência da VL do 9D4 com a sequência da VK A27 da linha germinal é mostrado na Figura 10. A análise adicional da sequência da VL do 9D4 utilizando o sistema Kabat de determinação da região CDR 91 ΕΡ1781705Β1 levou ao delineamento das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve conforme mostrado nas Figuras 3B e 10, e nos SEQ ID NOs: 16, 20 e 24, respetivamente.
Exemplo 3: Anticorpos monoclonais humanos anti-IFNAR-1 inibem a atividade biológica do interferão a2b A linha celular Daudi, derivada a partir de um linfoma de Burkitt de linfoblastos B, expressa altos níveis de IFNAR-1, e o crescimento destas células é inibido pelos interferões Tipo 1. Para medir a capacidade de bloqueio funcional dos anticorpos anti-IFNAR-1 humanos, dois ensaios diferentes foram realizados, um ensaio de proliferação celular e um ensaio de repórter.
No primeiro ensaio, células de Daudi foram cultivadas com interferão a2b na presença ou ausência de anticorpo e a proliferação foi medida através da absorção de 3 [H] — thymidine: as células de Daudi (ATCC CCL-213) foram cultivadas em RPMI contendo FCS a 10% e beta mercaptoetanol a 2mM (meio). As células foram submetidas a rotação e ressuspendidas numa concentração de 1 x 106 células/ml em meios com albumina sérica humana a 1% adicionada (meios e HS) . A cada poço de uma placa de 96 poços, 100 μΐ de interferão a2b a 200 U/ml (Schering Corporation) contendo a concentração apropriada de anticorpo foram adicionados. 100 μΐ de células de Daudi em meio e HS foram adicionadas aos poços e as placas foram incubadas durante 48 horas a 37 °C. As placas foram pulsadas com 1 pCi de 3 [H]-timidina e incubadas durante 24 horas adicionais. As placas foram colhidas, recolhidas para uma placa de filtro de fibra de 96 poços e contadas utilizando um contador de cintilação TopCount (Packard). As contagens por minuto foram traçadas como uma função da concentração de anticorpo e os dados foram analisados através de regressão não linear, dose-resposta sigmoide (declive variável) utilizando o software Prism (San Diego, CA).
No segundo ensaio, as células U937 foram transfectadas 92 ΕΡ1781705Β1 com um vetor no qual um Elemento de Resposta Estimulada por Interferão foi ligado a um gene repórter (ISRE-RG) e foi medida a capacidade de anticorpos humanizados anti-IFNAR-1 para bloquear a expressão induzida pelo IFN. As células foram cultivadas em RPMI contendo FCS a 10% e beta mercaptoetanol a 2mM (meio) . As células (1 x 105 células/ml) foram ressuspendidas em meios com soro humano a 2% adicionado. 100 μΐ de células foram adicionados a uma placa de 96 poços. Os anticorpos foram diluídos seriadamente em meios contendo 200 U/ml de interferão a2b (Schering Corporation) e 100 μΐ foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas durante a noite a 37 °C. A seguir a esta incubação, a expressão do gene repórter foi analisada através de citometria de fluxo. A intensidade fluorescente média geométrica foi traçada como uma função da concentração de anticorpo e os dados foram analisados através de regressão não linear, dose-resposta sigmoide (declive variável) utilizando o software Prism (San Diego, CA) .
Utilizando os dois ensaios descritos acima, a potência do anticorpo monoclonal humano 3F11 foi comparada com o anticorpo murino anti-IFNAR-1 64G12 (N° de Depósito de ECACC 92022605) e com o anticorpo humanizado anti-IFNAR-1 Dl H3K1 (descrito adicionalmente no N° de Série US 60/465.058. A potência do 3F11 mostrou ser uma potência 5-10 vezes maior do que o anticorpo murino e uma potência 6-30 vezes maior do que o anticorpo humanizado. Os resultados estão sumarizados no Quadro 1 abaixo.
Quadro 1. Capacidade de bloqueio do anticorpo anti-IFNAR-1 humano no IFN alfa 2b
Isotipo Proliferação Celular (Daudi) CE50 (nM) Repórter ISRE-RG (U937) CEso (nM) 64G12 m IgGl 3,1 6,0 Dl H3K1 h IgGl 9,3 8,0 3F11 h IgGl 0,3 1,2 93 ΕΡ1781705Β1
Exemplo 4: Anticorpos monoclonais humanos anti-IFNAR-1 inibem a atividade biológica do IFN ómega
Utilizando o ensaio de proliferação de Daudi descrito anteriormente no Exemplo 3, a capacidade do anticorpo humano anti-IFNAR-1 para inibir o IFN ómega foi testada. A cada poço de uma placa de 96 poços, 100 μΐ de interferão ómega a 200 U/ml (PBL) contendo a concentração apropriada de anticorpo foram adicionados. Os anticorpos humanos 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 foram 4-18 vezes mais potentes (conforme medido pela CE50) do que o anticorpo murino 64G12. Os resultados estão sumarizados no Quadro 2 abaixo.
Quadro 2. Capacidade de bloqueio do anticorpo anti-IFNAR-1 humano no IFN ómega
Isotipo Proliferação Celular (Daudi) CE50 (nM) 64G12 m IgGl 5,5 Dl H3K1 h IgGl 30,7 3F11 h IgGl 0,6 4G5 h IgGl 1,4 11E2 h IgGl 0,3 9D4 h IgGl 0,3
Exemplo 5: Anticorpos monoclonais humanos anti-IFNAR-1 inibem a atividade biológica de múltiplos IFNs Tipo I
Conforme descrito no Exemplo 3, o interferão alfa inibe a proliferação de células de Daudi (linfoma de Burkitt, ACTT # CCL-213) de uma forma dependente da dose. Um anticorpo neutralizante, que bloqueia a ligação do interferão ao seu recetor, irá restaurar a proliferação. Utilizando este ensaio de proliferação, a especificidade dos anticorpos humanos anti-IFN alfa purificados foi examinada através da testagem para o bloqueio de IFNa linfoblastóide natural, interferão leucocitário natural, subtipos de IFN alfa recombinantes, IFN beta e IFN ómega. 94 ΕΡ1781705Β1
Células de Daudi foram cultivadas em meio de cultivo (RPMI 1640 suplementado com FCS a 10%, 2-ME lx, L-glutamina e penicilina estreptomicina) com e sem a adição de IFNa numa placa de cultura de células de fundo plano, de 96 poços. Cada tipo de interferão tipo I testado foi ensaiado a CE50 e misturado com uma titulação seriada a 2 vezes de anticorpo 3F11 anti-IFNAR-1, tipicamente a partir de 50 pg/ml (312 nM) através de 381 pg/ml (2,4 pM) . A mistura anticorpo/IFN foi adicionada às células de Daudi numa placa de fundo plano de 96 poços a uma densidade final de 1 x 104 células de Daudi/100 ul/poço e incubadas a 37 °C, C02 a 5%, 72 horas. A proliferação foi analisada com a adição de MTS (Promega), 20 μΐ/poço e a D.O. a 490 nm foi medida após uma incubação adicional de 3 horas. O número de células viáveis foi proporcional à leitura da D.O. A percentagem de bloqueio do interferão foi calculada relativamente à proliferação de Daudi na ausência de IFN (=100% de bloqueio) e na presença apenas de IFN (=0% de bloqueio). O anticorpo 3F11 foi classificado de acordo com o grau de bloqueio, resultando num perfil de especificidade do subtipo IFNa. Os resultados demonstraram que o anticorpo humano anti-recetor 1 do interferão alfa, 3F11 inibe a ação de múltiplos subtipos de interferão alfa incluindo IFNa 6, 2b, 2a, 1, 16, 10, 8, 5, 14, 17, 7, 4 e 21, bem como o IFN linfoblastóide, IFN leucocitário e o IFN ómega. O 3F11 é um inibidor de menor nivel do IFN beta, apesar de se observar uma inibição de mais de 50%. A percentagem de bloqueio e desvio padrão do interferão são mostrados no Quadro 3, abaixo.
Quadro 3: Inibição de Múltiplos interferões tipo I por
Anticorpos
Bloqueio de IFN (%) pelo 3F11 a lOOOx Ac IFN média dp IFN linfoblastóide 94,9 2,9 IFNa 6 107,1 6, 6 95 ΕΡ1781705Β1 IFNa 2b 101,9 0,4 iFNa 2a 103,1 3,0 IFNa 1 111, 6 1,9 IFN leucocitário 109,4 1,4 IFNa 16 105,7 1,4 IFNa 10 96, 7 5,5 IFNa 8 87,5 2,6 IFNa 5 105,1 3,9 IFNa 14 100,3 1,4 IFNa 17 99,8 2,4 IFNa 7 102,8 3,2 IFNa 4 100,5 2,5 IFNa 21 104,4 2,3 IFN-beta 53,0 1,7 IFN-ómega 107,1 1,3
Exemplo 6: Inibição da secreção de IP-10 induzida por IFN pelos anticorpos anti-IFNAR-1 A adição de IFN alfa 2b aos meios de cultura celulares demonstrou induzir a secreção de IP-10 pelas células mononucleares (PBMNC) do sangue periférico. A atividade fo anticorpo humano anti-IFNAR-1, 3F11 foi testada para a inibição da secreção de IP-10 induzida por interferão pelas culturas normais de PBMNC através de um ensaio de ligação de ELISA.
As PBMNCs foram incubadas num meio de cultura (RPMI 1640 + FBS a 10% + soro humano a 1%) com IFN leucocitário, INF alpha 2b, ou IFN ω durante 24-48 horas. Os sobrenadantes foram recolhidos e analisados para a concentração IP-10/CXCL10 utilizando um kit de ELISA de sanduíche guantitativa (Quantikine®, R&D Systems) numa diluição de 1:30 de acordo com as recomendações do fabricante. Os resultados demonstraram que o anticorpo monoclonal humano 3F11 inibe a secreção pela cultura de 96 ΕΡ1781705Β1 PBMNC normais de IP-10 induzida pelo IFN leucocitário, o IFNa 2b e o IFNco recombinante. Estes resultados são mostrados no Quadro 4.
Quadro 4: Inibição pelos Anticorpos da Expressão de IP-10 induzida por IFN em PBMNC Normais
Tratamento com Ac Nenhum IFN IFN alfa IFN IFN IP-10 (pg/ml ) leucocitár io IP-10 (pg/ml) 2b IP-10 (pg/ml) ómega IP-10 (pg/ml) Nenhum anticorpo 907 2665 2739 2904 3F11 (5 pg/ml) 387 854 745 674 Ig Controlo (5 pg/ml) 838 3512 3117 3960 * 100 U/ml de cada subtipo de IFN foram adicionados às culturas
Exemplo 7: Ensaio de competição cruzada de anticorpos monoclonais humanos anti-IFNAR-1
Para avaliar se os anticorpos monoclonais humanos se ligam ao mesmo epitopo do que o anticorpo monoclonal murino 64G12, um ensaio de ELISA de competição cruzada foi utilizado para determinar se os anticorpos competiam pelo mesmo epitopo de ligação.
Placas de 96 poços foram revestidas com IFNAR-1 humano derivado de CHO a uma concentração de 1 pg/ml em DPBS recentemente preparado a 100 μΐ/poço (Mediatech). Os anticorpos monoclonais humanos 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 foram adicionados a 20 pg/ml à coluna 1 dos poços e diluídos seriadamente numa razão de 1:2 nos poços a partir da coluna 1 até à 12, seguindo-se incubação durante 45 minutos. O anticorpo monoclonal murino 64G 12, a uma concentração CE75 de 0,3 pg/ml, foi adicionado em 50 μΐ por poço e as placas foram incubadas durante 30 minutos. As placas foram lavadas 3 vezes com o lavador automático de placas Elx 405 (BIO-TEK Instruments). Um anticorpo anti-IgG murino com F(ab')2 de cabra purificado com afinidade para a peroxidase foi diluído em PBS a 1:3000 e adicionado como o conjugado de 97 ΕΡ1781705Β1 deteção (Jackson ImmunoResearch Laboratories, cat. 115-036-0710) . Depois de uma hora de incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com um lavador automático de placas Elx 405. Uma solução de ABTS (800 μΐ de solução mãe de ABTS, 8 μΐ de H2O2 a 30% e 100 ml de tampão de citrato de fosfato) a 27,8 mg/ml foi adicionada a cada poço e incubada durante 20 minutos. As placas foram lidas a 415 nm utilizando 490 nm como o comprimento de onda de referência. Os resultados são mostrados na Fig. 11. Os resultados demonstram que os anticorpos monoclonais humanos anti-IFNAR-1, 3F11, 4G5, 11E2 e 9D4 não competem com o 64G12 pela ligação ao IFNAR-1 e ligam-se assim a um epítopo diferente no IFNAR-1 do que o 64G12.
Exemplo 8: Inibição pelos Anticorpos do Desenvolvimento de Células Dendriticas Mediadas pelo Plasma do LES O plasma do LES induz o desenvolvimento de células dendriticas a partir de monócitos humanos normais. Neste exemplo, o anticorpo monoclonal humano purificado anti-IFNAR-1, 3F11, foi testado para a inibição do desenvolvimento de células dendriticas, conforme analisado através da capacidade dos anticorpos para inibir a indução pelo plasma do LES dos marcadores de superfície celular CD38, MHC de Classe I e CD123.
Uma camada leucocitária de 25 ml foi diluída quatro vezes com PBS. A amostra foi separada em tubos cónicos 4 x 50 ml e 15 ml de meio de separação de leucócitos (ICN Biomedicals) foi colocado em camadas por baixo. Depois de uma rotação de 30 minutos a 500 x g, a camada leucocitária contendo as PBMCs foi removida e lavada com PBS. As células foram ressuspendidas em meios de cultura a 4 x 106 células/ml. Os monócitos foram isolados incubando PBMC (2,0 x 107 células/ 5 ml/balão de 25 cm2) durante 1,5 horas a 37 °C em meio de cultura, lavando depois as células não aderentes duas vezes. A seguir à segunda lavagem as células foram cultivadas em meios contendo soro humano inativado 98 ΕΡ1781705Β1 aquecido a 1%. Plasma de pacientes com LES a 25 % mais/menos anticorpos neutralizantes e isotipos controlo (30 pg/ml) foram adicionados aos balões; IFN alfa 2b (100 e 10 iu/ml) mais plasma humano normal a 25% foi utilizado como um controlo positivo para a indução de marcadores. Os balões foram incubados a 37° C, C02 a 5% durante três a sete dias. O meio condicionado foi colhido de cada balão e as células da suspensão foram recuperadas através de centrifugação a 1000 rpm num rotôr Sorvall RTH-750. As células peletizadas foram retidas em gelo e o sobrenadante foi congelado a -80° C para ELISA. As células aderidas foram recuperadas a partir do balão com uma lavagem de PBS (2 ml), seguindo-se uma incubação de 15 minutos em verseno (3 ml), se necessário. O balão foi raspado no final da incubação de verseno e o balão foi finalmente enxaguado com uma lavagem de PBS (2 ml). Cada uma das lavagens de PBS e o verseno foram combinadas com as células recuperadas a partir da colheira do meio condicionado. A suspensão de células agrupadas foi centrifugada a 1000 rpm num rotôr Sorvall RTH-750, o pélete resultante foi ressuspendido para 300 μΐ em tampão corante (PBS + EDTA a 0,1 M + FBS a 2% + HS a 1%) e dispensados 100 μΐ/poço para uma placa de fundo em V de 96 poços. A placa foi submetida a centrifugação pulsada a 2800 rpm num rotôr RTH-750 e as células peletizadas foram ressuspendidas a 25 μΐ/poço em anticorpos marcados com fluorocromo conforme se segue: (1) anti-MHC I-FITC murino + anti-CD38-PE murino e (2) isotipos controlo igG-FITC murino + IgG-PE murino. A placa foi incubada em gelo durante 45 minutos, protegida da luz. As células foram lavadas três vezes com a adição de 200 μΐ de tampão corante seguido de centrifugação pulsada e finalmente ressupendidas em 200 μΐ de paraformaldeido a 2% em PBS. A coloração das células dendríticas foi analisada através de citometria de fluxo com o Becton Dickinson FACScalibur™. Os acessos foram desenhados no gráfico Dispersão Frontal vs. Dispersão gg ΕΡ1781705Β1
Lateral para remover as células contaminantes da análise. O anticorpo monoclonal humano anti-IFNAR-1, 3F11 inibe o processo de desenvolvimento de células dendríticas dependente do IFN alfa, conforme demonstrado através da expressão normalizada dos marcadores da superfície celular MHC de Classe I, CD38 e CD123 na presença de 3F11. Os resultados são mostrados abaixo no Quadro 5, em que (A) e (B) sumarizam os resultados para duas amostras representativas de dadores com LES.
Quadro 5: Inibição da Maturação de Células Dendríticas (A) Plasma do Dador #40* (13,3 iU/mL**) Condições da Cultura MHC de Classe I CD12 3 CD3 8 0 IFN/mL 10 IFN/mL 100 IFN/mL 0 3F11 HulgGl (isotipo controlo) MFI MFI MFI 148 14 40 200 19 44 229 26 63 206 22 47 115 13 32 194 22 62 (B) Plasma do Dador #59* (75,3 iU/mL**) Condiçoes da Cultura MHC de Classe I CD123 CD38 0 IFN/mL 10 IFN/mL 100 IFN/mL 0 3F11 HulgGl (isotipo controlo) 229 11 58 271 12 86 294 13 112 202 15 62 112 8 22 266 14 55 100 ΕΡ1781705Β1
Exemplo 9: Análise de Ligação de Scatchard dos anticorpos humanos anti-IFNAR-1 às células de Daudi ou células mononucleares do sangue periférico humano
As células mononucleares do sangue periférico humano foram preparadas a partir de sangue fresco através de protocolos padrão utilizando a separação de Ficol. As células de Daudi foram obtidas de ATCC e cultivadas em RPMI contendo soro fetal bovino (FBS). As células foram lavadas duas vezes com RPMI contendo FBS a 10% a 4 graus e as células foram ajustadas a 4 x 107 células/ml em meios de RPMI contendo soro fetal bovino a 10% (tampão de ligação). Placas Millipore (MAFB NOB) foram revestidas com leite em pó desnatado a 1% em água e armazenadas a 4 °C durante a noite. As placas foram lavadas com tampão de ligação e 25 μΐ de anticorpo não marcado (excesso de 1000 vezes) e tampão de ligação foi adicionado aos poços controlo numa placa de filtro de fibra de vidro Millipore de 96 poços (NSB de ligação não especifica). Vinte e cinco microlitros de tampão apenas foram adicionados ao poço de controlo de ligação máxima (ligação total). Vinte e cinco microlitros de concentrações variadas de anticorpo anti-IFNAR-1 marcado com 125I e 25 μΐ de células de Daudi ou células mononucleares do sangue periférico humano (4 x 107 células/ml) em tampão de ligação foram adicionados. As placas foram incubadas durante 2 horas a 200 RPM num agitador a 4 °C. Aquando da conclusão da incubação as placas Millipore foram lavadas duas vezes com 0,2 ml de tampão de ligação frio. Os filtros foram removidos e contados num contador gama. A avaliação da ligação de equilíbrio foi realizada utilizando parâmetros de ligação a locais únicos com o software Prism (San Diego, CA). Utilizando o ensaio de Scatchard anterior, a KD do anticorpo para as células de Daudi e para as células mononucleares do sangue periférico humano foi de aproximadamente 0:2 nM e 0,5 nM, respetivamente. 101 ΕΡ1781705Β1
RESUMO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: SEQUÊNCIA SEQ ID NO: SEQUÊNCIA 1 VH CDR1 a.a. 3F11 21 VK CDR3 a.a. 3F11 2 VH CDR1 a.a. 4G5 22 VK CDR3 a.a. 4G5 3 VH CDR1 a.a. 11E2 23 VK CDR3 a.a. 11E2 4 VH CDR1 a.a. 9D4 24 VK CDR3 a.a. 9D4 5 VH CDR2 a.a. 3F11 25 VH a.a. 3F11 6 VH CDR2 a.a. 4G5 26 VH a.a. 4G5 7 VH CDR2 a.a. 11E2 27 VH a.a. 11E2 8 VH CDR2 a.a. 9D4 28 VH a.a. 9D4 9 VH CDR3 a.a. 3F11 29 VK a.a. 3F11 10 VH CDR3 a.a. 4G5 30 VK a.a. 4G5 11 VH CDR3 a.a. 11E2 31 VK a.a. 11 E2 12 VH CDR3 a.a. 9D4 32 VK a.a. 9D4 13 VK CDR1 a.a. 3F11 33 VH n.t. 3F11 14 VK CDR1 a.a. 4G5 34 VH n.t. 4G5 15 VK CDR1 a.a. 11E2 35 VH n.t. 11E2 16 VK CDR1 a.a. 9D4 36 VH n.t. 9D4 17 VK CDR2 a.a. 3F11 37 VK n.t. 3F11 18 VK CDR2 a.a. 4G5 38 VK n.t. 4G5 19 VK CDR2 a.a. 11E2 39 VK n.t. 11E2 20 VK CDR2 a.a. 9D4 40 VK n.t. 9D4 41 VH 4-34 a.a. linha germinal 42 VH 5-51 a.a. linha germinal 43 VK L18 a.a. linha germinal 44 VK A27 a.a. linha germinal 102 ΕΡ1781705Β1
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
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Documentos de patente referidos na descrição • US 6713609 BI [0008] • WO 2004094473 A2 [0008] • US 5225539 A, Winter [0076] [0109] • US 5530101 A [0076] [0079] [0109] • US 5585089 A [0076] [0079] [0109] • US 5693762 A [0076] [0079] [0109] • US 6180370 A, Queen [0076] [0079] [0109] • US 20030153043 A, Carr [0082] • US 5677425 A, Bodmer [0084] • US 6165745 A, Ward [0085] • US 6277375 B, Ward [0086] • US 5869046 A [0086] • US 6121022 A, Presta [0086] • US 5624821 A [0087] • US 5648260 A, Winter [0087] • US 6194551 B, Idusogie [0088] • WO 9429351 A, Bodmer [0089] • WO 0042072 A, Presta [0090] • US 5714350 A [0091] • US 6350861 A, Co [0091] • EP 1176195 A, Hanai [0092] • WO 03035835 A, Presta [0092] • WO 9954342 A, Umana [0092] • EP 0154316 A, Nishimura [0093] • EP 0401384 A, Ishikawa [0093] • WO 02092780 A, Short [0099] 103 ΕΡ1781705Β1 wo 03074679 Δ , Lazar [0099] us 4816567 A, Cabilly [0109] us 5545806 A [0112] [0193] us 5569825 A [0112] us 5625126 A [0112] us 5633425 A [0112] us 5789650 A [0112] us 5877397 A [0112] us 5661016 A [0112] us 5814318 A [0112] us 5874299 A [0112] us 5770429 A, Lonberg and Kay [0112] us 5545807 A, Surani [0112] [0193] wo 9203918 A [0112] wo 9312227 A [0112] wo 9425585 A [0112] wo 9713852 A [0112] wo 9824884 A [0112] [0118] [0194] wo 9945962 A, Lonberg and Kay [0112] wo 0114424 A, Korman [0112] [0118] wo 0243478 A, Ishida [0113] us 5939598 A [0114] us 6075181 A [0114] us 6114598 A [0114] us 6150584 A [0114] us 6162963 A, Kucherlapati [0114] us 5223409 A [0116] us 5403484 A [0116] us 5571698 A, Ladner [0116] us 5427908 A [0116] us 5580717 A, Dower [0116] us 5969108 A [0116] us 6172197 A, McCafferty [0116] us 5885793 A [0116] us 6521404 A [0116] 104 ΕΡ1781705Β1 us 6544731 A [0116] us 6555313 A [0116] us 6582915 A [0116] us 6593081 A, Grif f us 5476996 A [0117] us 5698767 A, Wilso us 4399216 A [0125] us 4634665 A [0125] us 5179017 A, Axel wo 8704462 A [0127] wo 8901036 A [0127] EP 338841 A [0127] us 4946778 A, Ladne wo 8800052 A, Fange us 4954617 A [0147] wo 9410332 A [0147] us 5260203 A [0153] us 5455030 A [0153] us 4881175 A [0153] us 5132405 A [0153] us 5091513 A [0153] us 5476786 A [0153] us 5013653 A [0153] us 5258498 A [0153] us 5482858 A [0153] us 5399163 A [0175] us 5383851 A [0175] us 5312335 A [0175] us 5064413 A [0175] us 4941880 A [0175] us 4790824 A [0175] us 4596556 A [0175] us 4487603 A [0175] us 4486194 A [0175] us 4447233 A [0175] 105 ΕΡ1781705Β1 • US 4447224 A [0175] • US 4439196 A [0175] • US 4475196 A [0175] • US 4522811 A [0176] • US 5374548 A [0176] • US 5399331 A [0176] • US 5416016 A, Low [0176] • US 5888511 A [0178] • US 20020160974 A [0178] • US 60465155 B [0185] • WO 0109187 A [0193] • US 5625825 A [0193] • US 60465058 B [0219]
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Lisboa, 16 de Dezembro de 2014 112

Claims (27)

  1. ΕΡ1781705Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga ao recetor do interferão alfa humano (IFNAR-1), em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 1; uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 5; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 9; uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:13; uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:17; e uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:21; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2; uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID 1 ΕΡ1781705Β1 NO: 6; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 10; uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:14; uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:18; e uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:22; e (c) uma região variável de cadeia pesada CDR1 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia pesada CDR2 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 8; uma região variável de cadeia pesada CDR3 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:12; uma região variável de cadeia leve CDR1 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:16; uma região variável de cadeia leve CDR2 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:2 0; e uma região variável de cadeia leve CDR3 que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:24.
  2. 2. O anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 1, que compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de um gene de VH 4-34 ou 5-51 humano. 2 ΕΡ1781705Β1 3. 0 anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 1, gue compreende uma região variável de cadeia leve gue é o produto de um gene de VK L18 ou A27 humano. 4. 0 anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 2, gue compreende uma região variável de cadeia leve gue é o produto de um gene de VK L18 ou A27 humano. 5. 0 anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 2 ou 4, que compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene de VH 4-34 humano e uma região variável de cadeia leve de um gene de VK LI8 humano. 6. 0 anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 2 ou 4, que compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene de VH 5-51 humano e uma região variável de cadeia leve de um gene de VK A27 humano. 7. 0 anticorpo monoclonal isc ao antigénio do mesmo, da compreende: (a) uma região variável compreende os aminoácidos i; (b) uma região variável compreende os aminoácidos 5; (c) uma região variável compreende os aminoácidos 9; (d) uma região variável lado, ou porção de ligação reivindicação 1, o qual de cadeia pesada CDR1 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia pesada CDR2 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia pesada CDR3 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR1 que 3 ΕΡ1781705Β1 ΕΡ1781705Β1 região variável isolado, da isolado, da compreende os aminoácidos 13; (e) uma região variável compreende os aminoácidos 17; e (f) uma região variável compreende os aminoácidos 21. 8. 0 anticorpo monoclonal ao antigénio do mesmo, compreende: (a) uma região variável compreende os aminoácidos 2; (b) uma região variável compreende os aminoácidos 6; (c) uma região variável compreende os aminoácidos 10; (d) uma região variável compreende os aminoácidos 14; (e) uma região variável compreende os aminoácidos 18; e (f) uma região variável compreende os aminoácidos 22 .
  3. 9. O anticorpo monoclonal ao antigénio do mesmo, compreende: (a) uma estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR2 gue estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR3 que estabelecidos na SEQ ID NO: ou porção de ligação reivindicação 1, o qual de cadeia pesada CDR1 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia pesada CDR2 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia pesada CDR3 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR1 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR2 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR3 que estabelecidos na SEQ ID NO: ou porção de ligação reivindicação 1, o qual de cadeia pesada CDR1 que 4 ΕΡ1781705Β1 compreende os aminoácidos 4; (b) uma região variável compreende os aminoácidos 8; (c) uma região variável compreende os aminoácidos 12; (d) uma região variável compreende os aminoácidos 16; (e) uma região variável compreende os aminoácidos 20; e (f) uma região variável compreende os aminoácidos 24 . estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia pesada CDR2 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia pesada CDR3 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR1 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR2 que estabelecidos na SEQ ID NO: de cadeia leve CDR3 que estabelecidos na SEQ ID NO:
  4. 10. O anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da reivindicação 1, o qual compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:25; e uma região variável de cadeia leve que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:2 9; (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:26; e uma região variável de cadeia leve que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:30; e (c) uma região variável de cadeia pesada que 5 ΕΡ1781705Β1 compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:2 8; e uma região variável de cadeia leve que compreende NO:32 . os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID 11. 0 anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 10, o qual compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 25; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:29.
  5. 12. O anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 10, o qual compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 2 6; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO:30.
  6. 13. O anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigénio do mesmo, da reivindicação 10, o qual compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 28; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende os aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 32.
  7. 14. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-13, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, se 6 ΕΡ1781705Β1 liga ao recetor 1 do interferão alfa com uma KD de 1 x 10 M ou mais de afinidade.
  8. 15. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-13, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, se liga ao recetor 1 do interferão alfa com uma KD de 1 x 10 9 M ou mais de afinidade.
  9. 16. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe a atividade biológica do IFN-β.
  10. 17. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe a atividade do IFN ómega num ensaio de proliferação de células de Daudi.
  11. 18. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe a atividade de múltiplos interferões tipo I.
  12. 19. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe a atividade do IFNa2b num ensaio de proliferação de células de Daudi.
  13. 20. O anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe a secreção de IP-10 pelas células mononucleares do sangue 7 ΕΡ1781705Β1 periférico induzida pelo IFNa2b. 21. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe a secreção de IP-10 pelas células mononucleares do sangue periférico induzida pelo IFN ómega. 22. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe o desenvolvimento de células dendriticas mediada pelo plasma do Lúpus Eritematoso Sistémico. 23. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-15, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, se liga ao recetor 1 do interferão alfa com uma KD de 1 x 10 7 M ou menos.
  14. 24. Uma composição que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-23, e um portador farmaceuticamente aceitável.
  15. 25. Um imunoconjugado que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-23, ligado a um agente terapêutico.
  16. 26. O imunoconjugado da reivindicação 25 que compreende adicionalmente um portador farmaceuticamente aceitável.
  17. 27. O imunocon jugado da reivindicação 25 em que o agente terapêutico é uma citotoxina. 8 ΕΡ1781705Β1 28. 0 imunoconjugado da reivindicação 27 que compreende adicionalmente um portador farmaceuticamente aceitável. 29. 0 imunocon jugado da reivindicação 25 em que o agente terapêutico é um isotopo radioativo.
  18. 30. O imunoconjugado da reivindicação 29 que compreende adicionalmente um portador farmaceuticamente aceitável.
  19. 31. Uma molécula biespecifica que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-23, ligado a uma segunda fração funcional tendo um especificidade de ligação diferente do dito anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo.
  20. 32. Uma composição que compreende a molécula biespecífica da reivindicação 31 e um portador farmaceuticamente aceitável.
  21. 33. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-23.
  22. 34. Um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 33.
  23. 35. Uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão da reivindicação 34.
  24. 36. Um ratinho transgénico que compreende os transgenes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana, em que o ratinho expressa o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-23. 9 ΕΡ1781705Β1
  25. 37. Um hibridoma preparado a partir do ratinho da reivindicação 36, em que o hibridoma produz o dito anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio do mesmo.
  26. 38. Um método in vitro para a inibição da atividade biológica de um interferão tipo I numa célula que expressa o recetor 1 do interferão alfa que compreende o contacto da célula com o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-23, de tal forma que a atividade biológica do interferão tipo I é inibida. 39. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-23 para utilização no tratamento de uma doença ou distúrbio mediado pelo interferão tipo I num sujeito com necessidade de tratamento, em que a doença ou distúrbio é selecionada a partir do grupo que consiste em lúpus eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependente da insulina, doença intestinal inflamatória, esclerose múltipla, psoriase, tiroidite autoimune, artrite reumatoide e glomerulonefrite, VIH (ou SIDA) e rejeição de transplantes (ou doença do enxerto contra o hospedeiro).
  27. 40. Utilização do anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações 1-23 no fabrico de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio mediado pelo interferão tipo I num sujeito com necessidade de tratamento, em que a doença ou distúrbio é selecionada a partir do grupo que consiste em lúpus eritematoso sistémico, diabetes mellitus dependente da insulina, doença intestinal inflamatória, esclerose múltipla, psoriase, tiroidite autoimune, artrite reumatoide e glomerulonefrite, VIH (ou SIDA) e rejeição de transplantes (ou doença do enxerto contra o hospedeiro). Lisboa, 16 de Dezembro de 2014 10
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