KR810001115B1

KR810001115B1 - 항생물질 네오비리도 그리제인류의 제조방법

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Publication number: KR810001115B1
Application number: KR7701313A
Authority: KR
Inventors: 야스시 오꾸무라; 가즈히꼬 오까무라; 야스오 후까가와; 도모유끼 이시꾸라; 가게아끼 고오노; 라인 조세프
Original assignee: 스즈끼 시즈오; 산라꾸오우썬 가부시기 가이샤; 라인 조세프; 팬 래브즈, 인코포레이팃드
Priority date: 1977-06-03
Filing date: 1977-06-03
Publication date: 1981-09-18

Abstract

내용 없음.

Description

항생물질 네오비리도 그리제인류의 제조방법

제1도는 네오비리도 그리제인 Ⅰ의 자외선흡수스펙트럼(메탄올 중 메탄올성 0.1N 가성소오다 중)

제2도는 네오비리도 그리제인 Ⅱ의 자외선흡수스펙트럼(메탄올 중 메탄올성 0.1N 가성소오다 중)

제3도는 네오비리도 그리제인 Ⅲ의 자외선흡수스펙트럼(메탄올 중 메탄올성 0.1N 가성소오다 중)

제4도는 네오비리도 그리제인 Ⅰ의 적외선흡수스펙트럼(KBr정)

제5도는 네오비리도 그리제인 Ⅱ의 적외선흡수스펙트럼(KBr정)

제6도는 네오비리도 그리제인 Ⅲ의 적외선흡수스펙트럼(KBr정)

제7도는 비리도 그리제인의 자외선흡수스펙트럼(메탄올 중 및 0.1N 메탄올성 가성소오다 중)

제8도는 비리도 그리제인의 적외선흡수스펙트럼(KBr정)

본 발명은 새로운 항생물질 네오비리도 그리제인류 및 그들의 제조법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ이라 명명된 펩타이드계 신항생물질 및 그들의 제조법과 그들을 유효성분으로 하는 치료제에 관한 것이다.

본 발명의 항생물질은 특히 그램양성세균류 및 마이코푸라즈마에 대해서 고도의 활성을 갖는다.

소위, 미카마이신(mikamycin-vernamycin)[또는 스트렙토크래민(streptogramin)]과의 항생 물질은 두개의 주된 군(群)으로 분류한다. -은 D.vazquez에 의한 A군(안티비오틱스 Ⅲ 521∼534(springer verlag Berlin Heidelberg New York 1975)의 마크로환상락톤 화합물로서 그리제오비리딘(griseoviridin) 오스트레오 그레이신A(OStreo grycin A=미카마이신 A(=mikamycin A)=버어지니어마이신 M(Virginiamycin M)=스타피로마이신 M(staphylomycin M)=푸리스티나마이신 ⅡA(Pristinamycin ⅡA)=베투나마이신 A(Vernamycin A)=스트렙토 그래민 A(streptogramin A)=시네루기스틴 A-1(synergistin A-1)=화합물 PA-114A/=화합물 E-129 A인자 등], 오스트레오 그레이신 G(Ostreogrycin G)[=버어지니어마이신 MⅡ(Virginiamycin M Ⅱ=스타피로마이신 MⅡ(stapylomycin MⅡ) 푸리스티나마이신 ⅡB(Pristinamycin ⅡB)=디히드로스테레오그레이신 A(dihydro-streogrycin A=화합물 E-129-B인자=화합물 R·P-13920 등) 및 화합물 A-2315 A,B 및 C이다.

이 군의 항생물질은 정균적(靜菌的)이며, 그램양성균 및 마이코프라즈마에 대해서 활성을 갖는다.

본 발명의 발효생산물의 하나인 그리제오비리딘(Griseoviridin)은 스트렙토미세테스(strepmycetes)에 의해서 비리도그리제인(viridogrisein)과 함께 생산되는 것으로 알려져 있다.

그리제오비리덴의 생산은 USP 3,023,204 및 3,174,902에 공지되어 있다. 제2의 군은 D,vazqez에 의해서 B군이라 불리우며, 마크로환상 뎁시펩타이드(depsipeptide)로서 두개의 아군(亞群)(Subgroups), 즉, 비리도 그리제인 아군 및 베르마이신 B(vernamycin B)아군으로 분류된다. 이 군의 항생물질은 타피로콕커스·아우레우스(staphylococcus aureus) 및 바찔루스 서브티리스(Bacillus Subtilis)와 같은 그램양성균의 증식을 억제하는데 효과적이다. 베르나마이신 B 아군은 12의 동족체(homologues)를 포함한다. 이 균의 항생물질명의 발표된 이름의 동의어 관계는 대단히 복잡하며, 이 아군의 모든 화합물명을 모두 든다는 것은 불가능하다. 이 아군중의 대표적인 과학적으로 중요한 화합물은 다음과 같은 것이다.

1. 베루나마이신 B_α=오스트레오 그레인 B=푸리스티나마이신 ⅠA=미카마이신 B=스트렙토그라민 B=시넬기스틴 B-1=화합물 E-129=인자=화합물 PA 114 B₁

2. 베루나마이신 Bγ=오스트레오그레이신 B₁=푸마스티나마이신 ⅠC=화합물 E-129 Z₁인인.

3. 베루나마이신 Bβ=오스트레오그레이신 B₂=푸마스티나마이신 ⅠB=화합물 E-129Z₂=인자=화합물RP-13919.

4. 오스테레오 그레이신 B₃=화물인 E-129Z₃인자.

5. 페트리신 A(Patricin A)

6. 페트리신 B(Patricion B)

7. 베르나마이신 Bδ

8. 베르나마이신 C=도마신(doricin)

9. 버어지니어마이신(스타피토마이신) S

10. 버어지니어마이신(스타피토마이신) S₂

11. 버어지니어마이신(스타피토마이신) S₃

12. 버어지니어마이신(스타피토마이신) S₄(또는 S₁)

이 아군의 화합물은, 같은 4종의 성분 3-히드록시피코린산(hidroxypic Olinic acid), L-스테오닌(L-threonine), L-프로린(L-Proline) 및 L-페닐그리신(L-Phenylglycin)이 관여한 7개의 구성분으로서 구성되어 있다고 하는 공통적인 특징을 갖는다.

반면 비리도 그리제인 아군중에는 유일한 종류인 화합물 비리도 그리제인이 알려져 있을 뿐이며, 비리도그리제인이 에타마이신(etamycin)의 화합물 K-179 및 화합물 F-1370A와 동일화합물이란 것은 이미 확립되어 있다. 상기한 베르나마이신 B 아군에 비교해서, 비리도 그리제인은 8종의 성분 3-히드록시피코린산, L-스테오닌, D-로이신(D-leucine), 4-히드록시-D-프로린(4-hydroxy-D-Proline), 자르코신(Sarcosine), β-N-디메틸-L-로이신(β,N-dimethyl-L-Leucine), L-아라닌(L-alanine) 및 L-페닐자르코신(L-phenylsacorsine)으로 구성되어 있다.

본 발명의 다음의 설명에서 명확한 바와 같이 본 발명의 항생물질인 네오비리도그리제인(neoviridogrisein)은 이 후자의 비리도 그리제인 아군에 속하며, 네오비리도 그리제인류중의 1종 네오비리도 그리제인 Ⅳ는 비리도 그리제인과 동일물이라는 것이 본 발명자에 의해서 밝혀졌다.

비리도 그리제인의 제법에 대해서는 USP 3, 023, 204에 공지되어 있다.

A군과 B군이라고 하는 다른 화합물의 상승효과(Synergism)은 여러가지의 미생물에 있어서 잘 알려져 있으며, 의약의 치료효과를 증강하기 위해 유효성분으로 이 과(科)의 항생물질을 함유한 의약으로도 쓰여지고 있으나, 이 네오비리도 그리제인류에 있어서도 그 사실이 존재한다는 것이 명확해졌다.

본 발명은, 신규성 및 유용성을 갖는 항생물질에 관한 것이다.

더욱 상세하게로는 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ 및 비리도 그리제인이라 불리우는 일군의 뎁시펩타이드 항생물질에 관한 것으로 이 항생물질은 그램양성세균 및 마이코푸라즈마에 대해서 활성을 갖으며, 농도, 조농축(粗濃縮) 또는 순수한 형으로서 그리제오비리딘과 함께 또는 수반하지 않고 사용할 수 있다.

본 발명은 각종의 그램양성세균 및 마이코푸라즈마의 증식을 저지하는 뛰어난 효과를 갖는다. 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ라 불리우는 일군의 신규 항생물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또 본 발명은 스트렙토미세스 SP, P 8648(미생연균기 : (微生硏菌寄) 제3562호) 및 ATCC 31289(Strepotmyces sp. p 8648, FERMP-No, 3562), ATCC 31289라 명명된 스트렙토미세스 속의 신종의 균을 사용 호기(好氣)조건하에서 적당한 수성배지에서 배양시켜서 생생한 네오비리도 그리제인을 그리제오 비리딘과 함께 또는 동반하지 않고 회수하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또, 본 발명은 적당한 아미노산을 첨가하는 것에 의해서, 네오비리도그리제인 Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ중에서 소요되는 종류의 생산량을 선택적으로 증가하는 방법을 개시(開示)하는 것을 목적으로 한다. 즉, 배양전 혹은 배양중에 푸로린 또는 α-아미노-n-낙산을 첨가하는 것에 의해서, 전자는 네오비리도그리제인 Ⅰ및 Ⅱ를, 후자는 네오비리도그리제인 Ⅰ 및 Ⅲ을, 각각 배지(培地)중에 선택적으로 축적시킬 수가 있는 것이다.

본 발명의 기타의 목적은 발명의 상세한 설명의 항에서 명확해진다.

본 발명의 네오비리도그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ(경우에 따라 Ⅳ)는, 그램양성균 및 마이코푸라즈마를 포함한 각종의 병원균에 대해서 고도의 활성을 가지며, 사람 및 가축의 약품으로써 유효하게 사용할 수가 있는 것이다.

다시 상세하게 설명하면 스타피로록커스 아우레우스(Staphyloocccus aureus), 스타피로콕커스 피오게네스(Staphylococcus Pyogenes), 디푸토콕커스 뉴모니에(Diplococcus Pneumoniae), 마이코푸라즈마 갈리셉리컴(Mycoplasma garisepticum), 마이코푸라즈마 퍼멘텐스(Mycoplasma farmentans), 마이코푸라즈마 아가락체에(Mycoplasma agalactiae)등의 그램양성균류 및 마이코푸라즈마에 의해서 일어나는 감염증의 치료약으로서 유효하게 사용할 수가 있는 것이다.

뒤에 후술하는 바와 같이, 본 발명의 방법의 미생물은 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ 및 네오비리도그리제인 Ⅳ(비리도그리제인) 및 네오비리도 그리제인 A(그리제오비리딘)이라 불리우는 복수의 항생물질을 생산한다. 그 중, 네오비리도 그리제인 A는 이미 알려진 항생물질 그리제오비리딘(Griseoviridin)과 동일하다는 것이 확인되었으며, 또 네오비리도 그리제인 B는 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ 및 네오비리도 그리제인 Ⅳ라 불리우는 일군의 펩타이드제 항생물질의 혼합물이며, 이중 네오비리도 그리제인 Ⅳ는 이미 알려진 항생물질 비리도 그리제인(viridogrisein)과 동일 물질인 것이나, 다른 3물질은 새로운 항생물질이라는 것이 밝혀졌다. 아울러, 본 명세서에서는 네오비리도 그리제인류라고 하는 명칭을 네오비리도그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ 및 비리도그리제인의 혼합물 뿐만이 아니고, 이 4자의 중 두개 이상의 혼합물의 이름으로서 사용하고, 또는 이들 4자의 상위개념의 일반명으로써 사용한다.

먼저, 본 발명의 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 및 비리도그리제인 및 그리제오비리딘을 생산하는 균주는 스트렙토마이세스 속에 속하는 방선균의 일종 스트렙토마이세스 SP, P 8648(미공연균기탁수리번호(微工硏菌寄託受理番號 제 3562호) ATCC 31289호(Streptomyces SP. P 8648, FERMP-No, 3562)를 배양하는 것에 의해서 제조할 수가 있는 것이다.

이런 균주는 후꾸이껜 구즈다끼가와 상류, 구즈다끼댐(福井손九龍川上流九龍댐)공의해 최초로 분리되었다.

다음에 본 균주의 균학적 특징을 기슬한다.

본원 사용의 균주는 잘 분지(分枝)한 단순분지의 기생균사(

)에서, 짧은 무색의 기중균사(

)를 신장하고, 그 선단에 느슨한 나선상의 포자연쇄(胞子連鎖)를 형성한다. 그 포자의 표면은 평활한 것이다. 윤생체(輪生體) 및 자낭포자의 형성은 확인되지 않았다. 각종 배지에 있어서의 본 군주의 배양적 특징은 다음과 같은 것이다.

(1) 슈크로우스 초산염 한천배지

생 육 : 약간 생육

기중균사 : 백색의 기중균사를 곳곳에 엷게 형성

기생균사 : 무색∼회백색

가용성색소 : 없음

(2) 그루코오스 아스파라긴 한천배지

생 육 : 양호

기중균사 : 거의 형성치 않고, 형성하면 백색

기생균사 : 담황백색∼밝은 황색(2db∼2fb)

가용성색소 : 없음

(3) 글리세린 아스파라긴 한천배지

생 육 : 중정도

기중균사 : 거의 형성치 않고, 형성하면 백색

기생균사 : 담황색, 회황색(db∼2dc∼3ec)

가용성색소 : 없음

(4) 이스트 맥아 한천배지

생 육 : 양호

기중균사 : 백색∼약간 회색을 띤 백색

기생균사 : 밝은 황색(2fb)이나 배양후기에는 갈회색(3li)으로 된다.

가용성색소 : 없거나, 때로는 약간 갈색을 나타냄.

(5) 스타아치 한천배지

생 육 : 중정도

기중균사 : 거의 형성치 않으나, 형성하면 백색,

기생균사 : 담황색(2db), 코로니 중심부는 밝은 회황갈색(zge)를 나타냄.

가용성 색소 : 없음

전본의 분해: 약간 분해함

(6) 티로신 한천배지

생 육 : 중정도

기중균사 : 거의 형성치 않으나, 드물게 백색기중균사의 점재(點在)를 확인한다.

기생균사 : 회황색(3ec)∼밝은 회황갈색(3ge)

가용성색소 : 배양초기에는 엷은 자색∼담적갈색 색소를 생성하지만, 약 10일 배양으로 담갈색으로 되며, 그 뒤 엷어진다. (메타닌 색소를 약간 생성한다.)

(7) 영양 한천배지

생 육 : 양호

기중균사 : 엷게 백색의 기중균사를 형성한다.

기생균사 : 담황색(2db)

가용성색소 : 없음

(8)오오토밀 한천배지

생 육 : 양호

기중균사 : 백색∼회백색

기생균사 : 회황색(3ec), 밝은 회적갈색(4ge)

가용성색소 : 없음

본 균주는 25∼33℃를 최적온도 범위로써 생육하지만, 45℃ 또는 10℃에서는 생육불량이지만 생육할 수 있는 것이다. 그러나, 52℃ 이상에서는 생육할 수 없는 것이다.

본 균주는, 그루코오스 펩톤 제라틴 배지상에서 제라틴을 액화하고, 무기염, 전분한천배지상에서, 약하지만 전분을 가수분해한다. 본 균주는 탈지유를 펩톤화한다. 단 응고는 인정되지 않는다. 본 균주는 펩톤 이스트 철 한천배지 및 트립톤 이스트 액체 배지중에서는, 메타닌 색소를 생성치 않으나, 티로신 한천배지중에서는 때때로 생성한다. 본 균주는 푸리드햄곳토리이브 한천배지상에 있어서, D-키시로우스, D-구루코오스, D-푸락토오스, L-램노오스, D-만닛트를 이용하고, L-아라비노오스, I-이노시톨, 라피노우스를 이용치 않고, 슈크로우스를 약간 이용한다.

본원 발명의 항생물질 네오비리도 그리제인류의 항생물질을 생산하는 이미 알려진 균주로써, 다음의 방선균을 들 수 있다. 즉, 스트렙토마이세스, 그리제우스(Streptomyces griseus) NRRL 2426, 스트렙토마이세스, 그리제오비리디스(Streptomyces griseoviridis) NRRL 2427, 스트렙토마이세스 SP.(Streptomyces SP.)에타마이신 생산균 및 스트렙토마이세스·콘가넨시이스(Streptomyces Conganensis)이다.

이들의 균을 본원 발명에 사용하는 균주와 비교하면, 스트렙토마이세스 그리제우스 NRRL 2426은 포자연쇄가 직상(直狀) 내지는 약간 파상(波狀)인 것으로써, 형태적 분류 RF(Rectviflexibiles)섹숀에 속하며, 이스트 맥아한천 배지상에 있어서 회색∼황회색(e∼2ge)의 기중균사를 착생(着生)하고, L-아라비노오스를 동화하는데 반하여 본원 사용의 균주는 형태적 분류에서는 S(Spirales)섹숀에 속하며, 이스트 맥아한천배지상에 있어서 백색∼밝은 회백색의 기중균사(

)를 착생하고, L-아라비노오스를 이용하지 않는 등, 양자는 전혀 다른 성질을 나타내고 있다. 다음에 에타마이신 생산균은, 좌벡한천배지, 그루코오스, 아스파라긴한천배지, 영양한천배지 등의 배지상에 있어서의 배양적 특징이나 탄소원 동화패턴 등에 있어서 본원 사용의 균주와 커다란 차이를 나타냄. 스트렙토마이세스·콘가넨시스는, 포자연쇄의 형태적 특징 등 본원 사용의 균주와 명확하게 다르다. 상기 4주(株)의 중에서 본원 사용의 균주와 가장 근연(近緣)이라고 생각되는 스트렙토마이세스·그리제오비티디스 NRRL 2427에 대해서는, 양자를 동시에 나란히 하여 배양해서, 비교시험을 행하였다. 그 결과를 다음 표에 나타냄.

상기와 같이, 스트렙토마이세스 그리제오비리디스 NRRL 2427과, 본원 발명의 균주와의 사이에는 형태적 특징, 배양적 특징, 탄소원동화패턴 등에 있어서 여러가지의 명확한 상위점이 보여진다.

또 이들 양균을 나란이 하여 후술하는 생산조건에서 배양하면, 본원 사용의 균주는 비오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ을 포함하는 네오비리도그리제인류를 생산하는데 비해서, 스트렙토마이세스 그리제오비리디스 NRRL 2427은 이들 3성분을 생산할 수가 없다고 하는 생리화학적인 차가 인정된다.

이들의 결과에서 판단되는 것처럼, 본원 사용의 균주에 해당하는 이미 알려진 균주는 존재치 않으며 신종으로 인정하는 것이 타당하다고 생각되며, 스트렙토마이세스·SP, P 8648이라 명명했다. 본 균주는 통상 산업성공업기술원 미생물공업기술연구소에 기탁되어, 미공연균기탁수리번호 제3662호(FERM-P-No,3562) ATCC 31289를 받게 되었다.

잘 알려진 바와 같이, 방성균은 자연 및 인공돌연변이에 의해서 그 균학적 성질이 변화한다. 본원 발명에 사용되는 균주는 상기, 미공연균기탁수리번호 제3562호의 균주에만 한정되는 것은 아니며, 본원 발명의 항생물질 네오비리도 그리제인류를 생산하는 능력을 갖는 본 균주의 자연 및 인공돌연변이 이주(異株)를 포함하는 것이다.

다음에 상기의 생산균을 사용해서 본 발명의 항생물질을 제조하는 방법을 설명한다. 상기의 항생물질 네오비리도 그리제인류를 생산하자면 네오비리도 그리제인류 생산능력을 갖는 스트렙토마이세스속 균주를 생산에 알맞는 영양배지에 접종하고, 이를 18 내지 37℃에서 2일 내지 14일간 호기적으로 배양생산하고, 그 배양물에서 추출단리 정제한다.

배지성분으로서는, 통상적인 스트렙토마이세스 배양에 쓰여지고 있는 공지의 것이 사용될 수 있다.

예컨데 탄소원으로써 구루코오스, 글리셀린, 전분, 덱스트린, 오오토밀, 당밀, 유지, 지방 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로서는, 대부분, 면실분, 육(肉)엑키스, 펩톤, 건조효모, 코온스티이푸라카, 효모엑기스, 카제인, 카제인 가수분해물 등의 유기물 및 유산암모늄, 초산암모늄 등의 무기물이 사용될 수 있다.

또 필요에 응해서, 탄산칼슘, 식염, 염화칼륨, 인산염, 유산마그네슘, 기타의 미량금속염 등의 무기염류를 첨가하는 외에, 본균의 생육을 도우고, 항생물질 네오비리도 그리제인의 생산을 촉진하는 아미노산, 비타민 등의 유기물 및 무기물을 알맞게 첨가할 수가 있는 것이다. 배양방법은, 일반적으로 항생물질의 생산에 쓰여지고 있는 진탕배양, 탱크배양 등에 의한 액체 배양법이 이용되지만, 공업적 생산에는 탱크내심분(深部) 배양법이 무엇보다도 알맞다.

이 배양은 25∼33℃가 바람직하다. 이 방법으로서 본 항생물질류의 생산은 진탕배양, 탱크배양 모두 2내지 10일에서 최고농도에 달한다. 배지의 종류에 따라서, 배양중에 pH가 산성 또는 알칼리성으로 크게 기울어지는 경우가 있으나, 이런 경우에는 배양종의 pH를 6내지 9로 유지하도록 하는 것이 바람직하다.

배양의 시발시의 pH는 6.5내지 8.5로 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용하는 군주는 배양조건에 의해서 그리제오비리딘 및 네오비리도 그리제인류 각 성분과를 생산하는 능력을 가지고 있으며, 특히 유리(遊離)의 아미노산 또는 유기산을 첨가하는 일없이, 통상의 방선균 발효에 보통으로 사용되고 있는 탄소원 및 질소원을 적당히 조합시키는 등 배양조건을 조절하는 것에 의해서 상기 생산물의 생산비율을 조절하는 것이 가능한 것이나, 유리아미노산, 특히 생산물의 구성아미노산을 배양중에 첨가해서 배양중의 아미노산 조성을 변화시키는 것에 의해서, 새로운 항생물질 네오비리도그리제인 Ⅰ,Ⅱ및/또는 네오비리도 그리제인 Ⅲ의 생산량을 필요에 응해서 선택적으로 증가시키는 것이 가능하다.

또, 본 발명에서 사용되는 균주 스트렙토미세스 SP, P 8648은 공지의 비리도그리제인 생산주에 보이지 않는 네오비리도그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ의 생산능력을 본래 가지고 있으나, 카자미노산 또는 푸토린을 적량 배양중에 첨가하는 것에 의해서, 항균력의 강한 네오비리도 그리제인 Ⅱ의 생산을 선택적으로 증가시킬 수가 있으며, 또, n-아미노-α-낙산을 네오비리도 그리제인류 생산개시전에 배양중에 첨가하는 것에 의해서, 네오비리도그리제인 Ⅰ 및 Ⅲ의 생산량을 선택적으로 증가시킬 수가 있는 것이다.

배양액 중에 축적한 항생물질 네오비리도 그리제인류는 뎁시펩타이드를 단리하기 위한 공지의 방법 및, 는 물질의 물성에 의거한 각종의 정제방법에 의해 각 성분으로 회수 단리할 수가 있는 것이다.

또, 필요에 용해서 네오비리도 그리제인류의 혼합물 또는 이들과 그리제오비리딘과의 혼합물로서 회수할 수가 있는 것이다.

본 항생물질을 사료첨가제 또는 동물약으로써 조제할 경우에는, 혼합물로써 회수하는 것이 경제적으로 유리한 것이다.

배양액중에 존재하는 항생물질 네오비리도 그리제인류는 초산에틸, 초산부틸, 벤젠, 톨루엔, n-부탄올, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 메틸아소부틸케톤 등의 난수용성 유기용매에 의해 추출된다. 그리제오비리딘을 추출치 않고, 네오비리도 그리제인류를 선택적으로 추출하려고 할 경우에는, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 용매의 사용이 바람직하다.

네오비리도 그리제인류는 배양균 체중에는 거의 존재치 않으므로, 배양균체를 여과 또는 원심분리에 의해, 미리 제거세정하고, 그 세액(洗液)을 함유한 배양여액에서 본 항생물질을 추출하는 것이 균체중의 지용성(脂溶性) 불순물을 제거할 수 있으므로 바람직하다. 유기용매에 의한 추출법외에, 활성탄, 암바라이트-XAD(로움, 안드 화아스사제)등에 의한 흡탈착, 암바라이트 ⅠR-Ⅰ20(로움 앤드 화아스사제), 다우엑스 50W-X₂(다우케미칼 사제) 등의 양이온 교환수지에 의한 흡착, 용출, 새파덱스 LH-20(파알마시아-사제)등에 의한 겔여과, 알루미너, 실리카겔 등에 의한 흡착크로마토 등을, 컬럼법 또는 박층법에 의해 알맞게 조합해서 사용하고, 경우에 따라서는 적당한 용매를 사용한 향류(向流)분배법 등을 병용해서, 본 항생물질을 회수할 수가 있는 것이다.

다음에 본 발명의 네오비리도 그리제인류의 물리화학적 정상을 기술한다.

네오비리도 그리제인류는 어느 것이든 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 디옥산, 초산에틸, 초산부틸, 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 벤젠, 톨루엔, 염화메틸렌, 클로로포름, 4염화탄소, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시시드에 가용, 에틸에 에테르, 물에 난용, 석유에 에테르, 헥산이 거의 불용의 백색 무정형 고체이다. 네오비리도 그리제인류는, 어느 것이든 수용액 중에서 25∼27℃의 온도 범위에서는, 적어도 1개월은 안정이며, 60℃, 30분의 처리를 행한 경우에도 pH 2∼9의 범위에서는 완전히 안정한 것이다.

코푸라법으로서 측정한 융점은 다음과 같은 것이다.

네오비리도 그리제인 Ⅱ 93℃ : 네오비리도 그리제인 Ⅲ 115℃ :비리도 그리제인 140℃

네오비리도 그리제인 Ⅰ, 네오비리도 그리제인 Ⅱ 및 네오비리도 그리제인Ⅲ 및 비리도 그리제인의 적외선흡수 스펙트로를 각각 제1도, 제2도, 제3도 및 제7도에 나타냄. 각도 모두 도면중 ①의 실선은 중성 메탄올 중의 자외선흡수를, ②의 쇄선은 0.1N 메탄올성 가성소오다의 자외선흡수를 나타냄.

메탄올 중에서 측정한 자외선 흡수극대 및 그 파장에 있어서의

값(괄호내)를 다음에 나타냄.

네오비리도 그리제인 Ⅰ305㎚(65.0) : 네오비리도 그리제인 Ⅱ 305㎚(88.0):네오비리도 그리제인 Ⅲ 305㎚(90.0) : 비리도 그리제인 340㎚ : 0.1N 메탄올성 가성소오다 용액 중에서의 자외선흡수 극대 및 그 파장에 있어서의

값을 다음에 나타냄.

네오비리도 그리제인 Ⅰ 340㎚(70.0): 네오비리도 그리제인 Ⅱ 340㎚(84.0):네오비리도 그리제인 Ⅲ 340㎚(90.0) : 비리도 그리제인 340㎚(96.0).

취화칼륨 정제법(錠製法)으로서 측정한 네오비리고 그리제인 Ⅰ.Ⅱ 및 Ⅲ 및 비리도 그리제인의 적외선 흡수스펙트럼을 각각 제4도, 제5도, 제6도 및 제8도에 나타냄. 그 적외선흡수극대는 다음에 나타낸 파수(波數)에서 인정된다.

네오비리도 그리제인 Ⅰ: (KBr정)

3370, 2910, 2850, 1735 1675(sh) 1635, 1590(sh), 1515, 1460(sh), 1445, 1405, 1375 1290, 1280, 1250(sh), 1200, 1190, 1160, 1125, 1100,

네오비리도 그리제인 Ⅱ: (KBr정)

3320, 2950, 2920, 2820, 2800, 1745, 1670(sh), 1630, 1600(sh), 1575, 1515, 1460(sh), 1445, 1405, 1390, 1365, 1330(sh), 1295, 1275, 1240, 1200, 1195, 1160, 1130, 1095,

네오비리도 그리제인 Ⅲ:(KBr정)

3335, 2960, 2940, 2870, 1750, 1670(sh), 1660(sh), 1635, 1590(sh), 1515, 1450, 1405, 1390(sh), 1370, 1340(sh), 1300, 1245, 1200, 1160(sh), 1130, 1100,

질량분석법으로 구한 분자량을 다음에 나타냄.

네오비리도 그리제인 Ⅰ 876

네오비리도 그리제인 Ⅱ 862

네오비리도 그리제인 Ⅲ 892

비리도 그리제인 878

맬크사제 실리카겔 플레이트 60F Rf를 사용해서 상승법으로서 전개한 실리카겔 박층 크로마토에 있어서의 R F 값을 다음에 나타냄.

(1)용매계(벤젠 : 메탄올=5:1)의 경우

네오비리도 그리제인 Ⅰ Rf 0.66

네오비리도 그리제인 Ⅱ Rf 0.62

네오비리도 그리제인 Ⅲ Rf 0.59

비리도 그리제인 Rf 0.55

그리제오 비리딘 Rf 0.20

(2)용매계(클로로포름 : 메탄올=30:1) 경우

네오비리도 그리제인 Ⅰ Rf 0.39

네오비리도 그리제인 Ⅱ Rf 0.32

네오비리도 그리제인 Ⅲ Rf 0.19

비리도 그리제인 Rf 0.18

그리제오 비리딘 Rf 0.02

네오비리도 그리제인류의 제각기를 6N 염산중 110℃에서 하룻밤 가수분해하고, 농축 건고해서 충분히 염산을 제거한후, 박층크로마토(이스트만, 클래머그램, 시이트 13254, 이스트만 코닥사제를 사용, n-부탄올:초산:물=4:1:1의 용매계 또는 n-프로판올:피리딘:초산:물-15:10:3:12의 용매계를 사용해서 전개), 고압 여지전기영동(高壓濾紙電氣泳動)(동양여지 No, 51 A 여지, 동양여지사제를 사용하여, 개미산:초산:물:=25:75:900의 pH 1.8의 완충액을 사용 0℃에서 30분간, 60V/㎝에서 통전)및 아미노산분석계(히다데제 KLA-5)에 걸어서 아미노산 분석을 행했든 바, 다음에 나타낸 아미노산이 검출되었다.

네오비리도 그리제인 Ⅰ:스레오닌, 로이신, 푸로린, α-아미노-n-낙산, 살코신, 페닐살코신, β,N-디메틸로이신

네오비리도 그리제인 Ⅱ:스레오닌, 로이신, 푸로린, 알라닌, 살코신, 페닐살코신, β,N-디메틸로이신.

네오비리도 그리제인 Ⅲ:스레오닌, 로이신, 옥시푸로린, α-아미노-n-낙산, 살코신,페닐살코신, β,N-디메틸로이신.

비리도 그리제인 :스레오닐, 로이신, 옥시프로린, 알라닌, 살코신, 페닐살코신, β,N-디메틸로이신.

네오비리도 그리제인류에 3-옥시피코린산이 공통해서 존재한다는 것이 질량분석 및 박층크로마토(멜크, 실리카겔 플레이트를 사용해서 클로로포름:메탄올=2:1의 용매계로서 전개했을 경우의 Rf값이 0.46, 또 이스트만·클로머그램·시이트13254를 사용해서 n-부탄올:초산:물=4:1의 용매계로서 전개했을 경우의 Rf 값은 0.62로서 이미 알려진 시료의 그것과 각각 잘 일치)에 의해 확인되었다.

질량분석은 다음의 두가지 방법으로 실시했다.

네오비리도 그리제인의 각각을 직접 질량분석계에 도입해서 분자량 결정을 행하고, 또 F·compernolle et·al(organic Mass spectrometry vol, 6, 151-166,(1972)의 방법에 따라 네오비리도 그리제인류의 각각을 0.1N 가성소오다로서 실온에서 하릇밤 알칼리 아수분해를 행한 분해물을 디아조메탄에 의해서 메틸화한후 질량분석계에 도입해서 화학구조의 해석(解析)을 행하였다.

이상 설명한 결과를 총합해서, 네오비리도 그리제인 Ⅰ, 네오비리도 그리제인 Ⅱ,네오비리도 그리제인 Ⅲ의 화학구조는 다음과 같이 이결정되었다.

네오비리도 그리제인 Ⅰ

네오비리드 그리제인 Ⅱ

네오비리드 그리제인 Ⅲ

네오비리도 그리제인 Ⅱ, 네오비리도 그리제인 Ⅱ 및 네오비리도 그리제인 Ⅲ은 비리도그리제인에 유사한 새로운 펩타이드계 항생물질이다. 네오비리도 그리제인 Ⅳ 상당물질은 앞에서도 설명한 바와 같이 비리도그리제인 및 에타마이신의 이미 알려진 시료와 직접 비교해서, 그것과 동일하다는 것이 확인되었다.

생물학적 성질

네오비리도 그리제인류 및 그리제오비리딘과의 혼합물은, 광범한 항균스펙트럼을 나타내며, 또한 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ은, 박테리아 마이코푸라즈마, 액티노미세스 및 리켓티아제에 대해 In virto 시험에 있어서는 광범위의 항균스펙트럼을 나타내며, 스타피로콕커스 아우레우스(straphylococcus aureus) 및 그 내성균을 함유한 포도구균, 스트렙토콕커스 피오게네스(streptccoccus Pyogenes)등의 연쇄구균 및 디푸로콕커스 뉴우모니에(Diplococcus Pneumoniae)등의 폐염구균 및 살루티나 루테아(sarcina Lutea), 바틸루스 서브티리스(Bacillus Subtilis), 마이코푸라즈마 가리셉티컴(Mycoplasma gallisepticum), 마이코푸라즈마 풀모니스 (M,Pulmonis), 마이코푸라즈마 퍼멘텐스(M, fermentans), 및 마이코푸라즈마 아가락체(M, agalactiae) 등의 동상의 균주 및 내성주에 대해서 강한 항균력을 나타냄.

네오비라도 그리제인 Ⅰ, 네오비리도 그리제인 Ⅱ 및 네오비리도 그리제인 Ⅲ 및 비리도 그리제인의 혼합물 즉 네오비리도 그리제인류의 혼합물 및 네오비리도 그리제인류와 그리제오비리딘과의 혼합물에 대해서, 브로스·다이류션법으로서 행한 각종 미생물에 대한 최소 저지농도를 다음 표에 나타냄.

주 : (a) NV는 네오비리도그리제인 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ는 각각 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ및Ⅲ의 략(略)

(b) EM : 에리스토마이신, STH : 스트렙토슬리신, PC:페니실린, TC:테트라싸이클린

LM :로이코마이신, CP:클로람페니콜, SM:스트렙토마이신, KM:카나마이신,

㎚ : 네오마이신, OM:오레안도마이신, ( )r : ( )내약제에 대한 내성균

(c) BHI : 푸레인·화아트·인펙죤·부로스, MY 말토엑키스·이스트배지

네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ는 그리제오비리딘과 공존하면 항균력이 증대한다. 네오비리도 그리제인류 혼합물과 그리제오비리딘과의 혼합비를 바꾸어서 최소저지농도를 측정하면, 결과는 다음 표와 같으며 네오비리도 그리제인류 혼합물과 그리제오비리딘과를 등량(等量)씩 가했을 경우 그 항균력은, 제각기의 단독의 수배의 항균력을 나타냄.

* 살루시나·루테아를 사용한 브로스·다이류션법(BHI 배지)

그렇기 때문에, 본 발명의 새로운 항생물질 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ은 각각 단독으로서는 유효한 항생물질이라는 것을 물론이거니와, 이를 네오비리도 그리제인류 그리제오비리딘과 혼합하는 것에 의해, 한층 유효한 항생물질로 되는 것이다.

네오비리도 그리제인류와 그리제오비리딘과의 혼합물은 특히 가축의 유방염등에 연쇄구균감염증, 화농성질환인 포도구균감염증, 폐염구균감염증 등의 제질환에 유효한 항생물질이라고 말할 수 있을 것이다.

상기 표에서 네오비리도그리제인과 그리제오비리딘과의 혼합비가 50:50인 때, 상승효과(Synergistcaction)은 가장 현저하며, 즉, 네오비리도 그리제인 혹은 그리제오비리딘만일 때에 비교해서, 그들을 동시에 혼합한 것은 3∼4배의 활성을 나타내는 것이 확인되었다.

표에서 보는 바와 같이, 네오비리도 그리제인 Ⅱ는 비리도 그리제인에 비해서 강한 항균활성을 가지고 있다. 이 실험은 2배의 희석법으로 최소저지농도를 측정했으나, 다음에 희석비율을 낮게 해서, 각각의 화소저지농도를 정사(精査)했다. 결과는 다음 표와 같았으며, 네오비리도 그리제인은 비리도 그리제인에 비교해서 2배 내지 3배 강한 항균활성을 가지고 있다는 것이 명확해졌다.

주: 생략기호, 전표와 같음

또, 네오비리도 그리제인류 혼합물을 2∼20ppm 사료 중에 첨가해서 10주간에 걸쳐 오스비나에 의한 사옥시험을 실시했든 바, 첨가구(添加口) 는 증체량 및 사료효율의 점에서 무첨가의 대조군보다 뛰어나고 있었다.

따라서 네오비리도 그리제인 혼합물은 사료 첨가제로써도 사용되는 것을 알았다.

다음에 본 특허제조법의 실시예를 들겠으나, 특허청구의 범위는, 이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

다음의 표는 여러가지의 마이코프라즈마(Mycoplasma)의 균주에 대해서 네오비리도 그리제인 Ⅱ의 시험관내에 있어서 높은 활성을 갖는다는 것 아울러 비리도 그리제인 Ⅲ-그리제오비리딘의 혼합물에 비교해서 네오비리도 그리제인 Ⅱ-그리제오비리딘의 혼합물이 뛰어난 상승효과를 갖는다는 것을 나타냄.

주 : 배지(1)PPLO 강화브로스(일본:위생연구소)

(2)PPLO 브로스 (Difco), 차녹스(chanocks)

혼합비 50/50배지

NV : 네오비리도 그리제인

VG : 비리도 그리제인

GV : 그리제오 비리딜

M. 아미코푸라즈마(M. Mycoplasma)

상기 표에 나타낸 것처럼, 본 발명의 신규인 화합물 네오비리도 그리체인 Ⅰ-Ⅲ은 그램 양성세균 및 마이코푸라즈마 균주에 대해서, 각각 단독으로 사용해서도, 또는 비리도그리제인(네오비리고 그리제인 Ⅳ)및 그리제오비리딘과의 여러가지 혼합물로써 사용하여도 현저한 활성을 나타내고 있다.

네오비리도 그리제인 Ⅰ-Ⅲ, 비리도그리제인(네오비리도 그리제인 Ⅳ) 및 그리제오비리딘의 혼합물 중에 있어서의 혼합중량비는 대단히 넓은 범위내에서 바꾸어도 놀랄만한 항미생물활성 및 항마이코푸라즈마활성이 잔존하고 있다는 것이 인정된다. 한정적인 예는 아니지만 대표적인 예로는 네오비리도 그리제인 Ⅱ27%, 네오비리도 그리제인 Ⅳ(비리도 그리제인) 23%, 그리제오비리딘 50%(모두 중량비)의 조성을 갖는 혼합물을 우식증(儷磐症dental, caries)및 치조농후(Peridontal)에 관계되는 미생물 스트렙토콕커스 무던스(streptcoccus mutans)에 대해서 시험관 중에서 시험했다. 시험은 톳드·헤위트·브로즈(Difco)와 0.5%의 TC 락토알부민의 가수분해물(Difco)의 배지로서 행하여졌다.

시험개시시에 있어서의 미생물수는 3×10⁴/㎖이었다. 시험관을 37℃에서 48시간 혐기적(嫌氣的)으로 배양했다. 최소저지농도(MIC) 및 최소살균농도는 모두 네오비리도 그리제인의 농도 1.0ppm이었다.

아울러 이것도 한정적인 예는 아니지만, 다른 예로써 같은 혼합물을 돼지의 적리(赤痢)의 미생물인 트레표네에마 히오디센테아에(Treponema hyodysenteriae)에 대해서 시험관내에서 시험했다. 혼합물을 혈액한천(blood agar)중의 희석법에 의해서 100, 50, 10, 5, 1, 0,5 및 0.1ppm의 농도로서 행하여졌다. 면봉(綿俸)에 붙인 균액을 사아래에 접종하고, 42℃에서 4일간 배양했다. MIC는 0.5ppm로 결정되었다. 또 한정적인 것은 아니지만, 다른 예로써 마음의 중량 % 조성의 혼합물을 여러 종의 마이코푸라프라이즈마균주에 대해서 시험관내에서 시험했다.

이런 경우의 MIC는 다음과 같은 것이다.

네오비리도 그리제인 Ⅱ 25%; 네오비리도 그리제인 Ⅳ (비리도그리제인) 25% ; 그리제오비리딘 50% (모두 중량비)

상기한 형의 네오비리도 그리제인-그리제오비리딘 혼합물은 상기한 병원균에 의한 감염증의 동물의 처지에도 유효한 것이다.

또, 미카마이신(mikamycin) A 및 B는 사료 첨가물로서 대단히 효과적이라는 것이 알려져 있으므로 본 발명이 화합물에 대해서도 동물의 사료시험을 행하였다. 네오비리도 그리제린을 혼합물로서 병아리의 먹이에 2∼20ppm의 비율로서 첨가해서 숫병아리를 10주간 사육했다. 네오비리도 그리제인을 첨가치 않은 같은 사료를 준 대조구(對照區)의 병아리에 비교해서 네오비리도 그레제인을 첨가한 먹이로서 사육한 병아리는 증체율(增體率) 및 사료효율에 있어서 뛰어나고 있다. 따라서 본 발명의 네오비리도그리제인은 사료 첨가물로서도 대단히 유용하다는 것이 입증되었다.

또한, 네오비리도 그리제인 Ⅰ-Ⅱ의 중의 일종이상을 함유한 조성물 경우에 따라 비리도 그리제인(네오비리도 그리제인 Ⅳ) 및 그리제오 비리딘과의 혼합물이 그 각 성분의 중량비의 대단히 넓은 범위의 혼합비의 범위내에서 사료첨가물로써 대단히 유용하였다. 그 대표적인 예로써 한정적인 것은 아니나, 네오비리도 그리제인 Ⅱ 27% : 네오비리도 그리제인 Ⅳ(비리도그리제인 23% : 그리제오비리딘 50% 모두 중량비)로서 된 조성의 혼합물을 병아리의 사육의 먹이중에 첨가해서 생물시험을 행하였다. 생후 하루가 된 숫병아리를 1구에 15마리식 사용해서 약 55%의 호밀 입(粒)에 비타민류 무기성분, 지방 및 단백질을 가한 먹이로서 11일간 사육했다. 호밀 입의 많은 사료는 통상 불량내지는 중정도의 성장밖에 얻어지지 않기 때문에 성장촉진제 및 사료첨가물용의 항생물질의 스크리이닝 표준사료로써 사용되고 있다. 페니실린(100ppm)을 플러스의 대조품으로써 사용했다. 그 결과를 다음에 표시한다. 사료/증체비는 중가한 체중량에 대한 섭취된 사료의 중량의 비인 것이며,체중비는 시험개시시의 중량에 대한 11일간의 시험후에 있어서의 병아리의 체중비이며 , 최후의 난의 평균증체중(g)는 병아리 한 마리당의 편균증체의 질량(g)을 나타냄

다음에 본 발명의 실시예를 다시 나타내겠으나, 본 발명은 이 실시예만에 한정되는 것이 아님은 몰론이다.

[실시예 1]

대부분 0.5%, 펄머메디어(트레더어즈·오일·밀사제)0.5%, 오오토밀 0.5%, 건조효모 0.5%, 당밀 0.5%(pH 6.5로 조정)로서 된 배지 50㎖을 250㎖들이 삼각 프레코에 넣고 살균 후, 스트렙토마이세스 SP, P 8648를 접종하고, 28℃에서 48시간 로우터리 진탕배양을 행하여 이를 종모로 했다.

대두분 0.5%, 비너쓰·미일 0.5%, 오오토미일 0.5%, 건조효모 0.5%, 당밀 0.5%(pH 6.5)로서 된 배지 100㎖들이 삼각프래스코에 넣고, 살균후 종모를 2㎖씩 접종하고, 28℃에서 96시간 토우터리 진탕배양(200rpm×7㎝)를 행하였다.

프래스코 12개분의 배양액을 모아 여과에 의해 배양여액을 얻었다. 케이크를 100㎖의 물로서 세정해서 그 세정액을 배양여액에 가하였다.

이 액의 pH는 8.3이며, 사루시나·루테아(Sarcina lutea)를 물어넣은 뉴트리엔트·아가 평판상에서, 직경 8mm의 펄프디스크를 사용해서 비오엣세이를 행하였든바 직경 23mm의 저지원(阻止원)을 주었다.

이 액을 200㎖의 n-부탄올로서 2회 추출하고, n-부탄올층을 농축 견고해서, 90㎎의 고형물을 얻었다. 이를 와고오겔 C-100(화광순약사제)의 실리카겔컬럼(1.5 ø×25㎝)에 차야지하고, 먼저 벤젠-아세톤=(5:1)의 혼합용매 300㎖로서, 이어서 벤젠-아세톤(2:1)의 혼합용매로서 전개 용출하고, 용출액을 10g씩 채취했다.

프렉션 번호 No. 25∼35의 활성구분을 모아 농축 건고하고, 네오비리도 그리제인류 혼합물(즉 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 및 비리도그리제인 30㎎을 얻었다. 이를 벤젠:아세톤=1:1의 혼합용매를 사용해서 멜크사제 실리카겔플레이트 F254 위에서 박층클로마토상에서 Rf=0.05의 스폿트를 주었다.

[실시예 2]

실시예 1의 종모배지와 같은 조성의 배지 10ℓ을 15ℓ들이 스테인레스제 쟈퍼멘터에 넣고, 살균후, 같은 조성의 배지중에서 28℃에서 48시간 배양한 프래스코종배양액 200㎖를 접종하고, 매분 5ℓ의 무균공기를 통해 가면 2분의 1경(經)의 푸트페라로시 매분 200회전 교반해 가면서 27∼28℃에서 96시간 통기교반 배양을 행하였다. 배양종료 후 여과하고, 여액을 pH 6.0으로 조절후 2ℓ의 초산에틸로서 4회 추출했다. 초산에틸층을 취하여 탈수망초를 첨가한 뒤, 농축 견고해서, 조분말 700㎎을 얻었다.

이를 소량의 메탄올에 용해하고, 이를 세파덱스 LH-20컬럼(3ψ×50㎝)에 챠아지하고, 메탄올로서 전개하고, 용출액을 10㎖에 채취했다. 플랙숀번호 No. 22∼29의 활성구분을 모아, 이를 마린크롯트사제 실리카겔컬럼(1.5ψ×20㎝)에 걸어, 클로로포름:메탄올=30:1의 혼합용매로서 전개용출하고, 용출액을 5g씩 채취했다. 플렉숀번호 No.5∼12의 활성구분을 농축건고하고, 백색분말 25㎎을 얻었다. 이 백색분말을 초산에틸에 용해하고, 실리카겔 박층 클로타토를 행해서, 이것이 네오비리도 그리제인류 혼합물이란 것을 확인하였다.

본 분말중의 네오비리드 그리제인 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 및 비리도 그리제일의 조성율은 다음과 같은 것이다.

네오비리도 그리제인 Ⅰ: 15% 네오비라도 그리제인Ⅲ : 20%

네오비라도 그리제인 Ⅱ: 20% 비리도 그리제인 : 45%

상기 LH-20컬럼의 플렉숀번호 No. 30∼34의 활성부분을 모아, 감압농축한 후 온(溫)메탄올에서 재결정에 의해, 30㎎의 침상결정을 얻었다. 이 결정은 박층클로마토상의 거동 기타 이 화학적 성상이 그리제오비리딘과 일치했다.

[실시예 3]

본 배양배지의 조성을 대부분 0.5, 펄머메디어(트래더어스·오일·밀사제) 0.5%, 오오토밀 0.5%, 건조효모 0.5%, 당밀 0.5%, DL-α-아미노-n-낙산 0.1%(pH 6.5)로써 실시예 1과 같은 방법으로 96시간 진탕 배양을 행하였다. 프래스코 13개분의 배양여액을 n-부탄올 30㎖에서 추출하고, 그 부탄올층을 농축건고해서 조분말 70㎎을 얻었다. 이 조분말을 멜크사제 실리카겔 플레이트(F254)에서 박층클로마토를 행하고 사루시나·루테아를 검정균으로서 비오오오토 그래프를 행했든 바, 하기와 같은 항균활성 스폿트 Rf값의 높은 쪽에서 네오비리도 그리제인 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ 및 비리도 그리제인 및 그리제오리티딘의 순)을 주었다. 전개용매와 각 성분의 Rf값과의 관계는 다음과 같은 것이었다.

[실시예 4]

쇠고기 엑키스 0.3%, 트립톤(디프로사제) 0.5%, 포도당 0.1%, 가용성전분 2.4%, 효모엑키스 0.5%, 탄산칼슘 0.4%, 대두분 0.5%(pH 7.0)의 배지 50㎖를 250㎖들이 삼각프래스코에 넣어 120℃, 15분간 살균 후 스트렙토마이세스 SP·P 8648의 포자를 사면배양에 의해 접종하고, 25℃로서 3일간 진탕배양하고, 이를 종모배양으로 했다. 가용성전분 0.5%, 포도당 20%, 펄머메디어 1.0%, 오오토밀 0.5%, 콘스티프리커 0.5%, 제2인산칼륨 0.05%, 유산마그네슘 0.05%(pH 6.5)로서 된 배지 50㎖를 250㎖들이 삼각프레스코에 넣고, 살균후, 상기 종모배양을 2%마다 접종하고, 25℃로서 진탕 배양했다. 24내지 48시간 배양후, 살균한 카자미노산(디프코사제)또는 푸로린용액(pH 7.0)을 0.4%로 되도록 첨가하고, 진탕배양을 속행했다. 접종에서 4일간 배양 후 배양액을 등량의 초산에틸을 사용해서 2회 추출하고, 추출액을 농축 건고후, 일정량의 초산에틸에 용해하고, 일정량을 실리카겔 박층판상에 스폿트하고, 클로로포름:메탄올=100:2의 혼합용매를 사용해서 2회, 다중(多重)전개했다. 전개후 3650Å의 자외선에서 검출되는 스폿트 부분을 긁어모아, 일정량의 메탄올로서 추출용출후, 사투시나·루테아를 검정균으로서 각성분량을 비오엣세이하였다. 네오비리도 그리제인류 각성분의 생산비율은 다음과 같은 것이었다.

[실시예 5]

대두분 0.5%, 펄머메디어(트레이더어스·오일·밀사제) 0.5%, 오오토밀 0.5%, 건조효모 0.5%, 당밀 0.5%, DL-α-아미노-n-낙산 0.1%의 조성으로 된 배지(pH 6.5ℓ) 600ℓ을 1.4KL들이 스테인레스제 배양 탱크에 넣고, 가열살균하고, 냉각 후 이것에 실시예 2의 자퍼어맨터 배양과 동일 조건에서 배양했다. 23시간 종모배양을 약 10ℓ 접종했다.

대분 300ℓ의 무균공기를 하방(下方)스파아쟈에서 통하고, 2분의 1경의 푸로레라(2단)으로 매분 180회전 교반해 가면서 28℃에서 75시간, 통기교반배양을 행하였다. 배양후 고형분을 여과하고, 그 배양여액을 150ℓ의 n-부탄올로서 2회 추출했다.

부탄올층을 모아, 소량의 포화식염수로서 세정후, 로우터리·에바포레이터로서 농축해서 액량을 2ℓ로 했다. 이것에 실리카겔(WaKO C-100, 화공순약사제) 20g을 첨가해서 농축건고하고, 이를 소량의 클로로포름이 현탁해서 실리카겔컬럼(6.5㎝×75㎝, 24ℓ, 실리카겐-WaKO C -100)에 챠아지 했다. 이 컬럼을 클로로포름-메탄올(최초는 클로로포름 단독으로서, 메탄올접종)의 혼합용매로서 용출하고, 용출액을 500g씩 채취했다. 플렉숀번호 No. 16∼29의 합성구분(네오비리도 그리제인류 구분)을 모아 농축후, 세라덱스 LH-2-컬럼(7ψ×45㎝)에 도입하고, 메탄올로서 용출하고, 용출액을 100g씩 채취했다. 플렉숀번호 No. 6∼15의 활성구분을 모아 농축건고해서 조분말 15g을 얻었다.

다시 상기 실리카겔 컬럼에 있어서의 플랙숀번허 No. 50∼60의 활성구분(그리제오비리딘 구분)을 모아 농측후, 세파덱스 LH-20컬럼(7ψ×45㎝)으로 도입하고, 메탄올로서 용출하고, 용출액을 100g씩 채취했다. 플랙숀 번호 No- 18∼23의 활성구분을 모아 농축건고해서 조분말 1g을 얻었다.

[실시예 6]

실시예 5에 얻어진 네오비리도 그리제인류 구분의 조분말 1g을 초산에틸 2㎖에 용해하고, 델크사제 실리카겔 플레이트 10매에 화선(畵線)했다. 이를 먼저 클로로포름 : 메탄올= 50 : 1의 혼합용매로서 전개풍건(風乾)하고, 이어서 클로로포름:메탄올=25:1의 혼합용매로서 전개해서 푸레파라티브한 박층 클로마토를 행하였다.

전개 후 3650Å 자외선으로 검출되는 네오비리도 그리제인 Ⅰ부분을 긁어모아, 소량의 메탄올로서 추출하고 농축건고해서 유상의 네오비리도 그리제인 Ⅰ16.7㎎을 얻었다.

그와 같이 해서, 네오비리도 그리제인 Ⅱ부분을 긁어 모아, 그것에서 같은 물질의 백색분말 11.1㎎을 얻었다. 그와 같이 해서 네오비리도 그리제인 Ⅲ부분을 긁어 모아, 그것에서 같은 물질의 백색분말 15.2㎎을 얻었다. 그와 같이 비리도 그리제인 부분을 긁어 모아, 그것에서 같은 물질의 백색분말 30.0㎎을 얻었다.

각 성분을 봉관중에서 6N-염산을 사용해서 110℃, 36시간 가수분해를 행하고, 그 가수분해물에 대해 박층클로마토, 페어퍼클로마토 및 아미노산 분석계 등에 의해, 아미노산 및 유기산의 분석을 행하였다.

네오비리도 그리제인류 각 성분 중에 다음에 나타낸 아미노산 및 유기산이 검출되었다.

자외선, 적외선흡수특성, 질량분석 및 NMR 분석에 있어거의 거동 기타에서 네오비리도 그리제인Ⅳ 상당부는 비리도 그리제인과 같이 정해지며, 다른 네오비리도 그리제인류의 화학구조가 결정되었다.

Claims

탄소원, 질소원, 무기염, 미량성분으로 된 영양배지에서 스트렙토미세스(streptomyces)속에 속하는 다음의 일반식 (Ⅰ)

(식 중 R₁은 -CH₃또는 -CH₂·CH₃이며 R₂는 H 또는 -OH이다)

로서 나타내어지는 항생물질을 생성하는 능력을 갖는 미생물 스트렙토미세스 S·P P 8648 미공연균기 3562호를 온도 18∼37℃, pH 6∼9로서 호기적으로 배양해서 배지중에 일반식 (Ⅰ)의 뎁시펩타이드 항생물질 또는 그의 혼합물을 축적시켜서 분리하는 것을 특징으로 하는 텝시펩타이드 항생물질 네오비리도 그리제인류의 제조방법.