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KR20160127181A - 질환 위험 인자의 식별 방법 - Google Patents

질환 위험 인자의 식별 방법 Download PDF

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KR20160127181A
KR20160127181A KR1020167030021A KR20167030021A KR20160127181A KR 20160127181 A KR20160127181 A KR 20160127181A KR 1020167030021 A KR1020167030021 A KR 1020167030021A KR 20167030021 A KR20167030021 A KR 20167030021A KR 20160127181 A KR20160127181 A KR 20160127181A
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KR
South Korea
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disease
subject
alzheimer
tomm40
dip
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020167030021A
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Inventor
앨런 디 로지스
Original Assignee
진판델 파마슈티컬스 인코포레이티드
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Publication date
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Application filed by 진판델 파마슈티컬스 인코포레이티드 filed Critical 진판델 파마슈티컬스 인코포레이티드
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Abstract

관심의 상태 (예, 알츠하이머병) 의 발달과 관련된 유전적 변이를 식별하는 방법, 및 그렇게 식별된 유전적 변이가 본원에서 제공된다. 본원에서 기술된 유전적 변이의 탐지시, 활성제에 의한 (예, 특정 활성제에 의한 및/또는 더 이른 연령에서) 치료 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 유전적 변이는 TOMM40 유전자의 결손/삽입 다형성 (DIP) 이다. 대상이 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있는지를 결정하기 위한 키트가 또한 제공된다. 활성제에 의한 관심의 상태에 대한 치료에 대상이 반응성인지를 결정하기 위한 키트가 추가로 제공된다.

Description

질환 위험 인자의 식별 방법{METHOD OF IDENTIFYING DISEASE RISK FACTORS}
관련 출원
본 출원은 2008 년 8 월 12 일에 출원된 미국 가 출원 제 61/088,203 호, 2009 년 6 월 12 일에 출원된 미국 가 출원 제 61/186,673 호; 및 2009 년 7 월 10 일에 출원된 미국 가 출원 제 61/224,647 호에 대해 우선권을 주장하며, 그 각각의 공개는 그 전체가 본원에서 참조에 의해 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 게놈 분석 및 DNA 서열 변이의 연구를 포함하는 유전체학, 유전학, 약리유전학 및 생물정보학의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA 서열 내 변이와 특정 질환, 장애 또는 상태에 대한 개인의 감수성 및/또는 특정 약물 또는 치료에 대한 반응의 예상 간의 연관성의 연구에 관한 것이다.
복합 질환과 관련된 유전적 마커에 대한 탐색이 진행중이다. SNP 어레이에 의한 게놈 전체 스캐닝 연구는 알츠하이머병의 연구에 있어서 가장 중요한 조사 영역으로서 ApoE 영역을 계속 강조하고 있다 (Coon et al., J. Clin. Psychiatry 68: 613-8 (2007); Li et al., Arch. Neurol. 65: 45-53 (2007)).
ApoE 4 동종형은 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험과 이전에 강하게 관련되었었다 (Pericak-Vance et al., Am. J. Hum. Genet. 48, 1034-50 (1991); Martin et al., 2000, Roses, et al. 의 미국 특허 제 6,027,896 호, Roses, et al. 의 미국 특허 제 5,716,828 호). 상기 관계는 용량 의존적이다 (Yoshizawa et al.,1994; Schellenberg, 1995). 즉, 2 개의 ApoE 4 대립유전자의 보유자는 오직 하나의 ApoE 4 대립유전자의 보유자보다 후기발병 알츠하이머병 (LOAD) 을 더욱 및 더 이른 나이에 발달시킬 것이다 (Corder et al., Science 261, 921-3 (1993)).
그럼에도 불구하고, E 4 대립유전자는 오직 대략 50 % 의 유전성 알츠하이머병의 이유가 된다. 하나의 설명은 ApoE 4 가 단지 인근의 연관 불균형 관계에 있는 것에 대해 대리 마커로서의 역할을 한다는 것이다. 대안적으로, 미토콘드리아 독성에 있어서 ApoE 4 에 관한 기계적 역할의 최근 발견을 고려하면, ApoE 4 의 음성적 효과는 인근에 인코딩된 또다른 유전자 산물에 의해 폐지되거나 악화될 수 있다 (Chang et al., 2005).
ApoE 상태는 또한 관상 동맥 질환에 대한 위험 및 아마도 또한 다른 질환 및 장애의 숙주와도 관련되므로, ApoE 영역의 연구의 결과는 알츠하이머병에 제한되지 않으나, 잠재적으로 지대한 영향을 가져올 것이다 (Mahley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 5644-51 (2006)). 더욱 광범위하게, 복합 질환 진행에 연루되는 것으로 알려진 다른 유전적 영역과 연관 불균형 관계에 있는 유전자를 둘러싼 진행 또는 경로에 대한 변이 서열의 조사는 그들 질환의 메카니즘을 판독하는 데 있어서 귀중한 정보를 제공할 것이다.
하기 단계를 포함하는, 관심의 상태의 발달 (예, 관심의 질환의 조기 또는 후기발병) 과 관련된 유전적 변이를 식별하는 방법이 본원에서 제공된다: (a) DNA 를 포함하는 생물학적 샘플로부터 관심의 유전적 좌위에서 복수의 개인 대상이 보유하는 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, 대상이 (i) 관심의 상태에 영향받은 대상 및 (ii) 관심의 상태에 영향받지 않은 대상을 모두 포함하는 단계; (b) 상기 복수의 대상에서 관찰된 뉴클레오티드 서열로부터 상기 유전적 좌위에서 유전적 변이를 식별하는 단계 (예, 다중 서열 정렬 분석을 사용함); (c) 상기 대상의 상기 뉴클레오티드 서열의 계통수를 구성함으로써 상기 유전적 변이를 지도화하는 단계로서, 상기 계통수가 상기 대상 간 변이 변화를 식별하는 가지를 포함하는 단계 (예, 동일한 시스트론 상의 변이 변화); (d) 상기 계통수 내의 가지로서 나타난 유전적 변이를 조사하고, 영향받은 및 영향받지 않은 대상의 비를 결정하여, 영향받은 대 영향받지 않은 대상의 변화된 비를 초래하는 변화를 식별하는 단계 (바람직하게는 여기서 시작점은 가장 많은 대상을 나타내는 유전적 변이임); 및 그 후 (e) 영향받은 대 영향받지 않은 대상의 비가 상기 계통수 상의 하나 이상의 인접한 변이와 상당히 상이한 (예, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90 % 이상 상이한) 유전적 변이 또는 변이의 군 (일배체형) 을 식별함으로써, 상기 관심의 상태의 발달과 관련된 유전적 변이를 식별하는 단계.
일부 구현예에서, 모든 대상은 관심의 상태와 관련된 동일한 알려진 다형성을 보유한다.
일부 구현예에서, 관심의 상태는 신경변성 질환, 대사 질환 (예, 이상지질혈증), 심장혈관 질환, 정신 장애 또는 암이다. 일부 구현예에서, 관심의 질환은 ApoE 및/또는 TOMM40 이 질환 발병기전에 연루되는 질환이다.
일부 구현예에서, 관심의 상태는 증가된 또는 감소된 미토콘드리아 기능이상과 관련된다. 일부 구현예에서, 관심의 상태는 정신분열증이다. 일부 구현예에서, 관심의 상태는 관상 동맥 질환이다. 일부 구현예에서, 관심의 상태는 제 2 형 당뇨병이다. 일부 구현예에서, 관심의 상태는 파키슨병이다. 일부 구현예에서, 관심의 상태는 알츠하이머병이다.
일부 구현예에서, 알려진 다형성 위험 인자는 아포지질단백질 E 대립유전자 (예, ApoE 2, ApoE 3 또는 ApoE 4) 이다.
일부 구현예에서, 관심의 유전적 좌위는 알려진 다형성과 연관 불균형 관계에 있다. 일부 구현예에서, 관심의 유전적 좌위는 동일한 염색체 상에 및 알려진 다형성으로부터 10, 20, 30, 40 또는 50 킬로베이스 미만 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 유전적 좌위는 TOMM40 이다.
하기 단계를 포함하는, 관심의 상태의 발달에 대한 증가된 위험을 결정하는 방법이 또한 제공된다: (a) DNA 를 포함하는 생물학적 샘플로부터 개체가 보유하는 선행 단락 중 임의의 방법에 의해 식별되는 유전적 변이를 결정하는 단계; 및 그 후 (b) 유전적 변이가 존재하는 경우 대상이 관심의 상태의 발달에 대한 증가된 위험에 있는지를 결정하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 대상 (예, 하나 이상의 Apo E3 대립유전자를 보유하는 대상) 에서 알츠하이머병의 발달에 대한 증가된 위험을 결정하는 방법이 또한 제공된다: (a) 대상으로부터 취해진 DNA 를 포함하는 생물학적 샘플로부터 알츠하이머병의 증가된 또는 감소된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계; 및 (b) 유전적 변이가 존재 또는 부존재하는 경우 대상이 알츠하이머병의 증가된 또는 감소된 위험에 있는지를 결정하는 단계.
일부 구현예에서, 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부가 결정된다. 일부 구현예에서, 대상이 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상인지 여부가 결정된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (c) 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있다고 결정되는 경우 치료적 유효량으로 대상에게 항알츠하이머병 활성제를 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 유전적 변이가 존재 또는 부존재하지 않는 대상에 비해 유전적 변이의 존재 또는 부존재에 의해 대상이 증가된 위험에 있다고 결정되는 경우 투여 단계는 더 이른 나이에 대상에서 수행된다 (예, ApoE 4/4 대상의 경우, 55 세 이상에서 시작하기 보다는 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53 세에서 시작하여 및 그 후에 매년 연속적으로; ApoE 4/3 대상의 경우, 60 세 이상에서 시작하기 보다는 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 58 세에서 및 그 후에 매년 연속적으로; ApoE 3/3 대상의 경우, 65 세 이상에서 시작하기 보다는 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 또는 63 세에서 및 그 후에 매년 연속적으로; 및 ApoE 2/3 대상의 경우, 70 세 이상에서 시작하기 보다는 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 또는 68 세에서 및 그 후에 매년 연속적으로).
일부 구현예에서, 활성제는 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, PPAR 작용제 또는 조정제 (예, 티아졸리딘디온 또는 글리타자 계열의 약물), 항체, 융합 단백질, 치료적 RNA 분자, 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 활성제는 로시글리타존 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, TOMM40 의 유전적 변이는 하기 표 1 에 열거된 변이이다.
치료적 유효량으로 대상에게 항알츠하이머병 활성제를 투여함으로써 대상 (예, 알츠하이머병에 대한 하나 이상의 ApoE 3 대립유전자를 갖는 대상) 을 치료하는 방법이 또한 제공되고; 개선은 하기 단계를 포함한다: 유전적 변이를 보유하지 않는 상응하는 대상에 비해 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이를 보유하는 경우 더 이른 나이에 대상에게 활성제를 투여하는 단계 (예, ApoE 4/4 대상의 경우, 55 세 이상에서 시작하기 보다는 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53 세에서 시작하여 및 그 후에 매년 연속적으로; ApoE 4/3 대상의 경우, 60 세 이상에서 시작하기 보다는 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 58 세에서 및 그 후에 매년 연속적으로; ApoE 3/3 대상의 경우, 65 세 이상에서 시작하기 보다는 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 또는 63 세에서 및 그 후에 매년 연속적으로; 및 ApoE 2/3 대상의 경우, 70 세 이상에서 시작하기 보다는 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 또는 68 세에서 및 그 후에 매년 연속적으로).
일부 구현예에서, 대상은 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4 대상이다. 일부 구현예에서, 대상은 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상이다.
일부 구현예에서, 활성제는 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, PPAR 작용제 또는 조정제 (예, 티아졸리딘디온 또는 글리타자 계열의 약물), 항체, 융합 단백질, 치료적 RNA 분자, 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 활성제는 로시글리타존 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, TOMM40 유전자의 유전적 변이는 결손/삽입 다형성 (DIP) 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 삽입 다형성이다. 일부 구현예에서, DIP 는 폴리-T 결손/삽입 다형성 (예, 5 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 20 내지 50 bp 폴리-T) 이다.
일부 구현예에서, TOMM40 의 유전적 변이는 하기 표 1 에 열거된 변이이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523 이다.
하기 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자를 위한 ApoE 및/또는 TOMM40 과 관련된 관심의 상태의 치료 방법이 또한 제공된다: (a) 개체가 보유하는 단락 1-12 의 방법에 의해 식별되는 유전적 변이의 존재 또는 부존재를 결정하여 환자의 유전적 프로파일을 생성하는 단계; 및 그 후, 상기 프로파일이 환자가 활성제에 반응성임을 지시하는 경우, (b) 치료적 유효량으로 대상에게 활성제를 투여하여 관심의 상태를 치료하는 단계.
일부 구현예에서, 활성제는 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, PPAR 작용제 또는 조정제 (예, 티아졸리딘디온 또는 글리타자 계열의 약물), 항체, 융합 단백질, 치료적 RNA 분자, 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 활성제는 로시글리타존 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, TOMM40 유전자의 유전적 변이는 결손/삽입 다형성 (DIP) 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 삽입 다형성이다. 일부 구현예에서, DIP 는 폴리-T 결손/삽입 다형성 (예, 5 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 20 내지 50 bp 폴리-T 삽입) 이다.
일부 구현예에서, TOMM40 의 유전적 변이는 하기 표 1 에 열거된 TOMM40 의 변이이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523 이다.
하기 단계를 포함하는, 대상의 알츠하이머병의 치료 방법이 또한 제공된다: (a) 대상으로부터 취해진 DNA 를 포함하는 생물학적 샘플로부터 활성제에 대한 반응성과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계; 및, 유전적 변이가 존재하는 경우, (b) 치료적 유효량으로 대상에게 활성제를 투여하여 알츠하이머병을 치료하는 단계.
일부 구현예에서, 대상은 하나 이상의 ApoE 3 대립유전자를 보유한다. 일부 구현예에서, 대상은 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상이다.
일부 구현예에서, 활성제는 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, PPAR 작용제 또는 조정제 (예, 티아졸리딘디온 또는 글리타자 계열의 약물), 항체, 융합 단백질, 치료적 RNA 분자, 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 활성제는 로시글리타존 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, TOMM40 유전자의 유전적 변이는 결손/삽입 다형성 (DIP) 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 삽입 다형성이다. 일부 구현예에서, DIP 는 폴리-T 결손/삽입 다형성 (예, 5 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 20 내지 50 bp 폴리-T) 이다.
일부 구현예에서, TOMM40 유전자의 유전적 변이는 하기 표 1 에 열거된 변이이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523 이다.
상기 단락에 따른 알츠하이머병의 치료 방법을 수행하기 위한 약제의 제조를 위한 항알츠하이머병 활성제의 용도가 추가로 제공된다. 알츠하이머병의 치료 방법을 수행하기 위한 항알츠하이머병 활성제의 용도가 또한 제공된다.
하기 단계를 포함하는 환자 프로파일을 수득하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병을 발달시킬 위험에 있는 환자에 대한 예후를 결정하는 방법이 제공된다: 환자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ApoE 대립유전자의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계, 및 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계, 및 그 후 환자 프로파일을 예후로 전환하는 단계로서, ApoE 대립유전자의 존재 및 하나 이상의 TOMM40 DIP 다형성의 존재가 환자를 알츠하이머병을 발달시킬 위험에 있는 환자로서 식별하는 단계.
일부 구현예에서, DIP 는 삽입 다형성이다. 일부 구현예에서, DIP 는 폴리-T 결손/삽입 다형성 (예, 5 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 20 내지 50 폴리-T) 이다.
일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523 이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상이다.
하기 단계를 포함하는, 알츠하이머병 치료 요법의 임상 시험의 하위그룹 내로 대상을 계층화하는 방법이 또한 제공된다: 환자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ApoE 대립유전자의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계, 및 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계로서, 대상이 하나 이상의 ApoE 및/또는 TOMM40 DIP 대립유전자의 존재 또는 부존재에 기초하여 요법의 임상 시험에 대한 하위그룹 내로 계층화되는 단계.
일부 구현예에서, DIP 는 삽입 다형성이다. 일부 구현예에서, DIP 는 폴리-T 삽입 다형성 (예, 5 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 20 내지 50 폴리-T 삽입) 이다.
일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523 이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상이다.
하기 단계를 포함하는, 알츠하이머병 치료의 임상 시험에서 환자를 식별하는 방법이 추가로 제공된다: a) 알츠하이머병으로 진단받은 환자를 식별하는 단계; 및 b) 하기 단계를 포함하는 환자 프로파일을 수득하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병으로 진단받은 환자에 대한 예후를 결정하는 단계: i) 환자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ApoE 대립유전자의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계, ii) TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계, 및 iii) 환자가 알츠하이머병의 치료에 대한 임상 시험의 후보인지 여부의 예측을 포함하는 예후로 환자 프로파일을 전환하는 단계.
일부 구현예에서, DIP 는 삽입 다형성이다. 일부 구현예에서, DIP 는 폴리-T 결손/삽입 다형성 (예, 5 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 20 내지 50 폴리-T) 이다.
일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523 이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상이다.
하기를 포함하는, 대상이 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있는지를 결정하기 위한 키트가 제공된다: (A) ApoE 3, ApoE 4 또는 ApoE 2 에 선택적으로 결합하는 항체, 및 동일한 것을 인코딩하는 DNA 에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택되는, ApoE 3, ApoE 4 또는 ApoE 2 를 특이적으로 탐지하는 하나 이상의 시약; (B) TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 의 존재 또는 부존재를 특이적으로 탐지하는 하나 이상의 시약; 및 (C) 하기 단계에 의해, 대상이 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있는지를 결정하기 위한 지침: (i) 하나 이상의 시약으로 대상에서 ApoE 동종형의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계; (ii) TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계; 및 (iii) 하나 이상의 시약으로 ApoE 동종형 및 TOMM40 DIP 의 존재가 탐지되는지 여부를 관찰함으로써 환자가 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있는지 여부를 관찰하는 단계로서, ApoE 동종형 및 TOMM40 DIP 의 존재가 대상이 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있음을 지시하는 단계.
일부 구현예에서, 하나 이상의 시약 및 지침은 단일 용기 내에 포장된다.
일부 구현예에서, DIP 는 삽입 다형성이다. 일부 구현예에서, DIP 는 폴리-T 결손/삽입 다형성 (예, 5 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 20 내지 50 폴리-T) 이다.
일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523 이다.
일부 구현예에서, 결정 단계는 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상이다.
하기를 포함하는, ApoE 및/또는 TOMM40 과 관련된 관심의 상태에 대한 치료에 대상이 반응성인지를 활성제로 결정하기 위한 키트가 제공된다: (A) ApoE 3, ApoE 4 또는 ApoE 2 에 선택적으로 결합하는 항체, 및 동일한 것을 인코딩하는 DNA 에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택되는, ApoE 3, ApoE 4 또는 ApoE 2 를 특이적으로 탐지하는 하나 이상의 시약; (B) TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 의 존재 또는 부존재를 특이적으로 탐지하는 하나 이상의 시약; 및 (C) 하기 단계에 의해, 관심의 활성제로 관심의 상태에 대한 치료에 대상이 반응성인지를 결정하기 위한 지침: (i) 하나 이상의 시약으로 대상에서 ApoE 동종형의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계; (ii) TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계; 및 (iii) 하나 이상의 시약으로 ApoE 동종형 및 TOMM40 DIP 의 존재가 탐지되는지 여부를 관찰함으로써 대상이 치료에 반응성인지 여부를 결정하는 단계로서, ApoE 3 및 TOMM40 DIP 의 존재가 대상이 활성제에 의한 치료에 반응성임을 지시하는 단계.
일부 구현예에서, 하나 이상의 시약 및 지침은 단일 용기 내에 포장된다.
일부 구현예에서, DIP 는 삽입 다형성이다. 일부 구현예에서, DIP 는 폴리-T 결손/삽입 다형성 (예, 5 내지 100, 또는 10 내지 80, 또는 20 내지 50 bp 폴리-T) 이다.
일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 이다. 일부 구현예에서, DIP 는 rs10524523 이다.
일부 구현예에서, 결정 단계는 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상이다.
모든 상기 구현예는 임의의 방식 및/또는 조합으로 조합될 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 상기 및 다른 목적 및 양상은 본원에서 제공된 도면 및 하기 명세서에서 더욱 상세히 설명된다.
도 1 은 일부 구현예에 따라 관심의 상태와 관련될 수 있는 관심의 유전적 좌위에서 게놈 서열의 예정된 영역 내 유전적 변이를 식별하기 위한 일반적 순서도를 나타낸다.
도 2 는 5 개의 흔한 ApoE 유전자형의 유전의 함수로서 알츠하이머병 발병의 평균 연령의 그래프를 나타내고, ApoE 4 를 알츠하이머병에 대한 위험 인자로서 나타낸다 (1993).
도 3 은 예시적인 관심의 유전적 좌위인 염색체 19 상의 영역 A, B 및 C 를 나타낸다. TOMM40 유전자는 ApoE 유전자에 매우 근접해 있고, 외부 미토콘드리아 막으로 인도되는 40 kD 단백질을 인코딩한다. TOMM40 은 미토콘드리아 단백질 내수송의 조절로 직접적으로 ApoE 와 상호작용하고, 현재의 가설은 특정 TOMM40 변이(들) 의 존재가 ApoE 3 대립유전자의 용량 의존적 존재와 관련된 알츠하이머병에 대한 증가된 위험을 악화시킨다는 것이다.
도 4 는 본원에서 상술된 일부 구현예에 따라 생성된 도 3 에서 나타난 바와 같은 영역 B 의 진화적 지도를 도식적 형태로 나타낸다. 각각의 가로 타원형은 관찰된 서열 변이 (예, 뉴클레오티드 변화) 를 나타내고, 타원형의 크기는 그의 빈도를 나타낸다. 각각의 변이는 계통수 내의 마디로 불리고, 가지에 의한 하나의 마디의 또다른 마디로의 연결은 개체가 보유하는 cis 에서의 2 개의 변이의 관찰을 나타낸다.
도 5 는 TOMM40 에 대해 구성된 영역 B 에 기초한 계통수의 도식적 도표이고, 이 영역에서 TOMM40 변이의 2 개의 주요 그룹 또는 클레이드 내의 ApoE 표현형의 백분율을 나타낸다.
도 6 은 탐색적 (R1) (23 Kb) 및 확인적 (R2) (10 Kb) 연구 (NCBI Build 36.3) 에 있어서 1 차 시퀀싱되는 일배체형 블록 및 영역을 타나내는 LD 플롯을 포함하는 TOMM40-ApoE 좌위의 도식적 개요를 나타낸다. LD 플롯은 상이한 선 특성에 의해 나타낸 D'/LOD 색체 배합으로 r2 값, 단색 가시 일배체형 블록 규정, 합맵 데이타 (CEU 분석 패널) 에 대해 나타나 있다.
도 7 은 변이의 분리에 의한 계통수의 표현을 나타낸다. 7a: SNP 변이, 클레이드 A 대 B, E6 - E10 은 TOMM40 엑손을 나타내고, 수직선은 SNP 의 근사적 위치를 나타낸다. 2 개의 주 가지의 분리는 강한 붓스트랩(bootstrap) 지지를 갖는다 (973/1000). 7b: rs10524523 길이 다형성. 기술적 통계량이 길이 다형성의 각각의 군에 대해 제시된다. 계통수 또는 매우 작은 클레이드 내에서 개별적 외집단을 형성한 몇몇 긴 일배체형은 '나머지' 로 나타낸 군 내에 있다.
도 8 은 ApoE 유전자형 3/3 (8a), 3/4 (8b) 및 4/4 (8c) 에 의해 계층화된 rs10524523 길이 다형성의 길이의 막대그래프를 나타낸다. N=210 일배체형 (AS 코호트).
도 9 는 60 내지 86 세 사이에 발병한 AD 환자에 대한 AD 발병 연령 및 rs10524523 다형성의 길이 간의 연관성을 나타낸다. 블록 플롯은 95 % 범위 (수직선), 중간값 (박스 내 수평선) 및 사분위수 범위 (블록) 를 나타낸다.
본 발명은 이하에서 더욱 상세히 설명된다. 본 명세서는 본 발명이 실시될 수 있는 모든 상이한 방식의 상세한 목록, 또는 본 발명에 부가될 수 있는 모든 특징을 의미하지 않는다. 예를 들어, 하나의 구현예와 관련하여 설명된 특징은 다른 구현예에 포함될 수 있고, 특정 구현예와 관련하여 설명된 특징은 그 구현예로부터서 삭제될 수 있다. 게다가, 본 발명에서 벗어나지 않는 본원에서 제시된 다양한 구현예에 대한 수많은 변이 및 부가는 본 공개에 비추어 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 하기 명세서는 본 발명의 일부 특정 구현예를 설명하려는 것이지, 모든 치환, 조합 및 그의 변이를 빠짐없이 구체화하려는 것이 아니다.
발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형은 문맥이 명백히 다르게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 또한, 본원에서 사용된 "및/또는" 은 열거된 항목의 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합 뿐만 아니라, 대안적으로 해석되는 경우 ("또는") 조합의 결여를 언급하고 포함한다.
본 발명은 복합 질환 및 장애에 대한 특별한 관심의 영역 내의 유전적 변이를 밝히는 방법을 지향한다. 또한 본 발명은 표현형 정보와의 연관성에 기초한 가장 정보제공적인 유전적 마커의 발견에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 특정 질환, 장애 또는 상태에 대한 감수성과 관련된 유전적 마커의 위치를 찾는 데 사용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 후보 치료 또는 약물에 대한 대상 반응에 관한 데이타는 그 치료 또는 약물에 대한 유익한 반응과 관련된 유전적 마커의 위치에 대한 계통발생적 분석 (즉, 약리유전학) 에 포함될 수 있다. 상기 방법은 특정 좌위로부터의 유전적 변이의 임의의 데이타 세트에 적용될 수 있다. 본 발명에 따라 유전적 위험 인자를 찾기 위한 접근의 순서도에 대해 도 1 을 참고한다.
하나의 양상에서, 유전적 변이의 분석은 변이 서열 데이타에 기초한다. 두 번째 양상에서, 구조가 이배체 유전자형 데이타를 사용하여 밝혀짐으로써, 성분 일배체형을 실험적으로 또는 계산적으로 추론할 필요를 없앤다 (예를 들어, Roses et al. 의 미국 특허 제 6,027,896 호 참조). 또다른 양상에서, 본 방법은 존재하는 서열 변이의 기록을 제공하지만 전체 서열을 실제로 제공하지는 않는 실험 절차에 의해 표적 핵산의 질문으로부터 수득되는 비특징화된 대립유전적 변이에 적용될 수 있다. 유전적 변이의 근본적 구조는 또한 이배체 유전자형 데이타로부터 성분 일배체형을 추론하는데 유용하다.
질환 또는 장애 (예, 미토콘드리아 기능이상을 연루시키는 것으로 여겨지는 것 (예, 알츠하이머병 또는 다른 신경변성 질환)) 를 갖는 대상의 평가에서 또는 그러한 질환을 발달시킬 위험에 있는 것으로 의심되는 대상의 평가를 위해 사용되는 당업계에서 기술되거나 알려진 다른 임상 진단 정보와 함께 본원에서 기술된 방법이 사용되는 것이 고려되고 바람직하다. 본 발명은 또한 다른 복합 질환, 장애 또는 상태에 대한 유전적 위험 인자의 발견에 적용가능하다.
본원에서 언급된 모든 미국 특허 참조의 공개는 그 전체가 본원에서 참조에 의해 포함된다.
1. 정의. 하기 정의가 본원에서 사용된다:
"관심의 상태" 는 계통발생적 연구 및/또는 그 후의 진단 또는 예후에 대해 지정되는 특정 상태, 질환 또는 장애를 언급한다. 본원에서 사용된 "상태" 는 ApoE 및/또는 TOMM40 및/또는 미토콘드리아 기능이상과 관련된 상태, 예를 들어, 신경변성 질환, 대사성 질환, 신경 장애, 및 암을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
ApoE 및/또는 TOMM40 이 연루되는 상태의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 심장혈관 질환; 대사성 질환; 신경변성 질환; 신경성 트라우마 또는 질환; 자가면역 질환 (예, 다발성 경화증 (Pinholt M, et al. Apo E in multiple sclerosis and optic neuritis: the apo E-epsilon4 allele is associated with progression of multiple sclerosis. Mult Scler. 11:511-5 (2005); Masterman, T. & Hillert, J. The telltale scan: APOE ε4 in multiple sclerosis. Lancet Neurol. 3: 331 (2004)), 신경정신병적 전신 홍반 루푸스 (Pullmann Jr. R, et al. Apolipoprotein E polymorphism in patients with neuropsychiatric SLE. Clin Rheumatol. 23: 97-101 (2004)) 등); 바이러스성 감염 (예, 간염 C 감염과 관련된 간 질환 (Wozniak MA, et al. Apolipoprotein E-64 protects against severe liver disease caused by hepatitis C virus. Hepatol. 36: 456-463 (2004)), HIV 질환 (Burt TD, et al. Apolipoprotein (apo) E4 enhances HIV-I cell entry in vitro, and the APOE epsilon4/epsilon4 genotype accelerates HIV disease progression. Proc Natl Acad Sci USA. 105:8718-23 (2008)) 등); 엉덩이 골절/골다공증 (Pluijm SM, et al. Effects of gender and age on the association of apolipoprotein E epsilon4 with bone mineral density, bone turnover and the risk of fractures in older people. Osteoporos Int. 13: 701-9 (2002)); 미토콘드리아 질환 (Chang S, et al. Lipid- and receptor-binding regions of apolipoprotein E4 fragments act in concert to cause mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 102:18694-9 (2005)); 노화 (Schachter F, et al. Genetic associations with human longevity at the APOE and ACE loci. Nat Genet. 6:29-32 (1994); Rea IM, et al., Apolipoprotein E alleles in nonagenarian subjects in the Belfast Elderly Longitudinal Free-living Ageing Study (BELFAST). Mech. Aging and Develop. 122: 1367-1372 (2001)); 염증 (Li L, et al., Infection induces a positive acute phase apolipoprotein E response from a negative acute phase gene: role of hepatic LDL receptors. J Lipid Res. 49:1782-93 (2008)); 및 기억 기능이상 (Caselli RJ, et al. Longitudinal modeling of age-related memory decline and the APOE epsilon4 effect. N Engl J Med. 361:255-63 (2009)).
본원에서 사용된 "심장혈관 질환" 은 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는, 심장 및/또는 혈관을 연루시키는 질환을 언급한다: 관상 동맥 질환 (Song Y, et al. Metaanalysis: apolipoprotein E genotypes and risk for coronary heart disease. Ann Intern Med. 141:137-47 (2004); Bennet AM, et al., Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk. JAMA 298:1300-11 (2007)), 죽상경화증 (Norata GD, et al. Effects of PCSK9 variants on common carotid artery intima media thickness and relation to ApoE alleles. Atherosclerosis (2009) Jun 27. [Epub ahead of print], doi:10.1016/j. atherosclerosis 2009.06.023; Paternoster L, et al. Association Between Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness May Suggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke. Stroke 39:48-54 (2008)), 허혈성 심장 질환 (Schmitz F, et al., Robust association of the APOE 4 allele with premature myocardial infarction especially in patients without hypercholesterolaemia: the Aachen study. Eur. J. Clin. Investigation 37: 106-108 (2007)), 허혈성 뇌졸중과 같은 혈관 질환 (Peck G, et al. The genetics of primary haemorrhagic stroke, subarachnoid haemorrhage and ruptured intracranial aneurysms in adults. PLoS One. 3:e3691 (2008); Paternoster L, et al. Association Between Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness May Suggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke. Stroke 39:48-54 (2008)), 혈관성 치매 (Bang OY, et al. Important link between dementia subtype and apolipoprotein E: a meta-analysis. Yonsei Med J. 44:401-13 (2003); Baum L, et al. Apolipoprotein E epsilon4 allele is associated with vascular dementia. Dement Geriatr Cogn Disord. 22:301-5 (2006)) 등.
본원에서 사용된 "신경병성 질환" 은 하기를 언급한다: 알츠하이머병 (Corder EH, et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science 261:921-3 (1993); Corder EH, et al. There is a pathologic relationship between ApoE-epsilon 4 and Alzheimer's disease. Arch Neurol. 52:650-1 (1995)), 파킨슨병 (Huang X, et al. Apolipoprotein E and dementia in Parkinson disease: a meta-analysis. Arch Neurol. 63:189-93 (2006); Huang X et al. APOE-[epsilon]2 allele associated with higher prevalence of sporadic Parkinson disease. Neurology 62:2198-202 (2004); Martinez, M. et al. Apolipoprotein E4 is probably responsible for the chromosome 19 linkage peak for Parkinson's disease. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 136B, 172-174 (2005)), 헌팅톤병, 및 뉴런의 감소를 야기하는 복수의 덜 흔한 질환 및 장애 예를 들어, 연령 관련 황반 변성 (Thakkinstian A, et al. Association between apolipoprotein E polymorphisms and age-related macular degeneration: A HuGE review and meta-analysis. Am J Epidemiol. 164:813-22 (2006); Bojanowski CM, et al. An apolipoprotein E variant may protect against age-related macular degeneration through cytokine regulation. Environ Mol Mutagen. 47:594-602 (2006)).
"신경성 트라우마 또는 질환" 은 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 두부 손상 후 결과 (Zhou W, et al. Meta-analysis of APOE4 allele and outcome after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 25:279-90 (2008); Lo TY, et al. Modulating effect of apolipoprotein E polymorphisms on secondary brain insult and outcome after childhood brain trauma. Childs Nerv Syst. 25:47-54 (2009)), 편두통 (Gupta R, et al. Polymorphism in apolipoprotein E among migraineurs and tension-type headache subjects. J Headache Pain. 10:115-20 (2009)), 혈관성 부종 (James ML, et al. Apolipoprotein E modifies neurological outcome by affecting cerebral edema but not hematoma size after intracerebral hemorrhage in humans. J Stroke Cerebrovasc Dis. 18:144-9 (2009); James ML, et al. Pharmacogenomic effects of apolipoprotein e on intracerebral hemorrhage. Stroke 40:632-9 (2009)) 등.
본원에서 사용된 "대사성 질환" 은 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 이상지질혈증 (Willer CJ, et al. Newly identified loci that influence lipid concentrations and risk of coronary artery disease. Nat Genet. 40:161-9 (2008); Bennet AM, et al., Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk. JAMA 298:1300-11 (2007)), 말기 콩팥 질환 (Oda H, et al. Apolipoprotein E polymorphism and renal disease. Kidney Int Suppl. 71:S25-7 (1999); Hubacek JA, et al. Apolipoprotein E Polymorphism in Hemodialyzed Patients and Healthy Controls. Biochem Genet. (2009) Jun 30. [Epub ahead of print] DOI 10.1007/s10528-009-9266-y.), 만성 신장 질환 (Yoshida T, et al. Association of a polymorphism of the apolipoprotein E gene with chronic kidney disease in Japanese individuals with metabolic syndrome. Genomics 93:221-6 (2009); Leiva E, et al. Relationship between Apolipoprotein E polymorphism and nephropathy in type-2 diabetic patients. Diabetes Res Clin Pract. 78:196-201 (2007)), 쓸개 질환 (Boland LL, et al. Apolipoprotein E genotype and gallbladder disease risk in a large population-based cohort. Ann Epidemiol. 16:763-9 (2006); Andreotti G, et al. Polymorphisms of genes in the lipid metabolism pathway and risk of biliary tract cancers and stones: a population-based case-control study in Shanghai, China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17:525-34 (2008)), 당뇨병 (제 II 형) (Elosua R, et al. Obesity Modulates the Association among APOE Genotype, Insulin, and Glucose in Men. Obes Res. 11:1502-1508 (2003); Moreno JA, et al. The Apolipoprotein E Gene Promoter (-219G/T) Polymorphism Determines Insulin Sensitivity in Response to Dietary Fat in Healthy Young Adults. J. Nutr. 135:2535-2540 (2005)), 대사 증후군, 담석증 (Abu Abeid S, et al. Apolipoprotein-E genotype and the risk of developing cholelithiasis following bariatric surgery: a clue to prevention of routine prophylactic cholecystectomy. Obes Surg. 12:354-7 (2002)) 등.
본원에서 사용된 "정신 장애" 는 하기를 언급한다: 정신분열증 (Kampman O, et al. Apolipoprotein E polymorphism is associated with age of onset in schizophrenia. J Hum Genet. 49:355-9 (2004); Dean B. et al., Plasma apolipoprotein E is decreased in schizophrenia spectrum and bipolar disorder. Psychiatry Res. 158:75-78 (2008)), 강박 장애 (OCD), 중독성 행동 (흡연 중독, 알콜 중독 등), 양극성 장애 (Dean B. et al., Plasma apolipoprotein E is decreased in schizophrenia spectrum and bipolar disorder. Psychiatry Res. 158:75-78 (2008)), 및 다른 정신성 질환, 장애 또는 상태.
본원에서 사용된 "상태의 발달" 은 질환, 장애 또는 다른 의학적 상태의 초기 진단, 또는 대상이 이미 진단받은 기존의 질환, 장애 또는 의학적 상태의 악화를 언급한다.
본원에서 사용된 "진단" 또는 "예후" 는 공통 뉴클레오티드 서열, 증상, 징후, 가족력, 또는 환자의 건강 상태의 고려와 관련된 다른 데이타를 공유하는 복수의 개체와의 비교에 기초하여, 주어진 질환, 장애 또는 상태에 대한 특정 치료에 대한 가장 가능성 높은 결과, 시간 및/또는 반응을 예측하기 위한 정보 (예, 생물학적 샘플에 대한 다른 분자적 시험으로부터의 유전적 정보 또는 데이타, 징후 및 증상, 진찰 결과, 인지 수행 결과 등) 의 사용을 언급한다.
본원에서 사용된 "생물학적 샘플" 은 관심의 핵산을 포함할 것으로 의심되는 물질을 언급한다. DNA 를 포함하는 생물학적 샘플은 모발, 피부, 볼 면봉 수득물 (cheek swab), 및 생물학적 유체 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 가래, 림프액, 정액, 질점막, 대변, 소변, 척수액 등을 포함한다. 상기 샘플로부터의 DNA 의 분리는 당업자에게 잘 알려져 있다.
일부 구현예에 따른 "대상" 은 그의 유전자형(들) 또는 일배체형(들) 이 개체의 상태 (즉, 질환 또는 장애 상태) 및/또는 후보 약물 또는 치료에 대한 반응과 함께 결정되고 기록되는 개체가다. 복수의 대상으로부터의 뉴클레오티드 서열이 계통수를 구성하는데 사용되고, 그 후 진단 또는 예후 목적을 위해 개체로부터의 유사한 뉴클레오티드 서열이 계통수 상의 것과 비교될 수 있다.
본원에서 사용된 "유전자" 는 프로모터, 엑손, 인트론, 및 발현을 제어하는 다른 미번역되는 영역을 포함하는, RNA 산물의 조절된 생합성을 위한 모든 정보를 포함하는 DNA 의 분절을 의미한다.
본원에서 사용된 "유전적 좌위" 또는 "좌위" 는 종종 유전자 또는 물리적 또는 표현형 특징 또는 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 스트레치에 해당하는 염색체 또는 DNA 분자 상의 위치를 의미한다. 좌위들은 좌위의 복수형이다.
본원에서 핵산에 적용된 "증폭" 은 핵산의 하나 이상의 카피의 형성을 초래하는 임의의 방법을 언급하고, 바람직하게는 증폭은 기하급수적이다. DNA 의 특정 서열의 효소적 증폭을 위한 하나의 상기 방법은 Saiki et al., 1986, Science 230:1350-1354 에 의해 기술된 바와 같은 중합효소 연쇄반응 (PCR) 으로서 알려져 있다. PCR 에서 사용되는 프라이머는 보통 길이가 약 10 내지 50 개 이상의 뉴클레오티드에서 다양하고, 전형적으로 충분한 특이성을 보장하기 위해 약 15 개 이상의 뉴클레오티드가 선택된다. 생성되는 이중 가닥 절편은 "앰플리콘" 으로 불리고, 길이가 겨우 약 30 개 뉴클레오티드 내지 20,000 개 이상에서 다양할 수 있다.
본원에서 사용된 "마커" 또는 "유전적 마커" 는 특정 좌위에서 DNA 서열의 알려진 변이이다. 변이는 돌연변이 또는 유전으로 인해 개체 내에 존재할 수 있다. 유전적 마커는 단일 염기쌍 변화 (단일 뉴클레오티드 다형성, SNP) 를 둘러싼 서열과 같은 짧은 DNA 서열, 또는 초위성과 같은 긴 것일 수 있다. 마커는 유전된 질환 및 그의 유전적 원인 (예를 들어, 단백질의 결함이 있는 또는 다른 경우 바람직하지 않은 형태를 초래하는 유전자의 특정 돌연변이) 간의 관계를 연구하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "유전적 위험 인자" 는 상태, 질환 또는 장애에 대한 증가된 감수성과 관련된 유전적 마커를 의미한다. 그것은 또한 선택된 약물 또는 관심의 치료에 대한 특정 반응과 관련된 유전적 마커를 언급할 수 있다.
본원에서 사용된 "와 관련된" 은 기회 단독에 의해 예상되는 것보다 더욱 흔한 2 이상의 특징의 동시 발현을 의미한다. 연관성의 예는 HLA (HLA 는 인간 백혈구 항원을 의미함) 로 불리는 백혈구의 표면 상의 특징을 포함한다. 특정 HLA 유형, HLA 유형 B-27 은 강직성 척추염을 포함하는 다수의 질환에 대한 증가된 위험과 관련된다. 강직성 척추염은 일반적 집단에서 보다 HLA B-27 을 갖는 인간에서 87 배 더 발생할 가능성이 있다.
유전적 위험 인자로 인해 "상태 발달의 증가된 위험" 에 있는 대상은 그 상태에 취약하고, 그 상태에 대한 유전적 감수성을 갖고/갖거나, 유전적 위험 인자가 부존재하는 대상보다 상태를 더욱 발생시킬 가능성이 있는 대상이다. 예를 들어, 하나 또는 두 개의 ApoE 4 대립유전자의 존재로 인해 "알츠하이머병 발달의 증가된 위험" 에 있는 대상은 ApoE 4 대립유전자를 보유하지 않는 대상보다 알츠하이머병을 더욱 발달시킬 가능성이 있는 대상이다.
본원에서 사용된 "다형성" 은 게놈의 DNA 내 특정 좌위에서 2 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열의 존재를 의미한다. 다형성은 유전적 마커로서의 역할을 할 수 있고, 또한 유전적 변이로서 언급될 수 있다. 다형성은 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결손 및 초위성을 포함하고, 유전자 발현 또는 단백질 기능에서 탐지가능한 차이를 초래할 수 있으나 반드시 그러하지는 없다. 다형성 부위는 뉴클레오티드 서열이 집단 내 하나 이상의 개체의 참조 서열과 다른 좌위 내의 뉴클레오티드 위치이다.
본원에서 사용된 "결손/삽입 다형성" 또는 "DIP" 는 또다른 것과 관련된 하나의 버전의 서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입이다. 대립유전자 중 어느 것이 부 대립유전자를 나타내는지 알려진 경우, 용어 "결손" 은 부 대립유전자가 뉴클레오티드의 결손인 경우에 사용되고, 용어 "삽입" 은 부 대립유전자가 뉴클레오티드의 첨가인 경우에 사용된다. 용어 "결손/삽입 다형성" 은 또한 다수의 형태 또는 길이가 존재하고 부 대립유전자가 명백한 경우에 사용된다. 예를 들어, 본원에서 기술된 폴리-T 다형성의 경우, 다양한 길이의 다형성이 관찰된다.
본원에서 사용된 "다형성 데이타" 는 특정 유전자에 대한 하기 중 하나 이상에 관한 정보를 의미한다: 다형성 부위의 위치; 그 부위에서의 서열 변이; 하나 이상의 집단 내 다형성의 빈도; 그 유전자에 대해 결정된 상이한 유전자형 및/또는 일배체형; 하나 이상의 집단 내 하나 이상의 이들 유전자형 및/또는 일배체형의 빈도; 및 그 유전자에 대한 일배체형 또는 유전자형 및 소질 간의 임의의 알려진 연관성.
본원에서 사용된 "일배체형" 은 개체 내 하나 이상의 염색체 상에 보유되는 유전적 변이 또는 변이의 조합을 언급한다. 일배체형은 종종 다수의 인접한 다형성 좌위를 포함한다. 본원에서 사용된 일배체형의 모든 부분은 염색체 또는 반수체 DNA 분자의 동일한 카피 상에 존재한다. 반대되는 증거가 없는 한, 일배체형은 감수분열 중에 함께 전달될 수 있는 다수의 좌위의 조합을 나타내는 것으로 간주된다. 각각의 인간은 양 부모로부터의 상동 염색체 상에 유전되는 서열로 이루어진 임의의 주어진 유전적 좌위에 대한 한쌍의 일배체형을 보유한다. 이들 일배체형은 동일할 수 있고 또는 주어진 좌위에 대한 2 개의 상이한 유전적 변이를 나타낼 수 있다. 하플로타이핑은 개체 내 하나 이상의 일배체형을 결정하는 방법이다. 하플로타이핑은 가문 족보, 분자 기술 및/또는 통계적 추측을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "변이" "변이체" 또는 "유전적 변이" 는 집단 내 일배체형의 특정 동종형을 언급하고, 특정 형태는 유전자 서열 내의 하나 이상의 및 흔히 하나 초과의 변이 부위 또는 뉴클레오티드의 서열에서 동일한 일배체형의 다른 형태와 상이하다. 유전자의 상이한 대립유전자 간에 상이한 이들 변이 부위에서의 서열은 "유전자 서열 변이" "대립유전자" "변이" 또는 "변이체" 로 언급된다. 용어 "대안적 형태" 는 유전자 서열 내에 하나 이상의 및 흔히 하나 초과의 변이 부위를 가짐으로써 다른 대립유전자와 구별될 수 있는 대립유전자를 언급한다. "변이" 또는 "변이체" 와 동등한 것으로 당업계에 알려진 다른 용어는 돌연변이 및 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 을 포함한다. 변이 또는 변이들의 존재에 대한 언급은 단지 유전자 내의 임의의 변이의 존재라기 보다는 특정 변이, 즉, 특정 다형성 부위에서의 특정 뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 사용된 "동종형" 은 그의 특정 서열 및/또는 구조에 의해 다른 형태와 구별되는, 특정 형태의 유전자, mRNA, cDNA 또는 그에 의해 인코딩되는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 아포지질단백질 E 의 ApoE 4 동종형은 ApoE2 또는 ApoE 3 동종형과 대립된다.
본원에서 사용된 "시스트론" 은 단일 폴리펩티드에 대한 유전적 코드를 포함하고 유전적 단위로서 기능하는 단일 염색체 상에 존재하는 DNA 의 절편을 의미한다. 시스트론은 단일 기능 단위 (즉, 유전자) 와 관련된 엑손, 인트론 및 조절 요소를 포함한다. 상기 용어는 유전적 요소가 동일한 DNA 분자 상에 위치하는지 여부와 상관 없이 ("trans" 상보) 또는 동일한 DNA 분자 상에 위치하는 경우에만 ("cis" 작용 요소) 기능적으로 상호작용할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 전통적 cis-trans 시험에서 유래한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "유전자형" 은 특정 부위(들)에서 핵산 서열 내에 존재하는 특정 뉴클레오티드(들)에 의해 규정될 수 있는 유전자의 특정 대립 형태를 언급한다. 유전자형은 또한 하나 이상의 다형성 좌위에 존재하는 대립유전자의 쌍을 지시할 수 있다. 인간과 같은 이배체 유기체의 경우, 2 개의 일배체형이 1 개의 유전자형을 구성한다. 유전자형분석은 예를 들어 핵산 증폭, 항체 결합 또는 다른 화학적 분석에 의해 개체의 유전자형을 결정하기 위한 임의의 방법이다. 결과로서 얻은 유전자형은 언페이스드(unphased)일 수 있는데, 이는 발견된 서열이 어느 한 부모 염색체로부터 유래되었는지 알려지지 않은 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "연관 불균형" 은 2 이상의 좌위에서 대립유전자의 비무작위 관련을 의미한다. 연관 불균형은 대립유전자 또는 유전적 마커의 일부 조합이 그의 빈도에 기초하여 대립유전자로부터의 일배체형의 무작위 형성으로부터 예상되는 것보다 집단 내에서 다소 빈번히 발생하는 상황을 기술한다. 상이한 좌위에서 다형성 간의 비무작위 관련은 연관 불균형의 정도에 의해 측정된다.
본원에서 사용된 "다중 서열 정렬" 또는 "MSA" 는 서열 간 상동성 및 이종성을 결정하기 위한 복수의 개체에서 유래된 게놈 DNA 로부터의 3 개 이상의 뉴클레오티드 서열의 정렬을 의미한다. 일반적으로, 의문의 서열의 입력 세트는 공통 조상으로부터 내려오고 계통을 공유하는 진화적 관계를 갖는 것으로 추정된다. 컴퓨터 알로리즘은 정렬된 서열의 분석을 수행하는 데 가장 흔히 사용된다.
본 발명의 일부 구현예는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램 제품에 의해 실시되는 단계를 포함할 수 있는 블록 도표 설명 방법 (예, 도 1) 을 참조하여 기술된다. 작업 설명 및/또는 블록 도표의 각각의 블록, 및 작업 설명 및/또는 블록 도표 내 블록의 조합은 아날로그 및/또는 디지털 하드웨어, 및/또는 컴퓨터 프로그램 지침에 의해 실시될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이들 컴퓨터 프로그램 지침은 범용 컴퓨터, 특수 목적 컴퓨터, ASIC, 및/또는 다른 프로그램가능 데이타 처리 장치의 프로세서에 제공될 수 있고, 지침 (이는 컴퓨터 및/또는 다른 프로그램가능 데이타 처리 장치의 프로세서를 통해 실시됨) 은 작업 설명 및/또는 블록 도표 내에 구체화된 기능/작용을 실시하기 위한 수단을 만든다. 따라서, 블록 도표 및 작업 설명은 장치, 방법 및 컴퓨터 프로그램 제품을 지원하는 것으로 이해될 것이다.
운영 체제와 같은 다른 소프트웨어가 또한 포함될 수 있다. 다중 서열 정렬 모듈, 지도화 모듈 및/또는 본원에서 기술된 다른 모듈의 기능은 별개의 하드웨어 부품, 하나 이상의 특수 용도의 집적 회로 (ASIC) 및/또는 하나 이상의 특수 목적 디지탈 프로세서 및/또는 컴퓨터를 사용하여 적어도 부분적으로 구현될 수 있다는 것이 추가로 이해될 것이다.
본원에서 사용된 "지도화" 는 관찰된 각각의 새로운 뉴클레오티드 서열 변이에 마디를 부여하고, 그 마디를 동일한 염색체 또는 시스트론 상에서 동일한 개체가 보유하는 알려진 서열을 나타내는 또다른 마디에 연결시키고, 각각의 마디에 나타난 각각의 유형의 대상의 수를 계수함으로써 계통수를 만드는 것을 의미한다. 상기 방식으로 만든 계통수의 예에 대해 도 4 를 참조한다.
"계통발생적" 은 하나의 종 내의 유기체 또는 개체의 다양한 군 간의 진화적 연결의 연구와 관련된 것을 의미한다. 유전적 정보가 용이하게 입수가능하기 전에, 계통발생은 주로 표현형 관찰에 기초했다. 본원에서 사용된 "계통발생적 지도화" 는 진화적 연결 및 분기의 연대를 결정하기 위해 DNA 서열 데이타를 사용하여 복수의 개체가 보유하는 관련된 서열 변이를 연결하는 것을 의미한다. "계통수" 는 변이 간 연결을 지도화한 결과이다.
본원에서 사용된 "마디" 는 하나 이상의 대상이 보유하는 실제 변이 서열을 나타내는 계통수 상의 다형성 데이타 점을 의미한다. 마디는 동일한 염색체 상에서 및 동일한 시스트론 내이지만 그 시스트론 내의 상이한 유전적 좌위에서 동일한 개체가 보유하는 변이 서열을 나타내는 또다른 마디로 가지에 의해 연결된다. 마디의 존재는 하나 이상의 대상이 그 마디에 의해 지시되는 서열 뿐만 아니라 가지에 의해 연결된 이웃 마디가 나타내는 서열도 보유했음을 나타낸다.
본원에서 사용된 "가지" 는 2 개의 구별되는 변이 서열 또는 일배체형을 나타내는 2 개의 마디 간 연결을 의미하고, 이 경우 2 개의 변이는 개체로부터의 동일한 염색체 상에 및 동일한 시스트론 내에 위치한다. "분지 점" 은 그로부터 2 개 이상의 가지가 확장된 임의의 마디를 의미하지만, 본원에서는 특히 그로부터 3 개 이상의 마디가 확장된 뿌리 마디를 언급하는데 사용된다. "뿌리 마디" 는 그로부터 유전적 분기가, 연결된 마디에 의해 나타난 다양한 인근의 서열 변이를 생성한 공통 진화적 조상의 유전적 서열을 나타낸다.
본원에서 사용된 "반복적으로" 는 연속적으로 각각의 특징에 대한 값의 반복적 계산을 언급한다. 예를 들어, 계통수 상의 각각의 마디를 분석하여 관심의 상태 (예컨대 알츠하이머병) 에 영향받은 대상 대 대조군 영향받지 않은 대상의 수의 비를 계산하고; 이 비를 연결된 마디와 비교하여 관심의 상태, 장애 또는 질환의 발달에 대한 증가된 또는 감소된 위험과의 연관성을 찾는다. 하나의 마디 및 다음 마디 간의 상기 비의 실질적 변화는 더 이른 질환 발병의 위험을 증가 또는 감소시키는 변이의 존재를 나타낸다. "유전적 변이를 반복적으로 조사하는 것" 은 가장 많은 수의 개체가 공유하는 서열을 나타내는 마디로 분석을 시작하고, 이어서 그 마디로부터 확장된 가지에 의해 연결된 마디, 그 후 두번째 수준의 마디 등을 분석하는 것을 의미한다. 그 후 분석은 전반적으로 나무의 뿌리로부터 나무의 마디 및 외부 가지를 향해 진행한다.
본원에서 사용된 "치료" 는 대상의 건강의 특정 양상에 변화를 가져오기 위해 도입되는 (즉 특정 질환, 장애 또는 상태에 대해 지시되는) 임의의 약물, 절차, 생활방식 변화 또는 다른 조정을 포함한다.
본원에서 사용된 "약물" 은 질환 또는 상태를 치료 또는 예방 또는 통제하기 위해 개인에게 투여되는 화학물 또는 생물학적 산물, 또는 화학물 또는 생물학적 산물의 조합을 언급한다. 본원에서 사용된 용어 "약물" 은 용어 "약", "약제", "치료적 개입" 또는 "약학적 제품" 과 동의어이다. 가장 바람직하게는 약물은 하나 이상의 특정 질환 또는 상태의 치료에 대해 정부 기관에 의해 승인된다.
"질환", "장애" 및 "상태" 는 당업계에서 통상적으로 인식되고, 일반적으로 비정상적 및/또는 바람직하지 않은 것으로 인식되는 개체 또는 환자의 징후 및/또는 증상의 존재를 지적한다. 질환 또는 상태는 병적 변화에 기초하여 분류 및 진단될 수 있다. 질환 또는 상태는 Harrison's Principles of Internal Medicine, 1997 또는 Robbins Pathologic Basis of Diseases, 1998 과 같은 표준 문서에 열거된 질환의 유형으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용된 "미토콘드리아 기능이상" 은 세포 또는 세포들 내의 미토콘드리아의 임의의 유해한 이상을 의미한다. 미토콘드리아 기능이상과 관련된 것으로 당업계에 현재 알려진 일부 질환, 장애 또는 상태는 알츠하이머병, 파키슨병, 및 다른 신경변성 질환, 뇌졸중 및 심장 발작에서의 허혈 재관류 손상, 간질, 당뇨병 및 노화를 포함한다. 많은 다른 질환, 장애 및 상태가 미토콘드리아 기능이상과 관련되었다. 실제로, 미토콘드리아는 대부분의 세포 유형의 적절한 기능에 중요하고, 미토콘드리아 감소는 종종 세포사를 초래한다. 이 미토콘드리아 기능이상은 ATP 생산을 저하시키고, 칼슘 항상성을 파괴하고, 산화 스트레스를 증가시킴으로써 세포 손상 및 사망을 야기한다. 더욱이, 미토콘드리아 손상은 세포질 내로 시토크롬 c 및 다른 세포자멸촉진 인자의 방출을 야기함으로써 세포자멸적 세포사를 초래할 수 있다 (검토를 위해, Wallace, 1999; Schapira, 2006 참조). 본원에 기재된 특정 실시예와 관련하여, ApoE 3 및 ApoE 4 동종형은 TOMM40 과의 상호작용을 통해 미토콘드리아 기능이상을 야기하는 것으로 가정된다. 일부 TOMM40 변이는 ApoE 3 동종형과 상승적으로 작용하여 미토콘드리아 감소를 가속화할 수 있다. 이 미토콘드리아 메카니즘은 많은 복합 유전적 질환, 장애 및 상태에 기여하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용된 "대상" 은 바람직하게는 인간 대상이나 이에 제한되지 않는다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있고, 백인, 미국 흑인, 흑인, 아시아인, 히스패닉, 인디안 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 인종 또는 민족일 수 있다. 대상은 갓난아기, 신생아, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인을 포함하는 임의의 연령일 수 있다. 대상은 또한 동물 대상, 특히 포유류 대상 예컨대 개, 고양이, 소, 염소, 말, 양, 돼지, 설치류 (예, 랫트 및 마우스), 토끼목, 영장류 (비인간 영장류를 포함함) 등을 포함할 수 있고, 수의학 또는 약학적 약물 개발 목적을 위해 검색될 수 있다.
본원에서 사용된 "치료하다" "치료하는" 또는 "치료" 는 환자의 상태 (예, 하나 이상의 증상) 의 개선, 질환 등의 발병 또는 진행의 지연을 포함하는 질환으로 고통받는 환자에게 유익을 주는 임의의 유형의 조치를 언급한다.
본원에서 사용된 "후기발병 알츠하이머병" 또는 "LOAD" 는 당업계에 알려져 있고, 알츠하이머병이 65 세 후에 진단되거나 발병하는 경우 사용되는 분류이다. 이는 알츠하이머병의 가장 흔한 형태이다.
2. 유전적 변이를 식별하기 위한 방법
게놈 전체 스캔에서 유래된 연관성의 목록은 유용하지만, 질환 복합성을 설명하는데 일반적으로 부적당하다. 유전자의 상호작용, 경로 및 가계는 특이성을 제공할 수 있다. 고해상도 변이 지도화는 복합적 유전적 상호작용에 대한 해답을 밝힐 수 있다. 이는 그 자체로는 관심의 질환, 장애 또는 상태에 대한 연관성을 완전히 설명하지 않는 하나의 알려진 유전적 위험 인자가 더욱 상세한 조사를 위한 뛰어난 후보 유전적 좌위를 제시할 수 있는 경우에 특히 적용가능하다. 더욱이, 약리유전학은 약물 개발에 유용한 한편, 또한 생물학적 연관성을 확장시킬 수 있다. 다수의 개체로부터의 서열 데이타의 분석으로 집단 내 개체간 유전자 서열의 변이를 발견하는 것은 집단 내 모든 변이 중 더 많은 부분의 탐지를 산출할 것이다.
본 발명의 방법에 의해 분석될 초기 서열 정보는 복수의 대상의 게놈 DNA 로부터 유래된다. 유기체는 그에 대한 다수의 서열이 입수가능한 임의의 유기체일 수 있으나, 바람직하게는 인간으로부터이다. 새로운 변이의 식별시 종종 인종, 민족, 성별 및/또는 지리적 기원에 기초하여 상이한 집단 군을 스크리닝하는 것이 유용한데, 이는 그러한 군 간에 빈도에 있어서 특정 변이가 상이할 수 있기 때문이다. 가장 바람직하게는, 다유전자적으로 여겨지는 질환 또는 장애 (유전적으로 복합적인 질환/장애) 에 대해, 대상 집단에 의해 나타난 표현형은 스펙트럼의 극단으로부터이다. DNA 를 포함하는 생물학적 샘플은 혈액, 정액, 볼 면봉 수득물 등일 수 있다. 상기 샘플로부터의 DNA 의 분리는 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 주어진 질환, 장애 또는 상태에 대해 하나 이상의 알려진 위험 인자 (유전적 또는 다른 경우) 를 갖는 복수의 대상으로부터의 뉴클레오티드 서열 데이타의 분석에 관한 것이다. 뉴클레오티드 서열이 분석되어 일배체형 데이타를 생성한 후, 일배체형 또는 유전적 변이가 계통수 상에 지도화되어, 나타난 서열의 진화를 설명한다. 이 나무를 복수의 대상에 대한 표현형 데이타와 비교하여, 계통수 상에서 관찰된 일배체형을 보유하는 개체에 대해 예후 또는 진단이 가능하다.
다른 구현예에서, 본 발명은 집단 군의 유전적 차이에 따라 조정된 약물이 개발되고/되거나 적당한 유전적 프로파일로 개체에게 투여될 수 있도록, 질환에 대한 개체의 감수성 및/또는 특정 약물 또는 약물들에 대한 개체의 반응을 예측하기 위한 유전적 일배체형 정보의 용도 및 약리유전학 및 약리유전체학의 분야에 관한 것이다.
뉴클레오티드 서열 정보는 게놈 DNA 로부터 유래된다. 사용된 유전자 서열 데이타는 임상적 또는 비인간 동물로부터 또는 배양된 세포 또는 분리된 조직 연구로부터 수득될 수 있다. 유기체는 그에 대해 다수의 서열이 입수가능한 임의의 유기체일 수 있으나, 바람직하게는 인간으로부터이다. 새로운 변이의 식별시 종종 인종, 민족, 성별 및/또는 지리적 기원에 기초하여 상이한 집단 군을 스크리닝하는 것이 유용한데, 이는 그러한 군 간에 빈도에 있어서 특정 변이가 상이할 수 있기 때문이다. 가장 바람직하게는, 다유전자적으로 여겨지는 질환 또는 장애 (유전적으로 복합적인 질환/장애) 에 대해, 대상 집단에 의해 나타난 표현형은 반대 극단이다.
DNA 를 포함하는 생물학적 샘플은 혈액, 정액, 볼 면봉 수득물 등일 수 있다. 상기 샘플로부터의 DNA 의 분리는 당업계에 알려져 있다. 관심의 특정 유전적 좌위에서 DNA 서열을 결정하는 방법이 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 자동 시퀀싱은 현재 광범위하게 이용가능하고, 관심의 유전적 좌위에 매우 근접한 또는 그 안의 고도로 보존된 서열을 인식하도록 특이적으로 디자인된 하나 이상의 프라이머 및 분리된 DNA 샘플만을 요구한다.
일부 구현예에 따라, 관심의 규정된 유전적 영역 또는 좌위 (예, 정방향 및 역방향 PCR 프라이머의 세트에 의해 규정됨) 가 특정 장애에 대해 잘 특징화된 환자를 포함하는 사람들의 코호트로부터 신중하게 서열화된다.
공통 서열이 결정되고, 주어진 유전적 좌위에 대한 모든 관찰된 서열 변이가 목록으로 작성된다. 가장 많은 수의 관찰된 변이를 갖는 좌위는 공통의 조상으로부터의 진화적 분지를 나타낸다. 그와 같이, 이들 좌위는 오직 하나 또는 매우 적은 관찰된 변이를 갖는 좌위에 cis 로 연결된다. 적어도 조사의 초기 단계 중에, 유사한 조상을 나타내는 공통의 일반적 표현형을 공유하는 대상의 군 내로 집단이 분석되는 것이 바람직하다. 그렇지 않은 경우, 계통수의 구성을 통한 이들 데이타의 분석은 엄청나게 다수의 대상을 요구할 것이다.
3. 다중 서열 정렬.
집단 내 유전자 또는 유전적 영역 내 특정 변이 또는 복수의 변이의 존재를 결정하는 것은, 고도로 보존된 것으로 알려진 관심의 영역 내의 서열을 표적화함으로써 특정 유전적 좌위의 위치를 찾아내는 것을 수반하는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 고도로 보존된 좌위로부터, 인접한 서열은 당업계에 잘 알려진 많은 기술 중 하나를 통해 용이하게 수득된다.
복수의 대상으로부터 평행 DNA 서열을 분석하는 첫번째 단계는 다중 서열 정렬 ("MSA") 이다. MSA 는 전형적으로는 유전자 또는 유전적 영역 내에서 다형성 차이를 갖는 상동 샘플로부터 서열 정렬을 표시하여 보존된 부위 및 변이 서열을 나타내는데 이용된다. 관심의 좌위에서 수득된 서열 정보의 MSA 는 하나 이상의 다양한 알려진 기술 및 공개적으로 입수가능한 소프트웨어를 사용하여 구성될 수 있고, 인터넷을 포함하는 많은 출처로부터 공개적으로 입수가능하다. 당업계에 알려진 다중 서열 정렬을 분석하는 방법은 예를 들어 Sjolander 의 미국 특허 제 6,128,587 호; Schork et al. 의 미국 특허 제 6,291,182 호; 및 Stanton et al. 의 미국 특허 제 6,401,043 호에 기술된 것을 포함한다.
4. 계통수 및 분석.
"계통수" 의 구성에 대한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, Sanderson, 2008 참조). Sun et al. 은 "일배체형 블록" 분석을 사용하여 톨라이크 수용체 (TLR) 변이 및 전립선 암 간의 연관성을 연구했고 (2005), Bardel et al. (2005) 은 분지학적 분석 접근을 사용하여 CARD15 유전적 변이 및 크론병 간의 연관성을 조사했다. 그러나, 어느 누구도 질환과 이전에 관련되었던 유전적 좌위를 이용하여 연관을 조사하지 않았다.
일부 구현예에 따른 계통수는 위상기하학에 의해 구성될 수 있고, 연구되는 개인 대상에서 관찰되는 일배체형 서열 변이는 나무 상의 마디 (데이타에서 관찰된 각각의 서열을 나타냄) 를 형성한다. 마디는 다른 마디에 연결될 수 있고, 공통의 조상은 나무의 분지 부위, 공통의 뿌리 또는 뿌리 마디에서 발견된다. 계통수는 그에 대해 데이타가 분석된 유전적 좌위 간의 진화적 관계를 반영한다 (Sanderson, 2008; Tzeng, 2005; Seltman, 2003 참조). 도 4 는 도 3 에 나타난 유전적 좌위의 영역 B 에 대해 구성된 상세한 계통수를 나타낸다.
계통수 평가에 대한 시작점은 일반적으로 MSA 이다 (상기 참조). 서열 데이타에 기초하여 계통수를 구성하는데 다수의 응용 소프트웨어가 입수가능하다. 예를 들어, Brocklebank, et al. 의 미국 특허 제 7,127,466 호 및 미국 특허 제 6,532,467 호를 참조한다. 기본 전제는 많은 변이를 나타내는 유전적 좌위가 cis 로 연결된 이들 변이에 의해 나타난다는 것이다. 다형성은 관련된 서열의 군 또는 일배체형을 규정하는 나무 내에서 분지점 (마디) 을 만든다.
계통수는 상태에 영향받은 대상 대 영향받지 않은 대조군 대상의 비를 반복적으로 조사함으로써 정보를 위해 이용된다; 계산은 가장 많은 수의 대상에서 관찰되는 마디에서 시작하여 더 적은 대상에서 관찰되는 마디로 나무의 주변부를 향해 이동한다. 관심의 상태에 영향받은 대상 대 영향받지 않은 대조군 대상의 비에 있어서 실질적 변화가 존재하는 마디, 가지 또는 분지점의 위치를 찾는 것이 목표이다. 그러한 분지점은 더 낮은 위험 대상으로부터 더 높은 위험 대상의 진화적 분지 또는 그 반대를 나타낸다.
생성된 계통수의 통계적 분석은 당업계에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 하나의 당업계에 인식된 방법은 붓스트랩 신뢰 수준의 계산이다 (Efron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13429-13434 (1996) 참조).
5. 환자 평가.
일단 특정 유전적 좌위에 대해 계통수가 생성되면, 개체는 그의 DNA 서열을 계통수를 구성하는 서열과 비교함으로써 평가될 수 있다. 관심의 상태의 더 높은 발생률 (즉, 질환 또는 장애에 영향받은 대상 대 영향받지 않은 대조군 대상의 더 높은 비) 을 갖는 대상을 나타내는 나무의 영역에 상응하는 일배체형 또는 서열 변이의 존재는 개체가 또한 증가된 위험에 있음을 의미할 것이다. 역으로 실질적으로 더 낮은 비는 관심의 상태의 발달의 감소된 위험에 상응한다.
계통수는 또한 일부 구현예에 따른 관심의 치료 방법 또는 활성제에 의한 치료에 대한 관심의 상태의 반응에 기초하여 분석될 수 있다.
6. APOE 및 TOMM40.
ApoE 표현형 및 유전자형은 당업계에 잘 알려져 있다. ApoE 에 대한 확립된 명명법 시스템 뿐만 아니라 표현형 및 유전자형이 예를 들어, Zannis et al., 1982 에 기술되어 있고, 이는 본원에서 참조에 의해 포함된다.
TOMM40 (The Outer Mitochondrial Membrane channel subunit, 40kDa) 표현형 및 유전자형이 또한 알려져 있다. TOMM40 은 미토콘드리아 내로의 단백질 내수송에 필수적인 미토콘드리아 막 내에 존재하는 트랜스로케이스의 채널 형성 서브유닛로서 기능한다.
알츠하이머병 환자의 연구로부터의 게놈 전체 연관성 스캐닝 데이타는 아포지질단백질 E (ApoE) 유전자를 포함하는 연관 불균형 영역을 명백히 식별했다. ApoE 4 변이는 1993 년의 초기 공개 (예를 들어, Corder et al. 참조) 이후 확립된 감수성 유전자로서 폭넓게 복제되어 왔다. 그러나, 게놈 전체 연관성 스캐닝 데이타는 외부 미토콘드리아 막으로의 ApoE 및 TOMM40 동시 국소화를 수반하는 세포 생물학 연구에서 관찰된 주목할 만한 "일치" 를 산출했다. 상기 다른 유전자, TOMM40 은 1998 년에 ApoE 주위의 연관 불균형을 모델링하는 연구 중에 최초로 발견되었다. 다형성은 작은 연관 불균형 영역 내의 ApoE 에 인접하여 위치해 있었다.
ApoE 는 외부 미토콘드리아 막으로 동시 국소화하고, 이는 알츠하이머병 발현의 조기 단계로서 ApoE-유도된 미토콘드리아 어팝토시스에 대한 잠재적 역할을 초래하는 동종형-특이적 상호작용을 시사한다. 생물학적 데이타는 신경 세포 배양물 내의 이동 미토콘드리아의 비율 뿐만 아니라 미토콘드리아의 이동 속도 및 통과 거리가, 증가된 미토콘드리아 어팝토시스에 영향을 미치는 인자임을 증명했다. 계통발생적 데이타는 TOMM40 에 대한 알츠하이머병의 발달에 대한 독립적 유적적 효과를 시사한다.
ApoE 는 인간 신경세포 배양물 내의 미토콘드리아에 특이적으로 결합하고 (Chang, 2005), TOMM40 의 유전적 변이 진화를 지도화하는 것과 조합된 수백명의 알츠하이머병 환자 및 짝지은 대조군 내의 상기 연관 불균형 영역의 시퀀싱은, 도 3 에 나타난 바와 같은 ApoE-TOMM40 상호작용에 대한 특별한 관심의 영역을 규정한다. 상기 진화적 데이타는 ApoE 및 TOMM40 간의 유전적 연관성을 추가로 지지하고, 미토콘드리아 기능이상이 다년에 걸쳐 서서히 발생하는 신경세포 사망의 원인이 될 수 있음을 시사한다. 알츠하이머병에 대한 발병의 연령 분포는 (예를 들어, Roses et al. 의 미국 특허 제 6,027,896 호 참조) 질환의 임상적 발현을 초래하는 2 개의 생화학적으로 상호작용하는 단백질의 강하게 연관된 변이의 유전을 반영할 수 있다.
본원에서 상술된 바와 같이, ApoE 대립유전자 및 TOMM40 변이의 다수의 일배체형 간의 상호작용은 알츠하이머병 발병기전에 기여한다; 특히, ApoE 의 E 3 대립유전자에 연관된 TOMM40 의 일배체형이 질환 발병기전에 기여한다. TOMM40 유전적 변이 중 몇몇은 오직 ApoE 3 에 cis-연결되도록 진화했다 (유사하게, 특이적 TOMM40 변이는 ApoE 4 또는 ApoE 2 에 cis-연결되도록 진화했을 수 있다.) 따라서, TOMM40 변이의 임의의 부가된 유전적 효과는 ApoE 4 와 독립적으로 분리되나, 2 개의 변이 단백질 산물은 trans 에서 기능적으로 상호작용하여 주어진 관찰가능한 표현형 또는 형질을 생성할 수 있다. 따라서, TOMM40 변이의 임의의 부가된 유전적 효과는 ApoE 4 로부터 독립적으로 분리된다. 인접한 상호작용하는 유전자의 상기 "일치" 는 모든 알츠하이머병 게놈 전체 연관성 스캐닝 연구에서 발견된 매우 유의한 통계적 연관성 데이타를 설명할 수 있다. 초기의 상업적으로 입수가능한 게놈 전체 연관성 스캐닝 플랫폼이 임의의 ApoE 다형성을 포함하지 않았으나, TOMM40 및 ApoC1 SNP 에 의해 식별되었음을 언급하는 것은 흥미롭다 (그러나 상기 영역은 거의 항상 "ApoE 영역" 으로 언급됨).
발병기전의 추정되는 분자 메카니즘 및 질환 유전학을 조합시키는 상기 데이타는 또한 약리유전학 맥락에서 생각될 수 있다. ApoE 4 대립유전자 유전의 강한 유전적 효과 때문에, ApoE 4 는 10 년 이상 동안 복합 감수성 유전자로서 언급되어 왔다. ApoE 유전자형의 함수로서 발병의 연령 분포의 일관된 반복은 ApoE 3 유전의 역할이 전적으로 양성이 아니지만 질환 발생의 더 느린 속도에서 관찰되는 더 낮은 위험 인자라는 것을 확인한다. 연관 불균형 영역 내에 ApoE 3 을 포함하는 DNA 가닥 상에만 위치하는, 따라서 게놈 전체 연관성 패널 내의 SNP 에 대해 요구되는 하디-바인베르크 평형에 있지 않은, TOMM40 의 유전적 변이가 존재한다 (Roses et al., 비공개 데이타). 오직 ApoE 3 으로 cis-연결된 TOMM40 서열 내의 진화적 변화는 ApoE 3 과 관련된 알츠하이머병의 위험을 증가시키는 작용을 하는 한편, ApoE 3 으로 cis-연결된 TOMM40 의 다른 변이는 ApoE 3 와 관련된 위험을 감소시킨다. 독립적 유전적 시험은 더 적은 알츠하이머병과 관련된 상기 TOMM40 다형성이 유전자형 [ApoE 3/3 또는 ApoE 4/3] 을 포함하는 ApoE 3 에 대한 발병의 연령 분포 플롯의 연령 중 더 늦은 연령에 분리되는지 여부를 결정할 것이다.
대상에서 ApoE 2, 3 또는 4, 및/또는 TOMM40 일배체형의 또는 동일한 것을 인코딩하는 DNA 의 존재 또는 부존재 (일부 구현예에서, 각각에 대한 대립유전자의 수를 포함함) 를 탐지하는 것은 임의의 적합한 수단에 의해 직접 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 다양한 기술이 당업자에게 알려져 있다. 모든 기술은 일반적으로 대상으로부터 DNA 또는 단백질을 포함하는 생물학적 물질의 샘플을 수집한 후, 대상이 관심의 일배체형을 소지하는지 여부를 탐지하는 단계를 수반한다. 예를 들어, ApoE 에 대한 탐지 단계는 대상으로부터 ApoE 샘플을 수집한 후 (예를 들어, 뇌척수액, 또는 ApoE 를 포함하는 임의의 다른 유체 또는 조직으로부터), ApoE 샘플 내의 ApoE 2, 3 또는 4 동종형의 존재 또는 부존재를 결정함으로써 (예, 등전 포커싱 또는 면역검정에 의해) 수행될 수 있다.
ApoE 및/또는 TOMM40 동종형을 인코딩하는 DNA 의 존재 또는 부존재를 결정하는 것은 적합한 탐지가능한 기로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브에 의한 관심의 게놈 DNA 영역의 직접적 시퀀싱에 의해, 및/또는 중합효소 연쇄반응 또는 라이게이스 연쇄반응과 같은 증폭 반응에 의해 수행될 수 있다 (증폭 반응의 산물은 그 후 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 다수의 다른 기술에 의해 탐지될 수 있음). 또한, 탐지 단계는 TOMM40 일배체형 및/또는 ApoE 를 인코딩하는 유전자에 대해 대상이 이종접합체 또는 동종접합체인지 여부를 탐지하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 수많은 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브 검정 포맷이 알려져 있다. 예를 들어, Wahl et al. 의 미국 특허 제 4,302,204 호; Falkow et al. 의 미국 특허 제 4,358,535 호; Ranki et al. 의 미국 특허 제 4,563,419 호; 및 Stavrianopoulos et al. 의 미국 특허 제 4,994,373 호를 참조한다 (출원인은 본원에서 언급된 모든 미국 특허 참조의 공개가 참조에 의해 본원에 포함되는 것을 특히 의도함).
일부 구현예에서, 탐지는 DNA 의 멀티플렉스 증폭 (예, 대립유전자-특이적 형광 PCR) 을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 탐지는 마이크로어레이 (칩, 비드 등) 로의 하이브리드화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 탐지는 탐지될 일배체형을 포함하는 유전자의 적당한 부분을 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 효소에 의한 소화에 대한 감수성을 변화시키는 일배체형이 탐지에 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 제한 효소가 DNA 에 적용될 때 소화 패턴을 나타내는 제한 절편 길이 다형성 (RFLP) 이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 일배체형의 존재는 대립유전자 특이적 증폭에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 일배체형의 존재는 프라이머 확장에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 일배체형의 존재는 올리고뉴클레오티드 결찰에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 일배체형의 존재는 탐지가능하게 표지된 프로브에 의한 하이브리드화에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, Sun et al. 의 미국 특허 출원 공개 제 2008/0153088 호; Kobler et al., Identification of an 11T allele in the polypyrimidine tract of intron 8 of the CFTR gene, Genetics in Medicine 8(2): 125-8 (2006); Costa et al., Multiplex Allele-Specific Fluorescent PCR for Haplotyping the IVS8 (TG)m(T)n Locus in the CFTR Gene, Clin. Chem., 54:1564-1567 (2008); Johnson et al., A Comparative Study of Five Technologically Diverse CFTR Testing Platforms, J. Mol. Diagnostics, 9(3) (2007); Pratt et al., Development of Genomic Reference Materials for Cystic Fibrosis Genetic Testing, J. Mol. Diagnostics, 11:186-193 (2009) 를 참조한다.
선택된, 또는 표적, 핵산 서열의 증폭은 생물학적 샘플로부터 분리된 DNA 에 대한 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로 D. Kwoh and T. Kwoh, 1990 을 참조한다. 적합한 증폭 기술의 예는 중합효소 연쇄반응, 라이게이스 연쇄반응, 가닥 배치 증폭 (일반적으로 Walker et al., 1992a; Walker et al., 1992b 참조), 전사-기반 증폭 (Kwoh et al., 1989 참조), 자기-지속적 서열 복제 (또는 "3SR") (Guatelli et al., 1990 참조), Qβ 레플리케이스 시스템 (Lizardi et al., 1988 참조), 핵산 서열-기반 증폭 (또는 "NASBA") (Lewis, 1992 참조), 복구 연쇄반응 (또는 "RCR") (Lewis, supra 참조) 및 부메랑 DNA 증폭 (또는 "BDA") (Lewis, supra 참조) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 중합효소 연쇄반응이 현재 바람직하다.
상기와 같은 DNA 증폭 기술은 ApoE 4 를 인코딩하는 DNA 에는 특이적으로 결합하지만 동일한 하이브리드화 조건 하에서 ApoE 2 또는 ApoE 3 을 인코딩하는 DNA 에는 결합하지 않고, 증폭 반응에서 ApoE 4 DNA 또는 그의 부분의 증폭에 대한 프라이머 또는 프라이머들로서 역할을 하는, 프로브, 한 쌍의 프로브 또는 두 쌍의 프로브의 사용을 수반할 수 있다. 마찬가지로, ApoE 2 를 인코딩하는 DNA 에는 특이적으로 결합하지만 동일한 하이브리드화 조건 하에서 ApoE 3 또는 ApoE 4 를 인코딩하는 DNA 에는 결합하지 않고, 증폭 반응에서 ApoE 2 DNA 또는 그의 부분의 증폭에 대한 프라이머 또는 프라이머들로서 역할을 하는, 프로브, 한 쌍의 프로브 또는 두 쌍의 프로브를 사용할 수 있고; ApoE 3 를 인코딩하는 DNA 에는 특이적으로 결합하지만 동일한 하이브리드화 조건 하에서 ApoE 2 또는 ApoE 4 를 인코딩하는 DNA 에는 결합하지 않고, 증폭 반응에서 ApoE 3 DNA 또는 그의 부분의 증폭에 대한 프라이머 또는 프라이머들로서 역할을 하는, 프로브, 한 쌍의 프로브 또는 두 쌍의 프로브를 사용할 수 있다.
유사하게, 관심의 TOMM40 일배체형을 인코딩하는 DNA 에는 특이적으로 결합하지만 동일한 하이브리드화 조건 하에서 다른 TOMM40 일배체형에는 결합하지 않고, 증폭 반응에서 TOMM40 DNA 또는 그의 부분의 증폭에 대한 프라이머 또는 프라이머들로서 역할을 하는, 프로브, 한 쌍의 프로브 또는 두 쌍의 프로브를 사용할 수 있다.
일반적으로, ApoE 및/또는 TOMM40 일배체형을 인코딩하는 DNA 를 탐지하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 프로브는 관심의 일배체형을 인코딩하는 DNA 에는 결합하나, 동일한 하이브리드화 조건 하에서 다른 일배체형을 인코딩하는 DNA 에는 결합하지 않는 올리고뉴클레오티드 프로브이다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 항체와 함께 하기와 같은 적합한 탐지가능한 기로 표지된다.
중합효소 연쇄반응(PCR) 은 알려진 기술에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,683,195 호; 제 4,683,202 호; 제 4,800,159 호; 및 제 4,965,188 호를 참조한다. 일반적으로, PCR 은 먼저 하이브리드화 조건 하에 탐지될 특정 서열의 각각의 가닥에 대한 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 핵산 샘플을 처리하여 (예, 내열성 DNA 중합효소의 존재 하에) 각각의 핵산 가닥에 상보적인 각각의 프라이머의 확장 산물이 합성되도록 하고, 특정 서열의 각각의 가닥에 충분히 상보적인 프라이머가 그와 하이브리드화하여 각각의 프라이머로부터 합성된 확장 산물이 그의 상보체로부터 분리되는 경우 다른 프라이머의 확장 산물의 합성에 대한 주형으로서 역할을 할 수 있도록 하고, 그 후 탐지될 서열 또는 서열들이 존재하는 경우 변성 조건 하에 샘플을 처리하여 그의 주형으로부터 프라이머 확장 산물을 분리시키는 것을 포함한다. 상기 단계들은 바람직한 정도의 증폭이 수득되는 경우까지 주기적으로 반복된다. 증폭된 서열의 탐지는 반응 산물과 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 (예, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브) 를 반응 산물에 부가하고 (상기 프로브는 탐지가능한 표지를 보유함), 그 후 알려진 기술에 따라, 또는 겔 상에서의 직접적 시각화에 의해 표지를 탐지함으로써 수행될 수 있다.
PCR 조건이 모든 ApoE 대립유전자 유형의 증폭을 허용하는 경우, 그 유형은 대립유전자 특이적 프로브와의 하이브리드화에 의해, 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해, 변성 구배 겔 상의 전기영동, 또는 다른 기술에 의해 구별될 수 있다. ApoE 유전자형을 결정하기 위한 PCR 프로토콜은 본원에서 참조에 의해 포함된 Wenham et al. (1991) 에 기술되어 있다. ApoE 동종형의 식별 및 증폭에 효과적인 프라이머의 예가 상기에 기술되어 있다. ApoE 다형성 영역 (ApoE 4, E3 또는 E2) 에 특이적인 프라이머가 이용될 수 있다. Wenham 에서, 예를 들어, ApoE 다형성 부위 (뉴클레오티드 3745 및 3883 을 포함하는 코돈 112 및 158) 를 포괄하는 DNA 의 227 bp 영역을 증폭하는 PCR 프라이머가 이용된다. 증폭된 절편은 그 후 전기영동 겔 상에서 인지가능할 수 있는 6 개의 가능한 ApoE 유전자형으로부터의 상이한 제한 절편을 제공하는 제한 엔도뉴클레아제 CfoI 로 처리된다. 또한 부가적 방법에 대해 본원에서 참조에 의해 포함된 Hixon et al. (1990); Houlston et al. (1989) Wenham et al. (1991); 및 Konrula et al. (1990) 을 참조한다.
알츠하이머병 이외에, 본 발명의 방법이 기존의 분석에 비해 장점을 제공하는 몇몇 다른 유전적으로 복합적인 질환 및 장애가 존재한다. 예를 들어, 다수의 제 2 형 당뇨병 유전적 연구로부터의 데이타는 매우 큰 임상적 사례/대조군 시리즈가 게놈 전체 연관성 연구에 의해 규정된 좌위에 대한 통계적 유의성을 제공하는데 필요할 것이라는 관점을 지지한다.
7. 활성제, 조성물 및 치료.
상기와 같이, 본원에서 상술된 방법을 사용하여 만들어진 계통수는 또한 일부 구현예에 따른 관심의 치료 방법 또는 활성제에 의한 치료에 대한 관심의 상태의 반응성에 기초하여 분석될 수 있고, 대상 또는 환자에 대한 치료 결정은 식별된 특이적 유전적 변이에 기초할 수 있다.
활성제. 활성제는 관심의 상태의 치료에 대해 알려진 것을 포함하고, 티아졸리딘디온 또는 글리타자 계열의 약물을 제한없이 포함하는, 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, 및 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체 (PPAR) 작용제 또는 조정제를 제한없이 포함하는, 항알츠하이머병 활성제를 포함한다. 활성제는 또한 생물약학적 제품, 예를 들어 항체 (예, 모노클론성, 폴리클론성, 유도체 또는 수식 항체 예컨대 Domain Antibodies™, 바피뉴주맙 등), 융합 단백질 또는 치료적 RNA 분자일 수 있다. 활성제는 또한 상기 제품의 임의의 조합일 수 있다.
아세틸콜린에스테라제 억제제의 예는 도네페질 (ARICEPT 로서 상업적으로 입수가능함), 갈란타민 (RAZADYNE 으로서 상업적으로 입수가능함), 및 리바스티그민 (EXELON 으로서 상업적으로 입수가능함) 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 부가적 예는 미국 특허 제 6,303,633 호; 제 5,965,569 호; 제 5,595,883 호; 제 5,574,046 호; 및 제 5,171,750 호에 기술된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다 (본원에서 언급된 모든 미국 특허 참조의 공개는 그 전체가 본원에서 참조에 의해 포함됨).
NMDA 수용체 대항제의 예는 메만틴 (AKATINOL, AXURA, EBIXIA/ABIXIA, MEMOX 및 NAMENDA 로서 상업적으로 입수가능함) 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 부가적 예는 미국 특허 제 6,956,055 호; 제 6,828,462 호; 제 6,642,267 호; 제 6,432,985 호; 및 제 5,990126 호에 기술된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
티아졸리딘디온의 예는 로시글리타존 (AVANDIA 로서 상업적으로 입수가능함) 및 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 부가적 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-벤조티아졸릴)아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-벤조티아졸릴)아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-벤족사졸릴)아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-벤족사졸릴)아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-피리미디닐)아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-피리미디닐)아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-(2-(N-메틸-N-[2-(4,5-디메틸티아졸릴)]아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4,5-디메틸티아졸릴)]아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-티아졸릴)아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-티아졸릴)아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-[4-(2-(N-메틸-N-(2-(4-페닐티아졸릴))아미노)에톡시)벤질]-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-(4-페닐티아졸릴))아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4-페닐-5-메틸티아졸릴)]아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4-페닐-5-메틸티아졸릴)]아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4-메틸-5-페닐티아졸릴)]아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4-메틸-5-페닐티아졸릴)]아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4-메틸티아졸릴)]아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4-메틸티아졸릴)]아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-[4-(2-(N-메틸-N-[2-(5-페닐옥사졸릴)]아미노)에톡시)벤질]-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(5-페닐옥사졸릴)]아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4,5-디메틸옥사졸릴)]아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-[2-(4,5-디메틸옥사졸릴)]아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-[4-(2-(2-피리미디닐아미노)에톡시)벤질]-2,4-티아졸리딘디온; 5-[4-(2-(2-피리미디닐아미노)에톡시)벤질리덴]-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-아세틸-N-(2-피리미디닐)아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-(2-(N-(2-벤조티아졸릴)-N-벤질아미노)에톡시)벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-(2-(N-(2-벤조티아졸릴)-N-벤질아미노)에톡시)벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[3-(N-메틸-N-(2-벤족사졸릴)아미노)프로폭시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[3-(N-메틸-N-(2-벤족사졸릴)아미노)프로폭시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-피리딜)아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-메틸-N-(2-피리딜)아미노)에톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[4-(N-메틸-N-(2-벤족사졸릴)아미노)부톡시]벤질리덴)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[4-(N-메틸-N-(2-벤족사졸릴)아미노)부톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-(2-벤족사졸릴)아미노)에톡시]벤질리덴)2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-(2-벤족사졸릴)아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온; 5-(4-[2-(N-이소프로필-N-(2-벤족사졸릴)아미노)에톡시]벤질)-2,4-티아졸리딘디온, 및 그의 약학적으로 허용가능한 염. 예를 들어, 미국 특허 제 5,002953 호를 참조한다.
본원에서 개시된 활성제는 상기와 같이 그의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하고 바람직하지 않은 독성 효과를 제공하지 않는 염이다. 그러한 염의 예는 (a) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산 부가 염; 및 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 타닌산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 유기산으로 형성된 염; (b) 염소, 브롬 및 요오드와 같은 원소 음이온으로부터 형성된 염, 및 (c) 염기로부터 유래된 염, 예컨대 암모늄 염, 나트륨 및 칼륨의 염과 같은 알칼리금속염, 칼슘 및 마그네슘의 염과 같은 알칼리토금속염, 및 디시클로헥실아민 및 N-메틸-D-글루카민과 같은 유기 염기에 의한 염이다.
활성제는 전구약물로서 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 "전구약물" 은, 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 지나친 독성, 과민증, 알레르기 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉되는 용도에 적합하고, 합리적인 위험/유익 비에 적합하고, 그의 의도된 용도에 효과적인 본 발명의 화합물의 상기 전구약물 뿐만 아니라, 가능한 경우 본 발명의 화합물의 양성이온 형태를 언급한다. 용어 "전구약물" 은 예를 들어, 혈액 내에서 가수분해에 의해 생체 내에서 신속하게 전환되어 상기 화학식의 모 화합물을 산출하는 화합물을 언급한다. 철저한 논의가 T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series 및 Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987 에서 제공되며, 이들 모두가 본원에서 참조에 의해 포함된다. 또한 미국 특허 제 6,680,299 호를 참조한다. 예는 대상에 의해 생체 내에서 본원에서 기술된 활성 화합물의 활성도를 갖는 활성 약물로 대사되는 전구약물을 포함하고, 이 경우 전구약물은 알콜 또는 카르복실산기의 에스테르 (그러한 기가 화합물 내에 존재하는 경우); 알콜기의 아세탈 또는 케탈 (그러한 기가 화합물 내에 존재하는 경우); 아민기의 N-만니히 염기 또는 이민 (그러한 기가 화합물 내에 존재하는 경우); 또는 카르보닐기의 시프 염기, 옥심, 아세탈, 에놀 에스테르, 옥사졸리딘 또는 티아졸리딘 (그러한 기가 화합물 내에 존재하는 경우) 이고, 이는 미국 특허 제 6,680,324 호 및 미국 특허 제 6,680,322 호에 기술된 바와 같다.
조성물. 상기 활성제는 알려진 기술에 따라 약학적 담체 내에서의 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995) 를 참조한다. 본 발명에 따른 약학적 제형물의 제조에 있어서, 활성 화합물 (그의 생리적으로 허용가능한 염을 포함함) 은 전형적으로는 그중에서도 허용가능한 담체와 혼합된다. 담체는 물론 제형물 내의 임의의 다른 성분과 화합가능하다는 의미에서 허용가능해야 하고, 환자에게 해로워서는 안된다. 담체는 고체 또는 액체, 또는 둘 다일 수 있고, 바람직하게는 0.01 또는 0.5 중량% 내지 95 또는 99 중량% 의 활성 화합물을 포함할 수 있는 단위 투여 제형물, 예를 들어 정제로서 화합물과 제형화된다. 하나 이상의 부수적 성분을 임의로 포함하는 성분을 혼합하는 것을 포함하는 임의의 잘 알려진 약학의 기술에 의해 제조될 수 있는 본 발명의 제형물 내에 하나 이상의 활성 화합물이 포함될 수 있다.
본 발명의 제형물은 경구, 직장, 국소, 구강 (예, 설하), 질, 비경구 (예, 피하, 근육내, 피부내 또는 정맥내), 국소 (즉, 기도 표면을 포함하는 점막 표면 및 피부 모두) 및 경피 투여에 적합한 것을 포함하지만, 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료될 상태의 성질 및 중증도에 따라 및 사용될 특정 화합물의 성질에 따라 다를 것이다.
경구 투여에 적합한 제형물은 소정의 양의 활성 화합물을 각각 포함하는 캡슐, 사켓, 로젠지 또는 정제와 같은 별개의 단위 내에; 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비수성 액체 내 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 에멀전으로서 제시될 수 있다. 상기 제형물은 활성 화합물 및 적합한 담체 (이는 상기와 같이 하나 이상의 부 성분을 포함할 수 있음) 를 결합시키는 단계를 포함하는 임의의 적합한 약학의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 제형물은 활성 화합물을 액체 또는 미분된 고체 담체, 또는 둘 다와 균일하고 밀접하게 혼합한 후, 필요한 경우 수득된 혼합물을 성형함으로써 제조된다. 예를 들어, 정제는 활성 화합물을 포함하는 분말 또는 과립을 임의로 하나 이상의 부 성분과 함께 압축 또는 성형함으로써 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제, 윤활제, 불활성 희석제 및/또는 표면 활성/분산제(들)과 임의로 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 화합물을 적합한 기계 내에서 압축시킴으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 결합제로 습윤화된 분말 화합물을 적합한 기계 내에서 성형함으로써 제조될 수 있다.
구강 (설하) 투여에 적합한 제형물은 향이 나는 베이스, 보통 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 내에 활성 화합물을 포함하는 로젠지; 및 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성 베이스 내에 화합물을 포함하는 향정을 포함한다.
비경구적 투여에 적합한 본 발명의 제형물은 활성 화합물(들)의 살균 수성 및 비수성 주사 용액을 포함하고, 이 제제는 바람직하게는 의도된 수령자의 혈액과 등장성이다. 상기 제제는 제형물이 의도된 수령자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 항산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 포함할 수 있다. 수성 및 비수성 살균 현탁액은 현탁화제 및 비후제를 포함할 수 있다. 제형물은 단위 투여 또는 다중 투여 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 제시될 수 있고, 사용 직전에 살균 액체 담체, 예를 들어 식염수 또는 주사용 물의 부가만을 요구하는 냉동 건조된 (동결 건조된) 상태에서 저장될 수 있다. 임시 주사 용액 및 현탁액은 상기 종류의 살균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 양상에서, 밀봉된 용기 내의 단위 투여 형태로, 활성제(들) 또는 그의 염을 포함하는 주사가능한 안정적인 살균 조성물이 제공된다. 화합물 또는 염은 적합한 약학적으로 허용가능한 담체와 재구성되어 대상 내로의 주사에 적합한 액체 조성물을 형성할 수 있는 동결건조물의 형태로 제공된다. 단위 투여 형태는 전형적으로는 약 10 mg 내지 약 10 그램의 화합물 또는 염을 포함한다. 화합물 또는 염이 실질적으로 수 불용성인 경우, 생리적으로 허용가능한 충분한 양의 유화제가 수용성 담체 내에 화합물 또는 염을 유화시키기 위해 충분한 양으로 이용될 수 있다. 하나의 그러한 유용한 유화제는 포스파티딜 콜린이다.
피부에의 국소 적용에 적합한 제형물은 바람직하게는 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일의 형태를 갖는다. 사용될 수 있는 담체는 페트롤륨 젤리, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 경피 향상제, 및 그들 둘 이상의 조합을 포함한다.
경피 투여에 적합한 제형물은 연장된 시간 동안 수령자의 표피와 밀접하게 접촉되어 있도록 조정된 별개의 패치로서 제시될 수 있다. 경피 투여에 적합한 제형물은 또한 이온삼투요법에 의해 전달될 수 있고 (예를 들어, Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986) 참조), 전형적으로는 활성 화합물의 임의로 완충된 수용액의 형태를 갖는다. 적합한 제형물은 시트레이트 또는 비스＼트리스 완충액 (pH 6) 또는 에탄올/물 을 포함하고, 0.1 내지 0.2 M 의 활성 성분을 포함한다.
활성 화합물(들)에 더하여, 약학적 조성물은 pH-조정 첨가제와 같은 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 특히, 유용한 pH-조정제는 산 예컨대 염산, 염기 또는 완충제 예컨대 나트륨 락테이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 포스페이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 보레이트 또는 나트륨 글루코네이트를 포함한다. 또한, 조성물은 미생물 보존제를 포함할 수 있다. 유용한 미생물 보존제는 메틸파라벤, 프로필파라벤 및 벤질 알콜을 포함한다. 미생물 보존제는 전형적으로는 다중투여 용도를 위해 디자인된 바이알 내에 제형물이 배치되는 경우에 이용된다. 물론, 지시된 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 동결건조될 수 있다.
투여량. 임의의 특이적 활성제 (이의 이용은 본 발명의 범주 내임) 의 치료적으로 유효한 투여량은 화합물 및 환자마다 다소 다를 것이고, 환자의 상태 및 전달의 경로에 따라 다를 것이다. 경구 투여의 경우, 1, 2 또는 3 mg 내지 30, 40 또는 50 mg 의 총 1 일 투여량은 단일 1 일 투여물로서 제공되거나 2 또는 3 개의 1 일 투여물들 내로 분할되어 사용될 수 있다.
치료. 본원에서 기술된 또는 본원에서 교시된 방법을 사용하여 발견된 유전적 변이는 예를 들어 유전적 변이 또는 변이들의 존재 또는 부존재에 기초하여 어떤 활성제 및/또는 치료 과정을 투여할지를 결정함으로써 상태 (예, ApoE 및/또는 TOMM40 과 관련된 상태) 로 고생하는 환자의 치료 과정을 결정하는데 사용될 수 있다. 유전적 변이의 존재 또는 부존재는 활성제의 효능 및/또는 환자에 대한 치료 과정을 지시하고, 상태에 대한 발병 연령을 예측하고, 바람직한 투여 요법 등을 지시할 수 있다. 환자에 대해 유전적 프로파일이 생성될 수 있고, 그 프로파일은 환자가 특정 활성제에 반응성일 가능성이 있는 환자의 군에 속하는지 여부를 결정하는 데 참고된다.
유전적 변이의 존재 또는 부존재에 기초하여 치료, 치료 시간, 투여 요법 등에 관한 권장을 지시하는 사용 지침이 활성제와 함께 포장되거나 다른 방법으로 조합될 수 있다.
8. 질환 위험의 예측 또는 예후를 결정하는 방법.
본 발명의 일부 구현예에 따라 무증상의 개체에 대한 질환 위험의 예측 또는 예후 (질환의 통상적 경과 또는 사례의 특색으로부터 예상되는 고통 또는 질환 경과의 전망) 를 결정하기 위해, 환자의 유전자형 (예, ApoE 및/또는 TOMM40 유전자형) 과 같은 유전적 데이타 및 환자의 진단 또는 병력을 포함하는 진단 데이타가 처리되어 치료적 선택 및 결과 예측을 제공할 수 있다. 처리는 "환자 프로파일" 의 수득 예컨대 연령 및 성별을 포함하는 환자의 병력의 수집, 관심의 좌위의 유전자형분석 (예를 들어, 적당히 디자인된 프라이머를 사용하는 그리고 RT-PCR 또는 PCR 증폭 단계를 사용하는 및/또는 예를 들어, 항체-매개 방법 또는 효소 시험을 사용하는 표현형분석), 및 이 원 데이타를 예후로 전환시키는 통계적 또는 다른 분석을 포함할 수 있다. 예후는 환자의 질환 발병의 연령, 약물 요법에 대한 반응, 치료 시간, 치료 효능 등의 예측을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 예후는 환자 데이타를 분석하고 환자 데이타 또는 프로파일을 예후로 전환시키기 위해 관계형 데이타베이스에 대한 통계적 비교 검토를 실행하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램의 사용을 포함할 수 있다.
"환자 프로파일" 은 예측 및/또는 예후 분석이 수행될 환자와 관련된 데이타 및/또는 물질을 포함한다. 데이타는 환자의 진단, 연령, 성별 및/또는 유전자형에 대한 정보를 포함할 수 있다. 환자 프로파일은 또한 환자로부터의 물질 예컨대 혈액, 혈청 단백질 샘플, 뇌척수액, 또는 정제된 RNA 또는 DNA 를 포함할 수 있다.
9. 임상 시험에서의 유전자형 계층화.
본원에서 교시된 또는 본원의 방법으로 결정된 유전자형의 탐지는, 예를 들어 미국 특허 제 6,573,049 호, 제 6,368,797 호 및 제 6,291,175 호에 기술된 바와 같이, 다른 유전자형 정보가 임상 시험을 수행하는 데 사용되는 방식으로 임상시험을 수행하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 유리하게는 환자 집단의 세밀화를 허용하거나 계층화하여 (예, 하나 이상의 하위그룹으로 집단을 분할함으로써) 특히 특정 유전자형을 갖는 환자의 특정 하위집단에 대해 특정 치료 요법의 이점이 더욱 정확히 탐지될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 복수의 대상에게 시험 활성제 또는 요법을 투여하는 단계 (전형적으로는 별도의 그러나 유사한 특징의 복수의 대상에게 투여되는 조절 또는 플라시보 요법) 및 복수의 대상에서 상기 유전자형 (예, ApoE 및/또는 TOMM40) 의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계를 포함한다. 유전자형은 시험 요법의 투여 단계 이전, 이후 또는 그와 동시에 탐지될 수 있다. 그 후 상기 요법의 효능, 요법의 부작용의 결여 등을 제한없이 포함하는 잠재적 치료 결과 또는 결론 또는 임의의 적합한 파라미터에 따라, 시험 요법에 대한 하나 이상의 탐지된 대립유전자의 영향이 결정될 수 있다.
특정 유전자형이 관련된 것으로 결정된 임의의 수의 질환을 치료하는 시험 화합물의 효능을 시험하기 위해, 그 질환으로 진단받거나 그 질환을 발달시킬 위험에 있는 대상에 대해 임상 시험이 수립될 수 있다. 임상 시험의 완료 후 대상이 유전자형 분석되는 경우, 그 분석은 여전히 효능에 대해 평가될 대립유전자 및 질환의 치료 간의 관계를 결정하는 것을 목적으로 할 수 있다. 대안적으로는, 증상을 보이거나 증상을 보이지 않는 대상이 그 질환으로 아직 진단받지는 않았지만 그 질환을 발달시킬 위험에 있다고 결정된 경우, 상기 기술된 임상 시험과 유사한 임상 시험이 수행될 수 있다.
치료 군을 디자인할 때 근본적인 생물학적 메카니즘이 또한 고려될 수 있다. 예를 들어, ApoE 4 (1-272) 절편은 ApoE 3 (1-272) 보다 미토콘드리아에 결합하고, 미토콘드리아 세포 동태를 감소시키고, 시냅스형성을 감소시킨다. 알츠하이머병의 치료를 위한 약물 후보인 로시글리타존은 ApoE 4 와 함께보다 ApoE 3 에 대해 더 많이 세포분열형성을 증가시키고 시냅스형성을 증가시킨다 (ApoE 절편 결합의 효과와 반대됨). 그러므로, 약물 또는 치료 후보 (예, 로시글리타존) 는 작용의 근본적인 메카니즘에 기초하여 선택될 수 있는데, 이는 그것이 계층화를 위해 사용되는 유전적 마커 (예, ApoE 2, E 3, E 4 및/또는 TOMM40 변이) 와 관련되기 때문이다.
시험을 위해 선택된 약물의 효능의 평가는 일정 기간 동안 대상을 모니터링하고, 질환 발병의 지연 및 발병 시점에서의 질환의 강도를 분석하는 것 뿐만 아니라, 질환과 관련된 증상의 발병을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 임상 시험에서 질환의 발병을 제거 또는 지연시키거나 질환의 증상을 감소시키는 약물은 질환으로 진단받거나 질환을 발달시킬 위험에 있는 환자에게 사용하는데 유익한 약물일 수 있다. 상기 시험에서 사용될 수 있는 시험 화합물은 임상적 사용에 대해 이전에 승인된 것 및 아직 사용 승인되지 않거나 특정 질환의 치료에 대해 승인된 새로운 화합물 포함하는 상기 물질을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 임상 시험은 투여량, 투여 시간, 독성 또는 부작용, 투여 경로 및 치료의 효능을 포함하는 약물 투여의 최적화를 포함할 수 있다.
10. 관심의 좌위에서의 유전자형 변이의 탐지에 유용한 키트.
질환이 ApoE 및/또는 TOMM40 과 관련된 경우 (예, 후기발병 알츠하이머병), 대상이 질환을 발달시킬 (더 이른 나이에 발병하여 질환을 발달시킬) 증가된 위험에 있는지를 결정하기 위한 키트, 및/또는 특정 치료에 대한 후보가 본원에서 제공된다. 키트는 본원에서 기술된 ApoE 및/또는 TOMM40 변이의 존재 또는 부존재를 탐지하는 데 특이적인 하나 이상의 시약을 포함하고, 대상이 질환 발달의 증가된 위험에 있는지 여부를 결정하는 것을 돕는 지침을 포함할 수 있다. 키트는 ApoE 유전자 (예, ApoE 2, ApoE 3 및/또는 ApoE 4) 의 탐지를 위한 핵산, 또는 ApoE 유전자형의 탐지를 위한 등전 포커싱 방법에 관한 지침; 및/또는 본원에서 기술된 TOMM40 변이의 탐지를 위한 핵산을 임의로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 ApoE 2, ApoE 3, ApoE 4 에, 또는 TOMM40 의 동종형에 결합하는 하나 이상의 항체를 임의로 포함할 수 있다. 시험 키트는 전형적으로는 시험 수행을 위한 인쇄된 지침과 함께 단일 용기 내에 모든 요소와 함께 임의의 적합한 방식으로 포장될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 완충액, 효소, 및 프라이머 유도 증폭을 통해 게놈 핵산을 증폭시키기 위한 시약을 임의로 포함할 수 있다. 키트는 또한 증폭된 핵산 내의 특정 일배체형의 존재 또는 부존재를 탐지하기 위한 하나 이상의 장치를 또한 포함할 수 있다. 상기 장치는 미국 특허 제 6,355,429 호에 기술된 것 중 임의의 하나와 같은, 바이오칩 또는 마이크로어레이 장치에 부착될 수 있는, 일배체형 핵산에 하이브리드화하는 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다. 바이오칩 또는 마이크로어레이 장치는 일배체형 서열에 하이브리드화할 수 있는 표면에 부착된 하나 이상의 포획 프로브를 임의로 갖는다. 바람직한 구현예에서, 바이오칩 또는 마이크로어레이는 다수의 프로브를 포함하고, 가장 바람직하게는 존재하는 경우 한 세트의 측면 프라이머에 의해 증폭될 수 있는 일배체형 서열에 대한 하나 이상의 프로브를 포함한다. 예를 들어, 5 쌍의 측면 프라이머가 증폭에 사용되는 경우, 장치는 각각의 증폭된 산물에 대한 하나 이상의 일배체형 프로브, 또는 5 개 이상의 프로브를 포함할 것이다. 키트는 또한 바람직하게는 키트의 요소를 사용하기 위한 지침을 포함한다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에서 더 상세히 설명된다.
실시예 1: 계통수의 구성
모든 알려진 게놈 전체 스캐닝 연구는 아포지질단백질C1 [ApoC1] 좌위 주위에서 극도로 유의한 p 값을 입증한다 (Mahley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103: 5644-51 (2006), Coon et al., J. Clin. Psychiatry 68: 613-8 (2007); Li et al., Arch. Neurol. 65: 45-53 (2007)). 각각의 시리즈가 ApoE 연관 불균형 영역 외부에서 "선호되는" 경계선 유의한 후보 유전자를 식별했으나, 이들 선호되는 후보 유전자가 각각의 연구에서 상이했다는 것이 동일하게 중요하다. TOMM40 는 ApoC1 에 인접해 있고, ApoE 와 연관 불균형 관계에 있다. ApoE 3 또는 ApoE 4 및 상이한 TOMM40 동종형 간의 상호작용은 더 이른 연령 범위 내에서의 알츠하이머병 발달의 증가된 또는 감소된 위험과 관련된 것으로 여겨진다. Apo 4/4, 3/4, 3/3, 2/4 및 2/3 유전자형에 대한 발병의 연령 곡선이 도 2 에 나타나 있고, 이는 ApoE 프로파일에 따라 질환의 더 이른 발달에 대한 위험의 범위를 나타낸다. 그러나, ApoE 가 단독으로 상기 발병의 연령 곡선에서의 모든 데이타를 설명하는 것으로 보이지는 않는다.
상이한 ApoE 대립유전자와 관련된 알츠하이머병 위험의 다형성 프로파일링에 대한 다양한 방법이 제안되어 왔다 (예를 들어, Cox et al. 의 미국 출원 제 20060228728 호; Li and Grupe 의 미국 출원 제 20080051318 호 참조). ApoE 4 퍼즐로의 계통발생적 접근이 본원에 나타나 있다.
관심의 좌위의 생물학적 샘플, DNA 분리, 증폭. 총 340 명의 대상은 군 A 에서 135 명의 알츠하이머병 사례 및 99 명의 연령-짝지은 대조군 뿐만 아니라 군 B 에서 57 명의 사례 및 49 명의 대조군을 포함했다. 모든 대상은 더 이른 질환 발병에 대한 더 높은 위험과 이전에 관련되었던 ApoE 유전자형 (즉 3/3, 3/4 또는 4/4) 을 보유했다. 모든 대상으로부터 DNA 를 포함하는 생물학적 샘플을 수집했다. 그 후 염색체 19 상의 유전적 좌위의 시퀀싱에 대한 종래의 방법에 따라 게놈 DNA 를 분리했다.
도 3 은 다수의 보고로부터의 게놈 전체 스캐닝 데이타를 사용하는 연구의 대상이 되는 염색체 19 상의 유전적 영역을 나타낸다. 상기 영역은 GenBank 참조 서열 AF050154 내에 포함된다. 소프트웨어를 사용하여 변이 좌위에 대한 다중 서열 정렬을 생성했다 (예, ClustalW2, European Bioinformatics Institute). 그 뒤에, 계통수 구성을 위한 소프트웨어 (예, MEGA version 2.1, Center for Evolutionary Functional Genomics, TREEVOLVE, Department of Zoology, University of Oxford, 또는 간명성-기반 구성 소프트웨어 예컨대 PAUP, Sinauer Associates) 를 사용하여 다중 서열 정렬을 분석했다. 예를 들어, Genetic Data Analysis (GDA: 별개의 유전적 데이타의 분석을 위한 소프트웨어, The Bioinformatics Research Center of North Carolina State University) 로 통계적 분석을 수행할 수 있다. 영역 B 분석의 결과를 도 4 의 계통수에 나타냈다.
도 4 에서 데이타의 각각의 부분은 관찰된 서열 변이를 나타낸다. 이들 변이는 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결손 또는 초위성일 수 있고, 유전자 발현 또는 단백질 기능에서의 탐지가능한 차이를 초래하거나 초래하지 않을 수 있다. 각각의 마디는 하나 초과의 염색체 상에서 발생하는 변이 (또는 다수의 변이) 를 나타낸다. 인접한 마디는 cis 위치에 있는 서열의 경계를 규정하므로, 대상의 염색체 상의 관심의 영역 내에서 하나의 단위로서 유전될 가능성이 높다. 가장 많은 수의 이어지는 마디들에 선행하는 마디는 시간이 지나면서 유전적 분지가 발생하는 진화적 조상의 변이를 나타낸다.
알츠하이머병의 실질적으로 더 높은 발생률 (즉, 질환으로 영향받은 대상 대 영향받지 않은 대조군 대상의 더 높은 비) 을 갖는 대상을 나타내는 나무의 영역에 상응하는 일배체형 또는 서열 변이의 존재는 개체가 또한 증가된 위험에 있음을 의미할 것이다. 반대로, 상당히 더 낮은 비는 알츠하이머병 발달의 감소된 위험에 상응한다.
TOMM40 은 미토콘드리아 단백질 내수송의 조절에서 ApoE 와 직접적으로 상호작용하고, 현재의 가설은 특정 TOMM40 변이(들)의 발현이 ApoE 3 대립유전자의 용량-의존적 존재와 관련된 알츠하이머병에 대한 비교적 중등도 위험을 악화시킨다는 것이다. 그러한 TOMM40 변이는 본 발명의 방법을 사용하여 영역 B 내에서 발견된다.
인간 대상에 대해 새로운 약물을 시험하는 것은 막대한 위험을 수반한다 (Kenter and Cohen, Lancet, 368: 1387-91 (2006) 참조). 계통수의 사용으로 관심의 약물 또는 치료에 대한 개체의 반응을 예상하는 것은 위험을 유의하게 경감시킬 잠재력을 갖는다. 예비 연구는 로시글리타존 (Avandia) 이 알츠하이머병의 치료에 있어서 유전적-프로파일 특이적 효능을 가질 수 있음을 지시했다 (Risner et al., The Pharmacogenomics Journal 6, 246-254 (2006); Brodbeck et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 105, 1343-6 (2008) 참조). 제 II 상 임상 시험 데이타는 ApoE 4 대립유전자를 갖지 않는 알츠하이머병 환자가 1 또는 2 ApoE 4 대립유전자를 보유하는 환자보다 로시글리타존에 더 잘 반응했음을 나타낸다 (데이타는 나타나지 않음). 이는 본원에서 교시된 방법으로 식별된 변이를 사용하여 유전자형에 기초한 치료에 대한 개체의 반응을 예상할 수 있다는 가설을 지지한다.
실시예 2: 관심의 TOMM40 변이의 식별
CLUSTAL X 프로그램 (version 2.0.10, Larkin et al., Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948 (2007)) 을 사용하여 174 개의 서열 (87 명의 대상 각각으로부터 2 개) 을 정렬했다. European Bioinformatics Institute (EBI) 웹사이트 상에서 시행되는 바와 같은 이웃 연결 알고리즘 (Saitou and Nei, The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Evol. Biol., 4:406-425 (1987)) 을 사용하여 계통수를 구성하는데 다중 서열 정렬을 사용했다.
결과로서 얻어진 계통수는 첫번째 분지에서 2 개의 주요 군 (A, B) 의 구조를 갖는다. 이들 군에 대한 ApoE 유전자형 빈도를 표로 만들어서 도 5 에 나타냈다. 군 B 는 주로 ε3/ε3 및 ε3/ε4 ApoE 유전자형의 대상-일배체형을 포함하고, ε4/ε4 ApoE 유전자형의 대상-일배체형은 거의 포함하지 않는다는 것이 명백하다. 군 A 는 ε4/ε4 유전자형을 갖는 대상 일배체형의 거의 모두를 포함한다.
SNP 발견 플랫폼 (다형성) 에 의해 생성된 다형성의 목록을 사용하여, 데이타를 2 개의 군으로 분리한 TOMM40 유전자 내의 특이적 변이를 식별했다. 우도비 검정을 사용하여 0.005 미만의 p 값을 갖는 유의한 변이를 식별했다.
변이의 목록을 표 1 에 요약했다. 표 1 에서, 부 대립유전자가 뉴클레오티드의 결손인 경우 용어 "결손" 을 사용했고, 부 대립유전자가 뉴클레오티드의 부가인 경우 용어 "삽입" 을 사용했다. 2 개 이상의 가능한 형태가 존재하고 부 대립유전자가 분명하지 않은 경우 용어 "결손/삽입 다형성" 을 사용했다. 예를 들어, 폴리-T 다형성의 경우, 다수의 길이 다형성이 관찰되었다. 표 1 의 2 번째 행은 서열을 2 개의 군으로 분할하는 변이와 관련된 특이적 대립유전자의 식별에 대한 정보를 제공한다. 예를 들어, T>A 는 T 대립유전자가 계통수 상의 군 "A" 로 서열을 분리함을 나타낸다. 2 개의 대립유전자가 열거된 경우 (예 G>B; A>A) 각각의 대립유전자는 서열 데이타를 2 개의 군으로 독특하게 분리하는 한편, 단일 대립유전자가 열거된 경우 이는 데이타의 우세한 분리와 관련되고, 나머지 대립유전자는 데이타를 동종 군으로 독특하게 분리하지 않는 대신 모든 군의 혼합이다.
표 1. ApoE 유전자형에 의해 분포하는 계통수 상의 군과 관련된 TOMM40 변이.
Figure pat00001
실시예 3: ApoE 3 의 2 개의 구별되는 형태: 위험을 증가시키고 발병의 연령을 감소시키는 TOMM40 일배체형과 연관된 것, 및 위험을 감소시키는 것
아포지질단백질 E (ApoE) 유전자형, 특히 ApoE ε4 (ApoE 4) 의 알츠하이머병 (AD) 발병의 연령 및 위험과의 연관성은 임의의 복합 질환에 대해 여전히 가장 확인된 유전적 연관성이다. 후기발병 AD 에 대한 ApoE 4 의 유전률의 추정은 58 % 내지 79 % 의 범위이고, ApoE 4 대립유전자로 인한 모집단 기인 위험도는 20 % 내지 70 % 이다. 상기 추정은 다른 유전적 변이 및/또는 변이들 간의 상호작용이 부가적 질환 위험을 발생시키고 발병의 연령 분포을 수정한다는 것을 시사한다.
AD 에 대한 게놈 전체 스캔 연관성 결과는 ApoE 를 포함하는 LD 영역의 비상한 연관성을 지속적으로 재현해 왔다. 외부 미토콘드리아 막의 단백질 트랜스로케이스인 TOMM40 은 ApoE 와 함께 높은 LD 내에 있고, 새로운 미토콘드리아를 합성하기 위해 세포질 펩티드 및 단백질이 통과하는 막 채널에 대한 코드이다. LD 영역 내의 부가적 일배체형을 식별하여 유전률의 추정을 증가시키는 것이 목적이었다.
방법: AD 환자 및 대조군에서 자세한 (10×) 1 차 시퀀싱을 사용하여 ApoE 및 TOMM40 을 모두 포함하는 LD 영역을 조사했다. 발병의 연령 및 위험 분포와 관련하여 66 명의 환자 및 66 명의 연령-짝지은 대조군에서 TOMM40 및 ApoE 를 포함하는 LD 영역의 계통발생적 분석을 수행했다.
결론: 상이한 TOMM40 변이의 독특한 구별되는 유전된 패밀리가 ApoE 3 과 같은 동일한 게놈 범위 상에 위치하나, ApoE 4 를 포함하는 게놈 범위 상에는 위치하지 않고, AD 의 위험 분포의 연령을 증가 또는 감소시킬 수 있음을 발견했다. 그러므로, 이들 TOMM40 변이의 유전적 유전은 ApoE 4 의 유전과 독립적이고, ApoE 3 의 2 가지 구별되는 형태 (위험을 증가시키고 발병의 연령을 감소시키는 TOMM40 일배체형과 연관된 것, 및 위험을 감소시키는 것) 의 차이를 효과적으로 제공한다. 이들 데이타는 연령, ApoE 및 TOMM40 유전자형에 따라 발병 위험의 유전적 연령의 정확도를 증가시키고, AD 의 더 낮은 위험 대, 다음 5-7 년 동안의 AD 의 높은 위험을 규정하는 기회를 제공한다.
실시예 4: 3 개의 식별된 TOMM40 DIP 변이의 분석
본 출원에서 식별된 3 개의 TOMM40 변이는 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 결손/삽입 다형성 (DIP) 이다. 이들 DIP 는 National Center for Biotechnology Information dbSNP database 에서의 rs10524523 및 rs 10602329 및 DIP3 으로서 표시되는 이전에 기술되지 않은 다형성으로서 식별된다. 상기 다형성은 NCBI build 36 에 따라 각각 chr19:50,094,889, chr19:50,094,731 및 chr19:50,096,647 에 위치한다. 본 발명은 TOMM40 유전자, 특히 그 유전자의 10 Kb 절편의 계통발생적 분석을 사용하는 상기 DIP 의 식별, 및 DIP 가 계통발생적 분석에 의해 결정된 상이한 진화적 군과 관련됨을 기술한다. 또한 본 발명은 (1) 장래의 알츠하이머병 발달에 대한 건강한 사람의 위험을 결정하고, (2) 약 8 년의 기간 내에서 AD 발병의 연령을 예측하기 위한, 상기 DIP 의 이용을 개시한다.
본원에서 특징화된 3 개의 DIP 다형성은 TOMM40 유전자 내의 DIP 폴리-T 리피트의 상이한 길이에 상응한다. DIP 폴리-T 변이의 질환 위험과의 연관성은 우선성을 갖는다. 예를 들어 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절 (CFTR) 유전자의 인트론 8 내의 폴리-T 변이는 엑손 9 의 스킵핑 및 낭포성 섬유증의 발달과 관련된다 (Groman et al., Am J Hum Genet 74(1): 176-9 (2004)). 본원에서 하기가 개시된다: (1) 질환 위험 및/또는 질환 발병 연령의 차이에 대해 예측적인 DIP 를 식별하기 위한 신규한 방법 (상기 기술된 계통발생적 연관성 분석) 의 사용, (2) AD 발병의 연령 및 AD 위험의 차이와 관련된 3 개의 특이적 DIP 의 식별, (3) 상기 SNP 를 개별적으로, 함께, 또는 TOMM40 또는 ApoE 내의 다른 서열 변이와 함께 사용하여, 질환을 진단하거나 질환 발병의 연령, 질환 예후, 질환 하위유형, 질환 중증도와 같은 질환 특징을 예측 또는 결정하거나, 약물에 대한 반응을 분석 또는 결정하는 것.
계통발생적 분석은 2 개의 상이한 클레이드 내로의 rs10524523 및 rs10602329 DIP 의 분포를 밝힌다. 이 분석은 군 B 내에서 계통발생적으로 식별된 클레이드에 대해 상기 좌위 지도에서 더 짧은 폴리-T 길이를 밝히고, 그 군은 더 높은 백분율의 ApoE e3/e3 유전자형 대상, 유효하게 더 적은 (0 %) ApoE e4/e4 대상 및 더 낮은 사례/대조군 비 (즉, AD 질환 위험) 를 포함한다 (도 5). DIP 길이 및 계통발생적 군 간의 연관성은 우도비 검정 또는 피어슨 카이제곱 검정에 의해 통계적으로 유의하다 (p < 0.0001).
게놈 구조, 2 개의 유전자 간의 계통발생적 분석에서 나타난 바와 같은 진화적 관계 및 높은 연관 불균형, 및 2 개의 유전자 산물 간의 추정되는 물리적 상호작용으로 인해, TOMM40 유전자형의 영향은 ApoE 유전자형에 의해 영향을 받는 다른 질환으로 확장될 가능성이 높다. 이들 질환은 파키슨병, 다발성 경화증, 심장혈관 질환, 이상지질혈증, 외상성 뇌 손상으로부터의 회복, 뇌 허혈성 사건으로부터의 회복, 마취제에 대한 반응, 및 AD 및 본원에서 열거된 질환을 치료하기 위해 사용되는 약물에 대한 반응을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 다형성은 또한 TOMM40 또는 ApoE 단백질 내의 변이 또는 유전적 변이에 의해 영향을 받는 질환을 치료하는데 유용한 화합물의 탐색을 위한 약물 발견 노력에서 사용될 수 있다.
게다가, 상기 변이는 모노클론성 항체 및 siRNA 분자에 의해 예시되는 바와 같이 특이적으로 표적화되는 약제에 기초한 요법을 결정하거나 이에 영향을 줄 수 있다.
본원에서 개시된 TOMM40 내의 DIP 다형성은 하기 열거한 표 4 에 나타낸 프라이머에 의한 DNA 시퀀싱을 제한없이 포함하는 많은 상이한 분자 뉴클레오티드 분석 방법을 사용하여 개체의 DNA 샘플로부터 식별될 수 있다.
실시예 5: rs10524523 에서 더 긴 폴리-T 추적은 LOAD 의 더 이른 발병 연령과 유의하게 관련됨
계통발생적 분석을 사용하여 낮은 빈도 유전적 변이 간의 유전적 관계를 식별하고, 진화적으로 관련된 일배체형을 군집시켜 왔다 (Hahn et al. Population genetic and phylogenetic evidence for positive selection on regulatory mutations at the factor VII locus in humans. Genetics 167, 867-77 (2004)). 상기 방법을 이용하여 LOAD 에 대한 신규한 위험 결정인자의 존재에 대해 ApoE-TOMM40 LD 블록을 탐색했다. 탐색적 연구에서, 72 명의 LOAD 사례 및 60 명의 연령-짝지은 대조군에 대해, TOMM40 및 ApoE 유전자를 포함하는 23 Kb 의 DNA 를 증폭시키고 시퀀싱하고, 상 분석 일배체형을 결정했다 (Li et al. Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease. Arch Neurol 65, 45-53 (2008)). 상기 영역의 엑손 2-10 을 인코딩하는 10 Kb 에 대해 구별되는 계통수를 구성하는 것이 가능했다. 2 개의 클레이드 (A 및 B) 를 강한 붓스트랩 지지 (98 %, 1000 번의 반복검증) 로 구별했다. 상기 계통수 상에서 TOMM40 일배체형의 2 개의 클레이드 간의 ApoE 유전자형의 분포에서 유의한 차이가 존재했는데, 이는 이 영역이 기능적으로 유의할 수 있음을 시사한다. 모든 클레이드가 ε3/ε3 유전자형을 갖는 대상을 포함했으나, 모든 클레이드 B 일배체형의 98 % 가 ApoE ε3 대립유전자와의 cis 위치에서 발생했다 (P = 1.2 x 10-18, 피셔의 정확성 검정, 양측).
그 뒤에, 부검 확인된 AD 상태 및 질환 발병의 연령 데이타와 함께 하나의 코호트를 포함하는 2 개의 독립적인 LOAD 사례/대조군 코호트에서, 상기 TOMM40 의 10 Kb 영역의 계통발생적 구조, 특정 일배체형의 ApoE ε3-특이적 유전, 및 클레이드-특이적 다형성의 식별을 확인했다. 또한, 데이타가 입수가능했던 경우, 2 개의 클레이드 및 질환 위험 및 질환 발병의 연령 간의 연관성을 상기 2 개의 코호트에 대해 탐색했다. 첫번째 코호트 (AS) 는 Arizona Alzheimer's Disease Research Center (ADRC) 에서 확인된 AD 사례 (n = 74) 및 대조군 (n = 31) 으로 구성되었다. 두번째 코호트 (DS) 는 Duke Bryan ADRC 에서 집합되었고, ApoE ε3/ε4 대상만으로 구성되었다 (질환 발병의 알려진 연령의 40 명의 부검-확인된 사례 및 33 명의 대조군) (표 2). 50 세 내지 68 세에 질환이 발병한 DS 코호트의 아집합에 대해 DNA 시퀀싱이 성공적이었음에도 불구하고, 연관성 분석은 60 세 이후 AD 가 발달된 환자의 아집합에 제한되었다.
표 2. 코호트 조성. 사례 및 대조군의 수, 평균 연령, 및 여성인 백분율이 각각의 시리즈에 대해 나타나 있다. 평균 연령은 사례의 경우 AD 의 진단시 연령 및 대조군의 경우 조사시 연령으로서 제시된다. 평균으로부터의 표준 편차는 괄호 안에 제시되어 있다.
Figure pat00002
AS 코호트에 대해 강한 붓스트랩 지지 (97 %, 1000 번의 반복검증) 로 탐색적 연구에서 생성된 것과 유사한 구조의 계통수를 구성했다. ApoE ε4/ε4 대상이 클레이드 A 내에서만 발생한 반면 (군 간의 98 % 분리, P = 2.0 x 10-4 피셔의 정확성 검정, 양측), 나머지 ApoE 유전자형들은 클레이드 A 및 B 사이에 분포되었다 (도 6). 즉, ApoE ε4 는 항상 클레이드 A 변이와 함께 LD 내에 있었던 반면, ApoE ε3 은 클레이드 A 및 클레이드 B 일배체형 모두에서 발생했다. 계통수 상의 소수의 ApoE ε2/ε4 대상의 분포의 조사는 ApoE ε2-TOMM40 일배체형이 ApoEε3-TOMM40 일배체형과 유사한 진화적 역사를 공유함을 시사한다 (데이타는 나타나지 않음). 별도의 방법을 사용하여 계통발생적 구조를 확인하고, 유전적 범위 내의 재조합이 AS 코호트에 대해 생성된 계통수 구조가 틀렸음을 입증하지 않았다는 것을 보장하기 위해, 통계적 간명성을 사용하여 일배체형 네트워크를 또한 구성했다 (TCS version 1.21 (Clement et al. TCS: 유전자 계보를 추정하는 컴퓨터 프로그램. Mol Ecol 9, 1657-9 (2000))). 2 개의 방법 (최대 간명성 및 TCS) 으로부터 유래된 주요 대상-일배체형 군집은 일치되었다.
클레이드 A 는 클레이드 B 의 경우보다 AD 사례와 더욱 빈번히 관련되었다 (OR = 1.44, 95 % CI = 0.76 - 2.70). ApoE ε4 의 효과에 대해 통제하면서, ApoE ε3/ε4 이형접합체 (n = 36) 를 분석하여 클레이드 A 일배체형과 관련된 질환 위험을 추정했다. 클레이드 A 및 클레이드 B 에 대해 이종접합체인 아집합에 비해 TOMM40 클레이드 A 에 대해 동종접합체인 아집합의 경우 LOAD 의 더 높은 발생률에 대한 경향이 존재했고 (OR = 1.36, 95 % CI = 0.40 - 4.61), 따라서 클레이드 A 를 규정하는 TOMM40 변이의 적어도 일부가 LOAD 의 ApoE ε4-독립적 위험을 부여한다고 상정되었다.
AS 코호트 서열 데이타의 분석은 TOMM40 10 Kb 영역 내에서 39 개의 다형성 부위를 식별했고, 그 가운데 30 개의 간명성-정보제공적 부위 (2 이상의 서열에서 각각 나타난, 2 이상의 상이한 뉴클레오티드) 가 존재했다. 30 개의 간명성-정보제공적 부위 중에서, 18 개는 낮은 대립유전자 빈도 (MAF) > 0.10 을 가졌고, 6 개의 SNP 는 TOMM40 유전자의 경계 밖에 있었다. 10 개의 SNP 가 ApoE ε3 의 맥락에서 배타적으로 발생했고 (P = 6.07 x 10-50, 피셔의 정확성 검정, 양측, n = 210), ApoE ε4/ε4 동종접합체 대상 (n = 16) 에서는 전혀 발견되지 않았다. 대부분의 ε3-특이적 TOMM40 변이는 인트론 영역 내에 위치했다.
도 7 은 AS 코호트로부터의 ApoE ε3/ε3 대상에 대해 TOMM40 클레이드 A 및 B 를 구별하는 (P < 0.001 에서) 6 개의 삽입/결손 다형성 및 10 개의 SNP 를 나타낸다. 상기 다형성을 LOAD 위험과의 연관성에 대해 일배체형으로서 그리고 개별적으로 시험되었다 (표 3). 각각의 클레이드 B 대립유전자 (모든 경우에 부 대립유전자임) 에 대한 질환 위험에 대한 오즈 비는, 클레이드 B 대립유전자가 AS 코호트에서 AD 위험에 대해 보호적이라는 것을 시사하지만, 각각의 경우에 연관성은 가까스로 유의성을 놓쳤다. 표 3 에서 보고된 오즈 비에 대한 ApoE ε4 의 효과를 설명하기 위해, 혼주 AS 및 DS 코호트의 ApoE ε3/ε4 대상으로부터 무작위로 서열을 선택함으로써 48 명의 AD 사례 및 48 명의 AD 대조군의 균형 잡힌 세트를 구성했다. 상기 균형잡힌 데이타 세트에서 단일 SNP 는 다시 LOAD 와 유의하게 관련되지 않았다. 그러나, TOMM40 클레이드 B 를 구별하는 4 개의 SNP (rs8106922, rs1160985, rs760136, rs741780) 의 부 대립유전자는 3 개의 LOAD 사례/대조군 게놈 전체 연관성 연구에서 이전에 분석되었고, 질환 위험에 대해 보호적이라는 것이 밝혀졌는데 (각각의 경우에 OR < 1), 이는 본 발명자의 연구 (Abraham et al. A genome-wide association study for late-onset Alzheimer's disease using DNA pooling. BMC Med Genomics 1, 44 (2008); Carrasquillo et al. Genetic variation in PCDH1lX is associated with susceptibility to late-onset Alzheimer's disease. Nat Genet 41, 192-198 (2009); Takei et al. Genetic association study on in and around the ApoE in late-onset Alzheimer disease in Japanese. Genomics 93, 441- 448 (2009)) 에서 발견된 경향과 일치한다.
표 3. 각각의 SNP 에 대한 기술적 통계량 및 대립유전자 및 유전자형 연관성 결과.
Figure pat00003
2 개의 클레이드 및, 그러므로 ApoE ε3 일배체형의 2 개의 군을 구별했던 또다른 다형성은 TOMM40 의 인트론 6 내에 위치한 폴리-T 변이 (rs10524523) 였다. ApoE ε4 염색체 상에서, 상기 변이는 좁은, 단봉형 분포의 길이로 비교적 길었던 한편 (21 - 30 T 잔기, 평균 = 26.78, s.d. = 2.60, n = 32), ApoE ε3 염색체 상에서, 15.17 (s.d. = 0.85, n = 36) 및 33.15 (s.d. = 2.09, n = 55) T 잔기에서의 피크에 의해 길이의 쌍봉 분포가 명백했다 (도 8). 더 긴 폴리-T 길이 (T >= 27) 는 AS 코호트에서 더 높은 위험 클레이드인 클레이드 A 로 거의 배타적으로 분리되었다 (P = 7.6 x 10-46, n = 210, 피셔의 정확성 검증, 양측). 2 개의 가장 통상적인 더 짧은 길이 (15 또는 16 T 잔기) 를 포함하는 범주에 대한 사례/대조군 비는 1.46 (95 % CI = 1.25- 1.75) 이었고, 더 긴 길이 범주 (28, 29, 33 및 34 T 잔기) 에 대한 사례/대조군 비는 2.02 (95 % CI = 1.13 - 2.87) 였다. 상기 데이타는 더 긴 rs10524523 폴리-T 길이 및 AD 간의 연관성에 대한 경향을 나타냈다.
AS 코호트의 경우 TOMM40 일배체형 또는 개체 다형성의 LOAD 와의 연관성에 대한 경향만이 존재했던 한편, rs10524523 의 폴리-T 길이 범주 및 LOAD 발병의 연령 간에 유의한 연관성이 존재했다. 이는 그에 대해 질환 발병 데이타가 존재했는 부검-확인된 ApoE ε3/ε4 대상의 DS 코호트를 사용하여 시험했다. 더 긴 폴리-T 대립유전자 (>= 27 T 잔기) 는 훨씬 이른 연령에서 질환의 발병과 유의하게 관련되었다 (70.5 세 +/- 1.2 대 77.6 세 +/- 2.1, P = 0.02, n = 34) (도. 5).
그러므로 상기 다형성은, ApoE ε3 대립유전자를 보유하는 개체에 대한 질환 발병의 연령에 유의하게 영향을 미쳤다. 인트론 6 내에 위치한 3 개의 다른 폴리-T 길이 다형성 (rs34896370, rs56290633 및 rs10602329) 은 또한 클레이드 A 및 B 를 구별했으나, 이들 다형성은 질환 발병의 연령과 관련되지 않았다. 유사하게, 3 개의 게놈 전체 연관성 연구에서 AD 위험과 유의하게 관련되었던 단일 SNP, rs8106922 에 대해, 또는 클레이드를 구별하는 SNP 의 일배체형 및 LOAD 의 연령 간에 관계가 존재하지 않았다 (Abraham et al. A genome-wide association study for late-onset Alzheimer's disease using DNA pooling. BMC Med Genomics 1, 44 (2008); Carrasquillo et al. Genetic variation in PCDH11X is associated with susceptibility to late-onset Alzheimer’s disease. Nat Genet 41, 192-198 (2009); Takei et al. Genetic association study on in and around the ApoE in late-onset Alzheimer disease in Japanese. Genomics 93, 441-448 (2009)) (데이타는 나타나지 않음).
rs10524523 에서의 더 긴 폴리-T 추적이 LOAD 의 더 이른 발병 연령과 유의하게 관련된다고 결론내린다. 이 변이의 길이가 ApoE ε4 염색체 상에서 비교적 동종이고 비교적 긴 한편, ApoE ε3 에 연관된 폴리-T 길이의 2 개의 범주가 존재한다. ApoE ε2 염색체는 또한 ε3 염색체에 유사한 가변적 길이 폴리-T 리피트를 보유하는 것으로 보이나, 이 예비적 발견을 입증하고 폴리-T 리피트가 ApoE ε2 의 담체에 대한 매우 늦은 질환 발병 연령에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 추가의 연구가 필요하다.
ApoE ε4 에 대한 동종접합체가 아닌 개체에 대한 LOAD 의 발병의 연령에 영향을 미치는 다른 변이가 존재할 수 있는 한편, TOMM40 인트론 6 내의 폴리-T 다형성의 길이는 이 연관 영역에서 가장 강력한 유전적 예측인자로 보이고, 전향적으로 입증되어야 한다. 상기 데이타는 ApoE 유전자형-계층화된 발병의 연령 곡선 (Corder et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families. Science 261, 921-3 (1993); Li et al. Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease. Arch Neurol 65, 45-53 (2008)) 이 실제로 TOMM40 및 ApoE 내의 연관된 다형성의 특이적 상호작용을 반영하는 각각의 곡선을 갖는 곡선의 세트임을 시사한다. 그러므로, 상기 데이타는 60 세가 넘는 개체에 대해 5-7 년 윈도우 내에서 LOAD 발병의 연령의 예측에 대한 분석을 부가한다. 질환 발병의 연령과 rs10524523 또는 TOMM40 일배체형 및 ApoE 유전자형의 연관성을 입증하는 연구가 현재 계획중이다. 이 연구는 몇몇 인종 군에서 수행되는 전향적, 5 년, 집단-기반 연구일 것이고, 질환 발병의 예방 또는 연기 약물 시험과 조합될 것이다.
방법
상기 연구에서 분석된 2 개의 코호트는 Arizona Alzheimer's Disease Research Center (ADRC), Phoenix, Arizona 및 Duke Bryan ADRC, Durham, North Carolina 로부터 였다. 모든 대상은 유럽인 혈통이었다. Arizona 및 Duke 연구는 기관 감사 위원회에 의해 승인되었고, 모든 참가자로부터 적당한 사전 동의를 수득했다. 각각의 코호트 내의 사례 및 대조군에 대한 연령 및 성별 데이타가 표 2 에 나타나 있다. Duke 코호트의 경우, 질환 발병의 연령을 후향적으로 결정했고, 질환 진단을 부검에 의해 확인했다.
Polymorphic DNA Technologies (Alameda, CA) 에서의 원거리 PCR 및 DNA 시퀀싱을 위해 96 웰 플레이트 상에 샘플을 플레이팅했다.
Takara LA Taq 중합효소 (Takara Mirus Bio) 를 사용하여 원거리 PCR 을 수행했다. 반응 믹스 및 PCR 조건은 제조사에 의해 권장되는 바와 동일했다. 2.5 U 의 LA Taq 및 200-400 ng 인간 게놈 DNA 로 50 ㎕ 부피에서 PCR 을 수행했다. 열 순환을 하기 조건으로 수행했다: 94 ℃, 1 순환 동안 1 분; 94 ℃, 30 초; 57 ℃, 30 초; 68 ℃, 14 순환 동안 9 분; 94 ℃, 30 초; 57 ℃, 30 초; 68 ℃, 16 순환 동안 9 분 +15 초/순환; 72 ℃, 1 순환 동안 10 분. 원거리 PCR 에 대한 프라이머를 표 4 에 나타냈다.
표 4. 정방향 및 역방향 시퀀싱 프라이머가 열거되어 있다. 어두운 열은 R2 의 원거리 PCR 에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머를 자시한다 (도 2)
Figure pat00004
PCR 산물을 0.8 % 아가로스 겔 상에서 달리게 하고, 크리스탈 바이올렛 염료에 의해 시각화하고, 크기 표준과 비교하고, 겔로부터 잘라내고, TOPO XL PCR Cloning kit (Invitrogen) 에 포함된 정제 물질로 추출했다. 원거리 PCR 산물을 TOPO XL PCR 클로닝 벡터 내로 클로닝했다. 상기 시스템은 TA 클로닝 벡터를 사용하고, 10 kb 이하의 삽입물에 대해 권장된다. 제조사의 지침에 따라, 전기-적격 세포 (동일한 키트로부터의) 를 벡터에 의해 형질전환하고, 항생제의 존재 하에 플레이팅하고, 인큐베이션했다. 각각의 플레이트로부터 10 개의 클론을 집어내고, 96-웰 포맷에서 배양했다.
희석된 배양물을 TempliPhi DNA Sequencing Template Amplication kit (GE HealthCare/Amersham Biosciences) 의 일부인 변성 완충액으로 옮겼다. 이 완충액은 플라스미드 DNA 의 방출을 야기하나 박테리아 DNA 의 방출을 야기하지는 않는다. 배양물을 가열하고, 냉각시키고, 회전시키고, TempliPhi 효소 및 다른 성분을 포함하는 새로운 플레이트로 옮겼다. 상기 혼합물을 18 시간 동안 30 ℃ 에서 인큐베이션하여 플라스미드 주형의 증폭을 촉진했다. 그 후 상기 산물을 회전시키고, 65 ℃ 로 가열하여 효소를 파괴시켰다.
Big Dye, version 3.1 sequencing kit (Applied Biosystems) 를 사용하는 DNA 시퀀싱 반응에서 플라스미드 주형을 사용했다. 각각의 반응에 대해, 주형의 독특한 위치에 어닐링하도록 디자인된 적당한 시퀀싱 프라이머 (표 4) 를 사용했다. 총 30 순환 동안, 어닐링 온도 50 ℃, 연장 온도 60 ℃, 및 변성 온도 96 ℃ 로 순환 시퀀싱을 수행했다. 표준 수행 모드를 사용하여 50 ㎝ 모세관 어레이로 ABI 3730XL DNA 시퀀서 상에서 시퀀싱 반응 산물을 달리게 했다.
'Agent' 로 불리는 사유 시퀀싱 분석 프로그램 (Celera 에 의해 개발됨) 을 사용하여 적당한 참조 서열에 대해 시퀀싱 판독을 정렬하고, 각각의 클론과 관련된 '콘틱' 을 생성했다. 상기 시스템은 임의의 샘플에 대해 그에 대한 임의의 변이가 존재하는 모든 염기에 대해 추정된 품질 점수를 제공한다. 각각의 샘플에 대한 상기 시퀀싱 보고를 SNP 의 존재에 대해 분석했고 이는 클론의 하나의 아집합에 대한 하나의 일배체형 패턴에서 및 나머지 클론에 대한 상이한 일배체형 패턴에서 연관되었다. 관심의 영역에 대한 참조 파일을 NCBI dbSNP 로부터 공개적으로 입수가능한 그 영역에 대한 알려진 변이를 나열함으로써 준비했다. 알려진 참조 서열 및 공통 일배체형 서열 간의 모든 변이에 대한 각각의 대상의 일배체형 보고를 탐색함으로써 관심의 영역에 대한 유전자형 파일을 생성했다.
단일 일배체형을 갖는 샘플에 대해 준비된 10 개의 클론으로부터의 관찰된 길이를 검토함으로써 폴리-T 변이 (예, rs10524523) 에 대한 길이 판독 오류의 규모를 추정했다. 16 개의 짧은 폴리-T 길이를 갖는 전형적 샘플의 경우, 10 개의 클론에 대한 표준 편차는 0.97 이었다. 예를 들어 27 개의 더 긴 폴리-T 길이를 갖는 전형적 샘플의 경우, 표준 편차는 1.58 이었다.
계통발생적 분석을 수행했다. 디폴트 파라미터를 사용하는 ClustalW2 (version 2.0.10) 프로그램을 사용하여 서열의 다중 서열 정렬을 수행했다. Genedoc (version 2.7.000) 을 사용하여 정렬의 수동 조정을 완료했다. Bayesian, 최대 우도 및 거리-기반 재구성을 사용하여 계통수를 구성했다. 사용한 계통수 구성 소프트웨어는 Paup* (version 4.0b10), ClustalX2 (이웃 연결 방법, version 2.0.10) 및 Mr. Bayes (version 3.1.2) 이었다.
나무-2등분 및 재연결 가지 스와핑을 모든 방법에서 사용했다. 하기 핵심 결정인자에 대한 추정을 제공한 Modeltest 프로그램 (version 3.7) 을 사용하여 서열 진화의 가장 적합한 모델을 추정했다: 빈도 행렬, 감마 분포의 형상 및 비변이 부위의 비율. 특이적 나무 형태에 대한 통계적 지지를 결정하기 위해 1000 번의 반복검증을 사용하여 붓스트랩 분석을 수행했다.
또한 프로그램 TCS (version 1.21 (Clement et al. TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Mol Ecol 9, 1657-9 (2000))) 를 사용하여 서열 데이타로부터 일배체형 네트워크를 구성하여, 통계적 간명성을 사용하여 추정된 분지도와 계통수를 비교했다. 첫번째 경우에 대해 분실 데이타로서 및 두번째 경우에 대해 5 번째 캐릭터로서 처리된 갭으로, 계통수 및 일배체형 네트워크를 2 번 구성했다. DnaSP (version 5.00.02 (Librado et al. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics 25, 1451-2 (2009))) 를 사용하여 관심의 영역 내의 뉴클레오티드 다양성을 계산했다.
관심의 영역 내의 뉴클레오티드 다양성의 분석의 완료, 일배체형 네트워크 및 계통수의 구성 후, 상이한 방법으로부터의 결과를 비교하고 공통 나무로 조화시켰다. 최근의 질환 돌연변이를 공유하는 서열의 군이 계통수 상에서 더욱 밀접하게 분리되는 것으로 추정되었으나, 표현형모사, 우세성 및 우위성으로 인한 산발성 사례는 표현형-일배체형 관계 내로 노이즈를 도입할 수 있다 (Tachmazidou et al. Genetic association mapping via evolution-based clustering of haplotypes. PLoS Genet 3, e111 (2007)).
그러나, 표현형모사, 우세성 및 우위성으로 인한 산발성 사례는 표현형-일배체형 관계 내로 노이즈를 도입할 수 있다. 이 계통발생적 분석은 상기 효과를 최소화하기 위해 클레이드의 높은 수준 집합에 초점을 맞췄다. 계통수 내의 첫번째 분리에서 결정된 클레이드를 사용하여 클레이드 'B' 로부터의 TOMM40 대상-일배체형이 클레이드 'A' 로부터의 대상-일배체형보다 더 늦은 연령에서의 AD 의 발병과 관련되었다는 가설을 시험했다 (각각의 대상은 발병 연관성 신호의 AD 연령에 대해 2 개의 일배체형을 기여함). 상기 계통발생적 분석이 진화적으로 관련된 대상-일배체형의 범주를 식별했으므로, 상기 접근을 사용하여 수행되는 연관성의 시험의 수는 전형적 게놈 전체 연관성 연구에서보다 몇배 더 적었다. 상기 연관성의 시험이 상이한 클레이드가 발병의 연령에 의해 대상-일배체형 데이타를 분류했음을 확인한 경우, 추가의 통계적 분석을 수행하여 각각의 클레이드 내로 서열을 분리한 변이를 식별했다. 효과적으로, 이 분석은 나무 구조에 의해 인도되는 일련의 1-자유도 시험을 이용하여 발병의 연령에 영향을 미치는 인자로서 각각의 변이의 유의성을 평가했다. 단일 뉴클레오티드 및 삽입/결손 다형성을 사용하여 계통발생적 분석을 수행했다. 분석에 포함된 다형성 부위의 수에 대한 본페로니 수정으로 연관성의 통계적 시험을 조정했다.
다형성 분석 소프트웨어로부터의 일배체형 보고 및 DnaSP 소프트웨어 (version 5.00.02 (Librado et al. DnaSP v5: DNA 다형성 데이타의 종합적 분석을 위한 소프트웨어. Bioinformatics 25, 1451-2 (2009))) 로부터의 보고를 그 후의 통계적 분석에 사용했다. DS 코호트의 경우 LOAD 발병의 연령 및 AS 코호트의 경우 LOAD 위험과의 연관성에 대해 개체 TOMM40 SNP 변이, TOMM40 일배체형 및 폴리-T 리피트의 길이를 분석했다. 피셔의 정확성 검증 (양측) 을 사용하여 각각의 ApoE 대립유전자 또는 ApoE 유전자형과 관련된 특이적 TOMM40 대립유전자의 비율의 차이를 비교했다. 30 개의 간명성-정보제공적 부위 및 α = 0.05 로 시작하여, 특이적 대립유전자 연관성의 유의성에 대한 본페로니 수정은 0.001 의 P 값을 요구할 것이다. 오즈 비 (OR) 를 (사례 내의 부 대립유전자의 수/대조군 내의 부 대립유전자의 수)/(사례 내의 주 대립유전자의 수/대조군 내의 주 대립유전자의 수) 로서 계산하고, 95 % 신뢰 구간으로 보고했다. 발병 군의 규정된 LOAD 연령에 대한 평균을 t 검정, 양측에 의해 비교했다. 군 분산에 대한 표준 F 검정을 수행하여 균등 또는 불균등 분산을 추정하여 t 검정이 계산되었는지 여부를 결정했다. JMP 소프트웨어 (version 8, SAS Institute, Cary, NC) 를 사용하여 통계적 분석을 완료했다.
접근 코드: GenBank: TOMM40, 외부 미토콘드리아 막 40 상동체의 트랜스로케이스, 10452; ApoE, 아포지질단백질 E, 348
상기는 본 발명의 설명이며, 본 발명의 제한으로서 여겨져서는 안된다. 본 발명은 본원에 포함된 청구항의 등가물과 함께 하기 청구항에 의해 규정된다.
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Claims (55)

  1. 하기 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병의 발달에 대한 증가된 위험을 결정하는 방법:
    (a) 상기 대상으로부터 취해진 DNA 를 포함하는 생물학적 샘플로부터 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이의 존재를 탐지하는 단계로서, 상기 변이가 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내의 결손/삽입 다형성인 단계; 및
    (b) 상기 유전적 변이가 존재하는 경우 상기 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있는지를 결정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 하기 단계를 포함하는, 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있는 경우 치료적 유효량으로 상기 대상에게 투여하기 위한 항알츠하이머병 활성제를 제조하는 방법:
    (a) 상기 대상으로부터 취해진 DNA 를 포함하는 생물학적 샘플로부터 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이의 존재를 탐지하는 단계로서, 상기 변이가 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내의 결손/삽입 다형성인 단계;
    (b) 상기 유전적 변이가 존재하는 경우 상기 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있는지를 결정하는 단계; 및
    (c) 상기 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있다고 결정되는 경우 치료적 유효량으로 상기 대상에게 투여하기 위한 항알츠하이머병 활성제를 제조하는 단계.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 대상이 유전적 변이가 존재하지 않는 대상에 비해,상기 유전적 변이의 존재에 의해 증가된 위험에 있다고 결정되는 경우 더 이른 나이에 상기 대상에 투여하기 위하여, 상기 활성제를 제조하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 활성제가 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체 작용제 또는 조정제, 항체, 융합 단백질, 치료적 RNA 분자, 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TOMM40 의 상기 유전적 변이가 NCBI Build 36.3 의 게놈 위치 50,094,889 에서의 폴리-T 삽입 변이 (rs10524523) 인 방법.
  8. 치료적 유효량으로 대상에게 항알츠하이머병 활성제를 투여함으로써 알츠하이머병을 치료하기 위하여, 대상에 투여하기 위한 항알츠하이머병 활성제의 제조방법으로서; 개선이 하기 단계를 포함하는 방법:
    상기 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이를 보유하는 경우 상기 유전적 변이를 보유하지 않는 상응하는 대상에 비해 더 이른 나이에 상기 대상에게 투여하기 위한 활성제를 제조하는 단계,
    TOMM40 의 상기 유전적 변이가 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내의 결손/삽입 다형성 (DIP) 인 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 활성제가 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체 작용제 또는 조정제, 항체, 융합 단백질, 치료적 RNA 분자, 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, TOMM40 유전자의 상기 유전적 변이가 rs10524523, rs10602329 및 DIP3 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 변이인 방법.
  13. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DIP 가 삽입 다형성인 방법.
  14. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DIP 가 폴리-T 결손/삽입 다형성인 방법.
  15. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, TOMM40 유전자의 상기 유전적 변이가 rs10524523 인 방법.
  16. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DIP 가 20 내지 50 개의 인접 염기쌍의 폴리-T 를 갖는 폴리-T 결손/삽입 다형성인 방법.
  17. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DIP 가 rs10524523 에서 20 내지 50 개의 인접 염기쌍의 폴리-T 를 갖는 폴리-T 결손/삽입 다형성인 방법.
  18. 하기 단계를 포함하는 환자 프로파일을 수득하는 단계를 포함하는, 환자의 알츠하이머병 발달에 대한 위험 또는 예후를 결정하는 방법:
    상기 환자의 생물학적 샘플에서 ApoE 2, ApoE 3 또는 ApoE 4 대립유전자 중 하나 이상의 존재를 탐지하는 단계, 및
    알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 변이의 존재를 탐지하는 단계, 및 그 후
    상기 환자 프로파일을 상기 예후로 전환하는 단계로서, 상기 ApoE 2, ApoE 3 또는 ApoE 4 대립유전자의 존재 및 상기 하나 이상의 TOMM40 DIP 다형성 변이의 존재가 상기 환자를 알츠하이머병을 발달시킬 위험에 있는 환자로서 식별하는 단계.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 DIP 가 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 인 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 DIP 가 삽입 다형성인 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 상기 DIP 가 폴리-T 결손/삽입 다형성인 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 DIP 가 rs10524523 인 방법.
  23. 제 18 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 하기 단계를 포함하는, 알츠하이머병 치료 요법의 임상 시험의 하위그룹 내로 대상을 계층화하는 방법:
    상기 환자의 생물학적 샘플에서 ApoE 2, ApoE 3 또는 ApoE 4 대립유전자 중 하나 이상의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계,
    알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 변이의 존재를 탐지하는 단계, 및
    상기 하나 이상의 ApoE 2, ApoE 3 또는 ApoE 4 대립유전자 및/또는 TOMM40 DIP 변이의 존재 또는 부존재에 기초하여 상기 요법의 상기 임상 시험에 대한 상기 하위그룹 내로 상기 대상을 계층화하는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 DIP 가 삽입 다형성인 방법.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 DIP 가 폴리-T 결손/삽입 다형성인 방법.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 DIP 가 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 인 방법.
  28. 제 24 항에 있어서, 상기 DIP 가 rs10524523 인 방법.
  29. 제 24 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 하기를 포함하는, 대상이 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있는지를 결정하기 위한 키트:
    (A) ApoE 동종형에 선택적으로 결합하는 항체, 및 ApoE 대립유전자를 인코딩하는 DNA 에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택되는, ApoE 3, ApoE 4 및/또는 ApoE 2 를 특이적으로 탐지하는 하나 이상의 시약;
    (B) 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 변이의 존재를 특이적으로 탐지하는 하나 이상의 시약; 및
    (C) 하기 단계에 의해, 대상이 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있는지를 결정하기 위한 지침:
    (i) 상기 하나 이상의 시약으로 상기 대상에서 ApoE 3, ApoE 4 및/또는 ApoE 2 동종형의 존재 또는 부존재를 탐지하는 단계;
    (ii) 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 인트론 6 또는 인트론 9 내에 위치하는 하나 이상의 TOMM40 결손/삽입 다형성 (DIP) 변이의 존재를 탐지하는 단계; 및
    (iii) 상기 하나 이상의 시약으로 ApoE 3, ApoE 4 및/또는 ApoE 2 및 상기 TOMM40 DIP 의 존재가 탐지되는지 여부를 관찰함으로써 대상이 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있는지 여부를 관찰하는 단계로서, ApoE 3, ApoE 4 및/또는 ApoE 2 동종형 및 상기 TOMM40 DIP 변이의 존재가 상기 대상이 후기발병 알츠하이머병 발달의 증가된 위험에 있음을 지시하는 단계.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 하나 이상의 시약 및 상기 지침이 단일 용기 내에 포장되는 키트.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 DIP 가 삽입 다형성인 키트.
  33. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 DIP 가 폴리-T 결손/삽입 다형성인 키트.
  34. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 DIP 가 rs10524523, rs10602329 또는 DIP3 인 키트.
  35. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 DIP 가 rs10524523 인 키트.
  36. 제 30 항 또는 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정 단계가 상기 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 키트.
  37. 하기 단계를 포함하는, 대상에서 알츠하이머병 발달에 대한 증가된 위험을 결정하는 방법:
    (a) 상기 대상으로부터 취해진 DNA 를 포함하는 생물학적 샘플로부터 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이의 존재를 탐지하는 단계로서, 상기 변이가 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 NCBI Build 36.3 의 유전적 위치에 있는 단계: 50,092,565, 50,092,587, 50,093,609, 50,094,317, 50,094,558, 50,094,716, 50,094,733, 50,094,889, 50,095,506, 50,095,764, 50,096,531, 50,096,647, 50,096,697, 50,096,812, 50,096,902, 50,097,361, 50,098,378 및 50,098,513; 및
    (b) 상기 유전적 변이가 존재하는 경우 상기 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있는지를 결정하는 단계.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 하기 단계를 포함하는, 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있는 경우 치료적 유효량으로 상기 대상에게 투여하기 위한 항알츠하이머병 활성제를 제조하는 방법:
    a) 상기 대상으로부터 취해진 DNA 를 포함하는 생물학적 샘플로부터 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이의 존재를 탐지하는 단계로서, 상기 변이가 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 NCBI Build 36.3 의 유전적 위치에 있는 단계: 50,092,565, 50,092,587, 50,093,609, 50,094,317, 50,094,558, 50,094,716, 50,094,733, 50,094,889, 50,095,506, 50,095,764, 50,096,531, 50,096,647, 50,096,697, 50,096,812, 50,096,902, 50,097,361, 50,098,378 및 50,098,513;
    (b) 상기 유전적 변이가 존재하는 경우 상기 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있는지를 결정하는 단계; 및
    (c) 상기 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험에 있다고 결정되는 경우 치료적 유효량으로 상기 대상에게 투여하기 위한 항알츠하이머병 활성제를 제조하는 단계.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 대상이 유전적 변이가 존재하지 않는 대상에 비해, 상기 유전적 변이의 존재에 의해 증가된 위험에 있다고 결정되는 경우 더 이른 나이에 상기 대상에 투여하기 위하여, 상기 활성제를 제조하는 방법.
  42. 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서, 상기 활성제가 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체 작용제 또는 조정제, 항체, 융합 단백질, 치료적 RNA 분자, 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  43. 치료적 유효량으로 대상에게 항알츠하이머병 활성제를 투여함으로써 알츠하이머병을 치료하기 위하여, 대상에 투여하기 위한 항알츠하이머병 활성제의 제조방법으로서; 개선이 하기 단계를 포함하는 방법:
    상기 대상이 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 TOMM40 유전자의 유전적 변이를 보유하는 경우 상기 유전적 변이를 보유하지 않는 상응하는 대상에 비해 더 이른 나이에 상기 대상에게 투여하기 위한 활성제를 제조하는 단계로서,
    TOMM40 의 상기 유전적 변이가 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 NCBI Build 36.3 의 유전적 위치에 있는 단계: 50,092,565, 50,092,587, 50,093,609, 50,094,317, 50,094,558, 50,094,716, 50,094,733, 50,094,889, 50,095,506, 50,095,764, 50,096,531, 50,096,647, 50,096,697, 50,096,812, 50,096,902, 50,097,361, 50,098,378 및 50,098,513.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4 또는 E4/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제 43 항에 있어서, 상기 대상이 Apo E3/E3 또는 E3/E4 대상인지 여부를 탐지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제 43 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성제가 아세틸콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 대항제, 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체 작용제 또는 조정제, 항체, 융합 단백질, 치료적 RNA 분자, 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  47. 제 7 항에 있어서, TOMM40 유전자의 유전적 변이가 20 내지 50 개의 인접 염기쌍의 폴리-T 를 갖는 결손/삽입 다형성 rs10524523 인 방법.
  48. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 활성제가 티아졸리딘디온인 방법.
  49. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 활성제가 티아졸리딘디온 약물인 방법.
  50. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성제가 티아졸리딘디온인 방법.
  51. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성제가 티아졸리딘디온 약물인 방법.
  52. 제 4 항, 제 5 항, 제 8 항 내지 제 10 항, 제 40 항 및 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 알츠하이머병의 발병을 지연시키기 위한 것인 방법.
  53. 제 4 항, 제 8 항 내지 제 10 항, 제 40 항 및 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 알츠하이머병의 진행을 지연시키기 위한 것인 방법.
  54. 제 4 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 활성제가 티아졸리딘디온이고, TOMM40 유전자의 상기 유전적 변이가 rs10524523 에 있고, 상기 투여가 알츠하이머병의 발병을 지연시키기 위한 것인 방법.
  55. 제 4 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 활성제가 티아졸리딘디온이고, TOMM40 유전자의 상기 유전적 변이가 rs10524523 에 있고, 상기 투여가 알츠하이머병의 진행을 지연시키기 위한 것인 방법.
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