PL203842B1 - Geny kalciwirusów kotów i szczepionki, a zwłaszcza szczepionki zrekombinowane - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Obecny wynalazek dotyczy genów konkretnych szczepów kalciwirusów kota, białek kodowanych przez te geny i ich zastosowania do przygotowania preparatów immunogennych i szczepionek zrekombinowanych lub z podjednostek, przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kotów. Te preparaty immunogenne i te szczepionki mogą być kombinowane z preparatami immunogennymi przygotowanymi na bazie innych patogennych czynników kota do uzyskania preparatów immunogennych i szczepionek multiwalencyjnych.

Kalciwirusy kota (po angielsku Feline Calicivirus lub FCV) były opisane po raz pierwszy w 1957 r. (Fastier L.B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18. 383-389). Kalciwirusy kota są razem z wirusami opryszczki kota dwoma głównymi źródłami dolegliwości wirusowych górnych dróg oddechowych u kota. Wirusy FCV atakują dużą liczbę zwierząt, ze stopniem nosicielstwa FCV rzędu 15 do 25% i częstością występowania przeciwciał w surowicy przeciwko FCV od 70 do 100% (Coutts i wsp. Vet Rec. 1994. 135. 555-556; Ellis T.M. Australian Vet. J. 1981. 57. 115-118; Harbour i wsp. Vet. Rec. 1991. 128. 77-80; Reubel i wsp. Feline Dendistry 1992. 22. 1347-1360). Po inicjalnej fazie hipertermii tym chorobom dróg oddechowych towarzyszą na ogół owrzodzenia w jamie ustnej (podniebienie, język, wargi, nos), katar, zapalenie spojówek, ewentualnie anoreksja i astenia. Wirusy FCV mogą też powodować zapalenia płuc, zapalenia otrzewnej i bóle w stawach (zespół kulenia).

Przekaz wirusa FCV jest wyłącznie horyzontalny, nie ma transmisji pionowej od matki do jej potomka w czasie ciąży (Johnson R.P. Res. Vet. Sci. 1984. 31. 114-119). Przekaz FCV zachodzi przez kontakt między zakażonymi zwierzętami i zwierzętami zdrowymi lub drogą powietrzną w czasie kichania (Wardley RC. Arch. Virol. 1976. 52. 243-249).

Kalciwirusy kota są nagimi wirusami z rodziny Calciviridae, posiadają jednoniciowy dodatni RNA o wielkoś ci okoł o 7,7 kilopar zasad (kbp) (Carter M. J. Arch. Virol. 1994. 9. 429-439).

Podobnie jak dla wielu wirusów RNA istnieje wielka heterogenność w populacji wirusów FCV. Warianty antygenowe, wykazane na początku lat 70-tych przez doświadczenia nad seroneutralizacją krzyżową pozwoliły na klasyfikację FCV na kilka szczepów wirusa lub quasi-gatunków (Radfoord i wsp. Proc. 1^st Symp. Caliciviruses ESVV 1997. 93-99).

Zidentyfikowano i zsekwencjonowano szereg szczepów FCV, w szczególności szczep F9 (Carter i wsp. Arch. Virol. 1992. 122. 223-235, sekwencja zdeponowana w bazie danych GenBank pod numerem dostępu M86379), CFI (Neill i wsp. J. Virol. 1991 65. 5440-5447, numer dostępu GenBank U13992 i M32819), Urbana lub URB (Sosnovtsev i Green Virology 1995. 210. 383-390, numer dostępu GenBank L40021), F4 (Tohya i wsp. Arch. Virol. 1991. 117. 173-181, numery dostępu GenBank D31836 i D90357), KCD (Fastier L.B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18. 882-889, numer dostępu GenBank L09719), LLK (numer dostępu GenBank U07131), NADC (numer dostępu GenBank L09718), 2280 (numer dostępu GenBank X99445) i 255 (Kahn i Gillepsie. Cornell Vet. 1970, 60. 669-683, numer dostępu GenBank U07130).

Szczepienia przeciwko FCV zostały wprowadzone od końca lat 70-tych na podstawie atenuowanych szczepów FCV, przede wszystkim szczepu F9 izolowanego w USA w 1958 r. przez Bittle'a (Bittle i wsp., Am. J. Vet. Res. 1960. 21. 547-550) lub szczepów wyprowadzonych z F9 przez pasaże in vitro lub in vivo („podobne do F9).

Dostępne są też szczepionki inaktywowane. Stosują przede wszystkim szczep 255 i 2280, wyizolowany w 1970 z kota wykazującego zapalenie płuc (Kahn i Gillepsie. Cornell Vet. 1970. 60. 669-683) i w 1983 z kota cierpią cego na kulenie (Pedersen i wsp. Fel. Prac. 1983. 13. 26-35).

Odpowiedź humoralna jest przede wszystkim nakierowana przeciwko białku kapsydu, także nazywanego p65 (Guiver i wsp. J. Gen. Virol. 1992. 73. 2429-2433). Geny kodujące białka kapsydu wielu kalciwirusów kota były sklonowane i porównane bez wyróżniania bardziej szczegółowo jakichś sekwencji (Glenn i wsp. Proc. 1^st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997. 106-110; Geissler i wsp. Virus Res. 1997. 48. 193-206; Neill i wsp. Proc. 1^st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997, 120-124).

Gen kodujący białko kapsydu był także sklonowany i wyrażany w różnych systemach ekspresyjnych, w szczególności gen kodujący białko kapsydu wirusa FCV KS20 w plazmidach (Geissler i wsp. J. Virol. 1999. 73. 834-838), geny kodujące białka kapsydu wirusa FCV CFI-68, JOK63, JOK92, LS012 i F9 w bakulowirusach (DeSilver i wsp. Proc. 1^st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997. 131-143), gen kodujący białko kapsydu wirusa FCV F4 w wirusie opryszczki kota typu 1 (Yokoyama i wsp. J. Vet. Med. Sci. 1998. 60. 717-723).

PL 203 842 B1

Ze względu na zmianę antygenów w czasie, antysurowice produkowane przeciwko szczepom szczepionkowym wyizolowanym w latach 60-70, takim jak szczepy F9, 255 lub 2280 neutralizują zaledwie niewiele izolatów z lat 90. Na przykład, surowica anty-F9 neutralizuje 43% izolatów amerykańskich okresu 1990-96, w stosunku do 56% dla okresu 1980-1989 i 86% dla okresu 1958-79 i tylko 10% izolatów angielskich okresu 1990-1996 (Lauritzen i wsp. Vet. Microbiol. 1997. 56. 55-63).

Celem obecnego wynalazku jest wykazanie nowych szczepów FCV indukujących u kota przeciwciała mające szerokie spektrum krzyżowej neutralizacji.

Innym celem wynalazku jest opracowanie preparatów immunogennych i szczepionek przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kotów na podstawie szczepów FCV.

Szczególnym celem wynalazku jest na podstawie wybranych szczepów izolacja i charakterystyka genów kodujących białka immunogenne do stosowana w szczepieniu przeciw chorobom powodowanych przez kalciwirusy u kotów.

Innym celem wynalazku jest zaproponowanie wektorów ekspresyjnych in vitro i in vivo zrekombinowanych i wyrażających przynajmniej jedną taką sekwencję nukleotydów.

Innym celem wynalazku jest zaproponowanie preparatów immunogennych lub szczepionek multiwalencyjnych przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota.

Jeszcze innym celem wynalazku jest zaproponowanie preparatów immunogennych lub szczepionek multiwalencyjnych przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota i przynajmniej jednemu innemu patogenowi kota.

Wynalazek dotyczy zasadniczo dwóch szczepów FCV uzyskanych za pomocą wymazów z gardła przeprowadzonych we Francji i Królestwie Zjednoczonym na kotach prezentujących objawy zakażenia przez kalciwirusy kota. Chodzi odpowiednio o szczep G1 (zdeponowany w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (lub CNCM) Instytutu Pasteura, Paryż, Francja, pod numerem dostępu I-2167) i szczep 431 (zdeponowany w CNCM pod numerem dostępu I-2166), oba zdeponowane 12 marca 1999. Ten szczep FCV G1 wyizolowany we Francji nie odpowiada szczepowi FCV wyizolowanemu w Zjednoczonym Królestwie w 1978 roku przez Tohya (Tohya Y. i wsp., Jpn. J. Sci., 1990. 52, 955-961) i także nazwany G1.

Wybór szczepów FCV 431 i G1 został przeprowadzony poprzez testy seroneutralizacji krzyżowej w stosunku do izolatów FCV z panelu referencyjnego. Ten panel referencyjny jest złożony z 18 aktualnych izolatów FCV pobranych od kotów wykazujących objawy zakażenia przez kalciwirusy kota i pochodzą cych z trzech róż nych obszarów geograficznych. 7 izolatów jest amerykańskich, te izolaty zostały zidentyfikowane jako RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 i RMI9. 7 izolatów jest francuskich, są określane jako A2, F1, G1, G3, E3031, H3-2 i H4-1. 4 ostatnie izolaty są angielskie i są określane jako 431, 388b, 337 i J5.

Szczepy panelu dostępne u deponującego na żądanie. Były one także publikowane w artykule w czasopiśmie „Archives of Virology (Poulet i wsp. Arch. Virol. luty 2000. 145(2). 243-261), dostępny w Internecie w dacie zdeponowania u wydawcy.

W czasie testów seroneutralizacji krzyżowej mię dzy 18 izolatami FCV panelu referencyjnego, okazało się w sposób zadziwiający, że surowica przeciw izolatowi 431 neutralizuje 14 z 17 heterologicznych izolatów panelu referencyjnego (miano homologiczne seroneutralizacji nie jest uwzględniane). Dla porównania anty-surowice szczepów „szczepionkowych 255 i F9 neutralizują każdy tylko 2 z 18 izolatów panelu.

W sposób nieoczekiwany deponują cy znalazł wię c ze szczepem FCV 431 szczep dominujący, który może być stosowany do ochrony kotowatych i w szczególności kotów przeciwko większości szczepów FCV. Dzięki panelowi szczepów FCV tu ujawnionych jest możliwe dla specjalisty wybranie innych dominujących szczepów FCV. Przez równoważność wynalazek obejmuje także poprzez szczep FCV 431 szczepy FCV ekwiwalentne w stosunku do tego ostatniego, mające przeciwciała o szerokim spektrum neutralizacji krzyżowej.

Istnieje równoważność gdy surowica przeciwko szczepowi FCV seroneutralizuje przynajmniej 13 z 18 izolatów heterologicznych panelu referencyjnego (to znaczy obejmując FCV 431) korzystnie gdy seroneutralizuje przynajmniej 14 z 18 izolatów heterologicznych panelu referencyjnego, a korzystniej gdy seroneutralizuje przynajmniej 15 z 18 izolatów heterologicznych panelu referencyjnego.

Uważa się ogólnie, że szczep FCV seroneutralizuje inny szczep FCV, gdy miano heterologiczne seroneutralizacji jest większe lub równe 1,2 log10 VN50 (Povey C. i Ingersoll J., Infection and Immunity,

1975, 11, 877-885). Deponujący uznał tę wartość jak próg dodatniości. Jednak wyniki seroneutralizacji

PL 203 842 B1 krzyżowej uzyskane przez izolat FCV mający miano homologiczne seroneutralizacji poniżej lub równe 2 log10 VN50 nie mogą być interpretowane.

Drugą metodą do ustalenia ekwiwalencji szczepu FCV w stosunku do szczepu FCV 431 jest stosowanie przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla szczepu FCV 431 i testowanie za pomocą pośredniej immunofluorescencji (IFI) szczepu FCV kandydata. Deponującemu udało się w ten sposób wyprodukowanie kilku przeciwciał monoklonalnych, które okazały się specyficzne dla szczepu 431. Jedno z nich nazwano 44. Istnieje równoważność jeśli jest reaktywność immunofluorescencji z przeciwciałami monklonalnymi specyficznymi dla 431, na przykład, z przeciwciałem monoklonalnym 44. To przeciwciało monoklonalne i odpowiednia hybrydoma są dostępne u deponującego na żądanie i są także ujawnione w artykule Poulet i wsp. Odpowiednia hybrydoma była także deponowana 11 sierpnia 1999 roku w CNCM pod numerem dostępu I-2282. Jest jednak ewidentne, że specjalista jest w stanie produkować przeciwciała monoklonalne za pomocą technik klasycznych i selekcjonować, w stosunku do panelu, te które są specyficzne względem szczepu 431.

Drugi szczep FCV G1 wybrano ze względu na jego komplementarność w stosunku do szczepu FCV 431, jako że kombinacja anty-surowic przeciwko 431 i G1 seroneutralizuje 100% izolatów panelu referencyjnego, to znaczy, że te trzy szczepy FCV G1 mają oznaczone miano seroneutralizacji wyższe lub równe 2 log10 VN50 względem izolatów FCV panelu referencyjnego, przeciwko którym antysurowica 431 nie seroneutralizuje lub robi to słabo (wartość niższa od 1,2 log10 VN50). Wynalazek obejmuje także ekwiwalentne szczepy FCV mające tę samą komplementarność względem szczepu FCV 431. Można także wyprodukować i selekcjonować przeciwciała monoklonalne specyficzne względem tego szczepu, co pozwala następnie na określenie ekwiwalentów na tej innej podstawie.

Deponującemu poza tym udało się wyizolować, scharakteryzować oraz zsekwencjonować gen kapsydu FCV 431 i FCV G1, białka kapsydu i określić sekwencje odpowiednich cDNA (komplementarnych cDNA).

Celem wynalazku jest więc fragment kwasu nukleinowego zawierający całą lub część sekwencji kodującej białko kapsydu wirusa 431, którego sekwencja aminokwasów jest reprezentowana na SEQ ID N°: 7 na fig. 2, lub fragment immunologicznie czynny tego białka, to znaczy epitop, peptyd lub polipeptyd zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kapsydu.

Celem wynalazku jest w szczególności fragment DNA zawierający sekwencję cDNA SEQ ID N°: 6 lub fragment zachowujący istotne właściwości całej sekwencji, to znaczy kodujący peptyd, polipeptyd lub epitop zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kapsydu. Celem wynalazku jest szczególnie fragment DNA zawierający tę sekwencję cDNA w szczególności połączoną z elementami regulacji transkrypcji.

Jest ewidentne, że wynalazek obejmuje automatycznie fragmenty kwasu nukleinowego, fragmenty DNA i sekwencje ekwiwalentnych cDNA, to znaczy fragmenty sekwencji nukleotydów specyficznych kapsydu FCV nie zmieniających specyficzności ani funkcjonalności szczepu o sekwencji opisanej lub polipeptydów kodowanych przez tę sekwencję. Oczywiście będą włączone sekwencje, które różnią się ze względu na degenerację kodu.

Wynalazek obejmuje także automatycznie sekwencje nukleotydów (RNA, DNA, cDNA) ekwiwalentne w tym znaczeniu, że kodują białko kapsydu FCV, lub peptyd, polipeptyd lub epitop specyficzny dla białka kapsydu FCV, zdolny do indukcji in vivo u gatunku kotowatych, w szczególności u kota, przeciwciał mających zasadniczo to samo spektrum krzyżowego zobojętnienia jak anty-surowica szczepu FCV 431. Chodzi w szczególności o sekwencji pochodzące od szczepów FCV ekwiwalentnych według definicji danej powyżej względem panelu lub przeciwciała monoklonalnego 44.

Celem wynalazku jest też fragment kwasu nukleinowego zawierający całą lub część sekwencji nukleotydów kodujących białka kapsydu wirusa G1 taka jak przedstawiona jako SEQ ID N°: 5 lub na fig. 1, lub immunologicznie czynny składnik tego białka, to znaczy epitop, peptyd lub polipeptyd zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kapsydu.

Celem wynalazku jest mianowicie fragment DNA zawierający sekwencję cDNA SEQ ID N°: 4 lub fragment zachowujący niezbędne właściwości całej sekwencji, to znaczy kodujący peptyd, polipeptyd lub epitop zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kapsydu. Celem wynalazku jest w szczególności fragment DNA zawierający tę sekwencję cDNA, w szczególności połączoną z elementami regulacji transkrypcji. Jest oczywiste, że wynalazek obejmuje automatycznie fragmenty kwasu nukleinowego, ekwiwalentne fragmenty DNA i sekwencje cDNA, to znaczy fragmenty i sekwencje nukleotydów nie zmieniające funkcjonalności ani specyficzności szczepu o opisanej sekwenPL 203 842 B1 cji lub polipeptydów kodowanych przez tę sekwencję. Oczywiście będą włączone sekwencje, które różnią się ze względu na degenerację kodu.

Wynalazek obejmuje także automatycznie sekwencje nukleotydów (RNA, DNA, cDNA) ekwiwalentne w tym znaczeniu, że kodują peptyd, polipeptyd lub epitop zdolny do indukcji in vivo u gatunku kotowatych, w szczególności u kota, przeciwciał mających zasadniczo to samo spektrum krzyżowego zobojętnienia jak anty-surowica szczepu FCV G1. Chodzi w szczególności o sekwencje nukleotydów pochodzące od szczepów FCV komplementarnych w znaczeniu podanym powyżej.

Gen kodujący białko kapsydu wirusów FCV G1 i FCV 431 ma wielkość 2007 nukleotydów dla FCV 431 i 2010 nukleotydów dla FCV G1. Białko kapsydu ma wielkość 668 aminokwasów dla FCV 431 i 669 aminokwasów dla FCV G1 i masę 60-65 kDa (białko p65).

Celem wynalazku jest też wektor ekspresyjny zawierający przynajmniej jeden fragment DNA według wynalazku, w szczególności cDNA typu 431 lub cDNA typu G1 w warunkach pozwalających na jego ekspresję in vivo. Według szczególnego wykonania, wektor ekspresyjny zawiera cDNA typu 431 i cDNA typu G1. Przez „typ' należy rozumieć, że cDNA jest komplementarny do sekwencji RNA rozważanego szczepu.

Te wektory ekspresyjne mogą być wirusami ospy, na przykład, wirusami krowianki, wirusami ptasimi (ospa kanarka, ospa ptasia), obejmując wirusy ospy specyficzne gatunkowo (ospa świni, ospa szopa i ospa wielbłąda), adenowirusy i wirusy opryszczki, takie jak wirusy opryszczki kota (np. FR-A-2-741 806). Dla wirusów ospy, specjalista może odnieść się do WO-A-9215672, WO-A-9526751, WO-A-9012882 i WO-A-9527780.

Można stosować szereg strategii wstawiania w celu uzyskania ekspresji kilku heterologicznych sekwencji nukleotydów wychodząc z tego samego wektora ekspresji in vivo. Te strategie wstawiania są to mianowicie stosowanie podwójnej kasety ekspresyjnej mającej przeciwną orientację, lub stosowanie podwójnej kasety ekspresyjnej mającej identyczną orientację, lub jeszcze wielokrotnej kasety ekspresyjnej z elementem IRES (wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu, po angielsku, Internal Ribosome Entry Site) umieszczonym między każdą wstawką (patent EP-A1-0803573).

Sekwencje nukleotydów heterologicznych są wstawione pod kontrolą sygnałów regulacyjnych transkrypcji i w szczególności promotorów, korzystnie wniesionych w czasie insercji. Nie jest jednak wykluczone spowodowanie ekspresji tych sekwencji pod kontrolą własnych sygnałów stosowanego wektora ekspresyjnego. Wśród wektorów ekspresji ospy kanarka jednym z korzystnych promotorów jest promotor krowianki H6 (Taylor J. i wsp. Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. i wsp. J. Virol., 63, 4189-4198; Perkus M. i wsp. J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).

Wektory do ekspresji in vivo mogą być także plazmidami. Określenie plazmid ma obejmować całą jednostkę transkrypcji DNA w formie sekwencji polinukleotydowej zawierającej sekwencją cDNA według wynalazku i elementy niezbędne do jej ekspresji in vivo. Korzystna jest forma plazmidu kolistego, superzwinięta lub nie. Forma liniowa także wchodzi w zakres wynalazku.

Każdy plazmid zawiera promotor zdolny do zapewnienia, w komórkach gospodarza, ekspresji cDNA wstawionego pod jego kontrolę. Chodzi na ogół o silny promotor eukariotyczny i w szczególności promotor wczesny wirusa cytomegalii CMV-IE, pochodzący z myszy lub ludzki lub też o innym pochodzeniu takim jak szczur, świnka morska. W bardziej ogólny sposób promotor jest albo pochodzenia wirusowego albo pochodzenia komórkowego. Jako promotor wirusowy inny niż CMV-IE można podać wczesny lub późny promotor wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Jako promotor komórkowy można podać promotor genu cytoszkieletu, taki jak na przykład promotor desminy lub jeszcze promotor aktyny. Podfragment tych promotorów, zachowujących tę samą aktywność promotora jest zawarty w tym wynalazku, np. obcięte promotory CMV-IE według WO-A-98/00166.

Gdy szereg sekwencji heterologicznych (cDNA i/lub geny FCV lub innych patogenów kota) jest obecnych w tym samym plazmidzie mogą one być prezentowane w tej samej jednostce transkrypcji lub w dwóch różnych jednostkach.

Plazmidy mogą także zawierać inne elementy regulacji transkrypcji takie jak na przykład sekwencje stabilizujące typu intron, korzystnie intron II genu β-globiny królika (van Ooyen i wsp., Science, 1979, 206: 337-344), sekwencji sygnałowej białka kodowanego przez gen tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA; Montgomery i wsp. Cell. Mol. Biol. 1997, 43: 285-292) i sygnał poliadenylacji (poliA), w szczególności genu bydlęcego hormonu wzrostu (bGH) (US-A-5 122 458) lub genu β-globiny królika.

Celem wynalazku jest także stosowanie cDNA według wynalazku do produkcji in vitro białek kapsydu lub ich fragmentów i epitopów czynnych immunologicznie i ich włączenie do preparatów immunogennych i szczepionek podjednostkowych.

PL 203 842 B1

Celem wynalazku jest także preparat immunogenny lub szczepionka przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota zawierająca przynajmniej jeden wektor do ekspresji in vivo zrekombinowany według wynalazku i nośnik lub zaróbkę dopuszczalne w weterynarii i ewentualnie adiuwant.

Pojęcie preparatu immunogennego obejmuje każdy preparat mogący po podaniu kotu indukować przynajmniej odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko pożądanemu patogenowi kota. Przez szczepionkę rozumie się preparat zdolny do indukowania skutecznej ochrony.

Korzystnie ten preparat immunogenny lub szczepionka zawiera wektor do ekspresji in vivo do którego jest wstawiony cDNA typu FCV 431, co obejmuje jego ekwiwalenty lub cDNA FCV G1, co obejmuje jego ekwiwalenty.

Według pierwszego bardzo korzystnego wykonania ten preparat immunogenny lub szczepionka zawiera wektor ekspresyjny do którego jest wstawiony cDNA typu FCV 431, co obejmuje jego ekwiwalenty lub cDNA FCV G1, co obejmuje ekwiwalenty tego ostatniego.

Według drugiego bardzo korzystnego wykonania ten preparat immunogenny lub szczepionka zawiera przynajmniej dwa wektory ekspresyjne; do pierwszego jest wstawiony cDNA typu FCV 431, co obejmuje jego ekwiwalenty, a do drugiego cDNA FCV G1, co obejmuje ekwiwalenty tego ostatniego.

Aby dodawać adiuwanty do preparatów i szczepionek według wynalazku można stosować dowolny adiuwant znany specjaliście. Jednak korzystne jest formułowanie ich albo w postaci emulsji olej-w-wodzie albo dodać do nich polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego lub kopolimery bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, lub lipid kationowy zawierający sól czwartorzędowego amonu.

Wśród polimerów korzystne są polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego usieciowane za pomocą eterów polialkenylowych cukrów lub polialkoholi. Te związki są znane jako karbomer (Pharmeuropa tom 8, nr 2, czerwiec 1996). Specjalista może też odnieść się do US-A-2 909 462 (podany dla odniesienia) opisującego takie polimery akrylowe usieciowane przez związek polihydroksylowy mający przynajmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8, atomy wodorów przynajmniej trzech hydroksyli są zastąpione przez nienasycone reszty alifatyczne mające przynajmniej 2 atomy węgla. Korzystne reszty są to te zawierające 2 do 4 atomów węgla, np. winyle, allile i inne nienasycone grupy etylenowe. Reszty nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) są szczególnie odpowiednie, są one usieciowane przez allil sacharozy lub za pomocą allilopentaerytiritolu. Wśród nich można podać Carbopol® 974P, 934P oraz 971P.

Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylu, korzystne są EMA® (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowymi lub usieciowanymi, na przykład, usieciowanymi przez diwinyloeter. Można odnieść się do J. Fields i wsp. Nature 186: 778-780, 4 czerwca 1960 roku (podany dla odniesienia). Pod kątem ich budowy polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego i EMA® są tworzone korzystnie z motywów podstawowych o następującym wzorze:

R, R₂

----c-(CH₂) _x-C-(CH₂) _y---COOH COOH gdzie

- R1 i R2 takie same lub różne reprezentują H lub CH3 - x = 0 lub 1, korzystnie x = 1 - y = 1 lub 2 i x + y = 2.

Dla EMA® x = 0 i y = 2. Dla karbomerów x = y = 1.

Te polimery rozpuszcza się w wodzie lub w soli fizjologicznej (NaCl 20 g/l) i pH doprowadza się do 7,3-7,4 za pomocą wodorotlenku sodu, aby dać roztwór adiuwantu, do którego będzie włączony wektor ekspresyjny lub podjednostki.

Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionki będzie od 0,01% do 1,5% masa/obj., bardziej korzystnie od 0,05 do 1% masa/obj., najbardziej korzystnie od 0,1 do 0,4% masa/obj.

PL 203 842 B1

Lipidy kationowe zawierający czwartorzędowe sole amonu, które są szczególnie ale nie wyłącznie dostosowane do wektorów ekspresji plazmidowej odpowiadają wzorowi:

ch₃

R₁ - O - CH₂ - CH - CH₂ - N -— R₂ - X

OR, CH₃ w którym R1 jest liniową resztą alifatyczną nasyconą lub nienasyconą, mającą 12 do 18 atomów węgla, R2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą 2 do 3 atomów węgla i X grupą hydroksylową lub aminową.

Korzystnie chodzi o DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanamon; WO-A-9634109), korzystnie zasocjowane z obojętnym lipidem, w szczególności DOPE (dioleilo-fosfatydylo-etanolamina), aby tworzyć DMRIE-DOPE. Korzystnie mieszaninę plazmidu z tym adiuwantem przyrządza się bezpośrednio przed użyciem i jest korzystne przed jego podaniem zwierzęciu danie czasu tak przygotowanej mieszaninie aby uległa skompleksowaniu, na przykład, w czasie od 10 do 60 minut, a zwłaszcza rzędu 30 minut.

O ile DOPE jest obecny stosunek molarny DMRIE:DOPE jest korzystnie od 95:5 do 5:95, bardziej korzystnie 1:1.

Stosunek wagowy plazmid:adiuwant DMRIE lub DMRIE-DOPE może mianowicie być od 50:1 do 1:10, szczególnie od 10:1 do 1:5, korzystnie od 1:1 do 1:2.

Wektory do ekspresji in vivo kodujące cDNA typu FCV według wynalazku mogą także kodować GM-CSF kota lub być połączone z drugim wektorem kodującym GM-CSF kota (np. plazmidy pJP089 i pJP090, odpowiednio fig. 5 i fig. 6). W przypadku plazmidów korzystna jest mieszanina dwóch plazmidów. W przypadku wektorów wirusowych korzystny jest pojedynczy wektor. Do tego wektora ekspresyjnego lub tej mieszaniny wektorów ekspresyjnych można także dodać adiuwant jak opisano uprzednio.

Celem wynalazku jest także preparat immunogenny multiwalencyjny lub szczepionka multiwalencyjna przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota i przynajmniej jednemu innemu patogenowi kota, stosujący ten sam zrekombinowany wektor do ekspresji in vivo zawierający i wyrażający przynajmniej jeden cDNA typu FCV według wynalazku i przynajmniej jedną sekwencję nukleotydów immunogenu innego patogenu kota lub fragmentu immunologicznie czynnego tego immunogenu.

Celem wynalazku jest także preparat immunogenny multiwalencyjny lub szczepionka multiwalencyjna zawierający przynajmniej jeden wektor do ekspresji in vivo do którego jest wstawiony przynajmniej jeden cDNA typu FCV według wynalazku i przynajmniej drugi wektor ekspresyjny, do którego jest wstawiona sekwencja kodująca immunogen lub fragment immunologicznie czynny innego patogenu kota, mogą to być, na przykład, te opisane w przykładach 7 do 15 i 17 do 19 zgłoszenia patentowego według publikacji WO-A-9803660 (pPB179, pPB180, pPB181, pAB009, pAB053, pAB052, pAB056, pAB058, pAB029, pAB030, pAB083,pAB041).

Szczepionki zrekombinowane monowalencyjne lub multiwalencyjne takie jak opisano uprzednio mogą być także połączone z przynajmniej jedną szczepionką klasyczną (inaktywowaną, żywą atenuowaną, podjednostki) skierowaną przeciwko przynajmniej jednemu patogenowi kota takiemu samemu lub innemu.

Te inne patogeny kota są w szczególności wybrane z grupy złożonej z wirusa zapalenia nosa i tchawicy kota lub wirusa opryszczki kota (FHV), wirusa białaczki kota (FeLV), parwowirusów kota (FPV), wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kota (FIPV), wirusa niedoboru odporności kota (FIV), wirusa wścieklizny, Chlamydia.

Celem wynalazku są też izolowane białka kapsydów oczyszczone lub syntetyczne szczepu FCV431 i szczepu FCV G1 mające sekwencję aminokwasów odpowiednio przedstawione w SEQ ID N°: 7 i SEQ ID N°: 5. Obejmuje to automatycznie ekwiwalentne białka, to znaczy pochodzące od szczepów ekwiwalentnych do szczepów FCV 431 i FCV G1 według definicji podanych powyżej (na podstawie panelu i/lub przeciwciała monoklonalnego w szczególności przeciwciała monoklonalnego 44). Korzystnie te białka kapsydu mogą być zmontowane w postaci pustych kapsydów.

PL 203 842 B1

Celem wynalazku są także fragmenty i epitopy (przynajmniej około 8 do 10 aminokwasów) tych białek, które zachowują specyficzność i immungenność całego białka.

Białka kapsydu, ewentualnie zmontowane w postaci pustych kapsydów i ich fragmenty i epitopy mogą być produkowane za pomocą ekspresji in vitro. Odpowiednia sekwencja nukleotydów jest wstawiona do systemu ekspresji in vitro i wyrażana przez ten system i zebrany produkt ekspresji się w koń cu oczyszcza znanymi sposobami.

System ekspresji może być pochodzenia wirusowego, w szczególności z bakulowirusa (US-A-4 745 051). Integruje się sekwencję kodującą lub fragment (w przypadku epitopu lub fragmentu) do genomu bakulowirusa (np. bakulowirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV - wirus polihedrozy jądrowej) i ten ostatni następnie namnaża się, w szczególności na komórkach owadów, np. Spodoptera frugiperda S19 (depozyt ATCC CRL 1711).

System ekspresji in vitro może być pochodzenia prokariotycznego np. Escherichia coli lub eukariotycznego, w szczególności z drożdży, np. Saccharomyces cerevisiae lub komórek eukariotycznych ssaków, w szczególności linii komórkowych takich jak CHO (komórki jajnika chomika), HeLa, BHK lub komórki owadów np. Spodoptera frugiperda (powyżej) lub też komórki kota.

Jako promotory do stosowania w tych komórkowych konstruktach można podać silne promotory wirusowe, takie jak wirusa SV40 (Fiers i wsp., Nature, (1978) 273: 113) i promotor wczesny (CMV-IE) wirusa CMV lub cytomegalowirusa ludzkiego (McGregor i Caskey, Nucleic Acids Res. 17: 2365, 1989), mysiego lub innego pochodzenia, lub jeszcze genu polihedryny bakulowirusa AcNPV (Hooft van Iddekinge i wsp., 1983, Virology 131: 561-565).

Specjalista wie jak oczyszczać i/lub izolować białka, zmontowane lub nie w postaci pustych kapsydów, ich fragmenty i epitopy wychodząc z produktu i technik opisanych powyżej. Jako przykład można przypomnieć, że specjalista dysponuje różnymi metodami, które obejmują w szczególności precypitację opartą na rozpuszczalności interesujących białek, fragmentów i epitopów w zależności od soli obecnych w środowisku, strącanie rozpuszczalnikami organicznymi, polimerami i innymi związkami, strącanie powinowactwa i wybiórcza denaturacja, chromatografię kolumnowe, w tym chromatografię cieczową wysokowydajną (HPLC), chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, chromatografię immunopowinowactwa, chromatografię stosującą ligandy, immunoprecyypitację, sączenie na żelu, elektroforezę, sposoby sączenia w szczególności ultrasączenie i ultrawirowanie w gradiencie.

Specjalista może się odnieść przykładowo do K.Y. Green i wsp. J. Clin. Microb., lipiec 1997, tom 35, 7: 1909-1914 dla produkcji kapsydów w bakulowirusie namnażanym na komórkach Sf9 i zebranych za pomocą ultrawirowania na gradientach sacharozy (10 do 50%).

Białka kapsydu, ich fragmenty i epitopy mogą także być produkowane za pomocą syntezy chemicznej sposobami, którymi dysponuje specjalista.

Celem wynalazku są też preparaty immunogenne lub szczepionki zawierające przynajmniej jeden antygen podjednostkowy złożony z białka kapsydu, korzystnie montowanego w postaci kapsydów pustych FCV 431 i/lub FCV G1 lub odpowiedni fragment epitopu, w nośniku lub zaróbce akceptowalnych w weterynarii, i korzystnie adiuwant. Korzystnie preparat i szczepionki według wynalazku zawierają antygeny podjednostkowe pochodzące z dwóch szczepów FCV 431 i FCV G1. Także preparaty i szczepionki mogą zawierać białka kapsydu nie montowane i białka zmontowane w postaci pustych kapsydów.

Aby dodać adiuwanty do preparatów immunogennych i szczepionek według wynalazku, można jako adiuwant stosować (1) wodorotlenek glinu, (2) polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego, polimer bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenyIowej, lub (3) formułować preparat immunogenny lub szczepionkę w formie emulsji olej-w-wodzie i w szczególności emulsji SPT opisanej str. 147 Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach red. M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, i emulsji MF59 opisanej na str. 183 tej samej publikacji.

Emulsja olej-w-wodzie może być mianowicie na bazie płynnego lekkiego oleju parafinowego (typ Farmakopeia europejska); oleju izoprenoidowego takiego jak skwalan, skwalen; oleju będącego wynikiem oligomeryzacji alkenów, w szczególności izobutenu lub decenu; estrów kwasów lub alkoholi z liniowym ugrupowaniem alkoholowym, bardziej szczególnie olei roś linnych, oleinianu etylu, di(kaprylanu/kapranu) glikolu propylenowego, tri(kaprylanu/kapranu) glicerolu, dioleinianu glikolu propylenowego; estrów kwasów lub alkoholi tłuszczowych rozgałęzionych, w szczególności estrów kwasu izostearowego. Olej jest stosowany w połączeniu z emulgatorami aby wytworzyć emulsję. Emulgatory są korzystnie środkami powierzchniowo czynnymi niejonowymi w szczególności estrami sorbitanu,

PL 203 842 B1 mannidu, glicerolu, poliglicerolu, glikolu polipropylenowego i kwasu olejowego, izostearynowego, rycynoolejowego, hydroksystearynowego, ewentualnie etoksylowane, bloki kopolimerów polioksypropylen-polioksyetylen w szczególności Pluronic®, w szczególności L121.

Celem wynalazku są także preparaty immunogenne i szczepionki multiwalencyjne, w których walencja FCV jest walencją podjednostkową jak opisano powyżej.

Celem tego wynalazku jest też sposób immunizacji kotów przeciwko chorobom powodowanych przez kalciwirusy.

Sposób ten obejmuje podanie preparatu immunologicznego lub szczepionki według wynalazku kotom. To podanie może być zrobione w szczególności na drodze pozajelitowej, przez podanie podskórne, doskórne, domięśniowe, dootrzewnowe. Korzystnie podanie odbywa się na drodze podskórnej lub domięśniowej.

Różne sposoby podania mogą być stosowane dla preparatów immunogennych i szczepionek plazmidowych w szczególności cząsteczki złota otoczone DNA i wystrzeliwane tak by wnikały do komórek skóry immunizowanego osobnika (Tang i wsp. Nature 1992. 356. 152-154) i iniektory z strumieniem cieczy pozwalające na transfekcję naraz komórek skóry i komórek znajdujących się pod nimi (Furth i wsp. Analytical Bioch. 1992. 205. 365-368).

Specjalista posiada kompetencje potrzebne do definiowania precyzyjnie liczby zastrzyków i dawek każdej szczepionki do stosowania dla każdego protokołu szczepienia.

Wynalazek będzie obecnie opisany bardziej szczegółowo za pomocą sposobów wykonania użytych jako przykłady nie ograniczające odnoszące się do rysunków, w których: fig. 1 - Sekwencja cDNA i białka kapsydu szczepu FCV G1; fig. 2 - Sekwencja cDNA i białka kapsydu szczepu FCV 431; fig. 3 - Mapa restrykcyjna plazmidu pJCA151; fig. 4 - Sekwencja regionu C6L wirusa ospy kanarka (szczep ALVAC); fig. 5 - Mapa restrykcyjna plazmidu pJP089; fig. 6 - Sekwencja genu GM-CSF kota 3R3; fig. 7 - Mapa restrykcyjna plazmidu pJP090; fig. 8 - Sekwencja genu GM-CSF kota 3R4; a fig. 9 - Tablica mian krzyżowej seroneutralizacji.

Lista sekwencji do konstruktów tego wynalazku

SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N°

1: Oligonukleotyd PB331

2: Oligonukleotyd PB333

3: Oligonukleotyd PB332

4: Sekwencja cDNA kapsydu FCV G1

5: Sekwencja białka kapsydu FCV G1

6: Sekwencja cDNA kapsydu FCV 431

7: Sekwencja białka kapsydu FCV 431

8: Oligonukleotyd JCA289

9: Oligonukleotyd JCA290

10: Sekwencja regionu C6L wirusa ospy kanarka (szczep ALVAC)

11: Oligonukleotyd C6A1

12: Oligonukleotyd C6B1

13: Oligonukleotyd C6C1

14: Oligonukleotyd C6D1

15: Oligonukleotyd JCA291

16: Oligonukleotyd JCA292

17: Oligonukleotyd JCA293

18: Oligonukleotyd JCA294

19: Oligonukleotyd JCA295

20: Oligonukleotyd JP578

21: Oligonukleotyd JP579

22: Sekwencja genu GM-CSF kota 3R3

23: Sekwencja genu GM-CSF kota 3R4

P r z y k ł a d y:

Wszystkie konstrukty plazmidów przeprowadzono stosując standardowe techniki biologii molekularnej (klonowanie, trawienie enzymami restrykcyjnymi, synteza komplementarnego DNA jednoniciowego, amplifikacja łańcuchowa z polimerazą, wydłużanie oligonukleotydu przez polimerazę DNA...) opisane przez Sambrook J. i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne stosowane

PL 203 842 B1 do tego wynalazku jak i różne fragmenty amplifikowane za pomocą amplifikacji łańcuchowej polimerazy (=ACP lub PCR) wyizolowano za pomocą zestawu Geneclean7 (BIO101 Inc., La Jolla, CA).

P r z y k ł a d 1: Izolaty i hodowla kalciwirusów kota G1 i 431

Źródła kalciwirusa kota określonego jako G1 uzyskano z pobrania we Francji od kota prezentującego objawy zakażenia przez kalciwirusy kota. Ten szczep FCV G1 zdeponowano 12 marca 1999 roku w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (czyli CNCM) Instytutu Pasteura, Paryż, Francja pod numerem dostępu I-2167.

Szczep kalciwirusa kota określony jako 431 uzyskano z pobrania w Anglii od kota prezentującego objawy zakażenia przez kalciwirusy kota. Ten szczep FCV 431 zdeponowano 12 marca 1999 roku w Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (czyli CNCM) Instytutu Pasteura, Paryż , Francja pod numerem dostępu I-2166.

Dla ich amplifikacji szczepy kalciwirusa kota hodowano na komórkach linii nerki kota (CrandellReese Feline Kidney lub CRFK Nr ATCC CCL-94, Crandell i wsp. In vitro 1973, 9, 176-185).

Komórki CRFK umieszczono w hodowli w płytce z 96 studzienkami lub w Falconach 25 cm z podłożem DMEM uzupełnionym 5% płodową surowicą cielę cą zawierającym około 100000 komórek na ml. Komórki hodowano w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2.

Po 3 dniach warstwa komórek dochodzi do konfluencji. Podłoże hodowlane jest następnie zastępowane przez podłoże DMEM bez surowicy ale z dodatkiem 50 mg/ml gentamycyny i dodaje się rozmrożone próbki izolatów wirusowych FCV w objętości po 100 μΐ rozcieńczeń seryjnych czterokrotnych do studzienek do klonowania w ograniczonych rozcieńczeniach wirusa FCV albo 1 ml na Falcon.

Gdy efekt cytopatyczny (ECP) jest kompletny (24-48 godzin od początku umieszczenia w hodowli) zbiera się zawiesiny wirusów i zamraża w -70°C. Konieczne sana ogół 3-4 kolejne pasaże do produkcji partii wirusa. Partię wirusa przechowuje się w -70°C.

P r z y k ł a d 2: Ekstrakcja RNA wirusowego szczepów G1 i 431 kalciwirusa kota

Komórki CRFK hodowano w 37°C w rolowanych butelkach 2 litrowych (850 cm²) w modyfikowanym podłożu Eagle (MEM, Gibco BRL) uzupełniony 2,5% hydrolizatem laktalbuminy (Gibco BRL) i 5% surowica płodowa cielęca (Gibco BRL). Do rolowanej butelki dodawano po 300 ml zawiesiny komórek w podłożu MEM przy około 100000 komórek/ml. Po 3 dniach warstwa komórek jest konfluentna. Następnie podłożu hodowli komórek zastąpiono podłożem MEM bez surowicy i dodano wirus FCV do wielokrotności zakażenia (moi) 0,5 DICC50/komórkę. Hodowlę wirusową utrzymywano w 37°C podczas 24 lub 48 godzin aż do uzyskania efektu cytopatycznego dla całości warstwy komórek. Zawiesinę wirusa zbierano a następnie klarowano za pomocą wirowania.

RNA wirusowy zawarły w 100 ml zawiesiny szczepu FCV G1, który był preparowany ekstrahowano roztworami zestawu High Pure™ Viral RNA Kit Nr Kat. 1 858 882, Roche Molecular Biochemicals) według zaleceń dostawcy dla etapów ekstrakcji. Uzyskany osad RNA uzyskany na koniec ekstrakcji zawieszono w 10 ml sterylnej wody destylowanej bez RNAzy.

RNA wirusowy szczepu FCV 431 ekstrahowano w tych samych warunkach wychodząc ze 100 ml zawiesiny wirusa odpowiedniego szczepu. Osad RNA uzyskany na koniec ekstrakcji zawieszono w 10 ml sterylnej wody destylowanej bez RNAzy.

P r z y k ł a d 3: Synteza DNA komplementarnych genów kapsydów szczepów G1 i 431 kalciwirusów kota

DNA komplementarne odpowiadające genom kapsydów szczepów G1 i 431 kalciwirusów kota syntetyzowano z zestawem Gene Amp RNA PCR Kit (Nr Kat N 808 0017 Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki zalecane przez producenta.

Dla szczepu FCV G1 reakcja odwrotnej transkrypcji po której przeprowadzono reakcją łańcuchową polimerazy (reakcja „TI-ACP lub „RT-PCR) była przeprowadzona z 1 ml zawiesiny wirusowego RNA FCV G1 (przykład 2) z następującymi oligonukleotydami:

PB331 (33 mer) (SEQ ID N° 1)

5' TTGCGGCCGCTGTGATGTGTTCGAAGTTTGAGC 3' i PB333 (36 mer) (SEQ ID N° 2)

5' TTGGCGCCGYTGACCMAGTGCAGCYTTRTCCAATTC 3'.

Warunki syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA to temperatura 42°C przez 15 min., następnie 99°C przez 5 min. i w końcu 4°C przez 5 min.. Warunki reakcji PCR to temperatura 95°C przez 2 min., następnie 35 cykli (95°C przez 1 min., a następnie 62°C przez 1 min. i 72°C przez 2 min.) i w końcu 72°C przez 7 min., aby wyprodukować fragment RT-PCR o wielkości około 2000 par zasad (bp), który określono jako „G1-4.

PL 203 842 B1

Dla szczepu FCV 431 reakcja odwrotnej transkrypcji po której przeprowadzono reakcją łańcuchową polimerazy (reakcja „TI-ACP lub „RT-PCR) była przeprowadzona z 1 ml zawiesiny wirusowego RNA FCV G1 (przykład 2) z następującymi oligonukleotydami:

PB331 (33 mer) (SEQ ID N° 1) i PB332 (38 mer) (SEQ ID N° 3)

5' TTGGCGCCAAYWGTRTTWGHTACAGTRTCAATYARRCC 3'.

Warunki syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA to temperatura 42°C przez 15 min., następnie 99°C przez 5 min. i w końcu 4°C przez 5 min.. Warunki reakcji PCR to temperatura 95°C przez 2 min., następnie 35 cykli (95°C przez 1 min., a następnie 62°C przez 1 min. i 72°C przez 2 min.) i w końcu 72°C przez 7 min., aby wyprodukować fragment RT-PCR o wielkości około 2000 par zasad (bp), który określono jako „431-2.

P r z y k ł a d 4: Klonowanie genu kodującego białko kapsydu szczepu G1 kalciwirusa kota

Fragment RT-PCR „G1-4 strawiono Narl, a następnie Notl, aby wyizolować po elektroforezie w ż elu agarozowym fragmentu Narl-Notl o wielkoś ci około 2000 bp. Fragment ten zligowano z wektorem pBlueScript® II KS+ (Nr Kat 212208 Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, USA), uprzednio strawionego Notl i ClaI, następnie defosforylowanego, aby uzyskać plazmid pG1-4-5 (5033 bp).

Fragment Notl-Narl sklonowany w tym plazmidzie zsekwencjonowano w całości na obu niciach, aby określić sekwencję genu kapsydu. Sekwencja genu kapsydu szczepu FCV G1 (2010 bp) (SEQ ID N° 4) jak i sekwencja białka kapsydu (p65) (668 aminokwasów) (SEQ ID N° 5) kodowana przez ten gen są przedstawione na fig. 1.

P r z y k ł a d 5: Klonowanie genu kodującego białko kapsydu szczepu 431 kalciwirusa kota

Fragment RT-PCR „431-2 strawiono Narl, a następnie Notl, aby wyizolować po elektroforezie w ż elu agarozowym fragment Narl-Notl o wielkoś ci okoł o 2000 bp. Fragment ten zligowano z wektorem pBlueScript® II KS+ (Nr Kat 212208 Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, USA), uprzednio strawionego Notl i ClaI, następnie defosforylowanego, aby uzyskać plazmid p431-2-1 (4985 bp).

Fragment Narl-Notl sklonowany w tym plazmidzie zsekwencjonowano w całości na obu niciach aby określić sekwencję genu kapsydu. Sekwencja genu kapsydu szczepu FCV 431 (2007 bp) (SEQ ID N° 6) jak i sekwencja białka kapsydu (p65) (668 aminokwasów) (SEQ ID N° 7) kodowana przez ten gen są przedstawione na fig. 2.

P r z y k ł a d 6. Konstrukcja plazmidu pJCA151

Reakcja PCR była przeprowadzona stosując plazmid p431-2-1 (przykład 5) i jako matryce następujące oligonukleotydy:

JCA289 SEQ ID N° 8 (36 mer):

5' AAACGCGTCGACATGTGCTCAACCTGCGCTAACGTG 3' i

JCA290 SEQ ID N° 9 (33 mer):

5' TTTTGATATCTCATATTTTAACCATTCCACTCC 3', aby zamplifikować fragment PCR około 2030 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi Sall i EcoRV, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment SalI-EcoRV 2014 bp. Ten fragment restrykcyjny następnie zligowano z plazmidem pVR1012 (Hartikka J. i wsp. Human Gene Therapy. 1997. 7. 1205-1217) uprzednio strawionym Sall i EcoRV, aby uzyskać plazmid pJCA151 (6908 bp) (fig. 3).

P r z y k ł a d 7. Konstrukcja plazmidu dawcy dla insercji w miejscu C6L wirusa ospy kanarka

Fig. 4 (SEQ ID N° 10) przedstawia sekwencję fragmentu 3700 bp genomowego DNA wirusa ospy kanarka. Analiza tej sekwencji wykazała otwartą ramkę odczytu (ORF), którą nazwano C6L, która rozpoczyna się w pozycji 377 i kończy się w pozycji 2254. Konstrukcja plazmidu insercyjnego powodująca delecję ORF C6L i jego zastąpienie przez miejsce wielokrotnego klonowania otoczone przez sygnał zakończenia transkrypcji i translacji była przeprowadzona jak opisano poniżej.

Przeprowadzono reakcję PCR wychodząc z matrycy złożonej z DNA genomowego wirusa ospy kanarka i z następującymi oligonukleotydami:

C6A1 (SEQ ID N° 11) (42 mer)

5' ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT

3' i C6B1 (SEQ ID N° 12) (73 mer)

5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTT

TTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA 3', aby wyizolować fragment PCR 432 bp (fragment A).

PL 203 842 B1

Reakcja PCR była przeprowadzona wychodząc z matrycy złożonej z DNA genomowego wirusa ospy kanarka i z następującymi oligonukleotydami:

C6C1 (SEQ ID N° 13) (72 mer)

5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAAT

GAGTATATATAATTGAAAAAGTAA

3' i C6D1 (SEQ ID N° 14) (45 mer)

5' GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3', aby wyizolować fragment PCR 1210 bp (fragment B).

Fragmenty A i B zhybrydyzowano razem, aby służyły jako matryca dla reakcji PCR przeprowadzonej z oligonukleotydami C6A1 (SEQ ID N° 11) i C6D1 (SEQ ID N° 14), aby wygenerować fragment PCR 1630 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi SacI i KpnI, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment SacI-KpnI 1613 bp. Ten fragment następnie zligowano z wektorem pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA Nr kat 212205) uprzednio strawionym enzymami SacI i KpnI, aby uzyskać plazmid pC6L. Sekwencję tego plazmidu sprawdzono za pomocą sekwencjonowania. Ten plazmid zawiera 370 bp sekwencji zlokalizowanych powyżej ORF C6L („lewe ramię flankujące C6), przedwczesny sygnał zatrzymania transkrypcji krowianki, kodony stop w 6 ramkach odczytu, miejsce wielokrotnego klonowania zawierające miejsca restrykcyjne Smal, Pstl, XhoI i EcoRI i w końcu 1156 bp sekwencji zlokalizowanych poniżej ORF C6L („prawe ramię flankujące C6).

Plazmid pMP528HRH (Perkus M i wsp. J. Virol. 1989. 63. 3829-3836) stosowano jako matrycę do amplifikacji całkowitej sekwencji promotora krowianki H6 (numer dostępu GenBank M28351) z nastę pują cymi oligonukleotydami:

JCA291 (SEQ ID N° 15) (34 mer)

5' AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3' i JCA292 (SEQ ID N° 16) (43 mer)

5' AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG 3', aby uzyskać fragment PCR 149 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi Smal i EcoRI aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Smal-EcoRI 138 bp. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pC6L uprzednio strawionym Smal i EcoRI aby uzyskać plazmid pJCA150.

P r z y k ł a d 8. Konstrukcja wirusa zrekombinowanego vCP1710 (zrekombinowany wirus ospy kanarka wyrażający gen kapsydu szczepu FCV 431).

Przeprowadzono reakcję PCR stosując plazmid p431-2-1 (przykład 5) jako matrycę i następujące oligonukleotydy:

JCA293 (SEQ ID N° 17) (55 mer):

5AAATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTGCTCAACCTGCGCTAACGTG 3' et JCA294 (SEQ ID N° 18) (33 mer):

5' TTTTGTCGACTCATATTTTAACCATTCCACTCC 3', aby zamplifikować fragment PCR 2050 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi

Nrul i Sall, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Nrul-Sall 2035 bp (fragment A). Plazmid pJCA150 (przykład 7) strawiono enzymami restrykcyjnym Nrul i Sall, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Nrul-Sall około 4500 bp (fragment B). Fragmenty A i B wówczas zligowano razem, aby uzyskać plazmid pJCA152.

Plazmid pJCA152 linearyzowano Notl, a następnie transfekowano do komórek pierwotnych zarodków kurcząt zakażonych wirusem ospy kanarka (szczep ALVAC) według techniki precypitacji fosforanem wapnia opisanej uprzednio (Panicalli i Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. 79. 4927-4931; Piccini i wsp. w Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. red. Wu R. i Grossman L. Academic Press). Pozytywne płytki wybrano na podstawie hybrydyzacji ze znakowaną radioaktywną sondą specyficzną dla genu kapsydu szczepu FCV 431. Te fagi przeszły 4 kolejne cykle selekcji/oczyszczania łysinek, aż wyizolowano czystą populację. Łysinkę reprezentatywną dla rekombinacji in vitro miedzy plazmidem dawcą pJCA 152 i genomem wirusa ospy kanarka ALVAC następnie zamplifikowano i partię uzyskanego wirusa zrekombinowanego nazwano vCP1710.

P r z y k ł a d 9. Konstrukcja wirusa zrekombinowanego vCP1711 (zrekombinowany wirus ospy kanarka wyrażający gen kapsydu szczepu FCV G1).

Przeprowadzono reakcję PCR stosując plazmid pG 1-4-5 (przykład 4) jako matrycę i następujące oligonukleotydy:

JCA293(SEQ ID N° 17)

PL 203 842 B1 i JCA295 (SEQ ID N° 19) (33 mer):

5' TTTTGTCGACTCATAGTTTTGTCATAGTACTCC 3', aby zamplifikować fragment PCR 2050 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi Nrul i Sall, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Nrul-Sall 2035 bp (fragment A). Plazmid pJCA150 (przykład 7) strawiono enzymami restrykcyjnym Nrul i Sall, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment restrykcyjny Nrul-Sall około 4500 bp (fragment B). Fragmenty A i B wówczas zligowano razem aby uzyskać plazmid pJCA153.

Plazmid pJCA153 linearyzowano Notl, a następnie transfekowano do komórek pierwotnych zarodków kurcząt zakażonych wirusem ospy kanarka (szczep ALVAC) według techniki precypitacji fosforanem wapnia opisanej uprzednio (Panicali i Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. 79. 4927-4931; Piccini i wsp. w Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. red. Wu R. i Grossman L. Academic Press). Pozytywne płytki wybrano na podstawie hybrydyzacji ze znakowaną radioaktywną specyficzną genu kapsydu szczepu FCV G1. Te fagi przeszły 4 kolejne cykle selekcji/oczyszczania łysinek, aż wyizolowano czystą populację. Łysinkę reprezentatywna rekombinacji in vitro miedzy plazmidem dawcą pJCA152 i genomem wirusa ospy kanarka ALVAC a następnie zamplifikowaną i zapas uzyskanego wirusa zrekombinowanego nazwano vCP1711.

P r z y k ł a d 10: Plazmid kodujący GM-CSF kota

Krew kota zebrano w probówce zawierającej EDTA za pomocą pobrania krwi. Komórki jednojądrowe zebrano za pomocą wirowania na gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Komórki jednojądrowe kota następnie stymulowano konkanawaliną A (ConA) (stężenie końcowe około 4 μg/ml) i fitohemaglutyniną A (stężenie końcowe około 10 μg/ml). Po stymulacji limfocyty „ConA'' i „PHA zebrano przez zdrapanie szalek hodowlanych i całkowity RNA tych komórek ekstrahowano stosując zestaw mRNA isolation kit for White Blood Cells (Boehringer Mannheim/Roche Nr Kat. 1 934 325).

Całkowity RNA wyekstrahowany z limfoblastów kota stymulowanych ConA i PHA posłużył jako matryca do syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA. Tę pierwszą nić komplementarnego DNA zsyntetyzowano przez elongację oligonukleotydu p(dT)15 (Boehringer Mannheim Nr Kat. 814 270). DNA komplementarny jednoniciowy następnie stosowano jako matrycę do reakcji PCR z następującymi oligonukleotydami:

JP578 (SEQ ID N° 20) (33 mer)

5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' i JP579 (SEQ ID N° 21) (36 mer)

5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3', aby zamplifikować fragment PCR około 450 par zasad (bp). Ten fragment strawiono Notl aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment Notl-Notl 450 bp. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pVR1012 (Hartikka J. i wsp. Human Gene Therapy. 1997. 7. 1205-1217). Zidentyfikowano dwa klony zawierające sekwencję GM-CSF kota (SEQ ID N° 22 i SEQ ID N° 23) w dobrej orientacji pod względem promotora hCMWIE odpowiednio pJP089 i pJP090. Te dwa plazmidy maja wielkość 5364 bp (fig. 5 i 7).

Sekwencja genu GM-CSF kota sklonowana w plazmidzie pJP089 zawiera 13 różnic na poziomie nukleotydów od sekwencji GM-CSF kota dostępnej w GenBank (numer dostępu AF053007). Najważniejszą zmianą jest zmiana C > T, która pociąga za sobą zmianę leucyna > fenyloalanina dla aminokwasu (pierwsza zasada kodonu dla aminokwasu # 107; fig. 6). Sekwencja genu GM-CSF kota sklonowana w plazmidzie pJP090 jest ekwiwalentna do tej zawartej w plazmidzie pJP089 poza tym, że zmiana leucyna > fenyloalanina nie jest obecna dla aminokwasu # 107 (fig. 8). Sprawdzenie sekwencji 3' genu GM-CSF kota za pomocą zestawu 3' RACE wykazało, że w tej pozycji 107 może być obecny u tego samego kota aminokwas leucyna lub aminokwas fenyloalanina.

P r z y k ł a d 11: Wytwarzanie połączonych szczepionek plazmidowych

Mieszano różne plazmidy konieczne do wytwarzania szczepionki asocjowanej. Te plazmidy mogą być w szczególności tymi, które są opisane w przykładach 6 i 10 (pJCA151, pJP089 i pJP090) i przykładach 7 do 15 i 17 do 19 zgłoszenia patentowego wg publikacji WO-A-9803660 (pPB179, pPB180, pPB181, pAB009, pAB053, pAB052, pAB056, pAB058, pAB029, pAB030, pAB083, pAB041). Mieszaniny są przeprowadzone w ten sposób, że stężenie końcowe każdego plazmidu odpowiada skutecznej dawce każdego plazmidu. Roztwory stosowane do dopasowania stężenia końcowego szczepionki mogą być albo roztworem NaCl 0,9% lub buforu PBS.

PL 203 842 B1

P r z y k ł a d 12: Formułowanie plazmidów do szczepionek

Roztwór DNA zawierający jeden lub kilka plazmidów według przykładów 11 zatężano za pomocą strącenia etanolem jak opisano w Sambrook i wsp. (1989). Osad DNA zawieszano w roztworze

0,9% NaCl, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml. Roztwór 0,75 mM DMRIE-DOPE przygotowano przez zawieszenie liofilizatu DMRIE-DOPE w odpowiedniej objętości sterylnej H2O.

Tworzenie kompleksów DNA plazmidowy-lipid przeprowadza się przez rozcieńczenie w równych częściach 0,75 mM roztworu DMRIE-DOPE roztworem DNA 1 mg/ml w NaCl 0,9%. Roztwór DNA wprowadza się stopniowo za pomocą sterylnej igły 26G wzdłuż ściany butelki zawierającej roztwór kationowego lipidu, aby uniknąć wytwarzania piany. Następnie miesza się łagodnie od momentu gdy dwa roztwory zmieszają się. Wówczas otrzymuje się w końcu kompozycję zawierającą 0,375 mM DMRIE-DOPE i 500 pg/ml plazmidu.

Jest korzystne, aby całość stosowanych roztworów była w temperaturze otoczenia dla operacji opisanych powyżej. Pozwala się na zachodzenie kompleksowania DNA/DMRIE-DOPE w temperaturze otoczenia w czasie 30 minut przed przejściem do immunizacji zwierząt.

P r z y k ł a d 13: Formułowanie wektorów ospy kanarka do szczepionek

Do przygotowania szczepionek do zrekombinowanych wirusów ospy kanarka vCP1710 (przykład 8) i vCP1711 (przykład 9) mogą być stosowane adiuwanty z roztworu karbomerów. Korzystnym karbomerem jest Carbopol™ 974P wytworzony przez BF Goodrich, Ohio, USA (masa cząsteczkowa około 3 000 000).

Roztwór podstawowy 1,5% Carbopol™ 974P jest wstępnie przygotowany w wodzie destylowanej zawierającej 1 g/l chlorku sodu. Ten roztwór podstawowy wówczas stosuje się dla wytworzenia 4 mg/ml Carbopol™ 974P w soli fizjologicznej. Roztwór podstawowy mieszano z odpowiednią obję tością soli fizjologicznej albo w pojedynczym etapie albo w kilku kolejnych etapach, wartość pH w każdym etapie jest doprowadzana roztworem wodorotlenku sodu 1 N (lub jeszcze bardziej stężonym), aby uzyskać końcową wartość pH 7,3-7,4.

Gotowy do użycia roztwór Carbopol™ 974P tak uzyskany może być użyty do zawieszenia zrekombinowanych zliofilizowanych wirusów (np. vCP1710, vCP1711) lub do rozcieńczenia roztworów podstawowych stężonych zrekombinowanych wirusów (np. vCP1710, vCP1711). Na przykład, aby uzyskać zawiesinę wirusową zawierającą 10 pfu na dawkę 1 ml, można rozcieńczyć roztwór wirusa w taki sposób, aby uzyska ć miano 10^8,3 pfu/ml, a nastę pnie rozcień czyć równą częścią tego roztworu Carbopol™ 974P gotowego do użycia 4 mg/ml.

P r z y k ł a d 14: Testy pośredniej immunofluorescencji (IFI)

Testy IFI przeprowadzono na płytkach z 96 studzienkami zawierającymi komórki CRFK hodowane w pojedynczych warstwach i infekowane przez testowany wirus FCV.

200 μΐ na studzienkę zawiesiny komórek CRFK z 90000 komórek/ml w podłożu F15 (Gibco BRL, Nr katalogu 045-1075) zawierającym 5% płodową surowicę cielęcą umieszczono w hodowli w płytkach po 96 studzienek. Przy konfluencji 320 DICC50 FCV zaszczepiono pod 100 μl podłoża F15. Gdy pierwsze ogniska ECP się pojawiają komórki płucze się zimnym PBS bez wapnia i magnezu (PBS; Sigma), a następnie utrwala w -20°C przez 30 minut zimnym acetonem zawierającym 5% obj./obj. wody. Po wyschnięciu komórki zakażone i utrwalone komórki skontaktowano w czasie 30 minut w 37°C z 100 μl na studzienkę płynu puchlinowego odpowiadającego monoklonalnemu przeciwciału 44 antyFCV 431 (hybrydoma 431 2 0 17 E9 T, zdeponowana w CNCM pod numerem dostępu I-2282) rozcieńczonego do 1/5000 w buforze TRIS-HCl 50 mM pH 7,6.

Po dwóch płukaniach PBS wykrywano utrwalenie przeciwciał przez inkubację w tych samych warunkach z przeciwciałem kozy anty-IgG myszy koniugowanym z izotiocyjanianem fluoresceiny (Biosys, koniugat FITC 2 mg/ml) i rozcieńczano 1/150 buforem TRIS-HCL 50 mM pH 7,6. Odczyt robiono pod mikroskopem optycznym w świetle UV.

To przeciwciało monoklonalne testowano w stosunku do każdego z izolatów panelu. Wiązało się wyłącznie z komórkami CRFK zakażonymi przez FCV 431.

Test ten może być stosowany do określenia ekwiwalentów szczepu FCV 431. Te ekwiwalenty to są te, na których jest związane przeciwciało monoklonalne 44.

P r z y k ł a d 15: Seroneutralizacja krzyżowa in vitro

Przeprowadzono testy seroneutralizacji krzyżowej między 18 izolatami z terenu uzyskanymi przez pobranie wymazów z gardła praktykowanych na kotach prezentujących objawy zakażenia przez kalciwirusy kota. Siedem pochodzi geograficznie z Francji, chodzi o izolaty określane jako A2, F3031,

G1, G3, F1, H3-2 i H1-4. 4 pochodzi geograficznie z Wielkiej Brytanii, chodzi o izolaty identyfikowane

PL 203 842 B1 jako J5, 337, 388b i 431. I w końcu 7 pochodzi geograficznie z USA, chodzi o izolaty określane jako RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 i RMI9.

Dla każdego wirusa FCV wytworzono antysurowicę przez inokulację kotków drogą ustnonosową z 1060 DICC50 odpowiedniego wirusa FCV. Kotki wolne od patogenów specyficznych (EOPS) były w wieku 10 do 14 tygodni. Surowica każdego zwierzę cia jest zbierana miesiąc po zakażeniu. Surowice inaktywowano ciepłem (30 minut w 56°C), rozporcjowano i przechowywano w -20°C.

Surowica otrzymana dla każdego izolatu jest testowana pod kątem swej zdolności do neutralizacji 18 izolatów. Surowice rozcieńcza się szeregowo trzykrotnie podłożem DMEM w płytkach po 96 studzienek do hodowli komórek. Do 0,05 ml rozcieńczonej surowicy dodaje się 0,05 ml podłoża hodowlanego zawierającego około 100 DICC50 wybranego szczepu wirusa. Tę mieszaninę inkubuje się przez 2 godziny w 37°C w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO2.

Następnie dodaje się 0,15 ml zawiesiny komórek CFRK zawierające około 100000 komórek na ml do każdej mieszaniny. Efekt cytopatyczny obserwuje się za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym po 4 dni hodowli w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Miana neutralizujące każdej surowicy oblicza się według metody Karber'a. Miana są podane w postaci największego rozcieńczenia hamującego efekt cytopatyczny dla 50% studzienek. Miana są wyrażane w log10. Miano minimalne tak znalezione wynosi 0,7 log10 VN50. Każdą surowicę mianuje się przynajmniej dwa razy, korzystnie trzy razy.

Fig. 9 przedstawia zestaw neutralizowanych mian uzyskanych w czasie seroneutralizacji krzyżowych przeprowadzonych między tymi 18 szczepami FCV i tymi 18 surowicami.

Należy dobrze zrozumieć, że wynalazek zdefiniowany przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do poszczególnych wykonań wskazanych w powyższym opisie, ale obejmuje warianty, które nie wykraczają poza zakres niniejszego wynalazku.

LISTA SEKWENCJI <110=· MERIAL <120=· Geny kalciwirusów kota i zawierające je rekombinowana szczepionka <130=· FCV Zrekombinowany <140>

<141> 2000-02-11 <160> 23 <170> Patencln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna i <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 1 ctgcggccgc tgtgatgtgt tcgaagtttg agc 33 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 2

Ltggcgccgy tcaccraagtg cagcyttrtc caattc 36 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400=· 3 ttggcgccaa ywgtrttwgh tacagtrtca atyarrcc 38 <210> 4 <211> 2010 <212> DNA <213> kalciwirus kota <400> 4

PL 203 842 B1 atgcgctcaa cctęcgctaa cgtgcttaaa tactatg.att gggatcccca cacaaaattg 60 gttatcgacc ccaataaatc cccttctcta ggcttctgcg ataaaccgct tttatgctgc 120 cacccagaac ttctcccaga acttggaaca gtgtgggatt gtgaccaatc ccctctacaa 180 atctaccttg aacctatcc: tggcaatgac caatggagct cgacacttga tgctatcgat 240 cccgttgttc cccccatgca ccgggacaag gctgggaaaa tcttccaacc tcatcctggt 300 gttccaacgc accacctcat caatgaagtc gcaaaacctt gggatccaaa tctccccatc 360 ttccgattgg aagctgacgg ggattcatcc atcacgaccc ccgagcaagg aacattggtc 420 ggcggtgtta ttgccgagcc cagcgctcaa atggcaactg ctgctgacgc agcaactggc 480 aagagcgttg acccggaatc ggagtctttc ttctcattcc ataccagtgt gaattggagt 540 acatctgaaa cccagggaaa catcctcctt aaacaatctt taggacccct acttaatcct 600 tacc:tgaac acctttctaa actatacgtt gcttggtctg gatcagtgga tgtaaggttc 660 tctattcctg gctccggtgt cttcgggggg aaattggctg ccattgttgt gcctccaggg 720 gttgaccccg tccagagcac ctcaatgctc cagtatcccc atgtcctctt tgatgctcgc 780 caagttgaac ctgttatatt tccaatcccc gatttaagga gcactctcta tcacctaatg 840 tctgatactg acaccacacc ccttgttatc atggtatata atgatcttat taacccttat 900 gctaatgatt ccaactcttc tgggtgtatt gttaccgttg agaccaaacc tggacctgac 960 ttcaaatttc acctcctgaa accacctgga tcaatgttaa ctcatggctc tattccctct 1020 gacttgattc caaaaccttc atccctttgg attggaaatc gatattggtc tgacataact 1080 gattttgtaa ttcggccatc cgtgtttcaa gccaatcgtc actttgactt caaccaagaa 1140 acggctggat ggagcacacc aagatttcga cccataacaa taactattag tgaaagtaat 1200 ggatcaaaac tgggaactgg cgtggccaca gattacattg tgcccggcat acctgatggt 1260 tggcctgaca ccacaattgg tgaggaattg acaccagctg gagattactc aatcacaaac 1320 ggtagtcgca acgacattgc aacagctaat gcttatgaca gtgctgatgt gatcacaaac 1380 accacaaatt tcagggggat ctacatttgt ggagcactcc agagggcttg gggcgataag 1440 aagatctcaa gtacagcttt cataaccact gctattaagg aaggtaatac gcttaaacca 1500 tcaaatacaa ctgacatgac aaaaattgct gtgtacc&gg acactcatgt tggcagggat 1560 gttcaaacat ctgatgatac aecggcaatc cttggttaca ctggaattgg tgaacaggca 1620 attggatcta atagggatag tgtggttcgc attagcatgc tgccggaaac tggtgcccgc 1680 ggcgggaatc acccaattct ccacaaaaat tccattaagt taggatatgt actcaggtca 1740 attgatgtgt tcaactcaca aattctccac acatctagac aactgtccct caatcattac 1800 ttgctaccac ctgactcatt tgctgtttat aggattatag actctaatgg atcctggttt 1860 gatgtaggga ttgatagtga tggtttttcc tctgttggtg tttctagtat ccctaaactt 1920 gagctccctc tttctgcctc ctacatggga attcagctgg caaagattcg acctgcctct 1980 aacactagga gtactatgac aaaactatga 2010 <210> 5 <211> 669 <212> PRT <2I3> kalciwirus kota <400> 5

Mec Cys 1

Ser

Thr

• Cys 5

Ala Asn

Val

Leu

Lys 10

Tyr

Tyr

Asp

Trp

Asp 15

Pro

His Thr

Lys

Leu 20

Val

Ile Asp

Pro

Asn 25

Lys

Phe

Leu

Ser

Leu 30

Gly

Phe

Cys Asp

Lys 35

Pro

Leu

Leu Cys

Cys 40

Tyr

Pro

Glu

Leu

Leu 45

Pro

Glu

Phe

Gly Thr SC

Val

Trp

Asp

Cys Asp 55

Gin

Ser

Pro

Leu

Gin 60

Ile

Tyr

Leu

Glu

Ser Ile 65

Leu

Gly

Asp

Asp Glu 70

Trp

Ser

Ser

Thr 75

Phe

Asp

Ala

Ile

Asp 80

Pro Vai

Val

Pro

Pro

Met His

Trp

Asp

Lys

Ala

Gly

Lys

Ile

Phe

Gin

S5 go 95

Pro His p_ro Gly _Val Leu Mec His His Leu ile Asn Glu Val Ala Lys

PL 203 842 B1

100

105

110

Ala

Trp

Asp

Pro

Asn

Leu

Pro

Ile

Phe

Arg

Leu

Glu

Ala

Asp

Gly

Asp

115

120

125

Ser

Ser

Ile

Thr

Thr

Pro

Glu

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Gly

Gly

Val

Ile

130

135

140

Ala

Glu

Pro

Ser

Ala

Gin

Met

Al a

Thr

Ala

Ala

Asp

Ala

Ala

Thr

Gly

145

150

155

160

Lys

Ser

Val

Asp

Ser

Glu

Trp

Glu

Ser

Phe

Phe

Ser

Phe

His

Thr

Ser

165

170

175

Val

Asn

Trp

Ser

Thr

Ser

Glu

Thr

Gin

Gly

Lys

Ile

Leu

Phe

Lys

Gin

180

185

190

Ser

Leu

Gly

Pro

Leu

Leu

Asn

Pro

Tyr

Leu

Glu

His

Leu

Ser

Lys

Leu

195

200

205

Tyr

Val

Ala

Trp

Ser

Gly

Ser

Val

Asp

Val

Arg

Phe

Ser

Ile

Ser

Gly

210

215

220

Ser

Gly

Val

Phe

Gly

Gly

Lys

Leu

Ala

Ala

Ile

Val

Val

Pro

Pro

Gly

225 230 235 240

Val Asp Pro Val Gin Ser Thr Ser Met Leu Gin Tyr Pro His Val Leu 245 250 255

Phe Asp Ala Arg Gin Val Glu Pro Val Ile Phe Ser Ile Pro Asp Leu 260 265 270

Arg Ser Thr Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp Thr Thr Ser Leu 275 280 285

Val Ile Met Val Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ser

290

295

300

Asn 305

Ser

Ser

Gly

Cys

Ile Val 310

Thr

Val

Glu

Thr 315

Lys

Pro

Gly

Pro

Asp 320

Phe

Lys

Phe

His

Leu 325

Leu Lys

Pro

Pro

Gly 330

Ser

Met

Leu

Thr

His 335

Gly

Ser

Ile

Pro

Ser 340

Asp

Leu Ile

Pro

Lys 345

Ser

Ser

Ser

Leu

Trp 350

Ile

Gly

Asn

Arg

Tyr 355

Trp

Ser

Asp Ile

Thr 360

Asp

Phe

Val

Ile

Arg 365

Pro

Phe

Val

Phe

Gin 370

Ala

Asn

Arg

His Phe 375

Asp

Phe

Asn

Gin

Glu 380

Thr

Ala

Gly

Trp

Ser

Thr

Pro

Arg

Phe

Arg Pro

Ile

Thr

Ile

Thr

Ile

Ser

Glu

Ser

Asn

385 390 395 400

Gly Ser Lys Leu Gly Thr Gly Val Ala Thr Asp Tyr Ile Val Pro Gly 405 410 415

Ile Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Gly Glu Glu Leu Thr Pro 420 425 430

PL 203 842 B1

Ala Gly	Asp Tyr Ser Ile	; Thr	Asn Gly	Ser	Gly	Asn	Asp	Ile	Ala	Thr
	435		440				445
Ala Asn	Ala Tyr Asp Ser	Ala	Asp Val	Ile	Thr	Asn	Thr	Thr	Asn	Phe
450		455				460
Arg Gly	Met Tyr Ile Cys	Gly	Ala Leu	Gin	Arg	Ala	Trp	Gly	Asp	Lys
465	470				475					480
Lys Ile	Ser Ser Thr Ala	Phe	Ile Thr	Thr	Ala	Ile	Lys	Glu	Gly	Asn
	455			490					495
Thr Leu	Lys Pro Ser Asn	Thr	Ile Asp	Met	Thr	Lys	Ile	Ala	Val	Tyr
	500		505					510
Gin Asp	Thr His Val Gly	Arg	Asp Val	Gin	Thr	Ser	Asp	Asp	Thr	Leu
	515		520				525
Ala Ile	Leu Gly Tyr Thr	Gly	Ile Gly	Glu	Gin	Ala	Ile	Gly	Ser	Asn
530		535				540
Arg Asp	Ser Val Val Arg	Ile	Ser Met	Leu	Pro	Glu	Thr	Gly	Ala	Arg
545	550				555					560
Gly Gly	Asn His Pro Ile	Phe	Tyr Lys	Asn	Ser	Ile	Lys	•Leu	Gly	Tyr
	565			570					575
Val Leu	Arg Ser Ile Asp	Val	Phe Asn	Ser	Gin	Ile	Leu	His	Thr	Ser
	580		585					590
Arg Gin	Leu Ser Leu Asn.	His	Tyr Leu	Leu	Pro	Pro	Asp	Ser	Phe	Ala
	595		600				605
Val Tyr .	Arg Ile Ile Asp .	Ser Asn Gly	Ser	Trp	Phe	Asp	Val	Gly	Ile

610 615 620

Asp Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Ser Ile Pro Lys Leu

625 630 635 640

Glu Phe Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Met Gly Ile Gin Leu Ala Lys Ile

045 650 655

Arg Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Thr Met Thr Lys Leu 660 665 <210> 6 <2ll> 2007 <212> DNA <213> kalciwirus kota <400> 6 atgtgctcaa cctgcgctaa cgtgcttaaa tactatgatt gggatcccca ctttagattg 60 attactaacc ccaacaaatt tctttccgtt ggcttctgtg ataatcctct tatgtgttgt 120 tatcccgaat tactccctga atttggaact gtgtgggact gtgatcagtc accaccccaa 180 atttatctag agtccatcct tggtgatgac gaatgggctt ccacttacga agcagttgac 240 ccagtggtgc caccaatgca ttgggatagt gctggaaaga tctttcagcc acatcctggt 300 gtattgatgc accatctcat tggtgaagtt gctaaggcct gggatccaaa cttaccactc 360 ctccgcccgg aagcggatga tggatccgtg accacgcccg aacaaggaac actggttggt 420

PL 203 842 B1 ęgaęzcćCtę ctgagcctaa tgcccaaatg tcagctgttg ctgacgtggc cactggcaaa agcgccgact ctgagtggga agcattcttc tctttccaca ccagtgtcaa ttggagcaca tctgsaaccc aagggaaaat cctttttaaa caatctctag gccccctact taacccttac ct:actcatc tcgcaaaact ttatgttgca tggcctggtt ctattgaggt tagattttca atctcrggat ccggtgtctt tggtggaaaa ctggctgcta ttgttgtgcc acccgggatc gatcccgcgc aaagcacatc aatgttgcag tacccccatg ttctgtttga tgctcgtcaa gttgsacctg ttatcctcac tatccctgat ttgagaaata gtctatatca ccttatgtct gacac:gata ctacatctct tgtcattatg atatacaatg atcccattaa tccctatgct aatgaztcta actcatccgg etgcactgtt actgtggage caaaacctgg ccccgacttc aaat::cacc tcttgaaacc gcctgggtct atgttaactc atgggtcaat tccatccgac cccaccccaa aaccctcctc tctctggatt ggcaaccgac actggtctga tataactgat tttgtcatca aacctcttgt tttccaggct aatcgacatt ttgacttcaa tcaagagact gcagcctgga gcactcccag atttagaccc ataaccatca cagtttctga gaagggagga tcaaaectgg gtattggtgt tgcaactgac tctattgtcc ctggcatacc agacggctgg ccggatacca ccattccaga aaaacttacc ccagcaggtg actacgcaat cacaaatggg ggaaacaatg acatcaccac tgctgcggac tatgatgggg caagtataat caaaaacaat acaaa:ttca agggtatgta tatttgtggt gctttgcaaa gagcttgggg tgacaagaaa atttc=aaca ccgcctctat cactaccgca atcagagagg gtaactcaat aaaaccatct aatgtaattg acacgacaaa acttgccgtt tatcaagatg ctcatgttgg tgcagaactt caaacctctg acaccacctt agcaatcctt ggttataccg ggattggtga agaagctata ggcctggata gggacaaagt ggtgcgtatt agcatacttc cagaaactgg tgctcgtggc ggaastcacc ctattttcta tatgaacaaa attaaattag gttatgttat tagatcaata gatgzrgcaa actcccaaat tttacataca tctaggcaat catcactcaa taattatcta crggcicccg actcccttgc agtttacaga attattgatt ctggcggctc ttggtttgat actgcuactg atagtgatgg tttttctttt gttggtgtat ctcaaattgg aaaattggag cctccactaa ctgcctccta catgggaatt caattggcaa agactcgact tgcctcaaac actagcagtg gaatggttaa aatatga

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2007 <210> 7 <211> 668 <212> PRT <213> kalciwirus kota <400> 7

Cys Ala Asn Val 5

Ile Ile Asn Pro

Leu Met Cys Cys 40

Asp Cys Asp Gin 55

Met Cys Ser Thr 1

His Phe Arg Leu 20

Cys Asp Asn Pro 35

Gly Thr Val Trp 5 0

Leu Lys Tyr Tyr 10

Asn Lys Phe Leu 25

Tyr Pro Glu Leu

Ser Pro Leu Gin 60

Asp Trp Asp Pro 15

Ser Val Gly Phe 30

Leu Pro Glu Phe 45

Ile Tyr Leu Glu

Ser Ile Leu Gly Asp Asp Glu Trp 65 70

Pro Val Val Pro Pro Met His Trp 85

Pro His Pro Gly Val Leu Met His 100

Ala Trp Asp Pro Asn Leu Pro Leu Π5 120

Ser Val Thr Thr Pro Glu Gin Gly 135

Ala Ser Thr Tyr Glu Ala Val Asp 75 80

Asp Ser Ala Gly Lys Ile Phe Gin 90 95

His Leu Ile Gly Glu Val Ala Lys 105 no

Phe Arg Leu Glu Ala Asp Asp Gly 125

Thr Leu Val Gly Gly Val Ile Ala 140

PL 203 842 B1

Glu 145

Pro

Asn

Ala

Gin

Met 150

Ser

Ala

Val

Ala

Asp 155

Val

Ala

Thr

Gly

Lys 160

Ser

Val

Asp

Ser

Glu 165

Trp

Glu

Ala

Phe

Phe 170

Ser

Phe

His

Thr

Ser 175

Val

Asn

Trp

Ser

Thr 180

Ser

Glu

Thr

Gin

Gly 185

Lys

Ile

Leu

Phe

Lys 190

Gin

Ser

Leu

Gly

Pro 195

Leu

Leu

Asn

Pro

Tyr 200

Leu

Thr

His

Leu

Ala 205

Lys

Leu

Tyr

Val

Ala 210

Trp

Ser

Gly

Ser

Ile 215

Glu

Val

Arg

Phe

Ser 220

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly 225

Val

Phe

Gly

Gly

Lys 230

Leu

Ala

Ala

Ile

Val 235

Val

Pro

Pro

Gly

Ile 240

Asp

Pro

Val

Gin

Ser 245

Thr

Ser

Met

Leu

Gin 250

Tyr

Pro

His

Val

Leu 255

Phe

Asp

Ala

Arg

Gin 260

Val

Glu

Pro

Val

Ile 265

Phe

Thr

Ile

Pro

Asp 270

Leu

Arg

Asn

Ser

Leu

Tyr

His

Leu

Met

Ser

Asp

Thr

Asp

Thr

Thr -

Ser

Leu

Val

275 280 285

Ile Met Ile Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ser Asn 290 295 300

Ser Ser Gly*Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Gly Pro Asp Phe 305 310 315 · 320

Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met Leu Thr His Gly Ser 325 330 335

Ile Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ser Leu Trp Ile Gly Asn 340 345 350

Arg His Trp Ser Asp Ile Thr Asp Phe Val Ile Lys Pro Phe Val Phe 355 360 365

Gin Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gin Glu Thr Ala Gly Trp Ser 370 375 380

Thr Pro Arg Phe Arg Pro Ile Thr Ile Thr Val Ser Glu Lys Gly Gly

385 390 395 400

Ser Lys Leu Gly Ile Gly Val Ala Thr Asp Ser Ile Val Pro Gly Ile

405 4io 415

Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Pro Glu Lys Leu Thr Pro Ala 420 425 430

Gly Asp Tyr Ala Ile Thr Asn Gly Gly Asn Asn Asp Ile Thr Thr Ala 435 440 445

Ala Asp Tyr Asp Gly Ala Ser. Ile Ile Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys 450 455 460

PL 203 842 B1

Gly

Mec

Tyr Ile

Cys

Gly

Ala Leu

Gin

Arg

Ala

Trp

Gly

Asp

Lys

Lys

465

470

475

480

Ile

Ser

Asn Thr

Ala

Phe

Ile Thr

Thr

Ala

Ile

Arg

Glu

Gly

Asn

Ser

485

490

495

Ile

Lys

Pro Ser

Asn

Val

Ile Asp

Met

Thr

Lys

Leu

Ala

Val

Tyr

Gin

500

505

510

Asp

Ala

His Val

Gly

Ala

Glu Leu

Gin

Thr

Ser

Asp

Ile

Thr

Leu

Ala

515

520

525

Ile

Leu

Gly Tyr

Thr

Gly

Ile Gly

Glu

Glu

Ala

Ile

Gly

Leu

Asp

Arg

530

535

540

Asp

Lys

Val Val

Arg

Ile

Ser Ile

Leu

Pro

Glu

Thr

Gly

Ala

Arg

Gly

545

550

555

560

Gly

Asn

His Pro

Ile

Phe

Tyr Met

Asn

Lys

Ile

Lys

Leu

Gly

Tyr

Val

565

570

575

Ile

Arg

Ser Ile

Asp

Val

Ala Asn

Ser

Gin

Ile

Leu

His

Thr

Ser

Arg

580

585

590

Gin

Leu

Ser Leu

Asn

Asn

Tyr Leu

Leu

Ala

Pro

Asp

Ser

Phe

Ala

Val

595

600

605

Tyr

Arg

Ile Ile

Asp

Ser

Gly Gly

Ser

Trp

Phe

Asp

Ile

Gly

Ile

Asp

610

615

620

Ser

Asp

Gly Phe

Ser

Phe

Val Gly

Val

Ser

Gin

Ile

Gly

Lys

Leu

Glu

625

63 0-

635

640

Phe

Pro

Leu Thr

Ala

Ser

Tyr Met

Gly

Ile

Gin

Leu

Ala

Lys

Ile

Arg

645

650

655

Leu .

Ala

Ser Asn

Ile .

Arg

Ser Gly .

Met

Val

Lys

Ile

660 665 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

c222> Opis sekwencji syntetycznej:

oligonukleotyd <40o> e aaacgcgtcg acatgtgctc aacctgcgct aacgtg 36 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<22 3> Opis sekwencji syntetycznej:

PL 203 842 B1 oligonukleotyd <400> 9 tcc:gata:c tcacacttta accactccac ccc 33 <210> 10 <211> 3701 <212> DNA <213 > wirus ospy kanarka <400> 10 aagcttctat caaaaocccc aatgagttag gcgcagatag tatagatatt actacaaagg 60 tattcatatt tcctatcaat tctaaagtag atgatactaa caactcaaag atgatgatag 120 tagataatag acacgctcac ataatgactg caaatttgga cggttcacat cttaatcacc 180 acgcgttcat aagtttcaac tgcatagatc aaaatctcac taaaaagata gccgatgtat 240 ccgagagaga ccggacatct aactacgcta aagaaactac agttataaac aacacataat 300 ggatctcgcc accaccagtt atatttaaca taagtacaat aaaaagtatt aaataaaaat 360 acttacttac caaaaaacgt catcaccaca aaaactacat tctacagaac aatctatagt 420 agagtccccc aagagccaca acctaaaaga taaccacaat gtaatatcta ccacatcaga 480 cgatgatacc gttgtagtaa taaatgaaga taatgtactg tcatctacaa gattactacc 540 atttgateaa accccgcttt tcaactcctt taataacggt ccatcaaaat acgaaaccac 600 tagtgataca atattagata cagacaccca taattattat atacccagcc ctccctccct 660 gttagatatt ctaaaaaaaa gagcgt.gt.ga tttagaatca gaagatctaa attatgcgtt 720 aataagagae aatagtaact tatattataa agatatgact cacatgaata attggttatt 780 tactaaagga ttattagatt acaagtttgt attattgcgc gatgtagata aatgttacaa 840 acagtataat aaaaagaata ctataataga tataatacat cgcgataaca gacagtataa 900 catatgggtt aaaaacgtta tagaatactg ttctcctggc tatatattat ggttacatga 960 tctaaaagcc cctgctgaag atgattggtt aagatacgat aaccgtataa acgaattatc 1020 tgcggataaa ttatacactt tcgagttcat agttatatta gaaaataata taaaacattt 1080 acgagtaggt acaataattg tacatccaaa caagataata gctaatggta catctaataa 1140 tatacttact gattttctat c.ttacgtaga agaactaata tatcatcata attcatctat 1200 aatattggcc ggatattttt tagaattctt tgagaccact attttatcag aatttatttc 1260 ttcatcttct gaatgggcaa tgaatagtaa ctgtttagta cacctgaaaa cagggtatga 1320 agctatactc tttgatgcta gtttattttt ccaactctct actaaaagca attatgtaaa 1380 atattggaca aagaaaactt tgcagtataa gaactttttt aaagacggta aacagttagc 1440 aaaatatata attaagaaag atagtcaggt gatagataga gtatgttatt tacacgcagc 1500 tgtatacaat cacgtaactt acttaatgga tacgtttaaa attcctggtt ttgattttaa 1560 attctccgga acgatagata tactactgtt tggaatattg cataaggata atgagaatat 1620 attttatccg aaacgtgttc ctgtaactaa tataatatca gaatctatct atgcagattt 1680 ctactttata tcagatgcca ataaattcag taaaaagata gaatataaaa ctatgtttcc 1740 tatactcgca caaaactact atccaaaagg aaggccctat tttacacata catctaacga 1800 agatcttctg cctatctgtt tatgcgaagt aacagtttgt aaagatataa aaaatccatt 1860 attatattct aaaaaggata tatcagcaaa acgattcata ggtttattta catctgtcga 1920 tataaatacg gctgttgagt taagaggata taaaataaga gtaataggat gtttagaatg 1980 gcctgaaaag ataaaaacat ttaattctaa tcctacatac attagattat tactaacaga 2040 aagacgttta gatattctac attcctatct gcttaaattt aatataacag aggatatagc 2100 caccagagat cgagtcagaa ataatttacc tataatttct tttatcgtca gttattgtag 2160 atcgtatact tataaattac taaattgcca tatgtacaat tcgtgtaaga taacaaagtg 2220 taaatataat ceggtaatat ataatcctat ataggagtat atataattga aaaagtaaaa 2280 tataaatcat ataataatga aacgaaatat cagtaataga caggaactgg cagattcttc 2340 tcccaatgaa ctaagtactg ctaaatctcc aaaattacat aaaaatgata cagcaaatac 2400 agcttcattc aacgaattac ctttcaattt tttcagacac accttattac aaaccaacta 2460 agccagacga tcagaaagta aatataaatt taacttatgg gtataatata ataaagattc 2520 atgatattaa csatttactt aacgatgtta atagacttat tccatcaacc ccttcaaacc 2580 cttctggaca tcataaaata ccagttaatg atattaaaat agattgttta agagatgtaa 2640 ataattattt ggaggtaaag gatataaaat tagtctatct ttcacatgga aacgaattac 2700 ctaatattaa caattatgat aggaactttt taggacttac agctgttata tgtatcaaca 2760 atacaggcag atctatggtt atggtaaaac actgtaacgg gaagcagcat tctatggtaa 2820 ctggcctatg tttaatagcc agatcacttt accctataaa cattttacca caaataatag 2880 gaccctctag azatttaata ctatatctaa caacaacaaa aaaattcaac gatgtacggc 2940

PL 203 842 B1 cagaagcazt ztctactasc aaagacaasg atactctatc ttacctacaa gatatgaaag 3000 aagataatca zttagtaats gccactaata tggaaagaaa tgtacacaaa aacgtggaag 3060 cttttatatt aaatagcata ttactagaag atttaaaatc tagacttagt ataacaaaac 3120 agttaaatgc caatatcgat tctatatttc atcataacag tagtacatta atcagtgata 3180 tactgaaaco atctacagac tcaactatgc aaggaataag caatatgcca attatgtcta 3240 atatcttaac tttagaacta aaacgttcta ccaatactaa aaataggata cgtgataggc 3300 tgttaaaagc tgcaataaat agtaaggatg tagaagaaat actttgttct ataccttcgg 3360 aggaaagaac tttagaacaa cttaagttta atcaaacctg tatttatgaa caccataaaa 3420 aaattatgga agatacaagt aaaagaacgg atgttgaatg tcgtagttca gaacataact 3480 atacggctaa cttatataaa gtgtacggac aaaacgaaca tatgattact tatatactag 3540 ctctcataac taggattaat aatattatag aaactttaaa atacaatctg gtggggctag 3600 acgaatctac aatacgtaat ataaattaca taatttcaca aagaacaaaa aaaaatcaag 3660 tttctaatac cttatagata aactatattt tttaccactg a 3701 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 11 atcatcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 42 <210> 12 <211> 73 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opi_s sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 12 gaattcctcg agctgcagcc cgggttttta tagctaatta gtcatttttt cgtaagtaag 60 tatttttatt caa 7₃ <210> 13 <211> 72 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<2z3> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 13 cccgggctgc agctcgagca attcttttta ttgattaact agtcaaatga gtatatataa 60 ttgaaaaagt aa 72 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna

PL 203 842 B1 <220>

< 2 23> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 14 gacgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agctg 45 <210> 15 <211? 34 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 15 aaacccgggt tctttatcct etacttaaaa agtg 34 <21Q> 16 <211> 43 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

^<223^> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 16 aaaagaattc gtcgactacg’atacaaactt aacggacatc gcg 43 <210> 17 <211> 55 <212> DNA ^<213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 17 aaaccgcgat atccgttaag tttgtatcgt aatgtgctca acctgcgcta acgtg 55 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400 18 ttttgtcgac tcatatttta accattccac tcc 33 <210> 15

PL 203 842 B1 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <22Ό>

<223 > Opis sekwencj i syntetycznej: oligonukleotyd <400> 19 ttttgtcgac tcatagtttt gtcatagtac tcc 33 <21O> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 20 tatgcggccg ccaccatgtg gctgcagaac ctg 33 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <400> 21 tatgcggccg ctacgtatca cttcttgact ggtttc 36 <210> 22 <211> 432 <212> DNA <213> Koci niemowlak · <400> 22 acgtggctgc agaacctgct tttcctgggc actgtggtct gcagcatctc tgcacccacc 60 agttcaccca gctctgtcac tcggccctgg caacacgtgg atgccatcaa ggaggctctg 120 agccttctga acaacagtag tgaaataact gctgtgatga atgaagcagt agaagtcgtc 180 tctgaaatgt ttgaccctga ggagccgaaa tgcctgcaga ctcacctaaa gctgtacgag 240 cagggcctac ggggcagcct catcagcctc aaggagcctc tgagaatgat ggccaaccat 300 tacaagcagc actgcccctt tactccggaa acgccctgtg aaacccagac tatcaccttc 360 aaaaatttca aagagaatct gaaggatttt ctgtttaaca tcccctttga ctgctggaaa 420 ccagtcaaga ag 432 <210> 23 <211> 432 <212> DNA <213> Koci niemowlak <400> 23 acgtggctgc agaacctgct tcccctgggc accgtggccc gcagcatctc tgcacccacc 60

PL 203 842 B1 agcccaccca gccctgccac tcggccctgg caacacgtgg acgccatcaa ggaggctctg 120 agccttctga acaacagtag tgaaataact gctgtgatga atgaagcagt agaagtcgtc 180 tctgaaatgt ttgaccctga ggagccgaaa tgcccgcaga ctcacctaaa gctgtacgag 240 cagggcctac ggggcagcct catcagcctc aaggagcctc tgaggatgat ggccaaccat 300 tacaagcagc actgccccct tactccggaa acgccctgtg aaacccagac tatcaccttc 360 aaaaatttca aagagaatct gaaggatttt ctgtttaaca tcccctttga ctgctggaaa 420 ccagtcaaga ag

Claims (27)

1. Fragment DNA zawierający sekwencję nukleotydów przedstawioną w SEQ ID N°: 6 lub fragment tej sekwencji kodujący epitop, peptyd lub polipeptyd zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kodowanego przez kompletną sekwencję.

2. Fragment według zastrz. 1 zawierający sekwencję nukleotydów przedstawioną w SEQ ID N°: 6 i elementy regulacji jej transkrypcji.

3. Fragment kwasu nukleinowego kodujący białko kapsydu przedstawione w SEQ ID N°: 7 lub immunologicznie czynny fragment tego białka.

4. Wektor do ekspresji in vivo lub in vitro zawierający fragment kwasu nukleinowego według jednego z zastrz. 1 do 3.

5. Wektor do ekspresji in vivo według zastrz. 4, znamienny tym, że jest wybrany z grupy złożonej z wirusów ospy, adenowirusów i wirusów opryszczki.

6. Wektor do ekspresji in vivo według zastrz. 4, znamienny tym, że jest plazmidem.

7. Wektor do ekspresji in vivo według dowolnego z zastrz. 4 do 6, znamienny tym, że dodatkowo zawiera fragment DNA zawierający całą lub część sekwencji nukleotydów przedstawionej w SEQ ID N°: 4.

8. Fragment DNA zawierający sekwencję nukleotydów przedstawioną w SEQ ID N°: 4 lub fragment tej sekwencji kodujący epitop, peptyd lub polipeptyd zachowujący zasadniczo aktywność immunogenną białka kodowanego przez kompletną sekwencję.

9. Fragment według zastrz. 8 zawierający sekwencję nukleotydów przedstawioną w SEQ ID N°: 4 i elementy regulacji jej transkrypcji.

10. Fragment kwasu nukleinowego kodujący białko kapsydu przedstawione w SEQ ID N°: 5 lub immunologicznie czynny fragment tego białka.

11. Wektor do ekspresji in vivo według dowolnego z zastrz. 4 do 6, znamienny tym, że dodatkowo zawiera fragment kwasu nukleinowego według jednego z zastrz. 8 do 10.

12. Wektor do ekspresji według dowolnego z zastrz. 4 do 7 i 11, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję nukleotydów immunogenu, lub fragment czynny immunologicznie, innego patogenu kota.

13. Wektor do ekspresji według zastrz. 12, znamienny tym, że inny patogen kota jest wybrany z grupy złożonej z wirusa zapalenia nosa i tchawicy (zwany też wirusem opryszczki kota, FHV), wirusa białaczki kota (FeLV), parwowirusów kota (FPV), wirusa zakaźnego zapalenia otrzewnej kota (FIPV), wirusa niedoboru odporności kota (FIV), wirusa wścieklizny, Chlamydia.

14. Preparat immunogenny lub szczepionka przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota, w której antygen jest białkiem, peptydem, poli-peptydem lub epitopem zdolnym do indukcji in vivo u gatunku kotowatych, w szczególności u kota, przeciwciał zdolnych do seroneutralizacji przynajmniej 13 szczepów FCV z panelu złożonego z następujących 18 szczepów FCV: RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7, RMI9, A2, F1, G1, G3, F3031, H3-2, Hl-4, 431, 388b, 337 i J5, korzystnie przynajmniej 14 z tych 18 szczepów, i jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 15 z tych 18 szczepów.

15. Preparat immunogenny lub szczepionka przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota, w której antygen jest białkiem, peptydem, poli-peptydem lub epitopem szczepu FCV rozpoznawanego przez przeciwciało monoklonalne 44 zdeponowane w CNCM pod numerem dostępu I-2282.

16. Preparat immunogenny lub szczepionka według zastrz. 14 lub 15, znamienny tym, że zawiera wektor do ekspresji in vivo, do którego jest wstawiona sekwencja cDNA typu FCV kodująca antygen.

PL 203 842 B1

17. Preparat immunogenny lub szczepionka według zastrz. 16, znamienny tym, że zawiera wektor do ekspresji in vivo według jednego z zastrz. 4 do 7 i 11, i nośnik lub zaróbkę dopuszczalne w weterynarii i ewentualnie adiuwant.

18. Preparat immunogenny lub szczepionka przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota, znamienny tym, że zawiera wektor do ekspresji in vivo według jednego z zastrz. 4 do 7 i 11, i wektor do ekspresji in vivo, do którego jest wstawiona sekwencja kodują ca immunogen innego patogenu kota.

19. Preparat immunogenny lub szczepionka multiwalencyjna przeciwko chorobie powodowanej przez kalciwirusy u kota i przynajmniej jednemu innemu patogenowi kota, znamienny tym, że zawiera wektor do ekspresji in vivo według zastrz. 12 lub 13, i nośnik lub zaróbkę dopuszczalne w weterynarii i ewentualnie adiuwant.

20. Preparat immunogenny lub szczepionka według dowolnego z zastrz. 15 do 19, znamienny tym, że przynajmniej jeden z wektorów do ekspresji in vivo jest plazmidem, i że adiuwant jest lipidem kationowym zawierającym sól czwartorzędową amonu o wzorze:

ch₃

R, - O - CH₂ - CH - CH₂ - N -— R₂ - X

OR, CH₃ gdzie R1 jest alifatyczną resztą liniową nasyconą lub nienasyconą, mającą 12 do 18 atomów węgla, R2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą 2 lub 3 atomy węgla, a X grupą hydroksylową lub aminową.

21. Preparat immunogenny lub szczepionka według zastrz. 20, znamienny tym, że adiuwant jest DMRIE korzystnie połączony z obojętnym lipidem DOPE, aby wytworzyć DMRIE-DOPE.

22. Preparat immunogenny lub szczepionka według dowolnego z zastrz. 15 do 19, znamienny tym, że przynajmniej jeden z wektorów do ekspresji jest wirusem ospy, korzystnie wirusem ospy kanarka, i ż e adiuwant jest polimerem kwasu akrylowego lub metakrylowego, korzystnie karbomerem.

23. Preparat immunogenny lub szczepionka według dowolnego z zastrz. 15 do 22, znamienny tym, że zawiera dodatkowo wektor plazmidowy do ekspresji in vivo, do którego jest wstawiony gen kodujący GM-CSF kota.

24. Preparat immunogenny lub szczepionka według zastrz. 14, znamienny tym, że zawiera białko kapsydu szczepu FCV 431, ewentualnie zmontowany w postaci pustych kapsydów, białko to ma sekwencję SEQ ID N°: 7, lub fragmentu lub immunologicznie czynnego epitopu tego białka.

25. Preparat immunogenny lub szczepionka według zastrz. 14 lub 24, znamienny tym, że zawiera białko kapsydu szczepu FCV G1, ewentualnie zmontowane w postaci pustych kapsydów, białko to ma sekwencję SEQ ID N°: 5 lub fragmentu lub epitopu immunologicznie czynnego tego białka.

26. Białko kapsydu wyizolowane, oczyszczone lub syntetyczne mające sekwencję SEQ ID N°: 7.

27. Białko kapsydu wyizolowane, oczyszczone lub syntetyczne mające sekwencję SEQ ID N°: 5.