PT1261622E

PT1261622E - Lh purificada

Info

Publication number: PT1261622E
Application number: PT01907476T
Authority: PT
Inventors: Gianfranco Paradisi; Mara Rossi; Laura Scaglia
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2007-04-30
Also published as: US7053054B2; UA78676C2; CY1108056T1; HUP0301814A2; DE60127100T2; UA92145C2; CN100480258C; EA200200893A1; SK287041B6; BR0108553A; US20060079460A1; AU3543601A; ES2278722T3; ZA200206108B; KR20030001358A; DK1261622T3; BRPI0108553B1; NO328693B1; EP1777231A3; BR122012018280B8

Description

1

DESCRIÇÃO "LH PURIFICADA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo de purificação da hormona luteinizante (LH), em particular a purificação da LH recombinante (r-LH) a partir de uma amostra de LH recombinante em bruto, compreendendo a utilização combinada de cromatografia de troca iónica com uma resina de troca aniónica e HPLC de fase reversa. A Hormona Luteinizante (LH) é uma gonadotrofina secretada no lóbulo anterior da pituitária em conjunto com outra gonadotrofina, a hormona estimulante dos foliculos (FSH). Estas hormonas são heterodimeros e consistem de subunidades α e β ligadas de forma não covalente.

Estas gonadotrofinas estimulam o funcionamento normal das gónadas e a secreção de seis hormonas, tanto em homens como em mulheres. Em mulheres, a hormona estimulante dos foliculos estimula o desenvolvimento e maturação dos foliculos e óvulos. À medida que os foliculos se desenvolvem produzem estrogénio em quantidades cada vez maiores que, a meio do ciclo, estimulam a libertação de LH. Isto causa a ruptura dos foliculos com ovulação e converte o foliculo no corpo lúteo que segrega progesterona. Nos homens, a hormona luteinizante estimula as células intersticiais dos testículos para segregar testosterona, que por seu lado tem um efeito directo nos tubos seminíferos. As substâncias gonadotroficas com actividade luteinizante ou estimuladora dos foliculos, ou ambas, são 2 utilizadas no tratamento de distúrbios de fertilidade, principalmente em indivíduos do sexo feminino mas também em indivíduos do sexo masculino. Tais substâncias incluem a gonadotrofina coriónica que possui actividade de LH e gonadotrofinas para a menopausa humana que possuem ambas as actividades LH e FSH. Uma hormona luteinizante humana, derivada de DNA recombinante (rechLH) está a ser investigada como uma alternativa à gonadotrofina coriónica ou para administração em conjunção com a FSH. Vários métodos têm sido utilizados para isolar e purificar a LH, tais como a troca iónica, filtração em gel e a cromatografia por imunoafinidade (Jack, G.W., Blazek, R., James, K., Boyd, J.E. & Micklem, L.R. A produção automatizada por cromatografia de imunoafinidade das hormonas glicoproteicas da pituitária humana, tirotropina, folitropina e lutropina. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45-58, 1987). A cromatografia de troca iónica tem sido utilizada para o isolamento destas hormonas, no entanto, este método parece ter vários problemas interrelacionados causados pela considerável heterogeneidade de carga da LH no tecido pituitário. Primeiro, pelo facto de estas glicoproteínas e a FSH terem cargas sobreponíveis, a sua separação completa é difícil e trabalhosa. Segundo, a purificação destas hormonas como fracções únicas pode ser difícil (Stockell Hartree, A-, Thomas, M., Furnival, B.E. , Burns, T.W. & Langley, P. . As actividades estimulantes da tiróide e lipolíticas das preparações purificadas de hormona estimulante da tiróide humana. Journal of Endocrinology 53, 95-100, 1972). Como resultado, certas formas carregadas da hormona podem ser seleccionadas durante a purificação, de acordo com o sugerido no caso da LH (Storring, P.L. Zaidi, A.A., Mistry, 3 Y.G. Lindberg, M., Stenning, B.E. & Diczfalusy, E.. A comparison of preparations of highly purified human pituitary luteinising hormone: differences in the luteinizing hormone potencies as determíned by in vivo bioassays, in vitro bioassay and immunoassay. Acta Endocrinologica 101, 339-347, 1982). A purificação selective irá complicar adicionalmente a caracterização destas formas heterogéneas, incluindo a análise estrutural dos seus componentes hidratos de carbono. A variação no conteúdo em oligossacáridos aniónicos que contêm grupos sialilo e sulfato pode ser a prinicipal causa de heterogeneidade na LH. O documento WO 90/02757 diz respeito à purificação de LH bovina recombinante, utilizando os passos de cromatografia de troca iónica com uma resina fortemente catiónica (Trisacryl M-SP) assim como uma HPLC reversa; não é dada nenhuma orientação para utilizar a troca iónica com uma resina de troca aniónica de modo a melhorar a bioactividade especifica da LH. O documento WO 98/20039 divulga um processo de separação e purificação da FSH e da LH. O processo de purificação reivindicado inclui uma cromatografia de troca iónica, uma cromatografia de afinidade e uma segunda cromatografia de troca iónica O documento de Hakola K. et al., Recombinant forms of rat and human luteinising hormone and follicle-stimulating hormone: Comparison of functions in vitro and in vivo; Journal of Endocrinology 158 (1998), 441-448, refere-se a uma LH recombinante humana altamente purificada (99,9% de 4 pureza e 15.900 Ul/mg por bioensaio in vivo), sem fronecer informação sobre a sua preparação.

Foram descritos métodos convencionais de fraccionamento para a preparação da hormona luteinizante (LH) da urina humana com uma potência de 982 Ul/mg por ensaio biológico e 1.166 UI por radioimunoensaio (Donini S. & Donini P. Acta endocr., Copenh. 63, Suppl. 142, 257-277, 1969). Foi utilizado um imunoabsorvente de antisoro de coelho para a gonadotrofina coriónica humana purificada (HCG) para purificar a LH das fracções prinicipal e colateral, obtidas durante a preparação da hormona estimuladora do foliculo (FSH) a partir da urina de mulheres na menopausa (van Hell, H., Schuurs A.H.W.M. & den Hollander, F.C.. Em Symposium on gonadotrophins, New York, 17 Junho de 1971. Eds. B.B. Saxena, C.G. Beling & H.M. Gandy. New York: John Wiley & Son, Inc, 1972). A preparação obtida tinha potencies de LH mais elevadas, mas também proporções FSH:LH superiores que aquelas preparadas por Donini & Donini (1969) . A LH recombinante tem a vantagem de ser desprovida de outras hormonas gonadotróficas, tais como a FSH e TSH. A preparação em bruto da LH recombinante contém, no entanto, todas as outras proteínas e contaminantes da célula utilizados na sua produção recombinante, sendo altamente desejável um método para conseguir uma pureza absoluta da hormona luteinizante recombinante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi verificado que uma preparação em bruto de LH, derivada de uma amostra do meio de cultura obtido após o 5 processo recombinante ou a partir de um concentrado bruto de urina de mulheres em pós-menopausa, pode ser purificada a um tal grau que a LH resultante é praticamente isenta de proteínas e/ou outros contaminantes contidos na preparação em bruto de LH. Dependendo do material iniciador, a proteina e outros contaminantes são de origem humana (material iniciador: gonadotrofinas da menopausa humana) ou de origem num célula hospedeira, por exemplo, CHO no caso de uma célula hospedeira CHO. 0 processo de purificação é baseado na utilização da cromatografia de troca iónica com uma resina de troca aniónica e HPLC em fase reversa. A utilização adicional, opcional, de uma coluna de permeação em gel permite a remoção de quaiquer vestígios residuais de contaminantes a da preparação de LH pura. São obtidos resultados óptimos quando são efectuados dois passos da cromatografia de troca iónica e dois passos da HPLC em fase reversa. 0 proceso da invenção pode ser utilizado para a purificação da LH recombinante, partindo de uma amostra de um meio de cultura obtido após o processo de recombinação, tal que a LH altamente purificada resultante é praticamente livre, por exemplo, de proteínas FBS, normalmente contidas no meio de cultura, ácidos nucleicos ou outros contaminantes presentes nas células hospedeiras utilizadas para o processo recombinante. 0 processo da invenção pode igualmente ser utilizado para a purificação da LH urinária, partindo de um concentrado em bruto da urina pós-menopausica e para a purificação da LH de outras espécies, particularmente de 6 mamíferos, incluindo, por exemplo, bovina, equina, porcina, ovina, de rato, de murganho e de macaco. É, deste modo, um objectivo da presente invenção proporcionar um processo para a purificação da LH a partir de uma amostra compreendendo a utilização combinada da cromatografia de troca iónica com uma resina de troca aniónica e da HPLC de fase reversa. 0 processo compreende os passos de sujeição da amostra (se necessário, concentrada) a cromatografia de troca iónica com uma resina de troca aniónica e sujeição do eluato a HPLC de fase reversa. Pode ser realizado, adicionalmente, um passo excedente de aplicação do eluato numa coluna de permeação em gel.

Dependendo da pureza da preparação inicial, a cromatografia de troca iónica com uma resina de troca aniónica e a HPLC de fase reversa são, preferencialmente, realizadas duas vezes, de modo a obter resultados óptimos para o processo de purificação. Tal processo pode compreender os passos de: (a) eluição da amostra através de uma coluna de cromatografia de troca iónica em DEAE Sepharose; (b) eluição através de uma coluna de cromatografia de troca iónica em Q- Sepharose; (c) eluição através de uma coluna de HPLC de fase reversa Sílica Cl 8;

(d) nova eluição através de uma coluna de HPLC de fase reversa Sílica C18 [opcionalmente 7 com um eluente diferente a partir do passo c) ] ; e (e) eluição atrvés de uma coluna de permeação em gel.

Numa forma de realização preferida da invenção, a eluição através de cromatogradia de troca iónica em DEAE Sepharose é realizada num tampão de fosfato de sódio a um pH 8. A eluição através da cromatografia de troca iónica em Q-Sepharose é, preferencialmente, efectuada em tampão de acetato de amónio a pH 7,5. 0 passo (c) de HPLC de fase reversa é, preferencialmente, efectuado com 2-propanol/acetato de amónio como fase móvel. 0 passo (d) de hplc de fase reversa é, preferncialmente, realizado com 2-propanol/Tris-HCl como fase móvel. A LH da presente invenção é, preferencialmente, LH humana e, de um modo mais preferido, é LH humana recombinante, derivando do meio de cultura de células de mamíferos (preferencialmente células CHO) utilizadas no processo recombinante. É um objectivo adicional da invenção proporcionar uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da LH recombinante, como preparada pelo processo recombinante como descrito acima, junatmnete com excipientes adequados, tais como sacarose, necessária à estabilização do produto liofilizado. A composição farmacêutica da LH recombinante é particularmente adequada para administração subcutânea.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método para a purificação da LH, em particular, para a purificação de uma LH recombinante a partir de uma preparação em bruto no meio de cultura do processo recombinante. A r-hLH é obtida com um elevado grau de pureza e actividade especifica elevada, praticamente isenta de proteínas do Soro Bovino Fetal (FBS), se presentes no meio de cultura e de ácidos nucleicos ou outros contaminantes contidos nas células hospedeiras utilizadas no processo recombinante. A invenção é destinada à utilização com materiais biológicos, particularmente misturas em bruto contendo LH e outras proteínas contaminantes aqui referidas como amostras de material iniciador. Os exemplos abaixo descritos em detalhe utilizam amostras de material iniciador contendo r-hLH, obtida do meio de cultura sobrenadante de um bioreactor. De um modo alternativo, a amostra é a Gonadotrofina Menopáusica Humana (hMG), um concentrao em bruto de urina pós-menopausica. A amostra é constituída por meio de cultura sobrenadante, recolhido de freco da cultura de células, perfundido através de um bioreactor. É clarificado, de um modo preferido, por filtração. A solução em bruto pode depois ser concentrada, se necessário, e sujeita a ultrafiltração para remover material contendo pesos moleculares inferiores a 10. A ultrafiltração também 9

permite a alteração do tampão para fosfato de sódio, pH 8,0.

Após os passos preliminares, a amostra é então sujeita a cromatografia de troca iónica com uma resina de troca aniónica e a HPLC de fase reversa, as quais são, de um modo preferido, realizadas por duas vezes. O primeiro passo de permuta iónica é, preferencialmente, realizado com DEAE Sepharose. Este é, essencialmente, um passo de "passagem" da LH no qual uma grande parte das proteínas não-LH são eliminadas. O segundo passo de troca iónica é, preferencialmente, realizado com uma coluna Q-Sepharose. Este é também um passo de "passagem" da LH e é designado para remover o DNA potencial e contaminantes proteicos do meio ou da célula hospedeira. Numa forma de realização preferida, este passo é realizado a cerca de 5 °C, eluindo com tampão de acetato de amónio a pH 7,5. A cromatografia de fase reversa em Silica C18 também é, preferencialmente, realizada por duas vezes e é eficaz na remoção de quantidades vestigiais de FBS, proteínas celulares e contaminantes de endotoxina. O primeiro passo de HPLC é, preferencialmente, realizado com 2-propanol/acetato de amónio como fase móvel. O segundo passo de HPLC de fase reversa é, preferencialmente, realizado utilizando 2-propanol/Tris-HCl como fase móvel. A solução retida é, então, concentrada e pode ser recuperada com hidrogenocarbonato de amónio, pH 8,0. o produto concentrado é, de um modo preferido, sujeito a cromatografia de permeação em gel em Sephacryl S100 HR. Neste passo, é conseguida uma separação com base no tamanho molecular, eluindo com hidrogenocarbonato de amónio pH 8,0 sendo o eluato depois submetido, preferencialmente, a filtração 10 para remover contaminantes virais, depois uma ultrafiltração em membranas com um limite de exclusão de 10 KD em tampão de fosfato de sódio, pH 8,0. Após a filtração, o volume de LH purificada é, preferencialmente, armazenado em frascos esterilizados a baixa temperatura. EXEMPLO 1

Reagentes Ácido acético (glacial), grau analítico (Ph. Eur.)

Acetato de amónio, grau analítico

Hidrogenocarbonato de amónio, grau analítico (B.P.)

Fosfato de sódio dibásico, grau analítico Ácido clorídrico, grau analítico (Ph. Eur.) Ácido fosfórico, grau analítico (Ph. Eur.) 2-propanol, grau analítico (Ph. Eur.)

Cloreto de sódio, grau analítico (Ph. Eur.)

Fosfato de sódio monobásico, grau analítico

Pastilhas de hidróxido de sódio, grau analítico (Ph. Eur.)

Ácido trifluoroacético (TFA), grau HPLC

Tris-(hidroximetil)aminometano, grau analítico Água para injecção (WFI) (Ph. Eur.)

Diagrama de fluxo do resumo do processo de purificação A Tabela 1 é um diagrama de fluxo resumindo o processo de purificação da r-hLH, salientando os princípios de operação de cada um dos passos intermediários. 11

Tabela 1: Diagrama de fluxo resumindo o processo de purificação da r-hLH

MEIO DE CULTURA DO BIOREACTOR PASSO I Ultrafiltração (10 KD) COLHEITA DE r-hLH EM BRUTO CONCENTRADA PASSO II Colheita da r-hLH em bruto, concentrada, armazenada DEAE SEPHAROSE CL-6B Fracção não ligada contém r-hLH Ultrafiltração (100 kD) Ultrafiltração (10 kD) PASSO III Q-SEPHAROSE FF Fracção não ligada contém r-hLH PASSO IV 12 RP-HPLC Eluato contém r-hLH PASSO V 2° RP-HPLC Eluato contém r-hLH Ultrafiltração (10 kD) PASSO VI SEPHACRYL SI00 HR Fracção não ligada contém r-hLH Ultrafiltração (10 kD) Retido contém r-hLH SOLUÇÃO VOLUMOSA DE r-hLH 12

Clarificação, concentração, diálise e filtração das colheitas (Passo I)

Neste passo (Passo I) o tampão é alterado para ser de composição controlada e ser conseguida uma concentração preliminar. Este passo é realizado a cerca de +5 °C e é repetido individualmente para cada colheita durante o ciclo de produção do bioreactor. Um intervalo de temperatura preferido é 5 ± 3 °C. (i) Clarificação das colheitas

Aquando da recepção do meio de cultura recolhido de fresco de um bioreactor, o material é, preferencialmente, processado, começando pela clarificação da solução sobrenadante por filtração. (ii) Concentração/diálise das colheitas

As membranas, armazenadas em hidróxido de sódio 0,05 M entre cargas, são lavadas com WFI até o pH diminuir a aproximadamente 8 . O tampão de calibração, fosfato de sódio 0,025 M pH 8, substitui a água. Uma vez condicionada a solução de r-hLH em bruto do bioreactor, é concentrada e dialisada para remover material contendo pesos moleculares inferiores a 10 kD (limite de exclusão da membrana de 10 kD). O concentrado resultante é armazenado a cerca de - 15 °C. 13

Cromatografia de troca iónica em Sepharose DEAE CL-6B (Passo II) 0 passo de cromatografia é um passo de "passagem" da r-hLH, no qual uma grande parte das proteínas não-r-hLH são eliminadas e a solução é adicionalmente concentrada e dialisada. As fases de cromatografia em que o produto passa através da coluna, são realizados numa sala refrigerada.

(i) Cromatografia de troca iónica em Sepharose DEAE CL-6B A coluna é empacotada com uma resina de troca aniónica de carga fraca, Sepharose de dietilaminoetano 8DEAE), equilibrada no primeiro instante com fosfato de sódio 0,15 M pH 8. Um intervalo preferido de pH é 8+0,3. A coluna é depois condicionada com o tampão corrente, fosfato de sódio 0,025 M pH8. Um intervalo de pH preferido é 8+0,3. A solução de r-hLH é carregada na coluna através de um dispositivo de filtração, o qual se localiza na coluna como uma segurança. A coluna é alimentada com fosfato de sódio 0,025 M pH 8. Um intervalo de pH preferido é 8+0,3. O processo cromatográfico é controlado por espectrofotometria a 280 nm. O efluente a sair primeiro é desprezado até a linha de base passar a marca de absorvância de 5%. 14 A fracção não ligada contendo a r-hLH é recolhida até a linha de base ter diminuído até 10%. (ii) Ultrafiltração

Um dispositivo de ultrafiltração, equipado com uma membrana com limite de exclusão de 100 kD, armazenado em NaOH 0,05 M, é lavado com WFI até o pH do permeado ser aproximadamente 8. A água e substituída pelo tampão de calibração acetato de amónio 0,08 M, pH 7,5. Um intervalo de pH preferido é 7,5 ± 0,3. A solução de r-hLH obtida do passo de cromatografia de troca iónica é ultrafiltrada através da membrana de 100 kD e a fracção do permeado é recolhida. O ultrafiltro é lavado com alíquotas de acetato de amónio 0,08 M pH 7,5 e todas as fracções de lavagem são recolhidas na solução de permeado. (iii) Concentração/Diálise

Um dispositivo de ultrafiltração equipado com uma membrana com limite de exclusão de 10 kD, armazenado em NaOH 0,05 M, é lavado com WFI até o pH da fracção de permeado ser aproximadamente 8. A água é substituída pelo tampão de calibração, acetato de amónio 0,08 M pH 7,5. A solução de r-hLH é concentrada. O acetato de amónio 0,08 M pH 7,5 é adicionado ao retentado e a solução é 15 concentrada. A diálise é continuada até que o pH e a condutividade do retentado sejam os mesmos do tampão a entrar. 0 retentado resultante é recuperado.

Cromatografia de troca iónica em Q Sepharose de Fluxo Rápido (Passo III)

Este passo é também um passo de "passagem" da r-hLH é é concebido para remover o DNA potencial e contaminantes proteicos do meio ou da célula hospedeira. (i) Calibração da coluna 0 condicionamento da coluna é realizado com tampa corrente, tampão de acetato de amónio 0,08 M, pH 7,5. Um intervalo preferido de pH é 7,5 ± 0,3. (ii) Passo de purificação da r-hLH em Q-Sepharose

FF A solução de r-hLH é carregada atrav's de um dsipositivo de filtração, o qual se localiza na coluna de Q Sepharose como uma segurança. A coluna é posteriormente lavada com acetato de amónio 0,08 M, pH 7,5. O efluente que sai primeiro é desprezado até a linha de base passar a marca de absorvância de 5%. A fracção não ligada contendo a r-hLH é recolhida até que a linha de base tenha descido até 10%. 16 A solução de r-hLH do Passo III pode ser armazenada congelada, paea utilização subsequente. Se armazenada à temperatura e -15 °C ou abaixo, o intermediário r-hLH é descongelado a +5 ± 3 °C, tipicamente ao lngo de um período de 24 ± 8 horas antes de se submeter ao HPLC de fase reversa (Passo IV).

Primeiro HPLC preparativo de fase reversa (Passo IV)

Este passo, realizado à temperatura ambiente, é eficaz na remoção de quantidades vestigiais de FBS/proteína CHO e contaminantes de endotoxina. (i) Empacotamento da coluna e activação da resina A coluna é empacotada com sílica C18 de poro largo e, se nova, a resina C18 é condicionada com 2-propanol. (ii) Calibração da coluna A coluna é equilibrada com 2-propanol 12,4% p/p em tampão de acetato de amónio 0,05 M, pH 7. Um intervalo preferido de pH é 7 ± 0,2.

(iii) Ajustes de pH e volume da solução de r-hLH do passo III A solução de r-hLH é ajustada a pH 7 com ácido acético concentrado. Um intervalo preferido de pH é 7 ± 0,2. 17 0 volume da solução de r-hLH é depois ajustado pela adição de 2-propanol, de modo a obter uma concentração final de 2-propanol igual a 12,4% p/p. (iv) Filtração da solução r-hLH ajustada 0 dispositivo de filtração equipado com um filtro de 0,22 ym é lavado com 2-propanol 12,4% p/p em tampão de acetato de amónio 0,05 M, pH 7. Um intervalo preferido de pH é 7 ± 0,2. A solução de r-hLH ajustada é filtrada. O recipiente é lavado com aliquotas de 2-propanol 12,4% p/p em tampão de acetato de amónio 0,05 M, pH 7, filtrado e as fracçõeslavadas são armazenadas com a solução de r-hLH. Um intervalo preferido de pH é 7 ± 0,2. (v) Passo de purificação da r-hLH na primeira

coluna C18 de RP-HPLC A solução de r-hLH é carregada na coluna e a cromatografia é controlada por espectrofotometria UV a 280 nm. A coluna é alimentada com 2-propanol 12,4% p/p em tampão de acetato de amónio 0,05 M de pH 7 até que a A28o volte à linha de base em que a fracção não ligada é desprezada.

A eluição da r-hLH é subsequentemente realizada com uma fase móvel de 2-propanol/acetato de amónio 0,05 M 18 através de um gradiente linear de 2-propanol 14,7% a 20,7% p/p. A r-hLH é fraccionada quando a A28o começa a aumentar. Todas as fracções do pico da r-hLH cujas alturas são superiores a 20% da escala total são armazenadas.

Coluna do segundo HPLC de fase reversa preparativo (Passo V)

Este passo, realizado à temperatura ambiente, é eficaz na remoção de quantidades vestigiais de FBS/proteina CHO e contaminantes de endotoxina. (i) Empacotamento da coluna e activação da resina A coluna é empacotada com sílica C18 de poro largo e, se nova, a resina C18 é condicionada com 2-propanol. (ii) Calibração da coluna A coluna é equilibrada com 2-propanol 14,7% p/p em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 7. Um intervalo preferido de pH é 7 + 0,2. (iii) Ajustes de volume e pH da solução de r-hLH do Passo iv É adicionado tampão Tris-HCl 2 M, pH 7 à amostra de r-hLH de modo a reduzir a concentração em 2-propanol para aproximadamente a mesma que no tampão de caloibração da coluna (14,7% p/p). 19 A solução de r-hLH é ajustada a pH 7 com HC1 12 M. Um intervalo preferido de pH é 7 í 0,2.

(iv) Passo de purificação da r-hLH na segunda coluna C18 de RP-HPLC A solução de r-hLH é carregada na coluna e a cromatografia é controlada por espectrofotometria UV a 280 nm. A coluna é alimentada com 2-propanol a 14,7% em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 7. Um intervalo de ph preferido é 7 ± 0,2. A fracção não ligada é desprezada. A eluição da r-hLH é subsequentemente realizada com uma fase móvel de 2-propanol/Tris HC1 0,5 M através de um gradiente linear de 2-propanol desde 14,7% a 20,7% p/p. A r-hLH é fraccionada quando a A280 começa a aumentar. Todas as fracções do pico de r-hLH cujas alturas são superiores a 20% da escala total são armazenadas. (v) Diálise A solução de r-hLH do passo da segunda C18 RP-HPLC é diluída com WFL. De um modo preferido, são utilizados 8 volumes de WFI. A solução de r-hLH diluída é dialisada por ultrafiltração numa membrana de 10 kD (ver página 7, passo VI) contra WFI. São subsequentemente 20 adicionadas aliquotas de hidrogenocarbonato de amónio 0,5 M, pH 8 e a diálise é continuada até que as caracteristicas do tampão de hidrogenocarbonato de amónio sejam satisfeitas. A solução de retentado é concentrada para um volume final de, aproximadamente, 1 L e recuperada. O ultrafiltro é lavado com hidrogenocarbonato de sódio 0,5 M, pH 8 e as fracções lavadas com a ultrafiltração são armazenadas com o retentado e opcionalmente, mais concentradas. Esta concentração adicional é dependente da dimensão da coluna utilizada no próximo passo, i.e., Passo VI.

Cromatografia de Permeação em Gel em Sephacryl S100 HR e ultrafiltração (Passo VI)

Neste passo, é conseguida uma separação com base no tamanho molecular e a solução é sujeita a ultrafiltração. Todas as operações realizadas neste passo são desencadeadas a cerca de +5 °C. Um intervalo de temperatura preferido é +5 °C ± 3. (i) cromatografia de permeação em gel em

Sephacryl S100 HR A coluna é empacotada com Sephacryl S100 HR e é equilibrada na primeira instância com WFI. A coluna é depois equilibrada com hidrogenocarbonato de amónio 0,5 M pH 8. 21 A coluna é alimentada com hidrogenocarbonato de amónio 0,5 M pH 8. O processo cromatográfico é controlado por espectrofotometria a 280 nm. A r-hLH é fraccionada quando a A2so começa a aumentar. Todas as fracções do pico de r-hLH cujas alturas são superiores a 20% da escala total, são armazenadas. A solução de r-hLH, eluida da coluna Sephacryl S100 HR é, depois, preferencialmente passada através de um filtro, por exemplo, Virosolve®, para remover os contaminantes virais.

(ii) Diálise e conventração da r-hLH

As membranas (membranas de ultrafiltração de 10 kD), armazenadas em hidróxido de sódio 0,05 M entre corridas de purificação, são lavadas com WFI até o pH reduzir até, aproximadamente, 8. A solução de r-hLH diluida é dialisada (por membranas de ultrafiltração de 10 kD) contra WFI. São subsequentemente adicionadas aliquotas de tampão de fosfato de sódio 0,01 M, pH 8 e a diálise é continuada até as caracteristicas do tampão de fosfato de sódio serem satisfeitas.

Se necessário, a solução do retentado é concentrada para um volume final de, aproximadamente, 500 mL e recuperada. O ultrafiltro é lavado com tampão de fosfato de sódio 0,01 M, pH 8 e as fracções lavadas do ultrafiltro são armazenadas com o retentado. 22

Pode ser realizado um passo opcional de concentração adicional da LH, dependendo da condição seleccionada para o armazenamento. A solução de r-hLH é filtrada e o filtrado é recolhido num recipiente esterilizado. 0 volume de r-hLH purificada é, preferencialmente, armazenado em frascos estéreis a cerca de -15 °C.

Reagentes, tampões, eluentes e químicos

Resinas cromatográficas

As seguintes resinas cromatográficas são frequentemente empregues no processo de purificação. Podem ser igualmente empregues resinas equivalentes no processo de purificação.

Passo II: DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia)

Passo III: Q-Sepharose Fluxo Rápido (Pharmacia)

Passo IV: Sílica C18 RP-HPLC (Waters)

Passo V: Sílica C18 RP-HPLC (Waters)

Passo VI: Sephacryl S100 HR (Pharmacia)

Os fornecedores são:

Amersham Pharmacia Biotech,

Bjõrkgatan 30 S-751 84, Uppsala 23

Sweden

Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA 01757 USA

RESULTADOS

Actividade Biológica A actividade biológica de diferentes cargas de r-LH após a purificação com o método da presente invenção é dsecrita na Tabela 2. A concentração de proteina (mg de proteina LH/mL) foi determinada por espectrofotometria a 276,5 nm, utilizando a absortividade derivada experimentalmente com base na análise da sequência de aminoácidos a=0,812. A actividade média especifica da preparação de r-LH é particularmente eivada, quantificando cerca de 25.000 Ul/mg (de proteina de LH). 24

Tabela 2

Actividade especifica de cargas volumosas de r-hLH N° carga Act. Espec. [UI/mg] BLCA 9802 28.173 BLCA 9803 25.819 BLCA 9804 27.472 BLCA 9805 31.229 BLCA 9806 26.995 BLCA 9808 26.279 BLCA 9809 20.522 BLCA 9810 22.275 BLCA 9811 27.642 BLCA 9812 29.941 BLCA 9813 28.345 BLCA 9814 27.581 BLCA 9815 24.541

Formulações

As formulações liofilizadas foram desenvolvidas com a LH recombinante altamente purificada da presente invenção.

Como um exemplo típico, foi preparada uma formulação liofilizada a uma intensidade de 75 UI em frascos DIN 2R utilizando a sacarose como excipiente (Tabela 3) , a qual resultou como estável a 4 °C durante vários meses. 25

Tabela 3

Nome dos Ingredientes Fórmula unitária Ingrediente activo LH humana recombinante 3,4 mcg (75 UI) Outro ingrediente Sacarose 47,75 mg Tween 20 0,05 mg Fosfato dissódico di- 0,825 mg hidratado Fosfato monossódico mono- 0,052 mg hidratado

Lisboa, 23 de Março de 2007

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a purificação de LH a partir de uma amostra compreendendo a utilização de: • Cromatografia de troca iónica com uma resina de troca aniónica e • HPLC de fase reversa.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo os passos de: (a) sujeição da amostra a cromatografia de troca iónica para produzir um primeiro eluato; (b) sujeição do primeiro eluato a HPLC de fase reversa para produzir um segundo eluato; e (c) aplicação do segundo eluato numa cromatografa de permeação em gel.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a cromatografia de troca iónica e a HPLC de fase reversa são realizadas duas vezes.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo os passos de: (a) eluição da amostra através de uma coluna DEAE Sepharose para cromatografia de troca iónica; (b) eluição através de uma coluna de Q-Sepharose para cromatografia de troca iónica; (c) eluição através de uma coluna Silica C18 para HPLC de fase reversa; 2 (d) eluição adicional através de uma coluna Silica C18 para HPLC de fase reversa e (e) eluição através de uma coluna de permeação em gel.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a eluição através da cromatografia de troca iónica em DEAE Sepharose é realizada em tampão de fosfato de sódio a pH 8.
6. Processo de acordo com a reivindicação4, em que a eluição através da cromatografia de troca iónica em Q- Sepharose é realizada em tampão de acetato de amónio a pH 7,5.
7. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que o passo (c) de HPLC de fase reversa é realizado com 2- propanol/acetato de amónio como fase móvel.
8. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que o passo (d) de HPLC de fase reversa é realizado com 2- propanol/Tris-HCl como fase móvel.
9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a LH é LH humana.
10. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra é um meio de cultura de células CHO.
11. hLH recombinante contendo uma bioactividade especifica de desde 20522 a 31229 Ul/mg.
12. hLH recombinante de acordo com a reivindicação 11 contendo uma bioactividade especifica de cerca de 25000 Ul/mg. 3
13. Utilização da hLH recombinante de acordo com a reivindicação 11 ou 12 para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio de fertilidade.
14. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da hLH recombinante de acordo com a reivindicação 11 ou 12 e seus excipientes adequados.
15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, em que o excipiente é a sacarose.
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, compreendendo adicionalmente Tween 20, fosfato dissódico di-hidratado e fosfato monossódico mono-hidratado.
17. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, para administração subcutânea. Lisboa, 23 de Março de 2007