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KR20110080154A - 제초제-저항성 ａｈａｓ-돌연변이체 및 사용 방법 - Google Patents

제초제-저항성 ａｈａｓ-돌연변이체 및 사용 방법 Download PDF

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KR20110080154A
KR20110080154A KR1020117009349A KR20117009349A KR20110080154A KR 20110080154 A KR20110080154 A KR 20110080154A KR 1020117009349 A KR1020117009349 A KR 1020117009349A KR 20117009349 A KR20117009349 A KR 20117009349A KR 20110080154 A KR20110080154 A KR 20110080154A
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brassica
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ahas
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nucleic acid
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KR1020117009349A
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데일 칼슨
그레그 고칼
존 맥 엘버
제임스 피어스
크리스티안 쇼프케
비자이 싱
키이쓰 워커
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바스프아그로케미칼 프로덕츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은 아세토히드록시산 신타제 (AHAS)-억제성 제초제에 대한 개선된 수준의 관용성을 갖는 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물을 제공한다. 본 발명은 또한 AHAS 대형 서브유닛의 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 발현 벡터, 1개, 2개 또는 그 이상의 돌연변이를 함유하는 AHASL 서브유닛을 코딩하는 핵산을 포함하는 식물, 이러한 AHASL 서브유닛 돌연변이체 핵산을 포함하는 식물, 그의 제조 및 사용 방법, 및 잡초의 방제 방법을 제공한다.

Description

제초제-저항성 ＡＨＡＳ-돌연변이체 및 사용 방법 {HERBICIDE-RESISTANT AHAS-MUTANTS AND METHODS OF USE}
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본 출원은 2008년 9월 26일에 출원된 미국 가출원 제61/100,541호의 이익을 청구하며, 그 전문은 본원에 참고로 도입된다.
<기술분야>
본 발명은 제초제-저항성 브라시카(Brassica) 식물, 및 AHAS-억제성 제초제-저항성 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 단백질을 코딩하는 신규 폴리뉴클레오티드 서열, 이러한 식물의 종자, 및 이러한 식물의 사용 방법에 관한 것이다.
아세토히드록시산 신타제 (AHAS; EC 4.1.3.18, 또한 아세토락테이트 신타제 또는 ALS라고 공지됨)는 분지쇄 아미노산인 발린, 류신 및 이소류신의 생화학적 합성을 촉매하는 최초의 효소이다 (문헌 [Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247]). AHAS는 술포닐우레아 (문헌 [Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57]; [Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626]; [LaRossa and Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161]), 이미다졸리논 (문헌 [Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546]), 트리아졸로피리미딘 (문헌 [Subramanian and Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines", Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E., eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288]; [Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57]; [Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626]); 및 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 (문헌 [Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57]; [Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626]); 및 N-술포닐아미노 카르보닐을 포함하는 5가지의 구조적으로 다른 제초제 부류의 작용 부위이다. 이미다졸리논 및 술포닐우레아 제초제는 매우 낮은 적용률에서의 유효성 및 동물에서의 상대적인 무독성으로 인해 현대 농업에서 광범위하게 사용된다. 이러한 부류의 제초제들은 AHAS 활성을 억제함으로써 많은 잡초 종을 포함하는 감수성 식물들의 추가 성장 및 발달을 방지한다.
사용하는 이미다졸리논 및 술포닐우레아 제초제의 유형 및 비율 면에서 농부에게 더 큰 유연성을 부여하기 위해, 더 강력한 제초제 관용성이 종종 요망된다. 또한, 제초제 관용성 품종을 개발하는 식물 육종자는 품종을 개발하기 위해 사용하는 생식질 배경에서의 더 큰 유연성을 허용하는, 더 큰 제초제 관용성을 제공하는 돌연변이를 다루기를 원한다. 이러한 AHAS-억제성 제초제-저항성 품종을 생산하기 위해, 식물 육종자는 추가 육종 계통, 바람직하게는 증가된 AHAS-억제성 제초제-저항성을 갖는 계통을 개발할 필요가 있다. 따라서, 작물 식물의 추가 AHAS-억제성 제초제-저항성 육종 계통 및 품종, 뿐만 아니라 AHAS-억제성 제초제-저항성 육종 계통 및 품종의 생산 및 사용을 위한 방법 및 조성물이 요구된다.
<발명의 요약>
본 발명은 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 제초제 관용성 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물을 생산할 수 있는 브라시카 종자를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물을 생산할 수 있는 10％ 이상의 종자를 포함하는, 브라시카 종자의 용기를 제공한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 본 발명은 브라시카 식물이 그의 게놈 내에 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 제초제 저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 코딩 핵산 분자의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인, 유효량의 AHAS-억제성 제초제를 잡초 및 브라시카 식물에 적용하는 것을 포함하는, 브라시카 식물 부근에 있는 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 돌연변이체 브라시카 계통의 종자를 성장시켜 얻은 브라시카 식물인 제1 브라시카 계통을 제2 브라시카 계통과 교배시키는 단계; 및 종자를 얻는 단계를 포함하는, 브라시카 식물을 육종하는 방법을 제공한다. 이러한 돌연변이체 브라시카 계통에는 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9278 하에 기탁되어 있는, BnCL120C7; 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9279 하에 기탁되어 있는, BnCL131A1; 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9402 하에 기탁되어 있는, BnCL140B3; 및 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9403 하에 기탁되어 있는, BnCL140C7이 포함된다.
종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9278 하에 기탁되어 있는, BnCL120C7; 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9279 하에 기탁되어 있는, BnCL131A1; 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9402 하에 기탁되어 있는, BnCL140B3; 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9403 하에 기탁되어 있는, BnCL140C7; 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-10321 하에 기탁되어 있는, PM1PM2/BnCL131A1로 지정된 돌연변이체 브라시카 식물 계통의 종자가 또한 제공된다.
본 발명은 또한 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌을 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌을 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌을 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물을 생산할 수 있는 브라시카 종자를 제공한다.
본 발명은 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9279 하에 기탁되어 있는, 돌연변이체 계통 BnCL131A1의 종자를 성장시켜 얻은 브라시카 식물인 제1 브라시카 계통을 제2 브라시카 계통과 교배시키는 단계; 및 종자를 얻는 단계를 포함하는, 브라시카 식물을 육종하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 AHAS 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 포함하는 비-트랜스제닉(non-transgenic) 브라시카 식물을 제공한다.
또한, (a) 서열 23의 A122, R199, T203, S653 및 G654로 구성된 군에서 선택된 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 돌연변이된 AHAS 단백질을 발현하는 돌연변이체 AHAS 유전자를 갖는 식물 세포를 생산하기 위해 AHAS 유전자에 표적화된 돌연변이를 갖는 유전자 복구 올리고뉴클레오베이스를 브라시카 식물 세포에 도입하는 단계; (b) AHAS-억제성 제초제의 존재하에 상응하는 야생형 식물 세포와 비교하여 실질적으로 정상적인 성장을 갖는 식물 세포를 확인하는 단계; 및 (c) 상기 식물 세포로부터 돌연변이된 AHAS 유전자를 갖는 비-트랜스제닉 제초제 관용성 브라시카 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제에 대해 관용성인 비-트랜스제닉 브라시카 식물을 생산하는 방법이 제공된다.
서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 제초제 관용성 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 갖는 제1 브라시카 식물을 제2 브라시카 식물과 교배시키는 단계; 및 종자를 얻는 단계를 포함하는, F1 하이브리드 브라시카 종자를 생산하는 방법이 추가로 제공된다.
서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 AHAS 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 포함하는 식물 세포가 또한 제공된다.
게놈 내에 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 AHASL 코딩 핵산 분자의 하나 이상의 카피를 포함하는 제1 브라시카 식물을 제2 브라시카 식물과 교배시키는 단계; 및 교배로부터 생성된 종자를 얻는 단계를 포함하는, 식물의 제초제-저항성을 증가시키는 방법이 또한 제공된다.
또한, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 제초제 관용성 브라시카 AHASL 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자 및 관심 단백질을 코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물이 제공된다.
브라시카 식물이 그의 게놈 내에 서열 23의 A122 및 S653에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 갖는 제초제 저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 제1 AHASL 핵산 분자, 및 A122T, P197S, A205V, W574L, S653N 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 돌연변이를 갖는 제2 제초제 저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제2 AHASL 핵산 분자의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인, 유효량의 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제를 잡초 및 브라시카 식물에 적용하는 것을 포함하는, 브라시카 식물 부근에 있는 잡초를 방제하는 방법이 추가로 제공된다.
도 1은 브라시카 유묘 추출물 중 AHAS 활성의 도식적 표현을 제공한다.
도 2는 야생형 브라시카 식물 및 본 발명의 돌연변이된 핵산 분자를 함유하는 브라시카 식물의 한 예의 제초제 분무 분석의 결과를 제공한다.
도 3은 본 발명의 핵산 분자 간의 핵산 서열 정렬을 제공한다 (각각 서열 11 내지 16, 외관 순서에 따라).
도 4는 본 발명의 AHAS 단백질 간의 아미노산 서열 정렬을 제공한다 (각각 서열 17 내지 21, 외관 순서에 따라).
도 5는 도 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) AHASL 단백질의 핵산 및 아미노산 서열을 제공한다. 서열 22로서 개시된 DNA 서열 및 서열 23으로서 개시된 아미노산 서열.
<발명의 상세한 설명>
본 개시는 아세토히드록시산 신타제 (AHAS)-억제성 제초제 저항성 식물로부터 돌연변이체 AHAS 단백질을 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 및 이와 관련된 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 야생형 (즉 돌연변이되지 않은) 브라시카 나푸스(Brassica napus) AHAS 서열과 관련하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 AHAS 단백질을 코딩한다. 본 개시는 또한 이러한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 뿐만 아니라 이러한 벡터 및 핵산 분자를 함유하는 트랜스제닉(transgenic) 식물을 제공한다.
본 개시는 또한 야생형 서열과 관련하여 2개 이상의 아미노산 치환을 갖는 돌연변이된 AHAS 코딩 서열, 예를 들어 돌연변이 유발된 AHAS III 코딩 서열을 포함하는 비-트랜스제닉 식물을 제공한다. 돌연변이된 AHAS 코딩 서열은 아라비돕시스(Arabidopsis) AHAS 단백질 서열 (도 5; 서열 23)의 위치 122에 상응하는 위치 및 위치 653에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 이러한 식물을 생산하는 방법 및 이러한 식물을 사용하여 육종하는 방법이 또한 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 식물, 종자, 방법 및 조성물은 위치 122에 상응하는 위치에서의 알라닌의 트레오닌으로의 치환 및 위치 653에 상응하는 위치에서의 세린의 아스파라긴으로의 치환을 갖는 AHAS 단백질의 발현을 초래하는 돌연변이를 갖는 AHAS 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 사용을 이용한다 (또한 때로는 본원에서 CLB-1이라고 지칭됨). 다른 실시양태에서, 본 발명의 식물, 종자, 방법 및 조성물은 위치 122에 상응하는 위치에서 치환된 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 글리신, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신 및 발린에서 선택된 아미노산 및 위치 653에 상응하는 위치에서 치환된 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 글리신, 히스티딘, 알라닌, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 메티오닌, 류신, 트레오닌, 이소류신 및 발린에서 선택된 아미노산을 갖는 AHAS 단백질의 발현을 초래하는 돌연변이를 갖는 AHAS 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 사용을 이용한다.
또한, 본원에 제공된 바와 같은 돌연변이된 AHAS 서열을 함유하는 트랜스제닉 식물 및 비-트랜스제닉 식물을 이용하여 잡초를 방제하는 방법이 제공된다.
추가로, 본원은 본원에서 BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3, BnCL140C7이라고 지칭되는 제초제 저항성 브라시카 계통, 뿐만 아니라 하기 상세히 기재된 바와 같은 돌연변이유발 방법을 이용하여 생산된 그의 종자, 자손 및 유도체를 제공한다.
본 발명은 또한 단일 AHAS 코딩 서열에서 AHAS 돌연변이를 조합시 달성되는 향상된 제초제-관용성 및 향상된 제초제 관용성을 얻기 위한 방법을 제공한다. 한 예에서, 아라비돕시스 AHAS 단백질 서열 (도 5; 서열 23)의 위치 A122 및 S653에 상응하는 돌연변이를 조합한 식물은 이러한 향상된 제초제 관용성을 나타낸다. 생성된 제초제 관용성은 위치 A122 또는 S653에 상응하는 돌연변이를 함유하는 식물에서 얻은 관용성 수준이 개별적으로 함께 첨가된 경우 관측되는 관용성 수준을 넘어서 유의하게 향상되며, 예를 들어 상승작용적 효과를 갖는다.
본 발명을 추가로 상세히 기재하기 전에, 하기 용어들을 먼저 정의할 것이다.
정의
"제초제-관용성" 또는 "제초제-저항성" 식물은 돌연변이된 AHAS 핵산 분자가 결핍된 정상적인 또는 야생형 식물을 통상적으로 사멸시키거나 그의 성장을 억제할 수준의 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제에 대해 관용성 또는 저항성인 식물을 지칭한다. "제초제-저항성 AHAS 핵산 분자"는 돌연변이되지 않은 AHAS 단백질에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 핵산 분자를 의미하며, 여기서 돌연변이는 제초제-저항성 AHAS 단백질의 발현을 초래한다. "제초제-관용성 AHAS 단백질" 또는 "제초제-저항성 AHAS 단백질"은, AHAS 활성을 방해하는 것으로 공지된 하나 이상의 제초제의 존재 하에, 및 야생형 AHAS 단백질의 AHAS 활성을 억제하는 것으로 공지된 제초제의 농도 또는 수준에서 이러한 AHAS 단백질이 야생형 AHAS 단백질의 AHAS 활성에 비해 더 높은 AHAS 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 더욱이, 이러한 제초제-관용성 또는 제초제-저항성 AHAS 단백질의 AHAS 활성은 본원에서 "제초제-관용성" 또는 "제초제-저항성" AHAS 활성으로서 지칭될 수 있다.
본 발명을 위해, 용어 "제초제에 대해 관용성인" 및 "제초제에 대해 저항성인"은 상호교환가능하게 사용되고, 등가의 의미 및 등가의 범위를 갖는 것으로 의도된다. 유사하게, 용어 "제초제-관용성" 및 "제초제-저항성"은 상호교환가능하게 사용되고, 등가의 의미 및 등가의 범위를 갖는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 용어 "이미다졸리논에 대해 저항성인" 및 "이미다졸리논-저항성"은 상호교환가능하게 사용되고, 각각 용어 "이미다졸리논에 대해 관용성인" 및 "이미다졸리논-관용성"과 이와 등가의 의미 및 등가의 범위인 것으로 의도된다. "제초제 저항성" 또는 "제초제 관용성"은 문헌 [Singh, et al. Anal. Biochem., (1988), 171:173-179]에 개시된 방법을 이용하여 AHAS 억제제, 예컨대 이마자목스(imazamox)의 존재하에 돌연변이 유발된 AHAS 서열을 함유하는 식물로부터 및 돌연변이 유발된 AHAS 서열이 결핍된 식물로부터 세포 추출물로부터 얻은 AHAS 활성의 비교에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 저항성 또는 관용성 식물은 100 μM 이마자목스를 이용하여 검정시 문헌 [Singh et al (1988)]에 개시된 방법을 이용하여 25％ 초과의 비억제를 나타낸다.
"단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자 또는 단백질, 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분은 그의 천연 환경에서 발견되는, 정상적으로는 핵산 분자 또는 단백질을 수반하거나 이와 상호작용하는 구성성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않는다. 따라서, 단리된 또는 정제된 핵산 분자 또는 단백질은 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 다른 세포성 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 기타 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 한 실시양태에서, "단리된" 핵산은 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA 내에서 천연적으로 핵산에 플랭킹(flanking)된 서열 (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열) (바람직하게는, 단백질 코딩 서열)을 실질적으로 함유하지 않는다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 핵산이 유래된 세포의 게놈 DNA 내에서 천연적으로 핵산 분자에 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만으로 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 세포에서 그의 발현을 제어하는 그의 천연 게놈 서열, 예를 들어 천연 프로모터 또는 천연 3' 비-번역 영역에 의해 플랭킹된다. 세포성 물질을 실질적으로 함유하지 않는 단백질은 약 30％, 20％, 10％, 5％ 또는 1％ 미만 (건조 중량 기준)의 오염성 단백질을 갖는 단백질 제제를 포함한다. 본 발명의 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분이 재조합적으로 생산되는 경우, 바람직하게는, 배양 배지는 약 30％, 20％, 10％, 5％ 또는 1％ (건조 중량 기준) 미만의 화학적 전구체 또는 관심 단백질이 아닌 화학물질을 나타낸다.
용어 "야생형"은 사람에 의해 인공적으로 생산되거나 돌연변이된 것과 다른, 천연에서 발견될 수 있는 핵산 분자 또는 단백질을 지칭하는데 사용된다. 한 실시양태에서, "야생형" AHAS 핵산 서열은 도 3의 BN-02의 핵산 서열을 지칭한다. 유사하게, 야생형 브라시카 식물은 도 3의 BN-02의 핵산 서열을 갖는 브라시카 식물을 지칭한다. 상기 용어는 또한 도 3의 BN-02의 AHAS 핵산 서열을 함유하는 식물을 지칭하는데 사용된다. 용어 "야생형"의 사용은 반드시 식물, 식물 조직, 식물 세포 또는 기타 숙주 세포가 그의 게놈 내에 재조합 DNA가 없고/거나, 본원에 개시된 것과 상이한 제초제 저항성 특징을 갖지 않는다는 것을 의미하도록 의도되지는 않는다.
"돌연변이된" 분자 또는 "돌연변이체 분자" 또는 "돌연변이 유발된" 분자, 예컨대 핵산 분자 또는 아미노산 분자는 돌연변이되지 않은 또는 야생형 분자의 등가 위치에 핵산 또는 아미노산과 비교하여 하나 이상의 핵산 또는 아미노산 치환, 결실 또는 염기전환을 갖는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 용어는 의도적인 인간 조작의 결과로서 그의 천연 또는 야생형 형태로부터 변형되고 천연 서열을 포함하지 않는 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "상승작용," "상승작용적" 및 그의 파생형 (예컨대 "상승작용적 효과"에서)은 2개 이상의 돌연변이된 AHAS 폴리펩티드의 조합, 및/또는 단일 코딩 서열 내의 돌연변이의 조합, 예컨대 위치 A122 및 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 코딩하는 AHAS 핵산 분자 및 이를 갖는 AHAS 폴리펩티드의 생물학적 활성이 개별 돌연변이를 갖는 AHAS 폴리펩티드의 생물학적 활성의 합계보다 10％ 이상 더 큰 환경을 지칭한다. AHAS 폴리펩티드에 대한 생물학적 활성은 AHAS-억제성 제초제, 예컨대 이마자목스에 의한 처리후 15일에 각각의 돌연변이를 함유하는 식물의 조합된 손상 비율과 본 발명의 돌연변이 유발된 분자를 함유하는 식물의 손상 비율을 비교함으로써 측정될 수 있다.
"등가 위치" 또는 "상응하는 위치"는 기준 아미노산 위치와 동일한 보존된 영역 내에 있는 위치를 지칭한다. 예를 들어, AHAS 단백질 서열과 관련하여, 본원에 개시된 아미노산 위치는 도 5에 기재된 아미노산 서열 (도 5; 서열 23)을 갖는 아라비돕시스 탈리아나 AHASL 단백질에서의 아미노산 위치에 상응한다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 특정 아미노산 위치는 도 5에 기재된 전장 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) AHASL 아미노산 서열 (서열 23) 내에 상기 아미노산의 상응하는 위치를 지칭한다. 더욱이, 실제 아미노산 위치는 아미노산이 예를 들어, 아미노산 서열의 N-말단 종결부에 첨가되거나 이로부터 제거되었는가에 따라 다양할 수 있으나, 등가 위치는 도 5 (서열 23)와 같은 기준 서열과의 정렬을 통해 여전히 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 나열된 위치 또는 등가 위치 (예를 들어, "아미노산 위치 653 또는 등가 위치")에 아미노 치환을 포함한다.
"단편"은 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 본 발명의 AHAS 단백질의 아미노산 서열의 부분을 지칭한다. 본 발명의 AHASL 뉴클레오티드 서열의 단편은 AHASL 단백질의 생물학적으로 활성인 부분을 코딩할 수 있거나, 또는 이는 하기 개시된 방법을 이용하여 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용될 수 있는 단편일 수 있다. AHAS 폴리펩티드의 단편은 AHAS 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 포함할 수 있다.
용어 "생물학적으로 활성인 단편 및 변이체"는 AHAS 활성을 포함하거나 코딩하는 예시된 핵산 분자 및 폴리펩티드의 단편 및 변이체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "조절 요소"는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있는 핵산을 지칭한다. 조절 요소에는 프로모터, 인핸서, 인트론, 5' UTR 및 3' UTR이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 요소와 제2 핵산 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 여기서 조절 요소 서열은 제2 핵산 서열의 발현의 제어에 관여되며, 예를 들어 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사 및/또는 번역을 개시하고/거나 매개한다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된은 연결될 핵산 서열이 인접하고, 필요할 경우 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하도록 동일한 리딩 프레임에서 인접한 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "트랜스제닉"은 하나 이상의 재조합 핵산 분자의 전체 또는 일부를 함유하는 임의의 세포, 조직, 식물, 식물 세포, 캘러스, 식물 조직 또는 식물 부분을 지칭한다.
핵산 분자
한 측면에서, 본 발명은 유래된 야생형 (즉 천연) 핵산 서열과 비교하여 돌연변이를 갖는 핵산 서열을 포함하는 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 서열에 관련된 단리된 핵산 분자, 뿐만 아니라 이러한 돌연변이를 포함하는 이러한 서열의 단편에 관한 것이다. 이러한 단리된 핵산 서열은 도 3 및 4의 서열을 포함한다. 다른 측면에서, 본 개시는 AHAS-억제성 제초제에 대한 관용성 또는 향상된 수준의 저항성을 제공할 수 있는, 야생형 단백질에 비해 돌연변이를 갖는 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 및 이러한 돌연변이체 AHASL 단백질에 관한 것이다. 한 실시양태에서, AHASL 코딩 서열은 야생형 서열에 비해 2개의 돌연변이를 함유하는 돌연변이된 브라시카 AHASL 코딩 서열, 예를 들어 브라시카 나푸스 AHAS III 코딩 서열이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 야생형 브라시카 식물의 돌연변이유발에 의해 생산된 제초제-저항성 브라시카 식물로부터 제초제-저항성 브라시카 AHASL III 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 단리 및 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
핵산 분자는 임의의 공급원, 예컨대 식물 또는 박테리아 공급원으로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 식물 공급원, 예컨대 브라시카 식물로부터 유래된다. 브라시카 식물로부터 유래된 핵산 분자는 브라시카 나푸스, 브라시카 라파 또는 브라시카 준세아(B. juncea)를 포함하는 임의의 브라시카 종으로부터 유래될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 임의의 AHAS 코딩 서열, 예컨대 AHAS I, AHAS II 또는 AHAS III으로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 AHASL 코딩 서열의 ATG 출발 코돈으로부터 아미노산 위치 122 (예를 들어 GCT -> ACT) 및/또는 653 (예를 들어 AGT -> AAT)에 코돈 서열에 상응하는 위치에서 핵산 서열 내의 돌연변이를 포함한다. 그러나, 임의의 돌연변이는 본 개시의 범위 내에서 아미노산 위치 122 및 653에 상응하는 위치에서 생성될 수 있다.
더욱이, AHAS 서열의 위치 122 및 653에서의 돌연변이는 위치 122에 상응하는 위치에서 알라닌이 아닌 임의의 아미노산 또는 위치 653에 상응하는 위치에서 세린이 아닌 임의의 아미노산을 갖는 AHAS 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 한 실시양태에서, 위치 122 및 653에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 보존적 아미노산 치환일 수 있으나, 다른 실시양태에서, 치환은 각각 위치 122 및 653에 트레오닌 또는 아스파라긴의 보존적 치환일 수 있다. 다른 실시양태에서, 위치 122에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 위치에서의 아미노산의 발현을 초래한다. 다른 실시양태에서, 위치 653에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 아스파라긴 아미노산의 발현을 초래한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩된 AHAS 단백질은 AHASL 유전자의 위치 653 (예를 들어 S653N) (아라비돕시스 탈리아나 번호매김에 기초함)에 상응하는 위치에서 세린의 아스파라긴으로의 치환 및 위치 122에 상응하는 위치에서 알라닌의 트레오닌으로의 치환 (예를 들어 A122T)을 포함한다. 그러나, 보존적 아미노산 치환을 포함하는 임의의 아미노산 치환은 본 개시의 범위 내에서 이들 위치에서 이루어질 수 있다. 본 발명은 야생형 브라시카 AHASL 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 단리 및 뉴클레오티드 서열을 추가로 개시한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 위치 122에 상응하는 위치에서 알라닌의 트레오닌으로의 치환 및 위치 653에 상응하는 위치에서 세린의 아스파라긴으로의 치환을 갖는 AHAS 단백질의 발현을 초래하는 돌연변이를 갖는 AHAS 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 위치 122에 상응하는 위치에서 치환된 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 글리신, 히스티딘, 세린, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 메티오닌, 류신, 아스파라긴, 이소류신 및 발린에서 선택된 아미노산 및 위치 653에 상응하는 위치에서 치환된 아르기닌, 글루타민, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 리신, 글리신, 히스티딘, 알라닌, 프롤린, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 메티오닌, 류신, 트레오닌, 이소류신 및 발린에서 선택된 아미노산을 갖는 AHAS 단백질의 발현을 초래하는 돌연변이를 갖는 AHAS 단백질을 코딩한다.
본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 폴리펩티드 서열은 임의의 AHAS-억제성 제초제에 대해 저항성 또는 관용성을 나타낼 수 있다. 이러한 돌연변이 유발된 AHAS 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제에 대해 저항성 또는 관용성일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 폴리펩티드 서열은 이미다졸리논 제초제 및 술포닐우레아 제초제로 구성된 군에서 선택된 AHAS-억제성 제초제에 대해 저항성 또는 관용성을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 폴리펩티드 서열은 이미다졸리논 제초제에 대해 저항성 또는 관용성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 위치 A122 및 S653에 상응하는 위치에서 돌연변이를 갖는 돌연변이 유발된 AHAS 서열은 상승작용적 제초제 관용성 수준을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 이중 돌연변이체 AHAS 서열을 함유하는 식물에서 얻은 제초제 관용성의 수준은 각각의 개별 돌연변이를 갖는 AHAS 서열을 함유하는 식물에서 관측된 관용성의 부가적 수준보다 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 그 초과로 더 높다. 이러한 상승작용적 제초제 관용성 수준은 또한 AHAS-억제제 관용성 AHAS 단백질을 코딩하는 하나 이상의 추가 돌연변이 유발된 또는 재조합 AHAS 서열과 조합하여, 위치 A122 및 S653에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 갖는 돌연변이 유발된 AHAS 서열을 갖는 식물에서 얻을 수 있다.
또한, 위치 122에 상응하는 위치에서 알라닌의 트레오닌으로의 치환 (A122T)을 갖는 브라시카 나푸스 AHAS III 단백질을 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자가 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 이러한 핵산 분자는 또한 핵산 서열에, 예를 들어 위치 653에 상응하는 위치에서의 세린의 아스파라긴으로의 치환 (S653N)을 코딩하는 핵산 분자에 제2 돌연변이를 함유한다.
본 개시는 또한 도 3 및 4에 기재된 바와 같은 BN02-120 또는 BN02-131의 핵산 서열을 갖는 단리된 핵산 분자, 뿐만 아니라 그의 단편 및 변이체를 제공한다.
본 개시는 또한 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 AHAS 단백질의 발현을 초래하는 하나 이상의 핵산 치환을 갖는, 브라시카로부터의 AHASL 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 도 3 및 4에 기재된 바와 같은 BN02-120 또는 BN02-131의 뉴클레오티드 서열, 도 4에 기재된 바와 같은 BN02-120 또는 BN02-131로서 확인된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 도 3에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 도 4에 BN02-120 또는 BN02-131에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 기능적 AHASL 단백질을 코딩하는 이러한 뉴클레오티드 서열의 단편 및 변이체를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 서열은 위치 122 및/또는 653에 상응하는 상기 돌연변이 이외에 임의의 개수의 돌연변이를 갖는 것을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이 유발된 AHAS 서열은 무증후 돌연변이이거나 또는 AHAS-억제성 제초제의 동일한 또는 다른 부류에 대해 저항성 또는 관용성을 제공할 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 추가 돌연변이를 함유할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 도 3 및 4에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 뿐만 아니라 AHAS 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 그의 단편 및 변이체를 제공한다. 추가로, 본원에 기재된 핵산 분자, 예를 들어 도 3 및 4에 기재된 뉴클레오티드 서열 (BN02-120 또는 BN02-131로서 확인됨), 및 AHAS 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 그의 단편 및 변이체에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 제공된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 브라시카 AHASL 단백질의 보존된 영역 내에 확인된 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 AHASL 단백질을 제공한다.
본 발명은 단리된 또는 실질적으로 정제된 핵산 또는 단백질 조성물을 포함한다.
본 발명은 돌연변이된 AHAS 단백질을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 단리된 폴리펩티드는 도 4에 기재된 바와 같은 BN02-120 또는 BN02-131의 아미노산 서열, 도 3에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 BN02-120 또는 BN02-131에 의해 코딩된 아미노산 서열, 아미노산 서열, 및 AHAS 활성을 포함하는 AHAS 폴리펩티드를 코딩하는 상기 아미노산 서열의 기능적 단편 및 변이체로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
개시된 핵산 분자는 식물, 예를 들어 작물 식물, 예컨대 브라시카 식물의 형질전환을 위한 핵산 구축물에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시의 핵산 분자를 함유하는 이러한 핵산 구축물은 제초제, 예컨대 AHAS 활성을 억제하는 것으로 공지된 제초제, 예컨대 이미다졸리논 제초제에 대한 저항성을 제공하는 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 구축물은 발현 카세트, 발현 벡터, 형질전환 벡터, 플라스미드 등에서 사용될 수 있다. 이러한 구축물에 의한 형질전환 후 얻은 트랜스제닉 식물은 AHAS-억제성 제초제, 예를 들어 이미다졸리논 및 술포닐우레아 제초제에 대한 증가된 저항성을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 AHASL 핵산 분자 및 그의 단편 및 변이체를 포함한다. 이들 뉴클레오티드 서열의 단편인 핵산 분자가 또한 본 발명에 포함된다. 한 실시양태에서, 단편은 야생형 서열로부터의 상응하는 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이된 서열을 포함한다. AHAS 단백질의 생물학적으로 활성인 부분은 본 발명의 AHAS 뉴클레오티드 서열 중 하나의 부분을 단리하고, AHAS 단백질의 코딩된 부분을 발현시키고 (예를 들어, 시험관내 재조합 발현에 의해), AHAS 단백질의 코딩된 부분의 활성을 평가함으로써 제조될 수 있다. AHAS 뉴클레오티드 서열의 단편인 핵산 분자는 의도된 용도에 따라 약 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 또는 900개 이상의 뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 전장 뉴클레오티드 서열에 존재하는 뉴클레오티드의 개수 이하를 포함한다.
본 발명의 AHAS 단백질의 생물학적으로 활성인 부분을 코딩하는 AHAS 뉴클레오티드 서열의 단편은 약 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 또는 250개 이상의 인접 아미노산, 또는 본 발명의 전장 AHAS 단백질에 존재하는 아미노산의 총 개수 이하를 코딩할 것이다. PCR 프라이머를 위한 혼성화 프로브로서 유용한 AHAS 뉴클레오티드 서열의 단편은 일반적으로 AHAS 단백질의 생물학적으로 활성인 부분을 코딩할 필요가 없다. 한 실시양태에서, AHAS 서열의 단편은 본원에 개시된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본원에 개시된 뉴클레오티드 서열의 변이체인 핵산 분자가 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 AHAS 뉴클레오티드 서열의 "변이체"는 본원에 개시된 AHAS 단백질을 코딩하나 유전자 코드의 동의성 때문에 보존적으로 상이한 서열을 포함한다. 이들 천연 대립유전자 변이체는 익히 공지된 분자 생물학 기술, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 하기 약술된 바와 같은 혼성화 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 또한 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발의 이용에 의해 생성되었으나 하기 논의된 바와 같이 본 발명에 개시된 AHAS 단백질을 여전히 코딩하는 합성적으로 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는 본원에 개시된 특정 뉴클레오티드 서열과 약 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 동일성을 가질 것이다. 변이체 AHAS 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 AHAS 단백질의 아미노산 서열과 약 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 AHAS 단백질을 각각 코딩할 것이다.
또한, 당업자는 변화가 돌연변이에 의해 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 도입되어 이에 의해 AHAS 단백질의 생물학적 활성의 변경 없이 코딩된 AHAS 단백질의 아미노산 서열의 변화를 초래할 수 있다는 것을 추가로 인지할 것이다. 따라서, 도 3에 기재된 바와 같은 BN02-120 또는 BN02-131과 상이한 서열을 갖는 AHAS 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 코딩된 단백질에 도입되도록 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 본원에 개시된 상응하는 뉴클레오티드 서열에 도입함으로써 제작될 수 있다. 돌연변이는 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발 및 본원에 기재된 기술에 의해 도입될 수 있다. 이러한 변이체 뉴클레오티드 서열이 또한 본 발명에 포함된다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 이루어질 수 있다. "비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성의 변경 없이 AHAS 단백질의 야생형 서열 (예를 들어, 도 5의 서열 (서열 23))로부터 변경되지 않을 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 필요하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 부류는 당업계에서 정의되었다. 이들 부류는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 이러한 치환은 보존된 아미노산 잔기, 또는 보존된 모티프 내에 존재하는 아미노산 잔기들에 대해서는 이루어지지 않을 것이다.
본 발명의 단백질은 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 포함하는 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 이러한 조작 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, AHAS 단백질의 아미노산 서열 변이체는 DNA 내의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경을 위한 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492]; [Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382]; 미국 특허 제4,873,192호; [Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 안내는 본원에 참고로 도입된 문헌 [Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]에서 찾을 수 있다. 보존적 치환, 예컨대 한 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산과 교환하는 것이 바람직할 수 있다.
별법으로, AHAS 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위로 돌연변이를 도입함으로써, 예컨대 포화 돌연변이유발에 의해 변이체 AHAS 뉴클레오티드 서열을 제조할 수 있고, 생성된 돌연변이체를 AHAS 활성에 대해 스크리닝하여, AHAS 활성 (제초제-저항성 AHAS 활성 포함)을 보유한 돌연변이체를 확인할 수 있다. 돌연변이유발 후, 코딩된 단백질을 재조합적으로 발현시킬 수 있고, 단백질의 활성을 표준 검정 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 서열, 뿐만 아니라 그의 단편 및 변이체를 포함한다. 본 발명의 AHASL 뉴클레오티드 서열, 및 그의 단편 및 변이체는 프로브 및/또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 동일하거나 일치하는 단백질을 코딩하는 전사물 또는 게놈 서열을 검출하는데 사용될 수 있다.
이러한 방식으로, PCR, 혼성화 등과 같은 방법은 본 발명의 서열과 실질적인 동일성을 갖는 이러한 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)] 및 [Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)]을 참조한다. 본원에 기재된 AHAS 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편 및 변이체에 대한 서열 동일성을 기초로 단리된 AHASL 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다.
혼성화 방법에서, 공지된 AHAS 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부는 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)]에 개시되어 있다. 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편, cDNA 단편, RNA 단편 또는 기타 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 검출가능한 기, 예컨대 32P 또는 임의의 다른 검출가능한 마커, 예컨대 기타 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자로 표지될 수 있다. 혼성화를 위한 프로브는 본원에 개시된 공지된 AHAS 뉴클레오티드 서열을 기초로 합성 올리고뉴클레오티드를 표지함으로써 제조될 수 있다. 공지된 AHAS 뉴클레오티드 서열 또는 코딩된 아미노산 서열 내의 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 기초로 설계된 동의성 프라이머가 또한 사용될 수 있다. 프로브는 본 발명의 AHAS 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편 또는 변이체의 적어도 약 12개, 바람직하게는 약 25개, 보다 바람직하게는 약 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900개의 연속적인 뉴클레오티드에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 전형적으로 포함한다. 혼성화를 위한 프로브의 제조는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 본원에 참고로 도입된 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본원에 개시된 전체 돌연변이된 AHAS 핵산 서열 또는 그의 하나 이상의 부분은 상응하는 AHAS 서열 및 전령 RNA에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브로서 사용될 수 있다. 혼성화 기술은 플레이팅된 DNA 라이브러리의 혼성화 스크리닝을 포함한다 (플라크 또는 콜로니; 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)] 참조).
이러한 서열의 혼성화는 엄격한 조건 하에 수행될 수 있다. "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브가 다른 서열들에 대한 것보다 검출가능하게 더 큰 정도 (예를 들어, 배경에 비해 2배 이상)로 자신의 표적 서열에 혼성화할 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다.
한 실시양태에서, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도는 약 1.5 M 미만의 Na 이온, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 온도는 짧은 프로브 (예를 들어, 뉴클레오티드 10개 내지 50개)에 대해서는 약 30℃ 이상, 및 긴 프로브 (예를 들어, 뉴클레오티드 50개 초과)에 대해서는 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 낮은 엄격성 조건은 37℃에서의 30 내지 35％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS (나트륨 도데실 술페이트)의 완충제 용액으로의 혼성화, 및 50 내지 55℃에서의 1× 내지 2× SSC (20× SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨)에서의 세척을 포함한다. 예시적인 중간 정도의 엄격성 조건은 37℃에서의 40 내지 45％ 포름아미드, 1.0 M NaCl, 1％ SDS에서의 혼성화, 및 55 내지 60℃에서의 0.5× 내지 1× SSC에서의 세척을 포함한다. 예시적인 높은 엄격성 조건은 37℃에서의 50％ 포름아미드, 1 M NaCl, 1％ SDS에서의 혼성화, 및 60 내지 65℃에서의 0.1× SSC에서의 세척을 포함한다. 임의로, 세척 완충제는 약 0.1％ 내지 약 1％ SDS를 포함할 수 있다. 혼성화 지속시간은 일반적으로 약 24시간 미만, 통상적으로 약 4시간 내지 약 12시간이다.
특이성은 전형적으로 혼성화후 세척의 함수이고, 결정적인 인자는 이온 강도 및 최종 세척 용액의 온도이다. DNA-DNA 하이브리드에 대해, Tm의 근사값은 문헌 [Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284]의 식 Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (％GC)- 0.61 (％ form)- 500/L [여기서, M은 1가 양이온의 몰농도이고, ％GC는 DNA 내의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이며, ％ form은 혼성화 용액 내의 포름아미드의 백분율이고, L은 염기쌍 내의 하이브리드의 길이임]으로부터 구할 수 있다. Tm은 상보적 표적 서열의 50％가 완전하게 매칭되는 프로브에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서의 온도)이다. Tm은 각각 1％의 미스매칭에 대해 약 1℃만큼 감소되므로; Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건은 원하는 동일성의 서열에 혼성화하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, >90％ 동일성을 갖는 서열을 추구하는 경우, Tm은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 그의 상보물에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 극도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 1℃, 2℃, 3℃ 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중간 정도로 엄격한 조건은 열 융점 (Tm)보다 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있으며; 낮은 엄격성 조건은 열 융점 (Tm)보다 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃ 또는 20℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 원하는 Tm을 이용하여, 당업자는 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격성의 변동이 고유하게 기재된다는 것을 이해할 것이다. 원하는 정도의 미스매칭이 45℃ (수용액) 또는 32℃ (포름아미드 용액) 미만의 Tm을 초래하는 경우, 더 높은 온도가 사용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 문헌 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)]; 및 [Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)]에서 찾을 수 있다. 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]을 참조한다.
본 발명의 핵산 분자 및 단백질은 도 3 및 4에 기재된 바와 같은 BN02-120 또는 BN02-131의 뉴클레오티드 서열과 충분히 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 포함하는 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 용어 "충분히 동일한"은 본원에서 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통의 구조적 도메인 및/또는 공통의 기능적 활성을 갖도록 충분한 개수의 또는 최소 개수의, 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 동일한 또는 등가 (예를 들어, 유사한 측쇄를 갖음)의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 함유하는 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, 적어도 약 45％, 55％ 또는 65％ 동일성, 바람직하게는 75％ 동일성, 보다 바람직하게는 85％, 95％ 또는 98％ 동일성을 갖는 공통의 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 충분히 동일한 것으로 본원에서 정의된다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 최적의 비교 목적으로 서열들을 정렬한다. 2개의 서열 간의 동일성 백분율은 서열들이 공유하는 동일한 위치의 개수의 함수이다 (즉, 동일성 백분율 = 동일한 위치의 개수/위치 (예를 들어, 중복되는 위치)의 총 개수 ×100). 한 실시양태에서, 2개의 서열은 길이가 동일하다. 2개의 서열 간의 동일성 백분율은 갭(gap)을 허용하거나 허용하지 않으면서, 하기 기재된 것들과 유사한 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 동일성 백분율을 계산하는데 있어서, 전형적으로 정확한 매치를 카운팅한다.
2개의 서열 간의 동일성 백분율의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적 예는 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 [Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 혼입된다. NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드(word) 길이 = 12로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여, 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 워드 길이 = 3으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여, 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭이 있는 BLAST가 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 별법으로, PSI-Blast는 분자들 간의 거리 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하는데 이용될 수 있다. 상기 문헌 [Altschul et al. (1997)]을 참조한다. BLAST, 갭이 있는 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 서열 비교용으로 사용된 수학적 알고리즘의 다른 바람직한 비제한적 예는 문헌 [Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)으로 혼입된다. 아미노산 서열들을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 웨이트(weight) 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용할 수 있다. 정렬은 또한 검열(inspection)에 의해 수동으로 수행될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 제공된 서열 동일성/유사성 값은 본 발명의 전장 서열을 사용하여, 그리고 소프트웨어 패키지 벡터 NTI 어드밴스(Advance) 10 (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드) 내에 포함된 프로그램 AlignX (디폴트 파라미터 사용) 또는 임의의 그와 등가인 프로그램을 사용하는 알고리즘 Clustal W (문헌 [Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994])에 의한 다중 정렬을 사용하여 수득된 값을 지칭한다. "등가 프로그램"은 임의의 2개의 해당 서열에 대해, 소프트웨어 패키지 벡터 NTI 어드밴스 10의 AlignX에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교시 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 서열 동일성 백분율을 갖는 정렬을 생성시키는 임의의 서열 비교 프로그램을 의미한다.
본 발명의 돌연변이체 AHASL 단백질은 개시된 단백질 뿐만 아니라 그의 변이 및 변형된 형태를 포함한다. 이러한 변이체는 원하는 AHAS 돌연변이체 활성을 계속 보유할 것이다. 한 실시양태에서, 변이체 단백질을 코딩하는 핵산 분자 내의 이러한 돌연변이는 서열을 리딩 프레임 밖에 위치시키지 않고, 바람직하게는 이차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적 영역을 생성하지 않을 것이다. EP 특허 출원 공개 제75,444호를 참조한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 서열은 AHAS 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. 이러한 활성은 본원에 참고로 도입된 문헌 [Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171:173-179]에 개시된 것과 같은 AHAS 활성 스크린에 의해 평가될 수 있다.
변이체 뉴클레오티드 서열 및 단백질은 또한 돌연변이유발성 및 재조합유발성 절차, 예컨대 DNA 셔플링(shuffling)으로부터 유래된 서열 및 단백질을 포함한다. 이러한 절차로, 하나 이상의 상이한 AHASL 코딩 서열은 원하는 특정을 보유하는 새로운 AHASL 단백질을 생성하도록 조작될 수 있다. 이러한 방식으로, 재조합 핵산의 라이브러리는 실질적인 서열 동일성을 갖고 시험관내에서 또는 생체내에서 상동 재조합될 수 있는 서열 영역들을 포함하는 관련 서열 핵산들의 집단으로부터 생성된다. 예를 들어, 이러한 접근법을 이용하여, 관심 도메인을 코딩하는 서열 모티프는 본 발명의 AHASL 유전자와 다른 공지된 AHASL 유전자 사이에 셔플링되어, 관심 특성이 개선된 단백질, 예컨대 효소의 경우 Km이 증가된 단백질을 코딩하는 새로운 유전자를 수득할 수 있다. 이러한 DNA 셔플링을 위한 전략은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751]; [Stemmer (1994) Nature 370:389-391]; [Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438]; [Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347]; [Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509]; [Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291]; 및 미국 특허 제5,605,793호 및 제5,837,458호를 참조한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 다른 유기체, 특히 다른 식물, 더욱 특히 다른 쌍자엽식물로부터 상응하는 서열을 단리하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, PCR, 혼성화 등과 같은 방법이 본원에 기재된 서열들에 대한 서열 상동성을 기초로 이러한 서열들을 확인하는데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 전체 AHASL 서열 또는 그의 단편에 대한 서열 동일성을 기초로 단리된 서열이 본 발명에 포함된다. 따라서, AHASL 단백질을 코딩하고 엄격한 조건 하에 본원에 개시된 서열 또는 그의 단편에 혼성화하는 단리된 서열이 본 발명에 포함된다.
PCR 접근법에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 임의의 관심 식물로부터 추출된 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 상응하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 PCR 반응에서 사용하기 위해 설계될 수 있다. PCR 프라이머 설계 및 PCR 클로닝을 위한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)]에 개시되어 있다. 또한, 문헌 [Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)]; [Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)]; 및 [Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)]을 참조한다. 공지된 PCR 방법에는 쌍을 이룬 프라이머, 네스티드(nested) 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 동의성 프라이머, 유전자-특이적 프라이머, 벡터-특이적 프라이머, 부분적으로 미스매칭된 프라이머 등을 사용하는 방법이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
구축물
본 발명의 핵산 분자는 재조합 핵산 구축물의 생성에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 핵산 구축물, 예를 들어 관심 식물에서 발현을 위한 발현 카세트의 제조에서 사용될 수 있다.
발현 카세트는 본 발명의 AHASL 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 카세트는 또한 유기체로 공동-형질전환되는 하나 이상의 추가 유전자를 함유할 수 있다. 별법으로, 추가 유전자(들)가 다중 발현 카세트 상에 제공될 수 있다.
핵산 구축물에는 조절 영역의 전사 조절 하에 있도록 AHASL 핵산 서열을 삽입하기 위한 다수의 제한 부위가 제공될 수 있다. 핵산 구축물은 또한 선별성 마커 유전자를 코딩하는 핵산 분자를 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 발현 카세트는 전사의 5'-3' 방향으로 전사 및 번역 개시 영역 (즉, 프로모터), 본 발명의 AHASL 핵산 서열, 및 식물에서 기능성인 전사 및 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역)을 포함한다.
임의의 프로모터가 핵산 구축물의 생성에서 사용될 수 있다. 프로모터는 식물 숙주 및/또는 본 발명의 AHASL 핵산 서열에 대해 천연 또는 유사성, 또는 외래성 또는 이종성일 수 있다. 또한, 프로모터는 천연 서열이거나 또는 별법으로 합성 서열일 수 있다. 프로모터가 식물 숙주에 대해 "외래성" 또는 "이종성"인 경우, 이는 프로모터가 도입되는 천연 식물에서 이러한 프로모터가 발견되지 않는 것을 의미한다. 프로모터가 본 발명의 AHASL 핵산 서열에 대해 "외래성" 또는 "이종성"인 경우, 이는 프로모터가 작동가능하게 연결된 본 발명의 AHASL 핵산 서열에 대한 천연 또는 자연 발생 프로모터가 아닌 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 키메라 유전자는 코딩 서열에 이종성인 전사 개시 영역에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함한다.
이종성 프로모터를 사용하여 본 발명의 AHASL 핵산 분자를 발현시키는 것이 바람직할 수 있으나, 천연 프로모터 서열이 구축물의 제조에서 사용될 수 있다. 이러한 구축물은 식물 또는 식물 세포에서 AHASL 단백질의 발현 수준을 변화시킬 것이다. 따라서, 식물 또는 식물 세포의 표현형이 변경된다.
임의의 프로모터는 AHAS 코딩 서열의 발현을 제어하는 구축물, 예컨대 식물에서 발현을 위한 구성적, 조직-선호형, 유도성 또는 기타 프로모터를 제공하는 프로모터의 제조에서 사용될 수 있다. 구성적 프로모터에는, 예를 들어 제WO 99/43838호 및 미국 특허 제6,072,050호에 개시된 Rsyn7 프로모터 및 기타 구성적 프로모터의 코어 프로모터; 코어 CaMV 35S 프로모터 (문헌 [Odell et al. (1985) Nature 313:810-812]); 벼 액틴 (문헌 [McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171]); 유비퀴틴 (문헌 [Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632] 및 [Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689]); pEMU (문헌 [Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588]); MAS (문헌 [Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730]); ALS 프로모터 (미국 특허 제5,659,026호) 등이 포함된다. 기타 구성적 프로모터에는, 예를 들어 미국 특허 제5,608,149호; 제5,608,144호; 제5,604,121호; 제5,569,597호; 제5,466,785호; 제5,399,680호; 제5,268,463호; 제5,608,142호 및 제6,177,611호에 기재된 것들이 포함된다.
조직-선호형 프로모터가 특정 식물 조직 내에서 AHASL 발현을 지정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 조직-선호형 프로모터에는 잎-선호형 프로모터, 뿌리-선호형 프로모터, 종자-선호형 프로모터 및 줄기-선호형 프로모터가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 조직-선호형 프로모터에는 문헌 [Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265]; [Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803]; [Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343]; [Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168]; [Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341]; [Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535]; [Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524]; [Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778]; [Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196]; [Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138]; [Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590]; 및 [Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505]에 기재된 것들이 포함된다.
핵산 구축물은 또한 전사 종결 영역을 포함할 수 있다. 전사 종결 영역이 사용되는 경우, 핵산 구축물의 제조에서 임의의 종결 영역이 사용될 수 있다. 예를 들어, 종결 영역은 전사 개시 영역에 대해 천연일 수 있거나, 작동가능하게 연결된 관심 AHASL 서열에 대해 천연일 수 있거나, 식물 숙주에 대해 천연일 수 있거나, 또는 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다 (즉, 프로모터, 관심 AHASL 핵산 분자, 식물 숙주 또는 이들의 임의의 조합에 대해 외래성 또는 이종성). 본 발명의 구축물에서 사용하기 위해 이용가능한 종결 영역의 예로는 아그로박테리움 투메파시엔스(A. tumefaciens)의 Ti-플라스미드, 예컨대 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 종결 영역으로부터의 영역이 포함된다. 또한, 문헌 [Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144]; [Proudfoot (1991) Cell 64:671-674]; [Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149]; [Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272]; [Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158]; [Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903]; 및 [Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639]를 참조한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 형질전환된 식물에서의 증가된 발현에 대해 최적화될 수 있다. 즉, 돌연변이체 AHASL 단백질을 코딩하는 핵산은 개선된 발현을 위한 식물-선호형 코돈을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 숙주-선호형 코돈 용법의 논의에 대해 문헌 [Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11]을 참조한다. 식물-선호형 유전자의 합성을 위한 방법은 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,380,831호 및 제5,436,391호 및 문헌 [Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498]을 참조한다.
또한, 본원에 개시된 핵산 서열에 다른 서열 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 추가 서열 변형은 세포성 숙주에서의 유전자 발현을 향상시키는 것으로 공지되어 있다. 이는 위조 폴리아데닐화 신호, 엑손/인트론 스플라이스 부위 신호, 트랜스포존-유사 반복부를 코딩하는 서열, 및 유전자 발현에 유해할 수 있는 다른 이러한 잘 특징화된 서열의 제거를 포함한다. 서열의 G-C 함량은 또한 숙주 세포에서 발현되는 공지된 유전자를 참조로 계산된 바와 같이, 표적 세포성 숙주에 대해 평균인 수준으로 조정될 수 있다. 또한, 서열은 예측된 헤어핀 이차 mRNA 구조를 회피하도록 변형될 수 있다.
다른 핵산 서열이 또한 본 발명의 구축물의 제조에서, 예를 들어 AHAS 코딩 서열의 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 핵산 서열에는 옥수수 AdhI, 인트론1 유전자의 인트론 (문헌 [Callis et al. (1987) Genes and Development 1:1183-1200]), 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 옥수수 황화 반점 바이러스 및 알팔파 모자이크 바이러스로부터의 리더 서열 (W-서열) (문헌 [Gallie et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:8693-8711] 및 [Skuzeski et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990])이 포함된다. 옥수수의 쉬룬켄(shrunken)-1 유전자좌로부터의 제1 인트론은 키메라 유전자 구축물에서 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 미국 특허 제5,424,412호 및 제5,593,874호에는 유전자 발현 구축물에서의 특정 인트론의 사용이 개시되어 있고, 문헌 [Gallie et al. (1994) Plant Physiol. 106:929-939]은 인트론이 조직 특이적 기준으로 유전자 발현을 조절하는데 유용하다는 것을 또한 나타냈다. AHAS 대형 서브유닛 유전자 발현을 추가로 향상시키거나 최적화하기 위해, 본 발명의 식물 발현 벡터는 또한 매트릭스 부착 영역 (MAR)을 함유하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 그러면, 이러한 변형된 발현 시스템으로 형질전환된 식물 세포는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 과다발현 또는 구성적 발현을 나타낼 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물은 발현 카세트 구축물 내에 5' 리더 서열을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 향상시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 당업계에 공지되어 있고, 피코르나바이러스 리더, 예를 들어 EMCV 리더 (엔세팔로마이오카르디티스 5' 비-코딩 영역) (문헌 [Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130]); 포티바이러스 리더, 예를 들어 TEV 리더 (담배 식각 바이러스) (문헌 [Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238]), MDMV 리더 (옥수수 왜소 모자이크 바이러스) (문헌 [Virology 154:9-20]), 및 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) (문헌 [Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94]); 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA (AMV RNA 4)로부터의 비-번역 리더 (문헌 [Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625]); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) (문헌 [Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256]); 및 옥수수 황화 반점 바이러스 리더 (MCMV) (문헌 [Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385])가 포함된다. 문헌 [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]을 또한 참조한다. 번역을 향상시키는 것으로 공지된 기타 방법, 예를 들어 인트론 등이 또한 사용될 수 있다.
핵산 구축물의 제조에서, 적절한 배향, 및 경우에 따라 적절한 리딩 프레임 내의 DNA 서열을 제공하도록 다양한 DNA 단편들이 조작될 수 있다. 이를 위해, 어댑터 또는 링커가 DNA 단편들을 연결하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 다른 조작이 편리한 제한 부위, 과잉 DNA의 제거, 제한 부위의 제거 등을 제공하기 위해 수반될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 시험관내 돌연변이유발, 프라이머 복구, 제한, 어닐링(annealing), 재치환, 예를 들어 염기전위 및 염기전환이 수반될 수 있다.
본 발명의 발현 구축물은 또한 AHAS 서열의 발현을 엽록체로 지정할 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 관심 유전자 산물을 식물 세포 엽록체로 지정하는 엽록체 운반 펩티드를 코딩하는 엽록체-표적화 서열을 포함한다. 이러한 운반 펩티드는 당업계에 공지되어 있다. 엽록체-표적화 서열과 관련하여, "작동가능하게 연결된"은 2개의 서열이 인접하고 동일한 리딩 프레임 내에 있도록, 운반 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 (즉, 엽록체-표적화 서열)이 본 발명의 AHASL 핵산 분자에 연결되는 것을 의미한다. 예를 들어, 문헌 [Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126]; [Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550]; [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]; [Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421]; 및 [Shah et al. (1986) Science 233:478-481]을 참조한다. 본 발명의 AHASL 단백질은 천연 엽록체 운반 펩티드를 포함할 수 있으나, 엽록체-표적화 서열을 본 발명의 성숙형 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 작동가능하게 연결시킴으로써 당업계에 공지된 임의의 엽록체 운반 펩티드가 본 발명의 성숙형 AHASL 단백질의 아미노산 서열에 융합될 수 있다.
엽록체 표적화 서열은 당업계에 공지되어 있고, 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 (루비스코) (문헌 [de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780]; [Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342]); 5-(엔올피루빌)쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) (문헌 [Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810]); 트립토판 신타제 (문헌 [Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087]); 플라스토시아닌 (문헌 [Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363]); 코리스메이트 신타제 (문헌 [Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457]); 및 광-수확(light harvesting) 엽록소 a/b 결합 단백질 (LHBP) (문헌 [Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999])의 엽록체 소형 서브유닛을 포함한다. 또한, 문헌 [Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126]; [Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550]; [Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968]; [Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421]; 및 [Shah et al. (1986) Science 233:478-481]을 참조한다.
다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 식물 세포 엽록체로부터 돌연변이체 AHAS 코딩 서열의 발현을 지정하도록 제조될 수 있다. 엽록체의 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530]; [Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917]; [Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606]을 참조한다. 이 방법은 선별성 마커를 함유하는 DNA의 입자 총(gun) 전달, 및 상동성 재조합을 통한 색소체 게놈으로의 DNA의 표적화에 의존한다. 또한, 색소체 형질전환은 핵에 의해 코딩되고 색소체에 지정되는 RNA 폴리머라제의 조직-선호형 발현에 의한 무증후 색소체-유래 트랜스진(transgene)의 전사활성화에 의해 달성될 수 있다. 이러한 시스템은 문헌 [McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305]에서 보고되었다.
엽록체로 표적화되는 관심 핵산은 식물 핵과 이러한 세포소기관 사이의 코돈 용법에서의 차이를 설명하도록 엽록체에서의 발현에 대해 최적화될 수 있다. 이러한 방식으로, 관심 핵산은 엽록체-선호형 코돈을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,380,831호를 참조한다.
핵산 구축물은 식물 세포를 형질전환시키고 돌연변이체 AHAS 코딩 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물을 재생시키는데 사용될 수 있다. 수많은 식물 형질전환 벡터 및 식물의 형질전환 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제6,753,458호, 문헌 [An, G. et al. (1986) Plant Physiol., 81:301-305]; [Fry, J. et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325]; [Block, M. (1988) Theor. Appl Genet. 76:767-774]; [Hinchee et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212.203-212]; [Cousins et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494]; [Chee, P. P. and Slightom, J. L. (1992) Gene. 118:255-260]; [Christou et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246]; [D'Halluin et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314]; [Dhir et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88]; [Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216]; [Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P:119-124]; [Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183]; [Dong, J. A. and Mc Hughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148]; [Franklin, C. I. and Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167]; [Golovkin et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52]; [Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078]; [Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13]; [Ayeres N. M. and Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239]; [Barcelo et al. (1994) Plant. J. 5:583-592]; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307]; [Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230]; [Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27]; [Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586]; [Hartman et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923]; [Ritala et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325]; 및 [Wan, Y. C. and Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748]을 참조한다. 구축물은 또한 상동성 재조합을 사용하여 식물 세포로 형질전환될 수 있다.
본 발명의 AHASL 서열을 포함하는 개시된 구축물은 트랜스제닉 숙주 세포, 예컨대 박테리아, 효모를 생성시키고 식물 세포를 형질전환시키고 몇몇 경우에 트랜스제닉 식물을 재생시키는 다양한 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AHASL 돌연변이체 코딩 핵산을 함유하는 트랜스제닉 작물 식물의 생산 방법은 (a) 본 발명의 돌연변이체 AHASL을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 식물 세포에 도입하는 단계, 및 (b) 식물 세포로부터 제초제 관용성인 트랜스제닉 식물을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서, 식물에서 핵산(들)의 발현은 야생형 식물 또는 공지된 AHAS 돌연변이체 유형 식물과 비교하여 제초제 관용성을 초래한다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 식물 세포에는 원형질체, 배우자 생성 세포, 및 전체 식물로 재생하는 세포가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 많은 경우에, 재조합 핵산 분자의 전체 또는 일부는 안정하게 염색체 또는 안정한 염색체외 요소로 통합되며, 그러므로 이어지는 세대로 전달된다.
본 발명은 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 식물 종의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 관심 식물 종의 예로는 강냉이 또는 옥수수 (제아 마이스(Zea mays)), 브라시카 종 (예를 들어, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파, 브라시카 준세아), 예를 들어 종자유의 공급원으로서 유용한 브라시카 종, 알팔파 (메디카고 사티바(Medicago sativa)), 벼 (오리자 사티바(Oryza sativa)), 호밀 (세칼레 세레알레(Secale cereale)), 사탕수수 (소르검 비콜로르(Sorghum bicolor), 소르검 불가레(Sorghum vulgare)), 기장 (예를 들어, 진주 기장 (페니세툼 글라우쿰(Pennisetum glaucum)), 찰기장 (파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum)), 조 (세타리아 이탈리카(Setaria italica)), 손가락 기장 (엘레우신 코라카나(Eleusine coracana))), 해바라기 (헬리안투스 아누우스(Helianthus annuus)), 홍화 (카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius)), 밀 (트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum), 트리티쿰 투르기둠 두룸 아종(T. Turgidum ssp . durum)), 대두 (글리시네 막스(Glycine max)), 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)), 감자 (솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum)), 땅콩 (아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)), 목화 (고시피움 바르바덴스(Gossypium barbadense), 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum)), 고구마 (이포모에아 바타투스(Ipomoea batatus)), 카사바 (마니호트 에스쿨렌타(Manihot esculenta)), 커피 (코페아 (Coffea) 종), 코코넛 (코코스 누시페라(Cocos nucifera)), 파인애플 (아나나스 코모수스(Ananas comosus)), 감귤류 나무 (시트러스(Citrus) 종), 코코아 (테오브로마 카카오(Theobroma cacao)), 차 (카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)), 바나나 (무사(Musa) 종), 아보카도 (페르세아 아메리카나(Persea americana)), 무화과 (피쿠스 카시카(Ficus casica)), 구아바 (프시디움 구아자바(Psidium guajava)), 망고 (만기페라 인디카(Mangifera indica)), 올리브 (올레아 에우로파에아(Olea europaea)), 파파야 (카리카 파파야(Carica papaya)), 캐슈 (아나카르디움 옥시덴탈레(Anacardium occidentale)), 마카다미아 (마카다미아 인테그리폴리아(Macadamia integrifolia)), 아몬드 (프루누스 아미그달루스(Prunus amygdalus)), 사탕무 (베타 불가리스(Beta vulgaris)), 사탕수수 (사카룸(Saccharum) 종), 귀리 (아베나 사티바(Avena sativa)), 보리 (호르데움 불가레(Hordeum vulgare)), 채소류, 관상식물 및 구과식물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 식물은 작물 식물 (예를 들어, 해바라기, 브라시카 종, 목화, 사탕무, 대두, 땅콩, 알팔파, 홍화, 담배, 옥수수, 벼, 밀, 호밀, 보리, 라이밀, 사탕수수, 기장 등)이다.
본 발명의 AHASL 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이체 AHASL 핵산 분자가 또한 선별성 마커로서, 예를 들어 돌연변이체 AHASL 폴리펩티드를 코딩하는 도입된 핵산 분자를 함유하는 트랜스제닉 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 a) 선별 마커로서 사용되는 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 AHASL 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하며, 추가 단리된 관심 핵산을 임의로 포함할 수 있는 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 부분을 제공하는 단계; b) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 부분을 하나 이상의 AHAS 억제제 또는 AHAS 억제성 화합물과 접촉시키는 단계; c) 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 부분이 억제제 또는 억제성 화합물의 영향을 받는가를 결정하는 단계; 및 d) 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 부분을 확인 또는 선별하는 단계를 포함하는, 형질전환된 식물 세포, 식물 조직, 식물 또는 그의 부분을 확인 또는 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 제초제 관용성에 대한 추가 개선을 설계하는 분자 모델링 연구에서 유용한, 본원에 기재된 돌연변이를 함유하는 정제된 AHASL 단백질에서 구현된다. 단백질 정제 방법은 익히 공지되어 있고, 시판되는 제품 또는 특별히 설계된 방법을 이용하여, 예를 들어 문헌 [Protein Biotechnology, Walsh and Headon (Wiley, 1994)]에 기재된 바와 같이 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제, 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 제초제에 대해 저항성 또는 관용성인 식물, 식물 조직, 식물 세포 및 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 식물 세포 및 숙주 세포는 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제에 대해 향상된 저항성 또는 향상된 관용성을 나타낸다. 용어 '향상된'은 기대되는 양 초과의 저항성 또는 관용성의 양의 증가를 지칭한다. 제초제의 바람직한 양 또는 농도는 "유효량" 또는 "유효 농도"이다. "유효량" 및 "유효 농도"는 각각 유사한 야생형 식물, 식물 조직, 식물 세포, 소포자 또는 숙주 세포를 사멸시키거나 그의 성장을 억제하기에 충분한 양 및 농도를 의미하나, 상기 양은 본 발명의 제초제-저항성 식물, 식물 조직, 식물 세포, 소포자 및 숙주 세포를 사멸시키거나 그의 성장을 심하게 억제하지 않는다. 전형적으로, 제초제의 유효량은 관심 잡초를 사멸시키기 위해 농업 생산 시스템에서 일상적으로 사용되는 양이다. 이러한 양은 당업자에게 공지되어 있거나 당업계에 공지된 방법을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다. 더욱이, 농업 생산 시스템에서의 제초제의 유효량은 식물 배양 시스템, 예를 들어 소포자 배양 시스템을 위한 제초제의 유효량과 실질적으로 상이할 수 있는 것으로 인지된다.
본 발명의 제초제는 AHAS 활성이 제초제의 존재하에 감소되도록 AHAS 효소의 활성을 방해하는 것이다. 이러한 제초제는 또한 본원에서 "AHAS-억제성 제초제" 또는 간단히 "AHAS 억제제"라고 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 "AHAS-억제성 제초제" 또는 "AHAS 억제제"는 AHAS 효소의 활성을 방해하는 단일 제초제로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 달리 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, "AHAS-억제성 제초제" 또는 "AHAS 억제제"는 단일 제초제, 또는 2가지, 3가지, 4가지 또는 그 초과의 제초제들 (각각 AHAS 효소의 활성을 방해함)의 혼합물일 수 있다.
달리 명확하게 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "식물"은 임의의 발달 단계의 식물, 뿐만 아니라 전체 무손상 식물에 부착될 수 있거나 이로부터 분리될 수 있는 식물의 임의의 부분 또는 부분들을 의미하도록 의도된다. 이러한 식물의 부분에는 식물 캘러스, 식물 수풀, 식물 원형질체 및 식물 세포 조직 배양물 (이로부터 식물이 재생될 수 있음)을 포함하는 식물의 기관, 조직 및 세포가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 식물 부분의 예로는 줄기, 잎, 뿌리, 화서, 꽃, 잔꽃, 과실, 작은 꽃자루, 꽃자루, 수꽃술, 꽃밥, 암술머리, 암술대, 씨방, 꽃잎, 꽃받침, 심피, 근단, 근관, 근모, 엽모, 종자모, 화분립, 소포자, 배아, 배주, 떡잎, 배축, 상배축, 물관부, 체관부, 유조직, 배젖, 동반 세포, 공변 세포, 및 식물의 임의의 다른 공지된 기관, 조직 및 세포가 포함된다. 더욱이, 종자는 식물 부분인 것으로 인지된다.
본 발명의 식물은 비-트랜스제닉 식물 및 트랜스제닉 식물 둘 모두를 포함한다. "비-트랜스제닉 식물"은 그의 게놈 내에 재조합 DNA가 없으나 돌연변이유발 기술, 예컨대 화학적 돌연변이유발을 이용하여 또는 본원에 제공된 방법에 의해 돌연변이된 식물 세포 게놈 내에 돌연변이체 핵산 분자를 함유하는 식물을 의미하도록 의도된다. 비-트랜스제닉 식물은 자연 과정의 결과로서 돌연변이체 서열을 갖는 식물을 포함하지 않는다. "트랜스제닉 식물"은 그의 게놈 내에 재조합 DNA를 포함하는 식물을 의미하도록 의도된다. 이러한 트랜스제닉 식물은 재조합 DNA를 식물의 게놈에 도입함으로써 생산될 수 있다. 이러한 재조합 DNA가 트랜스제닉 식물의 게놈에 혼입되는 경우, 식물의 자손도 또한 재조합 DNA를 포함할 수 있다. 하나 이상의 선조 트랜스제닉 식물의 재조합 DNA의 적어도 일부를 포함하는 자손 식물도 또한 트랜스제닉 식물이다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 핵산 분자를 함유하는 AHAS-제초제 저항성 식물을 제공한다. AHAS-제초제 저항성 식물은 본원에 기재된 바와 같은 AHASL 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 비-트랜스제닉 또는 트랜스제닉 제초제-관용성 식물일 수 있다. AHAS-제초제 저항성 식물은 제1 식물을 제2 식물과 타가-수분하고 꽃가루 수용 식물 (제1 식물 또는 제2 식물 중 어느 하나일 수 있음)이 이러한 타가 수분으로부터 종자를 생산하게 함으로써 생산될 수 있다. 이로부터 생성된 종자 및 자손 식물은 종자 및/또는 자손 식물의 게놈으로 교배된 돌연변이를 가질 수 있다. 꽃가루-수용 식물은 제1 식물 또는 제2 식물 중 어느 하나일 수 있다. 제1 식물은 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 AHASL 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 분자를 포함한다. 제2 식물은 임의의 잘 수정되는 식물일 수 있고, 동일한 또는 상이한 AHASL 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 분자를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 AHASL 돌연변이체 폴리펩티드는 야생형 AHASL 폴리펩티드에 비해 동일한 또는 상이한 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있다. AHASL 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 1개의 핵산 분자 또는 2개의 AHASL 돌연변이체 폴리펩티드를 코딩하는 2개의 핵산 분자를 포함하는 교배로부터 발생한 종자 또는 자손 식물이 선별될 수 있다.
제1 식물 및 제2 식물이 각각 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자에 대해 동형접합인 경우, 생성된 자손 식물 각각은 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자 각각의 1개의 카피를 포함하고, 선별 단계는 생략될 수 있다. 제1 식물 및 제2 식물 중 하나 이상이 이형접합인 경우, 예를 들어 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자 둘 모두를 포함하는 자손 식물을 확인하기 위해 자손 식물의 DNA를 분석함으로써 또는 자손 식물을 증가된 제초제 관용성에 대해 시험함으로써 핵산 분자 둘 모두를 포함하는 자손 식물이 선별될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열을 함유하는 식물은 예를 들어, 국제 출원 제PCT/US00/23457호, 또는 미국 특허 제6,271,360호, 제6,479,292호 및 제7,094,606호에 개시된 방법을 포함하는 비-트랜스제닉 방법, 예컨대 위치 지정 돌연변이유발 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 점 돌연변이를 숙주 세포 게놈에 도입하기 위해 올리고뉴클레오티드-지정 유전자 복구의 사용을 수반할 수 있고, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 예컨대 유전자 복구 올리고뉴클레오베이스의 사용을 수반할 수 있다 (미국 특허 제6,870,075호 및 제5,565,350호 참조). 올리고뉴클레오베이스는 뉴클레오베이스를 포함하는 중합체이며, 상기 중합체는 왓슨-크릭 염기쌍형성에 의해 상보적 서열을 갖는 DNA로 혼성화할 수 있다. 뉴클레오베이스는 퓨린, 피리미딘 또는 그의 유도체 또는 유사체인 염기를 포함한다. 뉴클레오베이스는 펩티드 뉴클레오베이스, 펩티드 핵산의 서브유닛 및 모르폴린 뉴클레오베이스, 뿐만 아니라 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오시드는 펜토스푸라노실 잔기, 예를 들어 임의로 치환된 리보시드 또는 2'-데옥시리보시드를 함유하는 뉴클레오베이스이다. 뉴클레오시드는 인을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 여러 연결 잔기 중 하나에 의해 연결될 수 있다. 비치환된 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 뉴클레오시드는 뉴클레오티드라고 지칭된다. 올리고뉴클레오베이스 쇄는 중합체의 최후 뉴클레오베이스인 단일 5' 및 3' 말단을 갖는다. 특정 올리고뉴클레오베이스 쇄는 모든 유형의 뉴클레오베이스를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오베이스 화합물은 상보적이고 왓슨-크릭 염기쌍형성에 의해 혼성화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오베이스 쇄를 포함하는 화합물이다. 뉴클레오베이스는 데옥시리보형 또는 리보형이다. 리보형 뉴클레오베이스는 2' 탄소가 히드록실, 알킬옥시 또는 할로겐으로 치환된 메틸렌인 뉴클레오베이스를 함유하는 펜토스푸라노실이다. 데옥시리보형 뉴클레오베이스는 리보형 뉴클레오베이스가 아닌 뉴클레오베이스이고, 펜토스푸라노실 잔기를 함유하지 않는 모든 뉴클레오베이스를 포함한다.
단일-가닥 올리고뉴클레오티드 돌연변이 벡터 (SSMOV)는 돌연변이를 AHAS 코딩 서열에 도입하기 위해 제조될 수 있다. SSMOV는 국제 특허 출원 제PCT/US00/23457호 및 미국 특허 제6,271,360호; 제6,479,292호; 및 제7,094,606호에 따라 제조될 수 있다. SSOMV의 서열은 미국 특허 제5,565,350호; 제5,731,181호, 제5,756,325호; 제5,871,984호; 제5,760,012호; 제5,888,983호; 제5,795,972호; 제5,780,296호; 제5,945,339호; 제6,004,804호 및 제6,010,907호 및 국제 공개 제WO 98/49350호; 제WO 99/07865호; 제WO 99/58723호; 제WO 99/58702호 및 제WO 99/40789호에 기재된 돌연변이 벡터와 동일한 원리를 기초로 할 수 있다. 한 실시양태에서, SSOMV의 서열은 돌연변이유발 영역이라고 지칭되는 원하는 유전자 변경을 함유하는 영역에 의해 분리된 표적 서열과 상동성인 2개의 영역을 함유한다. 돌연변이유발 영역은 표적 서열 내의 상동성 영역을 분리하는 서열과 동일한 길이이나 상이한 서열을 갖는 서열을 가질 수 있다. 이러한 돌연변이유발 영역은 치환을 유발할 수 있다. 별법으로, SSOMV 내의 상동성 영역은 서로 인접할 수 있으나, 동일한 서열을 갖는 표적 유전자 내의 영역은 1개, 2개 또는 그 초과의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 이러한 SSOMV는 SSOMV에 부재하는 뉴클레오티드의 표적 유전자로부터의 결실을 유발한다. 마지막으로, 상동성 영역과 동일한 표적 유전자의 서열은 표적 유전자 내에서 인접할 수 있으나, SSOMV의 서열 내의 1개, 2개 또는 그 초과의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 이러한 SSOMV는 표적 유전자의 서열 내에 삽입을 유발한다.
일부 실시양태에서, SSOMV의 뉴클레오티드는, 5' 말단 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드간 연결 또는 별법으로 2개의 5' 말단 및/또는 3' 말단 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 또는 포스포아미데이트일 수 있는 것을 제외하고, 비변형된 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 데옥시리보뉴클레오티드이다. 본원에서 사용되는 뉴클레오티드간 연결은 SSOMV의 뉴클레오티드 간의 연결이고, 5' 말단 뉴클레오티드 또는 3' 말단 뉴클레오티드와 차단성 치환기 간의 연결을 포함하지 않는다. 한 특정 실시양태에서, SSOMV의 길이는 21개 내지 60개의 데옥시뉴클레오티드이고, 따라서, 상동성 영역의 길이는 20개 이상의 데옥시뉴클레오티드의 총 길이이고, 2개 이상의 상동성 영역은 각각 8개 이상의 데옥시뉴클레오티드의 길이를 가져야 한다.
SSOMV는 표적 유전자의 코딩 가닥 또는 비-코딩 가닥에 대해 상보적이 되도록 설계될 수 있다. 원하는 돌연변이가 단일 염기의 치환인 경우, 돌연변이유발 뉴클레오티드 둘 모두가 피리미딘인 것이 바람직하다. 원하는 기능적 결과를 달성하는 것와 일치하는 정도로, 상보적 가닥 내의 돌연변이유발 뉴클레오티드 및 표적화된 뉴클레오티드 둘 모두가 피리미딘인 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 염기전환 돌연변이를 코딩하는 SSOMV, 즉, C 또는 T 돌연변이유발 뉴클레오티드는 각각 상보적 가닥 내의 C 또는 T 뉴클레오티드와 미스매칭된다.
올리고데옥시뉴클레오티드 이외에, SSOMV는 링커를 통해 5' 말단 탄소에 부착된 5' 차단성 치환기를 함유할 수 있다. 링커의 화학은 임의의 화학일 수 있고, 6개 이상의 원자 길이이고, 링커는 바람직하게는 가요성이다. 다양한 무독성 치환기, 예컨대 비오틴, 콜레스테롤 또는 다른 스테로이드 또는 비-삽입성 양이온성 형광 염료가 사용될 수 있다. SSOMV를 제조하기 위한 시약의 예로는 글렌 리서치(Glen Research) (미국 버지니아주 스털링) (현재 지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 Cy3™ 및 Cy5™으로서 시판되는 시약이 포함되며, 상기 시약은 올리고뉴클레오티드에 혼입시 3,3,3',3'-테트라메틸 N,N'-이소프로필 치환된 인도모노카르보시아닌 및 인도디카르보시아닌 염료를 각각 제공하는 차단된 포스포로아미디트이다. 한 실시양태에서, 시약은 Cy3이다. 인도카르보시아닌이 N-옥시알킬 치환된 경우, 이는 편리하게는 5' 말단 포스페이트와 포스포디에스테르 결합을 통해 올리고데옥시뉴클레오티드의 5' 말단에 연결될 수 있다. 염료와 올리고데옥시뉴클레오티드 간의 염료 링커의 화학은 중요하지 않고, 합성 편의를 위해 선택된다. 시판되는 Cy3 포스포르아미디트가 지시된 바와 같이 사용되는 경우, 생성된 5' 변형은 N-히드록시프로필, N'-포스파티딜프로필 3,3,3',3'-테트라메틸 인도모노카르보시아닌인 링커 및 차단성 치환기로 함께 구성된다.
한 실시양태에서, 인도카르보시아닌 염료는 인돌 고리의 3 및 3' 위치에서 4치환된다. 이론에 제한되지 않고, 이들 치환은 염료가 삽입성 염료가 되는 것을 방지한다. 이들 위치에서의 치환기의 동일성은 중요하지 않다. 또한, SSOMV는 3' 차단성 치환기를 가질 수 있다. 또 한편, 3' 차단성 치환기의 화학은 중요하지 않다.
AHAS 유전자에 도입될 변화는 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 포함하는 핵산 서열의 임의의 영역 내에 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 (AHAS) 유전자에 도입될 변화는 이종성 영역에 의해 코딩된다. 유전자에 도입될 변화는 유전자 서열의 하나 이상의 염기의 변화 (즉 치환) 또는 하나 이상의 염기의 부가 또는 결실일 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 BnCL120C7이라고 지칭되는 제초제-저항성 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 BnCL120C7로부터의 2500개 이상의 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC: American Type Culture Collection) (미국 20110 버지니아주 머내서스)의 특허 기탁소에 2008년 6월 23일에 기탁되었고, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-9278이 할당되었다. 본 발명은 또한 본원에서 BnCL131A1이라고 지칭되는 제초제-저항성 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 BnCL131A1로부터의 2500개 이상의 종자는 2008년 6월 23일에 기탁되었고, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-9279가 할당되었다. 본 발명은 또한 본원에서 BnCL140B3이라고 지칭되는 제초제-저항성 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 BnCL140B3으로부터의 2500개 이상의 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (미국 20110 버지니아주 머내서스)의 특허 기탁소에 2008년 8월 27일에 기탁되었고, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-9402가 할당되었다. 본 발명은 또한 본원에서 BnCL140C7이라고 지칭되는 제초제-저항성 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 BnCL140C7로부터의 2500개 이상의 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (미국 20110 버지니아주 머내서스)의 특허 기탁소에 2008년 8월 27일에 기탁되었고, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-9403이 할당되었다. 본 발명은 또한 본원에서 PM1PM2/BnCL131A1이라고 지칭되는 제초제-저항성 브라시카 계통을 제공한다. 브라시카 계통 PM1PM2/BnCL131A1로부터의 2500개 이상의 종자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (미국 20110 버지니아주 머내서스)의 특허 기탁소에 2009년 9월 9일에 기탁되었고, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-10321이 할당되었다. 기탁물은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조항 하에 유지될 것이다. 브라시카 계통 BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3, BnCL140C7 및 PM1PM2/BnCL131A1의 기탁은 30년 이상 및 기탁물 샘플의 공급에 대한 가장 최근의 요청이 ATCC에 접수되고 나서 5년 이상의 조항에 대해 이루어졌다. 또한, 출원인은 샘플의 생육력의 표시를 제공하는 것을 포함하여, 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809의 모든 요건을 충족시켰다.
본 발명에 예시된 돌연변이체 제초제-저항성 브라시카 계통 BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3 및 BnCL140C7은 실시예에 개시된 바와 같은 부위-지정 돌연변이유발 기술을 이용하여 생산되었다. 그러나, 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산되는 제초제-저항성 브라시카 식물에 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 임의의 돌연변이유발 방법이 본 발명의 제초제-저항성 브라시카 식물을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 돌연변이유발 방법은 하기의 돌연변이원들 중 임의의 하나 이상의 사용을 수반할 수 있다: 방사선, 예컨대 X선, 감마선 (예를 들어, 코발트 60 또는 세슘 137), 중성자 (예를 들어, 원자 반응기에서의 우라늄 235에 의한 핵분열의 생성물), 베타 방사선 (예를 들어, 방사성동위원소, 예컨대 인 32 또는 탄소 14로부터 방출됨), 및 자외선 조사 (바람직하게는 250 내지 290 nm), 및 화학적 돌연변이원, 예컨대 에틸 메탄술포네이트 (EMS), 염기 유사체 (예를 들어, 5-브로모-우라실), 관련된 화합물 (예를 들어, 8-에톡시 카페인), 항생제 (예를 들어, 스트렙토니그린), 알킬화제 (예를 들어, 황 머스타드, 질소 머스타드, 에폭시드, 에틸렌아민, 술페이트, 술포네이트, 술폰, 락톤), 아지드, 히드록실아민, 아질산 또는 아크리딘. 제초제-저항성 식물은 또한 조직 배양 방법을 이용하여 제초제-저항성 돌연변이를 포함하는 식물 세포를 선별한 후, 이로부터 제초제-저항성 식물을 재생시킴으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,773,702호 및 제5,859,348호를 참조하며, 상기 특허 둘 모두는 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 돌연변이 육종의 추가 상세사항은 문헌 ["Principles of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company]에서 찾을 수 있고, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 도입된다. 또한, 위치 지정 돌연변이유발이 본원에 개시된 바와 같은 숙주 식물 세포 내의 돌연변이된 AHASL 서열을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 브라시카 식물은 야생형 AHASL 단백질에 비해 아미노산 위치 653 (아라비돕시스 탈리아나 명명법)에 아스파라긴, 아미노산 위치 122 (아라비돕시스 탈리아나 명명법)에 트레오닌 및 야생형 AHASL 단백질에 비해 AHASL 단백질 내에 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 포함하는 식물을 추가로 포함하며, 여기서 이러한 브라시카 식물은 야생형 브라시카 식물과 비교하여 하나 이상의 제초제에 대해 증가된 저항성을 갖는다.
식물 및 육종 방법
본 발명의 AHAS-제초제 저항성 식물 및 이러한 식물의 자손, 예컨대 브라시카 AHAS-제초제 저항성 식물은 저항성 식물, AHAS-억제성 제초제에 대해 증가된 관용성을 갖는 식물 및 이러한 식물의 종자를 제조하는 방법에서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원에 예시된 브라시카 식물은 추가 제초제 저항성 식물, 예컨대 브라시카 나푸스 (예를 들어 캐놀라)의 실용 품종(commercial variety)을 개발하기 위한 육종 프로그램에서 사용될 수 있다. 이러한 방법에 따라, 제1 양친 식물이 제2 양친 식물과의 교배에 사용될 수 있고, 여기서 제1 양친 식물 또는 제2 양친 식물 중 하나 이상은 본 발명의 하나 이상의 AHASL 핵산 서열, 예를 들어 A122T 돌연변이 및 S653N 돌연변이를 갖는 AHASL 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 함유한다. 이러한 과정의 한가지 용도는 F1 하이브리드 식물의 생산에서의 용도이다. 이러한 과정의 다른 중요한 측면은 과정이 신규 양친, 이성반수체 또는 순계의 개발에 사용될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 식물 계통은 임의의 제2 식물에 교배될 수 있고, 생성된 하이브리드 자손 각각은 약 5세대 내지 7세대 또는 그 초과의 세대 동안 자가 수분 및/또는 형매교배(sibbing)됨으로써, 다수의 독특한 양친 계통을 제공할 수 있다. 그 후, 이러한 양친 계통은 다른 계통과 교배되고, 생성된 하이브리드 자손은 이로운 특징에 대해 분석될 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 특징을 부여하는 신규 계통이 확인될 수 있다. 반수체성, 계통 육종, 단일 종자 가계, 변형된 단일 종자 가계, 순환 선별 및 역교배를 포함하는 다양한 육종 방법이 이러한 방법에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물 및 그의 자손은 제초제 관용성의 부가적 효과가 아닌 상승작용적 효과를 나타내며, 이에 의해 다중 돌연변이를 포함하는 식물 및 그의 자손에서 제초제 관용성의 수준은 AHASL 단일 돌연변이체 단백질을 포함하는 식물의 조합된 제초제 관용성보다 더 크다.
본 발명의 핵산 분자를 함유하는 식물 계통은 천연 또는 기계적 기술에 의해 교배될 수 있다. 기계적 수분은 암술머리 상에 전달될 수 있는 꽃가루의 유형을 제어함으로써 또는 수동으로 수분시킴으로써 실행될 수 있다.
후손 및/또는 자손 식물은 돌연변이된 AHASL 핵산 또는 폴리펩티드의 존재를 결정하기 위한 임의의 방법에 의해 본 발명의 핵산 분자에 대해 평가될 수 있다. 이러한 방법에는 표현형 평가, 유전자형 평가 또는 이들의 조합이 포함된다. 자손 식물은 제초제 저항성 및 다른 원하는 형질에 대해 후속 세대에서 평가될 수 있다. AHAS-억제제 제초제에 대한 저항성은 식물을 하나 이상의 적절한 AHAS-억제제 제초제에 노출시키고, 제초제 손상을 평가함으로써 평가될 수 있다. 일부 형질, 예컨대 도복(lodging) 저항성 및 식물 키는 식물의 육안 검열을 통해 평가될 수 있는 한편, 조기 성숙은 꼬투리 내의 종자의 육안 검열에 의해 평가될 수 있다 (장각과). 기타 형질, 예컨대 종자의 오일 백분율, 단백질 백분율 및 총 글루코시놀레이트는 근적외선 분광법 및/또는 액체 크로마토그래피 및/또는 기체 크로마토그래피와 같은 기술을 이용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 식물은 또한 임의의 유전자형 분석 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 식물의 유전자형 평가에는 이소자임 전기영동, 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), 무작위로 증폭된 다형성 DNA (RAPD), 임의로 프라이밍(priming)된 폴리머라제 연쇄 반응 (AP-PCR), 대립유전자-특이적 PCR (AS-PCR), DNA 증폭 핑거프린팅 (DAF), 서열 특징화된 증폭된 영역 (SCAR), 증폭된 단편 길이 다형성 (AFLP), "마이크로새틀라이트(Microsatellite)"라고 또한 지칭되는 단순 서열 반복 (SSR)과 같은 기술을 이용하는 것이 포함된다. 본원에 제공된 식물의 유전자형을 분석하기 위한 추가 조성물 및 방법에는 미국 공개 제2004/0171027호, 미국 공개 제2005/02080506호 및 미국 공개 제2005/0283858호에 개시된 방법들이 포함되고, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
평가 및 조작 (하나 이상의 적절한 AHAS-억제제 제초제로의 노출을 통한 평가 및 조작)은 여러 세대에 걸쳐 발생할 수 있다. 새로운 계통의 성능은 대비 품종과 비교하여 객관적인 기준을 이용하여 평가될 수 있다. 형질들의 원하는 조합을 나타내는 계통은 다른 계통에 교배되거나 자가-수분되어 종자를 생산한다. 자가-수분은 한 꽃에서 동일한 꽃으로 또는 동일한 식물의 다른 꽃으로 꽃가루가 전달되는 것을 지칭한다. 많은 세대 동안 자가-수분되고 유형에 대해 선별된 식물은 거의 모든 유전자좌에서 동종접합성이 되고, 순수 육종 자손의 균일한 집단을 생산한다.
임의의 육종 방법이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 제초제-저항성 식물은 반수체 방법을 이용하여 육종될 수 있다. 이러한 방법에서, 특징들의 원하는 상보물에 대한 유전학적 기초를 갖는 양친들이 단순 또는 복합 교배로 교배된다. 교배 (또는 타가-수분)은 한 식물로부터 상이한 식물로 꽃가루가 전달되는 것을 지칭한다. 교배의 자손을 성장시키고, 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 소포자 (미성숙 화분립)를 분리하고 여과한다 (예를 들어 문헌 [Swanson, E. B. et al., (1987) Plant Cell Reports, 6: 94-97, "Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus, L.]; 및 [Swanson, E. B., (1990) Microspore culture in Brassica, pp. 159-169 in Methods in Molecular Biology, vol. 6, Plant Cell and Tissue Culture, Humana Press]). 이러한 소포자들은 유전자의 분리(segregation)를 나타낸다. 소포자를 적절한 AHAS-억제제 제초제, 예컨대 이마제타피르 (예를 들어 푸르수트(PURSUIT)™) 또는 이마자목스 (예를 들어 솔로(SOLO)™, 비욘드(BEYOND)™ 및 랩토르(RAPTOR)™) 또는 이마제타피르와 이마자목스의 50/50 혼합물 (예를 들어 오딧세이(ODYSSEY)™)의 존재 하에 배양하고, 여기서 상기 제초제는 제초제에 대한 저항성을 담당하는 돌연변이가 없는 소포자를 사멸시킨다. 제초제에 대한 저항성을 담당하는 유전자를 보유하는 소포자는 생존하고, 배아를 생산하며, 배아가 반수체 식물을 형성한다. 그 후, 염색체가 배가되어, 반수체 배가물을 생산한다.
기타 육종 방법이 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 계통 육종은 주로 자가-수분성인 작물, 예컨대 브라시카 및 캐놀라의 개선에 사용될 수 있다. 계통 육종은 2개의 유전자형을 교배시키는 것으로 시작되고, 여기서 각각의 유전자형은 다른 유전자형에 없는 하나 이상의 원하는 특징을 가질 수 있거나 다른 유전자형을 보완한다. 2개의 원래의 양친이 원하는 특징 모두를 제공하지 않는 경우, 추가 양친이 교배 계획에 포함될 수 있다.
이러한 양친들은 단순 또는 복합 방식으로 교배되어, 단순 또는 복합 F1을 생산할 수 있다. F1 식물 하나 또는 여럿을 자가 교배시킴으로써 또는 2개의 F1을 이종교배 (즉, 형매 짝짓기(sib mating))시킴으로써 F1로부터 F2 집단이 생산된다. 최상의 개체의 선별은 F2 세대에서 시작될 수 있고, F3에서 시작하여, 최상의 패밀리, 및 최상의 패밀리 내의 최상의 개체들이 선별된다. 유전가능성이 낮은 형질에 대한 선별의 유효성을 개선시키기 위해, 패밀리들의 반복된 검사가 F4 세대에서 시작될 수 있다. 진전된 동계교배 단계 (즉, F6 및 F7)에서, 최상의 계통 또는 표현형적으로 유사한 계통들의 혼합물은 새로운 재배종으로서의 잠재적인 발매에 대해 검사될 수 있다. 그러나, 계통 육종 방법은 개선된 AHAS-제초제 저항성 식물을 개발하기 위하여 반수체성 방법보다 더욱 시간 소모적인데, 이는 식물이 다중 세대에 대한 분리를 나타내고, 원하는 형질의 회복이 비교적 낮기 때문이다.
단일 종자 가계 (SSD) 절차가 개선된 품종을 육종하는데 또한 사용될 수 있다. 엄격한 의미에서 SSD 절차는 분리 집단을 식재하고, 식물 당 1개의 종자의 샘플을 수확하고, 단일 종자들의 집단을 사용하여 다음 세대를 식재하는 것을 지칭한다. 집단이 F2에서 원하는 수준의 동계교배로 진전된 경우, 계통이 유래된 식물들은 각각 상이한 F2 개체로 거슬러 올라갈 것이다. 발아하지 못한 일부 종자 또는 하나 이상의 종자를 생산하지 못한 일부 식물로 인해, 집단 내의 식물의 수가 각각의 세대에서 감퇴된다. 그 결과, 본래는 F2 집단 내에 샘플링된 모든 식물이 세대 진행이 완료되었을 때 자손으로 나타나지는 않을 것이다.
다중-종자 절차에서, 캐놀라 육종자는 집단 내의 각각의 식물로부터 하나 이상의 꼬투리를 통상적으로 수확하고, 이들을 함께 타작하여 벌크(bulk)를 형성시킨다. 벌크의 일부는 다음 세대를 식재하는데 사용하고, 일부는 예비로 남겨둔다. 이 절차는 변형된 단일-종자 가계 또는 꼬투리-벌크 기술이라고 지칭되었다. 다중-종자 절차는 수확시 노동력을 절약하기 위해 사용되었다. 꼬투리를 기계로 타작하는 것은 단일-종자 절차의 경우 손으로 각각으로부터 하나의 종자를 제거하는 것보다 상당히 더 빠르다. 다중-종자 절차는 각각의 동계교배 세대에 대해 집단의 동일한 개수의 종자를 식재하는 것을 또한 가능하게 한다. 충분한 종자가 수확되어, 발아하지 않았거나 종자를 생산하지 않은 식물들을 보상한다.
역교배 육종은 간단하게 유전되는, 고도로 유전성인 형질에 대한 유전자 또는 유전자들을 공급원 품종 또는 계통 (공여친)으로부터 다른 원하는 재배종 또는 순계 (반복친) 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 최초의 교배 후, 공여친의 표현형을 보유하는 개체들을 선별하고, 반복친으로 반복적으로 교배시킨다 (역교배시킨다). 역교배가 완료된 경우, 생성된 식물은 반복친의 속성 및 공여친으로부터 전달된 원하는 형질을 가질 것으로 기대된다.
개선된 품종이 순환 선별을 통해 또한 개발될 수 있다. 이 방법에서, 이종접합성 개체들의 유전학적으로 가변성인 집단은 여러 상이한 양친들을 이종교배시킴으로써 확인 또는 생성된다. 최상의 식물은 개별적인 우월성, 우수한 자손 또는 뛰어난 조합 능력을 기초로 선별된다. 선별된 식물을 이종교배시켜, 새로운 집단을 생산하고, 이러한 집단에서 추가 선별 사이클이 계속된다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 제1 식물 계통을 제2 식물 계통과 교배시켜 분리 집단을 형성시키며, 여기서 제1 식물 계통 또는 제2 식물 계통은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 AHAS-억제성 제초제 저항성 식물인 단계; (b) 증가된 AHAS-억제성 제초제 저항성, 본 발명의 핵산 분자의 존재 또는 둘 모두에 대해 집단을 스크리닝하는 단계; 및 (c) 야생형 식물에 비해 증가된 AHAS 저항성을 갖고 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 집단의 하나 이상의 구성원을 선별하는 단계를 포함하는, AHAS-억제성 제초제에 대해 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 제1 식물 또는 제2 식물은 본 발명의 AHASL 핵산 분자를 함유한다. 한 실시양태에서, 상기 방법에서 사용하기 위한 식물은 브라시카 식물이다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 적어도 제1 AHAS-억제성 제초제 저항성 식물 계통을 제2 식물 계통과 교배시켜 분리 집단을 형성시키는 단계; (b) 증가된 AHAS-억제성 제초제 저항성에 대해 집단을 스크리닝하는 단계; 및 (c) 증가된 AHAS-억제성 제초제 저항성을 갖는 집단의 하나 이상의 구성원을 선별하는 단계를 포함하는, AHAS-억제성 제초제 저항성 형질을 식물 내로 유전자이입시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법에서 사용하기 위한 식물은 브라시카 식물이다.
별법으로, 본 발명의 다른 측면에서, 제1 및 제2 양친 브라시카 식물 둘 모두는 본원에 기재된 바와 같은 AHAS-억제성 제초제 저항성 브라시카 식물일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 증가된 AHAS-억제성 제초제 저항성을 갖는 브라시카 식물을 사용하여 생산된 임의의 브라시카 식물은 본 발명의 일부를 형성한다. 본원에서 사용되는 교배는 자가교배, 형매교배, 역교배, 다른 또는 동일한 양친 계통에 대한 교배, 집단에 대한 교배 등을 의미할 수 있다.
본 발명은 또한 유성 생식을 수반하는 통상적인 식물 육종을 통해 제초제-저항성 식물, 예컨대 제초제-저항성 브라시카 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제초제에 대해 저항성인 제1 식물을 제초제에 대해 저항성이 아닌 제2 식물에 교배시키는 것을 포함한다. 제1 식물은 예를 들어, 제초제 저항성 AHASL을 코딩하는 본 발명의 돌연변이체 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 브라시카 식물, 및 BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3 또는 BnCL140C7의 브라시카 식물의 제초제-저항성 특징을 포함하는 비-트랜스제닉 브라시카 식물을 포함하는 임의의 본 발명의 제초제 저항성 식물일 수 있다. 제2 식물은 제1 식물과 교배되는 경우 생육성 자손 식물 (즉, 종자)을 생산할 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 전형적으로 (그러나 필수적은 아님), 제1 식물 및 제2 식물은 동일한 종의 식물이다. 예를 들어, 브라시카 나푸스 식물 내의 A 게놈 상의 돌연변이체 AHASL 서열은 브라시카 나푸스 식물을 예를 들어, 브라시카 준세아 식물과 교배함으로써 또한 A 게놈을 갖는 다른 브라시카 식물로 육종될 수 있다. 본 발명의 방법은 제1 교배의 자손 식물을 제1 식물 또는 제2 식물과 동일한 계통 또는 유전자형의 식물에 역교배시킨 것의 하나 이상의 세대를 추가로 수반할 수 있다. 별법으로, 제1 교배 또는 임의의 후속 교배의 자손은 제1 식물 또는 제2 식물과 상이한 계통 또는 유전자형인 제3 식물에 교배될 수 있다. 본 발명의 방법은 제1 식물의 제초제 저항성 특징을 포함하는 식물을 선별하는 것을 추가적으로 수반할 수 있다.
본 발명은 유성 생식을 수반하는 통상적인 식물 육종을 통해 식물, 특히 제초제-저항성 브라시카 식물의 제초제-저항성을 증가시키는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 제초제에 대해 저항성인 제1 식물을 제초제에 대해 저항성이거나 저항성이 아닐 수 있거나 또는 제1 식물과 상이한 제초제 또는 제초제들에 대해 저항성일 수 있는 제2 식물에 교배시키는 것을 포함한다. 제1 식물은 예를 들어, 제초제 저항성 AHASL을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물, 및 BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3 또는 BnCL140C7의 브라시카 식물의 제초제-저항성 특징을 포함하는 비-트랜스제닉 브라시카 식물을 포함하는 임의의 본 발명의 제초제 저항성 식물일 수 있다. 제2 식물은 제1 식물과 교배되는 경우 생육성 자손 식물 (즉, 종자)을 생산할 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 전형적으로 (그러나 필수적은 아님), 제1 식물 및 제2 식물은 동일한 종의 식물이고; 또한, 제1 식물 및 제2 식물은 동일한 속에 포함되나 상이한 종일 수 있고 (예: 브라시카 준세아 x 브라시카 나푸스, 브라시카 준세아 x 브라시카 라파(Brassica rapa), 브라시카 나푸스 x 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea), 브라시카 준세아 x 브라시카 니그라(Brassica nigra) 등)이고, 또한 제1 식물 및 제2 식물은 상이한 속의 식물이다 (예: 브라시카 x 시나피스(Sinapis)). 본 발명의 이러한 방법에 의해 생산된 자손 식물은 제1 식물 또는 제2 식물 중 어느 하나 또는 둘 모두와 비교시 제초제에 대해 증가된 저항성을 갖는다. 제1 식물 및 제2 식물이 상이한 제초제들에 대해 저항성인 경우, 자손 식물은 제1 식물 및 제2 식물의 조합된 제초제 저항성 특징을 가질 것이다. 본 발명의 방법은 제1 교배의 자손 식물을 제1 식물 또는 제2 식물과 동일한 계통 또는 유전자형의 식물에 역교배시킨 것의 하나 이상의 세대를 추가로 수반할 수 있다. 별법으로, 제1 교배 또는 임의의 후속 교배의 자손은 제1 식물 또는 제2 식물과 상이한 계통 또는 유전자형인 제3 식물에 교배될 수 있다. 본 발명의 방법은 제1 식물, 제2 식물, 또는 제1 식물 및 제2 식물 둘 모두의 제초제 저항성 특징을 포함하는 식물을 선별하는 것을 또한 수반할 수 있다.
본 발명의 식물은 트랜스제닉 식물 또는 비-트랜스제닉 식물일 수 있다. 이미다졸리논 및/또는 술포닐우레아 제초제에 대한 증가된 저항성을 갖는 비-트랜스제닉 브라시카 식물의 예로는 BnCL131A1, BnCL120C7, BnCL140B3, BnCL140C7 또는 PM1PM2/BnCL131A1의 브라시카 식물; 또는 BnCL131A1, BnCL120C7, BnCL140B3, BnCL140C7 또는 PM1PM2/BnCL131A1의 식물의 돌연변이체, 재조합체 또는 유전자 조작된 유도체; 또는 BnCL131A1, BnCL120C7, BnCL140B3, BnCL140C7 또는 PM1PM2/BnCL131A1의 식물의 임의의 자손; 또는 이들 식물 중 임의의 식물의 자손인 식물; 또는 BnCL131A1, BnCL120C7, BnCL140B3, BnCL140C7 또는 PM1PM2/BnCL131A1의 식물의 제초제 저항성 특징을 포함하는 식물이 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자, 발현 카세트 또는 형질전환 벡터로 형질전환된 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자 및 비인간 숙주 세포를 제공한다. 이러한 형질전환된 식물, 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자 및 비인간 숙주 세포는 각각 비형질전환된 식물, 식물 조직, 식물 세포 또는 비인간 숙주 세포를 사멸시키거나 그의 성장을 억제하는 제초제의 수준에서 하나 이상의 제초제에 대해 향상된 관용성 또는 저항성을 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 형질전환된 식물, 식물 조직, 식물 세포 및 종자는 브라시카 및 작물 식물이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 식물로부터 얻은 AHAS-억제성 제초제 저항성을 갖는 식물을 생산할 수 있는 AHAS-억제성 제초제 관용성 식물의 종자를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 제초제 저항성 형질을 갖는 종자로부터 성장된 식물로부터 얻은 AHAS-억제성 제초제 저항성을 갖는 식물의 종자로부터 성장된 식물, 뿐만 아니라 이러한 식물로부터의 식물 부분 및 조직 배양물을 제공한다.
AHAS-억제성 제초제 저항성 식물을 생산할 수 있는 식물 종자의 용기가 또한 본원에 제공된다. 종자의 용기는 임의의 개수, 중량 또는 부피의 종자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 용기는 적어도 약 10개, 25개, 50개, 75개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개, 5000개 또는 그 이상, 또는 이보다 많은 종자를 함유할 수 있다. 별법으로, 용기는 적어도 약 1 온스, 5 온스, 10 온스, 1 파운드, 2 파운드, 3 파운드, 4 파운드, 5 파운드 또는 그 이상, 또는 이보다 많은 종자를 함유할 수 있다.
식물 종자의 용기는 당업계에서 입수가능한 임의의 용기일 수 있다. 비제한적인 예로서, 용기는 상자, 자루, 패킷(packet), 파우치(pouch), 테이프 롤(tape roll), 페일(pail), 호일(foil) 또는 튜브일 수 있다.
다른 실시양태에서, 종자의 용기에 함유된 종자는 처리된 종자 또는 비처리된 종자일 수 있다. 한 측면에서, 종자는 발아를 개선시키도록, 예를 들어 종자의 프라이밍(priming)에 의해 또는 종자-유래 병원체에 대해 보호하기 위한 소독에 의해 처리될 수 있다. 다른 측면에서, 종자는 예를 들어 식재성, 종자 출아 및 종자-유래 병원체에 대한 보호를 개선시키기 위해 임의의 이용가능한 코팅으로 코팅될 수 있다. 종자 코팅은 펠렛화, 필름 코팅 및 인크러스트먼트(encrustment)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의 형태의 종자 코팅일 수 있다.
또한, 브라시카 식물은 AHAS-억제제 관용성과 조합된 추가 관심 형질 (또한 "스태킹된 형질" 또는 "형질 스태킹"이라고 지칭됨), 예컨대 추가 제초제, 예컨대 글리포세이트, 글루포시네이트 및/또는 디캄바에 대한 저항성의 조합을 갖는 식물을 생산하는 육종 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 브라시카 식물은 다중 AHAS-억제성 제초제 저항성 코딩 서열을 갖는 브라시카 식물을 생산하는 육종 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 개시된 식물은 다른 농업용으로 중요한 형질, 예컨대 질환 및 병원체 저항성, 예컨대 Bt 유전자에 의해 부여되는 저항성, 묵입병 저항성과 조합된 AHAS-억제성 제초제 관용성 형질을 갖는 식물을 생산하는 육종 방법에서 사용될 수 있다.
개시된 육종 방법은 (a) 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 제초제 관용성 AHAS 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 함유하는 브라시카 식물을 제2 브라시카 식물과 교배시키는 단계; 및 (b) 교배로부터 종자를 얻는 단계를 포함하는, AHAS-억제성 제초제 저항성 브라시카 식물을 육종하는 방법을 포함한다. 얻은 종자는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 함유하는 종자를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이러한 방법은 교배의 종자로부터 DNA 샘플을 얻는 단계, 및 돌연변이 유발된 핵산 분자의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 검정하는 단계를 추가로 수반할 수 있다. 별법으로, 종자는 제초제 관용성 AHAS 핵산을 발현하는 종자 또는 자손을 확인하기 위해 AHAS-억제성 제초제 관용성에 대해 스크리닝될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 포함하는 AHAS-억제성 제초제 저항성 브라시카 식물인 제1 브라시카 계통을 제2 브라시카 계통과 교배시켜 분리 집단을 형성시키는 단계; (b) 증가된 AHAS-억제성 제초제 저항성에 대해 집단을 스크리닝하는 단계; 및 (c) 야생형 브라시카 식물에 비해 증가된 AHAS 저항성을 갖는 집단의 하나 이상의 구성원을 선별하는 단계를 포함하는, AHAS-억제성 제초제에 대해 저항성을 갖는 브라시카 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 적어도 제1 AHAS-억제성 제초제 저항성 브라시카 계통을 제2 브라시카 계통과 교배시켜 분리 집단을 형성시키는 단계; (b) 증가된 AHAS-억제성 제초제 저항성에 대해 집단을 스크리닝하는 단계; 및 (c) 증가된 AHAS-억제성 제초제 저항성을 갖는 집단의 하나 이상의 구성원을 선별하는 단계를 포함하는, AHAS-억제성 제초제 저항성 형질을 브라시카 식물 내로 유전자이입시키는 방법을 제공한다.
별법으로, 본 발명의 다른 측면에서, 제1 및 제2 양친 브라시카 식물 둘 모두는 본원에 기재된 바와 같은 AHAS-억제성 제초제 저항성 브라시카 식물일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 갖는 브라시카 식물을 사용하여 생산된 임의의 브라시카 식물은 본 발명의 일부를 형성한다. 본원에서 사용되는 교배는 자가교배, 형매교배, 역교배, 다른 또는 동일한 양친 계통에 대한 교배, 집단에 대한 교배 등을 의미할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자는 제2 제초제, 예컨대 글리포세이트 또는 글루포시네이트에 대한 저항성을 부여하는 핵산 분자와의 분자 스택(stack)으로 조작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 분자 스택은 제3 제초제에 대한 관용성을 부여하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 서열은 글루포시네이트에 대한 관용성을 부여하고, 특정 실시양태에서, 서열은 패트(pat)를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 브라시카 식물은 하나 이상의 관심 형질을 포함하고, 일부 실시양태에서, 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자는 원하는 형질 조합을 갖는 식물을 생산하기 위해 관심 핵산 분자 서열의 임의의 조합으로 스태킹된다. 본원에서 사용되는 형질은 특정 서열 또는 서열 군으로부터 유래된 표현형을 지칭한다. 예를 들어, 제초제-관용성 핵산 분자는 살충 및/또는 살곤충 활성을 갖는 폴리펩티드, 예컨대 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소 단백질 (미국 특허 제5,366,892호; 제5,747,450호; 제5,737,514호; 제5,723,756호; 제5,593,881호; 및 문헌 [Geiser et al. (1986) Gene 48:109-118]; [Lee et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:4648-4657] (Vip3A); [Galitzky et al. (2001) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57:1101-1109] (Cry3Bb1); 및 [Herman et al. (2004) J. Agric. Food Chem. 52:2726-2734] (Cry1F)에 기재됨), 렉틴 (문헌 [Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825-830]), 펜틴 (미국 특허 제5,981,722호에 기재됨) 등을 코딩하는 임의의 다른 핵산 분자로 스태킹될 수 있다. 생성된 조합은 또한 관심 핵산 분자 중 임의의 하나의 다중 카피를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자는 추가 개선된 특성을 갖는 본 발명의 브라시카 식물을 생산하도록 다른 제초제-관용성 형질로 스태킹될 수 있다. 이러한 실시양태에서 사용될 수 있는 다른 제초제-관용성 핵산 분자는 다른 작용 기전에 의해 글리포세이트 또는 AHAS 억제제에 대해 관용성을 부여하는 것, 예를 들어 미국 특허 제5,776,760호 및 제5,463,175호에 더 충분히 기재된 바와 같은 글리포세이트 산화-환원 효소를 코딩하는 유전자를 포함한다. 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자와 조합될 수 있는 다른 형질에는 더 높은 수준의 5-(엔올피루빌)쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)를 생산하는 능력을 식물에 부여하는 핵산 분자로부터 유래된 것, 예를 들어 미국 특허 제6,248,876 B1호; 제5,627,061호; 제5,804,425호; 제5,633,435호; 제5,145,783호; 제4,971,908호; 제5,312,910호; 제5,188,642호; 제4,940,835호; 제5,866,775호; 제6,225,114 B1호; 제6,130,366호; 제5,310,667호; 제4,535,060호; 제4,769,061호; 제5,633,448호; 제5,510,471호; 제Re. 36,449호; 제RE 37,287 E호; 및 제5,491,288호; 및 국제 공개 제WO 97/04103호; 제WO 00/66746호; 제WO 01/66704호 및 제WO 00/66747호에 더 충분히 기재된 바와 같은 것이 포함된다. 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자와 조합될 수 있는 다른 형질에는 술포닐우레아 및/또는 이미다졸리논에 대한 관용성을 부여하는 것, 예를 들어 미국 특허 제5,605,011호; 제5,013,659호; 제5,141,870호; 제5,767,361호; 제5,731,180호; 제5,304,732호; 제4,761,373호; 제5,331,107호; 제5,928,937호 및 제5,378,824호; 및 국제 공개 제WO 96/33270호에 더 충분히 기재된 바와 같은 것이 포함된다.
따라서, 관심 유전자를 코딩하는 다른 돌연변이체 또는 재조합 핵산, 예컨대 AHAS-억제제 관용성 핵산 분자와 조합하여 (즉 "스태킹된") 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 함유하는 브라시카 식물이 제공된다. 한 예에서, 이러한 조합에서 사용될 수 있는 추가 AHAS-억제제 관용성 핵산 분자는 야생형 AHAS 서열과 비교하여 임의의 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 P197S, A205V, S653N, W574L 및/또는 A122T 및 이들의 조합 (예를 들어, 이중 또는 삼중 돌연변이체 AHAS 서열)을 갖는 AHAS 단백질을 함유할 수 있다. 한 예에서, 위치 A122 및 S653에 아미노산 돌연변이를 포함하는 제초제 관용성 AHASL 단백질을 위치 W574에 아미노산 돌연변이를 포함하는 다른 제초제 관용성 AHASL 단백질 및 위치 S653에 아미노산 돌연변이를 포함하는 제초제 관용성 AHASL 단백질과 조합하는 브라시카 식물이 제공된다. 또한, 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-10321 하에 기탁되어 있는 PM1PM2/BnCL131A1로 지정된 이러한 돌연변이체 브라시카 식물 계통의 종자가 제공된다.
또한, AHAS-억제제 관용성 핵산과 조합될 돌연변이된 또는 재조합 핵산은 브라시카의 임의의 게놈 상에 위치될 수 있고, 이형접합 또는 동형접합 스택을 생산할 수 있다. 따라서, 스태킹에서 사용하기 위한 관심 핵산은 본 발명의 이중 돌연변이 AHAS-억제제 관용성 핵산과 동일한 또는 상이한 게놈 상에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 이형접합 스택을 생산하기 위해 "A" 게놈 상에 또는 동형접합 스택을 생산하기 위해 "C" 게놈 상에 위치된 이미다졸리논 관용성 핵산 분자와 조합하여 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS를 함유하는 브라시카 나푸스 식물 (AACC 게놈 함유)이 제공된다. 다른 예에서, 예를 들어 이형접합 스택을 생산하기 위해 "A" 게놈 상에 또는 동형접합 스택을 생산하기 위해 "B" 게놈 상에 위치된 이미다졸리논 관용성 핵산 분자와 조합하여 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS를 함유하는 브라시카 준세아 식물 (AABB 게놈 함유)이 제공된다. 또 다른 예에서, 예를 들어 이형접합 스택을 생산하기 위해 "A" 게놈 상에 위치된 이미다졸리논 관용성 핵산 분자와 조합하여 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS를 함유하는 브라시카 라파 식물 (AA 게놈 함유)이 제공된다.
이러한 브라시카 식물의 예로는 단일 돌연변이 W574L을 함유하는 A 게놈으로부터의 AHASL 핵산 분자인 PM2와 조합하여 (예를 들어, 제WO 2004/040011호 참조), 및 일부 실시양태에서 단일 돌연변이 S653N을 함유하는 C 게놈 서열로부터의 AHASL 핵산 분자인 PM1과 추가로 조합하여 (예를 들어, 제WO 2004/040011호 참조) 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 함유하는 브라시카 나푸스 식물이 포함된다. 다른 예로는 단일 돌연변이 S653N을 함유하는 B 게놈으로부터의 AHASL 핵산 분자인 bR과 조합하여 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 함유하는 브라시카 준세아 식물이 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 공개 제2005/0283858호 및 제2009/0013424호). 다른 예로는 PM1과 조합하여 본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 함유하는 브라시카 식물이 포함된다.
일부 실시양태에서, AHAS-억제제 관용성 핵산의 조합은 AHAS-억제제에 대한 임의의 수준의 관용성, 예컨대 부가적 효과 또는 상승작용적 효과를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자는 예를 들어, 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)가 호모겐티세이트로 전환되는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐-피루베이트디옥시게나제로 스태킹될 수 있다. 상기 효소를 억제하고 HPP의 호모겐티세이트로의 전환을 억제하기 위해 상기 효소에 결합하는 분자는 제초제로서 유용하다. 식물에 이러한 제초제에 대한 관용성을 부여하는 형질은 미국 특허 제6,245,968 B1호; 제6,268,549호 및 제6,069,115호; 및 국제 공개 제WO 99/23886호에 기재되어 있다. 돌연변이 유발된 AHAS 서열로 스태킹될 수 있는 적합한 제초제-관용성 형질의 다른 예로는 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 핵산 분자 (이는 보고된 바에 따르면 예를 들어, 제WO2005/107437호에 기재된 바와 같이 2,4-D 및 다른 페녹시 옥신 제초제, 뿐만 아니라 아릴옥시페녹시프로피오네이트 제초제에 대한 관용성을 부여함) 및 디캄바-관용성 핵산 분자, 예를 들어 문헌 [Herman et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:24759-24767]에 기재된 바와 같은 것이 포함된다.
본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자와 조합될 수 있는 제초제-관용성 형질의 다른 예로는 미국 특허 제5,969,213호; 제5,489,520호; 제5,550,318호; 제5,874,265호; 제5,919,675호; 제5,561,236호; 제5,648,477호; 제5,646,024호; 제6,177,616호; 및 제5,879,903호에 기재된 바와 같은 외인성 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제를 코딩하는 핵산 분자에 의해 부여되는 것이 포함된다. 외인성 포스피노트리신 아세틸트랜스페라제를 함유하는 식물은 효소 글루타민 신타제를 억제하는 글루포시네이트 제초제에 대해 개선된 관용성을 나타낼 수 있다. 돌연변이 유발된 AHAS 서열과 조합될 수 있는 제초제-관용성 형질의 다른 예로는 미국 특허 제6,288,306 B1호; 제6,282,837 B1호 및 제5,767,373호; 및 국제 공개 제WO 01/12825호에 기재된 바와 같은 변경된 프로토포르피리노겐 옥시다제 (프로톡스) 활성을 부여하는 핵산 분자에 의해 부여되는 것이 포함된다. 이러한 핵산 분자를 함유하는 식물은 프로톡스 효소를 표적으로 하는 임의의 다양한 제초제 (또한 "프로톡스 억제제"라고 지칭됨)에 대해 개선된 관용성을 나타낼 수 있다.
돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자와 조합될 수 있는 제초제 관용성 유전자의 또 다른 예로는 디캄바 제초제에 대한 관용성을 부여하는 유전자가 포함된다. 이러한 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제7,022,896호 및 미국 공개 제2008/0015110호에 기재되어 있다.
본 발명의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자와 조합될 수 있는 제초제-관용성 형질의 다른 예로는 식물, 예를 들어 브라시카 식물에서 하나 이상의 제초제에 대한 관용성을 부여하는 것이 포함된다. 제초제-관용성 브라시카 식물은 당업계에 공지되어 있으며, 특정 제초제에 대한 관용성이 다양한 식물이다. 예를 들어, 미국 특허 제5,627,061호를 참조한다. 이들 관용성을 담당하는 형질(들)은 육종에 의해 또는 다른 방법, 예컨대 트랜스제닉을 통해 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자와 조합되어, 본 발명의 식물 뿐만 아니라 그의 사용 방법을 제공할 수 있다.
돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자는 또한 하나 이상의 다른 형질과 조합되어, 동물 사료용으로 바람직한 형질, 예컨대 높은 오일 함량 (예를 들어, 미국 특허 제7,238,856호; 제7,268,276호); 아미노산 조성, 단백질 함량, 개선된 소화능력 또는 변경된 지방산 조성을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 원하는 형질 조합을 추가로 포함하는 본 발명의 식물을 생산할 수 있다.
돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자는 또한 다른 원하는 형질, 예를 들어 약독성 및 질환 저항성 유전자 (문헌 [Jones et al. (1994) Science 266:789-793]; [Martin et al. (1993) Science 262:1432-1436]; [Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089-1099]), 및 가공 또는 가공 생성물에 바람직한 형질, 예컨대 변형된 오일 (예를 들어, 지방산 데새투라제 유전자 (미국 특허 제5,952,544호; 제WO 94/11516호)); 및 중합체 또는 바이오플라스틱 (예를 들어, 미국 특허 제5,602,321호; 베타-케토티올라제, 폴리히드록시부티레이트 신타제 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제 (문헌 [Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847])는 폴리히드록시알카노에이트 (PHA)의 발현을 촉진함)과 조합될 수 있다. 제초제-관용성 핵산 분자는 또한 임의의 작물학적 형질을 제공하는 핵산 분자와 조합될 수 있다.
스태킹된 조합은 임의의 공지된 방법에 의한 식물 육종, 또는 유전자 형질전환 또는 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 서열이 식물을 유전적으로 형질전환시킴으로써 스태킹된 경우, 관심 핵산 분자 서열은 임의의 시간에 및 임의의 순서로 조합될 수 있다. 형질은 형질전환 카세트의 임의의 조합에 의해 제공된 관심 핵산 분자와 공동-형질전환 프로토콜에서 동시에 도입될 수 있다. 예를 들어, 2개의 서열이 도입되는 경우, 2개의 서열은 별개의 형질전환 카세트에 함유되거나 (트랜스) 또는 동일한 형질전환 카세트 상에 함유될 수 있다 (시스). 서열의 발현은 동일한 프로모터에 의해 또는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 특정 경우에, 관심 핵산 분자의 발현을 억제하는 형질전환 카세트를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 다른 억제 카세트 또는 과다발현 카세트의 임의의 조합과 조합되어, 식물에서 원하는 형질 조합을 생성할 수 있다. 핵산 분자는 부위-특이적 재조합 시스템을 이용하여 원하는 게놈 위치에 스태킹될 수 있는 것으로 추가로 인지된다. 예를 들어, 제WO99/25821호, 제WO99/25854호, 제WO99/25840호, 제WO99/25855호 및 제WO99/25853호를 참조하며, 상기 문헌들은 본원에 참고로 도입된다.
검출 방법
자손 및 유도체를 포함하는, 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함하는 식물을 확인하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 이러한 방법은 임의의 생물학적 물질에서 이러한 돌연변이 유발된 서열을 함유하는 식물의 확인 및/또는 검출에서 사용된다. 이러한 방법에는 예를 들어, 종자 순도를 확인하는 방법, 및 본 발명의 돌연변이 유발된 서열에 대해 종자 로트 내의 종자를 스크리닝하는 방법이 포함된다. 한 실시양태에서, 생물학적 샘플 내에 돌연변이 유발된 AHAS 서열을 확인하는 방법이 제공되고, 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 제1 핵산 프라이머 및 제2 핵산 프라이머 및 생물학적 샘플의 혼합물을 형성시키는 단계; 제1 핵산 프라이머 및 제2 핵산 프라이머가 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 증폭시키는 조건 하에 혼합물을 반응시키는 단계; 및 증폭된 돌연변이 유발된 AHAS 서열 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
증폭된 핵산 분자 (앰플리콘)는 돌연변이 유발된 AHAS 서열을 검출하게 하는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 앰플리콘은 길이가 약 10개, 50개, 100개, 200개, 300개, 500개, 700개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 돌연변이 유발된 핵산 분자에 혼성화할 수 있는 핵산 분자 프로브 및 브라시카 DNA를 갖는 생물학적 샘플을 함유하는 혼합물을 형성시키는 단계, 핵산 분자 프로브가 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자에 혼성화하게 하는 조건 하에 혼합물을 반응시키는 단계, 및 핵산 분자 프로브가 샘플 내의 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자에 혼성화하는가를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 내의 돌연변이 유발된 AHAS 서열을 확인 또는 검출하는 방법이 제공되며, 여기서 혼성화의 존재는 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자의 존재를 나타낸다.
트랜스제닉
본 발명은 또한 식물을 본 발명의 AHASL 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 구축물로 형질전환시키는 것을 포함하는, 식물에서 AHAS 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 핵산 구축물을 하나 이상의 식물 세포로 도입하고, 이로부터 형질전환된 식물을 재생시키는 것을 수반한다. 핵산 구축물은 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드, 특히 도 3 및 4에 기재된 바와 같은 BN02-120 또는 BN02-131의 뉴클레오티드 서열, 및 그의 단편 및 변이체를 포함한다. 상기 방법은 식물 세포에서 유전자 발현을 구동할 수 있는 프로모터의 사용을 추가로 수반한다. 한 실시양태에서, 이러한 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조직-선호형 프로모터이다. 이러한 방법에 의해 생산된 식물은 비형질전환된 식물과 비교시 증가된 AHAS 활성, 특히 제초제-관용성 AHAS 활성을 포함한다. 따라서, 상기 방법은 AHAS 효소의 촉매적 활성을 방해하는 하나 이상의 제초제, 특히 이미다졸리논 제초제에 대한 식물의 저항성의 향상 또는 증가에서 사용된다.
한 실시양태에서, 제초제-저항성 식물을 생산하는 방법은 식물 세포에서 발현을 구동하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구축물로 식물 세포를 형질전환시키는 단계, 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환된 식물을 재생시키는 단계를 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 특히 도 3 및 4에 기재된 바와 같은 BN02-120 또는 BN02-131의 뉴클레오티드 서열, 및 그의 단편 및 변이체에서 선택된다. 이러한 방법에 의해 생산된 제초제-저항성 식물은, 비형질전환된 식물과 비교하여 하나 이상의 제초제, 특히 AHAS 효소의 활성을 방해하는 제초제, 예를 들어 이미다졸리논 제초제 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 향상된 저항성을 포함한다.
제초제 저항성 및 잡초 방제
본 발명의 AHAS-억제성 제초제 저항성 식물은 잡초를 방제하는 방법에서 사용된다. 따라서, 본 발명은 제초제-저항성 식물, 예컨대 본 발명의 AHASL 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물 부근에 있는 잡초를 방제하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 야생형 식물과 비교시 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제, 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 제초제에 대해 저항성을 갖는 제초제-저항성 식물 및 잡초에 유효량의 AHAS-억제성 제초제를 적용하는 것을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열을 갖는 임의의 식물이 이러한 방법에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제초제-저항성 식물은 브라시카 나푸스, 브라시카 라파 및 브라시카 준세아를 포함하나 이에 제한되지 않는 브라시카 작물 식물이다.
AHAS-억제성 제초제, 예컨대 이미다졸리논 및 술포닐우레아 제초제에 대해 증가된 저항성을 갖는 식물을 제공함으로써, 식물 성장을 향상시키고 영양분에 대한 경쟁을 감소시키도록 잡초로부터 식물을 보호하기 위해 광범위한 제형이 사용될 수 있다. 제초제는 본원에 기재된 식물을 둘러싼 영역에서 출아전, 출아후, 식재전 및 식재시의 잡초 방제를 위해 그 자체로 사용될 수 있거나, 또는 다른 첨가제를 함유하는 AHAS-억제성 제초제 제형이 사용될 수 있다. 제초제는 또한 종자 처리로서 사용될 수 있다. 유효 농도 또는 유효량의 제초제, 또는 유효 농도 또는 유효량의 제초제를 포함하는 조성물이 파종 전에 또는 파종 동안 종자에 직접적으로 적용될 수 있다. AHAS-억제성 제초제 제형 또는 조성물에서 발견되는 첨가제에는 다른 제초제, 세제, 아쥬반트, 살포제, 점착제, 안정화제 등이 포함된다. 제초제 제형은 습식 또는 건식 제제일 수 있고, 유동성 분말, 유화성 농축물 및 액체 농축물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 제초제 및 제초제 제형은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 분무, 관주, 살분, 코팅 등에 의해 적용될 수 있다.
본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 AHAS-억제성 제초제는 종자 처리, 토양 처리 및 잎 처리를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 적용될 수 있다.
본 발명은 AHAS 효소의 활성을 방해하는 하나 이상의 제초제에 대한 식물, 식물 조직, 식물 세포 또는 기타 숙주 세포의 관용성 또는 저항성을 향상시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 이러한 AHAS-억제성 제초제는 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제, 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 제초제 또는 이들의 혼합물이다. 보다 바람직하게는, 이러한 제초제는 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제 또는 이들의 혼합물이다. 본 발명을 위해, 이미다졸리논 제초제에는 푸르수트® (이마제타피르), 카드레(CADRE)® (이마자픽), 랩토르® (이마자목스), 셉터(SCEPTER)® (이마자퀸), 아세르트(ASSERT)® (이마제타벤즈), 아르세날(ARSENAL)® (이마자피르), 상기 언급된 제초제들 중 임의의 것의 유도체, 및 상기 언급된 제초제들 중 둘 이상의 혼합물, 예를 들어 이마자피르/이마자목스 (오딧세이®)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 이미다졸리논 제초제는 2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미디아졸린-2-일)-니코틴산, [2-(4-이소프로필)-4-] [메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-3-퀴놀린카르복실] 산, [5-에틸-2-(4-이소프로필-] 4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-니코틴산, 2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산, [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-] 이미다졸린-2-일)-5-메틸니코틴산, 및 메틸 [6-(4-이소프로필-4-] 메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-m-톨루에이트와 메틸 [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-] 옥소-2-이미다졸린-2-일)-p-톨루에이트의 혼합물에서 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 5-에틸-2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-니코틴산 및 [2-(4-이소프로필-4-메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-]일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산의 사용이 바람직하다. [2-(4-이소프로필-4-] 메틸-5-옥소-2-이미다졸린-2-일)-5-(메톡시메틸)-니코틴산의 사용이 특히 바람직하다.
본 발명을 위해, 술포닐우레아 제초제에는 클로르술푸론, 메트술푸론 메틸, 술포메투론 메틸, 클로리무론 에틸, 티펜술푸론 메틸, 트리베누론 메틸, 벤술푸론 메틸, 니코술푸론, 에타메트술푸론 메틸, 림술푸론, 트리플루술푸론 메틸, 트리아술푸론, 프리미술푸론 메틸, 시노술푸론, 아미도술푸론, 플루자술푸론, 이마조술푸론, 피라조술푸론 에틸, 할로술푸론, 아짐술푸론, 시클로술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론 메틸, 포람술푸론, 요오도술푸론, 옥사술푸론, 메소술푸론, 프로술푸론, 술포술푸론, 트리플록시술푸론, 트리토술푸론, 상기 언급된 제초제들 중 임의의 것의 유도체, 및 상기 언급된 제초제들 중 둘 이상의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 트리아졸로피리미딘 제초제에는 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람 및 페녹스술람이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제에는 비스피리박, 피리티오박, 피리미노박, 피리벤족심 및 피리프탈리드가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 제초제에는 플루카르바존 및 프로폭시카르바존이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
피리미디닐옥시벤조에이트 제초제는 피리미디닐티오벤조에이트 제초제와 밀접하게 관련되고, 미국 잡초 학회 (Weed Science Society of America)에서 후자의 명칭의 표제 하에 일반화되는 것으로 인지된다. 따라서, 본 발명의 제초제는 상기 기재된 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제를 포함하나 이에 제한되지 않는 피리미디닐티오벤조에이트 제초제를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 개시된 브라시카 식물에 적용하기 위한 농업용 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 제초제, 살진균제, 살균제, 비료 등을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 농업용 조성물은 하나 이상의 제초제, 또는 다른 농업용 조성물, 예컨대 살진균제, 살균제, 비료 등과 하나 이상의 제초제의 조합을 포함하는 제초제용 조성물이다.
임의의 제초제가 본 발명의 AHAS-억제제 관용성 핵산 서열을 함유하는 브라시카 식물을 함유하는 작물, 작물 부분 또는 경작 구역에 적용될 수 있다. 제초제의 분류 (즉, 클래스 및 서브클래스로의 제초제의 분류)는 당업계에 익히 공지되어 있고, HRAC (제초제 저항성 작용 위원회) 및 WSSA (미국 잡초 학회)에 의한 분류를 포함한다. HRAC 분류는 예를 들어, 전세계에서 웹사이트 hracglobal.com/Publications/Classificationof HerbicideModeofAction/tabid/222/Default.aspx에서 이용가능하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제, 술포닐아미노카르보닐트리아졸리논 제초제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 AHAS 억제성 제초제의 사용을 수반하는 방법을 제공한다. 이들 방법에서, AHAS-억제성 제초제는 종자 처리, 토양 처리 및 잎 처리를 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, AHAS-억제성 제초제는 하나 이상의 추가 농업용 조성물, 예컨대 추가 제초제, 살진균제, 살균제, 항바이러스성 조성물 또는 이들의 조합과 조합될 수 있다. 조합에서 사용하기 위한 추가 제초제에는 술파미드 제초제, 유기포스페이트 제초제 및 벤조티아디아지논 제초제를 포함하는 임의의 제초제가 포함된다. 술파미드 제초제에는 사플루페나실이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 유기포스페이트 제초제에는 글리포세이트 및 글루포시네이트가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 벤조티아디아지논 제초제에는 벤타존이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이러한 조합에서 사용하기 위한 살진균제에는 피라클로스트로빈이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
프로토포르피리노겐 [IX] 옥시다제 (PPO) 억제성 제초제가 또한 본 발명의 조성물에서 사용된다. PPO 억제성 제초제는 당업계에 공지되어 있고, 디페닐에테르 제초제 (니트로페닐 에테르 제초제 포함), 예컨대 아시플루오르펜 (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-2-니트로벤조산), 바이페녹스 (메틸 5-(2,4-디클로로페녹시)-2-니트로벤조에이트), DPEI (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-2-니트로아세토페논 옥심-o-(아세트산, 메틸 에스테르)), DPEII (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-3-메톡시프탈리드), 에톡시펜 ((1S)-1-카르복시에틸 2-클로로-5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]벤조에이트), 포메사펜 (5-[2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페녹시]-N-(메틸술포닐)-2-니트로벤즈아미드), 락토펜 (에틸 O-[5-(2-클로로-α,α,α-트리플루오로-p-톨릴옥시)-2-니트로벤조일]-DL-락테이트) 및 옥시플루오르펜 (2-클로로-1-(3-에톡시-4-니트로페녹시)-4-(트리플루오로메틸)벤젠)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. PPO-억제성 제초제에는 또한 디카르복스이미드 제초제, 예컨대 N-페닐-프탈이미드 플루미클로락 ([2-클로로-5-(시클로헥스-1-엔-1,2-디카르복스이미도)-4-플루오로페녹시]아세트산), 플루미옥사진 (N-(7-플루오로-3,4-디히드로-3-옥소-4-프로프-2-인일-2H-1,4-벤즈옥사진-6-일)시클로헥스-1-엔-1,2-디카르복스아미드)가 포함된다. PPO-억제성 제초제에는 트리아졸리논 제초제, 예컨대 카르펜트라존 (α,2-디클로로- 5-[4-(디플루오로메틸)-4,5-디히드로-3-메틸-5-옥소-1H-1,2,4-트리아졸-1-일]-4-플루오로벤젠프로판산), 및 술펜트라존 (N-[2,4-디클로로-5-[4-(디플루오로메틸)-4,5-디히드로-3-메틸-5-옥소-1H-1,2,4-트리아졸-1-일]페닐]메탄술폰아미드)가 추가로 포함된다. PPO-억제성 제초제에는 또한 니피라클로펜 (1-[2,6-디클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-4-니트로-1H-피라졸-5-아민) 및 피라플루펜 (2-클로로-5-(4-클로로-5-디플루오로메톡시-1-메틸피라졸-3-일)-4-플루오로페녹시아세트산)을 포함하나 이에 제한되지 않는 페닐피라졸 제초제가 포함된다. PPO-억제성 제초제에는 또한 옥사디아졸론 제초제, 예컨대 옥사디아존 (3-[2,4-디클로로-5-(1-메틸에톡시)페닐]-5-(1,1-디메틸에틸)-1,3,4-옥사디아졸-2(3H)-온) 및 옥사디아르길 (5-tert-부틸-3-[2,4-디클로로-5-(프로프-2-인일옥시)페닐]-1,3,4-옥사디아졸-2(3H)-온)이 포함된다. PPO-억제성 제초제에는 티아디아졸론 제초제, 예컨대 플루티아세트 ([[2-클로로-4-플루오로-5-[(테트라히드로-3-옥소-1H,3H-[1,3,4]티아디아졸로[3,4-a]피리다진-1-일리덴)아미노]페닐]티오]아세트산); 뿐만 아니라 제US2008254985호 (Zagar and Sievernich) (그 전문이 본원에 참고로 도입됨)의 섹션 III.4)에 기재된 것이 추가로 포함된다.
옥신 제초제가 또한 본 발명의 조성물에서 사용된다. 옥신 제초제에는 작용 기전이 옥신 모방체 또는 옥신 억제제 (항옥신제)인 제초제성 활성 성분을 포함하는 것이 포함된다. 옥신 제초제의 예로는 피클로람 (4-아미노-3,5,6-트리클로로피콜린산); 디캄바 (3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 클로피브르산 ((p-클로로페녹시)이소부티르산); 2-(4-클로로페녹시)-2-메틸프로판산); 베나졸린 (4-클로로-2-옥소-3-벤조티아졸아세트산; 4-클로로-2-옥소벤조티아졸린-3-일-아세트산); TIBA (2,3,5-트리요오도벤조산); 2,3,6-TBA (2,3,6-트리클로로벤조산); 트리클로피르 (3,5,6-트리클로로-2-피리딜옥시아세트산); 퀸클로락 (3,7-디클로로퀴놀린-8-카르복실산); 및 옥신-모방성 또는 옥신-차단성 페녹시 제초제, 예를 들어 페녹시아세트산, 페녹시프로피온산 및 페녹시부티르산 제초제, 예를 들어: 2,4-D ((2,4-디클로로페녹시)아세트산), MCPA ((4-클로로-2-메틸페녹시)아세트산), 2,4-DB (4-(2,4-디클로로페녹시)부티르산), 2,4-DEP (트리스[2-(2,4-디클로로페녹시)에틸]포스페이트), 4-CPA (4-클로로페녹시아세트산), 2,4,5-T ((2,4,5-트리클로로페녹시)아세트산), 디클로르프로프 (2-(2,4-디클로로페녹시)프로판산), 페노프로프 (2-(2,4,5-트리클로로페녹시)프로판산) 및 메코프로프 (2-(2-메틸-4-클로로-페녹시)프로피온산)이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 농업용 조성물의 조합의 예로는 이마자피르 및 이마자픽; 이마자피르 및 벤타존; 이마자피르, 이마자픽 및 벤타존; 이마자피르 및 피라클로스트로빈; 이마자피르, 이마자픽 및 피라클로스트로빈; 이마자피르 및 사플루페나실; 이마자피르, 이마자픽 및 사플루페나실; 이마자픽, 사플루페나실 및 글리포세이트; 이마자피르, 이마자픽, 사플루페나실 및 글리포세이트; 이마자픽 및 글리포세이트; 이마자피르 및 글리포세이트; 이마자피르, 사플루페나실 및 글리포세이트; 및 사플루페나실 및 글리포세이트가 포함된다.
적용 전에, AHAS-억제성 제초제는 통상적인 제형, 예를 들어 용액, 에멀젼, 현탁액, 분진, 분말, 페이스트 및 과립으로 전환될 수 있다. 사용 형태는 의도되는 특정 목적에 좌우되고; 각각의 경우에, 본 발명에 따른 화합물의 미세하고 균일한 분포가 보장되어야 한다.
제형은 공지된 방식으로 (예를 들어, 검토를 위해 제US 3,060,084호, 제EP-A 707 445호 (액체 농축물에 대해), 문헌 [Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48], [Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pp 8-57] 및 이하 제WO 91/13546호, 제US 4,172,714호, 제US 4,144,050호, 제US 3,920,442호, 제US 5,180,587호, 제US 5,232,701호, 제US 5,208,030호, 제GB 2,095,558호, 제US 3,299,566호, [Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961], [Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989] 및 [Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001], [2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8)] 참조), 예를 들어 활성 화합물을 농약 제형에 적합한 보조제, 예컨대 용매 및/또는 담체, 필요한 경우 유화제, 계면활성제 및 분산제, 보존제, 소포제, 동결방지제로 증량시킴으로써, 종자 처리 제형의 경우에는 또한 임의로 착색제 및/또는 결합제 및/또는 겔화제로 증량시킴으로써 제조될 수 있다.
제형에서 사용하기 위한 적합한 용매의 예로는 물, 방향족 용매 (예를 들어 솔베소(Solvesso) 제품, 크실렌), 파라핀 (예를 들어, 미네랄 오일 분획), 알콜 (예를 들어, 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질 알콜), 케톤 (예를 들어, 시클로헥사논, 감마-부티로락톤), 피롤리돈 (NMP, NOP), 아세테이트 (글리콜 디아세테이트), 글리콜, 지방산 디메틸아미드, 지방산 및 지방산 에스테르가 포함된다. 용매 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 제형에서 사용하기 위한 적합한 담체의 예로는 분쇄된 천연 광물 (예를 들어 카올린, 점토, 탈크, 백악) 및 분쇄된 합성 광물 (예를 들어, 고도로 분산성인 실리카, 실리케이트)이 포함된다.
본 발명의 제형에서 사용하기 위한 적합한 유화제에는 비이온성 및 음이온성 유화제 (예를 들어 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르, 알킬술포네이트 및 아릴술포네이트)가 포함된다.
본 발명의 제형에서 사용하기 위한 분산제의 예로는 리그닌-술파이트 폐액 및 메틸셀룰로스가 포함된다.
본 발명의 제형에서 사용하기 위한 적합한 계면활성제에는 리그노술폰산, 나프탈렌술폰산, 페놀술폰산, 디부틸나프탈렌술폰산, 알킬아릴술포네이트, 알킬 술페이트, 알킬술포네이트, 지방 알콜 술페이트, 지방산 및 황산화 지방 알콜 글리콜 에테르의 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 암모늄 염, 또한 술폰화 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체와 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산과 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌 옥틸페놀 에테르, 에톡시화 이소옥틸페놀, 옥틸페놀, 노닐페놀, 알킬페놀 폴리글리콜 에테르, 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 트리스테아릴페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴 폴리에테르 알콜, 알콜 및 지방 알콜 에틸렌 옥시드 축합물, 에톡시화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 에톡시화 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알콜 폴리글리콜 에테르 아세탈, 소르비톨 에스테르, 리그노술파이트 폐액 및 메틸셀룰로스가 포함된다.
직접 분무가능한 용액, 에멀젼, 페이스트 또는 오일 분산액의 제조에 적합한 물질은 중간 내지 높은 비점의 미네랄 오일 분획, 예컨대 등유 또는 디젤 오일이고, 또한 콜타르 오일 및 식물성 또는 동물성 기원의 오일, 지방족, 고리형 및 방향족 탄화수소, 예를 들어 톨루엔, 크실렌, 파라핀, 테트라히드로나프탈렌, 알킬화 나프탈렌 또는 이들의 유도체, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 시클로헥산올, 시클로헥사논, 이소포론, 고도로 극성인 용매, 예를 들어 디메틸 술폭시드, N-메틸피롤리돈 또는 물이다.
또한, 동결방지제 예컨대 글리세린, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 살균제가 제형에 첨가될 수 있다.
본 발명의 제형에서 사용하기 위한 적합한 소포제에는 예를 들어 규소 또는 스테아르산마그네슘을 기재로 하는 소포제가 포함된다.
본 발명의 제형에서 사용하기 위한 적합한 보존제에는 예를 들어, 디클로로페놀 및 벤질알콜헤미포름알데히드가 포함된다.
본 발명의 종자 처리 제형은 결합제 및 임의로 착색제를 또한 포함할 수 있다.
처리 후 종자 상의 활성 물질의 접착을 개선하기 위해 결합제가 개시된 종자 제형에 첨가될 수 있다. 적합한 결합제는 블록 공중합체 EO/PO 계면활성제, 뿐만 아니라 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리부텐, 폴리이소부틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌아민, 폴리에틸렌아미드, 폴리에틸렌이민 (루파솔(Lupasol)®, 폴리민(Polymin)®), 폴리에테르, 폴리우레탄, 폴리비닐아세테이트, 틸로스 및 이러한 중합체들로부터 유도된 공중합체이다.
임의로, 또한 착색제가 제형에 포함될 수 있다. 종자 처리 제형을 위한 적합한 착색제 또는 염료는 로다민(Rhodamin) B, 씨.아이.(C.I.) 피그먼트 레드 112, 씨.아이. 솔벤트 레드 1, 피그먼트 블루 15:4, 피그먼트 블루 15:3, 피그먼트 블루 15:2, 피그먼트 블루 15:1, 피그먼트 블루 80, 피그먼트 옐로우 1, 피그먼트 옐로우 13, 피그먼트 레드 112, 피그먼트 레드 48:2, 피그먼트 레드 48:1, 피그먼트 레드 57:1, 피그먼트 레드 53:1, 피그먼트 오렌지 43, 피그먼트 오렌지 34, 피그먼트 오렌지 5, 피그먼트 그린 36, 피그먼트 그린 7, 피그먼트 화이트 6, 피그먼트 브라운 25, 베이직(basic) 바이올렛 10, 베이직 바이올렛 49, 액시드(acid) 레드 51, 액시드 레드 52, 액시드 레드 14, 액시드 블루 9, 액시드 옐로우 23, 베이직 레드 10, 베이직 레드 108이다.
적합한 겔화제의 예는 카라게난 (사티아겔(Satiagel)®)이다.
분말, 살포용 물질 및 비산성 제품은 활성 물질을 고체 담체와 혼합함으로써 또는 동시에 분쇄함으로써 제조될 수 있다.
과립, 예를 들어 코팅된 과립, 함침된 과립 및 균질성 과립은 활성 화합물을 고체 담체에 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 고체 담체의 예는 무기 토류, 예컨대 실리카 겔, 실리케이트, 탈크, 카올린, 아타클레이(attaclay), 석회석, 석회, 백악, 교회 점토, 황토, 점토, 백운석, 규조토, 황산칼슘, 황산마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄된 합성 물질, 비료, 예를 들어 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아, 및 식물 기원의 제품, 예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목재 가루 및 견과류 껍질 가루, 셀룰로스 분말 및 기타 고체 담체이다.
일반적으로, 제형은 0.01 내지 95 중량％, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량％의 AHAS-억제성 제초제를 포함한다. 이러한 경우에, AHAS-억제성 제초제는 90 내지 100 중량％, 바람직하게는 95 내지 100 중량％ (NMR 스펙트럼에 따름)의 순도로 사용된다. 종자 처리 목적을 위해, 각각의 제형이 2-10배 희석되어, 바로 사용가능한 제제 내의 활성 화합물의 농도가 0.01 내지 60 중량％, 바람직하게는 0.1 내지 40 중량％에 이를 수 있다.
AHAS-억제성 제초제는 분무, 아토마이징(atomizing), 살분, 살포 또는 살수에 의해 그 자체로, 제형 형태로 또는 이로부터 제조된 사용 형태로, 예를 들어 직접 분무가능한 용액, 분말, 현탁액 또는 분산액, 에멀젼, 오일 분산액, 페이스트, 비산성 제품, 살포용 물질 또는 과립의 형태로 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도된 목적에 전적으로 좌우되며; 이는 각각의 경우에 본 발명에 따른 AHAS-억제성 제초제의 가장 미세한 가능한 분포를 확실히 하도록 의도된다.
수성 사용 형태는 물을 첨가함으로써 에멀젼 농축물, 페이스트 또는 습윤화가능한 분말 (분무가능한 분말, 오일 분산액)로부터 제조될 수 있다. 에멀젼, 페이스트 또는 오일 분산액을 제조하기 위해, 그 자체로의 물질 또는 오일 또는 용매에 용해된 물질이 습윤제, 점착제, 분산제 또는 유화제에 의해 물에서 균질화될 수 있다. 그러나, 활성 물질, 습윤제, 점착제, 분산제 또는 유화제, 및 적절한 경우 용매 또는 오일로 구성된 농축물을 제조하는 것이 또한 가능하고, 이러한 농축물은 물로 희석하기에 적합하다.
바로 사용가능한 제제 내의 활성 화합물 농도는 상대적으로 광범위한 범위 내에서 다양할 수 있다. 일반적으로, 이는 0.0001 내지 10 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량％이다.
또한, AHAS-억제성 제초제는 95 중량％ 초과의 활성 물질을 포함하는 제형을 적용하거나, 또는 심지어 첨가제 없이 활성 물질을 적용하는 것이 가능한, 초미량(ultra-low-volume) 방법 (ULV)에서 성공적으로 사용될 수 있다.
하기는 제형의 예이다:
1. 잎 적용을 위한 물로 희석되는 제품. 종자 처리 목적을 위해, 이러한 제품은 희석된 상태로 또는 희석되지 않은 상태로 종자에 적용될 수 있다.
A) 수용성 농축물 (SL, LS)
10 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 90 중량부의 물 또는 수용성 용매에 용해시킨다. 별법으로, 습윤제 또는 다른 보조제를 첨가한다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제를 용해시켜, 이에 의해 10％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다.
B) 분산성 농축물 (DC)
10 중량부의 분산제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈을 첨가하면서 20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 70 중량부의 시클로헥사논에 용해시킨다. 물로 희석하여 분산액을 얻으며, 이에 의해 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다.
C) 유화성 농축물 (EC)
칼슘 도데실벤젠술포네이트 및 피마자유 에톡실레이트 (각각의 경우 5 중량부)를 첨가하면서 15 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 7 중량부의 크실렌에 용해시킨다. 물로 희석하여 에멀젼을 얻으며, 이에 의해 15％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다.
D) 에멀젼 (EW, EO, ES)
칼슘 도데실벤젠술포네이트 및 피마자유 에톡실레이트 (각각의 경우에 5 중량부)를 첨가하면서 25 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 35 중량부의 크실렌에서 용해시킨다. 이 혼합물을 유화기 (울트라투락스(Ultraturrax))에 의해 30 중량부의 물에 도입하고, 균일한 에멀젼으로 만든다. 물로 희석하여 에멀젼을 얻으며, 이에 의해 25％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다.
E) 현탁액 (SC, OD, FS)
교반된 볼 밀에서, 10 중량부의 분산제 및 습윤제 및 70 중량부의 물 또는 유기 용매를 첨가하면서 20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 세분하여, 미세 AHAS-억제성 제초제 현탁액을 얻는다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제의 안정한 현탁액을 얻으며, 이에 의해 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다.
F) 수분산성 과립 및 수용성 과립 (WG, SG)
50 중량부의 분산제 및 습윤제를 첨가하면서 50 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하고, 기술적 기기 (예를 들어, 압출, 분무 타워, 유동층)에 의해 수분산성 또는 수용성 과립으로서 제조한다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제의 안정한 분산액 또는 용액을 얻으며, 이에 의해 50％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다.
G) 수분산성 분말 및 수용성 분말 (WP, SP, SS, WS)
25 중량부의 분산제, 습윤제 및 실리카 겔을 첨가하면서 75 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 회전자-고정자 밀에서 분쇄한다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제의 안정한 분산액 또는 용액을 얻으며, 이에 의해 75％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다.
I) 겔-제형 (GF)
교반된 볼 밀에서, 10 중량부의 분산제, 1 중량부의 겔화제 습윤제 및 70 중량부의 물 또는 유기 용매를 첨가하면서 20 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 세분하여, 미세 AHAS-억제성 제초제 현탁액을 얻는다. 물로 희석하여 AHAS-억제성 제초제의 안정한 현탁액을 얻으며, 이에 의해 20％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다. 이러한 겔 제형은 종자 처리로서 사용하기에 적합하다.
2. 잎 적용을 위한 희석되지 않은 상태로 적용되는 제품. 종자 처리 목적을 위해, 이러한 제품은 희석된 상태로 종자에 적용될 수 있다.
A) 비산성 분말 (DP, DS)
5 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하고, 95 중량부의 미분 카올린과 함께 치밀하게 혼합한다. 이렇게 하여 5％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 비산성 제품을 얻는다.
B) 과립 (GR, FG, GG, MG)
0.5 중량부의 AHAS-억제성 제초제를 미세하게 분쇄하고, 95.5 중량부의 담체와 회합시켜, 이에 의해 0.5％ (w/w)의 AHAS-억제성 제초제를 갖는 제형을 수득한다. 현재 방법은 압출, 분무-건조 또는 유동층이다. 이렇게 하여 잎 사용을 위한 희석되지 않은 상태로 적용되는 과립을 얻는다.
통상적인 종자 처리 제형에는 예를 들어 유동성 농축물 FS, 용액 LS, 건식 처리용 분말 DS, 슬러리 처리용 수분산성 분말 WS, 수용성 분말 SS 및 에멀젼 ES 및 EC, 및 겔 제형 GF가 포함된다. 이러한 제형들은 희석된 상태로 또는 희석되지 않은 상태로 종자에 적용될 수 있다. 종자에의 적용은 파종 전에 종자 상에 직접적으로 수행된다.
한 실시양태에서, FS 제형이 종자 처리에 사용된다. 전형적으로, FS 제형은 1 내지 800 g/ℓ의 활성 성분, 1 내지 200 g/ℓ의 계면활성제, 0 내지 200 g/ℓ의 동결방지제, 0 내지 400 g/ℓ의 결합제, 0 내지 200 g/ℓ의 안료 및 1 ℓ까지의 용매, 바람직하게는 물을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제초제-저항성 브라시카 식물의 비-트랜스제닉 및 트랜스제닉 종자를 제공한다. 이러한 종자는 예를 들어, BnCL120C7 또는 BnCL131A1의 식물의 제초제-저항성 특징을 포함하는 비-트랜스제닉 브라시카 종자, 및 제초제-저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자를 포함한다.
종자 처리를 위해, 본 발명에 따른 제초제 저항성 식물의 종자는 제초제, 바람직하게는 AHAS-억제성 제초제, 예컨대 아미도술푸론, 아짐술푸론, 벤술푸론, 클로리무론, 클로르술푸론, 시노술푸론, 시클로술파무론, 에타메트술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론, 포람술푸론, 할로술푸론, 이마조술푸론, 요오도술푸론, 메소술푸론, 메트술푸론, 니코술푸론, 옥사술푸론, 프리미술푸론, 프로술푸론, 피라조술푸론, 림술푸론, 술포메투론, 술포술푸론, 티펜술푸론, 트리아술푸론, 트리베누론, 트리플록시술푸론, 트리플루술푸론, 트리토술푸론, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자피르, 이마자퀸, 이마제타피르, 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 페녹스술람, 비스피리박, 피리미노박, 프로폭시카르바존, 플루카르바존, 피리벤족심, 피리프탈리드, 피리티오박 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 제초제로, 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제형으로 처리된다.
용어 종자 처리는 당업계에 공지된 모든 적합한 종자 처리 기술, 예컨대 종자 드레싱, 종자 코팅, 종자 살분, 종자 침지 및 종자 펠렛화를 포함한다.
본 발명의 한 변형에 따라, 본 발명의 추가 대상은 조성물/제형, 예를 들어 과립 제형으로서의 AHAS-억제성 제초제를 함유하는 과립 제형 (임의로 하나 이상의 고체 또는 액체 담체, 농업용으로 허용되는 담체 및/또는 임의로 하나 이상의 농업용으로 허용되는 계면활성제를 갖음)을 적용함으로써, 특히 종자 이랑(drill) 내로 적용함으로써 토양을 처리하는 방법이다. 예를 들어, 곡물, 옥수수, 목화 및 해바라기의 모판에서 이러한 방법이 유리하게 사용된다.
본 발명은 또한 아미도술푸론, 아짐술푸론, 벤술푸론, 클로리무론, 클로르술푸론, 시노술푸론, 시클로술파무론, 에타메트술푸론, 에톡시술푸론, 플라자술푸론, 플루피르술푸론, 포람술푸론, 할로술푸론, 이마조술푸론, 요오도술푸론, 메소술푸론, 메트술푸론, 니코술푸론, 옥사술푸론, 프리미술푸론, 프로술푸론, 피라조술푸론, 림술푸론, 술포메투론, 술포술푸론, 티펜술푸론, 트리아술푸론, 트리베누론, 트리플록시술푸론, 트리플루술푸론, 트리토술푸론, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자피르, 이마자퀸, 이마제타피르, 클로란술람, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 페녹스술람, 비스피리박, 피리미노박, 프로폭시카르바존, 플루카르바존, 피리벤족심, 피리프탈리드 및 피리티오박으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 AHAS 억제제를 포함하는 종자 처리 제형으로 코팅되거나 이를 함유하는 종자를 포함한다.
용어 "종자"는 진정 종자, 종자 조각, 뿌리순, 구경, 구근, 과실, 덩이줄기, 낟알, 꺾꽂이 순 및 꺾꽂이 묘조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 종류의 종자 및 식물 번식체(propagule)를 포함하고, 바람직한 실시양태에서는 진정 종자를 의미한다.
용어 "~로 코팅되고/거나 이를 함유하는"은 활성 성분이 적용 시에 대부분 번식 생성물의 표면 상에 있지만, 적용 방법에 따라 얼마간의 성분은 번식 생성물 내로 침투될 수 있다는 것을 일반적으로 의미한다. 상기 번식 생성물이 (재)식재되는 경우, 이는 활성 성분을 흡수할 수 있다.
AHAS-억제성 제초제 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제형에 의한 종자 처리 적용은 식물의 파종 전에 및 식물의 출아 전에 종자에 분무 또는 살분함으로써 수행된다.
종자의 처리에서, 상응하는 제형은 유효량의 AHAS-억제성 제초제 또는 AHAS-억제성 제초제를 포함하는 제형으로 종자를 처리함으로써 적용된다. 여기에서, 적용률은 종자 100 ㎏ 당 일반적으로 0.1 g 내지 10 kg의 a.i. (또는 a.i.의 혼합물 또는 제형), 바람직하게는 종자 100 ㎏ 당 1 g 내지 5 kg, 특히 종자 100 ㎏ 당 1 g 내지 2.5 kg이다. 상추와 같은 특정 작물에 대해서, 적용률이 더 높을 수 있다.
본 발명의 브라시카 식물 상에 적용되는 임의의 제초제 제형은 "탱크-믹스" 조성물로서 제조될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 각각의 성분 또는 성분들의 조합은 서로 개별적으로 저장될 수 있다. 그 후, 성분은 적용 전에 서로 혼합될 수 있다. 전형적으로, 이러한 혼합은 적용 직전에 수행된다. 탱크-믹스 공정에서, 혼합 전에 각각의 성분은 전형적으로 물 또는 적합한 유기 용매 내에 존재한다. 이러한 제형의 제조 방법 및 그에 대한 지침은 당업계에 공지되어 있다.
상기 방법은 본 발명의 브라시카 식물과 함께 사용될 제초제 조합의 개발을 추가로 허용한다. 이러한 방법에서, 경작 구역 내의 환경 상태가 평가된다. 평가될 수 있는 환경 상태에는 토지 및 표면 물 오염 염려, 작물의 의도된 용도, 작물 관용성, 토양 잔류물, 경작 구역에 존재하는 잡초, 토성, 토양의 pH, 토양내 유기 물질의 양, 적용 장비 및 경운 재배가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 환경 상태의 평가시, 제초제들의 조합의 유효량이 작물, 작물 부분, 작물의 종자 또는 경작 구역에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 브라시카 식물에 적용되는 제초제는 감수성 잡초 또는 원치않는 식물의 성장 개시를 방지하는 역할을 하고/거나 관심 구역에서 성장하는 잡초 또는 원치않는 식물에 손상을 유발하는 역할을 한다. 일부 실시양태에서, 제초제 또는 제초제 혼합물은 후속적으로 관심 구역 (즉, 밭 또는 경작 구역)에 식재되는 작물에 영향을 미치는 잡초 또는 원치않는 식물에 대한 이들 효과를 발휘한다. 방법에서, 제초제 조합의 적용은 동시에 수행될 필요는 없다. 작물이 식재되는 밭이 작물이 경작 구역에 있는 기간 동안 언젠가 적용될 검출가능한 양의 제1 제초제 및 제2 제초제를 함유하는 한, 작물은 본 발명에 따른 제초제의 혼합물로 처리된 것으로 간주된다. 따라서, 제공된 방법은 "출아전," "출아후," "식재전 혼입"이고/거나 식재 전에 종자 처리를 수반하는 제초제의 적용을 포함한다.
또한, 본 발명의 브라시카 종자를 코팅하는 방법이 제공된다. 방법은 유효량의 제초제 또는 제초제들의 조합 (본원에 개시된 바와 같음)으로 종자를 코팅하는 것을 포함한다. 그 후, 종자는 경작 구역에 식재될 수 있다. 유효량의 제초제 또는 제초제들의 조합 (본원에 개시된 바와 같음)을 포함하는 코팅을 갖는 브라시카 종자가 추가로 제공된다.
"출아전"은 식물이 토양으로부터 보이게 발아하기 전 및/또는 종자의 출아전 관심 구역 (예를 들어, 밭 또는 경작 구역)에 적용되는 제초제를 지칭한다. "출아후"는 식물이 토양으로부터 보이게 발아한 후 구역에 적용되는 제초제를 지칭한다. 몇몇 예에서, 용어 "출아전" 및 "출아후"는 관심 구역 내의 잡초 또는 원치않는 식물과 관련하여 사용되고, 몇몇 예에서 이들 용어는 관심 구역 내의 작물 식물과 관련하여 사용된다. 잡초 또는 원치않는 식물과 관련하여 사용되는 경우, 이들 용어는 관심 구역에 존재하거나 존재하는 것으로 믿어지는 오직 특정 유형의 잡초 또는 잡초의 종 또는 원치않는 식물에만 적용될 수 있다. 임의의 제초제는 출아전 및/또는 출아후 처리에 적용될 수 있으나, 몇몇 제초제는 출아전 또는 출아후 적용되는 경우 잡초 또는 잡초들 또는 원치않는 식물의 방제에 보다 효과적인 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 림술푸론은 출아전 및 출아후 활성 둘 모두는 갖지만, 다른 제초제는 출아전 (메톨라클로르) 또는 출아후 (글리포세이트) 활성을 우세하게 갖는다. 특정 제초제의 이들 특성은 당업계에 공지되어 있고, 당업자에 의해 용의하게 결정된다. 추가로, 당업자는 본 발명의 트랜스제닉 식물과 함께 사용하기 위한 적절한 제초제 및 적용 시간 및/또는 본 발명의 트랜스제닉 식물이 식재될 구역을 용의하게 선별할 수 있다. "식재전 혼입"은 식재전 토양으로의 화합물의 혼입을 수반한다.
따라서, 작물을 성장시키고/거나 잡초 또는 원치않는 식물을 방제하는 개선된 방법이 제공된다 (예를 들어, 잡초 또는 원치않는 식물을 더 잘 방제하기 위해 관심 작물을 식재하기 전에 하나 이상의 제초제로 구역을 처리하는 "식재전 전소"). "무경운" 또는 "저경운" (또한 "감소 경운"이라고 지칭됨)인, 작물을 성장시키고/거나 잡초 또는 원치않는 식물을 방제하는 방법이 추가로 제공된다. 이러한 방법에서, 토양은 전통적인 방법과 비교하여 성장 주기 동안 경작되지 않거나 또는 덜 빈번하게 경작되며; 이들 방법은 노동력 및 연료 비용을 포함하는, 다르게 추가 경작으로 인해 초래되는 비용을 절약할 수 있다.
방법은 여러 부류의 제초제의 동시 및/또는 순차 적용의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 오직 1종의 제초제 또는 다른 화학물질, 예를 들어 이미다졸리논 제초제로 본 발명의 식물 및/또는 관심 구역 (예를 들어, 밭 또는 경작 구역) 및/또는 잡초 및/또는 원치않는 식물을 처리하는 것을 수반한다.
제초제를 관심 구역 (및 그 안의 임의의 식물)에 적용하는 시점은 잡초 또는 원치않는 식물 방제의 최적화에 중요할 수 있다. 제초제를 적용하는 시점은 관심 구역 내의 식물의 크기 및/또는 식물의 성장 및/또는 발달의 단계, 예를 들어 구역에서 성장하는 작물 식물 또는 잡초 또는 원치않는 식물과 관련하여 결정될 수 있다. 식물의 성장 및/또는 발달의 단계는 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 제초제 또는 다른 화학물질을 식물이 성장하고 있는 관심 구역에 적용하는 시점은 특정 구역 내의 식물의 일부 또는 전체가 적어도 특정 크기 및/또는 성장 및/또는 발달의 단계에 도달한 시점, 또는 특정 구역 내의 식물의 일부 또는 전체가 아직 특정 크기 및/또는 성장 및/또는 발달의 단계에 도달하지 않은 시점일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 브라시카 식물은 출아후 제초제 처리에 대한 개선된 관용성을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 브라시카 식물은 더 높은 용량의 제초제에 대한 관용성, 더 광범위한 범위의 제초제에 대한 관용성 (즉, 더 많은 AHAS 억제제 화학에 대한 관용성)을 가질 수 있고/거나, 적절한 대조 식물과 비교하여 발달의 더 빠른 시점 또는 더 이후 시점에 적용되는 제초제의 용량에 대한 관용성을 가질 수 있다.
상이한 화학물질, 예컨대 제초제는 상이한 "잔류" 효과, 즉, 화학물질 또는 제초제에 의한 처리가 처리된 구역에서 성장하고 있는 식물에 대한 효과를 계속 갖는 상이한 양의 시간을 갖는다. 이러한 효과는 처리된 구역 (예를 들어, 밭 또는 경작 구역)의 원하는 미래 목적에 따라 원하는 것이거나 원치않는 것일 수 있다. 따라서, 윤작 계획은 각각의 작물을 위해 사용될 처리로부터의 잔류 효과 및 동일한 구역에서 후속적으로 성장될 작물에 대한 효과에 기초하여 선택될 수 있다. 당업자는 제초제의 잔류 효과를 평가하는데 사용될 수 있는 기술에 친숙하며; 예를 들어, AHAS를 억제하는 작용을 하는 제초제는 잔류 활성 수준이 다양하다. 다양한 제초제에 대한 잔류 활성은 당업계에 공지되어 있고, 또한 다양한 환경 인자, 예를 들어 토양 수분 수준, 온도, pH 및 토양 조성 (토성 및 유기 물질)에 따라 다양하다고 공지되어 있다. 본 발명의 브라시카 식물은 제초제의 잔류 활성에 대한 개선된 관용성이 이로운 작물을 성장시키는 방법에서 특히 사용된다.
또한, 본 발명의 브라시카 식물은 제초제 처리와 함께 작물 상에 사용되는 추가 화학물질, 예컨대 약해 경감제, 아쥬반트, 예컨대 술폰산암모늄 및 작물 오일 농축물 등에 의한 처리에 대한 개선된 관용성을 제공한다.
또한, 개시된 방법은 훨씬 더 넓은 스펙트럼의 농업적 보호를 제공하는 다성분 혼합물을 형성하기 위한, AHAS-억제성 제초제 또는 제초제들의 혼합물, 뿐만 아니라, 하나 이상의 다른 살곤충제, 살진균제, 살선충제, 살균제, 살비제, 성장 조절제, 화학불임제, 통신화학물질, 기피제, 유인제, 페로몬, 섭식 자극제 또는 다른 생물학적으로 활성인 화합물 또는 곤충병원성 박테리아, 바이러스 또는 진균의 사용을 포함할 수 있다. 방법에서 사용될 수 있는 이러한 농업용 보호제의 예로는 살곤충제, 예컨대 아바멕틴, 아세페이트, 아세타미프리드, 아미도플루메트 (S-1955), 아베르멕틴, 아자디라크틴, 아진포스-메틸, 비펜트린, 비페나제이트, 부프로페진, 카르보푸란, 카르탑, 클로르페나피르, 클로르플루아주론, 클로르피리포스, 클로르피리포스-메틸, 크로마페노지드, 클로티아니딘, 시플루메토펜, 시플루트린, 베타-시플루트린, 시할로트린, 람다-시할로트린, 시퍼메트린, 시로마진, 델타메트린, 디아펜티우론, 디아지논, 디엘드린, 디플루벤주론, 디메플루트린, 디메토에이트, 디노테푸란, 디오페놀란, 에마멕틴, 엔도술판, 에스펜발레레이트, 에티프롤, 페노티오카르브, 펜옥시카르브, 펜프로파트린, 펜발레레이트, 피프로닐, 플로니카미드, 플루벤디아미드, 플루시트리네이트, 타우-플루발리네이트, 플루페네림 (UR-50701), 플루페녹수론, 포노포스, 할로페노지드, 헥사플루무론, 히드라메틸논, 이미다클로프리드, 인독사카르브, 이소펜포스, 루페누론, 말라티온, 메타플루미존, 메탈데히드, 메타미도포스, 메티다티온, 메토밀, 메토프렌, 메톡시클로르, 메토플루트린, 모노크로토포스, 메톡시페노지드, 니텐피람, 니티아진, 노발루론, 노비플루무론 (XDE-007), 옥사밀, 파라티온, 파라티온-메틸, 퍼메트린, 포레이트, 포살론, 포스메트, 포스파미돈, 피리미카르브, 프로페노포스, 프로플루트린, 피메트로진, 피라플루프롤, 피레트린, 피리달릴, 피리프롤, 피리프록시펜, 로테논, 리아노딘, 스피노사드, 스피로디클로펜, 스피로메시핀 (BSN 2060), 스피로테트라메이트, 술프로포스, 테부페노지드, 테플루벤주론, 테플루트린, 테르부포스, 테트라클로르빈포스, 티아클로프리드, 티아메톡삼, 티오디카르브, 티오술탑-나트륨, 트랄로메트린, 트리아자메이트, 트리클로르폰 및 트리플루무론; 살진균제, 예컨대 아시벤졸라르, 알디모르프, 아미술브롬, 아자코나졸, 아족시스트로빈, 베날락실, 베노밀, 벤티아발리카르브, 벤티아발리카르브-이소프로필, 비노미알, 바이페닐, 비테르타놀, 블라스티시딘-S, 보르데아욱스 혼합물 (삼염기성 황산구리), 보스칼리드/니코비펜, 브로무코나졸, 부피리메이트, 부티오베이트, 카르복신, 카르프로파미드, 카프타폴, 카프탄, 카르벤다짐, 클로로넵, 클로로탈로닐, 클로졸리네이트, 클로트리마졸, 옥시염화구리, 구리 염, 예컨대 황산구리 및 수산화구리, 시아조파미드, 시플루나미드, 시목사닐, 시프로코나졸, 시프로디닐, 디클로플루아니드, 디클로시메트, 디클로메진, 디클로란, 디에토펜카르브, 디페노코나졸, 디메토모르프, 디목시스트로빈, 디니코나졸, 디니코나졸-M, 디노캅, 디스코스트로빈, 디티아논, 도데모르프, 도딘, 에코나졸, 에타코나졸, 에디펜포스, 에폭시코나졸, 에타복삼, 에티리몰, 에트리디아졸, 파목사돈, 페나미돈, 페나리몰, 펜부코나졸, 펜카라미드, 펜푸람, 펜헥사미드, 페녹사닐, 펜피클로닐, 펜프로피딘, 펜프로피모르프, 펜틴 아세테이트, 펜틴 히드록시드, 페르밤, 페르푸라조에이트, 페림존, 플루아지남, 플루디옥소닐, 플루메토베르, 플루오피콜리드, 플루옥사스트로빈, 플루퀸코나졸, 플루퀸코나졸, 플루실라졸, 플루술파미드, 플루톨라닐, 플루트리아폴, 폴페트, 포세틸-알루미늄, 푸베리다졸, 푸랄락실, 푸라메타피르, 헥사코나졸, 히멕사졸, 구아자틴, 이마잘릴, 이미벤코나졸, 이미녹타딘, 요오디카르브, 이프코나졸, 이프로벤포스, 이프로디온, 이프로발리카르브, 이소코나졸, 이소프로티올란, 카수가마이신, 크레속심-메틸, 만코젭, 만디프로파미드, 마넵, 마파니피린, 메페녹삼, 메프로닐, 메탈락실, 메트코나졸, 메타술포카르브, 메티람, 메토미노스트로빈/페노미노스트로빈, 메파니피림, 메트라페논, 미코나졸, 미클로부타닐, 네오-아소진 (페릭 메탄아르소네이트), 누아리몰, 옥틸리논, 오푸라세, 오리사스트로빈, 옥사딕실, 옥솔린산, 옥스포코나졸, 옥시카르복신, 파클로부트라졸, 펜코나졸, 펜시쿠론, 펜티오피라드, 페르푸라조에이트, 포스폰산, 프탈리드, 피코벤자미드, 피콕시스트로빈, 폴리옥신, 프로벤아졸, 프로클로라즈, 프로시미돈, 프로파모카르브, 프로파모카르브-히드로클로라이드, 프로피코나졸, 프로피넵, 프로퀴나지드, 프로티오코나졸, 피라클로스트로빈, 프리아조포스, 피리페녹스, 피리메타닐, 피리페녹스, 피롤니트린, 피로퀼론, 퀸코나졸, 퀴녹시펜, 퀸토젠, 실티오팜, 시메코나졸, 스피록사민, 스트렙토마이신, 황, 테부코나졸, 테크라젠, 테클로프탈람, 테크나젠, 테트라코나졸, 티아벤다졸, 티플루자미드, 티오파네이트, 티오파네이트-메틸, 티람, 티아디닐, 톨클로포스-메틸, 톨리플루아니드, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리아리몰, 트리아족시드, 트리데모르프, 트리모르프아미드, 트리시클라졸, 트리플록시스트로빈, 트리포린, 트리티코나졸, 우니코나졸, 발리다마이신, 빈클로졸린, 지넵, 지람 및 족사미드; 살선충제, 예컨대 알디카르브, 옥사밀 및 페나미포스; 살균제, 예컨대 스트렙토마이신; 살비제, 예컨대 아미트라즈, 키노메티오네이트, 클로로벤질레이트, 시헥사틴, 디코폴, 디에노클로르, 에톡사졸, 페나자퀸, 펜부타틴 옥시드, 펜프로파트린, 펜피록시메이트, 헥시티아족스, 프로파르기트, 피리다벤 및 테부펜피라드; 및 생물학적 작용제, 예를 들어 곤충병원성 박테리아, 예컨대 바실루스 투린기엔시스 아종 아이자와이(Bacillus thuringiensis subsp . Aizawai), 바실루스 투린기엔시스 아종 쿠르스타키(Bacillus thuringiensis subsp . Kurstaki) 및 바실루스 투린기엔시스의 캡슐화된 델타-내독소 (예를 들어, Cellcap, MPV, MPVII); 곤충병원성 진균, 예컨대 녹색 무스카르딘 진균; 및 곤충병원성 바이러스, 예를 들어 바큘로바이러스, 뉴클레오폴리헤드로 바이러스 (NPV), 예컨대 HzNPV, AfNPV; 및 그라뉼로시스 바이러스 (GV), 예컨대 CpGV가 포함된다. 방법에서 사용되는 이들 다양한 혼합 파트너 대 다른 조성물 (예를 들어, 제초제)의 중량비는 전형적으로 100:1 내지 1:100, 또는 30:1 내지 1:30, 10:1 내지 1:10, 또는 4:1 내지 1:4이다.
생물학적으로 유효량의 관심 AHAS-억제성 제초제 또는 제초제들의 혼합물, 및 유효량의 하나 이상의 추가 생물학적으로 활성인 화합물 또는 작용제를 포함하는 조성물이 추가로 제공되고, 하나 이상의 계면활성제, 고체 희석제 또는 액체 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 생물학적으로 활성인 화합물 또는 작용제의 예는 살곤충제, 예컨대 아바멕틴, 아세페이트, 아세타미프리드, 아미도플루메트 (S-1955), 아베르멕틴, 아자디라크틴, 아진포스-메틸, 비펜트린, 비페나제이트, 부프로페진, 카르보푸란, 클로르페나피르, 클로르플루아주론, 클로르피리포스, 클로르피리포스-메틸, 크로마페노지드, 클로티아니딘, 시플루트린, 베타-시플루트린, 시할로트린, 람다-시할로트린, 시퍼메트린, 시로마진, 델타메트린, 디아펜티우론, 디아지논, 디플루벤주론, 디메토에이트, 디오페놀란, 에마멕틴, 엔도술판, 에스펜발레레이트, 에티프롤, 페노티오카르브, 펜옥시카르브, 펜프로파트린, 펜발레레이트, 피프로닐, 플로니카미드, 플루시트리네이트, 타우-플루발리네이트, 플루페네림 (UR-50701), 플루페녹수론, 포노포스, 할로페노지드, 헥사플루무론, 이미다클로프리드, 인독사카르브, 이소펜포스, 루페누론, 말라티온, 메탈데히드, 메타미도포스, 메티다티온, 메토밀, 메토프렌, 메톡시클로르, 모노크로토포스, 메톡시페노지드, 니티아진, 노발루론, 노비플루무론 (XDE-007), 옥사밀, 파라티온, 파라티온-메틸, 퍼메트린, 포레이트, 포살론, 포스메트, 포스파미돈, 피리미카르브, 프로페노포스, 피메트로진, 피리달릴, 피리프록시펜, 로테논, 스피노사드, 스피로메시핀 (BSN 2060), 술프로포스, 테부페노지드, 테플루벤주론, 테플루트린, 테르부포스, 테트라클로르빈포스, 티아클로프리드, 티아메톡삼, 티오디카르브, 티오술탑-나트륨, 트랄로메트린, 트리클로르폰 및 트리플루무론; 살진균제, 예컨대 아시벤졸라르, 아족시스트로빈, 베노밀, 블라스티시딘-S, 보르데아욱스 혼합물 (삼염기성 황산구리), 브로무코나졸, 카르프로파미드, 카프타폴, 카프탄, 카르벤다짐, 클로로넵, 클로로탈로닐, 옥시염화구리, 구리 염, 시플루페나미드, 시목사닐, 시프로코나졸, 시프로디닐, (S)-3,5-디클로로-N-(3-클로로-1-에틸-1-메틸-2-옥소프로필)-4-메틸벤자미드 (RH 7281), 디클로시메트 (S-2900), 디클로메진, 디클로란, 디페노코나졸, (S)-3,5-디히드로-5-메틸-2-(메틸티오)-5-페닐-3-(페닐-아미노)-4H-이미다졸-4-온 (RP 407213), 디메토모르프, 디목시스트로빈, 디니코나졸, 디니코나졸-M, 도딘, 에디펜포스, 에폭시코나졸, 파목사돈, 페나미돈, 페나리몰, 펜부코나졸, 펜카라미드 (SZX0722), 펜피클로닐, 펜프로피딘, 펜프로피모르프, 펜틴 아세테이트, 펜틴 히드록시드, 플루아지남, 플루디옥소닐, 플루메토베르 (RPA 403397), 플루모르프/플루모를린 (SYP-L190), 플루옥사스트로빈 (HEC 5725), 플루퀸코나졸, 플루실라졸, 플루톨라닐, 플루트리아폴, 폴페트, 포세틸-알루미늄, 푸랄락실, 푸라메타피르 (S-82658), 헥사코나졸, 이프코나졸, 이프로벤포스, 이프로디온, 이소프로티올란, 카수가마이신, 크레속심-메틸, 만코젭, 마넵, 메페녹삼, 메프로닐, 메탈락실, 메트코나졸, 메토미노스트로빈/페노미노스트로빈 (SSF-126), 메트라페논 (AC375839), 미클로부타닐, 네오-아소진 (페릭 메탄아르소네이트), 니코비펜 (BAS 510), 오리사스트로빈, 옥사딕실, 펜코나졸, 펜시쿠론, 프로벤아졸, 프로클로라즈, 프로파모카르브, 프로피코나졸, 프로퀴나지드 (DPX-KQ926), 프로티오코나졸 (JAU 6476), 피리페녹스, 피라클로스트로빈, 피리메타닐, 피로퀼론, 퀴녹시펜, 스피록사민, 황, 테부코나졸, 테트라코나졸, 티아벤다졸, 티플루자미드, 티오파네이트-메틸, 티람, 티아디닐, 트리아디메폰, 트리아디메놀, 트리시클라졸, 트리플록시스트로빈, 트리티코나졸, 발리다마이신 및 빈클로졸린; 살선충제, 예컨대 알디카르브, 옥사밀 및 페나미포스; 살균제, 예컨대 스트렙토마이신; 살비제, 예컨대 아미트라즈, 키노메티오네이트, 클로로벤질레이트, 시헥사틴, 디코폴, 디에노클로르, 에톡사졸, 페나자퀸, 펜부타틴 옥시드, 펜프로파트린, 펜피록시메이트, 헥시티아족스, 프로파르기트, 피리다벤 및 테부펜피라드; 및 생물학적 작용제, 예를 들어 곤충병원성 박테리아, 예컨대 바실루스 투린기엔시스 아종 아이자와이, 바실루스 투린기엔시스 아종 쿠르스타키 및 바실루스 투린기엔시스의 캡슐화된 델타-내독소 (예를 들어, Cellcap, MPV, MPVII); 곤충병원성 진균, 예컨대 녹색 무스카르딘 진균; 및 곤충병원성 바이러스, 예를 들어 바큘로바이러스, 뉴클레오폴리헤드로 바이러스 (NPV), 예컨대 HzNPV, AfNPV; 및 그라뉼로시스 바이러스 (GV), 예컨대 CpGV이다. 방법은 또한 무척추동물 해충에 대해 독성인 단백질 (예컨대 바실루스 투린기엔시스 델타-내독소)을 발현하도록 유전적으로 형질전환된 식물의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 외인적으로 적용되는 무척추동물 해충 방제 화합물의 효과는 발현된 독소 단백질과 상승작용적일 수 있다.
따라서, 상기 방법은 AHAS-억제성 제초제 또는 AHAS-억제성 제초제 조합을 사용할 수 있고, 살곤충제 및/또는 살진균제, 및/또는 다른 농업용 화학물질, 예컨대 비료의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조합된 처리의 사용은 추가 잡초 종에 대한 활성 스펙트럼을 확장시키고 임의의 저항성 생물형의 증식을 억제할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 저항성 식물의 종자를 파종 전에 및/또는 발아전 후에 AHAS-억제성 제초제와 접촉시키는 것을 포함하는, 원치않는 식생을 박멸하거나 잡초를 방제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 종자를 예를 들어, 밭 내의 토양 또는 온실 내의 화분 매질에 파종하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 종자 바로 부근에 있는 원치않는 식생의 박멸 또는 잡초의 방제에서 특히 사용된다.
원치않는 식생의 방제는 잡초를 사멸시키고/거나 다르게는 잡초의 정상적인 성장을 지연시키거나 억제하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 가장 넓은 의미로 잡초는 원치않는 위치에서 성장하는 모든 식물을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 잡초에는, 예를 들어 쌍자엽 및 단자엽 잡초가 포함된다. 쌍자엽 잡초에는 하기 속의 잡초가 포함되나 이에 제한되지 않는다: 시나피스(Sinapis), 레피디움(Lepidium), 갈리움(Galium), 스텔라리아(Stellaria), 마트리카리아(Matricaria), 안테미스(Anthemis), 갈린소가(Galinsoga), 체노포디움(Chenopodium), 우르티카(Urtica), 세네시오(Senecio), 아마란투스(Amaranthus), 포르툴라카(Portulaca), 잔티움(Xanthium), 콘볼불루스(Convolvulus), 이포모에아(Ipomoea), 폴리고눔(Polygonum), 세스바니아(Sesbania), 암브로시아(Ambrosia), 시르시움(Cirsium), 카르두우스(Carduus), 손추스(Sonchus), 솔라눔(Solanum), 로리파(Rorippa), 로탈라(Rotala), 린데르니아(Lindernia), 라미움(Lamium), 베로니카(Veronica), 아부틸론(Abutilon), 에멕스(Emex), 다투라(Datura), 비올라(Viola), 갈레오프시스(Galeopsis), 파파베르(Papaver), 센타우레아(Centaurea), 트리폴리움(Trifolium), 라눈쿨루스(Ranunculus) 및 타락사쿰(Taraxacum). 단자엽 잡초에는 하기 속의 잡초가 포함되나 이에 제한되지 않는다: 에치노클로아(Echinochloa), 세타리아(Setaria), 파니쿰(Panicum), 디기타리아(Digitaria), 플레움(Phleum), 포아(Poa), 페스투카(Festuca), 엘레우신(Eleusine), 브라키아리아(Brachiaria), 롤리움(Lolium), 브로무스(Bromus), 아베나(Avena), 시페루스(Cyperus), 소르굼(Sorghum), 아그로피론(Agropyron), 시노돈(Cynodon), 모노초리아(Monochoria), 핌브리스티슬리스(Fimbristyslis), 사기타리아(Sagittaria), 엘레오카리스(Eleocharis), 스키르푸스(Scirpus), 파스팔룸(Paspalum), 이스카에뭄(Ischaemum), 스페노클레아(Sphenoclea), 닥틸로크테니움(Dactyloctenium), 아그로스티스(Agrostis), 알로페쿠루스(Alopecurus) 및 아페라(Apera).
또한, 본 발명의 잡초는, 예를 들어 원치않는 위치에서 성장하고 있는 작물 식물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 옥수수 식물이 대두 식물의 밭에서 원치않는 경우, 대두 식물을 주로 포함하는 밭에 있는 자생식물인 옥수수 식물은 잡초로 간주될 수 있다.
본원에서 단수형 ("a" 및 "an")은 1개의 또는 1개를 초과하는 (즉, 1개 이상의) 관사의 문법적인 대상을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, "요소(an element)"는 1개 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 단어 "포함" 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 파생형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하는 것을 의미하나, 어떠한 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다.
하기 실시예는 제한하기 위해서가 아니라 예시를 위해 제공된다.
실시예 1 - 돌연변이체 AHAS 서열의 제조
돌연변이체 서열의 제작 전에, 브라시카 나푸스 AHAS I 및 III에 대한 전체 코딩 서열을, BnALS3
Figure pct00001
및 BnALSOR2
Figure pct00002
및 BnALSOR3
Figure pct00003
을 각각 사용하여 증폭시키고, 클로닝하고, 비교를 위해 기준 서열로서 작용하는 계통 BN-02 (도 3 및 4), 계통 97 (AHAS III 내의 S653N을 갖는 BN-02, 도 3 및 3) 및 BN-11로부터 서열분석하였다.
1A. 유전자 복구 올리고뉴클레오티드 (GRON) 설계
얻은 AHAS III 핵산 서열에 기초하여, 일련의 유전자 복구 올리고뉴클레오티드 (GRON, 표 1에 나타냄)는, 아라비돕시스 AHAS에 대한 아미노산 번호매김에 기초하여 코딩된 AHAS III 단백질 내의 위치 122에 상응하는 알라닌의 트레오닌으로의 아미노산 치환을 초래하는 AHAS 코딩 영역 내의 핵산 돌연변이를 특이적으로 도입하기 위해 설계하였다. GRON은 AHAS III 내의 GCT의 ACT로의 뉴클레오티드 변화를 도입하기 위해 설계하였다. 이들 GRON 서열을 사용하여 이러한 변화에 대해 오직 AHAS III 핵산 서열만을 표적화하였다.
Figure pct00004
전환하는 염기는 진하게 나타낸다. V=CY3; H=3'DMT dC CPG
1B. 세포 배양 작업 기재
1B.1 봄 캐놀라 계통 97의 AHAS III 유전자 내의 A122T 돌연변이를 표적화하는 유전자 복구 올리고뉴클레오티드 (GRON) 도입 실험
BN-02라고 공지된 브라시카 재배종의 반수체인 소포자-유래 소식물체로부터의 잎 원형질체를 사용하는 이전 래피드 트레이트 디벨롭먼트 시스템(Rapid Trait Development System)™ (시부스 엘엘씨(Cibus LLC), 미국 캘리포니아주 샌디에고, "RTDS™") 실험으로부터 캐놀라 계통 97을 유도하였다. 계통 97은 AHAS III 단백질 내의 아미노산 위치 653에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하였다. AGT의 AAT로의 코돈 변화에 의해 돌연변이를 코딩하고, 세린의 아스파라긴으로의 치환을 초래하였으며, 이는 이마제타피르에 대한 관용성을 제공하였다. 동일한 유전자 내의 A122T 돌연변이의 부가는 단일 돌연변이와 비교하여 크게 향상된 Imi-관용성을 초래하였다.
계통 97의 AHAS III 유전자 내의 추가 돌연변이의 도입을 목적으로 하는 RTDS™ 실험을 수행하였다. 0.5 및 0.2 μM Imi로 선별된 원형질체-유래 캘러스로부터 계통 97을 재생시켰다. A122T;S653N 이중 돌연변이를 10 μM Imi의 농도에서 선별하였다. 실험을 위해 사용된 프로토콜은 섹션 1B.2-1B.6에 기재되어 있다.
1B.2 잎 원형질체의 단리를 위한 물질의 번식
소포자-유래 배아로부터 유래된 반수체 묘조를 시험관내에서 멸균 조건하에 번식시켰다. 꺾꽂이 순을 2주 내지 4주 마다 계대배양하고, 40 내지 45 ㎖ RS 배지 (문헌 [Dovzhenko A., 2001])의 부피를 함유하는 페트리 접시 (90 mm x 20 mm)에서 배양하였다. 접시를 마이크로포어 테이프(Micropore tape) (쓰리엠 캄파니(3M Company))로 밀봉하였다. 어린 잎을 절개하고 원형질체 단리를 위해 사용하였다.
1B.3 원형질체 단리 및 정제
2 내지 3주령 시험관내 묘조로부터의 잎 조직 약 600 mg을 5 ㎖ 배지 B (문헌 [Pelletier et al., 1983])를 갖는 페트리 접시에서 해부용 칼로 작은 스트립으로 절단하고, pH를 5.8로 조정하였다. 1시간 후, 배지 B를, 0.5％ 셀룰라제(Cellulase) YC 및 0.75％ 마세로자임(Macerozyme) R10 (둘 모두 칼란 리서치 프로덕츠(Karlan Research Products) (미국 애리조나주 커튼우드)로부터), 1 g/ℓ 소 혈청 알부민 및 1 g/ℓ 2-모르폴리노에탄술폰산이 용해된 배지 B로 구성된 필터-멸균화 효소 용액 12 ㎖로 대체하였다. 효소 용액을 진공-침투하고, 후속적으로 효소 용액 중 잎 조각을 갖는 접시를 암실에서 25℃에서 16 내지 18시간 동안 인큐베이션하였다. 요오딕사놀 밀도 구배를 이용하여 원형질체 정제를 수행하였다. 밀도 구배 원심분리 후, 정제된 원형질체를 갖는 밴드를 W5 배지 약 5 ㎖와 함께 제거하였다. 혈구계산기를 이용하여 원형질체 수율을 결정하고, 원형질체를 4℃에서 2시간 동안 저장하였다.
1B.4 유전자 복구 올리고뉴클레오티드 (GRON) 도입
원형질체 현탁액을 동등한 부피의 냉 배지 W5와 혼합하고, 50 ㎖ 원심분리기 튜브로 옮기고, 임상 원심분리기의 최저 세팅에서 10분 동안 원심분리하였다 (약 50 x g). 상등액을 제거하고, TM 배지 (문헌 [Klaus, S. 2003])로 대체하고, 원형질체 밀도를 5 x 106/㎖로 조정하였다. 2.5 x 106 원형질체를 함유하는 500 ㎕의 분취액 각각을 50 ㎖ 원심분리기 튜브로 분배하였다. GRON (예를 들어 BnALS1122/C/41/5'Cy3/3'idC; 표 1 참조)을 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 혼합하고, 이를 얼음 상에서 회전기 상에서 혼합함으로써 원형질체로 전달하였다. 500 ㎕ 처리 부피 당 대략 12 내지 300 ㎍의 GRON을 사용하였다. 그 후, 원심분리를 이용하여 원형질체를 수집하고, 암실에서 4℃에서 밤새 저장하였다.
1B.5 알긴산칼슘 중 원형질체의 봉입
그 후, 문헌 [Dovzhenko (2001)]에 기재된 방법에 기초하여 겔 (예를 들어, 아가로스, 알기네이트) 내에 원형질체를 봉입하였다. 겔 기판 내의 원형질체의 봉입은 원형질체 생존을 향상시키고 원형질체-유래 세포의 분열 빈도를 증가시키는 것으로 나타났다. PEG-GRON 처리 후 1일에, 한 처리된 샘플로부터 유래된 원형질체를 50 ㎖ 원심분리기 튜브로 이동시키고, 실온에 도달되게 하였다. 튜브를 임상 원심분리기에 의해 최저 세팅 (약 50 x g)에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 2.75 ㎖ 배지 B (131 mg/ℓ로 감소된 염화칼슘 이수화물 농도)에 재현탁하고, V-형상 60 ㎖ 시약 그릇에서 동일한 감소된-칼슘 배지 B 중 알긴산나트륨의 2.8％ (w/v) 용액 2.75 ㎖와 혼합하였다. 원형질체-알기네이트 현탁액을 멀티-채널 피펫 (더 넓은 개구부를 제공하기 위해 예비-절단 팁을 사용함)으로 흡수하고, 분취액 40 ㎕를 Ca-A 배지 50 ㎖에 적하하였다.
1B.6 원형질체 배양 및 Imi-관용성 캘러스의 선별
문헌 [Pelletier et al. (1983) Mol. Gen. Genet. 191:244-250]에 기재된 바와 유사한 배지에서 알기네이트 비드의 순차적 계대배양을 이용하여 이미다졸리논-관용성 캘러스를 선별하였다 (표 2 참조). 10 μM Imi의 농도에서 PEG/GRON 처리 후 1주에 선별을 개시하였다. 배양 배지로의 제초제의 첨가는 즉각적 효과를 갖지 않았다. 처음에, 이미다졸리논 없이 초기 배양기 동안 형성된 모든 마이크로콜로니는 계속 성장하였으나, 첨가된 제초제 없는 대조보다 더 느리게 성장하였다. 선별 개시 후 1 내지 2주에, 콜로니 대부분의 성장은 늦추어 지거나 정지하였다.
세포 및 마이크로콜로니를 50 mM 시트르산나트륨을 함유하는 배양 배지에 의해 30 내지 45분 동안 처리함으로써 원형질체의 봉입 후 3주에 알기네이트로부터 방출시켰다. 방출시, 대부분의 콜로니는 죽었거나, 죽은 세포의 외부 층으로 덮인 녹색 중심부로 구성되었다. 고체화된 선별 배지 E로 이동 후, 살아있는 세포를 여전히 함유한 마이크로캘러스 대부분은 성장을 정지하고 갈색으로 변하였다. 개별 캘러스의 제한된 성장은 계속되었으나, 모든 비관용성 캘러스는 결국 갈색으로 변하였다. 고체화된 선별 배지로의 이동 후 2 내지 3주에 (때때로 더 빨리), 활발히 성장하는 캘러스가 갈색 세포 및 마이크로캘러스의 배경에서 나타났다.
Figure pct00005
1B.7 AHAS III 유전자 내의 A122T;S653N 이중 돌연변이를 함유하는 원형질체-유래 Imi-관용성 캘러스로부터의 식물의 재생
고체화된 선별 배지 상에 발달하고 표적화된 돌연변이를 갖는 것으로 확인된 Imi-관용성 캘러스 (하기 실시예 1C 참조)를 제초제-비함유 배지 E로 이동시켜 발달을 가속화하였다. 개별 캘러스 계통은 성장 속도 및 형태학이 다양하였다. 일반적으로, 묘조 재생을 향한 발달은 아래 단계를 따랐다:
미분화된 녹색 캘러스 -> 어두운 녹색 구역을 갖는 캘러스 -> 뿌리의 발달 -> 초기 묘조의 발달 -> 과수성 (자기화) 잎을 갖는 왜소 묘조의 발달.
개별 캘러스 계통의 발달은 가변적이었으나, 배지 E 상의 연속적인 계대배양 및 증식 또는 더 낮은 농도의 NAA를 갖는 배지 E의 변형을 통해 묘조 형성 사건을 얻을 가능성을 증가시켰다.
묘조가 배지 E 상에 형성되고 3 내지 4개의 잎을 형성하면, 이를 RS 배지 (문헌 [Dovzhenko, 2001])로 이동시켰다. 상기 배지 상에, 시간이 지남에 따라 새로 형성된 묘조 및 잎 조직이 발달하였으며, 이는 형태학상 '정상' (즉, 비-과수성)이었다. 후속적으로, 소식물체의 경화 및 온실로의 이동을 위해 표준 프로토콜을 이용하였다.
1C. 분자 스크리닝
이마제타피르에 대한 관용성을 나타내는 캘러스로부터의 게놈 DNA를 도입된 A122T 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝하였다. 문헌 [Edwards et al. (1991) Nucleic Acids Research 19(6):1349]의 절차를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. AHAS I 및 III이 어떠한 인트론도 함유하지 않기 때문에, 게놈 DNA로부터의 PCR이 가능하였다. AHAS III 내의 A122 위치를 함유하는 영역을 증폭시키기 위해 유전자 특이적 (GS) 프라이머 BnALS3
Figure pct00006
및 BnALS9
Figure pct00007
를 사용하였다. 생성된 앰플리콘의 정제 및 정량화 후, 대립유전자-특이적 (AS) PCR 반응을 위한 템플레이트로서 생성된 앰플리콘을 사용하였다. A122T 돌연변이의 존재를 검출하기 위해 3-프라이머 믹스 (BnALSOF5
Figure pct00008
, BnALSOR8
Figure pct00009
및 BnALSIR2A
Figure pct00010
- 매스터-믹스 40)를 사용하였다. ACT (트레오닌) 코돈이 존재하는 경우 BnALSOF5와 짝형성하는 생성물을 오직 어닐링하고 형성하도록 내부 프라이머 (BnALS1R2A)를 설계하였다.
AS-PCR 스크린에서 사용된 바와 동일한 게놈 DNA 템플레이트를 사용하여 A122T 변화를 나타내는 모든 캘러스에 대해 유전자-특이적 PCR을 반복하였다. 이번은, 앰플리콘을 1％ 트리스-아세테이트 EDTA 겔로부터 겔-정제하고, A122 영역에 대해 서열분석하여 변화를 확인하였다. 확인시, 독립적 게놈 DNA 샘플을 캘러스 조직으로부터 제조하고, A122 영역을 다시 한번 서열분석하였다.
주어진 캘러스 계통으로부터의 2개의 독립적 샘플이 A122T 돌연변이의 존재에 대해 확인되면, 임의의 다른 비의도된 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP's)에 대해 체크하기 위해 AHAS 유전자 I 및 III을 그 전체 서열분석하였다. BnALS3
Figure pct00011
을 BnALSOR2
Figure pct00012
(유전자 III의 경우) 및 BnALSOR3
Figure pct00013
(유전자 I의 경우)와 함께 사용하여 전장 유전자를 증폭시키고, TopoPCR2.1 (인비트로젠)로 클로닝하였다. 진성 SNP's로부터 PCR 오차를 구별하기 위해 각각의 유전자의 4개의 클론을 서열분석하였다.
바이오-스프린트(Bio-sprint) 기기 (퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 스크리닝된 캘러스로부터 재생된 식물 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하고, 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 다시 스크리닝하였다. 유전자 III에서 계통 97 배경 식물과 A122T (BnALS3
Figure pct00014
및 BnALS9
Figure pct00015
및 S653N (BnALS10
Figure pct00016
및 BnALSOR2
Figure pct00017
) 서열을 함유하는 영역을 증폭시키는 프라이머를 사용하여 그의 존재를 확인하기 위해 유전자-특이적 PCR (GS-PCR)을 수행하였다.
총 18종의 캘러스 계통을 확인하였으며, 여기서 A122T 돌연변이 및 S653N 돌연변이 둘 모두의 존재를 AHAS III 유전자의 서열분석에 의해 확인하였다. 이들 캘러스 계통 중 12종은 묘조를 재생시켰다. 1종의 계통을 제외하고, 이중 돌연변이체 계통은 AHAS III 내의 A122T 및 S653N 돌연변이 둘 모두에 대해 동형접합 (즉, 반수체 또는 동형접합 이배체)이었다. 가장 전진된 계통인 BnCL131A1은 수 그램의 종자를 생성하였다. 식물 당 수율은 이배체 식물의 수율과 비교가능하였으며, 이는 선별/재생 동안 언젠가 자발적 이배체화가 발생하였음을 의미하였다. 이 계통의 꽃가루를 사용하여, 2종의 윈터 오일시드 레이프 (WOSR) 재배종인 BN-11 및 BN-19의 씨방을 수정시켰다. 또한, BnCL131A1 계통으로부터의 종자를 접속 번호 PTA-9279로서 ATCC에 기탁하였다. 2종의 추가 계통인 BnCL140B3 및 BnCL140C7 (둘 모두 AHAS III 내에 A122T 및 S653N 돌연변이를 코딩하는 돌연변이 유발된 AHAS 핵산 분자를 함유함)을 또한 접속 번호 PTA-9402 및 PTA-9403으로서 각각 기탁하였다.
AHAS III 서열 내에 오직 A122T 돌연변이를 함유하는 다른 브라시카 계통을 또한 확인하였다. 상기 계통 BnCL120C7의 종자를 또한 접속 번호 PTA-9278로서 ATCC에 기탁하였다.
실시예 2: 브라시카 나푸스 식물 추출물 및 전체 식물로부터의 AHAS 효소적 활성
계통 BN02 (야생형), PM1/PM2 (2개의 돌연변이체 유전자, 예를 들어 미국 특허 제7,355,098호 참조), BnCL131A1 (AHAS III A122T S653N 이중 돌연변이체) 및 BnCL120C7 (AHAS III A122T 단일 돌연변이체)에 대한 식물을 수확하기 전에 3-4 엽기까지 종자로부터 성장시켰다. 세포 추출물을 문헌 [Singh et al., (1988 Assay of Acetohydroxyacid Synthase. Analytical Biochemistry 171, 173-179)]에 따라 100 내지 0.78 μM 범위의 이마자목스의 8개의 일련의 희석물의 부재 또는 존재하에 AHAS 활성에 대해 3회 검정하였다. 활성은 억제되지 않은 (이마자목스 없음) 활성의 백분율로서 표현하였다 (도 1). 도 1에 나타낸 그래프는 3개의 식재 일자로부터 각각의 이마자목스 농도에 대한 억제되지 않은 평균 ％ 결과를 나타내며, 각각 총 7개의 독립적 추출 검정에 대해 2 내지 3회 반복하였다. 오차 막대는 ± 2 평균의 표준오차를 표시한다.
또한, 이중 돌연변이체를 함유하는 브라시카 나푸스 식물 (3-4 엽기)을, 야생형 식물과 비교하여 이마자목스에 의한 처리에 대한 반응에 대해 분석하였다. 계통 BN02 (야생형) 및 BnCL131A1 (AHAS III A122T:S653N, 이중 돌연변이체)을 0.5％ v/v 머지(Merge)로 보충된 210 g ai/ha 이마자목스로 잎 분무에 의해 처리하거나, 또는 대비로서 분무하지 않은 상태로 두었다. 처리 후 삼(3) 주에 처리된 식물을 평가하였고, 결과는 도 2에 나타낸다. 도 2는 식물 BN02 (상단 행) 및 BnCL131A1 (하단 행)에 대한 결과를 제공한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 야생형 BN-02 식물은 이마자목스의 210 g ai/ha 적용에 대해 거의 비-관용성이었으나, BnCL131A1 계통은 이러한 적용에 대해 거의 완전히 관용성이었다.
이중 돌연변이체를 함유하는 브라시카 나푸스 식물을 이미다졸리논 제초제 적용에 의한 식물 손상에 대해 또한 시험하였다. 계통 BN02 (야생형), BnCL131A1 (AHAS III A122T:S653N, 이중 돌연변이체), BnCL120C7 (AHAS III A122T 단일 돌연변이체), BnCL97 (AHAS III S653N 단일 돌연변이체), PM1/PM2 (상업용 2종의 유전자 대비), PM1 (AHAS I S653N 단일 돌연변이체) 및 PM2 (AHAS III W574L 단일 돌연변이체)에 대한 브라시카 나푸스 식물을 종자로부터 3-4 엽기까지 성장시킨 후, 분무하지 않은 상태로 두거나, 또는 0.5％ v/v 머지로 보충된 35, 70 또는 210 g ai/ha 이마자목스로 분무하였다. 계통 당 8 내지 24개의 식물에 대해 처리후 2주 (DAT: days after treatment)에 제초제 손상을 0 내지 9 스케일을 이용하여 평가하였으며, 여기서 0은 손상 없음이고, 9는 식물 사멸이다. 결과는 하기 표 3에 평균 손상 ± 1 평균의 표준오차로서 제공하였다. 제공된 결과는 BnCL97을 제외한 모든 계통에 대한 2개의 독립적 식재 및 분무를 포함한다. 표는 또한 ± 1 평균의 표준오차에 대한 값을 제공한다.
Figure pct00018
실시예 3: 이마자목스로 처리된 브라시카 나푸스 식물에 대한 제초제 손상 등급평가
이마자목스로 처리된 브라시카 나푸스 식물에 대한 제초제 손상 등급평가. 계통 BN02 (야생형), BnCL131A1의 2개의 계통 (AHAS III A122T S653N 이중 돌연변이체; BnCL131A1.0 및 BnCL131A1.18), PM1/PM2 (상업용 2종의 유전자 대비: AHAS I S653N & AHAS III W574L)에 대한 식물을 종자로부터 3-4 엽기까지 성장시킨 후, 분무하지 않은 상태로 두거나, 또는 0.5％ v/v 머지로 보충된 35, 70 또는 210 g ai/ha 이마자목스로 분무하였다. 계통 당 12개의 식물에 대해 처리후 2주에 제초제 손상을 평가하였다. 결과는 하기 표 4에 평균 손상 ± 1 평균의 표준오차로서 제공하였다. 결과는 모든 계통에 대한 1개의 식재 및 분무를 포함하고, 또한 ± 2 평균의 표준오차에 대한 값을 제공한다.
Figure pct00019
실시예 4: 밭 시험된 브라시카 나푸스 식물의 이마자목스 제초제 손상 등급평가
하기 봄 오일시드 레이프 계통으로부터의 브라시카 나푸스 식물을 미국 노스다코타주 미놋 주변 지역에서 밭 시험하였다: BN-02 (야생형), BN-T (야생형), BN-02 배경 유전자형의 BnCL131A1 (AHAS III A122T S653N 이중 돌연변이체), BN-02 배경 유전자형의 BnCL120C7 (BnAHASIII A122T), BN-02 배경 유전자형의 BnCL97 (BnAHASIII S653N), BN-T 배경의 PM1/PM2 (2종의 유전자 대비: AHAS I S653N & AHAS III W574L), BN-T 배경의 PM1 (1종의 유전자 대비: AHAS I S653N) 및 BN-T 배경의 PM2 (1종의 유전자 대비: AHAS III W574L). 계통을 5 m 길이 단일 행 플롯에서 식재하고, 3개의 반복 및 4개의 처리 (0 g ai/ha 이마자목스, 50 g ai/ha 이마자목스, 100 g ai/ha 이마자목스 및 200 g ai/ha 이마자목스)를 갖는 2 인자 분할구 설계로 배열하였다. 식물을 2-4 엽기에 상기 언급된 이마자목스 처리로 분무하였다. 이마자목스 제품 (비욘드(Beyond) 120 g/ℓ LC + 0.25％ (v/v) 비이온성 계면활성제)을 에이커 당 20 갤론 (또는 200 리터/ha)으로 희석하고, 트랙터 탑재된 붐을 이용하여 적용하였다.
처리후 15일 (DAT)에 제초제 손상을 플롯에 따른 기준으로 0 내지 100％의 스케일을 이용하여 평가하였으며, 여기서 0은 손상 없음이고, 100％는 완전 식물 사멸이었다. ANOVA를 이용하여 손상 등급평가를 통계적으로 분석하였으며, 결과는 표 5에 나타낸다.
Figure pct00020
이중 돌연변이체 계통, BnCL131A1 (BN-02) (AHAS III A122T, S653N)은 개별 돌연변이체 계통 BnCL97 (BN-02) (AHASIII S653N) 및 BNCL120C7 (BN-02) (AHASIII A122T)의 합계보다 훨씬 더 큰 제초제 관용성을 나타내었다. 200 g ai/ha 이마자목스에서 이중 돌연변이체 계통 (A122T + S653N)에 의해 나타난 관용성의 양은 62％ (100％ - 38작물 손상 ％)이었다. 200 g ai/ha에서 A122T 단일 돌연변이체에 의해 나타난 관용성의 양은 20％ (100％ - 80작물 손상 ％)이었다. 200 g ai/ha에서 S653N 단일 돌연변이체에 의해 나타난 관용성의 양은 17％ (100％ - 83작물 손상 ％)이었다. 관용성이 부가적인 경우, S653N 돌연변이와 함께 A122T 돌연변이의 조합의 기대 관용성은 37％였다. 대신에, 이중 돌연변이체의 관측 관용성은 62％였다. 따라서, 이중 돌연변이체 계통인 BnCL131A1 (BN-02)에서 관측된 제초제 관용성의 수준은 2종의 단일 돌연변이체 계통인 BNCL97 (BN-02) 및 BNCL120C7 (BN-02)에서 관측된 수준에 대해 상승작용적이었다.
실시예 5 스태킹된 AHAS 형질을 함유하는 브라시카 식물 및 이마자목스 제초제 손상 등급평가
스태킹된 AHAS-억제제 저항성 핵산 분자를 함유하는 브라시카 나푸스 식물을, 통상적인 육종 방법에 의해 CLB-1 (AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N)에 대해 동형접합인 AHAS-억제제 저항성 계통을 AHASL1A-W574(At)L (PM2) + AHASL1C-S653(At)N (PM1)에 대해 동형접합인 AHAS-억제제 저항성 계통과 교배함으로써 얻었다.
온실에서 하기 2종의 IMI-관용성 봄 브라시카 나푸스 양친 계통 간에 수동-교배된 하이브리드를 생산하였다: "BnCL131A1" (A 게놈 IMI-관용성 돌연변이 AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N에 대한 동형접합) 및 "PM1PM2" (A 게놈 AHAS-억제제 관용성 돌연변이 AHASL1A-W574(At)L (PM2) + C 게놈 AHAS-억제제 관용성 돌연변이 AHASL1C-S653(At)N (PM1)에 대한 동형접합). 생성된 이형접합 수동-교배된 하이브리드 계통, "PM1PM2/BnCL131A1" (스태킹된 돌연변이에 대한 이형접합: AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N, AHASL1A-W574(At)L (PM2), AHASL1C-S653(At)N (PM1))을 계통과 함께 밭 시험하였으며, 여기서 각각은 오직 1종의 AHAS-억제제 관용성 돌연변이 (동형접합 또는 이형접합) 및 여러 봄 브라시카 나푸스 대비를 함유하였다.
3개의 반복 시험을 미국 노스다코타주 심코에서 수행하고, 무작위화된 분할 블록 설계를 이용하였다. 5개의 상이한 이미다졸리논 제초제 처리 비율 하에 상이한 엔트리의 식물약해 퍼센트 (작물 손상 ％)를 측정하기 위한 시험을 설계하였다. 식물을 2-4 엽기에 100 리터/ha의 부피로 분무하였다. 사용된 이미다졸리논 제초제 비율은 아래와 같았다 (이마자목스 = 비욘드™ 120 g/ℓ LC (BAS 72001H); NIS = 인듀스(INDUCE)™ 90 (90％ 비이온성 계면활성제; 헬레나 케미칼 캄파니(Helena Chemical Co.), 미국 테네시주 콜리어빌):
Figure pct00021
수동-교배된 하이브리드 계통인 PM1PM2/BnCL131A1은 하기 3종의 이형접합 AHAS-억제제 관용성 돌연변이체 대립유전자를 함유하였다:
Figure pct00022
비교기 계통 BnCL131A1 (He)은 하기 1종의 이형접합 AHAS-억제제 관용성 돌연변이체 대립유전자를 함유하였다:
Figure pct00023
비교기 계통 PM2 (AHASL1A-PM2)는 하기 1종의 동형접합 AHAS-억제제 관용성 돌연변이체 대립유전자를 함유하였다:
Figure pct00024
비교기 계통 PM1 (AHASL1C-PM1)은 하기 1종의 동형접합 AHAS-억제제 관용성 돌연변이체 대립유전자를 함유하였다:
Figure pct00025
처리후 18일에 0 내지 100％의 스케일로 식물약해의 수준 (작물 손상 퍼센트)에 대해 각각의 플롯을 평가함으로써 작물 손상 등급평가를 밭에서 결정하였다. 통계적 유의성 (ANOVA)과 함께 3개의 반복실험에 걸쳐 각각의 엔트리에 대한 평균 값은 표 6에 나타낸다 (Ho = 동형접합; He = 이형접합). 표 6에 나타낸 각각의 값은 3개의 반복의 평균이었다.
Figure pct00026
결과
100％로부터 각각의 계통에 대한 작물 손상 퍼센트 등급평가 (표 6)를 공제하여 제초제 관용성 퍼센트 (표 7) (Ho = 동형접합; He = 이형접합)를 얻음으로써 식물약해 퍼센트 (작물 손상 ％) 등급평가를 제초제 관용성 등급평가로 전환하였다.
Figure pct00027
PM1PM2/BnCL131A1 내의 3종의 이형접합 돌연변이의 스태킹이 부가적 또는 상승작용적 제초제 관용성 효과를 초래하는가를 이해하기 위해, BnCL131A1 (He), PM1 (AHASL1C-PM1) 및 PM2 (AHASL1A-PM2)에 대한 관측 평균 제초제 관용성을 부가하여, 기대 제초제 관용성 퍼센트를 얻었다 (표 7). 이 실험에서 사용된 PM1 및 PM2 계통이 AHAS-억제제 관용성 돌연변이에 대한 동형접합이었다는 것을 주목하였다. 다른 대비 계통은 이형접합 IMI-관용성 PM1 계통 및 이형접합 IMI-관용성 PM2 계통이었으나, 이 물질은 이용가능하지 않았기 때문에 그의 동형접합 대응물을 사용하였다. 이전 연구로부터, 이형접합 IMI-관용성 돌연변이를 함유하는 계통이 항상 동형접합 AHAS-억제제 관용성 돌연변이를 함유하는 계통보다 이미다졸리논 제초제 처리에 대한 더 적은 관용성을 가진다는 것이 나타났다 (데이터는 나타내지 않음). 140 g ai/ha 이마자목스에서 3종의 개별 계통 (BnCL131A1 (He) + PM1 (AHASL1C-PM1) + PM2 (AHASL1A-PM2))에 대한 기대 부가적 제초제 관용성 퍼센트는 45％인 반면, PM1PM1/BnCL131A1 계통 (이형접합 상태의 3종의 돌연변이 모두를 함유함)의 관측 제초제 관용성 퍼센트는 78.3％였다. 유사한 결과가 관측되었다 (210 g ai/ha의 더 높은 처리 비율에서 기대 부가적 제초제 관용성 퍼센트는 55％인 반면, PM1PM2/BnCL131A1에 대한 관측 제초제 관용성 퍼센트는 85％였다) (표 7).
끝으로, 이형접합 AHAS-억제제 관용성 돌연변이를 갖는 스태킹된 계통인 PM1PM2/BnCL131A1은 단일 동형접합 AHAS-억제제 관용성 돌연변이에서 관측된 것보다 유의하게 더 큰 관용성을 초래한 이미다졸리논 제초제에 대한 기대치 않은 높은 수준의 관용성을 초래한 상승작용적 제초제 관용성 효과를 나타내었다.
상기 발명이 이해를 명확하게 하기 위해 설명 및 예시 방식으로 일부 상세히 기재되었지만, 첨부된 청구항의 범위 내에서 어느 정도의 변화 및 변형이 실행될 수 있음이 명백할 것이다.
ATCC PTA09278 20080623 ATCC PTA09279 20080623 ATCC PTA09402 20080804 ATCC PTA09403 20080804 ATCC PTA10321 20090909
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Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala 385 390 395 400 Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys 405 410 415 Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys 420 425 430 Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr 435 440 445 Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Gln Gly Lys Ala Ile Ile Ser 450 455 460 Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr 465 470 475 480 Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly 485 490 495 Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala 500 505 510 Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln 515 520 525 Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu 530 535 540 Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp Arg Phe 545 550 555 560 Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu 565 570 575 Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys Gly Ile 580 585 590 Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln 595 600 605 Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro 610 615 620 His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Asn Gly Gly Thr Phe Lys 625 630 635 640 Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr 645 650 <210> 22 <211> 2013 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 22 atggcggcgg caacaacaac aacaacaaca tcttcttcga tctccttctc caccaaacca 60 tctccttcct cctccaaatc accattacca atctccagat tctccctccc attctcccta 120 aaccccaaca aatcatcctc ctcctcccgc cgccgcggta tcaaatccag ctctccctcc 180 tccatctccg ccgtgctcaa cacaaccacc aatgtcacaa ccactccctc tccaaccaaa 240 cctaccaaac ccgaaacatt catctcccga ttcgctccag atcaaccccg caaaggcgct 300 gatatcctcg tcgaagcttt agaacgtcaa ggcgtagaaa ccgtattcgc ttaccctgga 360 ggtgcatcaa tggagattca ccaagcctta acccgctctt cctcaatccg taacgtcctt 420 cctcgtcacg aacaaggagg tgtattcgca gcagaaggat acgctcgatc ctcaggtaaa 480 ccaggtatct gtatagccac ttcaggtccc ggagctacaa atctcgttag cggattagcc 540 gatgcgttgt tagatagtgt tcctcttgta gcaatcacag gacaagtccc tcgtcgtatg 600 attggtacag atgcgtttca agagactccg attgttgagg taacgcgttc gattacgaag 660 cataactatc ttgtgatgga tgttgaagat atccctagga ttattgagga agctttcttt 720 ttagctactt ctggtagacc tggacctgtt ttggttgatg ttcctaaaga tattcaacaa 780 cagcttgcga ttcctaattg ggaacaggct atgagattac ctggttatat gtctaggatg 840 cctaaacctc cggaagattc tcatttggag cagattgtta ggttgatttc tgagtctaag 900 aagcctgtgt tgtatgttgg tggtggttgt ttgaattcta gcgatgaatt gggtaggttt 960 gttgagctta cggggatccc tgttgcgagt acgttgatgg ggctgggatc ttatccttgt 1020 gatgatgagt tgtcgttaca tatgcttgga atgcatggga ctgtgtatgc aaattacgct 1080 gtggagcata gtgatttgtt gttggcgttt ggggtaaggt ttgatgatcg tgtcacgggt 1140 aagcttgagg cttttgctag tagggctaag attgttcata ttgatattga ctcggctgag 1200 attgggaaga ataagactcc tcatgtgtct gtgtgtggtg atgttaagct ggctttgcaa 1260 gggatgaata aggttcttga gaaccgagcg gaggagctta agcttgattt tggagtttgg 1320 aggaatgagt tgaacgtaca gaaacagaag tttccgttga gctttaagac gtttggggaa 1380 gctattcctc cacagtatgc gattaaggtc cttgatgagt tgactgatgg aaaagccata 1440 ataagtactg gtgtcgggca acatcaaatg tgggcggcgc agttctacaa ttacaagaaa 1500 ccaaggcagt ggctatcatc aggaggcctt ggagctatgg gatttggact tcctgctgcg 1560 attggagcgt ctgttgctaa ccctgatgcg atagttgtgg atattgacgg agatggaagc 1620 tttataatga atgtgcaaga gctagccact attcgtgtag agaatcttcc agtgaaggta 1680 cttttattaa acaaccagca tcttggcatg gttatgcaat gggaagatcg gttctacaaa 1740 gctaaccgag ctcacacatt tctcggggat ccggctcagg aggacgagat attcccgaac 1800 atgttgctgt ttgcagcagc ttgcgggatt ccagcggcga gggtgacaaa gaaagcagat 1860 ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acaccaggac cttacctgtt ggatgtgatt 1920 tgtccgcacc aagaacatgt gttgccgatg atcccgagtg gtggcacttt caacgatgtc 1980 ataacggaag gagatggccg gattaaatac tga 2013 <210> 23 <211> 670 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 23 Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser Ile Ser Phe 1 5 10 15 Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser 20 25 30 Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser 35 40 45 Ser Arg Arg Arg Gly Ile Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ile Ser Ala 50 55 60 Val Leu Asn Thr Thr Thr Asn Val Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Lys 65 70 75 80 Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe Ile Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gln Pro 85 90 95 Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val 100 105 110 Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln 115 120 125 Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ser Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu 130 135 140 Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys 145 150 155 160 Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val 165 170 175 Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile 180 185 190 Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu 195 200 205 Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu 210 215 220 Val Met Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Ile Ile Glu Glu Ala Phe Phe 225 230 235 240 Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys 245 250 255 Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Glu Gln Ala Met Arg 260 265 270 Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His 275 280 285 Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu 290 295 300 Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe 305 310 315 320 Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly 325 330 335 Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His 340 345 350 Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu 355 360 365 Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala 370 375 380 Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu 385 390 395 400 Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys 405 410 415 Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu 420 425 430 Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gln Lys 435 440 445 Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro 450 455 460 Gln Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala Ile 465 470 475 480 Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr 485 490 495 Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala 500 505 510 Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro 515 520 525 Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn 530 535 540 Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Val 545 550 555 560 Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp 565 570 575 Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala 580 585 590 Gln Glu Asp Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Leu Phe Ala Ala Ala Cys 595 600 605 Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Glu Ala 610 615 620 Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile 625 630 635 640 Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr 645 650 655 Phe Asn Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr 660 665 670

Claims (105)

  1. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 브라시카(Brassica) 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, AHAS-억제성 제초제에 의한 억제에 대해 저항성인 AHAS 단백질을 코딩하는, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 코딩된 AHAS 단백질이 각각의 단일 돌연변이를 함유하는 핵산 분자에 의해 코딩된 AHAS 단백질의 부가적 수준과 비교하여 AHAS-억제성 제초제에 의한 억제에 대한 저항성의 상승작용적 수준을 나타내는 것인, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 도 4의 BN02-131의 아미노산 서열을 갖는 AHAS 단백질을 코딩하는, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 도 3의 BN02-131의 핵산 서열을 갖는, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  8. 제1항에 있어서, 브라시카 나푸스(Brassica napus) AHAS III 단백질을 코딩하는, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  9. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 발현 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 세린이 아닌 아미노산이 세린의 아스파라긴으로의 치환인 발현 벡터.
  12. 제9항에 있어서, 돌연변이 유발된 AHASL이 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 것인 발현 벡터.
  13. 제9항에 있어서, 핵산 분자가 도 4의 BN02-131의 아미노산 서열을 코딩하는 것인 발현 벡터.
  14. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 제초제 관용성 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물.
  15. 제14항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 브라시카 식물.
  16. 제14항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 브라시카 식물.
  17. 제14항에 있어서, AHAS 단백질이 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 것인 브라시카 식물.
  18. 제14항에 있어서, 브라시카 나푸스(B. napus) 및 브라시카 준세아(B. juncea)로 구성된 군에서 선택된 브라시카 종인 브라시카 식물.
  19. 제14항에 있어서, 제2 돌연변이된 AHASL 단백질을 포함하는 브라시카 식물.
  20. 제14항에 있어서, 돌연변이 유발된 핵산 분자가 재조합 발현 벡터의 부분인 브라시카 식물.
  21. 제14항에 있어서, 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제에 대해 저항성인 브라시카 식물.
  22. 제21항에 있어서, 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제, 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 제초제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 AHAS-억제성 제초제의 적용에 대해 저항성인 브라시카 식물.
  23. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물을 생산할 수 있는 브라시카 종자.
  24. 제23항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 브라시카 종자.
  25. 제23항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 브라시카 종자.
  26. 제23항에 있어서, AHAS 단백질이 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 것인 브라시카 종자.
  27. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물을 생산할 수 있는 10％ 이상의 종자를 포함하는, 브라시카 종자의 용기.
  28. 제27항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 브라시카 종자의 용기.
  29. 제27항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 브라시카 종자의 용기.
  30. 제27항에 있어서, AHAS 단백질이 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 것인 브라시카 종자의 용기.
  31. 제30항에 있어서, 25개 이상의 종자를 포함하는 용기.
  32. 브라시카 식물이 그의 게놈 내에 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 AHASL 코딩 핵산 분자의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인, 유효량의 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제를 잡초 및 브라시카 식물에 적용하는 것을 포함하는, 브라시카 식물 부근에 있는 잡초를 방제하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 방법.
  35. 제32항에 있어서, AHAS 단백질이 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 것인 방법.
  36. 제32항에 있어서, 브라시카 식물이 브라시카 준세아, 브라시카 나푸스, 브라시카 라파(B. rapa), 브라시카 카리나타(B. carinata), 브라시카 올레라세아(B. oleracea) 및 브라시카 니그라(B. nigra)로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  37. 제32항에 있어서, AHAS-억제성 제초제가 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  38. 제32항에 있어서, 브라시카 식물이 비-트랜스제닉(non-transgenic)인 방법.
  39. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 제초제 저항성 AHAS 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 AHAS 코딩 서열을 포함하는 브라시카 식물인 제1 브라시카 계통을 제2 브라시카 계통과 교배시키는 단계; 및
    종자를 얻는 단계
    를 포함하는, 브라시카 식물을 육종하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 돌연변이 유발된 AHAS 코딩 서열이 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하고, 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 돌연변이 유발된 AHAS 코딩 서열이 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하고, 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 제1 브라시카 계통이
    종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9278 하에 기탁되어 있는, BnCL120C7;
    종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9279 하에 기탁되어 있는, BnCL131A1;
    종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9402 하에 기탁되어 있는, BnCL140B3;
    종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9403 하에 기탁되어 있는, BnCL140C7;
    종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-10321 하에 기탁되어 있는, PM1PM2/BnCL131A1; 및
    PM1PM2/BnCL140B3
    으로 구성된 군에서 선택된 브라시카 계통의 종자로부터 얻은 것인 방법.
  43. 종자의 샘플이 ATCC 기탁 번호 PTA-9278 하에 기탁되어 있는, BnCL120C7로 지정된 브라시카 식물 계통의 종자.
  44. 제43항의 종자로부터 성장된 식물.
  45. 제44항의 식물로부터의 식물 부분.
  46. 제45항에 있어서, 꽃가루, 원형질체, 배주 및 세포로 구성된 군에서 선택된 식물 부분.
  47. 종자의 샘플이 ATCC 기탁 번호 PTA-9279 하에 기탁되어 있는, BnCL131A1로 지정된 브라시카 식물 계통의 종자.
  48. 제47항의 종자로부터 성장된 식물.
  49. 제48항의 식물로부터의 식물 부분.
  50. 제49항에 있어서, 꽃가루, 원형질체, 배주 및 세포로 구성된 군에서 선택된 식물 부분.
  51. 종자의 샘플이 ATCC 기탁 번호 PTA-9402 하에 기탁되어 있는, BnCL140B3으로 지정된 브라시카 식물 계통의 종자.
  52. 제51항의 종자로부터 성장된 식물.
  53. 제52항의 식물로부터의 식물 부분.
  54. 제53항에 있어서, 꽃가루, 원형질체, 배주 및 세포로 구성된 군에서 선택된 식물 부분.
  55. 종자의 샘플이 ATCC 기탁 번호 PTA-9403 하에 기탁되어 있는, BnCL140C7로 지정된 브라시카 식물 계통의 종자.
  56. 제55항의 종자로부터 성장된 식물.
  57. 제56항의 식물로부터의 식물 부분.
  58. 제57항에 있어서, 꽃가루, 원형질체, 배주 및 세포로 구성된 군에서 선택된 식물 부분.
  59. 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌을 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  60. 제59항에 있어서, 브라시카 AHASL 단백질이 AHASL III인, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  61. 제60항에 있어서, 도 3의 BN02-131의 핵산 서열을 갖는, 단리된, 재조합, 돌연변이 유발된 또는 합성 핵산 분자.
  62. 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌을 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물.
  63. 제62항에 있어서, 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9279 하에 기탁되어 있는, 돌연변이체 계통 BnCL131A1의 종자를 성장시켜 얻은 브라시카 식물.
  64. 도 5의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌을 갖는 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물을 생산할 수 있는 브라시카 종자.
  65. 종자의 샘플이 ATCC 접속 번호 PTA-9279 하에 기탁되어 있는, 돌연변이체 계통 BnCL131A1의 종자를 성장시켜 얻은 브라시카 식물인 제1 브라시카 계통을 제2 브라시카 계통과 교배시키는 단계; 및
    종자를 얻는 단계
    를 포함하는, 브라시카 식물을 육종하는 방법.
  66. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 AHAS 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 포함하는 비-트랜스제닉 브라시카 식물.
  67. 제66항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 비-트랜스제닉 브라시카 식물.
  68. 제66항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 비-트랜스제닉 브라시카 식물.
  69. 제65항에 있어서, AHAS 단백질이 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 것인 비-트랜스제닉 브라시카 식물.
  70. 제66항에 있어서, 브라시카 나푸스 및 브라시카 준세아로 구성된 군에서 선택된 브라시카 종인 브라시카 식물.
  71. 제66항에 있어서, 제2 돌연변이된 AHASL 단백질을 포함하는 브라시카 식물.
  72. 제66항에 있어서, 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제에 대해 저항성인 브라시카 식물.
  73. 제72항에 있어서, 이미다졸리논 제초제, 술포닐우레아 제초제, 트리아졸로피리미딘 제초제, 피리미디닐옥시벤조에이트 제초제, 술포닐아미노-카르보닐트리아졸리논 제초제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 AHAS-억제성 제초제의 적용에 대해 저항성인 브라시카 식물.
  74. (a) 서열 23의 A122, P197, R199, T203, A205, W574, S653 및 G654로 구성된 군에서 선택된 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 돌연변이된 AHAS 단백질을 발현하는 돌연변이체 AHAS 유전자를 갖는 식물 세포를 생산하기 위해 AHAS 유전자에 표적화된 돌연변이를 갖는 유전자 복구 올리고뉴클레오베이스를 브라시카 식물 세포에 도입하는 단계; (b) AHAS-억제성 제초제의 존재하에 상응하는 야생형 식물 세포와 비교하여 실질적으로 정상적인 성장을 갖는 식물 세포를 확인하는 단계; 및 (c) 상기 식물 세포로부터 돌연변이된 AHAS 유전자를 갖는 비-트랜스제닉 제초제 관용성 브라시카 식물을 재생시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻은, 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제에 대해 관용성인 비-트랜스제닉 브라시카 식물.
  75. 제74항에 있어서, 유전자 복구 올리고뉴클레오베이스가 혼합된 이중나선 뉴클레오티드 또는 SSMOV인 비-트랜스제닉 브라시카 식물.
  76. 제74항에 있어서, 돌연변이된 AHAS 유전자가 A122 및 S653으로 구성된 군에서 선택된 위치에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 것인 비-트랜스제닉 브라시카 식물.
  77. 제76항에 있어서, 돌연변이된 AHAS 유전자가 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 것인 비-트랜스제닉 브라시카 식물.
  78. 제74항의 비-트랜스제닉 브라시카 식물의 종자.
  79. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 제초제 관용성 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 갖는 제1 브라시카 식물을 제2 브라시카 식물과 교배시키는 단계; 및
    종자를 얻는 단계
    를 포함하는, F1 하이브리드 브라시카 종자를 생산하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 방법.
  81. 제79항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 방법.
  82. 제79항의 방법에 의해 얻은 F1 하이브리드 브라시카 종자.
  83. 도 5의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 AHAS 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자를 포함하는 식물 세포.
  84. 제83항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 식물 세포.
  85. 제83항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 식물 세포.
  86. 제83항에 있어서, 브라시카 식물 세포인 식물 세포.
  87. 제83항에 있어서, 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제에 대해 관용성인 식물 세포.
  88. 제83항에 있어서, 비-트랜스제닉인 식물 세포.
  89. 게놈 내에 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 갖는 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 AHASL 코딩 핵산 분자의 하나 이상의 카피를 포함하는 제1 브라시카 식물을 제2 브라시카 식물과 교배시키는 단계; 및
    교배로부터 생성된 종자를 얻는 단계
    를 포함하는, 식물의 제초제-저항성을 증가시키는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 제1 브라시카 식물 및 제2 브라시카 식물의 교배로부터 얻은 종자로부터 식물을 성장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  91. 제89항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 방법.
  92. 제89항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 방법.
  93. 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이 및 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하는 제초제 관용성 브라시카 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 돌연변이 유발된 핵산 분자 및 관심 단백질을 코딩하는 하나 이상의 추가 핵산 분자를 포함하는 브라시카 식물.
  94. 제93항에 있어서, 서열 23의 위치 A122에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 알라닌의 트레오닌으로의 치환인 브라시카 식물.
  95. 제93항에 있어서, 서열 23의 위치 S653에 상응하는 위치에서의 돌연변이가 세린의 아스파라긴으로의 치환인 브라시카 식물.
  96. 제93항에 있어서, AHAS 단백질이 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 것인 브라시카 식물.
  97. 제93항에 있어서, 하나 이상의 추가 핵산 분자가 AHAS-관용성, 글리포세이트 관용성, 디캄바 관용성, PPO-억제제 관용성, 곤충 저항성, 글루포시네이트 관용성, HPPD-억제제 관용성, 옥신 제초제 관용성 및 질환 저항성으로 구성된 군에서 선택된 관심 형질을 제공하는 관심 단백질을 코딩하는 것인 브라시카 식물.
  98. 제97항에 있어서, 관심 단백질이 AHAS-억제제 관용성을 제공하는 것인 브라시카 식물.
  99. 제98항에 있어서, 관심 단백질이 A122, P197, R199, T203, A205, W574, S653, G654 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 분자를 포함하는 AHAS 단백질인 브라시카 식물.
  100. 제98항에 있어서, AHAS 관용성이 PM1, PM2 및 BR1 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 유전자에 의해 코딩되는 것인 브라시카 식물.
  101. 브라시카 식물이 그의 게놈 내에 서열 23의 A122 및 S653에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 갖는 제초제 저항성 아세토히드록시산 신타제 대형 서브유닛 (AHASL) 단백질을 코딩하는 제1 AHASL 핵산 분자, 및 A122, P197, R199, T203, A205, W574, S653, G654 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 위치에서 돌연변이를 갖는 제2 제초제 저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 하나 이상의 제2 AHASL 핵산 분자의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인, 유효량의 하나 이상의 AHAS-억제성 제초제를 잡초 및 브라시카 식물에 적용하는 것을 포함하는, 브라시카 식물 부근에 있는 잡초를 방제하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 제1 AHASL 핵산 분자가 서열 23의 위치 122에 상응하는 위치에서 트레오닌 및 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 포함하는 AHASL 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  103. 제101항에 있어서, 제2 AHASL 핵산 분자가 서열 23의 위치 653에 상응하는 위치에서 아스파라긴을 갖는 AHASL 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  104. 제101항에 있어서, 브라시카 식물이 그의 게놈 내에 A122, P197, R199, T203, A205, W574, S653, G654 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 위치에서 돌연변이를 갖는 제3 제초제 저항성 AHASL 단백질을 코딩하는 제3 AHASL 핵산 분자의 하나 이상의 카피를 포함하는 것인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 제3 AHASL 핵산 분자가 서열 23의 위치 574에 상응하는 위치에서 트립토판을 갖는 AHASL 단백질을 코딩하는 것인 방법.
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