MXPA02000464A - Genes de calicivirus felino y vacunas, principalmente vacunas recombinadas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a la secuencia del gen de capside y a una secuencia correspondiente de ADNc, de una cepa FCV dominante denominada FCV 431. Esta se refiere tambien a la secuencia del gen de la capside asi como a la secuencia de ADNc de una cepa complementaria denominada G1. Las secuencias de ADNc pueden ser incorporadas en los vectores de expresion con miras a la preparacion de preparaciones inmunogenicas y de vacunas recombinadas o subunitarias que permiten la vacunacion contra la calicivirosis felina.

Description

GENES DE CALIC-.VIRUS FELINO Y VACUNAS, PRINCIPALMENTE VACUNAS RECOMBINADAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene que ver con los genes de cepas particulares de calicivirus felino, con las proteínas codificadas por estos genes, y su utilización para la realización de preparaciones inmunogénicas y de vacunas recombinadas o de subunidades contra la calicivirosis felina. Estas preparaciones inmunogénicas y estas vacunas pueden igualmente ser combinadas con preparaciones inmunogénicas o vacunas preparadas con base en otros agentes patógenos felinos, para la realización de preparaciones inmunogénicas y de vacunas multivalentes . Los calicivirus felinos (en inglés Feline Calicivirus o. FCV) han sido descritos por primera vez en 1957 (Fastier L.B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18. 382-389). Los calicivirus felino son, con los herpes virus felinos, las dos cepas principales de afecciones virales del tracto respiratorio superior en el gato. Los virus FCV infectan a un gran número de animales, con tasas de portación de FCV del orden de 15 a 25%, y una seroprevalencia anti-FVC de 70 a 100% (Coutts y colaboradores, Vet. Rec . 1994. 135. 555-556; Ellis T.M. Australian Vet. J. 1981,. 57. 115-118; Harbour y REF: 135552 colaboradores, Vet. Rec . 1991. 128. 77-80; Reubel y colaboradores, Feline Dendistry 1992. 22. 1347-1360). Después de una fase inicial de hipertermia, estas afecciones respiratorias son acompañadas en general de ulceraciones bucales (paladar, lengua, labios, nariz) , de rinitis, de conjuntivitis, eventualmente de anorexia y de astenia. El virus FCV puede igualmente provocar neumonías, enteritis, y dolores articulares (síndrome de cojera) . La transmisión del virus FCV no se hace más que horizontalmente, no existe transmisión vertical de la madre a su hijo al momento de la gestación (Jonson R.P. Res. Vet. Sci. 1984. 31. 114-119). La transmisión del FCV se realiza por contacto entre animales infectados y animales sanos o por vía área al momento de los estornudos ( ardley RC. Arch. Virol. 1976. 52. 243-249). Los calicivirus felinos son virus desnudos de la familia de los Caliciviridae , éstos están provistos de un ARN positivo de una sola hebra, de un tamaño de aproximadamente 7.7 kilo pares de bases (kpb) (Cárter, M.J. Arch. Virol. 1994. 9. 429-439) . Como los numerosos virus de ARN, existe una gran heterogeneidad en el seno de la población viral de FCV. Las variaciones antigénicas, puestas en evidencia desde comienzo de los años 70 por los experimentos de las seroneutralizaciones cruzadas, permiten clasificar los FCV en varias cepas virales o cuasiespecies (Radfoord y colaboradores, Proc. lst Int. Symp. Caliciviruses ESW 1997. 93-99) . Varias cepas de FCV han sido aisladas y secuenciadas, principalmente la cepa F9 (Cárter y colaboradores, Arch. Virol. 1992. 122. 223-235, secuencia depositada en el banco de datos GenBank bajo el número de acceso M86379) , CFI (Neil y colaboradores, J. Virol. 1991. 65. 5540-5447, número de acceso GenBank U13992 y M32819) , Urbana o URB (Sosnovtsev y Green Virology 1995. 210. 383-390, número de acceso GenBank L40021) , F4 (Tohya y colaboradores, Arch. Virol. 1991. 117. 173-181, números de acceso GenBank D31836 y D90357), KCD (Fastier L.B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18. 882-889, número de acceso GenBank L09719) , LLK (número de acceso GenBank U07131) , NADC (número de acceso GenBank L09718) , 2280 (número de acceso GenBank X99445) y 255 (Kahn y Gillepsie., Cornell Vet. 1970. 60. 669-683, número de acceso GenBank U07130) . La vacunación contra el FCV ha sido establecida desde finales de los años 70 a partir de las cepas FCV atenuadas, principalmente la cepa F9 aislada en 1958 por Bittle (Bittle y colaboradores, Am. J. Vet. Res. 1960. 21. 547-550) , o las cepas derivadas de F9 mediante el pase in vi tro o in vivo ("similar a F9" ) .

Las vacunas inactivadas son también disponibles. Éstas utilizan las cepas 255 y 2280, aisladas respectivamente en 1970 en un gato que presentaba una neumonía (Kahn y Gillepsie, Cornell Vet. 1970. 60. 669-683) y en 1983 en un gato aquejado de cojera (Pedersen y colaboradores, Fel . Prac . 1983. 13. 26-35) . La respuesta humoral es esencialmente dirigida contra la proteína de la cápside, también denominada p65 (Guiver y colaboradores, J. Gen. Virol. 1992. 73. 2429-2433). Los genes que codifican para la proteína de la cápside de numerosos calicivirus felino han sido secuenciados y comparados sin que se pueda distinguir más particularmente ciertas secuencias (Glenn y colaboradores, Proc. lst Symp. Caliciviruses ESW 1997. 106-110; Geissler y colaboradores, Virus Res. 1997. 48. 193-206; Neill y colaboradores, Proc. lst Int. Symp. Caliciviruses ESW 1997. 120-124). . El gen que codifica para la proteína de la cápside ha sido igualmente clonado y expresado en diferentes sistemas de expresión, principalmente el gen que codifica para la proteína de la cápside del virus FCV KS20 en los plásmidos (Geissler y colaboradores, J. Virol. 1999. 73. 834-838), los genes que codifican las proteínas de la cápside del virus FCV CFI-68, JOK63, JOK92 , LS012 y F9 en los baculovirus (DeSilver y colaboradores, Proc. lst Int. Symp. Caliciviruses ESW 1997. 131-143) , el gen que codifica la proteína de la cápside del virus FCV F4 en los virus herpes felino del tipo 1 (Yokoyama y colaboradores, J. Vet. Med. Sci. 1998. 60. 717-723). Estas diferentes construcciones han permitido la producción de proteínas de la cápside recombinadas . Debido al hecho de la derivación antigénica en el tiempo, los antisueros producidos contra las antiguas cepas de vacunas aisladas en los años 60-70, tales como las cepas F9, 255 ó 2280, no neutralizan más que pocos aislados de los años 90. Por ejemplo, el suero anti-F9 neutraliza 43% de los aislados del periodo 1990-96, contra 56% para el periodo 1980-89 y 86% para el periodo 1958-79, y solamente 10% de los aislados ingleses del periodo 1990-96 (Lauritzen y colaboradores, Vet. Microbiol. 1997. 56. 55-63). La presente invención tiene por objetivo la puesta en evidencia de las cepas de FCV, que inducen en los gatos anticuerpos que tienen un amplio espectro de neutralización cruzada. . La invención tiene en particular por objetivo, a partir de las cepas seleccionadas, el aislamiento y la caracterización de los genes que codifican para las proteínas inmunogénicas utilizables para la vacunación contra la calicivirus felina. Otro objetivo más de la invención es proponer los vectores de expresión in vi tro e in vivo recombinados, que contienen y que expresan al menos una secuencia nucleotídica de este tipo. Otro objetivo adicional de la invención es el de proponer las preparaciones inmunogénicas o vacunas contra la calicivirus felina. Otro objetivo adicional de la invención es proponer las preparaciones inmunogénicas multivalentes y las vacunas multivalentes contra la calicivirosis felina y contra al menos otro patógeno felino. La invención se refiere esencialmente a dos cepas FCV obtenidas mediante raspados faríngeos practicados en Francia y en el Reino Unido en gatos que presentan signos de infección por calicivirus felinos. Se trata principalmente de la cepa Gl (depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (o CNCM) del Instituto Pasteur, París, Francia, bajo el número de acceso 1-2167) y de la cepa 431 (depositada en la CNCM bajo el número de acceso 1-2166) , las dos cepas depositadas el 12 de marzo de 1999. Esta cepa FCV Gl aislada en Francia no corresponde a la cepa FCV aislada en el Reino Unido en 1978 por Tohya (Tohya Y. y colaboradores, Jpn. J. Sci. 1990. 52. 955-961) y nombrada igualmente Gl . La selección de las cepas FCV 431 y Gl ha sido realizada mediante las pruebas de seroneutralización frente a los aislados FCV de un panel de referencia. Este panel de referencia está compuesto de 18 aislados actuales de FCV tomados de gatos que presentan signos de infección por calicivirus felino y que provienen de tres zonas geográficas distintas. 7 aislados son americanos, estos aislados son identificados RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 y RMI9. 7 aislados son franceses, éstos son designados A2 , Fl Gl, G3 , F3031, H3-2 y Hl-4. Los 4 últimos aislados son ingleses, éstos son designados 431, 388b, 337 y J5. Las cepas de panel son accesibles del solicitante a simple demanda. Éstas han sido también publicadas en un artículo de la revista "Archives of Virology" (Poulet y colaboradores, Arch. Virol. Febrero 2000. 145(2). 243-261), disponible en línea en la Internet a la fecha de depósito de parte del editor. Luego de las pruebas de seroneutralizaciones cruzadas entre los 18 aislados de FCV del panel de referencia, se comprueba de manera sorprendente que el antisuero del aislado 431 neutraliza 14 de los 17 aislados heterólogos del panel de referencia (el título homólogo de seroneutralización no es tomado en cuenta) . Por comparación los antisueros de las cepas de vacunas "históricas" 255 y F9 no neutralizan cada uno más que 2 de los 18 aislados del panel . De manera inesperada, el solicitante ha encontrado, con la cepa FCV 431 una cepa dominante que puede ser utilizada para la protección de los felinos y en particular de los gatos contra la mayoría de las cepas de FCV. Gracias al panel de las cepas FCV divulgadas aquí, es posible para el experto en la materia seleccionar otras cepas FCV dominantes. 5 Por equivalencia la invención cubre también a través de la cepa FCV 431, las cepas FCV equivalentes a esta última, que tienen anticuerpos de amplio espectro de neutralización cruzada . Existe equivalencia cuando el antisuero de una cepa 10 FCV seroneutraliza al menos 13 de los 18 aislados heterólogos del panel de referencia (es decir incluyendo FCV 431) , preferentemente cuando éste seroneutraliza al menos 14 de los 18 aislados heterólogos del panel de referencia, de manera todavía más preferida cuando éste seroneutraliza al menos 15 15 de los 18 aislados heterólogos del panel de referencia. Se considera en general que una cepa de FCV seroneutraliza otra cepa FCV cuando el título heterólogo de la seroneutralización es superior o igual a 1.2 logio VN50 (Povey C. e Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 11, 20 877-885) . El solicitante ha tomado este valor como umbral de positividad. No obstante, los resultados de la seroneutralización cruzada, obtenidos por un aislado FCV que tiene un título homólogo de seroneutralización inferior o igual a 2 log10 VN50, no pueden ser interpretados. a^u ± Un segundo método para establecer la equivalencia de una cepa FCV frente a la cepa FCV 431, es utilizar los anticuerpos monoclonales específicos de la cepa FCV 431 y probar mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) la cepa FCV candidata. El solicitante ha logrado producir varios anticuerpos monoclonales que se comprueba son específicos de la cepa 431. Uno de ellos ha sido nombrado 44. Existe equivalencia si existe una reactividad en inmunofluorescencia con los anticuerpos monoclonales específicos de 431, por ejemplo con los anticuerpos monoclonales 44. Estos anticuerpos monoclonales y el hibridoma correspondiente son disponibles del solicitante a simple demanda, y son también divulgados en el artículo de Poulet y colaboradores, supra. El hibridoma correspondiente ha sido igualmente depositado el 11 de agosto de 1999 en la CNCM bajo el número de acceso I-2282. Huelga decir no obstante que el experto en la materia está perfectamente capacitado para producir los anticuerpos monoclonales mediante las técnicas clásicas y seleccionar, con relación al panel, aquellas que son específicas de la cepa 431. La otra cepa FCV Gl ha sido elegida por su complementariedad frente a la cepa FCV 431, a saber que la combinación de los antisueros de 431 y de Gl seroneutralizan 100% de los aislados del panel de referencia, es decir que la cepa FCV Gl tiene un título homólogo de seroneutralización superior o igual a 2 log10 VN50 y los títulos de seroneutralización heterólogos superiores o iguales a 1.2 logio VN50 frente a los aislados de FCV del panel de referencia, contra los cuales el antisuero 431 no seroneutralizan o lo hace débilmente (valor inferior a 1.2 logio VN50) . La invención cubre igualmente las cepas FCV equivalentes que tienen la misma complementariedad frente a la cepa FCV 431. Se pueden también producir y seleccionar los anticuerpos específicos de esta cepa, lo que permite determinar los equivalentes sobre esta otra base. La solicitante ha logrado además aislar, caracterizar y secuenciar el gen de la cápside de FCV 431 y FCV Gl , la proteína de cápside, y ha determinado las secuencias de ADNc (ADN complementario) correspondientes. La invención tiene pues por objetivo un fragmento de ácido nucleico que comprende toda o parte de la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína de la cápside del virus 431 donde la secuencia de aminoácidos es representada en la SEQ ID NO: 7 o en la figura 2, o un fragmento inmunológicamente activo de esta proteína, es decir un epítope, péptido o polipéptido que conserva sustancialmente la actividad inmunogénica de la proteína de la cápside. La invención tiene principalmente por objetivo un fragmento de ADN que comprende la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 6 o un fragmento que conserva las propiedades esenciales de la secuencia completa, es decir que codifica para un péptido, polipéptido o epítope que conserva sustancialmente la actividad inmunogénica de la proteína de cápside. La invención tiene en particular por objetivo un fragmento de ADN que comprende esta secuencia de ADNc, principalmente acoplada con los elementos de regulación de la transcripción. Huelga decir que la invención recubre automáticamente los fragmentos de ácido nucleico, los fragmentos de ADN y las secuencias de ADNc equivalentes, es decir los fragmentos y secuencias nucleotídicas específicas de la cápside FCV no cambian la funcionalidad ni la especificidad de la cepa de la secuencia descrita o los polipéptidos codificados por esta secuencia. Por supuesto, serán incluidas las secuencias que difieren por degeneración del código. La invención cubre igualmente automáticamente las secuencias nucleotídicas (ARN, ADN, ADNc) equivalentes en el sentido de que éstas codifican para una proteína de cápside FCV, o un péptido, polipéptido o epítope específico de la proteína de cápside FCV, capaz de inducir in vivo en la especie felina, en particular en el gato, los anticuerpos que tienen sensiblemente el mismo espectro de neutralización cruzada que el antisuero de la cepa FCV 431. Se trata en particular de las secuencias provenientes de las cepas FCV equivalentes según la definición dada anteriormente frente al panel y/o los anticuerpos monoclonales 44. La invención tiene también por objetivo un fragmento de ácido nucleico que comprende toda o parte de la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína de cápside del virus Gl tal como se representa en la SEQ ID NO: 5 o en la figura 1, o un fragmento inmunológicamente activo de esta proteína, es decir, un epítope, péptido o polipéptido que conserva sustancialmente la actividad inmunogénica de la proteína de cápside. La invención tiene principalmente por objetivo un fragmento de ADN que comprende la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO: 4 o un fragmento que conserva las propiedades esenciales de la secuencia completa, es decir que codifica para un péptido, polipéptido o epítope que conserva sustancialmente la actividad inmunogénica de la proteína de cápside. La invención tiene en particular por objetivo un fragmento de ADN que comprende esta secuencia de ADNc, principalmente acoplada con los elementos de regulación de la transcripción. Huelga decir que la invención recubre automáticamente los fragmentos de ácido nucleico, fragmentos de ADN y secuencias de ADNc equivalentes, es decir los fragmentos y las secuencias nucleotídicas que no cambian la funcionalidad ni la especificidad de cepa, de la secuencia descrita o los polipéptidos codificados por esta secuencia.

Por supuesto, serán incluidas las secuencias que difieren por degeneración del código. La invención cubre igualmente automáticamente las secuencias nucleotídicas (ARN, ADN, ADNc) equivalentes en el sentido de que éstas codifican para un péptido, polipéptido o epítope capaz de inducir in vivo en la especie felina, en particular en el gato, los anticuerpos que tienen sensiblemente el mismo espectro de neutralización cruzada que el antisuero de la cepa FCV Gl . Se trata en particular de las secuencias nucleotídicas provenientes de las cepas FCV complementarias según el sentido dado anteriormente. El gen que codifica para la proteína de la cápside de los virus FCV Gl y FCV 431 tiene un tamaño de 2007 nucleótidos para FCV 431 y de 2010 nucleótidos para FCV Gl . La proteína de cápside tiene un tamaño de 668 aminoácidos para FCV 431 y de 669 aminoácidos para FCV Gl , y una masa de 60-65 kDa (proteína p65) . La invención tiene también por objetivo un vector de expresión que comprende al menos un fragmento de ADN de acuerdo a la invención, principalmente un ADNc tipo 431 o un ADNc tipo Gl , en las condiciones que permiten su expresión in vivo . De acuerdo a una modalidad particular, el vector de expresión comprende un ADNc tipo 431 y un ADNc tipo Gl . Por "tipo" se debe entender que el ADNc es complementario a una secuencia de ADN de la cepa considerada.

Estos vectores de expresión pueden ser los poxvirus (virus de la viruela) , por ejemplo los virus de la vaccinia, los virus de la viruela aviar (viruela del canario, viruela de las aves de corral) , comprendiendo los poxvirus específicos de especie (viruela del cerdo, viruela del mapache y viruela del camello) , los adenovirus y los herpesvirus, tales como los virus herpes felinos (por ejemplo, Patente Francesa FR-A-2 7412 806) . Para los poxvirus o virus de la viruela, el experto en la materia puede referirse a O-A-9215672, O-A-9526751 , O-A-9012882 , y O-A-9527780. Varias estrategias de inserciones pueden ser utilizadas para la expresión de varias secuencias nucleotídicas heterólogas a partir del mismo vector de expresión in vi vo . Estas estrategias de inserción son principalmente la utilización de un doble cásete de expresión que tiene una orientación opuesta, o la utilización de un doble cásete de expresión que tiene una orientación idéntica o incluso un cásete múltiple de expresión, con un elemento "IRES" (Infernal Ribosome Entry Site por su acepción en inglés (Sitio de Entrada al Ribosoma Interno) ) situado entre cada inserto (Patente Europea EP-A1-0803573) . Las secuencias nucleotídicas heterólogas son insertadas bajo la dependencia de señales reguladoras de la transcripción y principalmente de promotores, de preferencia aportados al momento de la inserción. No obstante, no se excluye el hacer expresar estas secuencias nucleotídicas heterólogas bajo el control de las señales propias para el vector de expresión utilizado. Para los vectores de expresión de la viruela del canario, uno de los promotores preferidos es el promotor de la vaccinia H6 (Taylor y colaboradores, Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. y colaboradores, J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. y colaboradores, J. Virol., 1989, 63, 3829-3836). Los vectores de expresión in vivo pueden igualmente ser plásmidos. El término plásmido pretende cubrir cualquier unidad de transcripción de ADN bajo la forma de una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia de ADNc de acuerdo a la invención, y los elementos necesarios para su expresión in vi vo . Se prefiere la forma de plásmido circular, superenrollada o no. La forma lineal entra igualmente en el marco de esta invención. Cada plásmido comprende un promotor adaptado para asegurar, en las células huésped, la expresión del ADNc insertado bajo su dependencia. Se trata en general de un promotor eucariótico fuerte y en particular de un promotor precoz del citomegalovirus CMV-IE, de origen humano o murino o incluso eventualmente de otro origen tal como rata o cobayo. De manera más general, el promotor es ya sea de origen viral, o bien de origen celular. Como promotor viral diferente del CMV-IE, se puede citar el promotor precoz o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del Sarcoma de Rous . Como promotor celular, se puede citar el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo el promotor de la desmina, o incluso el promotor de la actina. Un subfragmento de estos promotores, que conserva la misma actividad promotora está comprendido en la presente invención, por ejemplo los promotores CMV-IE truncados de acuerdo a O-A-98/00166. Cuando varias secuencias heterólogas (ADNc y/o genes de FCV u otros patógenos felinos) están presentes en el mismo plásmido, éstas pueden estar presentes en la misma unidad de transcripción o en dos unidades diferentes. Los plásmidos pueden igualmente comprender otros elementos de regulación de la transcripción, tales como por ejemplo las secuencias estabilizadoras del tipo intrón, de preferencia intrón II del gen de la ß-globina de conejo (van Ooyen y colaboradores, Science, 1979, 206: 337-344), la secuencia de señal de la proteína codificada por el gen del activador del plasminógeno tisular (tPA; Montgomery y colaboradores, Cell. Mol. Biol.. 1997, 43: 285-292), y la señal de poliadenilación (polyA) , principalmente del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (Patente de los Estados Unidos US-A-5 122 458) o del gen de la ß-globina de conejo.

La invención tiene igualmente por objetivo la utilización del ADNc de acuerdo a la invención para la producción in vi tro de las proteínas de cápside o de sus fragmentos, y los epítopes inmunológicamente activos y su incorporación en las preparaciones inmunogénicas y las vacunas subunitarias . La invención tiene igualmente por objetivo una preparación inmunogénica o una vacuna contra la calicivirosis felina, que comprende al menos un vector de expresión in vivo recombinado de acuerdo a la invención y un vehículo y excipiente aceptable en el plano veterinario, y eventualmente un adyuvante. La noción de preparación inmunogénica cubre cualquier preparación susceptible, una vez administrada al gato, de inducir al menos una respuesta inmune dirigida contra el patógeno felino considerado. Por vacuna, se entiende una preparación capaz de inducir una protección eficaz . De preferencia, esta preparación inmunológica o esta vacuna comprende un vector de expresión in vivo en el cual se inserta un ADNc tipo FCV 431, que aquel que incluye sus equivalentes o un ADNc FCV Gl , aquel que incluye los equivalentes de este último. De acuerdo a una primera particularidad muy ventajosa, esta preparación ínmunológica o esta vacuna comprende un vector de expresión en el cual se inserta un ADNc tipo FCV 431, aquel que incluye sus equivalentes, y un ADNc tipo FCV Gl, aquel que incluye también los equivalentes de éste último. De acuerdo a una segunda particularidad muy ventajosa, esta preparación inmunológica o esta vacuna comprende al menos dos vectores de expresión: en el primero se inserta un ADNc tipo FCV 431, aquel que incluye sus equivalentes, y en el segundo un ADNc de la cepa FCV Gl , aquel que induce también los equivalentes de éste último. Para adyuvar a las preparaciones y vacunas de acuerdo a la invención, se puede utilizar cualquier adyuvante apropiado conocido por el experto en la materia. No obstante, se prefiere ya sea formularlos bajo la forma de emulsiones aceite en agua, o bien agregarle los polímeros del ácido acrílico o metacrílico o los copolímeros de anhídrido maleico y del derivado de alquenilo, o incluso un lípido catiónico que contiene una sal de amonio cuaternario. Entre los polímeros, se prefieren los polímeros del ácido acrílico o metacrílico reticulados, principalmente por los éteres polialquenílicos de azúcares o de polialcoholes .

Estos compuestos son conocidos bajo el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, no. 2, junio 1996). El experto en la materia puede también referirse a la Patente de los Estados Unidos US-A-2 909 462 (incorporada por referencia) que describe tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, de preferencia no más de 8, los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos están reemplazados por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden incluso contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo la denominación Carbopol® (BF Coodrich, Ohio, EUA) son particularmente apropiados. Éstos son reticulados por una alil-sacarosa o por un alilpentaeritritol . Entre ellos, se pueden citar el Carbopol® 974P, 934P y 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y del derivado de alquenilo, se prefieren los EMA® (Monsanto) que son los copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, lineales o reticulados, por ejemplo reticulados con éter divinílico. Se puede hacer referencia a J. Fields y colaboradores, Nature, 186:778-780, 4 de junio de 1960 (incorporado por referencia) . En el plano de su estructura, los polímeros del ácido acrílico o metacrílico y los EMA® son formados de preferencia de porciones de base de la siguiente fórmula : R. en la cual : Ri y R idénticos o diferentes, representan hidrógeno o CH3 x = 0 ó 1, de preferencia x = 1 y = 1 ó 2 , con x + y = 2 Para los EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1. Estos polímeros son disueltos en agua o en agua fisiológica (cloruro de sodio a 20 g/1) y el pH es ajustado a 7.3-7.4 con hidróxido de sodio, para la dar la solución adyuvante en la cual el vector de expresión o las subunidades serán incorporados . La concentración del polímero en la composición de vacuna final será de 0.01% a 1.5% P/V, más particularmente 0.05 a 1% P/V, de preferencia de 0.1 a 0.4% P/V. Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son particularmente, pero no exclusivamente adaptados para los vectores de expresión plasmídicos, responden a la fórmula: OR, CH en la cual Rl es un radical alifático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático, que incluye 2 ó 3 átomos de carbono, y X es un grupo hidroxilo o amino. Se prefiere el DMRIE (N- (2-hidroxietil) -N,N-dimetil-2 , 3 -bis (tetradeciloxi) -1-propanamonio; O-A-9634109) , de preferencia acoplado con un lípido neutro, principalmente la DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina) , para formar el DMRIE-DOPE. De preferencia, la mezcla plasmídica con este adyuvante se hace de manera extemporánea y se prefiere, antes de la administración al animal, dejar el tiempo para que la mezcla así constituida se haga compleja, por ejemplo durante una duración que va de 10 a 60 minutos, principalmente del orden de 30 minutos. Cuando la DOPE está presente, la proporción molar DMRIE:DOPE va de preferencia de 95:5 a 5:95, más particularmente de 1:1.

La proporción en peso del plásmido: adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE puede ir principalmente de 50:1 a 1:10, principalmente de 10:1 a 1:5, de preferencia de 1:1 a 1:2. Los vectores de expresión in vivo que codifican para un ADNc tipo FCV de acuerdo a la invención pueden igualmente codificar para el GM-CSF felino o estar asociados a un segundo vector que codifica para el GM-CSF felino (por ejemplo, los plásmidos pJP089 y pJP090, respectivamente figura 5 y figura 6) . En el caso de los plásmidos, se prefiere una mezcla de dos plásmidos. En el caso de los vectores virales se prefiere un solo vector. Este vector de expresión o esta mezcla de vectores de expresión puede también ser adyuvada tal como se describe anteriormente. La invención tiene también por objetivo una preparación inmunogénica multivalente o una vacuna multivalente contra la calicivirosis felina y contra al menos otro patógeno felino, utilizando un mismo vector de expresión in vi vo recombinado, que contiene y que expresa al menos un ADNc tipo FCV de acuerdo a la invención, y al menos una secuencia nucleotídica de un inmunógeno de otro patógeno felino o de un fragmento inmunológicamente activo de este inmunógeno . La invención tiene igualmente por objetivo una preparación inmunogénica multivalente o una vacuna multivalente que comprende al menos un vector de expresión in vivo, en el cual es insertado al menos un ADNc tipo FCV de acuerdo a la invención y al menos un segundo vector de expresión en el cual se insertada una secuencia que codifica para un inmunógeno, o un fragmento inmunológicamente activo, de otro patógeno felino. Los plásmidos apropiados en los cuales se inserta una secuencia que codifica para un inmunógeno, o un fragmento inmunológicamente activo, de otro patógeno felino, pueden ser principalmente aquellos descritos en los ejemplos 7 a 15 y 17 a 19 de la Solicitud de Patente WO-A-9803660 (pPB179, pPB180, pPB181, pAB009, pAB053, pAB052, pAB056, pAB058, pAB029, pAB030, pAB083, pAB041) . Las vacunas recombinadas monovalentes o multivalentes, tales como las que se describen precedentemente, pueden estar igualmente asociadas con al menos una vacuna clásica (inactivada, viva atenuada, subunidades) dirigida contra al menos un patógeno felino idéntico o diferente. Los otros patógenos felinos son principalmente elegidos entre el grupo que comprende los virus de la rinotraqueitis felina o el virus del herpes felino (FHV) , el virus de la leucemia felina (FeLV) , los parvovirus felinos (FPV) , el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) , el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) , el virus de la rabia , Chl amydi a .

La invención tiene también por objetivo las proteínas de la cápside, aisladas, purificadas o sintéticas, de la cepa FCV431 y de la cepa FCV Gl , que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 7, respectivamente SEQ ID NO: 5. Esta cubre automáticamente las proteínas equivalentes, es decir, provenientes de las cepas equivalentes a las cepas FCV 431 y FCV Gl de acuerdo a las definiciones dadas anteriormente (puesta en operación del panel y/o de un anticuerpo monoclonal, principalmente el anticuerpo monoclonal 44) . Ventajosamente, estas proteínas de cápside pueden ser ensambladas bajo la forma cápsides vacías . La invención tiene también por objetivo los fragmentos y los epítopes (al menos aproximadamente 8 a 10 aminoácidos) de esas proteínas, que conservan la especificidad y la inmunogenicidad de la proteína completa. Las proteínas de cápside, eventualmente ensambladas bajo la forma de cápsides vacías, y sus fragmentos y epítopes, pueden ser producidas mediante la expresión in vitro. La secuencia nucleotídica correspondiente es insertada en un sistema de expresión in vi tro y expresado por este sistema, y el producto de expresión se recolecta y eventualmente se purifica, como es conocido per se. El sistema de expresión puede ser de origen viral, en particular el baculovirus (Patente de los Estados Unidos US-A-4 745 051) . Se integra la secuencia codificante o un fragmento (en el caso del epítope o del fragmento) en el genoma del baculovirus (por ejemplo, el virus de la polihedrosis nuclear AcNPV de autografica califórnica, baculoviral) y éste último es enseguida propagado, principalmente sobre células de insectos, por ejemplo, Spodoptera frugiperda Sf9 (depósito ATCC CRL 1711) . El sistema de expresión in vivo puede ser de origen procariote, por ejemplo Escherichia coli , o eucariote, en particular levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, o las células eucarióticas de mamíferos, principalmente las líneas celulares tales como CHO (células de ovario de hámster chino) , HeLa, BHK o las células de insectos, por ejemplo, Spodoptera frugiperda (supra), o incluso células felinas. Como promotores utilizables en las construcciones celulares, se pueden citar los promotores virales fuertes tales como aquellos del virus SV40 (Fiers y colaboradores, Nature, (1978) 273: 113) y el promotor precoz (CMV-IE) del virus CMV o el citomegalovirus humano (McGregor y Caskey, Nucleic Acids Res. 17: 2365, 1989), murino o de otro origen, incluso aquel del gen de la polihedrina del Baculovirus AcNPV (Hooft van Iddekinge y colaboradores, 1983, Virology 131: 561-565) . El experto en la materia sabe cómo purificar y/o aislar las proteínas, ensambladas o no bajo la forma de cápsides vacías, sus fragmentos y epítopes, a partir de productos de las técnicas descritas anteriormente. A manera de ejemplo, se puede recordar que el experto en la materia tiene a su disposición diferentes métodos que comprenden principalmente: la precipitación basada en la solubilidad de las proteínas, fragmentos y epítopes de interés en función de las condiciones salinas del medio, precipitación con solventes orgánicos, polímeros y otros materiales, precipitación de afinidad y desnaturalización selectiva, cromatografía en columna, comprendida la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía que utiliza los ligandos, inmunoprecipitación, filtración sobre gel, electroforesis, métodos de filtración, principalmente ultrafiltración, y ultracentrifugación sobre gradiente. El experto en la materia puede recurrir a manera de ejemplo a K.Y. Green y colaboradores, J. Clin. Microb., Julio 1997, Vol. 35, 7: 1909-1914, para la producción de cápsides en baculovirus propagados sobre células Sf9 y la recolección por ultra-centrifugación sobre gradientes de sacarosa (10 al 50%) . Las proteínas de la cápside, y sus fragmentos y epítopes, pueden también ser producidos por síntesis química mediante los métodos a la disposición del experto en la materia . La invención tiene también por objetivo las preparaciones inmunogénicas y las vacunas que comprenden al menos un antígeno sub-unitario formado de una proteína de la cápside, de preferencia ensamblado bajo la forma de cápsides vacías, del FCV 431y/o FCV Gl , o de un fragmento o epítope correspondiente, en un vehículo o excipiente aceptable en el plano veterinario, y de preferencia un adyuvante. De preferencia, las preparaciones y las vacunas de acuerdo a la invención comprenden los antígenos sub-unitarios provenientes de las dos cepas FCV 431 y FCV Gl . De igual modo, las preparaciones y vacunas pueden comprender las proteínas de la cápside no ensambladas, y las proteínas ensambladas bajo la forma de cápsides vacías. Para adyuvar a la preparaciones inmunogénicas y las vacunas sub-unitarias de acuerdo a la invención, se puede utilizar a manera de adyuvante (1) hidróxido de aluminio, (2) un polímero de ácido acrílico o metacrílico, un polímero de anhídrido maleico y de derivado alquenílico (descrito anteriormente) o (3) formular la preparación inmunogénica o de vacuna bajo la forma de una emulsión aceite en agua, en particular la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita pl83 de la misma obra. La emulsión aceite en agua puede principalmente ser a base de aceite de parafina líquida ligera (tipo Farmacopea europea) ; de aceite isoprenoide tal como el escualeno, el escualeno; de aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o del deceno; de esteres de ácidos o de alcoholes con grupos alquilo lineal, más particularmente los aceites vegetales, el oleato de etilo, el di (caprilato/caprato) de propilenglicol, el tri (caprilato/caprato) de glicerol, el dioleato de propilenglicol; los esteres de ácidos o de alcoholes grasos ramificados, en particular los esteres del ácido isosteárico. El aceite es utilizado en asociación con los emulsificantes para formar la emulsión. Los emulsificantes son de preferencia los tensioactivos no iónicos, en particular los esteres de sorbitan, de manida, de glicerol, de poliglicerol, de propilenglicol, y del ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico, hidroxiesteárico, eventualmente etoxilados, los bloques copoliméricos de polioxopropileno-polioxietileno en particular los Pluronic®, principalmente L121. La invención tiene también por objetivo las preparaciones inmunogénicas y vacunas multivalentes en las cuales la valencia FCV es una valencia sub-unitaria como se describe anteriormente.

La presente invención tiene también por objetivo un método de inmunización de los gatos, contra las enfermedades debidas a los virus de la calicivirosis felina. Este método comprende la administración de una preparación inmunológica o de una vacuna de acuerdo a la invención a los gatos. Esta administración puede hacerse principalmente mediante la vía parenteral, por administración subcutánea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal. De preferencia, la administración se hace por la vía subcutánea o intramuscular. Diferentes medios de administración pueden ser utilizados para las preparaciones inumunogénicas y las vacunas plásmídicas, principalmente las partículas de oro recubiertas de ADN y protegidas de manera para penetrar en las células de la piel del sujeto a inmunizar (Tang y colaboradores, Nature 1992, 356, 152-154) y los inyectores por chorro líquido que permiten transfectar a la vez las células de la piel y las células de los tejidos subyacentes (Furth y colaboradores, Analytical Bioch. 1992, 205, 365-368) . El experto en la técnica posee las competencias necesarias para definir precisamente el número de administración y las dosis a utilizar para cada protocolo de inmunización.

La invención va a ser ahora descrita con más detalle con la ayuda de las modalidades de realización tomadas a manera de ejemplos no limitantes y que se refieren a los dibujos en los cuales: Figura 1 : Secuencia de ADNc y de la proteína de "cápside" de la cepa FCV Gl Figura 2 : Secuencia de ADNc y de la proteína de "cápside" de la cepa FCV 431 Figura 3 : Diagrama de restricción del plásmido pJCA151 Figura 4 : Secuencia de la región C6L del genoma del virus de la viruela del canario (canarypox) (cepa ALVAC) .. Figura 5: Diagrama de restricción del plásmido pJP089 Figura 6: Secuencia del gen GM-CSF felino 3R3 Figura 7 : Diagrama de restricción del plásmido pJP090 Figura 8: Secuencia del gen GM-CSF felino 3R4 Figura 9: Tabla de los títulos de seroneutralización cruzada Listado de secuencias para las construcciones de la presente invención SEQ ID NO 1: Oligonucleótido PB331 SEQ ID NO 2 : Oligonucleótido PB333 SEQ ID NO 3: Oligonucleótido PB332 SEQ ID NO 4 : Secuencia de ADNc de cápside de FCV Gl SEQ ID NO 5 : Secuencia de la proteína de cápside de FCV Gl SEQ ID NO 6: Secuencia de ADNc de cápside de FCV 431 SEQ ID NO 7: Secuencia de la proteína de cápside de FCV 431 SEQ ID NO 8: Oligonucleótido JCA289 SEQ ID NO 9: Oligonucleótido JCA290 SEQ ID NO 10: Secuencia de la región C6L del virus de la viruela del canario (cepa ALVAC) SEQ ID NO 11: Oligonucleótido C6A1 SEQ ID NO 12: Oligonucleótido C6B1 SEQ ID NO 13: Oligonucleótido C6C1 SEQ ID NO 14: Oligonucleótido C6D1 SEQ ID' NO 15: Oligonucleótido JCA291 SEQ ID NO 16: Oligonucleótido JCA292 SEQ ID NO 17: Oligonucleótido JCA293 SEQ ID NO 18: Oligonucleótido JCA294 SEQ ID NO 19: Oligonucleótido JCA295 SEQ ID NO 20: Oligonucleótido JP578 SEQ ID NO 21: Oligonucleótido JP579 SEQ ID NO 22: Secuencia del gen GM-CSF felino 3R3 SEQ ID NO 22: Secuencia del gen GM-CSF felino 3R4 EJEMPLOS Todas las construcciones de los plásmidos han sido realizadas utilizando las técnicas estándares de biología molecular (clonación, digestión con las enzimas de restricción, síntesis de un ADN complementario de una sola hebra, amplificación en cadena por polimerasa, alargamiento de un oligonucleótido por una ADN-polimerasa, etc.) descritos por Sambrook J. y colaboradores (Molecular Cloning: A Labora tory Manual . 2a. Edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, 1989). Todos los fragmentos de restricción utilizados para la presente invención, así como los diversos fragmentos de amplificación en cadena por polimerasa (= ACP o PCR) , han sido aislados y purificados utilizando el equipo "Geneclean7" (BIO01 Inc. La Jolla, CA) .

Ejemplo 1: Aislamiento y cultivo de las cepas de calicivirus felino Gl y 431 La cepa de calicivirus felino designada Gl ha sido obtenida a partir de una toma de muestra realizada en Francia sobre un gato que presentaba signos de calicivirosis . Esta cepa FCV Gl ha sido depositada el 12 de marzo de 1999 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (o CNCM) del Instituto Pasteur, París, Francia, bajo el número de acceso 1-2167. La cepa del calicivirus felino designada 431 ha sido aislada a partir de una toma de muestra realizada en Inglaterra sobre un gato que presentaba signos de calicivirosis. Esta cepa FCV 431 ha sido depositada el 12 de marzo de 1999 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (o CNCM) del Instituto Pasteur, París, Francia, bajo el número de acceso 1-2166. Para su amplificación, las cepas del calicivirus felino han sido cultivadas sobre células de la línea de riñon de gato (Crandell-Reese Feline Kidney o CRFK, No. ATCC CCL-94, Crandell y colaboradores, in vi tro 1973, 9, 176-185). Las células CRFK son puestas en cultivo en placa de 96 pozos o en Falcon de 25 cm2 con medio DMEM suplementado de 5% de suero fetal de ternera que contiene aproximadamente 100,000 células por ml . Las células son cultivadas a +37°C en atmósfera que contiene 5% de C02. Después de 3 días la cepa celular llega a la confluencia. El medio de cultivo es luego reemplazado con el medio DMEM sin suero pero adicionado con 50 mg/l de gentamicina y los aislados virales FCV son agregados a razón de un volumen de 100 µl de diluciones en serie de un cuarto en un cuarto de pozo para la clonación en diluciones limitadas de los virus FCV o de 1 ml por Falcon.

Cuando el efecto citopático (CPE) es completo (24-48 horas después del comienzo de la puesta en cultivo) , las suspensiones virales son recolectadas y congeladas a -70°C. Son en general necesarios 3 a 4 pases sucesivos para la producción de un lote viral. El lote viral es almacenado a -70°C.

Ejemplo 2: Extracción del ARN viral de las cepas Gl al 431 del calicivirus felino Las células CRFK son cultivadas a 37°C en matraces giratorios de 2 litros (850 cm2) en medio Eagle modificado (MEM, Gibco BRL) suplementado con 2.5% de hidrolizado de lactalbúmina (Gibco BRL) y de 5% de suero fetal de ternera (Gibco BRL) . Se agrega por matraz giratorio 300 ml de una suspensión celular en medio MEM a aproximadamente 100,000 células/ml. Después de 3 días la cepa celular es confluente. El medio de cultivo celular es luego reemplazado por el medio MEM sin suero y el virus FCV se agrega a una multiplicidad de infección (moi) de 0.5 DICC50/célula . El cultivo viral es mantenido a 37°C durante 24 a 48 horas hasta la obtención de un efecto citopático para el conjunto del tapiz celular. La suspensión viral es recolectada y luego aclarada mediante centrifugación.

El ARN viral contenido en 100 ml de suspensión viral de la cepa FCV Gl, que acaba de ser preparado, ha sido extraído con la soluciones del equipo "High Puré™ Viral RNA Kit" Cat # 1 858 882, Roche Molecular Biochemicals) , siguiendo las instrucciones del proveedor para las etapas de extracción. El botón o concentrado de ARN obtenido al final de la extracción es resuspendido con 10 ml de agua destilada estéril sin ARNasa. El ARN viral de la cepa FCV 431 es extraído en las mismas condiciones a partir de 100 ml de suspensión viral de la cepa correspondiente. El botón o concentrado de ARN obtenido al final de la extracción es resuspendido con 10 ml de agua destilada estéril sin ARNasa.

Ejemplo 3: Síntesis de los ADN complementarios de los genes de cápside de las cepas Gl y 431 del calicivirus felino Los ADN complementarios correspondientes a los genes de cápsíde de las cepas Gl y 431 del calicivirus felino, han sido sintetizados con el equipo "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EUA) utilizando las condiciones dadas por el proveedor. Para la cepa FCV Gl , una reacción de transcriptasa inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción "TI -ACP" o "RT-PCR") ha sido realizada con 1 ml de la suspensión de ARN viral FCV Gl (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes: PB331 (33 mer) (SEQ ID NO 1) 5' TTGCGGCCGCTGTGATGTGTTCGAAGTTTGAGC 3' y PB333 (36 mer) (SEQ ID NO 2) 5' TTGGCGCCGYTGACCMAGTGCAGCYTTRTCCAATTC 3' Las condiciones de la síntesis de la primera hebra de ADN complementaria son una temperatura de 42 °C durante 15 minutos, luego 99°C durante 5 minutos, y finalmente 4°C durante 15 minutos. Las condiciones de la reacción ACP son una temperatura de 95°C durante 2 minutos, luego 35 ciclos (95°C durante 1 minuto, luego 62°C durante 1 minuto, y 72°C durante 2 minutos), y finalmente 72°C durante 7 minutos para producir un fragmento de RT-PCR de aproximadamente de 2000 pares de bases (pb) que ha sido identificado "Gl-4" . Para la cepa FCV 431, una reacción de transcriptasa inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción "TI -ACP" o "RT-PCR") ha sido realizada con 1 ml de la suspensión de ARN viral FCV 431 (ejemplo 2) y con los ollgonucleótidos siguientes: PB331 (33 mer) (SEQ ID NO 1) y PB332 (38 mer) (SEQ ID NO 3) 5' TTGGCGCCAAYWGTRTT GHTACAGTRTCAATYARRCC 3' Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADN complementaria son una temperatura de 42 °C durante 15 minutos, luego 99°C durante 5 minutos, y finalmente 4°C durante 5 minutos. Las condiciones de la reacción de ACP son una temperatura de 95°C durante 2 minutos, luego 35 ciclos (95°C durante 1 minuto, después 62°C durante 1 minuto, y 72°C durante 2 minutos) , y finalmente 72 °C durante 7 minutos para producir un fragmento de RT-PCR de aproximadamente 200 pares de bases (pb) que ha sido identificado como "413-2".

Ejemplo 4: Clonación del gen que codifica para la proteína de cápside de la cepa Gl del calicivirus felino El fragmento RT-PCR "Gl-4" ha sido digerido con NarI y luego con Notl para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Narl-NorI de aproximadamente 2000 pares de bases. Este fragmento ha sido ligado con el vector pBlueScript® II KS+ (Cat # 212208 Stratagene Inc., La Jolla, CA 92037, EUA), previamente digerido con Notl-NarI luego desfosforilado, para dar el plásmido pGl-4-5 (5033 pb) . El fragmento Notl-NarI clonado en este plásmido ha sido completamente secuenciado sobre las dos hebras para determinar la secuencia del gen de la cápside. La secuencia del gen de la cápside de la cepa FCV Gl (2010 pb) (SEQ ID NO 4) , así como la secuencia de la proteína de cápside (p65) (668 aminoácidos) (SEQ ID NO 5) codificada por este gen, son presentadas en la figura 1.

Ejemplo 5: Clonación del gen que codifica para la proteína de cápside de la cepa 431 del calicivirus felino El fragmento RT-PCR "431-2" ha sido digerido para NarI luego con Notl para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Narl-Notl de aproximadamente 2000 pb. Este fragmento ha sido ligado con el vector pBlueScript® II KS+ (Cat # 212208 Stratagene Inc., la Jolla, CA 92037, EUA), previamente digerido con Notl y CLAI, luego desfosforilado, para dar el plásmido p431-2-l (4985 pb) . El fragmento Notl-NarI clonado en este plásmido ha sido completamente secuenciado sobre las dos hebras, para determinar la secuencia del gen de la cápside. La secuencia del gen de la cápside de la cepa FCV 431 (2007 pb) (SEQ ID NO 6) , así como la secuencia de la proteína de cápside (p65) (668 aminoácidos) (SEQ ID NO 7) codificada por este gen, se presentan en la figura 2.

Ejemplo 6: Construcción del plásmido pJCA151 Una reacción ACP ha sido realizada utilizando el plásmido p431-2-l (ejemplo 5) como matriz y los oligonucleótidos siguientes: JCA289 SEQ ID NO 8 (36 mer) ; 5' AAACGCGTCGACATGTGCTCAACCTGCGCTAACGTG 3' y JCA290 SEQ ID NO 9 (33 mer) : 5' TTTTGATATCTCATATTTTAACCATTCCACTCC 3' para amplificar un fragmento ACP de aproximadamente 2030 pb. Este fragmento ha sido digerido con las enzimas de restricción Salí y EcoRv para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento SalI-EcoRV de 2014 pb. Este fragmento de restricción ha sido luego ligado con el plásmido pVR1012 (Hartikka J. y colaboradores, Human Gene Therapy. 1997, 7, 1205-1217) , previamente digerido con Salí y EcoRV, para dar el plásmido pJCA151 (6908 pb) (Figura 3) .

Ejemplo 7: Construcción del plásmido donador para la inserción en el sitio C6L del virus de la viruela de canario La figura 4 (SEQ ID NO 10) muestra la secuencia de un fragmento de 3700 pb del ADN genómico del virus de la viruela del canario. El análisis de esta secuencia ha revelado una estructura abierta de lectura (COL) que ha sido denominada C6L, que comienza en la posición 377 y se termina en la posición 2254. La construcción de un plásmido de inserción que da como resultado la supresión de COL C6L y su reemplazo por un sitio de clonación múltiple flanqueado de las señales de detención de la transcripción y de la traducción, ha sido realizada como se define posteriormente en la presente. Una reacción ACP ha sido realizada a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los oligonucleótidos siguientes: C6A1 (SEQ ID NO 11) (42 mer) 5 ' ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3 ' y C6B1 (SEQ ID NO 12) (73 mer) 5' GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTC GTAAGTAAGTATTTTTATTTAA 3' para aislar un fragmento ACP de 432 pb (fragmento A) . Una reacción ACP ha sido realizada a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los siguientes oligonucleótidos: C6C1 (SEQ ID NO 13) (72 mer) 5 ' CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAG TATATATAATTGAAAAAGTAA 3' y C6D1 (SEQ ID NO 14) 45 mer) 5' GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3' •*-rifca para aislar un fragmento ACP de 1210 pb (fragmento B) . Los fragmentos A y B han sido hibridados conjuntamente para servir de matriz a una reacción ACP realizada con los oligonucleótidos C6A1 (SEQ ID NO 11) y C6D1 (SEQ ID NO 14) para generar un fragmento ACP de 1630 pb. Este fragmento ha sido digerido con las enzimas de restricción Sacl y Kpnl, para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento Sacl -Kpnl de 1613 pb. Este fragmento ha sido ligado con el vector pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, EUA, cat# 212205), previamente digerido por las enzimas Sacl y Kpnl, para dar el plásmido pC6L. La secuencia de este plásmido ha sido verificado mediante secuenciamiento. Este plásmido contiene 370 pb de las secuencias citadas con dirección hacia arriba (5') de COL C6L ("brazo flanqueante izquierdo C6"), una señal vaccinia de detención precoz de la transcripción, los codones de detención en las 6 fases de lectura, un sitio de clonación múltiple que contiene los sitios de restricción Smal, PstI, Xhol y EcoRI , y finalmente 1156 pb de secuencias situadas con dirección hacia abajo (3') del COL C6L ("brazo flanqueante derecho C6"). El plásmido pMP528HRH (Perkus M. y colaboradores, J. Virol., 1989, 63, 3829-3836) ha sido utilizado como matriz para amplificar la secuencia completa del promotor de la vaccinia H6 (No. de acceso GenBank M28351) con los siguientes oligonucleótidos : JCA291 (SEQ ID NO 15) (34 mer) 5' AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3' y JCA292 (SEQ ID NO 16) (43 mer) 5' AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG 3' para amplificar un fragmento ACP de 149 pb. Este fragmento ha sido digerido con las enzimas de restricción Smal y EcoRI para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción Smal-EcoRI de 138 pb. Este fragmento ha sido luego ligado con el plásmido pC6L, previamente digerido con Smal y EcoRI , para dar el plásmido pJCA150.

Ejemplo 8: Construcción del virus recombinante VCP1710 (virus de la viruela del canario recombinado, que expresa el gen de la cápside de la cepa FCV 431) Una reacción ACP ha sido realizada utilizando el plásmido p431-2-l (ejemplo 5) como matriz y los siguientes oligonucleótidos : JCA293 (SEQ ID NO 17) (55 mer) : 5 ' AAATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTGCTCAACCTGCGCTAACGTC 3 ' y JCA294 (SEQ ID NO 18) (33 mer) : 5 ' TTTTGTCGACTCATATTTTAACCATTCCACTCC 3 ' para amplificar un fragmento ACP de aproximadamente 2050 pb. Este fragmento ha sido digerido con las enzimas de restricción NruI y Salí para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Nrul-Sall de 2035 pb (fragmento A) . El plásmido pJCA150 (ejemplo 7) ha sido digerido con las enzimas de restricción NruI y Salí para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción Nrul-Sall de aproximadamente 4500 pb (fragmento B) . Los fragmentos A y B han sido luego ligados conjuntamente para dar el plásmido pJCA152. El plásmido pJCA152 ha sido linealizado con Notl, luego transfectado en las células primarias de embriones de pollo, infectadas con el virus de la viruela del canario (cepa ALVAC) de acuerdo a la técnica de precipitación con fosfato de calcio anteriormente descrita (Panicali y Paoletti Proc. Nat. Acad. Sic. 1982, 79, 4927-4931; Piccini y colaboradores, en Methods in Enzymology, 1987, 153, 545-563. Eds. Wu R. y Grossman L. Academic Prees) . Las placas positivas han sido seleccionadas con base en una hibridación con una sonda radiomarcada específica del gen de la cápside de la cepa FCV 431. Estas placas han sufrido 4 ciclos sucesivos de selección/purificación de las placas hasta que ha sido aislada una población pura. Una placa representativa de la recombinación in vi tro entre el plásmido donador pJCA152 y el genoma del virus ALVAC de la viruela del canario, ha sido luego amplificada y el material viral recombinado obtenido ha sido designado VCP1710.

Ejemplo 9: Construcción del virus recombinado vCP1711 (virus de la viruela del canario recombinado, que expresa el gen de la cápside de la cepa FCV Gl) Ha sido realizada una reacción ACP utilizando el plásmido pGl-4-5 (ejemplo 4) como matriz y los siguientes oligonucleótidos: JCA293 (SEQ ID NO 17) Y JCA295 (SQ ID NO 19 ( (33 mer) : 5' TTTTGTCGACTCATAGTTTTGTCATAGTACTCC 3' para amplificar un fragmento ACP de aproximadamente 2050 pb. Este fragmento ha sido digerido con las enzimas de restricción NruI y Salí para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento Nrul-Sall de 2035 pb (fragmento A) . El plásmido pJCA150 (ejemplo 7) ha sido digerido con las enzimas de restricción NruI y Salí para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción NruI y Salí de aproximadamente 4500 pb (fragmento B) . Los fragmentos A y B han sido luego ligados conjuntamente para dar el plásmido pJCA153. El plásmido pJCA153 ha sido linealizado con Notl, luego transfectado en las células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela de canario (cepa ALVAC) de acuerdo a la técnica de precipitación con fosfato de calcio anteriormente descrita (Panicali y Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982, 79, 4927-4931; Piccini y colaboradores, en Methods in Enzimology, 1987, 153, 545-563, Eds. Wu R. y Grossman L. Academic Press) . Las placas positivas han sido seleccionadas con base en una hibridación con una sonda radiomarcada específica del gen de cápside de la cepa FCV Gl . Estas placas han sufrido 4 ciclos sucesivos de selección/purificación de las placas hasta que ha sido aislada una población pura. Una placa representativa de la recombinación in vi tro entre el plásmido donador pJCA152 y el genoma del virus ALVAC de la viruela de canario, ha sido luego amplificada y el material viral recombinado obtenido ha sido designado VCP1711.

Ejemplo 10: Plásmido que codifica para el GM-CSF felino Ha sido recolectada sangre de gato mediante toma de sangre sobre un tubo que contiene EDTA. Las células mononucleadas han sido recolectadas mediante centrifugación sobre un gradiente de Ficoll, luego puestas en cultivo en caja de Petri de 60 mm de diámetro. Las células mononucleadas de gato han sido luego estimuladas con la concanavalina A (ConA) (concentración final de aproximadamente 4 µg/ml) y con la fito-hemaglutinina (PHA) (concentración final de aproximadamente 10 µg/ml) . Luego de la estimulación, los linfoblastos "ConA" y "PHA" han sido recolectados mediante raspado de las cajas de cultivo, y el ARN total de estas células ha sido extraído utilizando el equipo "Equipo de aislamiento de ARNm para células sanguíneas blancas" (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325) . El ARN total extraído de los linfoblastos de gato estimulados con la ConA y la PHA ha servido de matriz para la síntesis de la primera hebra de ADN complementario. Esta primera hebra de ADN complementario ha sido producida mediante alargamiento del oligonucleótido p (dT) 15 (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 814 270) . El ADN complementario de hebra simple obtenido ha sido utilizado como matriz para una reacción de ACP con los oligonucleótidos siguientes: JP578 (SEQ ID NO 20) (33 mer) 5' TATGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTG 3' y JP579 (SEQ ID NO 21) (36 mer) 5' TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTC 3' para amplificar un fragmento ACP de aproximadamente 450 pares de bases (pb) . Este fragmento ha sido digerido con Notl para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Notl -Notl de 450 pb. Este fragmento ha sido luego ligado con el plásmido pVR1012 (Hartikka J. y colaboradores, Human Gene Therapy. 1997. 7. 1205-1217). Dos clones que contienen la secuencia GM-CSF felina (SEQ ID NO 22 y SEQ ID NO 23) , en buena orientación con respecto al promotor hCMV/IE han sido identificados respectivamente pJP089 y pJP090. Estos dos plásmidos tienen un tamaño de 5364 pb (Figuras 5 y 7) . La secuencia del gen GM-CSF felino clonado en el plásmido pJP089 contiene 13 diferencias a nivel nucleotídico con la secuencia GM-CSF felina disponible en el GenBank (no. de acceso AF053007) . El cambio más importante es un cambio C — > T que involucra un cambio de leucina — fenilalanina para el aminoácido (primer base del codón del aminoácido # 107; Figura 6) . La secuencia del gen GM-CSF felino clonado en el plásmido pJP090 es equivalente a aquella contenida en el plásmido pJP089, salvo que el cambio de leucina —> fenilalanina no existe para el aminoácido # 107 (Figura 8) . La verificación de la secuencia 3' del gen GM-CSF de felino por medio del equipo 3' RACE ha mostrado que, en esta posición 107, se puede tener en el mismo gato, el aminoácido leucina o el aminoácido fenilalanina.

Ejemplo 11: Fabricación de vacunas plasmídicas asociadas Los diversos plásmidos necesarios para la fabricación de una vacuna asociada, son mezclados. Estos plásmidos pueden ser principalmente aquellos descritos en los ejemplos 6 y 10 (pJCA151, pJP089 y pJP090) y los ejemplos 7 a 15 y 17 a 19 de la solicitud de patente WO-A-9803660 (pPB179, pPB180, pPBldl, pAB009, pAB053, pAB052, pAB056, pAB058, pAB029, pAB030, pAB083, pAB041). Las mezclas son realizadas de tal manera que la concentración final de cada plásmido corresponda a la dosis eficaz de cada plásmido. Las soluciones utilizables para ajustar la concentración final de la vacuna pueden ser ya sea una solución de cloruro de sodio al 0.9%, o bien amortiguador de PBS.

Ejemplo 12: Formulación de los plásmidos de vacuna La solución de ADN que contiene uno o varios plásmidos de acuerdo al ejemplo 11, es concentrada mediante precipitación etanólica como se describe en Sambrook y colaboradores (1989) . El concentrado o botón de ADN es recogido con una solución de cloruro de sodio al 0.9% de manera para obtener la concentración de 1 mg/ml. Una solución de DMRIE-DOPE a 0.75 mM es preparada mediante recogida de un liofilizado de DMRIE-DOPE por un volumen adaptado de agua estéril. La formación de los complejos de ADN plasmídico-lípido es realizada mediante dilución a partes iguales de la solución de DMRIE-DOPE 0.75 mM por la solución de ADN a 1 mg/ml en cloruro de sodio 0.9%. La solución de ADN es introducida progresivamente con la ayuda de una aguja engastada 26G longitudinalmente de la pared del frasco que contiene la solución de lípido catiónico de manera para evitar la formación de espuma. Se procede a una agitación suave desde que las dos soluciones han sido mezcladas. Se obtiene finalmente una composición que comprende 0.375 mM de DMRIE-DOPE y 500 mg/ml del plásmido. Es deseable que el conjunto de las soluciones utilizadas esté a temperatura ambiente para el conjunto de las operaciones descritas anteriormente. Se permite la formación del complejo ADN/DMRIE-DOPE que se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de proceder a la inmunización de los animales.

Ejemplo 13: Formulación de vectores de vacunas de la viruela del canario Para la preparación de las vacunas, los virus recombinados de la viruela de canario vCP1710 (ejemplo 8) y vCP1711 (ejemplo 9) pueden ser adyuvados con soluciones de carbómero. El carbómero preferido es el CarbopolMR 974P fabricado por BF Goodrich, Ohio, EUA (peso molecular de aproximadamente 3 '000, 000). Una solución de reserva al 1.5% de CarbopolMR 974P es inicialmente preparada en el agua destilada que contiene 1 g/1 de cloruro de sodio. Esta solución de reserva es luego •utilizada para la elaboración de una solución a 4 mg/ml de Carbopol"1* 974P en agua fisiológica. La solución de reserva es mezclada al volumen adecuado de agua fisiológica, o bien en una etapa única, o bien en varias etapas sucesivas, el valor del pH es ajustado en cada etapa con una solución de hidróxido de sodio 1 N (o incluso más concentrada) con el fin de obtener un valor final de pH de 7.3-7.4) . La solución de CarbopolMR 974P lista para el empleo obtenida de este modo puede ser utilizada para recoger los virus recombinados, liofilizados (por ejemplo VCP1710, vCP1711) o para diluir las soluciones de reserva concentradas de los virus recombinantes (por ejemplo vCP1710, vCP1711) . Por ejemplo, para obtener una suspensión viral que contiene 108 ufp por dosis de 1 ml , se puede diluir una solución de reserva viral de manera para obtener un título de 108'3 ufp/ml, luego diluida a partes iguales con dicha solución de CarbopolMR 974P lista para el empleo a 4 mg/ml.

Ejemplo 14: Pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IFI) Las pruebas IFI son efectuadas sobre placas de 96 pozos que contienen las células CRFK cultivadas en monocapas e infectadas por el virus FCV a probar. •200 µl por pozo de una suspensión de células CRFK a 90,000 células/ml en medio F15 (Gibco BRL, Cat # 045-1075) que contiene 5% de suero fetal de ternera, son puestos en cultivo en placa de 96 pozos. En la confluencia, 320 DICC50 de FCV son inoculados bajo 100 µl de medio F15. Luego que aparecen los primeros focos de ECP, las células son entonces enjuagas con PBS sin calcio ni magnesio (PBS, Sigma) frío, luego fijadas a -20°C durante 30 minutos con acetona fría que contiene 55 v/v de agua. Después del secado, las células infectadas y fijadas son puestas en contacto durante 30 minutos a 37°C con 100 µl por pozo de líquido de ascitis correspondiente al anticuerpo monoclonal 44 anti -FCV 431 (hibridoma 431 2017 E9T, depositado en la CNCM bajo el número de acceso 1-2282), diluido a 1/5000 aproximadamente en amortiguador TRIS-HCl 50 mM pH 7.6. Después de dos enjuagues en PBS", la fijación de los anticuerpos es revelada por incubación en las mismas condiciones de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado al isotianato de fluoresceína (Biosys, conjugado FITC a 2 mg/ml) y diluido a 1/50 en amortiguador TRIS-HC1 50 mM pH 7.6. La lectura se hace bajo microscopio óptico en luz UV. Este anticuerpo monoclonal ha sido probado frente a cada uno de los aislados del panel. Éste se fija exclusivamente sobre las células CRFK infectadas por el FCV 431. Éste puede ser utilizado para determinar los equivalentes de la cepa FCV 431. Estos equivalentes son aquellos sobre los cuales se fija el anticuerpo monoclonal 44.

Ejemplo 15: Seroneutralización cruzada in vi tro Las pruebas de seroneutralización cruzada han sido efectuadas entre 18 aislados de campo obtenidos por raspados faríngeos practicados sobre gatos que presentan signos de calicivirosis felina. 7 tienen por origen geográfico Francia, se trata de los aislados identificados A2 , F2031, Gl, G3 , Fl, H3-2 y Hl-4. 4 tienen por origen geográfico Gran Bretaña, se trata de los aislados identificados J5 , 337, 388b y 431. Finalmente, 7 tienen por origen geográfico los Estados Unidos de América, se trata de los aislados identificados RMI1, RMI2, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7 y RMI9. Para cada virus FCV, ha sido producido antisuero por inoculación de gatitos por la vía oronasal con 106'0 DICC50 del virus FCV en cuestión. Los gatitos exentos de patógenos específicos (EOPS) son de 10 a 14 semanas. El suero de cada animal es recolectado un mes después de la infección. Los sueros han sido inactivados por calor (30 minutos a 56°C) , repartidos, divididos en alícuotas y almacenados a -20°C. El suero obtenido para cada aislado ha sido probado para su aptitud de neutralizar los 18 aislados. Los sueros han sido diluidos en cascada a un tercio con el medio DMEM en placas de 96 pozos para cultivo celular. A 0.5 ml de suero diluido se agregan 0.05 ml de medio de cultivo que contiene aproximadamente 100 DICC50 de la cepa viral seleccionada. Esta mezcla ha sido incubada durante 2 horas a 37°C en estufa en atmósfera que contiene 5% de C02. 0.15 ml de una suspensión de células CRFK que contienen aproximadamente 100,000 células por ml ha sido enseguida agregada a cada mezcla. El efecto citopático ha sido observado por microscopio de contraste de fases después de 4 días de cultivo a 37°C en atmósfera que contiene 5% de C02. Los títulos neutralizadores de cada suero han sido calculados siguiendo el método de Kárber. Los títulos son dados bajo la forma de la dilución más importante que inhibe el efecto citopático para 50% de los pozos. Los títulos son expresados en log?0. El título mínimo encontrado de este modo ha sido de 0.7 logio VN50. Cada suero ha sido titulado al menos dos veces, de preferencia tres veces. La figura 9 da el conjunto de los títulos neutralizadores obtenidos luego de las seroneutralizaciones cruzadas, efectuadas entre estas 18 cepas de FCV y estos 18 sueros . Debe ser bien comprendido que la invención definida por las reivindicaciones anexas no está limitada a las modalidades de realización particulares indicadas en la descripción anterior, sino que engloba las variantes que no se salen del marco ni del espíritu de la presente invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. .Üto aia-».., LISTADO DE SECUENCIAS <110> MERIA <120>Qenes ,jej calcivijrus felino y vacunas, pricipalmente vacunas recombinadas <130>FCV recombinado <140> <141> 2000-02-11 5 <160> 23 <170> Patenzln Ver . 2.1 <210> 1 <211> 33 <212> ADN <213> Se cu en c i a a rt i f i c i a l <220> <223> Descripción de la secuencia artificial 10 oligonucleotidica <400> 1 ttgcggccgc tgcgatgtgt tcgaagtttg age 33 <210> 2 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ¡ -S <223> Descripción de la secuencia artificia : oligonucleotido <400> 2 ttggcgccgy zgaccrnagtg cagcyttrtc caatte 3 g <210> 3 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial 0 <220> <223> Descripción de la secuencia artificial - oligonucleotido <400> 3 ttggcgccas y gtrttwgh tacagtrtca acyarrec 38 <210> 4 <211> 2010 <212> ADN <213> calicivirus felino t <400> 4 aegegcecaa ccegcgceaa cgegceeaaa eaceaecaee gggatcccca cacaaaaeeg 60 geeaeegacc ccaacaaacc cceeececea ggceecegcg aeaaaccgce eeeaegctgc 120 tacccagaac eececccaga aeteggaaca gegegggaee gegaccaaec ccctceacaa 180 aeeeacceeg aaeceaeccr eggegaegae gaatggagct cgacacttga tgctatcgat 240 ccegeegeec cccccacgca eegggacaag gctgggaaaa cctcccagcc tcatcctggt 300 geeceaacgc accaccccat caaegaagee gcaaaagctt gggatccaaa tceccccatc 360 ctccgattsg aagcegacgg ggacecaecc atcacgaccc ctgagcaagg aacaeeggtc 420 ggeggegeea Ctgccgagcc cagcgctcaa aeggcaaceg ctgctgacgc agcaaccggc 480 aagagegeeg acecggaaec cgageceeec eececaeecc atactagtgt gaattggagt 540 acatccgaaa cccagggaaa gaecceceee aaacaatct taggacccct acttaaccct 600 taccttgaac accteeceaa aeeaeacgee gcttggcccg gaecagegga tgtaaggttc 660 ectaeeeceg gceccggege ceecgggggg aaattggctg ccattgttgt gcctccaggg 720 gttgaccccg tccagagcac gecaaegcec cagtaccccc aegeccecee tgatgctcgc 780 caageegaac ccgttatatt eecaaecccc gatctaagga gcacececea tcacctaatg 840 ecegaeaceg aeaceacaec cceegeeaee aeggeaeaea atgaccttat taacccttat 900 gceaaegaee ccaacrceec tgggegeaee geeaccgeeg agaccaaacc tggacctgac 960 Ctcaaacttc acctcccgaa accaccegga ecaaegeeaa cccatggctc taetcccece 1020 gacrtgattc caaaaeceec atccctttgg attggaaatc gatattggtc tgacataact 1080 gattttgtaa eecggccaee cgegeeecaa gccaatcgtc acettgactt caaccaagaa 1140 acggceggae ggagcacacc aagaeeecga cccaeaacaa eaaceaeeag tgaaagtaae 1200 ggaecaaaac egggaacegg cgeggccaca gaeeacaeeg egcccggcat accegatgge 1260 eggccegaca ccacaaeegg tgaggaaeeg acaccagceg gagaeeacec aaecacaaac 1320 ggeageggca atgacaeegc aacagceaae gceeaegaca gegcegaege gaecacaaac 1380 accacaaaee ecaggsggac ceacaeeege ggagcacecc agagggceeg gggcgaeaag 1440 aagaececaa geacagceet caeaaccace gceaeeaagg aaggeaaeac gcetaaacca 1500 ecaaaeacaa eegacaegac aaaaaeegce gegeaccagg acacecaege eggcagggae 1560 geecaaacae cegaegaeac aceggcaaec ceeggeeaca ceggaaeegg egaacaggca 1620 aeeggaecea aeagggaeag tgeggeecgc aeeagcatgc egccggaaac eggegcccgc 1680 ggcgggaaec acccaaeeet ceacaaaaat eceaeeaage eaggaeaege acecaggeca 1740 aeegaegege ecaacecaca aaeececcac acaeceagac aacegeccce caaecaetac 1800 eegceaccac cegacecaet egcegeeeat aggaeeaeag actceaaegg aeceeggett 1860 gaegtaggga eegaeagega eggeeeeecc eetgeeggeg eteceageae ccceaaacee 1920 gageteccec teecegccec ceacaeggga aeecagcegg caaagaeecg acetgcctce 1980 aacaeeagga geaceatgac aaaaceaega 2010 <210> 5 <211> 669 <212> PRT <213> caiicivir s felino <400> 5 Mee Cys Ser Thr Cys Ala Asn Val Leu Lys Tyr Tyr Asp Trp Asp Pro 1 5 10 15 Kis Thr Lys Leu Val He Asp Pro Asn Lys Phe Leu Ser Leu Gly Phe 20 5 30 Cys Asp Lys Pro Leu Leu Cys Cys Tyr Pro Glu Leu Leu Pro Glu Phe 35 40 45 Gly Thr Val Trp Asp Cys Asp Gln Ser Pro Leu Gln He Tyr Leu Glu 50 55 60 Ser He Leu Gly Asp Asp Glu Trp Ser Ser Thr Phe Asp Ala He Asp 65 70 75 80 Pro Val Val Pro Pro Mee Has Trp Asp Lys Ala Gly Lys He Phe Gln 85 90 95 Pro His Pro Gly Val Leu Mee Kis H s Leu He Asr. Glu Val Ala Lys wg ^^£¿¡^§j 100 105 110 Ala Trp Asp Pro Asn Leu Pro He Phe Arg Leu Glu Ala Aso Gly Asp 115 120 125 Ser Ser He Thr Thr Pro Glu Gln Gly Thr Leu Val Gly Gly Val He 130 135 140 Ala Glu Pro Ser Ala Gln Mee Ala Thr Ala Ala Asp Ala Ala Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ser Phe Phe Ser Phe His Thr Ser 165 170 175 Val Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys He Leu Phe Lys Gln 180 185 190 Ser Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Glu His Leu Ser Lys Leu 195 200 205 Tyr Val Ala Trp Ser Gly Ser Val Asp Val Arg Phe Ser He Ser Glv 210 215 220 Ser Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala He Val Val Pro Pro Gly 225 230 235 240 Val Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Mee Leu Gln Tyr Pro His Val Leu 245 250 255 Phe A=p Ala Arg Gln Val Glu Pro Val He Phe Ser He Pro Asp Leu 260 65 270 Arg Ser Thr Leu Tyr His Leu Mee Ser Asp Thr Asp Thr Thr Ser Leu 275 280 285 Val He Mee Val Tyr Asn Asp Leu He Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ser 290 295 300 Asn Ser Ser Gly Cys He Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Gly Pro Asp 305 310 515 320 Phe Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Mee Leu Thr His Gly 325 330 335 Ser He Pro Ser Asp Leu He Pro Lys Ser Ser Ser Leu Trp He Gly 340 345 350 Asn Arg Tyr Trp Ser Asp He Thr Asp Phe Val He Arg Pro Phe Val 355 360 365 Phe Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu Thr Ala Gly Trp 370 375 380 Ser Thr Pro Arg Phe Arg Pro He Thr He Thr He Ser Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly =er Lys Leu Gly Thr Gly Val Ala Thr Asp Tyr He Val Pro Gly 405 410 5 He Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr He Gly Glu Glu Leu Thr Pro 420 425 430 Ala Gly Asp Tyr Ser He Thr Asn Gly Ser Gly Asn Asp He Ala Thr 435 440 445 Ala Asn Ala Tyr A=p Ser Ala Asp Val He Thr Asn Thr Thr Aen Phe 450 455 460 Arg Giy Met Tyr He Cys Gly Ala Leu Gln Arg Ala Trp Gly Asp Lys 465 470 475 480 Lys He Ser Ser Thr Ala Phe He Thr Thr Ala He Lys Glu Gly Asn 485 490 495 Thr Leu Lys Pro Ser Asn Thr He Asp Mee Thr Lys He Ala Val Tyr 500 505 510 Gln Asp Thr His Val Gly Arg Asp Val Gln Thr Ser Asp Asp Thr Leu 515 520 525 Ala He Leu Gly Tyr Thr Gly He Gly Glu Gln Ala He Gly Ser Asn 530 535 540 Are Asp Ser Val Val Arg He Ser Mee Leu Pro Glu Thr Gly Ala Are 545 550 555 560 Gly Gly Asn His Pro He Phe Tyr Lys Asn Ser He Lys -Leu Gly Tyr 565 570 575 Val Leu Arg Ser He Asp Val Phe Asn Ser Gln He Leu His Thr Ser 580 585 590 Arg Gln Leu Ser Leu Asn His Tyr Leu Leu Pro Pro Asp Ser Phe Ala 595 600 605 Val Tyr Arg He He Asp Ser Asn Gly Ser Trp Phe Asp Val Gly He 610 615 620 Asp Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Ser He Pro Lys Leu 625 630 635 640 Glu Phe Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Mee Gly He Gln Leu Ala Lys He 645 650 655 Arg Leu Ala Ser Asn He Arg Ser Thr Mee Thr Lys Leu 660 665 <210> 6 <211> 2007 <212> ADN <213> calicivirus felino <400> 6 aegegcecaa ccegcgceaa cgegceeaaa eaceaegaee gggaecccca ceeeagaeeg 60 aeeaeeaacc ccaacaaaee eceeeccgee ggeeecegeg aeaaeccece eaegtgeege 120 eaecccgaae eacecccega aeeeggaace gegegggace gegaecagec accaceccaa 180 aeeeaeceag ageccaecce eggegaegac gaaegggcee ccaceeacga agcagetgac 240 ccageggegc caccaaegca eegggaeage gceggaaaga eceeecagcc acaeccegse 300 geaeegaegc accaececae eggegaagee gceaaggcce gggaeccaaa ceeaccacec 360 eeecgecegg aagcggaega eggaeceseg accacgcceg aacaaggaac aceggetcge 420 ggagecaeec cegagcceaa egcccaaaeg ecagcegeeg cegacgeggc caceggcaaa 480 agegeegace cegageggga agcaeeceec eceeeccaca ccagegecaa eeggagcaca 540 ecegaaaccc aagggaaaae cceeeeeaaa caaececeag gecccceace eaacccteac 600 ceeacecatc tcgcaaaace eeatgtegca eggeceggte ceaeegagge tagaeteeca 660 ateeceggae ceggegecee eggeggaaaa ceggcegcea eegeegegcc acccgggaec 720 gaecccgegc aaagcacaec aaegeegcag eacccccaeg eeceseeega egcecgtcaa 780 geegaacctg eeaeceecac eaecccegae eegagaaaea geceaeaeca cceeaegece 840 gacacegata ceacaecece egtcaetaeg aeaeacaaeg aececaeeaa tccctaegcc 900 aaegaeecca acecaecegg aegcaeegee acegeggaga caaaaccegg ccccsaeeec 960 aaaeeecacc tceegaaacc gccegggece aegeeaacec aegggecaae tccatccgac 1020 ceeaecccaa aaeceeceec eceeeggaee ggcaaccgac aceggecega eataacegae 1080 eeegecaeca aacceeeege eeeccaggce aaecgacaee eegaceecaa ecaagagace 1140 gcaggcegga gcacecccag aeeeagaccc aeaaccaeca cagetecega gaagggagga 1200 ecaaaaeegg geaeeggege egcaacegac eceaeegecc ccggcaeacc agacggcegg 1260 ccggaeacca ccaeeccaga aaaaceeacc ccagcaggeg aceaegcaae cacaaaeggg 1 20 ggaaacaaeg acaecaccac egcegcggac eaegaegggg caageaeaae caaaaacaae 1380 acaaaeeeca agggeaegea eaeeegegge gceetgcaaa gagceegggg tgacaagaaa 1440 aeeecaaaca cegcceeeae caceaccgca aecagagagg geaacecaat aaaaccaece 1500 aaegeaaeeg acaegacaaa aceegccgee eaecaagaeg ctcaegeegg tgcagaacee 1560 caaaccectg acaecaccee agcaaeccee ggeeaeaccg ggaeeggega agaagceaea 1620 ggcceggaea gggacaaage ggegcgtaee agcaeaceec cagaaacegg tgctcgeggc 1680 ggaaaecacc ceaeeeecea eaegaacaaa aeeaaaeeag geeaegeeae easatcaaca 1740 gaegergcaa acecccaaae eeeacaeaca eceaggcaae eaecacecaa taattaecea 1800 ceggcecceg acecceeegc ageeeacaga aeeaeegaee ceggcggcec eeggeeegae 1860 aeegceaeeg aeagegaegg eeeeeceeee geeggegeae ctcaaaeegg aaaattggag 1920 eeeccaceaa cegcceccea caegggaaee caaeeggcaa agaeecgact tgcctcaaac 1980 aeeaggageg gaaeggeeaa aaeaega -,«„„ 3 2007 <210> 7 <211> 668 <212> PRT <213> calicivarus felino <400> 7 Mee Cys Ser Thr Cys Ala Asn Val Leu Lys Tyr Tyr Asp Trp Asp Pro 1 5 10 15 His Phe Arg Leu He He Asn Pro Asn Lys Phe Leu Ser Val Gly Phe 20 25 30 Cys As? Asn Pro Leu Mee Cys Cys Tyr Pro Glu Leu Leu Pro Glu 35 Phe 40 45 Gly Thr Val Trp Asp Cys Asp Gln Ser Pro Leu Gln He Tyr Leu Glu 55 60 Ser He Leu Gly Aep Asp Glu T;rp Ala Ser Thr Tyr Glu Ala Val Asp 65 70 75 80 Pro Val Val Pro Pro Mee Kis Trp Asp Ser Allaa GGllyy LLyyss HHee PPhhee Gln 85 90 95 Pro His Pro Gly Val Leu Mee H__s His Leu He Gly Glu Val Ala Lys 100 105 110 Ala Tr? Asp Pro Asn Leu Pro Leu Phe Arg Leu Glu Ala Asp Asp Gly US 120 125 V y Ser V=l Thr Thr Pro Glu Gln Gly Thr Leu Val Gly Gly Val He Ala 135 140 j?jafeíü- Glu Pro Asn Ala Gln Mee Ser Aia Val Ala Asp Val Ala Thr Gly Lys 145 150 155 160 Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser Phe Hie Thr Ser Val 165 170 175 Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gin Gly Lys He Leu Phe Lys Gln Ser 180 185 190 Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Thr His Leu Ala Lys Leu Tyr 195 200 205 Val Ala Trp Ser Gly Ser He Glu Val Arg Phe Ser He Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala He Val Val Pro Pro Gly He 225 230 235 240 Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Mee Leu Gln Tyr Pro His Val Leu Phe 245 250 255 Asp Ala Arg Gln Val Giu Pro Val He Phe Thr He Pro Asp Leu Arg 260 265 270 Aen Ser Leu Tyr His Leu Mee Ser Asp Thr Asp Thr Thr -Ser Leu Val 275 280 285 He Mee He Tyr Asn Aep Leu He Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ser Asn 290 295 300 Ser Ser Gly Cys He Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Gly Pro Asp Phe 305 310 315 320 Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Mee Leu Thr His Gly Ser 325 330 335 He Pro Ser Asp Leu He Pro Lys Ser Ser Ser Leu Trp He Gly Asn 340 345 250 Arg His Trp Ser Asp He Thr Asp Phe Val He Lys Pro Phe Val Phe 355 360 365 Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu Thr Ala Gly Trp Ser 370 375 380 Thr Pro Arg Phe Arg Pro He Thr He Thr Val Ser Glu Lys Gly Gly 385 390 395 400 Ser Lys Leu Gly He Gly Val Ala Thr Asp Ser He Val Pro Gly He 405 410 415 Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr He Pro Glu Lys Leu Thr Pro Ala 420 425 430 Gly Asp Tyr Ala He Thr Asn Gly Gly Asn Aen A=p He Thr Thr Ala 435 440 445 Ala Asp Tyr Asp Gly Ala Ser He He Lye Asn Asn Thr Asn Phe Lys 450 455 460 Gly Mee Tyr He Cye Gly Aia Leu Gln Arg Ala Trp Gly As? Lys Lys 465 470 475 480 He Ser Asn Thr Ala Phe He Thr Thr Ala He Arg Glu Gly Asn Ser 485 490 495 He Lys Pro Ser Asn Val He Asp Mee Thr Lys Leu Ala Val Tyr Gln 500 505 510 Asp Ala His Val Gly Ala Glu Leu Gln Thr Ser Asp He Thr Leu Ala 515 520 525 He Leu Gly Tyr Thr Gly He Gly Glu Glu Ala He Gly Leu Asp Arg 530 535 540 Asp Lys Val Val Arg He Ser He Leu Pro Glu Thr Gly Ala Arg Gly 545 550 555 560 Gly Asn His Pro He Phe Tyr Mee Asn Lys He Lys Leu Gly Tyr Val 565 570 575 He Aro Ser He Asp Val Ala Asn Ser Gln He Leu His Thr Ser Arg 580 585 590 Gln Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Leu Leu Ala Pro Asp Ser Phe Ala Val 595 600 605 - Tyr Arg He He Asp Ser Gly Gly Ser Trp Phe Asp He Gly He Asp 610 615 620 Ser Asp Gly Phe =er Phe Val Gly Val Ser Gln He Gly Lys Leu Glu 625 630 635 640 Phe Pro Leu Thr Ala Ser Tyr Mee Gly He Gln Leu Ala Lys He Arg 645 650 655 Leu Ala Ser Asn He Arg Ser Gly Mee Val Lys He 660 665 <210> 8 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido <400> 8 aaacgcgecg acaegegcec aaccegcgce aacgeg 36 <210> 9 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial1 oligonucleotido <400> 9 eeeegaeaec ecaeaeeeea accaeeccac ecc 33 <210> 10 <211> 3701 <212> ADN <213> virus de la viruela de canario <400> 10 aagceeceae caaaagecee aaegageeag gegeagaeag eaeagaeaee aceacaaagg 60 eaeecaeaee ecceaecaae eceaaageag aegaeaetaa eaacecaaag atgaegaeag 120 eagaeaaeag aeacgcecae aeaaegaceg caaaeeegga cggeecacae eeeaaecaec 180 acgcgeecae aageeecaac Cgcaeagaec aaaaececac eaaaaagaea gccgaegeae 240 eegagagaga eeggacaece aactacgcea aagaaaeeac ageeaeaaae aaeacaeaae 300 ggaeeeegee aecaecagee aeaeeeaaca taageacaae aaaaagtate aaaeaaaaae 360 aceeaceeac caaaaaaege caeeaeeaca aaaaceaeae ceeacagaac aaeceaeage 420 agagecceee eagageeaea aeeeaaaaga eaaccaeaae geaaeateea ccacaecaga 480 egaegaeace geegeageaa eaaaegaaga eaaegeactg eeaeceacaa gaeeaeeaec 540 aeeegaeaaa ae eceseeee eeaaceccee eaaeaacgge eeaecaaaae acgaaaceae 600 eagegaeaca aeaeeagaea eagaeaceca eaaeeaeeae aeacceagee cteceeceee 660 geeagaeaee ccaaaaaaaa gagcgegega eeeagaaeea gaagaeceaa aeeaegcgee 720 aaeaggagac aaeageaace eaeateaeaa agaeaegace eacaegaaea attggteaee 780 eaceaaagga eeaeeagaee acaageeege aeeaeegcgc gatgeagaea aaegetacaa 840 acageaeaae aaaaagaaea ceaeaaeaga eaeaaeacae cgcgaeaaca gacageaeaa 900 caeaegggee aaaaaegeea eagaaeaceg eectcceggc eaeaeaetae ggteacaega 960 eceaaaagcc gcegcegaag aegaeeggee aagaeacgae aaccgtaeaa acgaaeeaec 1020 egcggaeaaa eeaeacacee ecgagetcae ageeaeaeta gaaaaeaata eaaaacacet 1080 acgageagge ecaaeaaeeg eacaeccaaa caagataata gceaaeggea catctaaeaa 1140 eaeaceeace gaeeetceae ceeacgeaga agaaceaata eaecaecaea attcatceat 1200 aaeaeeggcc ggaeaeeeee eagaattcee egagaccace aeeeeaecag aatttacctc 1260 eecaeceece aaegggeaa egaaeageaa cegeetagea caccegaaaa cagggeaega 1320 agceaeacec eeegaegcea geteaeeeee ccaacecece aceaaaagca aeeaegeaaa 1380 aeaeeggaca aagaaaacee egcageaeaa gaaceeceee aaagacggea aacageeagc 1440 aaaaeaeaea aeeaagaaag aeagecagge gaeagaeaga geaegeeaee eacacgcagc 1500 tgeaeaeaae cacgeaacee aceeaaegga eacgeeeaaa aeecceggee eegaeeeeaa 1560 aeececcgga eegaeagaea eaceacegee eggaaeaeeg caeaaggaea aegagaaeae 1620 aeeeeaeccg aaacgegeee cegeaaceaa eaeaaeaeca gaaeceatce aegcagaeee 1680 eeaceeeaea ecagaegeea aeaaatecag eaaaaagaea gaaeaeaaaa ctatgeeecc 1740 eaeacecgca aaaaceace aeccaaaagg aaggccceae eeeacacaea catceaacga 1800 agaeceeceg eccaecegee eaegcgaage aacageeege aaagaeaeaa aaaaeccaee 1860 aeeaeaeece eaaaaggaea eaecagcaaa acgaeecaea ggeeeaeeea caecegecga 1920 eaeaaaeacg gcegetgage eaagaggaea eaaaaeaaga geaaeaggae geetagaaeg 1980 gccegaaaag eeaaaaaeae eeaaeeceaa ecceacaeac aeeagaetae taceaacaga 2040 aagacgeeea gaeaeeceac aeecceaece gceeaaaeee aaeaeaacag aggaeaeagc 2100 eaccagagae ccagecasaa aeaaeeeacc eaeaaeeece eeeaecgcca geeaeegeag 2160 aecgeaeace eaeaaaeeac eaaaeegcca eaegeacaae ecgegeaaga taacaaaseg 2220 eaaaeaeaae ceggeaaeae aeaaecceae aeaggageae aeaeaaeega aaaagcaáaa 2280 eaeaaaecae aeaaeaaega aacgaaaeae cageaaeaga caggaacegg cagaeeceec 2340 eeceaaegaa ceaageaceg ceaaaececc aaaaeeacae aaaaaegaea cagcaaaeac 2400 agceecaeec eacgaaeeac ceeeeaaeee eeecagacac acceeaeeac aaaceaacea 2460 agecagaega e agaaagea aaeaeaaaee eaaceeaegg geaeaaeaea aeaaagaeec 2520 aegaeaeeaa eaaeeeacee aacgaegeea aeagaceeae eccaecaacc cceecaaacc 2580 eeeceggaea eeaeaaaaea ccageeaaeg aeaeeaaaae agaeegeeea agagaegeaa 2640 aeaaeeaeee ggaggeaaag gaeaeaaaae eageceaece eecacaegga aaegaaeeac 2700 ceaaeaeeaa eaaeeaegae aggaaeeeee eaggaeeeac agcegeeaea tgtaecaaca 2760 aeacaggcag eeceaeggee aeggeaaaac acegeaacgg gaagcagcae tceaeggeaa 2820 ceggcceaeg eeeaaeagcc agaecaeeee aceceaeaaa caeeeeacca caaaeaaeag 2880 gatcceceag araeceaaea c caeaeceaa caacaacaaa aaaaeeeaac saegeaec c 2940 cagaageeee eeceaceaae aaasaeaaag aeaceceaec eeacceacea pscaegaaag 3000 aagaeaaeca eeeageacea gceaceaaea eggaaagaaa egeaeacaaa aacgeggaag 3060 ceeeeaeaee aaaeagcaea eeaceagaag aeeeaaaaec eagaceeage aeaacaaaac 3120 ageeaaaegc caaeaecgae tceaeaeeec accacaacag eageacaeea accagcgaca 3180 eacegaaacg aeceacagac ecaaceaegc aaggaaeaag caaeaegcca aecaegecea 3240 aeaceccaac eeeagaacea aaacgeecea ccaaeaceaa aaaeaggaea cgegacaggc 3300 cgeeaaaagc egcaaeaaae ageaaggaeg cagaagaaae aceeegeece aeacceecgg 3360 aggaaagaac eeeagaacaa ceeaageeea aecaaaceeg eaeeeaegaa caceaeaaaa 3420 aaaeeaegga agaeacaage aaaagaaegg aegeegaaeg ecgeageeea gaacacaacc 3480 aeacggceaa ceeaeaeaaa gegeacggac aaaacgaaea taegaeeace tacaeaceag 3540 cececaeaag eaggaeeaae aaeaeeaeag aaaceeeaaa aeaeaaeceg geggggccag 3600 acgaaeceac aaeacgeaae aeaaaeeaea eaaeeecaca aagaacaaaa aaaaaccaag 3660 teeceaaeac ceeaeagaea aaceaeaeee eeeaccaceg a 3701 <210> 11 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido <400> 11 aecaecgagc ecgcggccgc ceaecaaaag eceeaaegag ee 42 <210> 12 <211> 73 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido 15 <400> 12 gaaecccecg agcegcagcc cgggeeeeea easceaseca cecaeeet :e cgeaageaag 60 eaeeeeeaee eaa 73 <210> 13 <211> 72 < 12> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido <400> 13 cccgggcegc agcecgagga aeeceeeeea cegaeeaace agecaaaega geaeaeaeaa 60 eegaaaaage aa 72 <210> 14 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia artificial "> <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido <400> 14 gatgaeggta cceecaeaaa eacaagcccg accaaaccca agecg 45 <210> 15 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido <400> 15 aaacccgggt tccccaccce aeaceeaaaa agtg 34 <210> 16 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleotido <400> 16 aaaagaaeec gecgaceacg' aeacaaacee aacggaeaec gcg 43 <210> 17 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artif icial : 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Claims (27)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un fragmento de ADN, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEQ ID No. 6 o un fragmento de esta secuencia, que codifica para un epítope, péptido o polipéptido que conserva sustancialmente la actividad inmunogénica de la proteína codificada por la secuencia completa.

2. El fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEQ ID No. 6 y los elementos de regulación de su transcripción.

3. Un fragmento de ácido nucleico, caracterizado porque codifica para la proteína de cápside representada en la SEQ ID No. 7 o un fragmento inmunológicamente activo de esta proteína.

4. Un vector de expresión in vivo o in vi tro, caracterizado porque comprende un fragmento de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector de expresión in vivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es elegido del grupo constituido por los poxvirus, adenovirus y herpesvirus.

6. Un vector de expresión in vivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se trata de un plásmido .

7. Un vector de expresión in vivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque comprende además un fragmento de ADN que incluye toda o parte de la secuencia nucleotídica representada en la SEQ ID No. 4.

8. Un fragmento de ADN, caracterizado porque comprende toda o parte de la secuencia nucleotídica representada por la SEQ ID No. 4, o un fragmento de esta secuencia que codifica para un péptido o polipéptido que conserva sustancialmente la actividad inmunogénica de la proteína codificada por la secuencia completa.

9. Un fragmento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica representada por la SEQ ID No. 4 y los elementos de regulación de su transcripción.

10. Un fragmento de ácido nucleico, caracterizado porque codifica para la proteína de cápside representada en la SEQ ID No. 5 o un fragmento inmunológicamente activo de esta proteína. I I ??l

11. Un vector de expresión in vivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque comprende además un fragmento de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 y 11, caracterizado porque comprende además una secuencia nucleotídica de un inmunógeno, o un fragmento inmunológicamente activo de otro patógeno felino.

13. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el otro patógeno felino es elegido del grupo que consiste del virus de la rinotraqueítis felina (llamado también herpesvirus felino, FHV) , el virus de la leucemia felina (FeLV) , los parvovirus felinos (FPV) , el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV) , el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) , el virus de la rabia, Chlamydia .

14. Una preparación inmunogénica o vacuna contra la calicivirosis felina, caracterizada porque el antígeno es una proteína, un péptido, un polipéptido o un epítope capaz de inducir in vi vo en la especie felina, en particular en el gato, los anticuerpos capaces de seroneutralizar al menos 13 cepas de FCV entre aquellas de un panel constituido de las siguientes 18 cepas de FCV: RMI1, RMI2, RMI3, RMI5, RMI6, RMI7, RMI9, A2 , Fl , Gl , G3 , F3031, H3-2, Hl-4, 431, 388b, 337 y J5, preferentemente al menos 14 de las 18 cepas, y de manera todavía más preferida al menos 15 de las 18 cepas.

15. Una preparación inmunogénica o vacuna contra la calicivirosis felina, caracterizada porque el antígeno es una proteína, un péptido, un polipéptido o un epítope de una cepa FCV reconocida por el anticuerpo monoclonal 44 depositado en la CNCM bajo el número de acceso 1-2282.

16. Una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, caracterizada porque comprende un vector de expresión in vivo en el cual se inserta una secuencia de ADNc tipo FCV que codifica para el antígeno.

17. Una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende un vector de expresión in vivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 y 11, y un vehículo o excipiente aceptable en el plan veterinario, y eventualmente un adyuvante.

18. Una preparación inmunogénica o vacuna contra la calicivirosis felina y contra al menos otro patógeno felino, caracterizada porque comprende un vector de expresión in vivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 y 11 y un vector de expresión in vivo en el cual es insertada una secuencia que codifica para un inmunógeno de otro patógeno felino.

19. Una preparación inmunogénica o vacuna multivalente contra la calicivirosis felina y contra al menos otro patógeno felino, caracterizada porque comprende un vector de expresión in vivo de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, y un vehículo o excipiente aceptable en el plan veterinario, y eventualmente un adyuvante. 20. Una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada porque al menos uno de los vectores de expresión in vivo es un plásmido y porque el adyuvante es un lípido catiónico que contiene una sal de amonio cuaternario de la fórmula:

CH, R,-O-CH?-CH-CH,-N F -F -X OR, CH 3 en la cual Rx es un radical alifático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático, que incluye 2 ó 3 átomos de carbono, y X es un grupo hidroxilo o amino.

21. Una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el adyuvante es el DMRIE, de preferencia acoplado con un lípido neutro, el DOPE para formar el DMRIE-DOPE.

22. Una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada porque al menos uno de los vectores de expresión in vivo es un poxvirus, de preferencia un virus de la viruela del canario (canarypox) y porque el adyuvante es un polímero del ácido acrílico o metacrílico, de preferencia un carbómero .

23. Una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizada porque comprende además un vector plasmídico de expresión in vivo en el cual se inserta el gen que codifica para el GM-CSF felino.

24. Una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende una proteína de cápside de la cepa FCV 431, eventualmente ensamblada bajo la forma de cápsides vacías, esta proteína tiene la secuencia SEQ ID No. 7, o un fragmento o epítope inmunológicamente activo de esta proteína.

25. Una preparación inmunogénica o vacuna de conformidad con la reivindicaciones 14 ó 24, caracterizada porque comprende una proteína de cápside de la cepa FCV Gl , eventualmente ensamblada bajo la forma de cápsides vacías, esta proteína tiene la secuencia SEQ ID No. 5 o un fragmento o epítope inmunológicamente activo de esta proteína. ^^^

26. Una proteína de cápside, caracterizada porque es aislada, purificada o sintética, que tiene la secuencia SEQ ID No. 7.

27. Una proteína de cápside, caracterizada porque es aislada, purificada o sintética, que tiene la secuencia SEQ ID No. 5.