KR20140095467A

KR20140095467A - 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들, 이들의 제조 및 이들의 항바이러스제로서의 사용

Info

Publication number: KR20140095467A
Application number: KR1020147009385A
Authority: KR
Inventors: 피터 부츨러; 미켈라 슈미트케; 바딤 마카로프
Original assignee: 드리테 파텐트포트폴리오 베타일리궁스게젤샤프트 엠베하 운트 코. 카게
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2012-10-15
Publication date: 2014-08-01
Also published as: NZ623573A; EP2766367B1; HUE059217T2; JP6071012B2; MX2014003987A; AU2012322750A1; CA2850439A1; HRP20220928T1; EP2766367A1; IL231934A; BR112014008815B1; JP2014528468A; IL231934A0; SG10201602846TA; ES2924828T3; WO2013053942A1; SG11201401351PA; US20140296259A1; BR112014008815A2; DK2766367T3

Abstract

본 발명은 일반식 I의 5-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들:

I
또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약제에 관한 것이며, 식 중 적어도 하나의 페닐기 A 및 B에 있어서 적어도 하나의 수소 원자는 0.23 보다 큰 하멧 상수 σ_p 를 가지는 치환기 R^H로 치환된다. 본 발명은 또한 이의 제조 방법에 관한 것이다. 대응 화합물들에 대하여, 놀랍게도 바이러스에 대하여, 특히 리노바이러스 및 피코나바이러스에 대하여 특별히 높은 활성이 확인되었다. 더우기, 이 화합물들은 내성이 매우 좋다. 이러한 이유들로 이 화합물들은 바이러스성 감염증 치료에 적당하며 의약으로서 적당하다.

Description

4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들, 이들의 제조 및 이들의 항바이러스제로서의 사용 {4-Amino-3-phenylamino-6-phenylpyrazolo[3,4-d]pyrimidine derivatives, their manufacture and their use as antiviral active substances}

본 발명은 새로운 타입의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들 및 이들의 항바이러스제로서의 사용, 바람직하게는 피코르나바이러스 감염증 치료를 위한 사용에 관한 것이다.

피코르나바이러스, 특히 엔테로바이러스 및 리노바이러스는, 인간에 있어서 광범위한 종류의 질병들의 원인이다. 상기 엔테로바이러스는 60개 이상의 서로 다른 인간 병원성 항원형들을 포함한다 (Melnick J in: Fields B et al., editors. Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers; 1996, 655-712). 엔테로바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스 A 및 B 감염은 종종 비특이적 발열 과정을 가져오며 리노바이러스 감염으로부터 자주 구별되지 않는 상기도(upper respiratory tract) 질환을 유발한다. 유행병 (epidemics)으로서 나타날 수도 있는 더욱 심각한 임상적 형태는, 출혈결막염 (hemorrhagic conjunctivitis), 헤르페스목구멍염 (herpangina), 수족구병 (hand-foot-and-mouth disease), 무균수막염 (aseptic meningitis), 뇌염 (encephalitis) 및 급성 심근염 (myocarditis)을 포함한다. 그래서 서로 다른 바이러스 유형들이 동일한 증상을 유발할 수 있으며 또는 하나의 바이러스 유형이 전혀 다른 임상적 형태들을 유발할 수도 있다. 바이러스 진단에 있어서 현대적이고 민감한 방법들의 소개로, 지속적인 장내 바이러스성 RNA 뿐만 아니라 바이러스 단백질들을, 제 2형 당뇨병, 척수 회백질염 (poliomyositis) 및 특히 만성 심근염과 같은 만성 질환들과 관련되어 확인할 수 있었다. 지속적 엔테로바이러스 감염증은 또한 무감마글로블린혈증 (agammaglobulinemia)의 환자에서 나타나며 지속적 엔테로바이러스 수막뇌염 (meningoencephalitis)으로 나타난다. 피부근염 (dermatomyositis) 또는 다발근육염 (polymyositis)은 종종 승무원 증후군 (attendant symptoms)으로 나타났다. 리노바이러스는 약 100개의 항원형 (serotype)들을 포함한다. 리노바이러스 감염은 인간에 있어서 상기도의 전체 호흡기 질환 중 반 이상을 유발한다 (Couch RB in: Fields BM et al., editors: Fields Virology, 3rd edition. Lippincott-Raven, Philadelphia, 1996, 713-35). 대부분 무해한 과정을 거치는 이들 감기는, 약 10일 동안의 평균 질병 지속기간 중 매년 약 백만명의 지역보건의(GP: general practitioner) 방문과 학교 결석 및 직장 휴가를 가져온다. 가능한 합병증으로서는 중이염 (otitis media), 축농증 (sinusitis), 천식의 악화 및 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis)뿐만 아니라 하기도 (lower respiratory tract)의 감염을 포함하며 특히 어린아이, 고령의 환자 및 면역억제 환자들에서 나타난다. 유형이 다양하기 때문에 예방접종은 현재로서는 가능하지 않다. 이들 질병과 관련하여 근무를 못하고, 지역보건의를 방문하여야 하고 의약품을 투여하여야 하기 때문에 리노바이러스 및 엔테로바이러스는 매년 상당한 비용을 의미한다. 현재까지 유용한 바이러스-특이적 치료제가 없기 때문에 이들 바이러스 감염의 치료는 증상에 의존한다 (Rotbart HA: Antiviral Res 2002, 53(2), 83-98). 또한, 항생물질은 종종 불필요하게 처방된다. 따라서 새로운 바이러스 억제제 (virustatic agent) 개발이 절대적으로 필요하다.

엔테로바이러스 및 리노바이러스 감염증의 치료 가능성을 위한 집중적인 연구의 결과들은 2002년 롯바트에 의하여 총람 논문으로서 요약되어 있다 (Rotbart HA: Antiviral Res 2002, 53(2), 83-98). 예를 들면, 리바비린 (ribavirin)은 숙주 세포 효소인, 이노신 5’-모노포스페이트 (IMP) 탈수소효소를 억제한다. 퓨린 뉴클레오티드 (purine nucleotides)의 합성을 위하여 이 주요 효소 (key enzyme)를 비활성화시킴으로써, 피코르나바이러스의 복제가 생체외 (인비트로: in vitro) 및 생체내 (인비보: in vivo)에서 억제된다. 더우기, 리바비린은 소아마비 바이러스의 게놈에 직접 삽입되어 RNA 바이러스에 대한 돌연변이원 (mutagen)으로서도 작용하게 된다 (Crotty S et al.: Nat Med, 2000, 6(12),1375-9). 이들 화합물은 심각한 부작용들 때문에 리노바이러스 및 엔테로바이러스 감염증 치료에 사용되지 않는다. 바이러스성 RNA 합성을 방지하기 위한 구체적인 표적은 게놈 그 자체, 바이러스성 RNA-의존성 RNA 중합효소뽄만 아니라 복제복합체 (replication complex)에 필요한 기타 바이러스성 단백질들이다. 구아니딘류, 티오세미카바존류 (티오semicarbazones), 벤즈이미다졸류 (benzimidazoles), 디피리다몰류 (dipyridamoles) 및 플라본류 (flavones)가 세포 배양 중 다른 피코르나바이러스의 중합효소들의 억제제로서 오랫동안 알려져 왔다. 따라서 다양한 정도의 성공이 인비보에서 달성되었다. 인비록심 (Enviroxime) 유도체들은 폭넓은 항-엔테로바이러스 및 항-리노바이러스 활성을 가지는 가장 유력한 대체물질로서 여겨진다. 인비록심은 바이러스 단백질 3A에 결합함으로써, 바이러스 생식 (reproduction)에서 RNA 중간체 (intermediates) 형성에 필요한 플러스가닥 RNA의 합성 진행을 방해한다 (Heinz BA 및 Vance LM: J Virol, 1995, 69(7), 4189-97). 임상연구 중 치료효과가 중간 정도 또는 전혀 없거나, 불량한 약물동태 (약물동태학적s) 및 바람직하지 않은 부작용이 관찰되었다 (Miller FD et al.: Antimicrob Agents Chemother, 1985, 27(1), 102-6). 현재까지 생체이용률 및 내성 (tolerance)이 보다 좋은 새로운 유도체들에 대한 임상데이타는 없다.

바이러스성 단백질분해효소 2C의 미세구조 및 기능에 대한 지식에 기초하여, 단백질분해효소 억제제 AG 7088가 개발되었다. AG 7088는 나노몰 농도 범위에서 세포 배양 중 48 리노바이러스 유형들뿐만 아니라 키콕사 바이러스 A21, B3, 엔테로바이러스 70 및 에코바이러스 11에도 작용한다 (Pattick AK et al.: Antimicrobila Agents Chemother, 1999, 43(10), 2444-50). 현재까지 임상연구의 결정적인 데이타가 알려진 바는 없다.

캡시드 차단제 (capsid blockers)의 목표화 설계의 선행과제인 바이러스성 캡시드 (capsids) 분자구조의 규명으로, "WIN 물질들 (substances)"이 만들어졌다 (Diana GD: Curr Med Chem 2003, 2, 1-12). 이들은 리노바이러스 및 엔테로바이러스의 흡수 및/또는 탈각 (uncoating)을 방해한다. WIN 물질들 중 일부는 피코르나바이러스들 중 속 종류들 또는 바이러스 종류들 각각에 극히 특이적으로만 작용한다. 다른 유도체들은 리노바이러스뿐만 아니라 엔테로바이러스의 복제를 억제한다. WIN 물질들은 예를 들면 아릴돈 (arildone), 디스옥사릴 (disoxaril) 및 피로다비르 (pirodavir)를 포함한다. 이들 화합물은 세포 배양 중 매우 우수한 항바이러스성 효과를 나타낸다. 용해도가 나쁘거나 (아릴돈), 생체내이용률이 저조하거나 (아릴돈 및 디스옥사릴), 대사 및 배설이 신속하거나 (디스옥사릴 및 WIN 54954) 뿐만 아니라 부작용, 예를 들면 피부 발질 (skin rash) (WIN 54954)이 나타나, 임상 적용을 불가능하다. 다른 캅시드 억제제인 플레코나릴 (pleconaril)에 큰 기대가 있다. 플레코나릴은 경구 생체내이용율이 매우 우수하며, 바이러스 캅시드에서 소수성 포켓 (hydrophobic pocket)에 결합한 후 리노바이러스, 에코바이러스 및 키콕사 바이러스의 투과를 억제한다 (Pevear DC et al.: Antimicrob Agents Chemother 1999, 43(9), 2109-15; McKinlay MA et al.: Annu Rev Microbiol 1992, 46, 635-54). 따라서 통상의 감기부터 바이러스성 수막염 또는 심근염까지 폭넓은 스펙트럼의 바이러스성 질환들에 대하여 효과가 기대된다. 내성은 리노바이러스, 엔테로바이러스 71 및 키콕사 바이러스 B3의 경우에 관찰되었다 (Ledford RM et al.: J Virol 2004, 78(7), 3663-74; Groarke JM et al.: J Infect Dis 1999, 179(6), 1538-41). 엔테로바이러스 수막염 (Abzug MJ et al.: Pediatr Infect Dis J, 2003, 22, 335-41)뿐만 아니라 리노바이러스에 의한 호흡기 감염 (Hayden FG et al.: Antivir Ther, 2002, 7, 53-65; Hayden FG et al.: Clin Infect Dis, 2003, 36, 1523-32)을 앓고 있는 어린이와 성인들에 대한 임상연구들이 잘 되었다. 그러나 미국 내에서 리노바이러스 감염을 치료하기 위하여 플레코나릴 (Picovir, Viropharma, USA)을 라이센싱하기에는 증명된 치료효과가 충분하지 않다. 2002년 3월에 해당 신청은 FDA (the Food and Drug Administration)에서 불리한 위험-유익성 평가가 불리함 (unfavourable risk-benefit assessment)을 이유로 거절되었다.

피라졸로피리미딘류 또한 CRF 길항제 (Corticotropin-Releasing Factor Antagonists)로서 기술되어 왔다 (예를 들면 EP 674 642 및 EP 691 128). 예를 들면, 아데노신인산화효소 (adenosine kinase)를 억제하거나 (EP 496 617 또는 US 4,904,666), 잔틴 옥시게나제 (xanthine oxigenase)를 억제하거나 (J. Heterocyc. Chem. 19, 1565, 1982) 또는 기타 효소 시스템들을 억제한다 (US 2,965,643 및 US 3,600,389).

따라서 계속, 리노바이러스 및 엔테로바이러스 질환들을 치료하기 위한 매우 효과적인 항바이러스제를 개발하기 위한 항바이러스 연구의 결정적인 부분이 될 것이다. 새로운 화합물들은 잘 소화흡수되어야 하며, 또한 예를 들면 플레코나릴의 경우 존재하는 내성이 극복되어야 한다.

WO 00/43394 A 는 치환된 피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들 및 이들의 항바이러스제로서의 사용을 기술하고 있다.

EP 2 049 540 또한 4-아미노-3-아릴아미노-6-아릴피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들 및 이들의 항바이러스제로서의 사용을 기술하고 있다.

본 발명의 목적은 다른 피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들의 구체화뿐만 아니라 이들의 제조, 그리고 엔테로바이러스 및 리노바이러스에 대한 항바이러스제로서의 사용을 구체화하는 것이며, 뿐만 아니라, 예를 들면 이 물질들의 안정성 및 생체내이용율과 관련하여, 상술한 선행기술의 단점을 회피하는 것이다 .

상기 목적은 구체적으로는 일반식 I의 치환된 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들에 의하여 달성되며, 여기에는 이들의 약학적으로 허용되는 염 화합물들 및 이들의 전구약제 (pro-pharmacons)가 포함된다.

식 중 페닐기 A 및 B 중 적어도 하나에 있어서 적어도 하나의 수소 원자가 0.23 보다 큰 하멧 상수 (Hammett constant) σ_p 값을 가지는 치환기 R^H로 대체 (replace) 되며,

여기에서 페닐기 A 및 B 각각에 있어서 모든 추가의 수소 원자가 서로 독립적으로 잔기 R¹ 로 대체될 수 있으며, 식 중

· 각각의 R¹ 은 독립적으로 할로겐, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지의, 1-7개의 사슬구성원을 가지는 지방족 라디칼, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지의, 1-8개의 사슬구성원을 가지는 알칸올 라디칼, NO₂, CN, CONR² ₂, COR², COOR², OR², SR², NR² ₂, SO₂NR² ₂, CX₃, CR²X₂, OCX₃, OCR²X₂, 또는 페닐일 수 있으며;

· 각각의 R² 는 독립적으로 수소, 포화 또는 불포화, 할로겐화 또는 비- 할로겐화, 선형 또는 분지의, 1-7개의 사슬구성원을 가지는 지방족 라디칼, 벤질, 페닐 또는 나프틸, 포화 또는 불포화, 모노- 또는 폴리의, 헤테로원자들 N, S 또는 O을 가지는 헤테로사이클이며, 식 중 상기 언급된 기들 각각은 독립적으로 불소, 염소, 브롬, 트리플루오르메틸, 알킬, 알콕시, 시아노, 니트로, 아미노, 아미노알킬, C(O)-알킬, C(O)O-알킬, 벤질, 페닐 또는 나프틸로 치환될 수 있으며; 그리고

· X 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 I이다.

하위 청구항들에서, 구체적으로 치환된 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들의 유리함뿐만 아니라 그 가능한 적용들을 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

일반식 I의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들이 유리하며, 식 중 적어도 하나의 페닐기 A 및 B에 있어서 적어도 하나의 수소 원자가, NO₂, CN, CF₃, CCl₃, CBr₃, OCF₃, OCCl₃, OCBr₃, CHF₂, CHCl₂, CHBr₂, OCHCl₂, CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe 또는 COOEt로부터 선택된, 바람직하게는 CF₃ 또는 OCF₃로부터 선택된 치환기 R^H로 대체된다. 페닐기 A 및 B 중 둘 다 또는 하나에 있어서 하나, 두 개 또는 세 개의 수소 원자들이 치환기 R^H로 대체되는 것이 유리하다. 특별한 구현예에서 페닐기 A 및 B 중 하나에 있어서 정확히 한 개의 수소 원자가 치환기 R^H로 대체된다. 치환기 R^H 는 페닐 고리 A 또는 B의 파라 위치에 존재할 수 있다.

페닐기 A 및 B 각각은 서로 독립적으로, R^H 뿐만 아니라 추가의 잔기들 R¹을 가질 수 있다. 페닐기 A 및 B는 서로 독립적으로, 하나도 없거나, 하나, 두 개 또는 세 개의 추가의 잔기들 R¹를 가지는 것이 유리하며, 바람직하게는 하나도 없거나 또는 하나의 추가 잔기 R¹을 가지는 것이 유리하다.

알킬류로서 특히 선형 또는 분지의 C₁ _-7-알킬류, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 및 부틸을 본 발명과 관련하여 고려할 가치가 있다. 이와 동일하게 본 발명과 관련하여 알칸올류, 알킬아민류 및 알킬아미드류에도 적용된다.

본 발명은 일반식 II의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들을 특히 포함한다.

식 중 치환기 R^A, R^B 각각은 독립적으로 수소, 할로겐, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지의, 1-7개의 사슬구성원을 가지는 지방족 라디칼, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지의, 1-8개의 사슬구성원을 가지는 알칸올 라디칼, NO₂, CN, CONR² ₂, COR², COOR², OR², SR², NR² ₂, SO₂NR² ₂, CX₃, CR²X₂, OCX₃, OCR²X₂, 또는 페닐일 수 있으며; R² 및 X 는 상기에 정의된 바와 같으며; 식 중 치환기들 R^A, R^B 중 적어도 하나가 0.23 보다 큰 하멧 상수 σ_p 를 가진다.

본 발명은 일반식 IIa 또는 IIb의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들을 특히 포함한다:

식 중 R^H 는 NO₂, CN, CF₃, CCl₃, CBr₃, OCF₃, OCCl₃, OCBr₃, CHF₂, CHCl₂, CHBr₂, OCHCl₂, CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe 또는 COOEt로부터 선택되고, 바람직하게는 CF₃ 또는 OCF₃로부터 선택된다.

또한, 일반식 I, II, IIa 또는 IIb의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체를 함유하는 약학적 조성물들을 포함한다. 이러한 약학적 조성물들은 추가의 물질들, 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 부형제류 및 담체류를 함유할 수 있다. 특별한 양태에서 상기 약학적 조성물들은 추가의 활성물질들, 특히 항바이러스제, 특히 피코르나바이러스에 대한 활성제를 함유할 수 있다.

놀랍게도, 본 발명의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들이 간 마이크로좀 (liver microsomes)에서의 안정성이 최신기술의 물질들과 비교하여 상당히 안정한 것으로 나타났다. 더우기 마우스에서의 약물동태학적 연구에서 본 발명의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들이 최신기술의 물질들보다 상당히 우수한 생체내이용율을 가지는 것으로 나타났다. 동시에 본 발명의 화합물들은 나노 또는 마이크로몰 농도범위에서 피코르나바이러스에 대한 항바이러스성 활성, 특히 엔테로바이러스 및 리노바이러스에 대한 항바이러스성 활성이 강력한 것으로 나타났다.

따라서 화학식 I, II, IIa 또는 IIb의 화합물을 함유하는 약학적 제제는 피코르나바이러스 특히 엔테로바이러스 및 리노바이러스에 의하여 유발될 수 있는, 인간 및 동물들의, 호흡기 감염, 무균수막염, 뇌염 (encephalitis), 포진성구협염 (herpangina) 등의 치료에 특히 적당하다.

상기 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들은 페닐기 하나 또는 둘 모두에서 0.23 보다 큰 하멧 상수 σ_p를 가지는 치환기 R^H 를 가지는 것이 특징이다. 이 수치 0.23는 브롬의 하멧 상수 σ_p에 해당하며, 이것은 할로겐류 중에서 파라 위치에 대한 가장 큰 하멧 상수를 나타낸다.

치환기들에 대한 하멧 상수들의 결정은 하멧 식 (Hammett equation)에 따라 벤조산의 이온화 상수에 기초한다.

σ_x = log K _X - log K _H

식 중 K _H는 25 ℃에서 물 중 벤조산의 이온환 상수이며, K _X는 메타 또는 파라 치환된 벤조산에 대한 대응 상수이다. 메타 (σ_m) 및 파라 위치 (σ_p)의 서로 다른 치환기들에 대한 하멧 상수의 결정 방법뿐만 아니라 다양한 치환기들의 이미 확인된 수치들 또한 다음의 공개문헌에서 얻을 수 있으며 그 내용 전체가 본 명세서에 포함된다: Hansch et al., "A Survey of Hammett 치환기 Constants 및 Resonance 및 Field 파라미터들", in Chem. Rev. 1991. 97, 165-195. 따라서 적어도 하나의 치환기 R^H 가 결정적으로 위치하는 그 위치와 상관없이 파라 위치 (σ_p)에 대하여 제각각의 배타적인 수치 σ가 본 발명에 중요하다.

본 발명의 예로서는 표 1의 화합물들이며, 여기에는 이들의 약학적으로 허용되는 염 화합물들도 포함된다.

또한 본 화합물들의 전구약제 (pro-pharmacons: 프로드럭)도 포함하며, 특히 위치 1에서 피라졸 헤테로원자 상의 치환기로 특징되는 전구약제도 포함한다. 화합물의 이러한 유형들은 인비보에서 1H 피라졸 화합물로 전환되는 것으로 나타나왔다. 예로서 화합물들은, 위치 1에서 상기 피라졸 헤테로원자가 이미노(페닐)메틸 치환기로 치환되는 것, 예를 들면, 1-[이미노(페닐)메틸]-4-아미노-3-(4-트리플루오르메틸-페닐)아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘로, IUPAC 명명법으로는 지칭하면 1-벤질카르복스이미도일-6-페닐-3-N-[4-(트리플루오르메틸)페닐]-1H-피라졸로[3,4-d]-피리미딘-3,4-디아민에 관하여 언급되어 왔다. 여기 이것은 상기에서 기술된 화합물 CRCV-340의 제조 부산물, 즉 반응혼합물 중 과량의 벤즈아민과 화합물 CRCV-340가 반응한 결과물로서 다음의 화학식을 가지는 것에 관한 것이다:

CRCV -340- 프로드럭

이들 화합물들 (예를 들면 CRCV-340 프로드럭)이 인비보에서 매우 쉽게 표적 화합물로 전환됨이, 혈청 중에 최종 활성성분(예를 들면 CRCV-340)만이 주로 확인되는 방법으로 밝혀졌다. 또한 상기 화합물들로부터 생산되는 염들, 용매화물들 또는 그 염들의 용매화물들도 포함한다. 본 발명의 범위 안에서 바람직한 염들은 본 발명과 관련된 화합물들의 생리학적으로 무해한 염들이다. 본 발명과 관련된 화합물들의 생리학적으로 무해한 염들은 무기산류, 카르복실산류 및 설폰산류의 부가 염들을 포함하며, 예를 들면 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 메탄 설폰산, 설폰 초산 (sulphonic acetic acid), 톨루엔 설폰산, 벤젠설폰산, 나프탈렌-설폰산, 초산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 락트산, 타르타르산, 말산, 시트르산, 푸마르산, 말레산 및 벤조산으로부터의 염들이다.

본 발명은 특히, 일반식 (I)의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들의 합성방법뿐만 아니라 피코나바이러스 감염증에 대한 이들의 효과 및 사용을 이용하여 하기에서 자세히 설명될 것이다.

반응식 1은 피라졸로[3,4-d]피리미딘 1의 합성에 대한 일반 도해를 나타내며, 첫번째 단계에서 알콜 중 페닐아민류 3와 [비스(메틸티오)메틸렌]말로노니트릴 2를 축합하여 페닐 유도체들 4로 만드는 것을 포함한다. 후자는 각각 분리될 수 있으며 추가의 반응을 위하여 정제되거나 또는 정제하지 않고 직접 다음 반응 (원 포트 반응: "one-pot" reaction)에 사용될 수도 있다. 다음 단계는 페닐 유도체 4을 하이드라진 또는 하이드라진 유도체들과 반응시키는 것이다. 이 반응은 1 내지 4 시간 동안 끓여 이루어지며 피라졸 5을 고 수율로 얻는다. 피라졸로 [3,4-d]피리미딘 1 합성의 마지막 단계는 초산, 트리플루오로아세트산 또는 소디움 아세테이트 존재하에 페닐아민 6과 피라졸 5을 축합시키는 것이다.

[반응식 1]

상기 화합물들은 용매없이 200-220℃에서 과량의 소디움 아세테이트 존재하에서 대응 벤즈아미딘 염산염으로 마지막 합성 단계에서 피라졸 (5)을 변형시킴으로써 유리하게 얻어질 수 있다.

또는, 상기 화합물들을 포타슘-tert-부틸레이트 존재하에 마이크로파 조사하여 대응 벤조니트릴 (다량의 여분의 양)으로 마지막 합성 단계에서 피라졸 (5)을 w전환시킴으로써 얻을 수 있다.

다른 합성 방법으로는, 나트륨 수소화물 존재하에 아릴 이소티오시아네이트류로 말로노니트릴을 원 포트 반응시킨 후 메틸 요오드화물 또는 디메틸 설페이트로 반응혼합물을 처리하는 것이다. 이 과정에서 다량의 엔아민이 생성된다. 산 존재하에, 예를 들면 초산 또는 트리플루오로아세트산, 또는 이들의 염들 (아세테이트)의 존재하에서 아릴아민류 6와 피라졸 5를 축합시키는 것이 다시 한번, 피라졸로[3,4-d]피리미딘 1을 생산하기 위한 마지막 합성 단계이다.

특히 고 수율로의 피라졸 (5)의 피라졸로[3,4-d]피리미딘으로의 전환이, 유리 염기 (free base)로서 벤즈아미딘 성분을 사용하고 극성 용매 중에서 반응시킴으로써 이루어질 수 있는 것으로 나타났다. 이 방법의 장점은 또한, 분리하기 어려운 부산물들의 비율을 최소로 할 수 있다는 것이다. 이 반응은 다음의 반응 도해에 따라, 치환된 5-아미노-4-시아노-3-페닐아미노-피라졸류 (5)에 유리 염기 (6)로서 임의로 치환된 벤즈아민류를 반응시켜 4-아미노-3-(페닐아미노)-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 (1)로 전환하는 것에 기초하여 얻어진다.

[반응식 2]

잔기들 R^A 및 R^B 은 상기에서 R¹로서 정의된 치환기들이다.

상기에서 기술한 전환은, 상기 일반식 (I)에서 적어도 하나의 페닐기 A 및 B에 있어서 적어도 하나의 수소 원자가 하멧 상수 σ_p > 0.23인 치환기 R^H로 대체되는 것인 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들의 제조에 특히 적당한 반면, 상기 방법은 그러한 치환기들, 즉 이 잔기는 수소을 나타내거나 또는 화학식 I과 관련하여 상기에 정의된 바와 같은 잔기 R¹을 나타내는 것인 그러한 치환기들을 가지지 않는 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘류의 제조를 위하여 또한 사용될 수 있다.

바람직하게는 본 발명은 또한, 잔기들 R^A 및 R^B 은 서로 각각 독립적으로 NO₂, CN, CONR³ ₂, COOR³, CHO, CHONH₂, 할로겐, 불포화 또는 포화 선형 또는 분지의, 1 내지 6개의 사슬 구성원을 가지는 지방족 라디칼 (일명 알킬기), 포화 또는 불포화 선형 또는 분지의, 1-6개의 사슬구성원을 가지는 알칸올 라디칼 (일명 알콕시기), OR³, SR³, NR³ ₂, SO₂NR³, 디- 또는 트리플루오르메틸로부터 선택될 수 있으며, 상기 잔기 R³ 는 H, 메틸-, 에틸-, 프로필- 또는 부틸- 기들로 이루어질 수 있는, 상기에 기술된 반응들에 관한 것이다. 본 발명의 화합물들이 호변이성 형태 (tautomeric forms)로 존재할 수 있는 한, 본 발명은 모든 호변이성 형태들을 포함한다.

상기 문단 중의 치환기들은 별도로 특정되지 않는단 다음의 의미를 갖는다:

알킬뿐만 아니라 알콕시 중의 알킬 부분들도 직쇄 또는 분지의 알킬류를 나타내며, 별도로 기술되지 않는다면, (C1-C6)-알킬, 특히 (C1-C4)-알킬, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸을 포함한다. 유리하게는 알콕시는 직쇄 또는 분지의 알콕시 잔기, 특히 1 내지 6, 특히 바람직하게는 1 내지 4, 그리고 가장 바람직하게는 1 내지 3 탄소 원자들을 가지는 알콕시 잔기를 나타낸다. 예로서 그리고 바람직하게는 메톡시, 에톡시, N-프로폭시, 이소프로폭시, t-부톡시, n-펜톡시 및 n-헥스옥시 (n-hexoxy)가 언급된다. 아릴은 일반적으로 6 내지 14 탄소 원자들을 가지는 모노- 내지 트리사이클릭 방향족의, 카보사이클릭의 잔기를 나타낸다. 예로서 그리고 바람직하게는 아릴은 페닐, 나프틸 및 페난트레닐 (phenantrenyl)로부터 선택되고, 특히 페닐이 바람직하다. 할로겐은 불소, 염소, 브롬 및 요오드을 나타내며, 바람직하게는 불소 및 염소이다.

페닐아미딘 6이 대응 아릴아미딘으로 대체되는 경우인 일반적인 아릴피라졸로[3,4d]피리미딘 유도체들을 제조하는 것이 이 방법으로 또한 가능하다. 특히 페닐 고리 A 및 B 대신에 나프틸, 피리딜, 키놀일 (chinolyl), 피라지닐, 피리미딜, 피라졸릴, 트리아지닐, 이미다졸릴, 퓨라닐, 티에닐 또한 최종 산물에 함유될 수 있으며, 여기에서 상기 언급된 기들 각각에 있어서 수소 원자들 각각은 독립적으로, 화학식 I과 관련하여 상기에서 정의된 바처럼 잔기 R¹로 대체될 수 있다. 이러한 방법 또한 본 발명의 내용이다.

반응식 2에 나타낸 반응은 불활성, 극성 유기용매 중에서 이루어진다. 불활성 극성 유기용매들은, 예를 들면, 에테르, 구체적인 예로는 디에틸에테르, 메틸-tert.-부틸에테르, 1,2-디메톡시에탄, 글리콜 디에틸 에테르 또는 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르, 사이클릭 에테르, 예를 들면 디옥산, 테트라하이드로퓨란, 탄화수소류, 예를 들면 에틸 벤젠, 자일렌, 톨루엔 또는 알콜류, 예를 들면 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올 및 이소프로판올이다. 특히 용매로서 n-부탄올을 사용하여 순수한 생성물들을 얻는다. n-부탄올은, 피라졸 유도체의 최초 양에 대하여 1 내지 10의 몰비로, 특히 바람직하게는 1.5 내지 3의 몰비로 사용되어야 한다.

본 발명의 범위 안에서, 벤즈아미딘 (6)를 염기 형태 (유리 염기로서)로 새롭게 제조하는 경우 특히 유용하게 나온다. 상기 합성은 일반적인 방법을 사용하여 대응하는 유용한 염으로부터 이루어진다. 피라졸 유도체들 (5)에 대하여 벤즈아미딘 (6)을 1 내지 1.5의 몰비로 사용하는 것이 가장 좋다.

상기 반응은 60 내지 110℃의 온도에서, 바람직하게는 85 to 95℃에서, over 10-30 시간 동안, 바람직하게는 18-20 시간 동안 수행된다.

이러한 방법으로 얻어진 아미노-3-(페닐아미노)-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 (1)은 재결정으로 정제한다. 이를 위하여 바람직하게는 테트라하이드로퓨란 또는 테트라하이드로퓨란과 물 또는 유기용매와의 혼합물, 특히 바람직하게는 테트라하이드로퓨란과 톨루엔과의 혼합물이 사용된다. 여기에 다른 방법으로는 아미노-3-(페닐아미노)-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘을 또한 테트라하이드로퓨란 중의 뜨거운 용액으로부터 물 또는 유기용매로, 바람직하게는 톨루엔으로 석출시켜 정제할 수도 있다.

다음 실시예들에서 피코나바이러스 감염증에 바람직하게 적용가능한, 일반식 (I)의 특별한 화합물들을 나열하는데, 여기서 화합물들은 용액 또는 현탁액 상태로 제조될 수 있으며 이때 약학적으로 허용되는 수성, 유기성 또는 수성-유기성 매질을 이용할 수 있으며 경우 또는 비경구로 적용할 수 있으며 비경구로서는 정맥, 피하 또는 근육내 주사하거나 또는 비강내 투여할 수 있으며, 통상의 담체를 이용하여 정제, 캅셀제 또는 수성 현탁액제의 형태로 하여 경구투여용 또는 좌제로서 개발할 수 있다.

따라서 화학식 (I)의 화합물들은 체중을 기준으로 하여 0.1 to 1000 mg/kg 의 투여량으로 사용될 수 있다.

4-아미노-3- 페닐아미노 -6- 페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체들의 제조 및 분석

본 발명의 화합물들의 구조적 규명은 합성의 유형, 원소분석, NMR 분광학 및 질량분석으로 이루어졌다.

원료 물질들:

5-아미노-4-시아노-3-페닐아미노피라졸류는 반응식 1 에 나타낸 방법뿐만 아니라 토미나가 와이 등 (Tominaga Y et al., J. Heterocycl. Chem., 1990, 27, 775-779)의 기재에 따라 합성하였다. 아릴아미딘류는 이미 알려진 선행기술에 따라 대응 시아노겐 원료 화합물들로부터 합성하였다 (Boere, RT et al.: J. Organomet. Chem., 1987, 331, 161-167; Garigipati RS: Tetrahedron Lett., 1990, 31, 1969-1978; Dann O et al.: Justus Liebigs Ann. Chem., 1982, 1836-1839).

참조 실시예 1: 4-아미노-3- 페닐아미노 -6- 페닐피라졸로 [3,4-d] 피리미딘

(3-N,6-디페닐-2H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3,4-디아민)

3.0 g (17.24 mmol) 벤즈아미딘 염산염 수화물 및 2.2 g (23.0 mmol) 소디움 아세테이트를 교반하면서 2.3 g (11.5 mmol) 5-아미노-4-시아노-3-페닐아미노피라졸에 가하였다. 반응혼합물을 30 분 동안 220 ℃에서 가열하였다. 결과 물질을 50 ml 물로 처리하고, 여과하고 20 ml 냉 메탄올 및 20 ml 냉 에스테르로 세척하였다. 생성물을 DMF/물로부터 결정화하여 정제하였다.

밝은 황색, 고체 결정 물질. 수율 57 %. mp 253-5 ℃. R _f (클로로포름 - 메탄올; 10/1) - 0.8 (실리카겔 60). MS m/z 302 (M+).

참조 실시예 2: 4-아미노-3-( 페닐아미노 )-6- 페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 (다른 제조방법)

2.5 시간 동안 115℃에서 미리 건조한 5.22 g 벤즈아미딘 염산염을, 100 ml 메탄올 중 1.74 g 소디움 메틸레이트의 용액에 천천히 가하고 30 분 동안 실온에서 교반하였다. 비유기성 백색 침전물을 여과하여 분리한 후에 3.5 ml n-부탄올을 가하고 부피가 3 ml로 감소될 때까지 감압하였다. 그 잔사는 희끄무레한 오일이며, 4.0 g 벤즈아미딘에 해당되는데 즉시 다음 반응 단계에서 사용하였다.

5-아미노-4-시아노-3-(페닐아미노)-피라졸 (6.0 g; 분말 Ref-1)을 10 ml n-부탄올에 용해하고, 3 ml n-부탄올 중의 4.0 g 벤즈아미딘을 실온에서 가하였다. 반응을 20 시간 동안 85℃에서 진행하였다. 최종적으로, 용액을 냉각시키고, 황색 침전을 여과분리하고 5 ml n-부탄올 및 5 ml 톨루엔로 세척하였다.

수율: 68%

특성: 녹는점: 265-267℃ (테트라하이드로퓨란); MS (m/z) 302 (M+); 1H NMR (DMSO-d6): δ 12.38 (1H, s, NH), 8.30-8.36 (2H, q, 2 CH), 8,23 (1H, br. s., NH), 7.67 (2H, d, 2CH), 7.48 (2H, br. s., NH2), 7.42 (3H, m, 3CH), 7.12 (2H, d, 2CH) 및 6.98 (1H, m, CH) ppm; 원소분석 C17H14N6: 산출 %: C, 67.54; H, 4.67; N, 27.80; 측정 %: C, 67.49; H, 4.53; N, 27.74.

참조 실시예 3: 4-아미노-3-(4- 클로르페닐 )아미노-6- 페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘

(3-N-(4-클로르페닐)-6-페닐-2H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3,4-디아민)

참조 실시예 4: 4-아미노-3-(3,4- 디플루오르페닐 )아미노-6-페닐피라졸로[ 3,4-d]피 리미딘

(3-N-(3,4-디플루오르페닐)-6-페닐-2H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3,4-디아민)

참조 실시예 5: 4-아미노-3-[(4- 플루오로페닐 )아미노]-6-페닐피라졸로[ 3,4-d]피리미딘

화합물 Ref-5은 참조 실시예 2에 나타낸 것과 동일한 방법으로, 다만 5-아미노-4-시아노-3-[(4-플루오로페닐)아미노)-피라졸을 원료 물질로서 사용하여, 밝은 황색 결정성 침전을 형성시켜 제조하였다.

수율: 70%

특성: 녹는점: 262-263℃ (THF/톨루엔); MS (m/z): 320 (M'); 1H NMR (DMSO-d6): δ 12.69 (1H, s, NH), 8.33-8.41 (4H, m, 4CH), 8.18 (1H, br. s., NH), 7.58-7.65 (5H, m, NH2, 3CH), 7.27-7.31 (2H, n, 2CH) ppm; 원소분석 C17H14FN6: 산출 %: C, 63.74; H, 4.09; N, 26.24; 측정 %: C, 63.81; H, 4.11; N, 26.27.

참조 실시예 6: 4-아미노-3-[(3- 플루오로페닐 )아미노]-6-페닐피라졸로[ 3,4-d]피리미딘

화합물 Ref-6은 참조 실시예 2에 나타낸 것과 동일한 방법으로, 다만 5-아미노-4-시아노-3-[(3-플루오로페닐)아미노]-피라졸을 원료 성분으로서 사용하여, 밝은 황색 결정성 침전을 형성시켜 제조하였다.

수율: 76%

특성: 녹는점: 278-279℃ (THF/톨루엔); MS (m/z): 320 (M+); 1H NMR (DMSO-d6); δ 12.61 (1H, s, NH), 8.34-8.42 (2H, q, 2CH), 8.14 (1H, br. s., NH), 7.48 (2H, br. s., NH2), 7.3-7.43 (6H, m, 6CH), 6.60 (1H, s, CH) ppm; 원소분석 for C17H14FN6: 산출 %: C, 63.74; H, 4.09; N, 26.24; 측정 %: C, 63.81; H, 4.11; N, 26.27.

실시예 1: 4-아미노-3-(4- 트리플루오르메틸 - 페닐 )아미노-6-페닐피라졸로[ 3,4-d]피 리미딘 ( CRCV -340)

(6-페닐-3-N-[4-(트리플루오르메틸)페닐]-2H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3,4-디아민)

대응되는 치환 전구체 화합물을 사용하여 참조 실시예 1에 기술된 것과 같이 제조하였다.

실시예 2: 4-아미노-6- 페닐 -3-[(4-(트리플루오로 메틸 )- 페닐 ]아미노- 피라졸로 [3,4-d]피리미딘

화합물 CRCV-340 또한 참조 실시예 2에 나타낸 반응 스케쥴과 유사한 방법으로 밝은 황색 결정성 침전을 형성시켜 제조하였다.

수율: 58%

특성: 녹는점: 313-314℃ (THF/톨루엔); MS (m/z): 370 (M+); 1H NMR (DMSO-d6): δ 12.77 (1H, s, NH), 8.91 (1H, s, NH), 8.47 (2H, s, NH2), 7.81, 7.79, 7.63, 7.58 및 7.47 (9H, m, C6H4 및 C6H5) ppm; 원소분석 C18H13F3N6: 산출 %: C, 58.38; H, 3.54; N, 22,69; 측정 %: C, 58.41; H, 3.58; N, 22.74; HPLC: 99.30% (Saule Luna C18 (2), 아세토니트릴/물 - 90:10, 유속 0.6 ml/분, UV 254 nm; tR = 5.3 분)

실시예 3: 4-아미노-3- 페닐아미노 -6-[4-( 트리플루오르메톡시 )-페닐] 피라졸로 [3,4-d]피리미딘 ( MS -112)

(3-N-페닐-6-[4-(트리플루오르메톡시)페닐]-2H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3,4-디아민)

대응되는 치환 전구체 화합물을 이용하여 참조 실시예 1에 기술된 바처럼 제조하였다.

실시예 4: 4-아미노-6- 페닐 -3-[(4-( 트리플루오로메톡시 )- 페닐아미노 ]- 피라졸로[3,4-d]피리미딘

이 화합물 또한, 원료 화합물로서 5-아미노-4-시아노-3-[(4-트리플루오르메톡시페닐)아미노]피라졸을 사용하여 참조 실시예 2에 나타낸 반응 스케쥴과 유사한 방법으로 백색 결정성 침전을 형성시켜 제조하였다.

수율: 68%

특성: 녹는점: 260-262℃ (테트라하이드로퓨란/DMF); MS (m/z): 386 (M'); 1H NMR (DMSO-d6): δ 12.56 (1H, s, NH), 8.82 (2H, q, 2CH), 8.16 (1H, br. s., NH), 7.48 (2H, br. s., NH2), 7.3-7.43 (4H, m, C6H5), 7.05-7.11 (2H, 2 s, 2CH), 6.98 (1H, m, CH) ppm; 원소분석 C18H13F3N6O: 산출 %: C, 55.96; H, 3.39; N, 21.75; 측정 %: C, 56.07; H, 3.36; N, 21.61.

실시예 5: 4-아미노-6- 페닐 -3-[(4-( 트리플루오로메틸 )- 페닐 ]아미노-피라졸로[ 3,4-d]피리미딘의 정제

참조 실시예 2에 기재된 방법에 따라 합성된 4-아미노-6-페닐-3-[(4-트리플루오로메틸)-페닐]아미노-피라졸로[3,4-d]피리미딘 건조물 50g을, 가온하면서 300 ml의 THF에 녹였다. 이 용액을 300 ml 냉 톨루엔으로 처리하였다. 이 결과물 용액을 6 시간의 기간 동안 0℃ 이하의 온도에서 냉동고 중에 유지시켰다. 여과하여 36 g의 4-아미노-3-(4-트리플루오로페닐)아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘을 황색 결정으로서 얻었다.

녹는점: 313-314℃ (THF/DMF)

HPLC: 99.16% (Saule Luna C18(2), 아세토니트릴/물 -90:10, 유속 0.6 ml/분, UV 254 nm; tR = 5.3 분)

OBR 5-340의 대사에 대한 인비트로 ADMET 연구

목적: OBR 5-340의 인비트로 흡수, 분포, 대사, 배설 및 독성 (약어: ADMET)뿐만 아니라, 혈장 단백질 결합 그리고 혈장 및 간 마이크로솜 중에서의 안정성에 대한 인비트로 시험들을 조사하기 위함이다

시험: 상기 인비트로 시험들을 CRCV-340을 가지고 실시하고 얻어진 데이타를 표 2에 Ref. 2와 비교하여 요약하였다.

Ref 2와 비교한 CRCV-340에 대한 ADMET 연구 결과 요약.

시험 파라미터들	Ref-2	CRCV-340
혈장 단백질에 대한 결합	99.5 %	96.7 %
혈장 단백질의 방출	61.0 %	122.3 %
혈장 안정성	117.0 %	100.0 %
간 마이크로솜 중의 안정성	32.0 %	112.0 %

요약: 물질 CRCV-340은 Ref-2와 비교하여 간 마이크로솜 중 안정성이 더 좋을 뿐만 아니라 혈장 단백질의 방출이 증가되는 특징을 보였다.

마우스 중 CRCV -340의 약물동태실험

목적: CRCV-340에 대한 약물동태학적 데이타의 수집.

시험: 물질 및 참조 물질은 10% 크레모포 용액 0.5 ml 중 100 mg/kg KG의 농도로 마우스에 경구로 각각 1회 투여하였다. 투여후 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7 시간째에 혈청을 취하고 HPLC 분석법으로 CRCV-340, Ref-2 및 Ref-3의 마우스 혈장 중 농도를 측정하였다.

HPLC로 측정된 혈장 중 물질 농도들을 이용하고 컴퓨터 프로그램 ESTRIP을 사용하여 그 물질들의 약물동태학적 파라미터들을 산출하였다 (표 3).

마우스에 100 mg/kg CRCV-340, Ref-2 및 Ref-3을 위장 내 투여 후의 약물동태학적 데이타

물질	C_max	T_max	MRT	T₁ _/2	K_el	CL	V_d	AUC₀ _-t	AUC₀ _-∞	C_max/AUC₀ _-t
	(ng/ml)	(h)	(h)	(h)	(h^-1)	(ml×h/kg)	(ml/kg)	(ng×ml/h)	(ng×ml/h)	(h^-1)
Ref-2	1295.4	1.0	2.14	2.96	0.23	36.6	156.7	2354.5	2732.1	0.55
Ref-3	424.5	0.5	2.44	1.47	0.55	91.8	168.1	1085.7	1089.4	0.39
CRCV-340	1254.4	3.0	3.54	3.54	0.18	10.4	52.7	6418.3	9598.5	0.20

C_max 최고 혈중 농도

T_max 최고 혈중 농도에 도달되는 시간

MRT 체류 시간 (Mean residence time)

T₁ _/2 반감기

K_el 소실속도상수 (Elimination rate constant)

CL 제거율 (Clearance)

Vd 분포용적

AUC 곡선하 면적 (Area under curve)

C_max/AUC 위장으로부터 혈중으로의 흡수속도

결과: 마우스에서의 약물동태학적 시험 결과 CRCV-340가 Ref-2 및 Ref-3 보다 상당히 우수한 생체내이용율을 나타내었다.

CRCV -340의 마우스에서의 급성 독성 시험

목적: CRCV-340의 50 % 치사량 결정

시험: 물질 CRCV-340의 급성 독성을, 19.5 - 20.5 g 중량의 마우스에 40, 60, 80 또는 120 mg 물질/마우스 (각 물질 및 농도마다 5마리의 마우스)를 경구투여하여 시험하였다. 이는 체중 1 ㎏ 당 약 2g, 3g, 4g 또는 6g의 투여량에 해당된다. 관찰된 독성효과들은 물질 투여량이 상관성이 있었다. 40 및 60 mg/마우스의 투여량에서 물질 투여 후 3 시간까지 협동장애 (coordination disorders) 및 과활성이 부작용으로서 관찰되었다. 이 두개의 고 투여량 투여 후 호흡곤란, 공격행동 및 운동과다증 또한 있었다. CRCV-340에 대하여 LD₅₀가 3120 mg/kg로 결정되었다 (표 4).

마우스에 1회 경구투여 후의 물질 CRCV-340의 급성 독성 시험 결과

투여량	투여 후 72시간의 사망/생존
	Ref-2	CRCV-340
40 mg/마우스	0/5	1/5
60 mg/마우스	1/5	1/5
80 mg/마우스	3/5	3/5
120 mg/마우스	4/5	5/5
LD₅₀	78.6 mg/마우스 (3930 mg/kg)	62.4 mg/마우스 (3120 mg/kg)

결과: 생존율에서 얻어진 데이타는 시험한 두 물질의 매우 우수한 내성 (tolerance)을 증명한다.

마우스에서의 독성에 대한 장기 연구 ( Long term studies )

목적: 28일 동안에 걸쳐 CRCV-340 투여로 아급성으로 나타날 수 있는 가능한 부작용들 예를 들면 일반적인 증상, 중량, 내부 장기들 및 대사 상에 나타날 수 있는 가능한 부작용들을 밝히기 위하여 마우스에서의 아급성 독성을 결정하기 위함이다.

시험: 따라서 약 20 g의 수컷 및 암컷 마우스에 12.5, 50 또는 200 mg/kg로 물질 CRCV-340을 크레모포 제제 형태로, 대조군에는 크레모포를 하루에 한번 28 일 동안에 걸쳐 튜브를 통하여 위장내에 투여하였다. 실험기간 전체에 걸쳐 외피 및 점막의 상태, 배설물 및 일반 증상들을 평가하였다. 7, 14, 21 및 28일째에 중량을 기록하였다. 마지막 물질 투여 후 약 24 시간째에 동물들의 방향 감각을 시험하였다. 혈청 중 다음의 생화학 파라미터들을 분석하였다: 단백질 함유량, 우레아, 크레아티닌, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 및 알칼린 포스파타제의 혈청 활성. 헤모글로빈 농도, 헤마토크릿, 적색 및 백색 혈액 세포들뿐만 아니라 혈소판의 수를 혈액도말 (blood smear)에서 결정하였다. 실험의 마지막에 마우스들을 마취하고 해부하여 죽이고 내부 장기들을 현미경으로 평가하고 장기 중량을 측정하고, 다음의 조직학적 시험을 위한 샘플들을 포르말린에 넣었다.

결과 요약: 시험한 물질 농도들에서 매우 우수한 내성 (tolerance)임이 확인되었다. 동물들의 일반 증상, 이들의 외피들, 배설물 혹은 이들의 방향감각 또는 운동성 그 어느 것도, 주어진 물질에 의하여 바뀌지 않았다. 또한 체중 변화에 있어서 CRCV-340로 처리된 동물들은 대조군과 다르지 않았다. 생화학적 혈액 파라미터 용어들로서 혈액 도말 상에서 물질로 처리한 군과 베히클-처리군들간에 차이가 없었다. 내부 장기들 (간, 신장, 심장, 폐, 비장, 췌장 및 고환)에 대한 현미경 평가, 장기들의 중량뿐만 아니라, 심장, 폐, 간, 비장, 흉선, 췌장, 신장, 분비선, 고환, 위장 및 장관 조직 샘플들에 대한 조직학적 시험 결과들에서도 동일한 결과가 나왔다 (결과들은 별도 표기 안함).

리노바이러스에 대한 항바이러스성 스펙트럼 결정

목적: 50 개의 서로 다른 인간 리노바이러스 항원형들 및 CVB3 환자 분리물들 (isolates)과 관련하여 CRCV-340의 항바이러스성 효과 스펙트럼을 결정하기 위함이다.

시험: The 50 HRV 항원형들 및 20 임상 CVB3 분리물들을 HeLa, HeLa Wis 및/또는 LF 세포들에서 재생산하고, 이들의 역가를 측정하고 서열목록결정으로 그 항원형을 확인하였다. 이에 따라 CVB3 분리물들을 가지고 HRV 또는 플라크-감소 (plaque-reductions) 시험들로 zpE (zytopathic effect) 억제 시험들을 확립하였다. 대응 항바이러스성 시험들에서 Ref-3 및 CRCV-340로 투여량 효과 연구를 수행하였다. 표 5 및 6는 50 % 억제 농도들의 평균치의 개괄을 보여준다

HRV에 대한 Ref-3 및 CRCV-340의 효과 스펙트럼의 개괄. 모든 시험한 50 개의 항원형들에 대하여 그리고 45개의 플레코나릴-감수성 및 5개의 플레코나릴-저항성 항원형들에 대하여 평균치 및 표준편차를 각각 요약함.

물질	IC₅₀ [μM] all HRV (n = 50)		IC₅₀ [μM] 플레코나릴-감수성 HRV (n = 45)		IC₅₀ [μM] 플레코나릴-저항성 HRV (n = 5)		감수성 HRV의 수
	평균	S. D.	평균	S. D	평균	S. D.
Ref-3	16.11	11.94	18.52	10.88	0.07	0.01	23
CRCV-340	25.73	21.49	26.09	18.98	22.62	40.69	49

임상 CVB3-분리물들에 대한 Ref-3 및 CRCV-340의 효과 스펙트럼의 개괄. 모든 시험한 20개의 분리물들에 대하여 그리고 19개의 플레코나릴-감수성 분리물들 및 1개의 플레코나릴-저항성 항원형에 대하여 평균치 및 표준편차를 각각 요약함.

물질	IC₅₀ [μM] all CVB3 (n = 20)		IC₅₀ [μM] 플레코나릴-감수성 CVB3 (n = 19)		IC₅₀ [μM] 플레코나릴-저항성 CVB3 (n = 1)		감수성 CVB3의 수
	평균	S. D.	평균	S. D	평균	S. D.
Ref-3	0.68	0.90	0.71	0.91	0.13		20
CRCV-340	4.97	4.05	5.16	4.10	1.39		18*

* 시험한 최고 농도 13.5 μM

결과 요약: HRV에 대한 CRCV-340의 효과 스펙트럼은 Ref-3과 비교하여 유의성 있게 더 폭넓었다.

CVB3 -유도 만성 심근염의 마우스 모델에서 인비보 항바이러스성 효과 실험

목적: 마우스 모델에서 CRCV-340의 항바이러스성 효과를 확인하기 위함이다.

조사: CRCV-340의 효과를 8-주령 수컷 NMRI 마우스의 CVB 3-유도 심근염 모델에서 조사하였다. 또한 CVB3 31-1-93 또는 CVB3 H3-감염 동물들에게 물 (플라세보) 중 1 % CMC 중의 50 % 또는 20 % PEG-400 중의 상기 물질 100 mg/kg을 하루 한 번 혹은 2 번 7일 동안 투여하였다. 치료 효과를 평가하기 위한 파라미터들은, 체중 변화, 일반 증상, 심장 및 췌장 조직 중의 바이러스 역가뿐만 아니라 심장 및 췌장에서의 조직학적 변화들을 포함한다. 가짜로 감염된 (Pseudo-infected), 플라세보-처리된 또는 CRCV-340-처리된 동물들은 음성 대조 (negative control)로서 사용되고 감염된, 플라세보- 또는 플레코나릴-처리된 동물들은 감염과정의 전개 전반에 걸쳐 양성 대조 (positive control)로 사용되었다.

결과 요약: 플라세보와 대조하여 플레코나릴 CRCV-340는 NMRI-마우스의 CVB3 31-1-93-유도 만성 심근염 모델에서 효과적이었다. 과정 중 시험된 모든 파라미터들 (체중, 일반 증상, p.i. 7일째 심장 및 췌장 조직에서의 바이러스 역가, p.i. 7 및 21일째 심장 및 췌장의 조직병리학)에 대하여 임상적으로 그리고 통계상으로 유의성 있는 효과들이 관찰되었다.

참조 물질 플레코나릴과 비교한 치사 ( lethal ) 마우스 모델에서의 CRCV -340의 인비보 효과 연구

목적: 치사 마우스 모델에서 CRCV-340의 항바이러스성 효과를 확인하기 위함이다.

조사: 개발 후보물질 CRCV-340의 효과를 6 - 7 주령 수컷 BALB/c 마우스의 CVB 3-유도 심근염 모델에서 감염 용량 (infection dose) 의 다음 시험으로 실험하였다. 또한 CVB3 31-1-93 또는 CVB3 H3-감염 동물들에게 물 (플라세보) 중 1 % CMC 중의 20 % PEG-400 중의 상기 물질 100 mg/kg을 하루 2 번 7일 동안 투여하였다. 체중 변화, 일반 증상 그리고 대리표지 (surrogate marker) 25 % 체중 감소로 정의된 치사율을 치료 효과 평가를 위한 파라미터들로서 사용하였다. 가짜로-감염된, 플라세보-처리된 또는 CRCV-340-처리된 동물들은 음성 대조군을 나타내며 감염된, 플라세보- 또는 플레코나릴-처리된 동물들은 감염과정의 전개 전반에 걸쳐 양성 대조군을 나타낸다.

결과 요약: 플라세보와 대조하여 플레코나릴 CRCV-340는 CVB3 31-1-93로 감염시킨 후의 치사 BALB/c 마우스 모델에서 효과적이었다. 과정 중 시험된 모든 파라미터들 (체중, 일반 증상뿐만 아니라 치사율)에 대하여 임상적으로 그리고 통계상으로 유의성있는 효과들이 관찰되었다.

Claims

일반식 I의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약제:

식 중 적어도 하나의 페닐기 A 및 B에 있어서 적어도 하나의 수소 원자가 0.23 보다 큰 하멧 상수 σ_p를 가지는 치환기 R^H 로 치환되며,
식 중 페닐기 A 및 B 각각에 있어서 추가의 수소 원자들 각각은 독립적으로 잔기 R¹로 각각 치환될 수 있으며, 여기에서
각각의 R¹ 은 독립적으로 할로겐, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지의, 1-7개의 사슬구성원을 가지는 지방족 라디칼, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지의, 1-8개의 사슬구성원을 가지는 알칸올 라디칼, NO₂, CN, CONR² ₂, COR², COOR², OR², SR², NR² ₂, SO₂NR² ₂, CX₃, CR²X₂, OCX₃, OCR²X₂, 또는 페닐일 수 있으며;
각각의 R² 는 독립적으로 수소, 포화 또는 불포화, 할로겐화 또는 비-할로겐화, 선형 또는 분지의, 1-7개의 사슬구성원을 가지는 지방족 라디칼, 벤질, 페닐 또는 나프틸, 포화 또는 불포화, 모노- 또는 폴리의, 헤테로원자들 N, S 또는 O을 가지는 헤테로사이클이며, 여기에서 상기 언급된 기들 각각은 독립적으로 불소, 염소, 브롬, 트리플루오르메틸, 알킬, 알콕시, 시아노, 니트로, 아미노, 아미노알킬, C(O)-알킬, C(O)O-알킬, 벤질, 페닐 또는 나프틸로 치환될 수 있으며; 그리고
X는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 I이다.
제 1항에 있어서, 적어도 하나의 치환기 R^H 가 독립적으로 NO₂, CN, CF₃, CCl₃, CBr₃, OCF₃, OCCl₃, OCBr₃, CHF₂, CHCl₂, CHBr₂, OCHCl₂, CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe 또는 COOEt이고, 바람직하게는 CF₃ 또는 OCF₃인 것인 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체.
제 1항에 있어서, 일반식 II의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체:

식 중 치환기 R^A, R^B 는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지의, 1-7개의 사슬구성원을 가지는 지방족 라디칼, 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지의, 1-8개의 사슬구성원을 가지는 알칸올 라디칼, NO₂, CN, CONR² ₂, COR², COOR², OR², SR², NR² ₂, SO₂NR² ₂, CX₃, CR²X₂, OCX₃, OCR²X₂, 또는 페닐일 수 있으며;
여기에서 R² 및 X 는 청구항 1에 정의된 바와 같으며;
치환기들 R^A, R^B 중 적어도 하나가 0.23 보다 큰 하멧 상수 σ_p 를 가진다.
제 1항 또는 2항에 있어서, 일반식 IIa 또는 IIb의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체:

식 중 R^H 는 NO₂, CN, CF₃, CCl₃, CBr₃, OCF₃, OCCl₃, OCBr₃, CHF₂, CHCl₂, CHBr₂, OCHCl₂, CHO, COOH, COMe, COEt, COOMe 또는 COOEt이고, 바람직하게는 CF₃ 또는 OCF₃이다.
제 4항에 있어서, 하기 화학식의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체:

또는
앞서의 항들 중 어느 한 항에 있어서, 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체를 포함하는 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 약학적 조성물.
제 6항 또는 7항에 있어서, 하나 또는 수개의 다른 활성 성분을 더 포함하는 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 하나 또는 수개의 다른 활성 성분이 항바이러스제, 바람직하게는 피코나바이러스에 대한 활성제인 것인 약학적 조성물.
제 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제제화하는 것을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법.
제 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체의 의약으로의 사용.
제 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체의 바이러스성 감염증 예방 또는 치료에의 사용.
제 12항에 있어서, 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체의 바이러스성 감염증이 피코나바이러스 감염증인 것인 사용.
식 중 페닐기 A 및 B 중 각각의 수소 원자는 독립적으로 청구항 1에서 정의된 잔기 R¹으로 각각 치환될 수 있으며, 극성 유기용매 중에서, 바람직하게는 n-부탄올 중에서 유리 염기로서 벤즈아미딘을 사용하여 5-아미노-4-시아노-3-페닐아미노피라졸을 전환시키는 것을 포함하는, 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 따르는 또는 제 1항의 화학식 I에 따르는 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체의 제조 방법.
제 14항에 있어서, 식 중 4-아미노-3-페닐아미노-6-페닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 유도체가 테트라하이드로퓨란 또는 테트라하이드로퓨란과 물 또는 유기용매와의 혼합물을 사용하여 재결정하여 정제하거나 또는 테트라하이드로퓨란 중의 뜨거운 용액을 물 또는 유기용매로, 바람직하게는 톨루엔으로 침전시켜 정제하는 것인 제조 방법.