DE10244581A1 - Aminosäure produzierende Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren - Google Patents
Aminosäure produzierende Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-AminosäurenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Aminosäure produzierende Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia coli, die ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal in der Nukleotidsequenz der Kodierregion des rpoS-Gens enthalten und einen Suppressor für ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber-Suppressor, ochre-Suppressor und opal-Suppressor enthalten. Diese Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, unter Verwendung dieser Bakterien.
Description
- Die Erfindung betrifft Aminosäure produzierende Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia coli, die ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal in der Nukleotidsequenz der Kodierregion des rpoS-Gens enthalten und einen Suppressor für ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber- Suppressor, ochre-Suppressor und opal-Suppressor enthalten. Diese Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren insbesondere L-Threonin, unter Verwendung dieser Bakterien.
- L-Aminosäuren, insbesondere L-Threonin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
- Es ist bekannt, dass L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen der Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie z. B. Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, durch z. B. Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
- Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren.
- Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäuren produzierender Stämme der Familie Enterobacteriaceae eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion untersucht.
- Das rpoS-Gen, das auch unter der Bezeichnung katF-Gen bekannt ist, kodiert für ein Protein, das als σ38- beziehungsweise σS-Faktor, als σ38-Protein oder als σ38- Untereinheit oder auch als RpoS-Protein bezeichnet wird. In der Literatur finden sich auch die - allerdings weniger gebräuchlichen - Bezeichnungen abrD, dpeB, nur, appR, sigS, otsx und snrA für das rpoS-Gen. Der σS-Faktor reguliert als eine Untereinheit der RNA-Polymerase die Expression verschiedenster Gruppen von Genen (Loewen et al.; Canadian Journal of Microbiology 44 (8): 707-717 (1998)), wobei die Regulationsmechanismen häufig unklar sind.
- Angaben zur Nukleotidsequenz des rpoS- bzw. katF-Gens findet man bei Mulvey und Loewen (Nucleic Acids Research 17 (23): 9979-9991 (1989))und bei Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)). Die entsprechenden Angaben findet man auch beim National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) unter den Zugangsnummern (Accession Number) X16400 und AE000358. Der Translationsstart bzw. das Initiationskodon des rpoS-Gens wurde von Loewen et al. (Journal of Bacteriology 175 (7): 2150-2153 (1993)) bestimmt.
- Darüber hinaus sind in Stämmen von Escherichia coli, beispielsweise in Stämmen vom Typ W3110, eine Vielzahl von rpoS-Allelen bekannt (Ivanova et al.; Nucleic Acids Research 20 (20): 5479-5480 (1992) und Jishage und Ishihama; Journal of Bacteriology 179 (3): 959-963 (1997)).
- In WO 01/05939 wird gezeigt, dass nach vollständiger Ausschaltung des σ38-Faktors durch Einbau einer Deletion in das rpoS-Gen eines L-Glutaminsäure-Produzenten die Glutaminsäure-Produktion verbessert wird.
- Nagano et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 64 (9): 2012-2017 (2000)) berichten von einem Escherichia coli W3110-Stamm und der L-Lysin produzierenden Mutante W196, die beide ein rpoS-Allel enthalten, welches an der Stelle entsprechend Position 33 der Aminosäuresequenz des σ38 Proteins ein amber Stopkodon (TAG) enthält. Der Stamm W196 enthält darüber hinaus eine Mutation in dem für eine L- Serin-t-RNA kodierenden serU-Gen, das als supD bezeichnet wird.
- Beschreibung der Erfindung
- Wenn im Folgenden Aminosäuren oder L-Aminosäuren erwähnt werden sind damit sämtliche proteinogenen Aminosäuren mit Ausnahme des L-Lysins gemeint. Insbesondere sind damit L- Threonin, L-Isoleucin, L-Homoserin, L-Methionin, L- Glutaminsäure, L-Valin und L-Tryptophan gemeint, wobei L- Threonin bevorzugt wird. Unter "proteinogenen Aminosäuren" versteht man solche Aminosäuren die Bestandteile von Proteinen sind.
- Gegenstand der Erfindung sind Aminosäure insbesondere L- Threonin produzierende Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia coli, die ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal in der Nukleotidsequenz der Kodierregion des rpoS- Gens enthalten und einen Suppressor für ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber-Suppressor, ochre- Suppressor und opal-Suppressor enthalten.
- Die Bakterien die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, gegebenenfalls Stärke, gegebenenfalls Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia, Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden bevorzugt. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.
- Die L-Aminosäure produzierenden Bakterien die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können neben der gewünschten L-Aminosäure als Nebenprodukt unter anderem gegebenenfalls L-Lysin produzieren. Die erfindungsgemäßen Bakterien produzieren höchstens 0 bis 40% oder 0 bis 20%, vorzugsweise höchstens 0 bis 10%, besonders bevorzugt höchstens 0 bis 5% L-Lysin verglichen mit der Menge der gewünschten L-Aminosäure.
- L-Threonin produzierende Stämme aus der Familie der Enterobacteriaceae besitzen bevorzugt, unter anderen, ein oder mehrere der genetischen bzw. phänotypischen Merkmale ausgewählt aus der Gruppe: Resistenz gegen α-Amino-β- Hydroxyvaleriansäure, Resistenz gegen Thialysin, Resistenz gegen Ethionin, Resistenz gegen α-Methylserin, Resistenz gegen Diaminobernsteinsäure, Resistenz gegen α- Aminobuttersäure, Resistenz gegen Borrelidin, Resistenz gegen Rifampicin, Resistenz gegen Valin-Analoga wie beispielsweise Valinhydroxamat, Resistenz gegen Purinanaloga wie beispielsweise 6-Dimethylaminopurin, Bedürftigkeit für L-Methionin, gegebenenfalls partielle und kompensierbare Bedürftigkeit für L-Isoleucin, Bedürftigkeit für meso-Diaminopimelinsäure, Auxotrophie bezüglich Threonin-haltiger Dipeptide, Resistenz gegen L-Threonin, Resistenz gegen L-Homoserin, Resistenz gegen L-Lysin, Resistenz gegen L-Methionin, Resistenz gegen L- Glutaminsäure, Resistenz gegen L-Aspartat, Resistenz gegen L-Leucin, Resistenz gegen L-Phenylalanin, Resistenz gegen L-Serin, Resistenz gegen L-Cystein, Resistenz gegen L- Valin, Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyruvat, defekte Threonin-Dehydrogenase, gegebenenfalls Fähigkeit zur Saccharose-Verwertung, Verstärkung des Threonin-Operons, Verstärkung der Homoserin-Dehydrogenase T-Aspartatkinase I bevorzugt der feed back resistenten Form, Verstärkung der Homoserinkinase, Verstärkung der Threoninsynthase, Verstärkung der Aspartatkinase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Aspartatsemialdehyd- Dehydrogenase, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat- Carboxylase, gegebenenfalls der feed back resistenten Form, Verstärkung der Phosphoenolpyruvat-Synthase, Verstärkung der Transhydrogenase, Verstärkung des RhtB-Genproduktes, Verstärkung des RhtC-Genproduktes, Verstärkung des YfiK- Genproduktes, Verstärkung einer Pyruvat-Carboxylase, und Abschwächung der Essigsäurebildung.
- Unter einem Stopkodon vom Typ amber versteht man ein Stopkodon mit der Basenfolge TAG auf dem kodierenden Strang in einem DNA-Molekül entsprechend UAG auf der von diesem DNA-Molekül abgelesenen m-RNA.
- Unter einem Stopkodon vom Typ ochre versteht man ein Stopkodon mit der Basenfolge TAA auf dem kodierenden Strang in einem DNA-Molekül entsprechend UAA auf der von diesem DNA-Molekül abgelesenen m-RNA.
- Unter einem Stopkodon vom Typ opal versteht man ein Stopkodon mit der Basenfolge TGA auf dem kodierenden Strang in einem DNA-Molekül entsprechend UGA auf der von diesem DNA-Molekül abgelesenen m-RNA.
- Die genannten Stopkodone werden auch als Unsinn-Mutationen (nonsense mutations) bezeichnet (Edward A. Birge: Bacterial and Bacteriophage Genetics (Third Edition), Springer Verlag, Berlin, Deutschland, 1994).
- Die Nukleotidsequenz des rpoS-Gens kann dem Stand der Technik entnommen werden. Die Nukleotidsequenz des rpoS- Gens entsprechend der Accession No. AE000358 ist als SEQ ID NO. 1 dargestellt. Die Aminosäuresequenz des dazugehörigen RpoS-Genproduktes bzw. Proteins ist in der SEQ ID NO. 2 dargestellt.
- Die Nukleotidsequenz eines rpoS-Allels, das ein Stopkodon vom Typ amber an der Stelle der Nukleotidsequenz entsprechend Position 33 der Aminosäuresequenz des RpoS- Genproduktes bzw. Proteins, entsprechend SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID NO. 2, enthält, ist in SEQ ID NO. 3 wiedergegeben.
- Die Konzentration an σ38-Faktor kann durch quantitative "Western blot"-Methodik so wie bei Jishage und Ishima (Journal of Bacteriology 177 (23): 6832-6835 (1995)), Jishage et al. (Journal of Bacteriology 178 (18): 5447-5451 (1996)) und Jishage und Ishima (Journal of Bacteriology 179 (3): 959-963 (1997)) bestimmt werden.
- Unter Suppression versteht man allgemein den Effekt, dass durch eine Mutation in einem "zweiten" Gen die Auswirkung der Mutation in einem "ersten" Gen kompensiert bzw. supprimiert wird. Das mutierte Zweitgen bzw. die Zweitmutation wird im allgemeinen als Suppressor oder Suppressorgen bezeichnet.
- Ein Spezialfall von Suppressoren betrifft Allele von t-RNA- Genen, die für abnormale t-RNA Moleküle kodieren, welche Stopkodons erkennen können, so dass es bei der Translation anstatt eines Kettenabbruchs zum Einbau einer Aminosäure kommt. Weitergehende Erläuterungen zur Suppression kann man Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise dem Lehrbuch von Rolf Knippers "Molekulare Genetik" (6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem Lehrbuch von Ernst-L. Winnacker "Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie" (Dritter, veränderter Nachdruck, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem Lehrbuch von F. C. Neidhard (Ed.) "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" (2nd Edition, ASM Press, Washington, D. C., USA, 1996) entnehmen.
- Aus dem Stand der Technik sind unter anderem die in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Suppressor t-RNA Gene bzw. Allele bzw. t-RNA-Suppressoren bekannt, die Stopkodons vom Typ amber, ochre oder opal supprimieren können und entsprechend als amber-Suppressoren, ochre- Suppressoren oder opal-Suppressoren bezeichnet werden. Die Bezeichnungen für die jeweiligen Gene bzw. Allele und Suppressoren wurden den angegebenen Referenzen entnommen. Tabelle 1 Liste der amber-Suppressoren
Referenzen (Ref.) zu Tabelle 1 1) Neidhard (Ed.) "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" (2 nd. Edition, ASM Press, Washington, D. C., USA, 1996)
2) Martin et al, RNA 2 (9): 919-927, 1996
3) Normanly et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 83 (17): 6548-6552, 1986
4) Accession Number K01197
5) Yarus et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 77 (9): 5092-5096, 1990
6) McClain et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 87 (23): 9260-9264, 1990
7) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984
8) Raftery et al, Journal of Molecular Biology 190 (3): 513-517, 1986
9) Komatsoulis und Abelson, Biochemistry 32 (29): 7435-7444, 1993
10) Martin et al, Nucleic Acids Research 23 (5): 779-784, 1995
11) Normanly et al, Journal of Molecular Biology 213 (4): 719-726, 1990
12) McClain und Foss, Journal of Molecular Biology, 202 (4): 697-709, 1988 Tabelle 2 Liste der ochre-Suppressoren
Referenzen (Ref.) zu Tabelle 2 1) Neidhard (Ed.) "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" (2 nd. Edition, ASM Press, Washington, D. C., USA, 1996)
2) Raftery und Yarus, EMBO Journal 6 (5): 1499-1506, 1987
3) Accession number K01197
4) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984
5) Raftery et al, Journal of Molecular Biology 190 (3): 513-517, 1986 Tabelle 3 Liste der opal-Suppressoren
Referenzen (Ref.) zu Tabelle 3 1) Neidhard (Ed.) "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology" (2 nd. Edition, ASM Press, Washington, D. C., USA, 1996)
2) Schön et al, Nucleic Acids Research 17 (18): 7159-7165, 1989
3) Weygand-Durasevic et al, Journal of Molecular Biology 240 (2): 111-118, 1994
4) Raftery et al, Journal of Bacteriology 158 (3): 849-859, 1984
5) McClain et al, Proceedings of the National Academy of Science USA, 87 (23): 9260-9264, 1990 - In einem ersten Aspekt der Erfindung wurde gefunden, dass Aminosäure insbesondere L-Threonin produzierende Bakterien der Art Escherichia coli, die ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal in der Kodierregion des rpoS-Gens, insbesondere innerhalb des Bereiches entsprechend Position 2 bis 314 der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins gemäß SEQ ID No. 1 bzw. 2, tragen, in ihrer Leistungsfähigkeit Aminosäure zu produzieren weiter verbessert werden, wenn eine Suppressor t-RNA ausgewählt aus der Gruppe amber-Suppressor, ochre-Suppressor und opal- Suppressor in sie eingebaut wird.
- Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen wird die Aktivität oder Konzentration des RpoS-Proteins bzw. σ38-Faktors im allgemeinen auf > 0 bis 75%, beispielsweise 1 bis 75%, auf > 0 bis 50%, beispielsweise 0,5 bis 50%, auf > 0 bis 25% beispielsweise 0,25 bis 25%, auf > 0 bis 10%, beispielsweise 0,1 bis 10%, oder auf > 0 bis 5%, beispielsweise 0,05 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
- Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Verringerung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration des RpoS-Proteins bzw. σ38-Faktors in Aminosäure produzierenden Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, dass in diese Bakterien 1.) ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal in die Kodierregion des rpoS-Gens, insbesondere innerhalb des Bereiches entsprechend Position 2 bis 314 der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins gemäß SEQ ID No. 1 bzw. 2 eingebaut, und dass 2.) ein Suppressor t-RNA-Gen bzw. Allel in diese Bakterien eingebaut wird, das für eine Suppressor t-RNA ausgewählt aus der Gruppe amber- Suppressor, ochre-Suppressor und opal-Suppressor, kodiert.
- Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäure produzierenden Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, dass in diese Bakterien 1.) ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal in die Kodierregion des rpoS-Gens, insbesondere innerhalb des Bereiches entsprechend Position 2 bis 314 der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins gemäß SEQ ID No. 1 bzw. 2 eingebaut, und dass 2.) ein Suppressor t- RNA-Gen bzw. Allel in diese Bakterien eingebaut wird, das für eine Suppressor t-RNA ausgewählt aus der Gruppe amber- Suppressor, ochre-Suppressor und opal-Suppressor, kodiert.
- Gegenstand der Erfindung sind schließlich Aminosäure produzierende Bakterien der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia coli, die ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal in der Kodierregion des rpoS-Gens, insbesondere innerhalb des Bereiches entsprechend Position 2 bis 314 der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins gemäß SEQ ID No. 1 bzw. 2 enthalten, und die ein Suppressor t-RNA-Gen bzw. Allel enthalten, das für eine Suppressor t-RNA ausgewählt aus der Gruppe amber-Suppressor, ochre-Suppressor und opal- Suppressor kodiert.
- Bezüglich der Kodierregion des rpoS-Gens haben sich folgende Segmente als besonders vorteilhaft für den Einbau eines Stopkodons ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal, bevorzugt amber, erwiesen:
- - Segment der Kodierregion zwischen den Positionen 2 und 95, beispielsweise Position 33, entsprechend der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins, dargestellt in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2,
- - Segment der Kodierregion zwischen den Positionen 99 und 168, beispielsweise Position 148, entsprechend der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins, dargestellt SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID NO. 2,
- - Segment der Kodierregion zwischen den Positionen 190 und 245, entsprechend der Aminosäuresequenz des RpoS- Proteins, dargestellt in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2,
- - Segment der Kodierregion zwischen den Positionen 266 und 281, beispielsweise Position 270, entsprechend der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins, dargestellt in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID No. 2, und
- - Segment der Kodierregion zwischen den Positionen 287 und 314, beispielsweise Position 304, entsprechend der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins dargestellt in SEQ ID No. 1 bzw. SEQ ID NO. 2.
- In den Fällen in denen die Kodierregion des rpoS-Gens ein Stopkodon vom Typ amber besitzt, wird vorzugsweise ein amber-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe von Tabelle 1 verwendet.
- In den Fällen in denen die Kodierregion des rpoS-Gens ein Stopkodon vom Typ ochre besitzt, wird vorzugsweise ein ochre-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe von Tabelle 2 verwendet.
- In den Fällen in denen die Kodierregion des rpoS-Gens ein Stopkodon vom Typ opal besitzt, wird vorzugsweise ein opal- Suppressor ausgewählt aus der Gruppe von Tabelle 3 verwendet.
- Besonders bevorzugt werden solche Aminosäure produzierende Bakterien der Art Escherichia coli, die ein Stopkodon vom Typ amber an der Stelle der Nukleotidsequenz entsprechend der Position 33 der Aminosäuresequenz des RpoS-Genproduktes gemäß SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID NO. 2 und vorzugsweise einen amber-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe von Tabelle 1, insbesondere den Suppressor supE oder den Suppressor supD, besitzen und nicht mehr als 10% L-Lysin verglichen mit der Menge der gewünschten L-Aminosäure produzieren.
- Je nach verwendetem Suppressor bilden die Bakterien ein RpoS-Genprodukt bzw. σ38-Faktor, das/der an Position 33 der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 anstelle des L- Glutamin eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe L-Serin, L-Tyrosin, L-Leucin, L-Tryptophan, L-Lysin, L-Alanin, L- Arginin, L-Phenylalanin, L-Cystein, L-Prolin, L-Histidin, L-Threonin und L-Valin enthält. So wird beispielsweise bei der Verwendung des Suppressors supD L-Serin anstelle des L- Glutamin eingebaut. Bei Verwendung von Suppressoren, die die Aminosäure L-Glutamin in die Position 33 des RpoS- Genproduktes bzw. σ38-Faktors einbauen, wie beispielsweise supE, wird die Aminosäuresequenz nicht verändert.
- Ganz besonders bevorzugt werden L-Threonin produzierende Bakterien der Art Escherichia coli, die das rpoS-Allel dargestellt in SEQ ID NO. 3 und den Suppressor supE dargestellt in SEQ ID NO. 4 besitzen.
- Gegenstand der Erfindung ist weiterhin - diesem ersten Aspekt der Erfindung entsprechend - ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren oder Aminosäuren enthaltenden Futtermitteladditiven bei dem man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von Enterobacteriaceae, die ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal, bevorzugt amber, in der Kodierregion des rpoS-Gens, insbesondere innerhalb des Bereiches entsprechend Position 2 bis 314 der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins gemäß SEQ ID NO. 1 bzw. 2 und ein Suppressor t-RNA-Gen ausgewählt aus der Gruppe amber-Suppressor, ochre- Suppressor und opal-Suppressor tragen, in einem geeignetem Medium,
- b) Anreicherung der Aminosäure in der Fermentationsbrühe,
- c) Isolierung der Aminosäure oder Aminosäure enthaltenden Futtermitteladditivs aus der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls mit
- d) Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (≥ 0 bis 100%).
- Bevorzugt wird ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren oder Aminosäure enthaltenden Futtermitteladditiven bei dem man Enterobacteriaceae, die ein Stopkodon vom Typ amber in der Kodierregion des rpoS- Gens entsprechend Position 33 der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins gemäß SEQ ID NO. 1 bzw. 2 und einen amber- Suppressor, bevorzugt supE, enthalten, in einem geeignetem Medium fermentiert.
- Die erfindungsgemäßen Futtermitteladditive können in flüssiger sowie fester Form weiterverarbeitet werden.
- Mutationen, durch die ein Stopkodon im Leserahmen des rpoS- Gens eingefügt wird, können durch klassische Mutageneseverfahren unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder ultraviolettes Licht direkt im interessierenden Wirt erzeugt werden. Weiterhin können für die Mutagenese in vitro Methoden unter Verwendung von isolierter rpoS-DNA wie beispielsweise eine Behandlung mit Hydroxylamin (J. H. Miller: A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) eingesetzt werden. Schließlich können Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese unter Verwendung mutagener Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) oder der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wie sie im Handbuch von Newton und Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994) beschrieben sind, verwendet werden. Die erzeugten Mutationen können durch DNA- Sequenzierung beispielsweise nach der Methode von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Science USA 74 (12): 5463-5467 (1977)) bestimmt und überprüft werden.
- Geeignete Mutationen können durch Gen- beziehungsweise Allelaustausch in gewünschte Stämme eingebaut werden. Eine gebräuchliche Methode ist die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171 (9): 4617-4622 (1989)) beschriebene Methode des Genaustauschs mit Hilfe eines konditional replizierenden pSC101-Derivates pMAK705. Andere im Stand der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181 (22): 7143-7148 (1999)) oder die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182 (3): 842-847 (2000)) können gleichfalls benutzt werden.
- Es ist ebenfalls möglich, Mutationen durch Konjugation oder Transduktion in gewünschte Stämme zu überführen.
- Schließlich ist es möglich aus dem Stand der Technik bekannte Allele des rpoS-Gens, die ein Stopkodon im Leserahmen besitzen, zu verwenden und mit den oben beschriebenen Methoden in die gewünschten Stämme einzuführen.
- Zur Erzeugung von Suppressormutationen in t-RNA-Genen können im Grunde die gleichen Methoden, wie für das rpoS- Gen beschrieben, verwendet werden. Methoden der Oligonukleotidtechnik, wie sie beispielsweise von Khorana (Science 203 (4381): 614-625 (1979)) eingesetzt wurden, können ebenfalls verwendet werden. Weiterhin können insbesondere die im Stand der Technik beschriebenen t-RNA Suppressorgene eingesetzt werden.
- Methoden zur Suche, Charakterisierung und Bestimmung der Effizienz von t-RNA-Suppressoren sind im Stand der Technik beispielsweise bei Miller und Albertini (Journal of Molecular Biology 164 (1): 59-71 (1983)), bei McClain und Foss (Journal of Molecular Biology 202 (4): 697-709 (1988)), bei Normanly et al. (Journal of Molecular Biology 213 (4): 719-726 (1990)), bei Kleina et al. (Journal of Molecular Biology 213: 705-717 (1990)), bei Lesley et al. (Promega Notes Magazine 46, p. 02. (1994)) und bei Martin et al. (Nucleic Acids Research 23 (5): 779-784 (1995)) beschrieben.
- Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft die Variante des RpoS-Proteins dargestellt in SEQ ID NO. 6. Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung gelang es die Kodierregion dieser Variante des RpoS-Proteins zu identifizieren. Diese ist in der SEQ ID NO. 5 dargestellt.
- Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend Enterobacteriaceae, insbesondere solche die Aminosäuren produzieren, die das RpoS-Protein dargestellt in SEQ ID NO. 6 enthalten bzw. bilden. Es ist ebenfalls bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme das N-terminale Methionin in gebildeten Proteinen abgespalten werden kann.
- Gegenstand der Erfindung ist weiterhin - diesem zweiten Aspekt der Erfindung entsprechend - ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren oder Aminosäure enthaltenden Futtermitteladditiven bei dem man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von Enterobacteriaceae, die ein RpoS- Protein mit der Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO. 6 enthalten bzw. bilden,
- b) Anreicherung der Aminosäure in der Fermentationsbrühe,
- c) Isolierung der Aminosäure oder des Aminosäure enthaltenden Futtermitteladditivs aus der Fermentationsbrühe, gegebenenfalls mit
- d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (≥ 0 bis 100%).
- Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin mit Bakterien der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zum Einbau eines Stopkodons in die Kodierregion des rpoS-Gens und eines Suppressors für ein Stopkodon oder zusätzlich zur Expression der Variante des RpoS-Proteins dargestellt in SEQ ID NO. 6 ein oder mehrere Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzym(e) des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme für die Produktion von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat oder Enzyme der Glykolyse oder PTS-Enzyme oder Enzyme des Schwefelstoffwechsels zu verstärken.
- Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt. Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.
- Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
- So können beispielsweise gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Aspartatkinase, die Homoserin-Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon (US-A-4,278,765),
- - das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609),
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase kodierende pps- Gen (Molecular and General Genetics 231 (2): 332-336 (1992)),
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase kodierende ppc-Gen (Gene 31: 279-283 (1984)),
- - die für die Transhydrogenase kodierenden Gene pntA und pntB (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986))
- - das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB (EP-A-0 994 190),
- - das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase kodierende mqo- Gen (DE 100 34 833.5),
- - das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC (EP-A-1 013 765),
- - das für das Threonin-Exportprotein kodierende thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum (DE 100 26 494.8),
- - das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende gdhA-Gen (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
- - das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende hns-Gen (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)),
- - das für die Phosphoglucomutase kodierende pgm-Gen (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)),
- - das für die Fructose Biphosphat Aldolase kodierende fba- Gen (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)),
- - das für das Enzym I des Phosphotransferase-Systems (PTS) kodierende ptsI-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- - das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose- Phosphotransferase des Phosphotransferase-Systems (PTS) kodierende ptsH-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- - das für die Glucose-spezifische IIA Komponente des Phosphotransferase-Systems (PTS) kodierende crr-Gen des ptsHIcrr-Operons (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- - das für die Glucose-spezifische IIBC Komponente des Phosphotransferase-Systems (PTS) kodierende ptsG-Gen (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986))
- - das für den Regulator des Leucin-Regulons kodierende lrp-Gen (Journal of Biological Chemistry 266: 10768-10774 (1991)),
- - das für den globalen Regulator kodierende csrA-Gen (Journal of Bacteriology 175: 4744-4755 (1993)),
- - das für den Regulator des fad-Regulons kodierende fadR- Gen (Nucleic Acids Research 16: 7995-8009 (1988)),
- - das für den Regulator des zentralen Intermediärstoffwechsels kodierende iclR-Gen (Journal of Bacteriology 172: 2642-2649 (1990)),
- - das für das 10 Kd Chaperon kodierende mopB-Gen (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-12419 (1986)), das auch unter der Bezeichnung groES bekannt ist,
- - das für die kleine Untereinheit der Alkyl Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpC-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995))
- - das für die große Untereinheit der Alkyl Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpF-Gen des ahpCF-Operons (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7617-7621 (1995))
- - das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK-Gen (Journal of Bacteriology 170: 3150-3157 (1988))
- - das für den Regulator des cys-Regulons kodierende cysB- Gen (Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987)),
- - das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase kodierende cysJ-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- - das für die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende cysH-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)), und
- - das für das Hämoprotein der NADPH-Sulfit-Reduktase kodierende cysI-Gen des cysJIH-Operons (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989))
- Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin mit Bakterien der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zum Einbau eines Stopkodons in die Kodierregion des rpoS-Gens und eines Suppressors für ein Stopkodon, oder zusätzlich zur Expression der Variante des RpoS-Proteins dargestellt in SEQ ID NO. 6 eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Threonin-Dehydrogenase kodierende tdh-Gen (Ravnikar und Somerville; Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
- - das für die Malat-Dehydrogenase (E. C. 1.1.1.37) kodierende mdh-Gen (Vogel et al.; Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
- - das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) yjfA (Accession Number AAC77180 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
- - das Genprodukt des offenen Leserahmens (orf) ytfP (Accession Number AAC77179 des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)),
- - das für das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pckA-Gen (Medina et al.; Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990)),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan; Nucleic Acids Research 14 (13): 5449-5460 (1986)),
- - das für das Enzym Isocitrat-Lyase kodierende aceA-Gen (Matsuoko und McFadden; Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)),
- - das für den DgsA-Regulator des Phosphotransferase- Systems kodierende dgsA-Gen (Hosono et al.; Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-261 (1995)), das auch unter der Bezeichnung mlc-Gen bekannt ist, und
- - das für den Fructose-Repressor kodierende fruR-Gen (Jahreis et al.; Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)), das auch unter der Bezeichnung cra-Gen bekannt ist,
- Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein) oder Gen inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
- Durch die Maßnahmen der Abschwächung einschließlich der Verringerung der Expression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
- Es wurde weiterhin festgestellt, dass bei den oben genannten Gene tdh, mdh, pckA, poxB, aceA, dgsA und fruR und den offenen Leserahmen (ORF) yjfA und ytfr dadurch eine Abschwächung erreicht werden kann, dass ein Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und opal in die Kodierregion dieser Gene eingebaut wird und gleichzeitig ein Suppressor für das entsprechende Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber-Suppressor, ochre-Suppressor und opal- Suppressor verwendet wird. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung des Stopkodons vom Typ amber und des amber-Suppressors supE erwiesen.
- Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen können im batch- Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
- Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
- Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und gegebenenfalls Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
- Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25 W bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L- Aminosäuren gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
- Die Analyse von Aminosäuren kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.
- Folgender Mikroorganismus wurde als Reinkultur am 09. September 2002 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Escherichia coli Stamm DM1690 als DSM 15189.
- Der Stamm DSM 15189 enthält ein Stopkodon vom Typ amber an der Stelle entsprechend Position 33 der Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins, einen amber-Suppressor und produziert Threonin. SEQUENCE LISTING
Claims (28)
1. Aminosäure produzierende Bakterien der Familie
Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia
coli, dadurch gekennzeichnet, dass diese innerhalb der
Kodierregion des rpoS-Gens mindestens ein (1)
Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und
opal enthalten und mindestens einen (1) Suppressor
ausgewählt aus der Gruppe amber-Suppressor, ochre-
Suppressor und opal-Suppressor enthalten.
2. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass diese innerhalb der
Kodierregion des rpoS-Gens mindestens ein (1)
Stopkodon vom Typ amber enthalten und mindestens einen
(1) amber-Suppressor enthalten.
3. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, dass das Stopkodon vom Typ
amber innerhalb der Kodierregion des rpoS-Gens
entsprechend Positionen 2 bis 314 der
Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins, gemäß SEQ ID No.
2, liegt.
4. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, dass das Stopkodon vom Typ
amber innerhalb der Kodierregion des rpoS-Gens
entsprechend Positionen 2 bis 95 der Aminosäuresequenz
des RpoS-Proteins, gemäß SEQ ID No. 2, liegt.
5. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, dass das Stopkodon vom Typ
amber innerhalb der Kodierregion des rpoS-Gens
entsprechend der Position 33 der Aminosäuresequenz des
RpoS-Proteins, gemäß SEQ ID No. 2, liegt.
6. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien mindestens
einen (1) amber-Suppressor ausgewählt aus der Gruppe
supD und supE enthalten.
7. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien mindestens
den amber-Suppressor supE enthalten.
8. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass sie nicht mehr als 40% L-
Lysin als Nebenprodukt, verglichen mit der Menge der
gewünschten L-Aminosäure, produzieren.
9. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, dass sie nicht mehr als 10% L-
Lysin als Nebenprodukt, verglichen mit der Menge der
gewünschten L-Aminosäure, produzieren.
10. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, dass sie nicht mehr als 5% L-
Lysin als Nebenprodukt, verglichen mit der Menge der
gewünschten L-Aminosäure, produzieren.
11. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der
Aminosäure um eine Aminosäure ausgewählt aus der
Gruppe L-Threonin, L-Isoleucin, L-Homoserin, L-
Methionin, L-Glutaminsäure, L-Valin und L-Tryptophan
handelt.
12. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der
Aminosäure um L-Threonin handelt.
13. L-Threonin produzierende Bakterien der Familie
Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia
coli, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Stopkodon
vom Typ amber innerhalb der Kodierregion des rpoS-Gens
entsprechend der Position 33 der Aminosäuresequenz des
RpoS-Proteins, gemäß SEQ ID No. 2, und den amber-
Suppressor supE enthalten.
14. L-Threonin produzierende Bakterien gemäß Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
1. 14.1 das für die Aspartatkinase, die Homoserin-
Dehydrogenase, die Homoserinkinase und die
Threoninsynthase kodierende thrABC-Operon,
2. 14.2 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-
Gen,
3. 14.3 das für die Phosphoenolpyruvat-Synthase
kodierende pps-Gen,
4. 14.4 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase
kodierende ppc-Gen,
5. 14.5 die für die Transhydrogenase kodierenden Gene
pntA und pntB,
6. 14.6 das Homoserinresistenz vermittelnde Gen rhtB,
7. 14.7 das für die Malat:Chinon Oxidoreduktase
kodierende mqo-Gen,
8. 14.8 das Threoninresistenz vermittelnde Gen rhtC,
9. 14.9 das für das Threonin-Exportprotein kodierende
thrE-Gen von Corynebacterium glutamicum,
10. 14.10 das für die Glutamat-Dehydrogenase kodierende
gdhA-Gen,
11. 14.11 das für das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierende
hns-Gen,
12. 14.12 das für die Phosphoglucomutase kodierende pgm-
Gen,
13. 14.13 das für die Fructose Biphosphat Aldolase
kodierende fba-Gen,
14. 14.14 das für das Enzym I des Phosphotransferase-
Systems (PTS) kodierende ptsI-Gen des ptsHIcrr-
Operons,
15. 14.15 das für die Phosphohistidin-Protein-Hexose-
Phosphotransferase des Phosphotransferase-
Systems (PTS) kodierende ptsH-Gen des ptsHIcrr-
Operons,
16. 14.16 das für die Glucose-spezifische IIA Komponente
des Phosphotransferase-Systems (PTS) kodierende
crr-Gen des ptsHIcrr-Operons,
17. 14.17 das für die Glucose-spezifische IIBC Komponente
des Phosphotransferase-Systems (PTS) kodierende
ptsG-Gen,
18. 14.18 das für den Regulator des Leucin-Regulons
kodierende lrp-Gen,
19. 14.19 das für den globalen Regulator kodierende csrA-
Gen,
20. 14.20 das für den Regulator des fad-Regulons
kodierende fadR-Gen,
21. 14.21 das für den Regulator des zentralen
Intermediärstoffwechsels kodierende iclR-Gen,
22. 14.22 das für das 10 Kd Chaperon kodierende mopB-Gen,
das auch unter der Bezeichnung groES bekannt
ist,
23. 14.23 das für die kleine Untereinheit der Alkyl
Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpc-Gen des
ahpCF-Operons,
24. 14.24 das für die große Untereinheit der Alkyl
Hydroperoxid Reduktase kodierende ahpF-Gen des
ahpCF-Operons,
25. 14.25 das für die Cystein-Synthase A kodierende cysK-
Gen,
26. 14.26 das für den Regulator des cys-Regulons
kodierende cysB-Gen,
27. 14.27 das für das Flavoprotein der NADPH-Sulfit-
Reduktase kodierende cysJ-Gen des cysJIH-
Operons,
28. 14.28 das für die Adenylylsulfat-Reduktase kodierende
cysH-Gen des cysJIH-Operons, und
29. 14.29 das für das Hämoprotein der NADPH-Sulfit-
Reduktase kodierende cysI-Gen des cysJIH-
Operons,
15. Aminosäure produzierende Bakterien gemäß Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, dass weitere Gene abgeschwächt
werden.
16. Verfahren zur Verringerung der intrazellulären
Aktivität des RpoS-Proteins in Bakterien der Familie
Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia
coli, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein (1)
Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre und
opal in die Kodierregion des rpoS-Gens und dass
mindestens ein (1) Suppressor ausgewählt aus der
Gruppe amber-Suppressor, ochre-Suppressor und opal-
Suppressor eingebaut werden.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
dass die Aktivität oder Konzentration des RpoS-
Proteins bzw. σ38-Faktors auf > 0 bis 75% herabgesenkt
wird.
18. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
dass die Aktivität oder Konzentration des RpoS-
Proteins bzw. σ38-Faktors auf > 0 bis 5% herabgesenkt
wird.
19. Aminosäure produzierende Bakterien der Familie
Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia
coli, die ein RpoS-Protein bilden, dass an Position 33
der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 eine
Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe L-Serin, L-
Tyrosin, L-Leucin, L-Tryptophan, L-Lysin, L-Alanin, L-
Arginin, L-Phenylalanin, L-Cystein, L-Prolin, L-
Histidin, L-Threonin und L-Valin enthält, wobei die
Bakterien eine oder mehrere der Aminosäuren ausgewählt
aus der Gruppe L-Threonin, L-Isoleucin, L-Homoserin,
L-Methionin, L-Glutaminsäure, L-Valin und L-Tryptophan
produzieren.
20. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, das
folgende Schritte enthält
a) Fermentation von Bakterien der Familie
Enterobacteriaceae, insbesondere der Art
Escherichia coli, wobei die Bakterien innerhalb
der Kodierregion des rpoS-Gens mindestens ein (1)
Stopkodon ausgewählt aus der Gruppe amber, ochre
und opal besitzen und wobei die Bakterien
mindestens einen (1) Suppressor ausgewählt aus der
Gruppe amber-Suppressor, ochre-Suppressor und
opal-Suppressor besitzen,
b) Anreicherung des Aminosäure im Medium oder in den
Zellen der Mikroorganismen, und
c) Isolierung der Aminosäure, wobei gegebenenfalls
Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die
Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0
bis 100) davon im Produkt verbleiben.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,
dass es sich bei der Aminosäure um eine Aminosäure
ausgewählt aus der Gruppe ausgewählt aus der Gruppe L-
Threonin, L-Isoleucin, L-Homoserin, L-Methionin, L-
Glutaminsäure, L-Valin und L-Tryptophan handelt.
22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet,
dass es sich bei der Aminosäure um L-Threonin handelt.
23. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, das folgende
Schritte enthält
a) Fermentation von Bakterien der Familie
Enterobacteriaceae, insbesondere der Art
Escherichia coli, wobei die Bakterien innerhalb
der Kodierregion des rpoS-Gens entsprechend der
Position 33 der Aminosäuresequenz des RpoS-
Proteins, gemäß SEQ ID NO. 2 mindestens ein (1)
Stopkodon vom Typ amber besitzen und wobei die
Bakterien mindestens den amber-Suppressor supE
besitzen,
b) Anreicherung des L-Threonins im Medium oder in den
Zellen der Mikroorganismen, und
c) Isolierung des L-Threonins, wobei gegebenenfalls
Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder die
Biomasse in ihrer Gesamtheit oder Anteilen (≥ 0
bis 100) davon im Produkt verbleiben.
24. Aminosäure produzierende Bakterien der Familie
Enterobacteriaceae, insbesondere der Art Escherichia
coli, die das RpoS-Proteins dargestellt in SEQ ID NO.
6 enthalten bzw. bilden.
25. Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren oder
Aminosäure enthaltenden Futtermitteladditiven bei dem
man folgende Schritte durchführt:
a) Fermentation von Enterobacteriaceae, die ein RpoS-
Protein mit der Aminosäuresequenz dargestellt in
SEQ ID NO. 6 enthalten bzw. bilden,
b) Anreicherung der Aminosäure in der
Fermentationsbrühe,
c) Isolierung der Aminosäure oder des Aminosäure
enthaltenden Futtermitteladditivs aus der
Fermentationsbrühe, gegebenenfalls mit
d) mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe
und/oder der Biomasse (≥ 0 bis 100%).
26. Escherichia coli Stamm DM1690 hinterlegt als DSM 15189
bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland).
27. Escherichia coli Stamm DM1690 gemäß Anspruch 26,
dadurch gekennzeichnet, dass er ein Stopkodon vom Typ
amber an der Stelle entsprechend Position 33 der
Aminosäuresequenz des RpoS-Proteins, enthält.
28. Escherichia coli Stamm DM1690 gemäß Anspruch 27,
dadurch gekennzeichnet, dass er einen amber-Suppressor
enthält und Threonin produziert.
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