ES2340358T3 - Uso de lineas celulares alogenicas para cargar celulas que presentan antigenos para elicitar respuestas inmunes. - Google Patents
Uso de lineas celulares alogenicas para cargar celulas que presentan antigenos para elicitar respuestas inmunes. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de células dendríticas para preparar una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune citotóxica específica para un tumor en un paciente humano que presenta un tumor, donde dichas células dendríticas se preparan in vitro mediante (a) co-incubación de células dendríticas de dicho paciente con células tumorales humanas, alogénicas, apoptóticas, para formas células dendríticas cargadas, donde dichas células tumorales alogénicas poseen al menos un antígeno compartido entre las células tumorales alogénicas y las células tumorales de dicho paciente, y donde dicha respuesta inmune citotóxica está dirigida contra dicho antígeno tumoral compartido para causar rechazo del tumor.
Description
Uso de líneas celulares alogénicas para cargar
células que presentan antígenos para elicitar respuestas
inmunes.
Esta invención se refiere a células
inmunogénicas modificadas genéticamente.
Las células dendríticas (denominadas en lo
sucesivo "DC") son las únicas células presentadoras de
antígenos, o APC, capaces de inducir respuestas inmunes primarias
(Cella, et al. 1997. "Origin, maturation and antigen
presenting functions of dendritic cells", Curr Opin
Immunol 9: Banchereau, J., and R.M. Steinman. 1998.
"Dendritic cells and the control of immunity", Nature 392:245).
Los precursores de DC circulantes se dirigen a los tejidos donde
residen como células capturadoras de antígenos inmaduras, con alta
actividad de endocitosis y fagocitosis. Después de la captación de
antígenos, las DC migran a los órganos linfoides secundarios, donde
maduran y se convierten en células presentadoras de antígenos
capaces de seleccionar y activar células T CD4+ vírgenes
específicas de antígenos. Esto permite la diversificación de la
respuesta y la activación de efectores específicos de antígenos
como los linfocitos T citotóxicos específicos de antígenos
(denominados en lo sucesivo "CTL") y células B, así como
efectores no específicos, como las células NK, macrófagos y
eosinófilos (Sogn, J.A. 1998. "Tumor immunology: the glass is half
full", Immunity 9:757).
Las DC se han utilizado para provocar una
respuesta inmune contra los tumores. La inducción de la inmunidad
tumoral puede ser vista como un proceso de tres etapas que incluye:
1) presentación de antígenos asociados a tumores; 2) selección y
activación de antígenos asociados a tumores - células T específicas,
así como efectores no específicos, 3) localización de antígenos
asociados a tumores - células T específicas para el sitio del
tumor, y 4) reconocimiento de los elementos de restricción que
conducen a la destrucción de las células tumorales. La Patente
Estadounidense Nº 5.637.483, otorgada a Dranoff et al.,
describe un método por el cual las células tumorales modificadas
que expresan citocinas como GM-CSF e
IL-2, son irradiadas o se tornan incompetentes en
cuanto a su proliferación y posteriormente administradas a un
paciente para actuar como estimuladoras o supresoras del sistema
inmunológico sistémico de un paciente. Experimentos en ratones han
demostrado el desarrollo de respuestas antitumorales protectoras y
terapéuticas inducidas por DC cargadas con antígenos asociados a
tumores (Bell, et al. 1999. "Dendritic cells", Adv
Immunol 72:255). Además, ensayos clínicos piloto en seres
humanos demuestran la viabilidad de la administración de DC y la
capacidad de DC cargadas con péptidos de inducir respuestas de
células T específicas para péptidos en pacientes con linfoma,
melanoma maligno y carcinoma de próstata (Mukherji, et al.
1995. "Induction of antigen-specific cytolytic T
cells in situ in human melanoma by immunization with
synthetic peptide-pulsed autologous antigen
presenting cells", Proc Natl Acad Sci USA 92:8078; Hsu,
et al. 1996. "Vaccination of patients with
B-cell lymphoma using autologous
antigen-pulsed dendritic cells", Nat Med
2:52; Gilboa, E., et al. 1998. "Immunotherapy of cancer
with dendritic cell-based vaccines", Cancer
Immunol Immunother 46:82; Nestle, et al. 1998.
"Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor
lysate-pulsed dendritic cells", Nat Med
4:328; Tjoa, et al. 1998. "Evaluation of phase I/Il
clinical trials in prostate cancer with dendritic cells and PSMA
peptides", Prostate 36:39).
Para que las DC afecten el sistema inmunológico,
las células deben poseer fragmentos peptídicos procesados para
interactuar con las células T, o estar "cargadas". Uno de los
desafíos críticos para el uso de DC como vectores de inmunoterapia
es la identificación de un abordaje eficiente para la carga de
antígenos. Se han empleado varios sistemas para suministrar
antígenos asociados a tumores a las DC que incluyen: 1) péptidos
definidos de secuencias conocidas (Mayordomo, et al. 1995.
"Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with
synthetic tumor peptides elicit protective and therapeutic antitumor
immunity", Nat Med 1:1297; Celluzzi, et al. 1996.
"Peptide-pulsed dendritic cells induce
antigen-specific CTL-mediated
protective tumor immunity", J Exp Med 183:283); 2)
péptidos indefinidos eluidos con ácido de tumores autólogos
(Zitvogel, et al. 1996. "Therapy of murine tumors with
tumor peptide-pulsed 2dendritic cells: dependence on
T cells, B7 costimulation, and T helper cell
1-associated cytokines", J Exp Med
183:87); 3) lisados de tumor enteros (Fields, et al. 1998.
"Murine dendritic cells pulsed with whole tumor lysates mediate
potent antitumor immune responses in vitro and in
vivo", Proc Natl Acad Sci USA 95:9482); 4) vectores de
retrovirus y adenovirus (Song, et al. 1997. "Dendritic
cells genetically modified with an adenovirus vector encoding the
cDNA for a model antigen induce protective and therapeutic
antitumor immunity", J Exp Med 186:1247; Specht, et
al. 1997. "Dendritic cells retrovirally transduced with a
model antigen gene are therapeutically effective against established
pulmonary metastases", J Exp Med 186:1213); 5) ARN
derivado de células tumorales (Boczkowski, et al. 1996.
"Dendritic cells pulsed with RNA are potent
antigen-presenting cells in vitro and in
vivo", J Exp Med 184:465); y 6) fusión de DC con
células tumorales (Gong, et al. 1998. "Reversal of
tolerance to human MUCI antigen in MUCI transgenic mice immunized
with fusions of dendritic and carcinoma cells", Proc Natl Acad
Sci USA 95:6279).
Aunque todos los métodos para suministrar
antígenos asociados a tumores descritos anteriormente inducen
respuestas de células T y causan efectos anti- tumorales
considerables, cada uno tiene sus desventajas potenciales (Sogn,
J.A. 1998. "Tumor immunology: the glass is half full",
Immunity 9:757). Ante todo, los abordajes basados en
péptidos están limitados por 1) el conocimiento del haplotipo del
MHC de cada paciente; 2) el conocimiento de los motivos de unión al
MHC clase I correspondiente de los antígenos asociados al tumor; 3)
la variabilidad de la afinidad de unión al MHC clase I de los
péptidos sintéticos; y 4) el conocimiento de si varios péptidos
definidos, o cuáles de ellos, representan antígenos asociados a
tumores in vivo.
A diferencia de un abordaje basado en péptidos
que requiere información sobre el haplotipo del MHC y la secuencia
del péptido, el tejido tumoral no fraccionado puede proporcionar
epitopos de MHC clase I y de MHC clase II sin la identificación de
antígenos asociados a tumores. Estudios recientes han demostrado la
capacidad de las DC para capturar células muertas o moribundas y
provocar respuestas CTL secundarias restringidas de MHC clase I
(Albert, et al. 1998. "Dendritic cells acquire antigen from
apoptotic cells and induce class l- restricted CTLs",
Nature 392:86; Albert, et al. 1998.
"Tumor-specific killer cells in paraneoplastic
cerebellar degeneration", Nat Med 4:1321). Estos estudios
indicaron que 1) las DC cargadas con células infectadas con virus de
influenza muertas o moribundas pueden activar los linfocitos para
montar respuestas CTL específicas para virus; y 2) las DC que
capturan células tumorales muertas o moribundas pueden presentar
antígenos a células T específicas para péptidos de antígenos
asociados a tumores que se obtuvieron de pacientes con degeneración
cerebelosa paraneoplásica. Debido a la posibilidad de que las DC
modificadas genéticamente contribuyan de manera positiva en el
tratamiento de las enfermedades humanas, se desea un método sencillo
para su producción.
La Patente Estadounidense Nº 5.851.756 otorgada
a Steinman et al. revela métodos por los cuales pueden
producirse in vitro cultivos proliferantes de precursores de
DC y DC maduras. Steinman et al. describen la producción de
antígenos dependientes de células T usando cultivos de DC maduras,
donde los antígenos se componen de antígenos modificados por DC o
DC activadas por antígenos. Steinman et al. describen además
que los antígenos modificados por DC o las DC activadas por
antígenos pueden ser utilizados como inmunógenos para vacunas o el
tratamiento de enfermedades infecciosas.
Los principales problemas en la inmunoterapia
tumoral experimentados en los métodos presentados anteriormente son
el número limitado de los antígenos asociados a tumores bien
definidos y la falta de evidencia de que los antígenos asociados a
tumores conocidos representan realmente antígenos de rechazo in
vivo. Además, el uso de péptidos de unión de MHC clase I se
asocia con la restricción del HLA y la limitación de respuestas
inmunes inducidas a células T CD8+. En este contexto, el uso de
material antigénico no fraccionado, en forma de células tumorales
alogénicas muertas o moribundas, que proporciona epítopos de MHC
clase I y clase II que conduce a una respuesta inmune diversificada
que incluye numerosos clones de células T CD4+ y CTL representa una
alternativa interesante.
La Solicitud Internacional Nº WO 99/42564 de
Albert et al. revela métodos dirigidos hacia el desarrollo de
terapias para aumentar la inmunidad de pacientes a infecciones
crónicas y tumores mediante la inducción de células tumorales o
infectadas a la apoptosis; el acceso de las células tumorales o
infectadas a células dendríticas maduras, fagocíticas; y la
exposición de células dendríticas cebadas con células apoptóticas
que expresan el antígeno de interés a células T in vivo o
in vitro para la inducción de respuestas de células T
específicas para antígenos.
Hemos desarrollado ahora un método para
modificar genéticamente DC inmunogénicas. Hemos perfeccionado un
proceso que utiliza células presentadoras de antígenos, humanas,
inmaduras, que incluyen DC, derivadas de voluntarios sanos y de
pacientes, que pueden capturar células alogénicas muertas o
moribundas y posteriormente presentar sus antígenos a células T
autólogas, lo que induce la proliferación de células T CD4+ y
células T CD8+ autólogas. Por otra parte, mediante el uso de los
procesos descritos en la presente memoria, se ha encontrado que las
DC cargadas con células tumorales alogénicas pueden activar células
T CD8+, generar CTL específicos para antígenos expresados por
células muertas o moribundas, y también reconocer antígenos que se
comparten entre diferentes líneas de células tumorales. Otro
hallazgo más es que mediante el proceso descrito en la presente
memoria, DC cargadas con líneas celulares de tumores alogénicos
muertas o moribundas pueden cebar células T vírgenes e inducir su
diferenciación a CTL específicas para antígenos.
En un aspecto, la invención está dirigida a
inducir una respuesta inmune citotóxica, específica para tumores,
en un paciente humano que presenta un tumor, usando células
dendríticas que se preparan in vitro
co-incubando células dendríticas de dicho paciente
con células tumorales humanas, apoptóticas, alogénicas, para formar
células dendríticas cargadas, donde dichas células tumorales
alogénicas poseen al menos un antígeno compartido entre las células
tumorales alogéncas y dichas células tumorales del paciente, y donde
dicha respuesta inmune citotóxica está dirigida contra dicho
antígeno tumoral compartido. De este modo, las células del paciente
al tomar contacto con las células dendríticas cargadas maduran para
formar células citotóxicas que expresan actividad citotóxica contra
células tumorales, causando así el rechazo del tumor. Las células
citotóxicas resultantes pueden ser CD4 positivas, o CD8 positivas,
o ambas. Las células apoptóticas pueden obtenerse de líneas
celulares alogénicas. La respuesta inmune específica para el tumor
puede estar dirigida contra múltiples antígenos tumorales
compartidos.
En otro aspecto, la invención está dirigida a
inducir una respuesta inmune específica para tumores en un paciente
que presenta un tumor usando células T citotóxicas que se preparan
in vitro co-incubando células dendríticas
humanas con células tumorales humanas, apoptóticas, alogénicas, para
formar células dendríticas cargadas; y
co-cultivando dichas células dendríticas cargadas
con células T vírgenes humanas para formar células T citotóxicas,
donde dichas células tumorales alogénicas poseen al menos un
antígeno compartido entre las células tumorales alogénicas y dichas
células tumorales del paciente, y donde dicha respuesta inmune
citotóxica está dirigida contra dicho antígeno tumoral compartido.
Las células citotóxicas resultantes pueden ser células citotóxicas
naturales o células T citotóxicas naturales; pueden ser CD4
positivas, o CD8 positivas, o ambas. Las células apoptóticas
pueden obtenerse de líneas celulares alogénicas. La respuesta inmune
específica para el tumor puede estar dirigida contra múltiples
antígenos tumorales compartidos.
\newpage
En aún otro aspecto, la invención está dirigida
a un ensayo in vitro para determinar el grado de actividad
citotóxica de células citotóxicas contra células tumorales de un
paciente que comprende: (a) co-incubar células
dendríticas humanas con células tumorales alogénicas, humanas,
apoptóticas, que poseen antígenos para los cuales se desea una
respuesta inmune para formar células dendríticas cargadas; (b)
co-cultivar dichas células dendríticas cargadas con
células precursoras citotóxicas para formar células citotóxicas; (c)
aislar dichas células citotóxicas, (d) incubar dichas células
citotóxicas con dichas células tumorales del paciente; y (e)
monitorear la muerte de dichas células tumorales del paciente, donde
el grado de muerte de las células tumorales es proporcional a la
actividad citotóxica de dichas células citotóxicas.
Las Fig. 1A-C muestran que las
DC inmaduras capturan células tumorales muertas o moribundas. En la
Fig. 1A, células de carcinoma de próstata DU145 fueron inducidas a
la apoptosis por anti-Fas (1 \mug/ml,
CH-11, 16 hs.), las células muertas o moribundas
generadas fueron teñidas con FIAC-anexina V y PI. El
porcentaje de células muertas o moribundas se midió por citometría
de flujo. En la Fig. 1B, las células de carcinoma de próstata DU145
fueron inducidas a la apoptosis por anti-Fas (1
\mug/ml), CH-11, 16 hs); las células muertas o
moribundas generadas se marcaron con 7-AAD y se
incubaron con DC inmaduras marcadas con CD1a-FITC
durante 1 h a 37ºC. La captura de células muertas o moribundas por
las DC se cuantificó por citometría de flujo como porcentaje de
CD1a+ DC que se tornaron positivas para 7AAD. El análisis de
dispersión frontal/dispersión lateral de CD1a+7-ADD+
DC (R1) y CD1a+7-ADD- DC (R2) revela el aumento de
la granularidad de la población doble positiva que confirma el
englobamiento de los cuerpos celulares por las DC. En la Fig. 1C,
las DC inmaduras se incubaron con células tumorales muertas o
moribundas generadas a partir de las líneas de células tumorales
indicadas, ya sea a 4ºC o 37ºC, y el porcentaje de células doble
positivas se midió mediante el ensayo de citometría de flujo.
Las Fig. 2A-2B muestran que las
DC derivadas de monocitos (MDDC) de pacientes con carcinoma de
próstata capturan de manera eficiente cuerpos PrCa. Cuerpos
celulares PrCa marcados con 7AAD fueron co-incubados
con DC derivadas de monocitos marcadas con CD1a, de pacientes con
carcinoma de próstata (Fig. 2A) o de voluntarios sanos (Fig. 2B),
durante 1 h a 37ºC. La captación fue evaluada por citometría de
flujo.
Las Fig. 3A-3D muestran que DC
inmaduras cargadas con cuerpos celulares tumorales inducen la
proliferación de células T CD4+ y CD8+ purificadas. Se
co-cultivaron DC inmaduras marcadas con
CD1a-FITC con células tumorales muertas o moribundas
(Ap) durante 1 h a 37ºC y se clasificaron con base a la expresión de
CD1a. Las células clasificadas se co-cultivaron
durante 5 días con células T CD4+ (Fig. 3A), o células T CD8+ (5 x
10^{4} células/pocillo) autólogas, purificadas (Fig. 3B). Después
de 4 días de incubación, se añadió timidina tritiada, y se midió la
incorporación de timidina 16 hs más tarde. Los experimentos que
evalúan la proliferación de células T CD8+ se llevaron a cabo en
presencia de CD40L (200 ng/ml) para inducir la maduración de DC e
IL-2 (5 U/ml) para aumentar la proliferación de
células T. Se co-cultivaron DC inmaduras marcadas
con CD1a-FITC con células tumorales muertas o
moribundas (Ap) durante 1 h a 37ºC y se clasificaron con base a la
expresión de CD1a. Las células clasificadas se
co-cultivaron durante 5 días con células T CD4+
(Fig. 3C) o células T CD8+ (5 x 10^{4} células/pocillo) autólogas,
purificadas (fig. 3D) en presencia de anticuerpos monoclonales
contra moléculas de MHC clase I o II antes del inicio de los
cultivos y posteriormente durante todo el período de los mismos.
Después de 4 días de incubación, se añadió timidina tritiada y la
incorporación de timidina se midió 16 hs después.
Las Fig. 4A y 4B muestran que las DC cargadas
con líneas de células de carcinoma de próstata muertas o moribundas
ceban CTL. DC inmaduras marcadas con CD1a-FITC
fueron cargadas con cuerpos celulares derivados de DU145 (Fig. 4A) o
PC3 (Fig. 4B) de carcinoma de próstata durante 1 h a 37ºC,
clasificadas con base a la expresión de CD1a y utilizadas como
células estimuladoras. Los cultivos fueron colocados en una placa de
24 pocillos plaqueando las células estimuladoras con células T CD8+
autólogas, purificadas o PBMC totales. Se añadió ligando CD40
soluble (Immunex Corp) para inducir la maduración de las DC. Después
de 7 días de cultivo, las células T fueron cosechadas, lavadas y
replaqueadas con células estimuladoras recién preparadas durante 7
días más. La actividad citotóxica de los CTLs expandidos fue
evaluada en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr utilizando
células sensibilizantes, células no sensibilizantes y K562 como
objetivos. El porcentaje de citotoxicidad se midió como una función
de la liberación espontánea y total. Los resultados son
representativos de tres experimentos, y cada valor representa el
promedio de los pocillos por triplicado.
La Fig. 5 representa la unión a
HLA-A2 de los péptidos de PSA, PSA1 y PSA2. Se
incubaron células T2 con péptidos de PSA durante una noche,
posteriormente las células se lavaron y tiñeron con un anticuerpo
monoclonal específico para HLA-A2 conjugado con FITC
(HLA-A2, 28). La sobre-regulación de
las moléculas de HLA-A2 en las células T2 después de
la unión del péptido fue demostrada como histogramas desplazados.
Los histogramas llenos mostraron la tinción de control del
isotipo.
Las Fig. 6A y 6B muestran que DC cargadas con
una línea de células de carcinoma de próstata LnCAP muertas o
moribundas inducen CTL específicos para PSA. DC inmaduras marcadas
con CD1a-FITC generadas a partir de donantes de
HLA-A2+ de sexo femenino (Fig. 6A) y masculino (Fig.
6B), fueron cargadas con cuerpos celulares derivados de carcinoma de
próstata (LnCAP) durante 1 h a 37ºC, clasificadas con base a la
expresión de CD1a y utilizadas como células estimuladoras. Los
cultivos fueron colocados en una placa de 24 pocillos plaqueando las
células estimuladoras con células T CD8+ autólogas, purificadas. Se
añadió ligando CD40 soluble (Immunex Corp) para inducir la
maduración de las DC. Después de 7 días de cultivo, las células T
fueron cosechadas, lavadas y replaqueadas con células estimuladoras
recién preparadas durante 7 días más. La actividad citotóxica de las
células T CD8+ expandidas fue evaluada en un ensayo estándar de
liberación de ^{51}Cr utilizando células LnCAP sensibilizantes,
células T2 pulsadas con péptidos de PSA y K562 sensibles a NK como
objetivos. El porcentaje de citotoxicidad se midió como una función
de la liberación espontánea y total. Los resultados son
representativos de tres experimentos, y cada valor representa el
promedio de los pocillos por triplicado.
Las Fig. 7A y 7B muestran que DC cargadas con
células de melanoma muertas inducen la proliferación de células T.
DC no cargadas (UL-DC) y DC cargadas
(L-DC) se clasificaron y cultivaron con células T
CD4+ (Fig. 7A) y CD8+ (Fig. 7B) autólogas, purificadas (con CD40L e
IL2). Incorporación de timidina en el día 5. Representativo de dos
experimentos.
Las Fig. 8A y 8B muestran la inducción de CTL
por DC cargadas con células de melanoma muertas. Se cultivaron
células T CD8+ purificadas durante 3 semanas con DC no cargadas
(UL-DC) o DC cargadas con Me275. Las células T se
examinaron en un ensayo de liberación de cromo de 4 horas utilizando
como blanco células Me275 inmunizantes y células K562 como control
para la actividad de NK (a, media \pm SE, n=4) (Fig. 8A), así como
líneas de células tumorales HLA-A201^{+} no
relacionadas: cáncer de próstata (LnCAP) y cáncer de mama (1806)
(Fig. 8B). No se obtienen CTL cuando las células T son cultivadas
con células de melanoma muertas sin las DC (no se muestra).
Las Fig. 9A y 9B muestran la inducción de CTL
específicas de melanoma mediante DC cargadas con células de melanoma
muertas. Se cultivan células T CD8+ purificadas durante 3 semanas
con DC no cargadas o cargadas con Me275. La Fig. 9A muestra un
ELISPOT de IFN utilizando como objetivos DC, no pulsadas o pulsadas,
con los cuatro péptidos de melanoma (4P). Experimento representativo
de 3 realizados utilizando DC y células T de diferentes donantes. La
Fig. 9B muestra actividad de CTL en un ensayo de liberación de cromo
de 4 hs usando células no pulsadas y pulsadas con péptido de
melanoma (4P; valores medios de 3 experimentos) y células T2
pulsadas con péptido de PSA control (un experimento).
Las Fig. 10A-10C muestran DC
cargadas con células de melanoma muertas que ceban células T
vírgenes. Las células T vírgenes CD8^{+}CD45RA^{+}CD45RO^{-}
son cultivadas durante 3 semanas con DC no cargadas
(UL-DC) o con DC cargadas con células de melanoma
muertas (L-DC). Las células T son examinadas en un
ensayo de liberación de cromo de 4 horas. Los CTL obtenidos mediante
DC cargadas con cuerpos de Me275 destruyen las células T2 pulsadas
con diferentes péptidos de melanoma (prueba t pareada de dos colas
de datos transformados logarítmicamente que compara la muerte de
células T2 no pulsadas y pulsadas con péptidos) (Fig. 10A). Las
células vírgenes CD27^{+}CD45RA^{+}CD8^{+} se diferencian en
CTL capaces de destruir la línea celular utilizada para la
inmunización (Fig. 10B) y las células T2 pulsadas con péptidos de
melanoma pero no con péptido de PSA (Fig. 10C) (representativo de
dos experimentos).
La Fig. 11 muestra un cebado cruzado utilizando
DC cargadas con células de melanoma muertas. Las células T vírgenes
CD27^{+}CD45RA^{+}CD8^{+} son cebadas por DC
HLA-A201+ autólogas cargadas con células Colo829
HLA-A201^{-} muertas. Las células T obtenidas son
capaces de matar objetivos de melanoma
HLA-A201^{+}, pero no células de cáncer de mama
HLA-A201^{+} ni monocitos autólogos.
Las Fig. 12A y 12B muestran que subgrupos de DC
derivados de CD34+HPC en melanoma en estadío IV capturan células de
melanoma muertas o moribundas e inducen la proliferación de células
T autólogas. Las CD34+HPC se cultivaron durante 9 días con
GM-CSF, TNF y FLT3L. Las DC totales (Fig. 12A) y sus
subconjuntos aislados (Fig. 12B) fueron cargadas posteriormente con
la línea COLO829 de células de melanoma muertas o moribundas.
Después de un cultivo de toda una noche en presencia del factor de
maduración de DC CD40L, las DC se cultivaron posteriormente en dosis
graduadas (eje horizontal) con células T autólogas durante 5 días.
La proliferación de células T se determinó mediante la captación de
timidina (eje vertical, x 10^{3}).
Las Fig. 13A y 13B muestran que las DC inmaduras
de pacientes con melanoma capturan células de melanoma muertas o
moribundas e inducen la proliferación de células T CD4+ y CD8+. Se
co-cultivaron DC inmaduras de pacientes con melanoma
en estadío IV con cuerpos de melanoma durante 1 h, se clasificaron y
co-cultivaron durante 5 días con células T CD4+
(+CD40L) (Fig. 13A) o células T CD8+ autólogas, purificadas (5 x
10^{4} células/pocillo) (Fig. 13B) y se midió la timidina tritiada
en el Día 5 (eje vertical x 10^{3}). La proliferación de las
células T CD8+ se llevó a cabo en presencia de CD40L (200 ng/ml) e
IL-2 (U/ml).
Las Fig. 14A-14C muestran la
inducción de CTL específicos para melanoma mediante DC cargadas con
células de melanoma muertas usando DC y células T de pacientes con
melanoma maligno avanzado. Se cultivan células T CD8+ purificadas
durante 3 semanas con DC no cargadas o cargadas con Me275. La Fig.
14A muestra ELISPOT de IFN utilizando como objetivos DC, no pulsadas
o pulsadas, con los cuatro péptidos de melanoma (4P). Resultados de
un paciente. La Fig. 14B muestra actividad de CTL en un ensayo de
liberación de cromo de 4 horas. Las células T son capaces de
destruir las Me275 utilizadas en la inmunización, y la muerte se
incrementa cuando las células Me275 son pulsadas con los cuatro
péptidos de melanoma. Se obtuvieron resultados similares en dos
pacientes. La Fig. 14C muestra el cebado de células T vírgenes.
Células CD8^{+}CD45RA^{+}CD45RO^{-} cultivadas 3 semanas con
DC cargadas con células Me275 muertas destruyen células T2 pulsadas
con 4 péptidos de melanoma.
La Fig. 15 muestra que DC cargadas con células
de cáncer de mama muertas inducen la proliferación de células T
CD4^{+} autólogas. DC cargadas se preparan y cultivan en dosis
graduadas con 10^{5} células T CD4^{+} autólogas (pureza
>85%). La proliferación de células T se determina después de 5
días mediante la incorporación de timidina (cpm x 10^{3}). La
curva control representa cpm de los pocillos donde las células BrCa
muertas se plaquearon junto con las células T.
La Fig. 16 muestra que las DC cargadas pueden
sensibilizar células T que a su vez pueden destruir células
tumorales específicas. Se mezclan DC inmaduras con células de cáncer
de mama 1806 alogénicas, muertas. Las DC se incuban con células
tumorales muertas durante 48 horas en presencia de medio
condicionado por monocitos para inducir la maduración de las DC. Las
DC cosechadas se utilizan a continuación como estimuladoras de
células T CD8 autólogas en cultivos de 3 semanas (3 estimulaciones).
Las células T cosechadas se examinan en un ensayo de liberación de
cromo (porcentaje de lisis específica, eje vertical).
La Fig. 17 muestra que las DC cargadas maduras
pueden sensibilizar células T para destruir células tumorales. Se
mezclan DC inmaduras con células de cáncer de mama 1806 alogénicas,
muertas. Las DC se incuban con células tumorales muertas durante 48
horas en presencia de medio condicionado por monocitos para inducir
la maduración de las DC. Las DC cosechadas se utilizan
posteriormente como estimuladoras de linfocitos de sangre periférica
autólogos en cultivos de 3 semanas (3 estimulaciones). Las células T
cosechadas se examinan en un ensayo de liberación de cromo
(porcentaje de lisis específica, eje vertical).
La Fig. 18 muestra DC cargadas que pueden
sensibilizar células T para destruir células tumorales sin necesidad
de factores de maduración de DC exógenos. Se mezclan DC inmaduras
con células de cáncer de mama 1806 alogénicas, muertas. Las DC se
incuban con células tumorales muertas durante 48 horas. Las DC
cosechadas se utilizan como estimuladoras de linfocitos de sangre
periférica autólogos en cultivos de 3 semanas (3 estimulaciones).
Las células T cosechadas se examinan en un ensayo de liberación de
cromo (porcentaje de lisis específica, eje vertical).
La Fig. 19 muestra DC cargadas que pueden
sensibilizar células T, que a su vez pueden destruir células
tumorales específicas. Se mezclan DC inmaduras con células de cáncer
de mama MCF alogénicas, muertas. Las DC se incuban con células
tumorales muertas durante 48 horas en presencia de medio
condicionado por monocitos para inducir la maduración de las DC. Las
DC cosechadas se utilizan como estimuladoras de células T CD8
autólogas en cultivos de 3 semanas (3 estimulaciones). Las células T
cosechadas se examinan en un ensayo de liberación de cromo
(porcentaje de lisis específica, eje vertical). Las células
MCF-7 se incuban con IFN-\gamma
durante 7 días antes de su uso como objetivos de CTL.
La Fig. 20 muestra que los CTL específicos para
antígenos tumorales pueden ser enriquecidos por eliminación de
células T alo-específicas. El gráfico muestra el
porcentaje de lisis específica (eje de ordenadas) de células T2
cargadas con péptidos y células K562 en las proporciones efector a
objetivo indicadas. Las células efectoras se generaron a partir de
células T CD8+ adultas, después de la eliminación de células T
alo-específicas mediante dos rondas de estimulación
(de 7 días cada una) con DC autólogas cargadas con cuerpos derivados
de COLO829 en presencia de IL-7 (10 U/ml, primer
ciclo) e IL-2 (10 U/ml ciclo, 3º y 4º ciclos). Se
añadió el ligando CD40 para inducir la maduración de las DC. Las
células T2 se cargaron con péptido durante 2 horas.
La Fig. 21 muestra que DC cargadas con líneas de
células EBV muertas inducen la proliferación de células T CD4
vírgenes. Las DC inmaduras derivadas de monocitos se cargan con
células EBV muertas, se clasifican con base a la expresión de CD1a y
se cultivan durante 5 días con células T CD4+CD45RA+ vírgenes,
autólogas. La proliferación se mide mediante la incorporación de
timidina (cpm, eje vertical).
La Fig. 22 muestra que DC cargadas con líneas de
células EBV muertas y tratadas con el inhibidor NFkB inducen
tolerancia en células T CD4+ vírgenes. En el primer ciclo de
estimulación las células T CD4+CD45RA+ purificadas
(10^{6}/pocillo) se co-cultivan en placas de 24
pocillos con DC inmaduras, autólogas, clasificadas (1 x
10^{5}/pocillo) cargadas con líneas de células alogénicas, muertas
(Colo 829), en presencia o ausencia de un inhibidor de la
translocación de NFkB, NAC (25 mm, SIGMA). Después de 5 días, las
células T de ambos co-cultivos (-NAC y +NAC) se
cosechan, lavan y dejan reposar durante 2 días más. Las células T
provenientes de los cultivos primarios se exponen nuevamente en un
segundo ensayo de proliferación con las DC cargadas con células EBV
muertas que son autólogas (Colo-EBV) o alogénicas
(Hom2-EBV), a la línea celular Colo829 utilizada en
la primera estimulación. La proliferación se determina mediante la
captación de timidina (1 \muCi/pocillo durante las últimas 16 hs)
(eje vertical). Las células T se hacen tolerantes a los antígenos de
células Colo o Colo-EBV (panel izquierdo), pero
pueden proliferar en respuesta a otro antígeno (panel derecho).
Se describen células presentadoras de antígenos
novedosas, que incluyen entre otras a células dendríticas (DC), que
son cargadas con antígenos de líneas de células alogénicas muertas o
moribundas, y los métodos para elaborar estas células presentadoras
de antígenos. Estas células presentadoras de antígenos cargadas son
útiles para inducir respuestas inmunes profilácticas y respuestas
inmunes terapéuticas en seres humanos y en animales. En particular,
estas células presentadoras de antígenos cargadas son útiles en el
tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas.
Alternativamente, las células presentadoras de antígenos cargadas
pueden utilizarse para eliminar respuestas inmunes no deseadas como
respuestas autoinmunes y enfermedad injerto contra huésped o
reacción huésped contra injerto, es decir, el rechazo del injerto en
trasplantes de órganos y médula ósea.
Las células presentadoras de antígenos útiles en
la presente invención son células dendríticas en diversos estadíos
de diferenciación (precursores, células dendríticas inmaduras y
células dendríticas maduras), incluyendo las células dendríticas
derivadas de precursores sanguíneos células dendríticas derivadas de
células progenitoras hematopoyéticas CD34-, subconjuntos de células
dendríticas como células de Langerhans, DC intersticiales y DC
linfoides. Preferentemente, las células presentadoras de antígenos
son de origen humano. Salvo que se indique lo contrario, se
entiende que los términos "célula dendrítica" o "DC" como
se utilizan en la presente memoria se refieren a todas las células
presentadoras de antígenos de utilidad en la presente invención. En
una realización de la presente invención, las células dendríticas y
las células T respondedoras derivan de voluntarios sanos. En otra
realización, las células dendríticas y las células T derivan de
pacientes con cáncer u otra forma de enfermedad tumoral. En aun
otra realización, las células dendríticas se utilizan para
aplicación autóloga o alogénica.
En la presente invención, las células
dendríticas novedosas se obtienen cargando células dendríticas con
células alogénicas apoptóticas. Las células tumorales alogénicas
apoptóticas útiles en la presente invención incluyen, pero no están
limitadas, a líneas de células tumorales y células tumorales
alogénicas aisladas. Estas células dendríticas cargadas con células
alogénicas apoptóticas son capaces de producir células citotóxicas
capaces de destruir células tumorales así como también objetivos
cargados con péptidos derivados de antígenos asociados a tumores.
Las células citotóxicas incluyen, pero no están limitadas, a células
T CD8, células T CD4, células citotóxicas naturales y células T
citotóxicas naturales. Se entenderá en lo sucesivo que a menos que
se indique lo contrario, la referencia a células T citotóxicas
significa una o más de las células citotóxicas. Las células
dendríticas cargadas de antígenos preparadas como se describe en la
presente memoria pueden también cebar células T vírgenes para
diferenciarlas en células efectoras capaces de reconocer antígenos
tumorales múltiples y/o compartidos que se expresan en las células
tumorales que se utilizan para cargar las células dendríticas y/o
en otras células tumorales. Este cebado cruzado contra múltiples
antígenos compartidos entre las diferentes células, por ejemplo
células tumorales, es importante para obtener respuestas inmunes
amplias. La generación de CTL se asocia con la proliferación de
células T CD8+ restringidas a MHC clase I. Las DC cargadas pueden
también inducir la proliferación de células T CD4+ restringidas a
MHC clase II. Esta presentación cruzada de antígenos capturados es
de particular importancia porque las células T CD4+ pueden ejercer
una función auxiliar para la inducción y el mantenimiento de
células T CD8+ anti-tumorales, y tienen una función
efectora directa contra tumores positivos para MHC clase II, así
como también una función efectora indirecta mediante la activación
de otras células, por ejemplo macrófagos.
En la presente invención, los CTL obtenidos
mediante DC cargadas con cuerpos celulares de una fuente tumoral
alogénica específica pueden utilizarse para proporcionar un efecto
letal sobre otros tumores. Por ejemplo, los CTL obtenidos mediante
DC cargados con cuerpos celulares derivados de una línea de células
de carcinoma de próstata alogénicas específicas, como PC3,
destruyen otras líneas de células tumorales como las de carcinoma
de próstata DU145 y LnCAP. Se han obtenido resultados similares con
líneas de células de melanoma, líneas de células de cáncer de mama,
y CTL obtenidos mediante DC cargados con LnCAP contra células T2
pulsadas con péptidos de PSA. Por lo tanto, puede obtenerse una
respuesta inmune antitumoral mediante la activación de células T
específicas para antígenos tumorales compartidos. Por otra parte,
como se demuestra en la presente memoria, la actividad de CTL
contra péptidos de PSA, utilizando una tercera línea celular de
cáncer de próstata, prueba formalmente que: 1) la actividad de CTL
inducida se debe no solamente a la existencia de aloantígenos
compartidos, y 2) la presencia de aloantígenos no impide la
activación de células T específicas para antígenos tumorales
compartidos.
En la presente invención, las células tumorales
alogénicas pueden utilizarse para dirigir antígenos asociados a
tumores (TAA) a DC a fin de permitir la generación de CTL
específicos para TAA. En primer lugar, pueden utilizarse cuerpos
celulares alogénicos para cargar DC a fin de inducir respuestas
anti-tumorales en pacientes. Estas fuentes de
antígenos bien caracterizadas pueden permitir una evaluación clínica
más rigurosa que las preparaciones tumorales autólogas mal
definidas que pueden no permitir la estandarización y son a menudo
limitadas en su cantidad. Estos antígenos tumorales compartidos
pueden usarse para generar respuestas inmunes que llevarán al
rechazo del tumor. Una consecuencia importante de la presente
invención es que los antígenos tumorales compartidos no necesitan
ser sobreexpresados como se demuestra con células transfectadas o
animales transgénicos. Por último, este abordaje ofrece la
posibilidad de identificar nuevos antígenos tumorales compartidos no
disponibles a partir del análisis de clones de células T que
reaccionan con tumores autólogos.
Durante las respuestas inmunes, las respuestas
específicas para aloantígenos pueden eliminarse usando agentes que
destruyen linfocitos activados (por ejemplo: el anticuerpo
anti-Fas), sin impedir el desarrollo de respuestas
contra antígenos compartidos, proporcionando un método de
inactivación de clones auto-reactivos en las
enfermedades autoinmunes, y clones celulares específicos
alogénicos/xenogénicos en el contexto del trasplante
alogénico/xenogénico.
Las células T que están expuestas a células
dendríticas cargadas con células muertas pueden hacerse tolerantes
contra el(los) antígeno(s) expresado(s) en las
células muertas. Esto puede lograrse mediante manipulación de las
células dendríticas cargadas que permite la presentación de los
antígenos pero inhibe la expresión de moléculas
co-estimuladoras.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó que las DC derivadas de monocitos
(MDDC) inmaduras, generadas in vitro, fueron capaces de
capturar células tumorales muertas o moribundas.
Las DC derivadas de monocitos inmaduras se
generaron a partir de la fracción adherente de monocitos de sangre
periférica (PBMC) (Bender, et al. 1996. "Improved methods
for the generation of dendritic cells from nonproliferating
progenitors in human blood", J Immunol Methods 196:121).
Los PBMC de un donante sano se suspendieron en medio completo (CM)
que consiste en RPMI 1640, L-glutamina 1%,
penicilina/estreptomicina 1%, 2-mercaptoetanol 50
\muM, piruvato sódico 1%, aminoácidos esenciales 1% y suero fetal
de ternero (FCS) 10% inactivado por calor (todos de GIBCO BRL,
Grand Island, NY). Se dejó adherir las células a placas plásticas
(placas Falcon de 6 pocillos de Bectin-Dickinson,
Franklin Lakes, NJ). Después de incubar durante 2 horas a 37ºC, las
células no adherentes fueron retiradas, y las células adherentes se
cultivaron en CM con GM-CSF (GM-CSF
100 ng/ml Leukine, Immunex, Seattle, WA) e IL-4 (5
ng/ml R&D System, Minneapolis, MN). Se alimentó a los cultivos
cada 2 días. Las células se utilizaron habitualmente en el Día 6, y
la recuperación de DC utilizando este método, determinada por
inmunofluorescencia y citometría de flujo, fue >90% de células
CD1a+ CD14-, fenotipo característico de las DC derivadas de
monocitos inmaduras.
Las líneas de células tumorales de linfoma de
células T Jurkat (clon E6-1), carcinomas de próstata
DU145, PC3, LnCAP, y melanomas malignos A375.S2 y A2058 fueron
adquiridas de la American Type Culture Collection, Manassas, VA y
mantenidas en CM. Las células tumorales se indujeron a apoptosis.
Las líneas celulares de linfoma de células T Jurkat y de melanoma
A2058 y A375.S2 fueron inducidas a apoptosis mediante el tratamiento
de las células (1 x 10^{6}/ml) con anticuerpo monoclonal
anti-Fas (1 \mug/ml, clon CH-11,
de Beckman-Coulter) durante 16 horas en CM. Este
proceso resultó en aproximadamente >80% de células muertas o
moribundas, según lo determinado por unión de anexina V y tinción
con PI utilizando una metodología estándar reconocida en la técnica
(Fig. 1 A). Antes de que las células de carcinoma de próstata PC3
fueran tratadas con anticuerpo monoclonal anti-Fas,
se las sensibilizó con cicloheximida (25 \mug/ml, Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO) durante 2 horas. La muerte de las células de
carcinoma de próstata LnCAP fue inducida por tratamiento con
TNF-\alpha (40 ng/ml; CellPro, Inc., Bothell, WA)
durante 24 horas, seguido de irradiación (80 Gy).
Antes de cultivar juntas las células tumorales
moribundas y las DC, todas las células fueron marcadas
específicamente para detectar la captación por las DC de las
células tumorales moribundas. Las células tumorales moribundas se
recolectaron, lavaron con solución salina tamponada con fosfato
(PBS) y marcaron con el colorante fluorescente específico de ADN
7-aminoactinomicina (7-AAD) (Sigma
Chemical Co.) a 20 \mug/ml por cada 10^{6} células durante 30
minutos a 4ºC. Los cuerpos se lavaron posteriormente y
resuspendieron en CM a 1 x 10^{6} células/ml. Las DC inmaduras se
cosecharon, lavaron con medio de tinción (PBS con EDTA 5 mM y suero
fetal bovino (FBS) 2%) y marcaron con CD1a-FITC
(DAKO, Carpenteria, CA) durante 45 minutos a 4ºC. Después de la
tinción, las DC se lavaron con PBS con 2% de FCS (Gibco) y se
resuspendieron en CM a una concentración de 2 x 10^{5}células/ml.
Las DC y las células tumorales muertas o moribundas se
co-cultivaron a una relación 1:5 durante 1 h a 4ºC
o 37ºC en CM. Después del co-cultivo, las células se
recolectaron, lavaron en PBS y trataron con tripsina 0,05%/EDTA
0,02% durante 5 minutos para romper la unión entre células.
La carga de cuerpos de células tumorales
marcadas con 7-AAD por
FITC-CD1a^{+} DC se midió por citometría de flujo
como el porcentaje de DC doblemente positiva para
FIAC-CD1a + y 7-AAD (Fig. 1B). Un
análisis de dispersión frontal/dispersión lateral reveló el aumento
de granularidad de la población doble positiva, que confirma la
absorción de cuerpos de células tumorales por las DC (Fig. 1B). Como
se muestra en la Fig. 1C, hasta el 45% de las DC fueron capaces de
cargar cuerpos celulares de las líneas celulares A2058, A375.S2,
DU145, PC3, LnCAP y linfoma T Jurkat.
En datos no mostrados, se observó fagocitosis en
un contexto autólogo en el que se usaron una línea celular
linfoblastoide B transformada por EBV muerta o moribunda o células B
no transformadas. El grado en el cual las DC capturan células
tumorales muertas o moribundas fue independiente de si la muerte
celular fue inducida por unión a Fas o irradiación \gamma. La
tinción del ADN y una tinción de Giemsa estándar indicaron que sólo
una fracción, hasta un 45%, de los cuerpos de células tumorales
capturados por DC inmaduras contenían al menos un fragmento
nuclear. Esta captura parcial no parece deberse a una falta de
sustrato, ya que muchas células tumorales muertas o moribundas
marcadas permanecieron no fagocitadas por las DC.
Los resultados de la clasificación celular
activada por fluorescencia y la microscopía confocal demostraron que
las DC inmaduras tienen la capacidad de fagocitar cuerpos celulares
muertos o moribundos derivados de diferentes líneas de células
tumorales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se demostró que las DC derivadas de monocitos
(MDDC) que fueron generadas por cultivo de monocitos de un paciente
con carcinoma de próstata con GM-CSF e
IL-4 capturan cuerpos derivados de líneas celulares
PrCa. La tinción con Giemsa de las MDDC indicó que estas habían
fagocitado cuerpos derivados de la línea celular DU145 de cáncer de
próstata. Como se muestra en la Fig. 2A, hasta el 20% de las MDDC de
pacientes habían fagocitado cuerpos de células DU145, al igual que
las DC generadas a partir de un voluntario sano (Fig. 2B).
\vskip1.000000\baselineskip
Las DC cargadas con células tumorales alogénicas
muertas o moribundas indujeron la proliferación de células T
autólogas.
Las DC se cargaron con cuerpos de células
tumorales como anteriormente y se clasificaron con base a la tinción
con CD1a-FITC, para utilizarse como estimuladoras
de células T autólogas. Las fuentes de células T fueron PBMC sin
separar, células T CD4^{+} purificadas (>90%) y células T
CD8^{+} purificadas (>90%). Las células T CD4^{+} y las
células T CD8^{+} se obtuvieron de PBMC separadas con Ficoll de
voluntarios sanos (sin antecedentes de transfusión de sangre) y
depletadas de otras células usando anticuerpos monoclonales (mAbs)
purificados CD3 (UCHT1), CD4 (13B8.2), CD8 (B9.11), CD14 (RMO52),
CD16 (3G8), CD19 (14.119), CD56 (NKH-1),
anti-HLA-DR (B8.12.2), y
anti-glicoforina A (D2.10) (todos de
Beckman-Coulter, Miami, FL)
(Nouri-Shirazi, et al. 2000. "Dendritic
cells capture killed tumor cells and present their antigens to
elicit tumor-specific immune responses", J
Immunol 165:3797-3803) y Dynabeads de IgG de
cabra anti-ratón (Dynal, Lake Success, NY). La
pureza de las poblaciones enriquecidas fue >85%.
Las DC marcadas con CD1a se
co-cultivaron con cuerpos de células tumorales (sin
marcación de ADN), se clasificaron con base en la expresión de CD1a
(pureza >98%) y se plaquearon en placas de 96 pocillos con fondo
redondo en dosis graduadas de 0 a 5000 DC/pocillo. PBMC autólogas
(1 x 10^{5}/pocillo/200 \mul), células T CD4^{+} purificadas
(5 x 10^{4}/pocillo/200 \mul) o células T CD8^{+} purificadas
(5 x 10^{4}/pocillo/200 \mul) se añadieron a los pocillos que
contenían DC marcadas con CD1a. El ensayo de proliferación se llevó
a cabo en un medio de cultivo suplementado con suero AB humano 100%
inactivado por calor (Gemini Bio-products,
Woodland, CA). Se añadió CD40L soluble (200 ng/ml, Immunex, Seattle,
WA) al inicio del cultivo para inducir la maduración de las DC, y
se añadió IL-2 (U/ml, Genzyme Co., Cambridge, MA)
para apoyar la proliferación de las células T CD8^{+}
purificadas. Después de 4 días de incubación, se añadió timidina
tritiada (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD) a una actividad de 1
\muCi/pocillo. Las placas se cosecharon 16 horas después y la
radiactividad incorporada se midió por centellografía líquida según
las instrucciones del fabricante.
El mismo ensayo para detectar la expansión de
las células T también fue realizado en presencia de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra HLA-DR y
HLA-A,B,C para determinar los péptidos antigénicos
de moléculas de MHC clase I y II presentadas por las DC que son
esenciales para el inicio de la proliferación de las células T. Las
DC se incubaron con anticuerpos monoclonales contra
HLA-DR (clon L243 de Becton Dickinson) y
HLA-A,B,C (W 6/32, de DAKO, Botany, N.S.W.) a una
concentración final de 5 \mug/ml en CM durante 30 minutos antes
de la adición de las células T. Los anticuerpos monoclonales
estuvieron presentes durante todo el período de cultivo. Se
utilizaron anticuerpos monoclonales irrelevantes como controles de
isotipo.
Como se muestra en la Fig. 3A, las DC cargadas
con cuerpos de linfoma Jurkat indujeron la proliferación de células
T CD4^{+} autólogas independientemente de la presencia de CD40L
exógeno (que induce la maduración de las DC). Como se muestra en la
Fig. 3C, la proliferación de células T CD4^{+} fue fuertemente
inhibida por la presencia de anticuerpos monoclonales contra
moléculas de MHC de clase II. Por otra parte, las DC cargadas con
cuerpos celulares de carcinoma de próstata DU145 indujeron la
proliferación de células T CD8^{+} autólogas (Fig. 3B). En datos
no mostrados, fue necesaria la inducción de la maduración de DC por
la adición de CD40L exógeno e IL-2 para inducir la
proliferación máxima de las células T CD8^{+} purificadas. La
inhibición de la proliferación de células T CD8^{+} fue también
observada cuando el anticuerpo monoclonal contra moléculas de MHC
clase I se añadió a los cultivos (Fig. 3D). Aunque los macrófagos
fueron más potentes en la captura de cuerpos celulares
transformados por EBV que las DC inmaduras, no lograron provocar
respuestas de células T CD8^{+} (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez demostrado que las DC tienen la
capacidad de fagocitar cuerpos celulares muertos o moribundos
derivados de diferentes líneas de células tumorales y que fueron
capaces de inducir la proliferación de células T autólogas, se
determinó entonces que las DC cargadas con cuerpos de células
tumorales permiten la expansión de CTL que poseen actividad
citotóxica contra la línea de células tumorales inmunizante.
Las DC cargadas con células tumorales muertas o
moribundas (preparadas anteriormente en este ejemplo) se
clasificaron como se describe anteriormente y se utilizaron como
células estimuladoras, mientras que PBMC autólogas o células T
CD8^{+} purificadas (preparadas anteriormente en este ejemplo) se
utilizaron como respondedoras. Se prepararon cultivos en placas de
24 pocillos (Costar, Corning, Inc., Acton, MA) plaqueando
0,5-1 x 10^{5} células/ml de DC inmaduras
cargadas con 2 x 10^{6} células/ml de células respondedoras en un
volumen final de 2 ml. El medio de cultivo se suplementó con suero
AB humano 10% (Gemini Bio-products, Woodland, CA) e
IL-7 (10 U/ml de Immunex, Seattle, WA) en el primer
ciclo de siete días. Después de siete días, las células se
cosecharon y lavaron en medio de cultivo, y la estimulación con DC
cargadas con tumor se repitió durante dos ciclos adicionales de
siete días en presencia de IL-2 (10 U/ml, Genzyme
Co. Cambridge, MA). Para cada ciclo de estimulación, se preparó un
nuevo lote de DC cargadas de antígeno. Las células se recolectaron y
se evaluó su actividad citotóxica en un ensayo estándar de
liberación de cromo (Sitkovsky, M.V., Cytotoxic Cells: Recognition,
Effector Function, Generation and Methods, Henkart, P.A,, eds.,
Birkhauser, Boston, 1993). La citotoxicidad de las células T
sensibilizadas por las DC cargadas con antígenos de la línea celular
de carcinoma de próstata DU145 se comparó con la línea celular K562
sensible a NK.
Como se muestra en la Fig. 4A, las células T
expandidas sensibilizadas por DC cargadas con DU145 fueron capaces
de lisar células DU145 pero no el objetivo K562, demostrando así
actividad de CTL en lugar de actividad de NK. Los CTL con actividad
citotóxica equivalente se expandieron también contra la línea
celular tumoral de cebado cuando se utilizaron PBMC totales, en
lugar de células T CD8+ purificadas, como células respondedoras
(Fig. 4A). Se obtuvo también un cebado comparable de CTL cuando las
DC se cargaron con cuerpos celulares de carcinoma de próstata PC3
(Fig. 4B). Significativamente, los CTL expandidos fueron capaces de
lisar células PC3 utilizadas para la sensibilización y células de
la otra línea celular de carcinoma de próstata DU145, acreditando
el reconocimiento por parte de los CTL de antígenos compartidos.
Estos resultados mostraron que estas dos líneas celulares de
carcinoma de próstata comparten antígenos capaces de provocar la
generación de CTL, y demostraron que las DC cargadas con cuerpos
tumorales permiten la expansión de CTL con actividad citotóxica
contra la línea celular tumoral utilizada para la carga de las DC,
así como contra antígenos tumorales compartidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La carga de DC con cuerpos celulares tumorales
permitió la inducción de CTL específicos para c (TAA).
Células T2, una línea celular estándar
HLA-A201 negativa obtenida de la American Type
Culture Collection, fueron cargadas con antígenos específicos de
PSA, usando los péptidos de PSA sintéticos PSA1
(NH2-FLTPKKLQCV-OH, aminoácidos
141-150) y PSA2
(NH2-KLQCVDLHV-OH, aminoácidos
146-154) (Biosynthesis, Lewisville, Texas). Estos
péptidos específicos para PSA fueron identificados previamente como
péptidos de unión de HLA-A2 (Correale, et
al. 1997. "In vitro generation of human cytotoxic T
lymphocytes for peptides derived from
prostate-specific antigen", J Natl Cancer
Inst 89:293). La afinidad de unión a HLA-A2 de
los péptidos de PSA se evaluó mediante la
sobre-regulación de la expresión en superficie de A2
en células T2 después de la carga del péptido. Se incubaron
aproximadamente 1 x 10^{6} células T2 en medio completo libre de
suero con 50 \mug de péptido/ml a 37ºC en CO_{2} 5% durante
toda una noche. Las células se lavaron después dos veces con PBS y
posteriormente se tiñeron con anticuerpo monoclonal específico para
HLA-A2 conjugado con FITC (10% v/v)
(HLA-A2, 28 de One Lamda, Inc., Canoga Park, CA).
La intensidad de fluorescencia media de la tinción con
HLA-A2 con o sin carga de péptido se analizó
mediante citometría de flujo.
Utilizando los métodos descritos anteriormente
en este ejemplo, se cargaron DC con la línea celular LnCAP de
carcinoma de próstata debido a que estas células expresan PSA y
péptidos de PSA presentes en el contexto de HLA-A2
para lisis mediada por células T (Correale, et al. 1998.
"Generation of human cytolytic T lymphocyte lines directed
against prostate-specific antigen (PSA) employing a
PSA oligoepitope peptide", J Immunol 161:3186). La
tinción de inmunofluorescencia confirmó la expresión citoplasmática
de PSA en células LnCAP, pero no en células PC3. Para evaluar si
los cuerpos de LnCAP cargados en DC eran capaces de producir CTL
específicos para PSA restringidos a HLA-A2 in
vitro, las DC inmaduras generadas a partir de donantes
HLA-A2^{+} de sexo masculino o femenino se
co-cultivaron con cuerpos celulares LnCAP, y a
continuación se clasificaron y utilizaron como estimuladoras de
células T CD8^{+} autólogas, obtenidas por los métodos presentados
anteriormente en este ejemplo. Después de tres ciclos repetidos de
estimulación, se cosecharon las células respondedoras y la
actividad citotóxica y la especificidad se determinaron utilizando
células LnCAP, células K562 y células T2 cargadas con péptidos de
PSA como objetivos.
La unión de los péptidos de PSA a células T2 fue
confirmada por citometría de flujo (Fig. 5). Como se muestra en la
Fig. 6A, los CTL obtenidos de un donante de sexo femenino lisaron
las células LnCAP, pero no las células objetivo K562 sensibles a
NK. Es de destacar que los CTL generados fueron capaces de destruir
de manera eficiente y específica células T2 cargadas con péptidos
de PSA pero no células T2 no cargadas. Se logró hasta 50% (cinco
veces más) de lisis específica de células LnCAP y células T2
cargadas con PSA en una relación efector:objetivo de 50:1, en
comparación con células T2 no cargadas y células K562 (Fig. 6A). Las
DC generadas a partir de un donante de sexo masculino
HLA-A2+ fueron cargadas con cuerpos celulares de
LnCAP y utilizadas como estimuladoras de células T CD8+ autólogas.
Como se muestra en la Fig. 6B, los CTL generados a partir de un
donante masculino también fueron capaces de destruir células T2
cargadas con péptidos de PSA pero no células T2 no cargadas ni
células K562 sensibles a NK. Además, los CTL generados no fueron
capaces de destruir células T2 cargadas con péptido de matriz (MP)
de influenza control, demostrando una vez más la especificidad de la
respuesta (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
DC cargadas con células de melanoma alogénicas
muertas cebaron células T vírgenes diferenciándolas en linfocitos
CTL que fueron específicos para un amplio espectro de antígenos de
melanoma compartidos y fueron capaces de destruir líneas celulares
de melanoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares Colo829 y melanoma SkMel28,
K562, línea celular de carcinoma de próstata LnCAP, línea celular
de cáncer de mama 1806 (establecida por los Dres. A. Gazdar y J.
Minna en UTSW Medical Center en Dallas) y las células T2 fueron
adquiridas de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas,
VA). Las líneas celulares Me275 y Me290 fueron establecidas en el
Ludwig Cancer Institute en Lausana. Todas las líneas celulares se
mantuvieron en CM.
La muerte celular de ME275 fue inducida por
tratamiento con 10 \mug/ml de ácido betulínico durante 48 horas.
Las células Colo829 fueron muertas por el mismo método o por
irradiación gamma (150 Gy y posteriormente cultivadas 48 horas en
medio libre de suero). La muerte celular se evaluó por la
morfología, la externalización de fosfatidilserina usando anexina V
marcada con FITC (CALTAG, Burlingame, CA), y tinción con colorantes
específicos para ADN: 7AAD y azul tripano (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO).
Para determinar si las células de melanoma
alogénicas muertas suministradas a las DC permitirán la selección y
expansión de células T específicas para antígenos compartidos de
melanoma, se utilizaron dos líneas celulares de melanoma: Me275 y
Colo829. La elección se basó en 1) la expresión de
HLA-A201 por células Me275, pero no por células
Colo829, y 2) la expresión de TAA de melanoma "conocidos",
expresando ambas líneas celulares Melan A/MART-1,
gp100, tirosinasa y MAGE-3 a nivel de ARN y
proteínas (de Vries, TJ, et al. 1997. "Heterogeneous
expression of immunotherapy candidate proteins gpl00,
MART-1, and tyrosine in human melanoma cell lines
and in human melanocytic lesions". Cancer Res.
57:3223).
Para generar células tumorales muertas, se
examinaron varios factores que inducen la muerte, incluyendo daño
en el ADN y muerte mediada por receptor, siendo la muerte celular
monitoreada empleando tinción con anexina V/PI. Las células Colo829
podían ser muertas por irradiación \gamma/privación de suero (150
Gy, > 30% de células muertas). Las células Me275 demostraron ser
resistentes a la irradiación \gamma, así como a la muerte mediada
por receptor a través de unión a Fas, TNF o TRIAL (no se muestra).
Sin embargo, las células Me275 sufren una muerte rápida al
tratárselas con ácido betulínico (BA) (Pisha, et al. 1995.
"Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human
melanoma that functions by induction of apoptosis", Nat
Med 1:1046-1051; Fulda, et al. 1999.
"Betulinic acid: a new cytotoxic agent against malignant
brain-tumor cells", Int J Cancer
82:435-441; and Selzer, et al. 2000.
"Effects of betulinic acid alone and in combination with
irradiation inhuman melanoma cells", J Invest Dermatol
114:935-940). El BA es especialmente activo contra
el melanoma (así como también contra células de tumores malignos del
cerebro) e induce la muerte dependiente de las mitocondrias a
través de la activación de caspasa-8 y de
caspasa-3. Sobre la base de la cinética inicial y
de experimentos de dosis-respuesta (no se muestran)
las células de melanoma fueron tratadas durante 48 horas con 10
\mug/ml de BA (>50% de células muertas, una combinación de
apoptosis y necrosis). Colo829 y Me275 crecen como células
adherentes y se separaron al morir, por lo que para la carga de DC
se utilizó la fracción no adherente compuesta principalmente de
células muertas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron DC inmaduras a partir de PBMC
separadas con Ficoll de voluntarios sanos
HLA-A201^{+} o pacientes con melanoma en estadío
IV. Las PBMC de GM-CSF no movilizados o movilizados
(Amgen, Thousand Oaks, CA) se suspendieron en CM y se dejaron
adherir en placas plásticas (Falcon, de 6 pocillos, Franklin Lakes,
NJ) durante 2 horas a 37ºC. Las células no adherentes se retiraron,
y las células adherentes se cultivaron en CM durante 6 días. Se
añadió GM-CSF (100 ng/ml; Leukine, Immunex, Seattle,
WA) e IL4 (5 ng/mL; Schering-Plough) al cultivo
cada dos días. La recuperación de las DC en el día 7, determinada
por inmunofluorescencia estándar y análisis de FACS fue >90% de
las células CD1a^{+}. Para inducir la maduración de las DC se
añadió ligando de CD40 soluble (sCD40L; 200 ng/ml; Immunex, Seattle,
WA) al cultivo desde el día 5 al día 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Células CD4^{+} y CD8^{+} purificadas
(autólogas a las DC) se depletaron de otras células usando
anticuerpos monoclonales (mAbs) CD4 (13B8.2), CD8 (B9,11), CD14
(RM052), CD16 (3G8), CD19 (J4, 119), anti-CD45 RO
(UCHL1), CD56 (NKH-1),
anti-HLA-DR (B8.12.2), y
anti-glicoforina A (D2.10) purificados (todos de
IMMUNOTECH, Marsella, Francia) y Dynabeads con IgG de cabra
anti-ratón (Dynal, Lake Success, NY)
(Nouri-Shirazi, et al. 2000. "Dendritic
cells capture killed tumor cells and present their antigens to
elicit tumor-specific immune responses", J
Immunol 165:3797-3803). Para células T
CD8+CD45RA+CD27+, las células T CD8+ se tiñeron con
anti-CD45RA-PE y
anti-CD27-FITC
(Becton-Dickinson Immunocitometry Systems, San Jose,
CA) y se clasificaron por FACS. Las células T CD4^{+} y CD8^{+}
purificadas se utilizaron posteriormente en el ensayo de
proliferación de células T presentado a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de FACS se realizó en un equipo
FACSCalibur y la clasificación en un equipo FACS Vantage (Becton
Dickinson, Mountain View, CA). Los anticuerpos utilizados para
fenotipificar o clasificar las células fueron
Anti-CD1a marcado con FITC (Biosource),
Anti-CD14-APC,
Anti-CD80-PE,
Anti-CD83-PE,
Anti-CD86-PE,
Anti-HLA-DR-PerCP,
Anti-CD45RA-PE y
Anti-CD27-FITC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las CD marcadas con CD1a-FITC se
co-cultivaron durante 1 hora a 37ºC con cuerpos
tumorales, y posteriormente se clasificaron con base a la expresión
de CD1a (pureza >95%) y se plaquearon en placas de 96 pocillos
de fondo en "U" en dosis graduadas de 0 a 5000 DC/pocillo. Se
añadieron a las placas células T CD4^{+} o células T CD8^{+}
purificadas (10^{5}/pocillo/200 \mul). El ensayo de
proliferación se llevó a cabo en medio de cultivo suplementado con
suero humano AB 100% inactivado por calor (Gemini
Bio-products, Woodland, CA). Se añadió
CD-40L soluble (200 ng/ml; Immunex, Seattle, WA)
para inducir la maduración de las DC, e IL-2 (10
U/ml; Genzyme Co., Cambridge, MA) para apoyar la proliferación de
células T CD8^{+} purificadas. Después de 5 días, se añadió
timidina tritiada (NEN, Boston, MA) a una actividad de 1 Ci/pocillo.
Las placas se cosecharon 16 horas más tarde (Wallac, Inc.,
Gaithersburg, MD) y la radiactividad incorporada se midió por
centellografía líquida según las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron DC cargadas con cuerpos celulares
derivados de tumores y clasificadas como células estimuladoras,
mientras que células T CD8^{+}, CD8^{+}CD45RA^{+}CD45RO^{-}
o CD8^{+}CDR45A^{+}CD27^{+} se utilizaron como respondedoras.
Se prepararon cultivos en placas de 24 pocillos (Costar) plaqueando
DC cargadas a 1 x 10^{5} células con 1 x 10^{6} células T en un
volumen final de 1 ml. El medio de cultivo se suplementó con suero
AB 10%, sCD40L (200 ng/ml; Immunex, Seattle, WA); IL7 (10 UI/ml en
la primera semana) e IL-2 (10 UI/ml en la segunda y
tercera semanas). Las células T fueron reestimuladas con
preparaciones nuevas de DC no cargadas o DC cargadas con células
tumorales muertas semanalmente durante otras dos semanas. Seis días
después de la última estimulación, se cosecharon las células y se
examinó su actividad citotóxica, así como la capacidad de liberación
de IFN-\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la citotoxicidad en un ensayo estándar
de liberación de ^{51}Cr de 4 horas. En resumen, las células T2
fueron pulsadas durante una noche con 10 \mug/ml de los diversos
péptidos. Posteriormente, los diferentes objetivos se marcaron con
^{51}Cr (NEN, Boston, MA) y se lavaron tres veces con PBS. Los
linfocitos T citotóxicos (CTL) se co-cultivaron a
37ºC durante 4 horas con 1 x 10^{3} de células objetivo marcadas
con ^{51}Cr en 200 \mul de CM suplementado con suero AB 10% en
placas de cultivo de 96 pocillos. Después de 4 horas, se
recolectaron 50 \mul del sobrenadante y el porcentaje de células
muertas se calculó utilizando la fórmula:
liberación
porcentual = 100 x (cpm experimento - cpm liberación espontánea) /
(cpm liberación máxima - cpm liberación
espontánea).
Para cuantificar células T efectoras que liberan
IFN-\gamma específicas para antígenos, se utilizó
un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISPOT) según lo recomendado por
el fabricante. Se añadieron linfocitos T CD8^{+} (1 a 2 x
10^{5}/pocillo) por triplicado a placas de 96 pocillos con fondo
de nitrocelulosa (MAHA 54510, Millipore Corp.) precubiertas con
anticuerpo monoclonal
anti-IFN-\gamma primario
(1-D1K; Mabtech, Suecia) en 50 \mul de cRPMI por
pocillo. Para la detección de células T reactivas específicas, se
añadieron células dendríticas maduras, derivadas de monocitos,
antólogas, pulsadas con péptidos restringidos a MHC clase I, a
10^{4}/pocillo (volumen final 100 \mul/pocillo). Después de 20
horas, los pocillos se lavaron seis veces, se incubaron con el
segundo anticuerpo monoclonal
anti-IFN-\gamma biotinilado (7
B6-1; Mabtech) durante 2 horas, se lavaron y tiñeron
con el kit Vectastain Elite (Vectors Labs.).
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la capacidad de las DC inmaduras
derivadas de monocitos para capturar células de melanoma
muertas.
\newpage
Se mezclaron DC inmaduras con células de
melanoma muertas en relación 1:5 y se incubaron durante 1 hora a
37ºC para permitir la fagocitosis. Posteriormente, las DC se
clasificaron por citometría de flujo basada en propiedades de
dispersión frontal/dispersión lateral que reflejan el tamaño y la
granularidad de acuerdo con los procedimientos descritos en la
presente memoria.
Se determinó entonces que la presentación de
antígenos cargados por las DC podrían inducir la proliferación de
células T autólogas. Como se describió anteriormente en este
ejemplo, se cargaron DC inmaduras marcadas con
CD1a-FITC con células de melanoma muertas, se
clasificaron por citometría de flujo basada en la expresión de CD1a
(pureza >90%) y se co-cultivaron con células T
autólogas purificadas (>90%) en presencia de CD40L, que induce
la maduración de las DC cargadas y no cargadas determinada por la
expresión de CD83 (datos no mostrados). Las células T proliferaron
al cultivárselas con DC cargadas con células Me275 muertas, pero no
cuando se cultivaron solamente con células de melanoma muertas (Fig.
7). Estos resultados demostraron que las DC capturaron células de
melanoma alogénicas muertas y, mediante la presentación de sus
antígenos, indujeron la proliferación de células T autólogas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó que las DC cargadas con células de
melanoma muertas producen células T con actividad citotóxica contra
las células de melanoma usadas para la inmunización.
DC HLA-A201^{+} inmaduras se
cargaron con Me275 muertas, se clasificaron y utilizaron para
estimular células T CD8^{+} purificadas autólogas durante un
cultivo de 3 semanas. Se añadió CD40L soluble para inducir la
maduración de las DC, así como también IL-7 (10 U/ml
en la primera semana) e IL-2 (10 U/ml en la segunda
y tercera semanas) para ayudar a la proliferación de células T. Las
células T se cosecharon después de tres ciclos de estimulación y su
actividad citotóxica se determinó usando células Me275, células
tumorales HLA-A201^{+} no relacionadas, LnCAP,
1806 y células K562 sensibles a NK. Como se muestra en la Fig. 8,
las DC cargadas indujeron la diferenciación de CTL capaces de
destruir células de melanoma Me275, lisis específica 50 \pm 10%
(media \pm SE, n = 4, lisis específica 6 \pm 0,5% utilizando
células T control cultivadas con DC no cargadas) pero no células
tumorales HLA-A201^{+} no relacionadas, LnCAP,
1806, ni línea celular K562 sensible a NK. Estos resultados
demostraron que las DC cargadas con células de melanoma alogénicas
muertas pueden desencadenar la diferenciación de células T
CD8^{+} en CTL capaces de destruir las células de melanoma usadas
para la inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrollaron dos ensayos descritos
anteriormente en este ejemplo para determinar si las líneas de
células T generadas con DC cargadas con células de melanoma muertas
contienen células T específicas para antígenos asociados a
melanoma: 1) un ELISPOT para IFN-\gamma de una
noche con las DC HLA-A201^{+} pulsadas con
péptidos de melanoma: Melan A/MART-1_{27,35},
tirosinasa_{368,376} y MAGE-3_{271,279}, así
como gp100_{g209-2M} mutado; y 2) un ensayo de
liberación de cromo citotóxico utilizando células T2 pulsadas con
los cuatro péptidos como células objetivo. Como se muestra en la
Fig. 9A, líneas de CTL de 3 semanas obtenidas utilizando DC cargadas
con células Me275 muertas contienen células que reconocen una
combinación de los cuatro péptidos de melanoma, 27\pm2,9 manchas
específicas de melanoma/2 x 10^{5} células T (media \pm SE, n =
3, p = 0,03). Las líneas de células T generadas con DC no cargadas
y DC pulsadas con péptido solamente (sin las células T) dieron
3\pm1 y 4\pm1,5 manchas, respectivamente. Como se muestra en la
Fig. 9B, estas líneas de células T fueron capaces de destruir
células T2 pulsadas con una combinación de los cuatro péptidos
(56\pm13% de lisis específica; media \pm SE, n = 3), pero no
células T2 cargadas con un péptido derivado de PSA, lo que indica
especificidad para TAA de melanoma. La capacidad para inducir CTL
específicos para melanoma no se limitó a células Me275 ya que las
células T producidas por las DC cargadas con Colo 829
HLA-A201- también contenían células que podían
matar a las células T2 cargadas con cada uno de los péptidos de
melanoma (Tabla I). Así, pueden utilizarse diferentes líneas de
células de melanoma y diferentes métodos para destruir células de
melanoma, para cargar DC a fin de producir líneas de CTL específicas
para antígenos asociados a melanoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó a continuación que las DC cargadas
con células de melanoma muertas ceban células T CD8^{+} vírgenes
diferenciándolas en CTL específicos para melanoma.
En primer lugar, se cultivaron células T
CD8^{+}CD45RA^{+}CD45RO^{-} vírgenes (>80% de pureza) con
DC cargadas con células Me275 muertas. En dos experimentos
independientes, las células T obtenidas fueron capaces de destruir
(1) células T2 pulsadas con los cuatro péptidos de melanoma (hasta
70% de lisis específica, Fig. 10A), (2) células T2 cargadas con un
solo péptido: tirosinasa o gp100 o MAGE-3 (Fig.
10A), y (3) la línea celular Me275 utilizada para la inmunización
(datos no mostrados).
Aunque está mayormente compuesto por células T
verdaderamente vírgenes, el grupo de células T
CD8^{+}CD45RA^{+}
CD45RO^{-} contiene una pequeña fracción de células de "memoria efectoras" que podrían expandirse en nuestras condiciones de cultivo. Por lo tanto, con base en la expresión de CD27, el grupo de células T CD8^{+}CD45RA^{+}CD45RO^{-} fue subdividido para distinguir células T realmente sin experiencia (CD45RA^{+}CD27^{+}) de células T efectoras no comprometidas (CD45RA^{+}CD27^{-}) (Hamaan, D., et al, "Phenotypic and functional separation of memory and effector human CD8+ T cells" 1997. J. Exp. Med. 186:1407-1418). Cuando se cultivaron con DC cargadas con células de melanoma muertas, estas células T CD8^{+}CD45RA^{+}CD27^{+} produjeron CTL específicos para melanoma capaces de destruir las células de melanoma utilizadas en la inmunización (hasta 75% de lisis específica, Fig. 10B) y células T2 pulsadas con péptidos de melanoma (75% de destrucción específica de péptidos de melanoma) (Fig. 10C). La inducción de células T específicas de melanoma se confirmó además mediante ELISPOT de IFN-\gamma con DC autólogas pulsadas con péptidos de melanoma (23 manchas específicas de péptidos/10^{5} células T versus 5 manchas/10^{5} células T de fondo, datos no mostrados). Es de destacar que estas células T vírgenes cebadas mediante DC cargadas con células Colo829 HLA-A201^{-} fueron capaces de destruir objetivos de melanoma HLA-A201^{+} que incluían células Me275, Me290 y SkMel28, lo que demuestra cebado cruzado (Fig. 11).
CD45RO^{-} contiene una pequeña fracción de células de "memoria efectoras" que podrían expandirse en nuestras condiciones de cultivo. Por lo tanto, con base en la expresión de CD27, el grupo de células T CD8^{+}CD45RA^{+}CD45RO^{-} fue subdividido para distinguir células T realmente sin experiencia (CD45RA^{+}CD27^{+}) de células T efectoras no comprometidas (CD45RA^{+}CD27^{-}) (Hamaan, D., et al, "Phenotypic and functional separation of memory and effector human CD8+ T cells" 1997. J. Exp. Med. 186:1407-1418). Cuando se cultivaron con DC cargadas con células de melanoma muertas, estas células T CD8^{+}CD45RA^{+}CD27^{+} produjeron CTL específicos para melanoma capaces de destruir las células de melanoma utilizadas en la inmunización (hasta 75% de lisis específica, Fig. 10B) y células T2 pulsadas con péptidos de melanoma (75% de destrucción específica de péptidos de melanoma) (Fig. 10C). La inducción de células T específicas de melanoma se confirmó además mediante ELISPOT de IFN-\gamma con DC autólogas pulsadas con péptidos de melanoma (23 manchas específicas de péptidos/10^{5} células T versus 5 manchas/10^{5} células T de fondo, datos no mostrados). Es de destacar que estas células T vírgenes cebadas mediante DC cargadas con células Colo829 HLA-A201^{-} fueron capaces de destruir objetivos de melanoma HLA-A201^{+} que incluían células Me275, Me290 y SkMel28, lo que demuestra cebado cruzado (Fig. 11).
Considerados en conjunto, los resultados
demostraron por primera vez que las DC cargadas con células de
melanoma alogénicas muertas pueden cebar células T CD8^{+}
vírgenes para diferenciarlas en CTL específicos para antígenos
compartidos asociados a melanoma y fueron capaces de destruir
células tumorales similares en cuanto al HLA con las células
dendríticas.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra fase del estudio, se midió la capacidad
de las DC derivadas CD34+HPC en sangre de pacientes con melanoma en
estadío IV para capturar células de melanoma muertas o moribundas y
presentar sus antígenos a células T autólogas. Con este fin, se
clasificaron CD34DC en el Día 9 del cultivo con base en la expresión
de CD1a y CD14. Las CD34DC totales y sus subconjuntos aislados se
cultivaron con células de la línea celular de melanoma alogénica
Colo829 inducidas a morir por irradiación gamma durante 4 horas a
fin de permitir la captura de antígenos, y posteriormente durante
una noche con CD40L para permitir la activación y maduración de las
DC. A partir de entonces, las DC se utilizaron como estimuladoras
en cultivo con células T autólogas. Como se muestra en las Fig. 12A
y 12B, sólo CD34DC adultas cargadas con células de melanoma muertas
o moribundas indujeron la proliferación de células T autólogas.
Además, aunque ambos subconjuntos son capaces de capturar antígeno
y presentarlos en este sistema, las DC CD1a parecen más eficaces en
la inducción de la proliferación de células T autólogas. Estos
datos indican que las células dendríticas derivadas de CD34+HPC, que
consisten en células de Langerhans y DC intersticiales, pueden
capturar y presentar cuerpos de células tumorales alogénicas. Las
Fig. 13A y 13B muestran que DC inmaduras derivadas de monocitos de
un paciente con melanoma en estadío IV
co-cultivadas con células muertas o moribundas de
una línea de
células de melanoma inducen la proliferación de células T CD4+ (Fig. 13A) y células T CD8+ (Fig. 13B) autólogas.
células de melanoma inducen la proliferación de células T CD4+ (Fig. 13A) y células T CD8+ (Fig. 13B) autólogas.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque sería deseable vacunar a los pacientes
con melanoma con DC cargadas con células de melanoma muertas para
obtener respuestas inmunológicas, estos pacientes podrían sufrir una
disfunción inmunológica que puede reflejarse en la incapacidad de
las células T de su sangre para montar respuestas inmunitaria
específicas para melanoma (Lee, P.P., et al.
"Characterization of circulating T cells specific for
tumor-associated antigens in melanoma patients"
1999. Nat. Med.; 677-685). Se encontró que
las DC cargadas con líneas de células de melanoma alogénicas pueden
producir CTL específicos para melanoma utilizando células T de la
sangre y DC de pacientes con melanoma maligno avanzado.
Para determinar si las células T CD8^{+} de
pacientes con melanoma metastásico podrían diferenciarse en CTL
específicas para melanoma efectivas, se cultivaron células T
CD8^{+} purificadas durante 3 semanas con DC cargadas con células
Me275 muertas que contenían células T específicas para melanoma
según lo determinado por ELISPOT de IFN-\gamma
utilizando DC pulsadas con péptidos (15 manchas/2 x 10^{5} células
T, paciente # 6, Fig. 14A). Como se muestra en la Fig. 14B, células
T CD8^{+} purificadas cultivadas con DC cargadas con Me275
muertas generaron CTL capaces de destruir células Me275, ya sea no
pulsadas (50% de lisis específica) o pulsadas con los cuatro
péptidos de melanoma (88% de lisis específica, paciente # 1). En dos
pacientes, se encontró que células T
CD45RA^{+}CD45RO^{-}CD8^{+} cultivadas durante tres semanas
con DC cargadas con células de melanoma muertas se diferenciaron en
CTL específicos para melanoma como lo demuestra su capacidad para
destruir células T2 pulsadas con una combinación de cuatro péptidos
de melanoma (Fig. 14C y datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha encontrado ahora que las DC cargadas con
células de cáncer de mama muertas pueden inducir la proliferación
de células T CD4 autólogas. Las DC se cargaron primero con células
de cáncer de mama muertas, clasificadas o enriquecidas por
centrifugación diferencial, y posteriormente se
co-cultivaron en dosis graduadas con 1 x 10^{5}
células T CD4 autólogas (pureza >85%). Las DC derivadas de
monocitos y las células T fueron preparadas como se describe en los
Ejemplos 1 y 2. La captura de las células de cáncer de mama muertas
por DC inmaduras se monitoreó por citometría de flujo y tinción con
Giemsa como se describió en los Ejemplos 1 y 2. Después de 5 días
de co-cultivo con células T, se añadió timidina
tritiada (NEN, Boston, MA) a cada pocillo a una actividad de 1
Ci/pocillo. Las placas se cosecharon 16 horas más tarde (Wallac,
Inc., Gaithersburg, MD) y se midió la radiactividad incorporada
como se describe anteriormente. Como se muestra en la Fig. 15, las
DC cargadas indujeron la proliferación de células T de voluntarios
sanos, lo que indica que las DC pueden procesar antígenos de células
de cáncer de mama muertas y presentarlos a células T CD4^{+}
autólogas.
Se determinó también que diferentes células
tumorales pueden requerir condiciones particulares para la carga de
DC con células tumorales muertas. El método para cargar las DC que
produjo una presentación antigénica suficiente cuando se utilizaron
líneas celulares de melanoma o cáncer de próstata muertas, no fue
suficiente cuando se emplearon células de cáncer de mama muertas.
Por lo tanto, se estableció un nuevo método donde las DC se
co-cultivan con células de cáncer de mama muertas en
una proporción de 1:1 durante 48 horas.
También se determinó que las líneas de células T
con actividad citotóxica contra el cáncer de mama pueden ser
generadas in vitro. Se mezclaron DC inmaduras con células
1806 de cáncer de mama alogénicas (muertas por una combinación de
CHX y unión a Fas como se describe en el Ejemplo 1), se cultivaron
durante 48 horas en una proporción de 1:1 en presencia de
citoquinas que inducen la maduración de DC, TNF-a
(10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) e IL-1
(10 ng/ml) (todos de Genzyme). Posteriormente, las DC se utilizaron
para estimular células T CD8 autólogas purificadas utilizando los
procedimientos descritos en los Ejemplos 1 y 2. Las células T se
cosecharon mediante un ensayo de liberación de cromo después de tres
ciclos de estimulación, y su actividad citotóxica se determinó
usando un panel de líneas de células tumorales. Como se muestra en
la Fig. 16, las DC cargadas con cuerpos 1806 de cáncer de mama
indujeron la diferenciación de CTL capaces de matar células 1806 de
cáncer de mama con 30% de lisis específica, pero no la línea celular
K562 sensible a NK ni otras células tumorales, LnCAP y
MCF-7.
Se determinó también que las DC cargadas con
células de cáncer de mama pueden producir células T citotóxicas
cuando se cultivan con linfocitos de sangre periférica, sin
necesidad de purificación de células T y sin la adición de
citoquinas para ayudar a la proliferación de células T (como
IL-2 e IL-7). Todos los
procedimientos son los mismos que anteriormente, salvo que se usan
linfocitos de sangre periférica en lugar de células T CD8
purificadas (Fig. 17).
También se determinó que los CTL específicos
para cáncer de mama pueden ser producidos por DC cargadas con
células de cáncer de mama muertas utilizando linfocitos de sangre
periférica sin añadir citoquinas para inducir la maduración de DC
durante la carga con células de cáncer de mama muertas. Así, las DC
inmaduras se mezclan con células de cáncer de mama muertas (todos
los procedimientos son como los anteriores) y se cultivan durante
48 horas en CM. Posteriormente, las DC cargadas se utilizan como
estimuladoras de linfocitos de sangre periférica autólogos. Todos
los procedimientos son los mismos que los anteriores (Fig. 18).
También se determinó que el tratamiento de
células tumorales con IFN-\gamma aumentó tanto la
inmunogenicidad de las células tumorales muertas (no mostrado) como
su susceptibilidad a la lisis mediada por CTL (Fig. 19). Todos los
procedimientos son los mismos que los anteriores, salvo que las
células de cáncer de mama son tratadas con
IFN-\gamma durante 1 semana antes de ser
utilizadas como objetivos en el ensayo de citotoxicidad. Mediante
este método, los CTL específicos de cáncer de mama pueden obtenerse
usando diferentes líneas de cáncer de mama (datos no mostrados), lo
que indica que las DC cargadas con células de cáncer de mama muertas
o moribundas pueden utilizarse en la inmunización de personas contra
el cáncer de mama.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se utilizaron líneas de células tumorales
alogénicas como fuente de antígenos tumorales, la respuesta a
aloantígenos podría representar un componente principal de las
respuestas de CTL inducidas. Por lo tanto, se halló un sistema
in vitro para permitir la eliminación de células T
alo-específicas y el enriquecimiento potencial de
CTL específicos para antígenos tumorales. La línea celular de
melanoma COLO829 fue la fuente de aloantígenos y antígenos
asociados a tumores, mientras que la línea celular EBV transformada
(COLO829-BL) derivada del mismo donante fue la
fuente de aloantígeno.
Las DC se cargaron con cuerpos de COLO829, se
clasificaron como se describe anteriormente y se utilizaron como
estimuladoras para la expansión de células T CD8^{+} plaqueadas en
una proporción de 1:5. Las células T se cebaron en el primer ciclo
utilizando el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1 mediante
DC cargadas con COLO829, se cosecharon y posteriormente se
co-cultivaron en un segundo ciclo con DC cargadas
con la línea celular COLO829 transformada con EBV en presencia de
ligando Fas anticuerpo-anti-Fas
exógeno como se describe en el Ejemplo 1 (Immunotech, Marsella,
Francia). El concepto detrás de este abordaje fue que el uso de
cuerpos de células EBV y ligando Fas permite la eliminación de
células T alo-respondedoras. Después de estos dos
ciclos de siete días, las células T CD8^{+} supervivientes se
cosecharon y reestimularon en dos ciclos de siete días adicionales
mediante DC cargadas con cuerpos celulares de melanoma COLO829 para
expandir las células T específicas para antígenos de melanoma. La
actividad citotóxica resultante fue determinada en el ensayo
estándar de liberación de ^{51}Cr utilizando péptidos de melanoma
cargados en células T2 y células K562 sensibles a NK como objetivos
(mismos métodos que los descritos anteriormente). Como se muestra en
la Fig. 20, la línea de CTL producida fue capaz de lisar
específicamente células T2 cargadas con gp100, tirosinasa y, en
menor medida, con péptidos MART-1. De este modo, los
CTL específicos para antígenos tumorales pueden ser enriquecidos
por eliminación de células T alo-específicas. Estos
resultados indicaron la presentación cruzada de los antígenos
tumorales y la viabilidad de la eliminación de CTL
alo-específicos y proporcionaron la base y
herramientas para la inmunización de pacientes con carcinoma de
próstata con DC cargadas con cuerpos de líneas de células de
carcinoma de próstata alogénicas, y la identificación de nuevos
antígenos compartidos asociados a tumores de próstata.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células dendríticas también pueden ser
cargadas con células que expresan un antígeno al cual las células T
podrían hacerse tolerantes. Esto se demuestra en las Fig. 21 y 22
donde DC cargadas se tratan con compuestos que permiten la
presentación de antígenos pero inhiben la expresión de moléculas
co-estimuladoras. De esta manera, las células T
pueden reconocer el antígeno pero se volverán tolerantes; como se
demuestra en la Fig. 22 las células T son capaces de proliferar
cuando se reestimulan con el mismo antígeno.
\global\parskip0.850000\baselineskip
Las células T CD45RA+CD4+ purificadas se
obtienen a partir de PBMC separadas con Ficoll de voluntarios sanos,
depletadas de otras células utilizando anticuerpos monoclonales
(mAbs) CD8 (B9.11), CD45RO (UCHL1), CD14 (RMO52), CD16 (3G8), CD19
(J4.119), CD56 (NKH-1),
anti-HLA-DR (B8.12.2),
anti-glicoforina A (D2.10)
(Beckman-Coulter, Miami, FL) y Dynabeads con IgG de
cabra anti-ratón (Dynal, Lake Success, NY). La
pureza de la población enriquecida fue >90%.
Las DC inmaduras derivadas de monocitos son
generadas a partir de la fracción adherente de PBMC de sangre
periférica como se describe en el Ejemplo 1. Las líneas celulares
alogénicas (Colo 829, Colo-EBV y Hom2 EBV) se
preparan como se describió en el Ejemplo 1. Las DC cargadas con
antígeno se preparan como se describió anteriormente y se utilizan
para estimular células T CD4 vírgenes como se describió
anteriormente.
En el ensayo de tolerancia se
co-cultivan células T CD4+CD4SRA+ purificadas
(10^{6}/pocillo) en placas de 24 pocillos con DC autólogas,
inmaduras, clasificadas (1 x 10^{5}/pocillo) cargadas con líneas
de células alogénicas muertas (Colo 829) en presencia o ausencia de
un inhibidor de la translocación de NFkB: NAC (25mm, SIGMA).
Después de 5 días, las células T de ambos
co-cultivos (-NAC y +NAC) se cosechan, lavan y dejan
reposar durante 2 días. Las células T de los cultivos primarios se
exponen nuevamente en un segundo ensayo de proliferación con los
estimuladores indicados en la Fig. 22 (Colo EBV, Hom2 EBV). La
proliferación se determina mediante la captación de timidina
tritiada (1 \muCi/pocillo durante las últimas 16 hs).
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden obtenerse respuestas antitumorales en un
paciente mediante la administración de células presentadoras de
antígenos que incluyen, pero no están limitadas, a DC cargadas con
células tumorales alogénicas muertas. Los antígenos tumorales
múltiples y/o compartidos presentados en las células presentadoras
de antígenos pueden producir respuestas inmunes en el paciente, lo
que lleva al rechazo del tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden obtenerse respuestas antitumorales en un
paciente mediante la administración de células T específicas para
antígenos tumorales producidas ex vivo por DC cargadas con
células tumorales alogénicas muertas. Los antígenos tumorales
compartidos presentados en las células tumorales pueden ser
reconocidos por células T específicas para antígenos tumorales
múltiples y/o compartidos, lo que lleva al rechazo del tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto más de la presente invención puede
ser útil en el transplante de médula ósea y de órganos. En
particular, la presente invención permite la eliminación de células
T no deseadas que reaccionan contra el trasplante o contra el
huésped, lo que elimina o minimiza el riesgo de rechazo del injerto
o de enfermedad de injerto contra huésped. Las células
presentadoras de antígenos del donante o del huésped se cargan con
células B transformadas con EBV muertas o moribundas del huésped o
del donante, respectivamente. Se administran al paciente fármacos
inmunosupresores como azatioprina, ciclosporina o metotrexato, que
permiten destruir células T activadas. Posteriormente al
trasplante, no habrá rechazo del injerto o enfermedad de injerto
contra huésped, respectivamente, ya que las células T reactivas han
sido eliminadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto más de la presente invención puede
ser útil en la eliminación de la enfermedad residual en pacientes
post-trasplante con cánceres hematológicos que
incluyen, pero sin limitaciones, a leucemias y linfomas.
Las células presentadoras de antígenos del
donante se cargan con células leucémicas muertas o moribundas del
donante o líneas celulares alogénicas. Estas células presentadoras
de antígenos cargadas se administran entonces a los pacientes y los
antígenos compartidos presentados en las células presentadoras de
antígenos producen respuestas inmunes que llevan al rechazo del
tumor y a la eliminación de la enfermedad residual.
Claims (10)
1. Uso de células dendríticas para preparar una
composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune
citotóxica específica para un tumor en un paciente humano que
presenta un tumor, donde dichas células dendríticas se preparan
in vitro mediante
(a) co-incubación de células
dendríticas de dicho paciente con células tumorales humanas,
alogénicas, apoptóticas, para formas células dendríticas
cargadas,
donde dichas células tumorales alogénicas poseen
al menos un antígeno compartido entre las células tumorales
alogénicas y las células tumorales de dicho paciente, y
donde dicha respuesta inmune citotóxica está
dirigida contra dicho antígeno tumoral compartido para causar
rechazo del tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El uso de la Reivindicación 1, donde dichas
células apoptóticas se obtienen a partir de líneas celulares
alogénicas.
3. El uso de la Reivindicación 1 o 2, donde
dicha respuesta inmune citotóxica está dirigida contra antígenos
tumorales múltiples compartidos.
4. Uso de células T citotóxicas para preparar
una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune
específica para un tumor en un paciente humano que presenta un
tumor, donde dichas células T citotóxicas se preparan in
vitro mediante:
(a) co-incubación de células
dendríticas humanas con células tumorales humanas alogénicas,
apoptóticas, para formar células dendríticas cargadas; y
(b) co-cultivo de dichas células
dendríticas cargadas con células T humanas vírgenes para formar
células T citotóxicas,
donde dichas células tumorales alogénicas poseen
al menos un antígeno compartido entre las células tumorales
alogénicas y las células tumorales de dicho paciente, y
donde dicha respuesta inmune citotóxica está
dirigida contra dicho antígeno tumoral compartido.
\vskip1.000000\baselineskip
5. El uso de la Reivindicación 4, donde dichas
células apoptóticas alogénicas se obtienen a partir de líneas
celulares alogénicas.
6. El uso de la Reivindicación 4 o 5, donde
dicha respuesta inmune citotóxica está dirigida contra antígenos
tumorales múltiples compartidos.
7. El uso de las Reivindicaciones 4 a 6, donde
las células citotóxicas son células citotóxicas naturales o células
T citotóxicas naturales.
8. El uso de las Reivindicaciones 4 a 6, donde
las células citotóxicas son CD4 positivas.
9. El uso de las Reivindicaciones 4 a 6, donde
las células citotóxicas son CD8 positivas.
10. Un ensayo in vitro para determinar el
grado de actividad citotóxica de las células citotóxicas contra
células tumorales de un paciente que comprende:
(a) co-incubar células
dendríticas humanas con células tumorales humanas alogénicas,
apoptóticas, que poseen antígenos para los cuales se desea una
respuesta inmune a fin de formar células dendríticas cargadas;
(b) co-cultivar dichas células
dendríticas cargadas con células precursoras citotóxicas para formar
células citotóxicas;
(c) aislar dichas células citotóxicas;
(d) incubar dichas células citotóxicas con
dichas células tumorales del paciente; y
(e) monitorear la muerte de dichas células
tumorales del paciente,
donde el grado de muerte de las células
tumorales es proporcional a la actividad citotóxica de dichas
células citotóxicas.
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