CN111205376B - 一种疣荔枝螺多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种疣荔枝螺多糖的制备方法及其应用，以新鲜疣荔枝螺(Thais clavigera Kuster)为起始材料，经水煮，脱壳取肉，真空冷冻干燥处理过后，以碱水提取，乙醇沉淀，蛋白酶酶解，大孔树脂脱色，超滤后获得的已除去蛋白和色素，分子量大于10kD的精多糖组分。本发明制备的疣荔枝螺多糖具有显著的抗乙肝活性，能显著降低血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量，对保肝护肝具有重要作用。

Description

一种疣荔枝螺多糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种疣荔枝螺多糖的制备方法及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一种典型的噬肝性DNA病毒，慢性感染乙肝病毒会发展成为肝纤维化、肝硬化、肝功能代偿不全，乃至肝癌。乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染引起的慢性坏死性疾病，已成为全球主要的公共健康问题，其所致的肝脏恶性肿瘤居恶性肿瘤第五位。抑制或者杀灭乙肝病毒对于乙肝治疗有着极其重要的作用。目前临床用于慢性乙肝病毒治疗的药物分为两类：一类是免疫调节剂，其应答率低且副作用大；另一类是核苷酸类似物，其易积累耐药性且疗程漫长，需要终身治疗，因此研发新的安全有效的抗HBV药物是当务之急。

现研究证明，多糖因具有优异的抗氧化、清除自由基等作用，且具有高效、低毒、高生物利用率的特点，在预防和治疗由自由基引起的疾病如肿瘤、炎症等方面显示出独特的优越性，而且在提高机体免疫力方面有重要作用。目前，已有研究表明猪苓多糖、螺旋藻多糖、海藻硫酸多糖等多糖提取物有较好的抗HBV活性。

疣荔枝螺又称苦螺、辣螺，是一种在闽南地区非常受欢迎的可食用软体动物，民间有食用该海螺达到保肝护肝目的的习惯，亦有食用该海螺成功将乙肝转阴的案例。现代医学研究表明，该海螺有较好的抗炎作用，但是在抗乙肝病毒及保肝护肝方面的研究成果还比较少，迄今为止，尚无相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种疣荔枝螺多糖的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述疣荔枝螺多糖的应用。

本发明的技术方案如下：

一种疣荔枝螺多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将疣荔枝螺粉末用正己烷进行脱脂处理，获得脱脂疣荔枝螺粉末；

(2)将上述脱脂疣荔枝螺粉末与浓度为0.8-1.2wt％的氢氧化钠溶液混合后，于70-80℃浸提2-3次，每次1-2h，再经固液分离，获得疣荔枝螺水提取液；

(3)将上述疣荔枝螺水提取液调pH至中性后，置于旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得到浓缩疣荔枝螺水提取液；

(4)将上述浓缩疣荔枝螺水提取液与无水乙醇混合后，室温静置至沉淀出现，经离心和过滤获得第一沉淀；

(5)将上述第一沉淀进行冷冻干燥后复溶于蒸馏水，经离心和过滤以除去水不溶物，获得第一滤液；

(6)将上述第一滤液与无水乙醇混合后，室温静置至沉淀出现，经离心和过滤获得第二沉淀；

(7)将上述第二沉淀进行冷冻干燥，得到第一疣荔枝螺粗多糖；

(8)将上述第一疣荔枝螺粗多糖溶于蒸馏水后，加入胰蛋白酶或木瓜蛋白酶进行酶解，获得酶解液；

(9)在上述酶解液中加入Sevage试剂，充分搅拌混匀，离心除去不容物，收集上层液，然后以上层液代替上述酶解液重复该步骤直至无明显沉淀，获得上清液；

(10)将上述上清液浓缩冷冻干燥，得到第二疣荔枝螺粗多糖；

(11)将上述第二疣荔枝螺粗多糖溶于蒸馏水中，经大孔树脂吸附脱色，然后经10kD超滤管离心，收集该10kD超滤管上层的液体，对该液体进行浓缩冷冻干燥，即得所述疣荔枝螺多糖。

在本发明的一个优选实施方案中，所述疣荔枝螺粉末的制备方法包括：将大小均一的新鲜的疣荔枝螺洗净去除泥沙后，置于清水中加热煮沸3-5min，凉水迅速冷却，及时挑出可食用肉质部位，其余部位弃置；将该可食用肉质部位置于冰箱中冷冻至少24h，然后迅速取出放入真空冷冻干燥箱中24-48h直至完全干燥，接着置于中药粉碎机中粉碎，过75-85目筛网，即得。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)中的脱脂疣荔枝螺粉末与氢氧化钠溶液的料液比为1∶8-12。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(7)中的酶解的条件为：酶用量为3-5％，时间为1.8-2.2h，温度为58-61℃，pH＝7.4-7.6。

本发明的另一技术方案如下：

上述制备方法制备的疣荔枝螺多糖在制备防治乙型病毒性肝炎药物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述防治乙型病毒性肝炎药物的剂型为注射制剂或口服制剂。

本发明的再一技术方案如下：

上述制备方法制备的疣荔枝螺多糖在制备保肝护肝的保健品中的应用。

本发明的有益效果是：本发明以新鲜疣荔枝螺(Thais clavigera Kuster)为起始材料，经水煮，脱壳取肉，真空冷冻干燥处理过后，以碱水提取，乙醇沉淀，蛋白酶酶解，大孔树脂脱色，超滤后获得的已除去蛋白和色素，分子量大于10kD的精多糖组分，其具有显著的抗乙肝活性，能显著降低血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量，对保肝护肝具有重要作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中疣荔枝螺多糖对HBV转基因小鼠肝脏病理变化外观的影响。

图2为本发明实施例1中疣荔枝螺多糖对HBV转基因小鼠肝脏重量的影响。

图3为本发明实施例1中疣荔枝螺多糖对HBV转基因小鼠作用后的肝脏组织H.E染色。

图4为本发明实施例1中疣荔枝螺多糖对HBV转基因小鼠肝脏功能指标AST、ALT的影响。

图5为本发明实施例1中疣荔枝螺多糖对HBV转基因小鼠血清指标HBsAg、HBeAGg和HBVDNA的影响。

图6为本发明实施例1中疣荔枝螺多糖对HBV转基因小鼠肝脏组织指标HBsAg、HBeAGg、HBVDNA和HBVRNA的影响。

图7为本发明实施例1中疣荔枝螺多糖样品与单糖标准品经PMP衍生化后的HPLC图谱。其中，(a)为单糖标准品经PMP衍生化后的HPLC混合图谱；(b)为多糖样品经PMP衍生化后的HPLC图谱；1-甘露糖；2-氨基葡萄糖；3-葡萄糖醛酸；4-半乳糖醛酸；5-葡萄糖；6-半乳糖；7-鼠李糖；8-阿拉伯糖。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

一种疣荔枝螺多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将疣荔枝螺粉末用正己烷进行脱脂处理，获得脱脂疣荔枝螺粉末，具体为：取300g上述疣荔枝螺粉末，按适当比例加入正己烷于快速提取器中，每次提取1-2min，重复3次，抽滤后弃去澄清的亮黄色溶液，取沉淀，即为脱脂后疣荔枝螺粉末，晾干备用；

疣荔枝螺粉末的制备方法包括：将大小均一的新鲜的疣荔枝螺洗净去除泥沙后，置于清水中加热煮沸3-5min，凉水迅速冷却，及时挑出可食用肉质部位，其余部位弃置；将该可食用肉质部位置于冰箱中冷冻至少24h，然后迅速取出放入真空冷冻干燥箱中24-48h直至完全干燥，接着置于中药粉碎机中粉碎，过80目筛网，即得；

(2)将上述脱脂疣荔枝螺粉末与浓度为0.1wt％的氢氧化钠溶液以1∶10的料液比混合后，于70℃浸提2-3次，每次50min，再经固液分离，获得疣荔枝螺水提取液；

(3)将上述疣荔枝螺水提取液冷却后，用0.1mol/L HCl调pH至中性后，置于旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得到浓缩疣荔枝螺水提取液；

(4)将上述浓缩疣荔枝螺水提取液缓慢与无水乙醇混合后，室温静置至沉淀出现，经离心和过滤获得73.0g第一沉淀；

(5)将上述第一沉淀进行冷冻干燥后复溶于蒸馏水，经离心和过滤以除去水不溶物，获得第一滤液；

(6)将上述第一滤液与无水乙醇混合后，室温静置至沉淀出现，经离心和过滤获得第二沉淀；

(7)将上述第二沉淀进行冷冻干燥，得到118.15g第一疣荔枝螺粗多糖；

(8)将上述第一疣荔枝螺粗多糖溶于蒸馏水后，加入木瓜蛋白酶进行酶解，获得酶解液；酶解的条件为：酶用量为4％，时间为2h，温度为60℃，pH＝7.5，然后升温到90℃作用15min使酶灭活，冷却至室温，用0.1mol/L HCl调pH至中性；

(9)在上述酶解液中加入Sevage试剂(CHCl₃∶正丁醇＝5∶1，体积比)，充分搅拌混匀，离心除去不容物，收集上层液，然后以上层液代替上述酶解液重复该步骤直至无明显沉淀，获得上清液；

(10)将上述上清液浓缩冷冻干燥，得到第二疣荔枝螺粗多糖；

(11)将上述第二疣荔枝螺粗多糖溶于蒸馏水中，经大孔树脂吸附脱色(分两次通过r＝2.5cm，h＝35cm的D101大孔吸附树脂填充柱，用蒸馏水进行洗脱，经硫酸苯酚法对洗脱液中多糖进行鉴定，直到洗脱液中不再检测到多糖则停止洗脱；将洗脱液浓缩，再次通过洁净的r＝2.5cm，h＝35cm的D101大孔吸附树脂填充柱进行第二次脱色处理。浓缩洗脱液，得到除色素后的粗多糖。若颜色较深，可利用活性炭再次脱色)，然后分别使用3kD、10kD的超滤管对脱色后的粗多糖去除小分子杂质，并且对多糖进行初步分段，离心，将上层溶液冷冻干燥，称重得到总多糖18.77g，计算多糖得率为6.25％。其中得到分子量10kD以上的精制多糖13.90g，分子量介于3kD-10kD的精制多糖3.73g，分子量小于3kD的精制多糖1.14g。将分子量10kD以上的精制多糖用蒸馏水复溶，除去不溶物，取上清冷冻干燥，得到分子量在10kD以上的所述疣荔枝螺多糖9.7g。

HBV转基因小鼠模型体内药效学

实验设计和方法：实验动物为SPF级HBV转基因小鼠(C57BL/6-HBV，北京维通达生物技术有限公司)25只，随机分成5组，每组5只，分别为泰诺福韦艾拉酚胺(TAF)组(阳性对照组)、低剂量组、中剂量组、高剂量组和溶媒组(阴性对照)，饲养于SPF级二级生物安全实验室屏障环境中。阳性对照组以10mg/kg*d的剂量给药泰诺福韦艾拉酚胺(TAF)，实验组高中低三组依次给药剂量为50mg/kg*d、100mg/kg*d、150mg/kg*d，阴性对照组为溶媒，给药途径为腹腔注射。每天同一时间给药，连续给药28天。

血清及肝组织样品的制备：实验小鼠28天腹腔注射给药结束以后，对所有的实验小鼠禁食不禁水饲养12小时，剪掉胡须，摘眼球取血0.5至1mL，4℃静置，并将小鼠颈椎脱臼处死，解剖取出完整肝脏，用预冷的生理盐水漂洗后，吸水纸吸去肝脏表面的水后，称重，取肝脏左叶置于10％中性福尔马林液中固定，用于后期制备病理切片。取肝组织右叶相同位置的组织，清洗后与匀浆液混合，充分破碎，离心，取上清液。

实验结果：

1.实验动物肝脏外观、重量和病理切片H.E.染色

小鼠肝脏外观观察：图1为小鼠肝脏外观图，各组小鼠肝脏颜色均红润，阴性对照组即模型组表面有少许针尖状坏死灶和少许微小结节，不光滑，边缘有明显的血管淤血。阳性对照组与治疗组肝脏有光泽，无坏死点点和出血。给药28d后HBV转基因小鼠肝脏重量见表1。

表1

注：^*与溶媒组显著性差异分析p＜0.05；^**与溶媒组显著性差异分析p＜0.01

表1结果显示，与溶媒组阴性对照相比，阳性对照TAF组和治疗组肝重均有减轻，有显著性差异，其中疣荔枝螺多糖高剂量组肝重减轻效果最显著(p＜0.01)。HBV转基因小鼠由于能够产生完整的HBV病毒颗粒，对肝细胞有很强的杀伤作用，引起肝重代偿性增生和炎性水肿，从而使肝重增加。模型动物肝重减轻能直观反应出肝脏炎性水肿减轻或者增生减弱，肝重实验结果表明，疣荔枝螺多糖对HBV转基因小鼠在器官水平上有一定的治疗作用(图2)。

2.实验组HBV转基因小鼠肝组织H.E.染色

阴性对照组肝细胞肿胀，细胞核深染较多，肝小叶结构紊乱，肝索几乎不可见，未见假小叶。实验组与阳性对照TAF组肝组织均有一定程度的恢复，肝细胞肿胀程度很很大减轻，可见部分肝索结构，部分肝窦亦可见，但整体未达到正常肝脏状态。其中高剂量与中剂量组效果均优于阳性对照组，肝细胞肿胀程度较轻，肝索更为明显、有序。切片H.E.染色结果表明，疣荔枝螺多糖对HBV转基因小鼠肝脏有明显的改善作用，在实验剂量下优于阳性对照TAF。(见图3)

3.实验组对HBV转基因小鼠肝功能(AST、ALT)生化指标的影响

谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)被誉为人体类物质代谢催化剂，在肝细胞的胞浆里面含量丰富，也是衡量肝脏正常与否的重要指标，当HBV病毒颗粒从肝细胞释放导致细胞破裂受损时，血清中的AST和ALT的含量就会上升，以此来进行临床诊断。肝功能(AST、ALT)指标检测结见表2。

表2

注：^*与溶媒组显著性差异分析p＜0.05；^**与溶媒组显著性差异分析p＜0.01

图4显示小鼠血清中AST和ALT含量的变化，结果表明，与溶媒组阴性对照相比，实验组AST和ALT含量均有明显的降低，尤其是高剂量组，在实验剂量下效果优于阳性对照TAF组。表明疣荔枝多糖有明显的降低转氨酶，改善HBV引起的肝功能损伤，具有明显的保肝护肝作用，与实施例五中在器官层面和细胞层面表现的结果一致。

4.实验组对HBV转基因小鼠血清标志物(HBsAg、HBeAg和HBV DNA)的影响

乙肝病毒表明抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)是临床上判断HBV感染的重要指标。乙肝表面抗原(HBsAg)是HBV的外壳蛋白，本身具有抗原性，不具有传染性，但它的出现常伴随HBV的存在，所以它是已感染HBV的标志。HBeAg是病毒的核心内部成分，在病毒血清学检测中被认为是病毒复制的标志，表示肝细胞存在进行性损害和高度的传染性。HBVDNA为HBV脱氧核糖核酸，也是病毒核心部分，为判断病毒复制性的金指标，HBV DNA定量检查则是检测HBV感染最直接的一项指标。临床上通过定量检测HBV在乙肝患者血液中的含量可以判断患者感染现状以及准确评价药物的治疗效果。以上三个指标是目前最常用的用于评估抗HBV活性的重要指标。实验组对HBV转基因小鼠血清指标的影响见表3。

表3

注：^*与溶媒组显著性差异分析p＜0.05；^**与溶媒组显著性差异分析p＜0.01

结果显示，实验组与溶媒组相比有显著的抑制效果，多糖各组显示出较好的剂量依赖性。其中阳性对照组对HBsAg、HBeAg的抑制作用与低剂量组和中剂量组相当，但弱于高剂量组；HBV DNA的抑制作用优于疣荔枝螺多糖组。(见图5)

5、实验组对HBV转基因小鼠肝脏标志物(HBsAg、HBeAg、HBV DNA和RNA)的影响

HBV是一种嗜肝病毒，可在肝脏中大量增殖，肝脏组织中HBV病毒颗粒的含量可通过肝组织中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平反应出来，而肝细胞中HBV RNA的水平可反应出HBV的复制情况。实验组对HBV转基因小鼠肝脏指标的影响见表4。

表4

注：^*与溶媒组显著性差异分析p＜0.05；^**与溶媒组显著性差异分析p＜0.01

表4结果显示，实验组与溶媒组相比，肝组织中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平以及HBV RNA的水平均有显著性的降低，多糖各组显示出较好的剂量依赖性。除HBV DNA外，其他各指标显示，多糖中剂量和高剂量组均优于阳性对照TAF组，表明多糖在HBV RNA合成中起到一定的抑制作用，与TAF通过抑制DNA复制的作用机理相比，可能有着新的作用机制。(见图6)

疣荔枝螺多糖单糖组成成分分析

疣荔枝螺多糖的酸水解：准确称取上述分子量在10kD以上的疣荔枝螺多糖(10±0.1mg)置于10mL的容量瓶中并用蒸馏水定容，取1mL多糖溶液于5mL的圆底烧瓶中，加入2mL2mol/mL的三氟乙酸溶液，在105℃油浴锅中加热回流反应12h，取出蒸干溶剂，并向烧瓶中滴加甲醇，蒸干，重复三次。将固体转移至5mL容量瓶中，并用蒸馏水定容，即得到多糖水解液。

多糖的衍生化及纯化：准确移取上述多糖水解液100μL于2.5mL的离心管中，加入100μL 0.5mol/mL的1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液和100μL 0.3mol/L氢氧化钠溶液，涡旋混合，70℃水浴反应2h，取出冷却至室温，加入100μL 0.3mol/L盐酸溶液，涡旋混合，加入1mL三氯甲烷，充分振荡，超速离心机离心后静置分层，弃去下层CCl₃层，按照上述方法用CCl₃充分萃取三次，将上层水相过0.45μm滤膜，进高效液相色谱分析。

单糖标准工作液的衍生化：分别准确移取浓度为10mg/mL的单糖[D-甘露糖(Man)、L-鼠李糖(Rha)、D-葡萄糖(Glc)、DL-阿拉伯糖(Arab)、半乳糖醛酸、D-半乳糖(Gal)、D-葡萄糖醛酸(Glc-UA)、氨基葡萄糖]标准工作液100μL于2.5mL的离心管中，加入100μL 0.5mol/L的1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液和100μL 0.3mol/L氢氧化钠溶液，涡旋混合，70℃水浴反应2h，取出冷却至室温，加入100μL 0.3mol/L盐酸溶液，涡旋混合，加入1mL CCl₃，充分振荡，超速离心机12000r/min离心2min后静置分层，弃去下层CCl₃层，按照上述方法用CCl₃充分萃取3次，取水层，制备单糖系列标准溶液衍生物。将单糖系列标准溶液衍生物过0.45μm滤膜，进高效液相进行色谱分析。以单糖系列标准溶液衍生物的峰面积为纵坐标，以相应单糖的浓度为横坐标绘制标准曲线。

色谱条件

色谱柱：C18反相色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)。

柱温：40℃。

流速：0.9mL/min。

检测波长：250nm。

进样量：20μL。

流动相：A：磷酸缓冲盐-乙腈溶液A[(KH₂PO₄-NaOH，pH＝6.9)∶乙腈(85∶15)]

B：磷酸缓冲盐-乙腈溶液B[(KH₂PO₄-NaOH，pH＝6.9)∶乙腈(60∶40)]

表5流动相梯度洗脱程序

疣荔枝螺多糖和单糖经PMP衍生化后的HPLC图谱HPLC结果见如图7，单糖成分分析结果如表6所示：

表6

如图7所示，将疣荔枝螺多糖衍生化后的HPLC图谱和标准品进行对比分析，结果表明疣荔枝螺多糖主要含有的单糖为：甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。上述各单糖的最简摩尔比约为9∶16∶4∶512∶9∶4。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.疣荔枝螺多糖在制备防治乙型病毒性肝炎药物中的应用，其特征在于：所述疣荔枝螺多糖的制备方法包括如下步骤：

（1）将疣荔枝螺粉末用正己烷进行脱脂处理，获得脱脂疣荔枝螺粉末；

（2）将上述脱脂疣荔枝螺粉末与浓度为0.8-1.2wt%的氢氧化钠溶液混合后，于70-80℃浸提2-3次，每次1-2h，再经固液分离，获得疣荔枝螺水提取液；

（3）将上述疣荔枝螺水提取液调pH至中性后，置于旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得到浓缩疣荔枝螺水提取液；

（4）将上述浓缩疣荔枝螺水提取液与无水乙醇混合后，室温静置至沉淀出现，经离心和过滤获得第一沉淀；

（5）将上述第一沉淀进行冷冻干燥后复溶于蒸馏水，经离心和过滤以除去水不溶物，获得第一滤液；

（6）将上述第一滤液与无水乙醇混合后，室温静置至沉淀出现，经离心和过滤获得第二沉淀；

（7）将上述第二沉淀进行冷冻干燥，得到第一疣荔枝螺粗多糖；

（8）将上述第一疣荔枝螺粗多糖溶于蒸馏水后，加入胰蛋白酶或木瓜蛋白酶进行酶解，获得酶解液；

（9）在上述酶解液中加入Sevage试剂，充分搅拌混匀，离心除去不容物，收集上层液，然后以上层液代替上述酶解液重复该步骤直至无明显沉淀，获得上清液；

（10）将上述上清液浓缩冷冻干燥，得到第二疣荔枝螺粗多糖；

（11）将上述第二疣荔枝螺粗多糖溶于蒸馏水中，经大孔树脂吸附脱色，然后经10kD超滤管离心，收集该10kD超滤管上层的液体，对该液体进行浓缩冷冻干燥，即得所述疣荔枝螺多糖。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述疣荔枝螺粉末的制备方法包括：将大小均一的新鲜的疣荔枝螺洗净去除泥沙后，置于清水中加热煮沸3-5min，凉水迅速冷却，及时挑出可食用肉质部位，其余部位弃置；将该可食用肉质部位置于冰箱中冷冻至少24h，然后迅速取出放入真空冷冻干燥箱中24-48 h直至完全干燥，接着置于中药粉碎机中粉碎，过75-85目筛网，即得。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中的脱脂疣荔枝螺粉末与氢氧化钠溶液的料液比为1:8-12。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（8）中的酶解的条件为：酶用量为3-5%，时间为1.8-2.2h，温度为58-61℃，pH=7.4-7.6。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的应用，其特征在于：所述防治乙型病毒性肝炎药物的剂型为注射制剂或口服制剂。

6.疣荔枝螺多糖在制备保肝护肝的保健品中的应用，其特征在于：所述疣荔枝螺多糖的制备方法包括如下步骤：

（1）将疣荔枝螺粉末用正己烷进行脱脂处理，获得脱脂疣荔枝螺粉末；

（2）将上述脱脂疣荔枝螺粉末与浓度为0.8-1.2wt%的氢氧化钠溶液混合后，于70-80℃浸提2-3次，每次1-2h，再经固液分离，获得疣荔枝螺水提取液；

（3）将上述疣荔枝螺水提取液调pH至中性后，置于旋转蒸发仪中进行减压浓缩，得到浓缩疣荔枝螺水提取液；

（4）将上述浓缩疣荔枝螺水提取液与无水乙醇混合后，室温静置至沉淀出现，经离心和过滤获得第一沉淀；

（5）将上述第一沉淀进行冷冻干燥后复溶于蒸馏水，经离心和过滤以除去水不溶物，获得第一滤液；

（6）将上述第一滤液与无水乙醇混合后，室温静置至沉淀出现，经离心和过滤获得第二沉淀；

（7）将上述第二沉淀进行冷冻干燥，得到第一疣荔枝螺粗多糖；

（8）将上述第一疣荔枝螺粗多糖溶于蒸馏水后，加入胰蛋白酶或木瓜蛋白酶进行酶解，获得酶解液；

（9）在上述酶解液中加入Sevage试剂，充分搅拌混匀，离心除去不容物，收集上层液，然后以上层液代替上述酶解液重复该步骤直至无明显沉淀，获得上清液；

（10）将上述上清液浓缩冷冻干燥，得到第二疣荔枝螺粗多糖；

（11）将上述第二疣荔枝螺粗多糖溶于蒸馏水中，经大孔树脂吸附脱色，然后经10kD超滤管离心，收集该10kD超滤管上层的液体，对该液体进行浓缩冷冻干燥，即得所述疣荔枝螺多糖。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述疣荔枝螺粉末的制备方法包括：将大小均一的新鲜的疣荔枝螺洗净去除泥沙后，置于清水中加热煮沸3-5min，凉水迅速冷却，及时挑出可食用肉质部位，其余部位弃置；将该可食用肉质部位置于冰箱中冷冻至少24h，然后迅速取出放入真空冷冻干燥箱中24-48 h直至完全干燥，接着置于中药粉碎机中粉碎，过75-85目筛网，即得。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中的脱脂疣荔枝螺粉末与氢氧化钠溶液的料液比为1:8-12。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤（8）中的酶解的条件为：酶用量为3-5%，时间为1.8-2.2h，温度为58-61℃，pH=7.4-7.6。

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