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KR970009149B1 - Wf 2015 a 및 b화합물 및 그 제조 방법 - Google Patents

Wf 2015 a 및 b화합물 및 그 제조 방법 Download PDF

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KR970009149B1
KR970009149B1 KR1019880013902A KR880013902A KR970009149B1 KR 970009149 B1 KR970009149 B1 KR 970009149B1 KR 1019880013902 A KR1019880013902 A KR 1019880013902A KR 880013902 A KR880013902 A KR 880013902A KR 970009149 B1 KR970009149 B1 KR 970009149B1
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다카나오 오츠카
도시히로 시바타
히로시 데라노
야스히사 즈루미
마사쿠니 오쿠하라
Original Assignee
후지사와 야쿠힌 고교 가부시기가이샤
후지사와 도코키치로
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Abstract

내용 없음.

Description

WF 2015 A 및 B 화합물 및 그 제조 방법
본 발명은 신규의 WF 2015 A 및 B화합물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 억제 활성 및 항종양 활성을 갖는 신규한 WF 2015 A 및 B화합물 및, 영양 배지중에서 스콜레코바시듐(Scolecobasidium)속에 속하는 WF 2015 A 및 B-생산 숙주를 배양하여 WF 2015 A 및 B를 제조하는 방법과, 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
후술하는 실시예에서 얻어진 WF 2015 A 및 B는 하기의 물리 화학적 성질을 가진다.
(1) WF 2015 A :
a) 분자량 : 410[FAB-MS : m/z 411(M+H)]
b) 원소분석 : C 64.55 ; H 8.06 ; 0 27.39(차이에 의해)
c) 광학 회전도 : [α]D 23=-52℃(C=1.0, CH3OH)
d) UV흡수 스펙트럼 : 말단 흡수(CHCl3에서)
e) IR흡수 스펙트럼 :
Figure kpo00001
: 3450, 2960, 2920, 1710, 1650, 1440, 1370, 1300, 1260, 1200, 1170, 1120, 1100, 1070, 1050, 1000, 980, 920, 880, 830cm-1
f)1H NMR 흡수 스펙트럼 : (CDCl3)
δ : 6.95 (1H, dd, J=15.5 및 4.5Hz), 6.20 (1H,dd, J=15.5 및 2Hz), 5.70 (1H, 넓은 s), 5.20 (1H, 넓은 t, J=7Hz), 4.31 (1H, m), 3.90 (1H, m), 3.68 (1H,dd,J=11 및 3Hz), 3.44 (3H,s), 2.98 (1H,d,J=4.2Hz), 2.62 (1H,dd,J=6.5 및 6Hz), 2.56 (1H,d,J=4.2Hz), 2.36 (1H,m), 2.16 (1H,m), 2.10 (1H,m), 2.00 (1H,m), 1.98 (1H,d,J=11Hz), 1.87 (1H,m), 1.74 (3H,d,J=1Hz), 1.66 (3H,d,J=1Hz), 1.21 (3H,s), 1.14 (3H,d,J=6,5Hz), 1.07 (1H,m)
g)13C NMR 흡수 스펙트럼 : (CDCl3)
δ : 165.8 (s), 146.6 (d), 135.0 (s), 121.8 (d), 118.3 (d), 79.4 (4), 74.5 (d), 69.9 (d), 66,3 (d), 61.1 (d), 59.4 (s), 58.9 (s), 56.7 (q), 50.7 (t), 48.2 (d), 29.2 (t), 27.2 (t)
h) 용해도 : 가용성 : 클로로포름, 메탄올, 아세톤, 에탄올
불용성 : n-헥산, 물
i) 칼라 반응 : 양성 : 요오드 증기와의 반응
음성 : 닌히드린 반응, 몰리쉬 반응, 염화 제2철 반응,
j) 기질의 특성 : 중성 기질
(2) WF 2015 B :
a) 분자량 : 447[FAB-MS : m/z 469(M+Na)]
b) 원소 분석 : C 58.03 ; H 7.94 ; Cl 7.31 ; O 26.72(차이에 의해)
c) 광학 회전도 : [α]D 23=-248℃(C=2.0, CHCl3)
d) UV 흡수 스펙트럼 : 말단 흡수(CHCl3)
e) IR흡수 스펙트럼 :
Figure kpo00002
: 3450, 2960, 2920, 1710, 1650, 1440, 1370, 1300, 1260, 1200, 1170, 1120, 1100, 1070, 1050, 1000, 980, 920, 880, 830cm-1
f)1H NMR(400 MHz, CDCl3)
δ : 6.99(1H, dd, J=5 및 15.5Hz), 6.20(1H, dd, J=2 및 15.5Hz), 5.55(1H, m), 5.18(1H, m), 4.36(1H, m), 3.98(1H, dq, J=4 및 6Hz), 3.87(1H, d, J=11Hz), 3.49(1H, d, J=11Hz), 3.31(1H, m), 3.30(3H, s), 2.97(1H, t, J=6.5Hz), 2.50-2.40(2H, m), 2.17(1H, m), 2.05(1H, m), 1.90-1.75(2H, m), 1.73(3H, s), 1.66(3H, s), 1.49(3H, s), 1.40(1H, 넓은 d, J=14Hz), 1.20(3H, d, J=6Hz)
g)13C NMR (100 MHz, CDCl3)
δ : 165.7 (s), 146.3 (d), 134.8 (s), 122.4 (d), 118.2 (d), 78.7 (d), 76.2 (s), 74.5 (d), 70.0 (d), 66.1 (d), 64.0 (s), 62.3 (d), 56.7 (d), 50.5 (t), 43.3 (d), 29.1 (t), 27.5 (t), 25.8 (q), 23.5 (t), 22.2 (q), 17.9 (q), 17.6 (q)
h) 용해도 : 가용성 : 클로로포름, 메탄올, 아세톤, 에탄올
불용성 : n-핵산, 물
i) 칼라 반응 : 양성 : 요오드 증기와의 반응
음성 : 닌히드린 반응, 몰리쉬 반응, 염화 제2철 반응,
j) 기질의 특성 : 중성 기질
WF 2015 A 및 B는 영양 배지중에서 스콜레코바시듐 아레나륨(Scolecobasidium arenarium) F-2015 와 같은 스콜레코바시듐 속에 속하는 WF 2015 A 및/또는 B-생산 숙주를 배양하고, 배양액으로부터 WF 2015 A 및/또는 B-생산 숙주중에서, 스콜레코바시듐 아레나륨 F-2015는 본 발명자들에 의해 일본 이사카와켄 우치나다시의 해변에서 채집된 10년생 수목의 파편으로부터 신규하게 분리되었다. 스콜레코바시듐 아레나륨 F-2015의 동결 건조 샘플은 1987년 10월 13일에 수탁번호 FERM BP-1520으로서 부다페스트 조약의 국제 기탁 기관인 일본 이바라키켄 305츠쿠바군 야타베마치 히가시 1-쵸메 1-3에 소재하는 통상 산업성 공업 기술원성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에 기탁되었다.
신규의 WF 2015 A 및 B화합물은 본 명세서에서 설명한 특정 유기체의 사용 방법에서만 국한되는 것이 아니며, 이것은 예시용으로만 제시한다. 본 발명에서 X-선, 자외선 조사, N-메틸-N′-니트로-N-니트로소구아니딘, 2-아미노푸린 등의 처리와 같은 종래 방법에 의해 전술한 유기체로부터 제조된 수 있는 자연적 돌연변이체 및 인공적 돌연변이체를 포함하는 WF 2015 A 및 B를 생산할 수 있는 돌연변이체의 사용 방법도 포함된다.
스콜레바시듐 아레나륨 F-2015는 하기와 같은 형태학적, 배양상 및 생리학적 특징을 가진가.
상기 유기체는 각종 배양 배지상에서 급속히 성장하여 암올리브색의 펠트성 콜로니를 형성하였다. 2개월간, 그것의 텔로모프는 발견되지 않았지만, 분생포자 구조는 충분히 형성되었다. 분생포자 발생은 전할성 이었으며, 분생포자는 어둡고 격막이 있는 타원체이었다. 분생포자병은 짧고, 단순하거나 가지가 있었으며, 합족증 추이가 나타났다. 이러한 특성을 바탕으로 숙주 F-2015는 총생균속 스콜레코바시듐 엡보트(Abbott) 1927에 속하는 것으로 나타났다. 이것의 진균학적 특성은 다음과 같다.
각종 한천 배지상에서의 배양상 특징은 표1에 나타내었다. 옥수수 가루 한 천상의 배양물은 급속히 성장하여 25℃에서 1주일후에 직경이 4.5~5.5cm가 되었다. 이 콜로니의 표면은 평탄하고, 얇으며, 펠트성이고 황회색이었다. 뒷면도 동일하였다. 분생포자 구조가 관찰되었다. 맥아 추출물 한천상의 콜로니는 옥수수 가루 한천상에서의 속도와 유사하게 성장하였다. 표면은 평탄하고, 펠트성이며, 절흔상이고 암녹색 및 올리브 갈색이었다. 뒷면은 암녹색이었다. 분생포자가 충분히 형성되었다. 3.5% NaCl을 함유하는 맥아 추출물 한천상에서, 상기 죽주는 다른 배지상에서 보다 급속히 분산되었으며, 동일 조건하에서 직경이 8.0cm가 되었다. 이들은 평탄하고, 분말성 내지 펠트성이었으며, 비절흔상이고 올리브색 내지 암올리브색이었다. 뒷면은 녹색계 흑색이었다. 분생포자 구조는 충분히 형성되었다.
분생포자병은 단사성이며, 담갈색이고, 유연하며, 격막이 있고, 단순하거나 가지가 있었으며, 직선형 또는 가요성으로서, 길이는 (8-) 12-35 (-70)μm이고 두께는 2~4μm이었다. 각 가지의 말단은 팽윤되어 분생포자를 포함하는 톱니 모양 부위를 형성하였으며, 직경은 4~5μm이었다. 경우에 따라서, 분생포자병은 팽윤점으로부터 성장을 계속하여 2차 생식 측부를 형성하였다. 팽윤 부위에서, 2 내지 12의 자는 송이를 형성하였다. 분생 포자는 갈색이며, 난형공극(obovoid)이며, 기저부돌출부를 가진 타원체 내지 원통형이고, 미소하나 분명한 사마귀 모양으로서 양단부에 어두운 격막과 어두운 스폿을 가진 1-3(-5)의 격막이 있었으며, 길이는 (9-)12-25(-30)μm이고 두께는 4~7μm이었다. 식물성 균사는 격막이 있고, 유리 모이며, 유연하고 가지가 있었다. 균사 세포는 원통형으로서 두께가 2~6μm이었다. 유현 포자는 없었다.
숙주 F-2015는 5 내지 37℃의 온도 범위에서 성장 가능하나, 23 내지 25에서 최적 성장을 하였다. 이러한 온도 데이타는 감자 덱스트로스 한천상에서 측정 하였다. 이 숙주는 pH 4내지 10에서 성장할 수 있으며, YM 액체배지(Difco)중서 pH 6 내지 7에서 최적 성장하였다. 숙주는 20% NaCl까지 허용되었으나, 우한 성장은 5% 까지의 염수중에서 일어났다.
스콜레코바시듐 속의 계통학적 기준에 의하면, 숙주 F=2015는 스콜레코바시듐 아레나륨(Nicot) M.B. 앨리스(Ellis) 1976과 유사하였다. 앨리스 (Ellis, More Dematiaceous Hyphomycetes, P. 194, C.M.I. Kew, 1976)에 의한 상재에 해당하는 전술한 특성에는 예외가 없다. 이후, 본 발명자들은 상기 숙주가 스콜레코바시듐 아레나륨인 것을 확인하였으며, 스콜레코바시듐 아레나륨 F-2015로 명명하였다.
Figure kpo00003
약어) G : 성장속도, 측정된 콜로니의 직경, S : 콜로니 표면, R : 뒷면
주 : 1) 이 특성들은 25℃에서 7일간 배양후 관찰된 것이다. 칼라 설명은 문헌〔Methuen Handbook of Colour 에이. 코너럼 및 제이. 에이치. 반셔, Methuen Handbook of Colour, 3판, Methuen. London, 1983를 기초로 한 것이다.
일반적으로, WF 2015 A 및 B는 동화가능한 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양배지중에서, 바람직하게는 호기성 조건(예를 들면, 진탕 배양, 침수 배양등)하에서 WF 2015 A 및/또는 B 생산 숙주를 배양하여 제조할 수 있다.
영양 배지중의 바람직한 탄소원은 글루코스, 프룩토스, 글리세린 및 전분과 같은 탄수화물이다. 기타 공급원, 예를들어, 락토스, 아라비노스, 크실로스, 덱스트린, 당밀 등의 포함될 수 있다.
바람직한 질소원은 이스트 추출물, 펩톤, 글루텐분, 면종자분, 콩분, 옥수수 함침액, 건조 이스트 등이며, 암모늄염(예를 들면, 질산 암모늄, 황산 암모늄 등), 우레아, 아미노산 등과 같은 무기 및 유기 질소 화합물이 포함된다.
탄소원 및 질소원은 함께 사용하는 것이 유리하기는 하지만, 순수한 형태로 사용할 필요는 없으며, 이것은 미량의 성장 인자와 상당량의 영양분을 함유하는 덜 순수한 물질도 사용하기에 적합하기 때문이다. 필요한 경우, 탄산 칼슘, 인산 나트륨, 인산 칼륨, 요오드화 나트륨, 요오드화 칼륨, 마그네슘염, 염화 코발트와 같은 무기 염을 배지에 첨가할 수 있다. 필요에 따라서, 특히, 배양 배지가 현저하게 형성되는 경우, 액체 파라핀, 고급 알코올, 식물성유, 광물성유 및 실리콘과 같은 변형제를 첨가할 수 있다.
다량으로 제조하고자 하는 경우, 함침 호기성 배양 조건이 WF 2015 A 및 B 제조시에 바람직하다. 소량으로 제조하고자 하는 경우, 플라스크 또는 병내에서의 교반 또는 표면 배양법을 이용한다. 또한 성장을 대형 탱크내에서 행하는 경우, WF 2015 A 및 B의 제조 공정중 성장 지연을 방지하기 위해서 제조 탱크내에서 배양하는 유기체는 증식성 형태를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 우선 비교적 소량의 배양 배지를 유기체의 포자 또는 균사로 접종시키고, 이 접종 배지를 배양하여 유기체의 증식성 접종물을 제조한 후, 배양된 증식성 접종물을 대형 탱크에 무균상태로 옮기는 것이 바람직하다. 증식성 접종물을 제조한기 위한 배지로서는, WF 2015 A 및 B의 제조시에 사용된 배지와 대략 동일하거나 다소 상이한 배지를 사용할 수 있다.
배양 혼합물의 교반 및 포기는 여러가지 방법으로 행할 수 있다. 교반은 프로펠러 또는 그와 유사한 기계적 교반 장치를 사용하거나, 발효기를 회전 또는 각반하거나, 각종 펌핑 장치를 사용하거나 배지를 통해 살균 공기를 통과시켜서 행할 수 있다. 포기는 발효 혼합물을 통해 살균 공기를 통과시켜서 통기시킬 수 있다.
발효는 통상적으로 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 약 25℃의 온도에서 50 내지 100시간 동안 행하며, 이 시간은 발효 상태 및 규모에 따라 변화시킬 수 있다.
이렇게 제조된 WF 2015 A 및 B 대부분은 배양 여액중에서 발견되기 때문에, WF 2015 A 및 B는 액체배지를 여과 또는 원심 분리하여 얻어진 여액으로부터 감압 농축, 동결 건조, 종래 용매에 의한 추출, pH조절, 종래 수지(예를 들면, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비이온성 흡착 수지(에 의한 처리 종래 흡착제(예를 들면, 활성탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로오스, 알루미나)에 의한 처리, 결정화, 재결정화등의 종래 방법으로 분리할 수 있다.
WF 2015 A 및 B의 생물학적 특성을 하기 시험에서 상세히 설명한다.
WF 2015 A 및 B는 서로 분리할 수 있으며 실시예에서 예시한 바와 같이 WF 2015 A 및 B를 함유하는 미정제물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리할 수 있다.
시험 1(WF 2015 A의 항종양 활성)
WF 2015 A의 항종양 활성은 쥐의 실험적 종양 계통을 통해 측정하였다.
쥐의 프브로사코마 Meth A를 쥐 1 마리당 1×105세포의 접종 크기로 Balb/c 쥐(암컷, 생후 8주)에 피내이식하였다. 종양 세포를 이식하고 24시간 후, 정해진 용량의 WF 2015 A를 쥐에 정맥내 투여하였다.
종양 접종루 1, 2, 3, 4 및 7, 8, 9, 10일째에 1일 1회 치료하였다. 대조 동물에는 정맥내 투여량의 생리식염수를 투여하였다. 주사량은 모든 실험에서 0.2mℓ이었다. 매 실험에 5 마리의 쥐를 사용하였다.
투여후 14일째의 종양 중량은 종양의 길이와 폭의 캘리퍼 측정에서 유래된 하기식에 의해 측정하였다. :
종양 중량(mg)=1/2×a×b2
상기 식에서, a는 길이이고, b는 폭(mm)이다.
결과는 하기 표에 제시한다.
Figure kpo00004
(평균값 ±S.E., n=5)
시험 2(WF 2015의 시험관내 세포 독성)
본 시험에서는 인체의 폐선암 A549 세포와 쥐의 임파종 EL-4 세포를 사용하였다. A549 세포는 10% 가온 불활성 태아 송아지 혈청(FBS), 페니실린 G(60μg/mℓ) 및 스토렙토아이신(20μg/mℓ)으로 보충된 둘베코 배지중에서 단층 배양물로서 전파되었으며 트립신화에 의해 수집하였다. EL-4 세포는 10% FBS 및 항생제가 보충된 배양 플라스크내의 RPMI 배지중에서 유지시켰다.
배양물로부터 수집된 지수적 성장 세포 A549 또는 EL-4는 플라스크내의 각각 2×10 세포/mℓ 또는 2×10 세포/mℓ 농도의 적합한 배지(10% FBS 및 항생제로 보충된 둘베코배지 또는 RPMI 배지)중에서 부유되었다. 세포는 플라스틱조직 배양 디쉬내에서 정해진 용량의 WF 2015로 처리하였다.
세포 성장율 50% 억제하는데 필요한 기재의 농도(IC값, μg/mℓ)는 37℃, 5% 이산화탄소 습윤 분위기에서의 A549 세포의 120 시간 배양후 및 EL-4 세포의 48시간 배양후의 치료 세포의 약제 농도의 log 값 대 성장 속도(대조 %)를 플로팅하여 측정하였다.
그 결과는 다음과 같다.
(1)WF 2015 A IC값 : A549 3.0×10 μg/mℓ
EL-4 6.5×10 μg/mℓ
(2)WF 2015 B IC값 : A549 1.4×10 μg/mℓ
EL-4 5.1×10 μg/mℓ
시험 3(WF 2015의 급성 독성)
WF 2015 A 또는 B의 생리 식염수 용액(100mg/kg)을 5일 동안 1일 1회 51CR 숙주 쥐(암컷, 생후 5주)에 투여하였으며, 그 결과 쥐의 비정상 증후군은 전혀 발견되지 않은 것으로 나타났다.
시험 4(시험관내 혼합 임파구 반응(MLR)의 억제)
m/R 시험은 마이크로 타이터 플레이크에서 행하였으며, 각 웰은 10% 태아송아지 혈청, 2mM으 글루타민, 3×10 M의 2-메르캅토에탄올, 24mM의 중탄산 나트륨, 페니실린(50단위/mℓ) 및 스트렙토아이신(50μm/mℓ)가 보충된 0.2mℓ의 RPMI 1640 배지중에 특정 농도의 WF 2015 A 및 5×10 C57BL/6 레스폰더 세포(H-2 ), 5×10 미토마이신 C 처리(37℃에서 30분동안 25μm/mℓ의 미토마이신 C) BALB/C 스티뮬레이터 세포(H-2 )를 함유하도록 하였다. 세포를 5% CO: 95% 공기의 습한 분위기중에서 37℃에서 68시간동안 배양하고 세포를 수집하기 4시간 전에 H-티미딘(0.5 μCi)로 펄스 처리시켰다. 세포의 방사선 활성을 B-카운터로 분석하였다. 얻은 데이타로부터, MLR 억제율(%)을 계산하였다. 그 결과는 하기 표와 같다.
Figure kpo00005
시험 5(생체내 항 종양 활성)
생후 6 주된 암컷 BALB/C nu/nu쥐에 계속적으로 피하 유지된 인체 MX-1 유방편(3×3×3mm)를 0일째에 암컷 BALB/C nu/nu 쥐에 피하 이식하고, 특정일(0→4일, 7→11일 및 14→18일)에 1일 1회 쥐에 WF 2015 또는 부형제를 정맥내 투여하였다.
종양 중량을 하기와 같이 계산하였다(종양 길이 및 폭은 캘리퍼로 측정하였다).
종양 중량(mg)=1/2×a×b
상기 식에서, a는 길이이고, b는 폭(mm)이다.
종양 중량(초기) 및 (최종)을 각각 제1주사일(투약직전) 및 21일째(최종평가일)에 계산하였다.
각 시험군과 각 부형제 치료 대조군으로서 각각 8마리의 쥐를 사용하였다. 약제 효능은 종양 성장 억제율(%)로서 표시하였다.
결과는 하기표와 같다 :
Figure kpo00006
약학적 허용 담제와 혼합된 본 발명의 WF 2015 A 및/또는 B는 캡슐, 정제, 과립, 분제, 구강정제, 설하정제 및 용액과 같은 약학 조성물의 형태로 사람을 비롯한 포유동물에 면역 억제제 또는 항 종양제로서 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
약학적 허용 담체에는 종래에 약학용으로 사용하였던 각종 유기 또는 무기 담체 물질이 포함되며, 예를 들면, 부형제(에를 들면, 수크로스, 전분, 만니트, 소르비트, 락토스, 글루코스, 셀룰로스, 탈크, 인산칼슘, 탄산 칼슘 등), 결합제(셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리프로필피롤리돈, 젤라틴, 아리바아껌, 폴리에틸렌글라코올, 수크로스, 전분 등), 붕해제(예를 들면, 전분, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스의 칼슘염, 히드록시프로필-전분, 나트륨 글라코올-전분, 중탄산 나트륨, 인산 칼슘, 시트르산 칼슘 등), 윤활제(예를 들면, 스테아르산 마그네슘, 에어로실, 탈크, 라우릴황산 나트륨 등), 향미제(예를 들면, 시트르산, 멘톨, 글리신, 오렌지 분말 등), 보존제(벤조산 나트륨, 중탄산 나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등), 안정화제(시트르산, 시트르산 나트륨, 아세트산 등), 현탁제(예를 들면, 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 스테아르산 알루미늄 등), 분산제(예를 들면, 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 스테아르산 알루미늄 등), 분산제(예를 들면, 계면 활성제 등), 수성 희석제)예를 들면, 물), 오일 (예를 들면, 참기름 등), 베이스 왁스(예를 들면, 카카오버터, 폴리에틸렌그릴코올, 화이트 와셀린 등)이 있다.
본 화합물의 투여량은 질병의 종류, 환자의 체중 및/또는 나이 및 나아가서는 투여 경로와 같은 여러가지 요인에 따라 다르다.
WF 2015 A 및 B의 바람직한 투여량은 통상적으로 주사의 경우 0.01~10mg/kg일이고, 경구 투여의 경우 0.5~50mg/kg/일의 범위에서 선택된다.
다음의 실시예에 의거하여 본 발명을 설명한다.
실시예 1
2%의 가용성 전분, 1%의 옥수수 전분, 1%의 글루코스, 1%의 면종자분, 1%의 건조 이스트, 0.5%의 펩톤, 0.5%의 옥수수 함침액 및 탄산 칼슘(pH 6.0)을 함유하는 수성 배지(160mℓ)를 19개의 500mℓ 삼각 플라스크에 장입하고 120℃에서 20분 동안 살균시켰다. 스콜레코바시듐 아레나를 F-2015의 고리형 경사 배양물을 각 배지에 접종, 25℃에서 3일 동안 교반 배양하였따. 얻은 배양물을 120℃에서 20분 동안 미리 살균시킨 200ℓ 자아-발효기내의 3% 가용성 전분, 1% 글루코스, 1% 밀 배아, 0.5% 면 종자분 및 탄산칼슘 함유 수성 배지(120ℓ)에 접종하고, 25℃에서 3일 동안 배양하였다.
이렇게 얻어진 배양 액체배지를 규조토(20kg)로 여과하였다. 여액(95ℓ)를 에틸아세테이트(95ℓ)로 추출하였다. 이 추출 공정을 2회 실시하고 추출물출 혼합하였다. 무수 황산 마그네슘으로 탈수시킨 후, 에틸 아세테이트 층을 진공 농축하였다. 농축물을 실리카 겔 크로마토그래피 컬럼(1ℓ)에 공급하였다. 컬럼을 n-핵산(3ℓ) 및 n-핵산-에틸 아세테이트 혼합물(1:1, 3ℓ)로 세정하였다. 활성 분획을 에틸아세테이트(4ℓ)로 용출한 후 진공 농축하였다. 용출액을 실리카 겔 컬럼(400mℓ)에 부가로 가했다. 클로로포름(1.2ℓ) 및 클로로포름-메탄올의 혼합물(1:1, 300mℓ)로 세정한 후, 컬럼을 단계적으로 클로로프름-메탄올 혼합물(75:1, 50:1 및 25:1)로 용출하였다. 활성 분획을 진공 농축하고, 잔류물을 0DS(YMC) 컬럼 크로마토그래피하였다. 메탄올-물의 혼합물(1:1, 300mℓ)로 세정한 후, 컬럼을 단계적으로 메탄올-물 혼합물(3:2 및 7:3, 각 300mℓ)로 전개시켰다. 활성 분획을 감압하게 증발건조시켜서 정제된 무책 오일상의 WF 2015 A(92mg)을 얻었다.
실시예 2
스콜레코바시듐 아레나륨의 고리형 경사 배양물을 20개의 500mℓ 삼각 플라스크내의 2%의 가용성 전분, 1%의 옥수수 전분, 1%의 글루코스, 1%의 면종자분, 1%의 건조 이스트, 0.5%의 펩톤, 0.5%의 옥수수 함침액, 3%의 NaCl 및 0.2%의 CaCO(pH 6.0)함유 살균 종자 배지(160mℓ)에 접종하고, 회전교반기를 사용하며 250rpm으로 25℃에서 72시간 동안 배양하였다.
얻은 종자 배양 액체배지를 200ℓ스테린레스강 발효기내의 동일 산균 배지 160ℓ에 옮기고, 이것을 25℃에서 48시간동안 200rpm으로 교반하였다. 또한, 얻은 종자 배양물 90ℓ를 4000ℓ 강철 발효기내의 3% 가용성 전분, 1% 글루코스, 0.5% 면종자분, 1% 밀 배아, 3% NaCl 및 0.2% CaCO함유 생성 배지 3000ℓ에 접종하였다. 3,000ℓ/분의 통기와 130rpm의 교반하에 25℃에서 72시간 동안 배양을 행하였다.
배양 액체배지(2,850ℓ)를 규조토(65kg)으로 여과하였다. 여액을 활성 탄소컬럼(600ℓ)에 통과시켰다. 컬럼을 180ℓ의 탈이온수로 세정하고 80% 아세톤 수용액(180ℓ)으로 용출하였다. 용출액을 부피가 17ℓ가 되도록 진공 농축하였다. 농축물을 에틸 아세테이트 18ℓ로 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 분리하고 증발 건조시켜서 분말(61.3g)을 얻었다. 미정제 분말을 실리카 겔 0.3ℓ와 혼합하였다. 혼합물을 실리카겔(3ℓ)를 사용하여 컬럼 크로마토그래피하였다. 10ℓ의 핵산으로 컬럼을 전개시킨 후, 10ℓ의 핵산-에틸 아세테이트(1:1)로 전개시키고, 컬럼을 10ℓ의 에틸 아세테이트로 용출하였다. 활성 분획을 수집하고 증발 건조시켜서 분말을 얻었으며, 이 분말을 실리카 겔과 혼합하였다. 혼합물을 실리카 겔(1ℓ)를 사용하여 컬럼 크로마토그래피하였다. 컬럼을 3ℓ의 클로로프름, 이어서 3ℓ의 클로로르름-메탄올로 전개시킨 후, 3ℓ의 클로로프름-메탄올(75:1)로 용출하였다. 용출액을 증발 건조시켜서 분말(16.4g)을 얻었으며, 이 분말을 30mℓ의 역상 실리카 겔 ODS와 혼합하였다. 혼합물을 ODS컬럼 처리하고 2.4ℓ의 메탄올-물(1:1)로 전개시켰다. 컬럼을 메탄올-물(3:2)로 용출하였다. 활성 분획을 수집하고 감압농축하여 WF 2015 B(305mg)을 수득했다.

Claims (4)

1. 하기의 특성을 가지는 WF 2015 A 및 WF 2015 B화합물 :
(1) WF 2015 A :
a) 분자량 : 410[FAB-MS : m/z 411(M+H)]
b) 원소분석 : C 64.55 ; H 8.06 ; O 27.39(차이에 의해)
c) 광학 회전도 : [α]D 23=-52℃(C=1.0, CH3OH)
d) UV흡수 스펙트럼 : 말단 흡수(CHCl3에서)
e) IR흡수 스펙트럼 :
Figure kpo00007
: 3450, 2960, 2920, 1710, 1650, 1440, 1370, 1300, 1260, 1200, 1170, 1120, 1100, 1070, 1050, 1000, 980, 920, 880, 830cm-1
f)1H NMR 흡수 스펙트럼 : (CDCl3)
δ : 6.95 (1H, dd, J=15.5 및 4.5Hz), 6.20 (1H,dd, J=15.5 및 2Hz), 5.70 (1H, 넓은 s), 5.20 (1H, 넓은 t, J=7Hz), 4.31 (1H, m), 3.90 (1H, m), 3.68 (1H,dd,J=11 및 3Hz), 3.44 (3H,s), 2.98 (1H,d,J=4.2Hz), 2.62 (1H,dd,J=6.5 및 6Hz), 2.56 (1H,d,J=4.2Hz), 2.36 (1H,m), 2.16 (1H,m), 2.10 (1H,m), 2.00 (1H,m), 1.98 (1H,d,J=11Hz), 1.87 (1H,m), 1.74 (3H,d,J=1Hz), 1.66 (3H,d,J=1Hz), 1.21 (3H,s), 1.14 (3H,d,J=6,5Hz), 1.07 (1H,m)
g)13C NMR 흡수 스펙트럼 : (CDCl3)
δ : 165.8 (s), 146.6 (d), 135.0 (s), 121.8 (d), 118.3 (d), 79.4 (4), 74.5 (d), 69.9 (d), 66,3 (d), 61.1 (d), 59.4 (s), 58.9 (s), 56.7 (q), 50.7 (t), 48.2 (d), 29.2 (t), 27.2 (t)
h) 용해도 : 가용성 : 클로로포름, 메탄올, 아세톤, 에탄올
불용성 : n-헥산, 물
i) 칼라 반응 : 양성 : 요오드 증기와의 반응
음성 : 닌히드린 반응, 몰리쉬 반응, 염화 제2철 반응,
j) 기질의 특성 : 중성 기질
(2) WF 2015 B :
a) 분자량 : 447[FAB-MS : m/z 469(M+Na)]
b) 원소 분석 : C 58.03 ; H 7.94 ; Cl 7.31 ; O 26.72(차이에 의해)
c) 광학 회전도 : [α]D 23=-248℃(C=2.0, CHCl3)
d) UV 흡수 스펙트럼 : 말단 흡수(CHCl3)
e) IR흡수 스펙트럼 :
Figure kpo00008
: 3570, 3400, 2960, 2940, 2870, 2820, 1710, 1660, 1560, 1460, 1440, 1400, 1380, 1360, 1340, 1300, 1270, 1220, 1170, 1120, 1080, 1020, 980, 960, 940, 910cm-1
f)1H NMR(400 MHz, CDCl3)
δ : 6.99(1H, dd, J=5 및 15.5Hz), 6.20(1H, dd, J=2 및 15.5Hz), 5.55(1H, m), 5.18(1H, m), 4.36(1H, m), 3.98(1H, dq, J=4 및 6Hz), 3.87(1H, d, J=11Hz), 3.49(1H, d, J=11Hz), 3.31(1H, m), 3.30(3H, s), 2.97(1H, t, J=6.5Hz), 2.50-2.40(2H, m), 2.17(1H, m), 2.05(1H, m), 1.90-1.75(2H, m), 1.73(3H, s), 1.66(3H, s), 1.49(3H, s), 1.40(1H, 넓은 d, J=14Hz), 1.20(3H, d, J=6Hz)
g)13C NMR (100 MHz, CDCl3)
δ : 165.7 (s), 146.3 (d), 134.8 (s), 122.4 (d), 118.2 (d), 78.7 (d), 76.2 (s), 74.5 (d), 70.0 (d), 66.1 (d), 64.0 (s), 62.3 (d), 56.7 (d), 50.5 (t), 43.3 (d), 29.1 (t), 27.5 (t), 25.8 (q), 23.5 (t), 22.2 (q), 17.9 (q), 17.6 (q)
h) 용해도 : 가용성 : 클로로포름, 메탄올, 아세톤, 에탄올
불용성 : n-핵산, 물
i) 칼라 반응 : 양성 : 요오드 증기와의 반응
음성 : 닌히드린 반응, 몰리쉬 반응, 염화 제2철 반응,
j) 기질의 특성 : 중성 기질
영양 배지중에서 스콜레코바시듐(Scolecobasidium)속에 속하는 WF 2015 A 및/또는 B-생산 숙주를 배양하는 단계 및 수득한 배양 액체배지로 부터 WF 2015 A 및 B를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항의 WF 2015 A 및 B 화합물을 제조하는 방법.
유효성분으로서 제1항의 WF 2015 A 또는 B와 악학적 허용 담체를 포함하는 항종양 활성을 지닌 약학 조성물.
스콜레코바시듐 아레나륨(Scolecobasidium arenarium)F-2015 미생물.
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