PT1361882E - 4-fluoro-n-indan-2-il-benzamida e sua utilização como fármaco - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "4-FLUORO-N-INDAN-2-IL-BENZAMIDA E SUA UTILIZAÇÃO COMO FÁRMACO" A presente invenção refere-se a 4-fluoro-N-indan-2-il-benzamida da fórmula (I) e sua utilização como agente farmacêutico.

O

(I) A NO sintase endotelial (eNOS, NOS-III) pertence a um grupo de três isoenzimas que produzem óxido nítrico (NO) por oxidação da arginina. 0 NO libertado endotelialmente é de importância central em vários mecanismos cardiovasculares fundamentais. Possui um efeito vasodilatador e inibe a agregação de plaquetas, a adesão de leucócitos ao endotélio e a proliferação de células do músculo liso da íntima. A NO sintase endotelial é sujeita a regulação fisiológica e patofisiológica quer ao nível transcricional e ao nível pós-transcricional. A enzima já presente no endotélio pode sofrer activação dependente do cálcio e activação independente do cálcio através da fosforilação de aminoácidos específicos, mas também através de interacções directas com proteínas específicas. Os estimuladores desta libertação, normalmente transiente, de NO são, arginina extracelular, 17β-θΞίηορέηίο e o 1 estímulo mecânico exercido na superfície luminal do endotélio pelo fluxo sanguíneo (tensão de corte). Este último conduz, adicionalmente, à regulação da eNOS ao nível transcricional. Assim, por exemplo, Sessa et al. (Circ. Research 74 (1994) 349- 353) conseguiram, através de treino físico e do aumento da tensão de corte associada a este, obter um aumento acentuado na ecNOS. Não ficou esclarecido se a regulação ao nível pós-transcricional é relevante in vivo. Assim, por exemplo, a administração de uma dose elevada de arginina conduz apenas a uma melhoria transiente no vasorrelaxamento dependente do endotélio, em doentes com doença coronária cardíaca.

Por outro lado, a importância da regulação positiva da proteína eENOS é cientificamente aceite. Assim, existem evidências que demonstram que as propriedades protectoras do inibidor da HMG-CoA redutase simvastatina podem ser atribuídas, apesar da diminuição do lípido, em parte, também a um aumento na expressão da eNOS in vivo (Endres et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95 (1998) 8880-8885). Sabe-se adicionalmente que mutações de ponto único na região flanqueadora 5' do gene eNOS ("promotor da eNOS ") e a redução na taxa de transcrição do gene da eNOS associado a este, na população Japonesa estão associados com um aumento no risco de espasmos coronários (Nakayama et al., Circulation 99 (1999) 2864-2870).

Por isso, uma hipótese actual é a de que os mecanismos transcricionais e pós-transcricionais da regulação da eNOS estão gravemente perturbados em vários distúrbios, especialmente em distúrbios cardiovasculares. Mesmo nas fases mais precoces de uma vasta gama de distúrbios cardiovasculares é possível, para 2 uma disfunção deste tipo no endotélio que reveste os vasos sanguíneos, conduzir a uma deficiência em NO bioactivo, que se manifesta, com o progresso do distúrbio, na forma de alterações morfológicas e patofisiológicas mensuráveis. Assim, os passos críticos na aterogénese precoce são acelerados por uma diminuição na libertação do NO endotelial, tal como, por exemplo, a oxidação das lipoproteínas de baixa densidade, o recrutamento e deposição de monócitos na íntima dos vasos e a proliferação das células da íntima. Uma consequência da aterogénese é a formação de placas no interior dos vasos sanguíneos que podem, por sua vez, conduzir, através de uma diminuição na tensão de corte, a uma posterior diminuição na libertação do NO endotelial e a uma posterior deterioração na patologia. Uma vez que o NO endotelial é também um vasodilatador, uma diminuição deste, conduz também frequentemente a hipertensão, que pode, como um factor de risco independente, causar danos noutros órgãos.

Consequentemente, o objectivo de uma abordagem terapêutica ao tratamento destes distúrbios deve, consequentemente, ser a interrupção desta cadeia de eventos através do aumento da expressão de NO endotelial. As experiências de transferência génica in vitro que conduzem à sobre-expressão da NO sintetase em vasos previamente danificados são, de facto, capazes de contrariar os processos descritos e são, assim, prova da exactidão desta abordagem (Varenne et al., Hum. Gene Ther. 11 (2000) 1329). São divulgados na literatura alguns compostos de baixo peso molecular que, em culturas celulares, podem conduzir a um efeito directo na transcrição e expressão da eNOS. As estatinas, que já foram mencionadas são, no entanto, as únicas substâncias para as 3 quais já foi possível até à data, demonstrar in vivo tal aumento na eNOS, como um efeito secundário. No entanto, considerando a gama conhecida de efeitos secundários desta classe de substâncias, permanece por esclarecer até onde este efeito está presente numa dose toxicologicamente não problemática.

Liao et al. reivindica nos documentos WO 99/47153 e WO 00/03746 a utilização de inibidores da rhoGTPase e de gentes que influenciam a organização do citoesqueleto da actina para aumentar a eNOS nas células endoteliais e para a terapia de vários distúrbios tais como, por exemplo, acidentes vasculares cerebrais ou hipertensão pulmonar sem, no entanto, indicar um modo possível para o alcançar.

Assim, existe uma forte necessidade de um medicamento que regule positivamente a expressão da eNOS em células endoteliais. O objectivo da presente invenção é proporcionar um composto apresentando esta capacidade

Este objectivo é alcançado pela utilização de 4-fluoro-N-indan-2-il-benzamida de acordo com a fórmula (I),

(I) que estimula a expressão da NO sintetase endotelial, para a preparação de um medicamento para o tratamento de angina de peito estável ou instável, doença coronária cardíaca, angina Prinzmetal, síndrome coronária aguda, insuficiência cardíaca, 4 enfarte do miocárdio, trombose, doença oclusiva da artéria periférica, aterosclerose, restenose, danos endoteliais após PTCA, hipertensão, hipertensão essencial, hipertensão pulmonar, hipertensão secundária, hipertensão renovascular, glomerulonefrite crónica, disfunção eréctil, arritmia ventricular, diabetes, nefropatia, retinopatia, angiogénese, asma bronquial, insuficiência renal crónica, cirrose hepática ou osteoporose ou para a diminuição do risco cardiovascular em mulheres após menopausa ou após a toma de contraceptivos, bem como para um processo para a preparação de tal medicamento, compreendendo juntar 4-fluoro-N-indan-2-il-benzamida, de acordo com a fórmula (I), com uma ou mais substâncias veiculares farmacêuticas sólidas ou liquidas e/ou aditivos e, se desejado, em combinação com outros compostos farmaceuticamente activos numa forma de administração ou forma de dosagem adequada. A presente invenção inclui, além disso, a utilização de todos os solvatos do composto de acordo com a fórmula (I), por exemplo, hidratos e aductos com álcoois. 0 documento WO 00/51970 divulga a preparação e utilização de 4-fluoro-N-indan-2-il-benzamida como um medicamento. O composto possui forte potenciamento da actividade colinérgica e é útil para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios no sistema nervoso central para mamiferos e, de um modo mais particular, de amnésia, demência, e. g. demência senil, demência de Alzheimer, demência associada com várias doenças, tais como demência vascular cerebral, demência cerebral pós-traumática, demência devida a tumor cerebral, demência devida a hematoma subdural crónico, demência devida a hidrocefalia de pressão normal, demência pós-meningite, doença de Parkinson tipo demência e semelhantes. Espera-se que o composto seja útil como agente terapêutico e/ou preventivo para esquizofrenia, depressão, 5 acidente vascular cerebral, lesão na cabeça, privação de nicotina, lesão na espinal medula, ansiedade, polaciúria, incontinência urinária, distrofia miotónica, distúrbio de hiperactividade e défice de atenção, sonolência excessiva durante o dia (narcolepsia), doença de Parkinson ou autismo. 0 documento WO 00/51970 não divulga ou sugere a utilização de 4-fluoro-N-indan-2-il-benzamida para a regulação positiva da expressão da NO sintetase endotelial, em particular, para o tratamento de, angina de peito estável e instável, doença coronária cardiaca, angina Prinzmetal, sindrome coronária aguda, insuficiência cardíaca, enfarte do miocárdio, trombose, doença oclusiva da artéria periférica, aterosclerose, restenose, danos endoteliais após PTCA, hipertensão, hipertensão essencial, hipertensão pulmonar, hipertensão secundária, hipertensão renovascular, glomerulonefrite crónica, disfunção eréctil, arritmia ventricular, diabetes, nefropatia, retinopatia, angiogénese, asma bronquial, insuficiência renal crónica, cirrose hepática ou osteoporose ou para a diminuição do risco cardiovascular em mulheres após menopausa ou após a toma de contraceptivos. O composto de acordo com a fórmula (I) pode ser preparado partindo de 2-indanilamina que é conhecida na literatura. A 2-indanilamina pode ser feita reagir, na forma de base livre ou de um seu sal, com cloreto 4-fluorobenzoílo na presença de uma base como, por exemplo, trietilamina. A reacção é geralmente efectuada num solvente como o diclorometano, tetra-hidrofurano, tolueno ou dioxano e, de um modo preferido, à temperatura ambiente. Alternativamente, o composto de acordo com a fórmula (I) é obtido através de uma reacção de junção da referida 2-indanilamina com ácido 4-fluorobenzóico, na presença de uma base tal como, por exemplo, diisopropiletilamina e a utilização 6 de um reagente de acoplamento apropriado tal como, por exemplo, carbodiimidas, HATU ou TOTU.

Outras reacções para a síntese do composto de acordo com a fórmula (I) , são evidentes ou bem conhecidas pelo especialista na técnica e podem ser efectuadas sob condições padrão de acordo com ou de modo análogo a processos descritos na literatura, por exemplo, em Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie (Métodos em Química Orgânica) , Thieme-Verlag, Stuttgart, ou Organic Reactions, John Wiley & Sons, New York. Se desejado, o composto da fórmula (I) pode ser purificado por processos de purificação convencionais, por exemplo, através de recristalização ou cromatografia. Os compostos de partida para a preparação do composto da fórmula (I) estão disponíveis comercialmente ou podem ser preparados de acordo ou de modo análogo a processos da literatura. 0 composto de acordo com a fórmula (I) pode ser utilizado para regular positivamente a expressão da No sintetase endotelial e é um composto farmacêutico útil para o tratamento de várias doenças. No contexto da presente invenção, o tratamento inclui a terapia, bem como a profilaxia, das respectivas doenças.

As doenças que podem ser tratadas com o composto (I) de acordo com a presente invenção, incluem doenças cardiovasculares seleccionadas do grupo consistindo de angina de peito estável e instável, doença coronária cardíaca, angina Prinzmetal (espasmo), síndrome coronária aguda, insuficiência cardíaca, enfarte do miocárdio, trombose, doença oclusiva da artéria periférica (PAOD), aterosclerose, restenose, danos endoteliais após PTCA, hipertensão incluindo hipertensão essencial, 7 hipertensão pulmonar e hipertensão secundária (hipertensão renovascular, glomerulonefrite crónica), disfunção eréctil e arritmia ventricular e a diminuição do risco cardiovascular em mulheres após menopausa ou após a toma de contraceptivos. 0 composto (I) pode ser, adicionalmente, utilizado na terapia e profilaxia da diabetes, nefropatia (complicação associada a diabetes), retinopatia (complicação associada a diabetes), angiogénese, asma bronquial, insuficiência renal crónica, cirrose hepática ou osteoporose.

As indicações preferidas são angina de peito estável, doença coronária cardiaca, hipertensão e aterosclerose. 0 composto de acordo com a fórmula (I) pode também ser utilizado em combinação com outros compostos farmaceuticamente activos, de um modo preferido, compostos que são capazes de aumentar o efeito do composto de acordo com a fórmula (I) . Exemplos de tais compostos incluem: estatinas; inibidores da ACE; antagonistas ATI; inibidores da argininase; inibidores da PDE V; antagonistas de Ca; bloqueadores alfa; bloqueadores beta; metimazol e compostos análogos; arginina; tetra-hidrobiopterina; vitaminas, em particular vitamina C e vitamina B6; niacina. 0 composto (I), opcionalmente, em combinação com outros compostos farmaceuticamente activos, podem ser administrados a animais, de um modo preferido, a mamíferos e, em particular, a humanos, como o próprio fármaco ou na forma de preparações farmacêuticas (ou composições farmacêuticas) que compreendem uma dose eficaz do composto de fórmula (I) e um veículo farmaceuticamente aceitável, í. e. uma ou mais substâncias veiculares farmaceuticamente e/ou aditivos aceitáveis. As são utilizadas para referidas preparações farmacêuticas estimular a expressão da NO sintetase endotelial e, em particular, um medicamento para a terapia ou profilaxia das sindromes mencionadas anteriormente. 0 fármaco utilizado de acordo com a invenção pode ser administrado oralmente, por exemplo, na forma de pilulas, comprimidos, comprimidos laçados, comprimidos revestidos de açúcar, granulados, cápsulas de gelatina dura e mole, soluções oleosas, aquosas ou alcoólicas, xaropes, emulsões ou suspensões, ou rectalmente, por exemplo na forma de supositórios. A administração pode ser também efectuada parentericamente, por exemplo, subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente na forma de soluções para injecção ou infusão. Outras formas de administração adequadas são, por exemplo, administração percutânea ou tópica, por exemplo, na forma de unguentos, tinturas, vaporizadores ou sistemas terapêuticos transdérmicos, ou a administração por inalação na forma de vaporizadores nasais ou misturas de aerossóis ou, por exemplo, microcápsulas, implantes ou bastonetes. A forma de administração preferida depende, por exemplo, da doença a ser tratada e da sua gravidade. A quantidade de composto de fórmula (I) nas preparações farmacêuticas varia, normalmente, de 0,2 a 800 mg, de um modo preferido, de 0,5 a 500 mg, em particular de 1 a 200 mg, por dose, mas dependendo do tipo de preparação farmacêutica também pode ser superior. As preparações farmacêuticas compreendem, normalmente, 0,5 a 90 porcento em peso do composto da fórmula (I) . A preparação das preparações farmacêuticas pode ser efectuada de um modo conhecido per se. Com este objectivo, o composto da fórmula (I), em conjunto com uma ou mais substâncias 9 veiculares sólidas ou liquidas e/ou aditivos farmacêuticos (ou substâncias auxiliares) e, se desejado, em combinação com outros compostos farmaceuticamente activos com acção profilástica ou terapêutica, são agrupados numa forma de administração ou forma de dosagem adequada que pode, depois, ser utilizada como um fármaco em medicina veterinária ou humana.

Para a produção de pílulas, comprimidos, comprimidos revestidos com açúcar e cápsulas de gelatina dura é possível utilizar, por exemplo, lactose, amido, por exemplo, amido de milho ou derivados de amido, talco, ácido esteárico ou seus sais, etc. Os veículos para cápsulas de gelatina mole e supositórios são, por exemplo, gorduras, ceras, polióis líquidos e semi-sólidos, óleos endurecidos ou naturais, etc. Os veículos adequados para a preparação de soluções, por exemplo, de soluções para injecção ou de emulsões ou xaropes são, por exemplo, água, solução fisiológica de cloreto de sódio, álcoois, tais como etanol, glicerol, polióis, sacarose, açúcar invertido, glucose, manitol, óleos vegetais, etc. É também possível liofilizar o composto da fórmula (I) e utilizar os liofilizados resultantes, por exemplo, para preparar preparações para injecção ou infusão. Os veículos adequados para microcápsulas, implantes ou bastonetes são, por exemplo, copolímeros de ácido glicólico e ácido láctico.

Além do composto (I) e veículos, as preparações farmacêuticas podem também conter aditivos, por exemplo, enchimentos, desintegrantes, ligandos, lubrificantes, agentes humidificantes, estabilizadores, emulsionantes, dispersantes, conservantes, adoçantes, corantes, agentes de sabor aromatizantes, espessantes, diluentes, substâncias tamponantes, solventes, solubilizadores, agentes para atingir um efeito de 10 depósito, sais para alterar a pressão osmótica, agentes de revestimento ou antioxidantes. A dosagem do composto da fórmula (I) a ser administrada depende do caso individual e é, como é normal, para ser adaptada às circunstancias individuais para alcançar um efeito óptimo. Assim, depende da natureza e gravidade do distúrbio a ser tratado e, também, do sexo, idade, peso e resposta individual do humano ou animal a ser tratado, da duração da acção do composto (I), se a terapia é aguda, crónica ou prof ilástica, e se são administrados outros compostos activos além do composto da fórmula (I). Em geral, uma dose diária de, aproximadamente, 0,01 a 100 mg/kg, de um modo preferido, 0,1 a 10 mg/kg, em particular 0,3 a 5 mg/kg (em cada caso mg por kg de peso corporal) é apropriada para administração a um adulto pesando, aproximadamente, 75 kg de modo a obter os resultados desejados. A dose diária pode ser administrada numa dose única ou, em particular, guando são administradas guantidades superiores, pode ser dividida em várias, por exemplo, duas, três ou quatro doses individuais. Nalguns casos, dependendo da resposta individual, pode ser necessário afastar-se para cima ou para baixo da dose diária estabelecida. O composto de acordo com a fórmula (I) pode também ser utilizado para outros propósitos que não aqueles indicados anteriormente. Os exemplos não limitantes incluem propósitos de diagnóstico, a utilização como ferramentas bioquímicas e como intermediários para a preparação de outros compostos, e. g. compostos farmaceuticamente activos. A presente invenção irá agora ser ilustrada nos seguintes exemplos: 11

Exemplo:

Preparação de 4-Fluoro-N-(indan-2-il)-benzamida 43, 70 g (258 mol) de cloridrato de 2-aminoindano e 53, 43 g (528 mmol) de trietilamina foram misturadas com 250 mL de tetra-hidrofurano, foram adicionadas 42,89 g (270 mmol) de cloreto de 4-fluorobenzoilo e a mistura foi agitada durante 2 h à TA. A mistura resultante foi depois vertida numa mistura de gelo/HCl, o precipitado obtido foi filtrado, lavado com solução de NaHCCç e água e seco in vacuo. O produto em bruto foi cristalizado a partir do metanol. Foram obtidas 47,8 g (73%) de um produto branco cristalino.

pf.: 167 °C EM: M+H+ : 2 5 6,1 RMN de ΧΗ (300 MHz, d6-DMSO) : 2,96 (dd, 2H, H1/H3) , 3,25 (dd, 2H, H3/H1), 4,70 (sexteto, 1H, H2), 7,12-7,19 (m, 2H, H4,7/5,6), 7,20-7,28 (m, 2H, H5,6/4,7), 7,30 (t, 2H, H3',5'), 7,95 (dd, 2H, H2, 6'), 8,68 (d, 1H, NH)

Determinação da activação da transcrição de eNOS A activação da transcrição de eNOS foi determinada como descrito em detalhe em Li et al. "Activation of protein kinase C alpha and/or epsilon enhances transcription of the human 12 endothelial nitric oxide synthase gene", Mol. Pharmacol. 1998; 53: 630-637.

Resumidamente, um fragmento 5' de 3,5 kB de comprimento, do codão de partida do gene da eNOS foi clonado, sequenciado e clonado em plasmideos de expressão da luciferase de pirilampo, para monitorizar a activação do promotor da eNOS pela actividade do gene repórter. Foi utilizada uma linha celular endotelial humana, estavelmente transfectada, e expressando esta construção promotor-repórter para testar os compostos. As células foram incubadas durante 18 h com o composto (I). O composto foi dissolvido antes em DMSO estéril. Foi permitida uma concentração final de DMSO a 0,5% em meio completo. Foi determinada a indução da expressão do gene repórter nestas células, utilizando um sistema de ensaio convencional da luciferase (Promega, Cat. No E150) de acordo com as instruções do fabricante. A indução da luciferase em células incubadas com composto (I) foi comparada com as incubadas com apenas solvente. A proporção de ambas as actividades (proporção de indução da transcrição, TIR) foi representada graficamente em função da concentração do composto. Tipicamente, os valores de TIR começaram a concentrações baixas a uma proporção de 1, não indicando efeito do composto e prolongando-se para um valor máximo de TIR TIR(max) que indica o aumento da transcrição de eNOS. Os valores EC50 das proporções de indução da transcrição em função da concentração do composto foram determinados graficamente. O efeito do composto (I) na transcrição de eNOS foi confirmado num segundo ensaio baseado na detecção da proteína de NOSe. Foram isoladas células endoteliais primárias da veia do 13 cordão umbilical humano (HUVEC) e cultivadas de acordo com processos convencionais. As células confluentes foram incubadas com composto (I) durante 18 h e o efeito na expressão de proteina eNOS determinada através de um processo de transferência de Western quantitativo. Após incubação do composto (I), as HUVEC foram lisadas em tampão de lise arrefecido em gelo contendo Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, SDS a 1% e inibidores da protease. O lisado foi submetido a desnaturação convencional por electroforese em gel de poliacrilamida e transferido para membranas de nitrocelulose. Utilizando um anticorpo monoclonal primário especifico (Transduction Laboratories, UK) e anticorpo secundário marcado com fosfatase alcalina (Jackson Labs) , foi visualizada uma banda da proteina eNOS especifica e quantificada com base num método de detecção por quimiofluorescência.

Para o composto (I), o valor de EC50 foi de 0,8 μΜ, o valor de TIR(max) foi de 4,10.

Modelos animais

Todas as experiências com animais foram efectuadas de acordo com a lei Alemã de protecção animal e com as linhas de base para a utilização de animais experimentais como estabelecido por Guide for the Care and Use of Laboratory Animais do US National Institutes of Health. 14

Animais e Tratamento (Experiências A-C)

Foram utilizados murganhos deficientes em eNOS e ApoE (antecedente C57BL/6J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me). Todos os animais tinham 10-12 semanas de idade e pesavam 22 a 28 g. Três dias antes da cirurgia, os murganhos foram divididos em 4 grupos (controlo de apoE, n=10-12 ; apoE com composto (I), n=10-12; controlo de eNOS, n=10-12 ; eNOS com composto (I), n=10-12) e receberam ou uma ração de roedores convencional (contendo 4% de gordura e 0,001% de colesterol; a seguir designado como grupo placebo) ou uma ração de roedores convencional + composto (I) (10 ou 30 mg/kg/d p.o.). A Efeito anti-hipertensor em murganhos com gene ApoE silenciado

Foi determinada a pressão sanguínea em murganhos conscientes utilizando um sistema de tail-cuff computorizado.

Para o composto (I), após 4 meses de tratamento dos murganhos deficientes em ApoE, a pressão sanguínea foi reduzida significativamente (p<0,05) no grupo 30 mg/kg/d em comparação com o tratamento placebo (92 ± 5 mmHg versus 115 ± 2 mmHg). Após 4 semanas de tratamento, não se conseguiu observar redução na pressão sanguínea, a doses semelhantes, em murganhos deficientes em eNOS, 15 Β

Inibição da formação de neointima e aterogénese (braçadeira na artéria femoral)

Após 3 dias de tratamento dos murganhos deficientes em ApoE com composto (I) , (10 mg/kg/d prensado em ração), os animais foram anestesiados com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital (60 mg/kg) seguida por uma injecção intramuscular de xilazina (2 mg/kg) e foi colocada uma braçadeira à volta da artéria femoral como descrito em Moroi et al. (J Clin Invest. 101: 1225-32,1998). Resumidamente, a artéria femoral esquerda foi dissecada. Foi colocada uma braçadeira de polietileno de 2,0 mm não oclusiva, fabricada com tubo PE-50 (diâmetro interno 0,56 mm, diâmetro externo 0,965 mm, Becton Dickinson, Mountain View, Ca) à volta da artéria e atado no local com duas suturas 7-0. A artéria femoral direita foi isolada dos tecidos circundantes mas não foi colocada uma braçadeira. O tratamento com composto (I) foi continuado durante 14 dias após cirurgia. Depois, os animais foram sacrificados. A aorta foi retirada para determinação das expressões da eNOS vascular por transferência de Western quantitativa. Ambas as artérias femorais foram recolhidas, fixadas em formalina e embebidas em parafina. Foram cortadas 20 secções transversais (10 ym) da porção com braçadeira da artéria femoral esquerda e do segmento correspondente da artéria direita. As secções foram submetidas a coloração convencional com eosina e hematoxilina. As análises morfométricas foram efectuadas utilizando um programa de computador de análise de imagem (LeicaQWin, Leica Imaging Systems, Cambridge, GB). Para cada secção transversal foi determinada da área do lúmen da neointima e da média. Para esta finalidade, a neointima foi definida com a área entre o lúmen e a lâmina elástica interna e a média foi definida com a área entre a lâmina elástica interna e externa. A razão entre a área 16 da neoíntima e a área da média foi expressa como a razão neointima/média. 0 composto (I) reduziu a formação não adaptativa da neointima num factor de 2, diminuindo a razão de neointima para media de 0,39 ± 0,07 no grupo placebo, de 0,170 ± 0,04 no grupo do composto. Em paralelo, a expressão da eNOS vascular foi

aumentada num factor de 2,1. Não se conseguiu demonstrar o efeito do composto (I) numa situação semelhante utilizando murganhos deficientes em eNOS em vez de murganhos com ApoE silenciado. C Prevenção da formação da placa aterosclerótlca no tratamento crónico

Os murganhos deficientes em ApoE foram tratados durante 16 semanas com o composto (I), prensado em ração e, finalmente, sacrificados. Foram removidas as aortas de cada murganho, fixadas em formalina e embebidas em parafina. A formação da placa foi determinada via formação de lesões lipidicas nas aortas (do arco aórtico até ao diafragma) e foi analisada por coloração com óleo vermelho O. Para quantificar o efeito do composto respectivo na expressão da eNOS vascular foram utilizadas, nesta experiência, artérias femorais. O composto (I) de acordo com a presente invenção reduz significativamente a formação da placa (5,2 1% versus 13,3 ± 2,6 no grupo placebo, valores do tamanho total da placa em % da superfície total) . Verificou-se que a expressão da eNOS vascular era 1,75 vezes mais regulada no grupo de tratamento. 17

D Melhoria da função coronária em murganhos deficientes em ApoE

Nas experiências foram utilizados murganhos C57BL/6J Machos Velhos do tipo selvagem (Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld) e murganhos deficientes em apoE (antecedente C57BL/6J, Jackson

Laboratory, Bar Harbor, Me) com 6 meses de idade e pesando 28 a 36 g. Os murganhos foram divididos em 3 grupos (C57BL/6, n=8 ; controlo de apoE, n=8; apoE com composto (I), n=8) e receberam, durante 8 semanas, uma ração para roedores convencional (contendo 4% de gordura e 0,001% de colesterol) ou uma ração para roedores convencional + composto (I) (30 mg/kg/d p.o.).

Os murganhos foram anestesiados com pentobarbitona de sódio (100 mg/kg i.p.) e os corações foram rapidamente excisados e colocados num tampão de perfusão arrefecido por gelo. A aorta foi canulada e ligada a um aparelho de perfusão (HUGO SACHS ELECTRONICS, Freiburg, Alemanhã) que foi iniciado imediatamente a uma pressão de perfusão constante de 60 mm Hg. Os corações foram perfundidos de um modo retrogado com tampão de bicarbonato Krebs modificado, equilibrados com 95% de O2 e 5% de CO2 e mantidos a 37,5 °C.

Passou-se um tubo pequeno biselado (PE 50) através de uma veia pulmonar para o ventrículo esquerdo e empurrado através da parede ventricular, ancorado no apéx através de uma extremidade estriada e conectada a um micromanómetro de ponta (Millar 1.4 French). A auricula esquerda foi canulada através da mesma veia pulmonar e o coração virado para o modo de trabalho com uma pressão pré-carga constante de 10 mm Hg e uma pressão de 60 mm Hg. O fluxo de sarda aórtico e o fluxo de entrada auricular foram continuamente medidos utilizando sondas de fluxo 18 ultrasónicas (HSE/Transonic Systems Inc.). 0 fluxo coronário foi calculado como a diferença entre o fluxo auricular e o fluxo aórtico. Todos os dados hemodinâmicos foram digitalizados a uma razão de amostragem de 1000 Hz e gravados com um PC utilizando um software especializado (HEM, Notocord).

Os corações foram deixados a estabilizar durante 30 min. Todos os dados hemodinâmicos funcionais foram determinados durante o estado constante e durante o carregamento de pressão e volume.

As curvas de função do ventrículo esquerdo foram construídas variando a pressão de pré-carga. Para aquisição das curvas de pré-carga, a pós-carga foi estabelecida a 60 mm Hg e a pré-carga foi ajustada em passos de 5 mm Hg ao longo de uma gama de 5 a 25 mm Hg. Os corações foram deixados a estabilizar em condições de linha de base entre carregamento de volume e pressão.

Os corações isolados de animais deficientes em ApoE apresentaram um fluxo coronário inferior nesta situação em comparação com murganhos C57B16 do tipo selvagem (3,6 mL/min versus 4,95 mL/min). O tratamento de animais deficientes em ApoE com o Composto (I) de acordo com a presente invenção aumentaram o fluxo coronário para 5 mL/min, comparável como os niveis dos murganhos do tipo selvagem não doentes. 19 0 composto (I) também melhorou o fluxo coronário dependente de pré-carga e reduziu a incidência de arritmias ventriculares como um indicador para a eficácia anti-isquémica.

Lisboa, 22 de Novembro de 2006 20

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de 4-fluoro-N-indan-2-il-benzamida de acordo com a fórmula (I)

   (I) para a preparação de um medicamento para o tratamento de angina de peito estável ou instável, doença coronária cardiaca, angina Prinzmetal, sindrome coronária aguda, insuficiência cardiaca, enfarte do miocárdio, trombose, doença oclusiva da artéria periférica, aterosclerose, restenose, danos endoteliais após PTCA, hipertensão, hipertensão essencial, hipertensão pulmonar, hipertensão secundária, hipertensão renovascular, glomerulonefrite crónica, disfunção eréctil, arritmia ventricular, diabetes, nefropatia, retinopatia, angiogénese, asma bronquial, insuficiência renal crónica, cirrose hepática ou osteoporose ou para a diminuição do risco cardiovascular em mulheres após menopausa ou após a toma de contraceptivos.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o tratamento de angina de peito instável, sindrome coronária aguda, insuficiência cardiaca, enfarte do miocárdio, trombose, doença oclusiva da artéria periférica, restenose ou danos endoteliais após PTCA. 1
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para o tratamento de hipertensão, doença cardíaca coronária, angina de peito estável ou aterosclerose.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 3, em que o medicamento é para o tratamento de doença cardíaca coronária.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, em que o medicamento é para o tratamento de insuficiência cardíaca.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 5, em que o medicamento está na forma de uma pílula, comprimido, comprimido laçado, comprimido revestido de açúcar, granulado, cápsulas de gelatina dura ou mole, solução oleosa, alcoólica ou aquosa, xarope, emulsão ou suspensão, supositório, solução para injecção ou infusão, unguento, tintura, vaporizador ou sistema terapêutico transdérmico, vaporizador nasal, mistura de aerossol, microcápsula, implante ou bastonete.
7. 7. Processo para a preparação de um medicamento para o tratamento de angina de peito estável ou instável, doença coronária cardíaca, angina Prinzmetal, síndrome coronária aguda, insuficiência cardíaca, enfarte do miocárdio, trombose, doença oclusiva da artéria periférica, aterosclerose, restenose, danos endoteliais após PTCA, hipertensão, hipertensão essencial, hipertensão pulmonar, hipertensão secundária, hipertensão renovascular, glomerulonefrite crónica, disfunção eréctil, arritmia 2 ventricular, diabetes, nefropatia, retinopatia, angiogénese, asma bronquial, insuficiência renal crónica, cirrose hepática ou osteoporose ou para a diminuição do risco cardiovascular em mulheres após menopausa ou após a toma de contraceptivos, compreendendo juntar 4-fluoro-N-indan-2-il-benzamida de acordo com a fórmula (I)

   (I) em conjunto com uma ou mais substâncias veiculares sólidas ou liquidas e/ou aditivos farmacêuticos e, se desejado, em combinação com outros compostos farmaceuticamente activos, numa forma de administração ou forma de dosagem adequada.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o medicamento é para o tratamento de angina de peito instável, sindrome coronária aguda, insuficiência cardiaca, enfarte do miocárdio, trombose, doença oclusiva da artéria periférica, restenose ou danos endoteliais após PTCA.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o medicamento é para o tratamento de hipertensão, doença coronária cardiaca, angina de peito estável ou aterosclerose.
10. 10. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 e 9, em que o medicamento é para o tratamento de doença coronária cardiaca. 3
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 e 8, em que o medicamento é para o tratamento de insuficiência cardiaca.
12. 12. Processo de acordo com qualquer dasreivindicações 7 a 11, em que o medicamento está na forma de uma pilula, comprimido, comprimido laçado, comprimido revestido de açúcar, granulado, cápsulas de gelatina dura ou mole, solução oleosa, alcoólica ou aquosa, xarope, emulsão ou suspensão, supositório, solução para injecção ou infusão, unguento, tinturaria, vaporizador ou sistema terapêutico transdérmico, vaporizador nasal, mistura de aerossol, microcápsula, implante ou bastonete. Lisboa, 22 de Novembro de 2006 4