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PT1268425E - Inibidores de caspase do grupo do carbamato e as suas utilizações - Google Patents

Inibidores de caspase do grupo do carbamato e as suas utilizações Download PDF

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PT1268425E
PT1268425E PT01922868T PT01922868T PT1268425E PT 1268425 E PT1268425 E PT 1268425E PT 01922868 T PT01922868 T PT 01922868T PT 01922868 T PT01922868 T PT 01922868T PT 1268425 E PT1268425 E PT 1268425E
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PT
Portugal
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disease
compound according
group
ring
nmr
Prior art date
Application number
PT01922868T
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English (en)
Inventor
Ronald Knegtel
David Bebbington
David Kay
Julian Golec
Jean-Damien Charrier
Michael Mortimore
John Studley
Original Assignee
Vertex Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Description

DESCRIÇÃO
INIBIDORES DE CASPASE DO GRUPO DO CARBAMATO Ξ AS
SUAS UTILIZAÇÕES Âmbito da Invenção A presente invenção está dentro do domínio da química medicinal e tem por objecto novos compostos e as suas composições farmacêuticas, que inibem as caspases, que medeiam a apóptose das células e a inflamação. A presente invenção também tem por objecto composições farmacêuticas e a utilização dos compostos da presente invenção para a preparação de composições farmacêuticas para tratar doenças em que a acti-vidade da caspase está implicada.
Antecedentes da Invenção A apóptose, ou morte programada das células, é o mecanismo principal pelo· qual os organismos eliminam células indesejáveis. A desregulação da. apóptose, quer a apóptose excessiva ou a falta dela, tem estado implicada num certo numero de doenças, tais como, cancro, distúrbios inflamatórios agudos e distúrbios auto-imunitários, doenças isquémicas e certos distúrbios neurodegenerativos (ver, de uma forma geral, Science, 1998, 281, 1283-1312; Ellis et al., Ann. Rev. Cell. Biol., 1991, 7, 663).
As caspases são uma família de enzimas de cisteína protease, que são os mediadores chave na sinalização das vias para a apóptose e a desagregação das células (Thornberry, Chem. Biol·., 1998, 5, R97-R103). Estas vias de sinalização variam consoante o tipo de célula e o estímulo, mas todas as 1 vias da apóptose parecem convergir num caminho efector comum que leva à proteólise das proteínas chave. As caspases estão envolvidas tanto na fase efectora da via de sinalização, como ainda, a montante da sua iniciação. As caspases envolvidas a montante de eventos de iniciação tornam-se activas e, por sua vez, activam outras caspases que estão envolvidas nas últimas fases da apóptose. A caspase-1, a primeira caspase identificada, é também conhecida como a enzima que converte a interleucina ou "ECI" (ICE na terminologia inglesa). A caspase-1 converte o precursor de interleucina-ΐβ ("pIL-Ιβ") na forma activa pró-inflamatória, por clivagem especifica de pIL-Ιβ entre Asp-116 e Ala 117. Para além da caspase-1, há também rnais onze outras caspases humanas conhecidas, todas elas clivando especifica-mente nos resíduos de aspartilo. Também se tem observado que elas exigem condições severas para, pelo menos, quatro resíduos de aminoácidos no lado do terminal N no sitio da clivagem.
As caspases têm sido classificadas em três grupos consoante a sequência de aminoácidos que é preferida ou que é reconhecida em primeiro lugar. 0 grupo de caspases que inclui as caspases 1, 4 e 5 tem mostrado preferir aminoácidos aromáticos, hidrofóbicos na posição 4 no lado do terminal N do sítio de clivagem. Outro grupo que inclui as caspases 2, 3 e 7, reconhece resíduos de aspartilo tanto nas posições 1 como 4 no lado do terminal N do sitio de clivagem e, preferencialmente, uma sequência de Asp-Glu-X-Asp. Um terceiro grupo, que inclui as caspases 6, 8, 9 e 10 tolera muitos aminoácidos na sequência de reconhecimento principal, mas parece preferir resíduos com cadeias laterais alifáticas, ramificadas., tais como, valina e leucina na posição 4. 2
As caspases têm também sido agrupadas de acordo com a função que desempenham. A primeira sub-familia consiste nas caspases-1 (ECI), 4 e 5. Estas caspases têm mostrado estar envolvidas no tratamento de citocinas pró-inflamatórias e por isso desempenham um importante papel na inflamação. A cas-pase-1, a enzima desta classe mais estudada, activa o precursor de IL-Ιβ por clivagem proteolítica. Esta enzima desempenha por isso um papel chave na resposta inflamatória. A caspase-1 está também envolvida no processamento do factor de indução do interferão gama (FIIG ou IL-18), que estimula a produção do interferão gama, um imuno-regulador chave, que induz o aparecimento do antigénio, a activação das células T e a adesão das células.
As caspases restantes constituem a segunda e a terceira sub-familias. Estas enzimas são de uma importância central nas vias de sinalização intracelular que conduzem à apóptose. Uma sub-família consiste nas enzimas envolvidas em eventos de iniciação da via apoptótica, incluindo a transdução de sinais da membrana do plasma. Os elementos desta sub-familia incluem' as caspases 2, 8, 9 e 10. A outra sub-familia consiste nas caspases efectoras 3, 6 e 7, que estão envolvidas nos eventos da clivagem final a jusante,' que resulta na quebra sistemática e morte das células por apóptose. As caspases envolvidas na transdução do sinal a montante, activam as caspases a jusante que, por sua vez, desactivam o mecanismo de reparação do ADN, fragmentam o ADN, desmantelam a cito-estrutura das células e, finalmente, fragmentam as células. .
Determinou-se uma sequência de quatro aminoácidos reconhecida principalmente pelas caspases para os substratos de enzima. Talanian et al., J. Biol. Chem. 272, 9677-9682, (1997); Thornberry et al., J. Biol. Chem. 272, 17907-17911, (1997). 0 conhecimento da sequência de quarto aminoácidos 3 primeiramente reconhecida pelas caspases tem sido utilizado para preparar inibidores de caspase. Prepararam-se inibidores de tetrapéptidos reversíveis com a estrutura CH3CC>-[P4]-[P3]-[P2] ΌΗ (R) CH2CO2H, em que os símbolos P2 a F4 representam uma sequência óptima de reconhecimento de aminoácidos e R representa um aldeído, nitrilo ou cetona, capazes de se ligarem ao sulfidrilo da cisteína, da caspase. Rano e Thornberry, Chem. Biol. 4, 149-155 (1997); Mjalli, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 2689-2692 (1993); Nicholson et al., Nature 376,37-43 (1995). Os inibidores irreversíveis à base da ' sequência análoga do reconhecimento dos tetrapéptidos foram preparados, nos quais o símbolo R representa uma aciloximetilcetona-C0CH20C0R' . R' é exemplificado por um fenilo eventualmente substituído, tal como, 2, 6-diclorobenzoiloxi e em que R representa COCH2X, em que X representa um grupo eliminável, tal como, F ou Cl. Thornberry et al., Biochemistry 33, 3934 (1994); Dolle et al., J Med. Chem. 37, 563-564 (1994). Já foi demonstrada a utilidade dos inibidores de caspase para tratar uma variedade de estados de doença em mamíferos associados com um aumento da apóptose celular, utilizando inibidores peptídicos de caspase. Por exemplo, em modelos roedores, os inibidores de caspase mostraram que reduzem a dimensão do enfarte e inibem a apóptose cardiomiocítica depois do enfarte do miocárdio, para reduzir o volume da lesão e o défice neurológico resultante do ataque cardíaco, para reduzir a apóptose pós-traumática e o défice neurológico em feridas traumáticas do cérebro, têm mostrado que são eficazes no tratamento de destruição fulminante do fígado e que melhoram a sobrevivência após choque endotóxico. Yaoita et al., Circulation, 97, 276 (1998); Endres et al., J Cerebral Blood Flow and Metabolism, 18, 238 (1998); Cheng et al., J. Clin. Invest., 101, 1992 (1998); Yakovlev et al.., J Neuroscience, 17, 7415 (1997); Rodriquez et al., J. Exp. 4
Med., 184, 2067 (1996) ; Grobmyer et al-, Mol. Med., 5, 585 (1999).
Em geral, os inibidores peptídicos descritos antes são rrvuito potentes contra algumas das enzimas de caspase. Contudo, esta potência nem sempre vai ser reflectiva nos modelos celulares de apóptose. Além disso, os inibidores peptídicos são normalmente caracterizados por propriedades farmacológicas indesejáveis, tais como, uma fraca absorção oral, uma fraca estabilidade e um metabolismo rápido. Plattner and Norbeck, in Drug Discovery Technologies, Clark and Moos, Eds. (Ellis Horwood, Chichester, Inglaterra, 1990). Há descrições de inibidores peptídicos modificados. As patentes de invenção WO 91/15577 e WO 93/05071 descrevem inibidores peptídicos de ECI de fórmula geral: Z-Q2-Asp-Qi em que Z representa um grupo de protecção do terminal N; o símbolo Q2 representa 0 a 4 aminoácidos; e o símbolo Qi representa um grupo eliminável, electronegativo. A patente de invenção WO 99/18781 descreve inibidores de caspase dipeptídicos de fórmula geral: on.n.
em que o símbolo Ri representa um grupo de. protecção do terminal N; o símbolo AA representa um resíduo de um u-aminoácido ou um β-aminoácido naturais; o símbolo R2 representa hidrogénio ou CH2R4, em que o símbolo R4 representa 5 um grupo eliminável, electronegativo; e o símbolo R3 representa alquilo ou hidrogénio. Ά patente de invenção WO 99/47154 descreve ínibidores de caspases dipeptídicos de fórmula geral:
em que o símbolo Ri representa um grupo de protècção do terminal N; o símbolo AA representa um resíduo de um a-aminoácido ou um β-aminoácido naturais; e o símbolo R2 representa alquilo, eventualmente, substituído ou hidrogénio. A patente de invenção WO 00/023421 descreve inibidores dipeptídicos de apóptose de acilo (substituído) de fórmula geral: R2 /CH^n
rCOaR3 em que o símbolo n representa 0, 1 ou 2; o símbolo, q representa 1 ou 2,- o símbolo A representa um resíduo de um certo aminoácido natural ou não natural; o símbolo b representa um átomo de hidrogénio, um átomo de deutério, um alquilo Ci_i0 de cadeia linear ou ramificada, cicloalquilo, fenilo, fenilo substituído, naftilo, naftilo substituído, 2-benzoxazolilo, 2-oxazolilo substituído, (CH2) mcicloalquilo, (0¾) mfenilo, (0¾) m (fenilo substituído), (CH2)m(l- ou 2-naftilo), (0¾)^ heteroarilo, halogeno-metilo, CO2R13, CONR14R15, CH2ZR16, CH2OCO-arilo, CH20C0(arilo substituído), CH2OCO(heteroarilo), CH2OCO (heteroarilo substituído) ou CH20P0 (R17) R18, em que os símbolos R13, R14, R15, R16, R17 e R18 estão definidos no presente pedido de patente de invenção; o símbolo R2 selecciona-se 6
no grupo que contém hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, fenilo, fenilo substituído, (CH2)mNH2; o símbolo R3 representa hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, cicloalquil-alquilo, fe-nilalquilo ou fenilalquilo substituído; o símbolo X representa CH2, C=0, 0, S, NH, C=0NH ou CH2OCO e o símbolo Z representa um átomo de oxigénio ou de enxofre. A patente de invenção WO 97/24339 descreve inibidores da enzima que converte a interleucina-ΐβ de fórmula geral:
O
R,'^nM1-AAz-N-Y
H em que o símbolo R1 representa H, alquilo, alcoxi, um carbociclo, um heterociclo e vários outros grupos; os símbolos AAi e AA2 representam ligações simples e aminoácidos; e o símbolo Y representa um grupo de fórmula geral:
o em que o anel Tet representa um anel de tetrazólio; e o símbolo Z representa, inter aliar alquileno, alcenileno, 0, S, SO e S02. A patente de invenção europeia EP 618223 descreve inibidores de ECI de fórmula geral: R-Αχ -A2 ~X-A3 em que o símbolo R representa H, um grupo de protecção ou um anel, eventualmente, substituído PhCH20; o símbolo Ai representa um resíduo do ácido α-hidroxi ou α-aminoácido; o símbolo A2 representa um resíduo de ácido ct-hidroxi ou ot- 7 aminoácido ou os símbolos Ai e A2 formam, em conjunto, um pseudo-dipéptido ou um resíduo mimético de dipéptido; o símbolo X representa um resíduo derivado de Asp, em que o símbolo A3 representa CH2XiCOYi, CH2OY2, CH2SY3 ou CH2(CO)mY6, em que o símbolo X1 representa 0 ou S, o símbolo m representa 0 ou 1 e os símbolos Yi, Y2, Y3 e. Y6 representam, grupos alifáticos, cíclicos, eventualmente substituídos ou grupos arilo. A patente de invenção WO 98/16502 descreve, ínter alia, inibidores de EC-I de fórmula geral:
èm que os símbolos R1 e R2 têm os significados descritos no pedido de patente de invenção e o anel de pirrolidina está substituído por vários grupos.
Embora já tenham sido referenciados vários inibidores de caspase, não é claro que eles possuam as propriedades farmacológicas apropriadas, para serem úteis sob o ponto de vista terapêutico. Por 'isso, há uma necessidade contínua de· inibidores de moléculas pequenas de caspases, que sejam potentes, estáveis e penetrem nas, membranas de modo a providenciarem uma inibição efectiva da apóptose in vivo. Esses compostos seriam extremamente úteis para o tratamento das. doenças mencionadas antes, em que as enzimas de caspase desempenham um papel.
Sumário da Invenção
Verificou-se agora que os compostos da presente invenção e as suas composições farmacêuticas são eficazes como 8 inibidores de caspases e apóptose celular. Estes compostos têm a fórmula geral I:
em que o símbolo Z representa oxigénio ou enxofre; o símbolo R1 representa hidrogénio, -CHN2, -R, -CH2OR, -CH2SR ou -CH2Y; o símbolo R representa um grupo arilo, aralquilo, hetero-ciclilo ou heterociclilalquilo C1-12 alifático; o símbolo Y representa um grupo eliminável electronegativo; o símbolo R2 representa CO2H, CH2CO2H ou ésteres, amidas ou CONHSO2(alquilo}; o símbolo R3 representa um grupo capaz de se alojar no sub-sítio S2 de uma caspase; os símbolos considerados em conjunto com os átomos de azoto R4 e R5 interveniente, formam um sistema de anel hetero-, mono-, bi- ou tricíclico com 1-6 heteroátomos seleccionados entre azoto, oxigénio ou enxofre.
Os compostos da presente invenção têm propriedades de' inibição num a vasta gama de caspases alvo com uma boa eficácia em modelos celulares de apóptose. Além disso, estes compostos terão uma boa penetração nas células e propriedades farmacocinéticas e, em consequência da sua potência, têm uma 9 boa eficácia contra doenças em que 'as caspases estão implicadas.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção tem por objecto novos compostos e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, que são úteis como inibldores de caspase. A presente invenção também tem por objecto processos para a utilização destes compostos, para inibir a act.ividade da caspase e para tratar estados de doença mediados pela caspase. Estes compostos têm a fórmula geral I:
I em que o simbolo Z representa oxigénio ou enxofre; o símbolo R1 representa hidrogénio, -CHN2, -R, -CH2OR, -CH2SR ou -CH2Y; o simbolo R Representa um grupo arilo, aralquilo, heterociclilo ou heterociclilalquilo C1-12 alifático; o símbolo Y representa um grupo eliminável electronegativo; o simbolo R2 representa C02H, CH2C02H ou ésteres, amidas ou CONHSO2(alquilo); o símbolo R3 Representa um grupo capaz de se alojar no sub-sítio S2 de uma caspase; 10 o símbolo R4 considerados em conjunto com os átomos de azoto e. R5 interviniente, formam um sistema de anel hetero-, mono-, bi- ou tricíclico com 1-6 heteroátomos seleccionados entre azoto, oxigénio ou enxofre.
Talcomo se utiliza aqui, as definições que se seguem devem ser aplicadas a menos que seja indicado de outra forma. 0 termo "alifático", tal como se utiliza aqui, significa hidrocarbonetos C1-Ç12 de cadeia linear ou ramificada, que estão completamente saturados ou que contêm uma ou mais unidades de insaturação. Por exemplo, os grupos alifáticos apropriados incluem grupos alquilo, alcenilo ou alcinilo, lineares, ramificados ou cíclicos, substituídos ou insubstituídos e ós seus híbridos, tais como, cicloalquil-alquilo, cicloalcenil-alquilo ou cicloalquil-alcenilo. 0 termo "alquilo", utilizado isoladamente ou como parte de outra parte maior, refere-se a tanto a cadeias lineares como ramificadas contendo um a doze átomos de carbono. Quando se utiliza o termo alquilo como parte de uma partè maior, tal como, aralquilo ou heteroaralquilo, a porção alquilo.conterá, preferencialmente, um a seis carbonos. O termo "halogéneo" significa F, Cl, Br ou I. 0 termo "arilo" refere-se a grupos de anéis aromáticos, monocíclicos ou policíclicos comportando cinco a catorze átomos, tais como, fenilo, naftilo e antrilo. Ά expressão "grupo heterocíclico" refere-se a sistemas de anéis monocíclicos ou policíclicos, saturados e insaturados, contendo um ou mais heteroátomos e uma dimensão do anel de três a nove, tais como, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, dioxolanilo, oxazolilo, tiazo-lilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, pirazo-lilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, isoxazolilo, isotia-zolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piranilo. 11 piridinilo, piperidinilo, dioxanilo, morfolinilo, ditianilo, tiomorfolinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piperazinilo, triazinilo, tritianilo, indolizinilo, indolilo, isoindolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, inda-zolilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, purinilo, quinolí-zinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, 1,8-naftiridinilo, pteridinilo, quinuclidinilo, carbazolilo, acridinilo, fenazinilo, fenotia-zinilo ou fenoxazinilo. 0 termo "heteroarilo" refere-se a um anel heterocíclico que é aromático. Entende-se que os compostos da presente invenção estão limitados àqueles que existem na natureza como compostos quimicos estáveis. A expressão "grupo carbocíclico" refere-se a sistemas de anéis de carbono, monociclicos ou policiclicos, de três a catorze carbonos, que podem estar fundidos com grupos arilo ou heterociclicos. Os exemplos incluem ciclo-hexilo, ciclopentilo, ciclobutilo, ciclopropilo, indanilo, tetra-hidronaftilo e similares.
Um grupo alifático, alquilo, arilo, heteroarilo, hetero-ciclilo ou· carbociclilo, utilizado isoladamente ou como parte de uma parte maior, refere-se a grupos substituídos ou insubstituidos. Quando substituídos, estes grupos podem conter um ou mais substituintes. Exemplos de substituíntes apropriados incluem halogéneo, -R, -0R, -OH, -SH, -SR, OH protegido (tal como, aciloxi), fenilo (Ph), Ph substituído, -OPh, -OPh substituído, -N02, -CN, -NH2, -NHR, -N(R)2, -NHCOR, -NHCONHR, -NHCON(R)2, -NRCOR, -NHC02R, ~C02R, -C02H, -COR, -CONHR, -CON(R)2, -S(0)2R, -SONH2, -S(0)R, -S02NHR., -NHS(0)2R, =0, =S, =NNHR, =NNR2, =N-0R, =NWHC0R, =NNHC02R, =NNHS02R ou =NR, em que o símbolo R representa um grupo alifático ou um grupo alifático substituído. 12
Um azoto substituível num anel heterocíclico pode ser, eventualmente, substituído. Os substituintes apropriados para o azoto incluem R, COR, S(0)2R e C02R, em que o símbolo R representa um grupo alifático ou um grupo alifático substituído.
Os átomos de azoto e de enxofre podem estar na sua forma oxidada e o azoto pode estar numa forma quaternizada. A expressão "grupo eliminável, electronegativo", tem a definição conhecida pelos especialistas na matéria (ver, March, Advanced Organic Chemistry, 4th Edition, John Wiley & Sons, 1992). Exemplos de grupos elimináveis, electronega-tivos, incluem halogéneos, tais como, F, Cl, Br, I, grupos arilo e alquílsulfoniloxi, trifluorometano-sulfoniloxi, OR, SR, -0C=0(R), -OPO(R6) (R7) , em que o símbolo R representa um grupo alifático, um grupo arilo, um grupo aralquilo, um grupo carbocíclico, um grupo alquil-carbocíclico, um grupo heterocíclico ou um grupo alquil-heterocíclico; e os símbolos R6 e R7 seleccionam-se, independentemente, entre R ou OR.
Quando o grupo R2 está sob a forma de um éster ou de uma amída, os compostos presentes sofrem clivagem metabólica, originando os ácidos carbocíclicos correspondentes, que são inibidores activos de caspase. Dado que eles sofrem de clivagem metabólica, a natureza precisa do éster ou do grupo amida, não é crítica para o trabalho da presente invenção. A estrutura do grupo R2 desde uma estrutura relativamente simples de dietil-amida até um éster esteroidal. Exemplos de ésteres de ácidos R2-carboxílicos incluem, mas não se limitam, a alifáticos C1-12, tal como, alquilo Ci-6 ou cicloalquilo C3-10, arilo, tal como, fenilo, aralquilo, tal como, benzilo ou fenetilo, heterociclilo ou heterociclil-alquilo. Exemplos de anéis heterocíclicos de R2 apropriados 13 incluem, mas não se limitam, a anéis heterociclicos com 5-6 átomos no núcleo, comportando um a dois heteroátomos, tais como, piperidinilo, piperazinilo ou morfolinilo.
As amidas de ácidos R2-carboxilicos podem ser primárias, secundárias ou terciárias. Os substituintes apropriados no azoto da amida incluem, mas não se limitam, a um ou mais grupos, seleccionados, independentemente entre os grupos alifáticos, de arilo, de aralquilo, de heterociclilo ou heterociclilalquilo descritos antes, para o álcool de éster de R2. do mesmo modo, incluem-se outros pró-fármacos, dentro do âmbito da presente invenção. Ver, Bradley D. Anderson, "Prodrugs for Improved CNS Delivery" in Advanced Drug Delivery Reviews (1996), 19, 171-202.
Os isoésteres ou bioisoésteres dos ácidos R2-carboxili-cos são ésteres e amidas que resultam da permuta de um átomo ou de um grupo de átomos para criar um novo composto com propriedades biológicas semelhantes ao ácido ou éster carboxilico pai. A substituição bioisoestérica pode ter uma base fisico-quimica ou topológica. Um exemplo de uma substituição isoésterica para um ácido carboxilico é C0NHS02(alquilo), tal como, C0NHS02Me. R3 pode representar qualquer grupo capaz de sê ajustar ao sub-sítio S2 de uma caspase. Esses grupos são conhecidos dos muitos inibidores de'caspases que já foram referenciados (ver, patentes de invenção W091/15577, W093/05071, W099/18781, W099/47154, WO00/023421, W09724339, patente de invenção europeia EP618223, patente de invenção WO9816502, todas elas descritas antes). Além disso, as estruturas das várias enzimas de caspase, incluindo os sub-sitios S-2 são também conhecidas. As referências à estrutura de caspase incluem as seguintes: Blanchard H, et al., J. Mol. Biol. 14 302(1), 9-16 (2000); Wei Y, et al-, Cheia. Biol. 7(6):423-32 (2000); Lee D, et al., J Biol. Chem. 275(21):16007-14 (2000); Blanchard H, et al., Structure Fold Des. 7(9):1125-33 (1999); Okamoto Y, et al, Chem. Pharm. Buli. (Tokyo) 47(1):11-21 (1999); Margolin N, et al, J. Biol. Chem. 272(11):7223-8 (1997); Walker NP, et al., Cell 78(2):343-52 (1994); e Wilson RP, et al., Nature 370(6487):270-5 (1994).
Um grupo adapta-se ou não a um sub-sitio S-2 consoante a caspase particular que está a ser considerada. A dimensão do sub-sitio varia desde um sub-sítio S-2 pequeno de caspase-3 que' permite um grupo com uma dimensão até a um grupo alifático em C4 até a um sub-sitio relativamente grande que permite um grupo que tenha um peso molecular até cerca de 140 Daltons, tal como, um grupo naftilo.· A dimensão, em conjunto com a natureza electrónica do grupo R3 irá influenciar a selectividade do inibidor de caspase. A . partir das referências dadas antes, um especialista na técnica pode facilmente compreender se um grupo é capaz de se adaptar favoravelmente num sub-sitio S-2 de uma caspase, utilizando por exemplo, programas padronizados de modulação molecular, tais como Quanta ou Macromodel.
Os grupos R3 incluem os que se seleccionam entre hidrogénio, uma cadeia lateral de um α-aminoácido natural ou um grupo substituído ou insubstituído, com um peso molecular até cerca de 140 Daltons, seleccionado entre grupos alifáticos, arilo, aralquilo, heterociclilo e hetero-ciclilalquilo. Exemplos de grupos R3 alifáticos incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, ciclopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, ciclobutilo, pentilo, ciclopentilo, hexilo e ciclo-hexilo. Exemplos de grupos R3 de arilo incluem fenilo, indenilo e naftilo. Exemplos de grupos R3 heterociclicos incluem pirrolidinilo, pirrolinilo, imida- 15 zolidinilo, imidazolinilo, pirazolinilo, pirazolidi-nilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, o homopiperidinilo e quinuclidinilo. Exemplos de grupos de R de heteroarilo incluem furanilo, tienilo, pirrolilo, oxazole, tiazolilo, ímidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazoli-lo, oxadiazoliló, furazanilo, triazolilo, tíadiazolilo, pi-ridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, indolilo, isoindolilo, indolinilo, benzofuranilo, benzo-tiofeno, indazolilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, purini-lo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinolizinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, pteridinilo, cromanilo e isocromanilo. Cada grupo pode conter um ou mais substituintes, conforme descrito antes. R4 e R5 considerados em conjunto com o azoto interveniente formam um sistema de anel mono-, bi- ou1 hetero-tricíclico com 1-6 heteroátomos, preferencialmente, 1-4 hete-roátomos. Esses anéis incluem indole, isoindole, indolina, indazole, purina, di-hidropiridina, benzimidazole, imidazole, imidazolina, pirrole, pirrolidina, pirrolina, pirazole, pira-zolina, pirazolidina, triazole, piperidina, morfolina, tiomo-rfolina, piperazina, carbazole, fenotiazina, fenoxazina, di-hidrofenazina, di-hidrocinolina, di-hidroquinoxalina, tetra-hidroquinolina, tetra-hidroisoquinolina, di-hidronaftiridina, tetra-hidronaftiridina, di-hidroacridina, 5H-dibenzo[b,f]-azepina, 10,ll-di-hidro-5H-dibenzo[b,f]azepina, β-carbolina, pirido[4,3-b]indole, 2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diaza-antraceno, 3,6,9-triazafluoreno, tieno[3,2-bJpirrole ou di-hidrofenantridina substituídos ou insubstituidos. Os substituintes para R4 ou R5 incluem um ou mais grupos se-leccionados, independentemente, entre halogéneo, -R, -0R, -OH, -SH, -SR, OH protegido (tal como, aciloxi), fenilo (Ph), Ph substituído, -OPh, -OPh substituído, -NO2, -CN, -NH2, -NHR, -N(R)2 , -NHCOR, -NHCONHR, -NHC0N(R)2, -NRCOR, -NHC02R, 16 -C02R, -C02H, -COR, -CONHR, -C0N(R)2, -S(0)2R, -SONH2, -S(0)R, -S02NHR, ou -NHS(0)2R, em que cada símbolo R se selecciona, independentemente, entre um grupo alifático ou um grupo alifático substituído.
Os compostos da presente invenção em que o símbolo R2 representa COOH são gama-cetoácidos, que podem existir em solução como uma forma aberta 1 ou sob a forma de hemicetal ciclízado 2. A representação aqui feita de qualquer uma das formas isoméricas significa que inclui a outra. Do mesmo modo, . a ciclização pode ocorrer quando o símbolo R2 representa CH2COOH e esses isómeros ciclizados são entendidos como incluídos quando a forma de anel aberto está aqui representada.
Do mesmo modo, será evidente para um especialista na técnica, que certos compostos da presente invenção podem existir nas formas tautoméricas ou nas formas hidratadas, estando todas essas formas dos compostos dentro do âmbito da presente invenção. A menos que seja estabelecido de outra forma, as estruturas aqui descritas, são entendidas também como incluindo todas as formas estereoquímicas da estrutura; isto é, as configurações R e S para cada centro assimétrico. Por isso, os isómeros estereoquímicos simples, assim como, as misturas enantioméricas e diastereoméricas dos compostos da presente invenção estão dentro do âmbito da presente invenção. A menos que seja estabelecido de outra forma, as estruturas aqui descritas também incluem compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos enriquecidos sob o ponto de vista isotópico. Por. exemplo, os compostos que 17 têm as presentes estruturas excepto no que respeita à substituição de um hidrogénio por um deutério ou tritio ou a substituição de um carbono por carbono 13C- ou 14C-enriquecido, estão dentro do âmbito da presente invenção*
Um outro enquadramento.da presente invenção diz respeito a compostos que têm umã ou mais e,. preferencialmente, todas as características seguintes: (i) o símbolo Z representa oxigénio. (ii) o símbolo R1 representa hidrogénio, -R, -CH2OR, -CH2SR ou -CH2Y. Mais preferencialmente, o símbolo R1 representa -CH2OR,. -CH2SR ou -CH2Y. Ainda num enquadramento mais preferido, o símbolo R1 representa -CH2Y. Mas o mais preferido, é aquele em que o símbolo R1 representa -CH2F. (iií) o símbolo R2 representa CO2H ou um seu éster, amida ou ísoéster. (iv) o símbolo R3 representa um grupo com um peso molecular até cerca de 140 Daltons, tal como, .um grupo alifático ou aralquilo. Mais preferencialmente, o símbolo. R3 representa um alquilo C1-C4, que é um grupo que se adapta ao sub-sítío S2 de uma gama de caspases. (v) os símbolos R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente formam um sistema de anel heterocíclico, monocíclico, bicíclico ou tricíclíco ou um sistema de anel de heteroarilo, em que cada anel do sistema tem 5-7 átomos. 18
Uma característica chave dos compostos da presente invenção é o seu sistema de hetero-anel formado pondo em conjunto os símbolos R4 e R5 com o azoto interveniente. Os anéis heterocíclicos, bicíclicos ou tricíclicos ou de heteroarilo são preferíveis em relação aos anéis monocíclicos. De acordo com isto, um enquadramento preferido, diz respeito a compostos que têm uma ou mais e, preferencialmente, todas as seguintes caracteristicas: (i) o símbolo Z representa oxigénio; (ii) o símbolo R1 representa hidrogénio, -R, -CH2OR, -CH2SR ou -CH2Y, mais preferencialmente, o símbolo R1 representa -CH2OR, -CH2SR ou -CH2Y, 1 ainda num enquadramento mais preferido, o símbolo R representa -CH2Y mas, o mais preferido, é aquele em que o símbolo R1 representa -CH2F; (i.ii) o símbolo R2 representa C02H ou um seu éster, amida ou isoéster; (iv) o símbolo R3 representa um grupo com um peso molecular até cerca de 140 Daltons, tal como, um grupo alifático ou aralquilo, mais preferencialmente, o símbolo R3 representa um alquilo C1-C4 e/ou (v) os símbolos R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente formam um sistema de anel heterocíclico, monocíclico, bicíclico ou tricíclico ou um sistema de anel de heteroarilo, em que cada anel do sistema tem 5-7 átomos.
Exemplos de anéis monocíclicos preferidos incluem tria-zole, piperidina, morfolina, tiomorfolina, imidazole, pirro-lidina, pirazole e piperazina. Exemplos de anéis bicíclicos preferidos incluem indole, isoindole, indolina, indazole, benzimidazole, tieno[3,2-b]pirrole, di-hidroquinoxalina, di-hidrocinolina, di-hidronaftiridina, tetra-hidronaftiridina, tetra-hidroquinolina e tetra-hidroisoquinolina, mais preferencialmente, indole ou indolina. Exemplos de anéis tricíclicos preferidos incluem carbazole, fenotiazina, β-carbolina, pirido[4,3-b]indole, 2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diaza-antraceno, 3,6,9-triazafluoreno, fenoxazina, dibenzoazepina, 19 di-hidro-dibenzoazepina, di-hidrofenazina, di-hidroacridina ou di-hidrofenantridina, mais preferencialmente, carbazole, fenotiazina ou di-hidrofenantridina.
Exemplos específicos dos compostos de fórmula geral X, estão ilustrados no quadro 1.
Quadro 1. Exemplos de compostos de fórmula geral I (Z representa oxigénio) IJ‘ 0 f* ΛτβΤ· Z R5 M 0 N°. Estrutura 1 JLJ ^.cqH 0 /\ 0 2 /t ff CXTa 1 ° 3 0 V-CQ.H cr^ ® A ° 4 rra (jY^Vr· 20 5 Cl ^ ° y\ 6 ^yCF, ytyj jCC^H W “Λ H ° 7 Li ίΥτΥϊΤ- 0vN ° 8 j*yj ^C04H íYyWyV Kj? o o 9 ο ,Χ λ, fY Y μ 0 4\ 0 10 j^yc' 11 d^Mr 12 η ?*^Τ 0 γ'00^ 05 α" ο 21
13 rrC! 14 Λ ç-^r ο ^οαΒΗ ίΐϊ ιϊΤρ 15 β'Χ^ Λ s-OQfl V ® Λ1 ° 01 16 . “xV a-^N^ ο /CC^H U ϊχ ο 17 U* » Λ ” 0 18 19 ^-caH
20 21 f? Ao íVyyVV'> 5^ ° A. ° 22 23 (jí 24 (ÃA^> ^ ° /V ° 25 26 é A H ** 27 28 n ix ΛΑ ly X^ H X 29 ÍTT -: H jf ^ b /\ ° 30 ’ΐ ° /Ν ο 31 jO 0 Λ50£Η /yyvVy^ 32 Af 0 Α^Η V °ΛΗ 0 33 ÃfJ 0 ^co2H fy Y^-V^ ° A H ° 34 V.N ÃJ 0 ^C0SH rytVrY^ N^I 0 A H 0 35 N JU 0 .COaH ryNr°v^ ;V O A H 0 36 JO 0 XOgH ίΥγΥΐ^ Y ° H o 37 A, 0 A°2H OA^sVf 24
39
40 /? ο Xh jVVv^nVf ^ °H8C^CHaH ° 41 η o ΙΗΝ'Τ 0 r^-OH íVv^-Vf ^ °hAhH ° 42 ""vÇ ο Ah íV^^rV'' ^ 0hsc^CH3h ° 43 ^N-Ç O Ah 0 h3cÃch3h 0 44 °<j0 X (fYNT'°'X'l<Xr^r: 45 fS o HC.JU Λ jí , YY 0 I^OH IíXnT^>'vXn'Xvf ^ °hsoach3h ° 46 XÇ o Ah íVv°v^Vf
Depois da avaliação de muitos anéis heterociclicos R4-N-R5, verificou-se que os compostos triciclicos em que os anéis terminais estão praticamente no mesmo plano, mostram uma actividade de caspase surpreendentemente superior quando comparados com análogos acíclicos ou outros sistemas de anéis triciclicos que não são, de modo nenhum, co-planares. Esta. caracteristica de existirem praticamente no mesmo plano, pode ser conseguida quando o anel médio do sistema de anéis triciclicos é um anel com 5 ou 6 átomos no núcleo, tal como, um anel de carbazole ou de fenotiazina.
Além disso, estes . sistemas de anéis triciclicos praticamente no mesmo plano, assim como, os sistemas de anéis biciclicos, tais como, indole e indolina, conferem uma melhor actividade para um vasto número de caspases do que os compostos correspondentes, em que o anel heterociclico R4-N-R5 é monocíclico, tal como, piperidina, piperazina ou morfo-lina.
De acordo com isto, um enquadramento preferido da pré-sente invenção tem por objecto compostos de fórmula geral I, em que R4-N-R5 representa um sistema de anel triciclico, com 1-6 heteroátomos, preferencialmente, 1-4 heteroátomos, se-leccionados entre azoto, oxigénio ou enxofre, em que os anéis das extremidades do sistema de anel têm 5-7 átomos no anel e o anel do meio tem 5 ou 6 átomos no anel. 26
Um aspecto deste enquadramento diz respeito aos compostos de fórmula geral II:
em que o símbolo X representa uma ligação, -S-, —0-, -CH2- ou -NH- e ós símbolos Z, R1, R2 e R3 têm õs significados definidos antes. Quando X representa -CH2-, cada um dos hidrogénios do metileno pode estar,· eventualmente e independentemente, substituído por -0R, -OH, -SR, OH protegido (tal como, aciloxi), -CN, -NH2, -NHR, -N(R)2, -NHCOR, -NHCONHR, -NHC0N(R)2, -NRCOR, -NHC02R-C02R-C02H, -COR, -CONHR, -C0N(R)2,. -S(0)2R, -SONHs, -S(0)R, -S02NHR, -NHS(0)2R, =0, =S, =NNHR, =NNR2, =N-0R, =NNHC0R, =NNHC02R, =NNHS02R ou =NR, em que o símbolo R representa um grupo alifátíco C1-4. Quando o símbolo X representa -NH-, o hidrogénio de NH pode estar substituído por alquilo, CO (alquilo) , C02 (alquilo) ou S02 (alquilo) . Os grupos preferidos para R1, R2 e R3 são os descritos antes.
Os compostos da presente invenção podem ser preparados, em geral, por processos conhecidos pelos especialistas na matéria para compostos análogos, conforme ilustrado pelos esquemas gerais que seguem e pelos exemplos de preparação que se seguem. 27
Esquema I hov,co£r R5
R 2 R3 p^s^w^Os^oOaH Z R3
c | H2N^Yr1 B OH R3 (J4 o ^^WbV 2 R3 n n Ç* O f” I í3 H Óh 6
Reagentes: (a) R5-N=C=Z (2); (b) NaOH/THF/H20; (c) EDC/DMAP/HOBt; (d) i. periodinano de Dess-Martin, (ii)
TFA/DCM 0 esquema I anterior mostra uma via de síntese para a obtenção de· compostos em que o símbolo R4 representa um hidrogénio. A reacção de um isocianato ou de um tioisocianato 2 com um derivado de ácido láctico 1, produz o carbamato 3. 0 grupo éster de 3 é hidrolisado utilizando uma base ou quando o éster é um grupo t-butilo,. utilizando ácido trifluoro-acétíco, para se obter o ácido 4, que é então acoplado com o amino-álcool de 5. Consoante a natureza de R1 e R2, pode-se utilizar uma amino-cetona,· em lugar do amino-álcool, o que evita a subsequente etapa de oxidação. No caso de cetonas de fluorometilOf quando o símbolo R1 representa CH2F, o amino-álcool 5 pode obter-se de acordo com o processo de Revesz et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35, 9693. Finalmente, o grupo hidroxilo no composto 6 é oxidado e o composto resultante é tratado de forma apropriada de acordo com a natureza de R2. Por exemplo, se o produto I requer que o símbolo R2 seja um ácido carboxílico, então o símbolo R2 em 6 representa, 28 preferencialmente, um éster e a etapa final do esquema é uma hidrólise.
Os isocoanatos ou tioisocianatos 1 iniciais estão disponíveis comercialmente ou podem ser preparados por reacção de uma amina com fosgénio ou um equivalente de fosgénio (ou tiofosgénio para a preparação de tioisocianatos) na presença de uma base, tal como, trietilamina. Os derivados de lactato estão disponíveis comercialmente ou podem ser preparados por reacção de um aminoácidõ com um reagente de diazotização, tal como, com NaN02.
Esquema II HO^COaR R3 a
F*4 b,c ^ ^N^OyCQaH ΊΓΧ O Ra Z R3 3 1 7 Reagentes: (a) CDI/THF; (b) MeOTf/CH2C12; (c) R4R5NH (8)/THF. 0 esquema II' anterior mostra uma via sintética para a obtenção dos compostos I da presente invenção, em que o símbolo R4 representa um grupo alquilo ou quando os simbolos R4 e R5 em conjunto.formam um. anel. A reacção do derivado de lactato' 2 com 1,1'-carbonildi-imidazole (GDI) origina o imídazole 7. A metilação de 7 por meio de triflato de metilo, seguida da reacção com a amina 8 (ver, J. Med. Chem., (1996), 39, 982) , origina o produto intermédio 3. 0 esquema I anterior mostra como 3 pode ser convertido em I.
Esquema III R4R5NH 8
O R4fí5WH
Pj5 -r N sj/OsjtOgR 2 Rs 9 29
Reagentes: (a) COCI2/CH2CI2; (b) 1/THF.
Uma via de síntese alternativa para a obtenção dos compostos I da presente invenção, em que o símbolo R4 representa um grupo alquilo ou quando os símbolos R4 e R5 em conjunto formam um anel mostrado no esquema II anterior. 0 tratamento dá amina 8 com fosgénio origina um produto intermédio 9 de cloreto de carbamoílo. A reacção de 9 com um derivado de lactato 1 origina o produto intermédio 3.
Esquema IV R4
<N>^Ov^,C02R O R3
TO^COfcR ¥ 1 10
Reagentes: (a) CI3 COC (0) Cl/THF; (b) R4R5NH (8), NaOH, BU4NBr. 0 esquema IV anterior mostra uma via de sintase para a obtenção dos compostos da presente invenção, em que 0 símbolo R4 representa um hidrogénio ou um grupo alquilo ou quando os símbolos R4 e R5 em conjunto formam um anel. A reacção do éster de hidroxi 1 com fosgénio ou um equivalente de fosgénio, tal como, difosgénio ou trifosgénio, origina o produto intermédio 10 de cloroformato. A reacção de 10 com a amina 8 origina o produto intermédio 3.
Os compostos da presente invenção são produzidos para inibirem caspases. Por isso, os compostos da presente invenção podem ser analisados quanto à sua capacidade para inibir a apóptose, a libertação de IL-Ιβ ou directamente a activídade de' caspase. Os ensaios para cada uma das activi-dades estão descritos a seguir na secção de ensaios e são conhecidos na técnica. 30
Um enquadramento da presente invenção diz respeito a uma composição que compreende um composto de fórmula geral I ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Se se utilizam nestas composições sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico dos compostos da presente invenção, esses sais derivam, preferencialmente, de ácidos e de base inorgânicos ou orgânicos. Entre esses sais inclui-se o seguinte: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, sulfonato de benzeno, bi-sulfato, butirato, citrato, canfo-rato, sulfonato de canfor, ciclopentanopropionato, digli-conato, dodecil-sulfato, etano-sulfonato, fumarato, glico-heptanoato, glicerofosfato, hemi-sulfato, heptanoato, hexano-ato, cloridrato, bromidrato, iodeto, 2-hidroxi-etano-sulfo-nato, lactato, maleato, metano-sulfonato, 2-naftaleno-sulfo-nato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persul-fato, 3-fenil-propionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartracto, tiocianato, tosilato e undecanoato. Os sais de bases incluem sais de amónio, sais de metais alcalinos, tais como, sais de sódio e de potássio, sais de metais alcalino-terrosos, tais como, sais de cálcio e de magnésio, sais com bases orgânicas, tais como, sais de diciclo-hexilamina, N-metil-D-glucamina e sais com aminoácidos, tais como, argi-.nina, lisina, etc..
Os grupos que contêm azoto básico podem também ser quaternizados com agentes, tais como, halògenetos de alquilo inferior, tais como, cloretos, brometos e iodetos de metilo, etilo, propilo e butilo; sulfatos de dialquilo, tais como,. sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo e diamilo, haloge-netos de cadeia longa, tais como, cloretos, brometos e iodetos de decilo, laurilo, miristilo e estearilo, haloge-netos de aralquilo,tais como, brometos de benzilo e fenetilo 31 e outros. Obtêm-se assim produtos solúveis ou dispersiveis em água ou óleo. ·
Os compostos utilizados nas composições e nos processos da presente invenção podem, ser modificados, adicionando funcionalidades apropriadas para melhorar . as propriedades biológicas selectivas. Essas modificações são conhecidas na técnica e influem aquelas que aumentam a penetração biológica num dado sistema biológico (por exemplo, sangue, sistema linfático, sistema nervoso central), aumentam a disponibilidade oral, aumentam a solubilidade para permitir a administração por injecção após metabolismo e aumentam a taxa de excreção.
Os veículos aceitáveis sob o ponto de vista farma-. cêutico, qué podem ser utilizados nas presentes composições incluem, mas não se limitam, a permutadores de iões, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas do soro, tal como, albumina do soro humano, substâncias tampão, tais como, fosfates, glicina, . ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicéridos de ácidos gordos vegetais, saturados, água, sais ou electrólitos, tais como, sulfato de protamina, fosfato dissódico de hidrogénio, fosfato potássico de hidrogénio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trisilicato de magnésio, polivinil-pirrolidona, substâncias à base de celulose, polietileno-glicol, car-boximetil-celulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de blocos de polietileno-polioxipropileno, polietileno-glicol e gordura da lã.
De acordo com um enquadramento preferido, as composições da presente invenção são formuladas para uma administração farmacêutica a um mamífero, preferencialmente, a um ser humano. 32
Essas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas oralmente, parentericamente, por inalação, topicamente, rectalmente, nasalmente,. bocalmente, vaginalmente ou por via de um reservatório implantado. 0 termo "parentérico", tal como se utiliza aqui, inclui técnicas de ínjecção ou infusão subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intra-articulares, intrasinoviais, intra-externais, intratecais, intra-hepátiças, intralesionais e intracranianas. Preferencialmente, administram-se as composições oralmente ou intravenosamente.
As formas esterilizadas, injectáveis das composições da presente invenção, podem ser suspensões aquosas ou oleaginosas. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas nesta técnica, utilizando agentes de dispersão ou de molhagem apropriados e agentes de suspensão. A preparação injectável, esterilizada, pode também ser uma solução ou uma suspensão injectável, esterilizada, no seio de um diluente ou um dissolvente não tóxico, aceitável sob o ponto de vista parentérico, por, exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e dissolventes aceitáveis, que podem ser utilizados encontram-se a água, a solução de Ringer e a solução isotónica de cloreto de sódio. Além-disso, utilizam-se convencionalmente óleos de fixação esterilizados, utilizados como um dissolvente ou um meio de suspensão. Com este fim, pode-se utilizar qualquer óleo não volátil, suave, incluindo mono- ou di-glicéridos sintéticos. Utiliza-se na preparação de injectáveis ácidos, gordos, tal como, ácido oleico e os seus derivados de glicéridos, assim como, óleos naturais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, tal como, azeite ou óleo de ricino, especialmente, nas suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas podem também conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como, celulose carboximetilada ou agentes 33 de dispersão similares, que são normalmente utilizados na formulação de formas de dosagem aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluindo emulsões e suspensões. Outros normalmente utilizados são os tensioactivos, tal como, Tweens, Spans e outros agentes emulsionantes ou melhoradores da biodisponibilidade, que são normalmente utilizados no fabrico de sólidos e líquidos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ou podem ser utilizadas outras formas de dosagem para os fins da formulação.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas oralmente, em qualquer forma de dosagem oral aceitável incluindo, mas não se limitando, a cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de comprimidos para utilização oral, os veículos que se utilizam normalmente incluem a lactose e o amido de milho. Normalmente adicionam-se agentes lubrificantes, tais como, estearato de magnésio. Para a administração oral sob a forma de cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho anidro. Quando são necessárias suspensões aquosas para administração oral, combina-se o ingrediente activo com agentes emulsionantes e de suspensão. Se desejado, pode-se também adicionar alguns adoçantes, aromatizantes ou corantes.
Alternativamente, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas sob a forma de supositórios para administração rectal. Podem ser preparados misturando o agente com um excipiente não irritante apropriado, que é sólido à temperatura ambiente, mas liquido à temperatura rectal e, por isso, irá fundir no recto para libertar o fármaco. Esses materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelha e polietileno-glicois. j 34
As composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser administradas topicamente, especialmente quando o alvo do tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis para aplicação tópica incluindo doenças dos olhos, da pele e do tracto. intestinal inferior. As formulações tópicas apropriadas são facilmente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos. A aplicação tópica para o tracto - intestinal inferior pode ser. efectuada numa formulação de supositório rectal (ver antes) ou numa formulação de pomada apropriada. Os adesivos transdérmicos sob o ponto de vista tópico também podem ser utilizados.
Para as aplicações tópicas, as composições farmacêuticas podem ser formuladas numa pomada apropriada contendo o componente activo suspenso ou dissolvido em um ou mais veículos. Os veículos para a administração tópica dos compostos da presente invenção incluem, mas não se limitam, a ó-leos minerais petrolato liquido, . petrolato branco, propi-leno-glicol, polioxietileno, compostos de polioxi-propileno, cera emulsionante .e água. Alte.rnativamente, as.· composições farmacêuticas podem ser formuladas numa loção ou creme apropriados, contendo os componentes activos suspensos ou dissolvidos em um' ou mais veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Os veículos apropriados incluem, mas não se limitam, a :óleos minerais, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, ceras de ésteres de cetilo, álcool de cetearilo, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.
Para utilização oftálmica, as.composições farmacêuticas podem ser formuladas como suspensões micronizadas em soluções salinas'isotónicas, esterilizadas, de pH ajustado ou, preferencialmente, como soluções em soluções salinas isotónicas, 35 sem um esterilizadas, de pH ajustado, quer com, quer conservante, tal como, cloreto de benzilalcónio. Alternativamente, para as utilizações oftálmicas, as composições farmacêuticas podem ser formuladas sob uma forma de pomada, tal como, petrolato.
As composições farmacêuticas' da presente invenção podem também ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Essas composições preparam-se de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica das formulações farmacêuticas é podem ser preparadas como soluções em solução salina, utilizando álcool benzílico ou outros conservantes apropriados, promotores de absorção para melhorar a biodisponibilidade, flúor-carbonos e/ou outros agentes de solubilização ou dispersão convencionais.
As composições descritas antes são particularmente úteis em aplicações terapêuticas relacionadas com uma doença mediada por IL-1, uma doença mediada por apóptose, uma doença inflamatória, uma doença auto-imune, um distúrbio destrutivo dos ossos, um distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa, uma doença degenerativa, uma doença associada com a morte das células, uma doença relacionada com uma dieta com excesso de álcool, uma doença mediada por vírus, uveíte, peritonite inflamatória, osteoartrite, pancreatite, asma, síndroma da dificuldade respiratória do adulto, glomerulonefrite, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, escleroderma, tirói-dite crónica, doença de Grave, gastrite auto-imune, diabetes, anemia hemolítica auto-imune, neutropénia auto-imune, trombo-citopénia, hepatite activa crónica, miastenia gravis, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, psoríase, dermatite atópica, escaras, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição do transplante de órgãos, osteoporose, leucemia e distúrbios relacionados, síndroma de mielodisplasia, distúr- 36 bios dos ossos relacionados com mieloma múltiplo, leucemia mielogénica aguda, leucemia mielogénica crónica, melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, choque hemorrágico, sépsia·, choque séptico, queimaduras, Shigellosis, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Kennedy, doença do prião, isquémia cerebral, epilepsia, isquémia do miocárdio, insuficiência renal aguda e crónica, enfarte do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, aterosclerose, enxerto por bypass da artéria coronária, atrofia muscular espinal, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, encefalite relacionada com o VIH, envelhecimento, alopécia, danos neurológicos causados por enfarte, colite ulcerosa, traumatismo traumático do cérebro, traumatismo da espinal-medula, hepatite B, hepatite C, hepatite G, febre-amarela, febre do dengue ou encefalite japonesa,, várias formas de doenças do fígado, doenças renais, doenças do rim poliáptico, doenças gástricas e ulcera duodenal associadas ao H. pylori, infecção por VIH, tuberculose e meningite. Os compostos e composições são também úteis no. tratamento de complicações associadas com enxertos da cirurgia da ponte de safena da artéria coronária e como um componente de imunoterapia para o tratamento de várias formas de cancro. A quantidade de composto presente nas composições descritas antes deve ser suficiente para causar uma diminuição detectável na severidade da doença ou na actividade da caspase e/ou na apóptose das células, conforme se pode medir por qualquer um dos ensaios descritos nos exemplos.
Os compostos da presente invenção são também úteis em processos para a preservação das células, tal como pode ser necessário para um transplante de um órgão ou para preservar produtos sanguíneos. Já foram relatadas utilizações semelhan- 37
Nature tes para os inibidores de caspase (Schierle et al., Medicine, 1999, 5, 97). O processo envolve o tratamento das células ou dos tecidos a serem preservados com uma solução que compreenda o inibidor de caspase. A quantidade de inibi-dor de caspase necessária dependerá da eficácia do inibidor para um determinado tipo- de célula e a duração necessária para preservar as células da morte apoptótica das células.
De acordo com outro enquadramento, as composições da presente invenção podem ainda compreender outro agente terapêutico.. Esses agentes incluem, mas não se limitam, a agentes tromboliticos,' tais como, activadores plasminogénicos de tecido e estreptocinase. Quando se utiliza um segundo agente, o segundo agente pode ser administrado quer como uma segunda forma de dosagem separada ou como parte de uma forma de dosagem única com os compostos ou composições da presente invenção.
Também se deve entender que uma dose especifica e um regime de. tratamento para qualquer paciente em .particular dependerá de uma variedade de factores.incluindo, a actividade do composto especifico utilizado, da idade, do peso do corpo, do estado geral de saúde, do sexo, ' da dieta,· do tempo de administração, da taxa de excreção, da combinação defármacos e da decisão do médico que faz o tratamento e da severidade da doença em particular a ser tratada. A quantidade de ingredientes activos dependerá também do composto em particular e do agente terapêutico se estiver presente na composição.
Num enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto um processo de tratamento de um mamífero, com uma das doenças mencionadas antes e que inclui a etapa de administração ao referido mamífero de uma composição aceitável sob o 38 ponto de vista farmacêutico descrita antes. Neste enquadramento, se se administra ao paciente também um outro agente terapêutico ou inibidor de caspase, ele pode ser administrado em conjunto com o composto da presente invenção numa forma de dosagem única ou como uma forma de dosagem separada. Quando administrado como uma forma de dosagem separada,.. . o outro inibidor ou agente de caspase pode ser administrado antes, ao mesmo tempo ou a seguir da administração de uma composição aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, que compreende um composto da presente invenção.
Para que esta invenção possa ser completamente compreendida, dão-se á seguir exemplos preparativos e de análise. . .
Exemplos de Sintese
Os exemplos que se .seguem indicam processos de sintese para os compostos seleccionados da presente invenção.
Exemplo 1 ... Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazole-car-bamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
F
Processo A: Éster fcerc-butilico do ácido (S)-2-(clorocarbamoiloxi)-3-me-tilbutirico
39 A uma solução de difosgénio (4,55 g), no seio de THF (34 mL) , a 0 °C, adicionou-se uma solução do éster terc-butilico do ácido (S)-2-hidroxi-3-metilbutírico (para o processo de preparação ver Tetrahedron. Lett., (1993), 7409) (4,0 g) e piridina (1,82 g) , no seio de THF (34 mL) , gota a gota, durante 25 minutos. Deixou-se a mistura resultante aquecer para a temperatura ambiente, durante 4 horas. Filtrou-se depois a mistura através de celite e concentrou-se o filtrado a pressão reduzida. Voltou-se a dissolver o resíduo no seio de éter de dietilo (200 mL) e filtrou-se novamente através de celite. Concentrou-se o filtrado a pressão reduzida, para se obter o composto do sub-título, sob a forma de um óleo amarelo claro (5,27 g) : RMN do 1H (400 MHz, CDCI3) δ 0,98-1,10 (6H, m) , 1,55 (9H, s) , 2,30 (1H, m) , 4,83 (1H,· m)
Processo B: Éster terc-butilico do ácido (5)-3-metil-2-(carbazole-carbamoiloxi)-butírico
A uma solução de carbazole (15,15 g) no seio de diclorometano (180 mL) e THF (142 mL) , a 0 °C, adicionou-se hidróxido de sódio granulado (5,45 g) , seguido de brometo de tetrabutilamónio (2,93 g). Agitou-se a mistura resultante durante 30 . minutos e depois adicionou-se, gota a gota, durante 55 minutos, uma solução de cloroformato (21,41 g), no seio de THF. (81 mL). Deixou-se então a mistura aquecer até à temperatura ambiente, durante a noite.. Adicionou-se então diclorometano (1 L) e água (350 mL) e eliminou-se. a fase orgânica. Extraiu-se então a fase orgânica com diclorometano 40 (2 χ 250 mL) e lavaram-se as camadas orgânicas combinadas com água (200 mL) ,· depois com salmoura (200 mL) , secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia à pressão (acetato de etilo/hexano a 0-5 %) , para se obter o composto do subtítulo, sob a forma de um óleo incolor (29,3 g) : RMN do 1H (400 MHz, CDC13) δ 1,15-1,23 (6H, m), 1,55 (9H, s) , 2,52 (1H, m), 5,27 (1H, d), 7,36-7,57 (4H, m), 8,03 (2H, d), 8,47 (2H, d) .
Processo C: Ácido (S)—3—metil—2—(carbazole-carbamoíloxi)-butírico
Adicionou-se, gota a gota,' ácido trifluoroacético (84 mL) a uma solução agitada, arrefecida com gelo, de éster terc-butílico do ácido (S)-3-metil-2-(carbazole-carbamoil-oxi) -butírico (4,11 g) , no seio de DCM anidro (300 mL) . Agitou-se a mistura a 0' °C, durante .2 horas e depois à temperatura ambiente, durante 1 hora. Concentrou-se a mistura a pressão reduzida e depois dissolveu-se o resíduo no seio de DCM anidra e eliminou-se novamente o dissolvente a pressão reduzida. Repetiu-se o processo várias vezes de modo a eliminar o excesso de ácido trif luoroacético. Obteve^-se o ácido, sob a forma de uma goma verde clara (3,30 g) : RMN do ΧΗ (400 MHz, CDCI3) δ 1,12-1,37 (6H, m) , 2,70 (1H, m) , 5,47 (1H, m), 7,32-7,56 (4H, m), 8,00 (2H, d), 8,37 (2H, d).
Processo D: 41 Éster terc-butilico do ácido [3S/R, 45/R]-5-fluoro-4-hidroxi-3-((S)-3-metil-2-(carbazole)-carbamoiloxi-butirilamido)-pentanóico
Arrefeceu-se para 0 °C, uma mistura agitada do ácido (S)-3-metil-2-(carbazole)-carbamoiloxi-butírico (3,30 g), éster terc-butilico do ácido 3-amino-5-fluoro-4-hidroxi-pentanóico (2,42 g) , HOBt (1,58 g) , DMAP (1,49 g) . e THF (80 mL) e depois adicionou-se EDC (2,24 g) . Deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente, durante 16 horas e depois concentrou-se a pressão reduzida. Purificou-se o resíduo por cromatografia à pressão (acetato de. etilo/hexano a 15-45 %), para se obter o composto do sub-título, sob a forma de uma espuma branca (4,60 g) : RMN do 1H (400 MHz, CDC13) δ 1,09-
1,50 (15H, m) , 2,49 -2,80 (3H, m), 3,20- -3,62 (1H, m) , 3, 92- 4,58 (4H, m) , 5,32- 5,42 (1H, d), 6, 8 6 (1H, m largo), 7,40- 7,55 (4H, m) , ' 8,02 (2H, ' d),. 8,35 . (2H, m) ; RMN do 19F (37 6 MHz, CDC13) -22 9,6, . -229,7 , -230,8, -231, 4. Processo E • Éster terc-butilico do ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)— 3— metil-2-(carbazole-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Tractou-se uma solução agitada do éster terc-butilico do ácido [3S/R,4S/R]-5-fluoro-4-hidroxi-3-((S)-3-metil-2-(carba- 42 zole)-carbamoiloxi-butirilamido)-pentanóico (4,60g), no seio de DCM anidra (100 mL), com 1,1,1-triacetoxi-l,1-di-hidro-1,2-benzodoxol-3(1H)-ona (4,68 g) , a 0 °C. Manteve-se a mistura resultante a 0 °c, durante 2 horas, diluiu-se com acetato de etilo, depois verteu-se numa mistura 1:1 de carbonato de hidrogénio e sódio aquoso, saturado e tio-sulfato de sódio aquoso, saturado. Eliminou-se a camada orgânica e voltou-se· a extrair a camada aquosa com acetato de etilo. Secaram-se os extractos orgânicos combinados (sulfato de magnésio) e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia à pressão (acetato de etilo/hexano a 10-40 %), para se obter o composto do sub-tít-ulo, sob a forma de um sólido branco (3,96 g) : RMN do ÁH (400 MHz, CDC13) δ 1,85 (4,5H, s), 1,94-1,31 (6H, m) , 1,36 (4,5H, s):, 2,59 (1H, m) , 2,70-3,11 (2H, m), 4,91-5,31 (3H, m), 5,40-5,49 (1H, m), 7,25 (1H, s largo), 7,42 (2H, m), 7,53 (2H, m), 8,04 (2H, m), 8,35 (2H, m) ; RMN do 19F (37 6 MHz, CDC13) -232, 0, -232,1.
Exemplo IA Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazole)-car-bamoiloxi-butirilamino]-pentánóico:
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para o processo C. Isolou-se o produto, sob a forma .de um sólido branco (última etapa a 88 %): IV (sólido) 1721,2, 1695,6, 1664,9, 1449,8, 1378,1, 1198,9, 1040,1, 758,5 cm"1; RMN do (400 -MHz, d6-DMSO) δ 1,10 (6H, m largo), 2,41 (1H, m) , 2,54-3,04 (2H, m) , 4,31- 4,82 (1,6H, m, CH2F) , 5,10-5,41 (2,4H, m), 7,45 (2H, m), 7,57 43 (2H , m), 8,22 (2H, m) , 8,30 (2H, m), 8, 51-8 ,99 (1H, m largo) 12, 60 (1H, s largo); RMN do 13C (100 MHz, d6- -DMSO) 5 19,0 19, 1, 19,3, 30,4, 30 ,5, 30, -6,; 32,9, 34 :,5, 34, 7, 47,3, 47,4 52, 0, 52,3, 80,4, 80, 8, 83, 2, 83,4, 83, r 4 , 1 35,1 , 85,2, 116,2 116 ,3, 124,1, 125,7 , 125, 9, 137,9, 151, 7, 151,9, 152,0 168 ,8, 169,0, 169,2 , 172, o, 172,1, 173, 1, 173,2, 202,2 202 ,4, 202,5, 202,6; RMN do 19f .{376 MHz r d6 -DMSO) -226, 6 (t) -226, 8 (t), -230,5 (t) , -230,9 (t) , -232,9 (t) , -233,0 (t) ; EM (ESI +ve) 443 (M+H).
Exemplo 2 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3-clorocarba- zole) -carbamoíloxi-butirilamiiio] -pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos. A-E. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 99 %): IV. (sólido) 1721,2, 1690,5, 1664,9, 1444,7, 1367,9, 1209, 1, 1041 o,i. cm-1 ; RMN dc ) aH (400 MHz, d6- -DMSO) δ 1, 02-1 ,13 (6H, m) , 2, 40 (1H, m) ., 2, 50-2 ,99 (2H,· m) , 4, 30-4,85 (1, 6H, m) , 5,09-5, 48 (2,4H, m) , 7,48 (1H f m), ' 7 , 56· -7,66 ( 2H, m) , 8,20- 8,32 ( 3H, m) , 8, 39 ( 1H, m) , 8, 55-8,99 (1H, m largo), 12,5 (1H, br); RMN dc . 13c (100 . MH: z, dç-DMSO) δ 18,1 , 18 ,9, 19,1, 30,4, 30, 5, 33,0, 34 ,5, 34,7 t 47,4, 52, 0, 52,3 , 80 , 6, 80,9, 81,1, 83 ,4, 83, 43, 85, 1 , 85 ',2 , 103 ,8, 104,0, 117 ,0, 119,3 , 121, 3, 122, 3, 124 ,3, 124, 7, 127, 2, 127,4, 127 ,9, 128,5 , 136, 5, 138, 4, 151 ,5, 151, 6, 151, 7, 168,7, 168 ,9, 169,0 , 169, 1, 172, 0, 172 , 1, 173, 1, 173, 2, 202,2, 202 ,4, 44 202,44, 202,8 (C) ; RMN do 19F (376 MHz, d6-DMSO) -226, 6 (t) , -226,8 (t), -230,4 (t), -230,9 (t), -231,0 (t), -232,8 (t), -232,84 (t),· -232,9 (t) ; EM {ESI +ve) 477 (M+H) . > . ·
Exemplo 3 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3,6-diclorocar-bazole)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos A-E. -Isòlou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 99 %) : IV (sólido) 1721,2, 1659,7, 1470,3, 1434,4, 1367,9, 1209,1 ,1075, 9, ' 1045,2 cm”1;· RMN do *Η (400 MHz, de-DMSO) δ 0,98-1 ,14 (6H, m) , 2, 30-2,50 (1H, m) , 2,50- 3,01 (2H, m) , 4.,29-4 ,84 (1, 5H, m) , 5, 09-5,41 (2,5H, m) , r. 7,66 (2H, m), 8,19- 00 2H, m) , , 8,45 (2H, m) , 8 ,57-8, 99 (1H, m largo), 12,60 (1H, br, OH) ; RMN do 13C (100 MHz, d6- •DMSO) δ 15,5, 19,1, 19,2, 30,4, 30,45, 30,6, 33, 0, 34,5, 34, 7, 47, 3, 47,5, 52,0, 52,3, 80,8, 81,1, 81, 2, 83,4 , 84, 43, 85,1, 85,2, 117,8, 121,1, 126,3 , 128, ,4, 128,7, 136,9, , 151,2, 151,4, 168,6, 168,8, 168,9, . 168, 95, 172,0, 172,04 , 173,1, 173,14, 202,2, 202,3, 202,4, 202,6 ; RMN do 19F (376 MHz, dg-DMSO) -226, 6 (t), -226,8 (t), - -230,4 (t) , -230,8 (t) , -232,8 (t), -232, 9 (t); EM (ESI +ve) 511/513 (M+H). Exemplo 4 45 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-òxo-3-[(5)-3-metil-2-(2-clorocarba-zole)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Processo F: 4' -Cloro-2-nitrobifenilo
A uma solução de 2-bromonitrobenzeno (646 mg) , no seio. de THF (17 mL) , em atmosfera de azoto, adicionou-se tetra-quis-(trifenilfosfina)paládio (0) (900 mg). Agitou-se a mistura resultante à temperatura, ambiente, durante 20 minutos, depois adicionou-se uma solução do ácido 4-clorofenilborónico (1,0 g) , no seio de etanol (17 mL) e agitou-se a mistura resultante à temperatura ambiente, durante 1 hora. Adicionou-se então carbonato de sódio 2 M. (17 mL) e aqueceu-se a mistura reaccional à temperatura de refluxo, durante 2 horas. Deixou-se então a mistura arrefecer e concentrou-se a pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo no seio de acetato de etilo (100 mL) e eliminou-se a camada aquosa. Lavou-se a fase orgânica com salmoura (20 mL), secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia à pressão (acetato de etilo/hexano a 0-10 %), para se obter o composto do sub-título, sob a forma de um sólido amarelo (646 mg): RMN do 1H (400 MHz, CDCI3) δ 7,24-7,31 (2H, m) , 7,41-7,47 (3H, m) , 7,52 ,(1H, m) , 7,65 (1H, m) , 7,90 (1H, d). 46
Processo G:
Aqueceu-se a 150.°C, durante 3 horas, uma mistura de 4'-cloro-2-nitrobifenilo (640 mg) e fosfito de trietilo (1,9 mL). Deixou-se arrefecer a mistura e purificou-se por croma-tografia à pressão (acetato de etilo/hexano a 5-10 %) , para se obter o composto do sub-titulo, sob a forma dé um sólido branco (382 mg): RMN do 1H (400 MHz, de-DMSO) δ 7,12-7,23 (2H, m), 2,40 (1H, m), 7, 46-7,54 ' (2H, m), 8,12 (2H, d).
Exemplo 4 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-clorocarbazo-le)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos A-E. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 99 %) : IV (sólido) 1731,4, 1695,6, 1664,9, 1424,2, 1367,9, 1326, 9, 1193, 7, 1045,2 cm-1; RMN do (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,58-1,70 (6H, m) , 2,85-3,10 (1H, m) , 3,10-3,54 (2H, m)., 4,85-5,39 (1,4H, m) , 5, 65-5,98 (2,6H, m), 7,94-8,20 (3H, m) , 8,73-8,90 (4H, m) , 9,10-9,56 (1H, m largo), 13,2 (1H, br) ; RMN do 13C (100,MHz, d6-DMSO) δ 17,7, 17,9, 19,0, 19,1, 19,2, 47 30,4 f 30,5, 33, 0, 34,5 >, 34,7, 52,0, 52,3, 80, 6, 80,9 , 81,1 83,4 t 83,43 , 85,1, 85, 2, 104, 0, 117, 1, 121,0, 122,1, 124,2 124, 4, 124, .6, 124 ,8, .129,0, 132,0, , 138,2, 138,4, 151, 6 151, 61 , 168 ,7, 168 ,9, 169,0, 172,0, 172,05, 202,4, 202,42 202, 6; RMN i do 19F ( 37 6 MHz, d6- -DMSO) -225,99 (t), -226 ,2 (t) -22 9 ,8 (t) , -230,3 (t) , -232,3 (t), · -232,4 (t) ; EM (ESI +ve 477 (M+H)· Exempl' o 5 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S}-3-metil-2-(2,3-diclorocar-bazole)-carbamoiloxi-butlrilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos A-E. Preparou-se 2,3-diclorocarbaz.ole utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos F e G. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 98 %) : IV (sólido) 1721,2,. 1659,7, 1434,4, 1367,9, 1204,0, 1188,6, 1045,2 cm"1; RMN do 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,04-1,14 (6H, m) , 2,29-2,48 (1H, m) , 2,53-3,00 (2H, m) , 4,30-4,84 (1,7H, m) , 5,09-5 ,41 ( 2, 3H, m ), 7,49 (1H, m) , r 7, 63 (1H, m) , 00 20-8, 33 (2H, m), 8, ,42 -8,49 (1H, m) , 8, 62 (1H, m) , 8, 80-9 ,00 (1H, m largo) , 12, 5 (1H, largo); RMN do 13c (100 MHz, d6-l DMSO) δ. 17,7, 17,9, 19,0, 19,1, 30 ,5, 33, 0 , 34,5, 34, 7, 47,5 , 52, 0, 52,3, 80,8, r 81,0, 81,2, 83, 4 , 85,1, 85,2, 116 ,3, 117, 9, 121,5, 122, ,4, 124 ,1, 124, ,6, 126, 126,6, 129, ,0, 129, 7, 136, 8, 138, 5, 151, 4, 151, 45, 168, 6, 168,9, 172, o, 172,03, 48 173,1, 202,2, 202,3, 202,4, 202,5; RMN do 19F (376 MHz, d6- DMSO) -226, 6 (t) , -226,8 (t) , -230,3 (t) , -230,8 (t), -232,8 (t), -232,9 (t); EM (ESI+ve) 513 (M+H).
Exemplo 6 Ácido [3S/RJ-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-trifluorome-til)-carbazole-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando processos semelhantes aos descritos antes para os processos A-E. Preparou-se o 2-trifluorometilcarbazole utilizando um processo semelhante ao descrito antes' para os processos F e G, Isolou-se o produto, sob a forma de um' sólido.branco (última etapa a' 85 %): IV (sólido) 1731,4, 1695,6,.1695,7, 1434,4, 1321,8, 1198,9 , 1122, 1, 1065,7 cm"1 ; RMN do (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,06-1 /15'· (6H, r mj., 2,42 (1H, m), 2,50-3,01 (2H, m) , 4,29-4,83 (1,6H, m) , 5, 08-5,42 (2 ,4H, m) , 7,53 (1H, m), 7,68 (1H, m) , 7,83 ( 1H> m) , 8,29-8,40 (2H, m) , 8,4 8 (1H, m), 8, 64 (1H, m), Οϊ 1 o 00 CG ,01' (1H , m), 12,60 (1H , s largo); RMN do 13c (100 MHz, dg-DMSO) δ 17 ,4, 17,6, 19,0, 19,1, 30,4, 31, 0 , 321 r9, 34,5, 34,7, 52,0, 52,3, 80,7, 80,9 , 81,1, 81,1, 83,4, , 85, 1, 113,3, 116,3, 120,7, 120,9, 123, 6 , 124,4, 126, 2, 127,2 , 127,5, 127,8, 128,1, 128,9,. 137,2 , 138,9, 151, 6, 168,6 , 169,0, 172,0, 202,2, 202,3, 202,4, 202,6; RMN do 19F (376 MHz, d6- DMSO) -60,4 ( s) , -226, 6 (t) , -226,8 (t), - -229, 9 (t; ), -230,4 (t), - 231,0 I !t), -232,! 3 <t) , -233,0 (t); EM (ESI +ve) 511 (M+H) . Exemplo 7 49 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-metilcarbazo-le)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para o processo A-E. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a ' 90 %): IV (sólido) 1726,3, 1700,7, 1664,9, 1552,2, 1460,0, 1552, 2, ' 1460,0 , 1367, 9, 1332, 0, 1209,1, 1193, .7, 1040, , 1 cm 1; RMN do ΧΗ (4 00 MHz, dg-DMSO) δ 1,01-1,19 (6H , m) , 2, 30-3,00 (6H, m)·, 4,29- 4,85 (1 fm) / 5,11- -5,52 (2 , 5H , m) , 7, 29 (1H, m), 7 ,45 (1H, ! m)·, 7,55 (1H, m) , 8,05-8,18 (3H , m) , 8, 27 (1H, m) , 8 ,50-9,10 (1H> m largo), 12,50 (1H, s largo) ; RMN do 13C (1.00 MHz, d6-DMS0) δ 17,7, 18,0, 19,0, 19, 1, 19,2, r 22,2, 30,4,' 30,5, ,30 ,6, 30, 6, 33,0, 34,5 , 34,7, 47 ,4, 52,0 , 52,3, 52,7, 80,3, 80 ,6, 80, 7, 80,8, 83,2 , 83,4, 83 ,5, 85,2 , 85,2, 103,8 ,. 104,0,. 116,2, 116,3, 116, 6,. 120, 3, 120,4, 123,4, 124,0 , 125,2, 125,8, 127,3, 137, 5, 137, 9, 138,2, 151,7, 151,9 , 151,9, 168,8, 169,0, 169, 2, 169, .2, 172,0, 172,1, 173,1 , 173,2, 202,3, 202,4, 202,5 , 202,6 ; RMN do 19F (376 MHz, dg-DMSO) - -226,55 (t) , -226, 76 (t), -230, 43 {t), -230,89 (t) , · -232,84 (t), -232,97 (t). Exemplo 8 Ácido_[3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-2-(carbazole-carbamoil- oxi)-butirilamino]-pentanóico
50
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para o processo A-E. Preparou-se Ό cloroformato a partir do éster terc-butilico do ácido (s)—2— hidroxibutanóico, tal como se descreveu no processo A. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 90 %) : IV (sólido) 1716,1, 1654,6, 1449, 8, 1372,9, 1326, 9, 1204,0, 1050,4, 1029, 9 cm'1; RMN do (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,03-1,12 (3H, m) , 1,96-2,15 (2H, m), 2,50-3,01 (2H, m), 4,31-4,82 (1,8H, m) , 5,11-5,43 (2,2H, m), 7,45 (2H, m) , 7,59 (2H, m) , 8,18-8,32 (4H, m), 8,58-9,05 (1H, m largo), 12,60 (1H, s largo); RMN do 13C (100 MHz, d6-DMS0) δ 9,8, 9,9, 9,94, 24,9, 25,1, 25,2, 33,0, 34,6, 34,7, 47,4, 52,0, 52,3, 77,1, 77,3, 77,4, 77,45/ 83,4, 83,5, 85,2, 85,22, 116,3, 120,6, 124,0, 125,7., 127,9, 137,9, 151., 5, 151,7, 169,5, 169,8, 172,0, 172,1, 173,1, 202,3, 202,4, 202,5, 202,6; RMN do 19F (376 MHz, d6-DMSO) -226,6 (t) , -226,8 (t) , -230, 4 (t) , -231,0 (t), -232,9 (t), -233,0 (t).
Exemplo 9· Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3,3-dimetil-2-(carbazole-carbamolloxi)-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se. este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos A-E. Preparou-se o cloroformato a partir do éster terc-butilico do ácido (S)-2-hidroxi-3,3-dimetilbutanóico (para o processo de preparação ver Tetrahedron. Lett., (1993), 7409), tal como se descreveu no processo A. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido 51 branco .(última etapa a 94 %) : IV (sólido)'. 1782,7, 1721,2, 1526.6, 1444,7, 1373,0, 1332,0, 1301,3, 1198,9, 1117,0, 1040, 1, 753,3 cm'1; RMN do % (400 MHz, d6-DMS0) δ 1,15 (9H, s), 2,50-2,98 (2H, m) , 4,29-4,88 (1,5H, m) , .4, 97-5,45 (2,5H, m), 7,45 (2H, m) , 7,59 (2H, m) , 8,23 (2H, m) , 8,33 (2H, m.) , 8,50-8,97 (1H, m largo), 12,50 (1H,. s largo); RMN do 13C (100 MHz, dg-DMSO) δ 27,3, 33,4, 34,5, 34,6, 34,7, 34,8, 35,1, 52,5, 52,9, 83,5, 83, 9, 84,0, 84,1, 84, 3, 85,7, 85, 73, 116,7, 116, 8, 121,2, .124,6, 124, 64, 126,2, 128,4, 138,4, 152,2, 152,4, 152,5, 168,4, 168,7, 168,8,. 168, 9," 172, 6, . 172, 65, 173.6, 202,6, 202,8, 202,9, 203, 0; RMN do 19F (376 MHz, d6~ DMSO) -226, 5 (t) , -226, 6 (t) , -230,9 (t) , -231,5 (t) , -232,9 (t), -233,0 (t) ; EM (ESI +ve) 457 (M+H) .
Exemplo 10 Ácido . [3S/R] -5-fluoro-4-oxo-3- [ (S) -2- (2-clorocarba.zole-carba-.moiloxi-butirilaminoi-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos A-E. Preparou-se o cloroformato a partir do éster terc-butílico do ácido (S)-2-hidroxibutanóico, tal como se descreveu no processo A. Preparou-se o 2-cloròcarbazole tal como se descreveu nos processos F-G. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 77%); IV (sólido) 1733,08, 1699,89, 1662,97, 1448,18, 1423,38, 1369,84, 1332,48, 1215,16, 1199,62, 1052,26, 1033,17, 764,57, 747,53, 720,08, 651,85 cm" 1; RMN do (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,06-1,10 (3H, m) , 2,01-2,09 (2H, m) , 2,53-2, 98 (2H, m), 4,34-4,78 (1>6H, m) , 5,14-5,39 52 (2,4H, m), 7,45-7,61 (3H, m) , 8,24-8,31 (4H, m), 8,63-8,99 (1H, m largo), 12,50 (1H, s largo); RMN do 13C (100 MHz, dg-DMSO) δ 9,7, 23,7, 25,0, 3.1, 3, 34,6, 34,8, 52,0, 52,3, 77,4, 77,6, 83, 4, ,85,2, 110,9, 111,6, 116,2, 116,3, 119,0, 119, 4, 120,7, 120,9, 121,9, 122,1, 124,2, 124,3, 124,6, 124,8, 126,3, 128,3, 130,2, '132,0, . 138 ,.1,.-- 138,4, 151, 3, 169, 6, 172,1; RMN do 19F (376 MHz, d6-DMSO) -226, 60 (t) , -226,83 (t) , -230,34 (t), -231,88 (t) , -232,84 (t), -232,99 (t) .
Exemplo 11 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxò-3-[(S)-3-metil-2-(indole)-carba-moiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os. processos A-E. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 92 %): IV (sólido) 1731,4, 1664,9, 1536,8, 1454,9, 1393,5, 1326,9, 1239,8, 1035,0 cm-1; RMN do ^ (400 MHz, d6-DMSO) δ 1,30-1,62 (6H, m), 2,79 (1H, m) , 3,00-3, 48 (2H, m) , 4,77-5,04 (1, 6H , m), 5,42-5,88 (2 ,4H, m) , i ,29 (1H, m) , O Γ-Τ · h. Γ- 7,90 (2H, m), 8 ,10-8, 31 (2H, m) r 8,51-8, 63 (1H, m) , 8,91-9,45 (1H, m), 13, 0 (1H„ ’ s largo); RMN do 13C (100 MHz, d6- -DMSO) δ 15,5, 17, 3, 17,6, 18,9, 19, 2, 30, 6, 32, .9, 34,5,. 34, 7,. 47 ,4, 52,0, 52, 3, 65,3 , 80,0, 80, 3, 80, 5, 83, 4, 83,41 , 85, 1, 85,2, 104.02, 108,7, 108,71, 108,8, 114,9, 122,0, 123,5, 125,0, 126.3, 130,5, 135,0, 150,4, 168,8, 169,0, 169,1, 169,14,
172,0, 172,1, 173,1, 202,2, 202, 4, 202,5, ' 202, 6; RMN do 19F (376MHz, dg-DMSO) -226,1 (t),·-226,3 (t), -230,0 (t), -230,5 53 (t), -232,3 (t), -232,4 (t), -232,5 (t), -232,6 (t); EM (ESI +ve) 393 (M+H).
Exemplo 12 Ácido [3S/R] -5-fluoro-4-oxo-3- [ (S) -3-metil-2- (fonotiazirta) -carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Processo H: Éster fcerc-butílico do ácido {S) -3-metil-2- (fonotiazina)-car·^-bamoiloxi^-butírico.
A' uma solução agitada de éster terc-butilico do ácido (S).-2-hidroxi-3-metilbutírico (para o processo de preparação ver Tetrahedron. Lett.,· (1993), 7409) (300 mg),· no seio de THE (5 mL) , a 0 °C, adicionou-se hidreto de sódio (suspensão a ..60 % era óleo mineral, 72 mg) . Agitou-se a mistura resultante durante 30 minutos e depois adicíonou-se cloreto de fenotiazina-10-carbonilo (450 mg) e deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente, durante 12 horas. Diluiu-se 'então a mistura reaccional com acetato de etilo (15 mL) e água (3 mL) . Separaram-se as fases orgânicas e extraiu-se a fase aquosa com 2 x 5 mL de acetato de etilo. Lavaram-se entãoas camadas orgânicas combinadas com salmoura (5 mL) , secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia à pressão (acetato de etilo/hexano a 0-10 %) , para se obter o composto do sub- 54 titulo, sob a forma de um óleo incolor (528 mg) : . RMN do ‘‘Η (400 MHz, CDCI3) δ. 0,75-0,96 (6H, m) , 1,58 (9H, s) , 2,20 (1H, m), 4,86 (1H, d), 7,12-7,45 (6H, m), 7,70 (2H, m). Ácido (S)-3-metil-2-(fonotiazina)-carbamoiloxi-butírico
Fez-se a desprotecção do éster terc-butílico do ácido (S)-3-metil-2-(fonotiazina)-carbamoiloxi-butírico (528 mg), utilizando ácido trifluoroacético, tal Como se descreveu no processo C, para se obter um ácido, sob a forma de um sólido branco (440 mg): RMN do 1H (400 MHz,. CDC13) δ 0,77-1, 00 (6H, m), 2,29 (1H, m), 5,02 (1H, d), 7,15-7,48 (6H, m), 7,70 (2H, m) . :
Exemplo 12 Ácido , [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(fonotiazina)-carbampiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos C-E. Isolou-se o produto,, sob a forma de um solido branco (última etapa a 98 %): IV (sólido) 1782,7, 1710,9, 1521,5, 1465,2, 1260,3, 1219, 4, 1168,1, 1045,2, 758,5 cirf1; RMN do (400 MHz, d6-DMSO) δ.Ο,64-0,87 (6H, m), 1,96-2,16i(1H, m), 2,40-2,98 (2H, 55 m) , 4, 50-5,42 ( 4H, .m), 7,28 (2H, rn) , 7,39 (2H, m), 7,4 ;9 (2H, m) 7, 68 (2H / m largo), 7,88-8, 91 (1H , m largo) , 12, 61 (1H, s largo) ; RMN do 13C (100 MHz, dç-DMSO) δ 16,8, 17,1, 19,0, 19,2 f 30,3, 30, 5, 33,0, 33,2, 34,5,. 34,8, 47,3, 52,0, 52,4, 79,3 r 79,6, 79 17, 83, 4, 83,5 , 85,: L, 85,2, 103,8, . 127,1,' 127, 2, 127,: 3, 127,4, 131,4, 138,0, 138,1, 152,6, 152,8, 158, 82 , 169, 3, 169,5, 169,7, 172,0, 172,1, 172,13, 202,3,. 202, 4, .202, 6 / 202, 8; RMN do 19f' (376 MHz, d6-DMSO) -226, 6 (t), -226 /8 (t), -23 0,3 (t) , -231,3 (t) , -232,9 (t), -233, 0 (t); EM (ESI +ve) 475 (M+H).
Exemplo 13 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-úxo-3-[(S')-3-metil-2-(2-clorofonotia-zina)-carbamoiloxi-butlrilamino]-pentanóico
Processo I:
Cloreto de 2-clorofenotiazina e carbamilo
A uma suspensão de 2-clorofenotiazina (2 g), no seio de xileno (20 mL), adicionou-se difosgénio (3,4 g). Aqueceu-se a mistura a 140 °C, durante 18 horas. Arrefeceu-se então a mistura e elimiriou-se o xileno a pressão reduzida. Purificou- 56 se o resíduo por cromatografia à pressão (acetato de etilo/hexano a 2-5 %) , para se obter o composto do sub título, sob a forma de um sólido castanho (2,04 g): RMN do 1H (400 MHz, CDC13) δ 7,26-7,43 (4H, m) , 7,45-7,51. (1H, m) , 7,59-7,68 (2H, m) .
Exemplo 13 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(2-clorofonotia-zina)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos H e C-E. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco por CLER de fase inversa (última etapa a 61 %) : IV (sólido) 1732., 1460, 1365, 1207 cm"1; RMN d.o (400 MHz, d6-DMSO) δ 0,70-0,87 (6H, m)', 2,02-2,10 (1H, m) , 2,58-2, 90 (2H, m) , 4,34-5,37 (4H, m) , .7,27-7,88 (7H,, m) , 8,31-8,81 (1H, m);, RMN do 13C (100 MHz, dg-DMSO) δ 16,7/16,9, 18,9/19,1, ' 30,3/30,3, 34,5/34,8,
52,0/52,4, 79,6/80,0, 84,2/84,3, 127,0, 127,3, 127,3, 127,6, 128,0, 129,0, 130,5, 130,9, 131,7, 137,5/137,5, 139,1/139,1, 152,3/152,5, 169,6/169,7, 172,0/172,1, 202,3/202,7 (2d, J 14,1/14,0; RMN do 19F (376 MHz, d6-DMSO) -226, 6 (t) ,. -226,8 (t), -233,0 (t), -233,1 (t).'
Exemplo 14 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3-clorofonotia-zina).-carbamoiloxi-butirilamino] -pentanóico 57 a
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos Η, I e C-E. ' Preparou-se a fenotiazina de acordo com os processos descritos em J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 89 %): IV (sólido) 1717, 1527, 1469, 1350, 1322, 1217, 1042 cm" 1; RMN do ΧΗ (400 MHz, d6-DMSO) δ 0, 67-0, 85 (6H, m), 2,00-2,06 (1H, m) , 2,58-2,87 (2H, m), 4,33-4,86 (2, 6H, m) , 5,12-5,36 (1,4H, m) , 7,27-7,30 (1H, m) , 7,38-7,51 (3H, m), 7,63-7,68 (3H, m) , 8,24-8,82 (1H, m) ; RMN do 13C (100 MHz, d6-DMSO) δ 17,3/17,6 (CH3) , 19,4/19,5 (CH3) , 30,8/30, 8, 35,0/35,3, 52,5/52,9, 80,0/80,1, 84,7/84,8, 127,2, 127,3, 127,6, 127,9, 128,6, 130,7, 131,2, 133,7, .136,9/137,0, 137,8/137,8, 153,0/153,2, 170,1/170,2, 172,5/172,6, 202,9/203,2; RMN do 19F (376 MHz, de-DMSO) -226,7 (br), -226,9 (br) , -233,0 (t) ; EM (ESI +ve) 509/511 (M+H). '
Exemplo 15 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(3,7-diclorofo-notiazina)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
58
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos Η, Ϊ e- C-E. Preparou-se a fenotiazina de acordo com os processos descritos em J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco por CLER de fase inversa (última, etapa a 75 %) : IV (sólido) 1793, 1721, 1521, 1465, 1317, 1214, 108.6, 1044 cm"1; RMN do ΧΗ (400 MHz, d6- DMSO) δ 0,71-0,76 (3H, m) , 0,84-0,88 (3H, m), 2,05-2,12 (1H, m) , 2,58-2,92 (2H, m) , 4,31-4,87 (.2,5H·, m) , 5,09-5,36 (1,5H, m) , 7,47-7,56 .(2H, m) , 7, 67-7,71 (2H, m) , 7,72-7,81 (1H, m), 8, 39-8,87 (1H, m) ; ' RMN do . 13C (100 MHz,' d6-DMSO) δ 16,7/16,7/17,0, 19,0/19,1/19,2/19,3, 30,3/30,3/30,4, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,8/80,1, 84,2/84,3, 127,3, 127,4, 127,7, 128,5, 129,2, 129,7, 131,4/131,4, 132,0, 133,1/133,2, 136,4/136,5, 138,8/138,9, .152,2/152,3, : 169,5/169,6, 172,0/172,1, 202,4/202,5; RMN do 19F (376 MHz, d6-DMSO) -226,5 (largo) , . -226,8 (t), -232,9 (t), -233,0 (largo).
Exemplo 16 Ácido [3S/R] -5-flúoro-4-oxo-3- [ (S) -3-metil-2- (3-, 4-diclorofo-notlazina)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este. " composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos Η, I e C-E. Preparou-se a fenotiazina de acordo com os processos descritos em J. Chem. Soc. (1970), 2437-2441. Isolou-se o produto, sob ' a . forma de um sólido branco por CLER de fase 59 inversa (última etapa a 58 %): IV (sólido) 1736, 1436, 1365, 1222, 1050 cm"1; RMN do (400 MHz, d6-DMS0) δ 0, 66-0,85 (6H, m) , 2,00-2,08 (1H, m) , 2,57-2, 93 (2H, m) , 4,30-5,35 (4H, m) , 7,31-7,71 (6H, m), 8,27-8,83 (1H, m) ; RMN do 13C (100 MHz, d6-DMSO) δ 16,8/17,1, 19,0/19,1, 30,3, 34,5/34,8, 52,0/52,4, 79,7/80,0, 84,2/84,3, 179,2/178,6, 127,1, 127,3, 127,5, 128,2, 128,5, 128,5, 129,6, 130,0, 133,7, 137,3/137,3, 137,6/137,6, 152,5, 169,5/169,5, 172,0/172,1, 202,3; RMN do 19F .(376 MHz, dg-DMSO) -226, 6 (t) , -226,δ' (t) , -232,9 (t>.
Exemplo 17 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(9,10-di-hidro-fenantridina)-carbamoiloxi-butlrilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos Η, I e C-E. Preparou-se a 9,10-di-hidrofenantridina de acordo com os processos descritos em J. Chem. Soc. (1951), 3207-3211. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco por CLER de fase inversa (última etapa a 56 %) ; IV (sólido) 1732, 1365, 1226, 1212,.1203 cm"1; RMN do *Η (400 MHz, d6-DMSO) δ 0,8.4 (6H, m) , 2,05 (1H, m), 2, 55-2, 90. (2H, m) , 4,28-5, 36 (6H, m)., 7,26-7,43 (5H, m) , 7, 75-7,77 (1H, m) , 7,89-7,91 (2H, m) , 8,24-8,81 (1H, m); RMN do 13C (100 MHz, d6-DMSO) δ 17,1/17,4, 18,9/19,0, 30,3/30,4, 34,4/34,8, 46,9, 51,9/52,4, 79,0/79,4, 84,2/84,3, 123,8, 124,3, 125,1, 125,7, 126,2, 128,0, 128,2, 128,3, 128,5, 131,5, 134,1, 136,9, 153,1, 170,0/170,1, 60 172, 0/172,1, 202,4 (largo), -233,1 (t); EM (ESI +ve) 455 (ΜΗ),
Exemplo 18 Éster 1-(l-carboximetil-3-fluoro-2-oxo-propilcarbamoil)-2-me-til-propílico do ácido dibenzo[b,f]azepina-5-carboxllico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos Η, I e C-E. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 100 %) : IV (sólido) 1791,2, 1714,9, 1683:,4, 1525,6, 1492,6, 1370,1, 1325,6, 1229,3, 1212,5, 1053,4, 1032,7, 798,4 cm"1; RMN do 1E (400 MHz, d5-DMS0) δ 0,50 + 0, 68 (6H, 2 x m) , 1,90. (1H, m), 2,54-2,93 (2H, m), 4,20-5,44 (4H, m), 7,02 (2H, s)·, 7,30-7,80 (8H, m) ; RMN do 13C (100 MHz, d6-DMSG) δ 18,73, 19,17, 30,34, 34,56, 52,18, 84,37, 127,92, 128,61, 128,69, 129,63, 130,83, 134,40, 153,90, 169,64, 172,23, 202,29, 202,43, 202, 63 202,76; RMN do 19F (376 MHz, d6-DMSO) -226,83 (t), -226, 87 (t), -232,93. {t j, -233, 07 (t), -233,10 (t), -233,32 (t); EM (ESI+ve) 469 (M+H).
Exemplo. 19 Éster 1-(l-carboximetil-3-fluoro-2-oxo-propilcarbamoil)-2-metilpropllico do ácido 10,11-di-hidro-dibenzo[b,f]azepina-5-carboxílico 61
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para os processos Η, I e C-E. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (última etapa a 100 %): IV (sólido) 1796, 9, 1683, 9, 1521, 8:, 1491,5, 1368,3, 1324,8,- 1278,6, 1213, 4, 1201, 9, 1108, 0, 1056,4, 931,1, 776, 5, 746, 7 cm-1; RMN do: 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 0,50-0,95 (6H, m), 1,90 (1H, m), 2,55-3,00 (2H, m), 4,20-5,30 (8H, m) , 7,10-7,50 (8Η, m) ; RMN do 13C (100 MHz, d6-DMSO) δ 15,24, 16,79, 39,44, 52,43, 78,36, 84,34, 126,80, 1227,89, 128,43, 130,29, 136,29, 154,09, 169,58, 170,03, .172,19,. 173,12, 202,28, 2 02, 42; RMN do 19F (376 MHz, d6-DMSO) -226,76 (t) , -233,01 (t), -233,11. (t) , -233,38 (t); EM (ESI +ve) 471 (M+H).
Exemplo 20 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-( (S)-2,3-di-hidroindole-l-car-bamoiloxi-3-metil-butirilamino)-pentanóico
Processo J: Éster benzílico dò ácido (S)-2-(imidazolecarbamoiloxi)-3-me-ilbutírico 62
A uma solução agitada do éster benzílico do ácido (S)-2-hidroxi-3-metilbutírico {para a preparação ver J. Med. Chem., (1996), 39, 982, 1,5 g)’, no seio de THF (20 mL) , adicionou-se carbonildi-imidazole (1,17 g) e agitou-se a mistura resultante à temperatura ambiente, durante 12 horas. Concentrou-se a mistura reaccional a pressão reduzida e voltou-se a dissolver o resíduo no seio de acetato de etilo (30 mL) . Lavou-se a solução com ácido fosfórico a 1 % (2 x 10 mL) , depois com salmoura (10 mL), secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se, para se Obter o composto do sub-título, sob a forma de um óleo incolor (1,89 g) : RMN do 1H (400' MHz, CDCÍ3) Ô 1,02 (3H, d), 1,11 (3H, d), 2,47 (1H, m) , 5,15 (1H, d), 5,18-5,32 (2H, m), 7,11 (1H, s),7,18-7,60 (6H, m), 8,20 (1H, m) .
Processo K: '
Ester benzilico do ácido (S)-(2,3-di-hidroindole-l-carba-moiloxi) -3-metilbutírico
A uma solução agitada do éster benzílico do ácido (S)-2-(irtidazolecarbamoiloxi)-3-metilbutirico (355 mg), no seio de THF (7 mL), a 0 °C, adicionou-se trifluorometano-sulfonato de metilo (0,13 mL)..Agitou-se a solução resultante durante 30 minutos. Adicionou-se então indolina (280 mg) e deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente, durante 12 horas. Concentrou-se a mistura reaccional a pressão reduzida e 63 voltou-se a dissolver o resíduo no seio de acetato de etilo (30 mL) . Lavou-se a solução com uma solução saturada de bicarbonato de sódio (5mL), depois com ácido clorídrico 1 M (2 x 5 mL) , depois com salmoura (5 mL) , secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia à pressão (acetato de . etilo/hexano a 5-7 %), para se obter o composto do sub-título, sob a forma de ura óleo incolor (342 mg): RMN do ^ (400 MHz, CDC13) δ 0,86-1,18 (6H, m) , 2,35 (1H, m), 3,08-3,25 (2H, m) , 4, 05-4,25 (2H, m) , 4,95-5,32 (3H, n), 6,95-7,91 (9H, m) .
Processo L:
Ácido (S)-(2,3-di-hidroindole-l-carbamoiloxl)-3-metilbutírlcO
A uma solução agitada do éster benzílico do ácido (S) — (2,3-di-hidroindole-l-carbamoiloxi)-3-metilbutírico (342 mg), no seio .de metanol (25 mL) , adicionou-se paládio em carvão a. 10%.(80 mg). Hidrogenou-se a mistura à temperatura ambiente, durante. 2 horas. Filtrou-se então a mistura.através de celite e concentrou-se o filtrado, para se obter- o composto do subtítulo,' sob a· forma de um óleo incolor· (255 mg).: RMN do 1H (400 MHz, CDC13). δ 0,95-1,21 (6H, m) , 2,40 (1H, m) , 3,20 (2H, m), 4,01-4,25 (2H, m), 4,95-5,15 (1H, m), ,6, 97-7, 99 (4H, m).
Exemplo 20 Ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-((S)-2,3-di-hidroindole-l-car-amoiloxi-3-metil-butirllamino)-pentanóico 64
Preparou-se este composto utilizando um processo se-elhante ao descrito antes para os processos C-E. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco {última etapa a 94 %) : IV (sólido) 1680,2, 1485,6,. 1413, 9, 1137,4, 1050,4, 758,5 cm"1; RMN dó 1H {400 MHz, dâ-DMSO) δ 0,95 (6H, m largo), 2,17 (1H, m largo), 2,50-2,94 (2H, m),. 3,12 (2H, m largo), 3,84-4,23 (2H>. m largo), 4,27-5,39 (4H, m) , 6,98 (1H, m) , 7,22 (2H, m), 7,67 (1H, m largo), 7,78-8,30 (1H, m largo), 12,50 (1H, s largo) ; RMN do 13C (100 MHz, d6-DMSO) δ 17,2, 19,0, 19.2, 27,3, 30,4, 30,6, 32,9,.34,5, 34,6, 47,3, 47,35, 52,0, 52.2, 78,3, 83,4, 85,1, 104,0, 114,2, 123,0, 125,4, 127,5, 131, 7, 170,0, 1.72,07, 172,1, 173,2, 173,25, 202,3, 202,5, 202,6; RMN do 19F (376 MHz, d6-DMSO) -226, 7 (t) , -226,8 (t) , -233,1 (t), -233,3 (t); EM (ESI +ve) 395 (M+H).
Exemplo 21
Dietilamida do ácido [3S/R]-S-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazole)carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico.
Processo M: A uma solução agitada de ácido (exemplo. 1; preparado tal como se descreveu antes para os processos A-E) (100 mg), no seio de THF (2 mL), a 0 °C, adicionou-se dietilamina (16 mg), no seio de THF (0,5 mL) , seguida de clòridrato de 1 — (3— 65 dimetilaminopropil)-3-(etilcarbodi-imida), EDC) (48 mg). Deixou-se aquecer a mistura até à temperatura ambiente, durante 12 horas. Eliminou-se o dissolvente a pressão reduzida e purificou-se o resíduo por cromatografia à pressão (acetato de etilo/hexano a 50-60 %) , para se obter a amida, sob a forma de um sólido branco (54 mg) ; RMN do 1H (400 MHz, CDCI3) δ 0,69-1, 38 (12H, m ), 2,42-3,37 (7H, m) , 4,85-4,92 (1H, m) 5,01-5,55 (3H, m), 7,31-7,70 (5H, m) , 7,90-8,05. (2H, m) 8,25-8/42 (2H, m); RMN do 19F (376 MHz, CDCI3) -232,6 (t) -232,8 (t); EM (ESI +ve ) .4.98 (M+H) . Exemplo 22
Et-il-amida do ácido. [3S/R] -5-fluõro-4-oxo-3- [ (S) -3-metll-2-(carbazole)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para- o processo M. Isolou-se. o produto, sob a forma de um sólido branco (62 %) : RMN do 1H (400 MHz, CDC13) δ 0, 96 -1,31 (9H, m) , 2, 21- 2,45 (1H, m) , 2,48- -2, 80 (2H, m), 3, 15- -3,48 (2H, : m) , 4, 23- 4,76 (3H, m) , 5,05- -5, 42 (1H, m), 6, 42· -6,84 (1H, m) , 7, 38- 7,60 ' (4H, m) , 7,.95- -8, 09 (2H, m), 1 0 CM co 8,41 (2H, m) ; RMN do 19f (376 MHz, CDC13 i) - -223 ,8 (t), - 224 ,5 (t) ,· -226, 5 (t ), “ 227 ,1 ( t), -231,9. (t), -232 (t); EM (ESI +ve) '452 (M+H20) .
Exemplo 23 66
Piperazino-amida do ácido [35/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-me-til-2- (carbazole) -carbamoiloxi-butirilamino] -pentanóicQ
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para' o. processo M. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (78 %) : RMN do 1H (400 MHz, CDCI3)· δ 1,10-1,35 (6H, m) , 1,80-3,55 (14H, 4,82-4,98 (1H, m), 5,00-5,45 (3B, m), 7,38-7,60 (5H, 7,95-8,08 (2H, m) , 8,27-8,45 (2H, m) ; RMN do 19F (376 CDCI3) -232,5 (t), -232,7 (t); EM (ESI+ve) 525 (M+H).
Exemplo 24 N,N-dimetilaminoetil-amida do ácido, [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazole)-carbamoiloxi-butirilamino]-penta- nóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para, o processo M. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (49 %) : RMN do. 1H (400 MHz,. CDCI3) δ 1,14-1,31 ' (6H, m) , 1,88-3,04 (13H, m) , 3,88-4,41' (3H, m), 4,57-4,74 (1H, m) , 5,33-5,61 (1H, m) , 6,86-7,12 (1H, m), 7,33-7,56- (4H, m) , 8,01-8,05 (2H, m) , 67 8,27-8,41 (2Η, m) ; RMN do 1SF (376 MHz, CDC13) -222,4 (t) , -222,5 (t); EM (ESI +ve} 513 (M+H),
Exemplo 25 [3S/R] -5-Fluoro-4-oxo-3- [.(S) -3-metil-2- (carbazole) -carbamoi-loxi-butirilamino]-pentanoamida
Processo N: A uma solução agitada do ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazole-carbamoiloxi-butirilamino]-penta-nóico do exemplo 1 (150 mg), no seio de diclorometano '{1,5 mL) e dimetilformamida (0, 075 mL), adicionou-se carbonildi-imidazole (66 mg) . Agitou-se a mistura durante 2 horas, depois arrefeceu-se para 0 °C, enquanto se fazia borbulhar amónia através dela. Diluiu-se a mistura com acetato de etilo/solução de hidrogeno-sulfato de potássio a. 10 %.·
Eliminou-se a fase orgânica e extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo. Secaram-se as camadas orgânicas combinadas, sobre sulfato de, magnésio, filtrou-se e' . concentrou-se.. Purificou-se o resíduo por cromatografia à pressão (metanol /diclorometano a 5 %) , para se obter a amida, sob a forma de um sólido branco (80 mg); RMN do . 1H (400 MHz, CDCI3) 1, ΙΟΙ,28 (6H,. m), 2,12-2,75 (3H, m) , 4,10-4,85 (4H, m) , 5,29 (1H, m), 6,36, 6, 55, 6, 78, 6, 98 (1H, 4 x s) , 7,17 (1H, m) , 7,42 (2H, m), 7,50 (2H, m) , 7,99 (2H, m) , 8,29 (2H, m) ; RMN do 19F (376 MHz, CDCI3)· -225,47 (t) , -226, 00 (t) , -227,33 (t) , - 227,50 (t), -228,43 (t); EM (ESI +ve) 424 (M-H20+H). 68
Exemplo 26 Éster ciclo-hexílico do ácido [35/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metll-2-(carbazole)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para o processo M. Iso.lou-se o produto, sob..a- forma de um sólido branco (37 %) : RMN do 1H (400 MHz, CDC13) δ 0,90-1,80 (16H, m) , 2,59 <1H, m), 2,75-3,15 (2H,m), 4,40 (0,5H, m) , 4,64 (0,5H, m) , 4,95-5,45 (4H, m), 7,25 (1H, m), 7,42 <2H, m) , 7,52 (2H, m), 8,05 <2H, m) ,. 8,36 (2H, m) RMN do 19F (376 MHz, CDCI3) -231,95 (t) , -232,08 (t) .
Exemplo 27 Éster n-propílico do ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazole)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para o processo M. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (82 %) : RMN do 1H (400 MHz, CDCI3) δ 0,80 (3H, m) , 1,13-1,36 (6H, m) , 1,42 (1H, 69 m) , 1,58 (1H, m) , 2, 60 (1H, m) , 2,80- -3, 08 (2H, m) , 3,70 (1H, m) , 3, 98 (1H, m) , .4,92- •5,50 (4H, m.) , 7,21 (1H, m), 7,40 (2H, m) , 7,50 . (2H, m) , 8,00. (2H,m) , 8,32 (2H, m) ; RMN. do 19F (376 MHz, CDC13) -232,00 (t), -232,01 (t); EM (ESI +ve) 485 (M+H). Exemplo 28 Éster isopropílico do ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2-(carbazole)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para o processo M. Isólou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (7 %) : RMN do :*Ή (400 MHz, CDC13) δ 0,90-1,33 (12H, m) , 2,55 (1H, m) , 2,78-3,15 (2H, m) , 4,80-5,50 (5H, m) , 7,25 (1H, s largo), 7,43 (2H, m) , 7,55 (2H,.m), 8,05 (2H, m) , 8,36 (2H, m) ; RMN do l9F (376 MHz, CDCI3) -232,00 (t), -232,03 (t} .
Exemplo 29 Éster metílico do ácido [3S/R] -5-fluorò-4-oxo-3- [,(S) -3-metil-2~(carbazole)-carbamoiloxi-butirilamino]-pentanóico
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para o processo M. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (81 %) : RMN do 1H (400 MHz, CDCI3) δ 1,20 (6H, m) , 2,58 (1H, m),.2,80-3,05 (2H, 70 m) , 3,42/ 3,61 (3H, 2 x s) , 4,98-5,26 (3H, m) , 5,41 {1H, m) , 7,20 (1H, s largo), 7,45 (2H, m), 7,55 <2H, m), 8,04 (2H, m), 8,35 (2H, m) ; RMN do 19F (376 MHz, CDC13) -231, 99 (t), -232,00 (t); EM (ESI +ve) 457 (M+H).
Exemplo 30 Éster colesterólico do ácido [3S/R]-5-fluoro-4-oxo-3-[(S)-3-metil-2- (carbazole) -carbamoiloxi-butirilamino] -pentanóico '
Preparou-se este composto utilizando um processo semelhante ao descrito antes para o processo N, utilizando carbonildi-imidazole como reagente de acoplamento. Isolou-se o produto, sob a forma de um sólido branco (12 %): RMN do ’Ή (400 MHz, ÇDCI3} δ 0, 65-2,35 (47H, m) , 2,58 (1H, m) , 2,75-3,15 (2H,m), 4,25 (0,5H, m) , 4,48 (0,5H, m), 4,97-5,46 (5H, m) , 7,30 (1H, m) , 7,44 (2H, m) , 7,58 (2H, m) , 8,05 (2H, m) , 8,33 (1H, m); RMN do 19F. (376 MHz, CDC13) -231,91 (t), -232,03 (t). Isolou-se também o cetal correspondente, sob a forma de um sólido branco (21 %) : RMN do lR (400 MHz, CDC13) δ 0,65-2,10 (48H, m) , 2,35-3,15 (2H, 3 x m) , 3,42-3, 69 (1H, m) , 4,10-4,96 {4H, m) , 5,15-5,65 (2H, m), 6,78 (1H, m), 7,45 (2H, m) , 7,57 (2H, m) , 8,05 (2H, m) , 8,34 (2H, m) ; RMN do 19F (376 MHz, CDCI3) -230,57 (t), -230, 67 (t) .
Processos de Análise
Ensaios de Enzimas . 71
Os ensaios para a inibição de caspase basearam-se na clivagem de um substrato fluorogénico por meio das caspases-1, -3, -7 ou -8 humanas, purificadas, recombinantes. Os ensaios foram realizados praticamente da mesma maneira que os referidos por Garcia-Calvo et al.. (J. Biol. Chem. 273 (1998), 32608-32613), utilizando um substrato especifico para cada enzima. O substrato para a caspase-1 foi Acetil-Tir-Val-Ala-Asp-amino-4-metilcoumarina. O substrato para as caspases-3, -7 e -8 foi Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-metilcoumarina. A taxa de inactivação da enzima observada para uma concentração particular do inibidor, k0bS, é tratada em computador por ajustamentos directos dos dados à equação derivada por Thornberry et al. (Biochemistry 33 (1994), 3943-3939), utilizando um programa de computador de análise não linear dos mínimos quadrados (PRISM 2.0; GraphPad software). Para se obter a constante da · taxa de segunda ordem, desenharam-se os valores de kinact,. kobs em função . das respectivas concentrações de inibidor e calcularam-se em seguida os valores de kinact por meio de uma regressão linear computadorizada. Muitos dos compostos da presente invenção que foram analisados tinham valores de kinact .em função de caspase-1, entre 25.000 e 1.500.000 M"1s"1; valores de kinact em função de caspáse-3 entre 9.000 e 1.500.000 M-1s-1; valores de kinact em função de caspase-8 entre 10.000 e 700.000 M~1s”1. A inibição da secreção de. IL-Ιβ a partir de uma população mista de células mononucleares de sangue periférico (CMSP) 0 tratamento de pré-IL-Ιβ por meio de caspase-1 pode ser medido na cultura de células utilizando uma variedade de fontes de células. AS CMSP humanas obtidas de dadores saudáveis dão uma população mista de células de linfócitos e células mononucleares, que produzem um espectro de inter- 72 leucinas e de citocinas em resposta, a muitas classes de estimuladores fisiológicos.
Processo.experimental
Dissolve-se o composto de ensaio no seio de dimetil-sulfóxido (DMSO, Sigma #D-2650), para se obter uma solução concentrada 100 mM. Diluiu-se em meio' completo constituído por RPMI contendo SBF a 10 %,. inactivado pelo calor (Gibco BRL #10099-141) , L-glutamina 2 mM (Sigma, #G-7513) , .100' U' de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina (Sigma #P-7539). O intervalo final de concentrações do composto de ensaio varia de 100 μΜ até 6 nM ao longo das oito etapas de diluição. A concéntração riais elevada- do .composto de ensaio é equivalente· ao DMSO a 0,1 % no ensaio.
Isolou-se CMSP humanas a partir de camadas de. células brancas obtidas de um banco de sangue utilizando a centrifugação num meio de separação de leucócitos da Ficoll-Paque (Amersham, #17-1440-02). Realiza-se o ensaio das células numa placa de fundo redondo, esterilizada, com 96 orifícios (Nunc) . Cada tubo contém 100 pL da suspensão de células, 1 x 105 células, 50 pL de diluições do composto e 50 pL de LPS (Sigma #L-3012) a 50 ng/mL de concentração final. Os controlos consistem em células.+/- LPS de estimulação e Uma diluição em série de DMSO dissolvido da mesma maneira que o composto. Incubaram-se as placas durante 16-18 horas, a 37 °C, no seio de CO2 a 5 % è com uma humidade atmosférica de 95
Passadas 16-18 horas, colheram-se os sobrenadantes apôs centrifugação das placas a 100 x g, a 18 °C, durante 15 minutos e fez-se o'ensaio para determinar o seu conteúdo de IL-Ιβ. A medição de IL-Ιβ maduro no sobrenadante realiza-se 73 utilizando os kits da Quantikine (R&D Sistems), de acordo com as instruções do fabricante. Observaram-se níveis de IL-Ιβ madura de cerca de 600-1500 pg/mL para as CMSPs nos microtubos de controlo positivos. A potência inibidora dos compostos pode ser representada por um valor de CI5o, que é a concentração de inibidor à qual se detecta 50 % de IL-Ιβ madura no. sobrenadante, quando se compara com os controlos positivos. 0 quadro 5 mostra a inibição da secreção de IL-Ιβ a. partir das células mono-nuclearés de sangue periférico para os compostos seleccio-nados da presente invenção, conforme determinado pelos processos anteriores.
Ensaiaram-se os compostos seleccionados neste ensaio e eles mostraram que inibem a libertação de IL-Ιβ com valores de CI5o entre 0,04 μΜ e 20 μΜ. ,
Ensaio de Apóptose Induzido,' por Anti-Fas A apóptose celular pode ser induzida peia ligação do ligando de Fas (LFas) 7 os seu receptor, CD95 (Fas). CD95 pertence a uma família de receptores relacionados, conhecidos como os receptores da morte, que podem provocar apóptoseem células, por via da activação da" cascata das enzimas de caspase. 0 processo é iniciado pela ligação da molécula adaptadora FAD.D/MORT-1 ao domínio citoplasmático do complexo de receptor CD-95-ligando. A caspase-8 liga-se então, a FADD e torna-se activa, iniciando' uma cascata de acontecimentos que envolve a activação das caspases a jusante e, em consequência, a apóptose celular . ,A apóptose pode também ser induzida em células que expressam CD95, por exemplo, a linha de. células do linfoma das células T,· Jurkat E6.1, utilizando um anticorpo, em vez de LFas, para reticular a superfície das. 74 células CD95. A apóptose induzida por anti-Fas é também provocada por via da activação da caspase-8. Isto origina a base de um ensaio à base de células para rastrear os compostos quanto à inibição da via apoptótica mediada por caspase-8.
Processo Experimental
Faz-se uma cultura de células Jurkat' E6.1 em meio completo' constituído por RPMI-1640 (Sigma. No) + soro bovino fetal a 10. % (Gibco BRL N°·. 10099-141) + L-glutamina 2 mM (Sigma No. G-7513). Colhem-se as células na fase de crescimento· logarítmico. Transferem-se 100 mL de células a uma taxa de 5-8 x 105 células/mL para tubos'esterilizados .de 50 mL de. uma centrifugádora Falcon e centrifugam-se durante 5 minutos,' a 100 x . g, à temperatura ambiente. Elimina-se o sobrenadante é faz-sè uma nova suspensão das camadas de células combinadas em 25 mL de. meio completo. Còntam-se as células e ajusta-se a densidade para 2 x 106 células/mL com meio completo. O' composto do ensaio é. dissolvido em dimetil-sulfóxido (DMSO) (Sigma N°. D-2650), . para se obter uma solução concentrada 100 mM. Diluiu-se para 400 μΜ em meio completo, depois diluiu-se era série numa placa de microtubos de 96 microtubos antes da adição à placa de ensaio de células.
Adiciona-se 100 pL da suspensão de células (2 x 106 células) a cada microtubo de cada placa de fundo redondo de 96 microtubos esterilizados (Costar N°. 3790). Adiciona-se aos microtubos 50 pL da solução do composto ' na diluição apropriada e 50 pL de anticorpo anti-Fas, clone CH-11 (Kamiyã N°. MC-060), numa concentração final de 10 ng/mL. Os microtubos dè controlo têm menos anticorpo e menos composto, 75 mas têm uma diluição em série de DMSO como veiculo de controlo. Faz-se a incubação das placas durante 16-18 horas, a 37 °C, no seio de CO2 a 5 % e 95 % de humidade.
Mede-se a apóptose das células quantificando a fragmentação do ADN,.utilizando um "ensaio de detecção da morte das células" da Boehringer-Mannheim, N°. 1544. 675. Após da incubação durante 16-18 horas, faz-se a centrifugação das placas de ensaio a 100 x g, à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Elimina-se 150 pL do sobrenadante e substitui-se por 150 pL de meio completo fresco. Colhem-se então as células e adiciona-se a cada microtubo 200 pL do tampão de lise fornecido no kit de ensaio. Faz-se a trituração das células para assegurar a lise completa e faz-se a incubação durante 30 minutos, a 4 °C. As placas são então centrifugadas a 1.900 x g, durante 10 minutos è diluem-se: os sobrenadantes a 1:20 no tampão de incubação fornecido. Faz-se então o ensaio de 100 pL desta solução de acordo com as instruções do fabricante fornecidas com o kit. Mede-se DO405 nm 20 minutos após a adição do substrato final, num leitor de placas SPECTRAmax Plus (Molecular Devices). Desenha-se um gráfico de DO405 nm em função, da concentração do composto e calculam-se os valores de CI50 para os compostos utilizando o programa de ajustamento de curva SOFTmax Pro (Molecular Devices), utilizando a opção de ajustamento de quatro parâmetros.
Ensaiaram-se os compostos seleccionados neste ensaio e eles mostraram que inibem a apoptose das células Jurkat induzida por Fas, para valores de CI50 entre 0,001 pM e 0,15 pM.
Embora os requerentes tenham descrito um certo número de enquadramentos . da presente invenção, será evidente que. os exemplos básicos apresentados poderão, ser alterados para 76 originar outros enquadramentos, que utilizam os compostos e os processos da presente invenção. Por isso, deve entender-se que o âmbito da presente invenção estará definido pelas reivindicações em anexo e não pelos enquadramentos específicos, que foram apresentados a titulo de exemplo.
Lisboa, 20 de Março de 2008 77

Claims (23)

  1. REIVINDICAÇÕES Composto de fórmula geral I:
    ou um .seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de: Z representar oxigénio ou enxofre; R1 representar hidrogénio, -CHN2, -R, -CH2OR., -CH2SR ou -CH2Y; R representar um grupo alifático C1-12, arilo, aralquilo, heterociclilo ou heterociclilalquilo; Y representar um grupo eliminável . electronegativo seleccionado entre F, Cl, Br, I, arilsulfoniloxi, alquilsulfoniloxi, trifluorometano-sulfoniloxi, OR', SR', -00=0 (R') ou -OPO(R6} (R7) . em que o símbolo R' representa um grupo alifático, um grupo arilo, um grupo aralquilo, um grupo carbocí-clico, uni grupo- alquil-carbocíclico, um grupo hetero-cíclico ou. um grupo alquil-heterociclico; em que R6 e R7 se seleccionam, independentemente, entre R' ou CR/ ; R2 representar CO2H, 0Η20Ο2Η ou os seus ésteres ou as suas amidas ou CONHSO2(alquilo); R3· selecciona-se entre H, uma cadeia lateral de um a-aminoácido natural ou um grupo substituído ou insubs-tituído com um peso molecular de até 140 Daltons, seleccionado entre grupos alifáticos, arilo, arãlqui-lo, heterociclilo ou anel de heterociclilalquilo, em 1 que o referido anel de heterociclilo ou de hetero-ciclilalquilo é um sistema de anel com três a nove átomos no núcleo, saturado ou insaturado, monocíclico ou policíclico, em que cada anel contém até três heteroátomos seleccionados entre 0, N ou S; e os símbolos R4 e R5, considerados em conjunto com o átomo de azoto interveniente, formam um sistema de anel mono-, bi- ou tricíclico com 1-6 heteroátomos seleccionados entre azoto, oxigénio ou enxofre. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo facto de · ter uma ou mais das seguintes características: (ij Z representar oxigénio; (ii) R1 representar hidrogénio,. -R, -CH2OR, -CH2SR ou -CK2Y; (iii) . R2 representar CO2H ou um seu éster ou amida ou CONHSO2(alquilo); (iv) R3 representar um grupo com um peso molecular até cerca de 140 Daltons; ou (v) R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente, formarem um sistema de anel monocíclico, bicíclico ou tricíclico, em que cada anel do sistema tem 5-7 átomos.
  2. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracte-rizado pelo facto de ter as seguintes características: 2 1 o símbolo Z representar oxigénio; 2 (ii) o símbolo R1 representar hidrogénio, -R, -CH2OR,
  3. 3 -CH2SR ou -CH2Y; (iii) o símbolo R2 representar C02H ou um seu éster ou uma sua amida ou CONHS02- (alquilo) ; (iv) o símbolo R3 representar um grupo com um peso molecular até cerca de 140 Daltons; e (v) os símbolos R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente, formarem um sistema de anel heterociclico, monocíclico, bicíclico ou tricíclico, ou sistema de anel de heteroarilo, em que cada anel do sistema tem 5-7 átomos no anel.
  4. 4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracte- rizado pelo facto do símbolo R1 representar -CH2Y.
  5. 5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracte- rizado pelo facto do símbolo R1 representar -CH2F e R3 . representar um grupo alquilo C1-4.
  6. 6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracte- rizado pelo facto de R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente, formarem um sistema de anel heterociclico, bicíclico ou tricíclico ou um sistema de anel de heteroarilo, em que cada anel do sistema tem 5-7 átomos no anel.
  7. 7 10 kJ o Λ- ύυύΥ'' 0^0 11 (pKr°'Á^ 12 íVTVSrV> Kf* 0 /\ ° 13 xy ? o r'CCfeH οιοΥτ· 14 Λ fYvv^íjyF ^ 0 A. 6 15 j5 ? T n (VVvSVF Cl 16 °xS 17 U* «A H ° 18 a V 19 20 /v. ..ος,Η ry VvVy"f «V 0 Λ i 21 /] í? [‘nCx' íYyYVy^ ^ ° /\ ° 22 23 24 ^ ° /\ ° 25 9 26 ^ ° /\ b 27 Λ 28 À 29 fjJ'V^jfn"F ^ b /\ ° 30 *5» o o 31 JO q ^COaH rrvvS * f 32 Xp 0 rCO,H rVYYSr^ V O^H 0 33 O 0 íVYtS nF Ns^ 0 ^A*. H D 10 34 jy 0 ^co2h jfy"ϊΥϊτ^ 0 (XÍNn h 0 35 hJ Q .COaH ryYv^V^p O H O ' 36 JO 0 .COaH ίΥγ°γνν^ *V o ^ H 0 37 A%) 0 ^COsH νΧϊγΓ' 38 N^Jsf O ^ ^ O 39 Λ ^ jÇ*H 40 O-Ç 0 A*. íVnt^"vY-n'Y^f V °Hfi*CH,H ° 41 O ° ΗΓΤ P OOH fVNr^vYN'Y"P 42 *°vQ 0 Λη ιΓί 1 Ο , X H (3 HgCT^CHg .43 ΔγΡ ο Aw dXXirV' 44 yp ο λ,η fysc1 ^ W ° 45 «TN o toyY ο Λη |p*YN-)l——N— 46 iP o Ah (YrvV^F 47 <VP o Ah Ar'N-ir°'vJL-NAr'F ^ 'W-w ° 48 HsC-^N-O o A>h íTYYSr*~p ^ °hso^chsh 0
    7. Composto, de acordo com a reivindicação 6, caracte-rizado pelo facto de os símbolos R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente, formarem um sistema de anel heterociclico, tricíclico . ou um sistema de anel de heteroarilo, em que cada anel do sistema tem 5-7 átomos no anel.
  8. 8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracte-rizado pelo facto de o anel médio do sistema tricí- 3 clico de anéis ser um anel com cinco ou seis átomos no núcleo.
  9. 9. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo facto de ter uma ou mais das seguintes características: (i) Z representar oxigénio; (ii) R1 representar -CH2OR, -CH2SR ou -CH2Y; (iii.) R2 representar . C02H ou um seu éster ou uma sua amida ou CONHSO2- (alquilo) ; (iv) R3 representar alquilo Ci_4; ou (v) R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente, formarem um anel seleccionado entre indole, isoindole, indolina, indazole, purina, di-hidropiridina, benzimidazole, imida-zole, imidazolina, pirrole, pirrolidina, pirro-lina, pirazole, pirazolina, pirazolidina, tria-zole, piperidina, morfolina, tiomorfolina, pi-perazina, carbazole, fenotiazina, fenoxazina, dibenzoazepina, di-hidro-dibenzoazepina, di-hi-drofenazina, di-hidrocinolina, di-hidroquino-xalina, tetra-hidroquinolina, tetra-hidroiso-quinolina, di-hidronaftiridina, tetra-hidro-naftiridina, di-hidroacridina, β-carbolina, pirido-[4,3-b]indole, 2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-diaza-antraceno, 3, 6, 9-triazafluoreno, tieno[3,2-b]pirrole ou di-hidrofenantridina.
  10. 10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, çaracte-rizado pelo facto de ter uma ou mais das seguintes características: 4 1 Z representar oxigénio; (ii) R1 representar -CH2OR, -CH2SR ou -CH2Y; (iii) R2 representar C02H ou um seu éster ou amida ou C0NHS02(alquilo); (iv) R3 representar alquilo C1-4? ou (v) R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente, formarem um anel seleccionado entre indole, isoindole, índolina, indazole, benzimidazole, imidazole, pirrolidina, pirazo-le, tríazole, piperidina, morfolina, tiomorfo-lina, piperazina, carbazole, fenotiazina, fen-oxazina, dibenzoazepina, di-hidro-dibenzo-aze-pina, di-hidrofenazina, di-hidrocinolina, di-hidroquinoxalina, tetra-hidroquinolína, tetra-hidroisoquinolina, di-hidrona.ftiridína, tetra-hidronaftiridina, di-hidroacridina, . β-carboli-na, pirido[4,3-b]indole, 2,3,9-triazafluo-reno, 9-tia~2,10-diaza-antraceno, 3, 6,9-triaza-fluo-en, tieno[3,2-b]pirrole ou di-hidrofenan-tri-ina.
  11. 11. Composto, de acordo com a reivindicação 10, caracte-rizado pelo facto de ter uma ou mais das seguintes características: (i} Z representar oxigénio; (ii) . R1 representar -CH2OR, -CH2SR ou -CH2Y; (iii) R2 representar C02H ou um seu éster ou uma sua amida ou C0NHS02- (alquilo) ; (iv) R3 representar alquilo Ci_4; ou (v) R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente, formarem um sistema de anel substituído ou insubstituído, seleccionado entre carbazole, fenotiazina, indole, indolina, 5H-dibenzo[b,f]azepina, 10, ll-di-hidro-5H-di- 5 benzo-[b,f]azepina, β-carbolina, pirido[4,3-b]indole, 2,3,9-triazafluoreno, 9-tia-2,10-di-aza-antraceno, 3,6,9-triazafluoreno, tieno[3,2-bjpirrole ou di-hidrof enantridina·.
  12. 12. Composto, de acordo com a reivindicação 11, caracte-rizado pelo , facto de representar oxigénio; R1 representar -CH2OR, -CHgSR ou -CH2Y; R2 representar CO2H ou um seu éster, amida ou isoéster; R3 repre-entar alquilo C1-4; e R4 e R5, considerados em conjunto com o azoto interveniente, formarem um sistema de anel substituído ou insubstituído, seleccionado entre car-aole, fenotiazina, indole, indolina, 5H-dibenzo-[b,f]-azepina, 10,ll-di-hidro-5H-dibenzo[b,f]azepina; β-car-bolina, pirido[4,3—b]indole, 2,3,9-triazafluoreno, . 9-tia-2,10-diaza-antraceno, 3,6,9-triazafluoreno, tieno-[3,2-b]pirrole ou di-hidro-fenantridina.
  13. 13. Composto, de acordo com. a reivindicação 12, caracte-rizado pelo facto de R1 representar -CH2Y.
  14. 14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, cãracte-rizado pelo facto de R1 representar -CH2F.
  15. 15. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo facto de o composto se seleccionar entre:
    6
  16. 16. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado pelo facto de se seleccionar entre’ os seguintes compostos:
    12
  17. 17. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-16 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
  18. 18. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-16, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença num paciente, que seja aliviado por um tratamento com um inibidor de . caspase.
  19. 19. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-16, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, de uma doença seleccionada en- .tre doenças mediadas IL-1, uma doença mediada por apóptose, uma doença inflamatória, uma doença auto-imune, ura distúrbio destrutivo dos ossos, um distúrbio proliferativo, uma doença infecciosa, uma doença degenerativa, uma doença associada com a morte das células, uma doença relacionada com uma dieta com excesso de álcool, uma doença mediada por vírus, uveíte, peritonite inflamatória, osteoartrite, pancreatite, asma, síndroma da dificuldade respiratória do adulto, glomerulonefrite, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, escleroderma, tiróidite crónica, doença de Grave, gastrite auto-imune, diabetes, 13 anemia hèmolítica auto-imune, neutropénia auto-imune, trombocitopénia, hepatite activa crónica, miastenia gravis, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, psoriase, dermatite atópica, escaras, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição do transplante de órgãos, osteoporose, leucemias e distúrbios relacionados, síndroma de mielodisplasia, distúrbios dos ossos relacionados com mieloma múltiplo, leucemia mielogéni-ca aguda, leucemia mielogénica crónica, melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, choque hemorrágico, sépsia, choque séptico,' queimaduras, Shigellosis, doènça de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Kennedy, doença do prião, isquémia cerebral, epilepsia, isqué-mia do miocárdio, doenças do coração aguda e crónica, enfarte do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, .aterosclerose, enxerto por bypass da artéria coronária, atrofia muscular espinal, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, encefalite relacionada com o.VIH, envelhecimento, alopécia, danos neurológicos causados por enfarte, colite ulcerosa, feridas traumáticas do cérebro, traumatismo da espinal-medula, hepatite B, hepatite C, hepatite G, febre-amarela, febre do dengue ou encefalite japonesa, várias formas de doenças do fígado, doenças renais, doenças do rim poliapti co, doenças gástricas e ulcera duodenal associadas ao H. pylori, infecção por VIH, tuberculose, meningite, um tratamento de complicações associadas com enxertos do bypass da artéria coronária ou uma imunoterapia para o tratamento de várias formas de cancro.
  20. 20. Utilização de um composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-16, para a preparação de uma 14 composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de a • composição ser utilizada para tratar complicações associadas ' com enxertos por bypass da artéria coronária.
  21. 21. Processo in vitro para a preservação de células, ca-racterizado pelo facto de compreender a etapa de imersão das células numa solução do composto, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-16 ou de um seu derivado aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
  22. 22. Utilização de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-16, caracterizada pelo facto de essa composição ser utilizada em ligação com um trans-. plante de um órgão ou para a preservação de produtos do sangue. '
  23. 23. Utilização de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-16, para . a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de . essa composição ser utilizada como uma componente da imunoterapia para o tratamento do cancro. Lisboa, 20 de Março de 2008 15
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