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KR970000186B1 - 폴리아제티딘과의 교차결합에 의한 생물학적 물질의 고정방법 - Google Patents

폴리아제티딘과의 교차결합에 의한 생물학적 물질의 고정방법 Download PDF

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KR970000186B1
KR970000186B1 KR1019890700356A KR890700356A KR970000186B1 KR 970000186 B1 KR970000186 B1 KR 970000186B1 KR 1019890700356 A KR1019890700356 A KR 1019890700356A KR 890700356 A KR890700356 A KR 890700356A KR 970000186 B1 KR970000186 B1 KR 970000186B1
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South Korea
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fusarium
polyazetidine
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모엘가아르트 헨릭
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노보 노르디스크 아크티에 셀스카브
안네 세케르
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Abstract

내용 없슴.

Description

[발명의 명칭]
폴리아제티딘과의 교차결합에 의한 생물학적 물질의 고정방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 폴리아제티딘과의 교차결합에 의하여 생물학적 물질을 고정화하는(immobilizing) 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
고정된 생물학적 활성물질 분야는 약 20년전부터 드러났고 그 이후로 고정기법 및 고정생성물의 이용에 대한 대단히 많은 공보가 발표되었다. 그러한 연구는 효소, 세포, 항체 및 조효소의 고정화를 망라한다.
이 기간에 고정생성물의 여러 가지 이용이 대규모 공업용 식물에서 글루코스 이성화제의 사용으로부터 정제목적을 위한 고정된 항체의 이용에 이르기까지 상업화되었다.
기술분야에 공지된 많은 고정화 방법중에서 일군의 방법이 캐이. 모스바흐에 의해 Methods of Enzymology, 44(1976)에 기재된 바, 교차-결합으로서 알려져 있다. 교차결합은 물질과 이중-또는 다중기능성 교차결합제와의 반응에 의해 일어난다.
글루타르알데히드가 효소(예컨대 DK 143569참조)와 미생물세포(예컨대 US 특허 3,779,869참조) 두가지에 대한 교차결합제로서 사용되어 왔다. 그러나, 글루타르알데히드는 그것이 단지 -NH2와 -SH기와만 반응하기 때문에 이상적인 교차결합제는 아니다.
많은 효소와 세포가 이들 기의 함량이 낮기 때문에 글루타르알데히드가 불량하게 반응한다.
유럽특허공보 EP 0 206 687에 개시된 바와같이, 폴리아제티딘 중합체가 교차결합목적을 위해 유익하게 사용될 수 있다.
폴리아제티딘 중합체 교차결합시스템은 그것이 -NH2와 -SH기 뿐만 아니라 -COOH, -OH 및 -NH기와도 반응하기 때문에 글루타르알데히드보다 더 광범위하게 고정화에 응용할 수 있다.
그러나, EP 0 206 687에 개시된 고정화 방법은 다음의 관점에서 이상적이지 못하다:
-폴리아제티딘 중합체의 혼합시에 세포덩어리의 페이스트 콘시스턴시(consistency)는 혼합과정을 어렵게 만든다.
-교차결합제의 양은 상당히 많으며, 일반적으로는 폴리아제티딘 5 내지 30%, 글루타르알데히드 5 내지 40%이며 각각 10 내지 20%인 것이 바람직하다(세포슬러지 건조물의 %). 본 발명자는 혼합시에 페이스트 콘시스턴시에 기인한 폴리아제티딘과의 불량한 혼합때문에 많은 양이 필요하게 된다고 생각된다.
- 그 결과의 입자는 아마도 대량의 교차결합제 때문에 큰 확산한계를 가지며 매우 조밀하다.
폴리아제티딘으로의 고정화는 또한 지.제이.켈튼등에 의해 Biotechnology, Vol. 4, pp. 317-320(1986)에, US 특허 4,436,813에, 우드등에 의해 Bio/Technology, December 1984, pp. 1081-1084에, 및 유럽특허공보 EP 0 189 165에 기재되어 있다.
그러나, 이들은 순수한 교차결합방법이 아니며 대신에 활성세포의 담체에의 부착을 포함한다. 담체결합된 고정화는 많은 경우에서 담체의 사용이 활성을 약하게 하여 저활성생성물을 유도하고 때로 값비싼 담체물질이 요구되기 때문에 바람직하지 못하다.
[발명의 목적]
발명의 목적은 폴리아제티딘과의 교차결합에 의하여 고활성 및 물리적 고강도를 가지는 고정된 생물학적 물질을 제조하는데 사용될 수 있는 방법을 제공함으로써 상기 언급한 극복 또는 최소한 경감시키는 것이다.
[발명의 설명]
발명은 폴리아제티딘과의 교차결합에 의하여 생물학적 물질을 고정화 하는 방법을 제공하는 바, 방법은 생물학적 물질 폴리아제티딘과 수성혼합하는 단계, 그 결과의 혼합물을 응집시키는 단계, 응집된 생성물을 탈수시키는 단계, 탈수된 생성물을 하위분할시키는 단계 및 하위분할된 물질을 경화하여 입자형태의 고정된 생성물을 얻는 단계의 연속 단계로 이루어진다. 이 방법에서 교차결합반응은 마지막 경화단계중에 주로 일어난다.
발명에 따라 제조된 입자형태 고정생성물은 적층-상(bed) 컬럼에서의 사용에 아주 적당하며, 그 경우 낮은 압력강하를 나타낸다.
또한 그것은 그라인딩(grinding)중의 마손에 대단히 내성이며 그러므로 교반형 탱크 반응기에서의 사용에 아주 적당하다.
EP 0 206 687의 상술한 선행기술방법과는 대조적으로 폴리아제티딘 중합체는 탈수단계전의 용액 또는 분산액으로 첨가됨으로써 페이스트 상태에서 혼합하는 어려움을 피하게 된다.
교차결합제의 양은 EP 0 206 687과 비교하여 혼합이 보다 효과적이기 때문에 감소될 수 있다. 폴리아제티딘이 탈수전에 첨가되기 하지만, 그것이 거의 정량적으로 응집된 물질에 결합하므로 탈수도중에 손실되는 폴리아제티딘은 매우 작다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 방법에 의해 고정될 수 있는 생물학적 물질로는 효소, 세포덩어리(무상 또는 파괴된 세포, 생존가능 또는 비-생존가능), 항체 및 조효소가 있다. 그 물질은 종래기법에 의하여 원하는 대로 정제될 수 있는 수용액 또는 분산액으로서 사용될 수 있다.
정제농도는 발명의 실시에 결정적이지는 않지만, 고정생성물의 성상에 영향을 미친다.
반응혼합물에 존재하는 물의 양은 결정적이지 않음이 발견되었다. 과잉량의 물은 활성물질의 어떠한 심각한 손실없이도 탈수단계중에 제거될 것이다. 그러므로, 물은 편리한 콘시스턴시를 얻기 위해 첨가될 수 있다. 편리하게도 생물학적 물질은 수성분산액 또는 용액의 형태로 첨가된다.
본 발명의 실시에 사용되는 폴리아제티딘 중합체는 독일 특허공보 DT-AS-1,177,824에 따라 폴리아미드와 에피클로로히드린을 반응시킴으로써 제조되는 것들과 같이 실질적으로 반응성 아제티딘고리를 함유하는 수용성 중합체라면 어느것이라도 좋다.
상업적으로 쉽게 구할 수 있는 생성물의 실례는 폴리컵 2002, 키멘 557H 및 리텐 204이다(이들 모두 Hercules Inc., USA의 상표이다).
고정생성물의 성상을 제어하기 위해 폴리아제티딘의 양이 조절사용될 수 있다. 그로써, 대량은 일반적으로 물리적으로 강한 입자를 생산하는 한편 소량으로는 낮은 확산제한을 가지므로 높은 활성을 가지는 입자를 생산하게 된다. 적당한 양은 통상 약 0.1 내지 약 10% 범위일 것이고(이하 %는 생물학적 물질의 건조물의 중량에 의한 것이다), 전형적으로는 약 0.5 내지 약 5%, 예컨대 약 0.5 내지 약 3%일 것이다.
전과정의 pH는 일반적으로 중성부근이며 대부분은 약 5와 약 9 사이에 있다. 효소안정성에 따라 보다 높거나 보다 낮은 pH가 바람직할 수 있다.
반응중에 pH를 안정화하기 위하여 완충액이 포함될 수 있다.
선택적으로, 글루타르알데히드가 폴리아제티딘에 첨가하여 교차결합제로서 사용될 수 있다. 글루타르알데히드의 양은 약 40%(상기와 같이 건조물의)까지 일 수 있고, 전형적으로는 약 15% 이하이다.
만약 글루타르알데히드가 사용된다면, 생물학적 물질과 글루타르알데히드의 혼합물을 폴리아제티딘의 참가전 또는 후에 교차결합이 일어나도록, 예컨대 약 5분 내지 약 1시간동안 방치 보유하는 것이 바람직하다.
임의로, 폴리아제티딘과 반응하는 기, 예컨대 -NH2기(예컨대 폴리에틸렌이민, 키토산, 알부멘 또는 젤라틴) 또는 -COOH기(예컨대 카르복시-메틸셀룰로스)같은 기를 함유하는 보조교차결합제가 반응혼합물에 첨가될 수 있다. 만약 글루타르알데히드가 사용된다면 -NH2함유제제는 어느 것이라도 글루타르알데히드보다 앞서 첨가되어야 하는 것이 바람직하다. 이들은 예컨대 물리적 강도를 증가시키기 위하여, 용이한 취급을 위하여 필터케이크의 콘시스턴시를 조정하기 위해 사용될 수 있다. 또한 페니실린아실라제와 같은 어떤 경우에도 고정된 물질의 활성을 약하게 하기 위해 이들을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
보조제의 양은 건조물의 100%까지일 수 있다.
바람직한 양은 폴리에틸렌이민에 대해서는 20%까지 알부멘 또는 젤라틴에 대해서는 50%까지, 그리고 카르복시-메틸셀룰로스에 대해서는 10%까지이다.
혼합단계(및 만약 사용된다면 보유단계)중의 온도는 일반적으로 0 내지 60℃ 범위이다. 주위와 근접한 온도가 때로 편리하지만, 효소불안정성에 기인하여 보다 낮은 온도가 필요하기도 한다.
만족할만한 응집을 얻기 위하여 탈수단계전에 종래의 응집체가 첨가되는 것이 필요할 수도 있다. 응집제의 적당한 종류 및 양뿐만 아니라 이것에 대한 필요성은 기술분야에서 숙련된 사람에 의해 쉽게 결정된다.
폴리아제티딘은 교차결합제로서 작용하는 것 이외에도 양이온성 응집제로서 작용할 수 있다. 그로써, 음성 전하물질에 대해서는 만약 충분한 폴리아제티딘이 첨가된다면 별도의 응집제가 생략될 수 있다.
발명의 탈수단계는 응집후 잉여량의 물을 제거함으로써 페이스트덩어리를 형성하기 위해 의도된다. 그것은 여과 또는 원심분리에 의해 편리하게 행해진다.
발명에 따르는 하위분할단계는 이 단계에서 페이스트덩어리의 콘시스턴시가 조정된 크기의 각각의 입자로 쉽게 형성되는 것을 허용하기 때문에 경화단계전에 행해진다.
바람직한 기법은 축출법이다. 임의로, 축출된 입자는 경화단계 전 또는 후에, 예컨대 영국특허명세서 GB 1,362,265에 기재된 마루메라이저(Marumerizer)기법에 의해 둥글게 될 수 있다(구형화 됨).
발명의 경화단계는 물을 제거하고 교차결합반응이 진행되는 것을 허용하기 위해 작용하여, 그로써 물리적으로 강한 생성물이 얻어진다. 바람직한 기법은 일반적으로 15 내지 80℃에서의 공기 건조 또는 유동-상건조이다. 매우 민감한 생물학적 물질의 경우에, 저온건조 또는 냉동건조가 필요할 수도 있다.
고정생성물은 물 함량이 약 25% 중량/중량 이하가 되도록 건조되는 것이 바람직하다. 약 25% 이상의 상기의 최종 물함량을 가지는 생성물 의미 생물적 안정성은 불만스러울 수 있다.
나아가, 약 25% 이상의 상기 물함량으로는 폴리아제티딘 프리폴리머와의 교차결합이 일어나지 않을 수 있으며 또는 불완전할 수 있다; 입자는 보관기간동안 응집하려는 경향이 있을 수 있다.
물함량을 약 10% 이하로 건조하는 것은 생물학적 물질을 비활성화할 수 있다.
발명의 방법은 높은 물리적 강도의 고정생성물을 유도하고, 계속해서 적측상에서 사용되는 경우 저압력 강하를 유도한다.
실시효과는 2 내지 4의 압력낙하값(실시예 1에서와 같이 측정됨)을 가지는 발명에 따르는 고정생성물(푸사리움(Fusarium)으로부터 유도된 페니실린아실라제)이 높이 1미터 및 직경 1미터의 고정-상 컬럼반응기에서 1부에 보유시간으로 사용될 수 있다는 사실에 의하여 예시된다. 상 위로의 압력강하는 6달 이상동안 거의 일정하게 유지된다. 10 이상의 압력강하값을 가지는 유사한 선행기술생성물은 이들 조건을 견뎌낼 수 있다.
발명에 따라 고정된 생성물의 높은 물리적 강도는 또한 이하의 실시예에서 나타난 바와같이 적은 그라인딩 손실을 초래한다.
그라인딩 손실이 적은 생성물은 연속교반탱크 반응기에서 상당히 더 안정하다. 발명에 따라 고정된 페니실린 아실라제에 있어서 4m3반응기 시스템에서 4달 이상의 실제수명이 50% 이하의 활성손실과 함께 기대될 수 있다.
[실용성]
발명의 방법은 효소, 세포덩어리, 조효소 및 항체(단일 클론성 또는 다중 클론성)와 같은 생물학적 물질의 고정하에 광범위하게 응용될 수 있다.
효소는 부분적으로 또는 완전히 균등화된 세포페이스트중의 효소학상 활성세포의 형태로, 대부분 세포-유리효소용액의 형태로서 고정될 수 있다. 발명의 방법이 특히 유익한 몇가지 실례는 다음과 같다.
-스트렙토마이세스(Streptomyces)종으로부터, 예컨대 다음의 종으로부터의 글루코스이성화재: 스트렙토마이세스 뮤리누스 (S. murinus) (EP 0 194 760), 스트렙토마이세스 플라보비렌스 (S. flarorirens), 스트렙토마이세스 아크로모게누스 (S. achromogenus), 스트렙토마이세스 에키나투스 (S. echinatus), 스트렙토마이세스 베드모렌시스 (S. wedmorensis), 스트렙토마이세스 알부스(S. albus)(US 3,616,221), 스트렙토마이세스 올리보크로모게네스(S. olivochromogenes), 스트렙토마이세스 베네주엘라에(S. venezuelae)(US 3,622,463), 스트렙토마이세스 그리세오플라부스 (S. griseoflavus) (US 4,351,903), 스트렙토마이세스 글라우세스센스(S. glaucescens)(US 4,137,126), 스트렙토마이세스 올리바세우스(S. olivaceus)(US 3,625,828), 스트렙토마이세스 갈부스(S. galbus), 스트렙토마이세스 그라실리스(S. gracilis), 스트렙토마이세스 마텐시스(S. matensis), 스트렙토마이세스 니베우스(S. niveus), 스트렙토마이세스 플라텐시스(S. platensis)(헝가리특허 12,415), 스트렙토마이세스 비올라세오니거(S. violaceoniger)(독일특허 2,417,642), 스트렙토마이세스 악시도두란스(S. acidodurans)(US 4,399,222), 스트렙토마이세스 파에크로모게네스(S. phaeochromogenes), 스트렙토마이세스 프라디아에(S. fradiae), 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(S. roseochromogenes), 스트렙토마이세스 올리바세우스(S. olivacecus), 스트렙토마이세스 칼리포르니쿠스(S. californiocus), 스트렙토마이세스 바나세우스(S. vanaceus), 스트렙토마이세스 비르니기아에(S. virginiae)(일본특허공보 69-28473).
-바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans)로부터의 글루코스이성화제(US 3,979,261참조).
- 악티노플라네스(Actinoplanes)종, 특히 알티노플라네스 미조리엔시스(A. missouriensis)로부터의 글루코스이성화제.
- 아스페르길루스(Aspergillus)종, 특히 블랙 아스페로길루스와 보다 특히는 아스페르기루스 니거(A. niger)로부터 (US 특허 3,677,902참조), 또는 리조푸스(Rhizopus)종, 특히 리조푸스 델레마르(Ph. delelmar) 또는 리조푸스니베우스(Ph. niveus)로부터의 글루코아밀라제.
- 푸사리움(Fusarium)종, 특히 푸사리움 안구이오이데스(F. anguioides), 푸사리움 아르길라세움(F. argiilaceum), 푸사리움 아베나세움(F. avenaceum), 푸사리움 불비게늄(F. bulbigenum), 푸사리움 코에룰레움( F. coeruleum), 푸사리움 쿨모룸(F. culmorum), 푸사리움 에퀴세티(F. equiseti), 푸사리움 라테리티움(F. lateritium), 푸사리움 미니뭄(F. minimum), 푸사리움 모노리포르메(F. monoliforme), 푸사리움 옥시스포룸(F. oxysporum), 푸사리움 삼부시눔(F. sambucinum), 푸사리움 세미섹툼(F. semisectum), 푸사리움 솔라니(F, solani), 및 푸사리움 슬푸레움(F. sulphureum)으로부터의 페니실린-V 아실라제(GB 891,173 참조).
- 대장균(Eschericia coli), 프루테우스 레트게리(Proteus rettgeri), 클루이베라 시트로필라(Kluyvera citrophila), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus), 보비스타 플룸비아(Bovista plumbea) 또는 바실러스 메카테리움(Bacillus megaterium)으로부터의 페니실린 아실라제.
- 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)종, 특히 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) 또는 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis)로부터의 락타제.
- 덴마크 출원 DK 87/1283에 따르는 시안화물 히드라타제.
- 로도코커스(Rhodococcus)종, 슈도모나스(Pseudomonas)종, 또는 브레비박테리움(Brevibacterium)종으로부터의 니트릴라제, 니트릴히드라타제, 또는 아미다제. US 4,001,081, ep 0 093 782 및 EP 0 188 316 참조.
발명의 방법에 의해 고정되는 세포덩어리는 균등화된 세포페이스트 뿐만 아니라 생존가능 또는 비생존가능 무상세포의 형태일 수 있다.
세포는 미생물 또는 식물기원의 것이 바람직하다.
몇가지 바람직한 실례는 다음과 같다.
- 생전환에 사용하기 위한 생존가능 세포, 예컨대 에탄올 발효를 위한 효모.
- 효소적 활성을 가지는 세포, 예컨대 시안화물 히드리타제를 함유하고 있는 진균류 균사, EP 0 061 249와 EP 0 116 423 참조.
- 예컨대 중금속의 흡착제거에 사용하기 위한 세포덩어리, EP 0 181 497, US 4,320,093, US 4,298,334, US 4,293,333 및 JP-A 49-104,454 참조
[실시예 1]
글루코스이성화제 함유세포를 유럽특허공보 EP 0 194 760에 따라 스트렙토마이세스 뮤리누스 균주 DSM 3253의 발효에 의해 제조하였다.
배양 브로스에 원심분리에 의하여 세포를 수득하였다.
세포 슬러지의 건조물 함량은 7.0% 였다.
일반적인 고정방법은 다음과 같았다 ;
300g의 세포슬러지에 1.5% MgSO4, 7H2O 함유 탈이온수 300g을 첨가하였다. pH를 7.5로 조정하였다. 지시량의 폴리에틸렌이민(Sedipur, 서독 BASF 제품)을 첨가하여 혼합한 후 그 혼합물을 세포슬러지 건조물과 폴리에틸렌이민 건조물을 토대로 하여 15%의 활성 글루타르알데히드를 첨가함으로써 교차결합시켰다. 1 시간후 폴리아제티딘(Polycup
Figure kpo00001
2002)을 참가하여 교차결합된 세포 현탁액과 완전히 혼합하였다.
그런 다음 양이온성 응집제, 슈퍼플록 C521(Cyanamid Int.)을 첨가하여 혼합물을 응집시켰다. 교차결합된 효소를 여과에 의해 회수하고, 0.8mm 스크린을 통해 축출하여 입자로 형성한 다음 실온에서 건조시켰다.
글루코스이성화제 활성을 노보분석방법 F-855310(덴마아크 노보인두스트리 아크티에 셀스카브로부터 요청에 따라 이용 가능함)에 의해 측정하고 물리적 안전성을 컬럼위에 압력강하로서 측정하였다.
압력강하는 4cm의 효소상 높이(효소 5g)와 24mm 직경을 가지는 컬럼상에서 측정하였다. 리터당 1g의 MgSO4를 함유하는 탈광물수중의 45% 글루코스용액을 컬럼을 통해 40g/분의 속도로 60℃에서 펌프질 하였다.
압력강하(액의 mm로)는 효소입자의 물리적 안정성을 설명한다.
즉, 낮은 압력강하는 양호한 물리적 안정성에 상당한다.
그 결과를 하기의 표에 제시한다.
Figure kpo00002
약 20mm액을 초과하는 압력강하를 가지는 제제는 공업용 글루코스이성화제 컬럼에는 부적당한 것으로 생각되며, 그로써 이 실시예에서 공업적으로 유용한 효소를 만들기 위해서는 폴리아제티딘이 필수적이다. 활성은 증가하는 폴리아제티딘 농도로 약간 감소한다.
이 실시예는 폴리아제티딘으로 얻어진 고정된 제제의 물리적 안정성의 개선을 분명하게 보여준다.
[실시예 2]
실시예 1에 기재된 것과 유사한 실험을 DSM3253의 고수율 자손을 사용하여 수행하였다.
세포슬러지의 건조물 함량은 5.3%였고, 세포는 균등화에 의하여 부분적으로 파괴되었다. 그밖에는 고정화를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그 결과를 아래의 표에 제시한다.
Figure kpo00003
이들 실험으로부터 폴리아제티딘이 물리적으로 매우 안정한 제제라도 물리적 안정성을 개선시킨다고 결론지을 수 있다.
[실시예 3]
글루코스이성화제를 함유하고 있는 바실러스 코아귤란스를 폴리아제티딘으로 또는 그것없이 고정시켰다.
US 특허 3,979,261에 따라 제조된 바실러스 코아귤란스의 균등화된 세포페이스트를 0.1% MgSO중에 최종 건조물 농도가 3%가 되도록 현탁시켰다. 글루타르알데히드를 최종 농도 0.5%로 첨가하였다.
실온에서 60분동안 혼합한 후 폴리아제티딘(Polycup
Figure kpo00004
2002)을 첨가하고 이어서 슈퍼플록 C521로 응집시켰다. 교차결합된 요소를 여과에 의해 회수하여 축출에 의해 입자로 형성하고 실온에서 건조시켰다.
활성과 압력강하를 실시예 1에 기재한 바와같이 측정하였다.
그라인딩에 대한 내성을 0.5g의 효소를 20ml의 50mM 인산염, pH 7중에서 프로펠러로 격렬히 교반하고 1시간 후에 600nm에서의 혼탁도(광학밀도)로서 측정하였다. 측정간에 효소를 50mM 인산염, pH 7.0중의 6% NaCl로 스웰시키고 세척하였다.
Figure kpo00005
그라인딩과 물리적 안정성에 대한 2가지 내성은 폴리아제티딘의 첨가에 의해 개선된 한편, 활성은 단지 적은 손실만이 관찰되었다.
[실시예 4]
세포덩어리가 아닌 효소의 고정화의 실례로서 아스페르길루스 니거로부터의 아밀로글루코시다제를 선택하였다. 이 효소는 세포외재성이다.
상업적 제제인 AMG 400 L HP(덴마아크 노보인두스트리 아크티에 셀스카브)를 50mM 인산염 pH 7.0에 대하여 투석하였다.
제제를 건조물 농도가 2%가 되도록 희석하고 동량의 난 알부민을 첨가하였다. 글루타르알데히드를 0.6% 중량/부피의 농도로 첨가하였다.
한시간동안 교반한 후, 폴리아제티딘(Polycup
Figure kpo00006
2002)을 0.08% 중량/부피의 지시된 최종농도로 첨가하고 그 혼합물을 필터플록(Servo B. V., Netherlands)으로 응집시켰다.
효소를 전술한 실시예에 기재한 바와같이 회수하였다.
활성을 노보분석방법 AF159/2에 기재된 바와같이 측정하였다.
압력강하를 실시예 1에 기재한 바와같이, 그러나 35℃에서 및 50mM 인산염, pH 7.5중의 11% 중량/중량 글루코스로 측정하였다.
Figure kpo00007
* 입자프랙션 : 425 내지 710㎛
[실시예 5]
0.9% NaCl로 완전히 세척하여 놓은, 페니실린 아실라제 활성을 함유하고 있는 푸사리움종의 세포페이스트(영국특허 명세서 GB 891,173에 따라 제조함)를 50mM 인산염, pH 7.0중에 현탁시켜서 최종 건조물 함량을 3%로 하였다. 폴리에틸렌이민(Sedipur)을 최종 건조물 함량이 0.1%가 되도록 첨가하였다.
글루타르알데히드를 최종 농도가 0.2% 중량/부피가 되도록 첨가하였다. 전체 혼합 한시간 후 폴리아제티딘을 첨가하고, 마지막으로 그 혼합물을 양이온성 응집제, 필터플록으로 응집시켰다. 교차결합된 효소를 여과에 의해 회수하고, 0.6mm 스크린을 통한 축출에 의해 입자로 형성한 후 실온에서 건조시켰다.
효소활성을 노보분석 AF 186으로 측정하고 물리적 안정성을 압력강하 (실시예 3) 및 그라인딩에 대한 내성(실시예 3)으로서 측정하였다.
Figure kpo00008
* 450 내지 710㎛ 프랙션
표에서 알 수 있는 것처럼 폴리아제티딘은 물리적 안정성을 증가시킨다. 즉 그라인딩에 대한 증가된 내성과 매우 개선된 압력안정성을 제공한다. 그런, 부분적으로는 폴리아제티딘이 존재하는 경우 보다 조밀한 제제에 기인하는 것으로 믿어지는 확산 한계에 기인하여 이것을 활성손실이라는 대가를 치르고 얻어진다.
[실시예 6]
푸사리움종을 실시예 5에 기재한 바와같이, 그러나 모든 제제에서 상이한 pH가와 1% 키멘
Figure kpo00009
557H 교정시켰다.
그 결과를 아래의 표에 나타낸다.
Figure kpo00010
물리적 안정성은 양호하며 시험된 범위의 pH(6 내지 8)에는 무관하다.
[실시예 7]
폴리아제티딘 첨가시 시간의 중요성을 푸사리움종의 세포 페이스트로 조사하였다. 고정화를 실시예 5에서 설명한 바와같이 행하였고, 단, PEI가 없는 상태로 글루타르알데히드의 첨가 전 및 후 두 경우에 폴리아제티딘(Polycup
Figure kpo00011
2002)을 최종 농도 0.3% 첨가하였다.
Figure kpo00012
물리적 안정성은 폴리아제티딘이 글루타르알데히드 전과 후에 첨가되는 경우에 모두 증가한다.
[실시예 8]
폴리아제티딘과의 조합시에 글루타르알데히드의 효과를 시험하였다.
푸사리움종을 실시예 5에 기재한 바와같이, 그러나 몇가지 성분은 제외하고 고정시켰다. 그 결과를 표에 나타낸다.
Figure kpo00013
결과는 글루타르알데히드가 물리적 안전성, 특히 압력에 대한 내성을 증가시키는 것을 보여준다. 그러나 허용가능한 제제가 글루타르알데히드, PEI, 또는 응집제 없이도 만들어질 수 있다.
[실시예 9]
니트릴을 가수분해하는 능력을 가지고 있는 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)의 세포슬러지(EP 188,316에 따라 제조함)를 물로 희석하여 건조물을 2%로 하였다. 10% 폴리에틸렌이민(Sedipur)(세포슬러지의 건조물을 토대로)을 첨가하고, pH를 7.0으로 조정하였다. 5%의 활성 글루타르알데히드(세포슬러지 건조물과 폴리에틸렌이민 건조물을 토대로)의 첨가에 의해, 혼합물을 교차결합시켰다. 1시간 후, 2%의 폴리아제티딘(Kymene)(총 건조물을 토대로 하여)을 첨가하였다.
그런 다음 혼합물을 음이온성 응집제 슈퍼플록 A130의 첨가로 응집시켰다. 그런 후 교차결합된 효소를 여과에 의해 회수하고, 0.8mm 스크린을 통한 축출에 의해 입자로 형성한 후 실온에서 건조시켰다.
대조표준에 대해서는 동일한 세포슬러지를 폴리아제티딘만 없고 다른 것을 상기와 동일한 방법으로 교차결합시켰다.
비교하기 위해 동일한 세포슬러지를 선행기술방법에 의해 고정시켰다. 즉, US 4,248,968에 따라 폴라아크릴아미드겔에 침지하였다.
보다 구체적으로, 세포슬러지를 12,5% 건조물로 희석하고 그 공보의 실시예 12에 기재된 바대로 고정시켰다. 마지막으로 겔을 1mm 매쉬시이브로 잘라서 상징액이 투명해질때까지 식염수로 세척하였다.
압력강하를 다음의 조건에서 측정하였다.
11% 글루코스시럽
유속 : 40g/분
온도 : 35℃
압력강하는 25시간 후에 측정하였다.
5g(건조물)의 고정된 효소를 측정에 대해 사용하였다. 결과(g/cm 로 표시된 압력강하) :
발명 :
폴리아제티딘으로 교차결합 13
대조표준 :
폴리아제티딘이 없는 교차결합 200
겔 침지 200

Claims (21)

  1. 폴리아제티딘으로의 교차결합에 의하여 생물학적 물질을 고정시키는 방법으로서, 생물학적 물질을 폴리아제티딘과 수성혼합하는 단계, 그 결과의 혼합물을 응집시키는 단계, 응집생성물을 탈수하는 단계, 탈수된 생성물을 하위 분할하는 단계 및 하위 분할된 물질을 경화하여 입자형태의 고정생성물을 얻는 단계의 연속 단계로 이루어진다.
  2. 제1항에 있어서, 폴리아제티딘의 양이 생물학적 물질의 건조물 중량의 약 0.1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 5%인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 글루타르알데히드가 탈수단계가 실시되기 전에 폴리아제티딘/생물학적 물질 혼합물에 혼입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 글루타르알데히드의 양이 생물학적 물질중의 건조물의 약 40% 이하, 바람직하게는 약 15% 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 글루타르알데히드가 생물학적 물질과 수성 혼합된 후, 글루타르알데히드/생물학적 물질 혼합물이 그것과 폴리아제티딘과의 혼합전에 보유되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 글루타르알데히드와 폴리아제티딘이 생물학적 물질과 수성혼합되고 그런 다음 글루타르알데히드/폴리아제티딘/생물학적 물질 혼합물이 그의 탈수전에 보유되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 탈수단계전에 바람직하게는 약 100% 건조물 이하의 폴리에틸렌이민(가장 바람직하게는 약 10% 이하), 알부멘(가장 바람직하게는 약 50% 이하), 젤란틴 (가장 바람직하게는 약 50% 이하), 또는 카르복시메틸셀룰로스(가장 바람직하게는 약 10% 이하)(모든 %는 생물학적 물질중의 건조물에 관련한 중량%이다)를 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 유효량의 응집제가 탈수단계전에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 생물학적 물질이 수성분산액 또는 용액의 형태로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 생물학적 물질이 바람직하게는 식물 또는 미생물기원의 전체세포 또는 완전히 또는 부분적으로 파괴된 세포로부터의 세포덩어리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 고정된 물질이 바람직하게는 중금속의 흡착제거에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 생물학적 물질이 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 효소가 글루코스이성화제인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 효소가 스트렙토마이세스종, 가장 바람직하게는 스트렙토마이세스뮤리누스로부터, 바실러스 코아귤란스로부터 또는 악티노 플라네스 미오리엔시스로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 효소가 페니실린 아실라제인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 효소가 푸사리움종, 바람직하게는 푸사리움 안구이오이데스, 푸사리움 아르길라세움, 푸사리움 아베나세움, 푸사리움 불비게늄, 푸사리움 코에룰레움, 푸사리움 쿨로룸, 푸사리움 에퀴세티, 푸사리움 라테리티움, 푸사리움 미니뭄, 푸사리움 모노리포르메, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 삼부시눔, 푸사리움 세미섹툼, 푸사리움 솔라니 또는 푸사리움 슬푸레움으로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제12항에 있어서, 효소가 바람직하게는 로도코커스종(바람직하게는 로도코커스 에리트로폴리스), 슈도모나스종 또는 브레비박테리움종으로부터의 니트릴라제인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제12항에 있어서, 효소가 시안화물 히드라타제인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 생물학적 물질이 조효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 생물학적 물질이 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항의 방법에 의하여 제조된 고정된 효소의 효소-촉매 과정에서의 이용.
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