PL200676B1 - Sposób wytwarzania i izolowania białka o aktywności czynnika VIII i ludzkie linie komórkowe - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania i izolowania bia lka o aktywnosci czynnika VIII, który obejmuje hodowanie komórek oznaczonych przez American Type Culture Collection jako CRL-12568, które zawieraj a sekwencj e koduj ac a bia lko o aktywno sci czynnika VIII, funkcjonalnie po laczon a z promotorem, w warunkach wystarczaj acych do ekspresji i izolowanie bia lka. Wynalazek dotyczy tak ze ludzkiej linii komórkowej otrzymanej z ludzkich komórek ch loniaka i komórek 293S, która wyra za bia lko o aktywno sci czynnika VIII na wysokim poziomie. W zakres wynalazku wchodzi te z ludzka linia komórkowa oznaczona przez American Type Culture Collection jako CRL-12582. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania i izolowania białka o aktywności czynnika VIII oraz ludzkie linie komórkowe.

Niniejszy wynalazek dotyczy ulepszonego sposobu wytwarzania i czynnika VIII i jego pochodnych. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy procesu wytwarzania białka z aktywnością prokoagulacyjną czynnika VIII na skalę przemysłową.

Ludzki czynnik VIII jest śladową glikoproteiną osocza biorącą udział jako kofaktor w aktywacji czynnika X i czynnika IXa. Odziedziczony niedobór czynnika VIII powoduje hemofilię A, sprzężone z płcią zaburzenie krzepnię cia krwi, które moż e być leczone z powodzeniem oczyszczonym czynnikiem VIII. Terapia zastępcza hemofilii A ewoluowała od stosowania pochodzącego z osocza czynnika VIII do stosowania zrekombinowanego czynnika VIII uzyskanego przez klonowanie i ekspresję cDNA czynnika VIII w komórkach ssaków. (Wood i wsp., 1984, Nature 312: 330).

Czynnik VIII ma organizację domen A1-A2-B-A3-C1-C2 i jest syntetyzowany jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy z 2351 aminokwasów, z którego po translokacji do światła reticulum endoplazmatycznego odcinany jest 19-aminokwasowy peptyd sygnałowy. Ze względu na fakt, że czynnik VIII jest silnie glikozylowany, ekspresja na wysokim poziomie (>0,2 pg/c/d) czynnika VIII była trudna do uzyskania (Lind i wsp., 1995, Eur J Biochem. 232: 19-27; Kaufman i wsp., 1989, Mol Cell Biol: 9: 1233-1242). Ekspresja czynnika VIII w komórkach ssaków jest typowo 2-3 rzędy wielkości niższa niż obserwowana dla innych genów przy zastosowaniu podobnych wektorów i podejścia. Produktywność produkcyjnych linii komórkowych dla czynnika VIII była w zakresie 0,5 - 1 μυ/c/d (0,1 - 0,2 pg/c/d).

Wykazano, że domena B czynnika VIII jest zbędna dla aktywności prokoagulacyjnej. Kilka grup autorów (Lind i wsp., 1995, Eur J Biochem 232: 19-27; Tajima i wsp, 1990, Proc. 6^th Int Symp H. T. str. 51-63, patent US 5,661,008 dla Almstedt, 1997) doniosło, że stosowanie skróconych wariantów czynnika VIII poprawiło ekspresję czynnika VIII w komórkach ssaków. Jednak poziom ekspresji wariantów czynnika VIII pozostał poniżej 1 pg/c/d ze stabilnego klonu komórek.

Obecnie opracowaliśmy (i) sposób, który wyprowadza linie komórkowe z niesłychanie wysoką produktywnością białek mających aktywność prokoagulacyjną czynnika VIII i (ii) proces produkcji białek mających aktywność prokoagulacyjną czynnika VIII, wolny od białek osocza.

Według wynalazku sposób wytwarzania i izolowania białka o aktywności czynnika VIII, obejmuje hodowanie komórek oznaczonych przez American Type Culture Collection jako CRL-12568, które zawierają sekwencję kodującą białko o aktywności czynnika VIII, funkcjonalnie połączoną z promotorem, w warunkach wystarczających do ekspresji i izolowanie białka.

Korzystnie białko ma sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEKW. ID. Nr: 1 i jest wyrażane na poziomie co najmniej 2 gU/c/d, gdy komórki rosną w pożywce pozbawionej białek pochodzenia osoczowego. Bardziej korzystnie białko jest wyrażane na poziomie co najmniej 4gU/c/d, a najkorzystniej co najmniej 5 gU/c/d.

Wynalazek dotyczy również ludzkiej linii komórkowej otrzymanej z komórek oznaczonych przez American Type Culture Collection jako CRL-12568, które wyrażają białko o aktywności czynnika VIII. Korzystnie linia ta wyraża czynnik VIII z usuniętą domeną B.

W zakres wynalazku wchodzi ponadto ludzka linia komórkowa oznaczona przez American Type Culture Collection jako CRL-12582.

Sposób produkcji białek mających aktywność prokoagulacyjną czynnika VIII według wynalazku może być przeprowadzony na skalę przemysłową. Stosując nowo wytworzonego gospodarza komórkowego, wyprowadzono klony komórkowe o produktywności w zakresie 2-4 pg/komórkę/dzień (10 - 20 mU/c/d). W warunkach wolnych od surowicy, jeden klon utrzymał dzienną produkcję 2-4 pg/c/d. Klony z tym wysokim poziomem produktywności są zdolne do wytwarzania 3-4 milionów jednostek dziennie w 15-litrowym fermentorze perfuzyjnym. Jedna jednostka aktywności czynnika VIII jest to według definicji aktywność obecna w jednym mililitrze osocza. Jeden pg czynnika VIII jest na ogół równoważny około 5 gU aktywności FVIII.

W znaczeniu tu stosowanym, białko mające aktywność prokoagulacyjną czynnika VIII jest to białko, które powoduje aktywację czynnika VIII w układzie modelowym in vitro lub in vivo. Jako przykłady nieograniczające ta definicja obejmuje pełnej długości zrekombinowany ludzki czynnik VIII i czynnik VIII z usuniętą domeną B (BDD-FVIII), którego sekwencja jest opisana na figurze 1.

Wysoki poziom ekspresji białka mającego aktywność prokoagulacyjną czynnika VIII oznacza co najmniej około 2 gU/c/d, lub bardziej korzystnie co najmniej około 4 gU/c/d, lub najbardziej korzystnie

PL 200 676 B1 co najmniej około 5 μυ/c/d aktywności czynnika VIII, jeśli hodowla odbywa się w podłożu wolnym od białek pochodzących z osocza, lub co najmniej około 4 gU/c/d, lub bardziej korzystnie co najmniej około 8 gU/c/d, lub najbardziej korzystnie co najmniej około 10 gU/c/d aktywności czynnika VIII przy hodowli w podłożu uzupełnionym białkiem pochodzącym z surowicy. Gdy wyrażanym białkiem jest BDD-FVIII, można uzyskać linie komórkowe mające specyficzne produktywności do około 15 gU/c/d, bardziej korzystnie do około 20 gU/c/d, opisanym tu sposobem.

Stosowany tu do opisania pochodzenia linii komórkowych termin „wyprowadzony z” ma na celu obejmować, ale nie wyłącznie, normalny mitotyczny podział komórkowy i procesy, takie jak transfekcje, fuzje komórkowe lub inne techniki inżynierii genetycznej stosowane do zmiany komórek lub produkcji komórek o nowych właściwościach.

Krótki opis figur

Figura 1. Sekwencja aminokwasów BDD-FVIII (SEKW. ID. NR: 1).

Figura 2. Sekwencja końcowych powtórzeń (TR) sekwencji izolowanej z wirusa Epsteina-Barra (SEKW. ID. NR: 2).

Figura 3. Mapa plazmidu pCIS25DTR.

Figura 4 (a). Wyprowadzenie klonu 20B8.

Figura 4 (b). Porównanie produktywności kilku klonów w różnych podłożach. Podane są trzy zestawy danych z dwumiesięcznego testu stabilności każdego klonu.

Figura 5. Wolumetryczna produktywność klonu 20B8.

Oznaczenie FVIII

Aktywność pochodnych czynnika VIII uzyskanych z ekspresji zrekombinowanego genu w populacji komórek opornych na metotreksat (MTX) mierzono za pomocą oznaczenia chromogennego. Aktywność określano ilościowo stosując zestaw Coatest® czynnik VIII:C/4 (Cromogenix, Molndal, Szwecja) według instrukcji producenta. Jako wzorzec pomiaru w tym oznaczeniu stosowano standardowy czynnik antyhemofilityczny z USA (czynnik VIII) znany jako MEGA 1 (Office of Biologics Research and Review, Bethesda, MD). Zobacz Barrowcliffe, 1993, Thromb Haem 70:876.

Konstrukcja wektorów ekspresyjnych dla FVIII z wydeletowaną domeną B

Sekwencja czynnika FVIII z wydeletowaną domeną B (BDD) jest przedstawiona na figurze 1. Łańcuchy 90 kD i 80 kD połączono za pomocą linkera złożonego z 14 aminokwasów. Zobacz Chan S. Y. “Production of Recombinant Factor VIII in the Presence of Liposome-like Substances of Mixed Composition” zgłoszenie patentowe US Nr 08/634,001 złożone 16 kwietnia 1996. Wektor ekspresyjny dla BDD-FVIII wytworzono stosując standardowe techniki rekombinacji DNA. Struktura wektora ekspresyjnego (pCIS25DTR) jest przedstawiona na figurze 3. Wektor zawiera jednostkę transkrypcyjną dla BDD-FVIII i marker selekcyjny, reduktazę dihydrofolianową (dhfr). Dodatkowo do wektora wstawiono sekwencję powtórzeń terminalnych z wirusa Epsteina-Barra, która zwiększa stopień selekcji na leki (figura 2), w celu zwiększenia wydajności integracji. Wektor jest zasadniczo konstruktem wektora (zdeponowanego ATCC 98879), który został skonstruowany tak, aby zawierał jednostkę transkrypcyjną odpowiadającą sekwencji przedstawionej na figurze 1. Dalsze informacje o sekwencji powtórzeń terminalnych można znaleźć w pokrewnym zgłoszeniu patentowym, włączonym tu jako odniesienie, złożonym przez Cho i Chan, określonym jako MSB 7254 „Terminal repeat sequence of Epstein-Barr virus enhances drug selection ratio” złożonym w tym samym dniu jak niniejsze zgłoszenie.

Podobne wektory mogą być konstruowane i stosowane przez specjalistów w dziedzinie w celu otrzymania komórek wyrażających białka mające aktywność prokoagulacyjną czynnika VIII. Na przykład, sekwencja kodująca BDD-FVIII może być zastąpiona przez sekwencje kodujące znane warianty czynnika VIII, które zachowują aktywność prokoagulacyjną. Także zamiast dhfr mogą być stosowane inne markery selekcyjne, takie jak syntaza glutaminowa (gs) lub gen oporności wielolekowej (mdr). Wybór czynnika selekcyjnego musi być dokonany odpowiednio, jak to jest przyjęte w stanie techniki, tzn. dla dhfr korzystnym czynnikiem selekcyjnym jest metotreksat, dla gs korzystnym czynnikiem selekcyjnym jest sulfoksymina metioniny, a dla mdr korzystnym czynnikiem selekcyjnym jest kolchicyna.

Przykłady wykonania

Wyprowadzenie linii komórkowych wyrażających BDD-FVIII: Transfekcja, selekcja na lek i amplifikacja genu gg DNA pCIS25DTR przeniesiono do HKB11 (ATTC depozyt nr CRL 12568 - hybryda komórek 293S i komórek ludzkiego chłoniaka Burkitta (patrz zgłoszenie patentowe US złożone przez Cho i wsp. tego samego dnia jak obecne zgłoszenie i określone jako MSB-7241, włączone tu przez odniesienie) metodą elektroporacji ustawionej na 300 woltów i 300 mikrofaradów (BTX Electro cell

PL 200 676 B1

Manipulator 600) stosując kuwetę 2 mm (BTX część nr 620). W porównawczych eksperymentach przeprowadzonych równolegle do pracy z komórkami HKB11, transfekowano komórki CHO (jajnik chomika chińskiego) i komórki 293S (ludzka nerka zarodkowa) stosując lipidowy odczynnik kationowy DMRIE-C (Life Technologies, Gaithersburg, MD) według protokołu dostarczonego przez Life Technologies. Amplifikację transfekowanych komórek przeprowadzono ze wzrastającymi stężeniami metotreksatu (MTX) (100 nM, 200 nM, 400 nM i 800 nM przy 1 x 10⁶ komórek na płytkę 96-studzienkową w podłożu selekcyjnym MTX pozbawionym hipoksantyny i tymidyny (podłoż a DME/F12 bez hipoksantyny i tymidyny plus 5% dializowanej bydlęcej surowicy płodowej od Hyclone, Logan, UT). Komórki oporne na MTX oszacowano na wzrost i przeszukiwano pod kątem wydzielania BDD-FVIII stosując zestaw Coatest® czynnik VIII około 2-3 tygodni po transfekcji. Hodowlę komórek przeprowadzono w 37°C w nawilż onym inkubatorze z 5% CO2.

Klonowanie z rozcieńczeniem granicznym

Klony pojedynczych komórek (SCC) wyprowadzono przez klonowanie z rozcieńczeniem granicznym (LDC) wysoce produktywnych populacji w 96-studzienkowych płytkach w warunkach wolnych od surowicy. Komórki zaszczepiano z gęstością 1-10 komórek na studzienkę w podłożach DME/F12 uzupełnionych zrekombinowaną insuliną Humulin® (Lilly, Indianapolis, IN) przy 10 μg/ml, 10 x niezbędne aminokwasy (Life Technology, Gaithersburg, MD) i Plasmanate® frakcja białkowa surowicy ludzkiej. Frakcja białkowa surowicy ludzkiej (HPP) Plasmanate® zawiera ludzką albuminę (88%) i różne globuliny (12%). Klony przeszukiwano pod kątem produktywności BDD-FVIII stosując zestawy Coatest® czynnik VIII. Najwyżej produkujące klony wybrano do oceny stabilności w kolbach do wytrząsania. Dla komórek HKB przeprowadzono pierwszą rundę LDC stosując podłoże selekcyjne uzupełnione 5% dializowanym FBS. Drugą rundę LDC przeprowadzono w podłożu wolnym od surowicy ale zawierającym frakcję HPP Plasmanate® stosując pierwszy SCC przystosowany do podłoża wolnego od surowicy uzupełnionego frakcją HPP Plasmanate®.

Wyprowadzenie klonu HKB 20B8

Jak podsumowano na figurze 4 (a) wstępna populacja 1C10 została wyprowadzona z komórek HKB transfekowanych pCIS25DTR po amplifikacji z 400 nM MTX w podłożu selekcyjnym z 5% FBS. Jeden z pierwszych klonów pojedynczych komórek (SCC), 10A8, wyprowadzony z 1C10 metodą LDC z użyciem podłoża selekcyjnego uzupełnionego 5% FBS, zaadaptowano do podłoża wolnego od surowicy uzupełnionego frakcją HPP Plasmanate®. Nieoczekiwanie 10A8 wykazał w tym stadium niesłychanie podwyższone poziomy wytwarzania rFVIII (Figura 4b). Zatem przeprowadziliśmy drugie LDC stosując podłoże uzupełnione frakcją HPP Plasmanate®. Produktywność SCC (np. 20B8) wyprowadzonych z drugiego LDC była podobna do 10A8 przystosowanego do frakcji HPP Plasmanate®. 20B8 wykazał wyższe poziomy BDD-FVIII niż oryginalny 10A8 wyprowadzony z pierwszego LDC w podłożu zawierającym surowicę. W końcu, 20B8 przystosowano do wzrostu w podłożu wolnym od białek osocza (PPF). Próbki 20B8 zdeponowano w American Type Culture Collection (Manassas, VA) (ATCC depozyt nr CRL-12582).

Jak przedstawiono w tabeli 1, klony HKB wykazują wyższą produktywność dla BDD-FVIII. 10 - 20-krotny wzrost produktywności zaobserwowano w komórkach HKB w porównaniu z klonami wyprowadzonymi z transfekowanych komórek CHO i 293S. Komórki HKB, które nie tworzą dużych agregatów komórek, gdy są hodowane w kulturach zawiesinowych, są korzystnymi komórkami dla ekspresji białek mających aktywność prokoagulacyjną czynnika VIII.

T a b e l a 1

Ekspresja FVIII i BDD-FVIII w ludzkich liniach komórkowych i liniach od gryzoni

	Specyficzna produktywność (pU/c/d) *
Pochodne FVIII	BKH	293S	CHO	HKB
FVIII pełnej długości	0,45	1,2	0,5	1,0
BDD-FVIII	ND	2,5	1,0	20

*Średnia wartość dla 5 wysoce produktywnych klonów (w podłożu wolnym od surowicy) ND - nie badano

Adaptacja klonów do braku białek osocza

Klony HKB, które były przystosowane do wzrostu jako kultury zawiesinowe wolne od surowicy, były dalej odzwyczajane od uzupełnień białkami osocza. Odzwyczajanie przeprowadzono w sterylnych kolbach do wytrząsania z poliwęglanu (Corning, Corning, NY) przy gęstości komórek około 0,5 x 10⁶

PL 200 676 B1 komórek/ml stosując podłoże wolne od białek pochodzących z osocza. Podłoże wolne od białek pochodzących z osocza (PPF) było podłożem DME/F12 uzupełnionym Pluronic F68 (0,1%), CuSO4 (50 nM) i FeSO₄/EDTA (50 μΜ). Całkowitą wymianę podłoża przeprowadzano co 48 godzin i butle do wytrząsania ponownie zaszczepiano przy 0,5 x 10⁶ komórek/ml.

Fermentacja klonu 20B8

Produktywność klonu 20B8 oceniono w 15-litrowym fermentorze perfuzyjnym. Fermentor zaszczepiono komórkami klonu 20B8 przy gęstości około 3 x 10⁶ komórek/ml. Fermentor perfundowano z szybkością 4 objętości na dzień wolnym od surowicy podłożem produkcyjnym, jak opisano w uprzednim akapicie. Utrzymano ostateczną gęstość komórek 2 x 10⁷ komórek/ml w czasie oceny (45 dni). Jak przedstawiono na figurze 5, podczas pierwszych 4 tygodni fermentacji klon 20B8 perfundowano podłożem produkcyjnym wolnym od surowicy uzupełnionym frakcją HPP Plasmanate® i był on zdolny do utrzymania wysokiej produktywności. Od dnia 28 do końca przebiegu fermentacji, komórki perfundowano tym samym wolnym od osocza podłożem produkcyjnym ale z frakcją HPP Plasmanate®. Jak przedstawiono na fig. 5, komórki kontynuowały produkcję wysokich poziomów FVIII w środowisku pozbawionym białek pochodzących z osocza. „Wolne od białek pochodzących z osocza” oznacza, że zasadniczo żadne białka izolowane z osocza nie były dodane do podłoża.

Dyskusja

Wyprowadzenie komórek HKB dostarcza systemu produkcji wolnego od białka w celu wytwarzania nie tylko BDD-FVIII ale także innego terapeutycznego białka. Białka wyprodukowane z komórek HKB mają ludzkie wzory glikozylacji, które mogą poprawić okres półtrwania pewnych glikoprotein in vivo. Te komórki powinny także być użyteczne do wytwarzania szczepów adenowirusa i wirusa towarzyszącego adenowirusowi, które były zaprojektowane dla celów terapii genowej.

Powyższe przykłady mają na celu ilustrację wynalazku i uważa się, że specjaliści w dziedzinie będą świadomi możliwości wystąpienia wariantów. Zatem zakres wynalazku powinien być ograniczony tylko przez poniższe zastrzeżenia.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania i izolowania białka o aktywności czynnika VIII, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórek oznaczonych przez American Type Culture Collection jako CRL-12568, które zawierają sekwencję kodującą białko o aktywności czynnika VIII, funkcjonalnie połączoną z promotorem, w warunkach wystarczających do ekspresji i izolowanie białka.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko ma sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEKW. ID. Nr: 1.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko jest wyrażane na poziomie co najmniej 2 gU/c/d, gdy komórki rosną w pożywce pozbawionej białek pochodzenia osoczowego.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że białko jest wyrażane na poziomie co najmniej 4 gU/c/d.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że białko jest wyrażane na poziomie co najmniej 5 gU/c/d.
6. 6. Ludzka linia komórkowa otrzymana z komórek oznaczonych przez American Type Culture Collection jako CRL-12568, która wyraża białko o aktywności czynnika VIII.
7. 7. Ludzka linia komórkowa według zastrz. 6, znamienna tym, że wyraża czynnik VIII z usuniętą domeną B.
8. 8. Ludzka linia komórkowa oznaczona przez American Type Culture Collection jako CRL-12582.

   PL 200 676 B1

   Rysunki

   1 ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSWYKKTL 51 FVEFTVHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTWITLKN MASHPVSLHA 101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD 151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA 201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR 251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL 301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL 351 TDSEMDWRF DDDNSPSFIQ IRSVAKKHPK TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL 401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG 451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD 501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP 551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG 601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS 651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFE SMENPGLWIL GCHNSDFRNR 701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNPPVLK 751 RHQREITRTT LQSDQEEIDY DDTISVEMKK EDFDIYDEDE NQSPRSFQKK 801 TRHYFIAAVE RLWDYGMSSS PHVLRNFAQS GSVPQFKKW FQEFTDGSFT 851 QPLYRGELNE HLGLLGPYIR AEVEDNIMVT FRNQASRPYS FYSSLISYEE 901 DQRQGAEPRK NFVKPNETKT YFWKVQHHMA PTKDEFDCKA WAYFSDVDLE 951 KDVHSGLIGP LLVCHTNTLN PAHGRQVTVQ EFALFFTIFD ETKSWYFTEN 1001 MERNCRAPCN IQMEDPTFKE NYRFHAINGY IMDTLPGLVM AQDQRIRWYL 1051 LSMGSNENIH SIHFSGHVFT VRKKEEYKMA LYNLYPGVFE TVEMLPSKAG 1101 IWRVECLIGE HLHAGMSTLF LVYSNKCQTP LGMASGHIRD FQITASGQYG 1151 QWAPKLARLH YSGSINAWST KEPFSWIKVD LLAPMIIHGI KTQGARQKFS 1201 SLYISQFIIM YSLDGKKWQT YRGNSTGTLM VFFGNVDSSG IKHNIFNPPI 1251 IARYIRLHPT HYSIRSTLRM ELMGCDLNSC SMPLGMESKA ISDAQITASS 1301 YFTNMFATWS PSKARLHLQG RSNAWRPQVN NPKEWLQVDF QKTMKVTGVT 1351 TQGVKSLLTS MYVKEFLISS SQDGHQWTLF FQNGKVKVFQ GNQDSFTPW

   1401 NSLDPPLLTR YLRIHPQSWV HQIALRMEVL GCEAQDLY

   Fig. 1

   PL 200 676 B1 GGCAATGGAG CGTGAAGAAG GGCCCCAGGG CTGACCCCGG CAAACGTGAC (50) CCGGGGCTCC GGGGTGACCC AGGCAAGCGT GGCCAAGGGG CCCGTGGGTG (100) ACACAGGCAA CCCTGACAAA GGCCCCCCAG GAAAGACCCC CGGGGGGCAT (150) CGGGGGGGTG TTGGCGGGTC ATGGGGGGGG CGGGTCATGC CGCGCATTCC (200) TGGAAAAAGT GGAGGGGGCG TGGCCTTCCC CCCGCGGCCC CCTAGCCCCC (250) CCGCAGAGAG CGGCGCAACG GCGGGCGAGC GGCGGGGGGT CGGGGTCCGC (300) GGGCTCCGGG GGCTGCGGGC GGTGGATGGC GGCTGGCGTT CCGGGGATCG (350) GGGGGGGGTC GGGGGGCGCT GCGCGGGCGC AGCCATGCGT GACCGTGATG (400) AG (402)

   Fig.__2

   PL 200 676 B1

   ΗΚΒ11 + pCIS25DTR

   1C10 (400 nM ΜΤΧ)

   Pierwsze LDC

   10A8 (FBS)

   Adaptacja SF

   Adaptacja PPF

   20B8 (PPF) ~

   Fig._4A

   Produktywność właściwa (uU/c/cT

   40i

   ---r-, ....... ........₁ UmiinilillllL··/.·////! _[

   1C10(FBS) 10A8(FBS) 10A8(Plasmanate) 20B8(Plasmanate) 20B8(PPF)