PL184002B1

PL184002B1 - Sposób szczepienia przeciwko kokcydiozie

Info

Publication number: PL184002B1
Application number: PL96314639A
Authority: PL
Inventors: Nigel A. Evans; R.Craig Findly; Frederick H. Weber
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2002-08-30
Also published as: CO4440630A1; DZ2048A1; UA41381C2; PL314639A1; JPH10506920A; AU694872B2; NZ286754A; TR199600471A2; KR0167417B1; DE69520509T2; MY121973A; SI9600181A; AR002157A1; HU223707B1; HUP9601554A3; MX9709868A; ES2155129T3; DE69520509D1; AU5478296A; RU2125890C1

Abstract

1. Zastosowanie skutecznie uodparniajacej dawki zywych sporocyst lub merozoitów Eimeria albo ich mieszaniny do wytwarzania preparatu do szczepienia in ovo w koncowej cwiartce okresu inkubacji ptaków domowych przeciwko kokcydiozie. 16. Srodek do szczepienia in ovo w koncowej cwiartce okresu inkubacji ptaków domo- wych przeciwko kokcydiozie zawierajacy czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienny tym, ze jako czynnik aktywny zawiera skutecznie uod- parniajaca dawke zywych sporocyst lub merozoitów Eimeria albo ich mieszanine. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób szczepienia domowych ptaków przeciwko kokcydiozie, w szczególności podawania in ovo żywych sporozoitów lub merozoitów albo ich mieszanin, do rozwijających się jaj ptactwa domowego, w celu uodpornienia wylęgłych kurcząt przeciwko kokcydiozie.

Kokcydioza jest chorobą jelitową ptaków domowych wywoływaną przez zakażenie wewnątrzkomórkowymi pasożytami pierwotniakowymi z rodzaju Eimeria. Kokcydioza jest, najbardziej ekonomicznie niszczącą chorobą pasożytniczą ptaków domowych. Ocenia się, że zwalczanie kokcydiozy i straty wywoływane kokcydiozą kosztują przemysł hodowli ptactwa miliony dolarów każdego roku.

Różne usiłowania szczepienia ptaków domowych przeciwko kokcydiozie są opisywane od wczesnych lat pięćdziesiątych. Do aktualnych metod szczepienia należy podawanie żywych oocytów ptakom w pokarmie lub wodzie. Powyższe metody są jednak niewygodne i nieskuteczne, ponieważ nie wszystkie ptaki otrzymują zamierzoną dawkę oocytów i wiele z nich pozostaje albo nieochronione przez szczepionkę albo otrzymuje patogeniczną dawkę.

J.M. Sharma i B.R. Burmester w Avian Dis., 26: 134-149, 1981, donieśli, że kurczęta zaszczepione in ovo wirusem opryszczki indyków nabywają odporność przeciwko późniejszemu zakażeniu wirusem choroby Marek'a. W europejskiej publikacji patentowej nr 291173 opisano proces uodporniania, w którym niereplikacyjny immunogen podawany był in ovo. Immunogeny opisane specyficznie w europejskim opisie patentowym są otrzymanymi za pomocą inżynierii genetycznej immunogenami Eimeria i ekstraktem oocytów Eimeria. W europejskim opisie patentowym wykluczono żywe pasożyty, takie jakie stosuje się w zastrzeganej tutaj metodzie szczepienia.

Opisywana metoda szczepienia polega na podawaniu in ovo żywych sporozoitów lub merozoitów Eimeria albo ich mieszaniny do rozwijających się jaj ptaków domowych. Dostępne piśmiennictwo sugeruje, że taka metoda szczepienia nie powinna być skuteczna in ovo i powinna być stosowana po wylęgnięciu. T.K. Jeffers i G.E. Wagenbach donoszą w J. Parasit., 56(4), 656-662, 1970, że iniekcja in ovo sporozoitów E. tenella w 10 dniu inkubowania nie dawała znaczącej ochrony immunologicznej przeciwko następnemu zakażeniu oocytami E. tenella. W rzeczywistości donoszą oni, że kurczęta które nie były traktowane wykazywały większy stopień przeżycia przeciwko następnemu zakażeniu oocytami E. tenella niż kurczęta,

184 002 które były traktowane in ovo sporozoitami. K.L. Watkins i wsp. w Proc. VIth International Coccidiosis Conf., Abstract El-2, Ontario, Canada, 1993 opisali inokulację in ovo żywymi sporocytami i przetrwalnikującymi oocytami E. maxima i stwierdzili, że badania nie dały żadnych dowodów, że iniekcja in ovo chroni przeciwko następnemu zakażeniu po 10 dniach od wylęgnięcia oocytami E. maxima. Watkins i wsp. ponadto stwierdzili, że znaczącą ochronę immunologiczną uzyskuje się jeśli inokulację się wykonuje wkrótce po wylęgnięciu a nie in ovo. Wbrew temu stwierdzeniu, metoda szczepienia in ovo według wynalazku daje nieoczekiwanie uodpornienie chroniące kurczęta po wylęgnięciu przeciwko następnemu zakażeniu kokcydiozą.

Wynalazek, określany w opisie jako metoda szczepienia według wynalazku dotyczy metody szczepienia ptaków domowych przeciwko kokcydiozie i polega na podawaniu in ovo podczas ostatniej czwartej części okresu inkubowania skutecznie uodparniającej dawki żywych sporozoitów lub merozoitów Eimeria lub ich mieszaniny.

Określenie ptak(i) domowy oznacza, jeśli nie podano inaczej, kurczęta, indyki, kaczki, ptaki łowne (w tym, ale nie wyłącznie, przepiórki, bażanty i gęsi) oraz ptaki bezgrzebieniowe (w tym, ale nie wyłącznie, strusie afrykańskie).

Określenie in ovo oznacza jajo ptaka domowego zawierające żywy, rozwijający się embrion.

Określenie podawanie in ovo oznacza, jeśli nie podano inaczej, podawanie opisanej powyżej szczepionki do jaja ptaka domowego zawierającego żywy, rozwijający się embrion, z zastosowaniem do tego celu dowolnego sposobu penetracji przez skorupkę i wprowadzania szczepionki. Takie sposoby podawania polegają, ale nie wyłącznie, na wstrzykiwaniu szczepionki.

Określenie końcowa ćwiartka okresu inkubowania oznacza, jeśli nie podano inaczej, ostatnią ćwiartkę okresu inkubowania i wylęgania się jaja ptaka domowego.

Określenie Eimerina oznacza, jeśli nie podano inaczej, jeden lub więcej gatunków z rodzaju Eimeria zakażających ptaki domowe. Do tych gatunków Eimeria należą znajdowane u kurcząt, takie jak E. tenella, E. acervulina, F. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox i E. brunetti a także gatunki znajdowane u indyków, takie jak E. meleagrimitis, E. adenorides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua i E. subrotunda, oraz ponadto gatunki Eimeria zakażające inne, wymienione uprzednio ptaki domowe, Określenie Eimeria dotyczy również wszystkich szczepów z wymienionych gatunków Eimeria, w tym, ale nie wyłącznie, przedwcześnie rozwiniętych i osłabionych szczepów, do których należą szczepy napromieniane lub inaczej traktowane, tak że nie mają zdolności całkowitego rozwoju. Określenie Eimeria dotyczy także nowo odkrytych szczepów lub gatunków Eimeria zakażających wymienione uprzednio ptaki domowe.

Określenia sporozoity, sporocysty, oocyty i merozoity oznaczają. jeśli nie podano inaczej, żywe sporozoity, sporocysty, oocyty i merozoity.

Określenie skuteczna dawka uodporniająca oznacza, jeśli, nie podano inaczej ilość sporozoitów lub merozoitów, albo w przypadku mieszaniny ilość sporozoitów i merozoitów wystarczającą dla uzyskania ochrony immunologicznej wylęgniętych ptaków większej od wrodzonej odporności nie uodpornianych ptaków. Określenia uodpornianie i szczepienie są w niniejszym opisie równoznaczne i stosowane zamiennie.

Korzystna dawka do podawania sposobem według wynalazku wynosi 10 dol0⁶ sporozoitów lub merozoitów albo dla mieszaniny sporozoitów i merozoitów całkowita ilość wynosi również 10 do 10⁶.

o Z

Korzystniejsza dawka wynosi 10 do 10 sporozoitów lub merozoitów a dla mieszaniny całkowita ilość sporozoitów i merozoitów wynosi również 103 do 106.

Inna korzystna dawka, zawiera od 10² do 10⁵ sporozoitów lub merozoitów albo ich mieszaninę w łącznej ilości wynoszącej od 10² do 10⁵.

Korzystnymi ptakami domowymi szczepionymi sposobem według wynalazku są kurczaki.

Korzystna dawka do podawania in ovo do jaj kurzych zawiera sporozoity lub merozoity albo ich mieszaninę, z dwóch lub więcej gatunków Eimeria z grupy do której należą E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox i E. brunetti. Dawka zawiera

184 002 korzystnie od 10 do 10⁶ sporozoitów lub merozoitów albo ich mieszaniny, z każdego gatunku obecnego w dawce.

Innym korzystnym ptakiem domowym, który może być szczepiony sposobem według wynalazku jest indyk.

Korzystna dawka do podawania, in ovo do jaj indyczych zawiera sporozoity lub merozoity albo ich mieszaninę z dwóch lub więcej gatunków Eimeria, z grupy do której należą E. meleagrimitis, E, adenoides, E. gallapavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua i E. subrotunda. Wielkość dawki wynosi korzystnie od 10 do 10⁶ sporozoitów lub merozoitów albo ich mieszaniny, z każdego gatunku obecnego w dawce.

Do innych korzystnych ptaków domowych mogących być szczepionymi sposobami według wynalazku należą ptaki łowne, kaczki i ptaki bezgrzebieniowe,

Sposób według wynalazku polega ponadto na kombinacji opisywanych metod szczepienia i podawania immunostymulanta in ovo w dowolnym czasie podczas inkubowania.

Korzystną metodą podawania immunostymulanta jest równoczesne podawanie in ovo dawki sporozoitów lub merozoitów albo ich mieszaniny, podczas ostatniej ćwiartki okresu inkubowania.

Sposób szczepienia według wynalazku polega na podawaniu in ovo podczas ostatniej ćwiartki okresu inkubowania żywych sporozoitów lub merozoitów Eimeria do jaj ptaków domowych. W przypadku kurcząt, podawanie in ovo wykonuje się korzystnie w 15-20 dniu inkubowania a najkorzystniej w 18 dniu inkubowania. W przypadku indyków podawanie in ovo wykonuje się korzystnie w 21-26 dniu inkubowania.

Sposób szczepienia według wynalazku można realizować stosując dowolną odpowiednią metodę podawania in ovo. Korzystnie, szczepionkę według wynalazku podaje się drogą iniekcji. Zgodnie z jedną metodą wstrzykiwania, w skorupce jaj w najszerszym końcu wykonuje się dziurkę stosując igłę strzykawki nr 18 w celu odsłonięcia komórki powietrza w jaju. Przez tę dziurkę i przez błonę komórki powietrza można wprowadzić igłę strzykawki nr 22 o długości 2,45-3,67 cm przyłączoną, do strzykawki o odpowiedniej wielkości (1-3 ml). Odpowiednią ilość sporocyst lub merozoitów lub, gdy stosuje się mieszaninę, odpowiednią ilość sporozoitów i merozoitów zawiesza się w odpowiednim ciekłym nośniku, np. w 10-500 pl buforowanego fosforanem roztworu soli, i wstrzykuje do jaja. Odpowiednia objętość zależy od wielkości jaja. Jaja strusia będą mogły oczywiście przyjąć większą objętość niż jajo kurze. Miejscem wstrzykiwania może być dowolny region jaja lub embrionu. Korzystnie, wstrzykiwanie wykonuje się osiowo przez środek większego końca jaja do owodni.

Alternatywnie, w opisywanej metodzie szczepienia można stosować automatyczny system wstrzykiwania. Takie systemy są opisane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.681.063, nr 4.040.388, nr 4.469,047 i nr 1.593.646, które są tutaj włączone jako odnośniki. Inne odpowiednie metody wstrzykiwania są znane specjalistom.

Oocyty można otrzymywać dowolnymi wieloma metodami znanymi specjalistom. Należą do nich metody opisane przez. J.F. Ryleya i wsp. w Parasitology, 73:311-326, 1976 i przez

P.L. Longa i wsp. w Folia Veterinaria Latina VI£3 201-217, 1976, które to źródła są tutaj cytowane jako odnośniki. Według jednej metody, handlowe kurczęta brojlery w wieku około dwa tygodnie zakaża się wybranymi gatunkami Eimeria przez podawanie za pomocą zgłębnika odpowiedniej dawki zarodnikujących oocytów. Na przykład typowa dawka stosowana dla E. tenella wynosi 200.000 zarodnikujących oocytów dla jednego ptaka. Następnie stosuje się dobrze znane procedury zbierania i oczyszczania oocytów od zakażonych ptaków. Dla większości gatunków Eimeria zbiera się odchody zakażonych ptaków po upływie 5-7 dni od zakażenia, miesza je i przesącza w celu usunięcia materiału stałego i następnie odwirowuje z szybkością wystarczającą dla utworzenia pastylek z pozostałego materiału. W przypadku E. tenella stosuje się podobne postępowanie, z wyjątkiem tego, że odchody od zakażonych ptaków zbiera się po 6 dniach od zakażenia. Pastylki zawiesza się w nasyconym roztworze soli, w którym oocyty pływają a większość zanieczyszczających resztek można usunąć za pomocą odwirowania. Zawiesinę oocytów rozcieńcza się następnie w celu uzyskania niniejszego stężenia soli. Oocyty przemywa się kilkakrotnie w celu usunięcia soli i zawiesza powtórnie w 2,5% (waga/objętość) roztworze dichromianu potasowego. Zawiesinę oocytów inkubuje się

184 002 w temperaturze 29°C, wstrząsając (np. przy 140 obrotach/minutę) w ciągu około 72 godzin, dla wywołania zarodnikowania oocytów. Alternatywnie, oocyty można traktować podchlorynem sodowym i następnie sporulować. Ilość zarodnikujących oocytów w ml oznacza się za pomocą bezpośredniego liczenia przy zastosowaniu hemocytometru i otrzymaną hodowlę przechowuje się, korzystnie w stanie zamrożonym, do czasu użycia.

Dla otrzymania sporocyst, dichromian potasowy usuwa się z opisanej uprzednio zawiesiny oocytów za pomocą kilkukrotnego przemywania. Preparatyka polega na tym, że oocyty zbiera się za pomocą odwirowania i zawieszania w dejonizowanej lub destylowanej wodzie. Po usunięciu dichromianu, co ocenia się na podstawie zaniku żółtawopomarańczowęj barwy, zawiesinę oocytów miesza się z równą ilością podchlorynu sodowego (wybielacza) i inkubuje w pokojowej temperaturze w ciągu 15 minut. Wybielacz usuwa się drogą powtarzalnego przemywania i oocyty zawiesza się w roztworze fizjologicznym soli lub w dejonizowanej wodzie. Oocyty można rozrywać w celu uwolnienia, sporocyst, stosując w tym celu wiele znanych technik. Na przykład oocyty można rozrywać w celu uwolnienia sporocyst drogą mieszania oocytów ze szklanymi kulkami o średnicy 1-4 mm i wstrząsania ręcznego. Można także stosować mieszalnik wirowy, wstrząsany inkubator albo ręczny homogenizator. Nierozerwane oocyty i ścianki oocytów można oddzielać od uwolnionych sporocyst za pomocą różnicowego odwirowywania w 50% preparacie Percoll® (sprzedawanym przez firmę Pharmacia Biotech) lub w 1M roztworze sacharozy, co opisali Dulski i wsp. w Avian Diseases, 32:235-239, 1988.

W celu otrzymania sporozoitów lub preparatu bogatego w sporozoity do stosowania w sposobie według wynalazku, sporozoity wydobywa się z torbieli z opisanego uprzednio preparatu sporocysty. W jednej z metod postępowania, sporocysty otrzymane metodą opisaną powyżej pastylkuje się za pomocą wirowania, zawiesza w buforze ekscystującym (0,5% kwasu taurodezoksycholowego i 0,25% trypsyny w buforowanym fosforanem roztworze soli, pH 8,0) i inkubuje wstrząsając w ciągu jednej godziny w temperaturze 41°C. W próbce otrzymanej zawiesiny oznacza się ilość sporozoitów, przemywa całość jednorazowo w celu usunięcia buforu ekscystującego i zawiesza w buforowanym fosforanem roztworze soli w stężeniu pożądanym do wstrzykiwania in ovo. Preparat powyższy zawiera sporozoity, sporocysty i oocyty, i może być bez dalszego oczyszczania stosowany w sposobie szczepienia według wynalazku. Oczyszczone sporozoity, uwolnione od sporocyst i oocytów, można otrzymywać stosując chromatografię anionowymienną na żywicy DE-52, jak to opisali D.M. Schmatz i wsp, w

J. Protozool., 31:181-183, 1984, która to praca jest tutaj cytowana jako odnośnik. Wielkość dawki sporozoitów stosowana w sposobie szczepienia według wynalazku może być różna w zależności od typu szczepionego ptaka domowego i rodzaju użytego w szczepionce Eimeria. Generalnie, wielkość dawki wynosi 10 do 10’ sporozoitów/jajo lub korzystniej, dawka wynosi od 10² do 10⁵ sporozoitów/jajo.

Merozoity można otrzymywać różnymi, znanymi specjalistom, metodami. W jednej metodzie, sporozoitami zakaża się komórki pierwszego rzędu nerek kurcząt (PCK) wzrastające w hodowli jako zespół komórek, stosując modyfikację metody opisanej przez D.J. Dorana w J. Parasit., 57:891-900, 1971, która ta praca jest cytowana tutaj jako odnośnik. Komórki PCK hoduje się w temperaturze 40°C w 3% CO2 w modyfikowanym podłożu RK2DMEM/F12 z dodatkiem L-glutaminy i 15 mM HEPES, uzupełnionym o surowicę płodu wołowego, penicylinę i streptomycynę, 15 mM wodorowęglanu sodowego, 10 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostowego, 5 pg/ml insuliny, 5 pg/ml transferriny, 5 pg/ml kwasu selenawego oraz 0,01 pM chlorowodorku hydrokortizonu, zgodnie z metodą opisaną przez S.D. Chunga i wsp. w J. Cell Biol., 95:118-126, 1982. Komórki PCK preparuje się z nerek 2-3 tygodniowych kurcząt. W tym celu, nerki sieka się i następnie traktuje w temperaturze 37°C kilkoma porcjami roztworu 0,2 mg/ml kolagenazy (sprzedawanej przez firmę Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) w buforowanym fosforanem roztworze soli. Zespoły komórkowe w supernatancie przemywa się, zawiesza w zmodyfikowanym podłożu RK2 zawierającym 5% surowicy płodu wołowego i stosuje do zaszczepiania hodowli tkankowych w kolbach w ilości 105 zespołów/cm². Komórki PCK inkubuje się w ciągu 18 godzin w temperaturze 40°C w 3% CO2 i następnie zakaża 4 x 105 sporozoitów/cm2. Zakażone hodowle hoduje

184 002 się w zmodyfikowanym podłożu RK2 zawierającym 2% surowicy płodu wołowego. Po 24 godzinach inkubowania, dla umożliwienia inwazji, niezainwadowane sporozoity usuwa się mieszając zawartość kolby i usuwając podłoże hodowlane. Warstwę komórek przemywa się jednokrotnie zmodyfikowanym podłożem RK2 zawierającym 2% surowicy płodu wołowego i znów odrzuca się podłoże hodowlane. Dodaje się świeże podłoże RK2 i hodowlę inkubuje się w ciągu dalszych 48-54 godzin aż do uwolnienia merozoitów do podłoża hodowlanego.

Oczyszczanie merozoitów dla usunięcia resztek komórek gospodarza można wykonywać różnymi metodami, znanymi specjalistom. Według jednej z metod, opisanej przez J.A, Olsona, w Antimicrob. Agents Chemother., 34:1435-1439,1990, podłoże hodowlane zawierające uwolnione merozoity zbiera się i wiruje przy 450 g w ciągu 10 minut w celu zatężenia merozoitów. Pastylkę zawierającą merozoity i resztki komórek gospodarza zawiesza się w roztworze 0,1 M NaCl-0,05 M KCl zawierającym 20% albuminy surowicy wołowej i nanosi na kolumnę zawierającą anionowy wymieniacz jonowy DE-52 zrównoważony roztworem zawierającym 75 mM Tris, 40 mM NaH2PO4, 86 nM NaCl i 100 mM glukozy, pH 8,2. Merozoity przepływają przez kolumnę i po zebraniu można je testować na czystość za pomocą mikroskopu elektronowego, jak to opisał A. Kilejian w J. Biol. Chem., 249:4650-4655, 1974. Generalnie, dawka merozoitów może wynosić od 10 do 10⁶ merozoitów/jajo. Korzystna, dawka wynosi od 10 do 10⁵ merozoitów/jajo, a najkorzystniej od 10² do 10⁵ merozoitów/jajo. Gdy podaje się mieszaninę sporozoitów i merozoitów, wówczas generalnie całkowita, ilość merozoitów i sporozoitów w dawce dla jednego jaja może wynosić od 10 do 106 korzystnie od 10 do 10⁵, korzystniej od 102 do 10⁵.

Sporozoity lub merozoity, albo ich mieszanina, mogą być wstrzykiwane in ovo w dowolnym odpowiednim fizjologicznie środowisku. Korzystnie, są one zawieszane w fizjologicznie zrównoważonym roztworze soli, takiej jak roztwór soli buforowany fosforanem. Wybrane środowisko może ewentualnie zawierać jeden lub więcej środków zawieszających, takich jak odpowiednie fizjologicznie żele, żelatyny, hydrozole, celuloza lub i polisacharydowe gumy.

Korzystnie, w opisywanej metodzie szczepienia, sporozoity lub merozoity albo ich mieszanina, z dwóch lub więcej gatunków Eimeria, są wstrzykiwane in ovo w tym samym czasie. Zgodnie z opisywaną metodą szczepienia, sporozoity lub merozoity albo ich mieszanina, z wszystkich zidentyfikowanych gatunków Eimeria, które zakażają specyficzne ptaki domowe, takie, jak kurczęta, mogą być wstrzykiwane in ovo w tym samym czasie albo w seriach w odpowiednich dawkach, w celu uzyskania ochrony immunologicznej przeciwko wszystkim gatunkom.

Immunostymulanty mogą być stosowane w połączeniu z opisywaną metodą szczepienia. Do immunostymulantów, które można stosować w opisywanej metodzie szczepienia należą, ale nie wyłącznie, cytokiny, czynniki wzrostu, chemokiny, supematanty z hodowli komórek limfocytów, monocyty lub komórki z organów limfoidalnych, preparaty komórek lub ekstrakty komórek (np. utrwalony Staphylococcus aureus lub preparaty lipopolisacharydowe), mitogeny lub adiuwanty, w tym niskocząsteczkowe farmaceutyki. Immunostymulanty mogą być podawane in ovo w dowolnym czasie podczas okresu inkubowania. Korzystnie, immnunostymulanty są podawane in ovo w środowisku zawierającym dawkę sporozoitów lub merozoitów Eimeria albo ich mieszaniny.

Efektywność szczepienia sposobem według wynalazku przeciwko kokcydiozie jest ilustrowana poniższymi przykładami. Każdą dawkę, wstrzykiwano in ovo w opisanym uprzednio dopuszczalnym fizjologicznie roztworze soli. Efektywność poszczególnych preparatów oznaczano śledząc ich wpływ na stopień wylęgnięć i wagę kurcząt, oraz po zakażeniu, na wytwarzanie oocytów, przyrost wagi i patogenność (ilość uszkodzeń). Stopień uszkodzenia oznaczano zgodnie z protokołem opisanym przez J. K. Johnsona i W.M. Reida w Exp. Parasitol., 28:30-36, 1970, w którym 0 oznacza brak uszkodzeń zaś 4, maksymalną ilość uszkodzeń.

Przykład I. Do jaj kurzych w 18 dniu inkubowania wstrzyknięto preparat zawierający 105 sporozoitów E. tenella. Preparat nie był oczyszczany dla usunięcia sporocyst i oocytów. Każda dawka zawierała także około 10⁴ sporocytów E. tenella i około 10⁴ oocytów E. tenella.

184 002

Kontrolnym jajom wstrzyknięto tylko buforowany fosforanem roztwór soli. W populacji ptaków traktowanych yporozoitami średni poziom po 7 dniach od wylęgnięcia wynosi 1,1 x 10 oocytów/ptaka. Nie immunizowane i traktowane spor^itami ptaki zakażano różnymi dawkami zarodnikujących oocżtów E. tenella za pomocą zgłębnika doustnego, w dniach 7, 14 i 21 po wylęgnięciu. Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

immunizowane i nie immunizowane ptaki: Reakcja na zakażenie różnymi dawkami w różnych czasach po wylęgnięciu

Tabela 1

	Stopień uszkodzenia 6 dni po zakażeniu	Przyrost wagi ptaka 6 dni po zakażeniu
Grupa	Dawka, zakaząaąca (zarodnikujących ooyytów/ptaka)	Nie immunizowane	Immunizowane in ovo (105 sporozoitów 18 dnia po inkubowaniu	Nie immunizowa- ne	Immunizowa- ne in ovo (105 sporozoitów 18 dni po inkkUuwaniu
Zakażenie 7 dnia po wylęgnięciu	0	0	0	188	167
2,5 x 10³	3,0	0,3*	154	153
5x 10³	3,1	1,2*	153	167
1 x 10⁴	3,7	1,4*	123	165*
Zakażenie 14 dnia po wylęgnięciu	0	0	0	266	278
2,5 x 103	2,4	0,4*	260	269
5 x 103	2,8	1,1*	244	265
1 x 103	3,3	1,6*	235	259
Zakażenie 21 dnia po wylęgnięciu	0	0,1	0	361	357
2,5 x 103	2,3	0,7*	375	358
5x 103	2,1	0,8*	332	344
1 x 103	2,8	1,4*	337	395*

¹ Każda grupa podlegała jednemu zakażeniu zarodnikującymi oocytami w dniach 7, 14 lub 21 po wylęgnięciu. Na przykład ptaki zakażane 21 dnia po wylegnięciu nie były zakazane w dniu 7 lub 14.

* Znacząca różnica w stosunku do nie immunizowanych ptaków (p < 0,05, ANOVA).

Dane przedstawione w tabeli 1 wykazują, że immunizowane ptaki były mniej wrażliwe na zakażenie niż ich nie immunizowani partnerzy, na co wskazuje zmniejszenie uszkodzeń i lepszy przyrost masy u immunizowanych ptaków. Dane również wykazują, że sposób według wynalazku pozwala na uodpornianie kurcząt w stosunkowo wczesnym stadium życia (7 dni po wylęgnięciu). Ponadto, dane wykazują, że odporność utrzymuje się podczas wzrostu i rozwoju kurcząt. Uodpornianie kurcząt we wczesnym stadium życia stanowi znaczny postęp w przemyśle hodowli brojlerów, gdyż są one sprzedawane po osiągnięciu wieku 6 tygodni.

Przykład II. Do jaj kurzych w 18 dniu inkubowania wstrzykiwano roztwór soli (kontrola) lub preparaty zawierające różne dawki spooozoitów E. tenella, co pokazano w tabeli 2 wraz z wynikami sprzed zakażenia. Każda dawka ssorozoitów zawierała 62% ssooozoitów, 9% spooocżst i 29% oocżtów. W każdej dawce zawierającej 105 sporozoitów znajdowało się

1,6 x 105 wszystkich stadium pasożyta (sporo/oitę', ssooocysty i ooccUż).

184 002

Wpływ szczepienia in ovo na stopień wylęgnięcia i wagę kurcząt

Tabela 2

Ilość sporozoitów wstrzykniętych do jaja w 18 dniu inkubowania	Stopień wylęgnięcia (%)	Waga kurczęcia (g)
0	94	48,2
0	94	48,0
10³	100	49,4
104	97	47,0
10⁵	94	49,1

Dane z tabeli 2 pokazują że kurczęta wylęgnięte z jaj, do których wstrzyknięte były żywe sporozoity były praktycznie identyczne z kurczętami nie immunizowanymi, pod względem stopnia wylęgnięcia i wagi.

Kurczęta zakazano następnie 14 dnia od wylęgnięcia 1,25 x 10⁴ zarodnikujących oocytów E. tenella podawanych doustnie za pomocą zgłębnika. Wyniki uzyskane po zakażeniu przedstawiono w tabeli 3.

Reakcja na zakażenie nie immunizowanych ptaków w porównaniu z ptakami traktowanymi in ovo różnymi dawkami sporozoitów

Tabela 3

Ilość sporozoitów wstrzykniętych 18 dnia inkubowania	Przyrost masy ptaka 6 dnia po zakażeniu	Uszkodzenia 6 dnia po zakażeniu	Ilość oocytów (x 105) 6 dnia po zakażeniu
0	278	3,2	12,3
0 (nie zakażona kontrola)	321	0	0,003*
10³	289	2,6*	11,2
104	291	2,7	12,2
105	304*	1,4*	1,4*

* Znacząca różnica w porównaniu z nie immunizowaną grupą (otrzymującą roztwór soli), którą poddawano zakażeniu (p < 0,05, ANOVA).

Dane z tabeli 3 w^l^iazują że wszystkie parametry (przyrost wagi, stopień uszkodzenia, poziom oocytów) dla kurcząt, którym wstrzykiwano różne dawki preparatu sporozoitów udowadniają uodpornienie. W porównaniu z ptakami kontrolnymi traktowanymi tylko roztworami soli i poddawanym zakażeniu, ptaki immunizowane in ovo preparatem sporozoitowym wykazywały większy przyrost wagi i zmniejszenie uszkodzeń. Ponadto ptaki immunizowane in ovo preparatem sporozoitowym wykazywały obecność mniejszej ilości oocytów niż ptaki kontrolne po zakażeniu, co wskazuje, że zakażenie było mniej poważne u immunizowanych ptaków.

184 002

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie skutecznie uodparniającej dawki żywych sporocyst lub merozoitów Eimeria albo ich mieszaniny do wytwarzania preparatu do szczepienia in ovo w końcowej ćwiartce okresu inkubacji ptaków domowych przeciwko kokcydiozie.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dawka zawiera 10² do 10⁶ sporocyst lub merozoitów albo ich mieszaninę, w której całkowita ilość powyższych sporocyst i merozóitów wynosi od 102 106.
3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dawka zawiera 10³ do 106 sporocyst lub merozoitów albo ich mieszaninę, w której całkowita ilość powyższych sporocyst i merozoitów wynosi od 10³ do 106.
4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że dawka zawiera 102 do 10⁵ sporocyst lub merozoitów albo ich mieszaninę, w której całkowita ilość powyższych sporocyst i merozoitów wynosi od 102 do 10⁵.
5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że ptakiem domowym jest kurczak.
6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że dawka zawiera sporocysty lub oocyty albo ich mieszaninę, z dwóch lub więcej gatunków Eimeria wybranych z grupy, do której naleźu E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox i E. brunetti.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że preparat jest przeznaczony do iniekcji in ovo.
8. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że do wytwarzania preparatu do podawania in ovo stosuje się ponadto immunostymulant.
9. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że dawka zawiera merozoity.
10. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że dawka zawiera sporozoity.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że sporozoity są oczyszczone w celu usunięcia sporocyst i oocytów.
12. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że ptakiem domowym jest indyk.
13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że dawka zawiera sporocysty lub oocyty albo ich mieszaninę, z dwóch lub więcej gatunków Eimeria wybranych z grupy, do której należą E. memeagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua i E. subrotunda.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że preparat jest przeznaczony do iniekcji in ovo.
15. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że ptakiem domowym jest ptak łowny, kaczka lub ptak bezgrzebieniowy.
16. Środek do szczepienia in ovo w końcowej ćwiartce okresu inkubacji ptaków domowych przeciwko kokcydiozie zawierający czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera skutecznie uodparniającą dawkę żywych sporocyst lub merozoitów Eimeria albo ich mieszaninę.
17. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że dawka zawiera 102 do 106 sporocyst lub merozoitów albo ich mieszaninę, w której całkowita ilość powyższych sporocyst i merozoitów wynosi od 102 do 106.
18. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że dawka zawiera 10³ do 106 _Spo_rocyst lub merozoitów albo ich mieszaninę, w której całkowita ilość powyższych sporocyst i merozoitów wynosi od 10³ do 106.
19. Środek według zastrz. 16, znamienny tym, że dawka zawiera 102 do 10⁵ sporocyst lub merozoitów albo ich mieszaninę, w której całkowita ilość powyższych sporocyst i merozoitów wynosi od 102 do 10⁵.
20. Środek według zastrz. 17, znamienny tym, że ptakiem domowym jest kurczak.

184 002
21. Środek według zastrz. 20, znamienny tym, że dawka zawiera sporocysty lub oocyty albo ich mieszaninę, z dwóch lub więcej gatunków Eimeria wybranych z grupy, do której należą E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox i E. brunetti.
22. Środek według zastrz. 21, znamienny tym, że preparat jest przeznaczony do iniekcji in ovo.
23. Środek według zastrz. 17, znamienny tym, że do wytwarzania preparatu do podawania in ovo stosuje się ponadto immunostymulant.
24. Środek według zastrz. 17, znamienny tym, że dawka zawiera merozoity.
25. Środek według zastrz. 17, znamienny tym, że dawka zawiera sporozoity.
26. Środek według zastrz. 25, znamienny tym, że sporozoity są oczyszczone w celu usunięcia sporocyst i oocytów.
27. Środek według zastrz. 17, znamienny tym, że ptakiem domowym jest indyk.
28. Środek według zastrz. 27, znamienny tym, że dawka zawiera sporocysty lub oocyty albo ich mieszaninę, z dwóch lub więcej gatunków Eimeria wybranych z grupy, do której należą E. memeagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua i E. subrotunda.
29. Środek według zastrz. 28, znamienny tym, że preparat jest przeznaczony do iniekcji in ovo.
30. Środek według zastrz. 17, znamienny tym, ptakiem domowym jest ptak łowny, kaczka lub ptak bezgrzebieniowy.