PT1691833E

PT1691833E - Composições compreendendo polipéptidos

Info

Publication number: PT1691833E
Application number: PT04803302T
Authority: PT
Inventors: Nadja Prang; Robert Hofmeister; Andreas Wolf; Frank Hanakam; Thomas Urbig; Christian Itin; Patrick Baeuerle
Original assignee: Micromet Ag
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2010-06-08
Also published as: EP1691833A2; WO2005052004A2; CY2016010I2; US20070249529A1; HUS1600019I1; ES2341252T3; DK1691833T3; CA2544532C; DE602004025840D1; AU2004293182A1; SI1691833T1; EP2186527A1; ATE459374T1; LU93067I2; CA2544532A1; US10000574B2; CY2016010I1; CY1110689T1; BE2016C023I2; AU2004293182B2

Description

ΕΡ 1 691 833/PT DESCRIÇÃO "Composições compreendendo polipéptidos" 0 presente invento refere-se a composições compreendendo polipéptidos, especialmente polipéptidos capazes de se ligar especificamente a antigénios predeterminados através de epítopos nos referidos antigénios. Uma composição preferida é uma composição farmacêutica. 0 presente invento refere-se também a um método de produção de uma composição enriquecida na qual a quantidade de um polipéptido na forma monomérica foi enriquecida relativamente a outras formas multiméricas do polipéptido. 0 presente invento refere-se também a uma composição enriquecida produzida através do método de cima. 0 presente invento refere-se também a métodos para a prevenção, tratamento ou melhoria de várias doenças. Finalmente, o presente invento refere-se à utilização de composições para produção de um medicamento para a prevenção, tratamento ou melhoria destas várias doenças.

Com o advento de métodos padronizados para a produção de polipéptidos e proteínas recombinantes, estas espécies recombinantes estão a ser crescentemente empregues como agentes terapêuticos activos em composições farmacêuticas para o tratamento de estados de doença em seres humanos. Dado o número de companhias, organizações de investigação e laboratórios universitários envolvidos no desenvolvimento de polipéptidos e proteínas recombinantes terapêuticos, só se pode esperar que no futuro aumente o número de composições medicinais em que o efeito terapêutico é atribuível a um polipéptido ou proteína produzidos de forma recombinante.

Devido à sua elevada selectividade e afinidade de ligação, as imunoglobulinas ("Ig") ou anticorpos, representam uma classe especialmente relevante de proteínas de elevado potencial terapêutico. Com particular interesse em anos recentes foram produzidos de forma recombinante anticorpos de cadeia simples em ambas as formas monoespecífica e biespecífica. Os anticorpos de cadeia simples monoespecíficos são divulgados por exemplo, em US 4946778. Um anticorpo de cadeia simples biespecífico é divulgado por exemplo em 2

ΕΡ 1 691 833/PT US 5091513. Tais anticorpos de cadeia simples biespecificos podem ter particular relevância terapêutica, uma vez que as duas funcionalidades distintas dentro de uma tal espécie podem possuir eficazmente e selectivamente dois epitopos distintos, que são em muitos casos dois antigénios distintos espacialmente juntos in vivo. Devido ao facto de uma molécula de cadeia simples biespecífica unir dois locais de ligação ao antigénio numa cadeia polipeptídica simples contígua, tais moléculas superam os problemas de produção recombinante experimentados para as Ig inteiras devido por exemplo às últimas compreenderem uma porção Fc.

Tem tido particular interesse terapêutico o desenvolvimento de anticorpos produzidos de forma recombinante, por exemplo anticorpos de cadeia simples biespecificos, que são capazes de se ligar especificamente ao antigénio CD3 humano. O antigénio CD3 humano está presente tento em células T auxiliares como em células T citotóxicas. Estas últimas, nomeadamente as células T citotóxicas, são responsáveis pela morte de células invasoras ou infectadas contra as quais as células T citotóxicas foram activadas. CD3 humano denota um antigénio que é expresso em células T como parte do complexo multimolecular de células T e que compreende três cadeias diferentes: CD3-épsilon, CD3-delta e CD3-gama. A activação do potencial citotóxico das células T é um fenómeno complexo que requer a interacção de múltiplas proteínas. A proteína receptora de células T ("TCR") é um heterodímero ligado por dissulfureto ligado à membrana consistindo em duas subunidades glicoproteicas diferentes. A TCR reconhece e liga-se a um antigénio peptídico estranho que se ligou ele próprio a um membro da classe altamente diversa de proteínas principais de histocompatibilidade ("MHC") e foi apresentado, ligado ao MHC, na superfície das células de apresentação do antigénio ("APC").

Embora o TCR variável se ligue a um antigénio estranho tal como delineado acima, a sinalização para as células T de que esta ligação ocorreu depende da presença de outras proteínas de sinalização invariantes associadas ao TCR. Estas 3 ΕΡ 1 691 833/PT proteínas de sinalização na forma associada são colectivamente referidas como o complexo CD3.

Em resumo, a activação de citotoxicidade de células T depende normalmente primeiro da ligação do TCR a uma proteína de MHC, ela própria ligada a um antigénio estranho, situada numa célula separada. Apenas quando esta ligação inicial TCR-MHC ocorre pode suceder-lhe a cascata de sinalização dependente de CD3 responsável pela expansão clonal de células T e, finalmente, a citotoxicidade de células T.

No entanto, foi anteriormente verificado que certos locais de ligação ao antigénio polipeptídicos, produzidos de forma recombinante que se ligam especificamente a pelo menos uma parte do antigénio CD3 humano têm a capacidade de activar células T para exercerem um efeito citotóxico noutras células na ausência de ligação TCR-MHC independente. Isto significa que as células T se podem tornar citotoxicamente activas de um modo clonalmente independente, i.e., de uma maneira que seja independente do clone específico de TCR possuído pela célula T. Isto permite uma activação de todo o compartimento de células T em vez de apenas células T específicas de uma certa identidade clonal. Tais moléculas foram divulgadas em EP1348715; WO 99/54440; Mack, J. Immunol. 158: 3965-70, 1997;

Mack, PNAS 92: 7021-51995; Kufer, Câncer Immunol. Immunother. 45: 193-7, 1997; Lõffler, Blood 95: 2098-103, 2000; Bruhl, J.

Immunol. 166: 2420-6, 2001. O tipo de actividade biológica descrito acima, i.e., a capacidade de um polipéptido para (re)direccionar selectivamente o potencial citotóxico de células T citotóxicas contra células alvo predeterminadas para que as últimas sejam lisadas, pode ter a maior relevância terapêutica.

Especificamente, composições de tais polipéptidos tal como as descritas no parágrafo anterior podem ser e foram eficazmente utilizadas como parte de um regime de terapia implicando a destruição de células alvo associadas a determinadas doenças. Em particular, tais doenças incluem estados cancerosos nos quais células transformadas são as células alvo destinadas a destruição. 4 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ

Para além de ter o tipo de actividade biológica descrita acima, i.e., a capacidade para direccionar a citotoxicidade de células T para células alvo destinadas a destruição, as composições compreendendo polipéptidos do tipo descrito acima manifestarão frequentemente outros tipos adicionais de actividades biológicas não relacionadas com a lise das células alvo. Tais actividades biológicas adicionais podem ou não ser benéficas e, se uma tal composição for destinada a administração a um paciente, complicam a construção de um regime terapêutico. Por essa razão seria desejável eliminar estes tipos adicionais de actividades biológicas na maior extensão possível numa tal composição, para que o tipo de actividade biológica manifestado pela composição resultante permaneça tão homogéneo quanto possível. É por isso um objectivo do presente invento proporcionar uma composição que supere as dificuldades de cima.

Assim, o presente invento proporciona uma composição com um polipéptido. 0 polipéptido compreende pelo menos dois locais de ligação ao antigénio, em que os referidos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio estão localizados numa cadeia polipeptídica simples, e em que: um dos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio referidos liga-se especificamente ao antigénio CD3 humano; o referido polipéptido pode existir tanto na forma monomérica como na forma multimérica, sendo a referida forma monomérica a referida cadeia polipeptídica simples (com os pelo menos dois locais de ligação ao antigénio referidos) e a referida forma multimérica compreendendo pelo menos duas das referidas cadeias polipeptídicas simples associadas não covalentemente uma à outra, compreendendo assim pelo menos quatro locais de ligação ao antigénio; e a referida forma multimérica do referido polipéptido constitui não mais de 5% do peso total das formas monomérica e multimérica combinadas do referido polipéptido.

Os termos "polipéptido multimérico", "polipéptido na forma multimérica", "multímero", etc. tal como aqui se 5 ΕΡ 1 691 833/PT utilizam, são termos equivalentes e estão contemplados como significando (i) diferentes isoformas dentro de uma população de moléculas polipeptídicas multiméricas no mesmo grau (p.ex., diferentes isoformas diméricas), e/ou (ii) uma população de moléculas polipeptídicas que são multiméricas em diferentes graus (p.ex., dímeros, trímeros, etc.). 0 termo "local de ligação ao antigénio" deve ser entendido como uma porção de uma estrutura polipeptídica secundária e/ou terciária que se liga especificamente a um antigénio de interesse de um modo não covalente através de um epítopo do antigénio. Daqui em diante, deve estar presente que os antigénios são ligados através de um epítopo específico ou através de epítopos específicos de tais antigénios. Ligação "específica" denota a capacidade para discriminar entre diferentes antigénios como potenciais parceiros de ligação até um ponto em que, de um conjunto de uma pluralidade de diferentes antigénios como potenciais parceiros de ligação, apenas o antigénio de interesse se liga, ou se liga significativamente. Dentro do significado do presente invento, um antigénio liga-se "significativamente" quando, de entre um conjunto de diferentes antigénios igualmente acessíveis como potenciais parceiros de ligação, o antigénio de interesse se liga pelo menos 10 vezes, de preferência 50 vezes, ainda de preferência 100 vezes ou mais, mais frequentemente (num sentido cinético) que outros antigénios que não sejam o antigénio de interesse.

Enquanto um dos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio do polipéptido contido na composição do presente invento se liga especificamente ao antigénio CD3 humano, o pelo menos um outro local de ligação ao antigénio deste polipéptido é deixado ligar-se especificamente a qualquer outro antigénio (ou epítopo) de interesse ("antigénio alvo"). De preferência, o antigénio alvo é um antigénio expresso à superfície de uma célula, em que a célula que expressa o antigénio/epítopo alvo pode ser uma célula livre, tal como um linfócito na corrente sanguínea, ou pode fazer parte de um tecido sólido. Deste modo, o polipéptido contido na composição do presente invento pode com um braço (i.e., um local de ligação ao antigénio, ou o "local de ligação ao antigénio alvo") ligar-se especificamente ao antigénio alvo, enquanto 6 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ um/o segundo braço (i.e., outro/o outro local de ligação ao antigénio, ou o "local de ligação ao antigénio efector") do polipéptido contido na composição se liga especificamente e activa, através do antigénio CD3 humano, uma célula T citotóxica de um modo clonalmente independente tal como descrito acima. Deste modo, o polipéptido contido na composição de acordo com o presente invento pode ser geralmente empregue como parte de um regime terapêutico para destruir especificamente, através da célula T citotóxica, um certo tipo celular.

Tal como implicado acima, o polipéptido contido na composição de acordo com o presente invento é assim biologicamente activo. Os termos "biologicamente activo" e "actividade biológica" tal como aqui utilizados denotam a natureza de um efeito causado pelo polipéptido contido na composição de acordo com o presente invento quando o referido polipéptido é colocado num arranjo in vitro, ex vivo ou in vivo. Tal como aqui utilizada, actividade biológica refere-se portanto aos tipos de efeitos biológicos desencadeados em vez de à grandeza de um certo efeito.

Foi surpreendentemente verificado que a actividade biológica da forma monomérica do polipéptido contido na composição do presente invento é muito mais homogénea do que a da forma multimérica deste polipéptido. 0 mesmo é dizer que a forma monomérica do polipéptido demonstra um único tipo de actividade biológica (i.e., activação e redireccionamento da actividade citotóxica de células T contra células alvo que se pretendem destruir), enquanto a forma multimérica, por exemplo a forma dimérica do polipéptido, demonstra múltiplos tipos de actividade biológica que são diferentes dos manifestados pela forma monomérica do polipéptido.

Sem estar presos pela teoria, crê-se que a maior diversidade de actividade biológica observada para a forma multimérica do polipéptido contido na composição do presente invento pode ser devida, pelo menos em parte, ao maior número de modos de associação molecular disponíveis para o multímero em comparação com o monómero. 0 mesmo é dizer que, estatisticamente, existe um maior número de modos em que uma espécie multimérica constituída por uma pluralidade de cadeias 7 ΕΡ 1 691 833/PT polipeptídicas simples se pode associar e ficar dobrada do que existe para as correspondentes espécies monoméricas constituídas por apenas uma cadeia polipeptídica simples. Esta ideia surge de várias verificações dos inventores e é discutida em detalhe aqui adiante. A espécie monomérica do polipéptido contido na composição do presente invento exibe uma única actividade biológica. Tal como explicado acima, esta é a capacidade para recrutar as células T citotóxicas ("CTL") contra outras células que não sejam CTL, e que possuam à sua superfície um antigénio que se liga especificamente ao/a um local de ligação ao antigénio alvo.

Embora também manifestando parcialmente uma actividade biológica tal como observado para a espécie monomérica, uma ou mais das espécies multiméricas do referido polipéptido dão também origem a actividades biológicas adicionais. Foi por exemplo observado que as espécies multiméricas do polipéptido conduziram a uma diminuição no número de CTL presentes numa amostra. Embora não estando presos à teoria, os inventores acreditam que esta actividade biológica é provavelmente devida à associação intermolecular de pelo menos duas moléculas do polipéptido monomérico através dos seus respectivos locais de ligação ao antigénio. Deste modo, forma-se uma espécie multimérica na qual, por exemplo, os locais de ligação ao antigénio alvo se encaixam mutuamente um no outro, e ficam assim indisponíveis para ligação ao antigénio alvo, enquanto cada local de ligação ao antigénio efector específico para o antigénio CD3 humano permanece livre para se ligar a um antigénio CD3 respectivo. Deste modo, forma-se uma espécie que é capaz de se ligar especificamente a pelo menos duas moléculas distintas do antigénio CD3 humano através de epítopos idênticos. Uma tal espécie seria capaz de se ligar simultaneamente a pelo menos duas CTL separadas, um cenário no qual uma destas pelo menos duas CTL pode exercer o seu efeito citotóxico sobre qualquer outra das pelo menos duas CTL. Este tipo de actividade biológica, na qual outras células para além das células alvo destinadas a destruição (i.e., as próprias células T citotóxicas) são lisadas, faz diminuir o número global de CTL presentes numa amostra. Isto faz diminuir o número destas células T citotóxicas disponíveis para 8 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ participação no tipo de actividade biológica manifestada pela espécie monomérica, nomeadamente a destruição selectiva, através de lise mediada por células T, de células alvo doentes.

Adicionalmente, os inventores reconheceram que as formas multiméricas do polipéptido tal como contidas na composição do presente invento são capazes de activar CTL mesmo na ausência de outros tipos de células não CTL. Normalmente, a espécie monomérica do polipéptido contido na composição do presente invento activa o potencial citotóxico das CTL apenas na presença das células ("células alvo") apresentando o antigénio que se liga ao local de ligação ao antigénio alvo, células estas que são assim destinadas a destruição pelas CTL. A activação das CTL pelo polipéptido da presente composição apenas na presença de tais células alvo previne vantajosamente uma possivel direcção errada da actividade citotóxica das CTL para células não alvo que não sejam destinadas a destruição.

Os inventores verificaram também que a tendência para formar espécies multiméricas, especialmente uma espécie dimérica, é uma propriedade desta classe de polipéptidos em geral, nomeadamente cadeias polipeptídicas simples compreendendo tanto um local de ligação ao antigénio CD3 humano como um local de ligação para outro antigénio alvo para além do antigénio CD3 humano. As actividades biológicas adicionais acima podem portanto ser esperadas para qualquer polipéptido deste tipo, independentemente da especificidade do local de ligação ao antigénio alvo.

Tal como deriva das explicações acima, uma composição compreendendo apenas uma quantidade mínima, controlada de polipéptido na forma multimérica e em que o polipéptido total está substancialmente na forma monomérica demonstrará uma actividade biológica mais homogénea que a composição contendo uma quantidade maior de polipéptido multimérico. Ao prescrever um limite superior para a quantidade de polipéptido multimérico na composição do presente invento, obtém-se uma composição para a qual o grau de homogeneidade na actividade biológica é controlado e previsível. A capacidade de controlo e previsibilidade da actividade biológica são duas características que são preferíveis para composições 9 ΕΡ 1 691 833/PT contempladas para administração como parte de um regime terapêutico.

De acordo com uma concretização da composição de acordo com o presente invento, a forma multimérica do polipéptido constitui não mais de 4%, de preferência não mais de 3%, de maior preferência não mais de 2%, ainda de preferência não mais de 1%, ainda de maior preferência não mais de 0,5% do peso total combinado do polipéptido tanto nas formas monoméricas como multiméricas na composição. De maior preferência, as formas multiméricas do polipéptido constituem apenas ou mesmo menos do limite detectável das formas multiméricas do polipéptido na composição, estando a vasta maioria do polipéptido presente na composição numa forma monomérica.

Os termos “limite detectável" e "limite de detecção" tal como aqui utilizados são termos equivalentes e devem ser entendidos como denotando uma quantidade de polipéptido multimérico na presente composição abaixo da qual não é de todo possível a detecção do referido polipéptido multimérico, mesmo quando se aplica o ensaio mais rigoroso com as suas condições mais rigorosas. Métodos adequados para a determinação da quantidade de polipéptido multimérico na presente composição incluem qualquer método de detecção de espécies polipeptídicas, por exemplo através de electroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante em que as proteínas são coradas no gel com Azul brilhante de Coomassie ou nitrato de prata, através de análise Western blot ou métodos cromatográficos tais como HPLC de exclusão por tamanhos. De preferência, a monitorização da quantidade de polipéptido multimérico presente na composição pode ser mais bem realizada através de HPLC de exclusão por tamanhos analítica. Pela natureza do termo, o "limite detectável" dependerá da sensibilidade do método de detecção particular utilizado para ensaiar a quantidade da forma multimérica do polipéptido presente numa dada composição. Adicionalmente, o limite "detectável" dependerá compreensivelmente de quão rigorosamente os parâmetros do ensaio são aplicados para um dado método de escolha. 10 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ

Noutra concretização, a forma multimérica do polipéptido tal como descrito acima é exclusivamente a forma dimérica do polipéptido. A "forma dimérica" deve ser entendida como uma espécie compreendendo duas cadeias polipeptidicas simples, em que as duas cadeias polipeptidicas simples estão associadas não covalentemente uma à outra.

Está contemplada uma composição compreendendo um polipéptido que compreende ele próprio dois locais de ligação ao antigénio, e em que cada local de ligação ao antigénio compreende uma região variável de uma cadeia pesada de um anticorpo (VH) e uma região variável de uma cadeia leve de um anticorpo (VL), possuindo cada par VH/VL especificidade para um epítopo diferente, de preferência para um antigénio diferente, um dos quais é o antigénio CD3 humano. As regiões VH e VL dentro de um dado local de ligação ao antigénio podem ser derivadas do mesmo anticorpo ou de anticorpos diferentes. O local de ligação anti-CD3 pode estar localizado no terminal N ou C do polipéptido. Dentro do significado do presente invento, "VH/VL" ou "par VH/VL" deve ser entendido como denotando qualquer ordem de conectividade; seja VH-VL ou VL-VH. Embora a ligação covalente directa (peptídica) do aminoácido C-terminal de uma região VH ou VL ao aminoácido N-terminal de uma região VL ou VH, respectivamente, seja teoricamente possível, um perito na especialidade entenderá que uma tal ligação peptídica directa confere frequentemente muito poucos graus de liberdade espacial para permitir que as regiões VH e VL se associem de modo a que as suas respectivas regiões CDR possam formar um único local de ligação ao antigénio unificado. Um perito na especialidade compreenderá portanto que tal associação não covalente das regiões VH e VL consistente com a manutenção da capacidade para se ligar especificamente a um antigénio de escolha tornará frequentemente preferível a inclusão de um ligante peptídico interposto entre as regiões VH e VL. Um tal péptido ligante pode tomar a forma de ligantes divulgados na especialidade, por exemplo em EP 0623679 Bl, US 5258498, EP 0573551 BI e US 5525491.

Um perito na especialidade notará que se poderá esperar que uma tal molécula forme várias formas diméricas diferentes. Pode-se por exemplo esperar que as regiões VH e VL 11 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ constituindo ο local de ligação ao antigénio alvo de uma molécula polipeptídica monomérica se associe de um modo linear, anti-paralelo com as respectivas regiões VL e VH constituindo o local de ligação ao antigénio alvo de outra molécula polipeptídica monomérica. Isto produziria um polipéptido dimérico no qual os dois locais de ligação ao antigénio específicos para o antigénio CD3 humano permanecerão livres para se ligarem especificamente a dois antigénios CD3 humanos separados. Poder-se-á esperar também que as regiões VH e VL constituindo a especificidade de ligação ao antigénio CD3 de uma molécula polipeptídica monomérica se associe de um modo linear anti-paralelo com as respectivas regiões VL e VH constituindo a especificidade de ligação ao antigénio CD3 de outra molécula polipeptídica monomérica. Isto produziria um polipéptido dimérico no qual os dois locais de ligação ao antigénio específicos para o antigénio alvo permaneceriam livres para se ligarem especificamente a dois antigénios alvo separados. Estão também contemplados pares entre regiões VH e/ou VL do local de ligação ao antigénio alvo numa molécula polipeptídica monomérica com regiões VH e/ou VL do local de ligação ao antigénio efector específico para o antigénio CD3 humano noutra molécula polipeptídica monomérica. Aqui, poder-se-á esperar que a molécula polipeptídica dimérica retenha a capacidade para pelo menos parcialmente se ligar a cada um do antigénio CD3 humano e antigénio alvo de um modo específico. Os exemplos de cima não são limitantes em termos das diferentes espécies de polipéptido dimérico que podem ser formadas pelo polipéptido contido na composição do presente invento. Claramente, pode estar contemplada uma variedade de diferentes espécies diméricas, possivelmente explicando a actividade biológica variegada observada para o polipéptido multimérico, em particular para o dimérico.

De acordo com outra concretização do presente invento, a composição pode compreender polipéptidos nos quais um único local de ligação ao antigénio compreende duas regiões VH não covalentemente associadas na mesma cadeia polipeptídica, estando as duas regiões VH separadas por um ligante peptídico tal como descrito acima ou duas regiões VL associadas não covalentemente na mesma cadeia polipeptídica, estando as duas regiões VL separadas por um ligante peptídico tal como descrito acima. 12

ΕΡ 1 691 833/PT Ε considerado que as regiões VH e/ou VL de um dado local de ligação ao antigénio podem ser derivadas de diferentes fontes, por exemplo de dois anticorpos monoclonais diferentes que podem ou não ser originários de dois organismos da mesma espécie, ou podem ser modificados (i.e., quiméricos, truncados, humanizados, desimunizados, etc.).

Numa concretização especialmente preferida, o polipéptido contido na presente composição compreende dois locais de ligação ao antigénio, em que cada local de ligação ao antigénio compreende uma região VH e uma VL. Nesta concretização, os dois locais de ligação ao antigénio são covalentemente ligados um ao outro através de um espaçador peptidico curto, e cada local de ligação ao antigénio liga-se especificamente a um antigénio diferente. Como tal, um polipéptido de acordo com esta concretização seria representado pela fórmula genérica N- (VHa/VLa) -L- (VLa/VHa) -S- (VHb/VLb) -L- (VLb/VHb) -C, onde: - um respectivo par "VH/VL" ou "VL/VH" representa uma opção mutuamente exclusiva para escolha de VH ou VL nessa posição; - "a" e “h" (em índice) representa a especificidade para o antigénio a e b, respectivamente; - "L" representa um ligante peptidico ligando covalentemente uma respectiva VH e VL ou VL e VH dentro de um dado único local de ligação ao antigénio, tal como discutido acima; - "S" representa um espaçador peptidico, que é uma região polipeptídica ligando covalentemente o local de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao antigénio a com o local de ligação ao antigénio que se liga especif icamente ao antigénio b; e - "N" e "C" representam os respectivos terminais N e C do polipéptido.

Como tal, a presente concretização considera uma composição tal como exposta aqui compreendendo um polipéptido com dois locais de ligação ao antigénio distintos, em que cada 13 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ local de ligação ao antigénio compreende uma região VH e uma região VL ligadas através de um ligante peptidico, e em que os dois locais de ligação ao antigénio são ligados através de um único espaçador polipeptidico. Assim é criada uma cadeia polipeptidica simples na qual estão localizados dois locais de ligação ao antigénio de diferentes especificidades. Um perito na especialidade reconhecerá uma espécie desta forma geral como um "anticorpo de cadeia simples biespecífico".

Está dentro do âmbito da composição do presente invento que o polipéptido ai contido e tal como representado pela fórmula genérica acima possa incluir opcionalmente outras funcionalidades tais como um marcador de His ou um marcador Flag ou outras formas de marcadores funcionais.

Numa concretização particularmente preferida do presente invento a composição compreende um polipéptido no qual o outro dos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio, i.e., o local de ligação ao antigénio alvo, liga-se especificamente ao antigénio CD19 humano. 0 antigénio CD19 humano é expresso em toda a linhagem B humana desde a célula pró-B à célula B madura, não é derramado, é uniformemente expresso em todas as células de linfoma e está ausente das células estaminais. Assim, uma composição de acordo com esta concretização, nomeadamente uma compreendendo um polipéptido com um local de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao antigénio CD3 humano bem como um local de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao antigénio CD19 humano, é de grande valor potencial como terapêutico. A actividade biológica da forma monomérica do polipéptido compreendida numa composição recruta vantajosamente o potencial citotóxico das células T contra as células B num sujeito (tal como explicado acima). Ao controlar a razão multimero:monómero do polipéptido tal como exposto acima, obtêm-se uma composição que pode ser vantajosamente utilizada para tratar distúrbios relacionados com células B de um modo extremamente controlado e portanto de uma forma terapeuticamente eficaz. É especialmente preferida uma composição na qual o polipéptido com especificidades de ligação tanto ao antigénio CD3 humano como ao antigénio CD19 humano tem uma sequência de 14 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ aminoácidos equivalente, ou substancialmente equivalente, a qualquer uma das expostas em SEQ ID NO : 1-6 como se segue: Representação esquemática VH(CD19)-S-VH(CD3)-L-VL(CD3) de r SEQ ID NO 1: VL(CD19)-L Representação esquemática VL(CD19)-S-VH(CD3)-L-VL(CD3) de r SEQ ID NO 2: VH(CD19)-L - Representação esquemática de S-VH(CD19)-L-VL(CD19); ou SEQ ID NO 3: VH(CD3) -L-VL(CD3) - Representação esquemática de S-VL(CD19)-L-VH(CD19 ) , SEQ ID NO 4: VH(CD3) -L-VL(CD3) - Representação esquemática de S-VH(CD19)-L—VL(CD19) , SEQ ID NO 5: VL(CD3) -L-VH(CD3) - Representação esquemática de SEQ ID NO 6: VL(CD3) -L-VH(CD3) S-VL(CD19)-L—VH(CD19), em que: - VH(CD19) e VL(CD19) representam uma região VH e uma região VL, respectivamente, que se associam uma à outra para formar um local de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao antigénio CD19 através de um epítopo do antigénio CD19; - VH(CD3) e VL(CD3) representam uma região VH e uma região VL, respectivamente, que se associam uma à outra para formar um local de ligação ao antigénio que se liga especif icamente ao antigénio CD3 através de um epítopo do antigénio CD3 humano; - "L" e "S" são tal como definidos acima.

Nesta concretização, o termo "substancialmente equivalente a" é entendido como compreendendo sequências de aminoácidos homólogas a qualquer uma de SEQ ID NO: 1-6 em pelo menos 70%, com base numa comparação da sequência de aminoácidos primária. Tais graus de homologia podem ser determinados através de programas de alinhamento de sequências padrão tais como Vector NTI (InforMax™, Maryland, USA). Tais programas comparam sequências alinhadas numa base aminoácido-a-aminoácido, e podem ser definidos a vários níveis de rigor para a comparação (p.ex., aminoácido idêntico, substituição de aminoácidos conservativa, etc.). Dentro do significado desta concretização, os dois aminoácidos em questão são considerados 15 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ como sendo "homólogos" quando são idênticos um ao outro ou substituições conservativas um do outro. Para fins de exemplo não limitante, dois aminoácidos diferentes pertencentes à classe de aminoácidos lipófilos seriam considerados homólogos no sentido desta concretização, mesmo que esses dois aminoácidos não fossem idênticos, enquanto um aminoácido lipófilo por um lado e um aminoácido ácido com carga por outro não seriam considerados homólogos.

Noutra concretização preferida do presente invento a composição compreende um polipéptido no qual o outro dos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio, i.e. os locais de ligação ao antigénio que não se ligam especificamente ao antigénio CD3 humano, liga-se especificamente ao antigénio EpCAM humano ("Molécula de adesão das células epiteliais", também designada antigénio 17-1A, KSA, EGP40, GA733-2, ksl-4 ou esa). 0 EpCAM é uma glicoproteína integrada na membrana de 40 kDa de 314 aminoácidos com expressão específica em certos epitélios e em muitos carcinomas humanos. Mostrou-se em vários estudos que o EpCAM é benéfico em diagnóstico e terapia de vários carcinomas. Para além disso, em muito casos, foi observado que as células tumorais expressam EpCAM num grau muito maior que as suas formas de epitélio parentais ou menos agressivas dos referidos cancros.

Para obter uma composição de acordo com o presente invento começando a partir de uma composição compreendendo o polipéptido tanto na forma monomérica como multimérica, é frequentemente necessário ajustar a quantidade (i.e. o peso presente na composição) de polipéptido na forma monomérica relativamente à quantidade (i.e. o peso presente na composição) de polipéptido na forma multimérica. Uma vez que o peso do polipéptido na forma multimérica em composições não tratadas, por exemplo lisados celulares colhidos obtidos após expressão da proteína, excederão frequentemente 5% do peso total das formas monoméricas e multiméricas combinadas do polipéptido, será frequentemente necessário enriquecer o teor do polipéptido na forma monomérica relativamente ao teor do polipéptido na forma multimérica para obter a composição do presente invento. Em geral, as possibilidades incluem HPLC de permuta iónica de elevada resolução, cromatografia de exclusão por tamanhos de elevada resolução, purificação em gel, 16 ΕΡ 1 691 833/PT controlo das condições de expressão proteica (p.ex., escolha do hospedeiro de expressão, condições de crescimento aplicadas ao hospedeiro, vector de expressão utilizado, tipo de promotor utilizado, etc.)· São proporcionados particulares vantajosos nos exemplos aqui anexos.

Para efectuar o enriquecimento mencionado acima, outro aspecto do presente invento proporciona um método de produção de uma composição no qual a quantidade de um polipéptido na forma monomérica foi enriquecida relativamente à quantidade do referido polipéptido na forma multimérica. 0 método compreende os seguintes passos: a) proporcionar a composição compreendendo o referido polipéptido em ambas as formas multimérica e monomérica; b) isolar o referido polipéptido em ambas as formas multimérica e monomérica da referida composição, sendo o referido isolamento realizado através de: (bl) aplicação da referida composição a um primeiro material cromatográfico compreendendo um ião metálico, que é o ião Zn2+ ou Ni2+; (b2) remoção de quaisquer componentes da referida composição que não se tenham ligado ao primeiro material cromatográfico através de lavagem do referido primeiro material cromatográfico com um primeiro tampão; e (b3) eluição do referido polipéptido em ambas as formas multimérica e monomérica a partir do referido primeiro material cromatográfico através da aplicação de imidazole ao referido primeiro material cromatográfico numa concentração variando de 60 mM a 300 mM; (b4) recolha de um primeiro eluato compreendendo o referido polipéptido na forma multimérica e do referido polipéptido na forma monomérica; c) realizar um passo precursor que é preparatório para que a separação do referido polipéptido na forma multimérica do referido polipéptido na forma monomérica ocorra no passo (d), sendo o referido passo precursor realizado através de: 17

ΕΡ 1 691 833/PT (cl) aplicação do referido primeiro eluato a um segundo material cromatográfico, que é um material de permuta iónica; (c2) remoção de quaisquer componentes do primeiro eluato que não se tenham ligado ao referido segundo material cromatográfico através de lavagem do referido segundo material cromatográfico com um segundo tampão; (c3) eluição do referido polipéptido na forma multimérica e monomérica do referido segundo material cromatográfico através de aplicação de cloreto de sódio ao referido segundo material cromatográfico numa concentração variando de 200 mM a 500 mM; (c4) recolha de um segundo eluato; d) realizar uma separação do referido polipéptido na forma multimérica do referido polipéptido na forma monomérica, sendo a referida separação realizada através de: (dl) aplicação do referido segundo eluato a um terceiro material cromatográfico permitindo a separação com base no peso molecular; (d2) translocação dos componentes do segundo eluato aplicado ao longo do referido terceiro material cromatográfico através da aplicação de um tampão eluente ao referido terceiro material cromatográfico; (d3) recolha de um terceiro eluato em fracções; e) analisar as referidas fracções do referido terceiro eluato individualmente para obter uma medida da quantidade do referido polipéptido na forma monomérica relativamente à quantidade de polipéptido na forma multimérica em cada fracção; e combinar as fracções do referido terceiro eluato que (quase) exclusivamente contém o polipéptido na forma monomérica para obter uma composição enriquecida no polipéptido na forma monomérica. 18 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ

Dentro do significado do presente invento, o termo "uma composição que é enriquecida na forma monomérica do polipéptido" e semelhante é qualquer composição, cuja razão monómero:multimero foi ajustada para ficar conforme com o presente invento. Esta poderá ser um lisado celular não tratado tal como obtido após produção recombinante do polipéptido ou uma composição que tenha já sofrido algum grau de enriquecimento, mas que ainda não verifique os critérios desejados em relação à razão das formas monoméricas para multiméricas do polipéptido presente.

Está contemplado que o "primeiro material cromatográfico" e "segundo material cromatográfico" são utilizados como parte de um processo em descontinuo ou numa coluna de cromatográfia. De preferência, são utilizadas colunas de cromatográfia. Um perito na especialidade estará familiarizado com a selecção, empacotamento e preparação de tais colunas de cromatográfia antes da cromatográfia das proteínas.

De acordo com o método de cima, o primeiro material cromatográfico compreendendo um ião metálico é um material cromatográfico compreendendo um ião metálico bivalente, por exemplo o ião Ni2+ ou Zn2+. Um primeiro material cromatográfico vantajoso é EMD Fractogel® Chelating (Merck), que foi previamente carregado com Zn2+. Utilizando um tal primeiro material cromatográfico, é vantajosamente possível isolar o polipéptido, quer na forma monomérica quer multimérica, dos componentes estranhos tipicamente presentes, por exemplo, num lisado celular não tratado. A co-expressão de um marcador funcional como parte do polipéptido, por exemplo um marcador de His ou um marcador Flag, pode facilitar este isolamento.

De acordo com outra concretização preferida, o segundo material cromatográfico permite a separação com base em permuta aniónica. Um segundo material cromatográfico vantajoso a este respeito é Q Sepharose HP (Amersham Biosciences).

Tal como é típico em cromatográfia de proteínas, é vantajoso equilibrar os materiais cromatográficos, de preferência empacotados em colunas, com um tampão antes de realizar de facto a cromatográfia de proteínas. Após aplicação da composição ou do eluato a isolar ou separar ao material 19 ΕΡ 1 691 833/PT cromatográfico, este mesmo tampão é utilizado para lavar qualquer material que não se tenha conseguido ligar ao material cromatográfico. 0 volume do primeiro e segundo tampões utilizados para lavagem das substâncias não ligadas, respectivamente, do primeiro e segundo materiais cromatográficos corresponde vantajosamente a 6 a 10 vezes, de preferência 6 vezes o volume do respectivo material cromatográfico utilizado. 0 volume do tampão eluente utilizado para translocação de substâncias ao longo do terceiro material cromatográfico corresponde vantajosamente a 1 a 2 vezes, de preferência 1 vez o volume do material cromatográfico utilizado. Tampão fosfato (pH 8) é vantajoso tanto como primeiro tampão como segundo tampão, enquanto que tampão fosfato (pH 7,0-7,5) ou tampão citrato/lisina (pH 6,0-7,5) é vantajoso como tampão eluente.

De acordo com uma outra concretização do método do presente invento, o referido método compreende o passo adicional de análise da composição obtida no passo (e). Deste modo, pode-se obter uma medida da quantidade do referido polipéptido na forma monomérica relativamente à quantidade de polipéptido na forma multimérica na composição. Se desejado ou determinado ser necessário, pode resultar outro enriquecimento através da repetição dos passos (d) a (e). Numa tal repetição, a composição resultante do ciclo prévio de enriquecimento é aplicada ao terceiro material cromatográfico em vez do segundo eluato. Assim, o processo de enriquecimento da forma monomérica do polipéptido de modo a que esta forma esteja presente em não mais do que a proporção prescrita ou desejada dentro da composição pode ser um procedimento iterativo que pode ser repetido tão frequentemente quanto o necessário ou desejado até que um dado grau de enriquecimento na quantidade do polipéptido na forma monomérica tenha sido alcançado. Tipicamente, no entanto, um ciclo de enriquecimento deve ser suficiente para gerar uma composição conforme com os critérios expostos para a composição tal como aqui definida. É vantajoso efectuar tal análise opcional utilizando um método cromatográfico que separe substâncias com base no seu peso molecular. De preferência, um tal método cromatográfico é cromatográfia de exclusão por tamanhos de elevada resolução efectuada num aparelho de HPLC. Um perito na especialidade 20 ΕΡ 1 691 833/PT compreenderá como ajustar parâmetros de HPLC tais como caudal, pressão e natureza do tampão da fase móvel utilizado. A análise subsequente através de HPLC de exclusão por tamanhos tem a vantagem de que as quantidades relativas das formas monomérica e multimérica do polipéptido podem ser determinadas com um elevado grau de precisão e sensibilidade.

No método do presente invento, o referido imidazole no passo (b3) pode ser aplicado numa única concentração, ou pode ser aplicado na forma de um gradiente de concentração variando de 60 a p.ex. 300 mM. Igualmente, o referido cloreto de sódio no passo (c3) pode ser aplicado ao segundo material de cromatografia numa única concentração, ou pode ser aplicado na forma de um gradiente de concentração variando de 200 a p.ex. 500 mM. Tais gradientes de concentração podem ser um gradiente passo-a-passo, i.e., um gradiente no qual a concentração, por exemplo, de imidazole 60 mM/cloreto de sódio 200 mM é mantida durante um período de tempo antes da mudança para uma concentração de, por exemplo, 70 mM/cloreto de sódio 220 mM, que é mantida durante um período de tempo antes de ser mudada para a concentração seguinte e por aí adiante. O gradiente de concentração pode também ser um gradiente sem ser passo-a-passo, i.e. um gradiente no qual a concentração de imidazole/cloreto de sódio é aumentada a uma velocidade constante linear ao longo do tempo. No caso de ser utilizada uma única concentração de imidazole, concentrações vantajosas são 7 0 mM, 8 0 mM, 9 0 mM, 100 mM, 110 mM ou 12 0 mM. No caso de ser utilizada uma única concentração de cloreto de sódio, concentrações vantajosas são 370 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM ou 420 mM.

Numa concretização especialmente vantajosa do presente invento, o imidazole é aplicado numa única concentração de 80 mM ao primeiro material cromatográfico. Noutra concretização vantajosa do presente invento, o cloreto de sódio é aplicado numa única concentração de 400 mM ao segundo material cromatográfico. Uma combinação destas concretizações vantajosas é particularmente preferida. A aplicação de imidazole e cloreto de sódio nas respectivas concentrações acima tem o efeito vantajoso de que a distribuição da forma monomérica do polipéptido e as espécies que eluem mais próximo da forma multimérica do polipéptido, nomeadamente a forma 21 ΕΡ 1 691 833/PT dimérica do polipéptido, é resolvida como dois picos distintos, i.e. não sobreponiveis do polipéptido no subsequente segundo passo de separação (d) . A separação das duas espécies polipeptidicas, aqui as formas monomérica e dimérica do polipéptido, com tal resolução limiar permite que seja obtida a forma monomérica do polipéptido num rendimento mais elevado livre de impurezas da correspondente forma dimérica do polipéptido. Isto por sua vez aumenta a probabilidade de obtenção de fracções da segunda separação contendo exclusivamente ou predominantemente o polipéptido na forma monomérica. Como tal, a resolução vantajosa alcançada através das duas concentrações acima de imidazole e cloreto de sódio utilizadas concertadas aumenta a eficiência com a qual pode ser obtida uma composição enriquecida em relação à forma monomérica do polipéptido.

Outro aspecto do presente invento é uma composição (obtenível através do método de cima de obtenção de uma composição) que é enriquecida na forma monomérica do polipéptido relativamente à multimérica. Assim, o método e a utilização das reivindicações anexas 20 a 25 podem ser vantajosamente realizados/ocorrer com a composição obtida através de tal método acima.

Outro aspecto do presente invento proporciona um método para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de uma doença proliferativa, de um cancro residual mínimo, de uma doença tumoral, de uma doença inflamatória, de um distúrbio imunológico, de uma doença auto-imune, de uma doença infecciosa, de uma doença virai, de uma reacção alérgica, de uma reacção parasitária, de uma doença enxerto-versus-hospedeiro, de uma doença hospedeiro-versus-enxerto ou de uma malignidade de células B. De acordo com este aspecto, a composição tal como aqui divulgada acima é administrada a um sujeito a necessitar de uma tal prevenção, tratamento ou melhoria.

Outro aspecto do presente invento proporciona uma utilização da composição tal como aqui divulgado acima para a produção de um medicamento para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de uma doença proliferativa, de um cancro residual mínimo, de uma doença tumoral, de uma doença inflamatória, de 22 ΕΡ 1 691 833/PT um distúrbio imunológico, de uma doença auto-imune, de uma doença infecciosa, de uma doença virai, de uma reacção alérgica, de uma reacção parasitária, de uma doença enxerto-versus-hospedeiro, de uma doença hospedeiro-versus-enxerto ou de uma malignidade de células B.

De acordo com uma concretização preferida, a prevenção, o tratamento ou a melhoria ocorre num humano. A doença tumoral é de preferência seleccionada de entre o grupo que consiste num linfoma, um linfoma de células B e um linfoma de Hodgkin. Noutra concretização, o linfoma de células B é um linfoma não hodgkiniano. Noutra concretização, a doença auto-imune é seleccionada de entre artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes mellitus tipo 1, doença inflamatória do intestino, lúpus sistémico eritematoso, psoríase, esclerodermia e doenças auto-imunes da tiróide.

Ao longo do presente pedido, deve entender-se que a utilização de um termo no singular pode implicar, quando apropriado, a utilização do respectivo termo no plural. Semelhantemente, a utilização de um termo no plural pode implicar, quando apropriado, a utilização do respectivo termo no singular. 0 presente invento será agora melhor descrito através das figuras e exemplos anexos.

Breve descrição das figuras

Fig. IA: Modelo de um polipéptido compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que um local de ligação ao antigénio liga-se especificamente ao antigénio CD3 humano, e em que o polipéptido existe na forma monomérica.

Fig. 1B: Modelo de um polipéptido compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que um local de ligação ao antigénio liga-se especificamente ao antigénio CD3 humano, e em que o polipéptido existe na forma multimérica, (aqui, dimérica) devido a associação de dois locais de ligação ao antigénio alvo individuais. 23

ΕΡ 1 691 833/PT

Fig. 1C: Modelo de um polipéptido compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, em que um local de ligação ao antigénio liga-se especificamente ao antigénio CD3 humano, e em que o polipéptido existe na forma multimérica (aqui, dimérica) devido à associação de dois locais de ligação ao antigénio efectores individuais específicos para o antigénio CD3 humano.

Fig. 2: Supra-regulação do marcador inicial de células T CD69 em função da concentração do polipéptido na forma monomérica e multimérica (aqui, dimérica).

Fig. 3A: Lise mútua de células T em função da concentração de polipéptido na forma monomérica e multimérica (aqui, dimérica) utilizando PBMC como células efectoras.

Fig. 3B: Lise mútua de células T em função da concentração de polipéptido na forma monomérica e multimérica (aqui, dimérica) utilizando células MC15 como células efectoras.

Exemplos e descrição detalhada das figuras Exemplo 1: Produção do polipéptido A partir de vectores de expressão eucarióticos adequados, a expressão de um polipéptido compreendendo dois locais de ligação ao antigénio é efectuada em células CHO num biorreactor em tanque com agitação utilizando um meio livre de soro e de proteínas. A fermentação é conduzida em modo de carga em descontínuo a 37°C com alimentação de glicose. Após o processo de fermentação se completar, o sobrenadante contendo o polipéptido segregado é colhido através de filtração sem saída e concentrado 10 vezes através de filtração por fluxo. 0 seguinte descreve como a proporção da quantidade de polipéptido na forma monomérica para a quantidade de polipéptido na forma multimérica pode ser ajustada. Como modelo para tal ajuste, é utilizado o polipéptido anti-CD19 χ anti-CD3 de acordo com SEQ ID NO: 1 (daqui em diante "Construção 1") , e a forma multimérica da Construção 1 é a forma dimérica da Construção 1. 24

ΕΡ 1 691 833/PT A captura da Construção 1 a partir da colheita celular é efectuada utilizando uma coluna de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (Fractogel EMD Chelating, Merck) carregada com zinco (Zn2+-IMAC) . A coluna é equilibrada com 2 volumes da coluna (VC) de tampão fosfato, a colheita celular é aplicada a 120-180 cm/h e o material não ligado é lavado com 6 VC de tampão. A aplicação de um gradiente de passos com Imidazole 60-300 mM em tampão fosfato ao longo de 5 VC elui o produto. Alternativamente, uma concentração individual de imidazole 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM ou 120 mM pode ser utilizada para este fim. A purificação intermédia da Construção 1 é efectuada empregando cromatografia de permuta aniónica (AIEX, Q Sepharose HP, Amersham Biosciences). A coluna é equilibrada com 2 VC de tampão fosfato pH 8,0 e o eluato da coluna IMAC é directamente aplicado na coluna. A proteina não ligada é removida através de lavagem com 6 VC de tampão. O produto é subsequentemente eluido com um gradiente de passos de 6 VC de cloreto de sódio 200-500 mM em tampão. Alternativamente, uma concentração individual de 370 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM ou 420 mM de cloreto de sódio pode ser utilizada para este fim. 0 ajuste final é efectuado através de cromatografia de exclusão por tamanhos (SEC) incluindo uma separação das formas monomérica e dimérica da Construção 1. Uma coluna de grau preparativo Superdex 200 (Amersham Biosciences, altura do leito >600 mm) é equilibrada com pelo menos 4 VC de tampão fosfato pH 7,0-7,5 ou tampão citrato/lisina pH 6,0-7,5. A amostra (correspondendo a um volume de 1-5% do VC) é aplicada na coluna e é efectuada uma eluição isocrática utilizando o tampão de equilíbrio. O dímero elui a aproximadamente 0,5-0,6 VC enquanto o monómero elui a aproximadamente 0,6 a 0,7 VC (as condições exactas de eluição podem variar dependendo do comprimento da coluna, volume da amostra e qualidade do empacotamento da coluna). O polipéptido eluido é fraccionado e as fracções desejadas são combinadas. As últimas fracções contêm uma quantidade mais elevada de Construção 1 na forma monomérica que as fracções iniciais. A proporção da quantidade de Construção 1 monomérica para a quantidade de Construção 1 dimérica pode portanto ser influenciada pela escolha da fracção utilizada. 25

ΕΡ 1 691 833/PT

Combinações específicas dos parâmetros de eluição provaram ser muito vantajosas. Especificamente, a eluição do polipéptido, por exemplo Construção 1, a partir da coluna Zn2+—IMAC com uma única concentração de imidazole de 80 mM seguida no passo seguinte por eluição deste polipéptido da coluna de permuta aniónica com uma única concentração de 400 mM de cloreto de sódio produz uma mistura do polipéptido que, quando resolvida através de cromatografia de exclusão por tamanhos tal como descrito acima, resulta na forma monomérica do polipéptido a ser resolvida no limiar da seguinte forma multimérica maior do polipéptido, nomeadamente da forma dimérica do polipéptido. Esta falta de sobreposição dos lados dos picos correspondentes às formas monomérica e dimérica do polipéptido facilita a obtenção de fracções contendo exclusivamente ou predominantemente a forma monomérica do polipéptido; estas fracções podem ser posteriormente combinadas para obter uma mistura na qual o teor da forma monomérica do polipéptido foi enriquecido relativamente ao teor da forma multimérica ou, aqui, dimérica do polipéptido.

Como alternativa, pode ser utilizada cromatografia de permuta catiónica ou aniónica ou cromatografia em hidroxiapatite para separar o polipéptido monomérico do multimérico, especialmente do polipéptido dimérico. Na cromatografia de permuta tanto catiónica como aniónica a forma dimérica do polipéptido elui posteriormente durante a eluição do gradiente. Para separação do monómero e do dímero utilizando permuta iónica, o eluato da coluna de permuta aniónica deve ser diluído. Para permuta catiónica, o pH deve ser ajustado para permitir a ligação do polipéptido. Quando se utiliza cromatografia de hidroxiapatite, deve ser utilizado um tampão fosfato de baixa condutividade. A análise da proporção das quantidades relativas de polipéptido monomérico para multimérico numa dada mistura pode ser efectuada através de SEC-HPLC utilizando p.ex. um sistema de HPLC da série Agilent 1100 (ou semelhante) . A coluna utilizada é uma coluna Tosoh Biosep TSKgel G3000SWXL com coluna de guarda a um caudal de 0,6-0,75 ml/minuto a uma Pressão máxima de 75 bar (7,5xl06 Pa) . Como fase móvel é utilizado um tampão KH2PO4/KOH 100 mM, Na2SC>4 200 mM pH 6,6. São aplicados 100 μΐ de amostra. O tempo eluente total é de 27 26 ΕΡ 1 691 833/PT minutos. O comprimento de onda de detecção é regulado para 210 nm.

Exemplo 2: Actividades biológicas adicionais atribuíveis ao polipéptido na forma multimérica mas não ao polipéptido na forma monomérica

Um polipéptido compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, um dos quais se liga especificamente ao antigénio CD3 humano, é capaz de se ligar (e activar a actividade citotóxica) a células T citotóxicas através do antigénio CD3 localizado à superfície de tais células T citotóxicas. Ao mesmo tempo, um tal polipéptido pode ligar-se especificamente com o seu local de ligação alvo a um alvo na superfície, por exemplo, de células tumorais, que normalmente não seria reconhecido por células T citotóxicas. Deste modo, a actividade citotóxica de células T pode ser dirigida, por exemplo, a células tumorais como parte de um regime terapêutico para eliminar tais células. Idealmente, as células T citotóxicas são apenas activadas após interacção com uma célula alvo mediada pela molécula polipeptídica descrita acima. Enquanto o mecanismo de activação descrito acima parece ser a única actividade biológica observada para o polipéptido na forma monomérica (tal como aqui definido acima), observou-se que o polipéptido na forma multimérica (tal como aqui definido acima) exibe actividades biológicas adicionais.

Os polipéptidos compreendendo dois locais de ligação ao antigénio, dos quais um local de ligação ao antigénio liga-se especificamente ao antigénio CD3 humano, têm uma tendência para dimerizar.

Os seguintes exemplos discutem portanto a natureza destas actividades biológicas adicionais observadas para o polipéptido na forma multimérica, utilizando o polipéptido na forma dimérica como um exemplo concreto. A Fig. IA representa um polipéptido na forma monomérica tal como contido na composição do presente invento. Os locais de ligação ao antigénio do polipéptido são, cada um, derivados de anticorpos diferentes, e cada um compreende uma região VH e VL. As designações "VH/VL" e "VL/VH" denotam uma opção 27 ΕΡ 1 691 833/PT mutuamente exclusiva de VH ou VL na região assim designada. Deste modo esperar-se-ia gue uma região designada "VH/VL" se associasse com uma região designada "VL/VH" uma vez que as duas associações possíveis resultariam em, do terminal amino para o carboxilo, VH associando-se com VL ou VL associando-se com VH. Esperar-se-ia que o polipéptido na forma monomérica representado na Fig. IA se ligasse especificamente ao antigénio CD3 humano com o local de ligação ao antigénio esquerdo, e a outro antigénio alvo com o local de ligação ao antigénio direito. 0 polipéptido pode portanto actuar como uma ponte ligando especificamente a uma célula T citotóxica a uma célula alvo de interesse ao mesmo tempo que dirige a actividade citotóxica da célula T citotóxica contra a célula alvo tal como aqui descrito acima. A Fig. 1B representa um modelo possível para o polipéptido contido no presente invento, em que este polipéptido está na forma multimérica. Aqui, o polipéptido específico mostrado está na forma dimérica, significando que as duas cadeias polipeptídicas simples se associaram não covalentemente para formar uma espécie homodimérica. A Fig. 1B representa o cenário em que as duas cadeias polipeptídicas simples se associaram não covalentemente de um modo anti-paralelo através dos seus locais de ligação ao antigénio que se ligam especificamente ao antigénio alvo. Deve notar-se que neste modelo de formação de dímeros, os locais de ligação ao antigénio que se ligam especificamente ao antigénio CD3 humano (cada um designado "anti-CD3") estão livres para se ligarem a dois antigénios CD3 humanos separados (um antigénio CD3 humano é especificamente ligado por cada local de ligação anti-CD3). Em contraste, o local de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao antigénio alvo (designado "anti-alvo") presente numa cadeia polipeptídica simples é não covalentemente associado ao local de ligação "anti-alvo" presente na outra cadeia polipeptídica simples, para que nenhum destes dois locais de ligação ao antigénio se possa ligar especificamente ao antigénio alvo. Como tal, o polipéptido na forma dimérica representado na Fig. 1B seria capaz de se ligar simultaneamente e especificamente a dois antigénios CD3 humanos individuais, mas seria menos capaz de se ligar a um antigénio alvo. 28

ΕΡ 1 691 833/PT A Fig. 1C representa outro possível modelo para o polipéptido contido no presente invento, em que este polipéptido está na forma multimérica. Aqui, o polipéptido específico mostrado está na forma dimérica, significando que as duas cadeias polipeptídicas simples se associaram não covalentemente para formar uma espécie homodimérica. A Fig. 1B representa o cenário em que as duas cadeias polipeptídicas simples se associaram não covalentemente de um modo anti-paralelo ao longo dos seus locais de ligação efectores que se ligam especificamente ao antigénio CD3 humano. Deve notar-se que neste modelo de formação de dímeros, os locais de ligação ao antigénio que se ligam especificamente ao antigénio alvo (cada um designado "anti-alvo") estão livres para se ligarem a dois antigénios alvo separados (um antigénio alvo é especificamente ligado por cada local de ligação anti-alvo). Em contraste, o local de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao antigénio CD3 humano (designado "anti-CD3") presente numa cadeia polipeptídica simples é não covalentemente associado ao local de ligação "anti-CD3" presente na outra cadeia polipeptídica simples, para que nenhum destes dois locais de ligação ao antigénio se possa ligar especificamente ao antigénio CD3 humano. Como tal, o polipéptido na forma dimérica representado na Fig. 1C seria capaz de se ligar simultaneamente e especificamente a dois antigénios alvo individuais, mas seria menos capaz de se ligar a um antigénio CD3 humano.

Exemplo 2a: Activação de células T pelo polipéptido na forma multimérica (aqui, dimérica) na ausência de células alvo Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram preparadas a partir de sangue de um dador saudável através de centrifugação em densidade de Ficoll. Para investigar se o polipéptido da composição do presente invento na forma multimérica (aqui, dimérica) é capaz de activar células T na ausência de células alvo, as PBMC foram incubadas com um polipéptido compreendendo dois locais de ligação ao antigénio. Um local de ligação ao antigénio (o local de ligação efector) do polipéptido ligou-se especificamente ao antigénio CD3 humano, e o outro local de ligação ao antigénio (o local de ligação ao antigénio alvo) do polipéptido ligou-se especificamente ao antigénio EpCAM humano. Este polipéptido 29 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ particular foi escolhido para estudo porque a interacção com células alvo podia ser excluída devido à ausência de células positivas para EpCAM na população de PBMC; quaisquer efeitos observados na utilização do polipéptido de cima com PBMC seriam atribuíveis unicamente ao local de ligação que se liga especificamente ao antigénio CD3 humano.

Para comparar o efeito do polipéptido na forma monomérica com o efeito do polipéptido na forma dimérica, o polipéptido foi previamente resolvido em fracções contendo exclusivamente polipéptido monomérico (tal como por exemplo modelado na Fig. IA) ou exclusivamente polipéptido dimérico (tal como por exemplo modelado nas Fig. 1B e 1C). A resolução do polipéptido nestas fracções foi realizada tal como descrito acima no Exemplo 1.

Em placas de microtitulação de poços redondos, 2xl05 PBMC/poço foram incubadas num volume de 200 μΐ com fracções de monómero puro ou dímero puro do polipéptido nas concentrações indicadas na Fig. 2. Utilizando citometria de fluxo, os níveis de expressão de CD69 foram analisados em cada amostra após um período de incubação de 24 horas. CD69 é um marcador à superfície de células T, cuja supra-regulação pode servir como indicador inicial da activação de células T. Através da monitorização dos níveis de expressão de CD69 nas várias amostras, é possível obter uma medida inicial do grau ao qual a activação de células T ocorreu. As células T foram identificadas com um anticorpo específico anti-CD3. As amostras foram analisadas em duplicado. Tal como pode ser observado na Fig. 2, a incubação com o polipéptido na forma dimérica resultou em mais de 20% das células T a serem activadas a uma concentração de polipéptido de 1 pg/ml. A menor concentração de polipéptido na forma dimérica que desencadeia uma expansão de células T positivas para CD69 foi de 10 ng/ml. Em contraste, o polipéptido na forma monomérica induziu expressão de CD69 em apenas cerca de 3% das células T na concentração mais elevada testada (1 pg/ml de polipéptido na forma monomérica). O grau mínimo de activação observado em resposta ao polipéptido na forma monomérica a uma concentração de 1 pg/ml poderá ser resultado do polipéptido residual na forma dimérica ainda presente na preparação de polipéptido na forma monomérica. Estes dados demonstram que o polipéptido na 30 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ forma dimérica é capaz de activar células T na ausência de células alvo enquanto o monómero não. Esta capacidade representa uma actividade diferente da morte de células alvo que é atribuível ao polipéptido na forma dimérica mas não ao polipéptido na forma monomérica.

Exemplo 2b: Lise mútua de células T através do polipéptido na forma multimérica (aqui, dimérica)

Para analisar se o polipéptido na forma multimérica (aqui, dimérica) é capaz de matar células T foram efectuados dois conjuntos de experiências nas quais as células efectoras foram co-incubadas com a linha de células T HPBALL (DSMZ N.° ACC 483; DMSZ = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) na presença de polipéptido. No primeiro conjunto de experiências, foram utilizadas PBMC como células efectoras, enquanto as células efectoras utilizadas no segundo conjunto de experiências foram células MC15 (Biesinger B., Muller-Fleckenstein I., Stimmer B., Lang G., Wittmann S., Plater E., Desrosiers R.C. e Fleckenstein B., 2002, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 89: 3116-3119). O polipéptido utilizado para esta experiência compreendeu dois locais de ligação ao antigénio. Um local de ligação ao antigénio (o local de ligação efector) especificamente ligado ao antigénio CD3 humano, e o outro local de ligação ao antigénio especificamente ligado ao antigénio CD19 humano, um marcador de pan-células B aqui descrito acima. As células HPBALL foram descritas como sendo positivas para CD3. As células sanguíneas foram lavadas de filtros de leucócitos. As PBMC foram preparadas através de centrifugação de densidade de Ficoll. As células MC15 foram cultivadas tal como descrito na referência da literatura acima neste parágrafo. Para distinguir as células efectoras das células alvo, as células HPBALL foram coradas com o corante fluorescente Calceína AM de acordo com o protocolo do fabricante.

Para comparar o efeito do polipéptido na forma monomérica com o efeito do polipéptido na forma dimérica, o polipéptido foi previamente resolvido em fraeções contendo polipéptido exclusivamente monomérico (tal como por exemplo modelado na Fig. IA) ou polipéptido exclusivamente dimérico (tal como por exemplo modelado nas Fig. 1B e 1C). A resolução do polipéptido 31 ΕΡ 1 691 833/PT nestas fracções foi realizada tal como descrito acima no Exemplo 1.

Em placas de microtitulação de fundo redondo, 5χ105 células efectoras foram incubadas com 5xl04 células HPBALL durante 4 horas na presença de fracções de monómero altamente puro ou de dímero altamente puro do polipéptido de cima nas concentrações indicadas na Fig. 3A (para células efectoras PBMC) e Fig. 3B (para células efectoras MC15). Controlos apropriados contendo células HPBALL e células efectoras foram incubados na ausência de polipéptido. Após o período de incubação os sobrenadantes foram colhidos. A quantidade de corante fluorescente libertado pelas células mortas foi medida utilizando um espectrofluorímetro. Tal como se pode observar em cada uma de Fig. 3A e Fig. 3B, o polipéptido na forma dimérica induziu lise de células HPBALL em concentrações superiores a 10 ng/ml. Em contraste, não se observou lise de células alvo através do polipéptido na forma monomérica sob condições idênticas. Esta descoberta demonstra que a lise de células positivas para CD3 ocorreu e é atribuível ao polipéptido na forma dimérica mas não ao polipéptido na forma monomérica.

Exemplo 3: Propensão geral dos polipéptidos para formar dimeros

Foi desejado mostrar que a propensão para formar uma espécie multimérica é comum à classe geral de anticorpos de cadeia simples biespecíficos nos quais uma especificidade de ligação é para o antigénio CD3 humano. Para este fim, vários desses anticorpos biespecíficos foram produzidos em células de ovário de hamster chinês (CHO) de acordo com procedimentos geralmente conhecidos (Sambrook et al., 1989). Cada anticorpo de cadeia simples biespecífico produzido continha dois locais de ligação ao antigénio, cada local de ligação ao antigénio continha uma região de anticorpo VH e uma VL. Um dos dois locais de ligação ao antigénio em cada molécula era específico para o antigénio CD3 humano. O outro local de ligação ao antigénio ("local de ligação ao antigénio alvo") era específico para um antigénio alvo desejado diferente do antigénio CD3 humano. As proporções de polipéptido na forma monomérica e multimérica (aqui, dimérica) foram determinadas 32

ΕΡ 1 691 833/PT através de uma combinação de SDS-PAGE efectuada sob condições redutoras, Western Blot efectuado utilizando Penta-His (Qiagen) e anticorpos de Cabra anti-AP de ratinho (Sigma) e filtração em gel numa coluna Sephadex S200. As proporções relativas de polipéptido de cadeia simples biespecífico presente na forma dimérica são mostradas abaixo na Tabela 1 para polipéptidos compreendendo especificidades do antigénio alvo contra o antigénio CD19 humano, o antigénio EpCAM humano, o antigénio Wuel humano (um antigénio de mieloma múltiplo altamente específico) e o antigénio sTn humano (um hidrato de carbono apresentado no epitélio de células malignas na mama, cancro da próstata e do cólon).

Tabela 1

Especificidade do antigénio alvo % Aproximada de cadeias polipeptídicas simples presentes como monómero % Aproximada de cadeias polipeptídicas simples presentes como dímero CD19 (“Construção 1" de cima) <«65-70 % «30-35 % EpCAM «75% «25% Wuel «85-90% «10-155% sTn «75-80 % «20-25 %

Tal como pode ser claramente observado na Tabela 1, cada anticorpo de cadeia simples biespecífico com especificidade de ligação anti-antigénio CD3 humano forma espontaneamente quantidades significativas de espécies multiméricas (i.e., aqui, diméricas) quando deixado sem controlo. A propensão para formar espontaneamente homodímeros parece por essa razão ser uma característica genérica da classe à qual os anticorpos de cadeia simples biespecíficos aqui examinados pertencem. 33 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Micromet AG <120> Composições compreendendo polipéptidos

<130> MIC-017 PCT <150> EP 03 027 511.9 <151> 2003-11-28 <16 0 > 6 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 504 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> Construção 1: VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3) <400> 1 Αερ Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val ser Leu Gly 1 5 10 15 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Ile Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 SO Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr Hls Cys Gin Glr. Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gin Val 115 120 125 Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly ser Ser Val 130 135 140 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160 Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gin 1S5 170 175 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly 180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Αερ Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin 195 200 205 34 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu 210 215

Arg Glu Thr Thr Thr Vai Gly 225 230

Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr 245

Ile Lys Leu Gin Gin Ser Gly 260

Vai Lys Met Ser Cys Lys Thr 275

Met His Trp Vai Lys Gin Arg 290 295

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly 305 310

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr 325

Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser 340

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr 355

Thr Leu Thr Vai Ser Ser Vai 370 375

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Vai 385 390

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro 405

Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr 420

Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile 435

Vai Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 450 455

Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala 465 470

Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu 485

Ala Vai Tyr 220 Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr 235 Ala Met Asp Tyr Trp 240 Ser Gly 250 Gly Gly Gly Ser Asp 255 Leu Ala Arg Pro Gly 270 Ala Ser Tyr Thr Phe Thr Arg 285 Tyr Thr Gin Gly Leu 300 Glu Trp Ile Gly Asn Tyr 315 Asn Gin Lys Phe Lys 320 Ser 330 ser Ser Thr Ala Tyr 335 Met Ser Ala Vai Tyr Tyr 350 Cys Ala Asp Tyr Trp Gly Gin 365 Gly Thr Gly Ser Gly Gly 380 Ser Gly Gly Ile Gin 395 Leu Thr Gin Ser Pro 400 Lys 410 Vai Thr Met Thr Cys 415 Arg Trp Tyr Gin Gin Lys 430 Ser Gly Thr Ser Lys Vai 445 Ala Ser Gly Ser Gly Thr 460 Ser Tyr Ser Leu Ala Ala 475 Thr Tyr Tyr Cys Gin 480 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 490 495

Leu Lys His His His His His 500 <210> 2 <211> 505 <212> PRT <213> sequência artifi <220> <223> Construção 2: VH -VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3) 35

ΕΡ 1 691 833/PT <400> 2

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gin Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Vai Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 · Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Leu Thr 130 135 140 Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr Ile 145 150 155 160 Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu 165 170 ' 175 Asn Trp Tyr Gin Gin Ile Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 180 185 190 Asp Ala Ser Asn Leu Vai Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Vai Glu Lys Vai 210 215 220 Αβρ Ala Ala Thr Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr Glu Asp pro Trp Thr 225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255

Asp Ile Lys Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 260 265 270

Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 275 280 285

Thr Met His Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 290 295 300

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Aan Gin Lys Phe 36 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ

305 310 315 320 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 325 330 335 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 340 345 350 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 355 360 365 Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Vai Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Vai Asp Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser 385 390 395 400 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys 405 410 415 Arg Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser 420 425 430 Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Vai Ala Ser 435 440 445 Gly Vai Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser- 450 455 460 Leu Thr Ile Ser Ser Met GlU Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 465 470 475 480 Gin Gin Trp Ser Ser Asm Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 485 490 495 Glu Leu Lys His His His His His HiS 500 505

<210> 3 <211> 504 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> Construção 6: VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19) <400> 3

Asp 1 Ile Lys Leu Gin 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Leu Ala Arg Pro Gly 15 Ala ser Vai Lys Met 20 Ser Cys Lys Thr Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Arg Tyr Thr Met His 35 Trp Val Lys Glri Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Tyr 50 Ile Asn Pro Ser Arg 55 Gly Tyr Thr Asn Tyr 60 Asn Gin Lys Phe Lys 65 Asp Lys Ala Thr Leu 70 Thr Thr Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80 37

ΕΡ 1 691 833/PT

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 SO 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile 130 135 140 ríe£ Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

145 150 155 ISO

Ser Ser Vai Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser 165 170 175

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Vai Ala Ser Gly Vai Pro 180 185 190

Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 195 200 205

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 210 215 22G

Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu 245 250 255

Leu Vai Arg Pro Gly Ser Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 260 265 270

Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly 275 280 285

Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gin Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr 290 295 300

Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu 305 310 315 320

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp 325 330 335

Ser Ala Vai Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Vai Gly Arg 340 345 350 ' h.1 tr m m tr 'TVn v «TV.»* ·υ·οΊ φΚν irai w-ujr va-ujr J. U.+. v «a-*-*·*- νβ-α. 365 'Pw*- T-*r-r- Txr*- sl a Maf Scn ·ΤΚμ>- •P-»-»-» */*· *.?*- *j - “ 2“ 355 360

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380

Ser Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu 385 390 395 400

Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr 405 410 415

Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Ile Pro Gly Gin Pro 38 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ 420 425 430 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro 435 440 445 Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile 450 455 460 Hls Pro Vai Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gin Gin Ser 4S5 470 475 480 Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 485 490 495 Ser Gly His Hls His His Hls His 500

<210> 4 <211> 503 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> Construção 8: VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19) <400> 4

Asp Ile Lys Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Θ5 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile 130 135 140 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160 Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Qln Lys Ser Gly Thr Ser 165 170 175 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro 180 185 190 39

ΕΡ 1 691 833/PT

Tyr Arg Phe 195 Ser Gly Ser Gly Ser 200 Ser Ser 210 Met Glu Ala Glu Asp Ala 215 Ser Ser 225 Asn Pro Leu Thr Phe Gly 230 Ser Gly Gly Gly Gly 245 Ser Asp Ile Leu Ala Val Ser 260 Leu Gly Gin Arg Gin Ser Val 275 Asp Tyr Asp Gly Asp 280 Ile Pro 290 Gly Gin Pro Pro Lys Leu 295 val Ser 305 Gly Ile Pro Pro Arg Phe 310 Phe Thr Leu Asn Ile 325 His Pro Val His Cys Gin Gin 340 Ser Thr Glu Asp Lys Leu Glu 355 lie Lys Gly Gly Gly 360 Gly Gly 370 Gly Ser Gin Val Gin Leu 375 Arg Pro 385 Gly Ser Ser Val Lys Ile 390 Phe Ser Ser Tyr Trp 405 Met Asn Trp Leu Glu Trp lie 420 Gly Gin Ile Trp Asn Gly Lys 435 Phe Lys Gly Lys Ala 440 Ser Thr 450 Ala Tyr Met Gin Leu Ser 455 Val Tyr 465 Phe Cys Ala Arg Arg Glu 470 Tyr Ala Met Asp Tyr 485 Trp Gly Gin Gly His His His 500 His His His

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 205

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 220

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 235 240

Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser 250 255

Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser 265 270

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin 28.5

Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu 300 ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp 315 320

Glu Lys Vai Asp Ala Ala Thr Tyr 330 335

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr 345 350

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 365

Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai 380

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala 395 400

Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly 410 415

Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr 425 430

Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser 445

Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala 460

Thr Thr Thr Vai Gly Arg Tyr Tyr 475 480

Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 490 495

<210> 5 <211> 504 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> Construção 5: VL(CD3)-VH(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19) 40

40 ΕΡ 1 691 833/PT <400> 5

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Vai Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Vai Ser Tyr Met 20 25 30

Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Lys Vai Ala Ser Gly Vai Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 B0

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gin Gin Ser 115 120 125

Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys 130 135 140

Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Vai Lys Gin 145 150 155 160

Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg 165 170 175

Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr 180 185 190

Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr 195 200 205

Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His 210 215 220

Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser 225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu 245 250 255

Leu Vai Arg Pro Gly Ser Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 260 265 270

Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin' Arg Pro Gly 275 280 285

Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gin Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr 290 295 300 41 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ Αεη 305 Tyr Asn Gly Lys Phe 310 Lys Gly Lys Ala Thr 315 Leu Thr Ala Asp Glu 320 Ser Ser Ser Thr Ala 325 Tyr Met Gin Leu Ser Ser 330 Leu Ala Ser Glu 335 Asp Ser Ala Vai Tyr Phe 340 Cys Ala Arg Arg Glu Thr 345 Thr Thr Vai 35 0 Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met 355 Asp Tyr Trp 360 Gly Gin Gly Thr Thr 365 Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly 370 Ser Gly 375 Gly Gly Gly Ser 3B0 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Leu 385 Thr 390 Gin Ser Pro Ala ser 395 Leu Ala Vai Ser Leu 400 Gly Gin Arg Ala Thr 405 Ile ser Cys Lys Ala Ser 410 Gin Ser Vai Asp 415 Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr 420 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin 425 Ile Pro Gly Gin 430 Pro Pro Lys Leu Leu Ile 435 Tyr Asp Ala 440 Ser Asn Leu Vai Ser 445 Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly 450 Ser Gly Ser 455 Gly Thr Asp Phe 460 Thr Leu Asn Ile Hls 465 Pro Vai Glu Lys Vai 470 Asp Ala Ala Thr Tyr His 475 Cys Gin Gin Ser 480 Thr Glu Asp Pro Trp 485 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 490 Lys Leu Glu Ile 495 Lys

Ser Gly Hls His His Hls His His 500

<210> 6 <211> 503 <212> PRT <213> sequência artificial <220> <223> Construção 7: VL(CD3)-VH(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19) <400> 6

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 42 ΕΡ 1 691 833/ΡΤ

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 85

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 100

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115

Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro . 130 135

Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 145 150

Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu 165

Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin 180

Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr 195

Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr 210 215

Tyr cys Leu Asp Tyr Trp Gly 225 230

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 245

Leu Ala vai Ser Leu Gly Gin 260

Gin Ser vai Asp Tyr Asp Gly 275

Ile Pro Gly Gin Pro Pro Lys 290 295

Vai Ser Gly Ile Pro Pro Arg 305 310

Phe Thr Leu Asn Ile Hls Pro 325

His Cys Gin Gin ser Thr Glu 340

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly 355

Gly Gly Gly Ser Gin Vai Gin 370 375

Arg Pro Gly Ser Ser Vai Lys 385 390

Phe ser ser Tyr Trp Met Asn 405

Gin Trp 90 Ser Ser Asn Pro Leu 95 Thr Leu 105 Lys Gly Gly Gly Gly 110 Ser Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gin. 125 Gin Ser Ala Ser Vai Lys 140 Met Ser Cys Lys Tyr Thr Met 155 Hls Trp Val Lys Gin 160 Xle Gly Tyr 170 Xle Asn Pro Ser Arg 175 Phe 185 Lys Asp Lys Ala Thr 190 Leu Thr Tyr Met Gin Leu Ser Ser 205 Leu Thr Cys Ala Arg Tyr 220 Tyr Asp Asp His Gly Thr Thr 235 Leu Thr Val Ser Ser 240 Gin Leu 250 Thr Gin ser Pro Ala 255 Ser Ala 265 Thr Ile Ser Cys Lys 270 Ala Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 285 Gin Gin Leu Ile Tyr Asp 300 Ala Ser Asn Leu Ser Gly Ser Gly 315 Ser Gly Thr Asp 320 Glu Lys 330 val Asp Ala Ala Thr 335 Tyr Pro 345 Trp Thr Phe Gly Gly 350 Gly Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly 365 Ser Gly Gin Gin Ser Gly 380 Ala Glu Leu Val Ser Cys Lys 3 95 Ala Ser Gly Tyr Ala 400 Vai Lys 410 Gin Arg Pro Gly Gin Gly 415 43

ΕΡ 1 691 833/PT

Leu Glu Trp Ile 420 Gly Gin Ile Trp Pro 425 Gly Asp Gly Asp Thr 430 Asn Tyr Asn Gly Lya 435 Phe Lys Gly Lys Ala 440 Thr Leu Thr Ala Asp 445 Glu Ser Ser Ser Thr 450 Ala Tyr Met Gin Leu 455 Ser Ser Leu Ala Ser 4S 0 Glu Asp ser Ala Vai 465 Tyr Phe cys Ala Arg 470 Arg Glu Thr Thr Thr 475 Vai Gly Arg Tyr Tyr 480 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 435 Gly Gin Gly Thr 490 Thr Vai Thr Vai Ser 495 Ser Gly Hls Hls His 500 Hls Hls Hls

Lisboa, 2010-06-01

Claims

ΕΡ 1 691 833/PT 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo um polipéptido compreendendo pelo menos dois locais de ligação ao antigénio, em que os referidos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio estão localizados numa cadeia polipeptidica simples, e em que: - um dos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio referidos se liga especificamente ao antigénio CD3 humano; - o referido polipéptido pode existir tanto na forma monomérica como multimérica, sendo a referida forma monomérica a referida cadeia polipeptidica simples e a referida forma multimérica compreendendo pelo menos duas das referidas cadeias polipeptidicas simples associadas não covalentemente uma à outra; e - a referida forma multimérica do referido polipéptido constitui não mais de 5% do peso total das formas monomérica e multimérica combinadas do referido polipéptido.
2. Composição da reivindicação 1, em que pelo menos um dos dois locais de ligação ao antigénio compreende uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo (VH) e uma região variável da cadeia leve de um anticorpo (VL).
3. Composição da reivindicação 1 ou 2, em que o outro local de ligação ao antigénio dos referidos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio se liga especificamente ao antigénio CD19 humano ou ao antigénio EpCAM humano.
4. Composição da reivindicação 3, em que o outro local de ligação ao antigénio dos referidos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio se liga especificamente ao antigénio CD19 humano e em que o referido polipéptido tem uma sequência tal como representada em qualquer uma de SEQ ID NO: 1-6 ou uma sequência que é pelo menos 70% homóloga a qualquer uma de SEQ ID NO: 1-6.
5. Método de produção de uma composição de qualquer uma das reivindicações 1-4 em que a quantidade de um polipéptido na forma monomérica foi enriquecida relativamente à quantidade do referido polipéptido na forma multimérica, em que: ΕΡ 1 691 833/ΡΤ 2/6 - ο referido polipéptido compreende pelo menos dois locais de ligação ao antigénio numa cadeia polipeptidica simples, e um dos pelo menos dois locais de ligação ao antigénio referidos se liga especificamente ao antigénio CD3 humano; - o referido polipéptido na forma monomérica é a referida cadeia polipeptidica simples; e - o referido polipéptido na forma multimérica compreende pelo menos duas das referidas cadeias polipeptídicas simples associadas não covalentemente uma à outra; compreendendo o referido método os seguintes passos: a) proporcionar a composição compreendendo o referido polipéptido em ambas as formas, multimérica e monomérica; b) isolar o referido polipéptido em ambas as formas, multimérica e monomérica, a partir da referida composição, sendo o referido isolamento realizado através de: (bl) aplicação da referida composição a um primeiro material cromatográfico compreendendo um ião metálico; que é o ião Zn2+ ou Ni2+; (b2) remoção de quaisquer componentes da referida composição que não se tenham ligado ao referido primeiro material cromatográfico através de lavagem do referido primeiro material cromatográfico com um primeiro tampão; e (b3) eluição do referido polipéptido em ambas as formas, multimérica e monomérica, a partir do referido primeiro material cromatográfico, através da aplicação de imidazole ao referido primeiro material cromatográfico numa concentração variando de 60 mM a 300 mM; (b4) recolha de um primeiro eluato compreendendo o referido polipéptido na forma multimérica e o referido polipéptido na forma monomérica; c) realizar um passo precursor que é preparatório para que a separação do referido polipéptido na forma multimérica do referido polipéptido na forma monomérica ocorra no passo (d) , sendo o referido passo precursor realizado através de: ΕΡ 1 691 833/PT 3/6 (cl) aplicação do referido primeiro eluato a um segundo material cromatográfico, que é um material de permuta iónica; (c2) remoção de quaisquer componentes do primeiro eluato que não se tenham ligado ao referido segundo material cromatográfico através de lavagem do referido segundo material cromatográfico com um segundo tampão; (c3) eluição do referido polipéptido na forma multimérica e monomérica do referido segundo material cromatográfico através da aplicação de cloreto de sódio ao referido segundo material cromatográfico numa concentração variando de 200 mM a 500 mM; (c4) recolha de um segundo eluato; d) realizar uma separação do referido polipéptido na forma multimérica do referido polipéptido na forma monomérica, sendo a referida separação realizada através de: (dl) aplicação do referido segundo eluato a um terceiro material cromatográfico permitindo a separação com base no peso molecular; (d2) translocação dos componentes do segundo eluato aplicado ao longo do referido terceiro material cromatográfico através da aplicação de um tampão eluente ao referido terceiro material cromatográfico; (d3) recolha de um terceiro eluato em fracções; e) analisar as referidas fracções do referido terceiro eluato individualmente para obter uma medida da quantidade do referido polipéptido na forma monomérica relativamente à quantidade de polipéptido na forma multimérica em cada fracção; e f) combinar as fracções do referido terceiro eluato que (quase) exclusivamente contém o polipéptido na forma monomérica para obter uma composição enriquecida no polipéptido na forma monomérica.
6. Método da reivindicação 5, em que os passos (b2) e/ou (c2) é/são efectuados por meio de cromatográf ia numa coluna ou por meio de um processo em descontínuo, em que é preferido que os passos (b2) e (c2) sejam efectuados numa coluna. ΕΡ 1 691 833/PT 4/6
7. Método da reivindicação 5 ou 6, em que o referido segundo material cromatográfico permite separação com base em permuta aniónica.
8. Método de qualquer uma das reivindicações 5-7, em que a referida lavagem dos passos b2 e c2 é efectuada utilizando um volume do primeiro e/ou segundo tampão que é 6 a 10 vezes maior do que o volume do primeiro e/ou do segundo material cromatográfico, respectivamente.
9. Método de qualquer uma das reivindicações 5-8, em que a referida translocação do passo d2 é realizada através da aplicação de um volume do referido tampão eluente equivalente a 3 a 7 vezes o volume do terceiro material cromatográfico.
10. Método de qualquer uma das reivindicações 5-9, em que o referido primeiro e segundo tampão são cada um tampão fosfato de pH 8.
11. Método de qualquer uma das reivindicações 5-10, em que o referido tampão eluente no passo d2 é seleccionado de entre tampão fosfato de pH 7,0-7,5 e tampão citrato/lisina de pH 6,0-7,5.
12. Método de qualquer uma das reivindicações 5-11, compreendendo ainda o passo ou passos de análise da composição enriquecida no polipéptido na forma monomérica obtida no passo f para obter uma medida da quantidade do referido polipéptido na forma monomérica relativamente à quantidade de polipéptido na forma multimérica na referida composição e, opcionalmente, compreendendo ainda o passo de enriquecimento do teor de polipéptido na forma monomérica relativamente ao teor de polipéptido na forma multimérica através de repetição dos passos d a f com a referida composição enriquecida no polipéptido na forma monomérica.
13. Método de qualquer uma das reivindicações 5-12, em que a referida análise é efectuada utilizando um método cromatográf ico que separa substâncias com base no seu peso molecular. ΕΡ 1 691 833/PT 5/6
14. Método da reivindicação 13, em que o referido método cromatográfico é cromatografia de exclusão por tamanhos, em particular cromatografia de exclusão por tamanhos de elevada resolução.
15. Método de qualquer uma das reivindicações 5-14, em que: - o referido imidazole é aplicado na forma de um gradiente de concentração ou numa única concentração e/ou - o referido cloreto de sódio é aplicado na forma de um gradiente de concentração ou numa única concentração.
16. Método da reivindicação 15, em que: - o referido imidazole é aplicado numa única concentração escolhida de entre as seguintes concentrações: 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM e 120 mM; e - o referido cloreto de sódio é aplicado numa única concentração escolhida de entre as seguintes concentrações: 370 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM e 420 mM.
17. Método da reivindicação 16, em que o referido imidazole é aplicado numa concentração de 80 mM e/ou o referido cloreto de sódio é aplicado numa concentração de 400 mM.
18. Composição obtenível através do método de qualquer uma das reivindicações 5-17.
19. Utilização da composição de qualquer uma das reivindicações 1-4 ou da reivindicação 18 para produção de um medicamento para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de uma doença proliferativa, de um cancro residual mínimo, de uma doença tumoral, de uma doença inflamatória, de um distúrbio imunológico, de uma doença auto-imune, de uma doença infecciosa, de uma doença virai, de uma reacção alérgica, de uma reacção parasitária, de uma doença enxerto-versus-hospedeiro, de uma doença hospedeiro-versus-enxerto ou de uma malignidade de células B. ΕΡ 1 691 833/PT 6/6
20. Utilização da reivindicação 19, em que a prevenção, o tratamento ou a melhoria da doença ou do distúrbio ocorrem num ser humano.
21. Utilização da reivindicação 19 ou 20, em que a referida doença tumoral é seleccionada de entre o grupo que consiste num linfoma, uma leucemia de células B ou um linfoma de Hodgkin.
22. Utilização da reivindicação 19 ou 20, em que a referida malignidade de células B é um linfoma não hodgkiniano.
23 . Utilização da reivindicação 19 ou 20, em que a referida doença auto- -imune é seleccionada de entre artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes mellitus tipo 1, doença inflamatória do intestino, lúpus sistémico eritematoso, psoríase, esclerodermia e doenças auto-imunes da tiróide. Lisboa, 2010-06-01