MXPA04008216A - Anticuerpo monoclonal tenascina anti-humano. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un nuevo anticuerpo monoclonal ST2146 tenascina anti-humano, dotado con alta afinidad con el antigeno nativo y alta selectividad al tumor. El hibridoma cST2146 establemente produce el anticuerpo en condiciones de cultivo de alta densidad y es adecuado para el desarrollo industrial de productos a base de ST2146. El ST2146 presenta propiedades explotables para aplicaciones tanto terapeuticas como de diagnostico.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL TENASCIÑA ANTI-HUMANO Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales tenascina anti-humanos , métodos y materiales para obtenerlos, el uso de dichos anticuerpos para la preparación de medios de ¦ diagnóstico y medicamentos para la diagnosis y tratamiento, respectivamente, de tumores que expresan tenascina y materiales que comprenden dichos anticuerpos adecuados para uso en el campo médico. Antecedentes de la invención La especificidad de la terapia de tumor es a menudo, una etapa limitante en la determinación de los logros de un tratamiento. En efecto, el comienzo de los efectos tóxicos y la tolerabilidad reducida de ciertos agentes anticancerígenos limitan su uso y la calidad de vida de los pacientes . La reducción de la toxicidad está directamente ligada a la selectividad del tratamiento para células cancerígenas. Los anticuerpos monoclonales representan los medios ideales para el reconocimiento específico de tumores y, cuando se combinan con el sistema de amplificación avidina/biotina, constituyen una trayectoria extremadamente poderosa y selectiva para suministrar porciones activas al sitio del tumor.

REF . : 157747 La tenascina es una de las proteínas de matriz extracelular y muestra expresión restringida al sitio durante la embriogénesis , y se puede encontrar en tejidos adultos durante la curación de heridas y tumorigénesis , así como también en vasos sanguíneos de tumor nuevamente formado. La tenascina está ausente en tejido adulto normal, pero está expresada en el estroma de una variedad de tumores sólidos, tales como gliomas (Burdon, et al., Cáncer Res. 43 :2796-2805, 1983), carcinomas mamarios [Chiquet-Ehrismann, et al., 1986), de pulmón (Natali et al., Intl. J. Cáncer 54:56-68, 1989), fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas (Ramos D. M. et al., Int. J. Cáncer 75:680-687, 1998). La tenascina se encuentra en gliomas, pero no en tejido cerebral normal. Para una discusión de tenascina, se puede hacer referencia al documento WO 92/04464, Wistar, y referencias relacionadas. Basados en las enseñanzas del documento EP 0 496 074, G. Paganelli et al, desarrolló un procedimiento pre-objetivo de tres etapas para. el tratamiento sistémico y locoregional de tumores [Cremonesi M. et al., Eur. J. Nucí. Med. 26(2) :110-120, 1999; Paganelli G. et al., Eur. J. Nucí. Med. 26(4) :348-357, 1999; Paganelli G. , et al., Cáncer Biother. & Radiopharm. 16 (3) :227-235, 2001). Otras referencias al método pre-objetivo de tres etapas son el documento WO 94/04702 y US 5,578,287. El tratamiento pre-objetivo de tres etapas se basa en administración intravenosa, secuencial, de anticuérpo monoclonal anti-tenascina biotinilada, estreptavidina y biotina etiquetada 90Y, con dos administraciones consecutivas de avidina y albúmina biotinilada antes de estreptavidina y biotina etiquetada 90Y, respec ivamente, para reducir el antecedente no específico. La selectividad del procedimiento pre-objetivo de tres etapas de Paganelli, confía en el uso de un anticuerpo monoclonal anti-tenascina. El objetivo de matriz extracelular, comparado con el objetivo de antígenos de células tumorales, presenta la ventaja de ser inafectados por modulación del antígeno de células tumores, de este modo, representando un objetivo ideal para la terapia anti-tumoral . La dosis y sincronización de administraciones del tratamiento pre-objetivo de tres etapas, se ha fijado para lograr la relación de distribución de tumor/sin tumor óptima. Los datos obtenidos de 48 pacientes con glioblastoma (GBM) ' o astrocitoma anaplástico (AA) , incluidos en el estudio de Paganelli, muestran una carencia substancial de toxicidad, con la excepción de alguna reacción alérgica a estreptavidina (la cual puede ser superada usando avidina) , e indicación preliminar de la eficacia terapéutica. En efecto, 2 meses después del término del tratamiento, 25% de pacientes mostraron una reducción en el tamaño de tumor (Respuesta completa (reducción de tumor >50%)=6%; respuesta parcial (reducción de tumor <50%)=11%; respuesta menor (reducción de tumor <25%)=8%) y 52% de pacientes que no han progresado, con una relación de respuesta total superior al 77%. En algunos de estos pacientes, cuya expectación de vida fue menos de seis meses, la respuesta persistió por más de un año (Paganelli et al., 1999). El papel del anticuerpo anti-tenascina biotinilado, está localizado en el sitio del tumor y presenta biotinas para mediar la subsecuente avidina y acumulación de biotina 90Y. Los anticuerpos anti-tenascina se describen por ejemplo, en el documento US 5,624,659, Duke University, JP 2219590, Rikagaku y el . documento mencionado anteriormente WO 92/04464. Se describe un anticuerpo anti-tenascina en Siri A. et al., Nucí. Acid. Res. 19 (3) : 528-531, 1991; Balza E. et al., FEBS 332:39-43, 1993, y su uso para propósitos terapéuticos se describe en los mencionados anteriormente Cremonesi M. et al., Eur. J. Nucí. Med. 26 (2) :110-120, 1999, Paganelli G. et a., Eur. J. Nucí. Med. 26 (4) : 348-357, 1999; Paganelli G et al., C ncer Biother. & Radiopharm. 16 (3) :227-235, 2001. El clon usado para generar el anticuerpo anti-tenascina en la técnica, se conoce como BC4. El presente solicitante encuentra el clon BC4 inadecuado para el desarrollo industrial y propósitos regulatorios, debido a la producción de una cadena ligera adicional, no funcional (muy probablemente de origen mieloma parental) , cuyo nivel de expresión incrementa bajo la presión de cultivación escalonada, de este modo, previniendo la purificación de anticuerpo a gran escala. Sumario de la invención Se ha encontrado ahora, que se puede producir un anticuerpo monoclonal tenascina anti-humano, el cual resuelve los problemas mencionados anteriormente, es decir, un anticuerpo monoclonal que carece de la expresión de cadenas ligeras no funcionales. Por lo tanto, este anticuerpo es un objeto de la presente invención, junto con un método para obtener dicho anticuerpo, su uso en terapia, en particular para la preparación de un medicamento empleado para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por la expresión de tenascina, tales como tumores . La presente invención proporciona un anticuerpo y fragmentos de anticuerpos los cuales pueden también contener marcadores adicionales y agentes de diagnóstico, composiciones que contienen estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, y composiciones de diagnóstico y terapéuticas que las contienen, su uso en terapia y diagnósticos y métodos para elaborar estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. La presente invención también se dirige a un anticuerpo que codifica el ADN y fragmentos, vectores que contienen ADN, células hospedadoras que contienen vectores, proteína codificada por una proteína que codifica un ADN de las SEC ID' NOs . : 1 y 2; ADN que codifica una proteína y fragmentos; CDR específicos y proteínas que comprenden o contienen CDRs . De conformidad con la presente invención, dicho anticuerpo está, en una modalidad, caracterizado porque las secuencias de regiones variables de cadena ' ligera y pesada son SEC ID N0:1 y SEC ID N0:2, respectivamente. Estas secuencias se muestran en las Figuras 10 y 11. Por motivos de brevedad, el anticuerpo preferido de conformidad con la presente invención, será identificado con el nombre ST2146. Mientras la presente invención se enfoca en ST2146, como una ej emplificación de la presente invención, uno de habilidades ordinarias en la técnica apreciará que, una vez dada la presente descripción, otros anticuerpos similares y fragmentos de anticuerpos de ST 2146, así como también fragmentos de anticuerpos de estos anticuerpos similares, pueden ser producidos y usados dentro del ámbito de la presente invención. Tales anticuerpos similares pueden ser producidos por una cantidad razonable de experimentación, por aquellos expertos en la técnica. La presente invención por lo tanto, proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpo (tal como por ejemplo, una quimera de humano-ratón) o molécula de inmunoglobulina la cual enlaza específicamente a tenascina. La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina que comprende al menos, un CD de la cadena ligera variable de ST2146 y/o un CDR de la cadena pesada variable de ST2146. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina de la presente invención, puede ser un anticuerpo, un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, un anticuerpo de cadena única, o un anticuerpo multimérico. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina ' de la presente invención, puede ser una molécula Ig , IgD, IgG, IgA o IgE. La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina que comprende al menos, una de las secuencias SEC ID Nos. 1 , 2 , 9 , 11, 13 , 15 , 17 ó 19. La presente invención además, proporciona secuencias de ácido nucleico las cuales codifican las secuencias de aminoácidos de la presente invención, tales como las secuencias de las SEC ID NOs . : 1, 2, 9, 11, 13, 15, 17 ó 19. La presente invención proporciona por lo tanto, una secuencia de ADN que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina de la presente invención. Tales secuencias de ADN incluyen al menos, una secuencia de ADN o subsecuente, seleccionada de las SEC ID NOS.: 3, 4, 10, 21, 14, 16, 18 o 20.

Otra modalidad se dirige a una molécula de ácido nucleico purificada que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo o quimera de anticuerpo o producto de molécula de inmunoglobulina de . la invención. Una molécula de ácido nucleico, que codifica un producto de inmunoglobulina de la invención, puede ser elaborado usando técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden ser sintetizados oligonucleotidos usando sintetizadores de oligonucleotidos y ligados en conjunto para formar una estructura lectora abierta funcional que codifica un producto de inmunoglobulina de la invención. La molécula de ácido nucleico una vez sintetizada, puede ser clonada en un vector de ácido nucleico. Un vector de ácido nucleico tal como un plásmido, cósmido, fagémido, plásmido de levadura, vectores fagos, plásmido TI y similares, se conocen en la técnica. El vector puede ser un vector de expresión. Los vectores de expresión y sistemas de expresión, son comercialmente disponibles a partir de suministros . tales como Stratagene (La Jolla, Calif . ) . Otra modalidad de la invención, se dirige a una célula que comprende un ácido nucleico de la invención. Una célula puede ser elaborada por transfección . Se conocen métodos de transfección y los kits para transfección de células procarióticas y eucarióticas , se pueden adquirir de fuentes comerciales (por ejemplo, Stratagene, La Jolla, Calif.) .

Otra modalidad de la invención, se dirige al uso del anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina de la invención para medios útiles para detectar o diagnosticar un trastorno, que comprende las etapas poner en contacto una muestra de tejido a partir de un sujeto bajo tal condición, que permite la formación de un complejo entre dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina y un antígeno de tenascina, y determinar la formación de dicho complejo. Otra modalidad de la invención, se dirige al uso de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina de la invención o un ácido nucleico de la invención, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que expresan tenascina, en particular tumores. Se conocen los métodos para inmunoterapia de cáncer. Véase por ejemplo en Oíd, L. J. Immunotherapy for Cáncer, Scientific American, Septiembre 1996. Otra modalidad se dirige a una composición terapéutica que comprende un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina de la invénción. Los productos de inmunoglobulina de la invención pueden ser proporcionados en la forma de una composición que comprende el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable . La composición terapéutica puede ser usada para el tratamiento de trastornos en un mamífero tal como un humano. El medicamento se administrará a un mamífero en una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina de la invención al mamífero. En su uso como un agente terapéutico, el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina de la invención, puede ser ligado a un agente. El enlace puede ser por enlaces covalentes o por enlace de epítope anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina, puede ser reticulado a un segundo anticuerpo, en donde el segundo anticuerpo puede tener una afinidad para el agente . El agente puede ser un agente citotóxico. El término "agente citotóxico" como se usa aquí, se refiere a una substancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa destrucción de las células. El término está propuesto para incluir epítopes radioactivos (por ejemplo, I, Y, Pr) , agentes quimioterapeuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, planta o animal, o fragmentos de los mismos. El agente puede ser un agente quimioterapéutico . Un agente quimioterapéutica- es un compuesto químico empleado en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, Doxorubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinosido ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etoposido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas , Esperamicinas (Véase Patente Estadounidense No. 4,675,187), Melfalano y otras mostazas de nitrógeno relacionadas. El agente puede ser una citosina. El término citosina es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular, las cuales actúan en otro célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citosinas con .linfocinas , monocinas, y hormonas de polipéptidos tradicionales. Incluidas entre las citosinas están hormona de crecimiento tal como la hormona del crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionilo y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroides ; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como hormona estimulante del folículo (FSH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento del fibroblasto; prolactina; lactógeno placental; factor de necrosis del tumor; substancia que inhibe al útero; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento del nervio tales como NGF; factor de crecimiento de plaquetas ,-factores de crecimiento de transformación (TGFs) ; factor-I y II de crecimiento similar a la insulina;- eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos ; interferonas tales como interferona-alfa, beta, y gama, factores que estimulan la colonia (CSF) ; macrófago del granulocito-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF) ; interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-l.alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor necrosis del tumor; y otros factores de polipéptidos que incluyen LIF y kit de ligando (KL) . Como se usa aquí, el término citosina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia nativa. Para diagnósticos, el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina de la invención, puede estar unido a una etiqueta, tal como para un compuesto o composición detectable, el cual está conjugado directamente o indirectamente al anticuerpo. La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo, etiquetas de radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de substrato el cual es detectable . La invención también contempla la generación . de mutantes, de los CDR descritos por los mutantes, uno o más aminoácidos en la secuencias de las CDR. Se sabe que una substitución única de aminoácido apropiadamente colocado en un CDR, puede ser suficiente para originar la afinidad. Los investigadores han usado mutagenesis dirigida al sitio para incrementar la afinidad de algunos productos de inmunoglobulina por alrededor de 10 veces . Este método de incrementar o disminuir la afinidad de anticuerpos por mutación CDR, es comúnmente conocido (véase por ejemplo, Capítulo 23, Pa l, W. E., Fundamental Immunology, Raven Press, NY. N.Y. 1993) . De este modo, la substitución, supresión o adición de aminoácidos al CDR de la invención, para incrementar o disminuir la afinidad de enlace o especificidad, está también dentro de la contemplación de la invención. Un aspecto adicional de la presente invención es proporcionar un medicamento para tratar un individuo con un tumor, tal como tumores cerebrales císticos, gliomas, tumores mamarios, carcinomas de pulmón, fibrosarcomas o carcinomas de células escamosas, las cuales involucran administrar a un sujeto humano afligido con el tumor, como un tumor cerebral cístico (por ejemplo, uno el cual expresa tenascina) , un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina de la presente invención, que se enlaza a tenascina en una cantidad terapéuticamente efectiva. La etapa de administración se puede llevar a cabo depositando el anticuerpo en la cavidad del tumor. También como se describe aguí, está un método para tratar un tumor sólido, el cual comprende primero, remover un tumor sólido (por ejemplo, uno que exprese tenascina), a partir de un órgano de tejido sólido (por ejemplo, el cerebro) , de un sujeto humano enfermo; después formar una cavidad de resección adjunta en el órgano del sujeto en la ubicación a partir de la cual se removió el tumor sólido; y después administrar al sujeto un agente antineoplástico tal como un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, quimera de anticuerpo o producto de inmunoglobulina de la presente invención (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza a tenascina) , el cual es selectivamente tóxico a las células del tumor sólido en una cantidad terapéuticamente efectiva. En una modalidad de la invención, la etapa de administración se lleva a cabo depositando el agente antineoplástico en la cavidad de resección. Otro objeto de la presente invención, son fragmentos proteolíticos de dicho anticuerpo, que se enlazan a un epítope antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina C humana. En el curso de la descripción de la presente invención, por fragmentos anticuerpo están propuestos aquellos fragmentos los cuales se enlazan a un epítope antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina humana C. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo y los fragmentos de los mismos pueden además, contener marcadores adicionales y/o agentes de diagnóstico.

Dichos marcadores y/o agentes de diagnóstico son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica a las cuales se dirige la presente invención. De conformidad con una modalidad preferida de la presente invención, dicho anticuerpo o fragmentos proteolíticos de los mismos son biotinilados . Otro objeto de la presente invención es la línea de células de hibridoma, aquí nombradas CST2146, que producen dicho anticuerpo. La línea de células de hibridoma se ha depositado con el Advanced Biotechnology Center (por sus siglas en inglés, Centro Avanzado de Biotecnología), L.go Rosanna Benzi, 10 16132 GENOVA-Italia, el 29 de Enero de 2002, conforme la provisión del 'Tratado de Budapest, y se ha asignado el Acceso N°PD02003. La presente invención también comprende ADN que codifica el anticuerpo o fragmentos de los mismos, CDR específicos y proteínas que comprenden o contienen CDR, vectores que contienen dicho ADN y células hospedadoras que contienen dichos vectores. Otro objeto de la presente invención son los . derivados recombinantes de dicho anticuerpo. En particular, los derivados recombinantes preferidos son aquellos en donde la región constante murina es reemplazada por la contraparte humana (Ferrer C. et al., J. Biotechnol . 52: 51-60, 1996), o aquellos en donde la región constante murina es reemplazada por una porción biológicamente activa, tal como por ejemplo, un miembro de la familia avidina (Manuel L. et al., J. Immunol., 163:4421-4426, 1999), un factor de crecimiento empleado para estimulación de los efectores inmunológicos dirigidos al tumor (tales como por ejemplo, G-CSF, GM-CSF) , o aquellos en donde la región constante murina es reemplazada por una porción farmacológicamente activa, tal como por ejemplo, una toxina, un superantígeno, una citosina o cualquier otra proteína empleada en el mejoramiento de la eficacia terapéutica antitumoral (Di Massimo A.M. et al., British J. Cáncer 75 (6) : 822-828, 1997; Párente D. et al., Anticancer Research 17 (6A).-4073-4074, 1997). Los métodos para obtener dichos derivados recombinantes son bien conocidos en la técnica. Otro objeto de la presente invención, son los derivados conjugados de dicho anticuerpo. En particular, los derivados conjugados preferidos son aquellos en donde las porciones biológicamente activas están ligadas al anticuerpo por medio de métodos convencionales. Ejemplos de porciones biológicamente activas son elementos de la familia avidina, un factor de crecimiento empleado para la estimulación de los efectores inmunológicos dirigidos al tumor (tal como por ejemplo, G-CSF, GM-CSF) , una porción farmacológicamente activa tal como por ejemplo, una toxina, un superantígeno, una citosina o cualquier otra proteína empleada en el mejoramiento de la eficacia terapéutica antitumoral, fármacos antituorales, radioisótopos. De conformidad con la presente invención, derivados recombinantes o conjugados de tenascina antihumana monoclonal o fragmentos de los mismos, también están indicados como "derivados" . En una modalidad más particularmente preferida de la invención, distinto del anticuerpo y los fragmentos, también los derivados de los mismos son biotinilados . Todavía otro objeto de la presente invención es la línea de células de hibridoma que producen el anticuerpo, como se definen anteriormente. Dicho hibridoma ha sido depositado con el Advanced Biotechnology Center el 29 de Enero de 2002, bajo la provisión del Tratado de Budapest, con el número PD02003. Como un objeto adicional de la presente invención, se proporciona un proceso para la preparación del anticuerpo monoclonal, dicho proceso comprende cultivar la línea celular hibridoma y aislar el anticuerpo. Otro objeto de la presente invención, es el uso del anticuerpo monoclonal tenascina anti-humano, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que expresa tenascina, en particular un tumor. Una lista ejemplar no limitante, de tumores que expresan tenascina son gliomas, carcinomas de mama, pulmón, fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas . Todavía otro aspecto de la presente invención, es un medicamento para la radioinmunoterapxa de tumores, el cual se administra a un sujeto que sufre de un tumor que expresa tenascina, y comprende dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos proteolíticos , o derivados de los mismos. En una modalidad preferida, dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos proteolíticos o derivados de los mismos, son biotinilados, en una modalidad más particularmente preferida, el medicamento es adecuado para radioinmunoterapia, en particular para llevar a cabo el método pre-objetivo de tres etapas, como se describe en la técnica, por ejemplo, en el documento EP 0 496 074, European Journal of Nuclear Medicine Vol . 26, No. 4, Abril 1999; 348-357 y US 5,968,405. En este último aspecto, el medicamento de conformidad con la presente invención, estará en la forma de un kit, dicho kit está compuesto de 5 viales, cuyo primer vial contiene anticuerpo o fragmento o derivado del mismo biotinilado; el segundo vial contiene una avidina, el tercer vial contiene albúmina biotinilada, el cuarto vial contiene una estreptavidina, el quinto vial contiene biotina o derivado de biotina radioetiquetado . Tal clase de kit se proporciona en la European Journal of Nuclear Medicine Vol. 26, No. 4; Abril 199; 348-357. Una avidina comprende avidina, estreptavidina, PEG-avidina o PEG-estreptavidina, di o poliavidina o di- o poliestreptavidina . Una biotina radioetiquetada contiene un radionúclido, tal como se describe en el documento EP 0 496 074, preferiblemente 90Y. Se describen derivados de biotina por ejemplo, en el documento WO 02/066075. Un kit de esta clase se describe en Eurcpean Journal of Nuclear Medicine Vol. 26, No 4; Abril 1999; 348-357. Preferiblemente, los viales son adecuados para inyección humana. Los derivados recombinantes del anticuerpo de la presente invención, así como también sus conjugados, también son convenientemente usados en la terapia de tumor. Aunque el anticuerpo de la presente invención, así como también los fragmentos, derivados y conjugados de los mismos, son adecuadamente usados en el tratamiento de tumores relacionados con tenascina, en particular por medio de inmunoterapia, radioinmunoterapia es una modalidad preferida de la invención. El contenedor específico, preferiblemente en la forma de un vial adecuado para inyección, que comprende el anticuerpo o fragmentos del mismo en la forma biotinilada, es otro objeto de la presente invención. En otra modalidad de la presente invención, en el kit terapéutico, el anticuerpo biotinilado es combinado con otros anticuerpos específicos de tenascina, preferencialmente dirigidos hacia el fragmento A-D. Alternativamente, el anticuerpo biotinilado es combinado con otros anticuerpos específicos del tumor. Una enseñanza general de dicha clase de kit se proporciona en el documento EP 0 496 074, European Journal of Nuclear Medicine Vol . 26, No. 4; Abril 1999; 348-357 y US 5, 968,405. En particular, la presente invención también abarca un contenedor, opcionalmente que contiene múltiples compartimientos, que comprende el anticuerpo biotinilado o fragmentos o derivados de los mismos, amortiguadores y reactivos adecuados para uso en un kit terapéutico para un método pre-objetivo de tres etapas. Otro objeto de la presente invención, es el uso de dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos, o derivados recombinantes o · conjugados de los mismos o derivados biotinilados de los mismos, para la preparación de medios de diagnósticos, para la detección de enfermedades que expresan tenascina, en particular para formación de imágenes in vivo del tuiror. En una modalidad particular de la presente invención, dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos o derivados de los mismos, son usados en combinación con un segundo anticuerpo especifico de tenascina en un ensayo de intercalación para la producción de un kit de diagnóstico para la determinación del nivel de circulación de tenascina. El ensayo de intercalación es por ejemplo, un ensayo ELISA in vitro, bajo condiciones en donde el segundo anticuerpo se enlaza a un segundo epítope antigénico de tenascina, dicho ensayo ELISA in vitro es empleado para la determinación del nivel de circulación de tenascina. Los kits de diagnóstico o terapéuticos que comprenden el anticuerpo o fragmentos o derivados de los mismos, son un objeto adicional de la presente invención. Estos y otros objetos de la presente invención, se describirán en detalle en la siguiente descripción también por medio de ejemplos y figuras. Breve Descripción de las Figuras Figura 1: muestra la representación esquemática de tenascina-C humana, los fragmentos y reactivos antigénicos recombinantes relacionados, así como también la estrategia usada para generar un anticuerpo similar a BC-4. Figura 2 : muestra la confirmación de la naturaleza glicosídica de la variabilidad de cadena pesada ST2146, digiriendo el anticuerpo con una sialidasa. El ST214S fue amortiguador intercambiado con una columna de desalación HiTrap (Amersham-Pharmacia) , a 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio que contiene 150 mM de NaCl, a pH 6.4. El Mab se concentró en 100,000 centricones MWCO (Millipore) , a una concentración final de alrededor de 1 mg/ml y se digirió con 1.5 U/ml de sialidasa (Sigma) por 24 horas a 37°C. Las muestras se sometieron a electroforesis en gel de placa de poliacrilamida al 12%. El teñido del gel se hizo por Azul Brillante de Coomassie. Figura 3: Muestra la homogeneidad total de ST2146 contraria a BC4. (Nota: La cadena ligera roja se encontró no es funcional. Por lo tanto, el BC4 completamente funcional corresponde solamente al pico 3) . Figura 4: muestra manchado Western ST2146 que se enlaza al epítope tenascina humana comparado con el epítope antigénico de BC4 (Línea D está vacia) . Figura 5: muestra el ELISA competitivo en donde ST2146 fuertemente compite con BC4 en el enlace a tenascina humana, mientras ST2077 muestra solamente competición parcial. El ST2077 es un anticuerpo monoclonal especifico de tenascina obtenido en el procedimiento para generar ST2146. ST2077 muestra especificidad ST2146 similar (región de repetición similar a EGF de tenascina humana) , pero se dirige hacia un epítope antigénico solamente interfiriendo parcialmente con el epítope BC4/ST2146. Figuras 6A-6B: muestran la inmunoreactividad de ST2146 por ELISA en comparación con el pico completamente activo BC4. Figura 7 : muestra el protocolo para estudio de biodistribución de ST2146. Figura 8 : muestra la biodistribución para ST2146 en comparación con BC4 (biot=biotinilado ; IR=Inmunoreactividad expresada como la cantidad de anticuerpo para obtener 1.0 O.D. en ELISA) . Figura 9: muestra la relación de tumor/sin tumor para ST2146 en comparación con BC4. Figura 10: muestra la secuencia de ST2146 variable de cadena ligera (VL) (SEC ID NOs : 1 (longitud completa de aminoácido) , 3 (ADN que codifica el aminoácido) , 9 (aminoácido de cadena ligera de CDR1) , 10 (ADN de cadena ligera de CDR1) , 11 (aminoácido de cadena ligera de CDR2) , 12 (ADN de cadena ligera de CDR2) , 13 (aminoácido de cadena ligera de CDR3) , 14 (ADN de cadena ligera de CDR3) y 21 (ADN de longitud completa) ) . Figura 11 muestra la secuencia de ST2146 variable de cadena pesada (VH) , (SEC ID NOs : 2 (aminoácido de longitud completa) , 4 (ADN que codifica un aminoácido) , 15 (aminoácido de cadena pesada de CDR1) , 16 (ADN de cadena pesada de CDR1) , 17 (aminoácido de cadena pesada de CDR2) , 18 (ADN de cadena pesada de CDR2) , 19 (aminoácido de cadena pesada de CDR3) y 20 (ADN de cadena pesada de CDR3) y 22 (ADN de longitud completa) ) .

Descripción Detallada de la Invención El ST2146 se obtiene el clon de células de hibridoma correspondientes CST2146 como se da en detalle en los siguientes ejemplos. Hasta donde los aspectos industriales de la presente invención están relacionados, el anticuerpo aquí descrito será adecuadamente formulado en composiciones farmacéuticas o kits de diagnóstico como se hace normalmente en este campo técnico. Las composiciones farmacéuticas son convencionales en este campo, y pueden elaborarse por las personas expertas en la técnica solo basadas en el conocimiento general común. Ejemplos de composiciones farmacéuticas se dan en las referencias mencionadas en la presente invención. Lo mismo aplica a kits de diagnóstico. Particularmente preferido en el kit para radioinmunoterapia de tumores como se describe en los documentos mencionados anteriormente por Paganelli et al., y EP 0 496 074. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo y/o un fragmentos y/o un derivado recombinante y/o un conjugado del mismo en mezcla con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o vehículo, están incluidos en el ámbito de la presente invención.

El siguiente ejemplo, además ilustra la invención. E emplo 1 Para generar un nuevo clon de células de hibridoma con la especificidad de BC4 pero que carece de la expresión de cadena ligera no funcional, se inmunizaron ratones Balb/c con lisado de fago de E. coli pTn28. El pTn28 es un clon recombinante gtll que codifica un fragmento de la repetición similar EGF de tenascina humana, que previamente muestra contener- el epítope BC4 {Balza E. et al., 1993). La representación esquemática de tenascina-C humana, los fragmentos y reactivos antigénicos recombinantes relacionados, así como también la estrategia usada para generar un anticuerpo similar a BC-4, se dan en la figura 1. Esplenocitos inmunizados pTn28 fueron fusionados a células de mieloma que no producen Sp2/0Agl4 por método estándar {Cianfriglia M. et. al., Methods Enzymol . 121:193210, 1986) y la población de hibridoma se selecciona por ELISA en tenascina purificada SK-MEL-28 (línea de células de melanoma humano) . Los hibridomas específicos de tenascina se clonaron limitando la dilución dos veces en FCS que contiene medio y tres veces en medio libre de proteína (Animal Derived Component Free Médium HyClone, HyQR Perbio) . El subclon cST2146/D3d/F6e fue finalmente seleccionado para la producción del Master Cell Bank (por sus siglas en inglés, Banco de Células Principales) CST2146 (MCB) y Working Cell Bank (por sus siglas en inglés, Banco de Células de Trabajo (WCB) . La producción del Material de Referencia ST2146 se hizo por cultivación de células de hibridoma CST2146 en el Bioreactor de 2L y la estabilidad del Banco de Post-Producción de Células CST2146 (PPCB) , se confirmó por análisis FACS y Dilución Limitante. ST2146 es una inmunoglobulina de ratón del isotipo IgG2b/k. ST2146 probó ser homogéneo para la composición de cadena ligera como se muestra reduciendo el análisis SDS-PAGE, el cual también mostró un cierto grado de heterogeneidad de la cadena pesada. Esta observación fue consistente con una variabilidad en la glicosilación 0-ligada como se reporta previamente para el isotipo IgG2b de murina (Kim H. Et al., J. Biol. Chem. 269 (16) :12345-12350, 1994). La consistencia en el patrón de bandas de cadena pesada ST2146, se observó en tres diferentes lotes obtenidos de medio de cultivo que contiene FCS o medio libre de proteína. La confirmación de la naturaleza glicosxdxca de la variabilidad de la cadena pesada ST2146, se produjo digiriendo el anticuerpo con una sialidasa. El ST2146 fue amortiguador intercambiado con una columna de desalación HiTrap (Amersham-Pharmacia) , a 10 mM de amortiguador de fosfato de sodio que contiene 150 mM de NaCl, a pH 6.4. El Mab se concentró en 100,000 centricones MWCO (Millipore) , a una concentración final de alrededor de 1 mg/ml y se digirió con 1.5 U/ml de sialidasa (Sigma) por 24 horas a 37 °C. Las muestras se sometieron a electroforesis en gel de placa de poliacrilamida al 12%. El teñido del gel se hizo por Azul Brillante de Coomassie. Como se esperaba, esta digestión resultó en la eliminación de la banda de peso molecular superior (Figura 2) . La homogeneidad total del ST2146 también se confirmó por cromatografía de hidroxilapatito, la cual mostró un pico único para ST2146, contrario a los tres picos observados para BC4 (Figura 3, en donde el BC4 completamente funcional, corresponde al pico 3) . El ST2146 enlaza tenascina humana a un epítope estrictamente relacionado, sino idéntico, al epítope antigénico de BC4 como se muestra por el Manchado Western (Figura 4) y ELISA competitivo (Figura 5) . En la Figura 5, se mezcló BC4 biotinilado con concentraciones incrementadas de BC4, ST2077 o ST2146 como competidores, y se colocaron en placas, sobre placas revestidas de tenascina. El enlace se midió después de la adición de estreptavidina HRP y substrato cromogénico relacionado. El ST2077 es un anticuerpo que reconoce un epítope de tenascina dentro de la repetición similar a EGFy parcialmente portada con el epítope BC4. La inmunoreactividad del ST2146 se evaluó por ELISA en comparación con el pico completamente activo de BC4 (pico 3) . La Figura 6 muestra que la cantidad de ST2146 para obtener 1.0 OD en ELISA de concentración de antígeno óptimo (panel A) , es aproximadamente 20 veces menos que la cantidad del pico 3 completamente reactivo de BC4 y aproximadamente 100 veces menos que BC4. Esta diferencia es dramáticamente amplificada en condiciones de limitación de antígeno como en el panel B, en donde solamente ST2146 mantiene una buena inmunoreactividad . La afinidad de ST2146 se evaluó por BIAcore. El D de ST2146 resultó de 1.4xl0"9 (Ka 3.0xl05; kd 4.1xl0~4). Los datos de afinidad ST2146 se compararon con BC4, el cual muestra un KD de 4.9xl0~9 (Ka 1.9xl05; kd 9.3xl0"4). El mantenimiento de inmunoreactividad después de la biotinilación es una característica fundamental de un anticuerpo monoclonal a ser usado para el pre-obj etivo . Para evaluar el comportamiento del anticuerpo diferente ST2146 biotinilado: se investigaron relaciones de biotina y la inmunoreactividad del anticuerpo biotinilado medido por ELISA en comparación a BC4 y ST1897, el último es un anticuerpo monoclonal específico de tenascina con baja afinidad. Resultados en la tabla 1 muestran que la baja biotinilación (2-3 biotinas/mole) afectan ligeramente la inmunoreactividad de anticuerpos monoclonales , independientemente de sus afinidades. La biotinilación superior, hasta 20 biotinas/mole, está asociada con una reducción en la inmunoreactividad. Esta reducción es más alta, si más baja es la afinidad del anticuerpo.

Tabla 1 Estudio de Biotinilación en ST2146 % de Inmunoreactividad Moles de biotina/anticuerpo Mab Afinidad 2-3 3.5-5 7-10 15-20 (nM) ST1897 10 84.8+/-1.3 62.3+/- 26.65+/- 9.45+/- 12.4 13.8 9.26 BC4 4.9 82.4+/- 74.4+/-9.3 67.2+/- 12.6 11.5 12.3 ST2146 1.4 100 89.6+/- 77.63+/- 52.37+/- 4.39 8.59 3.95 % de inmunoreactividad es el promedio de 2-3 experimentos independientes +/- desviación estándar. La afinidad de ST2146 biotinilada se midió por BIAcore y resultó mantenida substancialmente sin materia el número de biotinas similares. La inmunohistoo^imica en diferentes tumores (mama, glioma, colon), muestra selectividad similar para BC4 y ST2146. La conducta farmacológica del ST2146 biotinilado se dirige para establecer la capacidad para localizar las masas del tumor. Los estudios de biodistribución de anticuerpos biotinilados ST2146 y BC4 125I etiquetado, se efectuaron en ratones sin pelo injertados con tumores humanos que expresa tenascina de conformidad con el protocolo en la Figura 7. Los ratones recibieron subcutáneamente células de carcinoma de colon humano HT29 4xl06 en 0.1 mi de solución estéril. Después de 15 dias, cuando la masa del tumor fue aproximadamente de 100 mg, grupos de 5 ratones recibieron intravenosamente BC4, ST2146 125I etiquetado o inmunoglobulinas de ratón normal (nMIg) a 10, 2, 0.5 o 0.1 µg/ratón en 0.1 mi de PBS estéril. Todos los anticuerpos se sometieron biotinilación (7-10 biotinas/mole) y las Mab biotiniladas tanto ST2146 como BC4, muestran una inmunoreactividad de alrededor de 80%. Cada animal recibió la siguiente cantidad de CPMs: Dosis BC4 ST2146 NMIg 10 ug 632.000 570.000 577.000 2 µ5 555.000 639.000 624.000 µg 310.000 401.000 382.000 µ9 186.000. 211.000 174.000 Resultados en la Figura 8 muestran que tanto BC4 como ST2146, específicamente se localizan en la masa del tumor. La cantidad de ambos anticuerpos en el sitio del tumor (expresada como el % de dosis/gramos de tejido inyectado), es dependiente de la dosis con una tendencia de acumulación superior para ST2146. Sin embargo, ST2146 muestra una mejor relación tumor/sin tumor comparada con BC4 como se muestra en la Figura 9. La región variable de la cadena ligera Kappa, se amplificó de ADNc circularizado usando un acoplamiento de cebadores (5 ' -TGTCAAGAGCTTCAACAGGA de la (SEC ID NO: 5), 5'-AAGATGGATACAGTTGGTGC de la (SEC ID NO: 6)), que templa a la región constante de anticuerpo como se describe en M. Sassano et al., Nucí. Ac. Res. (1994) 22, 1768-1769. La región variable de cadena pesada Gamma, se amplificó de ADNc circularizado usando los siguientes cebadores: y2bCHl oligo de ratón GTCACTGACTCAGGAAGTAGCC (SEC ID NO: 7); y2bCH3 oligo de ratón GCAACGTGAGACACGAGGGTCTG (SEC ID NO: 8), que templa a la región constante del anticuerpo como.se describe en M. Sassano et al. Nucí. Ac. Res. (1994) 22, 1768-1769. El PCR se llevó a cabo usando las siguientes condiciones: 1 minuto a 94°C, 1.5 minutos a 60°C, 2 minutos a 72°C por 30 ciclos.. Los fragmentos amplificados se clonaron directamente en plásmido pUC18 cortado de Smal. Se secuenciaron dos clones que contienen la cadena ligera de kappa y 4 clones que contienen regiones variables de cadena pesada gamma. El secuenciamiento se llevó a cabo en M G Biotech, Alemania. Se secuenciaron ambas hebras. No se encontraron ambigüedades . La figura 10 muestra la secuencia de ST2146 de cadena ligera variable (VL, por sus siglas en inglés) . La figura 11 muestra la secuencia de ST2146 de cadena pesada variable (VH, por sus siglas en inglés) .

La caracterización comparativa total de ST2146 hacia BC4 muestra que ST2146 tiene las características siguientes : anticuerpo minoclonal BC4 similar con respecto a la especificidad de epitope; homogéneo con respecto a la composición de cadena ligera y pesada; heterogéneo con respecto a la glicolisación de cadena pesada; superior a BC4 con respecto a inmunoreactividad como se espera basado en la heterogeneidad de BC4 ; alrededor de 3 veces superior a BC4 con respecto a la afinidad; superior a BC4 con respecto al mantenimiento de inmunoreactividad sobre biotinilación; similar a BC4 para selectividad en inmunohistoquimica; superior a BC4 con respecto al tumor objetivo. LISTA DE REFERENCIAS Balza E.( Siri A., Ponassi M. , Caocci F., Linnala A., Virtanen I., Zardi L. Production and characterization of monoclonal antobodies specific for different epitopes of huan tenascin. FEBS 332:39-43, 1993. Chinol M. , Casalini P., Maggiolo M. , Canevari S., Omodeo E.S., Caliceti P., Veronese F.M., Cremonesi M . , Chiolerio F., Nardone E., Siccardi A.G., Paganelli G. Biochemical modifications of avidin improbé pharmacokinetics and biodistribution, and reduce immunogenicity. British Journal of Cáncer 78(2): 189-197, 1998. Cianfriglia M. , Mariani M., Armellini D . , Massone A. , Lafata M. , Presentini L. and Antoni G. Methods for high frequency production of soluble antigen-specific hibridomas ; specificities and affinities of monoclonal antibodies obtained. Methods Enzymol 121:193210, 1986. Cremonesi M. , Ferrari M. , Chinol M. , Stabin M. G. , Grana C. , Prisco G., Robertson C. , Tosí G. , Paganelli G. Three-step radioimmunotherapy with yttrium-90 biotin: dosimetry and pharmacokinetics in cáncer patients . Eur J Nucl Med 26 (2) :110-120, 1999. Di Massimo AM. , Di Loreto M. , Pacilli A. , Raucci G. , D'Alatri L., Melé A. , Bolognesi A. , Polito L.( Stirpe F. and De Santis R. Immunoconjugates made of an anti EGF-receptor Monoclonal Antibody and Type ! RIPs from Saponaria ocymoides or Vaccaria pyramidata. British J. Cáncer 75 (6) : 882-828 , 1997. Párente D . , D'Alatri L. , Di Massimo AM. , Saccinto MP. , Novelli S., Pacilli A., Melé A. and De Santis R. Production and in vitro characterization of a recombinant immunotoxin made of a single chain anti-EGF receptor antibody and a type ribosome-inactivating protein (RIP) from filamentous fungus Aspergillus clavatus. Anticancer Research 17 (6A) :4073-4074, 1997.

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Claims (34)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Anticuerpo monoclonal tenascina anti-humano cuyas secuencias de región variable de cadena pesada y ligera, caracterizado porque son la SEC ID N0:1 y SEC ID N0:2, respectivamente, y los fragmentos proteolíticos de los mismos que enlazan a un epitope antigénico dentro de la repetición similar a EGF de tenascina C humana.
2. 2. Anticuerpo y fragmentos del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además contiene marcadores adicionales y/o agentes de diagnóstico.
3. 3. Derivados recombinantes del anticuerpo y fragmentos del mismo, caracterizados porque están de conformidad con la reivindicación 1 ó 2.
4. 4. Derivados recombinantes de conformidad con la reivindicación 3, caracterizados porque la región constante murina se reemplaza por la contraparte humana o una porción activa biológicamente o farmacológicamente.
5. 5. Derivados recombinantes de conformidad con la reivindicación 4, caracterizados porque dicha porción biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste de: un elemento de la familia avidina, un factor de crecimiento empleado para estimulación de los efectores inmunológicos dirigidos al tumor.
6. 6. Derivados recombinantes de conformidad con la reivindicación 4, caracterizados porque dicha porción farmacológicamente activa se selecciona del grupo que consiste de: una toxina, un superantígeno, una citosina o cualquier otra proteína empleada en el mejoramiento de la eficacia terapéutica antitumoral.
7. 7. Derivados conjugados del anticuerpo y los fragmentos del mismo, caracterizados porque están de conformidad con la reivindicación 1 ó 2.
8. 8. Conjugado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque una porción biológicamente o farmacológicamente activa se une a dicho anticuerpo o fragmen os del mismo .
9. 9. Conjugado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque dicha porción biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste de un factor de crecimiento empleado para estimulación de los efectores inmunológicos dirigidos al tumor o dicha porción f rmacológicamente activa se selecciona del grupo que consiste de una toxina, un superantígeno, una citosina o cualquier otra proteína 'empleada en el mejoramiento de la eficacia terapéutica antitumoral, fármacos antitumorales , radioisótopos .
10. 10. Molécula de inmunoglobulina, caracterizada porque se enlaza específicamente a tenascina.
11. 11. Derivado de anticuerpo biotinilado, o fragmentos o derivados recombinantes o conjugados del mismo o inmunoglobulina, caracterizado porque está de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. 12. Línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se depositó con el Advanced Biotechnology Center el Enero 29 del 2002, bajo la provisión del Tratado de Budapest, con el número PD02003.
13. 13. Proceso para la preparación de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende cultivar el hibridoma de la reivindicación 12 y aislar dicho anticuerpo.
14. 14. Uso del anticuerpo o fragmentos, o derivados recombinantes o conjugados del mismo o molécula de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o el derivado biotinilado de la reivindicación 11 para un medio de diagnóstico para la detección de enfermedades que expresan tenascina .
15. 15. Uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde dicha enfermedad es un tumor.
16. 16. Uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde dicho tumor se selecciona del grupo que consiste de gliomas, carcinomas mamarios, de pulmón, fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas.
17. 17. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde los medios de diagnóstico se usan en técnicas de formación de imágenes in vivo.
18. 18. Uso del anticuerpo o fragmentos, o derivados recombinantes o conjugados del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o el derivado biotinilado de la reivindicación 11, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que expresan tenascina.
19. 19. Uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde dicha enfermedad es un tumor.
20. 20. Uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde dicho tumor se selecciona del grupo que consiste de tumores cerebrales císticos, gliomas, carcinomas mamarios, de pulmón, fibrosarcomas y carcinomas de células escamosas.
21. 21. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en donde dicho medicamento es en la forma de un kit adecuado para portar el método de pre-objetivo de tres etapas.
22. 22. Kit terapéutico, caracterizado porque está compuesto de 5 viales, cuyo primer vial contiene el derivado biotinilado de conformidad con la reivindicación 11, el segundo vial contiene una avidina, el tercer vial contiene albúmina biotinilada, el cuarto vial contiene una estreptavidina, el quinto vial contiene biotina radioetiquetada o derivado de biotina.
23. 23. Kit terapéutico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dichos viales son adecuados para inyección en humanos .
24. 24. ADN, caracterizado porque codifica el anticuerpo, o/y fragmentos del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o derivados recombinantes de conformidad con la reivindicación 3 ó 4 o inraunoglobulina de conformidad con la reivindicación 10.
25. 25. CDR específicos y proteínas, caracterizados porque comprenden o contienen CDR.
26. 26. Vector, caracterizado porque contiene ??? de conformidad con la reivindicación 24.
27. 27. Células hospedadoras , caracterizadas porque comprenden vectores de conformidad con la reivindicación 26.
28. 28. Uso de anticuerpo o fragmentos, o derivados recombinantes o conjugados del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en combinación con un segundo anticuerpo específico de tenascina en un ensayo de intercalación, para la producción de un kit de diagnóstico para la determinación del nivel de circulación de tenascina.
29. 29. Kit de diagnóstico, caracterizado porque comprende el anticuerpo o fragmentos, o derivados recombinantes o conjugados del mismo o inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
30. 30. Contenedor, que opcionalmente contiene compartimentos múltiples, caracterizado porque comprende el anticuerpo biotinilado o fragmentos del mismo o inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 11, amortiguadores y reactivos adecuados para uso en un kit terapéutico para un método pre-objetivo de tres etapas.
31. 31. Contenedor de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque además ' comprende un anticuerpo especifico de tenascina separado, preferiblemente dirigido hacia el fragmento A-D.
32. 32. Contenedor de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque además comprende un anticuerpo específico del tumor separado.
33. 33. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 ó reivindicación 2, caracterizado porque está en combinación con un segundo anticuerpo específico de tenascina en un ensayo in vitro de ELISA de intercalación, bajo condiciones donde el segundo anticuerpo se enlaza a un segundo epítope antigénico de tenascina, dicho ensayo ELISA in vitro es empleado para determinar el nivel de circulación de tenascina.
34. 34. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo y/o un fragmento y/o un derivado recombinante y/o un conjugado del mismo y/o una inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en mezcla con al menos, un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.