PT1359934E - Tripeptidos e derivados de tripeptidos para o tratamento de doenças neurodegenerativas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "TRIPÉPTIDOS E DERIVADOS DE TRIPÉPTIDOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS" A invenção relaciona-se com a utilização de tripéptidos e derivados de tripéptidos para o tratamento de doenças neurodegenerativas, em particular doença de Alzheimer e deficiência cognitiva suave, e com composições farmacêuticas compreendendo tripéptidos ou derivados de tripéptidos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Técnica Antecedente

As doenças neurodegenerativas são caracterizadas por uma degradação ou degeneração nervosa que é geralmente provocada pela apoptose. Os exemplos de doenças neurodegenerativas incluem doença de Alzheimer, deficiência cognitiva suave, doença de Parkinson e os distúrbios neurológicos associados à SIDA. Por exemplo, na doença de Alzheimer, a degradação nervosa conduz a uma ruptura da capacidade de recordar, falar, pensar e decidir. As razões para estes distúrbios não são conhecidas em pormenor. Ao nível bioquímico é detectada uma alteração nos sistemas colinérgicos corticais com uma diminuição na formação do neurotransmissor acetilcolina. No córtex cerebral de doentes que sofrem da doença de Alzheimer a concentração de acetilcolina está reduzida em 20 a 40%. Em consequência disso, as extremidades nervosas são atacadas, o que conduz por fim à morte das células cerebrais, em particular do hipocampo. À luz destas observações, as abordagens terapêuticas para a doença de Alzheimer dirigem-se, por conseguinte, para a 2 estabilização da concentração de acetilcolina, em particular através da inibição da acetilcolinesterase a qual degrada a acetilcolina em acetato e colina. No entanto, a utilização de inibidores da acetilcolinesterase apresenta o inconveniente de resultar num melhoramento apenas temporário o qual não é adequado para parar ou até mesmo inverter a degeneração.

Por outro lado conhece-se os chamados factores neurotróficos ou neurotrofinas aos quais é atribuída uma influência significativa na sobrevivência, crescimento e diferenciação de populações discretas de neurónios. A família de neurotrofinas inclui o factor de crescimento de tecido nervoso (NGF), factor neurotrófico cerebral (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4) e a família CNTF (factor neurotrófico ciliar). As neurotrofinas são proteínas básicas pequenas com um peso molecular de 26 até 28 kDa. 0 NGF é o membro melhor caracterizado da família de neurotrofinas o qual apresenta actividade em muitos tecidos diferentes.

No sistema nervoso periférico (PNS), o NGF é crítico para o desenvolvimento dos nervos simpáticos e determinados nervos sensoriais. No sistema nervoso central (CNS), o NGF tem um papel trófico no desenvolvimento e manutenção dos neurónios colinérgicos do cérebro anterior basal. Ele também desempenha um papel na regeneração neuronal nos tecidos do SNC no adulto.

Sabe-se que os neurónios colinérgicos produzem acetilcolina na presença de NGF e não na sua ausência. Além disso também foi demonstrado que a administração de NGF a primatas conduz à regeneração de organismos celulares colinérgicos. 3

Com base nesta descoberta assume-se que a alteração da actividade do NGF pode ser, desse modo, o ponto de partida para a degeneração dos neurónios colinérgicos. Assim, parece, pelo menos teoricamente, que as substâncias neurotróficas são adequadas para o tratamento de doenças neurodegenerativas tal como a doença de Alzheimer. No entanto, estas substâncias que ocorrem fisiologicamente têm um raio de acção curto semelhante às substâncias autócrinas ou parácrinas. Portanto, até à data não é possível utilizar as vias terapêuticas comuns (entérica ou parentérica) para a sua aplicação, já que elas são processadas proteoliticamente na circulação sanguínea e noutros tecidos e são, desse modo, inactivadas. Além disso, sabe-se que elas não passam a barreira hematoencefálica (BBB) a qual é um pré-requisito da actividade no SNC.

Os ensaios clínicos realizados até à data com neurotrofinas humanas recombinantes não tiveram qualquer sucesso. Uma concebível administração intracerebral deverá ser excluída por considerações práticas. Deste modo não é possível uma transferência de resultados das experiências in vitro com o NGF ou outras neurotrofinas, assim como com fragmentos destes péptidos, para uma possível aplicação terapêutica.

Sumário da invenção

Assim, é o objectivo da presente invenção proporcionar substâncias específicas que conduzam a uma paragem e, de um modo preferido, à inversão da degeneração nervosa, em particular das células do hipocampo, e as quais são também adequadas para a administração terapêutica corrente permitindo, desse modo, a sua utilização como um medicamento para o tratamento de doenças neurodegenerativas. Além disso, é um objectivo da presente 4 invenção proporcionar as composições farmacêuticas correspondentes.

Este objectivo da presente invenção é alcançado através da utilização de compostos da fórmula (I) seguinte:

em que X representa NH2, NH-alquilo-Ci_3, N(alquil Ci_3)2; R3 é um resíduo derivado de um dos aminoácidos Fen, o qual pode estar cada um opcionalmente substituído com um ou mais grupos alcoxilo (Ci_5) , grupos alquilo (Ci_5) ou átomos de halogéneo, assim como Ile; R2 é um resíduo derivado de um dos aminoácidos Gli ou Ile;

Yi e Y2 representam H ou alquilo (Ci_5) ; R3 e R4 representam H; e R5 representa H; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; para a preparação de um medicamento útil no tratamento de doenças neurodegenerativas. A composição farmacêutica da presente invenção compreende compostos da fórmula (I) acima, em que X representa NH2, NH-alquilo (Ci_3) , N(alquil Ci_3)2; 5

Ri é um resíduo derivado do aminoácido Fen o qual pode estar opcionalmente substituído com um ou mais grupos alcoxilo (Ci_5), grupos alquilo (Ci_5) ou átomos de halogéneo; R2 representa um resíduo derivado de um dos aminoácidos Gli ou Ile;

Yi e Y2 representam, independentemente um do outro, H ou alquilo (Ci_3) ; R3 e R4 representam H; e R5 representa H; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Figuras A Figura 1 mostra a correlação de valores experimentais e calculados da distribuição hematoencefálica.

Descrição Pormenorizada

Se nada for indicado em contrário, os resíduos de aminoácido podem estar presentes tanto na forma D como na forma L, sendo preferida a forma L.

Para compostos de fórmula (I) particularmente preferidos, Ri é um resíduo o qual é derivado do aminoácido Fen, o qual está opcionalmente substituído com um ou mais grupos alcoxilo (Ci_5) , grupos alquilo (C1-5) ou um ou mais átomos de halogéneo, ou o qual é derivado do aminoácido Ile, R2 é um resíduo derivado do aminoácido Gli ou Ile, R3, R4 e R5 representam um átomo de hidrogénio, X é NH2, NH- alquilo(Ci- 6 3) ou N(alquil ¢1-3)2, e Yi e Y2 representam, independentemente um do outro, H ou alquilo (C1-3) .

Os compostos de fórmula (I) muito preferidos são a glicil-L-fenilalanil—L-prolinamida, a etilamida da N,N-dietil-isoleucil-fenilalanil-L-prolina, a N,N-dietil-isoleucil- isoleucil-prolinamida ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

As abreviaturas utilizadas para os aminoácidos (Fen para fenilalanina etc. assim como parcialmente os códigos de uma letra utilizados abaixo, tal como F para fenilalanina) são conhecidas do especialista (ver, por exemplo, Beyer e Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21st edition, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988). Assim, Fen significa fenilalanina, Gli glicina etc. A expressão "um resíduo derivado do aminoácido Fen" significa, desse modo, um resíduo benzilo (-CH2-C6H5) . Em conformidade, "um resíduo derivado do aminoácido Gli" significa um átomo de hidrogénio, "um resíduo derivado do aminoácido Ala" um grupo metilo etc..

Os compostos de fórmula (I) utilizados de acordo com a presente invenção são substâncias solúveis em água e são, desse modo, adequadas para administração entérica e parentérica.

No entanto, os compostos utilizados de acordo com a presente invenção não todos igualmente adequados para administração oral/entérica ou parentérica. Por exemplo, enquanto o HCl-Gli-Fen-ProNH2 é tido principalmente em consideração para administração parentérica, o N,N-Dietil-Ile-Ile-ProNH2 e N,N-Dietil-Ile-Fen-ProNHEt são adequados 7 para administração parentérica e, em particular, oral. A adequabilidade dos compostos a serem utilizados de acordo com a presente invenção para administração oral pode ser estimada utilizando o chamado Ensaio Paralelo de Permeação de Membrana Artificial o qual é descrito em mais pormenor abaixo. Para administração oral, são preferidos os compostos com valores superiores a 10, de um modo preferido superiores a 30, de um modo mais preferido superiores a 45, como determinados em conformidade com este ensaio.

Um pré-requisito essencial para a eficácia dos tripéptidos e derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção é a sua concentração no SNC. Para além de outros factores, esta é afectada pela grandeza da passagem da barreira hematoencefálica a qual pode ocorrer por transporte activo ou passivo. O chamado transporte facilitado ou transporte via plataformas de lipidos é considerado como mecanismo. O balanço do transporte é exprimido independentemente do seu tipo ou mecanismo pelo coeficiente de distribuição hematoencefálico (log BB). Quanto mais elevado for este coeficiente, maior é a concentração no SNC. A definição e a determinação do coeficiente de distribuição hematoencefálico por modelação molecular relacionada com o QSAR (relações quantitativas estrutura-actividade) são descritas a seguir em mais pormenor. O coeficiente de distribuição hematoencefálico dos compostos a serem utilizados em conformidade com a presente invenção é de um modo preferido -3,5 ou superior, sendo particularmente preferido um na gama de -3,0 e superior. 8

Além disso, as substâncias de fórmula (I) utilizadas de acordo com a presente invenção mostram uma afinidade elevada para os receptores de tirosina-cinase (TrkA, TrkB e TrkC). Uma vez que a substância neurotrófica NGF é conhecida como actuando por fixação a estes receptores, uma afinidade elevada para os receptores é uma forte indicação da acção neurotrófica dos compostos utilizados de acordo com a presente invenção. As constantes de ligação (pKD) podem ser determinadas por ferramentas de modelação molecular, e um método correspondente é descrito a seguir em mais pormenor. Os compostos utilizados de acordo com a presente invenção têm de um modo preferido valores de pKD de 5,5 ou superiores, sendo ainda mais preferidos valores de pKD de 7 ou superiores. A síntese dos tripéptidos e derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção não está particularmente restringida e pode ser realizada segundo métodos conhecidos, de um modo preferido, processos estereoespecíficos da química de péptidos em que é conservada a configuração L ou D dos respectivos aminoácidos ou seus derivados. Várias sínteses de péptidos são descritas em Beyer e Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21st edition, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988, páginas 829-834. Os métodos preferidos incluem o método do anidrido do ácido N-carboxílico (método NCA) e o método que utiliza anidridos mistos de ácidos carboxílicos, como se ilustra nas seguintes equações reaccionais: Método NCA: 1. Boc-AAl-NCA+H—L-Pro-NH2 -> BOC-AAl-L-Pro-NH2 2. Boc-AAl-L-Pro—NH2+TFA -> TFA-H-AAl-L-Pro-NH2 -> HCl-H-AA2-L-AAl-Pro-NH2 3. Boc-AA2-NCA+TFA-H-AAl-L-Pro-NH2 9 4. Boc-AA2-AAl-L-Pro-NH2+HCl -> HCl-H-AA2-AAl-L-Pro-NH2 Síntese via anidridos mistos de ácidos carboxílicos: 1. Boc-AA10H+C1-C00CH2 (CH3) 2 -> Boc-AA1-OCOO-CH2CH(CH3) 2 2. Boc-AA1-OCOOCH2CH(CH3) 2 -> Boc-AAl-L-Pro-NH2 3. Boc-AA2-OH+Cl-COOCH2CH(CH3)2 -> Boc-AA2-OCOOCH2CH (CH3) 2 4. Boc-AA2-OCOOCH2CH (CH3) 2+TFA-H-AA1-L-Pro-NH2 -> Boc-AA2-AAl-L-Pro-NH2 5. BOC-AA2-AA1-L—Pro-NH2+HCl -> HCl-H-AA2-AAl-L-Pro-NH2 em que AA1 e AA2 representam os aminoácidos central e terminal (derivados de Ri ou R2) respectivamente, Boc representa um resíduo terc-butiloxicarbonilo, NCA representa anidrido de ácido N-carboxílico e TFA representa ácido trifluoroacético. Os materiais de partida estão comercialmente disponíveis.

Quando se utilizam aminoácidos com grupos funcionais, tal como, por exemplo, serina, estes podem ser protegidos de um modo conhecido do especialista.

Além disso, os tripéptidos ou derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção podem ser sintetizados através da síntese de Merryfield em fase sólida opcionalmente modificada, de um modo preferido utilizando grupos de protecção fluoren-9-il-metoxi-carbonilo (resíduos Fmoc) ou aminoácidos protegidos com Fmoc/terc-butilo (tBu).

As reacções descritas acima têm duma maneira geral rendimentos superiores a 90%, relativamente aos passos reaccionais individuais, e um rendimento total maior do que 60%. A pureza dos tripéptidos e derivados de tripéptidos assim sintetizados é geralmente maior do que 98%, sendo 10 desse modo suficiente para serem utilizados em composições farmacêuticas. As estruturas dos tripéptidos e derivados de tripéptidos podem ser confirmadas por espectrometria de massa (MS), cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC), análise automática de aminoácidos (AAA), rotação óptica (OR) e/ou espectroscopia de infravermelho e ultravioleta (IV, UV).

Uma administração numa dose superior a 5 mg por quilograma de peso corporal por dia é habitualmente eficaz, em particular na administração parentérica múltipla.

Devido à sua estrutura molecular, estas substâncias mostram uma toxicidade muito baixa nos ensaios de toxicidade aguda e crónica. A dose letal mais pequena (i.v.) em ratazanas foi de 250 até 350 mg por quilograma de peso corporal. Deste modo, as substâncias ensaiadas mostram uma proporção terapêutica adequada o que é um pré-requisito para uma utilização terapêutica em seres humanos.

Os tripéptidos ou derivados de tripéptidos podem ser utilizados para a produção de composições farmacêuticas que são adequadas para administração por várias formas, por exemplo, parentérica (intravenosa, intramuscular, subcutânea), através do aparelho respiratório (bucal, sublingual, nasal, brônquica), a via transdérmica (percutânea) e a via entérica (perorai) . No último caso é necessária uma dosagem adequada para ultrapassar o efeito do primeiro passo.

As composições farmacêuticas da presente invenção contêm ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável, e diluentes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Pode 11 utilizar-se técnicas correntes para a sua formulação como descrito, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition Williams & Wilkins, PA, USA. A forma de administração é seleccionada em função da via de administração e compreende inter alia comprimidos, cápsulas, pós e soluções.

Para administração oral são de um modo preferido utilizados comprimidos e cápsulas os quais contêm um agente aglutinante adequado, por exemplo, gelatina ou polivinilpirrolidona, um enchimento adequado, por exemplo, lactose ou amido, um lubrificante adequado, por exemplo, estearato de magnésio e, opcionalmente, outros aditivos.

Uma formulação particularmente preferida para administração oral é um comprimido revestido contendo 100 mg ou 200 mg de N,N-dietil-Ile-Ile-ProNH2, dióxido de silício, estearato de magnésio, Macrogol 400/600, Hypromellose (E404), dióxido de titânio e croscarmelose de Na.

Para administração parentérica são preferidas soluções aquosas estéreis. Os solventes aquoso adequados incluem água, soro fisiológico, solução de Hank e solução de Ringer. É preferido, inter alia, um soro fisiológico contendo 20 g/1 dos tripéptidos ou derivados de tripéptidos, por exemplo, glicil-L-fenilalanil-L-prolinamida.

Uma formulação particularmente preferida para administração parentérica é uma ampola para injecção contendo 5 ml - 10 ml de solução de injecção para infusão compreendendo 100 mg 12 ou 200 mg de Gli-Fen-ProNH2 liofilizado, ácido acético, acetato de sódio e água para injecção. O efeito anti-neurodegenerativo dos tripéptidos ou derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção é surpreendente uma vez que os péptidos estão geralmente sujeitos a degradação proteolítica por endo- ou exopeptidases e a metabolização posterior, pelo que não se poderia esperar que eles atingissem e até ultrapassassem a barreira hematoencefálica. A amplitude e a velocidade desta degradação são indicadas pelo tempo de semivida do tripéptido ou derivado de tripéptido no plasma. Sabe-se que os tempos de semivida de tripéptidos como, por exemplo, a tireoliberina (TRH) são muito curtos. Consequentemente é surpreendente que os tripéptidos e derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção apresentem um período de semivida inesperadamente longo (> 24 h) . Este período de semivida longo é um pré-requisito adicional para um efeito anti-neurodegenerativo suficiente.

Além disso, em experiências com hepatócitos, poderia ser demonstrado experimentalmente que os tripéptidos e derivados de tripéptidos da presente invenção são apenas metabolizados lentamente no fígado. Este resultado foi confirmado pela análise do plasma e dos hepatócitos adicionados nos quais apenas se analisou o tripéptido ou derivado de tripéptido inalterado após uma exposição de quatro horas ou mais.

As propriedades terapêuticas superiores dos tripéptidos e derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção serão ainda ilustradas a seguir 13 utilizando modelos particularmente úteis da doença de Alzheimer. Utilizando estes modelos poderia demonstrar-se que a administração dos tripéptidos ou derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção não só resulta num aumento do número de neurónios no hipocampo, mas também resulta num melhoramento da capacidade de aprendizagem das ratazanas utilizadas nos ensaios. No entanto, antes de se descrever estas experiências em pormenor, descreve-se a determinação do coeficiente de distribuição hematoencefálico, o ensaio PAMPA, a determinação das constantes de ligação ao TrK, a determinação da estabilidade metabólica e sínteses seleccionadas dos derivados de tripéptidos utilizados na experiência seguinte.

Secção Experimental 1. Determinação do coeficiente de distribuição hematoencefálico

Como referido acima, a barreira hematoencefálica constitui geralmente um obstáculo para substâncias solúveis em água impedindo a utilização de muitas substâncias solúveis em água para o tratamento do SNC por administração corrente. No entanto, pôde-se demonstrar que os tripéptidos ou derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção têm a capacidade de passar a referida barreira hematoencefálica. A distribuição hematoencefálica dos tripéptidos e derivados de tripéptidos utilizados de acordo com a presente invenção pode ser quantificada do seguinte modo. A chamada técnica QSAR (relação quantitativa estrutura-actividade) é uma técnica estabelecida para a quantificação 14 de propriedades físico-químicas ou farmacológicas específicas de compostos químicos. Esta técnica compreende geralmente a determinação de uma correlação linear entre uma propriedade experimental específica dos compostos (tal como, por exemplo, o coeficiente de distribuição hematoencefálico (BB)) com parâmetros estruturais calculados A, B, C etc. através da modulação dos chamados descritores (XI, X2, etc.), resultando geralmente numa equação da forma seguinte:

Log BB = (XI x A) + (X2 x B) + (X3 x C)+ ... + constante

Com os descritores assim obtidos é depois possível calcular as respectivas propriedades experimentais, tal como, por exemplo, o coeficiente de distribuição hematoencefálico, de compostos para os quais não existem dados experimentais disponíveis. Em conformidade, a distribuição hematoencefálica é determinada do seguinte modo de acordo com a presente invenção.

Com base nos dados experimentais de 75 compostos (ver Luco, J.M., J. Chem. Inf. Comput. Sei. (1999), 39, 396-404) e em parâmetros específicos, como se explica a seguir, pôde-se obter uma correlação linear entre valores calculados e experimentais.

Os compostos foram construídos utilizando o pacote do programa de modelação molecular SYBILO (Tripos Associates Inc., 1699 S. Henley Road, Suite 303, St. Louis, Mo. 63144, EUA). Para determinar as conformações de baixa energia dos compostos para um conjunto seleccionado (A-F-P, A-dF-P, A-F-dP, A-dF-dP) realizou-se uma pesquisa aleatória. Todos os ângulos diédricos, à excepção da ligação peptídica, foram 15 considerados flexíveis. As conformações da cadeia principal das estruturas com a menor energia foram tomadas como a conformação de partida para todos os compostos.

Todos os compostos construídos manualmente foram minimizados energeticamente utilizando os campos de força Tripos (ver Clark, M., Kramer, III, R. D. e van Optenbosch, N. (1989), J. Comp. Chem. 10, 982-991) com cargas parciais de Gasteiger (PEOE) (Gasteiger, J., Marsili, M. (1980; Tetrahedron 36, 3219-3238)) e uma constante dieléctrica dependente da distância de 4. O programa de gráficos moleculares MOE (Chemical Computing Group Inc., Montreal, Canada, http://www.chemcomp.com) permite o cálculo de um conjunto largamente aplicável de descritores dependendo apenas da conectividade dos compostos e tipos de átomos (tipos no sentido de parâmetros de campo de força) (ver Labute na página de acesso citada acima). Todos os descritores aqui utilizados incluem uma aproximação simples da superfície de van der Walls dos compostos. Para o conjunto de ensaio de 1947 compostos orgânicos, obteve-se uma correlação elevada (r2 = 0,9666) entre a superfície exacta de van der Walls e a aproximação 2D. O primeiro conjunto de 14 parâmetros (PEOE-VSA) considerou a distribuição de carga (PEOE) da molécula utilizando limites de intervalo uniformes. Um segundo conjunto de 10 descritores (SlogP-VSA) descreve o log (P) dos compostos e um terceiro conjunto de 8 (SMR-VSA) depende da polarizabilidade molecular.

Calculou-se os valores de todos os 32 descritores descritos acima para cada um dos 75 compostos (ver Lucco, J.M., J. Chem. Inf. Comput. SCI. (1999), 39, 396-404) para encontrar 16 uma correlação com a distribuição hematoencefálica experimental. Efectuou-se uma regressão de componente principal para estimar um modelo linear de Log (BB) em função dos descritores. No primeiro cálculo pareceu que podiam ser abandonados 8 descritores devido a uma contribuição muito baixa. Após o segundo ensaio sem estes 8, surgiram mais 9 descritores com contribuições inferiores a 0,1. Finalmente, com base no cálculo de 70 compostos (eliminou-se 5 aberrantes óbvios) utilizando os restantes 15 descritores, obteve-se uma correlação linear relativamente boa e validada de modo cruzado (deixando um de fora). Esta correlação está graficamente representada na Figura 1 (neste gráfico: componentes utilizados: 15; número de condição 663,7658; erro quadrático médio (RMSE): 0,20126; coeficiente de correlação (R2): 0,03240; R2 validado de modo cruzado: 0,88321). O Log (BB) é definido como se segue: LOG (BB) = Log (concentração no cérebro)/(concentração no sangue).

Os descritores obtidos por esta correlação puderam ser depois utilizados no cálculo da distribuição hematoencefálica dos tripéptidos e derivados de tripéptidos da presente invenção.

Inter alia, obteve-se os seguintes valores os quais se relacionam com as formas presentes na gama de pH fisiológico: 17 A2 e derivados de Ai A2 e derivados de A2 A3 e derivados de A3 Coeficiente de distribuição hematoencefálico G F POH -4,9 G F pnh2 -3,3 G F PN(Et)2 -3,3 G F POEt -2,8 L F pnh2 -2,0 G D-F pnh2 -3,3 G F d-pnh2 -3,3 A P pnh2 -3,1 A P 3,3-di-Me-PNH2 -2,3 I P 3,3-di-Me-PNH2 -2,1 N(Et)2-G I pnh2 -2,0 N(Et)2-I I pnh2 -1,6 I I pnh2 -2,6 I S pnh2 -3,5 I 3,4,5-tri-MeO-F pnh2 -3,5 I 3,4-di-Me-F pnh2 -2,7 G W pnh2 -3,8 G Y pnh2 -3,9 AI: aminoácidos alifáticos incluindo substituição no grupo amino, correspondentes à fórmula (I) Y1Y2N-CR2H-CO-. A2: aminoácidos aromáticos incluindo substituição no anel de fenilo assim como aminoácidos alifáticos, de acordo com a fórmula (I) -NH-CHRi-CO-. A3: prolina e derivados D: dextrorrotatório

Pode retirar-se as seguintes conclusões destes cálculos: (a) É preferida a utilização de prolinamida, prolina(dietil)amida e de ésteres metilicos da prolina em vez do ácido livre da prolina no que se refere à passagem da barreira hematoencefálica. (b) Entre as unidades estruturais de A2 (correspondente a Ri de fórmula (I)) são preferidos o aminoácido aromático F e os seus derivados de alquilo assim como a isoleucina (I). 18 (c) Entre as unidades estruturais de AI (correspondente a R2 de fórmula (I)) são particularmente preferidos o aminoácido alifático I assim como a substituição do grupo amino de G e I com 2 grupos etilo. (d) A quiralidade óptica das unidades de aminoácido não desempenha, aparentemente, um papel para a passagem passiva da barreira hematoencefálica. 2. Absorção gastrointestinal A absorção de um fármaco administrado por via oral é determinada pela sua capacidade de atravessar a barreira gastrointestinal. 0 sistema de Ensaio Paralelo de Permeação de Membrana Artificial (PAMPA) é um método simples e rápido para o prognóstico da absorção gastrointestinal do fármaco. A permeação das camadas celulares biológicas está principalmente relacionada com os processos de difusão passiva. 0 método PAMPA mede a permeação de novos fármacos potenciais através de uma membrana artificial por difusão passiva e permite uma classificação em absorventes fracos, médios e fortes.

Utilizou-se o procedimento de acordo com o Ensaio Paralelo de Permeação de Membrana Artificial descrito por Kansy et al. (Kansy M., Senner F., Gobernator K., Physicochemical High Throughout Screening: Parallel Artificial Membrane Permeation Assay in the Description of Passive Absorption Processes, J. Med. Chem., 1998, 41(7), 1007-1010). A membrana artificial foi construída pipetando uma solução de lecitina em solvente orgânico sobre um material de filtro suporte em placas de 96 poços. Para todos os compostos de ensaio preparou-se soluções-mães a 5 mM em etanol. Diluiu-se em seguida em tampão de Tris (0,05M, pH 7,4) até uma 19 concentração final de 500 μΜ. Mediu-se as velocidades de permeação de todos os compostos de ensaio em triplicado ou quadruplicado. O tempo de difusão através da membrana artificial foi de 16 h. Determinou-se individualmente os valores de referência sem camada de fosfolipidos para todos os compostos. Mediu-se as concentrações nos compartimentos aceitadores por espectroscopia diferencial de UV utilizando um leitor de placas microtitulo Spectramax Plus384 da Molecular Devices. Determinou-se os valores de Xmax num ensaio prévio para cada composto e efectuou-se medições a este comprimento de onda. As velocidades de permeação são exprimidas como taxas de fluxo, as quais são calculadas de acordo com a seguinte fórmula: fluxo (%) = OD (poço de ensaio)/OD (poço de controlo) χ 100. Como padrões internos inclui-se na placa 3 fármacos com taxas de fluxo conhecidas para permeação fraca, média e forte: Bretilio,

Hidrocortisona e Cumarina. Após a experiência de permeação efectuou-se uma verificação da integridade da membrana para examinar se os compostos de ensaio danificaram a membrana artificial por um efeito tóxico ou não especifico, constituindo desse modo um falso positivo. Aplicou-se amarelo de lucifer, um corante incapaz de sofrer permeação, a cada poço após a experiência e mediu-se a concentração do marcador num contador Wallac Victor2 1420 Multilabel. Rejeitou-se os poços nos quais a concentração de amarelo de lucifer excedeu 1% da quantidade detectada nos poços de controlo (sem membrana artificial). Na presente experiência apenas um poço excedeu (para o composto de referência Bretilio) este limite e não foi, por conseguinte, tido em consideração. O Quadro 1 mostra as taxas de fluxo dos 7 compostos de ensaio e dos 3 compostos de referência. 20

Compostos Fluxo Pampa (%) Média ± EPM Número de poços HCl-Gli-Fen-ProNH2 0 4 TRH <10 4 N,N-Dietil-Ile-Ile-ProNH2 47 ± 1 4 N-Isopropil-Ile-Ile-ProNH2 35 ± 1 3 N,N-Dietil-Gli-Ile-ProNH2 25 ± 0,5 3 N,N-Dietil-Ile-Fen-PrONHEt 51 ± 6 4 H-Gli-Fen-Pro-OH 0 4 Bretílio 0 2 Hidrocortisona 55 11 4 Cumarina 72 1 2 4 O controlo interno constituído por 3 compostos de referência, cujas taxas de fluxo foram medidas várias vezes por nós e outros (ver Kansy et al. acima), não mostrou quaisquer anormalidades e atestaram as boas condições em que se realizou a experiência. Bretílio, um composto activamente transportado, o qual apresenta uma biodisponibilidade baixa em seres humanos, também exibiu uma taxa de fluxo de 0% nesta experiência. As taxas de fluxo para a Hidrocortisona e Cumarina, publicadas por Kansy et al. (ver acima) foram de 52 e 66%, respectivamente. Estes dados estão em concordância muito boa com os resultados obtidos na nossa experiência (Quadro D · O método PAMPA permite uma classificação dos compostos em 3 grupos:

Permeadores fracos (taxa de fluxo <20 %) , médios (20 %< taxa de fluxo <50 %) e fortes (taxa de fluxo >50 %). Segundo esta classificação, o HCl-Gli-Fen-ProNH2, bem como 21 a TRH e H-Gli-Fen-Pro-OH serão compostos fracamente absorvidos, prevendo-se que os N,N-Dietil-Ile-Ile-ProNH2, N-Isopropil-Ile-Ile-ProNH2, N,N-Dietil-Gli-Ile-ProNH2 e N,N-Dietil-Ile-Fen-ProNHEt sejam compostos media a fortemente absorvidos após aplicação perorai.

Com base nos resultados obtidos neste estudo pode estabelecer-se a seguinte classificação dos compostos de ensaio em termos de permeabilidade de membranas biológicas: HCl-Gli-Fen-ProNH2, H-Gli-Fen-Pro-OH < TRH, N,N-Dietil-Gli-Ile-ProNH2 < N-Isopropil-Ile-Ile-ProNH2 < N,N-Dietil-Ile-Ile-ProNH2 < N,N-Dietil-Ile-Fen-ProNHEt

Uma limitação do sistema de ensaio de permeação PAMPA como é aqui descrito é o facto de ele poder apenas detectar compostos que são transportados pela via transcelular. OS compostos que preferem a via paracelular ou activa podem dar taxas de fluxo baixas apesar de uma absorção boa em seres humanos após aplicação perorai. 3. Determinação de constantes de ligação

Com base na estrutura de raios X ou de modelos de fragmentos diméricos de TrkA, TrkB e TrkC realizou-se estudos de ligação de vários compostos de fórmula (I). Para todos os arranjos de ligandos entre ambos os monómeros devem calcular-se as suas constantes de afinidade (pKd = pKi) por meio de métodos teóricos (ver Wang, R.; Liu, L., Lai, L., Tang, Y., J. Mol. Model., 1998, 4, 379-394). a) Modelação do arranjo dimérico dos receptores A base para todas as investigações seguintes é a estrutura de raios X (pdb = 1 www) de um fragmento de TrkA ligado 22 pelo NGF (ver Wiesmann, C., Ultsch, Μ. H., Bass, S. H., De Vos, A. M., Nature 1999, 401, 184). Nós supomos que os ligandos se podem ligar de um modo semelhante ao NGF a dois monómeros de TrkA, TrkB ou TrkC. Quanto mais elevada for a afinidade dos ligandos, mais próximos serão ambos os monómeros mantidos em conjunto, o que é considerado como uma função principal para a actividade. Uma vez que o NGF é muito maior do que os derivados de tripéptidos tem de se preparar modelos que permitam a ligação de moléculas muito pequenas. Para este fim eliminou-se os grupos coordenados do NGF da estrutura de raios X e moveu-se manualmente um monómero para a proximidade do contacto de van der Walls com o outro monómero (utilizando o pacote de modelação molecular SYBILO (TRIPOS Associates Inc.). Para encontrar um arranjo relevante de ambos os monómeros não ocupados em conjunto realizou-se simulações de dinâmica molecular (MD) utilizando o campo de força de AMBER-ALL-ATOM (ver S. J. Weiner et al. , J. Amer. Chem. Soc. 1984, 106, 765-784) a 150 K para 20000 fs. A estrutura resultante após esta simulação foi optimizada para um gradiente de energia de 0,1 kcal/mol À2. Esta estrutura foi utilizada como um molde para modelar as estruturas de TrkB e TrkC e para os estudos de ligação.

Os modelos do arranjo dimérico de TrkB e TrkC foram gerados utilizando a ferramenta de modelação por homologia COMPOSER (ver Blundell, T.L., Carney, D., Gardner, S., Hayes, F., Howlin, B., Hubbard, T., Eur.J.Biochem. 1988, 172-513-20) de SYBILO e minimizações subsequentes da MD e energia. As estruturas resultantes foram verificadas em termos de qualidade utilizando o PROCHECK (ver Laskowski, R.A., 23

MacArthur, M.W., Moss, D.S., Thornton, J.M., J. Appl.Cryst., 1993, 26, 283-91). b) Estudos de ligação dos ligandos

Utilizou-se o programa GOLD [ver Jones, D.T., J.Mol.Biol., 1999, 292(2), 195-202; Jones, D.T., Tailor, W.R., Thornton, J.M., Nature 1992, 358, 86-89)] para fixação "automática" dos ligandos. Para garantir uma ligação óptima para cada um dos ligandos a todos os três receptores, investigou-se dois sítios de ligação ligeiramente diferentes. Utilizando GOLD determinou-se 20 estruturas de ligação (em conjunto 40) para cada ensaio. Uma vez que as estruturas proteicas são consideradas fixas, todos os 40 arranjos foram optimizados mantendo apenas a cadeia principal do receptor fixa. c) Determinação das constantes de afinidade

Para todos os complexos proteína-ligando calculou-se as energias de interacção dos ligandos com os receptores utilizando o campo de força Tripos, os chamados valores de ajuste utilizado o GOLD e o programa SCORE [ver Wang et al, ibid] para determinar os valores de pKd correspondentes aos valores de pKi no caso de complexos inibidores de enzimas (quanto maior for o ajuste ou os valores de pKd maior é a afinidade dos ligandos) . O SCORE considera não só as energias de interacção mas também a solvatação, dessolvatação e efeitos entrópicos nos arranjos de ligação.

Os resultados estão resumidos no quadro seguinte que mostra os melhores valores de pKd (pKi) para cada um dos ligandos ao receptor. O quadro também mostra os valores da distribuição hematoencefálica como se determinou acima. 24

Previu-se a afinidade mais elevada para o Et2-IFP-NH-Et (valor de pKi de 7,29 (cerca de 100 nM) quando se liga ao TrkA (por SCORE). Pode detectar-se algumas ligações por ponte de hidrogénio, no entanto, as mais importantes são as interacções hidrófobas de ambos os grupos etilo N-terminais e as da cadeia lateral Ile com três resíduos de histidina e da cadeia lateral fenilalanina com o Fen327 do receptor. Para todos os restantes ligandos a afinidade é cerca de uma ordem de grandeza menor.

Ligando Receptor valor de pKd Log BB HCl-Gli-Fen-ProNH2 TrkC 6,15 -3,3 N,N-Dietil-Ile-Ile- ProNH2 TrkB 6,15 -1,7 N-Isopropil-Ile-Ile- ProNH2 TrkA 6,31 -2,2 N,N-Dietil-Gli-Ile-ProNH2 TrkA 5, 44 -2,0 N,N-Dietil—Ile-Fen-ProNHEt TrkA 7, 29 -2,4 H-Gli-Fen-Pro-OH TrkC 5, 58 -4,9 4. Síntese a) Síntese de HCl-H-Gli-L-Fen-L-Pro-NH2

Passo 1: Boc-L-Fen-OH+H-L-Pro-Nfh -> Boc-L-Fen-L-Pro-Nfh

Dissolveu-se 87,6 g de Boc-L-Fen-OH numa mistura de 50 ml de dimetilformamida (DMF) e 300 ml de 1,2-dimetoxietano (DME) e arrefeceu-se até -15 °C. Subsequentemente, adicionou-se 37 ml de N-metilmorfolina (NMM) (1 equivalente) de uma única vez e adicionou-se 25 subsequentemente 45 ml de cloroformato de isobutilo (IBCF) (1 equivalente) gota a gota ao longo de 10 min. Agitou-se então a mistura durante mais 5 min a -15 °C. Adicionou-se subsequentemente 40 g de TFA.H-L-Pro-NH2 (1,06 equivalentes) em fracções ao longo de 5 min, e adicionou-se em seguida 315 ml de N,N-diisopropil-N-etilamine (DIEA) (1 equivalente) de uma única vez. Fez-se reagir a mistura reaccional dum dia para o outro à temperatura ambiente e pressão atmosférica. Subsequentemente, concentrou-se a mistura reaccional num evaporador rotativo munido com um aspirador de água e uma armadilha de gelo seco/acetona, e tomou-se o resíduo em 1 1 de acetato de etilo seguido de doze lavagens com 80 ml de solução aquosa de KHS04 IN, uma lavagem com 80 ml de solução aquosa saturada de cloreto de sódio, dez lavagens com 80 ml de solução aquosa saturada de NaHCCd, uma lavagem com 80 ml de solução aquosa saturada de cloreto de sódio numa ampola de decantação de 2 1. Realizou-se a secagem subsequente sobre 50 g de Na2S04. Após filtração através de um funil de vidro sinterizado (porosidade grosseira) concentrou-se como se descreveu acima. Triturou-se em seguida o resíduo de evaporação (espuma seca) em 1 1 de hexano, e recolheu-se um sólido num funil de vidro sinterizado (120 mm d.i. x 120 mm, porosidade média). Seguiu-se uma secagem num secador ao longo de 12 horas à temperatura ambiente e uma pressão de 0,1 até 1 mm Hg (bomba de vácuo a óleo, com uma armadilha de gelo seco/acetona). Deste modo, obteve-se 92,8 g de Boc-L-Fen-L-Pro-NH2 (rendimento: 77,8%).

Dados analíticos: 317 g/mol 60 °C (decomposição) massa molar (espectroscopia de massa): ponto de fusão: 26 pureza (HPLC): rotação óptica [Na/20 °C]: H20 [KF] : metais pesados: solventes: análise elementar: 95, 2% -23,9 1,84%

25,4 ppm 2,02 °/oo 64,0% C 7, 4% H 11,4% N 17,0% 0

Passo 2: Boc-L-Fen-L-Pro-NH2 -> TFA.H-L-Fen-L-Pro-NH2

Dissolveu-se/suspendeu-se o Boc-L-Fen-L-Pro-NH2 (180 g) obtido no passo 1 em 250 ml de cloreto de metileno num balão de fundo redondo de 2 1, munido com um agitador magnético. Em seguida, fez-se reagir 250 ml de ácido trifluoroacético com a solução à temperatura ambiente (15— 25 °C) e à pressão atmosférica durante uma hora. Precipitou-se então a mistura reaccional em 5 1 de éter terc-butilmetilico (TBME) sob agitação. Recolheu-se o precipitado num funil de vidro sinterizado e lavou-se subsequentemente duas vezes com 1,5 1 de éter dietílico e duas vezes com 1 1 de hexano. A secagem subsequente foi realizada como se descreveu acima no passo 1.

Passo 3: Boc-Gli-OH+TFA.H-L-Fen-L-Pro-NH2 -> Boc-Gli-L-Fen-L-Pro-NH2

Dissolveu-se 44 g de Boc-Gli-OH (1 equivalente) numa mistura de 50 ml de DMF e 300 ml de DME e arrefeceu-se subsequentemente até -15 °C. Adicionou-se 28 ml de NMM (1 equivalente) de uma única vez, seguida da adição gota a gota de 34 ml de IBCF (1 equivalente) ao longo de 10 min. Agitou-se a mistura mais 5 min a -15 °C. Àquele adicionou- 27 se 94,5 g de TFA.H-L-Fen-L-Pro-NH2 (1,06 equivalentes) em porções ao longo de 5 min, seguido da adição de 44 ml de DIEA (1 equivalente). Fez-se reagir a mistura reaccional dum dia para o outro à temperatura ambiente e pressão atmosférica. Subsequentemente, concentrou-se a mistura reaccional num evaporador rotativo, munido com um aspirador de água e uma armadilha de gelo seco/acetona, e tomou-se o resíduo em 1,2 1 de acetato de etilo, seguido de cinco lavagens com 80 ml de solução aquosa de KHS04 IN, cinco lavagens com 80 ml de solução aquosa saturada de NaHCCg, e uma lavagem com 80 ml de solução aquosa saturada de cloreto de sódio numa ampola de decantação de 2 1. Realizou-se a secagem subsequente sobre 50 g de Na2S04. Após filtração através de um funil de vidro sinterizado (porosidade grosseira) concentrou-se do modo como se descreveu acima. Triturou-se em seguida o resíduo de evaporação (óleo pegajoso) numa mistura de 1 1 de éter dietílico e 2 1 de hexano e recolheu-se um sólido num funil de vidro sinterizado (180 mm d.i. x 180 mm, porosidade média) . A secagem subsequente foi realizada num secador ao longo de 12 horas à temperatura ambiente e a uma pressão de 0,1 até 1 mm Hg (bomba de vácuo de óleo, com armadilha de gelo seco/acetona). Em conformidade, obteve-se 100 g de Boc-Gli-L-Fen-L-Pro-NH2 (rendimento: 94,7%).

Dados analíticos: massa molar (espectroscopia de massa): 418 g/mol ponto de fusão: 66 °C (decomposição) pureza (HPLC): 98,6% rotação óptica [Na/20 °C]: -27,9 3,78% 40,2 ppm 1,8 °/oo H20 [KF] : metais pesados: solventes: 28

análise elementar: 61,2% C 7,5% H 12,8% N 18,4% 0

Passo 4: Boc-Gli-L-Fen-L-Pro-NH2 -> HC1.H-Gli-L-Fen-L-Pro-NH2

Dissolveu-se/suspendeu-se o Boc-Gli-L-Fen-L-Pro-NH2 (149 g) obtido no passo 3 em 300 ml de cloreto de metileno e adicionou-se em seguida 300 ml de HC1 4N/dioxano de uma única vez. Fez-se reagir a mistura durante uma hora à temperatura ambiente (15-25 °C) à pressão atmosférica num balão de fundo redondo de 2 1 munido com um agitador magnético. Subsequentemente, adicionou-se 1 1 de éter dietilico à mistura reaccional e recolheu-se o precipitado num funil de vidro sinterizado. Lavou-se então o precipitado duas vezes com 1,5 1 de éter dietilico e secou-se como se descreveu no passo 1.

Dados analíticos:

318 g/mol 93 °C (decomposição) 98,8% -19,1 2, 79% 15,9 ppm 0,72 °/oo 53,7% C 6, 4% H 14,3% N 14,9% O massa molar (espectroscopia de massa) ponto de fusão: pureza (HPLC) : rotação óptica [Na/20 °C] : H20 [KF] : metais pesados: solventes: análise elementar: b) Síntese de N,N-Dietil-Ile-Fen-Pro-NH-Et 29 0 acetato de N,N-Dietil-Ile-Fen-Pro-NH-Et foi preparado por síntese em fase sólida do seguinte modo:

Passo Reacção Reagente Tempo Temperatura 0 H-R + Fmoc-Fen-OH -> Fmoc-Fen-R (I) B 2,00 h 20 °C 1 (I) ->H-Fen-R (II) A 0,25 h 20 °C 2 (II) +Boc-Ile-0H-> Boc- Ile-Fen-R (III) B 12,00 h t\3 O O O 3 (III) ->H-Ile-Fen-Pro-NH-Et (IV) C 1,50 h 20 °C 4 (IV) ->Separação por HPLC (IV) D 20 °C 5 (IV) ->N,N-Dietil-Ile- Fen-Pro-NH-Et (V) DMF, brometo de etilo 6 (V) ->Separação por HPLC (V) D 20 °C 7 (V) ->Liofilização (V) 20 °C 8 (V) ->Formação de Acetato (VI) E 20 °C 9 (VI) -> Liofilização (VII) conservar a -20 °C -20 °C H-R: H-Pro-(SASRIN)-N-Et (propriedade de Bachem AG, CH; em base de poliestireno)

A: 20% de Piperidina em DMF B: DCCl/HOBt/DMF C: 95% de TFA, seguido de evaporação D: RP-HPLC sobre C18, Sistema: 0,1% de TFA/Acetonitrilo E: permutador aniónico na forma de acetato, eluição com água

Dados analíticos:

Aparência: Produto amarelado

Solubilidade: 1 mg/ml em ácido acético a 5% (solução transparente, incolor)

Análise de Aminoácidos: Pro 1,00 (1)

Fen 0,03 (1) 30 determinado; incompleta ESI-MS: m=458 Pureza (HPLC) Teor de água: c) Síntese de

Ile 0,01 (1) N,N-dietil-Ile não Ligação Ile-Fen 5 u (massa média) >95% 3,9% N,N-Dietil-Ile-Ile-Pro-NH-Et pode ser hidrólise O sal acetato de N,N-Dietil-Ile-Ile-Pro-NH-Et foi preparado por síntese em fase sólida como se segue:

Passo Reacção Reagente Tempo Temperatura 0 Fmoc-R -> H-R (I) A 0,25 h 20 °C 1 (I) + Fmoc-Ile-Pro-OH -> Fmoc-Ile-Pro-R (II) B 1,25 h 20 °C 2 (II) -> H-Ile-Pro-R (III) A 0,25 h 20 °C 3 (III) +Fmoc-Ile—OH -> Fmoc-Ile-Ile-Pro-R (IV) B 1,50 h 20 °C 4 (IV) -> H-Ile-Ile-Pro-R (V) A 0,25 h 20 °C 5 (V) -> H-Ile-Ile-Pro-NH2 (VI) + HO-R C 1,50 h 20 °C 6 (VI) -> N,N-Dietil-Ile- Ile-Pro-NH2 (VII) DMF, brometo de etilo 7 (VII) -> Separação por HPLC (VII) D 20 °C 8 (VII) -> Liofilização (VII) 20 °C 9 (VII) -> Formação de Acetato (VIII) E 20 °C 10 (VIII) ->Liofilização (VIII) conservar a -20 °C -20 °C 31

Fmoc-R = Fmoc-Resina de Ramage (D-2200) Fmoc-Ile-Pro-OH (B-2135), Fmoc-Ile-OH (B-1340)

A = 20% de Piperidina em DMF B = TBTU/DIPEA/DMF C = 95% de TFA, seguido de precipitação com IPE D = RP-HPLC sobre C18, Sistema: 0,1% de TFA/Acetonitrilo E = Permutador Aniónico na forma de acetato, Eluição com H20

Dados analíticos:

Aparência: Produto amarelado

Solubilidade: 1 mg/ml em água (solução transparente, incolor)

Análise de Aminoácidos: Pro 1,00 (1)

Ile 0,03 (1) N,N-dietil-Ile não pode ser determinado;

Ligação Ile-Ile hidrólise incompleta ESI-MS: m=396,5 u (massa média)

Pureza (HPLC): >96%

Teor de água: 2,0% 5. Determinação da estabilidade metabólica

Isolamento e Cultura de hepatócitos de ratazana

Isolou-se hepatócitos de ratazanas Wistar macho adultas (IFFA Credo, L'Arbresle, França) por uma perfusão hepática in situ utilizando colagenase (adquirida de Sigma (St. Louis, Mo., E.U.A.), segundo um procedimento descrito por Seglen (Preparation of isolated rat liver cell, Methods Cell Biol. 13, 29-83, 1976) e modificado por Williams et

Improved III. al. (Rat hepatocyte primary culture. 32 dissociation and attachment techniques and the enhancement of survival by culture médium, in vitro 13: 809-817, 1977). Depois de se ter estimado a viabilidade celular pela resistência periférica de células intactas em microscopia de contraste de fase e o ensaio de azul de tripano, lavou-se hepatócitos isolados de fresco em meio básico de William E (WME) fortificado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, cortisol 7 0 μΜ, L-glutamina 2 mM, tampão de HEPES 10 mM e NaOH 4 mM. Aplicou-se em seguida a uma densidade de 0,5 x 106 células por placa plástica de cultura de células de 50 mm no meio anteriormente descrito para fixação das células durante 6 horas a 37 °C. Subsequentemente, lavou-se os hepatócitos três vezes em meio sem soro e sem colesterol (SF-WME) contendo 4 g/1 da fracção V da albumina de bovino (Sigma) como portador para 7,8 μΜ de uma mistura de ácidos gordos livres (Cheesebeuf M e Padieu P, Expression of major liver metabolic function in long-term serum-free rat liver epithelial cell lines. In vitro 20: 780-795, 1984) e transferiu-se em seguida para o SF-WME fortificado com os vários tripéptidos de fórmula (I). Para cada grupo de experiências, utilizou-se hepatócitos de três ou quatro fígados.

Estatística

As significâncias são calculadas utilizando o teste t de Student. Os valores são exprimidos como média ± DP.

Análise dos tripéptidos nos hepatócitos: Método: (Hepatócitos em suspensão)

Amostra de plasma: Precipitação com ácido tricloroacético. 33

Centrifugação e alíquota de sobrenadante para HPLC.

Coluna de permuta iónica: Nucleosil C18 (250 x 4,6 mm). Tampão TEAP a 0,1%/CH3CN, 1 ml/min Leituras a 210 nm

Condições de ensaio dos tripéptidos 20 μρ/24 h/101 células 101 células/ml

Reduzir a substância a 10 μρ/πιΐ e 1,0 μg/ml

Cada substância de cada concentração será analisada 10 vezes durante 24 h (lh, 2h, 4h, 6h, 8h, lOh, 12h, 16h, 20h, 24h) .

Resultados

Obteve-se os valores de semivida seguintes:

Tripéptido T ½ (h) N,N-Dietil-Ile-Ile-ProNH2 3,4 N-Isopropil-Ile-Ile-ProNH2 2,6 N,N-Dietil-Gli-Ile-ProNH2 2, 8 N,N-Dietil-Ile-Fen-ProNHEt 4,5 H-Gli-Fen-Pro-OH 0-1 1

Modelos Animais a) Introdução Não existem modelos animais para a doença de Alzheimer. O modelo do ratinho transgénico tem apenas uma utilização limitada no que se refere ao comportamento. Por esse motivo nós apresentamos uma bateria de três modelos de ratazana. 34

Cada modelo reproduz uma das caracteristicas fisiopatológicas da doença: degeneração neurofibrilar no modelo de vincristina, degeneração pela beta-amilóide no modelo Gpl20 e apoptose no modelo da dexametasona. A vincristina é um antineoplásico que é utilizado como um agente de sincronização. Esta molécula liga-se ao fuso dos microtúbulos, bloqueando desse modo a multiplicação celular durante a metafase. Ele é um veneno para o fuso. Os neurónios não se multiplicam em condições fisiológicas, mas os axónios são feitos de neurofibrilas cuja estrutura é semelhante à dos microtúbulos do fuso. A vincristina liga-se a estas neurofibrilas originando desse modo distúrbios de condução neuronal periférica em doentes que estão a ser tratados para neoplasias. Estes efeitos afectam principalmente a matéria branca dos axónios. Como a vincristina não passa a barreira hematoencefálica ela tem de ser dada por administração intracerebroventricular. A administração ICV repetida de vincristina provoca uma degeneração dos percursos de condução com o aparecimento de neurofibrilas anormais semelhantes às observadas na doença de Alzheimer. Esta degeneração afecta principalmente a estrutura periventricular. Os hipocampos são afectados através de uma diminuição das suas ramificações, enquanto os corpos celulares dos neurónios não são alterados. Nós também demonstramos que a administração repetida de vincristina é apenas possível por um período de tempo curto (5 dias no máximo) . Após este período forma-se uma camada protectora nas células gliais que impedem a difusão de vincristina do CSF para as células nervosas vizinhas. Não há desenvolvimento espontâneo da doença de Alzheimer em ratazanas que apresentam os diferentes tipos de lesões degenerativas (degeneração por placas beta-amilóide, 35 neurofibrilar e vacuolar). A administração ICV de vincristina, a qual pode provocar degeneração neurofibrilar, pode ser utilizada como um modelo animal parcial desta doença. Os estudos que nós realizamos em ratazanas no nosso laboratório mostraram uma diminuição da arborização do hipocampo. Após a administração de vincristina, a capacidade de aprendizagem dos animais é diminuída, ao mesmo tempo que se observa uma degeneração neurofibrilar do hipocampo. Uma vez que é difícil avaliar esta degeneração num modelo de rastreio, os únicos parâmetros de avaliação são as capacidades de aprendizagem. Este modelo foi padronizado e validado no nosso laboratório para se obter uma boa reprodutibilidade. A dexametasona é um corticóide semelhante ao cortisol natural. 0 stress provoca uma libertação de catecolamina e cortisol (corticosterona em ratazanas). 0 stress repetitivo - "stress crónico" - leva a uma regulação negativa dos receptores do hipocampo para os glucocorticóides. Estes estudos, os quais foram iniciados em ratazanas, foram confirmados em seres humanos, nos quais é observada em primeiro lugar uma forma especifica de depressão (síndrome da Guerra do Golfo), seguida de uma deficiência irreversível das capacidades cognitivas. Estudos de MRI em seres humanos mostraram uma degeneração dos neurónios do hipocampo. Uma síndrome semelhante é observada em doenças associadas ao hipercorticismo (Morbus Cushing) ou durante o tratamento prolongado com corticóides (Esclerose Múltipla). Em ratazanas, a administração repetida provoca inicialmente uma regulação negativa dos receptores de tipo II do hipocampo que é seguida por uma degeneração dos neurónios das camadas CAII e CAIU. A capacidade de aprendizagem dos animais é diminuída. Este modelo foi padronizado e validado 36 no nosso laboratório para se obter uma boa reprodutibilidade. A Gpl20 é uma glicoproteína da superfície do vírus do HIV. Esta glicoproteína desempenha um papel fundamental na ligação do vírus e na transferência do ARN virai para a célula hospedeira. A Gpl20 isolada também se liga aos receptores CD4 das células e origina uma lesão das membranas com o aspecto dos poros em que os iões cálcio mergulham, provocando desse modo a apoptose celular. Na superfície das células, a Gpl20 forma um depósito de proteínas glicosiladas que são muito semelhantes aos depósitos beta-amilóide. 0 vírus do HIV não atravessa a barreira hematoencefálica, mas os macrófagos infectados viralmente passam-na com facilidade. UMA vez chegado ao SNC, o macrófago morre e liberta o seu conteúdo celular com a Gpl20 e os outros constituintes virais. Esta Gpl20 liga-se ao CD4 das células gliais e também aos neurónios provocando, desse modo, demência complexa como a etapa final da SIDA. As lesões observadas são semelhantes às da doença de Alzheimer, mas com uma distribuição diferente. Na doença de Alzheimer as estruturas colinérgicas dos núcleos da base e do sistema límbico são os primeiros a serem alterados, enquanto na demência complexa da SIDA a distribuição das placas é disseminada. Nós realizamos vários estudos em ratazana utilizando este modelo da Gpl20. A administração no fluido cérebro-espinal provoca uma diminuição importante dos neurónios nos hipocampos associada a uma diminuição no consumo regional de glucose e uma diminuição no fluxo sanguíneo. A degeneração é observada nas camadas CAII e CAIII do hipocampo que induz uma diminuição das capacidades de aprendizagem. Este modelo 37 foi padronizado e validado no nosso laboratório para se obter uma boa reprodutibilidade. b) Materiais e métodos

Animais

Nesta experiência com animais utiliza-se 70 ratazanas Wistar machos (Charles River, Saint Aubin les Elbeuf, França), cada uma pesando em média 280-300 grama. Durante um período de uma semana, colocou-se os animais em estabulação num biotério onde se controlou os parâmetros seguintes: ritmo dia/noite: 7,00 a.m./7,00 p.m. temperatura: 22 + /- 1 °C. higrometria: 50 + /- 10%

Aos animais foi fornecido ad libitum água para beber e uma ração corrente UAR A03.

Modelo da Vincristina

Anestesiou-se ligeiramente as ratazanas com éter, fez-se uma incisão na pele do crânio e perfurou-se o crânio com uma broca de dentista. Dirigiu-se estereotaxicamente uma agulha metálica para o ventrículo lateral e fixou-se em seguida por meio de cimento de dentista. Em cada um dos dias da experiência controlou-se a patência da agulha.

Três dias após a introdução da agulha (recuperação do choque pós-operatório) injectou-se os animais não anestesiados com 5 μΐ de soro fisiológico normal contendo vincristina numa dose de 5 μg/kg/dia. (As experiências laboratoriais mostraram que a degeneração dependia da dose 38 de vincristina; a dose de 5 μg/kg/dia provoca uma perda de 40 até 60% da arborização do hipocampo) . Repetiu-se esta administração todos os dias durante um período de cinco dias.

Três dias após a última administração de vincristina, os animais foram anestesiados com hidrato de cloral (360 mg/kg) e, começando na artéria carótida externa, introduziu-se retrogradamente um cateter flutuante permanente numa artéria carótida comum. Este cateter foi deixado novamente no topo do crânio e fixado com cimento de dentista. Após dois dias os animais tinham recuperado do choque pós-operatório. As experiências de validação do modelo demonstraram que a degeneração foi particularmente importante após a primeira administração de vincristina e durante os primeiros dias após a última administração. O estado estacionário foi alcançado ao 3o dia após a última administração e o modelo foi estável durante um período de vários meses. Uma vez ultrapassado este período de tempo, observou-se um segundo tipo de degeneração que afecta a matéria branca e que era certamente devido ao fenómeno de apoptose).

Cinco dias após a última administração de vincristina, as vinte ratazanas foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos de 10 animais cada: - um grupo de 10 ratazanas recebeu uma injecção intracarótida de 1 ml/kg/dia de soro fisiológico normal (controlos) durante um período de 10 dias. - um grupo de 10 ratazanas recebeu 20 mg/kg/dia de HCl-Gli-Fen-ProNH2 dissolvido em soro fisiológico normal durante um período de 10 dias.

As injecções foram dadas às 9,00 a.m. 39

Durante os últimos cinco dias de tratamento, as ratazanas foram colocadas em condições de aprendizagem comuns para os três modelos entre as 10,00 a.m. e as 11,00 a.m. (ver abaixo).

Modelo da Dexametasona

Medicou-se 20 ratazanas por via oral com 50 mg/kg/dia de dexametasona ao longo de um período de 21 dias. No dia 19, anestesiou-se os animais com hidrato de cloral (360 mg/kg) e colocou-se um cateter na artéria carótida como se descreveu acima. No Dia 21, os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: - um grupo de 10 ratazanas recebeu uma injecção intracarótida de 1 ml/kg/dia de soro fisiológico normal durante um período de 10 dias (controlos). - um grupo de 10 ratazanas recebeu 20 mg/kg/dia de HCl-Gli-Fen-ProNH2 dissolvido em soro fisiológico normal durante um período de 10 dias.

As injecções foram dadas às 9,00 a.m.

Durante os últimos cinco dias de tratamento, as ratazanas foram colocadas em condições de aprendizagem comuns para os três modelos entre as 10,00 a.m. e as 11,00 a.m. (ver abaixo).

Após a última sessão de aprendizagem às 11,00 a.m., sacrificou-se as ratazanas por meio de decapitação e retirou-se rapidamente os hipocampos e colocou-se numa placa arrefecida a 0 °C. Determinou-se o número de receptores de glucocorticóides através de um método de ligação utilizando um corticóide marcado e um inibidor específico para a ligação do corticóide ao receptor (agui 40 um agonista total) . 0 teor de proteína foi medido pelo método de Lowry.

Os hipocampos de dada ratazana foram homogeneizados em 2ml de tampão de EDTA Glicerol molibdato de sódio. Centrifugou-se os homogenatos a 100.000 g durante 60 minutes. Diluiu-se uma alíquota do sobrenadante em água destilada e mediu-se o teor de proteína pelo método de Lowry. Esta concentração de proteína estava entre 1,3 e 1,7 mg/ml.

Dividiu-se o remanescente do sobrenadante em três partes com 0,2 ml cada. Adicionou-se concentrações crescentes (25, 50 e 75 nmoles/ml) de dexametasona 3H (Amersham 50 Ci/mM) a estas partes. Realizou-se outras três preparações nas mesmas condições, ao mesmo tempo que se adicionou uma quantidade de saturação de um antagonista total dos receptores (RU 28362) para se obter uma ligação não específica da dexametasona marcada.

Após uma noite de incubação a 4 °C, adicionou-se carvão/dextrano para absorver as proteínas e a dexametasona ligada. Após centrifugação, mediu-se a radioactividade do sobrenadante por cintilação líquida.

Regista-se as quantidades radioactivas da dexametasona ligada ao teor de proteína. Os resultados são exprimidos em fentomoles de corticóide ligado ao receptor por mg de proteínas.

Modelo da Gpl20

Utiliza-se 30 ratazanas nesta experiência. 41

Dia 0. Anestesiou-se ligeiramente os animais com éter, fez-se uma incisão na pele do crânio e perfurou-se o crânio com uma broca de dentista. Dirigiu-se estereotaxicamente uma agulha metálica para o ventrículo lateral e fixou-se em seguida com cimento de dentista. Em cada um dos dias da experiência controlou-se a patência da agulha.

Dia 3. Três dias após introdução da agulha (recuperação do choque pós-operatório) os animais receberam uma injecção intra-ventricular de 10 nM/kg/dia de Gpl20 (dissolvida em soro fisiológico normal) num volume de 20 μΐ. Repetiu-se esta administração diariamente durante um período de cinco dias.

Dia 18. Dez dias após a última administração de Gpl20, anestesiou-se as ratazanas com hidrato de cloral (360 mg/kg). Introduziu-se retrogradamente um cateter flutuante permanente na artéria carótida comum. Deixou-se novamente este cateter no topo do crânio, onde foi fixado.

Dia 21. Três dias depois (recuperação do choque pós- operatório) dividiu-se aleatoriamente as 30 ratazanas em três grupos de 10 animais cada: - o primeiro grupo de 10 ratazanas recebeu uma injecção intracarótida de 1 ml/kg/dia de soro fisiológico normal durante um período de 10 dias. - o segundo grupo de 10 ratazanas recebeu 10 mg/kg/dia de HCl-Gli-Fen-ProNH2 (dissolvido em soro fisiológico normal) durante um período de 10 dias. - o terceiro grupo recebeu 20 mg/kg/dia de HCl-Gli-Fen-

ProNH2 nas mesmas condições.

As injecções foram dadas entre as 9,00 e as 9,30 a.m. 42

Dia 26 a 30. Os animais de todos os três grupos foram colocados nas condições de aprendizagem comuns de todo o protocolo. As sessões de aprendizagem decorreram entre as 10,00 a.m. e as 11,00 a.m.

Dia 30. Após a última sessão de aprendizagem, as ratazanas foram sacrificadas por meio de decapitação, o cérebro foi retirado rapidamente e congelado a 80 °C em vapor de azoto líquido. Preparou-se secções de cérebro por criocorte a -20 °C.

As secções são descongeladas e reveladas com vermelho neutro. Após fixação mediu-se o número de neurónios na fatia do hipocampo. O método é padronizado contando os neurónios na mesma fatia. Um índice do número de neurónios relativamente a uma ratazana de controlo permite uma quantificação mais fiável do que a simples contagem.

Aprendizagem

Durante os últimos cinco dias de tratamento, às 10,00 a.m. (1 hora após a administração de HCl-Gli-Fen-ProNH2) , os animais foram colocados numa gaiola de aprendizagem para resposta condicionada de evasão ao som (Resposta condicionada de evasão). Os animais aprenderam a subir uma vara, primeiro para fugir e depois para evitar um choque eléctrico. Este método foi padronizado e quantificado no nosso laboratório (ver Le Poncin M., Lafitte J. C., Rapin J. R., Sound Avoidance Conditioning and a Mathematical approach to the description of acquisition performance, Math. Biosciences 59 (1982) 242-268).

Durante um período de cinco dias, os animais foram colocados todos os dias nestas condições de aprendizagem 43 num total de dez testes por dia. Os resultados são exprimidos como percentagens de respostas adequadas e a cinética da resposta é representada por uma curva de máximo multi-exponencial.

Em todas as experiências, que nós realizamos no laboratório, todos os animais de controlo exibiram uma resposta de evasão no Dia 5 de aprendizagem (100% de respostas adequadas). O máximo da curva representa as capacidades de aprendizagem. O declive da curva avalia a velocidade de aprendizagem. A área sob a curva (AUC) representa uma boa avaliação de todos os parâmetros condicionantes. O valor máximo da área sob a curva é 500, se os animais exibirem 100% de respostas adequadas tão cedo como o Dia 0. Na realidade, calcula-se uma área sob a curva média por dia, o que ascende a um valor máximo de 100. Nos animais de controlo absoluto, esta área sob a curva média é igual a 40+/-4.

Nas experiências supramencionadas, os animais de controlo são aqueles que receberam apenas um reagente que provoca degeneração. Nestas condições os valores óptimos dos animais de controlo estão longe de serem atingidos.

Reagentes

Todos os reagentes utilizados são reagentes de grau I e são fornecidos pela Aldrich (Saint Quentin Fallavier, França).

Dexametasona 3H é proporcionada pela Amersham (Inglaterra). 44 0 agonista específico (RU 28362) é proporcionado pela Roussel. 0 HCl-Gli-Fen-ProNH2 foi utilizado como sintetizado acima. Análise Estatística

Os resultados são exprimidos como uma média e o erro padrão da média (EPM) dos resultados obtidos para dez ratazanas por grupo experimental.

Após uma análise de variância ANOVA, os resultados significativos são obtidos por meio de um teste t de Student. A variabilidade é calculada como uma função dos mínimos quadrados para cada dia experimental. A significância é determinada por um teste t. d) Resultados 1. Modelo da Vincristina

Resposta condicionada de evasão ao som pelo método de ensaio de subida pela vara

Os resultados são apresentados no Quadro I abaixo. Para cada dia de aprendizagem, os valores listados no quadro correspondem à percentagem de evasão. A ratazana evita a descarga eléctrica trepando a vara. No primeiro dia não se observa qualquer evasão em qualquer um dos grupos de animais. A velocidade e capacidades de aprendizagem estão significativamente diminuídas em ratazanas que receberam vincristina como uma injecção ICV. 0 tratamento por injecção intracarótida com HCl-Gli-Fen-ProNíb restabelece 45 parcialmente os parâmetros de aprendizagem. Este resultado significativo é observado para as áreas sob as curvas e para o tempo nos Dias 2, 3, e 4.

Quadro I. Efeito de HCl-Gli-Fen-ProNH2 (20 mg/kg/dia por um período de 10 dias) nas capacidades de aprendizagem de ratazanas previamente tratadas com vincristina (5 μg/kg/dia sob a forma de injecção ICV durante um período de 5 dias). Os resultados são exprimidos como percentagens de respostas adequadas.

Tratamento DO Dl D2 D3 D4 AUC Sem vinc. 0 8 + /-2 34+/-4 71+/-4 90+/-3 40,6+/- 2,3 Vinc. sozinha (controlos) 0 3 + /-2 8 + /-3 21+/-3 33+/-5 13,2+/- 2,4 Vinc. com tripéptido 0 5 + /-2 **20+/-4 **40+/-5 **59+/-6 **24,8+/ -3,2 n = 10 para cada tempo m+/-EPM, **p>0,01 comparaçao entre animais de controlo e tratados com HCl-Gli-Fen-ProNH2 2. Modelo da Dexametasona Resposta Condicionada ao Som

Os resultados são apresentados no Quadro II abaixo. A dexametasona administrada por via oral leva a uma diminuição significativa das capacidades de aprendizagem. 0 HCl-Gli-Fen-ProNH2 restabelece parcialmente as capacidades de aprendizagem tão cedo como do segundo dia em diante. 0 HCl-Gli-FenE-ProNH2 administrado por via intravenosa restabelece significativamente a área média sob a curva. 46

Quadro II. Efeito de HCl-Gli-Fen-ProNH2 numa dose de 20 mg/kg/dia durante um período de 10 dias nas capacidades de aprendizagem que foram diminuídas por um pré-tratamento com dexametasona administrada por via oral. Os resultados são exprimidos como percentagens de respostas adequadas.

Tratamento DO Dl D2 D3 D4 AUC Sem dexam. 0 8 + /-2 34+/-4 71+/-4 90+/-3 40,6+/-2,3 Dexam. sozinha (controlos) 0 5 + /-2 15+/-3 38+/-4 50+/-3 21,6+/-2,2 Dexam. com tripéptido 0 7 + /-2 **29+/-5 **57+/-4 **75+/-3 **35,0+/-3,1 n = 10 por grupo e para cada tempo, m+/-EPM, *p<0,05 **p<0,01 comparação entre animais de controlo e tratados com HCl-Gli-Fen-ProNH2

Determinação dos receptores de corticóides

Os resultados são apresentados no Quadro III.

Quadro III. Determinação dos receptores de glucocorticóides de tipo II no hipocampo de ratazanas que foram pré-tratadas com dexametasona. Os resultados são exprimidos em fentomole/mg de proteínas.

Sem dexam. Dexam. sozinha (controlos) Dexam. com tripéptido 120+/-11 45+/-3 **73+/-4 n = 10 m+/-EPM, **p<0,01 comparação entre animais de controlo e tratados com HCL-GLI-FEN-PRONH2 A administração repetida de HCL-GLI-FEN-PRONH2 reduz a regulação negativa dos receptores de glucocorticóides no hipocampo. 47 3. Modelo da Gpl20 Resposta Condicionada ao Som

Os resultados são apresentados no Quadro IV abaixo. A administração intracerebroventricular de Gpl20 leva a uma diminuição dos parâmetros de aprendizagem. 0 HCl-Gli-Fen-ProNH2 injectado restabelece as capacidades do animal em função da dose. A administração repetida de 20 mg/kg é mais activa do que administração de 10 mg/kg. Esta diferença é observada tanto quantitativamente como no parâmetro de velocidade de aprendizagem.

Quadro IV. Efeito de HCl-Gli-Fen-ProNH2 nos parâmetros de aprendizagem da ratazana tratada com Gpl20 com injecção intracerebroventricular. Os resultados são exprimidos como percentagens de respostas adequadas.

Tratamento D0 Dl D2 D3 D4 AUC Sem Gpl20. 0 8 + /-2 34+/-4 71+/-4 90+/-3 40,6+/-2,3 Gpl20 sozinha (controlos) 0 6 + /-3 9 + /-3 12+/-3 18+/-3 11,2+/-2,3 Gpl20 com tripéptido (10 mg) 0 8/-2 **20/-4 **35+/-4 **55+/-7 **23,8+/- 4,1 Gpl20 com tripéptido (20 mg) 0 8/-2 **21/-4 **48+/-5 **70+/-5 **29,6+/- 3,0 n = 10 m+/-EPM, *p<0,05 **p<0,01 comparação entre animais de controlo e tratados

Contagem Neuronal 48

Conta-se os neurónios nas camadas CAIII do hipocampo. 0 número de neurónios num campo, o qual é teoricamente sempre idêntico, está relacionado com um valor teórico que foi observado nos animais de controlo. Por definição, o valor encontrado nos animais de controlo é 100 com uma variação máxima de 5%. O Quadro V mostra os resultados desta contagem neuronal.

Quadro V. Contagem dos neurónios do hipocampo após administração IVC de Gpl20. Efeito da injecção repetida de HCl-Gli-Fen-ProNH2 em doses de 10 até 20 mg/kg.

Controlos HCl-Gli-Fen-ProNH2 10 mg/kg/dia HCl-Gli-Fen-ProNH2 20 mg/kg/dia 38+/-3 46+/-4 ** 56+/-2 n = 10 m+/-EPM, **p<0,01 comparaçao entre animais de controlo e tratados

Apenas a administração de 20 mg/kg de HCl-Gli-Fen-ProNH2 leva a um aumento significativo no número de neurónios. d) Discussão- Conclusão A administração IVC repetida de vincristina provoca uma degeneração da arborização dos neurónios do hipocampo: ela é, na realidade, uma degeneração neurofibrilar. Esta degeneração é mais extensiva e ela afecta até mesmo os neurónios periventriculares para onde a vincristina se espalha. Deste modo, estas observações são semelhantes às observadas nos cérebros afectados pela doença de Alzheimer. A diferença prende-se com a localização da degeneração neurofibrilar e com as estruturas afectadas. 49

As estruturas do hipocampo são particularmente interessantes, uma vez que a sua destruição conduz a menores desempenhos na aprendizagem. Este é o caso neste modelo, onde as ratazanas que receberam vincristina deixam de ser capazes de aprender o modo de evitar o choque eléctrico subindo à vara. Isto também se aplica a outros modelos, mesmo no caso de a degeneração ser de um tipo diferente.

No caso da dexametasona ocorre uma regulação negativa dos receptores a qual antecede os fenómenos de apoptose. Até este momento não existe degeneração.

Pelo contrário, existe degeneração com a Gpl20, mas esta ainda não é completa.

Em todos os três casos, nós padronizamos os modelos de modo a conseguir-se recuperação. Se, por exemplo, a dose de Gpl20 for duplicada, ou se a dose for mantida mas a duração do tratamento duplicada, existe praticamente uma degeneração total. Os parâmetros de aprendizagem são próximos de zero, e o número de neurónios é muito baixo.

Além disso, determinados neurónios já não retém mais o corante, mesmo que eles continuem funcionais. Finalmente, pode ainda parar-se a degeneração, se o tratamento for iniciado durante a fase progressiva. Os resultados que nós observamos não correspondem a um repovoamento de neurónios, mas a uma menor perda neuronal.

Em conclusão, o HCl-Gli-Fen-ProNH2 administrado directamente melhora significativamente as capacidades de aprendizagem, se estas tiverem sido debilitadas após 50 administraçao ICV de vincristina e de Gp120, ou após tratamento oral com dexametasona. Ao mesmo tempo é melhorado o funcionamento neuronal do hipocampo.

Lisboa, 23 de Novembro de 2006

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de compostos da fórmula (I) seguinte:

r5 em que X representa NH2, NH-alquilo-Ci-3, N(alquil Ci_3)2; Ri é um resíduo derivado do aminoácido Fen, o qual pode estar opcionalmente substituído com um ou mais grupos alcoxilo (C1-5) , grupos alquilo (C1-5) ou átomos de halogéneo, ou o qual é um resíduo derivado de Ile; r2 é um resíduo derivado de um dos aminoácidos Gli ou Ile; Yi e Y 2 independentemente um do outro representam H ou alquilo (C1-3) ; R3 e R4 representam H; e R5 representa H; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; para a preparação de um medicamento para ser utilizado no tratamento de doenças neurodegenerativas. 1 2

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a doença neurodegenerativa é a doença de Alzheimer.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a doença neurodegenerativa é a deficiência cognitiva suave.

4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o composto de fórmula (I) é glicil-L-fenilalanil-L-prolinamida, etilamida de N,N-dietil-isoleucil-fenilalanil-L-prolina, N,N-dietil- isoleucil-isoleucil-prolinamida ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

5. Composição farmacêutica compreendendo compostos da fórmula (I) seguinte: x ,p

em que X representa NH2, NH-alquilo-Ci-5, N(alquil 01-5)2; Ri é um resíduo derivado do aminoácido Fen, o qual pode estar opcionalmente substituído com um ou mais grupos alcoxilo (C1-5) , grupos alquilo (C1-5) ou átomos de halogéneo; r2 é um resíduo derivado de um dos aminoácidos Gli ou Ile; Yi e Y2 representam H; R3 e R4 representam H; e 2 3 R5 representa H; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

6. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 5 ou 12, em que R2 é um residuo o qual é derivado do aminoácido Gli.

7. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 5 ou 6, em que o composto de fórmula (I) é glicil-L-fenilalanil-L-prolinamida, etilamida de N,N- dietil-isoleucil-fenilalanil-L-prolina, N,N-dietil- isoleucil-isoleucil-prolinamida ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

8. Utilização de um composto de fórmula (I) como definido na reivindicação 5 para a preparação de um medicamento para ser utilizado no tratamento de doenças neurodegenerativas. Lisboa, 23 de Novembro de 2006 3