DE3779946T2

DE3779946T2 - Antibiotikum a42125 und verfahren zu dessen herstellung.

Info

Publication number: DE3779946T2
Application number: DE8787303082T
Authority: DE
Inventors: Robert L Hamill; Ralph Emil Kastner
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1986-04-11
Filing date: 1987-04-09
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2007-04-10
Also published as: EG18187A; US4870021A; EP0241285B1; DK178387A; EP0241285A2; ATA257387A; IE870942L; PT84628A; DK178387D0; DE3779946D1; SU1547710A3; AU598531B2; CN87102770A; GR3005027T3; HUT46073A; IE59699B1; KR870010178A; KR920003666B1; JPS62281889A; CA1265462A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Antibictikum A42125 und einen neuen Stamm von Nocardia aerocolonigenes, NRRL 18049, der dieses Antibiotikum produziert. A42125 ist ein antibakterielles Mittel, das eine besonders interessante Aktivität gegenüber Mikroorganismen hat, die Methan produzieren. Da A42125 die Methanproduktion minimiert in Tests, bei denen Pansenbedingungen simuliert werden, sollte A42125 die Futterverwertungseffizienz erhöhen und damit wiederum das Wachstum von Wiederkäuern fördern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung von A42125 durch Züchten eines neuen Stamms von Nocardia aerocolonigenes, NRRL 18049, unter aeroben Submersfermentationsbedingungen, bis ein wesentlicher Gehalt des Antibiotikums produziert wird. A42125 wird aus der Fermentationsbrühe extrahiert, indem es auf ein Harz adsorbiert wird und von dem Harz mit einem polaren organischen Lösungsmittel eluiert wird. A42125 wird abgetrennt und weiter gereinigt durch anerkannte Verfahren wie zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie.
Da Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 ein neu entdeckter Stamm ist, bezieht sich die Erfindung weiterhin auf eine biologisch gereinigte Kultur dieses Mikroorganismus.
Die beigefügte Zeichnung zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von A42125 in KBr.
Es besteht ein ständiger Bedarf nach verbesserten Antibiotika auf dem Veterinärgebiet. Die Förderung des Wachstums von Tieren ist ein Ziel bei solchen Antibiotika. Die Förderung des Wachstums wird erreicht, indem das Auftreten von Krankheiten reduziert wird und die Futterverwertungseffizienz erhöht wird. Die Förderung des Wachstums bei Wiederkäuern, wie zum Beispiel Vieh und Schafen, ist von besonderem kommerziellem Interesse.
Bei Wiederkäuern bauen Mikroorganismen im Pansen des Tieres Kohlenhydrate ab, wobei Verbindungen gebildet werden, die metabolisiert werden können, zum Beispiel Propionate. Bestimmte Mikroorganismen beeinflussen jedoch die Effizienz dieses Systems negativ. Zum Beispiel vermindern Methanogene oder Methan produzierende Mikroorganismen die Effizienz der Futterverwertung bei Wiederkäuern. Ein besonderer Vorteil von A42125 ist es, daß es Methan erzeugende Mikroorganismen hemmt und damit verwendet werden kann, um das Wachstum bei Wiederkäuern zu fördern.
Obwohl sie im Panserverdauungsystem unerwünscht sind, leisten die Methan erzeugenden Mikroorganismen (Archaebakterien) einen wichtigen Beitrag zur Umwelt, da sie die Endstufe katalysieren, in der Abfallbiomasse zu Methan zersetzt wird. Weiterhin kann Methan nützlich werden als Brennstoff, was dazu beiträgt, Probleme mit Energiereserven zu lösen. Somit sind Methanbildner und Verfahren zur Erhöhung der Methanerzeugung wichtig.
Eine Lösung, um die Methanproduktion zu erhöhen, ist es, ein genetisches Austauschsystem bei Methanbildnern zu entwikkein. Um dies zu erreichen, sind selektierbare Merkmale, wie zum Beispiel Antibiotikaresistenz, wesentlich. Solche Merkmale werden normalerweise gefunden, indem man Mutanten selektiert, die gegenüber einem Antibiotikum resistent sind, das normalerweise den Mikroorganismus abtötet. Leider sind Methanbildner natürlicherweise resistent gegenüber den meisten Antibiotika. Somit sollte die Tatsache, daß A42125 Methanbildner inhibiert, es nützlich machen, um ein selektierbares Merkmal zu haben, um den genetischen Austausch bei Methanbildnern zu erleichtern.

Eigenschaften von A42125

Das Antibiotikum A42125 hat die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:
Zustand: weiße Kristalle (aus Wasser);
Schmelzpunkt: 149-150ºC;
UV: keine Absorption;
IR (KBr): siehe beigefügte Zeichnung; zeigt eine Absorption bei den folgenden Frequenzen (cm&supmin;¹): breiter Peak der einschließt 3423, 3413, 3409, 3403, 3398 und 3386; 2937, 1720, 1602, 1453, 1408, 1379, 1290, 1192, 1120, 1090, 1064, 971, 870, 830 und 802;
Titration (80% wäßriges Dimethylformamid): pKa's 5,2, 8,7 und 10,5;
Molekulargewicht: 2032 (Felddesorptionsmassenspektrometrie);
Empirische Formel: C&sub1;&sub0;&sub1;H&sub1;&sub8;&sub4;N&sub2;O&sub3;&sub8;
Elementaranalyse:
Element Gefunden %
Kohlenstoff 59,51
Wasserstoff 9,05
Stickstoff 1,44
Sauerstoff 30,08
Aminosäuren: keine gefunden;
Löslichkeit: löslich in Wasser;
Bioautographie: Unter Verwendung von Whatman Nr. 1 Papier imprägniert mit 0,95N Na&sub2;SO&sub4; und 0,05 Na&sub2;SO&sub4; H&sub2;O, einem Lösungsmittelsystem mit 80% wäßrigem Ethanol enthaltend 1,5% NaCl und Detektion mit Micrococcus luteus, hatte A42125 einen Rf-Wert von ungefähr 0,46.
Bezogen auf die Titrationseigenschaften scheint es, daß A42125 eine Carboxylgruppe, eine Aminfunktion und eine Phenolgruppe haben könnte, die Salze bilden können.
Solche Salze wären nützlich zur Abtrennung, Reinigung und Freisetzung des Antibiotikums. A42125-Salze sind deshalb Teil der Erfindung. Die pharmazeutisch annehmbaren Salze sind besonders nützlich. Beispiele für geeignete Salze sind die Alkali-, Erdalkali-, Amin- und Säureadditionssalze.
Beispielhafte und geeignete Alkali- und Erdalkalisalze schließen die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Rubidium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze ein. Geeignete Aminsalze schließen die Ammonium- und die primären, sekundären und tertiären C&sub1;-C&sub4;-Alkylammonium- und Hydroxy-C&sub2;-C&sub4;-alkylammoniumsalze ein. Beispielhafte Aminsalze schließen solche ein, die durch Reaktion von A42125 mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, sec-Butylamin, Isopropylamin, Diethylamin, Diisopropylamin, Ethanolamin, Triethylamin, 3-Amino-1-propanol und dergleichen gebildet werden.
Beispielhafte Säureadditionssalze schließen solche Salze ein, die gebildet werden durch Standardreaktionen sowohl mit organischen als auch anorganischen Säuren wie zum Beispiel Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamosäure, Schleimsäure, D- Glutaminsäure, d-Kampfersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Pikrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und dergleichen Säuren.
In der Veterinärpharmazeutik ist die Form eines Antibiotikums normalerweise nicht von großer Bedeutung, wenn ein Tier mit einem Antibiotikum behandelt wird. In den meisten Fällen verändern die Bedingungen innerhalb des Tiers das Arzneimittel in eine andere Form als die, in der es verabreicht wird. Die Salzform, in der es verabreicht werden kann, ist deshalb nicht allgemein von großer Bedeutung. Die Salzform kann jedoch ausgewählt werden aus Gründen der Wirtschaftlichkeit, Einfachheit und Toxizität.
Das Antibiotikum A42125 wird hergestellt durch Züchten eines A42125-produzierenden Stammes von Nocardia aerocolonigenes unter aeroben Submersbedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, bis wesentliche Antibiotikaaktivität erzeugt wird. A42125 kann gewonnen werden unter Verwendung verschiedener Isolations- und Reinigungsverfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind.
Der neue Nocardia aerocolonigenes Stamm, der für die Herstellung des Antibiotikums A42125 geeignet ist, wurde isoliert aus einer Bodenprobe aus Brasilien. Der Einfachheit halber wird er bei der Beschreibung des N. aerocolonigenes-Stammes als A42125-Kultur bezeichnet.
Taxonomische Untersuchungen dieses Organismus wurden durchgeführt von Frederick P. Mertz in dem Lilly-Entwicklungslaboratorium. Auf Basis dieser Untersuchungen wird der Organismus klassifiziert als neuer Stamm von Nocardia aerocolonigenes (Shinobu und Kawato) Pridham and Lyons 1970 (T.G. Pridham, "New Names and New Combinations in the Order Actinomycetales Buchanan 1917", USDA Tech. Bull. No. 1424:32, Agricultural Research Service, USDA, Washington, D.C., 1970). Diese Klassifikation basiert auf gleichzeitigen Laborvergleichen ebenso wie auf einer Untersuchung von veröffentlichten Beschreibungen ähnlicher Arten [M. Goodfellow und K.P. Schaal, "'Identification Methods for Nocardia, Actinomadura and Rhodococcus", in F.A. Skinner und D.W. Lovelock, Herausgeber, "Identification Methods for Microbiologists", 2. Ausgabe, Society for Applied Bacteriology Technical Series No. 14, Academic Press, Inc., New York, 1979, S. 261; R.E. Gordon, S.K. Mishra und D.A. Barnett, "Some Bits and Pieces of the Genus Nocardia: N. carnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis and N. aerocolonigenes", J. Gen. Microbiol. 109, 69-78 (1978); S.J. Mishra, R.E. Gordon und D.A. Barnett, "Identification of Nocardiae and Streptomycetes of Medical Importance", J. Clin. Microbiol. 11(6), 728-736 (1980); H. Mordarska und M. Mordarski, "Chemotaxonomic Characters and Classification of Some Nocardioform Bacteria", J. Gen. Microbiology 71; 77-86 (1972); R.C. Pittenger und R.B. Brigham, "Streptomyces orientalis, n.sp., the Source of Vancomycin", Antibiotics and Chemotherapy VI(11); 642-647 (1956); und S.A. Waksman, "The Actinoinycetes, Vol. II", The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961.]

Verwendete Verfahren

Das von International Streptomyces Project (ISP) für die Charakterisierung von Streptomyces-Arten empfohlene Verfahren [E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16(3), 313-340 (1966)] wurde durchgeführt mit bestimmten ergänzenden Tests (D.J. Blazevic und G.M. Ederer, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, Inc., New York, 1975).
Verfahren, die für die Charakterisierung von Nocardia- Arten von Gordon et al. empfohlen wurden [R.E. Gordon, D.A. Barnett, J.E. Handerhan und C.H. Pang, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the Nocardin Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974)], wurden angewendet.
Die Resistenz gegenüber Rifampin und Lysozym wurde gemessen mit Verfahren, wie sie von Gordon und Barnett empfohlen wurden [R.E. Gordon und D.A. Barnett, "Resistance to Rifampin and Lysozyine of Strains of Some Species of Mycobacterium and Nocardia as a Taxonomic Tool", Int. J. Syst. Bacteriol. 27(3), 176-178 (1977)].
ICSS-NBS Centroid Color Charts, Standardprobe Nr. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) und das Color Harmony Manual (4. Ausgabe, Colar Standards Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) wurden verwendet, um Farbnamen zuzuordnen.
Die Morphologie wurde untersucht unter Verwendung eines Lichtmikroskops. Ein Rasterelektronenmikroskop (SEM) wurde verwendet, um das Oberflächenmuster der Sporen zu untersuchen.
Die Melanoidpigmentproduktion (Chromogenizität) wurde bestimmt mit ISP Nr. 1 (Trypton-Hefeextrakt-Brühe), ISP Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar), ISP Nr.7 (Tyrosin-Agar) und modifiziertem ISP Nr. 7, bei dem das Tyrosin entfernt wurde.
Die Isomeren der Diaminopimelinsäure (DAP) und die Kohlenhydrate in den Hydrolysaten der vollständigen Zellen wurden bestimmt mit chromatographischen Verfahren gemäß Becker et al. [B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon und H.A. Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)] und gemäß Lechevalier [M.P. Lechevalier, "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance", J. Lab. Clin. Med. 71, 934-944 (1968)].
Mycolsäuren wurden bestimmt durch ein Verfahren auf der Basis von Techniken, wie sie beschrieben wurden von Minnikin [D.E. Minnikin, I.G. Hutchinson und A.B. Caldicott, "Thin-layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-containing Bacteria", J. Chromatography 188, 221-233 (1980)].
Die Stärkehydrolyse wurde bestimmt, indem die Gegenwart von Stärke mit Iod auf ISP Nr. 4 (anorganische Salze-Stärke-Agar) Platten untersucht wurde (siehe Blazevic und Ederer, oben).
Die NaCl-Toleranz wurde gemessen, indem NaCl zu ISP Nr. 2 Agar zugegeben wurde, um die gewünschte Konzentration einzustellen und die Platten 14 Tage bei 30º inkubiert wurden.
Die Resistenz gegenüber Antibiotika wurde gemessen, indem mit Antibiotikum getränkte Scheiben auf die Oberfläche von beimpften ISP Nr. 2 Agar-Platten gelegt wurden.
Phosphatase und Urease wurden bestimmt durch Verfahren, wie sie bei Blazevic und Ederer, oben, beschrieben wurden. Die Gelatineverflüssigung wurde verwendet, um die Proteinaseaktivität zu bestimmen.

Kultureigenschaften

Das Wachstum von A42125 war allgemein gut sowohl auf komplexen als auch auf definierten Agarmedien. Ein Luftmycel wurde erzeugt auf allen Agars mit Ausnahme des Hefe-Dextrose- Agars. Die Farbe der Sporenmasse war in der Farbreihe grau bis weiß. Die nächstkommenden Farben im Tresner und Bachus System waren d hellgrau und b austerweiß. Die Farbe der Rückseite war gelblich braun bis gelblich weiß. Ein hellbraunes lösliches Pigment wurde in ISP Nr. 2 und Hefe-Dextrose-Agar erzeugt. Tabelle I faßt diese Kultureigenschaften zusammen. Tabelle I: Kultureigenschaften von A42125, N. aerocolonigenes und N. orientalis Medium Eigenschafta N. orientalis N. aerocolonigenes reichlich hellbraun gut austerweiß keine hellgrau fahlgelb keine (faltige Oberfläche) ziemlich Tabelle I - Fortsetzung Medium Eigenschafta N. orientalis N. aerocolonigenes Calciummalat Czapek's Lösungs-Agar Glucose-Asparagin Leitungswasser-Agar gut austerweiß keine hellgrau sehr hellbraun 92.y weiß ziemlich: b fahlgelb 75.deep yBr keine (faltige Oberfläche) hellgelb bis braun Tabelle I - Fortsetzung Medium Eigenschafta N. orientalis N. aerocolonigenes Hefe-Dextrose-Agar reichlich keine (faltige Oberfläche) hellbraun fahlgelb aG = Wachstum; R = Rückseite; Am = Luftmycel; Sp = lösliches Pigment

Morphologische Eigenschaften

Die Kultur A42125 produziert ein umfangreiches Substrat und ein ziemlich gut entwickeltes Luftmycel. Wenn die Lufthyphen unter dem Lichtmikroskop betrachtet wurden, sahen sie spinnwebenartig aus. Diese Morphologie wird klassifiziert in dem in Bergey's Manual beschriebenen, nicht die Streptomyceten betreffenden Bereich (R.E. Buchanan und N. E. Gibbons Eds., "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Ausgabe, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974).
Konidien wurden beobachtet, als die Lufthyphen von ISP Nr. 4 Agarmedium mit Rasterelektronenmikroskop untersucht wurden.
Es waren wenig Sporen da, die unregelmäßig geformt waren. Das Oberflächenmuster der Sporen war glatt [(T.G. Pridham, C.W. Hesseltine und R.C. Benedict, "A Guide for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups", Appl. Microbiol. 6; 52-79 (1957)].
Die Sporenform war länglich bis zylindrisch und es wurden Ketten gebildet von mehr als 50. Die Sporengröße lag im Bereich von 1,2 - 0,9 x 0,5 - 0,4 µm und durchschnittlich 1,1 x 0,5 µm.
Wenn unter Submersschüttelbedingungen gezüchtet wurde, trennten sich die Hyphen in Fragmente.

Physiologische Eigenschaften

Die Kultur A42125 zersetzte Kasein, Elastin, Guanin, Hypoxanthin und Tyrosin; hydrolysierte Calciummalat, DNA, Äsculin und Stärke; bildete Säure aus Arabinose, Cellobiose, Fructose, Galactose, α-Methyl-D-glycosid, Glucose, Glycerin, Inosit, Lactose, Maltose, Mannit, Mannose, Melibiose, Raffinose, Rhamnose, Trehalose und Xylose; verwertete Acetat, Benzoat, Citrat, Malat, Oxalat, Propionat, Pyruvat, Succinat und Tartrat.
Die Kultur A42125 erzeugte Katalase, Phosphatase, Proteinase, Urease und Melanoidpigmente; war nicht resistent gegenüber Rifampin, aber resistent gegenüber Lysozym, Cephalothin, Gentamicin, Lincomycin, Penicillin und Tobramycin.
Die Kultur A42125 tolerierte bis zu 6% NaCl und wuchs bei Temperaturen zwischen 15 und 37ºC; sie konnte nicht überleben, wenn sie 8 Stunden lang einer Temperatur von 50ºC ausgesetzt wurde, konnte weder Magermilch hydrolysieren noch Nitrate zu Nitriten reduzieren. Diese physiologischen Eigenschaften sind in den Tabellen II und III gezeigt. Tabelle II: Einige morphologische und physiologische Eigenschaften von A42125 und verwandten Nocardia-Stämmena Eigenschaft N. aerocolonigenes N. orientalis N. brasiliensis Lufthyphen Konidien Säurefest Mycolsäuren in Zellwänden Urease Zersetzt: Adenin Casein Elastin Hypoxanthin Tyrosin Xanthin Resistenz gegenüber: Lysozym Rifampin Hydrolysiert: Calciummalat Äsculin Hippurat Stärke Verwertet: Benzoat Citrat Mucat Succinat Tartrat Reduziert Nitrat Überlebt bei 50ºC, 8 Stunden Tabelle II - Fortsetzung Eigenschaft N. aerocolonigenes N. orientalis N. brasiliensis Bildet Säure aus: Adonit 1-(+)-Arabinose Cellobiose i-Erythritol Glucose Glycerin Inosit α-Lactose Maltose D-Mannit D-Mannose Melezitose Melibiose α-Metylglucosid Raffinose Rhamnose Sorbit Trehalose Xylose Wächst bei: a + = hat die Eigenschaft; - = hat die Eigenschaft nicht Tabelle III: Zusätzliche Eigenschaften von A42125 Eigenschaft Merkmala Phosphatase Hydrolysiert Magermilch Melanoidpigmentproduktion Gelatineverflüssigung NaCl-Toleranz % Katalase Zersetzt: Chitin DNA Guanin Keratin Testosteron Verwertet: Acetat Malat Oxalat Propionat Pyruvat Bildet Säure aus: Dulcit Ethanol Fructose d-(+)-Galactose Inulin Salicin Saccharose Temperaturbereich für das Wachstum a + = Stamm hat die Eigenschaft; - = Stamm hat die Eigenschaft nicht

Zellwandanalyse

Hydrolysierte ganze Zellen enthielten das meso-Isomer der Diaminopimelinsäure. Die in Gesamtzellhydrolysaten vorhandenen Zucker waren Arabinose, Galactose, Mannose und Ribose. Die Zellwandart gemäß Becker, oben, war Typ IV und das Zuckermuster war Typ A (Lechevalier, oben). Es wurden von A42125 keine Mycolsäuren (LCN-A) produziert. Die Zellen färbten sich grampositiv, waren aber nicht säurefest.

Identität von Stamm A42125

Der Stamm A42125 hat eine Typ IV-Zellwand, ein Typ A-Gesamtzellzuckermuster und enthält keine Mycolsäuren (LCN-A). Diese chemotaxonomische Information und die allgemeinen Kultureigenschaften stimmen überein mit der Zuordnung von Stamm A42125 zu der Gattung Nocardia Trevisan 1889 [V.B.D. Skerman, V. McGowan und P.H.A. Sneath, Eds., "Approved Lists of Bacterial Names", Int. J. Syst. Bacteriol. 30; 225-420 (1980)].
Ein Vergleich der Eigenschaften von Stamm A42125 mit den veröffentlichten Beschreibungen von Nocardia-Arten zeigte Ähnlichkeit mit folgenden Arten:
Nocardia aerocolonigenes a,b
Nocardia brasiliensis a,b
Nocardia orientalis a,b,c
a Goodfellow und Schaal, oben
b Gordon, Mishra und Barnett, oben
c Pittenger und Brigham, oben
Diese Kulturen wurden gleichzeitig mit Stamm A42125 gezüchtet. Die veröffentlichten Daten und die Versuchsdaten wurden vereinigt und die Ergebnisse ausgewertet.
Ähnlichkeitskoeffizienten wurden berechnet, wie bei Kurylowicz et al. diskutiert (W. Kurylowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski und T. Szulga, "Numerical Taxonomy of Streptomycetes", Polish Medical Publishers, Warschau, 1975, S. 37), unter Verwendung der folgenden Gleichung:
worin Ns&spplus; die Anzahl positiver Übereinstimmungen, Ns&supmin; die Anzahl negativer Übereinstimmungen und Nd die Anzahl von Ungleichheiten (Unterschieden) ist.
Die Eigenschaften, die verwendet werden um SSM zu berechnen, waren physiologische Eigenschaften und nicht Kultur- oder morphologische Eigenschaften. Die Gesamtazahl von Eigenschaften war 44.
Die Ähnlichkeitskoeffizienten sind unten angegeben: Kultur N. aerocolonigenes N. orientalis N. brasiliensis
Weil N. brasiliensis kulturmäßig wenig Ähnlichkeit mit A42125 hatte und einen niedrigen SSM-Wert hatte, wurde er von der Betrachtung ausgeschlossen.
N. orientalis hatte ähnliche Kultureigenschaften wie A42125. Diese Ähnlichkeit ist besonders deutlich auf den ISP- Medien Nr. 3 und 4. Er wurde jedoch von den Überlegungen ausgeschlossen, weil die physiologischen Eigenschaften nicht ähnlich waren, wie durch den niedrigen SSM-Wert angedeutet.
N. aerocolonigenes hat keine Lufthyphen. Deshalb konnte ein Kulturvergleich von A42125 nur auf Basis von Wachstum, Farbe der Rückseite und löslichen Pigmenten gemacht werden. Als N. aerocolonigenes zuerst beschrieben wurde [E.B. Shirling und D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces 111", Int. J. Syst. Bacteriol. 18(4); 279-392 (1968)], wurde berichtet, daß er weiße Lufthyphen auf ISP Nr. 5 hat. Dieser Bericht stimmt überein mit Beobachtungen in den gleichzeitigen Vergleichsuntersuchungen (siehe Tabelle I, ISP Nr. 5). Das Wachstum und die Farbe der Rückseite von A42125 und N. aerocolonigenes stimmen annehmbar überein. Diese Übereinstimmung wird besonders gut auf Czapek's Lösungs-Agar und Glucose-Asparagin-Agar gezeigt.
Gordon, oben, klassifizierte Stämme von N. aerocolonigenes unter Verwendung anderer Eigenschaften als der Lufthyphen. Die physiologischen und chemotaxonomischen Ähnlichkeiten zwischen A42125 und N. aerocolonigenes wogen bei weitem die Unterschiede aufgrund der Abwesenheit von Lufthyphen auf. Drei Schlüsseleigenschaften wurden von Gordon angegeben, um N. orientalis von N. aerocolonigenes zu unterscheiden. Ein Vergleich dieser Eigenschaften mit denen von A42125 ist in Tabelle IV aufgelistet: Tabelle IV: Vergleich unterscheidender Eigenschaften von A42125, N. orientalis und N. aerocolonigenes Eigenschaft a N. orientalis N. aerocolonigenes Erythrit α-Methylglucosid Resistenz gegenüber Lysozym a + = Stamm hat die Eigenschaft - = Stamm hat die Eigenschaft nicht
Eine Untersuchung dieser Indikatoren zeigt, daß A42125 am nächsten mit N. aerocolonigenes verwandt ist.
A42125 und N. aerocolonigenes unterscheiden sich in der Kohlenstoffverwertung (gemessen durch Wachstum und Säureproduktion) nur bei einer Kohlenhydratquelle.
Unter Verwendung des von Mishra, oben, aufgestellten Schlüssels für die versuchsweise Identifizierung von Nocardia- Arten paßte Kultur A42125 direkt zu N. aerocolonigenes. Diese Vergleiche zeigen, daß A42125 eine begrenzte Kulturähnlichkeit und gute physiologische Ähnlichkeit mit N. aerocolonigenes hat. Der wesentlichste Unterschied ist die Gegenwart von Lufthyphen bei A42125. Da es bekannt war, daß N. aerocolonigenes Lufthyphen produziert, wird dieser Unterschied nicht als ausreichend betrachtet, um A42125 von diesem Taxon auszuschließen. Deshalb wird Kultur A42125 als Stamm von Nocardia aerocolonigenes (Shinobu und Kawato) Pridham und Lyons 1970 klassifiziert. Weil N aerocolonigenes jedoch nicht in der zugelassenen Liste von Bakteriennamen, oben, steht, ist es keine gültig veröffentlichte Art.
Wie im Fall von anderen Organismen, unterliegen die Eigenschaften der A42125-produzierenden Kultur, Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049, Veränderungen. Rekombinanten, Mutanten oder Varianten des Stammes können mit bekannten Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel können Mutanten erhalten werden durch Behandlung mit verschiedenen bekannten physikalischen und chemischen Mutagenen wie zum Beispiel Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und Chemikalien wie N-Methyl-N'- nitro-N-nitrosoguanidin. Alle natürlichen und induzierten Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Nocardia aerocolonigenes, die die Eigenschaft dar A42125-Produktion behalten, sind Teil der Erfindung.
Das Kulturmedium, das verwendet wird, um Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049 zu züchten, kann irgendeines aus einer Anzahl von Medien sein. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit bei der Herstellung, einer optimalen Ausbeute und der Leichtigkeit der Produktisolierung sind jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Zum Beispiel sind für N. aerocolonigenes bevorzugte Kohlenhydratquellen bei der Fermentation in großem Maßstab Glucose und Dextrine, obwohl andere Zucker oder Zuckerpolymere und dergleichen auch verwendet werden können.
Bevorzugte Stickstoffquellen für N. aerocolonigenes sind Sojagrütze und Maiseinweichwasser, obwohl andere Stickstoffquellen wie Schlempe, Hefeextrakt, Fleischextrakt und dergleichen auch verwendet werden können.
Beispiele für die anorganischen Nährsalze, die vorteilhafterweise in das Kulturmedium eingebracht werden können, sind die üblichen löslichen Salze, die Zink-, Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat- und dergleichen Ionen liefern können.
Essentielle Spurenelemente, die notwendig sind für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus, sollten auch in das Kulturmedium eingeschlossen werden. Solche Spurenelemente treten normalerweise als Verunreinigungen in anderen Substituenten des Mediums auf in solchen Mengen, die ausreichen, um den Wachstumserfordernissen des Organismus zu genügen. Schäumen ist normalerweise kein Problem, aber geringe Mengen (d.h. 0,2 ml/l) eines Antischaummittels wie Polypropylenglykol können zugegeben werden zu Fermentationsmedien in großem Maßstab, falls erforderlich.
Für die Herstellung wesentlicher Mengen des Antibiotikums A42125 ist die aerobe Submersfermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen an A42125 können durch Schüttelflaschenkultur erhalten werden. Wegen der Zeitverschiebung bei der Antibiotikaproduktion, die normalerweise mit der Beimpfung großer Tanks mit der Sporenform des Organismus verbunden ist, ist es bevorzugt, ein vegetatives Inokulum zu verwenden. Das vegetative Inokulum wird hergestellt, indem ein geringes Volumen des Kulturmediums mit der Sporenform oder Mycelfragmenten des Organismus beimpft wird, um eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus zu erhalten. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank überführt. Das Medium für das vegetative Inokulum kann dasselbe sein wie das, das für die größeren Fermentationen verwendet wird, aber andere Medien sind auch geeignet.
A42125 wird von Nocardia aerocolonigenes produziert, wenn er bei Temperaturen zwischen etwa 25 und etwa 37ºC gezüchtet wird. Eine gute Temperatur für die A42125-Produktion scheint etwa 30ºC zu sein.
Wie bei aeroben Submerskulturverfahren üblich, wird sterile Luft vom Boden her in das Gefäß geblasen, während das Medium mit üblichen Turbinenmischern gerührt wird. Unter den bisher verwendeten Bedingungen überschreitet die maximale Sauerstoffaufnahme bei der Fermentation den Wert von etwa 0,2 mM/l/Minute nicht. In einem vollständig unterteilten 165-l-Fermenter, der etwa 115 l Brühe enthält, ist eine Belüftungsrate von 0,125 V/V/m mit einer Rührrate von 200 bis 250 Upm ausreichend, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff bei oder über 30% Luftsättigung zu halten.
Die Produktion des Antibiotikums A42125 kann während der Fermentation verfolgt werden, indem Proben der Brühe auf Antibiotikaaktivität getestet werden gegenüber Organismen, von denen bekannt ist, daß sie gegenüber dem Antibiotikum empfindlich sind. Ein Testorganismus, der zum Testen der Gegenwart von A42125 geeignet ist, ist Micrococcus luteus. Der Bioassay wird in geeigneter Weise durchgeführt mit dem Agartüpfelplattentest.
Nach der Produktion unter aeroben Submersfermentationsbedingungen kann A42125 aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden mit Verfahren, wie sie auf dem Gebiet der Fermentation verwendet werden. Die während der Fermentation der A42125-produzierenden Organismen erzeugte Antibiotikaaktivität erscheint hauptsächlich in der Brühe. Eine maximale Gewinnung an A42125 wird daher erreicht, wenn das Medium zuerst filtriert wird, um die Brühe von der Mycelmasse abzutrennen. Die gefilterte Brühe kann dann gereinigt werden, um A42125 abzutrennen. Eine Vielzahl von Techniken kann für diese Reinigung verwendet werden.
Eine bevorzugte Technik zur Abtrennung von A42125 von der gefilterten Brühe besteht darin, daß man die Brühe auf einen pH von etwa 7 einstellt, ein geeignetes Adsorbens zugibt, zum Beispiel Diaion HP-20 Harz. Das Harz wird durch Filtration abgetrennt und mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel Acetonitril:Wasser (1:1), extrahiert. Das extrahierende Lösungsmittel kann dann im Vakuum verdampft werden, was A42125 ergibt.
Das auf diese Weise erhaltene A42125 kann weiter gereinigt werden mit anerkannten Verfahren. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Ionenaustauschchromatographie.
Die Abtrennung des Antibiotikums A42125 kann über Dünnschichtchromatographie (DC) verfolgt werden. Ein übliches Silicagel-DC-Lösungsmittelsystem ist Acetonitril:Methanol:Wasser: Ammoniumhydroxid (4:2:2:1). In diesem System hat A42125 einen Rf-Wert von ungefähr 0,43. Das Antibiotikum kann durch Bioautographie nachgewiesen werden, zum Beispiel unter Verwendung von Micrococcus luteus, oder mit anderen Methoden, zum Beispiel mit Vanillin-Schwefelsäure als Sprühreagenz.
Alternativ können die Kulturfeststoffe einschließlich der Mediumbestandteile und des Mycels ohne Extraktion oder Abtrennung verwendet werden, aber vorzugsweise nach Entfernung des Wassers, als Quelle für A42125. Zum Beispiel kann nach der Erzeugung von A42125 die gesamte Fermentationsbrühe durch Lyophilisierung, Walzentrocknung oder azeotrope Destillation und Trocknung getrocknet werden. Die getrocknete Brühe wird dann direkt in die Futtervormischung gemischt.
A42125 hemmt das Wachstum von Bakterien, die für Tiere und Pflanzen pathogen sind. Tabelle V listet die minimale Hemmkonzentration (MIC) auf, bei der A42125 verschiedene Bakterien hemmt, die mit üblichen Agarverdünnungstests gemessen wurde. Tabelle V: Antibakterielle Aktivität von A42125 Testorganismus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Epi Streptococcus pyogenes Streptococcus sp. Gruppe Haemophilus influenzae
Ein wesentlicher Aspekt bei antimikrobiellen Aktivität von A42125 betrifft die Aktivität gegenüber anaeroben Bakterien. MIC-Werte, bei denen A42125 verschiedene anaerobe Bakterien hemmt, bestimmt durch Standardagarverdünnungstest, sind in Tabelle VI aufgelistet. Die Endpunkte wurden nach 24-stündiger Inkubation abgelesen. Tabelle VI: Empfindlichkeit von anaeroben Bakterienisolaten gegenüber A42125 Anaerobe Bakterien Clostridium difficile Clostridium perfringens Clostridium septicum Eucobacterium aerofaciens Peptococcus asaccharolyticus Peptococcus prevoti Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus intermedius Propionibacterium acnes Bacteroides fragilis Bacteroides thetaiotaomicron Bacteroides melaninogenicus Bacteroides vulgatis Bacteroides corrodens Fusobacterium symbiosum Fusobacterium necrophorum
Gemäß einem weiteren wesentlichen Aspekt der antimikrobiellen Aktivität hemmt A42125 Methan erzeugende Bakterien. Zum Beispiel hemmte A42125 Methanococcus vannielli in Konzentrationen von nur 0,1 µg/ml in einem Test, bei dem ein Kristall A42125 auf einen 24-Stunden-Rasen (Minimalmedium) gebracht wurde und die Hemmung nach 3 Tagen gemessen wurde.
Eine weitere wesentliche Eigenschaft von A42125 ist die Fähigkeit, die Futterverwertungseffizienz bei Tieren zu verbessern. Zum Beispiel verbessert A42125 die Futterverwertungseffizienz bei Wiederkäuern, die eine entwickelte Pansenfunktion haben.
Die Effizienz der Futterverwertung kann überwacht werden, indem die Produktion und Konzentration von Propionatverbindungen im Pansen beobachtet wird. Die Pansenflüssigkeit wurde erhalten von einem Ochsen, der eine chirurgisch gesetzte Fistelöffnung in den Pansen hatte. Der Ochse erhielt eine hochwertige Kornration, deren Zusammensetzung wie folgt war:
69,95 % grob gemahlener Mais
10 % gemahlene Maiskolben
8 % Sojamehl (50% Protein)
5 % Alfalfamehl
5 % Melasse
0,6 % Harnstoff
0,5 % Dicalciumphosphat
0,5 % Calciumcarbonat
0,3 % Salz
0,07 % Vitamin A und D&sub2; Vormischung
0,05 % Vitamin E Vormischung
0,03 % Spurenmineralvormischung
Eine Probe der Pansenflüssigkeit wurde durch 4 Schichten Seihtuch durchlaufen gelassen und das Filtrat wurde in einer Vakuumflasche gesammelt. Das teilchenförmige Material, das von dem Seihtuch zurückgehalten wurde, wurde in ausreichend physiologischem Puffer resuspendiert, bis das Ursprungsvolumen der Pansenflüssigkeit wieder erhalten wurde, und die Suspension wurde wiederum durch das Seihtuch durchlaufen gelassen. Der verwendete Puffer ist unten beschrieben:
0,316 g/l Na&sub2;HPO&sub4;
0,152 g/l KH&sub2;PO&sub4;
2,260 g/l NaHCO&sub3;
0,375 g/l KCl
0,375 g/l NaCl
0,112 g/l MgSO&sub4;
0,038 g/l CaCl&sub2;
0,008 g/l FeSO&sub4; 7H&sub2;O
0,004 g/l MnSO&sub4;
0,004 g/l ZnSO&sub4; 7H&sub2;O
0,002 g/l CuSO&sub4; 5H&sub2;O
0,001 g/l CoCl&sub2;
Cheng et al., J. Dairy Sci. 38, 1225 (1955)
Die zwei Filtrate wurden in einem Scheidetrichter vereinigt und stehengelassen, bis teilchenförmiges Material nach oben schwamm. Die klare Phase wurde dann abgetrennt und 1:1 mit demselben Puffer verdünnt und auf einen pH von 7,0 eingestellt.
10 ml der verdünnten Pansenflüssigkeit wurden in einen 25-ml-Kolben gebracht mit 40 mg der oben gezeigten Beschickung. 5 mg Sojaprotein wurden dem Kolben auch zugegeben. Die zu behandelnde Verbindung wurde in jeden Testkolben eingewogen. Pro Behandlung wurden jeweils 4 gleiche Kolben verwendet. Zwei Reihen mit jeweils 4 Kontrollkolben wurden auch verwendet. Eine Nullzeitkontrolle wurde verwendet und auch eine 16 Stunden inkubierte Kontrolle. Alle Testkolben wurden 16 Stunden bei 38ºC inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde der pH gemessen und 2 ml 25% Metaphosphorsäure wurden zu jedem Kolben zugegeben. Die Proben wurden absetzen gelassen. Der Überstand wurde durch gaschromatographische Methoden auf flüchtige Fettsäuren analysiert.
Es wurden Analysen auf Acetat-, Propionat- und Butyratverbindungen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden statistisch verglichen mit den Ergebnissen von Analysen der Kontrollkolben. Behandlungen, bei denen die Propionatproduktion wesentlich höher ist als bei den Kontrollen, werden als aktive Behandlungen angesehen. Tabelle VII zeigt das Verhältnis der Konzentration an flüchtigen Fettsäuren (VFA) in mit A42125 behandelten Kolben zu der Konzentration in Kontrollkolben in diesen Tests. Tabelle VII: Wirkung von A42125 auf die Futterverwertungseffizienz von Wiederkäuern a Dosierung µg/ml Mol-% Propionat Mol-% Acetat Mol-% Butyrat Gesamt VFA/Kontroll VFA mM/l a fünf Tests
Die Methanhemmung trägt auch zu einer höheren Futterverwertungseffizienz bei Wiederkäuern bei, indem das Acetat in verwertbare Energie anstelle von Methan umgewandelt wird, das ausgetrieben wird. Diese Aktivität kann gemessen werden unter Verwendung eines in vitro Tests, der die Wirkung des Pansens simuliert. Dieser Test wurde durchgeführt in kontinuierlichen Fermentationskolben, die die Wirkung des Pansens über einen langen Zeitraum simulieren. Jeder Kolben war ein gasdichter Behälter mit Flüssigkeitseinlaßöffnungen, Feststoffeinlaßöffnungen, Entnahmeöffnungen und Gasauslaßröhrchen, die zu Kautschukblasen führten, die die Gase, die bei der Fermentation erzeugt wurden, aufnahmen. Das Flüssigkeitsvolumen in jedem Kolben wurde mit einem Überlaufrohr, das zu einem Flüssigkeitssammelgefäß führte, auf 500 ml kontrolliert. Die Temperatur der Kolben wurde auf 38 bis 40º gehalten. Jeder Kolben wurde mit einem Magnetrührer sanft gerührt.
Jeder Versuch wurde begonnen, indem in einen Kolben 500 ml durchgelaufene Pansenflüssigkeit gegeben wurde, die von einem mit Fistel versehenen Ochsen erhalten wurde, der dieselbe Diät, die in dem Test verwendet worden war, erhalten hatte. Der Sammelkolben für die austretende Flüssigkeit wurde mit 50 ml verdünnter Metaphosphorsäure vorbeladen, um die Fermentation in der aus dem Kolben überfließender Flüssigkeit zu stoppen. Der Kolben wurde abgedichtet und die Gassaminelblasen wurden befestigt.
Flüssigkeit wurde zu jedem Kolben kontinuierlich zugegeben, indem pro Tag 1 l eines Puffers mit einem pH von 6,8 bis 7,0 mit der folgenden Zusammensetzung eingetropft wurde:
Natriumhydrogenphosphat 2,2 g/l
Magnesiumchlorid 0,036
Natriumbicarbonat 5,9
Kaliumchlorid 0,34
Natriumchlorid 0,28
Harnstoff 1,0
Calciumchlorid 0,024
Die geeignete Nährlösung wurde zweimal täglich durch die Zuführöffnung in jedem Kolben zugegeben. Nach jeder Zuführung wurde die Gasauslaßöffnung geschlossen und der Kolben mit Kohlendioxid gespült.
Jeden Tag wurde die ausfließende Flüssigkeit gesammelt und analysiert und das Gas, das den Kolben verließ, wurde gesammelt und analysiert.
Die übliche Praxis war es, jeden Kolben 4 Tage zu betreiben, ohne daß eine Behandlungsverbindung der Nährlösung zugegeben wurde. Nach einem Zeitraum von 4 Tagen zur Equilibrierung wurde die Analyse der flüssigen und gasförmigen ausfließenden Komponenten begonnen und der Kolben wurde ohne Zugabe einer Behandlungsverbindung betrieben, bis die analytischen Daten relativ konstant wurden. Die Zugabe der behandelten Nährlösung in den Kolben wurde zu dem Zeitpunkt begonnen und der Kolben wurde mit der behandelten Nährlösung mindestens 7 Tage betrieben.
Die Verbindung wurde zu der Nährlösung in solcher Menge zugegeben, daß die Konzentration der Verbindung in dem 500-ml- Flüssigkeitsvolumen des Kolbens, die in Tabelle VIII unten gezeigt ist, erreicht wurde. In den meisten Tests wurden zwei Kolben pro Behandlungsmenge für jede Verbindung verwendet und die Daten beider Kolben für alle Behandlungstage wurden zusammengenommen und der Durchschnitt gebildet. Tabelle VIII zeigt die Methan inhibierende Aktivität von A42125. Tabelle VIII: Wirkung von A42125 auf die Mechanproduktion von Wiederkäuern a Dosierung µg/ml Methan mM/Tag a Drei Tests
Geschätzte LD&sub5;&sub0; nach einer Verabreichung einer Einzeldosis von A42125 an Mäuse:
LD&sub5;&sub0; (intraperitoneal) = < 9,375 mg/kg
LD&sub5;&sub0; (oral) = 89 mg/kg
A42125 ist typischerweise wirksam zur Erhöhung der Propionate und dadurch der Effizienz der Futterverwertung, wenn es an Wiederkäuer oral verabreicht wird in Raten von etwa 0,05 mg/kg/Tag bis etwa 6,75 mg/kg/Tag. Bevorzugte Verabreichungsraten sind etwa 0,2 mg/kg/Tag bis etwa 3,5 mg/kg/Tag.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung ist es, die Verbindung mit dem Tierfutter zu mischen, jedoch kann sie auch auf anderen Wegen verabreicht werden, zum Beispiel in Form von Tabletten, Beizen, Boli oder Kapseln. Die Formulierung dieser verschiedenen Dosierungsformen kann mit auf dem Gebiet der Veterinärpharmazeutik wohlbekannten Verfahren erreicht werden. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung enthalten, die direkt in Beziehung steht zu der richtigen täglichen Dosis für das zu behandelnde Tier.
Die Erfindung betrifft weiterhin Futterzusammensetzungen, die die Futterverwertung erhöhen können und eine Futterration und 6 bis 60 g pro Tonne A42125-Verbindung enthalten.
A42125 kann an Tiere oral oder parenteral verabreicht werden. Der praktischste Weg, um A42125 zu verabreichen, ist die Einarbeitung in das Futter. Eine Vielzahl von Futterarten einschließlich des üblichen Trockenfutters, flüssiger Futterarten und pelletisierter Futterarten kann verwendet werden. Obwohl das bevorzugte Verfahren der Verabreichung darin besteht, es mit dem Tierfutter zu mischen, kann es auch auf anderen Wegen verabreicht werden, zum Beispiel in Form von Tabletten, Beizen, Boli oder Kapseln. Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine Menge an A42125 enthalten, die direkt mit der richtigen täglichen Dosis für das zu behandelnde Tier in Beziehung steht.
Die Verfahren zur Formulierung von Arzneimitteln in Tierfutter sind wohlbekannt. Ein bevorzugtes Verfahren ist es, eine konzentrierte Arzneimittelvormischung herzustellen, die wiederum verwendet wird, um Arzneimittel enthaltendes Futter herzustellen. Typische Vormischungen können etwa 1 bis etwa 200 g Arzneimittel pro Pfund Vormischung enthalten. Vormischungen können entweder flüssige oder feste Präparate sein.
Die endgültige Formulierung des Futters für Tiere hängt ab von der zu verabreichenden Menge an Arzneimittel. Die üblichen Verfahren zur Formulierung, Mischung und Pelletisierung von Futter können verwendet werden, um Futter, das A42125 enthält, herzustellen.
A42125 kann für die parenterale Verabreichung mit auf dem Gebiet der Veterinärpharmazeutik anerkannten Verfahren formuliert werden. Wirksame injizierbare Zusammensetzungen, die A42125 enthalten, können entweder in Suspensions- oder Lösungsform sein. In der Lösungsform wird A42125 in einem physiologisch annehmbaren Träger gelöst. Solche Träger umfassen ein geeignetes Lösungsmittel, Konservierungsmittel wie Benzylalkohol, falls erforderlich, und Puffer. Geeignete Lösungsmittel schließen zum Beispiel Wasser, Alkohole, Glykole oder inerte Öle wie Pflanzenöle oder hochraffinierte Mineralöle ein.
Injizierbare Suspensionszusammensetzungen werden hergestellt unter Verwendung eines die Verbindung nicht lösenden Lösungsmittels mit Adjuvanzien als Träger. Das Nichtlösungsmittel kann zum Beispiel Wasser oder ein Glykol wie Polyethylenglykol sein.
Geeignete physiologisch annehmbare Adjuvanzien sind notwendig, um die Verbindung in der Suspensionszusammensetzung suspendiert zu halten. Die Adjuvanzien können ausgewählt werden aus Verdickungsmitteln, wie Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und Alginaten. Viele oberflächenaktive Mittel sind auch geeignet zur Suspendierung der Verbindungen. Lecithin, Alkylphenolpolyethylenoxidaddukte, Naphthalinsulfonate, Alkylbenzolsulfonate und Polyoxyethylensorbitanester sind geeignete Suspensionsmittel für flüssige Nichtlösungsmittel.
Viele Substanzen, die die Hydrophilizität, Dichte und Oberflächenspannung des flüssigen Nichtlösungsmittels beeinflussen, können dazu dienen, injizierbare Suspensionen in einzelnen Fällen herzustellen. Zum Beispiel können Silikon-Antischaummittel, Glykole, Sorbit und Zucker geeignete Suspensionsmittel sein.
Um die Erfindung näher zu erläutern, werden die folgenden Beispiele angegeben:

Beispiel 1

Herstellung des Antibiotikums A42125

A. Schüttelflaschenfermentation

Die Kultur Nocardia aerocolonigenes NRRL 18049, entweder in Form eines lyophilisierten Pellets oder als Suspension in flüssigem Stickstoff, wird verwendet, um ein Schrägagarmedium mit der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen: Schrägagarmedium Inhaltsstoff Menge (g/l) Kartoffeldextrin Hefeextrakt enzymhydrolysiertes Casein* Fleischextrakt Agar Deionisiertes Wasser q.s. * N-Z Amine A, Humko Sheffield Chemical Co., Lyndhurst NJ pH wird eingestellt auf 6,2 bis 7,0 mit NaOH
Der beimpfte Schrägagar wird bei 30ºC etwa 7 Tage inkubiert. Die reife Schrägagarkultur wird mit einem sterilen Werkzeug aufgekratzt, um die Sporen zu lockern und den Mycelrasen zu entfernen und zu mazerieren. Etwa 1/4 dar gelodkerten Sporen und so erhaltenes Kulturwachstum wird verwendet, um 50 ml eines vegetativen Mediums mit der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen: Vegetatives Medium Inhaltsstoff Menge (g/l) Glucose Tapioca-Dextrin* Sojagrütze Maiseinweichwasser Hefeextrakt Leitungswasser g.s. auf * Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur IL pH eingestellt auf ~5,5 bis 6,5 mit NaOH
Das beimpfte vegetative Medium wird etwa 72 Stunden in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben bei 30ºC inkubiert auf einem Schüttler, der sich in einem Kreis von 2 inch (5,08 cm) mit 250 Upm bewegt.
Das inkubierte vegetative Medium (1,25 ml) wird verwendet, um 50 ml eines Produktionsmediums mit der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen: Inhaltsstoff Menge (g/l Glucose Maisstärke lösliches Fleischpepton* enzymhydrolysiertes Casein ** Restmelasse Czapek's Mineralquelle*** Deionisiertes Wasser q.s. * O.M. Pepton, Amber Laboratories, Juneau WI ** N-Z Amin A *** Czapek's Mineralquelle hat die folgende Zusammensetzung: 100 g KCl; 100 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O; 2 g FeSO&sub4; 7H&sub2;O; q.s. auf 1 l mit deionisiertem Wasser
Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 250-ml- Weithals-Erlenmeyer-Kolben bei 30ºC 3 bis 5 Tage inkubiert auf einem Schüttler, der sich in Kreisen mit 2 inch bei 250 Upm bewegt.

B. Tankfermentation

Um ein großes Volumen Inokulum zu liefern, werden 10 ml inkubiertes vegetatives Medium, hergestellt wie in Abschnitt A. beschrieben, verwendet, um 250 ml eines Zweitstufenwachstumsmediums zu beimpfen, das dieselbe Zusammensetzung wie das vegetative Medium hat. Dieses Zweitstufenmedium wird in einem 2-l- Weithals-Erlenmeyer-Kolben etwa 70 Stunden bei 30ºC inkubiert auf einem Schüttler, der sich in Kreisen mit 2 inch bei 250 Upm bewegt.
Das so hergestellte inkubierte Zweitstufenmedium (400 ml) wird verwendet, um 100 l steriles Produktionsmedium zu beimpfen, das wie in Abschnitt A. beschrieben hergestellt wurde. Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 165 l gerührten Fermentationstank 3 bis 5 Tage bei einer Temperatur von 30ºC fermentieren gelassen. Eine niedrige Luftströmung (0,12 bis 0,25 V/V/m) und mäßige Upm (200 bis 250) in dem gerührten Gefäß halten einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff von mehr als 30% Luftsättigung aufrecht.

Beispiel 2

Isolierung von A42125

Die gesamte Fermentationsbrühe (92 l), die 3% Hyflo Supercel enthielt, wurde durch eine Filterpresse filtriert. Das Brühenfiltrat (74 l) wurde auf einen pH von 7 mit NaOH eingestellt. Diaion HP-20 Harz (9,4 l) wurden zugegeben. Die Mischung wurde 45 Minuten gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde verworfen und das Harz wurde dreimal mit Wasser (jeweils 10 l) und dreimal mit Acetonitril:Wasser (3:17, jeweils 10 l) gewaschen, indem es resuspendiert, gerührt und filtriert wurde. Die Waschlösungen wurden verworfen. A42125 wurde eluiert, indem das Harz in Acetonitril:Wasser (1:1, 10 l) suspendiert, gerührt und filtriert wurde. Vier aufeinanderfolgende Elutionen wurden durchgeführt und jede Eluatfraktion wurde getestet unter Verwendung eines Scheibenplattentests mit Micrococcus luteus. Die ersten zwei Eluate wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt, um das Acetonitril zu entfernen, und gefriergetrocknet, was 94,9 g rohes A42125 lieferte. Das dritte Eluat lieferte 20,8 g rohes A42125.

Beispiel 3

Reinigung und Kristallisierung von A42125

Die rohen A42125-Präparate, die in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden vereinigt (115,2 g) und in Wasser (3 l) gelöst. Die Lösung wurde filtriert, um Niederschlag zu entfernen, und das Filtrat wurde auf eine Säule aufgetragen, die 3 l Dowex 50 x 2 (NH&sub4;&spplus;), 100 bis 200 mesh Harz, enthielt. Die Säule wurde nacheinander mit 5 Säulenvolumina Wasser und 0,1N NH&sub4;OH gewaschen. Die Fraktionen der 2N NH&sub4;OH-Elution, die die größte Menge an A42125 enthielten, wurden vereinigt und auf ein Volumen von etwa 3 l eingeengt. A42125 fiel aus und wurde durch Filtration abgetrennt. Der Niederschlag wurde in Methanol (300 ml) gelöst und diese Lösung wurde zu Ether (6 l) zugegeben, um das A42125 auszufällen. Dieser Niederschlag wurde filtriert und getrocknet, was 16,6 g A42125 als amorphes Pulver lieferte. Ein zweiter Niederschlag wurde erhalten, indem die wäßrige Lösung weiter eingeengt wurde und in derselben Weise behandelt wurde, was 20,7 g weniger reines A42125 lieferte.
Das erste erhaltene A42125 (16,6 g) wurde in warmem Wasser (800 ml) gelöst. Diese Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und A42125 kristallisierte. Die Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt und im Vakuum getrocknet, was 10,6 g und 2,3 g (zweite Ernte) kristallines A42125 lieferte (Schmelzpunkt 149 bis 150ºC).

Beispiel 4

Mit A42125 angereicherte Viehration

Eine ausgewogene hoch-kornhaltige Ration angepaßt für Vieh wird hergestellt mit folgender Rezeptur: Inhaltsstoff Pfund/Tonne Mais, gelb Kolben, Mais Alfalfamehl, dehydratisiert, 17% Sojaschrot, lösungsmittelextrahiert Harnstoff, Futterqualität Melasse, Zuckerrohr Dicalciumphosphat Salz Calciumcarbonat Spurenmineralvormischung¹ Vitamin A + D3-Vormischung² Vitamin E-Vormischung³ ¹ Spurenmineralvormischung enthält: 2,50% Mangan als Mangan(II)oxid, 0,07% Iod als Kaliumiodid, 0,30% Kobalt als Kobaltcarbonat, 0,50% Kupfer als Kupferoxid und 20,00% Zink als Zinksulfat ² Jedes Pfund Vitamin A und D3-Vormischung enthält 2 000 000 USP-Einheiten Vitamin A und 225 750 USP-Einheiten Vitamin D3 ³ Jedes Pfund Vitamin E-Vormischung enthält 20 000 IT Vitamin E

Claims

1. Antibiotikum A42125 mit den folgenden Eigenschaften:

Zustand: Weiße Kristalle (aus Wasser);

Schmelzpunkt: 149 - 150ºC;

UV: Keine Absorption;

IR (KBr): Gezeigt in der beigefügten Figur;

Titration (80% wässriges Dimethylformamid):

pKa's 5,2, 8,7 und 10,5;

Molekulargewicht: 2032 (Feld-Desorptions- Massenspektrometrie);

Empirische Formel: C&sub1;&sub0;&sub1;H&sub1;&sub8;&sub4;N&sub2;O&sub3;&sub8;;

Aminosäuren: Keine gefunden;

Löslichkeit: Löslich in Wasser und die Salze von A42125.

2. Verbindung nach Anspruch 1, die A42125 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz von A42125 ist.

3. Verfahren zur Gewinnung des Antibiotikums A42125 umfassend,

daß man Nocardia Aerocolonigenes NRRL 18049 oder eine A42125-produzierende Variante, Mutante oder Rekombinante davon in einem Kulturmedium, daß assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submers-Fermentationsbedingungen züchtet, bis das Antibiotikum A42125 produziert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, das den zusätzlichen Schritt einschließt, daß inan A42125 aus dem Kulturmedium abtrennt.

5. Futterzusammensetzung zur Erhöhung der Futterverwertungs-effizienz bei Wiederkäuern umfassend Tierfutter und eine wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 2.

6. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Nocardia Aerocolonigenes NRRL 18049 oder eine A42125-produzierende Variante, Mutante oder Rekombinante davon.

7. Verfahren zur Entwicklung eines genetischen Austaussystemes bei Methanogene umfassend, daß man Mutanten auswählt, die resistent sind gegenüber dem Antibiotikum A42125 von Anspruch 1 und diese Mutanten für genetische Recombinationsversuche verwendet.