PT1478667E - Anticorpos monoclonais anti-tenascina humana - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-TENASCINA HUMANA" A presente invenção diz respeito a anticorpos monoclonais anti-tenascina humana, a métodos e materiais para os obter, à utilização dos referidos anticorpos para a preparação de meios de diagnóstico e de medicamentos, respectivamente para o diagnóstico e para o tratamento de tumores em que tenha lugar a expressão da tenascina, e também a materiais que compreendam tais anticorpos, adequados para utilização no domínio médico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A especificidade da terapêutica tumoral constitui, frequentemente, um passo limitador na determinação do êxito de um tratamento. Na realidade, o desencadeamento de efeitos tóxicos e a reduzida tolerabilidade de determinados agentes contra o cancro limitam a sua utilização e a qualidade de vida dos pacientes. A redução da toxicidade está directamente ligada à selectividade do tratamento contra as células cancerosas. Os anticorpos monoclonais representam o meio ideal para desenvolver compostos específicos dirigidos contra tumores e, quando combinados com o sistema de amplificação avidina/biotina, constituem uma via extremamente poderosa e selectiva para fazer chegar radicais activos ao local do tumor. A tenascina é uma das proteínas da matriz extracelular e revela expressão restringida ao local durante a embriogénese, podendo ser encontrada em tecidos adultos 2 durante a cicatrização de ferimentos e na tumorigénese, bem como em vasos sanguíneos tumorais recém-formados. A tenascina não existe em tecidos adultos normais, mas é expressa no estroma de diversos tumores sólidos, tais como os gliomas (Burdon, et al., Câncer Res. 43:2796-2805, 1983), em carcinomas mamários (Chiquet-Ehrismann, et al., 1986), em carcinomas pulmonares (Natali et al., Intl. J. Câncer 54:56-68, 1989), em fibrossarcomas e em carcinomas das células escamosas (Ramos D.M. et al., Int. J. Câncer 75:680-687, 1998). A tenascina existe em gliomas, mas não em tecidos cerebrais normais. Para um estudo sobre a tenascina faz-se referência ao documento WO 92/04464, Wistar, e às obras ali indicadas.

Com base nos preceitos do documento EP 0 496 074, G. Paganelli et al. desenvolveram uma metodologia de pré-direccionamento dos anticorpos contra o alvo em três etapas (three-step pre-targetlng) para o tratamento sistémico e locorregional de tumores (Cremonesi M. et al., Eur. J. Nucl. Med. 26(2):110-120, 1999; Paganelli G. et al., Eur. j. Nucl. Med. 26(4):348-357, 1999; Paganelli G., et al.. Câncer

Biother. & Radiopharm. 16(3):227-235, 2001).

Outras referências respeitantes ao processo de três passos de localização prévia do alvo são os documentos WO 94/04702 e US 5 578 287. O tratamento em três etapas de pré-direccionamento do anticorpo contra o alvo baseia-se na administração intravenosa e sequencial de um anticorpo monoclonal biotinilado anti-tenascina, estreptavidina e biotina marcada com 90Y, com duas administrações, para procura selectiva, de avidina e de albumina biotinilada, respectivamente antes da estreptavidina e da biotina marcada com 90Y, para redução das manifestações de 3 fundo não específicas. A selectividade da metodologia de Paganelli, em três etapas de pré-direccionamento do anticorpo contra o alvo, tem por base a utilização de um anticorpo monoclonal anti-tenascina. 0 uso de compostos dirigidos contra a matriz extracelular, comparado com compostos dirigidos contra antigénios de células tumorais, tem a vantagem de não ser afectado pela modulação antigénica das células tumorais, representando assim uma metodologia ideal para a terapêutica antitumoral.

Foram fixadas as doses e a distribuição temporal das administrações do tratamento em três passos de localização prévia do alvo com o intuito de se conseguir um coeficiente óptimo de distribuição tumoral/não tumoral. Os dados obtidos a partir de 48 pacientes com glioblastoma (GBM) ou com astrocitoma anaplásico (AA), incluídos no estudo de Paganelli, revelaram uma substancial falta de toxicidade, com a excepção de algumas reacções alérgicas à estreptavidina (que podem ser resolvidas utilizando avidina), constituindo um indicador preliminar de eficácia terapêutica. Na realidade, decorridos dois meses após o fim do tratamento, 25% dos pacientes revelaram uma redução do tamanho dos tumores (resposta completa (redução tumoral >50%)=6%; resposta parcial (redução tumoral <50%)=11%; resposta minor (redução tumoral <25%)=8%) e em 52% dos pacientes não houve progressão, com um índice de resposta global superior a 77%. Em alguns destes pacientes, cuja esperança de vida era inferior a 6 meses, a resposta persistiu durante mais de um ano (Paganelli et ai., 1999). O papel do anticorpo biotinilado anti-tenascina consiste em localizar-se no local do tumor e expor as 4 biotinas para mediarem a subsequente acumulação de avidina e de 90Y-biotina.

Os anticorpos anti-tenascina encontram-se descritos, por exemplo, no documento US 5 624 659, Duke University, JP 2219590, Rikagaku, no documento supramencionado WO 92/04464 e no documento 6 335 014 que explica a utilização de anticorpos monoclonais anti-tenascina humana em processos para tratar e evitar metástases. Há um anticorpo antitenascina que foi descrito por Siri A. et al., Nucl. Acid Res. 19(3):525-531, 1991; Balza E. et al., FEBS 332:39-43, 1993 e a sua utilização para fins terapêuticos está descrita nas obras supramencionadas de Cremonesi M. et al., Eur. J. Nucl. Med. 26(2):110-120, 1999; Paganelli G. et al., Eur. J. Nucl. Med. 26(4):348-357, 1999;, Paganelli G. et al., Câncer Biother. & Radiopharm. 16(3):227-235, 2001. O clone utilizado para gerar o anticorpo anti-tenascina é conhecido na especialidade pela designação de BC4. A requerente da presente invenção concluiu que o clone BC4 é inadequado para desenvolvimento industrial e para fins reguladores, devido à produção de uma cadeia leve suplementar, não funcional (muito provavelmente com origem no mieloma parental) cujo nivel de expressão subiu por influência do aumento de escala da cultura, impedindo assim a purificação do anticorpo em grande escala.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO

Descobriu-se recentemente que é possivel produzir um anticorpo monoclonal anti-tenascina humana que resolve os problemas supramencionados, designadamente um anticorpo monoclonal em que não há expressão das cadeias leves não funcionais. 5

Assim sendo, tal anticorpo constitui um objectivo da presente invenção, conjuntamente com um processo para se obter o referido anticorpo e a sua utilização em terapia, em particular para a preparação de um medicamento útil para o tratamento de doenças caracterizadas pela expressão de tenascina, tais como os tumores.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um anticorpo e fragmentos de anticorpo que também podem conter marcadores suplementares e agentes de diagnóstico, composições que contêm estes anticorpos e fragmentos de anticorpos e composições de diagnóstico e terapêuticas que os contêm, a sua utilização em terapia e em diagnóstico e ainda processos para preparar estes anticorpos e fragmentos de anticorpos. A presente invenção também tem por objecto o ADN que codifica os anticorpos e os fragmentos de anticorpos, vectores que contêm o ADN, células hospedeiras que contêm os vectores, proteínas codificadas pelo ADN que codifica a proteína de SEQ ID NOs: 1 e 2; o ADN que codifica a proteína e os fragmentos; as CDR especificas e as proteínas que compreendem ou contêm as CDR.

De acordo com a presente invenção, o referido anticorpo caracteriza-se pelo facto de as sequências da região variável de cadeia leve e pesada serem respectivamente as SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:2. Estas sequências estão representadas nas figuras 10 e 11. Por razões de concisão, o anticorpo preferencial de acordo com a presente invenção irá ser identificado pela designação ST2146. Embora a presente invenção incida sobre o ST2146, 6 enquanto exemplificação da presente invenção, faz-se observar a qualquer vulgar especialista na matéria que é possível produzir, à luz dos preceitos da presente memória descritiva, fragmentos do anticorpo ST2146 e utilizá-los no âmbito da presente invenção.

Tendo em conta o parágrafo anterior, a presente invenção proporciona então um anticorpo (doravante também designado por ST2146), tal como definido na reivindicação 1, ou um fragmento do anticorpo ou uma quimera de anticorpos (tal como, por exemplo, uma quimera de murganho-ser humano) ou uma molécula de imunoglobulina, que se liga especificamente à tenascina. A presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de anticorpo ou uma quimera de anticorpo, conforme definido na reivindicação 2, ou uma molécula de imunoglobulina, que compreende pelo menos uma CDR da cadeia leve variável de ST2146 e/ou uma CDR da cadeia pesada variável de ST2146. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo ou a quimera de anticorpos ou a molécula de imunoglobulina da presente invenção pode ser um anticorpo, um fragmento Fv, um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2, um anticorpo de cadeia única ou um anticorpo multimérico. 0 anticorpo ou o fragmento de anticorpo ou a quimera de anticorpos ou a molécula de imunoglobulina da presente invenção pode ser uma molécula de igM, IgD, IgG, igA ou IgE. A presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de anticorpo ou uma quimera de anticorpos ou uma molécula de imunoglobulina que compreende pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 11, 13, 15, 17 ou 19. A presente invenção proporciona ainda sequências de ácidos nucleicos que codificam as sequências de aminoácidos da presente invenção, tais como as sequências seleccionadas 7 entre as SEQ ID NOs: 1, 2, 9, 11, 13, 15, 17 ou 19. Deste modo, a presente invenção proporciona uma sequência de ADN que codifica um anticorpo ou um fragmento de anticorpo ou uma quimera de anticorpos ou uma molécula de imunoglobulina da presente invenção Tais sequências de ADN compreendem pelo menos uma sequência ou uma sub-sequência de ADN seleccionada entre as SEQ ID NOs: 3, 4, 10, 21, 14, 16, 18 ou 20.

Uma outra forma de realização tem por objecto uma molécula de ácido nucleico purificado que codifica o produto de anticorpo ou fragmento de anticorpo ou quimera de anticorpos ou molécula de imunoglobulina da invenção. É possível preparar uma molécula de ácido nucleico que codifica um produto de imunoglobulina da presente invenção, recorrendo a técnicas convencionais. Por exemplo, é possivel sintetizar oligonucleótidos, utilizando sintetizadores de oligonucleótidos, e ligá-los encadeadamente para formar uma grelha de leitura aberta funcional que codifica um produto de imunoglobulina da invenção. A molécula de ácido nucleico, depois de sintetizada, pode ser clonada num vector de ácido nucleico. Os vectores de ácido nucleico, tais como plasmideos, cosmideos, fagomideos, plasmideos de leveduras, vectores de fagos, plasmideos de TI e outros são conhecidos na especialidade. O vector pode ser um vector de expressão. Os vectores de expressão e os sistemas de expressão podem ser obtidos nos circuitos comerciais a partir de fornecedores tais como Stratagene (La Jolla, Calif.).

Uma outra forma de realização da presente invenção tem por objecto uma célula que compreende um ácido nucleico da invenção. É possível obter uma célula por transfecção. Os métodos de transfecção são conhecidos e há estojos para transfecção de células procarióticas e eucarióticas que podem ser adquiridos nos circuitos comerciais (v.g., Stratagene, La Jolla, Calif.)

Uma outra forma de realização da presente invenção tem por objecto a utilização do produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina da presente invenção para metodologias úteis para a detecção ou diagnóstico de uma patologia, compreendendo os passos que consistem em fazer contactar uma amostra de tecido, proveniente de um indivíduo, com o referido produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina e com um antigénio de tenascina, em condições que permitam a formação de um complexo entre eles e determinar a formação do referido complexo.

Uma outra forma de realização da presente invenção tem por objecto a utilização de um produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina da invenção ou de um ácido nucleico da invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de patologias em que tenha lugar a expressão de tenascina, em particular tumores. São conhecidos processos de imunoterapia contra o cancro. Ver, por exemplo, Old, L. J. Immunotherapy for Câncer, Scientific American, Setembro de 1996.

Uma outra forma de realização tem por objecto uma composição terapêutica que compreende um produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina da invenção. Os produtos de imunoglobulina da invenção podem ser fornecidos sob a forma de uma 9 composição que compreende o produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina conjuntamente com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. A composição terapêutica pode ser utilizada para o tratamento de patologias num mamífero, tal como um ser humano. 0 medicamento deve ser administrado a um mamífero numa quantidade terapeuticamente eficaz, para o mamífero, do produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina.

Na sua utilização como agente terapêutico, o produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina da invenção pode ser ligado a um agente. A ligação pode ser feita por meio de ligações covalentes ou por ligações de tipo anticorpo-epítopo. Por exemplo, um produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina pode ser interligado com um segundo anticorpo, em que o segundo anticorpo pode ter uma afinidade para com o agente. 0 agente pode ser um agente citotóxico. 0 termo "agente citotóxico", tal como aqui utilizado, designa uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa a destruição das células. 0 termo pretende abranger os isótopos radioactivos (v.g. I, Y, Pr), os agentes quimioterapêuticos e as toxinas, tais como as toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos. 0 agente pode ser um agente quimioterapêutico. Um agente quimioterapêutico é um composto químico útil para o tratamento de cancro. Como exemplos de agentes quimioterapêuticos refere-se os seleccionados entre Adriamicina, Doxorrubicina, 5-Fluorouracilo, Arabinosida de citosina ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, 10

Busulfano, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etoposido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (ver a patente de invenção norte-americana n° 4 675 187), Melfalan e outras mostardas azotadas congéneres. O agente pode ser uma citoquina. O termo citoquina é um termo genérico para designar proteínas libertadas por uma população de células que actuam sobre outras células como mediadores intercelulares. Como exemplos de tais citoquinas refere-se as seleccionadas entre linfoquinas, monoquinas e hormonas de polipeptidos tradicionais. Entre as citoquinas estão a hormona do crescimento, tal como a hormona do crescimento humano, a hormona do crescimento humano N-metionílica e a hormona do crescimento de bovinos; a hormona paratiróide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteínas, tais como a hormona estimuladora dos folículos (FSH), a hormona estimuladora da tiróide (TSH) e a hormona de luteinização (LH); o factor de crescimento hepático; o factor de crescimento dos fibroblastos; prolactina; lactogénio placentário; o factor de necrose tumoral; a substância inibidora muleriana; o péptido associado à gonadotropina do murganho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento dos nervos, tais como NGF; factor de crescimento das plaquetas; factores de crescimento transformantes (TGF); factores I e II de crescimento de tipo insulínico; eritropoietina (EPO); factores osteoinductivos; interferãos, tais como os interferãos α, β e γ; factores estimuladores de colónias 11 (CSF); CSF de granulócitos-macrofagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (IL), tais como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; um factor de necrose tumoral; e outros factores polipeptídicos, incluindo LIF e um ligando kit (KL). Tal como aqui utilizado, o termo citoquina abrange proteínas provenientes de fontes naturais ou provenientes de culturas de células recombinantes e equivalentes biologicamente activos das citoquinas de sequências naturais.

Para efeitos de diagnóstico, o produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina da presente invenção pode ser associado a um identificador, tal como um composto ou uma composição detectável que se conjugue directa ou indirectamente com o anticorpo. 0 identificador pode ser detectável por si próprio (v.gr., identificadores radioisótopos ou identificadores fluorescentes) ou então, no caso de um identificador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou de uma composição que seja o substrato, sendo isso detectável. A presente invenção também tem por objecto a geração de mutantes das CDR indicadas, mediante a mutação de um ou vários aminoácidos na sequência das CDR. Sabe-se que uma única substituição de um aminoácido, convenientemente colocado numa CDR, pode ser suficiente para aumentar a afinidade. 0 investigador recorreu à mutagénese dirigida ao local para aumentar em cerca de 10 vezes a afinidade de alguns produtos de imunoglobulina. Este processo de aumentar ou diminuir a afinidade dos anticorpos por mutação das CDR é perfeitamente conhecido (ver, v.g., o capítulo 23 da obra de Paul, W. E., Fundamental Immunology, Raven 12

Press, NY, N.Y. 1993) . Deste modo, a substituição, a supressão ou a adição de aminoácidos às CDR da invenção, para aumentar ou diminuir a afinidade ou a especificidade de ligação, estão também contempladas na presente invenção.

Um outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar um medicamento para tratar um indivíduo com um tumor, por exemplo, tumores císticos cerebrais, gliomas, tumores mamários, carcinomas pulmonares, fibrossarcomas ou carcinomas das células escamosas, o que implica administrar a um ser humano que padeça de um tumor, tal como um tumor cístico cerebral (v.g., um tumor em que tenha lugar a expressão de tenascina) um produto de anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina da presente invenção, que se ligue à tenascina numa quantidade terapeuticamente eficaz. 0 passo de administração pode ser realizado depositando o anticorpo na cavidade do tumor.

Também se descreve aqui um processo para tratar um tumor sólido, o qual consiste, em primeiro lugar, em remover um tumor sólido (v.g., um em que tenha lugar a expressão de tenascina) para fora de um órgão tecidual sólido (v.g., o cérebro) de um ser humano que disso padeça; formar então uma cavidade de ressecção fechada no órgão do paciente no local de onde o tumor sólido foi removido; e administrar depois ao paciente um agente antineoplásico, tal como um produto de um anticorpo, fragmento de anticorpo, quimera de anticorpos ou de imunoglobulina da presente invenção (v.g., um anticorpo que se ligue à tenascina), que seja selectivamente tóxico para as células do tumor sólido, numa quantidade terapeuticamente eficaz. De acordo com uma forma de realização da invenção, o passo 13 de administração é realizado depositando o agente antineoplásico na cavidade de ressecção.

Um outro objectivo da presente invenção diz respeito aos fragmentos proteolíticos do referido anticorpo, à ligação a um epitopo antigénico dentro da repetição de tipo EGF da tenascina C humana. Ao longo do texto descritivo da presente invenção, designa-se por fragmentos de anticorpos os fragmentos que se liguem a um epitopo antigénico no interior da repetição de tipo EGF da tenascina C humana.

De acordo com uma outra forma de realização da presente invenção, o anticorpo e os seus fragmentos podem conter também marcadores e/ou agentes de diagnóstico suplementares. Os referidos marcadores e/ou agentes de diagnóstico são perfeitamente conhecidos pelos especialistas na matéria aos quais se dirige a presente invenção.

De acordo com uma forma de realização preferencial da presente invenção, o referido anticorpo ou os seus fragmentos proteolíticos são biotinilados.

Um outro objectivo da presente invenção é a linhagem de células de hibridoma, aqui designada por CST2146, produtora do referido anticorpo. A linhagem de células de hibridoma foi depositada na instituição 'Advanced Biotechnology Center, L.go Rosanna Benzi, 10 16132 GENOVA-Italy, a 29 de Janeiro de 2002 ao abrigo do Tratado de Budapeste, tendo-lhe sido atribuído o número PD02003 de admissão. A presente invenção também compreende ADN que codifica o anticorpo ou os seus fragmentos, CDR específicas e proteínas que compreendem ou contêm as CDR, vectores que contêm o referido ADN e células hospedeiras que contêm os referidos vectores. 14

Um outro objectivo da presente invenção é constituído pelos derivados recombinantes do referido anticorpo. Em particular, os derivados recombinantes preferenciais são aqueles em que a região constante nos murinos é substituída pela parte equivalente humana (Ferrer C. et al., J. Biotechnol. 52: 51-60, 1996) ou aqueles em que a região constante dos murinos é substituídas por um radical biologicamente activo tal como, por exemplo, um membro da família das avidinas (Manuel L. et al., J. Immunol., 163: 4421-4426, 1999), um factor de crescimento útil para estimular efectores imunológicos dirigidos ao tumor (tais como, por exemplo, G-CSF, GM-CSF), ou aqueles em que a região constante dos murinos é substituída por um radical farmacologicamente activo, tais como, por exemplo, uma toxina, um superantigénio, uma citoquina ou qualquer outra proteína útil para reforçar a eficácia terapêutica antitumoral (Di Massimo A.M. et al., British J. Câncer 75(6):822-828, 1997; Parente D. et al., Anticancer Research 17(6A):4073-4074, 1997).

Os processos para se obter os referidos derivados recombinantes são perfeitamente conhecidos na especialidade.

Um outro objectivo da presente invenção é constituído pelos derivados conjugados do referido anticorpo.

Em particular, os derivados conjugados preferenciais são aqueles em que os radicais biologicamente activos são ligados aos anticorpos por processos convencionais. Como exemplos de radicais biologicamente activos refere-se os membros da família das avidinas, um factor de crescimento útil para estimular os efectores imunológicos dirigidos ao tumor (tais como, por exemplo, G-CSF, GM-CSF), um radical farmacologicamente activo tal como, por exemplo, uma 15 toxina, um superantigénio, uma citoquina ou qualquer outra proteína útil para a reforçar a eficácia terapêutica antitumoral, fármacos antitumorais e radioisótopos.

De acordo com a presente invenção, os derivados recombinantes ou conjugados de anticorpos monoclonais antitenascina humana ou seus fragmentos são também designados por "derivados".

De acordo com uma forma de realização particularmente mais preferencial, para além dos anticorpos e dos seus fragmentos, também os seus derivados são biotinilados.

Um outro objecto da presente invenção é constituído pela linhagem de células de hibridoma produtoras do anticorpo, conforme definido antes. 0 referido hibridoma foi depositado na instituição 'Advanced Biotechnology Center' em 29 de Janeiro de 2002, ao abrigo do Tratado de Budapeste, com o número PD02003.

De acordo com um outro objectivo da presente invenção, esta proporciona um processo para a preparação do anticorpo do monoclonal, consistindo tal processo em criar em cultura a linhagem de células de hibridoma supramencionada e em isolar o anticorpo.

Um outro objecto da presente invenção é a utilização do anticorpo monoclonal antitenascina humana para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma patologia em que tenha lugar a expressão de tenascina, em particular um tumor.

Como exemplos não limitativos de tumores em que tem lugar a expressão de tenascina refere-se os gliomas, os carcinomas mamários, os carcinomas pulmonares, os fibrossarcomas e os carcinomas das células escamosas. 16

De acordo com um outro dos seus aspectos, a presente invenção diz respeito a um medicamento para a radioimunoterapia de tumores, o qual é administrado a um paciente que padeça de um tumor em que tenha lugar a expressão de tenascina, sendo tal medicamento constituído pelo referido anticorpo monoclonal ou seus fragmentos proteolíticos ou os seus derivados. De acordo com uma forma de realização preferencial, o referido anticorpo monoclonal ou os seus fragmentos proteolíticos ou seus derivados são biotinilados e de acordo com uma forma de realização particularmente mais preferencial, o medicamento é adequado para radioimunoterapia, em particular para a execução do processo de três passos de localização prévia do alvo, conforme descrito na especialidade, por exemplo, nos documentos ep 0 496 074, European Journal of Nuclear Medicine Viol. 26, No 4; Abril de 1999; 348-357 e US 5 968 405. De acordo com este último aspecto, o medicamento de acordo com a presente invenção irá ser apresentado sob a forma de um estojo, contendo o referido estojo 5 frascos, em que o primeiro frasco contém o anticorpo biotinilado ou os seus fragmentos ou derivados; o segundo frasco contém uma avidina, o terceiro frasco contém albumina biotinilada, o quarto frasco contém uma estreptavidina e o quinto frasco contém biotina ou um derivado de biotina marcada com um radioisótopo. Este tipo de estojo está descrito na publicação 'European Journal of Nuclear Medicine Vol.26, No 4'; Abril de 1999; 348-357. Uma avidina pode ser avidina, estreptavidina, PEG-avidina ou PEG-estreptavidina, diavidina ou poliavidina ou di-estreptavidina ou poliestreptavidina. Uma biotina marcada com um radioisótopo contém um radionuclídeo, tal como descrito no documento EP 0 4 96 074, 17 de preferência 90Y. Os derivados de biotina estão descritos, por exemplo, no documento WO 02/066075. Há um estojo deste tipo que está descrito na publicação "European Journal of Nuclear Medicine Vol. 26, No 4"; Abril de 1999; 348-357. De preferência, os frascos são adequados para injecção em seres humanos.

Os derivados recombinantes do anticorpo da presente invenção, bem como os seus conjugados, também são utilizados convenientemente em terapia tumoral. Embora os anticorpos da presente invenção, bem como os seus fragmentos, derivados e conjugados, sejam utilizados convenientemente para o tratamento de tumores conotados com a tenascina, em particular por imunoterapia, a radioimunoterapia constitui uma forma de realização preferencial da invenção. O reservatório concreto, de preferência sob a forma de um frasco adequado para injecção, contendo o anticorpo ou os seus fragmentos, numa forma biotinilada, constitui um outro objecto da presente invenção.

De acordo com uma outra forma de realização da presente invenção, no estojo terapêutico o anticorpo biotinilado é combinado com outros anticorpos específicos da tenascina, preferencialmente dirigidos contra o fragmento A-D. Em alternativa, o anticorpo biotinilado é combinado com outros anticorpos específicos de tumores. É possível encontrar uma explicação genérica sobre o tipo de estojo referido nos documentos EP 0 496 074, European Journal of Nuclear Medicine Viol. 26, No 4; Abril de 1999; 348-357 e US 5 968 405.

Em particular, a presente invenção também consagra um reservatório, facultativamente com vários compartimentos, contendo o anticorpo biotinilado ou seus fragmentos ou derivados, agentes tampão e reagentes adequados para 18 utilização num estojo terapêutico para um processo de três passos de localização prévia do alvo.

Um outro objecto da presente invenção é a utilização do referido anticorpo monoclonal ou dos seus fragmentos ou derivados recombinantes ou seus conjugados ou dos seus derivados biotinilados, para a preparação de meios de diagnóstico para a detecção de doenças em que tenha lugar a expressão de tenascina, em particular para a obtenção de imagens de tumores in vivo.

De acordo com uma forma de realização particular da presente invenção, o referido anticorpo monoclonal, ou seus fragmentos ou derivados, é utilizado em combinação com um segundo anticorpo especifico da tenascina num ensaio em sanduíche para a produção de um estojo de diagnóstico para a determinação do nivel de tenascina na circulação. 0 ensaio em sanduiche é, por exemplo, um protocolo ELISA efectuado in vitro em condições em que o referido segundo anticorpo se liga a um segundo epítopo antigénico de tenascina, sendo o referido protocolo elisa in vitro útil para a determinação do nivel de tenascina na circulação.

Os estojos de diagnóstico ou terapêuticos, que contêm o anticorpo ou os seus fragmentos ou derivados, constituem um outro objecto da presente invenção.

Estes e outros objectos da presente invenção irão ser descritos minuciosamente no texto subsequente e também por meio de exemplos e figuras.

Descrição abreviada das figuras

Figura 1: ilustra a representação esquemática da tenascina C humana, de fragmentos antigénicos recombinantes 19 com ela associados, reagentes e ainda a estratégia utilizada para a geração de um anticorpo de tipo BC-4.

Figura 2: ilustra a confirmação da natureza glicosidica da variabilidade da cadeia pesada de ST2146, mediante digestão do anticorpo com uma sialidase.

Figura 3: ilustra a homogeneidade global do ST2146, comparativamente com BC4.

Figura 4: ilustra uma transferência de 'Western' da ligação do ST2146 ao epitopo da tenascina humana, comparativamente com o epitopo antigénico de BC4 (a pista D está vazia).

Figura 5: ilustra um protocolo ELISA competitivo em que o ST2146 compete fortemente com o BC4 na ligação à tenascina humana, ao passo que o ST2077 manifesta apenas uma competição parcial. 0 ST2077 é um anticorpo monoclonal especifico da tenascina, obtido no processo para gerar ST2146. 0 ST2077 revela uma especificidade idêntica à do ST2146 (região de repetição de tipo EGF da tenascina humana), mas está dirigido para um epitopo antigénico que interfere apenas parcialmente com o epitopo de BC4/ST2146.

Figura 6: ilustra a imunorreactividade do ST2146 pelo protocolo ELISA, comparativamente com o pico máximo totalmente activo do BC4.

Figura 7: ilustra o protocolo para o estudo de biodistribuição do ST2146.

Figura 8: ilustra a biodistribuição do ST2146, comparativamente com o BC4 (biot=biotinilado; IR= imunorreactividade expressa em função da quantidade de anticorpo para se obter um valor de D.O. =1,0 no protocolo ELISA). 20

Figura 9: ilustra o coeficiente tumoral/não tumoral para o ST2146, comparativamente com o BC4.

Figura 10: mostra a sequência da cadeia leve variável (VL) do ST2146 (SEQ ID NOs: 1 (aminoácido de comprimento completo), 3 (ADN que codifica o aminoácido), 9 (aminoácido da cadeia leve da CDRl), 10 (ADN da cadeia leve da CDR1), 11 (aminoácido da cadeia leve da CDR2), 12 (ADN da cadeia leve da CDR2), 13 (aminoácido da cadeia leve da CDR3), 14 (ADN da cadeia leve da CDR3) e 21 (ADN de comprimento completo)).

Figura 11: ilustra a sequência da cadeia pesada variável (VH) do ST214 6 (SEQ ID NOs: 2 (aminoácido de comprimento completo), 4 (ADN que codifica o aminoácido), 15 (aminoácido da cadeia pesada da CDRl), 16 (ADN da cadeia pesada da CDRl), 17 (aminoácido da cadeia pesada da CDR2), 18 (ADN da cadeia pesada da CDR2), 19 (aminoácido da cadeia pesada da CDR3), 20 (ADN da cadeia pesada da CDR3) e 22 (ADN de comprimento completo)).

Descrição minuciosa da invenção O ST2146 é obtido a partir do correspondente clone CST2146 de células de hibridoma, conforme descrito pormenorizadamente no exemplo seguinte.

Sempre que estejam em causa os aspectos industriais da presente invenção, o anticorpo aqui explicitado deve ser convenientemente formulado em composições farmacêuticas ou em estojos de diagnóstico, conforme se faz normalmente neste domínio da técnica.

As composições farmacêuticas são convencionais neste dominio e podem ser preparadas por um especialista na matéria, apenas com base em preceitos gerais consagrados. Os exemplos 21 de composições farmacêuticas são os que estão indicados nas obras de referência mencionadas na presente invenção. 0 mesmo se aplica aos estojos de diagnóstico. São particularmente preferenciais os estojos para a radioimunoterapia de tumores, conforme descrito nas publicações supramencionadas da autoria de Paganelli et al. e no documento EP 0 496 074.

Estão incluidas no âmbito da presente invenção as composições farmacêuticas que contenham o anticorpo e/ou um seu fragmento e/ou um seu derivado recombinante e/ou um seu conjugado, misturados pelo menos com um excipiente e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável. O exemplo subsequente ilustra melhor a presente invenção.

Exemplo 1

Com a finalidade de se gerar um novo clone de células de hibridoma com a especificidade do BC4, mas sem a expressão da cadeia leve não funcional, efectuou-se a imunização de murganhos Balb/c com lisado de fagos pTn28 de E. coli. O pTn28 é um clone recombinante Xgtll que codifica um fragmento da repetição de tipo EGF da tenascina humana, para o qual se demonstrou anteriormente que continha o epítopo BC4 (Balza E. et al., 1993). A representação esquemática da tenascina C humana, dos fragmentos antigénicos recombinantes congéneres e dos reagentes, bem como a estratégia utilizada para gerar um anticorpo de tipo BC-4, estão ilustrados na figura 1. Foram utilizados esplenócitos imunizados com pTn28 que foram fundidos com células de mieloma não produtoras de Sp2/0Agl4, pelo processo convencional (Cianfriglia M. et al., Methods Enzymol. 121:193210, 1986) e depois efectuou-se um rastreio 22 de pesquisa na população do hibridoma, pelo protocolo ELISA, sobre tenascina purificada de SK-MEL-28 (linhagem de células de melanoma humano). Os hibridomas específicos da tenascina foram clonados por diluição limitante, duas vezes em meio contendo FCS e três vezes em meio isento de proteínas (Animal Derived Component Free Médium HyClone, HyQR Perbio). 0 subclone cST2146/D3d/F6e foi finalmente seleccionado para a produção do banco principal de células CST2146 (MCB) e do banco de células de trabalho (WCB). A produção do material de referência ST2146 foi feita por cultura de células de hibridoma CST2146 num biorreactor de 2L e depois confirmou-se a estabilidade do banco de células pós-produção de CST2146 (PPCB) por análise de selecção celular 'FACS' e por diluição limitante. 0 ST2146 é uma imunoglobulina de murganho de isotipo IgG2b/k.

Confirmou-se que o ST2146 é homogéneo em termos da composição da cadeia leve, conforme demonstrado por análise redutora pelo protocolo de SDS-PAGE que também demonstrou a existência de um determinado grau de heterogeneidade da cadeia pesada. Esta observação foi consistente com uma variabilidade existente na glicosilação ligada a 0, conforme anteriormente assinalado para o isotipo lgG2b dos murinos (Kim H. et al., J. Biol. Chem. 269(16): 12345-12350, 1994). De forma consistente, no padrão do ST2146 foram observadas bandas de cadeias pesadas em três lotes diferentes obtidos a partir de um meio de cultura contendo FCS ou a partir de um meio isento de proteínas. A confirmação da natureza glicosídica da variabilidade da cadeia pesada do ST2146 foi obtida fazendo digerir o anticorpo com uma sialidase. Efectuou-se uma substituição do tampão do ST2146 numa coluna 23

HiTrap de permutas salinas (Amersham-Pharmacia), tendo a troca sido feita por tampão de fosfato de sódio 10 mM contendo NaCl 150 mM a pH 6,4. Efectuou-se a concentração do anticorpo monoclonal (Mab) em filtros centrífugos Centricon para valores críticos de 100 000 MWCO (Millipore), até à concentração final de cerca de 1 mg/mL, e depois fez-se digerir com uma sialidase na concentração de 1,5 U/mL (Sigma) durante 24 horas a 37°C. Submeteu-se as amostras a electroforese sobre uma placa de gel de poliacrilamida a 12%. Efectuou-se a coloração do gel com o corante azul brilhante de Coomassie. Conforme previsto, desta digestão resultou na eliminação da banda de massa molecular mais elevada (figura 2) . A homogeneidade global do ST214 6 também foi confirmada por cromatografia em hidroxiapatite, a qual revelou a existência de um pico singular para o ST2146, comparativamente com os três picos observados para o BC4 (Figura 3, em que o BC4 totalmente funcional corresponde ao pico 3). O ST2146 liga a tenascina humana a um epítopo estritamente congénere, senão mesmo idêntico, do epítopo antigénico do BC4, conforme demonstrado por transferência de 'Western' (figura 4) e pelo protocolo ELISA competitivo (figura 5) . Na figura 5, misturou-se o BC4 biotinilado com concentrações cada vez maiores de BC4, ST2077 ou ST2146, enquanto competidores, e fez-se uma sua distribuição sobre placas recobertas com tenascina. Mediu-se a ligação após a adição do conjugado de HRP-estreptavidina e do substrato cromogénico associado. O ST2077 é um anticorpo que reconhece um epítopo de tenascina dentro da repetição de tipo EGF, parcialmente partilhada com o epítopo de BC4. 24

Avaliou-se a imunorreactividade do ST2146 pelo protocolo ELISA, em comparação com o pico totalmente activo do BC4 (pico 3) . A figura 6 mostra que a quantidade de ST2146 para se obter um valor de D.O. =1,0, numa concentração óptima de antigénio, pelo protocolo ELISA (painel A) , é aproximadamente 20 vezes inferior à quantidade do pico 3 totalmente reactivo do BC4 e é aproximadamente 100 vezes inferior à do BC4. Esta diferença é extraordinariamente ampliada em condições de limitação do antigénio, tal como se observa no painel B, em que apenas o ST2146 mantém uma boa imunorreactividade.

Avaliou-se a afinidade do ST2146 pelo protocolo 'BIAcore'. O valor kD para o ST2146 foi de l,4xl0~9 (ka 3,0xl05; kd 4,lxl0”4). Efectuou-se uma comparação dos dados de afinidade do ST2146 com os do BC4, tendo sido verificado um valor kD igual a 4,9xlCT9 (ka l,9xl05; kd 9,3xlCT4). A conservação da imunorreactividade, após a biotinilação, é um requisito fundamental para que um anticorpo monoclonal seja utilizado para a localização prévia do alvo. Para se avaliar o comportamento do ST2146 biotinilado procedeu-se a uma investigação de diversas proporções entre anticorpo:biotina e mediu-se a imunorreactividade do anticorpo biotinilado, recorrendo ao protocolo ELISA, em comparação com o BC4 e o ST1897, sendo este último um anticorpo monoclonal especifico da tenascina, com menor afinidade. Os resultados agrupados no quadro 1 mostram que uma biotinalação fraca (2-3 moléculas de biotina/mole) afecta ligeiramente a imunorreactividade dos anticorpos monoclonais, independentemente das suas afinidades. Uma biotinilização de grau superior, até 230 moléculas de biotina/mole, está associada a uma redução de 25 imunorreactividade. Esta redução é tanto maior quanto menor é a afinidade do anticorpo.

Quadro 1

Estudo de afinidade com o ST2146 % de imunorreactividade Moles de biotina/avidina

Mab Afinidade 2-3 3,5-5 7-10 15-20 (nM) ST1897 10 84,8+/-1,3 62,3+/-12,4 26,65+/-13,8 9,45+/-9,26 BS4 4,9 82,4+/-11,5 74,4+/-9,3 67,2+/-12,3 12, 6 ST2146 1,4 100 89,6+/-4,39 77,63+/-8,59 52,37+/-3,95 A % de imunorreactividade é a média ± desvio padrão de 2-3 experiências independentes

Mediu-se a afinidade do ST2146 biotinilado, recorrendo ao protocolo 'BIAcore', tendo os resultados observados sido praticamente constantes, independentemente do número de moléculas de biotina ligadas.

Uma análise imunoistoquímica respeitante a diferentes tumores (tumor mamário, glioma e do cólon), revelou uma selectividade semelhante para o BC4 e para o ST2146.

Recorreu-se ao comportamento farmacológico do ST2146 biotinilado para se definir a sua aptidão para se instalar e localizar massas tumorais. Foram feitos estudos de biodistribuição de anticorpos ST2146 e BC4 biotinilados e marcados com o radioisótopo 125I em murganhos pelados enxertados com tumores humanos em que tem lugar a expressão de tenascina, em conformidade com o protocolo ilustrado na figura 7. Administrou-se aos murganhos subcutaneamente 26 4xl06 células do carcinoma do cólon humano HT29 em 0,1 mL de uma solução estéril. Decorridos 15 dias, quando a massa tumoral era aproximadamente igual a 100 mg, injectou-se intravenosamente, em grupos de 5 murganhos BC4, ST2146 ou imunoglobulinas de murganhos normais (nMIg), marcados com o isótopo 125I, doses de 10, 2, 0,5 ou 0,1 pg/murganho em ou de 0,1 mL de PBS estéril. Todos os anticorpos foram biotinilados (7-10 biotina/mole) e ambos os Mab biotinilados, ST2146 e BC4, manifestaram uma imunorreactividade de cerca de 80%. Cada animal recebeu as quantidades seguintes de CPM:

Dose BC4 ST2146 NMIg 10 pg 632 000 570 000 577 000 2 pg 555 000 639 000 624 000 0, 5 pg 310 000 401 000 382 000 0,1 pg 186 000 211 000 174 000 Os resultados da figura 8 mostram que tanto o BC4 como o ST2146 se localizam especificamente nas massas tumorais. A quantidade de ambos os anticorpos no local do tumor (expressa em % da dose injectada/grama de ; tecido) é dependente da dose, com uma tendência para uma acumulação maior no caso do ST2146. Além disso, o ST2146 revela um melhor coeficiente tumoral/não tumoral, comparativamente com o BC4, conforme ilustrado na figura 9. A região variável da cadeia leve k foi amplificada a partir de ADNc circularizado, utilizando para tal um par de iniciadores (5'-TGTCAAGAGCTTCAACAGGA (SEQ ID NO:5), 5'- -AAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO:6)) que se recombinam com a região constante do anticorpo, conforme descrito por M. Sassano et al., Nucl. Ac. Res. (1994) 22, 1768-1769. 27 A região variável da cadeia pesada γ foi amplificada a partir de ADNc circularizado, utilizando os iniciadores seguintes: oligo y2bCHl GTCACTGACTCAGGGAAGTAGCC (SEQ ID NO:7) de murganho; oligo y2bCH3 GCAACGTGAGACACGAGGGTCTG (SEQ ID NO: 8) de murganho, que se recombinam com a região constante do anticorpo, conforme descrito por M. Sassano et al. Nucl. Ac. Res. (1994) 22, 1768-1769.

Efectuou-se um protocolo de PCR nas condições seguintes: 1 minuto a 94°C, 1,5 minutos a 60°C, 2 minutos a 72°C durante 30 ciclos.

Os fragmentos amplificados foram clonados directamente no plasmideo pUC18 cortado com Smal. Efectuou-se a sequenciação de dois clones que continham as regiões variáveis da cadeia leve k e de 4 clones que continham as regiões variáveis da cadeia pesada γ. A sequenciação foi realizada em "MWG Biotech", Alemanha. Efectuou-se a sequenciação das duas cadeias. Não foram encontradas ambiguidades. A figura 10 ilustra a sequência da cadeia leve variável (VL) do ST2146. A figura 11 ilustra a sequência da cadeia pesada variável (VH) do ST2146. A caracterização comparativa geral do ST2146 relativamente ao BC4, mostra que o ST2146 possui as características seguintes: anticorpo monoclonal de tipo BC4, no que diz respeito à especificidade do epítopo; - homogéneo, no que diz respeito à composição das cadeias pesada e leve; - heterogéneo, no que diz respeito à glicosilação da cadeia pesada; 28 superior ao BC4, no que diz respeito à imunorreactividade, conforme esperado com base na heterogeneidade do BC4; - cerca de 3 vezes superior ao BC4, no que diz respeito à afinidade; - superior ao BC4, no que diz respeito à conservação da imunorreactividade após a biotinilação; - semelhante ao BC4, em termos de selectividade na imunoistoquímica; - superior ao BC4, no que diz respeito ao ataque ao tumor.

LISTA DE REFERÊNCIAS

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

<110> DE SANTIS, RITA ANASTASI, ΑΝΝΑ MARIA

<120> ANTICORPO MONOCLONAL ANTITENASCINA HUMANA <130> 2818-141 <14 0> <141> <150> 60/359 299 <151> 2002-02-26 <160> 22 <170> Patentin Ver. 2.1

<210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência proteinica da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <400> 1 32

Mefc 1 Arg Cys Leu Ala 5 Glu Phe Leu Gly Leu 10 Leu Val Leu Trp Xle 15 Pro Gly Ala Ile Gly Aep lie val Met Thr Gm Ala Ala Fro Ser vai Pro 20 25 30 Vai Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu Hia Sar Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg 50 55 60 Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ara 65 70 75 80 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser éiy Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe 85 80 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gin HÍS Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Fhe Gly Ma Gly Thr Lys 1X5 120 125 teu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Fro Thr vai Ser Xle 130 135 140

<210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência proteinica da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético <400> 2 33

Lys Vai Lys Leu Gin Slit Ser Gly Pro Gltt Leu Vai Lys Pro Gly Ala l 5 10 15 Ser Vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Ehe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Mefc Tyr Trp Vai Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pr o Tyr Asa Gly Vai Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys .Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Hat His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Het Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Th t Vai Thr Vai Ser Ser Π 5 120 <210> 3 <211> 426

<212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de ADN da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <220> <221> CDS <222> (1) .. (426) <400> 3 34 atg agg tgc cta gct gag ttc ctg ggg ctg ctt gtg ctc tgg ate CCt 48 Met Arg Cys Leu A2.& Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 gga ÇfCC att ggg gat att gtg etg act cag gct gês CCt tct gta CCt 96 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Vai Mefc Thr Gin Ala Ala Pro Ser val Pro 20 25 30 gtc act cct gga gag tca gta tcc ate tcc tgc agg tct agt aag agt 144 Vai Thr pro Gly Glu Ser Vai Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 etc Ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc cta cag agg 1S2 Leu Leu His Ser Ãee Gly Asa Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg 50 55 60 cca ggc çàg tct CCt cag ctc çtg ata tat cgg atg teç aac ctt gçc 240 Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Â2.9 65 70 75 80 tca gga gtc cca gac agg ttc agt ggc agt ggg tca gga act gct ttc 280 Ser Gly Vai f?ro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe 85 90 95 aca ctg aga ate agt aga gtg gag gct gag gat Gtg ggt gtt tat tac 336 Thr Leu Arg lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tat atg esa cat cta gsa tat ççg etc acq ttc ggt gct ggg aec aag 384 Cys Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 115 120 125 ctg gag ctg aas cgg gct gat .gct CfC& cca act gta tec ate 426 Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile 130 135 140

<210> 4 <211> 360 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de ADN da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético 35 <220> <221> CDS <222> (1) . (360) <400> 4 aag gtg aaa ctg cag cag tct gga cct om ctg gtg aag cct ggg gct 48 Lys Vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly PrO Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gta ice tgc aag get tct ggt tat. gea ttc act age tac 3« Ser vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phé Thr Ser Tyr 20 25 30 aae ata tac tgg «tff aag cag age cat gga aag age ctt gag tgg att 144 Asn «et Tyr Trp Vgl Lys Gin Ser Hís Gly Lys Ser Leu Giu Trp Ile ,35 40 45 gga tat att gat cct tac aat Wft gft act age tac aae cag aag ttc 192 Gly Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Vai Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 aag ggg aag gee aca ttg act gtt. gac aag tcc tcc age aca gee tac 240 tya 61y Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys Ser Ser Sç.r Thr Ma Tyr €5 70 75 80 atg cat etc aae age ctg aca tct gag gac tct gea gtc tat tac tgt 288 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser <31u Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 gea aça ggg ggc ggt agt ate tac tat gct atg gac tac tgg ggc caa 336 Ala Arg Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 ggg acc acg gtc scc gtc tcc tea 360 Sly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 36 <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <400> 5 tgtcaagagc ttcaacagga 20 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <4 0 0> 6 aagatggata cagttggtgc 20 <210> 7 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <400> 7 gtcactgact cagggaagta gcc 23 <210> 8 <211> 23

<212> ADN 37 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: iniciador <400> 8 gcaacgtgag acacgagggt ctg 23

<210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência peptidica da CDRl da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <400> 9

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Ϊ 5 10 15

<210> 10 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 38 <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência nucleotídica da CDRl da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <220> <221> CDS <222> (1) . . (48) <400> 10 agg tct agt aag agt ctc ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat 48 Mg Ser Ser Lys Ser teu Leu Bis Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15

<210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência peptidica da CDR2 da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <400> 11

Arg Het Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 12 <211> 21

<212> ADN 39 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência nucleotidica da CDR2 da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <220>

<221> CDS <222> (1) .. (21) <400> 12 c$£ atg tcc ase ett gcc tcs 21

Arg Met Ser Asrt Leu Ala Ser Í 5

<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência peptidica da CDR3 da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <400> 13

Met Gin Hls Leu Gin Tyr Pro Leu Thr 1 5 40

<210 > 14 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência nucleotidica da CDR3 da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <220> <221> CDS <222> (1) .. (27) < 4 0 0 > 14 atg caa cai cta. gaa tat ccg ctc acg 27

Met Gin His Leu Glu Tyr S?r© Leu Thr 1 5

<210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência peptidica da CDR1 da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético <4 0 0> 15 41 $er Tyr Abe Met Tyr 1 5

<210> 16 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência nucleotidica da CDRl da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético <220> <221> CDS <222> (1) .. (15) <400> 16 age tac aac atg tac 15

Ser Tyr Asn Mefc Tyr 1 5

<210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 42 <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência peptidica da CDR2 da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético <400> 17

Tyr lie Asp Pro Tyr Asn Gly Vai Thr Ser Tyr A$n Gin Lya Ptie lys 1 5 10 15

Gly

<210> 18 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência nucleotidica da CDR2 da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético <220> <221> CDS <222> (1) .. (51) < 4 0 0 > 18 tat att gat cct tac aat ggt gtt act age tac aac cag aag ttc asg 48

Tyr I1& Asp Pro Tyr Asn Gly Vai Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 1 S 10 15 ggo

Gly 51 43

<210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência peptídica da CDR3 da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético <400> 19

Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ma Met Asp Tyr 15 10

<210> 20 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência nucleotidica da CDR3 da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético <220> <221> CDS <222> (1) .. (33) <400> 20 44 ggg ggç ggt agt atç tác tat gçt atg g&c tac 33

Gly Gly Gly Sw IX* tyx Tyx Ma M©t Asp Tyc 1 5 10

<210> 21 <211> 773 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência nucleotidica da região variável de cadeia leve do ST2146 sintético <220>

<221> CDS <222> (292)..(717) <400> 21 cgaggatccc ctgtcaagag cttcaacagg aatgagtgtt agagacaaag gtcctgagac 60 45 gçcaccacca gctccccagc tccatcctet cttcccttct aaggtcttgg aggcttceçc 120

acaagcgacc taccactgtt geggtgctcc aaacotcctc cccacctcct tctcctccte ISO ctcectttcc ttggctttta tcatçctaat atttgcagaa aatattcaat aaaçtgagtc 240 tctgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaataaeee ctfcgataagg aagttctcag a atg agg 297

Met Arg 1 tgc Cta gct gag ttc ctg ggg ctg ett gtg ctc tgg ate cet gga ges 345 Cys Leu Ma Glu Phe Leu Gly Leu Leu Vai Leu Trp Ue Pro Gly Ala 5 10 15 afct ggg gat att gtg atg act cag gct gea ccc tct gta cct gtc act 393 11« c-iy Asp Π* Vai Hat Thr Gin Ara Ala Pro Ser Vai Pro Vai Thr 20 25 30 cet gga gag tea gta tcc ate tcc tgc agg tct agt aag agt ctc ctg 441 Pro Gly Glu Ser Vai Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu 35 40 45 50 cat agt aat ggc aac act tac ttg tat fcgg ttc cta cag agg cca ggc 489 His Ser ften Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly 55 60 £5 cag tct cet cag ctc ctg ata tat egg atg tcc aac ctt gçc tea gga 537 Gin Ser Pro Gin. Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly 70 75 80 gtc eca gac agg ttc agt ggc agt ggg tcá act gct ttc aca ctg 585 Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly âer Gly Thr Ala Phe Thr Leu 85 90 95 aga ate agt aga gtg gsg gct gag gat gtg ggt gtt tat tac tgt atg 633 Arç He Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met 100 105 110 caa cat cta gaa tat ccg ctc acg ttc mt gct ggg aec aag ctg gag 681 Gin HiS Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ma Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 130 ctg aaa egç gct gat gct gea eca act gta tcc ate ttgggtaccg 727 Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro vai Ser ile 135 140 agctcgaatt cgtaatcatg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattg 773

<210> 22 <211> 360 <212> ADN 46 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência nucleotídica da região variável de cadeia pesada do ST2146 sintético <220> <221> CDS <222> (D < 4 0 0 > 22 sag gtg aaa ctg cag cag tet gga cct gag ctg gtg aag cet ggg gct 48 lys vai Lys LSU Gin Gin Ser Gly Pro Gltt Leu Vai Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gta tGC tgc aag gct tet ggt tat gea ttc act age tac n Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Giy Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 aac atg tac tgg gtg aag cag aqc cat gga aag age ett gag tgg att 144 Asn Met Tyr Trp Vai Ly e Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45 gga tat att gat cct tac aat ggt gtt act age tac aac cag aag ttc 192 Gly Tyr lie Asp Pr o Tyr Asn Gly Val Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Pha 50: 55 60 aag ggc aag qcc aca ttg act gtt gac aae tcc tcc age aca gee tac 240 Lys Gly lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cat etc aac age ctg aca tet gag gac tet gea gtc tat tac tgt 288 $3et His Lê a Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga WB ggc ggt agt ate tac tat gct atg gaC tas tgg ggc oaa 336 Ala Arg Gly Gly Gly Ser 11 e Tyr Tyr Ala Kôt Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 m acc acg gtc acc gtc tcc tca 3S0 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 12 Ô 47

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição wo 9204464 A, Wistar [0004] EP 0496074 A, G. Paganelli WO 9404702 A [0006] US 5578287 A [0006] US 5624659 A [0010] JP 2219590 A [0010] US 6335014 B [0010] US 4675187 A [0025] US 5968405 A [0046] [0049] wo 02066075 A [0046] US 60359295 B [0078] [0010] [0005] [0046] [0049] [0058]

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Antibody-Avidin Fusion Protein Specific for the Transferrin Receptor serves as a Delivery Vehicle for Effective Brain Targeting: Initial Applications in Anti-HIV Antisense Drug Delivery to the Brain 1. J Immunol, 1999, vol. 163, 4421-4426 [0077] • Paganelli G.; Grana C.; Chinol M.; Cremonesi M.; De Cicco C.; De Braud F.; Robertson C.; Zurrida S.; Casadio C.; Zoboli S. Antibody-guided three step therapy for high grade glioma with yttrium-90 biotin. Eur j Nucl Med, 1999, vol. 26 (4), 348-357 [0077] • Paganelli G.; Bartolomei M.; Ferrari M.; Cremonesi M.; Broggi G.; Maira G.; Sturiale C.; Grana C.; Prisco G.; Gatti M. Pre-targeted locoregional radioimmunotherapy with 90Y-biotin in glioma patients: Phase I study and preliminary therapeutic results. Câncer Biother & Radiopharm, 2001, vol. 16 (3), 227-235 [0077] 51 • Ramos D.M.; Chen B; Regezi J; Zardi L; Pytela R.

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Lisboa 01/12/2010

Claims (28)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal anti-tenascina humana cujas sequências das regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada são respectivamente as SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:2, e seus fragmentos proteoliticos que se ligam a um epitopo antigénico com a repetição de tipo EGF da tenascina C humana.

2. Anticorpo monoclonal contra a tenascina C humana, cuja região variável de cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos designadas por SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13 e cuja região variável da cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos designadas por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 19, ou um fragmento do referido anticorpo monoclonal, em que o referido anticorpo ou o referido fragmento se liga a um epitopo antigénico com a repetição de tipo EGF da tenascina C humana.

3. Anticorpo e seus fragmentos de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, contendo ainda marcadores e/ou agentes de diagnóstico suplementares.

4. Anticorpo ou seus fragmentos biotinilados, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, que se ligam a um epitopo antigénico com a repetição de tipo EGF da tenascina C humana.

5. Linha de células de hibridoma, produtora de um anticorpo monoclonal anti-tenascina humana, que se liga a 2 um epítopo antigénico com a repetição de tipo EGF da tenascina C humana, depositado na instituição 'Advanced Biotechnology Center' a 29 de Janeiro de 2002, ao abrigo do Tratado de Budapeste, com o número PD02003.

6. Anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma da reivindicação 5.

7. Processo para a preparação do anticorpo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, o qual consiste em criar em cultura o hibridoma da reivindicação 5 e em isolar o referido anticorpo.

8. Utilização do anticorpo ou dos seus fragmentos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou do anticorpo ou dos seus fragmentos biotinilados de acordo com a reivindicação 4, para a preparação de meios de diagnóstico para a detecção de patologias em que ocorre a expressão de tenascina.

9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que a referida patologia é um tumor.

10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o referido tumor é seleccionado entre o conjunto constituído por gliomas, tumores mamários, carcinomas pulmonares, fibrossarcomas e carcinomas das células escamosas.

11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que os meios de diagnóstico são utilizados em técnicas de imagiologia in vivo. 3

12. Utilização do anticorpo ou seus fragmentos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou do anticorpo ou seus fragmentos biotinilados de acordo com a reivindicação 4, para a preparação de um medicamento para tratar tumores em que ocorre a expressão de tenascina.

13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o referido tumor é seleccionado entre o conjunto constituído por tumores císticos cerebrais, gliomas, tumores mamários, carcinomas pulmonares, fibrossarcomas e carcinomas das células escamosas.

14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, em que o referido medicamento tem a forma de um estojo adequado para a realização do método de pré-direccionamento do anticorpo contra o alvo em três etapas (three step pre-targeting).

15. Estojo terapêutico constituído por 5 frascos, em que o primeiro frasco contém o anticorpo ou os seus fragmentos biotinilados de acordo com a reivindicação 4, o segundo frasco contém uma avidina, o terceiro frasco contém albumina biotinilada, o quarto frasco contém uma estreptavidina e o quinto frasco contém uma biotina ou um derivado de biotina marcado com um radioisótopo.

16. Estojo terapêutico de acordo com a reivindicação 15, em que os referidos frascos são adequados para injecção em seres humanos. 4

17. ADN que codifica o anticorpo ou os seus fragmentos de acordo com as reivindicações 1 ou 2.

18. Proteínas que compreendem ou contêm as CDR que se ligam a um epítopo antigénico dentro da repetição de tipo EGF da tenascina C humana, possuindo as sequências de aminoácidos designadas por SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13 e as sequências de aminoácidos designadas por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 19.

19. Vector que contém o ADN da reivindicação 17.

20. Células hospedeiras que contêm os vectores da reivindicação 19.

21. Utilização do anticorpo ou seus fragmentos de acordo com as reivindicações 1 a 3 em combinação com um segundo anticorpo específico da tenascina num ensaio em sanduíche para a produção de um estojo de diagnóstico para a determinação do nível de tenascina circulante.

22. Estojo de diagnóstico que compreende o anticorpo ou os seus fragmentos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

23. Recipiente que contém o anticorpo ou os seus fragmentos biotinilados de acordo com a reivindicação 4 e agentes tampão e reagentes adequados para utilização num estojo terapêutico para um método de pré-direccionamento do anticorpo contra o alvo em três etapas. 5

24. Recipiente de acordo com a reivindicação 23, o qual possui diversos compartimentos.

25. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 24, o qual contém também um anticorpo separado, especifico da tenascina, dirigido preferencialmente contra o fragmento A-D.

26. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 24, o qual contém também um anticorpo separado, específico para um tumor.

27. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em combinação com um segundo anticorpo específico da tenascina num protocolo ELISA em sanduíche num ensaio in vitro em condições em que o referido segundo anticorpo se liga a um segundo epitopo antigénico da tenascina, sendo o referido ensaio ELISA in vitro útil para a determinação do nível de tenascina circulante.

28. Composição farmacêutica que compreende o anticorpo e/ou um seu fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em mistura pelo menos com um excipiente e/ou veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 01/12/2010