KR830002817B1

KR830002817B1 - 생물학적으로 활성인 fr-900156물질의 제조방법

Info

Publication number: KR830002817B1
Application number: KR1019790003985A
Authority: KR
Inventors: 요시오 구로다; 에이고 이구찌; 마사노부 고오사까; 하쯔오 아오끼; 히로시 이마나까
Original assignee: 후지사와 유우 기찌로오; 후지시와 야구힝 고오교오 가부시기가이샤
Priority date: 1979-11-14
Filing date: 1979-11-14
Publication date: 1983-12-26
Also published as: KR830001373A

Abstract

내용 없음.

Description

생물학적으로 활성인 FR-900156물질의 제조방법

첨부된 도면은 본 발명 FR-900156물질의 핵자기공명 스펙트럼임.

본 발명은 생물학적으로 활성인 FR-900156물질 또는 그염의 제조방법에 관한 것이다.

특히 면역성과 세망내피조직계의 활성을 높히고 따라서 동물 및 사람의 세균에 의한 감염증과 암치료에 유용한 신규 FR-900156물질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 세균 특히 그람양성 박테리아와 그람음성 박테리아와 그람음성 박테리아 및 곰팡이에 의한 감염증 및 동물과 사람에 있어서 암치료하는데 유용한 FR-900156물질을 스트렙토마이세스 속에 속하는 FR-900156물질 생성균주를 영양배지에서 발효시켜서 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 FR-900156물질은 스트렙토마이세스 올리바세오그리셔스, 스트렙토마이세스 속에 속하는 FR-900156물질 생성균주를 영양 배지에서 발효시켜 제조할 수 있다.

FR-900156물질을 제조하는데 사용할 수 있는 미생물질은 스트렙토마이세스속에 속하는 균주인데, 스트렙토마이세스 올리바세오그리셔스와 스트렙토마이세스 바이오레셔스의 균주중에서 최근에 토양시료로부터 스트렙토마이세스에 속하는 FR-900156물질 생성균주의 적당한 균주를 단리하였다.

FR-900156물질을 생성하기 위하여 본 발명은 상기한 특정 미생물만을 사용하는 것은 물론 아니다. 즉 본 발명은 FR-900156물질을 생성할 수 있는 여러 가지 돌연변이체, 즉 생물의 자연돌이변이 과정에 의해 생성된 천연돌연변이와 X-레이, 자외선, 니트로겐 머스타드오일 등의 공지된 방법에 의한 인공 돌연변이체도 사용할 수 있는 것이다.

I. 스트렙토마이세스 올리바세오그리셔스 nov. sp. C-353에 관하여 :

스트렙토마이세스 올리바세오그리셔스 C-353을 일본 고치현에서 수집한 토양시료에서 단리하고 이를 ATCC 31427호로 미국의 ATCC에 기탁하였다.

스트렙토마이세스 올리바세오그리셔스 nov. sp. C-353(ATCC-31427)은 다음의 형태학적. 배양, 생리학적 특성을 갖는다.

(1) 형태학적 특성 : 자당-질산염한천, 글리세린-아스파라긴 한천, 이스트-맥아추출물한천, 오트밀한천, 전분-무기염한천 및 베네트한천에서 10-14일 성숙시킨 배양체를 현미경으로 관찰하였다.

1. 포자 형성균자의 분지형태 :

단축분지

2. 포자형성 균자의 모양 :

레티나큐리아퍼티(폐쇄나선형, 환)

3. 포자의 수 :

5-20포자

4. 포자의 표면형태와 크기 :

유연

0.6-1.2×10-1.9미크론

5. 유주 자의 존재

무

6. 포자낭의 존재

무

7. 포자의 형성 :

기상균사체

8. 기질균사체의 무사분열 :

무

(2) 배양특성 :

30℃에서 10-14일간 각종 배지에서 성숙시킨 사면배양체를 다음처럼 관찰하였다.

(3) 생물학적 및 생리학적 특성 :

1. 온도(베네트 경사한천배지)

15-40℃에서 성장, 최적 28℃

2. 전분의 가수분해(전분-무기염한천)

약간 가수분해됨

3. 젤라틴의 액화(글루코스-펩톤 젤라틴천자배양에서)

음성

4. 우유에서의 활성

응집없음

펩톤화반응없음

5. 멜라닌의 생성(티로신한천, 펩톤-이스트철 한천배지와 트립톤-이스트 육즙에서)

양성

6. 각종 탄소화합물의 이용(프리담-고티렙기저 한천배지)

L-아리바노즈 -

D-크실로즈 ±

D-글루코즈 +

D-프럭토즈 +

D-가락토즈 +

자당 +

글리세린 +

이스시톨 +

락토오즈 +

L-람노즈 -

말토오즈 +

라피노오즈 -

D-만니톨 +

D-만노오즈 +

실리신 -

기호 : +, 훌륭한 유용성, ±, 의심스러움 -, 유용성 없음

7. 세포벽 패턴 I(LL-디아미노피멜산)문헌에 기록된 바, 즉 "확장세균학의 버기편람"8판(1975)와 이비. 셔림과 디. 고티렙 저 "극제스트렙토마이세스 계획 보고서"계통 세균학의 국제지 18권 16페이지와 279(1968), 19권 페이지 391(1969) 22와 22권 페이지 265(1972)에 기록된 상기한 특성을 갖는 군주를 검토하여 보면 스트렙토마이세스 유리터머스와 스트렙토마이세스 갤버스(오가미)는 균주 ATCC31427과 유사한 특성을 갖는 종류로 판별되었다.

그러나 군주 ATCC 31427은 다음과 같이 상기 미생물과 다르다.

스트렙토마이세스 유리터머스(오가미) :

이 종류의 균주는 아라비노즈를 흡수하며 이노시틀은 흡수하지 않는다. 이 균주에 의한 람노즈와 라피노즈의 흡수는 불분명하다. 루프는 형성되지 않는다. 직선 또는 굴곡성 균사체가 때때로 검출된다.

스트렙토마이세스 갤버스 :

개-나선형이 보통 형성된다. 이 종류의 균주는 가용성 황색-황녹색 색소를 생성하며 자당을 흡수하지 않는다.

상기 관찰로부터, 균주 ATCC 31427은 스트렙토마이세스 속에 속하는 새로운 종자라는 것을 인지할 수 있으며 이를 스트렙토마이세스올리바세오 그리세스 nov. sp. C-353으로 칭한다.

II. 스트렙토마이세스 바이오레셔스 제6724호에 관하여 :

스트렙토마이세스 바이오레셔스 제6724호를 일본 오끼나와현 이시가끼섬에서 수집한 토앙시료로부터 단리하고 번호 ATCC 31481호로 미국 ATCC에 기탁하였다.

스트렙토마이세스 바이오레셔스 제6724호는 다음과 같은 형태학적, 배양 및 생리학적 특성을 갖는다.

(1) 형태학적 특성

자당-질산염 한천, 글리세린-아스파라긴 한천, 전분-무기염한천, 이스트-맥아추출한천과 오트밀 한천에서 30℃ 때 10-14일간 배양시킨 배양체를 현미경 관찰하였다.

1. 포자형성균사의 분지형태 :

단축분지

2. 포자형성균사의 모양 :

나선형

3. 포자의 수 :

10-15

4. 포자의 표면 형태와 크기 :

가시투성이

0.3-0.7×0.6-1.1미크론

5. 유주자의 존재 :

무

6. 포자의 형성 :

무

7. 기질균사체의 무사분열 :

무

(2) 배양특성

30℃에서 10-14일간 각종 배지중에서 배양시킨 배양체에서 다음을 관찰하였다.

대응하는 균사체 색소는 0.05N NaOH를 가하여 적색에서 보라색으로 변하거나 0.05N HCl을 가하여 보라색에서 적색으로 변하는 pH지시약이다. 가용성 색소 역시 pH에 민감하여 대응하는 균사체색소에 나타난 것과 동일한 변화를 보여준다.

(3) 생물학적 및 생리학적 특성

1. 온도(베넷트 사면한천배지)

15-40℃에서 성장(최적 28℃)

2. 젤라틴의 액화(글루코스-펩톤 젤라틴 천자배지에서)

음성

3. 전분의 가부분해(전분-무기염 한천에서)

양성

4. 우유에서 활성

응고, 펩톤화없음

5. 멜라노이드 색소의 생성(티로신 한천, 펩톤-이스트철 한천과 트립톤-이스트추출육즙)

양성

매우 약하거나 티로신한천에서 무

6. 각종 탄소화합물의 용도

(프리담-고티렙기저 한천배지)

L-아라비노오즈 +

D-크실로오즈 +

L-람노오즈 +

D-글루코오즈 +

D-프럭토오즈 +

D-만노오즈 +

D-갈락토오즈 +

자당 +

락토오즈 +

라피놉스 +

이눌린 ±

셀룰로오즈 -

치틴 -

글리세린 +

D-만니톨 +

살리신 +

이노시틀 +

Na-초산염 -

Na-구연산염 +

Na-숙신산염 +

기호 : +훌륭한 유용성

±의심스러운

-유용성 없음

본 발명의 FR-900156물질의 스트렙토마이세스속(예, 스트렙토마이세스 올리바세오그리셔스 nov. sp. C-353과 스트렙토마이세스바이오레셔스 등)에 속하는 FR-900156물질 생성균주가 호기성 상태하의 동화될 수 있는 탄소와 질소 공급원함유 영양배지(예, 교반배양, 침액배양)에서 배양시켰을 때 생성된다.

영양배지중탄소의 우수한 공급원은 글루코오즈, 프럭토오즈, 글리세린, 전분 등과 같은 탄화수소이다.

그외에 락토오즈, 아라비노오즈, 크실로오즈, 덱스트린, 당밀 등이 있다.

질소의 우수한 공급원은 이스트 추출물, 펩톤, 글루우텐, 면실, 대두, 옥수수액, 건조이스트, 밀과 암모늄 염(예, 질산암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄), 요소, 아미노산과 같은 유기 및 무기질소화합물 등이다.

유리하게 혼합되어 사용되지만 질소와 탄소공급원은 성장요인이 되는 물질과 상당한 양의 무기질을 함유하는 덜 순수한 배지가 사용하기에 적합하므로 순수한 형태로 사용할 필요는 없다. 바람직할 경우 탄산칼슘, 인산나트륨이나 칼륨, 염화나트륨이나 칼륨, 마스네슘염, 구리염과 같은 무기염을 가할 수 있다. 필요할 경우 특히 배지액체파라핀, 지방유, 식물유, 광물유나 실리콘과 같은 비기포제가 발포할 때 첨가될 수 있다.

대량생산에 있어서, 기타 항생제의 생성에 사용된 우수한 방법의 경우의 호기성 배양조건이 FR-900156물질을 생성하는데 우수하다. 소량 생성에 있어 플로스크나 병에서 교반이나 표면배양법을 사용한다. 배양이 커다란 탱크 안에서 이루어질 때, FR-900156물질의 배양도중에 성장지연을 방지하기 위하여 배양탱크내에 영양생식 형태의 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 비교적 소량의 배양균주나 포자를 접종하여 접종물을 우선 배양하고, 이를 큰 탱크에 이송하는 것이 바람직하다. 영양균주가 생성된 배지는 실제로 FR-900156물질을 생성하는데 유용한 배지와 동일유사하다.

배양혼합물을 각종 방법으로 교반 및 통기할 수 있다. 교반은 프로펠러나 유사기계 교반장치로 발효기를 휘젖거나 흔들으므로, 각종 펌프장치나 불활성기체를 배지에 통과시키므로 실시할 수 있다. 통기는 발효혼합물을 불활성기체를 통과시키므로 실시할 수 있다.

발효는 20-40℃ 때 바람직하게는 30℃의 온도에서 50-100시간 동안에 걸쳐 실시한다.

FR-900156물질은 기타 공지된 항생제 회수에 주로 사용된 공지된 방법에 의하여 배양물로부터 회수할 수 있다.

일반적으로, 생성된 대부분의 FR-900156물질은 배양된 육즙내에서 발견되며, 따라서 FR-900156물질을 배양된 육즙을 원심분리하여 여과하거나, 감압농축, 동결건조, pH조절, 수지처리(예, 양이온이나 음이온 교환수지, 비이온성 흡착수지 등), 흡수제로 처리(예, 활성탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로오즈, 알루미나 등)결정화, 재결정화와 같은 공지된 방법에 의해 여과물로부터 분리할 수 있다.

배양육즙에서 생성된 FR-900156물질은 유리형태, 즉 FR-900156물질로 단리시킬 수 있고 용액이나 FR-900156물질 함유농축물이 염기, 즉 알칼리금속 화합물(예, 수산화나트륨, 탄산나트륨, 이탄산나트륨, 수산화칼륨), 알칼리토금속 화합물(예, 수산화칼륨, 수산화마그네슘 등), 암모니아와 같은 무기염기와 유기염기(예, 에탄올아민, 트리아민, 디시클크로헥실아민 등) 에탄올아민, 트리에틸아민, 디시클로헥실아민 등과 산, 즉 무기산(예, 염산, 황산, 인산)이나 유기산(예, 포름산, 초산, P-톨루엔설폰산, 구연산, 타르트르산)과 반응도중 예컨데, 추출, 단리, 정제반응도중에 처리하면 FR-900156물질은 상응하는 염 형태로 이송되며 단리될 수 있다. 한편 생성된 FR-900156물질의 염은 유리형태, 즉 FR-900156물질로 공지된 방법으로 전화될 수 있다.

더욱 유리형태로 수득된 FR-900156물질은 공지된 방법에 의해 상기 산이나 염기에 의해 상응하는 염으로 전화될 수 있다.

FR-900156물질은 다음의 물리적 및 화학적 특성을 갖는다. (다음 자료는 발효(3)의 실시예에 의해 수득된, 생성물의 결과이다) :

1) 형태 및 색

백색분말

2) 물질의 성질

양(兩)성

3) 색반응

양(陽)성 : 닌히드린, 과망간산 칼륨염 및 황산과 반응

음성 : 드라겐도르프 반응과 에리히반응

4) 용해성 :

용해 : 물

부분용해 : 메탄올

불용해 : 에탄올, 아세톤, 초산에틸, 벤젠, 헥산, 클로로포름

5) 융점 :

143-148(분해)

6) 비열회전

[a]²⁵ _p=27.1(C=물에서 0.4)

7) 자외선 흡수 스펙트럼

끝흡수

8) 적외선흡수 스펙트럼(KBγ)

1050, 1130, 1235, 1340, 1400, 1450, 1535, 1660, 1735, 2950, 2980, 3080, 3350

9) 원소분석

정성분석결과 FR-900156물질은 다음 원소를 갖는다.

탄소, 수소, 질소와 산소

10) 박층 크로마토 그라피

주) 1 : 상품명, 이스트만 코닥사제조

2 : 상품명, 메르크앤드 컴페니제조

11) 분자량

질량분석(필드 탈착법) M=519(기본피크 : M+1=520)

12) 핵자기 공명 흡수 스펙트럼

첨부된 도면에 나타남

(용매 : D₂O 참조 : TMSP)

13) 아미노산 분석

글리신 1.00몰비

글루타민산 1.06몰비

알라닌 1.04몰비

α,ε-디아미노피

멜린산 1.03

(몰비는 글리신을 1.00으로 하여 정함)

14) 분자구조식 :

C₂₀H₃₅N₅O₁₁

더욱 정제된 FR-900156물질의 시료(즉 발효(4)의 실시예에서 수득된 생성물)의 물리적 및 화학적 특성을 측정한 바 시료의 융점은 147-153℃(분해)이었고 다른 특성은 상기와 동일하다.

상기 물리화학적 특성을 분석하고 화학적 구조를 연구한 결과 FR-900156물질의 화학구조는 다음과 같다고 추론할 수 있다.

(D-락틸-L-알라닐-D-글루타밀(L)-메조 디아미노피메릴(L)-글리신)

본 발명의 FR-900156물질은 면역반응(세포면역과 체내항체생성을 고무시킴)과 세망내피조직계의 활성을 높이고 탄소의 혈류의 활성, 유사분열활성, 간섭인자의 활성을 유도하고 질병치료 및 항암성을 효율적으로 나타내는 것으로 밝혀졌다.

따라서 FR-900156물질은 세균 특히 그람-음성 박테리아와 그람-양성 박테리아와 곰팡이에 의한 질병의 치료와 동물의 암치료에 유용하다.

FR-900156물질의 약학적 유용성을 입증하기 위하여 다음의 약리학적 실험 데이타를 제공한다.

1. 세포면역성과 액성항체생성의 증가

기니아 픽(5마리단위)을 양 후측 다리에 500μg의 오발부민 함유 0.1ml FIA(프로드의 불완전 좌약)유제를 가하였다. 어떤 그룹에는 FIA만으로 항원을 받았으며 다른 그룹은 FIA에서 FR-900156물질로 항원을 받았다. 동물을 14일에 피부실험하고 16일에 방혈하였다.

그 결과를 표 1에 적었다.

[표 1]

주 :^*1 : 피부실험을 0.1ml의 염수에 용해된 5μg의 항원을 피부주사에 의하여 등에서부터 실시하였다. 실험부위의 피부반응을 48시간후에 측정하였다.

^*2 : 항체측정은 다음과 같이 실시하였다.

오발부민 피복시트 적혈세포를 염화크롬으로 제조하였다. 항체역가를 혈구응집 및 용혈소 역치(역値)를 일으키는 혈청의 최대희석치의 역수로 표현한다.

^*3 : 중요도를 학생 t-실험으로 계산하였다.

P＜0.05

2. 쥐 비장세포의 유사분열성

(물질과 방법)

(1) 동물 :

본 실험은 숫컷 BALB/C 13주된 것(실험 1)암놈 BALB/C 9주(실험 2)된 종의 쥐로 행하였다.

(2) 조직배양배지 :

사용된 조직배양배지는 로즈웰파크 메모리알 인스티튜드(RPML)-1640의 배지이다.

사용된 배지는 페니실린 G을 100단위/ml로 함유하고 스트렙토마이신 황산염을 100μg/ml 10% 송아지 혈청을 지녔다.

(3) 세포제조 :

비장을 불활성 상태에서 제거하고 헨크용액으로 세척하고 세포배양배지에서 절단하였다.

세포를 조직 배양배지에서 현탁하여 8×10⁶세포 /ml을 포함한다.

(4) 배양조건 :

마이크로테스트 II 조직 배양판의 각 구멍(8×12구멍)(제조 : 팔콘플라스틱사)속으로 0.1ml의 상기 세포 현탁액과 0.1ml의 하기 기술하는 실험화합물의 농축물을 붓고 농축물을 48시간동안 가습기(95%대기 5% CO₂)하에 37℃에서 배양하였다. 콘트롤용은 실험 화합물 함유배지 대신에 0.1ml의 일반배양배지를 지녔다.

(5) [3H]티미딘 흡수 :

전 실험에서, 20μl의(0-마이크로-큐린(μCi)/ml의 트리시에이트화된 티미딘(3H-티미딘)을 24시간의 배양도중에 각 구멍에 가하였다.

배양을 끝낸후, 생성된 세포를 여과지 위트만 GF83으로 여과한 후 염수로 그리고 5% 트리염화초산으로 세척하였다. 여과지를 건조하고 섬광기(0.1g의 P-비스(5-페닐옥사조릴)벤젠과 4g의 2.5-디페닐옥사조릴함유톨루엔 1l)에 놓고, DNA로 혼입된 3H-티미딘을 측정하였다.

(6) 자극지표 :

(7) 실험화합물

FR-900156물질

(결과)

[표 2]

3. 생쥐에 있어서 실험적 감염의 보호 효율

쥐에 있어 실험적 감염에 대한 보호 효율을 측정하기 위하여 FR-900156물질을 용해하고 불활성물로 희석하여 실험용 3-폴드 농도 약제를 제조하였다. 6주된 평균 24-26g의 숫놈 DDY-종쥐를 4마리 그룹으로 사용하였다. 디프코 배양 육즙에서 대장균의 배양물을 깨끗한 배지에서 1/100으로 희석하고 교반하며 30℃에서 배양하였다. 세포 밀도가 1×10⁸/ml가 될때 0.2ml의 배양물을 간헐적으로 주입한다. 장염발생후 처치를 받지않은 쥐는 감염 48시간 내에 죽었다. FR-900156물질 용액 1/5ml를 감염 1,4,5와 6일전에 피하 주사하였다.

감염 2일 후에 실험을 완결하고 생존 비율을 측정하였다. 실험결과를 표 3에 보여준다.

[표 3]

4. 항암성

6주된 돈루종의 암놈쥐를 각 3마리 단위로 사용하였다. 0.5ml의 행크 용액에서 복수중 간암 AH 66의 현탁액을 복강내에 이식하였다.

(5×10⁴세포/쥐)약 13일후에 모든 대조동물은 복수중으로 죽었다. 대조동물과 비교하여 생존시간의 길이가 효율의 기준이다.

종양이식 5,6,7,9일전에 치료를 하였다.

FR-900156 물질을 용해하고 불활성물로 희석하여 실험용 3겹 희석물을 생성하고 상기 FR-900156 물질의 불활성 염수 용액을 복강내에 주입하였다.

실험 결과를 표 4에 도시하였다.

[표 4]

5. 탄소의 혈류청정

시약 :

1. 탄소 현탁액, 로트링 도화잉크(170mg 탄소/ml)를 1% 젤라틴 함유 염수로 원액의 1/5로 희석하였다.

2. 0.1% 탄산나트륨 수용액

반응 :

쥐(DDY 쥐 5-6W)를 0.01ml/g 체중의 탄소량으로 꼬리 정맥내에 주입하였다.

피시료를 50μl를 취하게 눈금이 새겨진 모관 피펫으로 취하였다. 이것을 눈의 비각으로 역 궤도 정맥동내에 주입하였다.

시료를 3과 6분에 제거하였다. 피에 즉시 3.0ml의 탄산나트륨 수용액을 가하였다. 이는 피를 용혈시키고 탄소를 허용한다. 시료를 660mm에서 분광 광도계를 사용하여 측정하고 로그 농도는 전술한 표준 곡선으로 부터 얻어진다. 청정가 K는 다음 관계식에 따라 시간에 로그 탄소농도를 투사하여 결정된다.

상기에서 T₁과 T₂는 시료가 도출되었을 때의 시간(분)을 나타내고 C₁과 C₂는 각각 시간 T₁과 T₂에서 피중의 탄소농도를 나타낸다.

탄소청정에 대한 FR-900156물질 효과의 실험

주어진 약의 수용액을 쥐에 피하투여 하였다.

24시간후의 탄소의 혈류 청정을 측정하였다.

치료된 쥐에서의 K가를 대조 우위의 값과 비교하였다.

실험결과를 표 5에 도시하였다.

[표 5]

6. 간섭인자의 유도활성

본 실험에 4-6주된 숫놈 ICR 종쥐를 사용하였다. 이들 쥐의 비장을 제거하고 FR-900156물질을 처리하므로 간섭인자를 생성하기 위한 비장세포의 용량을 측정하였다.

단일 비장세포 현탁액을 스트렙토 마이신(100γ/ml) 페니실린 G (100γ/ml) 1% 글루타민과 2-메르갚토에타놀(5×10^-5M)이 부가된 RPMI-1640 배지내에서 제조하였다.

이를 배양배지(투여 : 100,10,1 μg/ml)과 용해된 FR-900156 물질의 존재 또는 부재하여 4×10⁷세포/ml의 농도때 37℃에서 배양하였다. 24시간후에 이들 배양물의 상징액을 수집하고 간섭인자 활성을 L-세포-VSV시스템에서 세포병리 효과(CPE)억제 실험으로 적정하였다. 항 비루스성 역가를 표준 간섭인자에 대해 1μ/ml로 표시하였다.

실험 결과를 표 6에 기술하였다.

[표 6]

7. 쥐에 있어 급독성

1g/kg(i.v.) : 독성없음

8. 세포독성(쥐 L세포)

500μg/ml : 무독성 효과

치료투여를 위하여 본 발명의 FR-900156물질을 여타 공지된 방법, 예컨데, 비독성 약학적으로 알맞는 담체와 본 발명의 활성물질을 혼합하는 약학적 조성물의 형태로 조제할 수 있다.

FR-900156물질의 약학적으로 알맞는 염은 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 암모늄 염, 에탄올아민 염, 트리에틸아민 염, 디시클로헥실아민염 등과 같은 무기나 유기염기 및 포름산염, 초산염, P-톨루엔 설론산염, 구연산염, 타르트르산염, 염산염, 황산염, 인산염과 같은 유기나 무기산과의 산부가염을 포함한다.

본 발명의 약학적인 조성물은 약학적 조제물 형태 예컨데 고체, 반고체, 액체 형태로 본 발명의 활성물질을 외부, 비경구에 적합한 유기나 무기매체가 부형제와 혼합되어 사용될 수 있다. 활성성분은 예컨데 비독성, 정제, 입제, 캅셀, 좌약, 용액, 유탁액, 현탁액 및 기타 적당한 형태와 결합되어 사용된다. 사용될 수 있는 매체는 물, 글루코스, 락토오즈, 이카시아고무, 젤라틴, 만니톨, 전분호정, 마그네슘 트리실리케이트, 활석, 옥수수전분, 케라틴, 콜로이드성실리카, 감지전분, 요소와 기타고체, 반고체 액체 형태로 보조제, 안정제, 착색제, 향료를 첨가시킬 수 있는 적합한 담체 등이다. 약학적 조성물은 활성에 안전하게 조제물중의 활성성분을 유지하기 위하여 보존제나 제균제를 포함하기도 한다. 활성목적 생성물은 질병진행 동태에 따라 충분한 치료효과가 나타나도록 약학적으로 조성된다.

본 조성물을 사람에게 가함에 있어, 정맥내, 근육내 또는 경구 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명 목적 화합물의 치료유효량이 각 개인의 연령 상태에 따라 변하지만 생물체에 kg당 2-100mg의 활성성분을 매일 투여하는 것이 일반적이며 평균 1회 투여량은 보통 50, 100, 250, 500mg이다.

하기 실시예를 본 발명을 예증하기 위하여 실시하였다.

실시예 : 발효

(1) 영양에서 1(pH 7.0)을 다음 성분으로부터 제조하였다.

영양배지 1

가용성전분 2중량%

글루텐 밀 1중량%

건조이스트 1중량%

옥수수 스티프액 1중량%

수도물

각 10개의 500ml에 100ml의 배지 1을 공지된 방법으로 불활성화하고 스트렙트마이세시 올리바세오 그리셔스 ATCC 31427의 경사 군체의 환영 배양물을 접종하였다. 세균을 교반기에서 48시간 동안 30℃때 배지내에서 성장시켰다.

20리터의 항아리 발효기내에 다음 성분으로부터 제조된 20리터의 성장성배지 2를 넣었다.

영양배지 2

가용성 전분 2중량 %

면실 밀 0.5중량 %

글루텐 밀 0.5중량 %

건조이스트 0.5중량 %

옥수스 스티프액 0.5중량 %

수도물

영양배지 2(pH 7.0)을 공지된 방법으로 불활성화하고 상기 제조된 영양균주 접종 배양물 전량을 무균접종하였다. 세균을 24시간동안 30℃때 배지 2에서 성장시켰다.

이렇게 생성된 영양 균주배양물 전량을 다음 성분으로부터 제조된 1600리터의 발효배지 함유 2000리터 발효기내에 무균 접종하였다.

발효배지

가용성전분 2중량 %

면실 밀 0.5중량%

밀 배아 0.5중량%

건조 이스트 0.25중량%

옥수수 스티프액 0.25중량%

KH₂PO₄0.5중량%

Na₂HPO₄·12H₂O 0.5중량%

COCl₂·6H₂O 1,25 mg/l

수도물 q.s.

세균을 30℃때 72시간동안 발효 배지중에서 배양하였다. 성장 기간도중 육즙을 170γpm으로 작동하는 프로펠러로 교반하고 불활성 기체를 분당 1600리터의 속도로 육즙을 통과시켰다.

발효를 완료한후 20kg의 "라디오리트"(상품명 일본 쇼와 화학사제 여과 보조물질)를 배양 육즙에 가하고 혼합물을 여과하여 균사체를 제거하였다. 1600리터의 여과물을 활성탄기등을 통과시킨후 1600리터의 물로 세척하였다. 3000리터의 50%아세톤 수용액으로 용출한후 용출물을 600리터로 농축시켰다.

농축물을 인산염 완충액(pH 6.0)으로 완충된 DEAE-세파덱스(상품명, 파마샤 에이비 제조)(200리터)칼럼을 통과시켰다. 칼럼을 계속하여 200리터의 물과 200리터 0.1M염 수용액으로 세척한 후 400리터의 0.3M염 수용액으로 용출하였다. 수용성용출제를 활성탄의 기둥(200리터)를 통과시키고 200리터의 물로세척한 후 400리터의 50%아세톤 수용액으로 용출하였다. 용축물을 농축하고 건조 동결하여 800의 백색분말을 수득하였다. 분말을 25리터의 물에 용해시키고 용액을 CM세파덱스(H⁺형)(25리터)의 칼럼을 통해 통과시켰다. 칼럼을 25리터의 물로 용출하고 용출액을 농축하고 건조 동결하여 33의 황백색 분말을 수득하였다. 분말을 셀룰로오즈의 칼럼(1.2리터)의 상단에 가하였다. 칼럼을 1000ml의 70% 프로판올 수용액으로 세척한 후 1000ml의 60% 프로판을 수용액으로 용출하였다. 용출물을 농축하고 동결 건조하여 4g의 백색분말을 수득하였다. 분말을 150ml의 물에 용해한후 용액을 세파덱스 G-15 (2.8l)형에서 칼럼 크로마토그라피하였다.

칼럼을 현상하고 물로 용출하였다. 활성분률을 수집하고 농축시킨후 동결 건조하여 4g의 백색분말을 수득하였다. 25ml의 물에 용해된 분말과 용액을 CM-세파덱스(H⁺형)(400ml)에서 칼럼 크로마토그라피하였다. 물로 용출하였다. 활성분률을 수집 농축한후 동결건조하여 40mg의 FR-900156 물질을 백색분말의 형태로(순도 : 약 7%)수득하였다.

(2) 발효를 실시예 (I)에서 기술한 방법으로 실시하였다. 발효를 끝낸후, 20kg의 "라디오리트"(상품명, 쇼와 화학사제 여과 보조물질)를 배양육즙에 가하고 혼합물을 여과하여 균사체를 제거하였다. 1600리터의 여과물을 활성탄의 칼럼(800리터)을 통과시킨후 1600리터의 물로 세척하였다. 3000리터의 50% 아세톤 수용액으로 용출한후 용출물을 600리터의 부피를 농축하였다. 농축물을 인산염 완충액(pH 6.0)으로 이미 완충시킨 DEAE-세파덱스(상품명, 파마샤 에이비제조)의 기둥을 통과시켰다. 기둥을 200리터의 물과 200리터의 0.1M 염화나트륨 용액으로 계속 세척하고 400리터의 0.3M 염화나트륨 용액으로 용출하였다. 수용성 용출물을 활성탄의 칼럼(200리터)을 통과시키고 200리터의 물로 세척하고 400리터의 50% 아세톤 수용액으로 용출하였다. 용출물을 농축하고 동결건조하여 800g의 백색분말을 수득하였다. 분말을 25리터의 물로 용해하고 용액을 CM-세파덱스 (H⁺형) (25리터)의 칼럼을 통과시켰다. 칼럼을 25리터의 물로 용출하고 용출물을 건조 동결하여 33g의 황백색 분말을 수득하였다.

분말을 셀룰로오즈 칼럼(1.2리터)의 상단에 놓았다. 칼럼을 1000ml의 70% 프로판올 수용액으로 세척하고 1000ml의 60% 프로판을 수용액으로 용출하였다. 용출물을 농축하고 건조 동결하여 4의 백색분말을 수득하였다. 분말을 300ml의 물로 용해한후 인산염 완충액(pH 6.0)으로 이미 완충시킨 DEAE-세파덱스(상품명, 파마샤 에이비제품)의 칼럼(1.4리터)을 통과시켰다. 칼럼을 1.5리터의 0.1M염화 나트륨용액으로 세척한후 3리터의 0.2M염화 나트륨 용액으로 용출하였다. 활성분률을 수집한후 활성탄의 칼럼(300ml)을 통과시켰다. 칼럼은 물로 세척한 후 800ml의 50% 아세톤 수용액으로 용출하였다. 용출물을 농축하고 동결건조하여 700mg의 백색분말을 수득하였다. 분말을 20ml의 물에 용해한 후 CM-세파덱스(H⁺형)(500ml)의 칼럼을 통과시켰다. 칼럼을 물로 용출하고 활성부분을 수집한후 농축하여 10ml의 농축물을 수득하였다. 농축물을 세파덱스 G 15(500ml)에서 칼럼 크로마토 그라피하고 물로 현탁하였다. 활성부분을 수집하고 농축한후 동결 건조하여 70mg의 백색분말을 수득하였다. 분말을 25ml의 물에 용해하고 셀룰로오즈(이스트만코닥사 제품)상에서 예비적 박막 크로마토 그라피하였다. 현탁용매는 부탄올, 초산과 물(4 : 1 : 2)의 혼합물이다. 50ml의 물로 용출하고 용출물을 농축한후 동결 건조하여 백색분말 형태의 FR-900155 물질 20mg을 수득하였다.

(3) 실시예 (1)에서 기술된 방법으로 발효시켰다.

발효를 끝낸후에 20kg의 "라디오 리트"(상품명, 쇼와 화학사 제조 여과 보조물질)를 배양육즙에 가하고 혼합물을 여과하여 균사체를 제거하였다. 1600리터의 여과물을 활성탄의 칼럼을 통해(800리터) 통과시킨후 1600리터의 물로 세척하였다. 3000리터의 50% 아세톤 수용액으로 용출물을 600리터의 부피로 농축하였다. 농축물을 인산염 완충액으로 이미 완충된 (pH6.0) DEAE-세파텍스(상품명 파마샤 에이비 제조)의 칼럼을 통해 통과시켰다. 칼럼을 200리터의 물과 200리터의 0.1M 염화나트륨 용액으로 계속 세척한 후에 400리터의 0.3M 염화나트륨 용액으로 용출하였다. 용출 수용액을 활성탄(200리터)의 칼럼을 통과시키고 200리터의 물로 세척한후 400리터의 50% 아세톤 수용액으로 용출하였다. 용출물을 농축한 후 동결 건조하여 800mg의 백색분말을 수득하였다. 분말을 25리터의 물에 용해하고 용액을 CM-세파덱스 (H⁺형)의 칼럼을 통과시켰다. 칼럼의 25리터의 물로 용출하고 용출물을 농축한 후 동결 건조하여 33의 황백색 분말을 수득하였다. 분말을 셀룰로오즈 칼럼(1.2리터)의 상단에 놓았다.

칼럼을 1000ml의 70% 프로판올 수용액으로 세척한후 1000ml의 60% 프로판올 수용액으로 용출물을 농축하고 동결 건조하여 4g을 백색분말을 수득하였다. 분말을 300ml의 물에 용해한 후 인산염 완충액(pH6.0)으로 완충된 DEAE-세파덱스(상품명, 파마샤 에이버제조)의 칼럼을 통과시켰다. 칼럼을 1.5리터의 0.1M 염화나트륨 용액으로 세척한 후 300리터의 0.2M 염화 나트륨 용액으로 용출하였다. 활성부분을 수집하고 활성탄의 칼럼을 통과시켰다. 칼럼을 물로 세척한 후 800ml의 50% 아세톤 수용액으로 용출하였다.

용출물을 농축하고 동결건조하여 700mg의 백색분말을 수득하였다. 분말을 20ml의 물에 용해한 후 CM-세파덱스(H⁺형) (500ml)의 칼럼을 통과시켰다. 칼럼을 물로 용출하고 활성부분을 수집한후 농출하여 10ml의 농축물을 얻었다. 농축물을 동결건조하여 400mg의 분말을 수득하였다. 분말을 셀룰로오즈 칼럼(500ml)의 상단에 놓았다. n-부탄올, 초산과 물(5 : 1 : 2)의 혼합물로 용출하였다. 활성부분을 수집하고 동결건조하여 200mg의 분말을 수득하였다. 분말을 7ml의 물로 용해하고 세파덱스 G 15(250ml)상에 놓았다. 활성부분을 수집하고 동결건조하여 백색분말 형태의 FR-900156 물질 100mg을 수득하였다.

(4) 실시예(3)에서 수득된 FR-900156의 백색분말을 상기 정제방법을 반복 실시하여 더욱 정제하므로보다 순도가 높은 FR-900156 물질을 수득하였다.

(5) 옥수수전분 2%(중량부), 글루텐 밀 1% 건조이스트 1%와 옥수수 스티프액 1%함유 100ml의 담체 각 10개의 500ml 플라스크에 넣고 공지된 방법으로 불활성화한 후 스트렙토 마이세스 바이오레셔스 ATCC31481의 경사 배양체에서 환형 접종하였다.

세균을 교반하기에서 48시간동안 30°때 배지내에서 배양시켰다.

30리터의 항아리 발효기에 20리터의 상기 배지를 가하였다. 배지를 공지된 방법으로 불활성화하고 상기 제조된 접종 배양물의 전체양으로 무균 접종하였다. 세균을 30시간동안 30℃때 배치체내에서 성숙시켰다.

제조된 접종물의 전부피를 가용성전분 2%(중량부), 글루텐 밀 1%, 면실밀 1%라 황산나트륨 (10수화물)2%함유 320리터의 배지(pH.6.5) 함유하는 400리터의 발효기 내에서 무균접종 하였다.

세균을 72시간동안 30℃의 배지에서 배양하였다. 성장기간 도중 육즙을 170γpm으로 작동하는 프로펠러로 교반하고 불활성 공기는 분당 320리터의 속도로 육즙을 통과시켰다. 발효를 안료한후, 4kg의 "라디오리트"로 제조된 육즙에 가하고 혼합물을 여과하여 균사체를 제거하였다. 300리터의 여과물을 활성탄(150리터)의 기둥을 통과시키고 300리터의 물로 세척하였다. 60리터의 50% 아세톤 수용액으로 용출하고 120ml로 용출물을 농축하였다.

농축물을 인산염 완충액(pH 6.0)으로 이미 완충시킨 DEAE-세파덱스 (30리터)의 칼럼을 통과시켰다. 칼럼을 30미터의 물과 30리터의 0.1M 염화 나트륨으로 계속하여 세척한후 0.3M염화 나트륨으로 용출하였다. 용출물(50리터)을 활성탄의 칼럼(30리터)을 통과시키고 60리터의 50%아세톤 수용액으로 용출하였다. 용출물을 동결 건조하여 120g의 백색분말을 수득하였다. 분말을 4리터의 물에 용해하고 용액을 CM-세파덱스(H^＋형)의 기둥(14리터)을 통과시켰다. 기둥을 물로 용출하고 용출물을 농축하고 동결건조하여 20g의 분말을 수득하였다. 분말을 셀룰로오츠 칼럼 상단에 놓았다. 프로판올 수용액으로 용출하고 활성부분을 수집하고 동결건조하여 5g의 분말을 수득하였다. 분말을 셀룰로우즈 칼럼 상단에 놓았다. 프로판올 수용액으로 용출하고 활성부분을 수집하고 동결건조하여 5g의 분말을 수득하였다. 분말을 셀룰로오즈 칼럼 상단에 놓았다. 프로판올 수용액으로 용출하고 활성부분을 수집하고 동결건조하여 5g의 분말을 수득하였다. 분말을 500ml의 물에 용해하고 용액을 인산염 완충액(pm 6)로 이미 완충시킨 DEAE-세파덱스(1.3리터)의 칼럼을 통과시켰다. 칼럼을 0.1M염화 나트륨으로 세척하고 0.2M염화나트륨으로 용출하였다. 활성부분을 수직하고 활성탄칼럼등(800ml)을 통과시켰다. 칼럼을 물로 세척하고 50% 아세톤 수용액(200ml)으로 용출하였다. 용출물을 농축하고 동결건조하여 1g의 분말을 수득하였다.

분말을 300ml의 물에 용해하고 용액을 CM-세파덱스 (H⁺형) 칼럼(250ml)을 통과시켰다. 칼럼을 현탁하고 물로 용출하였다. 활성부분을 농축한후 동결건조하여 800mg의 분말을 수득하였다. 분말을 20ml의 물에 용해하고 용액을 소량을 셀룰로오즈 혼합하였다. 혼합물을 셀룰로오즈 상에서 컬럼 크로마토 그라피하였다. 칼럼을 100ml의 아세톤과 300ml의 W-부틴올 : 초신, 물(4 : 1 : 1)의 혼합물과 연속 세척한 후 현탁하고 n-부탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 2) 1l의 혼합물로 용출하였다. 활성부분을 수집하고 동결건조하여 30mg의 분말을 수득하였다. 분말을 20ml의 물에 용해하고 용액을 세파덱스 G 15(250ml)칼럼등을 통과시켰다. 칼럼을 현탁하고 물로 용출하고 활성부분을 수집한후 동결건조하여 5mg의 FR-900156 물질을 수득하였다.

실시예 : 제약학 조성물

(1) 주사용 조제

필요한 FR-900156물질의 양은 작은병으로 각 활성성분을 500mg 포함하게 조제된다. 작은병을 박테리아로부터 멀리하기 위하여 밀봉하였다. 언제든지 사용시는 2ml의 주사용 불활성 종류액을 가한후 수용액을 주사 투여한다.

(2) 정제의 제법

정제의 적합한 형성물은 다음과 같다.

FR-900156물질 200mg

만니톨 400mg

전분 50mg

스테아린산 마그네슘 10mg

(3) 캅셀의 제법

FR-900156물질 300mg

스테아린산 마그네슘 15mg

상기한 성분을 혼합한 후 공지된 방법으로 경젤라틴 캅셀에 봉입하였다.

Claims

호기성 조건하에 스트렙토 마이세스속에 속하는 FR-900156생성 균주를 탄소, 질소와 무기염등의 동화될수 있는 영양배지 중에서 배양하는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 FR-900156물질의 제조방법.