PT1481075E - Bactérias produtoras de aminoácidos e um processo para preparar l-aminoácidos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"BACTÉRIAS PRODUTORAS DE AMINOÁCIDOS E UM PROCESSO PARA PREPARAR L-AMINOÁCIDOS" Âmbito da invenção A invenção relaciona-se com bactérias produtoras de L-treonina da espécie Escherichia coli, as quais contêm um codão de terminação do tipo âmbar na sequência de nucleótidos da região de codificação do gene rpoS e o correspondente supressor do codão de terminação, supressor de âmbar supE. Esta invenção relaciona-se também com um processo para preparar L-treonina, usando estas bactérias.

Antecedentes da Técnica

Os L-aminoácidos, em particular a L-treonina, são usados em medicina humana e na indústria farmacêutica, na indústria alimentar e muito particularmente em alimentos para animais.

Sabe-se que os L-aminoácidos são preparados por fermentação de estirpes de Enterobacteriaceae, em particular de Escherichia coli (E. coli) e Serratia marcescens. Melhorias nos métodos de preparação estão sempre a ser procuradas devido à grande importância deste processo. As melhorias do processo podem relacionar-se com medidas tecnológicas de fermentação tais como por exemplo agitação e fornecimento de oxigénio, ou com a composição dos meios nutritivos tais como por exemplo a concentração de açúcar durante a fermentação, ou com a obtenção da forma de produto através por exemplo de cromatografia de troca iónica, ou das caracteristicas de realização intrínsecas do próprio microrganismo. 2

Para melhorar as características de realização destes microrganismos, são usados os métodos de mutagénese, seleção e seleção de mutante. Deste modo são obtidas estirpes que são resistentes a antimetabolitos tais como por exemplo o análogo da treonina ácido a-amino-β-hidroxivalérico (AHV) ou que são autotróficas para importantes metabolitos reguladores e produzem L-aminoácidos tais como por exemplo a L-treonina.

Os métodos de engenharia de DNA recombinante foram também usados durante vários anos para o melhoramento das estirpes produtoras de L-aminoácidos da família Enterobacteriaceae, por amplificação individual dos genes de biossíntese de aminoácidos e testagem dos efeitos na produção. 0 gene rpoS, o qual é conhecido sob o nome de gene katF, codifica uma proteína que é chamada de fator o38 ou fator os, a proteína o38 ou a subunidade σ38 ou também a proteína RpoS. Os seguintes nomes para o gene rpoS são também encontrados na literatura, embora menos comummente: abrD, dpeB, appR, sigS, otsX e snrA. 0 fator os, como uma subunidade de RNA-polimerase, controla a expressão de uma larga variedade de diferentes grupos de genes (Loewen et al.; Canadian Journal of Microbiology 44 (8): 707-717 (1998)), onde os mecanismos de regulação são muitas vezes pouco claros.

Os dados na sequência de nucleótidos do gene rpoS ou katF podem ser encontrados em Mulvey e Loewen (Nucleic Acids Research 17 (23): 9979-9991 (1989)) e em Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)). Os dados correspondentes podem também ser encontrados no National Center for Biotechnology Information (NCBI) da National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) sob os números de registo 3 Χ16400 e AE000358. 0 inicio da traslação ou o codão de iniciação do gene rpoS foram determinados por Loewen et al. (Journal of Bacteriology 175 (7): 2150-2153 (1993)).

Para além disso, vários alelos rpoS são conhecidos em estirpes de Escherichia coli, por exemplo em estirpes do tipo em W3110 (Ivanova et al. / Nucleic Acids Research 20 (20) : 5479-5480 (1992) e Jishage e Ishihama; Journal of Bacteriology 179 (3): 959-963 (1997)).

Na WO 01/05939 é mostrado gue, após desligar completamente o fator σ38 por incorporação de uma deleção no gene rpoS de um produtor de ácido L-glutâmico, a produção de ácido glutâmico é melhorada.

Nagano et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 64 (9): 2012-2017 (2000)) referem uma estirpe W3110 de Escherichia coli e os mutantes W196 produtores de L-lisina os quais contêm ambas um alelo rpoS o qual contém um codão de terminação âmbar (TAG) no ponto correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína σ38. A estirpe W19 6 também contém uma mutação no gene serU gene que codifica L-serina tRNA que é chamado supD.

Descrição da invenção

Sempre que os aminoácidos ou L-aminoácidos forem mencionados a seguir, isto é entendido para cobrir todos os aminoácidos proteinogénicos com exceção da L-lisina. Isto significa, em particular, L-treonina, L-isoleucina, L-homoserina, L- metionina, ácido L-glutâmico, L-valina e L-triptofano, em que a L-treonina é preferida. "Aminoácidos proteinogénicos" são entendidos para serem aqueles aminoácidos que são constituintes de proteínas. 4

Estes incluem os aminoácidos L-glicina, L-alanina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina, L-serina, L-treonina, L-cisteína, L-metionina, L-prolina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano, L-asparagina, L-glutamina, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, L-arginina, L-lisina, L-histidina e L-selenocisteina. A invenção fornece bactérias produtoras de L-treonina da espécie Escherichia coli as quais são resistentes ao ácido a-amino-p-hidroxivalérico (=AHV) e que 1) contêm um codão de terminação do tipo âmbar na sequência de nucleótidos da região de codificação do gene rpoS e 2) contêm o supressor correspondente para o codão de terminação supressor de âmbar supE em que o codão de terminação do tipo âmbar se encontra dentro da região de codificação do gene rpoS correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS, de acordo com a SEQ ID No. 2.

As bactérias fornecidas pela presente invenção podem produzir L-treonina a partir de glucose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, opcionalmente amido, opcionalmente celulose ou a partir de glicerina e etanol. São representativas da família Enterobacteriaceae, escolhidas a partir das espécies Escherichia coli.

As bactérias produtoras de treonina fornecidas pela presente invenção podem, entre outras, produzir opcionalmente L-lisina como um produto secundário para além do desejado L-aminoácido. As bactérias de acordo com a invenção produzem no máximo 0 até 40% ou 0 até 20%, preferencialmente no máximo 0 até 10%, particularmente preferencialmente no máximo 0 até 5% de L-lisina em comparação com a quantidade de L- aminoácido desejado. Estes dados de percentagem correspondem a percentagem em peso. 5

As estirpes produtoras de L-treonina da família Enterobacteriaceae possuem preferencialmente, entre outras, uma ou mais das características genéticas ou fenotípicas selecionadas a partir do grupo: resistência ao ácido a-amino-p-hidroxivalérico, resistência a tialisina, resistência a etionina, resistência a a-metilserina, resistência a ácido diaminosuccínico, resistência a ácido α-aminobutírico, resistência a borrelidina, resistência a rifampicina, resistência a análogos da valina tais como, por exemplo, hidroxamato de valina, resistência a análogos de purina tais como, por exemplo, 6-dimetilaminopurina, uma necessidade de L-metionina, opcionalmente necessidade parcial e compensável de L-isoleucina, uma necessidade de ácido meso-diaminopimémico, auxotrofia em relação a dipéptidos contendo treonina, resistência a L-treonina, resistência a L-homoserina, resistência a L-lisina, resistência a L-metionina, resistência a ácido L-glutâmico, resistência a L-aspartato, resistência a L-leucina, resistência a L-fenilalanina, resistência a L-serina, resistência a L-cisteína, resistência a L-valina, sensibilidade ao fluoropiruvato, treonina desidrogenase defeituosa, opcionalmente uma capacidade para o uso de sacarose, melhoria do operão treonina, melhoria da homoserina desidrogenase I-aspartato quinase I preferencialmente a forma feed-back resistente, melhoria da homoserina quinase, melhoria da treonina sintase, melhoria da aspartato quinase, opcionalmente a forma feed-back resistente, melhoria de aspartato semialdeído dehidrogenase, melhoria de fosfoenolpiruvato carboxilase, opcionalmente a forma feed-back resistente, melhoria da fosfoenolpiruvato sintase, melhoria da transhidrogenase, melhoria do produto do gene RhtB, melhoria do produto do gene RhtC, melhoria do produto do gene YfiK, melhoria de 6 uma piruvato carboxilase, e atenuação da formação de ácido acético.

Um codão de terminação tipo âmbar é entendido para ser um codão de terminação com a sequência base TAG na cadeia de codificação numa molécula de DNA correspondente a UAG no mRNA lido por esta molécula de DNA.

Um codão de terminação do tipo ocre de acordo com a descrição é entendido para ser um codão de terminação com a sequência base TAA na cadeia de codificação numa molécula de DNA correspondente a UAA no mRNA lido por esta molécula de DNA.

Um codão de terminação do tipo opala de acordo com a descrição é entendido para ser um codão de terminação com a sequência base TGA numa cadeia de codificação numa molécula de DNA correspondente a UGA no mRNA lido por esta molécula de DNA.

Os codões de terminação mencionados são também chamados de mutações sem sentido (Edward A. Birge: Bacterial and Bacteriophage Genetics (Terceira Edição), Springer Verlag, Berlim, Alemanha, 1994). A sequência de nucleótidos para o gene rpoS pode ser obtida a partir da técnica anterior. A sequência de nucleótidos do gene rpoS correspondente ao No. de Registo AE000358 é dada como SEQ ID NO. 1. A sequência de aminoácidos do produto do gene RpoS relevante ou proteína é dada na SEQ ID NO. 2. A sequência de nucleótidos para um alelo rpoS que contém um codão de terminação tipo âmbar no ponto na sequência de nucleótidos correspondente à posição 33 na sequência de 7 aminoácidos do produto de gene rpoS ou proteína, correspondente às SEQ ID NO. 1 e SEQ ID NO. 2 respetivamente, é dada na SEQ ID NO. 3. A concentração do fator σ38 pode ser determinada através do método de "Western blot" quantitativo como descrito em Jishage e Ishima (Journal of Bacteriology 177 (23) : 6832-6835 (1995)), Jishage et al. (Journal of Bacteriology 178 (18) : 5447-5451 (1996)) e Jishage e Ishima (Journal of Bacteriology 179 (3): 959-963 (1997)). A supressão é geralmente entendida para ser o efeito em que os efeitos da mutação num "primeiro" gene são compensados ou suprimidos por uma mutação num "segundo" gene. 0 segundo gene mutado ou a segunda mutação é geralmente chamado de supressor ou gene supressor.

Um caso especial de supressores relaciona-se com alelos de genes tRNA que codificam as moléculas de tRNA anormais que podem reconhecer codões de terminação de modo a que a incorporação de um aminoácido ocorra em vez da terminação da cadeia durante a translação. Explanações extensivas de supressão podem ser encontrados em livros de texto genéticos tais como, por exemplo, o livro de texto de Rolf Knippers "Molekulare Genetik" (6a edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995) ou o livro de texto de Ernst-L. Winnacker "Gene und Klone, Eine Einfhrung in die Gentechnologie" (Dritter, reimpressão alterada, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou o livro de texto por F. C. Neidhard (Ed.) Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" (2a Edição, ASM Press, Washington, D. C. , USA, 1996). A supressão listada nas Tabelas 1, 2 e 3 são, entre outros, genes tRNA ou alelos ou tRNA supressores conhecidos da técnica anterior que podem suprimir codões de terminação tipo âmbar, ocre ou opala e são portanto chamados de supressores âmbar, supressores ocre ou supressores opala. Os nomes para os genes particulares ou alelos e supressores foram formados a partir de referências citadas.

Tabela 1

Lista de supressores de âmbar

Nome do supressor de gene/alelo Nome do tRNA Aminoácido incorporado Ref. supD (= Sul) Serina tRNA 2 Ser 1 supE (=Su2, supY) Glutamina tRNA2 Gin 1 supF Tirosina tRNA 1 Tyr 1 supP (= Su6) Leucina tRNA 5 Leu 1 supU (= su7) Triptofano tRNA Trp 1 supZ Tirosina tRNA 2 Tyr 1 t-RNAftspCUA Asp tRNA (CUA) Lys,Ala,Gin,Arg 2 tRNAPheCUA Fenilalanina tRNA Phe 3 tRNACysCUA Cisteína tRNA Cys 3 suIII+ âmbar Tirosina tRNA 1 Tyr 4 Su+271 Gln/Trp tRNA Gin 5 ARG Arginina tRNA Arg, Lys 6 ARGII Arginina tRNA Arg, Gin 6 LysA2 0 Lisina tRNA Lys 6 trpT175 Triptofano tRNA Gin 7 Su7 9 (= trpT17 9) Triptofano tRNA Trp 8 tRNACysCUA Cisteína tRNA Cys 9 t-RNAAsnCUA Asparagina tRNA Gin 10 Ala2 Alanina tRNA Ala 11 Cys Cisteína tRNA Lys 11 ProH Prolina tRNA Pro 11 HisA Histidina tRNA His 11 Gly2 Glicina tRNA Gly, Gin 11 Glyl Glicina tRNA Gly 11 Ilel Isoleucina tRNA Gin, Lys 11 Met (f) Metionina tRNA Lys 11 Ile2 Isoleucina tRNA Lys 11 AspM Asparagina tRNA Lys 11 Arg Arginina tRNA Lys, Arg 11 Thr2 Treonina tRNA Lys, Thr 11 Vai Valina tRNA Lys, Vai 11 GluA Ácido glutâmico tRNA Glu,Gin,Tyr,Arg 11 ECF Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF9 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF5-2 Fenilalanina tRNA Phe, Thr, Tyr 12 ECF10 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF602 Fenilalanina tRNA Phe,Lys,Thr,Vai 12 ECF606 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF11 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF12 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF6 Fenilalanina tRNA Phe, Thr 12 9 9 ECF401 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF402 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF403 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECF403G45 Fenilalanina tRNA Lys 12 ECF5 Fenilalanina tRNA Phe 12 ECFG73 Fenilalanina tRNA Phe, Gin 12

Referências (Ref.) para a Tabela 1: 1) Neidhard (Ed.)"Escherichia coli and Salmonella,

Cellular and Molecular Biology" (2a edição, ASM Press, Washington, D. C., USA, 1996) 2) Martin et al, RNA 2 (9): 919-927, 1996 3) Normanly et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 83 (17): 6548-6552, 1986 4) Número de registo K01197 5) Yarus et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 77 (9): 5092-5096, 1990 6) McClain et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 87 (23): 9260-9264,1990 7) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984 8) Raftery et al, Journal of Molecular Biology 190 (3):513-517, 1986 9) Komatsoulis und Abelson, Biochemistry 32 (29): 7435-7444, 1993 10) Martin et al, Nucleic Acids Research 23 (5): 779-784, 1995 11) Normanly et al, Journal of Molecular Biology 213 (4):719-726, 1990 12) McClain und Foss, Journal of Molecular Biology, 202 (4): 697-709, 1988

Tabela 2

Lista de supressores ocre de acordo com a descrição

Nome do gene/alelo supressor Nome do tRNA Aminoácido incorporado Ref. supB Glutamina tRNA 1 Gin 1 supC Tirosina tRNA 1 Tyr 1 supD Serina tRNA 3 Ser 1 supG(= supL, supN) Lisina tRNA Lys 1 supM (= supB15) Tirosina tRNA 2 Tyr 1 supU (= su8) Triptofano tRNA Trp 1 supV Triptofano tRNA Trp 1 tRNAt±u-Suoc2 05 Ácido glutâmico tRNA Glu 2 suIII+ ocre Tirosina tRNA 1 Tyr 3 trpT177 Triptofano tRNA Gin 4 Su7 9 (= trpT17 9) Triptofano tRNA Trp 5 Referências (Ref.) para a tabela 2: 1) Neidhard (Ed.)"Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" (2a edição, ASM Press, Washington, D. C. , USA, 1996) 2) Raftery und Yarus, EMBO Journal 6 (5): 1499-1506, 1987 3) Número de registo K01197 4) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984 5) Raftery et al, Journal of Molecular Biology 190 (3): 513-517, 1986 10

Tabela 3

Lista de supressores opala de acordo com a descrição

Nome do gene/alelo supressor Nome do tRNA Amino ácido incorporada Ref. supT Glicina tRNA 1 Gly 1 sumA Glicina tRNA 2 Gly 1 ims, mutA Glicina tRNA 3 Gly 1 supU (= su9) Triptofano tRNA Trp 1 selC Serina tRNA Selenocisteina 2 GLNA3U7 0 Glutamina tRNA Gin 3 trpT17 6 Triptofano tRNA Trp 4 ARG Arginina tRNA Arg 5 ARGII Arginina tRNA Arg 5 LysA20 Lisina tRNA Arg 5 Referências (Ref. 1) Neidhard (Ed. ) da Tabela 3: ) "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" (2a edição, ASM Press, Washington, D. C. , USA, 1996) 2) Schon et al, Nucleic Acids Research 17 (18 : 7159- 7165, 1989 3) Weygand-Durasevic et al, Journal of Molecular Biology 240 (2): 111-118, 1994 4) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984 5) McClain et al, Proceedings of the National Science USA, 87 (23): 9260-9264,1990 Academy of

Num primeiro aspeto da invenção, verificou-se que as bactérias produtoras de L-treonina da espécie Escherichia coli as quais são resistentes ao AHV e que contêm um codão de terminação tipo âmbar, são adicionalmente melhoradas no seu potencial para produzir aminoácidos quando um tRNA supressor do supressor âmbar, é aqui incorporado, em que o codão de terminação do tipo âmbar permanece dentro da região de codificação do gene rpoS correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS, de acordo com a SEQ ID No.2.

Como um resultado das medidas de acordo com a invenção, a atividade ou concentração da proteína RpoS ou fator σ38 é diminuída em geral para > 0 até 75%, por exemplo 1 até 75%, para > 0 até 50%, por exemplo 0,5 até 50%, para > 0 até 25% por exemplo 0,25 até 25%, para > 0 até 10%, por exemplo 0,1 até 10%, ou para > 0 até 5%, por exemplo 0,05 até 5% da atividade ou concentração da proteína do tipo selvagem, ou 11 da atividade ou concentração da proteína no microrganismo inicial. A presença do(s) supressore(s) mencionados impedem a atividade das proteínas RpoS ou fator σ38 caindo direta para baixo até 0.

Consequentemente, a invenção fornece um processo para diminuir a atividade intracelular ou a concentração das proteínas RpoS ou fator σ38 em bactérias produtoras de L-treonina da espécie Escherichia coli que são resistentes ao AHV e, em que nestas bactérias 1) um codão de terminação do tipo âmbar é incorporado na região de codificação do gene rpoS, e 2) o(s) correspondente (s) gene(s) ou alelo(s) de tRNA supressor que codifica (m) o tRNA supressor de âmbar SupE é/são incorporado(s) nestas bactérias em que o codão de terminação do tipo âmbar se encontra dentro da região de codificação do gene rpoS correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS, de acordo com a SEQ ID No. 2. A invenção fornece também um processo para preparar bactérias produtoras de L-treonina da espécie Escherichia coli que são resistentes ao AHV e, em que nestas bactérias 1) um codão de terminação tipo âmbar é incorporado na região de codificação do gene rpoS e que 2) um tRNA supressor de âmbar DSup E é incorporado nestas bactérias em que o codão de paragem do tipo âmbar e encontra dentro da região de codificação do gene rpoS correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS, de acordo com a SEQ ID No. 2.

Finalmente, a invenção fornece bactérias produtoras de L-treonina da espécie Escherichia coli, as quais são resistentes a AHV e que contêm um codão de terminação tipo âmbar na região de codificação do gene rpoS, e contém o 12 correspondente tRNA supressor sup E, em que o codão de terminação tipo âmbar se encontra dentro da região de codificação do gene rpoS correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS, de acordo com a SEQ ID No. 2.

Em relação à região de codificação do gene rpoS, os seguintes segmentos provaram ser particularmente vantajosos para a incorporação de um codão de terminação escolhido a partir do grupo âmbar, ocre e opala, preferencialmente âmbar: • segmento da região de codificação entre as posições 2 e 95, por exemplo posição 33, correspondente à sequência de aminoácidos da proteína RpoS, dada na SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2, • segmento da região de codificação entre as posições 99 e 168, por exemplo posição 148, correspondente à sequência de aminoácidos da proteína RpoS, dada na SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2, • segmento da região de codificação entre as posições 190 e 245, correspondente à sequência de aminoácidos da proteína RpoS, dada na SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2, • segmento da região de codificação entre as posições 266 e 281, por exemplo posição 270 correspondente à sequência de aminoácidos da proteína RpoS, dada na SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2, e segmento da região de codificação entre as posições 287 e 314, por exemplo posição 304, correspondente à 13

sequência de aminoácidos da proteína RpoS, dada na SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2.

De acordo com a descrição no caso de a região de codificação do gene rpoS ter um codão de terminação tipo âmbar, um supressor âmbar escolhido a partir do grupo da Tabela 1 é preferencialmente usado.

De acordo com a descrição no caso de a região de codificação do gene rpoS ter um codão de terminação do tipo ocre, um supressor de ocre escolhido a partir do grupo da Tabela 2 é preferencialmente usado.

De acordo com a descrição no caso de a região de codificação do gene rpoS ter um codão de terminação do tipo opala, um supressor de opala escolhido a partir do grupo da Tabela 3 é preferencialmente usado.

Dependendo do supressor usado, a bactéria forma um produto genético RpoS ou fator σ38 que contém, na posição 33 da sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO. 2, em vez de L-glutamina, um aminoácido escolhido a partir do grupo L-serina, L-tirosina, L-leucina, L-triptofano, L-lisina, L-alanina, L-arginina, L-fenilalanina, L-cisteína, L- prolina, L-histidina, L-treonina e L-valina. Assim, por exemplo quando se usa o supressor supD, a L-serina é incorporada em vez de L-glutamina. Quando se usam supressores que incorporam o aminoácido L-glutamina na posição 33 do produto genético rpoS ou fator o38, tal como por exemplo supE, a sequência de aminoácidos não é alterada.

As bactérias produtoras de L-treonina da espécie Escherichia coli que contêm o alelo rpoS dado na SEQ ID NO. 14 3 e o supressor supE dado na SEQ ID NO. 4 são muito particularmente preferidos. A invenção fornece também, correspondente a este primeiro aspeto da invenção, um processo para preparar aminoácidos ou aditivos para alimentos contendo aminoácidos no qual são realizados os seguintes passos: a) fermentação de bactérias da espécie Escherichia coli, que são resistentes ao ácido α-amino-B-hidroxivalérico e que contêm 1) dentro da região de codificação do gene rpoS correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS de acordo com a SEQ ID No. 2 um codão de paragem do tipo âmbar e 2) o correspondente supressor de âmbar supE, num meio adequado, b) enriquecimento da L-treonina no meio ou nas células dos microrganismos, e c) isolamento da L-treonina, quando opcionalmente os constituintes do caldo de fermentação e/ou a biomassa na integra, ou uma proporção destes (á 0 bis 100), permanecem no produto.

Os aditivos para alimentos de acordo com a invenção podem ser adicionalmente processados na forma líquida e também na forma sólida.

As mutações através das quais um codão de terminação é introduzido na grelha de leitura do gene rpoS podem ser produzidas diretamente no hospedeiro relevante através de métodos de mutagénese clássicos usando substâncias mutagénicas tais como, por exemplo, N-metilo-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, ou luz ultravioleta. 15

Para além disso, os métodos ín vítro que usam DNA rpoS isolado tal como, por exemplo, tratamento com hidroxilamina podem ser usados para mutagénese (J. H. Miller: A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992). Finalmente, podem ser usados os processos para mutagénese orientada para um sitio usando oligonucleótidos mutagénicos (T. A. Brown: Gentechnologie fur Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) ou a reação de cadeia de polimerase (PCR), como é descrito em livro por Newton e Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) . As mutações produzidas podem ser determinadas e testadas por sequenciação de DNA, por exemplo usando o método de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Science USA 74 (12): 5463-5467 (1977)).

Mutações adequadas podem ser incorporadas nas estirpes desejadas com a ajuda de processos recombinantes por meio de substituição de genes ou alelos. Um método comummente usado é o método de substituição de genes com a ajuda de um replicante condicional pMAK705 derivado de pSClOl, como descrito por Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171 (9): 4617-4622 (1989)). Outros métodos descritos na técnica anterior tal como, por exemplo, o método de Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181 (22): 7143-7148 (1999)) ou o método de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182 (3): 842-847 (2000)) podem ser usados. É também possível transferir mutações para as desejadas estirpes por conjugação ou transdução.

Finalmente, é possível usar alelos do gene rpoS conhecido da técnica anterior os quais contêm um codão de terminação 16 na grelha de leitura e introduzir estes nas desejadas estirpes usando os métodos descritos acima.

As estirpes obtidas pelo método descrito acima são preferencialmente mutantes, transformantes, recombinantes, transdutantes ou transconjugantes.

Com vista a produzir mutações supressoras nos genes tRNA, basicamente os mesmos métodos descritos para o gene rpoS podem ser usados. Métodos usando engenharia de oligonucleótidos, tais como os usados, por exemplo, por Khorana (Science 203 (4381): 614-625 (1979)), podem ser também usados. Para além disso, os genes tRNA supressores usados na técnica anterior podem ser usados em particular. Métodos para pesquisar, caracterizar e determinar a eficiência dos tRNA supressores são descritos na técnica anterior, por exemplo em Miller e Albertini (Journal of Molecular Biology 164 (1): 59-71 (1983)), in McClain e Foss (Journal of Molecular Biology 202 (4): 697-709 (1988)), em Normanly et al. (Journal of Molecular Biology 213 (4): 719-726 (1990)), em Kleina et al. (Journal of Molecular Biology 213: 705-717 (1990)), em Lesley et al. (Promega Notes Magazine 46, p. 02. (1994)) e in Martin et al. (Nucleic Acids Research 23 (5): 779-784 (1995)).

Para além disso, para a produção de L-treonina com bactérias da espécie Escherichia coli, pode ser vantajoso adicionalmente incorporar um codão de terminação na região de codificação do gene rpoS e um supressor correspondente para um codão de terminação, para aumentar uma ou mais enzimas do passo conhecido de biossintese de treonina ou enzima(s) para metabolismo anaplerótico ou enzimas para a produção de fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleótido 17 reduzido ou enzimas para glicolise ou enzimas PTS ou enzimas para metabolismo do enxofre. A expressão "melhoria" nesta conexão descreve um aumento na atividade ou concentração intracelular de uma ou mais enzimas ou proteínas num microrganismo que são codificadas pelo DNA correspondente através, por exemplo, do aumento do número de cópias do gene ou genes, usando um promotor forte ou um gene que codifica uma enzima correspondente ou proteína com atividade mais elevada e opcionalmente combinando estas medidas. 0 uso de genes endogénicos é geralmente preferido. "Genes endogénicos" ou "sequências de nucleótidos endogénicos" são entendidos para serem os genes ou as sequência de nucleótidos que estão presentes na população de uma espécie.

Usando as medidas de melhoria, em particular a sobre expressão, a atividade ou a concentração da proteína correspondente é geralmente aumentada em pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, no máximo até 1000% ou 2000%, em relação à proteína do tipo selvagem ou à atividade ou concentração da proteína no microrganismo inicial.

Assim, por exemplo, um ou mais genes, escolhidos do grupo seguinte, podem ser melhorados, em especial sobre expressados: o operão thrABC que codifica a aspartato quinase, homoserina dehidrogenase, homoserina quinase e treonina sintase (US-A-4,278,765), 18 • o gene pyc que codifica a piruvato carboxilase (DE-A-19 831 609), • o gene pps que codifica a fosfoenolpiruvato sintase (Molecular and General Genetics 231 (2) : 332-336 (1992)), • o gene ppc que codifica a fosfoenolpiruvato carboxilase (Gene 31: 279-283 (1984)), • os genes pntA e pntB que codificam a transhidrogenase (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)), • o gene rhtB que confere resistência à homoserina (EP-A-0 994 190), • o gene mqo que codifica a malato:quinona oxidoredutase (DE 100 348 33.5), • o gene rhtC que confere resistência à treonina (EP-A-1 013 765), • o gene thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica a proteína de exportação da treonina (DE 100 264 94,8), • o gene gdhA que codifica a glutamato dehidrogenase (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)), • o gene hns gene que codifica a proteína HLP-II de ligação a DNA (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)), • o gene pgm que codifica fosfoglucomutase (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)), • o gene fba que codifica a frutose bifosfato aldolase (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)), • o gene ptsl do operão ptsHIcrr, que codifica a enzima I no sistema fosfotransferase (PTS) (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)), • o gene ptsH do operão ptsHIcrr, que codifica a proteína fosfohistidina hexose fosfotransferase no sistema 19 fosfotransferase (PTS) (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)), • o gene crr do operão ptsHIcrr, que codifica o componente IIA especifico para glucose no sistema fosfotransferase (PTS) (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)), • o gene ptsG que codifica o componente IIBC especifico para glucose no sistema fosfotransferase (PTS) (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986)), • o gene lrp que codifica o regulador do regulão leucina (Journal of Biological Chemistry 266: 10768-10774 (1991)), • o gene csrA que codifica o regulador global (Journal of Bacteriology 175: 4744-4755 (1993)), • o gene fadR que codifica o regulador do regulão fad (Nucleic Acids Research 16: 7995-8009 (1988)), • o gene iclR gene que codifica o regulador do metabolismo intermediário central (Journal of Bacteriology 172: 2642-2649 (1990)), • o gene mopB que codifica o 10 Kd acompanhante (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-12419 (1986)), que é também conhecido pelo nome groES, • o gene ahpC do operão ahpCF, que codifica a pequena subunidade na hidroperóxido de alquilo redutase (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995)) • o gene ahpF do operão ahpCF, que codifica a subunidade larga na hidroperóxido de alquilo redutase (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995)) • o gene cysK que codifica cisteina sintase A (Journal of Bacteriology 170: 3150-3157 (1988)) 20 • o gene cysB que codifica o regulador do regulão cys (Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987)), • o gene cysJ do operão cysJIH, que codifica flavoproteina na NADPH sulfito redutase (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)), • o gene cysH do operão cysJIH, que codifica a adenililsulfato redutase (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of

Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)), e • o gene cysl do operão cysJIH, que codifica haemoproteina na NADPH sulfito redutase (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)).

Para além disso, pode ser vantajoso para a produção de L-treonina com bactérias da espécie Escherichia coli, incorporar adicionalmente um codão de terminação na região de codificação do gene rpoS e o correspondente supressor do codão de terminação, para atenuar, em particular o desligar ou reduzir a expressão de, um ou mais genes escolhidos a partir do grupo seguinte: • o gene tdh que codifica a treonina dehidrogenase (Ravnikar und Somerville; Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)), • o gene mdh que codifica a malato dehidrogenase (E.C. 1.1.1.37) (Vogel et al.; Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)), • o produto genético da grelha de leitura aberta (orf) yjfA (Número de Registo AAC77180 do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)), 21 • o produto genético da grelha de leitura aberta (orf) ytfP (Número de registo AAC77179 do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)), • o gene pckA que codifica a enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (Medina et al. ; Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990)), • the poxB gene que codifica piruvato oxidase (Grabau und

Cronan; Nucleic Acids Research 14 (13) : 5449-5460 (1986)), • the aceA gene que codifica a enzima isocitrato liase (Matsuoko und McFadden; Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)), • o gene dgsA que codifica o regulador DgsA no sistema fosfotransferase (Hosono et al.; Bioscience,

Biotechnology and Biochemistry 59: 256-261 (1995)), o qual é também conhecido pelo nome de gene mlc, e • o gene fruR que codifica o repressor de frutose (Jahreis et al.; Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)), que também é conhecido pelo nome de gene cra. A expressão "atenuação" nesta conexão descreve a diminuição em ou o desligamento da atividade ou da concentração intracelular de uma um mais enzimas ou proteínas num microrganismo as quais são codificadas pelo DNA correspondente, por exemplo, usando um promotor fraco ou um gene ou alelo que codifica a correspondente enzima com uma baixa atividade ou inativa a enzima, proteína ou gene correspondente e opcionalmente combinando estas medidas.

Usando as medidas de atenuação, incluindo a diminuição da expressão, a atividade ou concentração da proteína correspondente é geralmente diminuída para 0 até 75%, 0 até 50%, 0 até 25%, 0 até 10% ou 0 até 5% da atividade ou 22 concentração da proteína do tipo selvagem, ou a atividade ou concentração da proteína no microrganismo inicial.

Foi também demonstrado que no caso dos genes tdh, mdh, pckA, poxB, aceA, dgsA e fruR mencionados acima e as grelhas de leitura abertas (ORF) yj fA e ytfP e também para os genes ugpB (gene que codifica proteína de ligação periplástica no sistema de transporte sn-glicerina-3-fosfato), aspA (gene aspartato de amónio liase (= gene aspartase)), aceB (gene que codifica a enzima malato sintase A) e aceK (gene que codifica a enzima isocitrato dehidrogenase quinase/fosfatase), a atenuação pode ser atingida 1) incorporando um codão de terminação, escolhido a partir do grupo âmbar, ocre e opala, na região de codificação destes genes e 2) simultaneamente um supressor para o correspondente codão de terminação, escolhido a partir do grupo supressor âmbar, supressor de ocre e supressor de opala. 0 uso do codão de terminação tipo âmbar e o supressor âmbar supE provou ser particularmente vantajoso. A metodologia descrita pode ser transferida para quaisquer genes para cuja atenuação ou desconexão se entende seja produzida.

Microrganismos de acordo com a invenção podem ser cultivados num processo de lote, num processo descontínuo alimentado ou num processo descontínuo de alimentação repetida. Uma revisão de métodos de cultura conhecidos é dada no livro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). 23 0 meio de cultura a usar tem de satisfazer de modo apropriado as exigências das estirpes especificas. Descrições do meio de cultura para diferentes microrganismos são dadas no livro "Manual of Methods for General Bacteriology" pela American Society for Bacteriology (Washington D. C. , USA, 1981).

Fontes de carbono que podem ser usadas são o açúcar e hidratos de carbono tais como por exemplo glucose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido e opcionalmente celulose, óleos e gorduras tais como por exemplo óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de côco, ácidos gordos tal como, por exemplo, ácido palmitico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois tais como por exemplo glicerina e etanol e ácidos orgânicos tais como por exemplo ácido acético. Estas substâncias podem ser usadas individualmente ou como misturas.

Fontes de azoto que podem ser usadas são compostos contendo azoto orgânico tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de maceração de milho, farinha de feijão de soja e ureia ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. As fontes de azoto podem ser usadas individualmente ou como misturas.

Fontes de fósforo que podem ser usadas são ácido fosfórico, dihidrogeno fosfato de potássio ou hidrogeno fosfato de dipotássio ou os correspondentes sais contendo sódio. 0 meio de cultura deve também conter sais de metais, tais como por exemplo sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, os quais são necessários para o crescimento. Finalmente substâncias de crescimento essenciais tais como aminoácidos 24 e vitaminas têm de ser usadas adicionalmente às substâncias mencionadas acima. Precursores adequados podem ser também adicionados ao meio de cultura. As matérias-primas mencionadas podem ser adicionadas à cultura na forma de uma única porção ou podem ser alimentadas de modo adequado durante a cultura.

Para controlar o pH da cultura, compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amónia ou água amoniacal ou compostos ácidos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico são usados de modo apropriado. Para controlar o desenvolvimento de espuma, agentes anti espuma tais como por exemplo ésteres poliglicol de ácido gordo são usados. Para manter a estabilidade dos plasmídeos, substâncias adequadas atuando seletivamente tais como por exemplo antibióticos podem ser adicionadas ao meio. Com vista a manter condições aeróbias, oxigénio ou misturas gasosas contendo oxigénio tais como por exemplo ar é introduzido na cultura. A temperatura da cultura é normalmente 25°C até 45°C e é preferencialmente 30°C até 40 °C. A cultura é mantida até que um máximo de L-aminoácidos seja formado. Este objetivo é normalmente atingido em 10 horas até 160 horas. A análise dos aminoácidos pode ser realizada usando uma cromatografia de troca aniónica seguida por derivação de ninhidrina, como descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)), ou pode ser realizada usando HPLC de fase reversa, como descrito em Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Os seguintes microrganismos foram depositados como uma cultura pura em 9 de Setembro de 2002 na German Collection 25 of Microrganismos and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) de acordo com o Tratado de Budapeste: • Estirpe DM1690 de Escherichia coli como DSM 15189. A estirpe DSM 15189 contém um codão de terminação tipo âmbar no ponto correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS e um supressor âmbar e produz treonina. O processo de acordo com a invenção é usado para a preparação fermentativa de L-treonina. A presente invenção é explicada em mais pormenor a seguir, fazendo uso de exemplos de trabalho.

Os meios mínimo (M9) e universal (LB) para a E. coli são descritos por J. H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press). O isolamento do DNA de plasmídeo de E. coli e todas as técnicas relacionadas com a restrição e Klenow e tratamento de fosfatase alcalina são realizados como descrito por Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). A transformação de E. coli, a menos que descrito diferentemente, é realizada como descrito em Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)). Transduções PI são realizadas como descrito por Lengeler et al. (Journal of Bacteriology 124: 26-38 (1975)).

Exemplo 1 26

Transdução do local do gene scr na estirpe MG1655 de E. coli K12 0 regulão scr nos plasmídeos pUR400 que ocorrem naturalmente (Schmid et al., Molecular Microbiology 2: 1-8 (1988)) promove a capacidade de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono. Com a ajuda do plasmideo pKJL710 (Ulmke et al., Journal of Bacteriology 181: 1920-1923 (1999)), que contém o regulão scr entre as duas repetições de sequência reversa do transposão Tnl721 (Ubben e Schmitt, Gene 41: 154-152 (1986)), seguido por transformação, transposição, conjugação e transdução, o regulão scr pode ser transferido para o cromossoma da Escherichia coli K12. Uma estirpe chamada LJ210 contem o regulão scr integrado no cromossoma na posição 6 minutos de acordo com Berlyn-Karte. O bacteriófago PI é multiplicado nesta estirpe e na estirpe MG1655 da E. coli K12 (Guyer et al., Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biology 45: 135-140 (1981)) é infetada com o fago lisado isolado. Por plaqueamento em meio mínimo (2 g/L) contendo sacarose, são obtidos os transdutantes MG1655 os quais podem usar sacarose como uma fonte de carbono. Ao clone selecionado é dado o nome de MG1655scr.

Exemplo 2

Mutagénese in—vivo da estirpe MG1655scr A partir de MG1655scr, após incubação a 37°C em agar mínimo ao qual foram adicionados 2 g/L de sacarose e 4 g/L de DL-β-hidroxinorvalina (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) , são isolados mutantes espontâneos que são resistentes ao ácido a-amino-p-hidroxivalérico (AHV) análogo de treonina. Ao mutante selecionado é dado o nome de MG1655scrAHVRI. 27

Exemplo 3

Incorporação de uma mutação de codão de terminação no gene rpoS em MG1655scrAHVRl por mutagénese sitio-especifica 3.1 Clonagem do gene rpoS a partir de MG1655 A estirpe MG1655 de Escherichia coli é usada como dador de DNA cromossomal. Um fragmento de DNA que contém a região do gene rpoS a ser mutada na região média é amplificado usando a reação de cadeia de polimerase (PCR) e os oligonucleótidos sintéticos. A partir da sequência do gene rpoS (Número de registo AE000358, SEQ ID No. 1) para Escherichia coli K12, os seguintes oligonucleótidos de primer (MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha) são escolhidos para PCR: rpoS9 (SEQ ID No. 7): 5'CAGT TATAGCGGCAGTACC 3' rpoS4 (SEQ ID No. 8): 5' GGACAGTGTTAACGACCATTCTC 3' 0 DNA cromossomal de E. coli K12 é isolado de acordo com os dados do fabricante usando "Qiagen Genomic-tips 100/G" (Qiagen, Hilden, Alemanha). Fragmentos de DNA de aproximadamente 2 kpb de comprimento podem ser isolados usando os primers específicos sob condições padrão de PCR (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and

Applications, Academic Press) com polimerase vent (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Alemanha). 0 fragmento de DNA amplificado é identificado usando eletroforese de gel num gel de agarose (0,8 %) e purificado com o Kit de Purificação de PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, 28

Alemanha). 0 produto de PCR purificado é ligado de acordo com os dados do fabricante usando o vetor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holland) e transformado na estirpe TOPIO de E. coli (Invitrogen, Groningen, Holland). A seleção de células contendo plasmídeos é realizada em agar LB ao qual foram adicionados 50 mg/L de canamicina. Após o isolamento de DNA de plasmideo, o vetor é testado usando clivagem de restrição e separação em gel de agarose (0,8 %) . O fragmento de DNA amplificado é testado por análise de sequência. A sequência no produto PCR está de acordo com a sequência dada na SEQ ID NO. 9. Ao plasmideo obtido é dado o nome de pCRBluntrpoS9-4. 3.2 Substituição do codão glutamina com vim codão de terminação âmbar por mutagénese sitio-especifica

Mutagénese sitio-dirigida é realizada com o Kit de Mutagénese Sítio-Dirigido QuikChange (Stratagene, La Jolla, USA) . Os seguintes oligonucleótidos de primer são escolhidos para amplificação linear: rpoSambarl (SEQ ID No. 10): 5' GGCCTTAGTAGAA (TAG) GAACCCAGTGATAACG 3' rpoSambar2 (SEQ ID No. 11): 5' CGTTATCACTGGGTTC (CTA) TTCTACTAAGGCC 3'

Estes primers são sintetizados por MWG Biotech. O codão de terminação âmbar que se pretende que substitua a glutamina na posição 33 na sequência de aminoácidos é marcado com parênteses na sequência de nucleótidos mostrada acima. O plasmideo pCRBluntrpoS9-4 descrito no exemplo 3.1 é usado com cada um dos dois primers complementares ao filamento no 29 plasmídeo para amplificação linear através de PfuTurbo DNA polimerase. Um plasmídeo mutado com filamentos circulares partidos é produzido durante este alongamento do primer. 0 produto da amplificação linear é tratado com Dpnl. Esta endonuclease especificamente corta o modelo de DNA metilado e semi-metilado. 0 novo vetor DNA sintetizado partido, mutado é transformado na estirpe XL1 Blue de E. coli (Bullock, Fernandez e Short, BioTechniques 5 (4) 376- 379 (1987) ) . Após transformação, as células XL1 Blue reparam as quebras nos plasmídeos mutados. A seleção dos transformantes é realizada em meio LB com 50 mg/L de canamicina. O plasmídeo obtido é testado após isolamento do DNA por meios de clivagem de restrição e separação em gel de agarose (0,8 %) . A sequência de DNA do fragmento de DNA mutado é testado por análise de sequência. A sequência está de acordo com a sequência dada na SEQ ID NO. 3 na região do gene rpoS. Ao plasmídeo obtido é dado o nome de pCRBluntrpoSambar. 3.3 Construção do vetor de substituição pMAK705rpoSamber 0 plasmídeo pCRBluntrpoSambar descrito no exemplo 3.2 é clivado com enzimas de restrição BamHI e Xbal (Gibco Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Alemanha). Após separação num gel de agarose (0,8 %) o fragmento rpoS com aproximadamente 2,1 kpb de comprimento contendo a mutação é isolado com o Kit de Extração em Gel QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemanha). 0 plasmídeo pMAK705 descrito em Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)) é clivado com enzimas de restrição BamHI e Xbal e ligado com o fragmento rpoS isolado (T4-DNA-Ligase, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemanha). Depois a estirpe DH5a de E. coli (Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87: 4645-4649 (1990)) é transformada com o lote de ligação 30 (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Habor, New York, 1989) . A seleção de células contendo o plasmídeo é realizada por plaqueamento do lote de transformação em agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Habor, New York, 1989) o qual é suplementado com 20 mg/L de cloranfenicol. O DNA de plasmídeo é isolado de um transformante usando o Kit QIAquick Spin Miniprep da Qiagen e testado por clivagem de restrição com as enzimas BamHI, EcoRI, EcoRV, StuI e Xbal seguida por eletroforese de gel de agarose. Ao plasmídeo é dado o nome de pMAK7 05rpoSamber. Um mapa do plasmídeo é mostrado na figura 1. 3.4 Mutagénese sitio-específica do gene rpoS da estirpe MG1655scrAHVRl de E. coli

Para mutagénese sitio-específica do gene rpoS, a estirpe MG1655scrAHVRl descrita no exemplo 2 é transformada com o plasmídeo pMAK705rpoSambar. A substituição do gene é realizada usando o processo de seleção descrito em Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)). A prova de que a mutação do alelo rpoSambar ocorreu no cromossoma é realizada usando o LightCycler da Roche Diagnostics (Mannheim, Alemanha). O LightCycler é um instrumento combinado que consiste de um termociclador e um fluorímetro.

Na primeira fase, uma secção de DNA de aproximadamente 0,3 kpb de comprimento que contém o sítio de mutação é amplificado por meio de PCR (Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) usando os seguintes oligonucleótidos de primer: 31 rpoSLCl (SEQ ID No. 12): 5'CGGAACCAGGCTTTTGCTTG 3' rpoSLC2 (SEQ ID No. 13): 5'GCGCGACGCGCAAAATAAAC 3'

Na segunda fase a presença da mutação é provada usando análise da curva de fusão (Lay et al.; Clinicai Chemistry 43: 2262-2267 (1997)) com dois oligonucleótidos adicionais de diferentes comprimentos e marcados com diferentes corantes fluorescentes (LightCycler (LC)-Red640 e fluoresceina) os quais hibridam numa região do sítio da mutação, usando o método "Transferência de Energia de ressonância de Fluorescência" (FRET). rpoSamberC (SEQ ID No. 14): 5'LC-Red640 - CTTAGTAGAACAGGAACCCAGTG - (P) 3' rpoSamberA (SEQ ID No. 15): 5' GATGAGAACGGAGTTGAGGTTTTTGACGAAAAGG - Fluoresceína 3'

Os primers apresentados para PCR são sintetizados por MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha) e os oligonucleótidos para hibridação são sintetizados por TIB MOLBIOL (Berlim, Alemanha).

Deste modo, é identificado um clone que contém uma base timidina em vez de uma base citosina na posição 952 numa sequência de DNA para o produto PCR rpoS (SEQ ID No. 9) . A base tripleto timina adenina guanina está presente na posição 97-99 da sequência de codificação do alelo rpoS (SEQ ID No. 3) e codifica um codão de terminação âmbar que conduz à terminação da translação. A este clone é dado o nome MG1655scrAHVRlrpoS. 32

Exemplo 4

A seleção in-vivo de um supressor de mutação âmbar na estirpe MG1655scrAHVRlrpoS 4.1 Construção de um vetor com um codão de terminação âmbar no gene Cat

Para a seleção de um supressor de mutação, um codão de terminação âmbar é incorporado no gene cat que codifica a cloranfenicol acetil transferase e confere resistência ao antibiótico cloranfenicol.

Para este fim, o bloco de genes Cat é ligado ao vetor pTrc99A linearizado HindIII (ambos da Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemanha) . A Estirpe DH5oc de E. coli (Grant et al. ; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87: 4645-4649 (1990)) é transformada com o lote de ligação (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Habor, New York, 1989). A seleção de células contendo o plasmídeo é realizada por plaqueamento do lote de transformação sobre o agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Habor, New York, 1989) o qual é suplementado com 50 mg/L de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo é isolado de um transformante usando o Kit QIAquick Spin Miniprep da Qiagen e testado por clivagem de restrição seguida por eletroforese de gel de agarose. 0 plasmídeo é chamado de pTrc99Acat.

Para incorporar um codão de terminação âmbar na região de codificação do gene cat, partindo da sequência para o gene cat, os primers que contêm os sítios de clivagem para as 33 enzimas de restrição AccIII e MscI são sintetizados por MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha. Os locais de reconhecimento para as enzimas de restrição são marcados sublinhando as sequências de nucleótidos mostradas a seguir. No primer catAccIII, por trás do sitio de clivagem AccIII, dois codões ATG que codificam o aminoácido metionina nas posições 75 e 77 na proteína cat são mudados nos codões TAG. Os codões de âmbar são apresentados entre parêntesis nas sequências de nucleótidos dadas a seguir. catAccIII: 5' GCTCATCCGGAATTCCGT(TAG)GCA(TAG)AAAG 3' (SEQ ID No. 16) catMscI: 5' GTCCATATTGGCCACGTTTAAATC 3' (SEQ ID No. 17) 0 DNA de plasmídeo do vetor pTrc99Acat é usado para PCR. Um fragmento de DNA com cerca de 300 pb de comprimento pode ser amplificado com os primers específicos sob condições padrão de PCR (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) usando Pfu DNA polimerase (Promega Corporation, Madison, USA) . O produto PCR é clivado com as enzimas de restrição AccIII e MscI. O vetor pTrc99Acat é também digerido com as enzimas AccIII e MscI, separadas em gel e um fragmento de 4,7 kpb de comprimento é isolado usando o kit de Extração em Gel QIAquick. Os dois fragmentos são ligados com T4 DNA ligase (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemanha). A estirpe XL1-Blue MRF’ de E. coli (Stratagene, La Jolla, USA) é transformada com o lote de ligação e as células contendo plasmídeo são selecionadas em agar LB ao qual foram adicionados 50 μg/mL de ampicilina. O sucesso da clonagem pode ser provada, após o isolamento de DNA de plasmídeo, por controlo de clivagem usando as enzimas EcoRI, PvuII, 34

SspI e Styl. 0 plasmídeo é chamado de pTrc99Acatamber. Um mapa do plasmídeo é mostrado na figura 2. 4.2 Seleção de clones com um supressor âmbar A estirpe MG1655scrAHVRlrpoS descrita no exemplo 3 é transformada com os vetores pTrc99Acat e pTrc99Acatamber. A seleção é realizada em agar LB o qual foi suplementado com 20 ou 50 μρ/πιΐ de cloranfenicol.

Os clones resistentes ao cloranfenicol que foram transformados com o vetor pTrc99Acatamber são transferidos para Agar LB ao qual foram adicionados 50 μυ/ητί de ampicilina, usando um palito dentário. O DNA de plasmídeo é isolado a partir de clones resistentes a cloranfenicol e ampicilina. O vetor pTrc99Acatamber é identificado por clivagem de restrição.

Um transformante resistente ao cloranfenicol MG1655scrAHVRrpoS/pTrc99Acatambar é curado pelo plasmídeo pTrc99Acatamber por sobre-inoculação várias vezes em meio LB e é dado o nome de DM1690. 4.3. Identificação do supressor de mutação de âmbar em DM1690

4.3.1. Teste para a mutação supD

Uma mutação conhecida conduz à supressão de codões de âmbar está presente no gene serU que codifica a serina tRNA-2. O alelo é chamado supD, o tRNA reconhece os codões de âmbar e incorpora serina. Na sequência do gene supD60 (Número de registo M10746) o anticodão citosina adenina adenina no gene serU do tipo selvagem é modificado por substituição da 35 base para dar citosina timina adenina e assim reconhece os codões uracilo adenina guanina.

Uma mutação possível no gene serU cromossómico pode ser detetada usando o LightCycler da Roche Diagnostics (Mannheim, Alemanha). 0 LightCycler é um instrumento combinado consistindo de um termociclador e um fluorímetro.

Na primeira fase, uma secção de DNA com aproximadamente 0,3 kpb de comprimento contendo o sítio de mutação é amplificada por PCR (Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) usando os seguintes oligonucleótidos primer: serULCl (SEQ ID No. 18): 5' CTTGTACTTTCCAGGGCCAC 3' serULC2 (SEQ ID No. 19): 5' T T TAGGAAAAGCAAGGCGGG 3'

Na segunda fase a presença de mutação é provada usando análise de curva de fusão (Lay et al.; Clinicai Chemistry 43: 2262-2267 (1997)) com dois oligonucleótidos adicionais de diferentes comprimentos e marcados com diferentes corantes fluorescentes (LightCycler (LC)-Red640 e fluoresceína) os quais hibridam numa região do sítio da mutação, usando o método "Transferência de Energia de ressonância de Fluorescência" (FRET). serUC (SEQ ID No. 20): 5'LC-Red640 -TCCGGTTTTCGAGACCGGTC-(P) 3' serUA (SEQ ID No. 21): 5' GAGGGGGATTTGAACCCCCGGTAGAGTTGCCCCTA-Fluoresceína 3' 36

Os primers para PCR mostrados são sintetizados pela MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha) e os oligonucleótidos para a hibridação mostrados são sintetizados pela TIB MOLBIOL (Berlim, Alemanha).

Pode ver-se que o gene serU do tipo selvagem está presente em DM1690 e assim não há mutação supD. 4.3.2 Análise de sequência do alelo supE em DM1690

Outra mutação conhecida que conduz à supressão dos codões âmbar está presente no gene glnV que codifica a glutamina tRNA-2. O alelo é chamado supE, o tRNA reconhece os codões âmbar e incorpora a glutamina. Na sequência do gene glnV (Número de registo AE000170) o anticodão citosina timina guanina no gene glnV tipo selvagem é modificado pela substituição de base para dar citosina timina adenina e reconhece os codões uracilo adenina guanina.

Partindo da sequência conhecida para a região glnV da Escherichia coli K12 (Número de registo AE000170), os seguintes oligonucleótidos primers (MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha) são escolhidos para PCR: glnXl (SEQ ID No. 22): 5' CTGGCGTGTTGAAACGTCAG 3' glnX2 (SEQ ID No. 23): 5' CACGCTGTTCGCAACCTAACC 3'

0 DNA cromossómico de DM1690 usado para PCR é isolado de acordo com os dados do fabricante usando "Qiagen Genomic-tips 100/G" (Qiagen, Hilden, Alemanha). Um fragmento de DNA 37 com aproximadamente 1 kpb de comprimento pode ser isolado usando os primers específicos sob condições padrão de PCR (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) com polimerase vent (New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Alemanha). O produto de PCR é purificado com o kit de Purificação por PCR QIAquick e sequenciado pelo Qiagen Sequencing Services (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). A sequência obtida está de acordo com a SEQ ID No. 4 numa região no gene glnV. A estirpe DM1690 possui o alelo supE e suprime codões âmbar por incorporação da glutamina.

Exemplo 5

Preparação de L-treonina usando as estirpes MG1655scrAHVRl, MG1655scrAHVRlrpoS e DM1690

As estirpes MG1655scrAHVRl, MG1655scrAHVRlrpoS e DM1690 são multiplicadas em meio mínimo com a seguinte composição: 3,5 g/L de Na2HP04*2H20, 1,5 g/L de KH2P04, 1 g/L de NH4C1, 0,1 g/L de MgS04*7H20, 2 g/L de sacarose, 20 g/L de agar. As culturas são incubadas durante 5 dias a 37 °C. A formação de L-treonina é monitorizada em culturas de lotes de 10 mL que estão contidas em frascos Erlenmeyer de 100 mL. Para este fim, 10 mL de meio de pré-cultura com a seguinte composição: 2 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de (NH4)2S04, 1 g/L de KH2P04, 0,5 g/L de MgS04*7H20, 15 g/L de CaC03, 20 g/L de sacarose, são inoculados e a mistura é incubada durante 16 horas a 37 °C e 180 rpm num incubador ESR da Kuhner AG (Birsfelden, Switzerland). Porções de 250 HL desta pré-cultura em cada caso são transferidas para 10 mL de meio de produção (25 g/L de (NH4) 2S04, 2 g/L de KH2P04, 1 g/L de MgS04*7H20, 0,03 g/L de FeS04*7H20, 0,018 38 g/L de MnS04*lH20, 30 g/L de CaC03, 20 g/L de sacarose) e incubados durante 48 horas a 37°C. Após incubação, a densidade ótica (OD) da suspensão de cultura é determinada usando um fotómetro LP2W de Dr. Lange (Berlim, Alemanha) com uma medida de comprimento de onda de 660 nm.

Quando a concentração de L-treonina formada é determinada no liquido sobrenadante filtrado esterilizado usando um analisador de aminoácidos da Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Alemanha) por meio de cromatografia de troca iónica e reação pós-coluna com deteção de ninhidrina. A Tabela 4 dá os resultados do ensaio.

Tabela 4

Estirpe DO (660 nm) L-treonina g/L MG1655scrAHVRl 5, 6 2,15 MG1655scrAHVRlrpoS 5,3 2,34 DM1690 5,2 2,46

Breve descrição das Figuras:

Figura 1: pMAK705rpoSambar Figura 2: pTrc99Acatambar

Dados relacionados com o comprimento são para ser encarados como dados aproximados. As abreviaturas e nomes usados são definidos com se segue: cat Gene de resistência ao cloranfenicol rep-ts Região de replicação sensível à temperatura do plasmídeo pSClOl

rpoS Região de codificação do gene rpoS 39

Amp Gene resistente à ampicilina lacl Gene para o gene repressor nos promotores trc

Ptrc região do promotor trc, IPTG induzivel

5S região 5S de rRNA

rrnBT região de terminação de rRNA

As abreviaturas para as enzimas de restrição são definidas como se segue: • AccIII: Endonuclease de restrição a partir de Acinetobacter calcoaceticus • BamHI Endonuclease de restrição a partir de Bacillus amyloliquefaciens • EcoRI Endonuclease de restrição a partir de Escherichia coli • EcoRV Endonuclease de restrição a partir de Escherichia coli • Ms cl Endonuclease de restrição a partir de espécies Microcossus • PvuII Endonuclease de restrição a partir de Proteus vulgaris • SspI Endonuclease de restrição a partir de espécies de Sphaerotilus • StuI Endonuclease de restrição a partir de Streptomyces tubercidius • Styl Endonuclease de restrição a partir de Salmonella typhi • Xbal Endonuclease de restrição a partir de Xanthomonas badrii 40

Lista de sequências

«110> asguass AG s&ÍÔ* Bactérias produtoras de aminoãcido e um processo para preparar L-aminoácidos <130> 018319 m <Í48> 23 <170* Patentln version 3*1

<2l0> 1 <211> 993 <212> SEJA <213> E&eh&richia coli <22G>

<22l> CUS <222> U>**(990í <22:3> <400> 1 afcg agt cag ãat acg ctg aaa gtt ca t gat fcta aat gaa gat gug gaa Ket Ser Gin Asn Tfer Leu Lys val HiS Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu 1 5 ΊΌΓ" 15 fctt gat gag aac gga gtt gag gtt fctt gac gaa aag gcc tta gta gaa Phe Asp Glu Asn Gly Vai Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu 20 25 30 cag gaa ccc agt gat aac gat ttg gcc gaa gag gaa ctg tta tcg cag Gin Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gin 35 40 45 gga gcc aca cag cgfc gtg ttg gac gcg act cag cfcfc fcac efct ggt gag aiy Ala ®hr Gin Arg Vai Leu Asp Ala «ir Gin hm •Pyr Leu Gly Glu 50 55 60 atfc ggt t&t tca cca ctg tta aeg gcc gaa gaa gaa gtt tafc fctt gcg 11« Qly Tyr Ser Fro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Alei 65 ?0 75 80 cgfc cgc gca ctg cgt gga gat gtc gcc tct cgc «gc cgg afcg ate gag Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp val Alá Ser Arg Arg Arg Mefc Ile Glu 85 90 95 agt aac ttg agt etg fftg gta aaa afct gcc cgc cgt tafc ggc aat cgt Ser Asn Leu Arg Leu Val val Lys He Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg 100 105 110 ggfc etg gcg ttg ctg gac efct ata gaa gag ggc aac ctg ggg ctg ate Gly leu Ala Leu Leu Asp Leu lie Glu Glu Giy Asn Leu Gly Leu lie 115 120 125 cgc gcg gta gag aag fctt gac ccg gaa cgfc ggt tfcc cgc fcfce tca aca Arg Ala Vai Glu LyS Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr 130 135 140 18 96 144 192 240 288 33 δ 384 432 tac gea acc tgg tgg att cgc cag acg att gaa egg gcg att atg aac

Tyr Ala Thr Trp Trp xle Arg Ola T&r lie Glu Arg Ala lie Met Asa

145 150 255 ISO caa acc cgt acfc att cgt fctg ecg att cac ate gta aag gag cfcg aac Gl» Hir Arg Thr 21e Arg leu Fro xle His Xle Vai Lys Glu leu As» 16S 170 175 gtfc tac ctg ega acc gea cgt g&g fctg tec cafc aag ctg gac cafc gaa val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys leu Asp His Glu 180 185 190 cca agt gcg çaa gag afcc gea gag caa cfcg gat aag cca gtt gafc gac Pro Ser Ala Glu Glu Xle Ala Glu Gla Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp 195 200 205 gtc age cgt atg ctt cgt ctt aac gag cgc att acc teg gta gac acc Val Ser Arg Hat Leu Arg Leu Asa Glu Arg Xle Thr Ser Val Asp Thr 210 215 220 ccg ctg ggt ggt gafc fccc gaa aaa gcg fctg cfcg gac afcc ctg gee gat

Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Xle Leu Ala Asp 225 230 235 240 gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac gat afcg aag

Glu Lys Glu As» Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gin Asp Asp Asp Mafc Lys 245 , 250 255 cag age afcc gfce aaa fcgg ctg ttc gag ctg aac gee aaa cag cgt gaa Gl» Ser Ile Val Lys Trp Leu Ehe Glu Leu Asn Ala Lys Gla Arg Glu 260 265 270 gfcg ctg gea cgt ega fcfcc ggt fctg ctg ggg tac gaa gcg gea aca ctg Val Leu Ala Arg Arg Fhe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu 275 280 285 gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt gfcfc cgc cag Glu Asp Vai Gly Arg Glu Xle Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gin 290 295 300 att cag gtt gaa ggc cfcg cgc cgt fctg cgc gaa ate ctg caa acg cag Xle Gin Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Xle Leu Gla Thr Gla 305 310 315 320 ggg ctg aat ate gaa gcg ctg ttc cgc gag taa

Gly Leu Asn Xle Glu Ala Leu Fhe Arg Glu 325 . 330 <210> 2 <211> 330

«212» FRT <213» Escherichia coli «400» 2

Met ser Gl» Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu 15 10 15

Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Fha Asp Glu 1¾¾ Ala Leu Val Glu 20 25 30 42

Gin Glu Pro Ser Asp As» Aap Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gl» 35 40 45 Gly Ala Thr Gl» Arg V&l Leu Asp Ala Thr GlnLeu Tyr Leu Gly Glu 5 50 55 60 Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala 65 70 75 80 10 Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu S5 90 95 Ser Assis. LeU Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg 100 105 110 15 aiy Leu Ala Leu Leu Asp Leu lie Glu Glu Gly As» Leu Gly Leu Ile 115 120 125 Arg Ala Val Glu Lys The Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr 20 130 135 140 Tyr Ala Thr Trp Trp lie Arg 01» Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn 145 150 155 160 25 Gin Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn 165 170 175 Vai Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu 180 185 190 30 Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gl» Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp 195 200 205 Val Ser Arg Mefc Leu Arg Leu As» Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr 35 210 215 220 Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp 225 230 235 240 40 Glu Lys Glu As» Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gin Asp Asp Asp Met Lys 245 250 255 Gin Ser Ile Val Lys Trp Leu Ph® Glu Leu Asn Ala Lys Gin Arg Glu 260 265 270 45 Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu 275 280 285 Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gin 50 290 295 300 Ile Gin Val GlU Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gin Thr Gin 305 310 315 320 55 Gly Leu As» Ile Glu Ala Leu pfae Arg Glu 325 330 <21ϋ> 3 «211» 993 «212» ΟΚΑ <213» Escherichia coli 60 43 <220> <321> Alelo <222> tu.-lsSO)

<223> A|e|o.rpoS <220> <221> misc_caracteristicas <222> (.97) * , ί99) <223> Codão-ambar <400> 3 atgagteaga atacgctgaa ggagttgagg tttttgacga gccgaag&gg aactgttatc taccttggfcg agattggtta cgtcgcgcac tgcgtggaga ctggtggtaa aaattgcccg gaagagggca acctggggct cgcttcfccaa catacgcaae caaacccgta ctattcgtfct accgcacgfcg agttgtccea caacfcggata agccagttga tcggtagaca ccccgctggg gaaaaagaga acggtccgga aaatggctgt fccgagctgaa ctggggtacg aagcggcaac cgtgttcgce agattcaggt gggctgaata tcgaagcgct <210> 4 <211> 75

<212> DMA <223> Escherichia co: agfefceatgat tt&aatgaag aaaggcctts gtagaafcagg gcagggagcc acacagcgtg ttcaccactg fctaacggccg tgtcgeefcefc cgccgccgga ccgttatggc aatcgtggte gafcccgcgcg gtagagaagt ctggtggafcfc cgccagacga gccgattcac atcgtaaagg taagctggac catgaaccaa tgacgtcagc cgtatgctte tggtgattcc gaaaaagcgfc agataccacg caagafcgacg cgccaaacag cgtgaagfcgc actggaagat gtaggtcgtg fcgasggcofcg cgecgfcttgc gfcfcecgcgag taa atgcggaafcfc fcgafcgagaac aacceagtga taacgatttg Cgfcfeggacgc gactcagctt aagaagaagfc ttattttgcg fcgatcgagag taacttgcgfc tggcgfctgct ggaccttatc ttgacccgga acgfcggfcfctc ttgaacggge gattatgaac agctgaacgt ttacctgcga gtgcggaaga gatcgcagag gtettaacga gcgcatfcacc tgctggacat cctggccgat atatgaagca gagcatcgtc tggcacgtcg attcggtttg aaatfeggcct eaccogtgaa gcgaaatcct gaaaaegcag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 993 <220> <222> tENA <222> (1)..(75)

<223> alelo-supE <400> 4 60 tggggtatcg ccaagcggfca aggcaccgga ttcfcaattcc ggcattccga ggfctcgaatc etcgtacocc agcca 75 44 <210> 5 <211> 714

<212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(711) <223> <400> 5 atg ate gag agt aac ttg cgt ctg gtg gta aaa att gee ege cgt tat 48 Met Ile Glu Ser Asn Leu Arg Leu Vai Vai Lys Ile Ala Arg Arg Tyr 1 5 10 15 ggc aat cgt ggt ctg gcg ttg ctg gac ctt ate gaa gag ggc aac ctg 96 Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu 20 25 30 ggg ctg ate ege gcg gta gag aag ttt gac ccg gaa cgt ggt ttc ege 144 Gly Leu Ile Arg Ala Vai Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg 35 40 45 ttc tea aca tac gca acc tgg tgg att ege cag acg att gaa cgg gcg 192 Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gin Thr Ile Glu Arg Ala 50 55 60 att atg aac caa acc cgt act att cgt ttg ccg att cac ate gta aag 240 Ile Met Asn Gin Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Vai Lys 65 70 75 80 gag ctg aac gtt tac ctg cga acc gca cgt gag ttg tcc cat aag ctg 288 Glu Leu Asn Vai Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu 85 90 95 gac cat gaa cca agt gcg gaa gag ate gca gag caa ctg gat aag cca 336 Asp His Glu Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gin Leu Asp Lys Pro 100 105 110 gtt gat gac gtc age cgt atg ctt cgt ctt aac gag ege att acc teg 384 Vai Asp Asp Vai Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser 115 120 125 gta gac acc ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa aaa gcg ttg ctg gac ate 432 Vai Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile 130 135 140 ctg gee gat gaa aaa gag aac ggt ccg gaa gat acc acg caa gat gac 480 Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gin Asp Asp 145 150 155 160 gat atg aag cag age ate gtc aaa tgg ctg ttc gag ctg aac gee aaa 528 Asp Met Lys Gin Ser Ile Vai Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys 165 170 175 cag cgt gaa gtg ctg gca cgt cga ttc ggt ttg ctg ggg •tac gaa gcg 576 Gin Arg Glu Vai Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala 180 185 190 gca aca ctg gaa gat gta ggt cgt gaa att ggc ctc acc cgt gaa cgt 624 Ala Thr Leu Glu Asp Vai Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg 195 200 205 45 gtt cgc cag att cag gtt gaa ggc ctg cgc cgt ttg cgc gaa ate ctg Vai Arg Gin Ile Gin Vai Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu 210 215 220 caa acg cag ggg ctg aat ate gaa gcg ctg ttc cgc gag taa Gin Thr Gin Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu 225 230 235 <210> £ <211> 237 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> £ Met Ile Glu Ser Asn Leu Arg Leu Vai Vai Lys Ile Ala Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu 20 25 30 Gly Leu Ile Arg Ala Vai Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg 35 40 45 Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gin Thr lie Glu Arg Ala 50 55 60 Ile Met Asn Gin Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Vai Lys 65 70 75 80 Glu Leu Asn Vai Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu 85 90 95 Asp His Glu Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gin Leu Asp Lys Pro 100 105 110 Vai Asp Asp Vai Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser 115 120 125 Vai Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile 130 135 140 Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gin Asp Asp 145 150 155 160 Asp Met Lys Gin Ser Ile Vai Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys 165 170 175 Gin Arg Glu Vai Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala 180 185 190 Ala Thr Leu Glu Asp Vai Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg 195 200 205 Vai Arg Gin Ile Gin Vai Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu 210 215 220 Gin Thr Gin Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu 225 230 235 672 714 46 46 <210» ? <2 n> <212» vm <23,3» Sequência sintética <220» <232> Primec <222» {1),.(19) <223 > rpoS9 <4Ô0> 7 cagttatagc ggcagtacc <21G» 8 <211» 23 <212 » μα <213 > Sequência sirrtõtica <220» <221» primar <222» (11..(23} <223» rpoS4 <400» 8 ggacagtgtt aacgaccatt ctc 23 <21Q> 9 <211> 2012 <212> 3>m <213> Escherichia coli <22Õ> <221» DMA, <222» (1)..(2012) <223» rpoS9~4 <400» 9 cagttatagc ggcagtaccfc ataccgtgaa aaaaggcgac acacttttct atatcgcctg 60 gattactggc aacgafcttcc gtgaccttgc tcagcgcaac aatattcagg caccataçgc 120 gctgaacgtt ggtcagacct tgcaggtggg taatgcttcc ggtacgccaa tcacfcggcgg 180 aaatgccatt acccaggccg acgcageaga gcaaggagtt gtgatoaagc ctgcacaaaa 240 ttecaccgfcfc gctgttgcgt cgcaaccgac aattacgtat tetgagtctt cgggtgaaca 300 gagtgctaac aaaattgttge cgaacaacaa gccaaetgcg accaoggtca cagcgcctgt 360 aacggtacca acagcaagca caaecgagee gactgtcagc agtacatcaa ccagtacgcc 420 tatctccacc tggcgctggc egactgaggg caaagtgate gaaacctttg gcgctfccfega 480 ggggggcaac aaggggatfeg atatcgcagg cagcaaagga caggc&afefca tcgcgaccgc 540 agatggccgc gttgfefctatg ctggtaacgc gctgegcggc tacggtaatc tgafctatcat 600 caaacataat gatgattacc tgagtgccta cgcceataac gacacaatgc tggtccggga 660 aeaacaagaa gfctaaggcgg ggcaaaaaat agcgaccatg ggfcageaccg gaaccagttc 72© aacacgcttg cattttgaaa tfccgttacaa ggggaaatcc gtaaacccge tgcgtfcafcfct 780 47 gccgcagcga taaatcggcg gaaccaggct tttgcttgaa tgttccgtca agggatcaeg 840 ggfcaggagce acettafcgag tcagaatacg ctgaaagfcfcc atgatfctaaa tgaagatgcg 900 gaatttgatg agaacggagt tgaggttttt gacgaaaagg ccttagtaga acaggaaccc 968 I •U ã. 1 atttggccga agaggaactg ttatcgcagg gagccacaca gcgtgtgttg 1020 gacgcgactc agctfctacct tggtgagatt ggttatteac cactgttaac ggccgaagaa 1080 gaagtfctatfc ttgcgcgtcg cgcactgcgt ggagatgtcg cctctcgccg ccggatgatc 1140 gagagtaacfc tgcgtctggt ggtaaaaatt gcccgccgtt atggcaafccg tggtctggçg 1200 ttgctggaoc ttatcgaaga gggcaacetg gggctgatcc gcgcggfcaga gaagtttgac 1260 ccggaacgtg gtttccgctt ctcaacatac geaacctggt ggattcgcca gacgatfcgaa 1320 cgggcgatta tgaaccaaae ccgtactatt cgtfctgccga ttcacafccgt aaaggagctg 1380 aacgtfctacc tgcgaaccgc acgtgagttg fccccataagc tggaccatga accaagtgcg 1440 gaagagatcg cagagcaact ggataagcca gttgatgacg tcagccgtat gcttcgtett 1500 aacgagcgca ttacctcggt agacaccccg ctgggtggtg atjtccgaaaa agcgttgcfcg ISSO gac&tectgg ecgatgaaaa agagaacggt ccggaagata ccaegcaaga tgacgatafcg 1620 aagcagagca tcgtcaaatg gctgttcgag ctgaacgcca aacagcgtga agtgctggca 1680 egtcgattcg gtttgcfcggg gfeacgaagcg gcaacactgg aagatgtagg tcgtgaaatt 1740 ggcctcaccc gtgaacgtgt tcgccagatt caggttgaag gcctgcgccg tttgcgcgaa 1800 atectgeaaa cgeaggggcfe gaatatcgaa gcgctgttcc gcgagtaagfc aagcatctgt 1860 cagaaaggcc agtcfccaagc gaggctggcc fctttctgtgc acaataaa&g gtccgatgcc 1920 catcggacct ttttattaag gtcaaattac cgcccatacg caccaggtaa fcfcaagaatec 1980 ggtaaaaceg agaatggtcg fctaacactgt cc 2012 <219> 10 <211> 31

<212> DNA <213> Sequência sintética <220» <221> Primei <222> -(1)..(31} <223 > rpoSatnberl <400> 10 ggccctagta gaataggaae ccagtgataa c 31 <210> 11 <211> 31

<212> DNA <213> Sequência sintética <220» <221> Pxixiox «222» {1} , · {31}

<223» rpoSamberS «400» 11 gteatc&efcg ggfctcctatt etactaaggc e «2X0» 12 «211» 20 «2X2» DÍÍ& í2X3> sequência sintética <25ó» <221» Frisser «222» (1>,.i20> <223» rpoSIcÇi <400» 12 çgga&eeagor ettttgcteg <210> 13 <211» 20 <212» <213» sequentla sintética <220» <231» Frlmer <232» (1)>,{20}

<223» rpoSLCS <490» 13 gegcg&egcg e&aaataaae <210» 14 <2U> 23 <212» m <213» <220» sequência sintética <221» Priíser <222» Çl}* *{23} <223» rpoSss&erC <400» 14 cttagtagaa eagga&eeea gfcg <210» IS <211» 34 «212» <213» : saqueada sintética <220» <221» Friteer <222» U), , ¢34) <223» spoSasftepA <408» 15 gatgagaaog gagttgaggt fctttg&egaa a&gg <218» 16 <211» 31 49 <3it» m «S*3* Sequência sintética «320» § «222» ipjfiasg» «22:2» {ih,a« «223» mfc&sem <40G» 1«

Si 10 gstçstsêw &8fcfc«e$fcts ggmasffcsa § <2K>> 2? <tll> 34 «212» MS, IS *%%%» Sequência sintética «S20»

«Ml» MàStoX «m» m»~mi

20 <222 > K&xM&cX <4m> 17 %4 gmmgttm mxe SS <zm> w <232» 30 «2.12» m «&Ι3> ; sequènda sintética 30 «220» «$S3* 3í'2s8®s· «mo» m < > tm «223» ssrOLCl

M 3S «405» 3.8 ©fc*8fcs©t&« o8sqtqq«&s «220» 38 <m> 2« 48 «312» ΪΜ& <S33> Sequência sintética «220» <221» wximx 4S «222» m.«tm <222» sí«x03C2 S0 ss ια «W» 38 tttasj»*»»* 8K»*SWe«8f <210» 20 «3X1» 20 <112» sm <3M> Sequência sintética * «3M» «221 > ^flrms «sai» <«..«<» «223» $>«rOC «4ÕÕ» 30 e«**cegsrfc« 30

M

50 S <210> <21l> <212» «213» 21 35sm Sequência sintética

XO

<220> <221> Priíaer <222» ¢3.),,(35} «223» serOA <400> 21 gagggggatt tgaacccccg gtagagttgc cccta 35 15 <210» 22 <211> 20 «212» DHA <213s- Sequência sintética 20 <220> <221> Pjritner «232» (1).,(20} <223» glnXl 25 «400» 22 etggcgfcgrtefc gaaacgtcag 20 30 <210> 23 <211» 21 <212> DMA <213> Sequência sintética <220» <221» Pfiaier35 <222» (1Í..Í21) <233» gltiX2 40

<400» 23 cacgctgttc gcaacCtáaC C 21

Lisboa, 2 de Março de 2012

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES Bactérias produtoras de L-treonina da espécie Escherichia coli, as quais são resistentes ao ácido a-amino^-hidroxivalérico, em que as referidas bactérias contêm 1) na região de codificação do gene rpoS um (1) codão de terminação do tipo âmbar e 2) o correspondente supressor de âmbar SupE, em que o codão de terminação do tipo âmbar se encontra dentro da região de codificação do gene rpoS correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS, de acordo com a SEQ ID No. 2. Bactérias produtoras de L-treonina como reivindicado na reivindicação 1, em que estas produzem não mais de 40 % de L-lisina como um produto secundário, em comparação com a quantidade de L-treonina desejada. Bactérias produtoras de L-treonina como reivindicado na reivindicação 2, em que estas produzem não mais de 10 % de L-lisina como um produto secundário, em comparação com a quantidade de L-treonina desejada. Bactérias produtoras de L-treonina como reivindicado na reivindicação 2, em que estas produzem não mais de 5% de L-lisina como um produto secundário, em comparação com a quantidade de L-treonina desejada. Bactérias produtoras de L-treonina como reivindicado nas reivindicações 1-4, em que um ou mais genes escolhidos do grupo dado a seguir são simultaneamente melhorados, em particular sobre-expressados: 2 a) o operão thrABC que codifica a aspartato quinase, homoserina dehidrogenase, homoserina quinase e treonina sintase, b) o gene pyc que codifica a piruvato carboxilase, c) o gene pps que codifica a fosfoenolpiruvato sintase, d) o gene ppc que codifica a fosfoenolpiruvato carboxilase, e) os genes pntA e pntB que codificam a transhidrogenase, f) o gene rhtB que confere resistência à homoserina, g) o gene mqo que codifica a malato: quinona oxiredutase, h) o gene rhtC que confere resistência à treonina, i) o gene thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica a proteína de exportação de treonina, j) o gene gdhA que codifica a glutamato desidrogenase, k) o gene hns que codifica a proteína HLP-II de ligação a DNA, D o gene pgm que codifica a fosfoglucomutase, 3 m) o gene fba que codifica a frutose bifosfato aldolase, η) o gene ptsl no operão ptsHIcrr, que codifica a enzima I no sistema fosfotransferase (PTS), o) o gene ptsH no operão ptsHIcrr, que codifica a proteína fosfohistidina hexose transferase no sistema fosfotransferase (PTS), p) o gene crr no operão ptsHIcrr, que codifica o componente IIA específico de glucose no sistema fosfotransferase (PTS), q) o gene pts que codifica o componente IIBC específico de glucose no sistema fosfotransferase (PTS), r) o gene lrp que codifica o regulador no regulão leucina, s) o gene crsA que codifica o regulador global, t) o gene fadR que codifica o regulador no regulão fad, u) o gene iclR que codifica o regulador no metabolismo intermediário central, v) o gene mopB que codifica o chaperone 10 Kd, que é também conhecido pelo nome de groES, w) o gene ahpC no operão ahpCF, que codifica a subunidade pequena da hidroxiperóxido alquilo redutase, 4 χ) ο gene ahpF no operão ahpCF, que codifica a subunidade grande da hidroxiperóxido de alquilo redutase, y) o gene cysK que codifica a cisteina sintase A, z) o gene cysB que codifica o regulador no regulão cys, aa) o gene cysJ no operão cysJIH, que codifica a flavoproteina na NADPH sulfito redutase, bb) o gene cysH no operão cysJIH, que codifica a adenililsulfato redutase, e cc) o gene cysl no operão cysJIH, que codifica a hemoproteína na NADPH sulfito redutase.
2. 6. Bactérias produtoras de L-treonina como reivindicado nas reivindicações 1-5, em que outros genes são atenuados.
3. 7. Processo para preparar L-treonina ou aditivos alimentares contendo L-treonina que contém os seguintes passos a) fermentação de bactérias da espécie Escherichia coli, que são resistentes ao ácido oc-amino-β-hidroxivalérico e que contêm 1) na região de codificação do gene rpoS correspondente à posição 33 na sequência de aminoácidos da proteína RpoS de acordo com a SEQ ID No. 2 um codão de 5 terminação do tipo âmbar e 2) o correspondente supressor âmbar supE, b) enriquecimento da L-treonina no meio ou nas células dos microrganismos, e c) isolamento da L-treonina, em que opcionalmente os constituintes do caldo de fermentação e/ou da biomassa na integra, ou uma proporção destes (> 0 bis 100), permanecem no produto.
4. 8. Processo como reivindicado na reivindicação 7, em que é usada a estirpe DM1690 de E. coli, depositada como DSM 15189.
5. 9. Estirpe DM1690 de Escherichia coli depositada como DMS 15189 na German Collection of Microrganismos and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Lisboa, 2 de Março de 2012