PL211907B1 - Komórki ekspresjonujące antygeny nowotworowe, sposób ich otrzymywania, ich zastosowanie oraz zawierająca je szczepionka przeciwnowotworowa - Google Patents
Komórki ekspresjonujące antygeny nowotworowe, sposób ich otrzymywania, ich zastosowanie oraz zawierająca je szczepionka przeciwnowotworowaInfo
- Publication number
- PL211907B1 PL211907B1 PL367617A PL36761702A PL211907B1 PL 211907 B1 PL211907 B1 PL 211907B1 PL 367617 A PL367617 A PL 367617A PL 36761702 A PL36761702 A PL 36761702A PL 211907 B1 PL211907 B1 PL 211907B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- antigens
- cta
- adhapi
- pbmc
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 21
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 title description 18
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 title description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 369
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 141
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 141
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 139
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 90
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 42
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 81
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 108010033737 Pokeweed Mitogens Proteins 0.000 claims description 21
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 15
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims description 12
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 6
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940037642 autologous vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 229940075628 hypomethylating agent Drugs 0.000 abstract description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000011987 methylation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 15
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 15
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000010968 computed tomography angiography Methods 0.000 description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 13
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 11
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 11
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 11
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 8
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 8
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 6
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 6
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 6
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 5
- 241000551546 Minerva Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 5
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 4
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 3
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 3
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 3
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 3
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 108010086662 phytohemagglutinin-M Proteins 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 2
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 2
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229960003603 decitabine Drugs 0.000 description 2
- 239000012649 demethylating agent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 241001034435 Brevipalpus obovatus Species 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100039361 Chondrosarcoma-associated gene 2/3 protein Human genes 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 239000012650 DNA demethylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940045805 DNA demethylating agent Drugs 0.000 description 1
- 230000035131 DNA demethylation Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000745414 Homo sapiens Chondrosarcoma-associated gene 2/3 protein Proteins 0.000 description 1
- 101001066268 Homo sapiens Erythroid transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 101000621309 Homo sapiens Wilms tumor protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 description 1
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 description 1
- 102100034640 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Human genes 0.000 description 1
- 108050007154 PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710173693 Short transient receptor potential channel 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710155955 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 208000037842 advanced-stage tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001335 demethylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 102000046689 human FOLH1 Human genes 0.000 description 1
- 102000048834 human GATA1 Human genes 0.000 description 1
- 102000046004 human WT1 Human genes 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229940030325 tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
- C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/13—B-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/41—Vertebrate antigens
- A61K40/42—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/52—CD40, CD40-ligand (CD154)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/59—Lectins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Niniejszy wynalazek związany jest z medycyną, w szczególności produktami, substancjami i kompozycjami stosowanymi do leczenia organizmów ludzkich i zwierzęcych, a dokładniej do diagnozy, zapobiegania i leczenia nowotworów. Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto szczepionek przeciwnowotworowych oraz sposobu ich otrzymywania.
Tło wynalazku
W ostatnim czasie zidentyfikowano kilka antygenów związanych z nowotworami (TAA), konstytutywnie wytwarzanych przez komórki nowotworowe o różnym typie histologicznym (Renkvist N. et al., Cancer Immunol. Immunother., 50:3-15, 2001). Niektóre z antygenów TAA mogą dostarczać wielu immunodominujących antygenów peptydowych rozpoznawanych w zestawieniu z określonymi haplotypami antygenów układu zgodności tkankowej (HLA) klasy I przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL) CD8+ (Renkvist N. et al., Cancer Immunol. Immunother., 50:3-15, 2001); co więcej, wybrane antygeny TAA, takie jak na przykład MAGE (Jager E. et al., J. Exp. Med, 187:265-270, 1998), NY-ESO-1 (Jager E. et al., J. Exp. Med., 187:265-270, 1998), SSX (Tureci O. et al. Cancer Res., 56(20):4766-72, 1996), tyrozynaza (Topalian S.L. et al., J. Exp. Med, 183:1965-1971, 1996), Melan-A/MART-1 (Zarour H.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:400-405, 2000), zawierają również epitopy rozpoznawane w zestawieniu z określonymi haplotypami HLA klasy II przez limfocyty T typu CD4+, będąc tym samym zdolne do wywoływania humoralnej odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw antygenom TAA (Wang R.F., Trends Immunol., 22:269-276, 2001).
Zidentyfikowano różne klasy antygenów TAA, które mogą odgrywać istotną rolę w terapii nowotworów:
i) antygeny nowotworu jądra (CTA), wytwarzane przez nowotwory o różnym typie histologicznym, lecz nie wytwarzane przez zdrowe tkanki inne niż jądra i łożysko, takie jak MAGE, GAGE, SSX SART-1, BAGE, NY-ESO-1, XAGE, TRAG-3 i SAGE; niektóre z nich reprezentują złożone rodziny (Traversari C., Minerva Biotech., 11:243-253, 1999);
ii) antygeny specyficzne dla procesu różnicowania, wytwarzane w zwykłych i nowotworowych melanocytach, takie jak tyrozynaza, Melan-A/MART-1, gp100/Pmel17, TRP-1/gp75, TRP-2 (Traversari C., Minerva Biotech., 11:243-253, 1999);
iii) antygeny o zwiększonej ekspresji w komórkach nowotworów złośliwych o różnym typie histologicznym, ale wytwarzane również w przypadku ich form łagodnych, jak na przykład PRAME (Ikeda H. Et al., Immunity, 6:199-208, 1997), HER-2/neu (Traversari C., Minerva Biotech., 11:243-253, 1999), CEA, MUC-1 (Monges G.M. et al., Am. J. Clin. Pathol., 112:635-640, 2001);
iv) antygeny powstające w wyniku mutacji punktowych w genach kodujących powszechnie występujące białka, takie jak MUM-1, β-katenina, HLA-A2, CDK4 i kaspaza 8 (Traversari C., Minerva
Biotech., 11:243-253, 1999);
v) antygeny wirusowe (Traversari C., Minerva Biotech., 11:243-253, 1999).
Oprócz antygenów TAA, do elementów komórkowymi niezbędnych do efektywnego wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej i rozpoznania antygenów przez limfocyty T gospodarza należą antygeny HLA klasy I i II oraz cząsteczki kostymulujące/dodatkowe (np. CD40, CD54, CD58, CD80, CD81) (Fleuren G.J. et al., Immunol. Rev., 145:91-122, 1995).
Spośród znanych klas antygenów TAA, antygeny CTA są, ze względu na ich ograniczoną ekspresję w zdrowych tkankach i znaną immunogenność in vivo w żywych organizmach, w szczególności ssaczych, w tym ludzkich, szczególnie dobrymi kandydatami do zastosowania w aktywnej immunoterapii pacjentów z chorobami nowotworowymi, (Jager E. et al., J Exp. Med., 187:265-270, 1998, Reinolds S.R. et al., Int. J. Cancer, 72: 972-976, 1997). Jednak, niejednorodna ekspresja specyficznych antygenów CTA w zmianach nowotworowych u różnych pacjentów ogranicza ich biologiczne zastosowanie w produkcji terapeutycznych szczepionek ukierunkowanych na antygeny CTA. Istotnie, w komórkach nowotworów złośliwych różnych pacjentów mogą być wytwarzane jedynie niektóre antygeny CTA (Sahin U. et al., Clin. Cancer Res., 6:3916-3922, 2000), których ekspresja jest dodatkowo hamowana (Lethz B. et al., Melanoma Res., 7: S83-S88, 1997) i/lub heterogenna (dos Santos N. R. et al., Cancer Res., 60:1654-1662, 2000); specyficzna ekspresja antygenów CTA w ramach poszczególnych zmianach nowotworowych również zastała odnotowana (Jungbluth A.A. et al., Br. J. Cancer, 83:493-497, 2000). Te przypadki, które mogą zachodzić in vivo pojedynczo lub jednocześnie, są też prawdopodobną przyczyną niskiej immunogenności komórek nowotworów złośliwych sprzyjającą rozwojowi choroby (Speiser D.E. et al., J. Exp. Med., 186:645-653, 1997) i mogą prowadzić do selekcji
PL 211 907 B1 immunologicznej in vivo komórek nowotworowych, podczas leczenia immunologicznego skierowanego przeciw specyficznym antygenom CTA, i powstawania klonów nie wytwarzających poszczególnych CTA. W związku z powyższym, metody leczenia, które są nastawione na wywołanie odpowiedzi immunologicznej względem różnych epitopów jednego antygenu CTA nie mogą być zastosowane u wię kszej liczby pacjentów z chorobą nowotworową , ze wzglę du na moż liwość braku lub ograniczonej ekspresji danych antygenów CTA w ich nowotworowo-zmienionych tkankach; co więcej, wywoływanie odpowiedzi immunologicznej względem pojedynczego antygenu CTA in vivo może powodować powstawanie wariantów nowotworu, które nie posiadają tego antygenu i są skutecznie niewrażliwe na spowodowaną/zwiększoną leczeniem skierowaną przeciw niemu odpowiedź. Dodatkowym ograniczeniem w terapii wykorzystującej pojedynczy antygen CTA jest jego heterogenna ekspresja w różnych zmianach nowotworowych (Schultz-Thater E. et al., Br. J. Cancer, 83:204-208, 2000), co więcej prezentacja różnych immunogennych epitopów pojedynczego antygenu CTA przez specyficzne haplotypy HLA klasy I lub II, umożliwia jedynie leczenie pacjentów o pewnym, zdefiniowanym fenotypie HLA.
W celu częściowego uniknię cia tych ograniczeń , w ramach najnowszych technologii terapeutycznych używa się jako szczepionki więcej niż jednego epitopu immunogennego pochodzącego z jednego lub wielu antygenów CTA, lub też całego biał ka CTA (Conference on Cancer Vaccines, Eds. Ferrantini M. and Belardelli F., Rzym-Włochy, Listopad 15-16, 1999; http://www.cancerresearch.org).
Równie silnie odczuwalna jest potrzeba szczepionki przeciwnowotworowej, która nie posiadałaby niedociągnięć obecnych rozwiązań, w szczególności ich niskiej immunogenności, wywoływania przez nie selekcji immunologicznej in vivo, a jednocześnie dawałaby możliwość zastosowania w przypadku dużej populacji pacjentów chorych na nowotwory, nieograniczanej przez pojedynczy antygen CTA lub TAA, na który byłaby ukierunkowana i nieograniczanej do konkretnego typu antygenów HLA klasy I i/lub II.
Najnowsze badania in vitro pokazały, że ekspresja wszystkich spośród obecnie znanych genów kodujących antygeny CTA, które zostały przebadane, jest indukowana lub wzmacniana w komórkach nowotworowych pochodzących z różnych tkanek po potraktowaniu ich czynnikami hipometylującymi DNA (dos Santos N.R. et al., Cancer Res., 60:1654-1662, 2000; Weber J. et al., Cancer Res., 54:1766-1771, 1994). Indukcja genów dla antygenów CTA okazała się być trwała i mierzalna również kilka tygodni po zakończeniu leczenia. Badania te potwierdzają tezę, iż antygeny CTA należą do grupy antygenów TTA, które są całkowicie regulowane poprzez metylację DNA. Co więcej, potraktowanie komórek nowotworowych czynnikami hipometylującymi DNA powoduje również towarzyszącą indukcji genów dla CTA, trwałą stymulację ekspresji antygenów HLA klasy I o pożądanym haplotypie i kostymulujących/dodatkowych cząsteczek CD54 i CD58 (Coral S. et al., J Immunother., 22:16-24, 1999).
Pomimo obiecujących właściwości terapeutycznych, antygeny CTA posiadają kilka wad, takich jak to, że: zbadane dotychczas specyficzne antygeny CTA wykazują heterogenną ekspresję w różnych zmianach nowotworowych ze współistnieniem komórek nowotworowych wytwarzających i nie wytwarzających CTA; jedynie wybrane antygeny CTA spośród dotychczas poznanych mogą być wytwarzane w różnych zmianach nowotworowych, niezależnie od ich typu histologicznego; progowy poziom ekspresji specyficznych antygenów CTA w komórkach nowotworowych jest niezbędny do ich rozpoznania przez specyficzne wobec CTA limfocyty CTL; szczepienie względem specyficznych antygenów CTA wymaga u pacjentów odpowiedniego fenotypu HLA klasy I, a w przypadku wybranych antygenów CTA również klasy II.
Ze względu na swoje unikalne własności biologiczne, wybrane antygeny CTA są używane w różnych testach klinicznych, których celem jest wywołanie lub wzmocnienie specyficznej względem antygenów CTA odpowiedzi immunologicznej u pacjentów dotkniętych nowotworami o różnym typie histologicznym. Różne sposoby postępowania są obecnie stosowane do wprowadzania terapeutycznych antygenów CTA na poziomie klinicznym, lub do uzyskiwania silniejszych środków immunizujących na poziomie przedklinicznym (dos Santos N.R. et al., Cancer Res., 60:1654-1662, 2000; Weber J. et al., Cancer Res., 54:1766-1771, 1994). Jak warto zauważyć, głównie ze względu na ograniczenia techniczne i praktyczne, jedynie ograniczona ilość immunogennych epitopów specyficznych antygenów CTA, lub pojedynczych białek CTA w całości jest obecnie używana w celach terapeutycznych na poziomie klinicznym. Lista zawierająca główne sposoby podawania antygenów CTA pacjentom z chorobą nowotworową używanych obecnie lub hipotetycznie planowanych do wprowadzenia znajduje się poniżej; należałoby również podkreślić, iż identyczne metody są używane do podawania pacjentom antygenów TAA, które należą do innych klas poznanych dotychczas TAA oraz, iż inne środki wspo4
PL 211 907 B1 magające i/lub nośniki są niekiedy stosowane do wzmocnienia immunogenności czynników terapeutycznych.
• Syntetyczne peptydy reprezentują ce immunogenny epitop(y) jednego lub wielu antygenów CTA rozpoznawany przez komórki T CD8+ (Conference on Cancer Vaccines, Eds. Ferrantini M. and Belardelli F., Rzym-Włochy, Listopad 15-16, 1999; http://www.cancerresearch.org).
• peptydy syntetyczne reprezentują ce immunogenny epitop(y) jednego lub wielu antygenów CTA zamknięte w liposomach (Steller M.A. et al., Clin. Cancer Res., 4:2103-2109, 1998) • Cał e syntetyczne biał ko antygenu CTA (Conference on Cancer Vaccines, Eds. Ferrantini M. and Belardelli F., Rzym-Włochy, Listopad 15-16, 1999; http://www.cancerresearch.org).
• Rekombinowane wektory wirusowe zawierają ce epitopy jednego lub wielu antygenów CTA rozpoznawane przez komórki T CD8+ (Jenne L. et al., Trends Immunol., 22:102-107, 2001) • Wstrzeliwanie „nagiego” DNA do komórek (Park J.H. et al., Mol. Cells, 9:384-391, 1999).
• Autologiczne jednoją drzaste komórki krwi obwodowej (PBMC)/makrofagi z wstawionymi ex vivo syntetycznymi peptydami reprezentującymi epitopy jednego lub wielu antygenów CTA rozpoznawane przez komórki T CD8+ (Conference on Cancer Vaccines, Eds. Ferrantini M. and Belardelli F., Rzym-Włochy, Listopad 15-16, 1999; http://www.cancerresearch.org).
• Autologiczne komórki dendrytyczne z wstawionymi ex vivo syntetycznymi peptydami reprezentującymi epitopy jednego lub wielu antygenów CTA rozpoznawane przez komórki T CD8+ lub całym syntetycznym białkiem antygenu CTA, lub preparatami całych komórek nowotworowych (Conference on Cancer Vaccines, Eds. Ferrantini M. and Belardelli F., Rzym-Włochy, Listopad 15-16, 1999; http://www.cancerresearch.org; Jenne L. et al., Trends Immunol., 22:102-107, 2001).
• autologiczne komórki dendrytyczne transfekowane lub transdukowane ex vivo DNA/RNA kodującym cały antygen CTA lub łączone z całymi komórkami nowotworowymi (Jenne L. et al., Trends Immunol., 22:102-107, 2001).
• autologiczne limfocyty T transfekowane lub transdukowane ex vivo DNA/RNA kodują cym cał kowity antygen CTA.
Do autologicznych szczepionek przeciwnowotworowych, będących głównym obiektem niniejszego wynalazku, odnoszą się również liczne doniesienia patentowe. WO 99/42128 dotyczy metody oznaczania transkrypcji HLA lub ich profilu ekspresji w nowotworach litych, co pozwala na wybórodpowiedniego sposobu ich leczenia i/lub kontrolowania ich rozwoju. Celem tego wynalazku jest zahamowanie niektórych izoform HLA-G, i w konsekwencji zwiększenie naturalnej odpowiedzi immunologicznej. Metoda w nim opisana obejmuje oczyszczanie komórek z próbki guza, ich lizę i poddawanie lizatu działaniu przeciwciał skierowanych przeciw antygenom HLA klasy I.
W DE 29913522 dostarczono sposobu przygotowywania szczepionki nowotworowej, obejmującego poddawanie komórek guza pobranych od pacjenta ciśnieniu 200-9000 barów, w celu ich zabicia lub uszkodzenia bez naruszenia błon komórkowych, a następnie wstrzykiwanie ich z powrotem pacjentowi.
WO 00/02581 dotyczy zdolności telomerazy lub jej fragmentu do indukowania odpowiedzi komórek T na onkogen lub zmutowane białko lub peptyd supresorowy nowotworu. Wzmiankowane peptydy są stosowane jako szczepionka przeciwnowotworowa.
WO 00/18933 dotyczy konstruktów DNA odpowiedzialnych za ekspresję zmutowanych, funkcjonalnie nieaktywnych antygenów, których efektywność indukowania transkrypcji i translacji DNA i RNA lub generowania peptydów antygenowych pozostała niezmieniona. Pacjent dotknięty chorobą nowotworową jest leczony przez podanie RNA lub plazmidowego DNA kodującego zmieniony ludzki antygen związany z nowotworem, w szczególności antygen PSMA. W innym zastosowaniu, autologiczne komórki dendrytyczne, które zostały in vitro poddane działaniu RNA lub plazmidowego DNA są używane jako szczepionka.
WO 00/20581 dotyczy szczepionki przeciwnowotworowej zawierającej nowy, izolowany peptyd wiążący MAGE-A3, HLA klasy II. Peptyd może być również wykorzystany do selektywnego wzbogacania populacji limfocytów T w limfocyty T CD4+ specyficzne wobec tego peptydu. Wspomniane wzbogacone limfocyty są także używane jako szczepionka przeciwnowotworowa.
WO 00/25813 dotyczy uniwersalnego wiązania antygenu związanego z nowotworem (TAA) do cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej. Sposób leczenia obejmuje podawanie cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących TAA, które będą obrabiane przez komórki prezentujące antygen, aktywujące limfocyty cytotoksyczne i niszczące komórki prezentujące TAA. Identyfikacja innych, oprócz specyficznego hTERT peptydu, antygenów TAA jest możliwa dzięki skomplikowanej, komputePL 211 907 B1 rowo wspomaganej metodzie syntezy również komputerowo zaprojektowanych peptydów, których aktywność jest weryfikowana za pomocą testów biologicznych.
WO 00/26249 dotyczy fragmentów ludzkiego białka WT-1 lub ludzkiego białka gata-1. Wzmiankowane fragmenty peptydów są używane jako szczepionki przeciwnowotworowe, gdyż aktywują cytotoksyczne limfocyty T (CTL).
W US 6077519 opisano szczepionkę przeciwnowotworową zawierają c ą zestaw epitopów komórek T uzyskanych przez elucję epitopów z tkanki nowotworowej za pomocą kwasu.
W WO 00/46352 przedstawiono szczepionkę przeciwnowotworową zawierając ą ludzkie limfocyty T, które wytwarzają funkcjonalne cząsteczki CD86. Limfocyty T są uzyskiwane przez poddawanie komórek T co najmniej dwóm następującym po sobie bodźcom, z których w każdy zaangażowany jest co najmniej jeden aktywator (przeciwciało przeciw CD2, 3 lub 28) i cytokina (interleukina), która stymuluje namnażanie komórek T. Coral S. et al., Journal of Immunotherapy, 22(1): 16-24, 1999 donosi, że zdolność komórek czerniaka do wywoływania odpowiedzi immunologicznej i ich rozpoznanie przez cytotoksyczne komórki gospodarza zależą od obecności i poziomu ekspresji HLA klasy I, cząsteczek kostymulujących i antygenów związanych z czerniakiem (MAA) na powierzchni komórek nowotworowych. Zastosowanie 5-azo-2'deoksycytydyny (5-AZA-CdR) w aktywnej i/lub pasywnej specyficznej immunoterapii mogłoby dzięki jej rozprowadzaniu się po całym organizmie zwiększyć rozpoznanie komórek czerniaka przez komórki cytotoksyczne.
Momparler, Anticancer Drugs Apr., 8(4):358-68, 1997, zalicza 5-AZA-CdR do chemoterapeutyków.
Schichijo S. et al. Jpn. J. Cancer Res., 87:751-756, July 1996, aby lepiej zrozumieć mechanizmy ekspresji genów MAGE, sprawdzili czy demetylujący związek 5-AZA-CdR indukuje MAGE 1, 2, 3 i 6 w normalnych i nowotworowych komórkach limfoidalnych. Autorzy pokazali indukcję badanych antygenów CTA tylko w niektórych testowanych próbkach, dowodząc, że demetylacja nie jest wystarczającym bodźcem, aby doprowadzić do indukcji genów MAGE we wszystkich przypadkach. Nie podali żadnych potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania komórek prezentujących antygen nowotworowy (Cancer Testis Antygen CTA), obejmujący etapy, w których:
a) aktywuje się komórki PBMC pobrane od pacjenta,
b) hoduje się i ewentualnie rozwija się ex vivo zaktywowane komórki, znamienny tym, że
c) poddaje się wyhodowane i ewentualnie rozwinięte komórki działaniu 5-azo-2'deoksycytydyny czterokrotnie, co 12 godzin, a następnie zastępuje się połowę płynu hodowlanego świeżym płynem hodowlanym i prowadzi się hodowlę przez następne 48 godzin, tak, aby komórki te jednocześnie ekspresjonowały wielorakie antygeny nowotworowe (Cancer Testis Antigens).
W realizacji sposobu według wynalazku, pacjent jest pacjentem cierpiącym na chorobę nowotworową.
Korzystnie, wspomniane komórki są linią unieśmiertelnionych komórek limfoblastoidalnych B nowotworu związanego z zakażeniem wirusem Epsteina-Barr.
Korzystnie, wspomniane komórki są limfocytami B aktywowanymi mitogenem szkarłatki (PWM).
Korzystnie, wspomniane komórki są limfocytami B aktywowanymi CD40.
Korzystnie, wspomniane komórki są komórkami PBMC aktywowanymi fitohemaglutyniną PHA + rekombinowaną ludzką interleukiną 2 (rhiIL-2).
Korzystnie, wspomniane komórki są komórkami PBMC aktywowanymi fitohemaglutyniną PHA + rekombinowaną ludzką interleukiną 2 (rhiIL-2) + mitogenem szkarłatki (PWM).
Korzystnie, wspomniane komórki są komórkami dendrytycznymi, monocytami, makrofagami.
Kolejnym przedmiotem wynalazku są komórki stale i jednocześnie ekspresjonujące antygeny nowotworowe (CTA), przy czym komórki otrzymano sposobem według wynalazku a ekspresjonowany antygen został wybrany spośród: MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, NY-ESO-1, GAGE 1-6, SSX-2.
Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powyższych komórek i/lub ich składników komórkowych do wytwarzania leku do zapobiegania i leczenia chorób nowotworowych o różnym typie histologicznym, związanym z konstytutywną ekspresją jednego lub więcej antygenów nowotworowych.
Korzystnie, wspólne antygeny nowotworowe są immunodominującymi antygenami nowotworowymi.
Korzystnie, wspólne antygeny nowotworowe nie są immunodominujące.
Korzystnie, wspólne antygeny nowotworowe są antygenami CTA.
PL 211 907 B1
Korzystnie, komórki według wynalazku są gromadzone jako rezerwuar zebranych antygenów.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciwnowotworowa zawierająca komórki według wynalazku.
W korzystnej realizacji, szczepionka jest szczepionką autologiczną.
W innej korzystnej realizacji, szczepionka wedł ug wynalazku jest szczepionką alogeniczną .
Korzystnie, szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że wspomniane komórki są stosowane jako rezerwuar zebranych antygenów.
Korzystnie, szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że użyte są składniki komórkowe wspomnianych komórek.
Jak wspomniano powyżej, opracowano metodę otrzymywania komórek prezentujących antygen, obejmującą pobranie wzmiankowanych komórek z organizmu; aktywację wzmiankowanych pobranych komórek; hodowlę i fakultatywnie rozwijanie ex vivo wzmiankowanych zaktywowanych komórek, poddawanie wzmiankowanych wyhodowanych i fakultatywnie rozciągniętych komórek działaniu czynników hipometylujących, tak aby wzmiankowane komórki prezentowały jednocześnie wiele antygenów związanych z nowotworem. Komórki uzyskane według metody będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, jak również ich składniki komórkowe, samodzielnie lub wraz ze wspomnianymi komórkami, umożliwiają zapobieganie i leczenie, szczególnie w przypadku ssaków, w tym ludzi, nowotworów o różnym typie histologicznym, które konstytutywnie wytwarzają jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem, wytwarzanych przez wspomniane komórki.
W poniż szym opisie niniejszego wynalazku, wzmiankowane komórki są w skrócie nazywane komórkami ADHAPI.
Najwygodniejszym sposobem zastosowania komórek otrzymanych opisaną powyższej metodą jest forma szczepionki przeciwnowotworowej.
Niniejszy wynalazek będzie poniżej szczegółowo opisany za pomocą przykładów realizacji i figur rysunku, na którym:
Na Figurze 1 przedstawiono namnażanie autologicznych komórek (aMLR)PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/B-EBV (□) lub komórkami B-EBV (♦) stosowanymi jako kontrola (S)a;
Na Figurze 2 przedstawiono namnażanie autologicznych komórek (aMLR)PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/PWM-B (□) lub komórkami PWM-B (♦) stosowanymi jako kontrola (S)a;
Na Figurze 3 przedstawiono namnażanie autologicznych komórek (aMLR)PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/CD40L-B (□) lub komórkami CD40L-B (♦) stosowanymi jako kontrola (S)a;
Na Figurze 4 przedstawiono namnażanie autologicznych komórek (aMLR)PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/PWM-PBMC (□) lub komórkami PWM-PBMC (♦) stosowanymi jako kontrola (S)a;
Na Figurze 5 przedstawiono namnażanie autologicznych komórek (aMLR)PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/PHA-PBMC (□) lub komórkami PHA-PBMC (♦) stosowanymi jako kontrola (S)a;
Na Figurze 6 przedstawiono namnażanie autologicznych komórek (aMLR)PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/PHA-+PWM-PBMC (□) lub komórkami PHA-+PWM-PBMC (♦) stosowanymi jako kontrola (S)a.
a Punkty reprezentują wartości ś rednie (cpm)±SD (zliczeń na minutę ± odchylenie standardowe) zużycia [3H]-TdR uzyskane w wyniku czterech niezależnych pomiarów.
Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nie ma żadnych ograniczeń, co do typu komórek, które mogłyby być użyte do otrzymania komórek prezentujących antygen, jeśli posiadają one wspomnianą wyżej charakterystykę i zostaną właściwie aktywowane i poddane działaniu czynnika hipometylującego.
Według niniejszego wynalazku, komórki są pobierane z organizmu, szczegółowo ssaczego, a bardziej szczegół owo ludzkiego. W potencjalnym zastosowaniu niniejszego wynalazku, wzmiankowany człowiek jest dotknięty chorobą nowotworową.
W najbardziej korzystnym sposobie zastosowania niniejszego wynalazku, komórki prezentujące antygen uzyskane opisaną powyżej metodą są komórkami układu immunologicznego.
W innym sposobie zastosowania niniejszego wynalazku, komórki prezentują ce antygen uzyskane opisaną powyżej metodą nie są komórkami układu immunologicznego. Komórki uzyskane według niniejszego wynalazku mogą wytwarzać wspólne immunodominujące antygeny nowotworowe lub wspólne nieimmunodominujące antygeny nowotworowe. W szczególnych przypadkach zastosowania niniejszego wynalazku, komórkami właściwymi do wykorzystania zgodnie z powyższym sposobem są:
PL 211 907 B1 • Linie komórkowe limfoblastów B unieśmiertelnianych wirusem Epsteina-Barra, poddane działaniu czynników hipometylujących DNA, uzyskane z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej lub osób zdrowych (komórki ADHAPI/B-EBV);
• Limfocyty B aktywowane mitogenem szkarł atki (PWM), poddane działaniu czynników hipometylujących DNA, uzyskane z limfocytów B oczyszczonych z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej lub osób zdrowych (komórki ADHAPI/PWM-B);
• Limfocyty B aktywowane CD40, poddane działaniu czynników hipometylujących DNA, uzyskane z limfocytów B oczyszczonych z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej lub osób zdrowych (komórki ADHAPI/CD40-B);
• Jednoj ą drzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) aktywowane mitogenem szkarł atki (PWM), poddane działaniu czynników hipometylujących DNA, uzyskane z oczyszczonych komórek PBMC pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej lub osób zdrowych (komórki ADHAPI/PWM-PBMC);
• Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) aktywowane fitohemaglutininą (PHA) i rekombinowaną ludzką interleukiną 2 (rhIL-2), poddanymi działaniu czynników hipometylujących DNA, uzyskanymi z oczyszczonych komórek PBMC pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej lub osób zdrowych (komórki ADHAPI/PHA-rhIL2-PBMC);
• Jednoją drzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) aktywowane fitohemaglutyniną (PHA), rekombinowaną ludzką interleukiną 2 (rhIL-2) oraz mitogenem szkarłatki (PWM), poddane działaniu czynników hipometylujących DNA, uzyskane z oczyszczonych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej lub osób zdrowych (komórki ADHAPI/PHA-rhIL2-PWM-PBMC);
• Komórki dendrytyczne, monocyty, makrofagi;
• Komórki CD34+, fibroblasty, komórki macierzyste, fibroblasty i keratynocyty.
Komórki otrzymane metodą według niniejszego wynalazku, mogą być stosowane jako czynniki zapobiegające i leczące nowotwory o różnym typie histologicznym, które konstytutywnie wytwarzają jeden lub więcej antygenów nowotworowych immunodominujących lub nieimmunodominujących.
Inna możliwa realizacja niniejszego wynalazku jest stosowana w przypadkach, gdy nie jest wskazane lub jest niekonieczne bezpośrednie wykorzystanie zdolności komórek tworzących szczepionkę do prezentowania antygenu. W tym przypadku, komórki tworzące szczepionkę lub ich składniki komórkowe uzyskane opisaną metodą mogą być użyte jako rezerwuar zebranych antygenów nowotworowych do szczepienia pacjentów. W korzystnej formie zastosowania niniejszego wynalazku, wybrane antygeny TAA to antygeny CTA.
Takie zastosowanie niniejszego wynalazku ma następujące zalety dla specjalisty w dziedzinie:
Antygeny CTA są immunogenne, ponieważ zawierają epitopy rozpoznawane przez specyficzne względem CTA komórki CTL CD8+.
Antygeny CTA są immunogenne, ponieważ zawierają epitopy rozpoznawane w zestawieniu z HLA klasy II przez specyficzne względem CTA limfocyty T CD4+. Niektóre CTA zawierają jednocześnie epitopy antygenów prezentowanych przez HLA klasy I i II, mogą więc jednocześnie indukować odpowiedź CTL CD8+ i limfocytów T CD4+.
CTA nie są wytwarzane w łagodnych tkankach, za wyjątkiem jąder i łożyska.
Różne CTA mogą być jednocześnie wytwarzane w nowotworowych komórkach złośliwych nowotworów litych i hemopoetycznych, dostarczając tym samym wielu celów dla immunoterapii, które są jednocześnie wytwarzane w komórkach transformowanych.
CTA różnego rodzaju są homogennie ekspresjonowane w występujących jednocześnie i sekwencyjnie zmianach przerzutowych u badanych pacjentów.
CTA różnego rodzaju mogą być wytwarzane w nowotworach o różnym pochodzeniu histologicznym, dostarczając wspólnych dla wszystkich ludzkich nowotworów celów dla immunoterapii, niezależnie od ich specyficznego typu histologicznego.
CTA różnego rodzaju mogą dostarczać wielu peptydów immunogennych prezentowanych w zestawieniu z HLA klasy I i II o różnym haplotypie.
W ramach kolejnego zastosowania niniejszego wynalazku, inhibitory deacetylazy histonowej mogłyby działać synergicznie z czynnikami hipometylującymi DNA indukując/wzmacniając ekspresję antygenów CTA, HLA oraz związków kostymulujących/dodatkowych w komórkach nowotworowych
PL 211 907 B1 o róż nym typie histologicznym. Istotnie, metylacja DNA i deacylacja histonów dział ają jako synergiczne poziomy epigenetycznego wyciszania genów w komórkach nowotworowych (Fuks F. et al., Nat. Genet., 24:88-91, 2000) i silne przywrócenie aktywności wybranych hipometylowanych genów o funkcji supresorowej dla nowotworów zostało zaobserwowane w komórkach nowotworu jelita grubego po podaniu inhibitorów deacetylazy histonowej, które następowało po wstępnej minimalnej demetylacji DNA (Cameron E.E. et al., Nat. Genet., 21:103-107, 1999).
Etap aktywacji w metodzie według niniejszego wynalazku jest przeprowadzany według ogólnie przyjętego schematu, który może być cytowany jako Current Protocols in Immunology, Coligan J.E. et al., Eds, Wiley.
Sposób demetylacji w metodzie według niniejszego wynalazku jest dobrze znany i udokumentowany literaturowo, więcej informacji można znaleźć w publikacji: Santini V. et al., Ann. Intern. Med., 134:573-586, 2000.
Czynniki hipometylujące, znane również jako czynniki demetylujące, używane do celów niniejszego wynalazku są również dobrze znane. Czynniki demetylujące DNA są szeroko opisane w literaturze, patrz dla przykładu WO 01/29235, US 5,851,773. Preferowanym czynnikiem demetylującym jest 5-azo-cytydyna lub, bardziej korzystnym 5-azo-2'deoksycytydyna (5-AZA-CdR).
Według niniejszego wynalazku, komórki prezentujące antygen służą do przygotowania szczepionek nowotworowych. W korzystnym zastosowaniu niniejszego wynalazku, wzmiankowane szczepionki są szczepionkami autologicznymi.
W kolejnym preferowanym zastosowaniu niniejszego wynalazku, wzmiankowane szczepionki są szczepionkami alogenicznymi. W tym zastosowaniu, komórki uzyskane w powyżej opisany sposób mogą być używane jako komórki prezentujące antygen i jako rezerwuar zebranych antygenów nowotworowych, w formie komórek lub ich składników komórkowych.
W następnym zastosowaniu niniejszego wynalazku komórki i/lub ich składniki komórkowe mogą być używane do otrzymywania efektorowych komórek układu odpornościowego; wzmiankowane komórki układu odpornościowego byłyby używane do uzyskania produktu stosowanego w powszechnie znanej immunoterapii adaptacyjnej. W innej formie zastosowania niniejszego wynalazku, szczepionka, której on dotyczy może być użyta w zestawieniu z wstępnym ogólnoustrojowym leczeniem pacjenta z chorobą nowotworową czynnikiem hipometylują cym, na przykł ad decytabin ą (5-azo-2'deoksycytydyną). Do tego zastosowania niniejszego wynalazku, może być użyty przygotowany środek, zawierający na przykład szczepionkę wykonaną wzmiankowaną metodą i zestaw farmaceutyczny pozwalający na ogólnoustrojowe podawanie czynnika hipometylującego, jak na przykład decytabiny.
Szczepionki mogą być przygotowywane technikami dobrze znanymi specjaliście w dziedzinie i wymagają jedynie powszechnie znanej wiedzy. Przykładowo, cytowania patentowe wspomniane w niniejszym opisie, są wystarczają ce do przygotowania szczepionek nowotworowych, patrz na przykład WO 00/25813 lub WO 00/46352. Specjalista w dziedzinie nie będzie miał trudności w ustaleniu prawidłowego sposobu używania szczepionek opisanych w niniejszym wynalazku, w szczególności ustaleniu sposobu ich podawania.
Wynalazek zilustrowano za pomocą poniższych przykładów.
PRZYKŁAD 1
Komórki ADHAPI/B-EBV
Oczyszczanie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (komórek PBMC)
Komórki PBMC były oczyszczane przez wirowanie heparynowanej krwi obwodowej pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej i osób zdrowych w standardowym gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque.
Otrzymywanie autologicznych linii komórkowych przez unieśmiertelnianie komórek PBMC wirusem Epsteina-Barra (EBV)
Limfoblastyczne linie komórkowe B-EBV+ były otrzymywane w wyniku inkubacji komórek PBMC z supernatantem pochodzącym z linii komórek małpich B95.8, w 37°C, w atmosferze nawilżanej z 5% zawartością CO2, w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (lub surowicy ludzkiej AB) oraz 2 mM L-glutaminy.
Otrzymywanie komórek ADHAPI/B-EBV i komórek B-EBV stosowanych jako kontrola
Limfoblastyczne linie komórkowe B-EBV+ (7,5x105 komórek/ml) były hodowane w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (lub surowicy ludzkiej AB) oraz 2 mM L-glutaminy w 37°C, w atmosferze nawilżanej z 5% zawartością CO2, oraz czteroPL 211 907 B1 krotnie, co 12 godzin poddawane krótkotrwałemu działaniu 1 μΜ 5-azo-2'-deoksycytydyny (5-AZACdR). Następnie, połowa pożywki została zastąpiona świeżą i hodowla była kontynuowana przez kolejne 48 godzin, po czym komórki były używane do doświadczeń i/lub mrożone w formie żywej. Komórki zastosowane jako kontrola (komórki B-EBV) były hodowane w podobnych warunkach doświadczalnych, ale nie poddawane działaniu 5-AZA-CdR.
Ostateczne oznaczanie ilości odzyskanych komórek ADHAPI/B-EBV i komórek B-EBV stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli I.
Reakcja aMLR (reakcja mieszanych limfocytów autologicznych) i reakcja MLR (reakcja mieszanych limfocytów)
Komórki ADHAPI/B-EBV i komórki B-EBV stosowane jako kontrola (komórki stymulujące=S) były zbierane, przemywane dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) i poddawane działaniu promieniowania X (75 Gy). W reakcjach aMLR i MLR ilościowe stężenia (od 1x106 komórek/ml do 6x104 komórek/ml) komórek ADHAPI/B-EBV lub komórek B-EBV używanych jako kontrola były dodawane do autologicznych lub alogenicznych komórek PBMC (1x106 komórek/ml) (komórki reagujące=R) umieszczonych w podłożu Basala Iscove'a wzbogaconym 10% inaktywowaną termicznie surowicą ludzką AB, 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliną, 100 μg/ml siarczanem streptomycyny i wysiewane na 96-studzienkowe płytki U-kształtne do ostatecznej objętości 200 μl/studzienkę. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C, w nawilżanej atmosferze z 5% zawartością CO2, 100 μl supernatantu było pobierane i natychmiast mrożone w -80°C, gdzie było przechowywane do czasu pomiaru wydzielania cytokin. Następnie, 100 μl świeżej pożywki było dodawane do każdej studzienki i hodowla była kontynuowana przez dodatkowe pięć dni, po czym komórki były poddawane całonocnemu działaniu 3H-TdR (1 μLCi/studzienkę) i zbierane. Inkorporacja 3H-TdR do komórek R była mierzona za pomocą licznika β.
Namnażanie autologicznych komórek PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/B-EBV lub komórkami B-EBV używanymi jako kontrola (S) podczas reakcji aMLR
Patrz Figura 1.
Profil fenotypowy komórek ADHAPI/B-EBV i B-EBV stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli II.
Analiza ekspresji antygenów CTA w komórkach ADHAPI/B-EBV i B-EBV stosowanych jako kontrola za pomocą reakcji RT-PCR
Warunki oraz startery użyte w celu zbadania ekspresji antygenów CTA w badanych komórkach przedstawiono poniżej:
w przypadku MAGE-1, -2, -3, -4 Brasseur F. et al., Int. J. Cancer, 63:375-380, 1995; w przypadku GAGE 1-6 Van den Eynde B. et al., J. Exp. Med., 182:689-698, 1995; w przypadku NY-ESO-1 Stockert E. et al., J. Exp. Med., 187:265-270, 1998; w przypadku SSX-2 Sahin U. et al., Clin. Cancer Res., 6:3916-3922, 2000.
| 5-AZA-CdR | - | + |
| MAGE-1 | 0/4a | 4/4 |
| MAGE-2 | NT | NT |
| MAGE-3 | 0/4 | 4/4 |
| MAGE-4 | NT | NT |
| NY-ESO-1 | 0/4 | 4/4 |
| GAGE-1-6 | 0/4 | 4/4 |
| SSX-2 | 2/4 | 4/4 |
pozytywne/badane; NT, niebadane
Oznaczanie wydzielania interferonu γ (IFN-γ) przez komórki PBMC (R) stymulowane podczas reakcji aMLR komórkami ADHAPI/B-EBV lub komórkami B-EBV używanymi jako kontrola (S) za pomocą testu ELISA
Wyniki przedstawiono w Tabeli III.
PL 211 907 B1
PRZYKŁAD 2
Komórki ADHAPI/PWM-B
Oczyszczanie limfocytów B
Komórki PBMC były oczyszczane przez wirowanie heparynowanej krwi obwodowej pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej i osób zdrowych w standardowym gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque; oczyszczone limfocyty T były otrzymywane przy pomocy tradycyjnego testu rozetowego E z baranich krwinek czerwonych poddanych działaniu neuraminidazy.
Otrzymywanie komórek B aktywowanych za pomocą PWM
Do oczyszczonych limfocytów B (1,5x106 komórek/ml) (1,5x106 komórek/ml) dodawano PWM (3 μg/ml) i hodowano je na pożywce Basala Iscove'a z dodatkiem 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej AB, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml siarczanu streptomycyny, przez 48 godzin w 37°C, w nawilżanej atmosferze z 5% zawartością CO2.
Otrzymywanie komórek ADHAPI/PWM-B i komórek PWM-B stosowanych jako kontrola
Limfocyty B aktywowane PWM były czterokrotnie, co 12 godzin poddawane krótkotrwałemu działaniu 1 μM 5-azo-2'-deoksycytydyny (5-AZA-CdR). Następnie połowa pożywki została zastąpiona świeżą i hodowla była kontynuowana przez kolejne 48 godzin. Następnie komórki były używane do doświadczeń i/lub mrożone w formie żywej.
Komórki używane jako kontrola (komórki PWM-B) były hodowane w podobnych warunkach doświadczalnych, ale nie poddawane działaniu 5-AZA-CdR.
Ostateczne oznaczanie ilości odzyskanych komórek ADHAPI/PWM-B i komórek PWM-B stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli I.
Reakcja aMLR (reakcja mieszanych limfocytów autologicznych) i reakcja MLR (reakcja mieszanych limfocytów)
Komórki ADHAPI/PWM-B i komórki PWM-B używane jako kontrola (komórki stymulujące=S) były zbierane, trzykrotnie przemywane zrównoważonym roztworem soli Hanksa z dodatkiem w 0,5% α-metylomannopiranozydu i poddawane działaniu promieniowania X (30 Gy). W reakcjach aMLR i MLR ilościowe stężenia (od 1x106 komórek/ml do 6x104 komórek/ml) komórek ADHAPI/PWM-B lub komórek PWM-B używanych jako kontrola były dodawane do autologicznych lub alogenicznych komórek PBMC (1x106 komórek/ml) (komórki reagujące=R) umieszczonych w podłożu Basala Iscove'a z dodatkiem 10% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny oraz 100 μg/ml siarczanu streptomycyny i wysiewane na U-kształtne 96-studzienkowe płytki do ostatecznej objętości 200 μl/studzienkę. Po 6 dniach inkubacji w 37°C, w nawilżanej atmosferze z 5% zawartością CO2, 100 μl supernatantu było pobierane z każdej hodowli, natychmiast mrożone w -80°C, i w ten sposób przechowywane do czasu pomiaru wydzielania cytokin. Następnie, 100 μl świeżej pożywki było dodawane do każdej studzienki, po czym komórki były poddawane całonocnemu działaniu 3H-TdR (1 μCi/studzienkę) i zbierane. Inkorporacja 3H-TdR do uzyskanych w ten sposób komórek R była mierzona za pomocą licznika β.
Profil fenotypowy komórek ADHAPI/PWM-B i komórek PWM-B stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli II.
Analiza ekspresji antygenów CTA w komórkach ADHAPI/PWM-B i PWM-B używanych jako kontrola przy pomocy reakcji RT-PCR
| 5-AZA-CdR | - | + |
| MAGE-1 | 0/4a | 4/4 |
| MAGE-2 | 0/4 | 4/4 |
| MAGE-3 | 0/4 | 4/4 |
| MAGE-4 | 0/4 | 4/4 |
| NY-ESO-1 | 0/4 | 4/4 |
| GAGE-1-6 | 0/4 | 4/4 |
| SSX-2 | 1/4 | 4/4 |
a pozytywne/badane.
Namnażanie autologicznych komórek PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/PWM-B lub komórkami PWM-B stosowanymi jako kontrola (S) podczas reakcji aMLR
Wyniki przedstawiono na Figurze 2.
PL 211 907 B1
Oznaczanie wydzielania interferonu γ (IFN-γ) przez alogeniczne (MLR) i autologiczne (aMLR) komórki PBMC (R) stymulowane komórkami ADHAPI/PWM-B lub komórkami PWM-B używanymi jako kontrola (S) za pomocą testu ELISA
Wyniki przedstawiono w Tabeli III.
PRZYKŁAD 3
Komórki ADHAPI/CD40L-B
Oczyszczanie komórek PBMC
Komórki PBMC były oczyszczane przez wirowanie w standardowym gradiencie gęstości FicollHypaque heparynowanej lub poddawanej antykoagulacji w roztworze dekstrozy z kwasem cytrynowym (ACD) krwi obwodowej pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej i osób zdrowych.
Otrzymywanie komórek PBMC zaktywowanych przy pomocy NIH3T3-CD40L
Komórki PBMC były hodowane wraz z półpłynnym poddanym działaniu promieniowania X (75 Gy) NIH3T3-CD40L w 37°C, w atmosferze nawilżanej z 5% zawartością CO2, na pożywce Basala Iscove'a zawierającej 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej AB, 2 mM L-glutaminy, 2 ng/ml ludzkiej rekombinowanej interleukiny 4 (rhIL-4), 50 μg/ml ludzkiej transferyny, 5 μg/ml ludzkiej rekombinowanej insuliny, 5,5x10-7 cyklosporyny A (CsA), 100 U/ml penicyliny oraz 100 μg/ml siarczanu streptomycyny (pełna pożywka). Po sześciu dniach inkubacji komórki PBMC były zbierane, płukane dwukrotnie w HBSS, zawieszane powtórnie w kompletnej pożywce Basala Iscove'a w stężeniu 1x106 komórek/ml i hodowane przez kolejne trzy dni razem ze świeżym NIH3T3-I CD40L w 37°C, w atmosferze nawilżanej z 5% zawartością CO2, jak opisano powyżej. Przedstawiona procedura była powtarzana co 2-3 dni. Sumaryczny czas hodowli wynosił maksymalnie 16-18 dni.
Otrzymywanie komórek ADHAPI/CD40L-B i komórek CD40L-B stosowanych jako kontrola
Po 16-18 dniach hodowli aktywowane komórki PBMC były zbierane i ponownie stymulowane przy pomocy NIH3T3-CD40L, jak opisano powyżej, po czym, po całonocnej inkubacji w 37°C, w atmosferze nawilżanej z 5% zawartością CO2, były czterokrotnie, co 12 godzin poddawane krótkotrwałemu działaniu 1 μM 5-azo-2'-deoksycytydyny (5-AZA-CdR), po czym zbierane i raz jeszcze stymulowane NIH3T3-CD40L, jak opisano powyżej, i hodowane przez następne 48 godzin. Następnie komórki były używane do doświadczeń i/lub mrożone w formie żywej. Komórki używane jako kontrola (komórki CD40L) były hodowane w podobnych warunkach doświadczalnych, ale nie poddawane działaniu 5-AZA-CdR.
Ostateczne oznaczanie ilości odzyskanych komórek ADHAPI/CD40L-B i komórek CD40L-B stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli I.
Reakcja aMLR (reakcja mieszanych limfocytów autologicznych) i reakcja MLR (reakcja mieszanych limfocytów)
Komórki ADHAPI/CD40L-B i komórki CD40L-B używane jako kontrola (komórki stymulujące=S) były zbierane, trzykrotnie przemywane zrównoważonym roztworem soli Hanksa i poddawane działaniu promieniowania X (50 Gy). W reakcjach aMLR i MLR ilościowe stężenia (od 1x106 komórek/ml do 6x104 komórek/ml) komórek ADHAPI/CD40L-B lub komórek CD40L-B używanych jako kontrola były dodawane do autologicznych lub alogenicznych komórek PBMC (1x106 komórek/ml) (komórki reagujące=R) umieszczonych w pożywce Basala Iscove'a zawierającej 10% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny oraz 100 pg//ml siarczanu streptomycyny i wysiewane na U-kształtne 96-dołkowe płytki do ostatecznej objętości 200 pl/studzienkę. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C, w nawilżanej atmosferze z 5% zawartością CO2, 100 pl supernatantu było pobierane z każdej hodowli, natychmiast mrożone w -80°C, i w ten sposób przechowywane do czasu pomiaru wydzielania cytokin. Następnie, 100 pl świeżej pożywki było dodawane do każdej studzienki i hodowla była kontynuowana przez dodatkowe pięć dni, po czym komórki były poddawane całonocnemu działaniu 3H-TdR (1 pCi/studzienkę) i zbierane. Inkorporacja 3H-TdR do uzyskanych w ten sposób komórek R była mierzona za pomocą licznika β.
Profil fenotypowy komórek ADHAPI/CD40L-B i komórek CD40L-B używanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli II.
Analiza ekspresji antygenów CTA w komórkach ADHAPI/CD40L-B i CD40L-B używanych jako kontrola przy pomocy reakcji RT-PCR
PL 211 907 B1
| 5-AZA-CdR | - | + |
| MAGE-1 | 0/10a | 10/10 |
| MAGE-2 | 0/10 | 9/10 |
| MAGE-3 | 0/11 | 10/11 |
| MAGE-4 | 0/11 | 11/11 |
| NY-ESO-1 | 0/14 | 14/14 |
| GAGE-1-6 | 0/14 | 14/14 |
| SSX-2 | 0/14 | 13/14 |
a pozytywne/badane.
Namnażanie autologicznych komórek PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/CD40L-B lub komórkami CD40L-B stosowanymi jako kontrola (S) podczas reakcji aMLR
Wyniki przedstawiono na Figurze 3.
Oznaczanie wydzielania interferonu γ (IFN-γ) przez komórki PBMC (R) stymulowane podczas reakcji aMLR komórkami ADHAPI/CD40L-B lub komórkami CD40L-B używanymi jako kontrola (S) za pomocą testu ELISA
Wyniki przedstawiono w Tabeli III.
PRZYKŁAD 4
Komórki ADHAPI/PWM-PBMC
Oczyszczanie komórek PBMC
Komórki PBMC były oczyszczane przez wirowanie heparynowanej krwi obwodowej pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej i osób zdrowych w standardowym gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque.
Otrzymywanie komórek PBMC zaktywowanych przy pomocy PWM
Do komórek PBMC (1,5x106 komórek/ml) dodawano PWM (3 μg/ml) i hodowano je w pożywce Basala Iscove'a zawierającej 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej AB, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml siarczanu streptomycyny, przez 48 godzin w 37°C, w nawilżanej atmosferze z 5% zawartością CO2.
Otrzymywanie komórek ADHAPI/PWM-PBMC i komórek PWM-PBMC stosowanych jako kontrola
Komórki PBMC aktywowane PWM były czterokrotnie, co 12 godzin poddawane krótkotrwałemu działaniu 1 μM 5-azo-2'-deoksycytydyny (5-AZA-CdR). Następnie, połowa pożywki została zastąpiona świeżą i hodowla była kontynuowana przez kolejne 48 godzin. Następnie, komórki były używane do doświadczeń i/lub mrożone w formie żywej. Komórki używane jako kontrola (komórki PWM-PBMC) były hodowane w podobnych warunkach doświadczalnych, ale nie poddawane działaniu 5-AZA-CdR. Ostateczne oznaczanie ilości odzyskanych komórek ADHAPI/PWM-PBMC i komórek PWM-PBMC używanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli I.
Reakcja aMLR (reakcja mieszanych limfocytów autologicznych) i reakcja MLR (reakcja mieszanych limfocytów)
Komórki ADHAPI/PWM-PBMC i komórki PWM-PBMC stosowane jako kontrola (komórki stymulujące=S) były zbierane, trzykrotnie przemywane zrównoważonym roztworem soli Hanksa z dodatkiem w 0,5% α-metylomannopiranozydu i poddawane działaniu promieniowania X (30 Gy). W reakcjach aMLR i MLR ilościowe stężenia (od 1x106 komórek/ml do 6x104 komórek/ml) komórek ADHAPI/PWMPBMC lub komórek PWM-PBMC używanych jako kontrola były dodawane do autologicznych lub alogenicznych komórek PBMC (1x106 komórek/ml) (komórki reagujące=R) umieszczonych w pożywce Basala Iscove'a zawierającej 10% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny oraz 100 μg/ml siarczanu streptomycyny i wysiewane na U-kształtne 96-studzienkowe płytki do ostatecznej objętości 200 μl/studzienkę. Po 6 dniach inkubacji w 37°C, w nawilżanej atmosferze z 5% zawartością CO2, 100 μl supernatantu było pobierane z każdej hodowli, natychmiast mrożone w -80°C, i w ten sposób przechowywane do czasu pomiaru wydzielania cytokin. Następnie, 100 μl świeżej pożywki było dodawane do każdej studzienki, po czym komórki były poddawa33 ne całonocnemu działaniu H-TdR (1 μCi/studzienkę) i zbierane. Inkorporacja H-TdR do uzyskanych w ten sposób komórek R była mierzona za pomocą licznika β.
PL 211 907 B1
Profil fenotypowy komórek ADHAPI/PWM-PBMC i komórek PWM-PBMC stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli II.
Analiza ekspresji antygenów CTA w komórkach ADHAPI/PWM-PBMC i PWM-PBMC używanych jako kontrola przy pomocy reakcji RT-PCR
| 5-AZA-CdR | - | + |
| MAGE-1 | 0/4a | 4/4 |
| MAGE-2 | 0/4 | 3/4 |
| MAGE-3 | 0/4 | 4/4 |
| MAGE-4 | 1/4 | 3/4 |
| NY-ESO-1 | 0/4 | 4/4 |
| GAGE-1-6 | 0/4 | 3/4 |
| SSX-2 | 0/4 | 3/4 |
a pozytywne/badane.
Namnażanie autologicznych (aMLR) komórek PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/PWM-PBMC lub komórkami PWM-PBMC używanymi jako kontrola (S) podczas reakcji aMLR Wyniki przedstawiono na Figurze 4.
Oznaczanie wydzielania interferonu γ (IFN-γ) przez autologiczne komórki PBMC (R) stymulowane podczas reakcji aMLR komórkami ADHAPI/PWM-PBMC lub komórkami PWM-PBMC stosowanymi jako kontrola (S) za pomocą testu ELISA
Wyniki przedstawiono w Tabeli III.
PRZYKŁAD 5
Komórki ADHAPI/PHA-PBMC
Oczyszczanie komórek PBMC
Komórki PBMC były oczyszczane przez wirowanie heparynowanej krwi obwodowej pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej i osób zdrowych w standardowym gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque.
Otrzymywanie komórek PBMC zaktywowanych przy pomocy PHA
Do komórek PBMC (1,5x106 komórek/ml) dodawano PHA-M (10 μg/ml) oraz 100 Ul/ml rhIL-2. Następnie hodowano je 48 godzin w 37°C, w atmosferze nawilżanej z 5% zawartością CO2, w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (lub na pożywce Basala Iscove'a zawierającej 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej AB) oraz 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml siarczanu streptomycyny (pełna pożywka).
Otrzymywanie komórek ADHAPI/PHA-PBMC i komórek PHA-PBMC stosowanych jako kontrola
Komórki PBMC aktywowane PHA były czterokrotnie, co 12 godzin poddawane krótkotrwałemu działaniu 1 μM 5-azo-2'-deoksycytydyny (5-AZA-CdR). Następnie, połowa pożywki została zastąpiona świeżą pełną pożywką nie zawierającą PHA-M i hodowla była kontynuowana przez kolejne 48 godzin. Następnie, komórki były używane do doświadczeń i/lub mrożone w formie żywej. Komórki używane jako kontrola (komórki PHA-PBMC) były hodowane w podobnych warunkach doświadczalnych, ale nie poddawane działaniu 5-AZA-CdR.
Ostateczne oznaczanie ilości odzyskanych komórek ADHAPI/PHA-PBMC i komórek PHAPBMC stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli I.
Reakcja aMLR (reakcja mieszanych limfocytów autologicznych) i reakcja MLR (reakcja mieszanych limfocytów)
Komórki ADHAPI/PHA-PBMC i komórki PHA-PBMC używane jako kontrola (komórki stymulujące=S) były zbierane, trzykrotnie przemywane zrównoważonym roztworem soli Hanksa z dodatkiem w 0,5% α-metylomannopiranozydu i poddawane działaniu promieniowania X (50 Gy). W reakcjach aMLR i MLR ilościowe stężenia (od 1x106 komórek/ml do 6x104 komórek/ml) komórek ADHAPI/PHAPBMC lub komórek PHA-PBMC używanych jako kontrola były dodawane do autologicznych lub alogenicznych komórek PBMC (1x106 komórek/ml) (komórki reagujące=R) umieszczonych w pożywce Basala Iscove'a zawierającej 10% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny oraz 100 μg/ml siarczanu streptomycyny i wysiewane na U-kształtne 96-dołkowe
PL 211 907 B1 płytki do ostatecznej objętości 200 μΙ/studzienkę. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C, w nawilżanej atmosferze z 5% zawartością CO2, 100 μl supernatantu było pobierane z każdej hodowli, natychmiast mrożone w -80°C, i w ten sposób przechowywane do czasu pomiaru wydzielania cytokin. Następnie, 100 ul świeżej pożywki było dodawane do każdej studzienki i hodowla była kontynuowana przez dodatkowe pięć dni, przy czym komórki były poddawane całonocnemu działaniu 3H-TdR (1 uCi//studzienkę) i zbierane. Inkorporacja 3H-TdR do uzyskanych w ten sposób komórek R była mierzona za pomocą licznika β.
Profil fenotypowy komórek ADHAPI/PHA-PBMC i komórek PHA-PBMC stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli II.
Analiza ekspresji antygenów CTA w komórkach ADHAPI/PHA-PBMC i PHA-PBMC używanych jako kontrola przy pomocy reakcji RT-PCR
| 5-AZA-CdR | - | + |
| MAGE-1 | 0/12a | 12/12 |
| MAGE-2 | 0/3 | 3/3 |
| MAGE-3 | 0/12 | 12/12 |
| MAGE-4 | 0/4 | 4/4 |
| NY-ESO-1 | 0/6 | 6/6 |
| GAGE-1-6 | 0/4 | 4/4 |
| SSX-2 | 0/6 | 6/6 |
a pozytywne/badane.
Namnażanie autologicznych komórek PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI/PHAPBMC lub komórkami PHA-PBMC stosowanymi jako kontrola (S) podczas reakcji aMLR
Wyniki przedstawiono na Figurze 5.
Oznaczanie wydzielania interferonu γ (IPN-γ) przez alogeniczne (MLR) i autologiczne (aMLR) komórki PBMC (R) stymulowane komórkami ADHAPI/PHA-PBMC lub komórkami PHA-PBMC używanymi jako kontrola (S) za pomocą testu ELISA Wyniki przedstawiono w Tabeli III.
PRZYKŁAD 6
Komórki ADHAPI/PHA+PWM-PBMC
Oczyszczanie komórek PBMC
Komórki PBMC były otrzymywane przez wirowanie heparynowanej lub antykoagulowanej za pomocą ACD krwi obwodowej pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej i osób zdrowych w standardowym gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque.
Otrzymywanie komórek PBMC zaktywowanych przy pomocy PHA i PWM
Do komórek PBMC (1,5x106 komórek/ml) dodawano PHA-M (10 ug/ml), PWM (3 ug/ml) oraz 100 Ul/ml rhIL-2. Następnie hodowano je 48 godzin w 37°C, w atmosferze nawilżanej z 5% zawartością CO2, na pożywce Basala Iscove'a zawierającej 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej AB (lub 10% inaktywowanej termicznie surowicy autologicznej) oraz 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 ug/ml siarczanu streptomycyny (pełna pożywka).
Otrzymywanie komórek ADHAPI/PHA+PWM-PBMC i komórek PHA+PWM-PBMC stosowanych jako kontrola
Komórki PBMC aktywowane PHA i PWM były czterokrotnie, co 12 godzin poddawane krótkotrwałemu działaniu 1 uM 5-azo-2'-deoksycytydyny (5-AZA-CdR). Następnie, połowa pożywki została zastąpiona świeżą pełną pożywką nie zawierającą PHA ani PWM i hodowla była kontynuowana przez kolejne 48 godzin. Następnie, komórki były używane do doświadczeń i/lub mrożone w formie żywej. Komórki używane jako kontrola (komórki PHA+PWM-PBMC) były hodowane w podobnych warunkach doświadczalnych, ale nie poddawane działaniu 5-AZA-CdR.
Ostateczne oznaczanie ilości odzyskanych komórek ADHAPI/PHA+PWM-PBMC i komórek
PHA+PWM-PBMC używanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli I.
Reakcja aMLR (reakcja mieszanych limfocytów autologicznych) i reakcja MLR (reakcja mieszanych limfocytów)
PL 211 907 B1
Komórki ADHAPI/PHA+PWM-PBMC i komórki PHA+PWM-PBMC używane jako kontrola (komórki stymulujące=S) były zbierane, trzykrotnie przemywane zrównoważonym roztworem soli Hanksa z dodatkiem w 0,5% α-metylomannopiranozydu i poddawane działaniu promieniowania X (50 Gy). W reakcjach aMLR i MLR ilościowe stężenia (od 1x106 komórek/ml do 6x104 komórek/ml) komórek ADHAPI/PHA-rhIL2-+PWM-PBMC lub komórek PHA+PWM-PBMC używanych jako kontrola były dodawane do autologicznych lub alogenicznych komórek PBMC (1x106 komórek/ml) (komórki reagujące=R) w pożywce Basala Iscove'a zawierającej 10% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny oraz 100 μg/ml siarczanu streptomycyny i wysiewane na U-kształtne 96-dołkowe płytki do ostatecznej objętości 200 μl/studzienkę. Po 6 dniach inkubacji w 37°C, w nawilżanej atmosferze z 5% zawartością CO2, 100 μl supernatantu było pobierane z każdej hodowli, natychmiast mrożone w -80°C, i w ten sposób przechowywane do czasu pomiaru wydzielania cytokin. Następnie, 100 μl świeżej pożywki było dodawane do każdej studzienki, komórki były podda33 wane całonocnemu działaniu 3H-TdR (1 μCi/studzienkę) i zbierane. Inkorporacja 3H-TdR do uzyskanych w ten sposób komórek R była mierzona za pomocą licznika β.
Profil fenotypowy komórek ADHAPI/PHA+PWM-PBMC i komórek PHA+PWM-PBMC stosowanych jako kontrola
Wyniki przedstawiono w Tabeli II.
Analiza RT-PCR dla CTA ekspresjonowanych w komórkach ADHAPI/PHA+PWM-PBMC i stosowanych jako kontrola PHA+PWM-PBMC
| 5-AZA-CdR | - | + |
| MAGE-1 | 0/7a | 7/7 |
| MAGE-2 | 0/7 | 7/7 |
| MAGE-3 | 0/7 | 7/7 |
| MAGE-4 | 0/7 | 7/7 |
| NY-ESO-1 | 0/7 | 7/7 |
| GAGE-1-6 | 0/7 | 7/7 |
| SSX-2 | 0/7 | 7/7 |
a pozytywne/badane.
Namnażanie autologicznych komórek PBMC (R) stymulowanych komórkami ADHAPI//PHA+PWM-PBMC (aMLR) lub komórkami PHA+PWM-PBMC stosowanymi jako kontrola (S) podczas reakcji w aMLR
Wyniki przedstawiono na Figurze 6.
Oznaczanie wydzielania interferonu γ (IFN-γ) przez alogeniczne (MLR) i autologiczne (aMLR) komórki PBMC (R) stymulowane komórkami ADHAPI/PHA+PWM-PBMC lub komórkami PHA+PWMPBMC stosowanymi jako kontrola (S) za pomocą testu ELISA.
Wyniki przedstawiono w Tabeli III.
Nowotworzenie komórek ADHAPI in vivo
Pojedyncze podskórne heteroprzeszczepy żywych komórek ADHAPI/PHA-rhIL2-PWM-PBMC (12x106) i komórek stosowanych jako ich kontrola, (14x106), komórek ADHAPI/CD40L-B (8x106) i komórek używanych jako ich kontrola (8x106) lub komórek ADHAPI/PHA-rhIL2-PWM-PBMC (12x106) poddawanych uprzednio działaniu promieniowania X (30 Gy) i komórek używanych jako ich kontrola, (14x106), komórek ADHAPI/CD40L-B (8x106) poddawanych uprzednio działaniu promieniowania X (50 Gy) i komórek używanych jako ich kontrola (8x106), w miejscu wstrzyknięcia i w odległych (dostępnych klinicznie) miejscach, nie powodowały ani powstawania nowotworu, ani też nie wpływały na ogólny stan zdrowia i wagę myszy BALB/c nu/nu, w 180 dni po podaniu. Powtarzane podskórne heteroprzeszczepy żywych komórek ADHAPI/B-EBV (5x106/pierwszy zastrzyk; 1x107/drugi i następne) oraz komórek B-EBV używanych jako kontrola (5x106/pierwszy zastrzyk; 1x107/drugi i następne) lub komórek ADHAPI/B-EBV poddawanych uprzednio działaniu promieniowania X (75 Gy) (5x106//pierwszy zastrzyk; 1x107/drugi i następne) oraz komórek B-EBV poddawanych uprzednio działaniu promieniowania X (75 Gy) używanych jako kontrola (5x106/pierwszy zastrzyk; 1x107/drugi i następne), nie powodowały w dniach 0, 33, 63 i 96 po podaniu powstawania nowotworu, ani też nie wpływały na ogólny stan zdrowia i wagę myszy BALB/c nu/nu w 180 dni po pierwszym podaniu. Ogólny stan zdro16
PL 211 907 B1 wia i waga myszy, którym podawano komórki ADHAPI był porównywalny z obserwowanym u zdrowych zwierząt, których nie szczepiono ani nie poddawano działaniu komórek B-EBV.
Zalety stosowania komórek ADHAPI jako poliwalentnych szczepionek komórkowych zawierających CTA
W porównaniu z głównymi metodami jak najskuteczniejszego podawania znanych antygenów CTA pacjentom z chorobą nowotworową dotychczas stosowanymi lub hipotetycznie planowanymi do wprowadzenia, komórki ADHAPI reprezentują zupełnie nowe i nowatorskie podejście oraz posiadają wiele ważnych/godnych uwagi zalet, w tym:
Komórki ADHAPI w porównaniu z niemodyfikowanymi genetycznie szczepionkami zawierającymi komórki CTA
Komórki ADHAPI stanowią nową i unikalną formę szczepionek APC, ponieważ jednocześnie wytwarzają liczne/wszystkie antygeny CTA regulowane przez metylację; jako syntetyzowane endogennie, antygeny CTA mogą wewnątrz komórek ADHAPI bezpośrednio i w tym samym czasie dotrzeć i do szlaku obróbki antygenu związanego z HLA klasy I, i związanego z HLA klasy II (Jenne L. et al., Trends Immunol., 22:102-107, 2001).
W ten sposób, dzięki konstytutywnej ekspresji na swojej powierzchni antygenów właściwych dla HLA klasy I i II, komórki ADHAPI mogą równolegle prezentować epitopy immunogenne endogennie syntetyzowanych CTA autologicznym limfocytom T CD8+ i CD4+; i dlatego, mogą jednocześnie wywoływać/wzmacniać humoralną odpowiedź immunologiczną oraz odpowiedź CTL swoistych względem CTA. Co więcej, komórki ADHAPI mogą wytwarzać i prezentować komórkom T gospodarza antygeny CTA regulowane przez metylację, które nie zostały dotąd zidentyfikowane i scharakteryzowane (jak również nie immunodominujące epitopy znanych i dotąd nieznanych antygenów CTA).
W odróżnieniu od komórek ADHAPI, autologiczne szczepionki APC poddawane krótkotrwałemu działaniu syntetycznego peptydu/syntetycznych peptydów CTA, syntetycznego białka CTA w całości lub preparatów całych komórek nowotworowych (np. komórki dendrytyczne, komórki PBMC), podobnie jak hybrydowe komórki powstające przez połączenie za pomocą elektrofuzji komórek dendrytycznych i nowotworowych (Kugler A. et al., Nat. Med., 6:332-336, 2000; Tureci O. et al., Cancer Res., 56(20):4766-72, 1996. Eds), wszystkie posiadają poważne wady, w tym: i) nieznane dalsze losy in vivo wstawianych ex vivo: syntetycznego peptydu/syntetycznych peptydów CTA, syntetycznego białka CTA w całości lub antygenów CTA pochodzących z komórek nowotworowych, które mogą znacząco wpływać na trwałość prezentacji antygenu systemowi immunologicznemu gospodarza; ii) ograniczonym ilościom syntetycznego peptydu/syntetycznych peptydów CTA, całego syntetycznego białka CTA w lub antygenów CTA pochodzących z komórek nowotworowych, które mogą zostać ex vivo wprowadzone do HLA klasy I i II w szczepionkach komórkowych, co może znacząco hamować immunogenność podawanych CTA; iii) ograniczenie przez fenotyp HLA pacjenta i wciąż niską liczbę znanych epitopów immunogennych zidentyfikowanych antygenów CTA prezentowanych przez HLA klasy I i jeszcze mniejszą w przypadku HLA klasy II; iv) dostępność odpowiednich ilości świeżej tkanki nowotworowej, która byłaby wystarczająco reprezentatywna pod względem zawartości CTA wytwarzanych w różnych zmianach nowotworowych (Jenne L. et al., Trends Immunol., 22:102-107, 2001).
Ekspresja endogennie syntetyzowanych antygenów CTA przez komórki ADHAPI jest trwała; w ten sposób przy zmieniających się wprowadzanych szczepionkach APC poddanych ex vivo działaniu: syntetycznego peptydu/syntetycznych peptydów CTA, syntetycznego białka CTA w całości lub antygenów CTA pochodzących z komórek nowotworowych; komórki ADHAPI mogą zapewnić przedłużoną stymulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza in vivo, przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości szczepień. Taką hipotezę potwierdza przewidywana, wynikająca z nie powodowania przez komórki ADHAPI powstawania nowotworów in vivo, możliwość wprowadzania tych komórek jako żywych, nie poddawanych działaniu promieniowania X, szczepionek komórkowych. Co więcej, po ich fizjologicznej śmierci in vivo, komórki ADHAPI, mogłyby wciąż spełniać rolę rezerwuaru endogennych peptydów i białek CTA, które mogłyby dalej skutecznie wzmacniać prezentację epitopów CTA związanych z HLA klasy I komórkom T CD8+ przez komórki dendrytyczne pacjenta, za pomocą immunologicznego mechanizmu wzajemnego uwrażliwiania (cross-priming), jak też prezentację epitopów CTA związanych z HLA klasy II komórkom T CD4+ w powszechnie znanym egzogennym szlaku obróbki antygenów.
Komórki ADHAPI zachowują swoją funkcję APC; skutecznie stymulują namnażanie i wydzielanie IFN-γ przez autologiczne i alogeniczne komórki PBMC; co więcej, komórki ADHAPI są w większości przypadków silniejszymi stymulatorami wzmiankowanych procesów, niż komórki stosowane
PL 211 907 B1 jako kontrola. Istotnym jest przy tym, że oprócz antygenów CTA, komórki ADHAPI mogą jednocześnie wytwarzać wyższe niż komórki używane jako kontrola, ilości antygenów HLA klasy I i/lub różnych cząsteczek kostymulujących/dodatkowych. Dowody te jasno obrazują dużą przewagę komórek ADHAPI jako autologicznych szczepionek komórkowych, w porównaniu z autologicznymi komórkami nowotworowymi, które są mało immunogenne i nie ekspresjonują konstytutywnie kilku cząsteczek kostymulujących/dodatkowych. Co więcej, w porównaniu z wytworzonych i rozwiniętych ex vivo autologicznych komórek dendrytycznych, szczepionki zawierające komórki ADHAPI są wytwarzane z w pełni dojrzałych i immunokompetentnych APC; co usuwa potencjalne ograniczenie w postaci etapu dojrzewania, istniejące w przypadku używania komórek dendrytycznych, w produkcji szczepionek komórkowych, które może powodować ich tolerowanie a nie immunogenność w stosunku do komórek gospodarza.
W porównaniu z innymi szczepionkami komórkowymi, uzyskiwanie ex vivo szczepionek zawierających komórki ADHAPI, które jednocześnie ekspresjonują liczne/wszystkie CTA regulowane przez metylację, jest proste, w większości przypadków szybkie, nie wymaga niewygodnych operacji in vitro na komórkach ani manipulacji genetycznych, nie wymaga autologicznej tkanki nowotworowej i daje wysoką powtarzalność wyników dla komórek PBMC od osób zdrowych i pacjentów z chorobą nowotworową.
Co więcej, blisko 100% preparatów z komórek ADHAPI prezentuje wszystkie testowane antygeny CTA, które są indukowane przez demetylację w komórkach APC. Dzięki takiej charakterystyce, standaryzacja i kontrola jakości (np. przez cytometrię przepływową opartą o wybrane cząsteczki na powierzchni komórek i reakcję RT-PCR dla wybranych CTA) i potencjału (np. przez ilościową reakcję RT-PCR dla wybranych CTA) jest łatwiejsza w przypadku produkcji szczepionek zawierających komórki ADHAPI. Dodatkowo, w porównaniu z innymi szczepionkami komórkowymi, które, jak dotąd, muszą być świeżo przygotowywane za każdym razem kiedy są podawane pacjentom, co w sposób oczywisty powoduje różnice między poszczególnymi preparatami (np. różnorodność komórkową, profilu fenotypowego komórek zawartych w szczepionce, ilości wprowadzonego syntetycznego peptydu/syntetycznych peptydów CTA, syntetycznego białka CTA w całości lub preparatu całych komórek nowotworowych, efektywności uzyskiwania komórek hybrydowych w wyniku elektrofuzji komórek nowotworowych i dendrytycznych); szczepionki zawierające komórki ADHAPI po przygotowaniu i przeprowadzeniu testów żywotności, jakości i potencjału immunogennego, mogą być porcjonowane, właściwie mrożone i przechowywane w formie żywej do momentu użycia w celach terapeutycznych. Co więcej, ponieważ nie wymagają one zetknięcia z autologiczną tkanką nowotworową ani tworzenia hybrydowych komórek dendrytyczno-nowotworowych ex vivo i ponieważ mogą być szybko przygotowywane w dużych ilościach przez wielokrotną leukaferezę, komórki ADHAPI dostarczają właściwie nieograniczonego źródła czynnika terapeutycznego dla każdego pacjenta.
W świetle jednoczesnej ekspresji licznych/wszystkich antygenów CTA regulowanych przez metylację, które są syntetyzowane endogennie i które mogą bezpośrednio i równocześnie trafić na szlaki obróbki antygenu HLA klasy I i II, wynikającej ze zdolności do ekspresjonowania i prezentowania komórkom T gospodarza regulowanych metylacją, a dotąd nie zidentyfikowanych i nie scharakteryzowanych, antygenów CTA (jak również nieimmunodominujących epitopów znanych i dotąd nieznanych antygenów CTA), jak i z powodu ciągle ograniczonej liczby znanych immunogennych epitopów pochodzących ze znanych antygenów CTA prezentowanych przez HLA klasy I i II, które mogą w ten sposób być stosowane do celów terapeutycznych tylko zgodnie z fenotypem HLA pacjenta; dodatkową zaletą komórek ADHAPI jest to, że najprawdopodobniej są one zdolne do jednoczesnego prezentowania znanych i nieznanych dotąd epitopów immunogennych różnych CTA w zestawieniu z jakimkolwiek i wieloma haplotypami HLA klasy I i II. W związku z powyższym, w porównaniu ze szczepionkami komórkowymi zawierającymi syntetyczny peptyd/syntetyczne peptydy CTA lub syntetyczne białko CTA w całości, możliwość leczenia szczepionkami zawierającymi komórki ADHAPI, nie jest ograniczona do pacjentów o zdefiniowanym fenotypie HLA; toteż wszyscy pacjenci z chorobami nowotworowymi, których zmiany rakowe wytwarzają jeden lub więcej antygenów CTA mogą być kandydatami do leczenia przy pomocy szczepionek zawierających komórki ADHAPI, niezależnie od ich fenotypu HLA. Spośród znanych antygenów CTA, jeden lub więcej jest wytwarzany w większości badanych guzów złośliwych o różnym typie histologicznym, stąd szczepienie komórkami ADHAPI mogłoby być zastosowane u znacznej większości pacjentów z chorobami nowotworowymi. Według znaczących danych MAGE, GAGE lub NY-ESO-1 są wytwarzane w 96% ludzkich nowotworów (Cancer Immunol. Immunother. 50:3-15, 2001).
PL 211 907 B1
W porównaniu ze szczepionkami komórkowymi zawierającymi syntetyczny peptyd/syntetyczne peptydy CTA lub syntetyczne białko CTA w całości, w przypadku których ograniczone ilości białka(białek) mogą być ex vivo dostarczane do HLA klasy I lub II szczepionek komórkowych, znacząco hamując immunogenność podawanego antygenu CTA i ze względu na ich jednoczesną ekspresję licznych/wszystkich antygenów CTA regulowanych przez metylację, komórki ADHAPI podczas trwania leczenia mogą zapobiegać selekcji immunologicznej wariantów nowotworu nie wytwarzających pojedynczego lub kilku antygenów CTA oraz konstytutywnie heterogennej lub negatywnie regulowanej ekspresji różnych CTA zachodzącej w specyficznych ogniskach nowotworu. Szczepionki zawierające komórki ADHAPI są tworzone przez autologiczne funkcjonalne komórki APC, które jednocześnie wytwarzają liczne/wszystkie znane regulowane metylacją antygeny CTA i które najprawdopodobniej wytwarzają dotąd nie zidentyfikowane antygeny CTA, których ekspresja jest regulowana metylacja DNA; co więcej, szczepionki zawierające komórki ADHAPI mogą być stosowane w przypadku pacjentów chorych na nowotwory wytwarzające antygeny CTA o różnym typie histologicznym. Takie właściwości funkcjonalne i fenotypowe stanowią o niewątpliwej przewadze szczepionek zawierających komórki ADHAPI nad obecnie używanymi szczepionkami zawierającymi alogeniczne komórki nowotworowe (np. lizaty z całych zebranych linii komórek nowotworowych lub nie oczyszczonych ekstraktów tych komórek, antygeny z zebranych linii komórek nowotworowych). Istotnie, szczepionki z komórek nowotworowych mogą, ale nie muszą, zawierać wystarczających ilości znanych lub dotąd nieznanych immunologicznie istotnych antygenów CTA, mogą zawierać nieistotne składniki komórkowe współzawodniczące z antygenami CTA o odpowiedź immunologiczną, mogą mieć zwiększoną toksyczność ze względu na swoją alogenność, wymagają wydajnej obróbki przy pomocy układu immunologicznego pacjenta i mogą być używane jedynie u pacjentów dotkniętych nowotworem złośliwym o tym samym typie histologicznym.
Komórki ADHAPI w porównaniu z modyfikowanymi genetycznie szczepionkami zawierającymi komórki CTA
Wytworzenie komórek ADHAPI nie wymaga manipulacji genetycznych ex vivo na autologicznych komórkach dendrytycznych lub innych autologicznych komórkach APC, które są niezbędne do wyprodukowania genetycznie zmodyfikowanych szczepionek komórkowych ekspresjonujących wybrane CTA po transfekcji lub transdukcji. Co więcej, w porównaniu z komórkami ADHAPI, szczepionki komórkowe modyfikowane genetycznie mają wiele ograniczeń, w tym: i) niska wydajność dostępnych technik transfekcji; ii) indukcja odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenom wektorów wirusowych używanych do transdukcji komórkowych, co prowadzi do zniszczenia genetycznie zmodyfikowanych komórek szczepionki; iii) obecność istniejących uprzednio lub indukowanych szczepieniem, przeciwciał neutralizujących kolidujących z podawaniem szczepionki; iv) bezpośredni wpływ wektorów wirusowych na żywotność, dojrzewanie i zdolność do prezentowania antygenu transdukowanych komórek (Jenne L. et al., Trends Immunol., 22:102-107, 2001).
T a b e l a I
Ilość odzyskanych komórek ADHAPI i komórek stosowanych jako kontrola
| Typ komórek | Komórki ADHAPI | Komórki kontrolne |
| B-EBVa | 114 ± 25 | 175 ± 51 |
| PWM-Bb | 16 ± 5 | 38 ± 17 |
| CD40L-Bc | 75 ± 27 | 96 ± 5 |
| PWM-PBMCd | 26 ± 11 | 45 ± 16 |
| PHA-PBMC® | 23 ± 11 | 63 ± 25 |
| PHA+PWM-PBMCf | 35 ± 28 | 63 ± 36 |
a Dane stanowią iloś ci ś rednie % ± SD (odchylenie standardowe) odzyskanych komórek porównaniu z iloś cią komórek (100%) użytych do ich otrzymania w wyniku 3 (a), 4 (b), 4 (c), 4 (d), 7 (e), i 5 (f) niezależ nych eksperymentów.
PL 211 907 B1
T a b e l a II
Profil fenotypowy komórek ADHAPI i komórek używanych jako kontrola*
| Antygen | Komórki ADHAPI | |||||
| CD40L-Bat | B-EBVb | Pwm-PBMCc | PWM-Bd | PHA-PBMC® | PHA+PWM- PBMCf | |
| HLA klasy I | f ns | Ns | ns | ns | ns | 0,02g |
| Lokus HLA-A | ns | Ns | nth | nt | 0,004 | nt |
| Lokus HLA-B | ns | Ns | nt | nt | 0,05 | nt |
| Allele HLA-A | 0,01 | Ns | ns | ns | 0,008 | 0,006 |
| Allele HLA-B | ns | Ns | nt | nt | ns | nt |
| CD40 | ns | 0,01 | ns | 0,005 | ns | ns |
| CD54 | 0,03 | 0,01 | ns | ns | 0,003 | ns |
| HLA Klasy II | ns | Ns | ns | 0,03 | ns | 0,05 |
| CD56 | nt | Nt | nt | ns | nt | nt |
| CD58 | ns | Ns | nt | nt | ns | ns |
| CD59 | nt | Nt | ns | ns | nt | 0,04 |
| CD80 | 0,05 | Ns | ns | ns | ns | ns |
| CD81 | nt | 0,002 | nt | nt | ns | nt |
| CD86 | 0,008 | Nt | ns | ns | nt | ns |
* Dane został y uzyskane za pomocą testu t-Studenta dla powiązanych par wyników, wartości średniej intensywności fluorescencji zostały uzyskane techniką cytometrii przepływowej w wyniku 6 (a), 6 (b), 4 (c), 4 (d), 6 (e), 2 (f) niezależnych pomiarów. Statystycznie znaczące róż nice były niezmiennie wynikiem podwyższonej ekspresji badanego antygenu w komórkach ADHAPI w porównaniu z autologicznymi komórkami stosowanymi jako kontrola.
f nie znaczące;
g wartość p h nie testowane t Komórki ADHAPI/CD40L-B= 82-100% CD20+; Komórki CD40L-B używane jako kontrola= 87-99% CD20+.
T a b e l a III
Ilość uwalnianego IFN-γ przez autologiczne (aMLR) i alogeniczne (MLR) komórki PBMC (R) stymulowane komórkami ADHAPI (S) i komórkami jako kontrola (S) określana za pomocą testu ELISA.
| Typ komórek | AMLR | MLR | ||
| Komórki kontrolne | Komórki ADHAPI | Komórki kontrolne | Komórki ADHAPI | |
| B-EBVa | 1770±919 | 2360 ± 85 0,5g | nth | nt |
| PWM-Bb | 4330 ± 629 | 5530 ± 804 0,06 | 4040 ± 721 | 4950 ± 476 0,08 |
| CD40L-Bc | 330 ±197 | 429±153 0,1 | nt | nt |
| PMW-PBMCd | 1500±135 | 1520 ±175 0,6 | nt | nt |
| PHA-PBMC® | 140 ± 70 | 956 ± 436 0,1 | 267±119 | 1040± 545 0,07 |
| PHA+PMW+PBMCf | 790 ± 236 | 831 ± 244 0,09 | 819±184 | 830±169 0,7 |
• Dane stanowią ilości średnie ± SD (odchylenie standardowe) IFN-γ uwalnianego uzyskane w wyniku dwóch (a), czterech (b), czterech (c), czterech (d), trzech (e) i czterech (f) niezależnych pomiarów. Stosunek S/R wynosił: 3:1 (a), 1:1 (b), 1:2 (c), 1:1 (d), 1:1 (e), 1:2 (f). Uwalnianie IFN-γ było badane po 24 godz. (a), sześciu dniach (b), 24 godz. (c), sześciu dniach (d), 24 godz. (e) i sześciu dniach (f) po rozpoczęciu hodowli; g wartość względna w stosunku do komórek używanych jako kontrola była uzyskana wg testu t-Studenta dla powiązanych par wyników; h nie testowane.
Claims (19)
1. Sposób otrzymywania komórek prezentujących antygen nowotworowy (Cancer Testis Antygen CTA), obejmujący etapy, w których:
a) aktywuje się komórki PBMC pobrane od pacjenta,
b) hoduje się i ewentualnie rozwija się ex vivo zaktywowane komórki, znamienny tym, że
c) poddaje się wyhodowane i ewentualnie rozwinięte komórki działaniu 5-azo-2'-deoksycytydyny czterokrotnie, co 12 godzin, a następnie zastępuje się połowę płynu hodowlanego świeżym płynem hodowlanym i prowadzi się hodowlę przez następne 48 godzin, tak, aby komórki te jednocześnie ekspresjonowały wielorakie antygeny nowotworowe (Cancer Testis Antigens).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pacjent jest pacjentem z chorobą nowotworową.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wspomniane komórki są linią unieśmiertelnionych komórek limfoblastoidalnych B nowotworu związanego z zakażeniem wirusem Epsteina-Barr.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wspomniane komórki są limfocytami B aktywowanymi mitogenem szkarłatki (PWM).
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wspomniane komórki są limfocytami B aktywowanymi CD40.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wspomniane komórki są komórkami PBMC aktywowanymi fitohemaglutyniną PHA + rekombinowaną ludzką interleukiną 2 (rhiIL-2).
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wspomniane komórki są komórkami PBMC aktywowanymi fitohemaglutyniną PHA + rekombinowaną ludzką interleukiną 2 (rhiIL-2) + mitogenem szkarłatki (PWM).
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wspomniane komórki są komórkami dendrytycznymi, monocytami, makrofagami.
9. Komórki stale i jednocześnie ekspresjonujące antygeny nowotworowe (CTA), przy czym komórki otrzymano sposobem określonym w dowolnym z zastrz. od 1 do 8 a ekspresjonowany antygen został wybrany spośród: MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, NY-ESO-1, GAGE 1-6, SSX-2.
10. Zastosowanie komórek jak określono w zastrz. 9 i/lub ich składników komórkowych do wytwarzania leku do zapobiegania i leczenia chorób nowotworowych o różnym typie histologicznym, związanym z konstytutywną ekspresją jednego lub więcej antygenów nowotworowych.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że wspólne antygeny nowotworowe są immunodominującymi antygenami nowotworowymi.
12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że wspólne antygeny nowotworowe nie są immunodominujące.
13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że wspólne antygeny nowotworowe są antygenami CTA.
14. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że wspomniane komórki są gromadzone jako rezerwuar zebranych antygenów.
15. Szczepionka przeciwnowotworowa zawierająca komórki określone w zastrz. 9.
16. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że jest szczepionką autologiczną.
17. Szczepionka według zastrz. 15, znamienna tym, że jest szczepionką alogeniczną.
18. Szczepionka według zastrz. 16 albo 17, znamienna tym, że wspomniane komórki są stosowane jako rezerwuar zebranych antygenów.
19. Szczepionka według zastrz. 18, znamienna tym, że użyte są składniki komórkowe wspomnianych komórek.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/IT2001/000419 WO2003012085A1 (en) | 2001-07-30 | 2001-07-30 | Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines |
| PCT/IT2002/000488 WO2003012086A1 (en) | 2001-07-30 | 2002-07-25 | Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL367617A1 PL367617A1 (pl) | 2005-03-07 |
| PL211907B1 true PL211907B1 (pl) | 2012-07-31 |
Family
ID=11133712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL367617A PL211907B1 (pl) | 2001-07-30 | 2002-07-25 | Komórki ekspresjonujące antygeny nowotworowe, sposób ich otrzymywania, ich zastosowanie oraz zawierająca je szczepionka przeciwnowotworowa |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20030119187A1 (pl) |
| EP (1) | EP1412485B1 (pl) |
| JP (1) | JP2004536615A (pl) |
| KR (1) | KR100916670B1 (pl) |
| CN (1) | CN100591762C (pl) |
| AT (1) | ATE505533T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002334387B2 (pl) |
| BR (1) | BR0211520A (pl) |
| CA (1) | CA2453522C (pl) |
| DE (1) | DE60239741D1 (pl) |
| DK (1) | DK1412485T3 (pl) |
| ES (1) | ES2367256T3 (pl) |
| HU (1) | HUP0401753A3 (pl) |
| MX (1) | MXPA04000885A (pl) |
| PL (1) | PL211907B1 (pl) |
| WO (2) | WO2003012085A1 (pl) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003012085A1 (en) | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines |
| US6982253B2 (en) | 2002-06-05 | 2006-01-03 | Supergen, Inc. | Liquid formulation of decitabine and use of the same |
| WO2004110481A2 (en) * | 2003-02-06 | 2004-12-23 | Cerus Corporation | Listeria attenuated for entry into non-phagocytic cells, vaccines comprising the listeria, and methods of use thereof |
| WO2004084936A2 (en) * | 2003-02-06 | 2004-10-07 | Cerus Corporation | Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof |
| US7695725B2 (en) * | 2003-02-06 | 2010-04-13 | Aduro Biotech | Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof |
| DE10329240A1 (de) * | 2003-06-24 | 2005-01-20 | Epigenomics Ag | Verfahren zur Analyse des Cytosin-Methylierungsstatus von Cancer-Testis-Antigenen für eine individualisierte Immuntherapie |
| US7842289B2 (en) * | 2003-12-24 | 2010-11-30 | Aduro Biotech | Recombinant nucleic acid molecules, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof |
| US7619058B2 (en) | 2004-01-20 | 2009-11-17 | Aichi Prefecture | Epitope/peptide recognized by HLA-A2402-restricted Ep-CAM-specific CTL and use of the same |
| WO2005075646A1 (ja) * | 2004-02-03 | 2005-08-18 | Kurume University | ストレス誘導抗アポトーシス分子（ｉｅｘ−１）由来ペプチド |
| US7250416B2 (en) | 2005-03-11 | 2007-07-31 | Supergen, Inc. | Azacytosine analogs and derivatives |
| WO2007011693A2 (en) | 2005-07-14 | 2007-01-25 | Medistem Laboratories, Inc. | Compositions of placentally-derived stem cells for the treatment of cancer |
| US7700567B2 (en) | 2005-09-29 | 2010-04-20 | Supergen, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| GB0700058D0 (en) * | 2007-01-03 | 2007-02-07 | Scancell Aps | Anti-tumor vaccine based on normal cells |
| EP2698430A3 (en) * | 2009-12-08 | 2014-03-05 | Wilson Wolf Manufacturing Corporation | Methods of cell culture for adoptive cell therapy |
| RU2644635C2 (ru) * | 2011-07-07 | 2018-02-13 | Рисёрч Кансер Инститьют Оф Америка | Системы, способы и составы для лечения рака |
| US8933078B2 (en) | 2011-07-14 | 2015-01-13 | Research Cancer Institute Of America | Method of treating cancer with combinations of histone deacetylase inhibitors (HDAC1) substances |
| HUE042327T2 (hu) | 2011-08-30 | 2019-06-28 | Astex Pharmaceuticals Inc | Decitabin-származék készítmények |
| PL2914254T3 (pl) * | 2012-10-30 | 2020-09-07 | Mei Pharma, Inc. | Terapie skojarzone w leczeniu nowotworów chemoodpornych |
| US9562219B2 (en) | 2013-12-27 | 2017-02-07 | SOTIO a.s. | Cryopreservation of apoptotic cancer cells for use in immunotherapy against cancer |
| CA2986687A1 (en) * | 2015-05-22 | 2016-12-01 | Brian J. Czerniecki | Manufacturing multi-dose injection ready dendritic cell vaccines |
| HK1254645A1 (zh) | 2015-07-02 | 2019-07-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | 冻乾药物组合物 |
| CN105132371B (zh) * | 2015-07-24 | 2016-05-25 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 体外提呈、激活dc细胞的方法及其应用 |
| US10052372B2 (en) * | 2016-05-24 | 2018-08-21 | Tessa Therapeutics Pte Ltd | T cell expansion |
| WO2018157081A1 (en) | 2017-02-27 | 2018-08-30 | Research Cancer Institute Of America | Compositions, methods, systems and/or kits for preventing and/or treating neoplasms |
| WO2018170457A1 (en) | 2017-03-17 | 2018-09-20 | Research Cancer Institute Of America | Compositions, methods, systems and/or kits for preventing and/or treating neoplasms |
| SG11202000932XA (en) | 2017-08-03 | 2020-02-27 | Otsuka Pharma Co Ltd | Drug compound and purification methods thereof |
| CN107557333B (zh) * | 2017-10-16 | 2018-07-31 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 一种用于细胞治疗的新抗原呈递细胞的制备方法 |
| EP3710434A4 (en) | 2017-11-17 | 2021-07-28 | Research Cancer Institute of America | COMPOSITIONS, METHODS, SYSTEMS AND / OR KITS FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF NEOPLASMS |
| KR102319259B1 (ko) | 2019-07-26 | 2021-10-28 | 정재웅 | 지반천공기용 확장리더 안전제어장치 |
| WO2021027057A1 (zh) * | 2019-08-15 | 2021-02-18 | 成都冕康生物科技有限公司 | 一种针对ebv病毒抗原的b细胞疫苗及其制备方法 |
| CN114099655A (zh) * | 2021-11-16 | 2022-03-01 | 苏州大学 | 一种预防或治疗癌症的疫苗系统及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1185811A (zh) * | 1995-03-31 | 1998-06-24 | H·沃尔夫 | 依赖于逆转录病毒样颗粒的抗原呈递系统 |
| CA2302316A1 (en) * | 1997-09-15 | 1999-03-25 | Genetic Immunity, Llc. | Method of delivering genes to antigen presenting cells of the skin |
| US6613753B2 (en) | 2001-02-21 | 2003-09-02 | Supergen, Inc. | Restore cancer-suppressing functions to neoplastic cells through DNA hypomethylation |
| WO2003012085A1 (en) | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines |
-
2001
- 2001-07-30 WO PCT/IT2001/000419 patent/WO2003012085A1/en not_active Ceased
- 2001-10-18 US US09/981,239 patent/US20030119187A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-07-25 EP EP02791520A patent/EP1412485B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-25 KR KR1020047001217A patent/KR100916670B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-25 DE DE60239741T patent/DE60239741D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-25 JP JP2003517263A patent/JP2004536615A/ja active Pending
- 2002-07-25 AU AU2002334387A patent/AU2002334387B2/en not_active Expired
- 2002-07-25 MX MXPA04000885A patent/MXPA04000885A/es active IP Right Grant
- 2002-07-25 HU HU0401753A patent/HUP0401753A3/hu unknown
- 2002-07-25 AT AT02791520T patent/ATE505533T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-07-25 BR BR0211520-4A patent/BR0211520A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-07-25 ES ES02791520T patent/ES2367256T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-25 PL PL367617A patent/PL211907B1/pl unknown
- 2002-07-25 CA CA2453522A patent/CA2453522C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-25 DK DK02791520.6T patent/DK1412485T3/da active
- 2002-07-25 US US10/485,351 patent/US7883889B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-25 WO PCT/IT2002/000488 patent/WO2003012086A1/en not_active Ceased
- 2002-07-25 CN CN02815007A patent/CN100591762C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-07-26 US US10/898,187 patent/US20050002920A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0401753A2 (hu) | 2004-11-29 |
| PL367617A1 (pl) | 2005-03-07 |
| JP2004536615A (ja) | 2004-12-09 |
| CA2453522A1 (en) | 2003-02-13 |
| CA2453522C (en) | 2013-04-30 |
| HUP0401753A3 (en) | 2011-04-28 |
| ATE505533T1 (de) | 2011-04-15 |
| EP1412485B1 (en) | 2011-04-13 |
| CN1537161A (zh) | 2004-10-13 |
| US7883889B2 (en) | 2011-02-08 |
| WO2003012085A1 (en) | 2003-02-13 |
| DE60239741D1 (de) | 2011-05-26 |
| US20050002920A1 (en) | 2005-01-06 |
| HK1068913A1 (zh) | 2005-05-06 |
| EP1412485A1 (en) | 2004-04-28 |
| WO2003012086A1 (en) | 2003-02-13 |
| US20030119187A1 (en) | 2003-06-26 |
| KR20040021662A (ko) | 2004-03-10 |
| DK1412485T3 (da) | 2011-08-01 |
| US20040185563A1 (en) | 2004-09-23 |
| MXPA04000885A (es) | 2004-06-03 |
| ES2367256T3 (es) | 2011-10-31 |
| KR100916670B1 (ko) | 2009-09-08 |
| AU2002334387B2 (en) | 2007-10-04 |
| BR0211520A (pt) | 2004-09-14 |
| CN100591762C (zh) | 2010-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL211907B1 (pl) | Komórki ekspresjonujące antygeny nowotworowe, sposób ich otrzymywania, ich zastosowanie oraz zawierająca je szczepionka przeciwnowotworowa | |
| AU2002334387A1 (en) | Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines | |
| Liau et al. | Treatment of intracranial gliomas with bone marrow—derived dendritic cells pulsed with tumor antigens | |
| Weigel et al. | Comparative analysis of murine marrow–derived dendritic cells generated by Flt3L or GM-CSF/IL-4 and matured with immune stimulatory agents on the in vivo induction of antileukemia responses | |
| RU2313365C2 (ru) | Фармацевтическая композиция для индукции иммунной реакции у человека | |
| JP4662776B2 (ja) | 抗原負荷した樹状細胞ワクチンを前駆体から発生させる迅速ワンステップ法 | |
| US20100303868A1 (en) | Ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases | |
| MXPA03010254A (es) | Metodo de terapia celular para el tratamiento de tumores. | |
| Kalady et al. | Dendritic cells pulsed with pancreatic cancer total tumor RNA generate specific antipancreatic cancer T cells | |
| WO2002053176A2 (en) | An autologous anti-cancer vaccine | |
| ES2340358T3 (es) | Uso de lineas celulares alogenicas para cargar celulas que presentan antigenos para elicitar respuestas inmunes. | |
| Osman et al. | Activation of autologous or HLA-identical sibling cytotoxic T lymphocytes by blood derived dendritic cells pulsed with tumor cell extracts. | |
| Abdel-Wahab et al. | Cotransfection of DC with TLR4 and MART-1 RNA induces MART-1-specific responses | |
| Wang et al. | Effect of dendritic cell vaccine against a tongue squamous cell cancer cell line (Tca8113) in vivo and in vitro | |
| O'Neill et al. | Immunotherapeutic potential of dendritic cells generated in long term stroma-dependent cultures | |
| HK1068913B (en) | Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines | |
| WO2001062092A1 (en) | Formulations and methods for using the same to elicit an immune response | |
| He et al. | Anti-tumor immune responses in immune-reconstituted mice injected with a tumor vaccine | |
| Çiftçi et al. | Current approaches in the treatment of melanoma-II: Immuno-and gene therapy | |
| Cha | MARRYING IMMUNOTHERAPY AND CHEMOTHERAPY: A CANCER THERAPY BASED ON T LYMPHOCYTE EXPANSION AUGMENTED BY ALTERNATE GAMMA CHAIN CYTOKINES AND GEMCITABINE-MEDIATED INHIBITION OF MYELOID DERIVED SUPPRESSOR CELLS |