PL203814B1 - Preparat immunostymulujacy wyodrębniony z mikroalg, kompozycja farmaceutyczna i suplement diety zawierające ten preparat, zastosowanie preparatu immunostymulującego oraz sposób otrzymywania tego preparatu z jadalnych mikroalg - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy preparatu immunostymulującego wyodrębnionego z mikroalg zawierającego polisacharydy, a także kompozycji farmaceutycznej i suplementu diety zawierających ten preparat. Ponadto, wynalazek dotyczy zastosowania tego preparatu immunostymulującego do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej lub suplementu diety do wzmacniania funkcji odpornościowej u osobnika wymagaj ą cego takiego leczenia. Wynalazek dotyczy równie ż sposobu otrzymywania tego preparatu z jadalnych mikroalg.

Stan techniki

W cią gu ostatnich trzech dekad immunoterapia pomyś lana jako sposób wpł ywania na odpowiedzi immunologiczne organizmu stała się nowym narzędziem w leczeniu chorób, a także w innych stanach u ludzi. Ma to szczególne znaczenie w stanach chorobowych, w których system immunologiczny jest zagrożony. Badania prowadzone na modelach chorobowych, jak również badania kliniczne wykazały, że wzmacnianie mechanizmów obronnych organizmu pacjenta jest pomocne w leczeniu i profilaktyce infekcji bakteryjnych, niedoboru odporności, raka i zaburzeń autoimmunologicznych (1-5). Kuracje mające na celu podnoszenie odporności mogą również znaleźć zastosowanie w stymulowaniu gojenia się ran. W procesie gojenia się ran główną rolę odgrywają makrofagi poprzez wpływanie na podział komórek i na tworzenie/regenerację nowej tkanki. Działają one również jako fagocyty, czynniki usuwające martwą tkankę oraz produkujące czynniki wzrostu, które wpływają na etap angiogenezy w procesie gojenia ran. (6).

Historycznie pierwszymi opracowanymi immunostymulatorami były produkty bakteryjne (lizaty i frakcje surowe), bakterie osłabione lub zabite termicznie. Należą tu ś rodki takie jak pałeczka Calmette-Guerina (BCG), Corynebacterium parvum i lipopolisacharyd (1,2). Jakkolwiek preparaty te z powodu ich toksyczności i niepożądanych efektów ubocznych nie zyskały szerszego zastosowania, to jednak wiele z nich zostało dopuszczonych przez USDA (Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych) do regulowania odporności w medycynie weterynaryjnej (3). Wychodząc z różnego rodzaju surowców opracowano również wiele innych substancji; należą tu preparaty naturalnego pochodzenia i te wytworzone na drodze syntezy chemicznej, a tak ż e te otrzymane przy wykorzystaniu technologii rekombinacyjnych. W większości substancje immunostymulujące pochodzenia naturalnego są to polisacharydy o wysokiej masie cząsteczkowej, glikoproteiny lub złożone peptydy (1). Na przykład, trzy grzybowe polisacharydy pochodzące z Schizophyllum commune (schizofylan), Lentinus edodes (lentinan) i Coriolus versicolor (krestin) znalazły obecnie kliniczne zastosowanie w Japonii jako czynniki modyfikujące odpowiedź biologiczną (4). Inny polisacharyd, acemannan (wyizolowany z Aloe vera) został dopuszczony przez Departament Weterynarii Stanów Zjednoczonych do leczenia włókniakomięsaków u psów i kotów (7). Istnieje kilka immunostymulatorów o niskiej masie cząsteczkowej pochodzących z produktów naturalnych jak na przykład glikosfingolipid KRN-7000. Badania kliniczne nad zastosowaniem KRN-7000 jako immunostymulatora do leczenia twardych guzów są obecnie w toku (8). Opracowano również kilka immunostymulatorów pochodzenia syntetycznego. Należą tu isoprynozyna i peptydy muramylowe (2). Ostatnio FDA (Federalny Urząd do Spraw Leków i Żywności) dopuścił do stosowania szereg innych immunomodulatorów pochodzenia endogennego, opracowanych przy zastosowaniu technologii rekombinacyjnych. Należą tu czynniki stymulujące tworzenie kolonii, interferony i rekombinacyjne białka (5). Jednakże związki te często charakteryzują się krótkimi czasami półtrwania i stąd trudno jest ustalić optymalne dawkowanie i odpowiednie kombinacje.

Jakkolwiek znane obecnie immunostymulatory wydają się być obiecujące, to jednak wciąż istnieje potrzeba opracowania silniejszych środków i tym samym zwiększenia arsenału leków dostępnych w immunoterapii. Jednym ze źródeł różnorodnych chemicznie związków, które może posłużyć do odkrycia nowych leków immunostymulujących są surowce naturalne. Od wieków produkty naturalne były wykorzystywane jako środki użyteczne w lecznictwie; wiele z nich znajduje kliniczne zastosowanie także obecnie. Wykorzystywanie produktów naturalnych do poszukiwania nowych leków wynika z ich niespotykanej różnorodności chemicznej, jak również z szerokiego spektrum ich aktywności biologicznej (9).

Od czasów starożytnych mikroalgi wykorzystywano jako źródło bogatego w składniki odżywcze pożywienia. Zapisy historyczne wskazują, że mikroalgi takie jak Spirulina platensis były spożywane przez plemiona zamieszkujące tereny nad Jeziorem Czad w Afryce i przez Azteków znad Jeziora

Texcoco w Meksyku (10). W ciągu kilku ostatnich dziesięcioleci wzrastało zainteresowanie produkcją jadalnych mikroalg na skalę przemysłową do celów spożywczych dla ludności, jak również na karmę

PL 203 814 B1 dla żywego inwentarza. Spośród wielu mikroalg przebadanych pod kątem ich przydatności dla celów handlowych trzema głównymi rodzajami, które są z powodzeniem hodowane i znalazły szerokie zastosowanie są Spirulina sp., Chlorella sp. i Aphanizomenon flos-aquae (AFA).

Zarówno doniesienia nieudokumentowane jak i najświeższe badania naukowe wskazują na związane ze spożywaniem jadalnych mikroalg wzmocnienie mechanizmów odpornościowych u zwierząt i ludzi. U myszy zakażonych Listeria monocytogenes doustne podawanie Chlorella pyrenoidosa wiąże się ze zwiększeniem naturalnej aktywności komórek uśmiercających (11) i zwiększeniem ilości komórek prekursorowych makrofagów (12). Spożywanie Spirulina platensis zwiększa aktywność fagocytarną makrofagów u kurcząt (13), a Spirulina fusiformis wykazuje efekt chemoprewencyjny u ludzi (14). Istnieją doniesienia, że spożywanie przez ludzi AFA wywołuje zmiany w przemieszczaniu się komórek odpornościowych i zwiększa gotowość immunologiczną (15). Decydujące o wszystkich tych efektach składniki aktywne nie zostały jak dotąd ostatecznie ustalone.

Z mikroalg bę dących przedmiotem niniejszych badań wyizolowano wiele różnych związków chemicznych. Dla wielu polisacharydów i glikoprotein wyizolowanych z gatunków Chlorella i Spirulina stwierdzono aktywność przeciwnowotworową, przeciwwirusową i immunostymulującą. W przeciwieństwie do tych gatunków, z AFA nie wyizolowano żadnych tego typu związków, które wykazywałyby jakąkolwiek aktywność biologiczną.

Z gatunku Chlorella wyizolowano i zidentyfikowano wiele polisacharydów posiadają cych aktywność biologiczną. W opisie patentowym USA nr 4 533 548 ujawniono wyizolowany z Chlorella pyrenoidosa polisacharyd o charakterze kwasowym wykazujący aktywność przeciwnowotworową i przeciwwirusową (16). Głównym glikozylowym składnikiem tego polisacharydu była ramnoza z niewielkimi domieszkami galaktozy, arabinozy, glukozy i kwasu glukuronowego. W opisie patentowym USA nr 4 831 020 ujawniono, że inny polisacharyd wyizolowany z morskiej Chlorella minutissima wykazuje działanie hamujące wzrost nowotworu. Nie podano jednakże ani masy cząsteczkowej tego polisacharydu, ani też jego kompozycji glikozylowej (17).

Z opisu patentowego USA nr 4 786 496 wiadomo, ż e lipidowa frakcja (część glikolipidowa) z morskiego gatunku Chlorella wykazała własności przeciwnowotworowe (18). Z gatunku Chlorella wyizolowano również kilka glikoprotein. I tak na przykład z opisu patentowego USA nr 4 822 612 wiadomo, że glikoproteina o masie cząsteczkowej 45000 g/mol wykazuje działanie przeciwnowotworowe (19). Z literatury naukowej znane są różne inne glikoproteiny (20-23) i gliceroglikolipidy (24), które mogą wykazywać działanie wzmacniające odporność i przeciwnowotworowe. Żaden z tych związków jednak nie jest polisacharydem.

Z gatunku Spirulina wyizolowano kilka różnego typu polisacharydów wykazujących aktywność biologiczną. Na przykład zawierający siarkę polisacharydowy spirulan wapnia hamuje rozprzestrzenianie się nowotworu i powstawanie przerzutów (25). Spirulan wapniowy (masa cząsteczkowa 74 600 g/mol) składa się z ramnozy (52,3%), 3-O-metyloramnozy (32,5%), 2,3-di-O-metyloramnozy (4,4%), 3-O-metyloksylozy (4,8%), kwasów uronowych (16,5%) i siarczanu (26).

W opisie patentowym USA nr 5 585 365 ujawniono, ż e z gatunku Spirulina wyizolowano na drodze ekstrakcji gorącą wodą polisacharyd o własnościach przeciwwirusowych mający masę cząsteczkową od 250 000 do 300 000 g/mol (27). Polisacharyd ten składa się z ramnozy, glukozy, fruktozy, rybozy, galaktozy, ksylozy, mannozy i kwasów glukuronowego i galakturonowego. Ostatnio z gatunku Spirulina wyizolowano szereg innych niskocząsteczkowych polisacharydów o masie cząsteczkowej od 12 600 do 60 000 g/mol (28-30).

Jednym ze sposobów oznaczenia aktywności immunostymulującej jest zastosowanie testu biologicznego wykorzystującego makrofagi. Monocyty/makrofagi znajdują się praktycznie we wszystkich tkankach odgrywając decydującą rolę w koordynowaniu odpowiedzi immunologicznych i w wielu procesach biologicznych (31). Grają więc główną rolę w fagocytozie, utrzymywaniu gotowości immunologicznej, gojeniu ran, niszczeniu drobnoustrojów i komórek guzów i rozpoznawaniu antygenów przez limfocyty T (32). W raku makrofagi ograniczają cytotoksyczne działanie guza poprzez produkcję cytokin i innych czynników decydujących o odporności (33). Ażeby makrofagi mogły odgrywać decydującą rolę w odporności adaptacyjnej i wrodzonej muszą skutecznie reagować na czynniki otoczenia ulegając szybkiej aktywacji (34). W aktywacji makrofagów pośredniczą czynniki transkrypcji prozapalnej takie jak jądrowy czynnik kappa B (NF-kappa B). Takie czynniki transkrypcji regulują następnie i dopasowują odpowiednio aktywację/tłumienie zestawu genów, które pośredniczą w wielu różnych odpowiedziach immunologicznych.

PL 203 814 B1

W niestymulowanych makrofagach NF-kappa B wystę pują jako nieaktywne heterodimery niszczone przez białka hamujące kappa B (I-kappa B) w obrębie cytosolu. Czynniki które powodują dysocjację i degradację białek I-kappa B pozwalają na przemieszczenie dimerów NF-kappa B do jądra, gdzie mogą one aktywować transkrypcję genów typu downstream (35). Do docelowych genów regulowanych przez NF-kappa B należą prozapalne cytokiny, chemokiny, enzymy zapalne, cząsteczki adhezji i receptory (36). W wynalazku niniejszym do sterowania ekstrakcją, izolacją do charakteryzowania i opracowania polisacharydowych preparatów immunostymulujących otrzymywanych z jadalnych mikroalg zastosowano test na NF-kappa B w ludzkich monocytach oparty na czynniku transkrypcyjnym. W odróżnieniu od prawie wszystkich dostępnych obecnie polisacharydów, polisacharydy według niniejszego wynalazku są rozpuszczalne zarówno w wodzie jak i w roztworze wodnym etanolu.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest preparat immunostymulujący wyodrębniony z mikroalg zawierający polisacharydy ekstrahowalne za pomocą rozpuszczalnika zawierającego wodę lub mieszaninę wody i co najmniej jednego alkoholu, zawierającego od 1 do 4 atomów węgla, cechujący się tym, ż e wspomniane aktywne polisacharydy mają masę cząsteczkową wynoszącą powyżej 2 milionów g/mol i obejmują składniki glikozylowe wybrane spośród mannozy, glukozy, ramnozy, galaktozy, fukozy, cukrów metylowanych, N-acetylowanych aminocukrów, arabinozy lub kwasu glukuronowego.

W korzystnym wariancie realizacji preparatu immunostymulują cego wedł ug wynalazku aktywność immunostymulująca wyraża się przez aktywację monocytów/makrofagów. W innym korzystnym wariancie realizacji preparatu immunostymulującego według wynalazku mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji preparatu immunostymulującego według wynalazku mikroalgi należą do gatunku Chlorella pyrenoidosa. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji preparatu immunostymulującego według wynalazku mikroalgi należą do gatunku Spirulina platensis. W następnym korzystnym wariancie realizacji preparatu immunostymulującego według wynalazku składniki glikozylowe aktywnych polisacharydów obejmują - w przypadku wykorzystania mikroalg należących do gatunku Aphanizomenon flos-aquae - mannozę, glukozę, ramnozę, galaktozę, fukozę, cukry metylowane i N-acetylowane aminocukry, w przypadku wykorzystania mikroalg należących do gatunku Chlorella pyrenoidosa - arabinozę, galaktozę, ramnozę, glukozę i cukry metylowane, a przypadku wykorzystania mikroalg należących do gatunku Spirulina platensis - ramnozę, kwas glukuronowy, fukozę, galaktozę i cukry metylowane.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca preparaty immunostymulujące według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest suplement diety zawierający preparaty immunostymulujące według wynalazku i nośnik lub zaróbkę, które są dopuszczalne w suplementach diety.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie preparatu immunostymulującego według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do wzmacniania funkcji odpornościowej u osobnika wymagaj ą cego takiego leczenia. W poszczególnych wariantach tego zastosowania wspomniany osobnik cierpi na infekcję wirusową, bakteryjną lub grzybową, na raka lub niedobór odporności, przy czym osobnikiem jest człowiek albo zwierzę.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie preparatu immunostymulującego według wynalazku do wytwarzania suplementu diety do wzmacniania funkcji odpornościowej u osobnika wymagającego takiego leczenia. W poszczególnych wariantach tego zastosowania wspomniany osobnik cierpi na infekcję wirusową, bakteryjną lub grzybową, na raka lub niedobór odporności, przy czym osobnikiem jest człowiek albo zwierzę.

W zastosowaniach wedł ug wynalazku wzbudzenie funkcji odpornoś ciowej wyraż a się poprzez stymulację aktywności monocytów/makrofagów u osobnika wymagającego takiego leczenia. W szczególnie korzystnym przypadku stymulacja aktywności monocytów/makrofagów przyspiesza gojenie się ran. W innym szczególnie korzystnym przypadku stymulacja aktywności monocytów/makrofagów jest zwiększona w odniesieniu do raka. W jeszcze innym szczególnie korzystnym przypadku stymulacja aktywności monocytów/makrofagów jest zwiększona w odniesieniu do niedoboru odporności. W kolejnym szczególnie korzystnym przypadku stymulacja aktywności monocytów/makrofagów jest zwiększona w odniesieniu do infekcji wirusowej, bakteryjnej lub grzybowej.

W kolejnych korzystnych wariantach zastosowań według wynalazku mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae, Chlorella pyrenoidosa albo Spirulina platensis.

PL 203 814 B1

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania preparatu z jadalnych mikroalg charakteryzujący się tym, że preparat z jadalnych mikroalg wzbogacony w immunostymulujące polisacharydy według wynalazku otrzymuje się w następujących etapach:

(a) wytwarza się ekstrakt przez ekstrakcję mikroalg przy użyciu rozpuszczalnika zawierającego wodę lub mieszaninę wody i co najmniej jednego alkoholu zawierającego od 1 do 4 atomów węgla, a temperatura prowadzenia ekstrakcji mieści się w zakresie od 4°C do 100°C;

(b) opcjonalnie zatęża się ekstrakt;

(c) wytrąca się preparat polisacharydowy z ekstraktu za pomocą środków służący do wytrącania;

(d) oddziela się wytrącony preparat polisacharydowy za pomocą środków służących do oddzielania; i (e) przemywa się osad z etapu (d) przy użyciu 95%-owego etanolu.

W korzystnych wariantach sposobu według wynalazku alkoholem stosowanym do ekstrakcji jest etanol, metanol, izopropanol lub propanol. W innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku stężenie alkoholu w etapie (a) wynosi korzystnie od 20% do 80%. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku temperatura ekstrakcji wynosi od 40°C do 80°C. W następnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae, Chlorella pyrenoidosa albo Spirulina platensis. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez odparowanie rozpuszczalnika, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem, przez liofilizację albo przez dializę. W dalszym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez dodanie etanolu do uzyskania końcowego stężenia 80% etanolu. W innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez schłodzenie ekstraktu. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez dodanie soli, w szczególności - siarczanu amonu. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku wytrącony preparat polisacharydowy oddziela się w etapie (d) przez odsączenie albo przez odwirowanie. W następnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku wytrącony preparat polisacharydowy przemywa się w etapie (e) przy użyciu 95%-owego etanolu. W innym korzystnym wariancie realizacji sposób według wynalazku obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytrąconego osadu przez rozpuszczenie go w wodzie i usunięcie przez ultrafiltrację zasadniczo wszystkich składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 100000 g/mol.

W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji sposób według wynalazku obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytrąconego osadu przez rozpuszczenie go w wodzie i usunięcie zasadniczo wszystkich składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 2 miliony g/mol przez kolumnową chromatografię wielkościowo wykluczającą (SEC).

Z Aphanizomenon flos-aquae (AFA), Chlorella pyrenoidosa i Spirulina platensis wyizolowano nowe, rozpuszczalne w wodzie preparaty polisacharydowe mające zdolność immunostymulowania makrofagów, zawierające aktywne polisacharydy o względnych masach cząsteczkowych powyżej 2 milionów g/mol. Omawiane preparaty polisacharydowe co najmniej tysiąc razy silniej aktywują monocyty niż preparaty polisacharydowe stosowane obecnie w klinikach w immunoterapii u pacjentów z nowotworami.

Krótki opis figur rysunku

Fig. 1 Chromatogram dla preparatu polisacharydowego NP 16847 (przykład 1), wykonany techniką wielkościowo wykluczającej HPLC; wstrzyknięcie 75 μL przy 500 μg/mL.

Fig. 2 Chromatogram dla preparatu polisacharydowego NP 16848 (przykład 2), wykonany techniką wielkościowo wykluczającej HPLC; wstrzyknięcie 200 μL przy 125 μg/mL

Fig. 3 Chromatogram dla preparatu polisacharydowego NP 16846 (przykład 3), wykonany techniką wielkościowo wykluczającej HPLC; wstrzyknięcie 200 μL przy 35 μg/mL

Fig. 4 Polisacharydowe preparaty NP 16847, NP16848 i NP 16846 wyizolowane z mikroalg zwiększają produkcję prozapalnego mRNA cytokin. Wyniki RT-PCR dla mRNA IL-1 β, mRNA TNF-α i mRNA GAPDH w komórkach THP-1 po 2 godzinach: kontrola (Ctl), bakteryjny LPS przy 10 μg/mL, (1) preparat polisacharydowy NP16847 (Przykład 1) przy 0,5 μg/mL, (2) preparat polisacharydowy NP 16846 (przykład 3) przy 0,5 μmg/mL i (3) preparat polisacharydowy NP 16848 (przykład 2) przy 0,5 μg/mL; bp oznacza pary zasad.

Fig. 5 Schemat blokowy przedstawiający kolejność operacji przy prowadzeniu ekstrakcji gorącą wodą w temperaturze 40°C i kolejnego wytrącania 70% etanolem w celu usunięcia materiału zawierającego fikocyjaninę (przykład 4)

PL 203 814 B1

Fig. 6 Schemat blokowy przedstawiający kolejność operacji przy prowadzeniu ekstrakcji gorącą wodą w temperaturze 40°C i kolejnego wytrącania siarczanem amonu w celu usunięcia materiału zawierającego fikocyjaninę (przykład 5)

Fig. 7 Schemat blokowy przedstawiający kolejność operacji przy prowadzeniu ekstrakcji gorącą wodą w temperaturze 70°C (przykład 6)

Fig. 8 Schemat blokowy przedstawiający kolejność operacji przy prowadzeniu ekstrakcji 70% etanolem w temperaturze 40°C, z pominięciem operacji rozpuszczania w mieszaninie butanolu z wodą (przykład 7)

Fig. 9 Schemat blokowy przedstawiający kolejność operacji przy prowadzeniu ekstrakcji 70% etanolem w temperaturze 40°C i kolejnego bezpośredniego wytrącania etanolem (przykład 8)

Fig. 10 Schemat blokowy przedstawiający kolejność operacji przy prowadzeniu ekstrakcji 70% etanolem w temperaturze 40°C i kolejnego bezpośredniego wytrącania 80% etanolem (przykład 9)

Fig. 11. Analiza metodą wielkościowo wykluczającej HPLC przeprowadzona dla preparatów NP 16847 przed i po ultrafiltracji otrzymanych przy zastosowaniu optymalnych warunków ekstrakcji, czyli 50% etanolu w temperaturze 60°C (przykład 24).

Szczegółowy opis wynalazku

Do kontrolowania procesu oczyszczania immunostymulujących polisacharydów, oraz do optymalizacji procesu ich ekstrakcji zastosowano test biologiczny na aktywację NF-kappa B w THP-1 ludzkich monocytach/makrofagach na bazie czynnika transkrypcji. Test ten mierzy aktywność immunostymulującą przejawiającą się zwiększoną ekspresją kierowanego przez NF-kappa B reportera lucyferazy. Ludzkie monocyty THP-1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) hodowano w podłożu RPMI 1640 z dodatkiem surowicy z płodów cielęcych (10% v/v FBS) i amikacyny (60 mg/L) w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2. Wzrastające aktywnie komórki poddawano przejściowo transfekcji stosując DEAE-dekstran (10 μg/1x10⁶ komórek) i plazmid reporterowy pBIIXLUC (10 μg/1x10⁶ komórek). Plazmid ten podarowany przez dr Riccardo Dalla-Favera zawiera dwie kopie fragmentu NF-kappa B z HPIV/IgK (37). Roztwór po transfekcji zawierający komórki THP-1 inkubowano w ciągu 7 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Następnie transfekowane komórki zawieszono ponownie w podłożu RPMI 1640 zawierającym 10% FBS i przeniesiono na 96-studzienkowe płytki nanosząc 2x10⁵ komórek do każdej studzienki. Po 24 godzinach do transfekowanych komórek dodano ekstrakty z mikroalg, frakcje i preparaty polisacharydowe. Po upływie 4 godzin od dodania próbek komórki zebrano i zmierzono aktywność lucyferazy. Komórki zebrano przy użyciu filtrów płytkowych Packard'a i poddawano lizie za pomocą 30 μL mieszaniny zawierającej lucyferazę (1:1, lucyferaza : LucLite™ 1xPBS, 1 mM Ca i Mg). Zestaw testowy zawierający gen reporterowy lucyferazy LucLite™ dostarczyła firma Packard (Downers Grove, IL). Emisję światła mierzono stosując mikropłytkowy licznik scyntylacyjny Packard'a w systemie pojedynczego fotonu. Aktywację przedstawiono procentowo w stosunku do maksymalnej aktywacji NF-kappa B przez 10 μg/mL LPS (E. coli, serotyp 026:B6, Sigma Chemical Co. St.Louis, MO), którą użyto jako kontrolę dodatnią.

Analizę składu glikozylowego i wiązań glikozydowych wykonał The University of Georgia, Complex Carbohydrate Research Center. Skład glikozylowy oznaczano stosując chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią masową na TMS-metyloglikozydach. W celu identyfikacji O-metylowanych cukrów wykrytych w analizie TMS-metyloglikozydów, skład glikozylowy oznaczano również stosując metodę z octanem alditolu (38). Analizę wiązań glikozydowych przeprowadzono stosując metodę Hakamori (39) w połączeniu z redukcją grupy karboksylowej w celu wykrycia połączeń z kwasem uranowym (40).

P r z y k ł a d 1 - Wstępne wyodrębnianie preparatu polisacharydowego o wysokiej masie cząsteczkowej z AFA (NP. 16847), wykazującego silną zdolność aktywacji monocytów

Surowy ekstrakt z AFA (Próbka nr 0110FA z Cell Tech, Klamath Falls, OR), otrzymano przeprowadzając trzykrotną (po 4 godziny każda) ekstrakcję materiału liofilizowanego (125 g), przy użyciu 70% etanolu w temperaturze 40°C. Ten surowy ekstrakt wykazywał wartość EC₅₀ 10 μg/mL. Wodnoetanolowe ekstrakty odparowano do sucha i następnie rozpuszczono w mieszaninie wody i chloroformu (1:1). Aktywność stwierdzono jedynie w warstwie wodnej; do warstwy tej dodano n-butanol (proporcja woda : n-butanol, 63:37) i po wytrząśnięciu i rozdzieleniu aktywniejszą warstwę wodną (EC₅₀=0,5 μg/mL) poddano wytrąceniu alkoholami (proporcja woda : metanol : etanol, 1:2:3) w temperaturze -80°C w ciągu 24 godzin. Wytrącony materiał określany jako preparat przed ultrafiltracją o wartości EC₅₀ 0,2 μg/mL stanowił około 3% masy wyjściowego suchego AFA. Materiał ten przepuszczono następnie przez urządzenie do ultrafiltracji z błoną z polieterosulfonu oddzielającą cząPL 203 814 B1 steczki o masie do 100 000 (Centricon Plus-20 pochodzący z firmy Millipore, Bedford, MA). Zatrzymany materiał przemyto następnie kilkakrotnie 3% (w/v) roztworem KCl w celu usunięcia zanieczyszczeń, które przelgnęły (prawdopodobnie w wyniku oddziaływań jonowych) do wielkocząsteczkowego materiału. Zatrzymana substancja określana jako materiał po ultrafiltracji wykazywała wartość EC50

0,1 μg/mL i stanowiła 0,6% masy wyjściowego AFA.

Zawartość węglowodanów w preparacie NP 16847 po ultrafiltracji oznaczona kolorymetrycznie (41) z zastosowaniem fenolu i kwasu siarkowego przy 450 nm i 490 nm wynosiła od 90% do 100%. Na tej podstawie uznano, że jest to preparat polisacharydowy. Analiza elementarna wykonana przez Galbraith Laboratories, Inc. (Knoxville, TN) wykazała, że materiał ten zawiera 49,1% węgla, 40,8% tlenu, 7,62% wodoru, 2,46% azotu i śladową ilość siarki. Skład glikozylowy i analizę wiązań materiału po ultrafiltracji przedstawiono poniżej w Tabeli 1.

T a b e l a 1. Skład glikozylowy i analiza wiązań glikozydowych dla preparatu polisacharydowego NP 16847 wyizolowanego z mikroalgi AFA sposobem ekstrakcji opisanym w Przykładzie 1. Dane uzyskane w jednym przykładzie.

Reszta glikozylowa	% molowy	Wiązanie glikozydowe	% powierzchni całkowitej
Mannoza	16,0	2-Mannoza/3-Mannoza	13,4
Glukoza	13,1	4-Ramnoza/T-Mannoza	10,6
4-Me-Mannoza	11,2	2-Ramnoza	7,6
Ramnoza	10,3	T-Ramnoza	7,5
2-Me-Ramnoza	8,1	3-Ramnoza	6,9
Galaktoza	8,0	2-Glukoza	5,3
Fukoza	7,0	2-Galaktoza	4,8
N-Acetylogalktozamina Galactosamine	7,0	2-Fukoza	4,7
N-Acetyloglukozamina	5,8	3,4-Fukoza	4,5
Ksyloza	4,8	4-Glukoza	4,4
2-Me-Fukoza	3,1	3-Ksyloza	4,4
3-Me-Galaktoza	2,6	4-Fukoza/T-Galaktoza	4,3
3-Me-Arabinoza	1,8	T-Ksyloza	3,2
Arabinoza	1,6	niezidentyfikowane	2,7
2,3-diMe-Arabinoza	1,2	T-Fukoza	2,5
		4-Mannoza	2,2
		2-Arabinoza (piranoza)	2,1
		4-Galaktoza	2,1
		2,3,6-Galaktoza	2,1
		3-Galaktoza	1,4
		3,5-Arabinoza(f)/3,4-Arabinoza(p)	1,3
		2,6-Glukoza	1,2
		6-Mannoza	0,6

Uwaga: Wszystkie grupy metylowe oznaczone są jako „Me”. Wszystkie wiązania glikozydowe są również przyłączone w pozycji 1 chyba, że zaznaczono inaczej. Skróty glikozyli mają następujące znaczenia: „T” dla wiązania końcowego, „f” dla furanozy i „p” dla piranozy. Obecność dwóch jednostek glikozylowych wskazuje na jednoczesną elucję składników podczas analizy.

PL 203 814 B1

NP16847 składa się głównie z mannozy, ramnozy i metylowanych reszt cukrowych z dodatkiem innych prostych cukrów i zacetylowanych aminocukrów. Jest to pierwsze doniesienie o jakimkolwiek polisacharydzie wykazującym jakąś aktywność biologiczną wyizolowanym z AFA.

NP16847 po ultrafiltracji analizowano stosując chromatografię wykluczającą cząstki o określonej wielkości (chromatografia wielkościowo wykluczająca - SEC). Zestaw składał się z kontrolera układowego Model 600E, wtryskiwacza UK6, układu doprowadzania rozpuszczalnika Model 600, refraktometru różnicowego Model 401 i integratora Model 3396A firmy Hewlett-Packard. Analizy przeprowadzano przy szybkości przepływu 1 mL/minutę stosując wodę do HPLC i kolumnę Shodex Ohpak KB-805 SEC (długość 300 mm, średnica wewnętrzna 8 mm) utrzymywaną w temperaturze 30°C. Kolumna ta ma zdolność rozdzielania cząsteczek o masie do 4 milionów daltonów. Analiza NP16847 po ultrafiltracji wykazała w eluacie z kolumny obecność jednego piku (Fig. 1) o czasie retencji odpowiadającym względnej masie cząsteczkowej ponad 2 miliony g/mol oznaczonej przy zastosowaniu porównawczych wzorców dekstranowych.

Opisany w przykładzie 1 sposób wyodrębniania mający na celu oczyszczanie polisacharydów otrzymanych z AFA jest nowy, ponieważ do wstępnej ekstrakcji stosuje się w nim 70% etanol, podczas gdy w dotychczas stosowanych procedurach ekstrakcję prowadzono gorącą wodą. W celu ustalenia, czy opisany w przykładzie 1 sposób może stać się standardową techniką ekstrakcji immunostmulujących polisacharydów z jadalnych mikroglonów, zastosowano go do dwóch innych stosowanych jako uzupełnienie żywienia mikroglonów tj. do Chlorella pyrenoidosa i Spirulina platensis.

P r z y k ł a d 2 - Wstę pne wyodrę bnianie preparatu polisacharydowego o wysokiej masie czą steczkowej z Chlorella pyrenoidosa (NP 16848), wykazującego silną zdolność aktywacji monocytów

Surowy ekstrakt z Chlorella (Próbka nr VP0978 pochodząca z Sun Chlorella Torrence, CA), otrzymano przeprowadzając trzykrotną (po 4 godziny każda) ekstrakcję materiału liofilizowanego (35 g) przy użyciu 70% etanolu w temperaturze 40°C. Ten surowy ekstrakt wykazywał wartość EC50 μg/mL. Wodno-etanolowe ekstrakty odparowano do sucha i następnie rozpuszczono w mieszaninie wody i chloroformu (1:1). Aktywność stwierdzono jedynie w warstwie wodnej; do warstwy tej dodano n-butanol (proporcja woda : n-butanol, 63:37) i po wytrząśnięciu i rozdzieleniu aktywniejszą warstwę wodną poddano wytrąceniu alkoholami (proporcja woda : metanol : etanol, 1:2:3) w temperaturze -80°C w ciągu 24 godzin. Wytrącony materiał przepuszczono następnie przez urządzenie do ultrafiltracji z błoną z polieterosulfonu oddzielającą cząsteczki o masie 100 000 (Centricon Plus-20 pochodzący z firmy Millipore, Bedford, MA). Zatrzymaną substancję przemyto następnie kilkakrotnie 3% (w/v) roztworem KCl w celu usunięcia zanieczyszczeń, które przelgnęły (prawdopodobnie w wyniku oddziaływań jonowych) do wielkocząsteczkowego materiału. Produkt po ultrafiltracji wykazywał wartość EC₅₀ 0,3 μg/mL i stanowił 0,2% masy substancji wyjściowej.

Zawartość węglowodanów w preparacie NP 16848 po ultrafiltracji oznaczona kolorymetrycznie (41) z zastosowaniem fenolu i kwasu siarkowego przy 450 nm i 490 nm wynosiła od 90% do 100%. Na tej podstawie uznano, że jest to preparat polisacharydowy. Skład glikozylowy i analizę wiązań materiału po ultrafiltracji przedstawiono poniżej w Tabeli 2.

T a b e l a 2. Skład glikozylowy i analiza wiązań glikozydowych dla preparatu polisacharydowego NP 16848 wyizolowanego z mikroalgi Chlorella pyrenoidosa sposobem ekstrakcji opisanym w Przykładzie 2.

Dane uzyskane w jednym przykładzie.

Reszta glikozylowa	% molowy	Wiązanie glikozydowe	% powierzchni całkowitej
1	2	3	4
Arabinoza	31,6	T-Galaktoza (furanoza)	12,2
Galaktoza	26,8	2-Glukoza	9,2
Ramnoza	12,4	6-Galaktoza (piranoza)	8,6
Glukoza	5,4	2,3-Ramnoza	8,4
3-Me-Arabinoza	3,0	T-Glukoza	5,9
3-Me-Mannoza	2,5	T-Arabinoza(furanoza)	5,5
Ksyloza	2,4	2-Arabinoza (furanoza)	5,4

PL 203 814 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4
4-Me-Arabinoza	2,4	3,6-Galaktoza	5,1
Mannoza	2,3	2,3,6-Galaktoza	4,9
Ryboza	1,9	T-Mannoza/3-Ram/4-Ram	3,7
2,4-diMe-Arabinoza	1,3	2,3-Arabinoza (furanoza)	3,3
3-Me-Galaktoza	1,2	T-Arabinoza (piranoza)	2,8
3-Me-Ksyloza	0,9	6-Galaktoza (furanoza)	2,6
3-Me-Ramnoza	0,9	3-Heksoza (furanoza)	2,4
3,5-diMe-Heksoza	0,9	3-Galaktoza	2,3
6-Me-Galaktoza	0,7	2-pento(furanoza)	2,1
Glicerol	0,5	4-Glukoza/2,4-Ara(p)/2,5-Ara(f)	2,1
Kwas 2-keto-3 dezoksyoktulosonowy	0,5	T-Ksyloza (piranoza)	1,8
2,3,6-triMe-Mannoza	0,4	4,6-Galaktoza	1,9
3,6-diMe-Mannoza	0,4	4-Galaktoza	1,9
2,3-diMe-Mannoza	0,4	3,4-Galaktoza	1,7
2-Me-Galaktoza	0,4	T-Galaktoza (piranoza)	1,4
N-Acetylogalaktozamina	0,3	3-pentoza (furanoza)	1,3
N-Acetyloglukozamina	0,3	3,4-Ramnoza	1,1
aminocukier	0,3	2-Mannoza/3-Mannoza	1,1
		3-Arabinoza (furanoza)	1,0
		2,6-Glukoza	0,5

Uwaga: Wszystkie grupy metylowe oznaczone są jako „Me”. Wszystkie wiązania glikozydowe są również przyłączone w pozycji 1, chyba że zaznaczono inaczej. Skróty glikozyli mają następujące znaczenia: „Ram” dla ramnozy, „Ara” dla arabinozy, „T” dla wiązania końcowego, „f” dla furanozy i „p” dla piranozy. Obecność dwóch, lub trzech jednostek glikozylowych wskazuje na jednoczesną elucję składników podczas analizy.

NP 16848 składa się głównie z arabinozy, galaktozy, ramnozy i metylowanych reszt cukrowych z dodatkiem innych prostych cukrów i zacetylowanych aminocukrów. Jakkolwiek istnieją w literaturze doniesienia na temat innych immunostymulujących polisacharydów i rozpuszczalnych w wodzie preparatów wyizolowanych z gatunku Chlorella to jednak NP16848 jest kompozycją nową.

Analiza NP 16848 po ultrafiltracji przeprowadzona metodą wielkościowo wykluczającej HPLC opisaną w przykładzie 1 wykazała w eluacie z kolumny obecność jednego piku (Fig. 2) o czasie retencji odpowiadającym względnej masie cząsteczkowej ponad 2 miliony daltonów oznaczonej przy zastosowaniu porównawczych wzorców dekstranowych.

P r z y k ł a d 3 - Wstę pne wyodrę bnianie preparatu polisacharydowego o wysokiej masie czą steczkowej ze Spirulina platensis (NP 16846), wykazującego silną zdolność aktywacji monocytów

Surowy ekstrakt ze Spirulina (Próbka nr B16933 pochodząca z Triarco Industries, Wayne, NJ), otrzymano przeprowadzając trzykrotną (po 4 godziny każda) ekstrakcję materiału liofilizowanego (35 g) przy użyciu 70% etanolu w temperaturze 40°C. Ten surowy ekstrakt wykazywał wartość EC50 μg/mL. Wodno-etanolowe ekstrakty odparowano do sucha i następnie rozpuszczono w mieszaninie wody i chloroformu (1:1). Aktywność stwierdzono jedynie w warstwie wodnej; do warstwy tej dodano n-butanol (proporcja woda : n-butanol, 63:37) i po wytrząśnięciu i rozdzieleniu aktywniejszą warstwę wodną poddano wytrąceniu alkoholami (proporcja woda : metanol : etanol, 1:2:3) w temperaturze -80°C w ciągu 24 godzin. Wytrącony materiał przepuszczono następnie przez urządzenie do ultrafiltracji z błoną z polieterosulfonu oddzielającą cząsteczki o masie 100 000 (Centricon Plus-20 pocho10

PL 203 814 B1 dzący z firmy Millipore, Bedford, MA). Zatrzymaną substancję przemyto następnie kilkakrotnie 3% (w/v) roztworem KCl w celu usunięcia zanieczyszczeń, które przelgnęły (prawdopodobnie w wyniku oddziaływań jonowych) do wielkocząsteczkowego materiału. Produkt po ultrafiltracji wykazywał wartość EC₅₀ 0,3 μg/mL i stanowił 0,1% masy substancji wyjściowej.

Zawartość węglowodanów w preparacie Spirulina po ultrafiltracji oznaczona kolorymetrycznie (41) z zastosowaniem fenolu i kwasu siarkowego przy 450 nm i 490 nm wynosiła od 90% do 100%.

Na tej podstawie uznano, że jest to preparat polisacharydowy. Skład glikozylowy i analizę wiązań ma teriału po ultrafiltracji przedstawiono poniżej w Tabeli 3.
T a b e l a 3. Skład glikozylowy i analiza wiązań glikozydowych dla preparatu polisacharydowego NP 16846 wyizolowanego z mikroglonu Spirulina platensis sposobem ekstrakcji opisanym w Przykładzie 3. Dane uzyskane w jednym przykładzie.
Reszta glikozylowa	% molowy	Wiązanie glikozydowe	% powierzchni całkowitej
Ramnoza	35,4	3-Ramnoza/T-kwas glukuronowy	25,8
Kwas glukuronowy	9,7	4-Galaktoza	7,8
Fukoza	7,7	4-Kwas glukuronowy	7,3
Galaktoza	7,1	3,4-Kwas glukuronowy	6,9
2-Me-Ramnoza	5,9	2-Ramnoza	5,7
Ksyloza	5,5	3-Fukoza	5,1
3-Me-Ramnoza	4,2	2,3-Ramnoza	4,9
3-Me-Ksyloza	4,2	T-Ksyloza (piranoza)	4,8
4-Me-Ramnoza	3,9	4,6-Galaktoza	4,3
Glukoza	3,6	T-Ramnoza	4,2
Mannoza	2,4	3,4-Fukoza	3,1
Kwas galakturonowy	2,0	3,4-Kwas galakturonowy	2,4
3-Me-Galaktoza	2,0	2-Mannoza/3-Mannoza	2,2
Arabinoza	1,8	4-Fukoza	2,2
aminocukier	1,5	T-Fukoza	2,2
2,3-diMe-Fukoza	1,2	3,4-Ramnoza	2,1
N-Acetyloglukozamina	0,9	2-Glukoza	1,5
2-Me-Glukoza	0,5	2,3-Mannoza	1,4
Glicerol	0,4	3-Glukoza	1,2
		3-Galaktoza	1,1
		4-Mannoza	1,0
		6-Mannoza	0,8
		2,6-Glukoza/4,6-Glukoza	0,8
		3-Ksyloza	0,7
		4-Ksyloza	0,6

Uwaga: Wszystkie grupy metylowe oznaczone są jako „Me”, a końcowe wiązania glikozydowe oznaczone są jako „T”. Wszystkie wiązania glikozydowe są również przyłączone w pozycji 1, chyba że zaznaczono inaczej. Obecność dwóch jednostek glikozylowych wskazuje na jednoczesną elucję składników podczas analizy.

PL 203 814 B1

NP16846 składa się głównie z ramnozy, kwasu glukuronowego, fukozy, galaktozy i metylowanych reszt cukrowych z dodatkiem innych prostych cukrów, kwasów uranowych i zacetylowanych aminocukrów. Inne polisacharydy o podobnym składzie glikozylowym wyizolowane z gatunku Spirulina, które były już opisywane w literaturze miały znacznie mniejsze rozmiary niż NP 16846.

Analiza NP 16846 po ultrafiltracji przeprowadzona metodą wielkościowo wykluczającej HPLC, opisaną w przykładzie 1, wykazała w eluacie z kolumny obecność jednego piku (Fig. 3) o czasie retencji odpowiadającym względnej masie cząsteczkowej ponad 2 miliony daltonów oznaczonej przy zastosowaniu porównawczych wzorców dekstranowych.

Aktywacja monocytów/makrofagów

W celu potwierdzenia aktywacji monocytów/makrofagów z THP-1 przez preparaty polisacharydowe z mikroalg, oznaczano poziomy informacyjnego RNA (mRNA) w pro-zapalnych cytokinach IL-1 β i TNF -α. Kontrolnie, w celu zbadania specyficzności zmian w stężeniach mRNA w IL-1 β i TNF-α oznaczano również stężenia mRNA w GAPDH (dehydrogenaza fosforanu aldehydu glicerynowego). Ponieważ gen kodujący GAPDH jest genem konstytutywnym, można więc oczekiwać że stężenia mRNA pozostaną w nim stałe, chyba że zmiany wprowadzane są sztucznie.

Startery RT-PCR dla IL-1 β, TNF-α i GAPDH dostarczyła firma Integrated DNA technologies, Inc. (Coraville, IA). Sekwencje dla starterów zostały opisane przez Su i wsp. (42). IL-1 β - zgodnie z kierunkiem (5-ATG-GCA-GAA-GTA-CCT-AAG-CTC-GC-3'); IL-1 β w kierunku odwrotnym. 5'-ACACAA-ATT-GCA-TGG-TGA-AGT-CAG-TT-3'); TNF-α - zgodnie z kierunkiem (5'-GAG-TGA-CAA-GCCTGT-AGC-CCA-TGT-TGT-AGC-3'); TNF-α w kierunku odwrotnym (5'-GCA-ATG-ATC-CCA-AAGTAG-ACC-TGC-CCA-GAC-T-3'); GAPDH - zgodnie z kierunkiem (5'-TGA-AGG-TCG-GAG-TCA-ACGGAT-TTG-GT-3'); GAPDH - w kierunku odwrotnym (5-CAT-GTG-GGC-CAT-GAG-GTC-CAC-CAC-3).

Aktywnie rosnące komórki THP-1 (3 mL, 1x10⁶ komórek/mL) inkubowano w ciągu 2 godzin w obecności badanego materiału. Całkowity RN A wyizolowano stosując zestaw TRI Reagent® (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH), w którym komórki poddawane są lizie przy użyciu kombinacji fenolu i tiocyjanianu guanidyny. Po dodaniu bromochloropropanu RN A przeszedł do warstwy wodnej, z której został wytrącony przez dodanie izopropanolu. Przy zastosowaniu tej metody uzyskano około 30 μg RNA. Elektroforeza tego produktu przeprowadzona przy użyciu 0,8% agarozy żelu nie wykazała obecności DNA jako zanieczyszczenia.

Reakcje RT-PCR przeprowadzono stosując zestaw odczynników z Promega (Madison, WI). W każdej reakcji używano następujących komponentów (objętość całkowita 30 μL): 6 μL buforu reakcyjnego AMV/Tfl 5x, 0,6 uL mieszaniny dNTP (10 mM), 1,2 μL MgSO₄ (25 mM), 0,6 μL odwrotnej transkryptazy AMV (5 jednostek/uL), 0,6 μL polimerazy Tfl DNA (5 jednostek/uL, 1,2 μL każdego startera (15 pmoli/uL), 2 ng całkowitego RNA (IL-1 β, TNF-α) lub 5 ng całkowitego RNA (GAPDH). W procesie RT-PCR zastosowano automatyczny cykler termiczny Techne Unit Progene. W pierwszym cyklu zastosowano temperaturę 48°C w ciągu 45 minut, a następnie zastosowano 94°C w ciągu 2 minut. Amplifikację uzyskano w 35 cyklach: denaturacja w temperaturze 94°C w ciągu 45 sekund, przyłączanie w temperaturze 60°C w ciągu 1 minuty i rozszerzenie w temperaturze 68°C w ciągu 2 minut. W końcowym cyklu utrzymywano próbki w temperaturze 68°C w ciągu 7 minut. Elektroforezę produktów RTPCR (mRNA w -α i GAPDH) przeprowadzono na 5% żelach poliakryloamidowych używając uL mieszaniny reakcyjnej i bromek etydyny jako środek wybarwiający.

Poddanie komórek THP-1 działaniu LPS, lub preparatów polisacharydowych z mikroalg spowodowało gwałtowny wzrost zarówno mRNA w IL-1 β (810 par zasad) jak i mRNA w TNF-α (444 par zasad) w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Stężenia mRNA konstytutywnego genu kodującego dehydrogenazę fosforanu aldehydu glicerynowego (GAPDH, 1000 par zasad) pozostały takie same we wszystkich próbkach (Fig. 4).

Obserwowana aktywacja NF-kappa B przez NP-16847, NP-16848 i NP-16846 nie była spowodowana zanieczyszczeniem preparatów endotoksynami. Potwierdziły to wyniki dwóch opisanych poniżej doświadczeń, które przeprowadzono w celu wyeliminowania takiej możliwości. W pierwszym, w kombinacji z każdym z preparatów polisacharydowych (0,1 do 1 ug/mL) dodawano polimyksynę B (10 ug/mL, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w celu zaobserwowania ewentualnego zahamowania aktywacji NF-kappa B. Wiadomo, że polimyksyna B jako polikationowy antybiotyk blokuje wiele biologicznych efektów wywieranych przez LPS poprzez wiązanie się do lipidowego A fragmentu cząsteczki. Wszystkie trzy preparaty polisacharydowe z mikroglonów okazały się niewrażliwe na dodatki polimyksyny B (danych nie przedstawiono). Dodatek polimyksyny B do LPS (10 ug/mL) spowodował obniżenie aktywacji NF-kappa B o 75%. Drugi eksperyment mający na celu wykrycie ewentualnych efektów

PL 203 814 B1 wywołanych przez endotoksyny polegał na poszukiwaniu w kompozycji glikozylowej obecności β-hydroksymirystynianu. W próbkach preparatów NP16848 i NP16846 nie zaobserwowano wykrywalnych śladów tego produktu. Tak więc nie jest prawdopodobne, aby obserwowana aktywacja makro fagów przez NP16848 i NP16846 spowodowana była działaniem endotoksyn.

Jednakże w dwóch różnych próbkach preparatów NP 16847 stwierdzono obecność niewielkich ilości (0,6% całkowitej powierzchni piku) β-hydroksymirystynianu. W celu sprawdzenia jak wiele materiału typu endotoksyn było obecne w próbkach, sześć próbek AFA poddano analizie wykorzystując test z lizatem amebocytu Limulus (LAL). Analizę wykonano w BioWhittaker, Walkersville, MD). Ilość materiału reagującego w tym teście dodatnio na LAL stanowiła 0,002% suchej masy mikroalg. Dla porównania, wydajność procentowa NP16847 jest około 300 razy wyższa (0,6% suchej masy mikroalg). Oznacza to, że przy stężeniu koniecznym do wywołania połowy maksymalnej aktywacji NF-kappa B przez NP16847 (100 ng/mL) łączna ilość obecnego materiału potencjalnie reagującego dodatnio na LAL wynosiła by 300 pg/mL. Takie stężenie endotoksyny było by niewykrywalne testem makrofagowym. Tak więc ewentualne zanieczyszczenie endotoksyną nie mogło być przyczyną stymulowania aktywacji makrofagów przez NP16847.

W przykładach od 1 do 3 wykazano, że z jadalnych mikroalg można wyizolować preparaty polisacharydowe o silnych własnościach immunostymulujących prowadząc ekstrakcję 70% etanolem w temperaturze 40°C. Dalsze etapy wyodrębniania tych preparatów polisacharydowych przebiegają według złożonych procedur i wymagają użycia rozpuszczalników organicznych. Polisacharydy, dzięki ich doskonałej rozpuszczalności w wodzie, zazwyczaj ekstrahowane są z surowców naturalnych przy użyciu gorącej wody. W tej sytuacji należało by oczekiwać, że uzyskiwane w tej metodzie procentowe wydajności tych polisacharydów będą wyższe, niż w przypadku gdy wstępną ekstrakcję prowadzi się 70% etanolem. Ponad to, ponieważ jest mało prawdopodobne aby wodny ekstrakt zawierał substancje niepolarne, w przypadku powodzenia tej metody nie było by konieczne usuwanie ich przy użyciu rozpuszczalników organicznych. Jednakże, w przeciwieństwie do tych oczekiwań, ekstrakcja wodna (przykłady 4 do 6) nie tylko dała preparaty zdecydowanie mniej aktywne niż te uzyskane przy zastosowaniu do wstępnej ekstrakcji wodnego etanolu (przykład 1), ale także była przyczyną dodatkowych komplikacji.

Zarówno analizy metodą wielkościowo wykluczającej HPLC, jak i oznaczenia aktywności immunostymulującej (aktywacja makrofagów) wykonywano tak jak to opisano w poprzednich przykładach. Używanym w każdym przykładzie mikroalgi był liofilizowany AFA (Próbka 041900 Merc) uzyskana od firmy Klamath Algae Products Inc., Klamath Falls, OR. Ultrafiltrację (jeśli była stosowana) prowadzono wykorzystując urządzenie z błoną z polieterosulfonu oddzielającą cząsteczki o masie do 100 000 (Centricon Plus-20 od firmy Millipore, Bedford, MA). W każdym doświadczeniu substancję oddzieloną przez ultrafiltrację przemywano kilkakrotnie 3% (w/v) roztworem KCl w celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogły przylgnąć do wielkocząsteczkowego materiału (prawdopodobnie w wyniku oddziaływań jonowych).

P r z y k ł a d 4 - Ekstrakcja wodna w temperaturze 40°C i usunięcie fikocyjaniny przez wytrącenie alkoholem

Wodna ekstrakcja AFA w temperaturze 40°C stwarzała problemy, ponieważ uzyskany surowy ekstrakt zawierał dużą ilość fikocyjaniny (niebieski barwnik białkowy). Próby oddzielenia tej fikocyjaniny przez ultrafiltrację nie powiodły się ponieważ na filtrze oddzielającym cząsteczki o masie do 100 000 g/mol była ona zatrzymywana razem z polisacharydowym preparatem NP16847. Pełne wytrącenie fikocyjaniny wymaga etanolu o stężeniu 70% lub wyższym (danych nie przedstawiono). W celu ocenienia tej metody 10 g liofilizowanego AFA poddawano trzykrotnej ekstrakcji wodą (po 62,5 mL) w temperaturze 40°C, każdorazowo w czasie od 4 do 8 godzin. Surowy ekstrakt wodny liofilizowano, ponownie rozpuszczono w 40 mL wody i następnie, w temperaturze pokojowej, dodano 92 mL etanolu do uzyskania jego końcowego stężenia 70%. Wytrącony materiał (zawierający fikocyjaninę) oddzielono i supernatant przepuszczono przez urządzenie do ultrafiltracji. Produkty z każdego etapu wyodrębniania oceniano pod względem zdolności do aktywacji makrofagów (Fig. 5). Jak widać, większość aktywności immunostymulującej została utracona podczas wytrącania 70% etanolem, ponieważ pozostała ona w osadzie zawierającym również fikocyjaninę. Procentowa wydajność materiału po ultrafiltracji (powyżej 100 000 g/mol) wynosiła dla tego sposobu 1%. Jakkolwiek jest to wydajność wyższa niż 0,6% uzyskane po ultrafiltracji w opisanym w przykładzie 1 sposobie ekstrakcji 70% etanolem, to jednak otrzymany materiał zawiera poza NP16847 inne substancje, ponieważ jego wartość

PL 203 814 B1

EC50 wynosi 1000 ng/mL. Dla porównania, wartość EC50 dla materiału uzyskanego w przykładzie 1 wynosi 100 ng/mL.

P r z y k ł a d 5 - Ekstrakcja wodna w temperaturze 40°C i usuwanie fikocyjaniny siarczanem amonu

W typowych metodach oddzielania fikocyjaniny stosuje się na ogół wytrącanie roztworem siarczanu amonu (nasycenie 40 - 65%). Zastosowano tę procedurę w celu sprawdzenia, czy przez takie wytrącenie siarczanem amonu można selektywnie usunąć fikocyjaninę z surowego ekstraktu. 10 g Liofilizowanego AFA poddawano trzykrotnej ekstrakcji wodą (po 62,5 mL) w temperaturze 40°C, każdorazowo w czasie od 4 do 8 godzin. Surowy ekstrakt wodny liofilizowano i ponownie rozpuszczono w 40 mL wody zawierającej 48 g siarczanu amonu (nasycenie 50%). Wytrącony materiał (zawierający fikocyjaninę) usunięto a supernatant przepuszczono przez urządzenie do ultrafiltracji. Procentowa wydajność produktu po ultrafiltracji wynosiła 1,32%, ale prawdopodobnie zawierał on niewiele NP16847 ponieważ jego aktywność była bardzo niska (EC50 > 1000 ng/mL). Na Fig. 6 zestawiono immunostymulujące aktywności produktów z każdego etapu procesu wyodrębniania. Podobnie jak w próbie poprzedniej, podczas dodawania siarczanu amonu większość NP 16847 ulega wytrąceniu razem z fikocyjaniną. Tak więc próby oddzielenia fikocyjaniny od NP 16847 w surowym ekstrakcie wodnym nie powiodły się. Co więcej, ponowna ekstrakcja wodnym etanolem w wyższych temperaturach (np. 50% etanol/60°C) pozostałości po wodnej ekstrakcji przeprowadzonej w temperaturze 40°C, pozwoliła na wydzielenie dodatkowej, znaczącej ilości NP16847 (patrz przykład 43). Tak więc ekstrakcja wodą w temperaturze 40°C nie zapewnia wydzielenia całości NP 16847.

P r z y k ł a d 6 - Ekstrakcja wodna w temperaturze 70°C

Ekstrakcja wodna w wyższych temperaturach jak na przykład 70°C mogła by spowodować denaturację i wytrącenie fikocyjaniny z pozostawieniem NP16847 i innych polarnych cząsteczek w roztworze. W celu sprawdzenia i oceny skuteczności takiego postępowania 20 g liofilizowanego AFA poddano trzykrotnej ekstrakcji wodą (po 125 mL) w temperaturze 70°C, każdorazowo w czasie od 4 do 8 godzin. Okazało się, że taki surowy ekstrakt nie zawierał fikocyjaniny, ponieważ nie był zabarwiony na niebiesko. Ekstrakt ten poddano liofilizacji, ponownie rozpuszczono w 80 mL wody, po czym przez dodanie alkoholi (woda : metanol : etanol, 1:2:3) w temperaturze -20°C, w ciągu 24 godzin wytrącono NP 16847. Taki wytrącony produkt przepuszczono przez urządzenie do ultrafiltracji. Na Fig. 7 przedstawiono zestawienie immunostymulujących aktywności materiałów uzyskiwanych na każdym z etapów procesu wyodrębniania. Wartość EC50 dla aktywacji makrofagów uzyskana dla materiału po ultrafiltracji (200 ng/mL) była trochę wyższa niż dla materiału otrzymanego w przykładzie 1 (100 ng/mL). Jednak procentowa wydajność obecnie otrzymanego materiału po ultrafiltracji wynosiła 1,74%, a zatem była w istotnym stopniu wyższa niż w przypadku NP16847 uzyskanego przy użyciu 70% etanolu w procesie opisanym w przykładzie 1, gdzie było to tylko 0,6%. Tak więc prowadząc ekstrakcję wodą w temperaturze 70°C uzyskuje się około trzy razy więcej NP16847 o porównywalnych wartościach EC50 dla materiału po ultrafiltracji.

Sposób wyodrębniania NP16847 przez ekstrakcję gorącą wodą (w temperaturze 70°C) jest pod kilkoma względami korzystniejszy od sposobu wyodrębniania opisanego w przykładzie 1. Chodzi o to, że nie używa się w nim rozpuszczalników organicznych, końcowy materiał uzyskuje się w kilku etapach, a ilość wyekstrahowanego NP16847 jest trzy razy większa. Omawiany sposób ma jednak również kilka niedogodności. Po pierwsze, surowy ekstrakt musi być poddawany liofilizacji w celu zagęszczenia, koniecznego dla uniknięcia nadmiernych objętości alkoholu potrzebnego do wytrącenia. Po drugie, produkt przed ultrafiltracją zawiera dużą ilość materiału nieaktywnego (świadczą o tym niskie wartości EC50 wynoszące około 500 ng/mL, oraz analiza HPLC przedstawiona na Fig. 7), którego oddzielenie bardzo spowalnia oczyszczanie przeprowadzane na urządzeniach do ultrafiltracji.

Wprowadzając modyfikacje do opisanego w przykładzie 1 sposobu ekstrakcji 70% etanolem sprawdzono kilka dalszych sposobów wyodrębniania. Sposoby te przedstawione w kolejnych przykładach nie wymagają stosowania rozpuszczalników organicznych i obejmują niewielką ilość etapów. Opracowany proces jest prosty, ekonomiczny i wydajny i pozwala na uniknięcie wszystkich komplikacji związanych z prowadzeniem ekstrakcji gorącą wodą.

P r z y k ł a d 7 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 40°C i rozpuszczanie ekstraktów w mieszaninie woda - chloroform

W opisanym w przykładzie 1 sposobie ekstrakcji NP16847, przeprowadzane jako drugie z kolei rozpuszczanie ekstraktu w mieszaninie wody z butanolem powoduje znaczne straty aktywności immunostymulującej, która przechodzi do warstwy butanolowej. Dlatego też wprowadzono do tego procesu

PL 203 814 B1 modyfikację polegającą na usunięciu operacji z butanolem. Ten nowy sposób jest identyczny z sposobem z przykładu 1 z tym, że występuje w nim tylko jeden etap rozpuszczania w mieszaninie chloroformu i wody (1:1). Na Fig. 8 przedstawiono schematycznie proces wyodrębniania, a także aktywności immunostymulujące na każdym etapie tego procesu. Wartość EC50 dla materiału po ultrafiltracji uzyskanego według tego sposobu jest nieco wyższa (200 ng/mL) niż dla materiału uzyskanego sposobem opisanym w przykładzie 1 (100 ng/mL). Wydajność procentowa uzyskanego omawianym sposobem NP16847 po ultrafiltracji wynosi 1,97%. Tak więc usunięcie z opisanego w przykładzie 1 sposobu z ekstrakcją 70% etanolem, etapu rozpuszczania ekstraktów w mieszaninie wody z butanolem pozwoliło na trzykrotne zwiększenie wydajności NP16847 po ultrafiltracji. Jednakże główną wadą tego nowego sposobu pozostaje konieczność stosowania chloroformu.

P r z y k ł a d 8 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 40°C i bezpoś rednie wytrą cenie alkoholem

W celu zbadania moż liwoś ci wyeliminowania z procesu zarówno butanolu jak i operacji z chloroformem 10 g liofilizowanego AFA poddano ekstrakcji 70% etanolem (każdorazowo po 125 mL) w temperaturze 40°C. Pierwszą ekstrakcję prowadzono w ciągu 3 godzin, a następną w ciągu 12 godzin. Surowy wodno-etanolowy ekstrakt pozostawiono na kilka godzin w temperaturze -20°C po czym wytrącony materiał oddzielono przez odwirowanie. Uzyskany osad przemyto zimnym 95% etanolem (w celu usunięcia niepolarnych pozostałości), ponownie rozpuszczono w wodzie i przepuszczono przez urządzenie do ultrafiltracji. Na Fig. 9 przedstawiono zestawienie aktywności immunostymulujących dla produktów z każdego etapu wyodrębniania. Wartość EC50 materiału po ultrafiltracji była nieco wyższa (200 ng/mL) niż w przypadku materiału uzyskanego w przykładzie 1 (100 ng/mL). Procentowa wydajność NP16847 po ultrafiltracji wynosiła 1,2%. Jakkolwiek jest ona dwukrotnie wyższa niż w przypadku stosowania sposobu opisanego w przykładzie 1, to jednak w porównaniu z wydajnością uzyskaną sposobem opisanym w przykładzie 7 jest to o 30% mniej. To obniżenie wydajności jest prawdopodobnie spowodowane niepełnym wytrąceniem produktu w 70% etanolu.

P r z y k ł a d 9 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 40°C i bezpoś rednie wytrą cenie 80% alkoholem

W celu uzyskania wyż szej wydajnoś ci NP16847 zmodyfikowano nieco sposób poprzedni (opisany w przykładzie 8). Do surowego ekstraktu otrzymanego przy użyciu 70% etanolu dodano zimny 100% etanol w ilości potrzebnej do uzyskania stężenia 80% i mieszaninę pozostawiono na kilka godzin w temperaturze -20°C. Z wytrąconym materiałem postępowano tak jak w przykładzie 8. Na Fig. 10 przedstawiono schematycznie proces wyodrębniania, a także aktywności immunostymulujące na każdym etapie tego procesu. Tak zmodyfikowanym sposobem uzyskano preparat NP 16847 przed ultrafiltracją z wydajnością 5,7%; wartość EC50 w teście aktywacji monocytów wynosiła 200 ng/mL. Procentowa wydajność materiału po ultrafiltracji wynosiła 1,8%. Wartość EC50 dla tego materiału była nieco wyższa (200 ng/mL) niż dla materiału otrzymanego w przykładzie 1 (100 ng/mL), ale identyczna z wartoś ciami dla produktów po ultrafiltracji uzyskanych w przykł adach 6 i 7.

Zastosowanie zatem sposobu polegającego na bezpośrednim wytrąceniu preparatu polisacharydowego 16847 z surowego ekstraktu w 70% etanolu (przykład 9) umożliwia osiągnięcie zamierzonych celów. Nie jest bowiem konieczne stosowanie rozpuszczalników organicznych (lub metanolu), unika się prowadzenia liofilizacji, czy odparowywania rozpuszczalnika a otrzymanie względnie czystego preparatu NP16847 odbywa się zaledwie w kilku etapach. Połowicznie oczyszczony preparat NP16847 (zawierający 70% materiału o masie cząsteczkowej mniejszej niż 100 000 g/mol) można otrzymać bez konieczności oczyszczania metodą ultrafiltracji (patrz chromatogramy HPLC dla materiałów przed i po ultrafiltracji przedstawione na Fig. 10). Preparat NP 16847 przed ultrafiltracją w postaci roślinnego ekstraktu może nadawać się do stosowania jako preparat uzupełniający żywienie. Do wyodrębnienia tego preparatu wystarczyłoby bezpośrednie wytrącenie alkoholem z ekstraktu w 70% etanolu.

Poniżej przedstawiono w punktach uzasadnienie dlaczego sposób wyodrębniania opisany w przykładzie 9 jest najkorzystniejszy spośród wszystkich sprawdzanych sposobów.

1. Ekstrakcja wodna w temperaturze 40°C.

a. Ekstrakty zawierają duże stężenia fikocyjaniny, której nie udaje się usunąć z NP16847 ani przez ultrafiltrację, ani przez wytrącanie etanolem, lub siarczanem amonu.

b. NP 16847 otrzymany po ultrafiltracji wykazywał niską aktywność - EC50 około 1000 ng/mL wobec 200 ng/mL (przykład 9).

PL 203 814 B1

c. Pozostałość po ekstrakcji zawierała dużą ilość NP16847, którego nie dawało się odzyskać przez wodną ekstrakcję w tej temperaturze (patrz przykład 43).

2. Ekstrakcja wodna w temperaturze 70°C

a. Prowadzenie wodnej ekstrakcji w tej temperaturze powoduje obecność w materiale przed ultrafiltracją dużej ilości nieaktywnych substancji polarnych, co jest niepożądane z dwóch powodów. Po pierwsze, preparat przed ultrafiltracją będzie zawierał NP16847 w niskim stężeniu. Po drugie, proces ultrafiltracji prowadzący do otrzymania preparatu NP16847 po ultrafiltracji będzie przebiegał niezwykle wolno.

b. Jakkolwiek w procesie nie używa się toksycznych rozpuszczalników organicznych, to jednak konieczne jest poddanie surowego ekstraktu liofilizacji.

3. Ekstrakcja 70% etanolem i następnie i rozpuszczanie ekstraktów w mieszaninie wody i rozpuszczalnika organicznego

a. Oczywistą główną niedogodnością tego sposobu jest konieczność używania rozpuszczalnika organicznego (tj. chloroformu) w celu usunięcia materiału niepolarnego.

Z podanych wyżej przykładów wynika, że optymalny ogólny sposób (opisany w przykładzie 9) obejmuje dwie wstępne ekstrakcje liofilizowanego AFA przy użyciu 70% etanolu w temperaturze 40°C. Następnie do surowego ekstraktu dodaje się 100% etanol do uzyskania końcowego stężenia etanolu 80% i chłodzi mieszaninę do -20°C. Wytrącony osad zbiera się i przemywa zimnym 95% etanolem w celu usunięcia resztek substancji lipofilowych. Substancje o wysokiej masie cząsteczkowej (powyżej 100 000 g/mol) zawierające domieszkę około 30% preparatu polisacharydowego przed ultrafiltracją można wyodrębnić przez ultrafiltrację. Poniżej przedstawiono porównanie preparatu NP16847 otrzymanego sposobem opisanym w przykładzie 1 i preparatu NP16847 uzyskanego przez ekstrakcję 70% etanolem w temperaturze 40°C (przykład 1):

	NP16847 (przykład 9)	NP16847 (przykład 1)
Wydajność przed ultrafiltracją	5,7%	3,0%
Wartość EC50 przed ultrafiltracją	200 ng/mL	200 ng/mL
Wydajność po ultrafiltracji	1,8%	0,6%
Wartość EC50 po ultrafiltracji	200 ng/mL	100 ng/mL

Dane te wykazują, że ekstrakcja AFA sposobem opisanym w przykładzie 9 daje dwa razy więcej preparatu NP16847 przed ultrafiltracją i trzy razy więcej tego preparatu po ultrafiltracji. Jednakże wartość EC50 otrzymanego tym sposobem preparatu po ultrafiltracji jest nieco wyższa niż dla preparatu otrzymanego w przykładzie 1, co świadczy o tym, że wzrost wydajności jest częściowo spowodowany obecnością materiału nieaktywnego. Dlatego też warunki prowadzenia procesu zastosowane w przykładzie 9 przyjęto jako wyjściowe do dalszej optymalizacji mającej na celu poprawę aktywności preparatu NP16847. W wyniku tej optymalizacji opracowano nowy sposób wyodrębniania, którego zalety są następujące:

1. Optymalna wydajność i dobra aktywność preparatu polisacharydowego NP16847 zarówno przed jak i po ultrafiltracji.

2. Niestosowanie rozpuszczalników organicznych.

3. W procesie nie ma konieczności usuwania dużych objętości wody, lub rozpuszczalników na wyparce rotacyjnej, lub przez liofilizację.

W przykładach 10-38 przedstawiono szczegółową analizę efektów zmian temperatury ekstrakcji jak i stężenia etanolu, wprowadzonych w celu optymalizacji warunków zastosowanych w przykładzie 9.

P r z y k ł a d 10 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 50°C i bezpośrednie wytrącanie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 50°C ekstrakcji 70% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu

PL 203 814 B1 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 6,5%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 11 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 60°C i bezpośrednie wytrącanie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 60°C ekstrakcji 70% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 7,1%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 12 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 70°C i bezpośrednie wytrącanie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 70°C ekstrakcji 70% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,4 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 75 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 7,1%. (Tabela 4). Po usunięciu materiału o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej 100 000 g/mol) uzyskano preparat 16847 po ultrafiltracji o wartości EC50 około 35 ng/mL z wydajnością 2,7%.

P r z y k ł a d 13 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 80°C i bezpośrednie wytrącanie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 80°C ekstrakcji 70% etanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 50 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 7,6%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 14 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 23°C i bezpośrednie wytrącanie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 23°C ekstrakcji 70% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,5 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 >250 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 4,5%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 15 - Ekstrakcja 60%-owym etanolem w temperaturze 23°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 23°C ekstrakcji 60% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,3 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 >250 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 7,0%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 16 - Ekstrakcja 60%-owym etanolem w temperaturze 40°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem

PL 203 814 B1 g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 40°C ekstrakcji 60% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 200 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 8,4%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 17 - Ekstrakcja 60% etanolem w temperaturze 50°C i bezpośrednie wytrącanie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 50°C ekstrakcji 60% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,0 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 9,4%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 18 - Ekstrakcja 60% etanolem w temperaturze 60°C i bezpośrednie wytrącanie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 60°C ekstrakcji 60% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,4 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 9,5%. (Tabela 4). Po usunięciu materiału o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej 100 000 g/mol) uzyskano preparat 16847 po ultrafiltracji o wartości EC50 około 75 ng/mL z wydajnością 3,5%.

P r z y k ł a d 19 - Ekstrakcja 60%-owym etanolem w temperaturze 70°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 70°C ekstrakcji 60%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80%-owym przez dodanie zimnego 100%-owym etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 50 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 10,0%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 20 - Ekstrakcja 60%-owym etanolem w temperaturze 80°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 80°C ekstrakcji 60%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80%-owym przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owego etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 25 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 11,2%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 21 - Ekstrakcja 50%-owym etanolem w temperaturze 23°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 23°C ekstrakcji 50%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin.

PL 203 814 B1

Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,3 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 200 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 9,1%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 22 - Ekstrakcja 50%-owym etanolem w temperaturze 40°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 40°C ekstrakcji 50%-owym etanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,3 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 8,9%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 23 - Ekstrakcja 50%-owym etanolem w temperaturze 50°C i bezpośrednie wytrącanie 80 %-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 50°C ekstrakcji 50%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,1 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 75 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 9,4%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 24 - Ekstrakcja 50%-owym etanolem w temperaturze 60°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 60°C ekstrakcji 50%-owego etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,4 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 25 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 10,8%. (Tabela 4). Po usunięciu materiału o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej 100 000 g/mol) uzyskano preparat 16847 po ultrafiltracji o wartości EC50 około 20 ng/mL z wydajnością 4,5%.

P r z y k ł a d 25 - Ekstrakcja 50%-owym etanolem w temperaturze 70°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 70°C ekstrakcji 50%-owym etanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,4 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100 %-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 25 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 10,2%. (Tabela 4). Po usunięciu materiału o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej 100 000 g/mol) uzyskano preparat 16847 po ultrafiltracji o wartości EC50 około 20 ng/mL z wydajnością 5,6%.

P r z y k ł a d 26 - Ekstrakcja 50%-owym etanolem w temperaturze 80°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem

PL 203 814 B1 g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 80°C ekstrakcji 50%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 25 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 11,7% (Tabela 4).

P r z y k ł a d 27 - Ekstrakcja 40%-owym etanolem w temperaturze 23°C i bezpośrednie wytrącanie 80 %-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 23°C ekstrakcji 40%-owym etanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,3 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100 %-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 >250 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 11,4%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 28 - Ekstrakcja 40%-owym etanolem w temperaturze 40°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 40°C ekstrakcji 40%-owym etanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,4 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owym etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 10,7%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 29 - Ekstrakcja 40%-owym etanolem w temperaturze 50°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 50°C ekstrakcji 40%-owym etanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,0 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 10,3% (Tabela 4).

P r z y k ł a d 30 - Ekstrakcja 40%-owym etanolem w temperaturze 60°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 60°C ekstrakcji 40%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,4 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 50 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 10,8%. (Tabela 4). Po usunięciu materiału o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej 100 000 g/mol) uzyskano preparat 16847 po ultrafiltracji o wartości EC50 około 25 ng/mL z wydajnością 3,3%.

P r z y k ł a d 31 - Ekstrakcja 40%-owym etanolem w temperaturze 70°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem

PL 203 814 B1 g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 70°C ekstrakcji 40%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,4 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 50 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 11,1%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 32 - Ekstrakcja 40%-owym etanolem w temperaturze 80°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 80°C ekstrakcji 40%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,3 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 50 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 12,6%. (Tabela 4). Po usunięciu materiału o niskiej masie cząsteczkowej (poniżej 100 000 g/mol) uzyskano preparat 16847 po ultrafiltracji o wartości EC50 około 30 ng/mL z wydajnością 6,2%.

P r z y k ł a d 33 - Ekstrakcja 30%-owym etanolem w temperaturze 23°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 23°C ekstrakcji 30%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 200 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 13,7%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 34 - Ekstrakcja 30%-owym etanolem w temperaturze 40°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 40°C ekstrakcji 30%-owym etanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,3 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 13,8%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 35 - Ekstrakcja 30%-owym etanolem w temperaturze 50°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 50°C ekstrakcji 30%-owym etanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,1 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 10,9%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 36 - Ekstrakcja 30%-owym etanolem w temperaturze 60°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem

PL 203 814 B1 g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 60°C ekstrakcji 30%-owym etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,2 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100%-owego etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95%-owym etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 10,5%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 37 - Ekstrakcja 30%-owym etanolem w temperaturze 70°C i bezpośrednie wytrącanie 80%-owym alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 70°C ekstrakcji 30% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,1 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 75 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 11,0%. (Tabela 4).

P r z y k ł a d 38 - Ekstrakcja 30% etanolem w temperaturze 80°C i bezpośrednie wytrącanie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 80°C ekstrakcji 30% etanolem, pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 3 godzin i drugi raz stosując 6,25 mL w ciągu 12 godzin. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,0 mL) odwirowano, a następnie stężenie etanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 75 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 11,9% (Tabela 4).

T a b e l a 4. Wpływ temperatury i stężenia etanolu użytego do wstępnej ekstrakcji AFA na procentową wydajność i aktywność właściwą preparatu polisacharydowego NP16847

	Procentowe stężenie etanolu
30% EtOH	40% EtOH	50% EtOH	60% EtOH	70% EtOH
Temperatura	80°C	11,9 75 ng/mL	12,6 50 ng/mL	11,7 25 ng/mL	11,2 25 ng/mL	7,6 50 ng/mL
70°C	11,0 75 ng/mL	11,1 50 ng/mL	10,2 25 ng/mL	10,0 50 ng/mL	7,1 75 ng/mL
60°C	10,5 100 ng/mL	10,8 50 ng/mL	10,8 25 ng/mL	9,5 100 ng/mL	7,1 100 ng/mL
50°C	10,9 100 ng/mL	10,3 100 ng/mL	9,4 75 ng/mL	9,4 100 ng/mL	6,5 100 ng/mL
40°C	13.8 100 ng/mL	10,7 100 ng/mL	8,9 100 ng/mL	8,4 200 ng/mL	5,7 200 ng/mL
23°C	13,7 200 ng/mL	11,4 >250 ng/mL	9,1 200 ng/mL	7,0 >250 ng/mL	4,5 >250 ng/mL

Legenda:

xx.x - Wydajność procentowa XX ng/ml Wartość EC50

W Tabeli 4 przedstawiono badania nad wpływem zmian temperatury i stężenia etanolu w procesie wstępnej ekstrakcji na uzyskane końcowe wyniki. Kryteriami oceny wyników uzyskiwanych w danych warunkach ekstrakcji były wydajność preparatu przed ultrafiltracją, a także uzyskiwana dla niego wartość EC50. Do oceny wyników przyjęto preparat przed ultrafiltracją z uwagi na potencjalną

PL 203 814 B1 możliwość zastosowania go, albo jako preparatu uzupełniającego żywienie, albo jako preparatu farmaceutycznego. Wyeliminowanie etapu ultrafiltracji stanowiło by istotnie uproszczenie procesu wyodrębniania.

Warunki zastosowane w przykładzie 9 (70% etanol i temperatura 40°C) pozwoliły na uzyskanie preparatu 16847 przed ultrafiltracją mającego wartość EC50 200 ng/mL z wydajnością 5,7%. Podniesienie temperatury wstępnej ekstrakcji powyżej 40°C przy zastosowaniu 70% etanolu spowodowało wzrost wydajności i poprawę aktywności właściwej uzyskiwanego preparatu polisacharydowego NP16847. Jednakże, obniżanie temperatury ekstrakcji z 40 do 23°C przy użyciu 70% etanolu, a także w przypadku innych stężeń etanolu nie doprowadziło do obniżenia wartości EC50. W tej temperaturze (23°C) wydajności wzrastały przy niższych stężeniach używanego etanolu. Wzrost tej wydajności był prawdopodobnie częściowo spowodowany faktem przechodzenia do ekstraktu większej ilości fikocyjaniny, o czym świadczy bardziej intensywne niebieskie zabarwienie uzyskiwanego materiału. Ekstrakcja 70% etanolem prowadzona w wyższych temperaturach prowadziła do niewielkiego wzrostu wydajności, ale także w zasadniczym stopniu zwiększała aktywność właściwą (na przykład 70% etanol w temperaturze 80°C). Ekstrakcja przy użyciu 50% etanolu w każdej temperaturze powyżej 40°C prowadziła do obniżenia wartości EC50 w stosunku do wartości uzyskiwanych przy użyciu etanolu o innych stężeniach. Przy stężeniach etanolu wyższych i niższych niż 50% aktywności właściwe na ogół zmniejszały się niezależnie od temperatury, w której prowadzono ekstrakcję. Natomiast te wyższe i niż sze od 50% stężenia etanolu wywierał y przeciwny wpł yw na wydajność produktu: przy wyż szych stężeniach etanolu wydajności obniżały się, a przy stężeniach niższych obserwowano niewielki wzrost wydajności (w temperaturach 50°C i poniżej). Uzyskiwane przy stężeniach etanolu wyższych niż 50% niższe wydajności produktu o zmniejszonej aktywności właściwej sugerują, że w tych warunkach mniejsza ilość NP16847 ulega wyekstrahowaniu. Dla stężeń etanolu niższych od 50%, uzyskiwane wyższe wydajności produktu posiadającego zmniejszoną aktywność właściwą sugerują że wraz z NP16847 ekstrakcji ulega wię cej materiał u nieaktywnego. W temperaturach poniż ej 60°C przy stę żeniach etanolu wynoszących 30% i 40% najprawdopodobniej większa ilość fikocyjaniny ulega wyekstrahowaniu i to ona właśnie stanowi część tego nieaktywnego materiału. Świadczy o tym bardziej intensywnie niebieski kolor wytrąconego osadu.

W regionie Tabeli 4 obejmują cym temperatury od 60°C do 80°C przy stężeniu etanolu wynoszącym 50% znajdują się warunki optymalne zarówno pod względem wydajności otrzymywanego produktu, jak pod względem jego aktywności właściwej. Szczególnie korzystne temperatury mieszczą się w granicach między 60°C i 70°C (przykłady 24 i 25), ponieważ dalsza analiza materiałów zarówno przed jak i po ultrafiltracji pochodzących z ekstrakcji w temperaturze 80°C przy użyciu etanolu o stężeniu 40% i 60% wykazała obecność dużych ilości materiału nierozpuszczalnego w wodzie. Te optymalne warunki pozwalają na otrzymanie produktu po ultrafiltracji o wartości EC50 około 20 ng/mL (5 razy niższa niż w przypadku stosowania 70% etanolu w temperaturze 40°C jak w przykładzie 1) z wydajnoś cią 4,5% do 5,6% (7,5 do 9,3 razy wy ż sza niż w podanych wyż ej warunkach z przykł adu 1).

P r z y k ł a d 39 - Skrócenie czasów ekstrakcji

Wyniki przedstawione w Tabeli 4 uzyskano poddając materiał dwóm ekstrakcjom - pierwszy raz w cią gu 3 godzin, a po raz drugi w cią gu 12 godzin we wszystkich podanych warunkach. Aby zoptymalizować proces ekstrakcji NP16847 w celu dostosowania go do dużej skali przebadano krótsze, bo wynoszące 1 godzinę, czasy prowadzenia ekstrakcji i stwierdzono, że zapewniają one takie same wydajności i aktywności uzyskiwanych produktów.

P r z y k ł a d 40 - Pojedyncza ekstrakcja gorącą wodą w temperaturze 95°C w ciągu 30 minut.

W znanych sposobach izolowania immunostymulują cych polisacharydów z innych typów mikroalg (17, 27) prowadzi się zwykle jedną ekstrakcję gorącą wodą o temperaturze 95°C ciągu 30 minut. W celu oceny przydatności tego sposobu 1 g liofilizowanego AFA poddano jednorazowej ekstrakcji przy użyciu 20 mL wody o temperaturze 95°C w ciągu 30 minut. Do ekstraktu dodano etanol do uzyskania stężenia 80% i pozostawiono mieszaninę w temperaturze -20°C przez kilka godzin. Wydajność wytrąconego osadu wynosiła 12,1%, ale zawierał on mało NP16847 ponieważ jego EC50 wynosiło 500 ng/mL. Wydajność po ultrafiltracji wynosiła 5,1%, ale nie zaobserwowano zmian w aktywności właściwej. Okazało się więc, że zastosowane warunki nie są odpowiednie do ekstrakcji NP16847 z AFA.

P r z y k ł a d 41 - Ekstrakcja wodna w temperaturze 4°C i kolejna reekstrakcja w temperaturze

60°C przy użyciu 50% etanolu

PL 203 814 B1

Istnieje możliwość, że stanowiący zanieczyszczenie polarny materiał udało by się selektywnie usunąć przez wstępną ekstrakcję wodną, nie tracąc przy tym istotnych ilości NP16847. Dla sprawdzenia i oceny tej koncepcji przeprowadzono próbę z dwuetapową ekstrakcją. Etap pierwszy polegał na wstępnej ekstrakcji wodnej w temperaturze 4°C, po czym w drugim etapie przeprowadzono reekstrakcję AFA w warunkach optymalnych (50% etanol w temperaturze 60°C). Jakkolwiek aktywność właściwa uzyskanego tym sposobem NP16847 była porównywalna do uzyskanej w optymalnych warunkach, to jednak wydajność produktu zarówno przed jak i po ultrafiltracji była w tym przypadku o około 70% niższa.

P r z y k ł a d 42 - Ekstrakcja wodna w temperaturze 23°C i kolejna reekstrakcja w temperaturze 60°C przy użyciu 50% etanolu

Sposób zastosowany w przykładzie 41 został nieco zmodyfikowany przez podwyższenie temperatury ekstrakcji z 4°C do 23°C. Tak więc pierwsza ekstrakcja polegała na wstępnej wodnej ekstrakcji AFA temperaturze 23°C, po czym w drugim etapie przeprowadzono reekstrakcję AFA w warunkach optymalnych (50% etanol w temperaturze 60°C). Uzyskane wyniki były podobne do tych z przykładu 41, to znaczy aktywność właściwa była porównywalna do uzyskanej w optymalnych warunkach, jednak wydajność produktu zarówno przed jak i po ultrafiltracji była w tym przypadku o około 70% niższa.

P r z y k ł a d 43 - Ekstrakcja wodna w temperaturze 40°C i kolejna reekstrakcja w temperaturze 60°C przy użyciu 50% etanolu

Sposób zastosowany w przykładzie 41 został nieco zmodyfikowany przez podwyższenie temperatury ekstrakcji z 4°C do 40°C. Tak więc pierwsza ekstrakcja polegała na wstępnej wodnej ekstrakcji AFA temperaturze 40°C, po czym w drugim etapie przeprowadzono reekstrakcję AFA w warunkach optymalnych (50% etanol w temperaturze 60°C). Uzyskane wyniki były podobne do tych z przykładu 41 (to znaczy aktywność właściwa była porównywalna do uzyskanej w optymalnych warunkach, jednak wydajność produktu zarówno przed jak i po ultrafiltracji była w tym przypadku o około 70% niższa).

P r z y k ł a d 44 - Ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 40°C i kolejna reekstrakcja w temperaturze 60°C przy użyciu 50% etanolu

Istnieje możliwość, że stanowiący zanieczyszczenie niepolarny materiał udało by się selektywnie usunąć przez wstępną ekstrakcję etanolem, nie tracąc przy tym istotnych ilości NP16847. Dla sprawdzenia i oceny tej koncepcji przeprowadzono próbę z dwuetapową ekstrakcją. Etap pierwszy polegał na wstępnej ekstrakcji AFA 70% etanolem w temperaturze 40°C, po czym w drugim etapie przeprowadzono reekstrakcję AFA w warunkach optymalnych (50% etanol w temperaturze 60°C). Jakkolwiek sposobem tym uzyskano dla NP 16847 po ultrafiltracji nieco lepsze wartości EC50 (10 ng/mL) niż w przykładach 24 i 25, to jednak wydajność wynosiła tu tylko 1,0%. Wydajność produktu przed ultrafiltracją charakteryzującego się wartością EC50 20 ng/mL wynosiła 2,2%.

Jedną z właściwości, jaką zaobserwowano u oczyszczonego NP16847 okazała się skłonność do przylegania do polipropylenowych końcówek pipet. Aby uniknąć zawyżania wartości EC50 spowodowanego przenoszeniem materiału podczas serii rozcieńczeń, pomiędzy poszczególnymi rozcieńczeniami końcówki pipet wymieniano.

Analizy chromatograficzne NP16847 przed i po ultrafiltracji przedstawiono na Fig. 5-11. Preparat NP16847 jaki wyodrębniano sposobem opisanym w przykładzie 1 eluował się na ogół jako szeroki, pojedynczy pik (Fig. 1). Jednakże przez zastosowanie zmodyfikowanych sposobów (przykłady 4-9) otrzymywano preparat po ultrafiltracji, który ulegał elucji dając na chromatogramie szeroki masyw składający się, jak się okazało z trzech pików (patrz Fig. 5-10). Ten potrójny pik zamieniał się jednak w szeroki pik pojedynczy w wyniku rozpuszczania produktu NP16847 po ultrafiltracji w mieszaninie wody i chloroformu (1:1). Na Fig. 9 i 10 przedstawiono kształt piku właściwego dla oczyszczonego polisacharydowego preparatu NP16847 po tej operacji z wodą i chloroformem. Szeroki pik daleko po prawej stronie każdego chromatogramu występuje również w ślepej próbce kontrolnej a więc pochodzi od chloroformu. Istnieje kilka możliwych wyjaśnień przyczyn przejścia źle rozdzielonego szerokiego piku w pik pojedynczy. Możliwe jest, że z NP16847 związana jest śladowa ilość niepolarnego, lub mającego charakter tłuszczowy materiału, który powoduje międzycząsteczkową asocjację polisacharydów z NP16847. Takie większe kompleksy mogą występować na chromatogramie jako grupy źle rozdzielonych pików. Usunięcie niepolarnego materiału chloroformem powodowało by rozerwanie takich połączeń dzięki czemu na chromatogramie pojawiały by się piki pojedyncze. Możliwe połączenie mającego charakter tłuszczowy, lub innego niepolarnego materiału z NP 16847 wyjaśniało by dlaczego ten preparat polisacharydowy ulega ekstrakcji przy użyciu wodnego etanolu o wysokim stężeniu. To, czy NP16847 jest pojedynczym polisacharydem, czy też mieszaniną pokrewnych polisachary24

PL 203 814 B1 dów jest trudne do oceny z powodu bardzo wysokiej masy cząsteczkowej tego materiału. Pik szeroki, mający postać grupy źle rozdzielonych pików nie występuje jednak w przypadku preparatów NP16847 przed i po ultrafiltracji otrzymywanych w optymalnych warunkach ekstrakcji (50% etanol w temperaturze 60°C - 70°C, patrz Fig. 11). Może to być spowodowane niższym stężeniem etanolu, albo wyższą temperaturą ekstrakcji, albo też obydwoma tymi czynnikami równocześnie.

Identyfikację węglowodanów wchodzących w skład różnych preparatów NP16847 przeprowadzono na TMS-metyloglikozydach stosując spektrometrię gazową połączoną z chromatografią gazową (Tabela 5).

T a b e l a 5. Analiza kompozycji glikozylowych różnych preparatów NP16847 wyizolowanych z AFA. Dane uzyskane w jednym eksperymencie.

Preparat NP 16847	NP7	NP4	NP6	NP3	NP5	NP1	NP2	NP8	NP9
Wartość EC50 (ng/mL)	10	20	20	25	25	100	500	500	500
Reszta glikozylowa					% Mol.
Arabinoza	3,1	10,8	8,4	9,3	7,8	4,3	15,7	2,6	4,2
Ramnoza	15,8	12,8	11,8	14,4	12,0	12,4	19,0	5,1	5,5
Fukoza	0,8	2,1	1,3	0,6	1,1	6,8	3,0	1,3	1,8
Ksyloza	0,8	1,3	1,0	0,9	0,8	2,2	1,4	0,7	1,0
Kwas glukuronowy	2,9	1,1	1,5	2,3	1,9	2,8	0,3	-	-
Reszty metylowane	7,7	7,5	5,1	6,2	7,2	12,5	8,7	10,4	12,0
Mannoza	33,2	22,1	24,9	29,7	24,0	19,9	5,1	9,0	9,3
Galaktoza	6,3	2,8	3,6	4,8	4,1	6,9	0,8	2,1	2,2
Glukoza	9,8	5,7	8,0	21,0	15,8	9,0	2,9	60,8	56,5
N-acetyloglukozamina	4,2	3,5	4,6	,	4,3	4,5	1,2	3,5	2,7
N-acetylogalaktozamina	5,5	10,8	11,5	-	7,5	8,6	15,6	1,4	1,5
N-acetylowany cukier	-	-	-	-	-	-	-	3,1	3,3
Nieznany cukier (1)	5,5	10,4	9,1	8,8	7,5	4,2	13,7	-	-
Nieznany cukier (2)	0,4	1,1	0,8	0,6	0,7	3,3	1,9	-	-
Nieznany cukier (3)	2,8	8,0	8,4	1,4	5,3	2,6	10,7	-	-
Kwas galakturonowy	1,4	-	-	-	-	-	-	-	-

#1 = Przykład 1 NP16847 (prep. po ultrafiltracji), ekstrakcja 70% etanolem w 40°C #2 = Nowa seria AFA NP16847 (prep. po ultrafiltracji), warunki z Przykładu 1 #3 = Prep. NP16847 przed ultrafiltracją, ekstrakcja 50% etanolem w 60°C (Przykład 24) #4 = Prep. NP16847 po ultrafiltracji, ekstrakcja 50% etanolem w 60°C (Przykład 24) #5 = Prep. NP16847 przed ultrafiltracją, ekstrakcja 50% etanolem w 70°C (Przykład 25) #6 = Prep. NP16847 po ultrafiltracji, ekstrakcja 50% etanolem w 70°C (Przykład 25) #7 = Materiał nierozpuszczony w czasie ekstrakcji 70% etanolem w 40°C, prep. NP16847 po ultrafiltracji reekstrahowany 50% etanolem w 60°C (Przykład 44) #8 = Materiał przed ultrafiltracją, ekstrakcja 100% wodą w 95°C (Przykład 40) #9 = Materiał po ultrafiltracji, ekstrakcja 100% wodą w 95°C (Przykład 40)

Ponowna analiza NP16847 otrzymanego w przykładzie 1 (NP1) potwierdziła poprzednio już ustalony dla tego materiału skład węglowodanów. Ponieważ w przykładach 4-44 używano inną partię AFA (dostarczoną przez inną firmę), do wyodrębniania preparatu NP 16847 z tego nowego materiału zastosowano sposób ekstrakcji opisany w przykładzie 1 (NP2). Okazało się, że zarówno ten preparat NP16847 jak i NP1 mają porównywalne składy glikozylowe, co świadczy o zgodności różnych partii AFA pod względem jakości. Jednakże preparat NP2 okazał się pięciokrotnie mniej aktywny niż NP1 (Tabela 5), co zostało prawdopodobnie spowodowane stratami aktywnych polisacharydów w wyniku

PL 203 814 B1 ich przechodzenia do fazy butanolowej podczas operacji rozpuszczania w mieszaninie n-butanolu i wody. Na ogół również podobne składy glikozylowe stwierdzono dla preparatów NP 16847 przed i po ultrafiltracji (NP3 - NP6), otrzymanych przy zastosowaniu optymalnych warunków ekstrakcji (50% etanol w temperaturze 60°C i 70°C). Jednakże preparat NP16847 przed ultrafiltracją miał znacznie wyższą zawartość glukozy, a niższą N-acetylowanych jednostek cukrowych niż preparat po ultrafiltracji. Biorąc pod uwagę zgodność składów węglowodanowych między tymi różnymi preparatami NP16847 (NP1 - NP7) należy uznać za oczywiste, że głównymi resztami glikozylowymi w tym materiale są mannoza, ramnoza, arabinoza i glukoza. W celu zidentyfikowania O-metylowanych cukrów wykrytych w analizie TMS-metyloglikozydów, do zbadania składu glikozylowego zastosowano również metodę z octanem alditolu. Stwierdzono, że występującymi w omawianych preparatach metylowanymi resztami cukrowymi są 2-metyloramnoza, 3-metyloramnoza, 4-metyloramnoza, 2-metylofukoza, 3-metyloarabinoza i 3-metylomannoza. Interesujące, że te preparaty NP16847 zawierają 5,1% - 12,5% metylowanych reszt węglowodanowych i wysoką zawartość procentową dezoksyheksoz (na przykład ramnozy i fukozy). Obie te cechy mogą tłumaczyć niezwykłą łatwość z jaką polisacharydowy materiał NP16847 ulega ekstrakcji przy użyciu wodnego alkoholu o stosunkowo wysokich stężeniach.

Ponieważ w wartościach EC50 dla badanych próbek (NP1 - NP7) zdarzają się różnice nawet pięćdziesięciokrotne, można by oczekiwać także różnic w ich składzie węglowodanowym. Ponieważ jednak różnic tych się nie obserwuje to oczywistym staje się fakt, że parametr ten nie może być użyty jako kryterium oceny czystości i aktywności preparatów NP16847. Dlatego też cechami odpowiedniejszymi dla oceny preparatów NP16847 będą ich aktywność biologiczna, wielkość cząsteczek i podatność na ekstrakcję wodnym etanolem. Możliwe jest, że to raczej jakaś pojedyncza cecha budowy NP16847 decyduje o jego zdolności do aktywacji monocytów/makrofagów i że nie odgrywa tu roli specyficzny skład węglowodanowy. Możliwe jest również, że składy kompozycji węglowodanowych NP1 NP7 odpowiadają zawartości polisacharydów poddających się ekstrakcji wodnymi roztworami etanolu i w tej grupie będą znajdować się polisacharydy immunostymulujące jako odrębna klasa o określonej budowie. Za taką interpretacją przemawia obserwacja, że materiał otrzymany przez ekstrakcję gorącą wodą (NP8 i NP9) ma skład węglowodanowy zupełnie inny niż preparaty NP16847 wyodrębnione przez ekstrakcję wodno-etanolową (NP1 - NP7). Główną resztą glikozylowa występującą w preparatach otrzymanych przez ekstrakcję AFA gorącą wodą, zarówno przed jak i po ultrafiltracji była glukoza (Tabela 5). Inną cechą odróżniającą NP8 i NP9 od materiału NP16847 wyodrębnionego przez ekstrakcję wodnym etanolem jest niższa zawartość procentowa ramnozy.

P r z y k ł a d 45 - Ekstrakcja 60% metanolem w temperaturze 65°C i bezpośrednie wytrącenie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 65°C ekstrakcji 60% metanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 1 godziny i drugi raz stosując 6,25 mL również w ciągu 1 godziny. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,5 mL) odwirowano, a następnie stężenie metanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% metanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 75 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 1,8%.

P r z y k ł a d 46 - Ekstrakcja 40% izopropanolem w temperaturze 65°C i bezpośrednie wytrącenie 80% alkoholem g Liofilizowanego AFA poddawano w temperaturze 65°C ekstrakcji 40% izopropanolem pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL w ciągu 1 godziny i drugi raz stosując 6,25 mL również w ciągu 1 godziny. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,5 mL) odwirowano, a następnie stężenie izopropanolu w supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% izopropanolu. Mieszaninę pozostawiono następnie przez kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50 100 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 12,0%.

P r z y k ł a d 47 - Ekstrakcja 100% etanolem w temperaturze wrzenia i wytrącenie przez schłodzenie do temperatury -20°C g Liofilizowanego AFA ekstrahowano przez ogrzewanie do wrzenia pod chłodnicą zwrotną ze 100% etanolem pierwszy raz przy użyciu 8 mL w ciągu 1 godziny i drugi raz stosując 6,5 mL również w ciągu 1 godziny. Połączone supernatanty z obu ekstrakcji (11,0 mL) pozostawiono następnie przez

PL 203 814 B1 kilka godzin w temperaturze -20°C, po czym osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym

95% etanolem. Wydzielony materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu mg/mL. W tym procesie ekstrakcji uzyskano preparat NP16847 przed ultrafiltracją o wartości EC50

750 ng/mL w teście aktywacji monocytów; wydajność tego preparatu wynosiła 0,68%.

P r z y k ł a d 48 - Ekstrakcja immunostymulującego materiału polisacharydowego wodnym alkoholem z innych jadalnych mikroalg (Chlorella i Spirulina)

Sposób otrzymywania NP16847 z AFA z zastosowaniem do wstępnej ekstrakcji wodnego etanolu w warunkach optymalnych, pozwala na uzyskiwanie preparatu dwudziestokrotnie aktywniejszego niż materiał otrzymywany z zastosowaniem do ekstrakcji gorącej wody (wartości EC50 dla aktywacji monocytów wynoszą odpowiednio 25 ng/mL wobec 500 ng/mL).

Ten sam sposób ekstrakcji wodnym etanolem można również zastosować do innych jadalnych mikroalg w celu otrzymywania z nich preparatów wzbogaconych w immunostymulujące polisacharydy. Na przykład, w poprzednio publikowanych opisach patentowych (16, 17, 27) ujawniono, że gatunki Chlorella i Spirulina zawierają immunostymulujące polisacharydy, które poddaje się ekstrakcji gorącą wodą. Jednakże okazało się, że dzięki zastosowaniu do ekstrakcji wodnego alkoholu (zamiast gorącej wody) uzyskuje się selektywne wzbogacenie w polisacharydy o własnościach immunostymulujących, co oznacza, że otrzymane z tych organizmów preparaty wykazują wyższą aktywność biologiczną, oraz że poprawia się procentowa wydajność materiału aktywnego (patrz poniżej opisane doświadczenia).

W doświadczeniach tych wykorzystano następujące jadalne mikroalgi: Chlorella pyrenoidosa (Sun Chlorella, próbka nr WS 1422) i Spirulina platensis (Nature's Way, próbka nr 912091). Wszystkie preparaty polisacharydowe stanowiły materiał przed ultrafiltracją. W celu przygotowania ekstraktów w gorącej wodzie 1 g liofilizowanej mikroalgi poddawano jednorazowej ekstrakcji przy użyciu 20 mL wody w temperaturze 95°C, w ciągu 30 minut. Do gorących wodnych ekstraktów dodawano etanol do uzyskania jego stężenia 80%, a następnie pozostawiono mieszaninę w temperaturze -20°C przez noc. Po wydzieleniu wydajność osadu z gatunku Chlorella wynosiła 13,2%, a wartość EC50 wynosiła dla niego 1000 ng/mL. Wydzielony osad otrzymany z gatunku Spirulina miał dla aktywacji monocytów/makrofagów wartość EC50 = 10 000 ng/mL; procentowa wydajność wynosiła 16,5%.

Wodno-etanolowe ekstrakty otrzymywano zmieniając stopniowo zarówno temperaturę jak i stężenie rozpuszczalnika (procentową zawartość etanolu w wodzie), które stosowano we wstępnej ekstrakcji. Kryteriami przyjętymi przy ustalaniu optymalnych warunków otrzymywania immunostymulującego materiału polisacharydowego były: uzyskiwana wydajność i wartość EC50 w teście aktywacji makrofagów. Ekstrakty z Chlorella i Spirulina otrzymywano według następującego sposobu: 1 g liofilizowanej mikroalgi ekstrahowano w odpowiedniej temperaturze pierwszy raz przy użyciu 7,5 mL wodnego etanolu w ciągu 2 godzin i drugi raz przy użyciu 6,25 mL wodnego etanolu w ciągu 2 godzin. Supernatanty z obydwu ekstrakcji połączono (11,3 mL) i odwirowano, a następnie stężenie etanolu w uzyskanym supernatancie doprowadzono do 80% przez dodanie zimnego 100% etanolu. Po schłodzeniu przez kilka godzin w temperaturze -20°C wytrącony osad oddzielono przez odwirowanie i przemyto zimnym 95% etanolem. Następnie uzyskany materiał wysuszono w próżni i rozpuszczono w wodzie w stężeniu 10 mg/mL.

Warunki ekstrakcji zapewniające zarówno optymalną wydajność jak aktywność immunostymulującą preparatów polisacharydowych z Chlorella i Spirulina były podobne do warunków optymalnych (50% etanol w temperaturze 60°C - 70°C) dla ekstrakcji NP16847 z AFA. Optymalne warunki dla otrzymywania immunostymulującego preparatu z Chlorella to prowadzenie wstępnej ekstrakcji przy użyciu 50% etanolu w temperaturze 70°C. Warunki te zapewniają uzyskiwanie preparatu przed ultrafiltracją o wartości EC50 25 ng/mL z wydajnością 6,5%. W przypadku Spirulina, optymalne warunki dla otrzymywania immunostymulującego preparatu polisacharydowego polegają na wstępnej ekstrakcji przy użyciu 40% - 50% etanolu w temperaturze między 50°C a 70°C. Warunki te zapewniają uzyskiwanie preparatu przed ultrafiltracją o EC50 500 ng/mL z wydajnością 9,0%. Dla porównania, jakkolwiek ekstrakcja gorącą wodą daje około dwukrotnie wyższe wydajności materiału, to jednak materiały te są 20 do 40 razy mniej aktywne niż preparaty otrzymywane sposobem, w którym zastosowano optymalne warunki ekstrakcji wodnym etanolem.

Podsumowując, należy stwierdzić, że opracowano prosty i wydajny sposób wyodrębniania

NP16847 zapewniający uzyskiwanie optymalnych wyników. Optymalne warunki ekstrakcji dla otrzymywania preparatu NP16847 przed ultrafiltracją to bezpośrednie wytrącenie alkoholem (stężenie 80% w temperaturze -20°C) z dwóch szarży ekstrakcji, przy czym każdą prowadzi się 1 godzinę używając

50% etanol w temperaturze 60°C - 70°C. Wydajność uzyskanego preparatu NP16847 przed ultrafiltraPL 203 814 B1 cją wynosi 11% w stosunku do suchej masy użytego AFA. Przeprowadzenie dodatkowego etapu obejmującego ultrafiltrację prowadzącą do oddzielenia wszystkich substancji o masie cząsteczkowej poniżej 100000 g/mol pozwala na otrzymanie względnie czystego preparatu polisacharydowego NP16847 z wydajnością 4,5% - 5,6%. Preparaty przed i po ultrafiltracji mają w przybliżeniu takie same wartości EC50 (25 ng/mL dla preparatu przed ultrafiltracją i 20 ng/mL dla preparatu po ultrafiltracji). W porównaniu z materiałem NP16847 otrzymanym w przykładzie 1 (ekstrakcja 70% etanolem w temperaturze 40°C), ten zoptymalizowany preparat po ultrafiltracji zawiera od 7,5 do 9,3 razy więcej NP16847 charakteryzującego się pięciokrotnie wyższą aktywnością. Opracowany sposób nadaje się zarówno do otrzymywania ekstraktu (roślinnego) stanowiącego uzupełnienie żywienia, jak do otrzymywania produktu farmaceutycznego w dużej skali.

Sposób opisany dla otrzymywania immunostymulujących kompozycji polisacharydowych (NP16847) z mikroalgi AFA można stosować również w celu otrzymywania preparatów wzbogaconych w immunostymulujące polisacharydy (na przykład te które aktywują monocyty/makrofagi) z innych mikroalg (do których należą gatunki Chlorella i Spirulina). Wyjątkową kompozycję węglowodanów we wszystkich trzech preparatach polisacharydowych z mikroalg uzyskuje się dzięki zastosowaniu sposobu, który zapewnia selektywne wzbogacenie tych preparatów w polisacharydy o działaniu immunostymulującym. Przy zastosowaniu tradycyjnego sposobu polegającego na ekstrakcji gorącą wodą te polisacharydy ekstrahują się bardzo słabo. Preparaty otrzymane przez ekstrakcję gorącą wodą są 20 do 40 razy mniej aktywne niż preparaty otrzymane zoptymalizowanym sposobem.

Preparaty farmaceutyczne

Przedmiotem wynalazku są także wytwarzane w dużej skali tanie preparaty polisacharydowe. Mikroalgi z których wyodrębnia się te preparaty polisacharydowe można hodować w tankach, podobnie jak hoduje się te mikroalgi obecnie do celów handlowych z przeznaczeniem do konsumpcji. Oznacza to, że nie będzie tu trudności z dostępnością surowca, co często ma miejsce w przypadku produkcji leków z surowców naturalnych. Będące przedmiotem wynalazku preparaty polisacharydowe występują w wysokich stężeniach (między 6,5% a 11% suchej masy mikroalgi) a sposób według wynalazku umożliwia proste, szybkie i tanie ich wyodrębnianie.

Ponieważ omawiane preparaty polisacharydowe mają zastosowanie jako leki w immunoterapii do leczenia niedoborów odporności, w raku, w procesach gojenia ran i w chorobach infekcyjnych, przedmiotem niniejszego wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne zawierające te preparaty, ewentualnie w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami lub zaróbkami.

Przeznaczone do stosowania kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają aktywne składniki w ilości niezbędnej do wywołania zamierzonego efektu terapeutycznego. Terapeutycznie skuteczna ilość oznacza ilość wystarczającą do zapobiegania rozwojowi występujących u leczonego osobnika objawów, lub do ich złagodzenia. Sposób określenia skutecznej terapeutycznie ilości jest dla specjalistów oczywisty, zwłaszcza w świetle przedstawionych w niniejszym opisie szczegółowych danych.

Ilość podawanej kompozycji zależy od leczonego stanu chorobowego, leczonego osobnika, jego masy ciała, ostrości dolegliwości, przyjętego sposobu podawania i indywidualnej oceny sytuacji dokonanej przez lekarza.

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można wytworzyć sposobem ogólnie znanym, na przykład przez zwykłe zmieszanie, rozpuszczenie, granulowanie, sporządzanie drażetek, sproszkowanie, utworzenie emulsji, kapsułkowanie, zamknięcie w dowolnych formach lub liofilizację.

Kompozycje farmaceutyczne przeznaczone do stosowania według wynalazku można więc wytwarzać w znany sposób przy użyciu jednego, lub większej ilości fizjologicznie dopuszczalnych nośników, zaróbek i substancji pomocniczych ułatwiających nadanie składnikom kompozycji formy preparatu, który może być stosowany jako farmaceutyk. Przyjęta forma preparatu zależna jest od wybranej drogi podawania.

W celu sporządzenia preparatu do iniekcji składniki według wynalazku przeprowadza się w wodne roztwory, korzystnie w fizjologicznie zgodnych buforach takich jak roztwór Hanks'a, roztwór Ringer'a, lub bufor w roztworze soli fizjologicznej. W preparatach przeznaczonych do stosowania na śluzówkę używa się środków wspomagających przechodzenie leku przez barierę, która musi być pokonana. Środki takie znane są specjalistom od produkcji leków.

Kompozycje przeznaczone do podawania doustnego sporządza się łatwo przez połączenie aktywnych składników z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, które są dobrze znane w technologii produkcji leków. Takie nośniki umożliwiają przeprowadzenie składników według wynalazku w formy

PL 203 814 B1 tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, płynów, żelów, syropów, past, zawiesin i tym podobne, przeznaczone do spożycia przez leczonego pacjenta. Preparaty farmaceutyczne do podawania doustnego można wytworzyć przy użyciu stałej zaróbki przez ewentualne zmielenie powstałej mieszaniny i dalszą obróbkę granulatu, po dodaniu odpowiednich substancji pomocniczych w celu otrzymania, w zależności od potrzeby, tabletek lub rdzeni drażetek. Odpowiednimi zaróbkami są zwłaszcza wypełniacze takie, jak cukry, w tym laktoza, cukier trzcinowy, mannitol, lub sorbitol; preparaty celulozowe takie jak na przykład skrobia kukurydziana, skrobia z pszenicy, skrobia ryżowa, skrobia ziemniaczana, żelatyna, guma tragakantowa, metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza, karboksymetyloceluloza sodowa i/lub poliwinylopirolidon (PVP).

W razie potrzeby można dodawać środki rozpraszające takie jak poprzecznie usieciowany poliwinylopirolidon, agar, lub kwas alginowy, lub jego sole takie jak alginian sodowy.

Rdzenie drażetek pokrywa się odpowiednimi powłokami. Można do tego celu używać zagęszczone roztwory cukru, które mogą ewentualnie zawierać gumę arabską, talk, poliwinylopirolidon, żel karbopol, glikol polietylenowy i/lub dwutlenek tytanu, roztwory lakieru i odpowiednie rozpuszczalniki organiczne, lub mieszaniny tych rozpuszczalników. Do tabletek, lub powłok drażetek można dodawać barwniki, lub pigmenty w celu rozróżniania, lub oznaczania różnych kombinacji dawek aktywnych składników.

Do preparatów farmaceutycznych, które mogą być podawane doustnie należą składane kapsułki żelatynowe, jak również zamknięte, zatopione kapsułki wykonane z żelatyny z dodatkiem plastyfikatora takiego, jak gliceryna, lub sorbitol. Kapsułki składane mogą zawierać składniki aktywne w mieszance z wypełniaczem takim jak laktoza, substancjami wiążącymi takimi jak skrobie, i/lub substancjami poślizgowymi takimi jak talk, lub stearynian magnezu i ewentualnie stabilizatory. W miękkich kapsułkach składniki aktywne mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich cieczach takich, jak oleje tłuszczowe, ciekła parafina, lub ciekłe glikole polietylenowe. Ponad to, można do nich dodawać stabilizatory. Wszystkie preparaty do podawania doustnego powinny zawierać odpowiednie do takiego podawania dawki substancji czynnych.

Kompozycje przeznaczone do ssania mogą mieć formę tabletek, lub pastylek sporządzonych w znany sposób.

Przeznaczone do podawania drogą inhalacji kompozycje według wynalazku są na ogół dostarczane w formie aerozolu w ciśnieniowych pojemnikach, lub nebulizerach zawierających odpowiedni nośnik, na przykład dichlorodifluorometan, trichlorofluorometan, dichlorotetrafluoroetan, dwutlenek węgla, lub inny odpowiedni gaz. Kapsułki i naboje na przykład z żelatyny do stosowania w inhalatorach i urządzeniach do wdmuchiwania mogą zawierać aktywną mieszankę składnika czynnego i odpowiedniego sypkiego podłoża takiego jak laktoza, lub skrobia.

Można również sporządzać kompozycje przeznaczone do podawania pozajelitowego w postaci iniekcji, na przykład w formie bolusa, lub ciągłego wlewu. Kompozycje do iniekcji mogą mieć formę jednostek dawkowania, na przykład ampułek, lub wielodawkowych pojemników, z dodatkiem substancji konserwujących. Kompozycje mogą mieć postać zawiesin, roztworów lub emulsji, w olejowych lub wodnych nośnikach i mogą zawierać substancje pomocnicze takie, jak czynniki ułatwiające tworzenie zawiesin, stabilizatory i/lub substancje rozpraszające.

Preparaty farmaceutyczne do stosowania pozajelitowego zawierają wodne roztwory składników aktywnych w postaci rozpuszczalnej w wodzie. Można ponad to sporządzać zawiesiny kompozycji aktywnych w postaci odpowiednich oleistych zawiesin do iniekcji. Jako lipofilowe rozpuszczalniki, lub nośniki można stosować oleje tłuszczowe, jak olej sezamowy, lub syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, takie jak oleinian etylu, lub triglicerydy, lub liposomy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje zwiększające lepkość, takie jak karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol, lub dekstran. Ewentualnie, zawiesina może również zawierać stabilizatory, lub czynniki zwiększające rozpuszczalność związków, a zatem umożliwiające sporządzenie roztworów o wysokim stężeniu.

Składnik czynny może mieć również postać proszku, z którego przy użyciu odpowiedniego nośnika, na przykład sterylnej, wolnej od pirogenów wody, przygotowuje się formę bezpośrednio przed użyciem.

Można również sporządzać kompozycje do stosowania doodbytniczego, takie jak czopki, lub wlewy doodbytnicze, przy czym kompozycje takie mogą na przykład zawierać znane podłoża do czopków, takie jak masło kakaowe, lub inne glicerydy.

Poza opisanymi wyżej formami farmaceutycznymi można także sporządzać preparaty typu depot. Takie preparaty o przedłużonym działaniu można stosować przez implantację (na przykład podPL 203 814 B1 skórnie, lub domięśniowo), lub drogą iniekcji domięśniowej. I tak na przykład, można sporządzać kompozycje przy użyciu odpowiednich materiałów polimerycznych, lub hydrofobowych (na przykład w postaci emulsji w fizjologicznie dopuszczalnym oleju), lub żywic jonowymiennych, lub słabo rozpuszczalnych pochodnych, na przykład słabo rozpuszczalnej soli.

Kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać odpowiednie nośniki, lub zaróbki w postaci stałej, lub w formie żelu. Do takich nośników, lub zaróbek należą na przykład węglan wapnia, fosforan wapnia, różne cukry, skrobie, pochodne celulozy, żelatyna i polimery, takie jak glikole polietylenowe. Podane substancje stanowią tylko przykłady nieograniczające zakresu wynalazku.

Do odpowiednich możliwych dróg podawania należą na przykład doustna, doodbytnicza, przez śluzówkę, przez skórę, lub dojelitowa; podawanie pozajelitowe obejmuje iniekcje domięśniowe, podskórne, dordzeniowe, jak również dooponowe, bezpośrednie dokomorowe, dożylne, dootrzewnowe, donosowe, lub śródoczne.

Można również stosować kompozycję w sposób bardziej miejscowy niż układowy, na przykład drogą wstrzyknięcia związku bezpośrednio w obszar dotknięty chorobą, często w postaci depot, lub w formie zapewniającej spowolnione uwalnianie.

Ponad to, możliwe jest podawanie leku w postaci zapewniającej skierowanie go do właściwego miejsca w organizmie, na przykład w liposomie pokrytym przeciwciałem specyficznym dla zaatakowanych chorobowo komórek. Liposom będzie skierowany do komórek i selektywnie przez nie wchłonięty.

Kompozycje mogą być, w zależności od potrzeby, oferowane w opakowaniach, lub urządzeniach dozujących zawierających jedną lub większą ilość zawierających składnik czynny jednostek dawkowych. Opakowanie może na przykład stanowić metalowa, lub plastykowa folia, tak jak w opakowaniach blistrowych. Do opakowania, lub urządzenia dozującego może być dołączona instrukcja stosowania. Można również sporządzać preparaty zawierające kompozycje według wynalazku w kompatybilnym nośniku farmaceutycznym umieszczone w odpowiednim pojemniku z etykietą na której podano wskazania do stosowania. Takim wskazaniem może być leczenie choroby.

Suplementy diety

Przeznaczone do stosowania według wynalazku suplementy diety obejmują kompozycje zawierające składniki aktywne w ilości wystarczającej do osiągnięcia zamierzonego celu. Ilość wystarczająca to taka, która zapobiega rozwojowi występujących u poddawanego kuracji osobnika objawów, lub powoduje ich złagodzenie. Sposób określenia tej wystarczającej ilości jest dla specjalistów oczywisty, zwłaszcza w świetle przedstawionych w niniejszym opisie szczegółowych danych.

Ilość podawanej kompozycji zależy od rodzaju dolegliwości, leczonego osobnika, jego masy ciała, ostrości dolegliwości, sposobu podawania i indywidualnej oceny sytuacji dokonanej przez lekarza.

Suplementy diety według niniejszego wynalazku zawierają składniki aktywne w mieszaninie z nadającymi się do celów spożywczych zaróbkami i/lub nośnikami. Zastosowana postać nośnika i tym samym takż e samego suplementu diety nie jest istotna. Noś nik moż e być ciekł y, mieć postać żelu, gelcap, kapsułki, proszku, twardej tabletki (powlekanej, lub niepowlekanej), herbatki i tym podobne. Do odpowiednich zaróbek i/lub nośników należą maltodekstryna, węglan wapnia, fosforan dwupotasowy, fosforan trójpotasowy, celuloza mikrokrystaliczna, dekstroza, mąka ryżowa, stearynian magnezu, kwas stearowy, kroskarmeloza sodowa, glikolan sodowy skrobiowy, usieciowany powidon, sacharoza, gumy roślinne, agar, laktoza, metyloceluloza, powidon, karboksymetyloceluloza, skrobia kukurydziana i tym podobne (w tym mieszaniny wyżej wymienionych). Różne składniki i zaróbki i/lub nośniki miesza się i nadaje im odpowiednie formy stosując znane techniki. Wysokość dawki zawartej w jednostce dawkowej dobiera się tak, aby przy zażywaniu sensownej ilości jednostek dawkowych uzyskać zalecane dzienne dozowanie.

Preparat uzupełniający żywienie może fakultatywnie zawierać również inne składniki takie, jak na przykład zioła, witaminy, składniki mineralne, środki wzmacniające, barwniki, środki słodzące, aromaty, składniki obojętne i tym podobne. Takie fakultatywnie stosowane składniki mogą być używane w postaci naturalnej, bą d ź jako koncentraty. Wybór jednego, lub kilku z tych składników jest przedmiotem badań nad opracowaniem formy i projektowaniem jej, zależy też od preferencji konsumenta i ostatecznego odbiorcy. Omawiane skł adniki dodaje się do suplementów diety w iloś ciach znanych specjalistom. Przy doborze tych ilości można kierować się zamieszczonymi w U.S. RDA danymi na temat dawkowania u dzieci i dorosłych.

PL 203 814 B1

Bibliografia

Wszystkie odsyłacze, przytoczenia, lub odniesienia umieszczone w niniejszym Zgłoszeniu Patentowym wyszczególniono w poniższym zestawieniu.

1. Hadden, J. W. Immunostimulants. Immunol. Today 1993, 14, 275-280.

2. Masihi, K. N. Immunomodulatory agents for prophylaxis and therapy of infections. Int. J. Antimicrob. Agents 2000, 74,181-191.

3. Van Kampen, K. R. Immunotherapy and cytokines. Semin. Vet. Med. Surg. (Small Anim.) 1997, 12,186-192.

4. Franz, G. Polysaccharides in pharmacy: Current applications and future concepts. Planta Med. 1989, 55, 493-497.

5. Frank, M. O.; Mandell, G. L. Immunomodulators. In Principles and Practice of Infectious Diseases, chapter 33, 4th ed.; Mandell, G. L., Bennett, J. E., Dolin, R., Eds.; Churchill Livingstone: New York, 1995; pp 450-458.

6. Wilson, K. Wound healing: the role of macrophages. Nurs. Crit. Care 1997, 2, 291-296.

7. King, G. K.; Yates, K. M.; Greenlee, P. G.; Pierce, K. R.; Ford, C. R.; McAnalley, B. H.; Tizard, I. R. The effect of Acemannan Immunostimulant in combination with surgery and radiation therapy on spontaneous canine and feline fibrosarcomas. J. Am. Animal Hosp. Assoc. 1995, 31: 439-47.

8. Natori, T.; Motoki, K.; Higa, T.; Koezuka, Y. KRN7000 as a new type of anti-tumor and immunostimulatory drug. In Drugs from the Sea; Fusetani, N., Ed.; Karger: New York, 2000; pp 86-97.

9. Shu, Y. Z. Recent natural products based drug development: A pharmaceutical industry perspective. J. Nat. Prod. 1998, 61, 1053-1071.

10. Ciferri, O. Spirulina, the edible microorganism. Microbiol. Rev. 1983, 47, 551-578.

11. Dantas, D. C; Kaneno, R.; Queiroz, M. L. The effects of Chlorella vulgaris in the protection of mice infected with Listeria monocytogenes. Role of natural killer cells. Immunopharmacol. lmmunotoxicol. 1999, 17, 609-619.

12. Dantas, D. C; Queiroz, M. L. Effects of Chlorella vulgaris on bone marrow progenitor cells of mice infected with Listeria monocytogenes. Int. J. Immunopharmacol. 1999, 21, 499-508.

13. Qureshi, M. A.; Garlich, J. D.; Kidd, M. T. Dietary Spirulina platensis en-hances humoral and cell-mediated immune functions in chickens. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 1996, 18, 465-476.

14. Mathew, B.; Sankaranarayanan, R.; Nair, P. P.; Varghese, C; Somanathan, T.; Amma,

B. P.; Amma, N. S.; Nair, M. K. Evaluation of chemoprevention of oral cancer with Spirulina fusiformis. Nutr. Cancer 1995, 24, 197-202.

15. Jensen, G. S.; Ginsberg, D. I.; Huerta, P.; Citton, M.; Drapeau, C. Consumption of Aphanizomenon flos-aquae has rapid effects on the circulation and function of immune cells in humans. JANA 2000, 2, 50-58.

16. Umezawa, I.; Komiyama, K. Acidic polysaccharide CH-1 isolated from Chlorella pyrenoidosa and the use thereof. U.S. Patent 4,533,548, 1985.

17. Watanabe, S.; Seto, A. Ingredient effective for activating immunity obtained from Chlorella minutissima. U.S. Patent 4,831,020,1989.

18. Watanabe, S.; Fujita, T. Immunopotentiating agent having anti-tumor activity U.S. Patent

4,786,496, 1988.

19. Shinpo, K. Anticancer agent. U.S. Patent 4,822,612,1989.

20. Noda, K.; Ohno, N.; Tanaka, K.; Okuda, M.; Yadomae, T.; Nomoto, K.; Shoyama, Y. A new type of biological response modifier from Chlorella vulgaris which needs protein moiety to show an antitumor activity. Phytother Res. 1998, 12, 309-319.

21. Tanaka, T.; Yamada, A.; Noda, K.; Hasegawa, T.; Okuda, M.; Shoyama, Y.; Nomoto, K. A novel glycoprotein obtained from Chlorella vulgaris strain CK22 shows antimetastatic immunopotentiation. Cancer Immunol. Immunother. 1998, 45, 313-320.

22. Noda, K.; Ohno, N.; Tanaka, K.; Kamiya, N.; Okuda, M.; Yadomae, T.; Nomoto, K.; Shoyama, Y. A water-soluble antitumor glycoprotein from Chlorella vulgaris. Planta Med. 1996, 62, 423-426.

23. Matsueda, S.; Shinpo, K.; Tanaka, K.; Abe, K.; Karasawa, H. Studies on anti-tumor active glycoprotein from Chlorella vulgaris. II. Sci. Rep. Hirosaki Univ. 1983, 30, 127-131.

24. Morimoto, A.; Nagatsu, A.; Murakami, N.; Sakakibara, J.; Tokuda, H.; Nishino, H.; Iwashima, A. Anti-tumor-promoting glyceroglycolipids from the green alga, Chlorella vulgaris. Phytochemistry 1995, 40, 1433-1437.

PL 203 814 B1

25. Mishima, T.; Murata, J.; Toyoshima, M.; Fujii, H.; Nakajima, M.; Hayashi, T.; Kato, T.; Saiki,

I. Inhibition of tumor invasion and metastasis by calcium spirulan (Ca-SP), a novel sulfated polysaccharide derived from a blue-green alga, Spirulina platensis. Clin. Exp. Metastasis 1998, 16, 541-550.

26. Lee, J. B.; Hayashi, T.; Hayashi, K.; Sankawa, U.; Maeda, M.; Nemoto, T.; Nakanishi, H. Further purification and structural analysis of calcium spirulan from Spirulina platensis. J. Nat. Prod. 1998, 61, 1101-1104.

27. Hayashi, T.; Hayashi, K; Kojima, I. Antiviral polysaccharide. U.S. Patent 5,585,365, 1996.

28. Wang, H.; Zeng, H. P.; Yang, S. Z. Isolation, purification and some properties of the watersoluble polysaccharides from Spirulina platensis. Jingxi Huagong 1999, 16, 26-29.

29. Wu, J.; Zhang, C; Liu, Y. Isolation, purification and immunological activities of extracellular polysaccharide EP II from Spirulina maxima. Yaowu Shengwu-Jishu 1999, 6, 99-102.

30. Zhang, Y.; Li, H.; Gao, J.; Shen, Z.; Lin, W.; Fu, H. New process for separation and purification of polysaccharides from Spirulina platensis. Shipin Yu Fajiao Gongye 1999, 25,15-18.

31. Elgert, K. D.; Alleva, D. G.; Mullins, D. W. Tumor-induced immune dysfunction: the macrophage connection. J. Leukoc. Biol. 1998, 64, 275-290.

32. Morrissette, N.; Gold, E.; Aderem, A. The macrophage: a cell for all seasons. Trends Cell. Biol. 1999, 9, 199-201.

33. Gordon, S. The role of the macrophage in immune regulation. Res. Immunol. 1998, 149, 685-688.

34. Adams, D. O.; Hamilton, T. A. Molecular basis of macrophage activation: diversity and its origins. In The Natural Immune System: The Macrophage; Lewis, C. E., McGee, J. O'D., Eds.; Oxford University Press Inc.: New York, 1992; pp 75-114.

35. ay, M. J.; Ghosh, S. Signal transduction through NF-kappa B. Immunol. Today' 1998, 19,

80-88.

36. Baeuerte, P. A.; Henkel, T. Function and activation of NF-kappa B in the immune system. Annu. Rev. Immunol. 1994, 12, 141-179.

37. Chang, C. C; Zhang, J.; Lombard!, L; Neri, A.; Dalla-Favera, R. Mechanism of expression and role in transcriptional control of the proto-oncogene NFKB-2/LYT-10. Oncogene, 1994, 9, 923-933.

38. York, W. S.; Darvill, A. G.; McNeil, M.; Stevenson, T. T.; Albersheim, P. Isolation and characterization of plant cell walls and cell wall components. MethodsEnzymol. 1986, 118, 3-40.

39. Hakomori, S. Rapid permethylation of glycolipids and polysaccharides, catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethyl sulfoxide. J. Biochem. Tokyo 1964, 55, 205-208.

40. Azadi, P.; O'Neill, M. A.; Bergmann, C.; Darvill, A. G.; Albersheim, P. The backbone of the pectic polysaccharide rhamnogalacturonan I is cleaved by an endohydrolase and an endolyase. Glycobiology 1995, 5, 783-789.

41. Sturgeon, R. J. Monosaccharides: colorimetric assays. In Methods in Plant Biochemistry, vol. 2, chapter 1; Dey, P. M., Harborne, J. B., Eds.; Academic Press: New York, 1990; pp 4-12.

42. Su, S.; Vivier, R. G.; Dickson, M. C; Thomas, N.; Kendrick, M. K.; Williamson, N. M.; Anson,

J. G.; Houston, J. G.; Craig, F. F. High-throughput RT-PCR analysis of multiple transcripts using a microplate RNA isolation procedure. Biotechniques, 1997, 22, 1107-1113.

43. Zhang, X.; Liu, M.; Liu, Q.; Wan, H.; Shanghao, L Preliminary isolation and spectral characteristics of phycocyanin of Gymnodinium cyaneum. Kexue Tongbao 1982, 27, 115-117.

44. Ogawa, K.; Tezuka, S.; Tsucha, Y.; Tanabe, Y.; Iwamoto, H. Phycocyanin as a chewing gum coloring agent. Japanese Patent 54138156,1979.

Claims (87)

1. Preparat immunostymulujący wyodrębniony z mikroalg zawierający polisacharydy ekstrahowalne za pomocą rozpuszczalnika zawierającego wodę lub mieszaninę wody i co najmniej jednego alkoholu, zawierającego od 1 do 4 atomów węgla, znamienny tym, że wspomniane aktywne polisacharydy mają masę cząsteczkową wynoszącą powyżej 2 milionów g/mol i obejmują składniki glikozylowe wybrane spośród mannozy, glukozy, ramnozy, galaktozy, fukozy, cukrów metylowanych, N-acetylowanych aminocukrów, arabinozy lub kwasu glukuronowego.

2. Preparat immunostymulujący według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność immunostymulująca wyraża się przez aktywację monocytów/makrofagów.

PL 203 814 B1

3. Preparat immunostymulujący według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae.

4. Preparat immunostymulujący według zastrz. 2, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae.

5. Preparat immunostymulujący według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Chlorella pyrenoidosa.

6. Preparat immunostymulujący według zastrz. 2, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Chlorella pyrenoidosa.

7. Preparat immunostymulujący według zastrz. 1, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Spirulina platensis.

8. Preparat immunostymulujący według zastrz. 2, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Spirulina platensis.

9. Preparat immunostymulujący według zastrz. 3, znamienny tym, że składniki glikozylowe aktywnych polisacharydów obejmują mannozę, glukozę, ramnozę, galaktozę, fukozę, cukry metylowane i N-acetylowane aminocukry.

10. Preparat immunostymulujący według zastrz. 4, znamienny tym, że składniki glikozylowe aktywnych polisacharydów obejmują mannozę, glukozę, ramnozę, galaktozę, fukozę, cukry metylowane i N-acetylowane aminocukry.

11. Preparat immunostymulujący według zastrz. 5, znamienny tym, że składniki glikozylowe aktywnych polisacharydów obejmują arabinozę, galaktozę, ramnozę, glukozę i cukry metylowane.

12. Preparat immunostymulujący według zastrz. 6, znamienny tym, że składniki glikozylowe aktywnych polisacharydów obejmują arabinozę, galaktozę, ramnozę, glukozę i cukry metylowane.

13. Preparat immunostymulujący według zastrz. 7, znamienny tym, że składniki glikozylowe aktywnych polisacharydów obejmują ramnozę, kwas glukuronowy, fukozę, galaktozę i cukry metylowane.

14. Preparat immunostymulujący według zastrz. 8, znamienny tym, że składniki glikozylowe aktywnych polisacharydów obejmują ramnozę, kwas glukuronowy, fukozę, galaktozę i cukry metylowane.

15. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera preparaty immunostymulujące określone w zastrzeżeniu 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.

16. Suplement diety, znamienny tym, że zawiera preparaty immunostymulujące określone w zastrzeżeniu 1 i nośnik lub zaróbkę, które są dopuszczalne w suplementach diety.

17. Zastosowanie preparatu immunostymulującego określonego w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do wzmacniania funkcji odpornościowej u osobnika wymagającego takiego leczenia.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że osobnik cierpi na infekcję wirusową, bakteryjną lub grzybową.

19. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że osobnik cierpi na raka.

20. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że osobnik cierpi na niedobór odporności.

21. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że osobnikiem jest człowiek.

22. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że osobnikiem jest zwierzę.

23. Zastosowanie preparatu immunostymulującego określonego w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania suplementu diety do wzmacniania funkcji odpornościowej u osobnika wymagającego takiego leczenia.

24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że osobnik cierpi na infekcję wirusową, bakteryjną lub grzybową.

25. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że osobnik cierpi na raka.

26. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że osobnik cierpi na niedobór odporności.

27. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że osobnikiem jest człowiek.

28. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że osobnikiem jest zwierzę.

29. Zastosowanie według jednego z zastrzeżeń 17-28, znamienne tym, że wzbudzenie funkcji odpornościowej wyraża się poprzez stymulację aktywności monocytów/makrofagów u osobnika wymagającego takiego leczenia.

30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że stymulacja aktywności monocytów/makrofagów przyspiesza gojenie się ran.

PL 203 814 B1

31. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że stymulacja aktywności monocytów/makrofagów jest zwiększona w odniesieniu do raka.

32. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że stymulacja aktywności monocytów/makrofagów jest zwiększona w odniesieniu do niedoboru odporności.

33. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że stymulacja aktywności monocytów/makrofagów jest zwiększona w odniesieniu do infekcji wirusowej, bakteryjnej lub grzybowej.

34. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że osobnikiem jest człowiek.

35. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że osobnikiem jest zwierzę.

36. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae.

37. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że mikroalgi należą do gatunku Chlorella pyrenoidosa.

38. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że mikroalgi należą do gatunku Spirulina platensis.

39. Sposób otrzymywania preparatu z jadalnych mikroalg, znamienny tym, że preparat z jadalnych mikroalg wzbogacony w immunostymulujące polisacharydy określone w zastrzeżeniu 1 otrzymuje się w następujących etapach:

a. wytwarza się ekstrakt przez ekstrakcję mikroalg przy użyciu rozpuszczalnika zawierającego wodę lub mieszaninę wody i co najmniej jednego alkoholu zawierającego od 1 do 4 atomów węgla, a temperatura prowadzenia ekstrakcji mieści się w zakresie od 4°C do 100°C;

b. opcjonalnie zatęża się ekstrakt;

c. wytrąca się preparat polisacharydowy z ekstraktu za pomocą środków służący do wytrącania;

d. oddziela się wytrącony preparat polisacharydowy za pomocą środków służących do oddzielania; i

e. przemywa się osad z etapu (d) przy użyciu 95%-owego etanolu.

Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że alkoholem stosowanym do ekstrakcji jest Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że alkoholem stosowanym do ekstrakcji jest etanol.

metanol.

42. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że alkoholem stosowanym do ekstrakcji jest izopropanol lub propanol.

43. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że stężenie alkoholu w etapie (a) wynosi korzystnie od 20% do 80%.

44. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że temperatura ekstrakcji wynosi od 40°C do 80°C.

45. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae.

46. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Chlorella pyrenoidosa.

47. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że mikroalgi należą do gatunku Spirulina platensis.

48. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez odparowanie rozpuszczalnika, nym ciśnieniem.

49. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez liofilizację.

50. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez dializę.

51. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez dodanie etanolu do uzyskania końcowego stężenia 80% etanolu.

52. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez schłodzenie ekstraktu.

53. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez dodanie soli.

54. Sposób według zastrz. 53, znamienny tym, że jako sól stosuje się siarczan amonu.

że zatężanie w etapie (b) korzystnie pod zmniejszo34

PL 203 814 B1

55. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy oddziela się w etapie (d) przez odsączenie.

56. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy oddziela się w etapie (d) przez odwirowanie.

57. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy przemywa się w etapie (e) przy użyciu 95%-owego etanolu.

58. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytrąconego osadu przez rozpuszczenie go w wodzie i usunięcie przez ultrafiltrację zasadniczo wszystkich składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 100000 g/mol.

59. Sposób według jednego z zastrzeżeń 39-42, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytrąconego osadu przez rozpuszczenie go w wodzie i usunięcie zasadniczo wszystkich składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 2 miliony g/mol przez kolumnową chromatografię wielkościowo wykluczającą.

60. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosowane mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae.

61. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosowane mikroalgi należą do gatunku Chlorella pyrenoidosa.

62. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosowane mikroalgi należą do gatunku Spirulina platensis.

63. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że temperatura ekstrakcji wynosi od 40°C do 80°C.

64. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez odparowanie rozpuszczalnika, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem.

65. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez liofilizację.

66. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez dializę.

67. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez dodanie etanolu do uzyskania końcowego stężenia 80% etanolu.

68. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez dodanie soli.

69. Sposób według zastrz. 68, znamienny tym, że jako sól stosuje się siarczan amonu.

70. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez schłodzenie ekstraktu.

71. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy oddziela się w etapie (d) przez odsączenie.

72. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy oddziela się w etapie (d) przez odwirowanie.

73. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy przemywa się w etapie (e) przy użyciu 95%-owego etanolu.

74. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytrąconego osadu przez rozpuszczenie go w wodzie i usunięcie przez ultrafiltrację zasadniczo wszystkich składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 100000 g/mol.

75. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytrąconego osadu przez rozpuszczenie go w wodzie i usunięcie zasadniczo wszystkich składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 2 miliony g/mol przez kolumnową chromatografię wielkościowo wykluczającą.

76. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że stosowane mikroalgi należą do gatunku Aphanizomenon flos-aquae.

11. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że stosowane mikroalgi należą do gatunku Chlorella pyrenoidosa.

78. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że stosowane mikroalgi należą do gatunku Spirulina platensis.

79. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez odparowanie rozpuszczalnika, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem.

PL 203 814 B1

80. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez liofilizację.

81. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że zatężanie w etapie (b) prowadzi się, jeśli jest to potrzebne, przez dializę.

82. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez dodanie etanolu do uzyskania końcowego stężenia 80% etanolu.

83. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez dodanie soli.

84. Sposób według zastrz. 83, znamienny tym, że jako sól stosuje się siarczan amonu.

85. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że preparat polisacharydowy wytrąca się w etapie (c) przez schłodzenie ekstraktu.

86. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy oddziela się w etapie (d) przez odsączenie.

87. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy oddziela się w etapie (d) przez odwirowanie.

88. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że wytrącony preparat polisacharydowy przemywa się w etapie (e) przy użyciu 95%-owego etanolu.

89. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytrąconego osadu przez rozpuszczenie go w wodzie i usunięcie przez ultrafiltrację zasadniczo wszystkich składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 100000 g/mol.

90. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap oczyszczania wytrąconego osadu przez rozpuszczenie go w wodzie i usunięcie zasadniczo wszystkich składników o masie cząsteczkowej mniejszej niż 2 miliony g/mol przez kolumnową chromatografię wielkościowo wykluczającą.