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CN102216453A - 除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法 - Google Patents

除草剂-抗性的ahas-突变体及使用方法 Download PDF

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CN102216453A CN2009801453449A CN200980145344A CN102216453A CN 102216453 A CN102216453 A CN 102216453A CN 2009801453449 A CN2009801453449 A CN 2009801453449A CN 200980145344 A CN200980145344 A CN 200980145344A CN 102216453 A CN102216453 A CN 102216453A
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Abstract

本发明提供了具有提高的对抑制AHAS的除草剂的耐受性水平的转基因的或非转基因的植物。本发明也提供了编码乙酰羟酸合酶(AHAS)大亚基的突变体的核酸，表达载体，包含编码含有1、2或更多个突变的AHASL亚基的核酸的植物，包含这样的AHASL亚基突变型核酸的植物，制备和使用它们的方法，和控制杂草的方法。

Description

除草剂-抗性的AHAS-突变体及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年9月26日提交的美国临时申请号 61/100,541的利益，其整个内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及除草剂-抗性的芸苔属植物、和编码抑制AHAS的除草剂-抗性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的新颖的多核苷酸序列、这样的植物的种子、和使用这样的植物的方法。
背景技术
乙酰羟酸合酶(AHAS； EC 4.1.3.18，也称作乙酰乳酸合酶或ALS)是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物化学合成的第一个酶(Singh (1999) “Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine”, Plant Amino Acid, Singh, B.K., 编, Marcel Dekker Inc. New York, New York, 第227-247页)。AHAS是5个结构上不同的除草剂家族的作用位点，所述除草剂家族包括磺酰脲类 (Tan 等人 (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57； Mallory-Smith和Retzinger (2003) Weed Technology 17:620–626； `LaRossa和Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161)、咪唑啉酮类(Shaner 等人 (1984) PlantPhysiol. 76:545-546)、三唑并嘧啶类(Subramanian和Gerwick (1989) “Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines,” 见Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R.和Sonnet, P.E.. 编, ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C.,第277-288页)； Tan 等人 (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57； Mallory-Smith和Retzinger (2003) Weed Technology 17:620–626) ；磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类 (Tan 等人 (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57； Mallory-Smith和Retzinger (2003) Weed Technology 17:620–626)；和N-磺酰基氨基羰基类。由于它们在非常低的施用率时的有效性和在动物中的相对无毒性，咪唑啉酮和磺酰脲除草剂被广泛地用于现代农业。通过抑制AHAS活性，这些除草剂家族阻止易感植物（包括许多杂草物种）的进一步生长和发育。
为了使农夫对他们使用的咪唑啉酮和磺酰脲除草剂的类型和频率具有更大的灵活性，经常需要更强的除草剂耐受性。另外，开发除草剂耐受品种的植物育种者希望利用提供更大除草剂耐受性的突变，使他们在用于开发他们的品种的种质背景中具有更大的灵活性。为了生产这样的抑制AHAS的除草剂-抗性的品种，植物育种者需要开发额外的育种系，优选具有增加的抑制AHAS的除草剂抗性。因而，需要农作物植物的额外的抑制AHAS的除草剂-抗性的育种系和品种、以及用于生产和使用抑制AHAS的除草剂-抗性的育种系和品种的方法和组合物。
发明内容
本发明提供了编码乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的分离的核酸分子，所述蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了表达载体，其包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的分离的核酸分子，所述蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了芸苔属植物，其包含编码除草剂耐受性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了能生成芸苔属植物的芸苔属种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了芸苔属种子的容器，其中所述容器包含至少10%的能生成芸苔属植物的种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。在另一个实施方案中，本发明提供了控制在芸苔属植物附近的杂草的方法，所述方法包括，将有效量的抑制AHAS的除草剂施用给杂草和芸苔属植物，其中所述芸苔属植物在它的基因组中包含诱变过的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL) 的编码核酸分子的至少一个拷贝，所述核酸分子编码除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
本发明也提供了育种芸苔属植物的方法，其中所述方法包括: 使第一个芸苔属系与第二个芸苔属系杂交，其中所述第一个芸苔属系是通过栽培突变型芸苔属系的种子得到的芸苔属植物；并得到种子。这样的突变型芸苔属系包括BnCL120C7，所述种子的样品已经在ATCC 登记号PTA-9278下保藏；BnCL131A1，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9279下保藏；BnCL140B3，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9402下保藏；和BnCL140C7，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9403下保藏。
也提供了命名为下述名称的突变型芸苔属植物系的种子：BnCL120C7，所述种子的样品已经在ATCC 登记号PTA-9278下保藏；BnCL131A1，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9279下保藏；BnCL140B3，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9402下保藏；和BnCL140C7，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9403下保藏；PM1PM2/BnCL131A1，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-10321下保藏。
本发明也提供了编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的分离的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸。
本发明另外提供了包含突变的核酸分子的芸苔属植物，所述核酸分子编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸。
另外，本发明提供了能生成芸苔属植物的芸苔属种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸。
本发明另外提供了育种芸苔属植物的方法，其中所述方法包括: 使第一个芸苔属系与第二个芸苔属系杂交，其中所述第一个芸苔属系是通过培养突变系BnCL131A1的种子（所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9279下保藏）得到的芸苔属植物；并得到种子。
本发明也提供了非转基因的芸苔属植物，其包含编码AHAS蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
也提供了用于生产耐受至少一种抑制AHAS的除草剂的非转基因的芸苔属植物的方法，所述方法包括：(a) 向芸苔属植物细胞中导入在AHAS基因中具有定向突变的基因修复寡核碱基（oligonucleobase），以生成具有突变型AHAS基因的植物细胞，所述突变型AHAS基因表达在一个或更多个氨基酸位置处被突变的AHAS蛋白，所述位置与选自SEQ ID NO: 23的A122、R199、T203、S653和G654的位置相对应；(b) 在有抑制AHAS的除草剂存在下，鉴别与对应的野生型植物细胞相比具有基本上正常生长的植物细胞；和(c) 从所述植物细胞再生非转基因的除草剂耐受性的具有突变的AHAS基因的芸苔属植物。
另外提供了用于生产F1杂种芸苔属种子的方法，所述方法包括，使第一种芸苔属植物与第二种芸苔属植物杂交，所述第一种芸苔属植物具有编码除草剂耐受性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变；并得到种子。
也提供了植物细胞，其包含编码AHAS蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
也提供了用于增加植物的除草剂-抗性的方法，所述方法包括，使第一种芸苔属植物与第二种芸苔属植物杂交，其中所述第一种芸苔属植物在它的基因组中包含诱变过的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)的编码核酸分子的至少一个拷贝，所述核酸分子编码除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变；并得到由杂交产生的种子。
另外，提供了包含诱变过的核酸分子和至少一种编码目标蛋白的其它核酸分子的芸苔属植物，所述诱变过的核酸分子编码除草剂耐受性的芸苔属AHASL蛋白，所述除草剂耐受性的芸苔属AHASL蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
另外提供了控制在芸苔属植物附近的杂草的方法，所述方法包括，将有效量的至少一种抑制AHAS的除草剂施用给杂草和芸苔属植物，其中所述芸苔属植物在它的基因组中包含第一种AHASL核酸分子的至少一个拷贝和至少一个第二种AHASL核酸分子，所述第一种AHASL核酸分子编码除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的A122和S653相对应的氨基酸位置处的突变，所述第二种AHASL核酸分子编码第二种除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有选自下述的突变：A122T、P197S、A205V、W574L、S653N及其组合。
附图说明
图1提供了芸苔属幼苗提取物中的AHAS活性的图示。
图2提供了野生型芸苔属植物和含有本发明的突变的核酸分子的芸苔属植物的一个实例的除草剂喷雾分析的结果。
图3提供了本发明的核酸分子(分别是SEQ ID NO 11-16，按照出现的次序)之间的核酸序列比对。
图4提供了本发明的AHAS蛋白(分别是SEQ ID NO 17-21，按照出现的次序)之间的氨基酸序列比对。
图5提供了具有图5所述氨基酸序列的拟南芥AHASL蛋白的核酸和氨基酸序列。DNA序列公开为SEQ ID NO: 22，氨基酸序列公开为SEQ ID NO: 23。
具体实施方式
本公开内容涉及来自抑制AHAS的除草剂-抗性的植物的编码突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)蛋白的分离的核苷酸和与其有关的方法。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子编码这样的AHAS蛋白，其相对于野生型(即未突变的) 欧洲油菜AHAS序列具有一个或更多个氨基酸置换。本公开内容也提供了包含这样的核酸分子的重组载体、以及含有这样的载体和核酸分子的转基因植物。
本公开内容也提供了非转基因植物，其包含突变的AHAS编码序列，例如，诱变过的AHAS III编码序列，所述序列相对于野生型序列具有2个或更多个氨基酸置换。突变的AHAS编码序列可以具有在与拟南芥属AHAS蛋白序列 (图5； SEQ ID NO: 23)的位置122相对应的位置处和与位置653相对应的位置处的氨基酸置换。也提供了制备这样的植物的方法和使用这样的植物的育种方法。
在有些实施方案中，本发明的植物、种子、方法和组合物使用编码具有突变的AHAS蛋白的核酸分子，所述突变导致具有在与位置122相对应的位置处的丙氨酸-至-苏氨酸置换和在与位置653相对应的位置处的丝氨酸-至-天冬酰胺置换的AHAS蛋白(在本文中有时也称作CLB-1)的表达。在其它实施方案中，本发明的植物、种子、方法和组合物使用编码具有突变的AHAS蛋白的核酸分子，所述突变导致具有在与位置122相对应的位置处被置换的选自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸和在与位置653相对应的位置处被置换的选自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸的AHAS蛋白的表达。
也提供了控制杂草的方法，其中使用含有本文提供的突变的AHAS序列的转基因植物和非转基因植物。
另外，本申请提供了在本文中称作BnCL120C7、BnCL131A1、BnCL140B3、BnCL140C7的除草剂-抗性的芸苔属系，以及使用下面详细描述的诱变方法生产的其种子、后代和衍生物。
本发明也提供了增强的除草剂耐受性和用于得到增强的除草剂耐受性的方法，这通过在单个AHAS编码序列中组合AHAS突变来实现。在一个实施例中，组合与拟南芥属AHAS蛋白序列 (图5； SEQ ID NO: 23)的位置 A122和S653相对应的突变的植物表现出这样的增强的除草剂耐受性。得到的除草剂耐受性显著增强，例如，具有协同效应，超过了当将在单独地含有与位置 A122或S653相对应的任一个突变的植物中获得的耐受性水平加到一起时观察到的耐受性水平。
在更详细地描述本发明之前，首先定义下面的术语。
定义
“除草剂-耐受的”或“除草剂-抗性的”植物是指这样的植物，其能耐受或抵抗至少一种抑制AHAS的除草剂，所述除草剂的水平通常会杀死或抑制缺少突变的AHAS核酸分子的正常的或野生型植物的生长。“除草剂-抗性的AHAS核酸分子”是指包含一个或更多个突变的核酸分子，所述突变导致相对于未突变的AHAS蛋白的一个或更多个氨基酸置换，其中所述突变导致除草剂-抗性的AHAS蛋白的表达。“除草剂-耐受的AHAS蛋白”或“除草剂-抗性的AHAS蛋白”是指，当存在已知会干扰AHAS活性的至少一种除草剂、且在已知会抑制野生型AHAS蛋白的AHAS活性的除草剂浓度或水平时，与野生型AHAS蛋白的AHAS活性相比，这样的AHAS蛋白表现出更高的AHAS活性。此外，这样的除草剂-耐受的或除草剂-抗性的AHAS蛋白的AHAS活性在本文中可以称作“除草剂-耐受的”或“除草剂-抗性的” AHAS活性。
对于本发明，术语“除草剂-耐受的”和“除草剂-抗性的” 互换使用，且意在具有等效的含义和等效的范围。类似地，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”互换使用，且意在具有等效的含义和等效的范围。同样地，术语“咪唑啉酮-抗性的”和“咪唑啉酮-抗性” 可互换使用，且意在分别具有与术语“咪唑啉酮-耐受的”和“咪唑啉酮-耐受性”等效的含义和等效的范围。使用在Singh, 等人 Anal. Biochem., (1988), 171: 173-179中公开的方法，通过在有诸如甲氧咪草烟（imazamox）等AHAS 抑制剂存在下，对比从来自含有诱变过的AHAS序列的植物和来自缺少诱变过的AHAS序列的植物的细胞提取物的AHAS活性，可以测量“除草剂抗性”或“除草剂耐受性”。在一个实施方案中，当使用100 μM 甲氧咪草烟测定时，使用在Singh 等人 (1988)中公开的方法，抗性的或耐受性的植物表现出大于25%未抑制。
“分离的”或“纯化的”核酸分子或蛋白或其生物活性部分大体上或基本上不含这样的组分，所述组分通常与核酸分子或蛋白相伴随或相互作用（当在它的天然存在环境中发现时）。因此，分离的或纯化的核酸分子或蛋白，基本上不含其它细胞材料或培养基（当通过重组技术生产时），或基本上不含化学前体或其它化学物质（当化学合成时）。在一个实施方案中，“分离的”核酸基本上不含这样的序列（优选地，蛋白编码序列），其在该核酸所来源的生物体的基因组DNA中天然地侧接该核酸（即，位于该核酸的5’和3’末端的序列）。例如，在不同的实施方案中，分离的核酸分子可包含小于约5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在该核酸所来源的细胞的基因组DNA中天然地侧接该核酸分子。在有些实施方案中，分离的核酸分子侧接它的天然基因组序列，它们控制它在细胞中的表达，例如，天然的启动子或天然的3’ 非翻译区。基本上不含细胞材料的蛋白包括具有低于大约30%、20%、10%、5%或1%（按干重计算）的污染性蛋白的蛋白制剂。当重组生产本发明的蛋白或其生物活性部分时，优选地，培养基具有低于大约30%、20%、10%、5%或1%（按干重计算）的化学前体或非目标蛋白的化学物质。
术语“野生型”用于表示可以在自然界中发现的核酸分子或蛋白，其不同于由人类人工地生产的或突变的。在一个实施方案中，“野生型” AHAS核酸序列是指图3中的BN-02的核酸序列。类似地，野生型芸苔属植物是指具有图3中的BN-02的核酸序列的芸苔属植物。该术语也用于表示含有图3中的BN-02的AHAS核酸序列的植物。术语“野生型”的使用无意必然地暗示，该植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在它的基因组中缺少重组DNA，和/或不具有不同于本文公开的那些的除草剂-抗性的特征。
“突变的”分子或“突变型分子”或“诱变过的”分子，诸如核酸分子或氨基酸分子，是指与未突变的或野生型分子的等效位置处的核酸或氨基酸相比，具有一个或更多个核酸或氨基酸置换、缺失或颠换的核酸分子或多肽。该术语表示从它的天然的或野生型形式修饰而成的核酸分子或多肽分子（作为故意人操作的结果），且不包括天然序列。
本文使用的术语“协同”、“协同的”和其衍生词（诸如在“协同效应”中）表示这样的情况，其中2个或更多个突变的AHAS 多肽的组合和/或单个编码序列中的突变的组合（诸如编码具有在与位置 A122和S653相对应的位置处的突变的AHAS 多肽的AHAS核酸分子）的生物活性，比具有单个突变的AHAS 多肽的生物活性的总和大至少10%。通过在用诸如甲氧咪草烟等抑制AHAS的除草剂处理之后15天，对比含有本发明的诱变过的分子的植物的损伤率和含有各个突变的植物的复合损伤率，可以测量AHAS 多肽的生物活性。
“等效位置”或“对应位置”表示在与参照氨基酸位置相同的保守区域中的位置。例如，关于AHAS蛋白序列，本文公开的氨基酸位置对应着在具有图5所示的氨基酸序列(图5； SEQ ID NO: 23)的拟南芥AHASL蛋白中的氨基酸位置。除非本文中另外指出，特定氨基酸位置表示在图5所示的全长拟南芥AHASL氨基酸序列(SEQ ID NO: 23)中的该氨基酸的对应位置。此外，实际氨基酸位置可以随是否添加或删除氨基酸（例如，从氨基酸序列的N-端）而异，但是，通过与诸如图5 (SEQ ID NO: 23)等参照序列的比对，仍然可以确定等效位置。因而，本发明包括在所述位置或等效位置(例如，“氨基酸位置653或等效位置”)处的氨基酸置换。
“片段”是指编码AHASL蛋白的核苷酸序列的一部分或本发明的AHAS蛋白的氨基酸序列的一部分。本发明的AHASL核苷酸序列的片段可以编码AHASL蛋白的生物活性部分，或它可以是使用下述方法用作杂交探针或PCR引物的片段。AHAS多肽的片段可以包括AHAS蛋白的生物活性片段。
术语“生物活性片段和变体”是指包含或编码AHAS活性的例证的核酸分子和多肽的片段和变体。
本文使用的术语“调节元件”是指能调节可操作地连接的核酸的转录和/或翻译的核酸。调节元件包括、但不限于：启动子、增强子、内含子、5’ UTR和3’ UTR。术语“可操作地连接的”是指调节元件和第二种核酸之间的功能连接，其中所述调节元件序列参与控制第二种核酸序列的表达，例如启动和/或介导与第二个序列相对应的DNA序列的转录和/或翻译。通常，可操作地连接的是指，被连接的核酸序列是连续的，且在必要时，连接邻近的且在相同读码框中的两个蛋白编码区。
本文使用的术语“转基因的”是指含有至少一个重组核酸分子的全部或一部分的任意细胞、组织、植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。
核酸分子
在一个方面，本发明涉及与乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)序列有关的分离的核酸分子，所述AHASL序列包含相对于它来源的野生型 (即天然的)核酸序列具有突变的核酸序列，以及包含这样的突变的这种序列的片段。这样的分离的核酸序列包括图3和4的那些。在另一个方面，本公开内容涉及包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码相对于野生型蛋白具有突变的AHASL蛋白，其能提供对抑制AHAS的除草剂的耐受性或增强的抗性水平，还涉及这样的突变型AHASL蛋白。在一个实施方案中，所述AHASL编码序列是突变的芸苔属AHASL编码序列, 例如相对于野生型序列含有2个突变的欧洲油菜AHAS III编码序列。在另一个实施方案中，本发明提供了编码除草剂-抗性的芸苔属AHASL III蛋白的核酸分子的分离和其核苷酸序列，其来自通过诱变野生型芸苔属植物生产的除草剂-抗性的芸苔属植物。
所述核酸分子可以源自任意来源，诸如植物或细菌来源。在一个实施方案中，所述核酸分子源自植物来源，诸如芸苔属植物。从芸苔属植物衍生出的核酸分子可以源自任意芸苔属物种，包括欧洲油菜(B. napus)、芜菁(B. rapa)或芥菜(B. juncea)。这样的核酸分子可以源自任意的AHAS编码序列，诸如AHAS I、AHAS II或AHAS III。在一个实施方案中，所述核酸分子在核酸序列中包含突变，所述突变是在与从AHASL编码序列的ATG 起始密码子算起的氨基酸位置 122 (例如 GCT→ACT)和/或653 (例如 AGT→AAT)处的密码子序列相对应的位置。但是，在本公开内容的范围内，在与氨基酸位置 122和653相对应的位置处，可以产生任意突变。
此外，在AHAS序列的位置 122和653处的突变可以导致AHAS蛋白的表达，所述AHAS蛋白具有在与位置122相对应的位置处的非丙氨酸的任意氨基酸或在与位置653相对应的位置处的非丝氨酸的任意氨基酸。在一个实施方案中，在与位置 122和653相对应的位置处的突变可以是保守氨基酸置换，而在其它实施方案中，所述置换可以分别是在位置 122和653处的苏氨酸或天冬酰胺的保守置换。在另一个实施方案中，在与位置122相对应的位置处的突变导致选自苏氨酸和缬氨酸的氨基酸在该位置处的表达。在另一个实施方案中，在与位置653相对应的位置处的突变导致天冬酰胺氨基酸的表达。在一个实施方案中，由本发明的核酸分子编码的AHAS蛋白包含在与AHASL基因的位置653(基于拟南芥编号)相对应的位置处的丝氨酸-至-天冬酰胺置换 (例如 S653N)和在与位置122相对应的位置处的丙氨酸-至-苏氨酸置换(例如 A122T)。但是，在本公开内容的范围内，可以在这些位置产生任意氨基酸置换，包括保守氨基酸置换。本发明另外公开了编码野生型芸苔属AHASL蛋白的核酸分子的分离和其核苷酸序列。
在有些实施方案中，本发明的核酸分子编码具有突变的AHAS蛋白，所述突变导致具有在与位置122相对应的位置处的丙氨酸-至-苏氨酸置换和在与位置653相对应的位置处的丝氨酸-至-天冬酰胺置换的AHAS蛋白的表达。在其它实施方案中，所述核酸分子编码具有突变的AHAS蛋白，所述突变导致具有在与位置122相对应的位置处被置换的选自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸和在与位置653相对应的位置处被置换的选自精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的氨基酸的AHAS蛋白的表达。
本发明的诱变过的AHAS 多肽序列可以表现出对任意抑制AHAS的除草剂的抗性或耐受性。这样的诱变过的AHAS 多肽序列可以是对至少一种抑制AHAS的除草剂抗性的或耐受性的。在一个实施方案中，本发明的诱变过的AHAS 多肽序列表现出对选自咪唑啉酮除草剂和磺酰脲除草剂的抑制AHAS的除草剂的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，本发明的诱变过的AHAS 多肽序列表现出对咪唑啉酮除草剂的抗性或耐受性。
在有些实施方案中，具有在与位置 A122和S653相对应的位置处的突变的诱变过的AHAS序列会提供协同的除草剂耐受性水平。在一个实施方案中，与在含有具有各个单个突变的AHAS序列的植物中观察到的耐受性累加水平相比，在含有本发明的双突变型AHAS序列的植物中得到的除草剂耐受性水平高了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。在具有在与位置 A122和S653相对应的氨基酸位置处的突变的诱变过的AHAS序列与一个或更多个额外的编码AHAS-抑制剂耐受性AHAS蛋白的诱变过的或重组的AHAS序列的组合的植物中，也可以得到这样的协同的除草剂耐受性水平。
还公开了编码欧洲油菜 AHAS III蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与位置122相对应的位置处的丙氨酸-至-苏氨酸置换(A122T)。在一个实施方案中，这样的核酸分子 也在核酸序列中含有第二种突变，例如在编码在与位置653相对应的位置处的丝氨酸-至-天冬酰胺置换 (S653N)的核酸分子中。
本公开内容也提供了具有在图3和4中所述的BN02-120或BN02-131的核酸序列的分离的核酸分子、及其片段和变体。
本公开内容也提供了编码来自芸苔属的AHASL蛋白的分离的核酸分子，其具有一个或更多个核酸置换，所述核酸置换导致具有一个或更多个氨基酸置换的AHAS蛋白的表达。例如，本发明提供了分离的核酸分子，其包含：在图3和4中所述的BN02-120或BN02-131的核苷酸序列，编码包含由图4所述的BN02-102或BN02-131鉴别出的氨基酸序列的AHASL蛋白的核苷酸序列，图3所述的核苷酸序列，编码包含由图4中的BN02-120或BN02-131所述的氨基酸序列的AHASL蛋白的核苷酸序列，和编码功能性AHASL蛋白的这样的核苷酸序列的片段和变体。
除了与位置 122和/或653相对应的那些突变以外，本发明的诱变过的AHAS序列包括具有任意数目的突变的那些。例如，所述诱变过的AHAS序列可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个额外的突变，它们可以是沉默突变，或提供对相同或其它种类的抑制AHAS的除草剂的抗性或耐受性。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码图3和4所示的氨基酸序列的核苷酸序列的分离的核酸分子，以及它们的编码具有AHAS活性的多肽的片段和变体。另外提供了具有由本文所述的核酸分子（例如在图3和4中所述的核苷酸序列(鉴别为BN02-120或BN02-131)）编码的氨基酸序列的多肽，和它们的编码包含AHAS活性的多肽的片段和变体。
本发明也提供了AHASL蛋白，其具有在本文公开的芸苔属AHASL蛋白的保守区域内的鉴别的氨基酸位置处的氨基酸置换。
本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白组合物。
本发明提供了包含突变的AHAS蛋白的分离的多肽。所述分离的多肽包含选自下述的氨基酸序列：图4所述的BN02-120或BN02-131的氨基酸序列，由图3所述的核苷酸序列 BN02-120或BN02-131编码的氨基酸序列，氨基酸序列，和编码包含AHAS活性的AHAS 多肽的所述氨基酸序列的功能片段和变体。
公开的核酸分子可以用于核酸构建体中，所述核酸构建体用于转化植物，例如，农作物植物，诸如芸苔属植物。在一个实施方案中，含有本公开内容的核酸分子的这种核酸构建体可以用于生产转基因植物，以提供对除草剂的抗性，所述除草剂例如已知会抑制AHAS活性的除草剂，诸如咪唑啉酮除草剂。所述核酸构建体可以用于表达盒、表达载体、转化载体、质粒等中。用这样的构建体转化后得到的转基因植物表现出增加的对抑制AHAS的除草剂（例如，咪唑啉酮和磺酰脲除草剂）的抗性。
因而，本发明包括AHASL核酸分子和其片段和变体。本发明也包括作为这些核苷酸序列的片段的核酸分子。在一个实施方案中，与来自野生型序列的对应序列相比，所述片段包含至少一个突变的序列。可以如下制备AHAS蛋白的生物活性部分：分离本发明的AHAS核苷酸序列之一的一部分，表达编码的AHAS蛋白的部分 (例如，通过在体外重组表达)，并评估编码的AHAS蛋白的部分的活性。作为AHAS核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900个核苷酸，或高达在本文公开的全长核苷酸序列中存在的核苷酸的数目，这取决于预期用途。
编码本发明的AHAS蛋白的生物活性部分的AHAS核苷酸序列片段至少编码约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225或250 个连续氨基酸，或高达在本发明的全长AHAS蛋白中存在的氨基酸总数。可用作PCR引物的杂交探针的AHAS核苷酸序列片段通常不需要编码AHAS蛋白的生物活性部分。在一个实施方案中，AHAS序列的片段包括一个或更多个本文公开的突变。
本发明还包括作为本文公开的核苷酸序列的变体的核酸分子。本发明的AHAS核苷酸序列的“变体”包括这样的序列，其编码本文公开的AHAS 蛋白，但由于遗传密码的简并性而保守地不同。使用熟知的分子生物学技术，例如下面概述的聚合酶链式反应（PCR）和杂交技术，可以鉴定这些天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括合成地衍生出的核苷酸序列，其如下所述已经通过例如使用定点诱变而产生，但仍编码在本发明中公开的AHAS蛋白。一般地，本发明的核苷酸序列变体会与本文公开的特定核苷酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。变体AHAS核苷酸序列分别编码具有这样的氨基酸序列的AHAS蛋白，所述氨基酸序列与本文公开的AHAS蛋白的氨基酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
此外，技术人员还会认识到，可通过突变向本发明的核苷酸序列中引入变化，从而导致所编码的AHAS蛋白的氨基酸序列的变化，而不改变AHAS蛋白的生物活性。因此，通过向本文公开的对应核苷酸序列中引入一个或更多个核苷酸置换、添加或缺失，从而将一个或更多个氨基酸置换、添加或缺失引入所编码的蛋白中，可以产生编码AHAS蛋白的分离的核酸分子，所述核酸分子具有不同于图3所述的BN02-120或BN02-131的序列的序列。通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变和本文所述的那些，可以导入突变。本发明还包括这样的变体核苷酸序列。
例如，在一个实施方案中，可在一个或更多个预测的非必需的氨基酸残基处进行保守氨基酸置换。“非必需的”氨基酸残基是可从AHAS蛋白的野生型序列(例如，图5的序列 (SEQ ID NO: 23))进行改变而不改变生物活性的残基，而“必需的”氨基酸残基是生物活性所必需的。“保守氨基酸置换”是这样的置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。在本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸（例如，门冬氨酸、谷氨酸）、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸（例如，，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。不对保守氨基酸残基或存在于保守基序中的氨基酸残基进行这样的置换。
可以以许多途径来改变本发明的蛋白，包括氨基酸置换、缺失和插入。用于这样的操作的方法在本领域中是普遍已知的。例如，通过DNA中的突变，可以制备AHAS蛋白的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492； Kunkel 等人 (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382； 美国专利号4,873,192； Walker和Gaastra, 编 (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)和其中引用的参考文献。关于不影响目标蛋白的生物活性的合适氨基酸置换的指南，可以参见Dayhoff等人, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)的模型，所述参考文献通过引用并入本文。保守置换，例如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸互换，可以是优选的。
或者，通过沿着AHAS编码序列的全部或一部分随机地引入突变（例如通过饱和诱变），可以制得变体AHAS核苷酸序列，并可以就AHAS活性对所得的突变体进行筛选，以鉴定保留了AHAS活性（包括除草剂-抗性的AHAS活性）的突变体。诱变后，可重组地表达所编码的蛋白，并可使用标准测定技术来确定蛋白的活性。
因此，本发明的核苷酸序列包括本文公开的序列及其片段和变体。本发明的AHASL核苷酸序列及其片段和变体可用作探针和/或引物。这样的探针可用于检测编码相同或同一蛋白的转录物或基因组序列。
以该方式，可使用诸如PCR、杂交等方法来鉴定具有与本发明的序列相当大同一性的此类序列。参见，例如，Sambrook等人, (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)，和Innis等人, (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)。本发明包括基于其与本文所示的AHAS核苷酸序列或其片段和变体的序列同一性而分离的AHASL核苷酸序列。
在杂交方法中，已知的AHAS核苷酸序列的全部或一部分可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建这样的cDNA和基因组文库的方法在本领域中是普遍已知的，并公开于Sambrook等人, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)中。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并可以用可检测的基团（例如32P）或任何其它可检测的标记物（例如其它放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子）进行标记。通过标记基于本文公开的已知AHAS核苷酸序列的合成的寡核苷酸，可以制备用于杂交的探针。另外可以使用简并引物，所述简并引物是基于在已知的AHAS核苷酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计。探针通常包含这样的核苷酸序列区域，其在严格条件下与本发明的AHAS核苷酸序列或其片段或变体的至少约12、优选约25、更优选约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800或900个连续核苷酸杂交。用于杂交的探针的制备在本领域中是普遍已知的，并公开于Sambrook 等人 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)，该文献通过引用并入本文。
例如，本文公开的完整的突变的AHAS核酸序列或者其一个或更多个部分可用作能够特异性地与对应AHAS序列和信使RNA杂交的探针。杂交技术包括涂板的DNA文库的杂交筛选(斑或集落； 参见，例如，Sambrook等人, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
可在严格条件下进行此类序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，在该条件下，探针与其靶序列的杂交程度将会比与其它序列的杂交程度可检测地更高（例如，为背景的至少2倍高）。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下是不同的。
在一个实施方案中，严格条件是这样的，其中，在pH 7.0至8.3时，盐浓度是小于约1.5 M Na离子，通常为约0.01至1.0 M Na离子浓度（或其它盐），并且对于短探针（例如，10至50个核苷酸），温度为至少约30℃，且对于长探针（例如，大于50个核苷酸），温度为至少约60℃。还可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来获得严格条件。示例性的低严格条件包括，在37℃使用30-35%的甲酰胺、1 M NaCl、1% SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液进行杂交，和在50-55℃在1×至2×SSC（20×SSC＝3.0 M NaCl/0.3 M柠檬酸三钠）中进行洗涤。示例性的中等严格条件包括，在37℃在40-45%的甲酰胺、1.0 M NaCl、1% SDS中进行杂交，和在55-60℃在0.5×至1×SSC中进行洗涤。示例性的高严格条件包括，在37℃在50%的甲酰胺、1 M NaCl、1% SDS中进行杂交，和在60-65℃在0.1×SSC中进行洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1%至约1% SDS。杂交的持续时间通常小于约24小时，通常为约4至约12小时。
特异性通常随杂交后洗涤而变化，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，可根据Meinkoth和Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267-284的公式：Tm＝81.5℃＋16.6（log M）＋0.41（%GC）－0.61（%form）－500/L，估算出Tm；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，且L是以碱基对表示的杂交物的长度。Tm是这样的温度（在确定的离子强度和pH下），即在该温度下，50%的互补靶序列与完美匹配的探针杂交。对于每1%的错配，Tm下降约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以与具有所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有>90%的同一性的序列，那么可将Tm下降10℃。一般地，选择严格条件，以使其比在确定的离子强度和pH下特定序列与其互补序列的热解链点(Tm)低约5℃。然而，非常严格条件可在比热解链点（Tm）低1、2、3或4℃下进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可在比热解链点（Tm）低6、7、8、9或10℃下进行杂交和/或洗涤；低严格条件可在比热解链点（Tm）低11、12、13、14、15或20℃下进行杂交和/或洗涤。使用公式、杂交和洗涤组合物、以及想要的Tm，普通技术人员将会理解，内在地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格度的变化。如果想要的错配程度导致低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液）的Tm，则优选地增加SSC浓度，以可以使用更高的温度。关于核酸的杂交的详尽指导，可以参见Tijssen, (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, 第1部分, 第2章(Elsevier, New York)； 和Ausubel等人编 (1995) Current Protocols in Molecular Biology, 第2章（Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York）。参见Sambrook等人, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York）。
本发明的核酸分子和蛋白包括，包含与图3和4所述的BN02-120或BN02-131的核苷酸序列充分同一的核苷酸或氨基酸序列的核酸分子和蛋白。术语“充分同一的”在本文中用于表示这样的第一氨基酸或核苷酸序列，其相对于第二氨基酸或核苷酸序列而言包含足够或最少数目的相同的或等同的（例如，具有相似的侧链）氨基酸残基或核苷酸，这样第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含具有至少约45%、55%或65%同一性、优选75%的同一性、更优选85%、95%或98%的同一性的共同结构域的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定义为充分同一的。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比随这些序列共有的相同位置的数目而变化（即，同一性百分比＝相同位置的数目/位置的总数（例如，重叠位置）×100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。使用与下面描述的技术相似的技术，可以确定两个序列之间的同一性百分比，其中允许或不允许缺口。在计算同一性百分比时，一般计算准确匹配的数目。
可使用数学算法来确定两个序列之间的同一性百分比。用于两个序列的比较的数学算法的优选的非限定性实例是Karlin和Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264的算法，在Karlin 和Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877中改进的算法。将此类算法整合入Altschul等人, (1990) J. Mol. Biol. 215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可使用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12，来进行BLAST核苷酸搜寻，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可使用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3，来进行BLAST蛋白搜寻，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对（gapped alignment），可以如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389中所述使用Gapped BLAST。或者，可使用PSI-Blast来进行可检测分子之间远缘关系的迭代搜寻。参见Altschul等人, （1997）, 同上。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各自程序（例如，XBLAST和NBLAST）的缺省参数。用于序列比较的数学算法的另一个优选并且非限定性实例是Myers和Miller, (1988) CABIOS 4:11-17的算法。将此类算法整合入ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表（PAM120 weight residue table）、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。也可通过目检而人工地进行比对。
除非另外指出，本文提供的序列同一性/相似性值是指使用本发明的全长序列和使用多重比对而获得的值，所述多重比对使用软件包Vector NTI Advance 10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中包含的程序AlignX（使用缺省参数）或其任何等同的程序，通过算法Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994)来进行。“等同的程序”意指任何序列比较程序，其对于所研究的任何两个序列，当与由软件包Vector NTI Advance 10中的AlignX产生的对应比对进行比较时，产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。
本发明的突变型AHASL蛋白包括公开的蛋白以及其变异和经修饰的形式。这样的变体将继续拥有希望的AHAS突变型活性。在一个实施方案中，在编码变体蛋白的核酸分子中的这种突变必须不能将序列置于读码框之外，且优选地将不形成可产生二级mRNA结构的互补区。参见，欧洲专利申请公开号75,444。
在一个实施方案中，本发明的序列编码具有AHAS活性的蛋白。通过AHAS活性筛选，诸如在Singh 等人 (1988) Anal. Biochem. 171:173-179（它通过引用并入本文）中公开的方法，可以评价这种活性。
变体核苷酸序列和蛋白还包括从致诱变的和致重组的过程（例如DNA重排）而衍生出的序列和蛋白。通过这样的过程，可操作一个或更多个不同的AHASL编码序列，以产生具有想要的特性的新的AHASL蛋白。以此方式，从一群相关序列核酸产生重组核酸的文库，所述相关序列核酸包含具有相当大序列同一性且可在体外或体内进行同源重组的序列区域。例如，使用该方法，可在本发明的AHASL基因和其它已知AHASL基因之间重排编码目标结构域的序列基序，以获得编码具有改进的目标性质（例如在酶的情况下，增加的Km）的蛋白的新基因。用于这样的DNA重排的策略在本领域中是已知的。参见，例如，Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751； Stemmer (1994) Nature 370:389-391； Crameri 等人 (1997) Nature Biotech. 15:436-438； Moore 等人 (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347； Zhang 等人 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509； Crameri 等人 (1998) Nature 391:288-291；和美国专利号5,605,793和5,837,458。
本发明的核苷酸序列可用于分离来自其它生物、特别是其它植物、更特别是其它双子叶植物的对应序列。以此方式，使用诸如PCR、杂交等方法，基于它们与本文所示序列的序列同源性，可以鉴定这样的序列。本发明包括基于它们与本文所示的完整的AHASL序列或其片段的序列同一性而分离的序列。因此，本发明包括分离的序列，其编码AHASL蛋白，并在严格条件下与本文公开的序列或其片段杂交。
在PCR方法中，可设计用于PCR反应的寡核苷酸引物，以从提取自任何目标植物的cDNA或基因组DNA扩增对应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中是普遍已知的，并公开于Sambrook等人, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。还可参见Innis等人编 (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)； Innis和Gelfand, 编(1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)； 以及Innis和Gelfand编(1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)。已知的PCR的方法包括，但不限于，使用成对引物、嵌套引物、单一特异性引物（single specific primers）、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
构建体
本发明的核酸分子可以用于生产重组核酸构建体。在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以用于制备核酸构建体，例如，用于在目标植物中进行表达的表达盒。
表达盒可以包括与本发明的AHASL核酸序列可操作地连接的调节序列。盒还可以额外地包含至少一个要共转化入生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供所述额外基因。
可以给核酸构建体提供多个限制位点，用于插入AHASL核酸序列，以使其在调节区的转录调节之下。核酸构建体可以额外地包含编码选择标记基因的核酸分子。
在一个实施方案中，表达盒按照5'-3'转录方向包含：转录和翻译起始区（例如，启动子）、本发明的AHASL核酸序列、以及在植物中具有功能的转录和翻译终止区（例如，终止区）。
在核酸构建体的生产中可以使用任意的启动子。启动子对于植物宿主和/或对于本发明的AHASL核酸序列而言可以是天然的或类似的，或是外源的或异源的。此外，启动子可以是天然的序列，或可选择地是合成的序列。当启动子对于植物宿主而言是“外源的”或“异源的”时，表示该启动子不存在于导入该启动子的天然植物中。当启动子对于本发明的AHASL核酸序列而言是“外源的”或“异源的”时，表示该启动子对于可操作地连接的本发明的AHASL核酸序列而言不是天然的或天然存在的启动子。本文使用的嵌合基因包含编码序列，所述编码序列可操作地连接至与其异源的转录起始区。
虽然使用异源启动子表达本发明的AHASL核酸分子可以是优选的，但在构建体的制备中可以使用天然的启动子序列。这样的构建体可在植物或植物细胞中改变AHASL蛋白的表达水平。因此，改变植物或植物细胞的表型。
在构建体的制备中可以使用任意启动子，以控制AHAS编码序列的表达，诸如组成型启动子、组织偏爱型启动子、诱导型启动子或用于在植物中表达的其它启动子。组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子以及在WO 99/43 838和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell 等人(1985) Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白（McElroy等人, (1990) PlantCell 2:163-171）；泛素(Christensen 等人(1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632和Christensen 等人(1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689)；pEMU (Last 等人 (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588)；MAS (Velten 等人(1984) EMBO J. 3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5, 659, 026)等。其它组成型启动子包括，例如，美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
组织偏爱型启动子可用于指导在特定植物组织内的AHASL表达。这样的组织偏爱型启动子包括，但不限于，叶偏爱型启动子、根偏爱型启动子、种子偏爱型启动子和茎偏爱型启动子。组织偏爱型启动子包括Yamamoto 等人(1997) Plant J. 12(2):255-265； Kawamata 等人(1997) PlantCell Physiol. 38(7):792-803； Hansen 等人(1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343； Russell 等人(1997) Transgenic Res. 6(2):157-168； Rinehart 等人(1996) Plant Physiol. 1 12(3):1331-1341； Van Camp 等人(1996) PlantPhysiol. 1 12(2):525-535； Canevascini 等人(1996) PlantPhysiol. 112(2): 513-524； Yamamoto 等人(1994) PlantCell Physiol. 35(5):773-778； Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196； Orozco 等人(1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138； Matsuoka 等人(1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586- 9590；和Guevara-Garcia 等人(1993) Plant J. 4(3):495-505。
核酸构建体还可以包含转录终止区。当使用转录终止区时，在核酸构建体的制备中可以使用任意终止区。例如，终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于可操作地连接的目标AHASL序列而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以源自另一种来源（即，对于启动子、目标AHASL核酸分子、植物宿主或其任何组合而言是外源的或异源的）。可用于本发明的构建体中的终止区的实例包括：来自根癌农杆菌（A. tumefaciens)的Ti-质粒的终止区，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau 等人(1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144； Proudfoot (1991) Cell 64:671-674； Sanfacon 等人(1991) Genes Dev. 5:141-149； Mogen 等人(1990) PlantCell 2:1261-1272； Munroe 等人(1990) Gene 91:151-158； Ballas 等人(1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903；和Joshi 等人(1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639。
在有些实施方案中，可以优化核酸，以增加在转化的植物中的表达。即，为了改善的表达，可以使用植物偏爱的密码子来合成编码突变型AHASL蛋白的核酸。关于宿主偏爱的密码子选择的讨论，参见，例如，Campbell和Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11。在本领域可获得的用于合成植物偏爱的基因的方法。参见，例如美国专利号5,380,831和5,436,391，和Murray等人, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, 所述参考文献通过引用并入本文。
另外，可以对本文公开的核酸序列进行其它序列修饰。例如，已知额外的序列修饰会增强在细胞宿主中的基因表达。这些修饰包括去除编码假多腺苷酸化信号的序列、外显子/内含子剪接位点信号、转座子样重复序列、和可能对基因表达有害的其它这样的确定表征的序列。还可以调节序列的G-C含量至靶细胞宿主的平均水平，如参照在该宿主细胞中表达的已知基因而计算出的水平。另外，可以修饰序列，以避免预测的发夹二级mRNA结构。
在本发明的构建体的制备中还可以使用其它核酸序列，例如用于增加AHAS编码序列的表达。这样的核酸序列包括玉米AdhI的内含子intron1基因(Callis 等人(1987) Genes and development 1:1183-1200)，和来自烟草花叶病毒（TMV）、玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒的前导序列（W-序列）(Gallie 等人(1987) Nucleic Acid Res.15:8693-8711,和Skuzeski 等人(1990) Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990)。已证实，来自玉米的shrunken-1基因座的第一个内含子会增加嵌合基因构建体中的基因的表达。美国专利号5,424,412和5,593,874公开了特定内含子在基因表达构建体中的用途，Gallie 等人((1994) Plant Physiol. 106:929-939)也已证实，在组织特异的基础上，内含子可用于调节基因表达。为了进一步增强或优化AHAS大亚基基因表达，本发明的植物表达载体还可包含含有基质附着区（MAR）的DNA序列。然后，用这样的经修饰的表达系统转化的植物细胞可以表现出本发明核苷酸序列的过表达或组成型表达。
本发明的核酸构建体可以额外地在表达盒构建体中包含5'前导序列。这样的前导序列可起增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域中是已知的，并包括：小RNA病毒前导序列，例如，EMCV前导序列（脑心肌炎5'非编码区）(Elroy-Stein 等人(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列（烟草蚀纹病毒）(Gallie 等人(1995) Gene 165(2):233-238),MDMV前导序列（玉米矮花叶病毒）(Virology 154:9-20),和人免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）(Macejak 等人(1991) Nature 353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒（AMV RNA 4）的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(Jobling 等人(1987) Nature 325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列（TMV）（Gallie等人, (1989) Molecular Biology of RNA, Cech编 (Liss, New York), 第237-256页）；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列（MCMV）(Lommel 等人(1991) Virology 81:382-385)。还参见，Della-Cioppa 等人(1987) Plant Physiol. 84:965-968。还可使用已知用于增强翻译的其它方法，例如内含子等。
在制备核酸构建体时，可操作不同的DNA片段，从而以正确的方向，和在合适时在正确的读码框中，提供DNA序列。为此目的，可使用接合体或连接体来连接DNA片段，或可采用其它操作来提供方便的限制位点、多余DNA的去除、限制位点的去除等。为了该目的，可涉及体外诱变、引物修补、限制性切割（restriction）、退火、再置换（resubstitutions）,例如转换和颠换。
本发明的表达构建体也可以包括能将AHAS序列的表达导向叶绿体的核酸序列。这样的核酸序列包括编码叶绿体转运肽的叶绿体靶向序列，所述叶绿体转运肽将目标基因产物导向植物细胞叶绿体。这样的转运肽在本领域中是已知的。关于叶绿体靶向序列，“可操作地连接的”是指将编码转运肽的核酸序列（即，叶绿体靶向序列）连接至本发明的AHASL核酸分子上，以使两个序列是紧邻的并在同一个读码框中。参见，例如，Von Heijne 等人(1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126； Clark 等人(1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550； Della-Cioppa 等人(1987) Plant Physiol. 84:965-968； Romer 等人(1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421；和Shah 等人(1986) Science 233:478-481。虽然本发明的AHASL蛋白可以包含天然的叶绿体转运肽，但通过将叶绿体靶向序列可操作地连接至编码本发明的成熟AHASL蛋白的核苷酸序列的5'-末端，可以将本领域已知的任何叶绿体转运肽融合至本发明的成熟AHASL蛋白的氨基酸序列上。
叶绿体靶向序列在本领域中是已知的，并包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho 等人(1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780； Schnell 等人(1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342)；5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）(Archer 等人(1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810)；色氨酸合酶(Zhao 等人(1995) J. Biol. Chem. 270(1 1):6081- 6087)； 质体蓝素 (Lawrence 等人(1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt 等人(1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457)；和集光叶绿素a/b结合蛋白（LHBP）(Lamppa 等人(1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999)。还可参见Von Heijne 等人(1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126； Clark 等人(1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550； Della-Cioppa 等人(1987) Plant Physiol. 84:965-968； Romer 等人(1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421；和Shah 等人(1986) Science 233 :478-481。
在另一个实施方案中，可以制备核酸构建体，以指导来自植物细胞叶绿体的突变型AHAS编码序列的表达。用于转化叶绿体的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Svab 等人(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530； Svab和Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917； Svab和Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606。所述方法依靠对包含选择标记的DNA进行基因枪递送，和通过同源重组将DNA靶向至质体基因组。此外，通过经核编码的且质体定向的RNA聚合酶的组织偏爱型表达而反式激活沉默的质体承载的转基因，可进行质体转化。在McBride 等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305中，已经报导了这样的系统。
可为了在叶绿体中表达而优化被靶向叶绿体的目标核酸，从而解决植物细胞核与该细胞器之间的密码子选择的差异。以此方式，可使用叶绿体偏爱型密码子来合成目标核酸。参见，例如，美国专利号5,380,831，它通过引用并入本文。
所述核酸构建体可以用于转化植物细胞，并再生包含突变型AHAS编码序列的转基因植物。用于转化植物的许多植物转化载体和方法是可获得的。参见，例如，美国专利号6,753,458, An, G. 等人(1986) Plant Physiol., 81:301-305； Fry, J. 等人(1987) PlantCell Rep. 6:321-325； Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-774； Hinchee 等人(1990) Stadler. Genet. Symp.203212.203-212； Cousins 等人(1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494； Chee, P. P.和Slightom, J. L. (1992) Gene.118:255-260； Christou 等人(1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246； D'Halluin 等人(1992) Bio/Technol. 10:309-3 14； Dhir 等人(1992) PlantPhysiol. 99:81-88； Casas 等人(1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216； Christou, P. (1993) in Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant ；29P:1 19-124； Davies, 等人(1993) PlantCell Rep. 12:180-183； Dong, J. A.和Mc Hughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148； Franklin, C. I.和Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167； Golovkin 等人(1993) PlantSci. 90:41-52； Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078； Asano, 等人(1994) PlantCell Rep. 13； Ayeres N. M.和Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239； Barcelo 等人(1994) Plant. J. 5:583-592； Becker, 等人(1994) Plant. J. 5:299-307； Borkowska 等人(1994) Acta. Physiol Plant. 16:225- 230； Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27； Eapen 等人(1994) PlantCell Rep. 13:582-586； Hartman 等人(1994) Bio-Technology 12: 919923； Ritala 等人(1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325；和Wan, Y. C.和Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748。使用同源重组方法，还可以将所述构建体转化进植物细胞中。
公开的包含本发明的AHASL序列的构建体可以用于不同的方法中，以生产转基因的宿主细胞，诸如细菌、酵母，和转化植物细胞，并在某些情况下，再生转基因植物。例如，生产含有本发明的AHASL突变体编码核酸的转基因农作物植物的方法，其中与野生型植物相比，或与已知的AHAS突变型植物相比，核酸在植物中的表达导致除草剂耐受性，所述方法包括：(a) 向植物细胞中导入表达载体，所述表达载体包含编码本发明的突变型AHASL的核酸，和(b) 从植物细胞生产除草剂耐受性的转基因植物。
用于本发明的方法中的植物细胞包括、但不限于：原生质体、配子生产细胞和再生成整株植物的细胞。在许多情况下，重组核酸分子的全部或一部分稳定地整合进染色体或稳定的染色体外元件中，使它向连续世代传递。
本发明可用于任何植物物种的转化，所述物种包括，但不限于，单子叶植物和双子叶植物。目标植物物种的实例包括，但不限于，玉米或玉蜀黍（Zea mays），芸苔属物种（例如，欧洲油菜、芜菁、芥菜），包括可用作种子油来源的芸苔属物种，苜蓿（紫花苜蓿(Medicago sativa)），水稻（Oryza sativa），黑麦（Secale cereale），高梁（两色高梁（Sorghum bicolor）、高梁（Sorghum vulgare）），稷（例如，珍珠粟（Pennisetum glaucum）、黍（Panicum miliaceum）、小米（Setaria italica）、龙爪稷（Eleusine coracana）），向日葵（Helianthus annuus），红花（Carthamus tinctorius），小麦（普通小麦（Triticum aestivum）、硬粒小麦（T. Turgidum ssp. durum）），大豆（Glycine max），烟草（Nicotiana tabacum），马铃薯（Solanum tuberosum），花生（Arachis hypogaea），棉花（海岛棉（Gossypium barbadense）、陆地棉（Gossypium hirsutum）），甘薯（Ipomoea batatus），木薯（Manihot esculenta），咖啡（咖啡属物种（Coffea spp.）），椰子（Cocos nucifera），菠萝（Ananas comosus），柑桔树（柑桔属物种（Citrus spp.）），可可（Theobroma cacao），茶（Camellia sinensis），香蕉（芭蕉属物种（Musa spp. ）），鳄梨（Persea americana），无花果（Ficus casica），番石榴（Psidium guajava），芒果（Mangifera indica），橄榄（油橄榄（Olea europaea）），番木瓜（Carica papaya），腰果（Anacardium occidentale），澳洲坚果（全缘叶澳洲坚果（Macadamia integrifolia）），扁桃（Prunus amygdalus），甜菜（Beta vulgaris），甘蔗（甘蔗属物种（Saccharum spp.）），燕麦(Avena sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、蔬菜、观赏植物和针叶树。优选地，本发明的植物是作物植物（例如，向日葵、芸苔属物种、棉花、甜菜、大豆、花生、苜蓿、红花、烟草、玉米、水稻、小麦、黑麦、大麦、黑小麦、高梁、稷等)。
编码本发明的AHASL 多肽的突变型AHASL核酸分子也可以用作选择标记，例如，用于鉴别转基因细胞，所述转基因细胞含有导入的编码突变型AHASL 多肽的核酸分子。在一个实施方案中，本发明提供了鉴别或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其一部分的方法，所述方法包括：a) 提供转化的植物细胞、植物组织、植物或其一部分，其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其一部分包含如上所述的编码本发明的AHASL突变型多肽的分离的核酸，其中所述多肽用作选择标志物，且其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其一部分可以任选地包含另外的分离的目标核酸；b) 使所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其一部分接触至少一种AHAS 抑制剂或抑制AHAS的化合物；c) 测定所述植物细胞、植物组织、植物或其一部分是否受到抑制剂或抑制化合物的影响；和d) 鉴别或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其一部分。
本发明也体现在含有本文所述突变的纯化的AHASL蛋白中，所述蛋白可用于分子建模研究中，用于设计对除草剂耐受性的进一步提高。蛋白纯化的方法是众所周知的，且可以使用可商业得到的产品或特殊设计的方法容易地实现，所述方法如例如在Protein Biotechnology, Walsh和Headon (Wiley, 1994)中所述。
本发明提供了对至少一种抑制AHAS的除草剂（诸如咪唑啉酮或磺酰脲除草剂）是抗性的或耐受性的植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞。在有些实施方案中，所述植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞表现出对至少一种抑制AHAS的除草剂的增强的抗性或增强的耐受性。术语“增强的”是指抗性或耐受性的量超过预期值的增加。除草剂的优选量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。 “有效量”和“有效浓度”分别意指这样的量和浓度，其足以杀死或抑制相似的野生型植物、植物组织、植物细胞、小孢子或宿主细胞的生长，但所述量不会杀死或同样严重地抑制本发明的除草剂-抗性的植物、植物组织、植物细胞、小孢子和宿主细胞的生长。通常，除草剂的有效量是在农业生产系统中为了杀死目标杂草而常规使用的量。这样的量对于本领域普通技术人员而言是已知的，或可以使用本领域已知的方法容易地确定。此外，应当认识到，在农业生产系统中的除草剂的有效量可能实质上不同于用于植物培养系统（例如，小孢子培养系统）的除草剂的有效量。
本发明的除草剂是干扰AHAS 酶的活性的除草剂，所以在除草剂存在下会降低AHAS活性。此类除草剂在本文也可称为“抑制AHAS的除草剂”，或简称为“AHAS抑制剂”。本文使用的“抑制AHAS的除草剂”或“AHAS抑制剂”并不是表示限于干扰AHAS酶的活性的单一除草剂。因此，除非另外说明或从上下文中显示，“抑制AHAS的除草剂”或“AHAS抑制剂”可以是一种除草剂或2、3、4或更多种除草剂的混合物，其中的每一种除草剂都会干扰AHAS酶的活性。
除非另外清楚地指出，本文使用的术语“植物”意指处于任何发育阶段的植物，以及可连接到整个完整植物上或从整个完整植物分离的任何植物部分（单个或复数个）。这样的植物部分包括，但不限于，植物的器官、组织和细胞，包括可以再生出植物的植物愈伤组织、植物块、植物原生质体和植物细胞组织培养物。具体的植物部分的实例包括茎、叶、根、花序、花、小花、果实、花梗（pedicle）、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛（leaf hair）、种毛（seed hair）、花粉粒、小孢子、胚、胚珠、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞和任何其它已知的植物的器官、组织和细胞。此外，应当认识到，种子是植物部分。
本发明的植物包括非转基因植物和转基因植物。“非转基因植物”意指在其基因组中缺少重组DNA的植物，但是其在植物细胞基因组中含有已经使用诱变技术（诸如化学诱变）或通过本文提供的那些方法突变的突变型核酸分子。非转基因植物不包括具有由于天然过程导致的突变序列的那些植物。“转基因植物”意指在其基因组中包含重组DNA的植物。通过将重组DNA导入植物的基因组中，可以产生这样的转基因植物。当这样的重组DNA被整合入转基因植物的基因组中时，植物的后代也可以包含该重组DNA。这样的后代植物也是转基因植物，即所述后代植物包含至少一个祖先转基因植物的重组DNA的至少一部分。
本发明也提供了含有本文公开的核酸分子的AHAS-除草剂-抗性的植物。所述AHAS-除草剂-抗性的植物可以是非转基因的或转基因的除草剂-耐受的植物，其包含编码本文所述的AHASL突变型多肽的核酸分子。通过使第一种植物与第二种植物异体授粉，并使花粉受体植物 (可以是第一种或第二种植物)从该异体授粉产生种子，可以生产AHAS-除草剂-抗性的植物。种子和由其产生的后代植物可以具有杂交（cross）进种子和/或后代植物的基因组中的突变。花粉受体植物可以是第一种或第二种植物。第一种植物包含第一种核酸分子，其编码本文公开的至少一种AHASL突变型多肽。第二种植物可以是任意相容的植物，且可以包含编码相同或不同的AHASL突变型多肽的第二种核酸分子。与野生型AHASL 多肽相比，所述第一种和第二种AHASL突变型多肽可以包含相同的或不同的氨基酸置换。可以选择由杂交产生的种子或后代植物，其包含编码AHASL突变型多肽的一种核酸分子，或编码两种AHASL突变型多肽的2种核酸分子。
当第一种和第二种植物分别是第一种和第二种核酸分子的纯合子时，每个得到的后代植物包含第一种和第二种核酸分子各自的一个拷贝，且可以省略选择步骤。当第一种和第二种植物中的至少一种是杂合子时，可以选择包含两种核酸分子的后代植物，例如，通过分析后代植物的DNA，以鉴别包含第一种和第二种核酸分子的后代植物，或通过测试后代植物的增加的除草剂耐受性。
在有些实施方案中，使用非转基因的方法，诸如定位诱变方法，包括在例如国际申请PCT/US00/23457或美国专利号6,271,360、6,479,292和7,094,606中公开的那些方法，可以生产含有本发明的核酸序列的植物。在一个实施方案中，这样的方法可以包含，使用寡核苷酸-指导的基因修复，以将点突变导入宿主细胞基因组中，且可以包含使用单链寡核苷酸，诸如基因修复寡核碱基(参见，美国专利号6,870,075和5,565,350)。寡核碱基是包含核碱基的聚合物，所述聚合物可以通过沃森-克里克碱基配对与具有互补序列的DNA杂交。核碱基包含碱基，所述碱基是嘌呤、嘧啶或其衍生物或类似物。核碱基包括肽核碱基、肽核酸的亚基和吗啉核碱基以及核苷和核苷酸。核苷是含有呋喃戊糖基部分的核碱基，例如，任选地取代的核苷或2'-脱氧核苷。核苷可以通过几个连接部分之一进行连接，所述连接部分可以含有或不含有磷。通过未取代的磷酸二酯键相连的核苷称作核苷酸。寡核碱基链具有单个5'和3' 末端，它们是聚合物的最后核碱基。特定寡核碱基链可以含有所有类型的核碱基。寡核碱基化合物是包含一个或更多个寡核碱基链的化合物，所述链是互补的，且通过沃森-克里克碱基配对进行杂交。核碱基是脱氧核糖型或核糖型。核糖型核碱基是含有呋喃戊糖基的核碱基，其中2'碳是被羟基、烷氧基或卤素取代的亚甲基。脱氧核糖型核碱基是除了核糖型核碱基以外的核碱基，且包括不含有呋喃戊糖基部分的所有核碱基。
可以制备单链寡核苷酸突变载体(SSMOV)，以将突变导入AHAS编码序列。根据国际专利申请 PCT/US00/23457和美国专利号6,271,360、6,479,292和7,094,606，可以制备SSMOV。SSOMV的序列可以基于与在美国专利号5,565,350、5,731,181、5,756,325、5,871,984、5,760,012、5,888,983、5,795,972、5,780,296、5,945,339、6,004,804和6,010,907中和在国际公开号WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/58723、WO 99/58702和WO 99/40789中所述的突变载体相同的原理。在一个实施方案中，SSOMV的序列含有与靶序列同源的2个区域，它们被含有希望的遗传改变的区域（称作增变区）隔开。所述增变区可以具有这样的序列，该序列具有与隔开靶序列中的同源区的序列相同的长度，但是具有不同的序列。这样的增变区可以造成置换。或者，SSOMV中的同源区可以彼此邻近，而具有相同序列的靶基因中的区域被1个、2个或更多个核苷酸隔开。这样的SSOMV会造成在SSOMV中不存在的核苷酸的靶基因的缺失。最后，与同源区同一的靶基因的序列可以邻近靶基因，但是被SSOMV序列中的1个、2个或更多个核苷酸隔开。这样的SSOMV会造成靶基因的序列的插入。
在有些实施方案中，SSOMV的核苷酸是通过未修饰的磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸，例外是，5'末端和/或3'末端核苷酸间键或2个5'末端和/或3'末端核苷酸间键可以是硫代磷酸酯或磷酰胺酯。本文使用的核苷酸间键是SSOMV的核苷酸之间的键，且不包括5'末端核苷酸或3'末端核苷酸和封闭取代基之间的键。在一个具体的实施方案中，SSOMV的长度是21至60个脱氧核苷酸，且同源区的长度因此是至少20个脱氧核苷酸的总长度，且至少2个同源区应当各自具有至少8个脱氧核苷酸的长度。
可以将SSOMV设计成与靶基因的编码链或非编码链互补。当希望的突变是单个碱基的置换时，优选地，两个增变核苷酸是嘧啶。为了达到与实现希望的功能结果相一致的程度，优选地，互补链中的增变核苷酸和靶向的核苷酸是嘧啶。在一个实施方案中，编码颠换突变（即，C或T 增变核苷酸）的SSOMV分别与互补链中的C或T核苷酸错配。
除了寡脱氧核苷酸以外，SSOMV可以含有5'封闭取代基，它通过连接物连接在5'末端碳上。连接物的化学性质可以是任意化学性质，且长度是至少6个原子，且连接物优选地是柔性的。可以使用多种无毒的取代基，诸如生物素、胆固醇或其它甾类或非嵌入型阳离子荧光染料。用于制备SSOMV的试剂的实例包括，由Glen Research, Sterling Va. (现在的GE Healthcare)作为Cy3TM和Cy5TM销售的试剂，它们是封闭的亚磷酰胺，在掺入寡核苷酸后，分别产生3,3,3',3'-四甲基 N,N'-异丙基取代的吲哚单羰花青染料和吲哚二羰花青染料。在一个实施方案中，所述试剂是Cy3。当吲哚羰花青被N-氧烷基取代时，它可以通过与5'末端磷酸的磷酸二酯键方便地连接于寡脱氧核苷酸的5'末端。染料和寡脱氧核苷酸之间的染料连接物的化学性质并不重要，可为合成方便而选择。当根据指导而使用可商业得到的Cy3亚磷酰胺时，所产生的5’修饰由一个封闭取代基和连接物共同组成，它们是N-羟丙基、N'-磷脂酰丙基3,3,3',3'-四甲基吲哚单羰花青。
在一个实施方案中，所述吲哚羰花青染料在吲哚环的3和3' 位置被四取代。在理论上不受限制地，这些取代防止该染料成为嵌入染料。在这些位置上的取代基的身份并不重要。另外，SSOMV可以具有3'封闭取代基。该3'封闭取代基的化学性质也不重要。
要导入AHAS基因中的变化可以是在核酸序列的任意区域，包括编码区和非编码区。在一个实施方案中，要导入靶(AHAS)基因中的变化是由异源区编码。要导入基因中的变化可以是基因序列的一个或更多个碱基的变化(即置换)或一个或更多个碱基的添加或缺失。
本发明也提供了在本文中称作BnCL120C7的除草剂-抗性的芸苔属系。在2008年6月23日，将来自芸苔属系 BnCL120C7的至少2500粒种子保藏于美国典型培养物保藏中心专利保藏所（Patent Depository of the American Type Culture Collection） (ATCC), Manassas, VA 20110 USA，并分配给ATCC专利保藏号PTA-9278。本发明也提供了在本文中称作BnCL131A1的除草剂-抗性的芸苔属系。在2008年6月23日，将来自芸苔属系 BnCL131A1的至少2500粒种子进行保藏，并分配给ATCC专利保藏号PTA-9279。本发明也提供了在本文中称作BnCL140B3的除草剂-抗性的芸苔属系。在2008年8月27日，将来自芸苔属系 BnCL140B3的至少2500粒种子保藏于美国典型培养物保藏中心专利保藏所(ATCC), Manassas, VA 20110 USA，并分配给ATCC专利保藏号PTA-9402。本发明也提供了在本文中称作BnCL140C7的除草剂-抗性的芸苔属系。在2008年8月27日，将来自芸苔属系BnCL140C7的至少2500粒种子保藏于美国典型培养物保藏中心专利保藏所(ATCC), Manassas, VA 20110 USA，并分配给ATCC专利保藏号PTA-9403。本发明也提供了在本文中称作PM1PM2/BnCL131A1的除草剂-抗性的芸苔属系。在2009年9月9日，将来自芸苔属系PM1PM2/BnCL131A1的至少2500粒种子保藏于美国典型培养物保藏中心专利保藏所(ATCC), Manassas, VA 20110 USA，并分配给ATCC专利保藏号PTA-10321。在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款下，维持该保藏。进行为期至少30年的芸苔属系 BnCL120C7、BnCL131A1、BnCL140B3、BnCL140C7和PM1PM2/BnCL131A1的保藏，并且在ATCC收到提供保藏的样品的最新请求后保藏至少5年。此外，申请人已满足37 C.F.R. §§ 1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活证明。
使用在实施例中公开的定点诱变技术，生产出在本发明中例证的突变型除草剂-抗性的芸苔属系 BnCL120C7、BnCL131A1、BnCL140B3和BnCL140C7。但是，本发明不限于通过这样的方法生产的除草剂-抗性的芸苔属植物。本领域已知的任何诱变方法可用于生产本发明的除草剂-抗性的芸苔属植物。此类诱变方法可以包括，例如，使用任何一种或更多种下述诱变剂：放射线，例如X-射线、γ射线（例如，钴60或铯137）、中子（例如，原子反应堆中铀235的核裂变产物）、β射线（例如，从诸如磷32或碳14等放射性同位素发射的）和紫外射线（优选地，从2500至2900 nm），和化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、碱基类似物（例如，5-溴-尿嘧啶）、相关化合物（例如，8-乙氧基咖啡因）、抗生素（例如，链黑霉素）、烷化剂（例如，硫芥（sulfur mustards）、氮芥、环氧化物、乙烯胺（ethylenamine）、硫酸盐、磺酸盐、砜、内酯）、叠氮化合物、羟胺、亚硝酸或吖啶。也可通过下述方法来生产除草剂-抗性的植物：使用组织培养方法来挑选包含除草剂抗性突变的植物细胞，然后从其再生出除草剂-抗性的植物。参见，例如，美国专利号5,773,702和5,859,348，两者通过引用全部并入本文。诱变育种的更详细内容可以参见“Principles of Cultivar Development” Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company，其公开内容通过引用并入本文。另外，定位诱变可以用于在宿主植物细胞中产生突变的AHASL序列，如在本文中所公开的。
本发明的芸苔属植物另外包括这样的植物，其与野生型AHASL蛋白相比，包含在氨基酸位置653(拟南芥命名法)处的天冬酰胺、在氨基酸位置122(拟南芥命名法)处的苏氨酸，以及相对于野生型AHASL蛋白在AHASL蛋白中包含一个或更多个额外的氨基酸置换，其中这样的芸苔属植物与野生型芸苔属植物相比，具有增加的对至少一种除草剂的抗性。
植物和育种方法
本发明的AHAS-除草剂-抗性的植物和这种植物的后代，诸如芸苔属AHAS-除草剂-抗性的植物，可以用于制备抗性植物、具有增加的对抑制AHAS的除草剂的耐受性的植物、和这样的植物的种子的方法中。因而，例如，本文例证的芸苔属植物可以用于育种计划中，以开发另外的除草剂-抗性的植物，诸如欧洲油菜(例如芸苔)的商业品种。根据这样的方法，可以使第一种亲本植物与第二种亲本植物杂交，其中第一种或第二种亲本植物中的至少一种含有至少一个本发明的AHASL核酸序列，例如这样的核酸分子，其编码具有A122T突变和S653N突变的AHASL 多肽。该方法的一种用途是生产F1杂种植物。该方法的另一个重要方面是，该方法可以用于开发新颖的亲本、双单倍体或近交系。例如，本文所述的植物系可以与任意第二种植物杂交，使得到的杂种后代各自自交和/或同胞交配约5-7代或更多代，由此提供大量不同的亲本系。这些亲本系然后可以与其它系杂交，并分析得到的杂种后代的有益特征。以此方式，可以鉴别出新颖的赋予希望的特征的系。在该方法中可以使用不同的育种方法，包括单倍性、谱系育种、单种子遗传、改良的单种子遗传、轮回选择和回交。
在有些实施方案中，所述植物及其后代表现出协同效应，而不是除草剂耐受性的累加效应，因此包含多个突变的植物及其后代中的除草剂耐受性水平大于包含AHASL单个突变型蛋白的植物的组合除草剂耐受性。
通过天然的或机械的技术，可以杂交含有本发明的核酸分子的植物系。通过控制可以转移到柱头上的花粉的类型，或通过人工授粉，可以实现机械授粉。
通过测定突变的AHASL核酸或多肽的存在的任意方法，可以评价下传的和/或后代的植物中的本发明的核酸分子。这样的方法包括表型评价、遗传型评价或其组合。可以在后代中评价后代植物的除草剂抗性和其它希望的特性。可以如下评价对AHAS-抑制剂除草剂的抗性：通过将植物暴露于一种或更多种适当的AHAS-抑制剂除草剂，并评价除草剂损伤。通过目检植物，可以评价某些特性，诸如倒伏抗性和植物高度，而通过目检豆荚(长角果)内的种子，可以评价早熟状态。使用诸如近红外光谱法和/或液相色谱法和/或气相色谱法等技术，可以评价种子的的其它特性，诸如油百分比、蛋白百分比和总硫代葡糖酸盐。
使用任意的遗传型分析方法，也可以鉴别本发明的植物。植物的遗传型评价包括，使用诸如同工酶电泳、限制片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态DNA (RAPD)、任意引发的聚合酶链式反应(AP-PCR)、等位基因特异性PCR (AS-PCR)、DNA扩增指纹法(DAF)、序列表征的扩增区域 (SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、也称作“微随体”的简单序列重复(SSR)等技术。用于分析本文提供的植物的遗传型的其它组合物和方法包括，在美国公开号2004/0171027、美国公开号2005/02080506和美国公开号2005/0283858中公开的那些方法，它们全部通过引用并入本文。
评价和操作(通过暴露于一种或更多种适当的AHAS-抑制剂除草剂)可以在几代中进行。使用与检查品种相对比的客观标准，可以评价新系的性能。使表现出希望的特性组合的系与另一个系杂交或自花授粉，以生产种子。自花授粉是指花粉从一朵花向相同花或相同植物的另一朵花转移。已经自花授粉并就类型选择多代的植物在几乎所有的基因座处变成纯合的，并生成真实育种后代的均一种群。
在本发明的方法中可以使用任意育种方法。在一个实施例中，使用单倍体方法，可以育种本发明的除草剂-抗性的植物。在这样的方法中，在简单杂交或复杂杂交中，杂交具有希望的特征补体的遗传基础的亲本。杂交(或异花授粉)是指花粉从一株植物向不同植物转移。使用本领域技术人员已知的技术 [(例如 Swanson, E. B. 等人, (1987) Plant Cell Reports, 6: 94-97, “Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus, L.；和Swanson, E. B., (1990) Microspore culture in Brassica,第159-169页，见Methods in Molecular Biology, 第6卷, Plant Cell and Tissue Culture, Humana Press]，培养杂交的后代，并分离和过滤小孢子(未成熟的花粉粒)。这些小孢子表现出基因的分离。在有诸如咪草烟 (例如 PURSUITTM)或甲氧咪草烟 (例如 SOLOTM、BEYONDTM和RAPTORTM)或咪草烟和甲氧咪草烟的50/50 混合物(例如 ODYSSEYTM)等适当的AHAS-抑制剂除草剂存在下，培养小孢子，所述除草剂会杀死缺少引起除草剂抗性的突变的小孢子。携带引起除草剂抗性的基因的小孢子会存活，并生成胚，其形成单倍体植物。它们的染色体然后倍增，生成双重单倍体。
根据本发明，也可以使用其它育种方法。例如，可以使用谱系育种来改良大部分自花授粉的农作物，诸如芸苔属和芸苔(canola)。谱系育种从2个遗传型的杂交开始，每个遗传型可能具有一个或更多个希望的特征，所述特征在另一个遗传型中缺少，或弥补另一个遗传型。如果2个起始亲本不能提供所有希望的特征，可以在杂交计划中包括额外的亲本。
可以以简单或复杂的方式使这些亲本杂交，以生产简单或复杂的F1。通过自交一株或几株F1植物，或通过互交2株F1(即，同胞交配)，从F1生产F2种群。最佳个体的选择可以从F2代开始，最佳家族的选择从F3开始，选择最佳家族内的最佳个体。重复的家族测试可以从F4代开始，以提高选择具有低遗传度的特性的有效性。在近交的晚期(即，F6和F7)，可以测试最佳的系或表型相似系的混合物作为新品种的潜在释放。但是，就用于开发改良的AHAS-除草剂-抗性的植物而言，谱系方法比单倍性方法耗费时间更多，因为植物表现出多代分离，且希望的特性的恢复相对较低。
单种子遗传(SSD)过程还可以用于育种改良品种。SSD 过程在严格意义上是指种植分离的种群，收获每株植物的单种子样本，再使用单种子种群种植下一代。当种群由F2代进展到期望的育种水平时，种系来源的每个植物就要追溯到不同的F2代个体。由于一些种子没能发育或一些植物没产生至少一个种子，种群中植物的数量逐代递减。结果，并不是F2种群中采样的所有植物都可以被其后代所表现，此时，代的延续结束。
在多种子过程中，芸苔种植者通常从种群的每一个植物上收获一个或更多的豆荚，将它们脱粒合成一批。一部分用于种植下一代，一部分储藏。该过程称作改良的单种子或豆荚累积技术。多种子过程已经用于节省收获时的劳动力。使用机器将豆荚脱粒比单种子过程的手工将每个豆荚脱粒快了许多。多种子过程还使近交的每一代都能种植出相同数量的种群的种子。收获足够的种子，以弥补那些不发育或不结种子的植物。
回交育种可以用于将来自来源品种或系(供体亲本)的简单遗传的、高度可遗传的特性的一个或复数个基因转移至另一个希望的品种或近交系(轮回亲本)。初次杂交后，选择具有供体亲本表型的个体，并重复地与轮回亲本杂交(回交)。当回交结束时，预期得到的植物具有轮回亲本的特性，且希望的特性从供体亲本转移。
通过轮回选择，还可以开发改良的品种。在该方法中，通过互交几个不同的亲本，鉴别或建立杂合个体的遗传上可变的种群。基于个体优越性、突出的后代或优良的配合力，选择最佳的植物。使选择的植物互交，以生成新种群，在其中继续另外的选择循环。
在另一个方面，本发明提供了生产具有抑制AHAS的除草剂抗性的植物的方法，所述方法包括：(a) 使第一个植物系与第二个植物系杂交，以形成分离的种群，其中所述第一个或第二个植物系是包含本发明的核酸分子的抑制AHAS的除草剂-抗性的植物；(b) 筛选种群中增加的抑制AHAS的除草剂抗性、本发明的核酸分子的存在、或二者；和(c) 选择与野生型植物相比具有增加的AHAS 抗性或含有本发明的核酸分子的一个或更多个种群成员。第一个或第二个植物含有本发明的AHASL核酸分子。在一个实施方案中，用于所述方法中的植物是芸苔属植物。
在另一个方面，本发明提供了将抑制AHAS的除草剂抗性特性基因渗入（introgress）到植物中的方法，所述方法包括：(a) 使至少第一个抑制AHAS的除草剂-抗性的植物系与第二个植物系杂交，以形成分离的种群；(b) 筛选种群中增加的抑制AHAS的除草剂抗性；和(c) 选择具有增加的抑制AHAS的除草剂抗性的至少一个种群成员。在一个实施方案中，用于所述方法中的植物是芸苔属植物。
或者，在本发明的另一个方面，第一个和第二个亲本芸苔属植物可以是本文所述的抑制AHAS的除草剂-抗性的芸苔属植物。因而，使用本文所述的具有增加的抑制AHAS的除草剂抗性的芸苔属植物生产的任意芸苔属植物构成本发明的一部分。本文使用的杂交可以是指自交、同胞交配、回交、与另一个或同一个亲本系杂交、与种群杂交等。
本发明也提供了用于生产除草剂-抗性的植物、诸如除草剂-抗性的芸苔属植物的方法，这通过包含有性生殖的常规植物育种来实现。所述方法包括，使抗除草剂的第一种植物与不抗除草剂的第二种植物杂交。第一种植物可以是本发明的除草剂-抗性的植物中的任一种，包括，例如，包含至少一个本发明的编码除草剂-抗性的AHASL的突变型核酸分子的芸苔属植物，和包含芸苔属植物BnCL120C7、BnCL131A1、BnCL140B3或BnCL140C7的除草剂抗性特征的非转基因芸苔属植物。第二种植物可以是当与第一种植物杂交时能够产生有活力的后代植物（即，种子）的任意植物。通常，但非必需地，第一种和第二种植物属于相同的物种。例如，通过使欧洲油菜植物与例如芥菜植物杂交，可以将欧洲油菜植物中的A基因组上的突变型AHASL序列育种进也具有A基因组的其它芸苔属植物中。本发明的方法还可包括将第一次杂交的后代植物与具有与第一种或第二种植物相同的品系或遗传型的植物回交一代或更多代。或者，可使第一次杂交或任何随后杂交的后代与第三种植物杂交，所述第三种植物属于与第一种或第二种植物不同的品系或遗传型。本发明的方法另外可以包括，选择包含第一种植物的除草剂抗性特征的植物。
本发明另外提供了用于增加植物、尤其是除草剂-抗性的芸苔属植物的除草剂抗性的方法，这通过包含有性生殖的常规植物育种来实现。所述方法包括将抗除草剂的第一种植物和第二种植物杂交，所述第二种植物可以抗或不抗除草剂，或者可以抗相对于第一种植物而言不同的一种或复数种除草剂。第一种植物可以是本发明的除草剂-抗性的植物中的任意植物，包括，例如，包含至少一个本发明的编码除草剂-抗性的AHASL的核酸分子的转基因的或非转基因的植物，和包含芸苔属植物BnCL120C7、BnCL131A1、BnCL140B3或BnCL140C7的除草剂抗性特征的非转基因芸苔属植物。第二种植物可以是当与第一种植物杂交时能够产生有活力的后代植物（即，种子）的任意植物。通常，但非必需地，第一种和第二种植物属于相同的物种；第一种和第二种植物也可以来自不同的物种，但是在相同属内(实例: 芥菜 x 欧洲油菜，芥菜 x 芜菁，欧洲油菜x 甘蓝，芥菜 x 黑芥，等)，并且，第一种和第二种植物也可以属于不同的属(实例: 芸苔属x 芥属)。与第一种或第二种植物或两者相比，由本发明的该方法产生的后代植物具有增加的对除草剂的抗性。当第一种和第二种植物抗不同的除草剂时，后代植物将具有第一种植物和第二种植物的组合的除草剂抗性特征。本发明的方法还可包括将第一次杂交的后代植物与具有与第一种或第二种植物种相同的品系或遗传型的植物回交一代或更多代。或者，可使第一次杂交或任何随后杂交的后代与第三种植物杂交，所述第三种植物属于与第一种或第二种植物不同的品系或遗传型。本发明的方法另外可以包括，选择包含第一种植物、第二种植物、或第一种和第二种植物二者的除草剂抗性特征的植物。
本发明的植物可以是转基因的或非转基因的。具有增加的对咪唑啉酮和/或磺酰脲除草剂的抗性的非转基因芸苔属植物的实例包括芸苔属植物BnCL131A1、BnCL120C7、BnCL140B3、BnCL140C7或PM1PM2/BnCL131A1；或植物BnCL131A1、BnCL120C7、BnCL140B3、BnCL140C7或PM1PM2/BnCL131A1的突变体、重组体或遗传工程化的衍生物；或植物BnCL131A1、BnCL120C7、BnCL140B3、BnCL140C7或PM1PM2/BnCL131A1的任意后代；或这些植物中的任一种的后代植物；或包含植物BnCL131A1、BnCL120C7、BnCL140B3、BnCL140C7、PM1PM2/BnCL131A1的除草剂抗性特征的植物。
本发明也提供了用本发明的至少一种核酸分子、表达盒或转化载体转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非-人宿主细胞。在分别会杀死或抑制未转化的植物、植物组织、植物细胞或非-人宿主细胞的生长的除草剂水平，这样的转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非-人宿主细胞具有增强的对至少一种除草剂的耐受性或抗性。在一个实施方案中，本发明的转化的植物、植物组织、植物细胞和种子是芸苔属和农作物植物。
本发明也提供了从通过本发明的方法生产的植物得到的抑制AHAS的除草剂耐受性的植物的种子，其能生成具有抑制AHAS的除草剂抗性的植物。
在另一个方面，本发明也提供了从具有抑制AHAS的除草剂抗性的植物的种子生长而成的植物，所述种子从具有除草剂抗性特性的种子而成的植物以及来自这样的植物的植物部分和组织培养物得到。
本文还提供了植物种子容器，其中所述种子能生成抑制AHAS的除草剂-抗性的植物。所述种子容器可以装有任意数目、重量或体积的种子。例如，所述容器可以装有至少或超过约10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000粒或更多种子。或者，所述容器可以装有至少或超过约1盎司、5盎司、10、盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多种子。
植物种子容器可以是本领域可得到的任意容器。作为非限制性实例，容器可以是盒子、袋子、包、小袋、胶带卷（tape roll）、桶、箔片或试管。
在另一个实施方案中，种子容器中装有的种子可以是处理过的或未处理的种子。在一个方面，可以处理种子，以提高发芽，例如，通过引发种子，或通过消毒来保护免于种子携带的病原体。在另一个方面，可以给种子包被任意可得到的包衣，以提高例如适种性、种子出苗（emergence）和保护免于种子携带的病原体。种子包衣可以是任意形式的种子包衣，包括，但不限于制粒、薄膜包衣和结壳（encrustment）。
另外，所述芸苔属植物可以用于育种方法中，以生成具有与AHAS-抑制剂耐受性相组合的额外目标特性(也称作“叠加特性”或“特性叠加”)的植物，诸如对诸如草甘膦、草铵膦和/或麦草畏等其它除草剂的抗性的组合。另外，所述芸苔属植物可以用于育种方法中，以生成具有多个抑制AHAS的除草剂抗性编码序列的芸苔属植物。此外，公开的植物可以用于育种方法中，以生成具有与其它农艺学上重要的特性（诸如疾病和病原体抗性，诸如Bt基因赋予的那些、黑腿病抗性）相组合的抑制AHAS的除草剂耐受性特性的植物。
公开的育种方法包括育种抑制AHAS的除草剂-抗性的芸苔属植物的方法，其中所述方法包括下述步骤：(a) 使第一种芸苔属植物与第二种芸苔属植物杂交，所述第一种芸苔属植物含有编码除草剂耐受性的AHAS蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变；并(b) 从杂交得到种子。
可以筛选得到的种子，以鉴别含有诱变过的核酸分子的种子。这样的方法可以另外包括，从杂交的种子得到DNA样品，并测定样品中是否存在诱变过的核酸分子。或者，可以筛选种子的抑制AHAS的除草剂耐受性，以鉴别表达除草剂耐受性的AHAS核酸的种子或后代。
在另一个方面，本发明提供了生产具有抑制AHAS的除草剂抗性的芸苔属植物的方法，所述方法包括：(a) 使第一个芸苔属系与第二个芸苔属系杂交，以形成分离的种群，其中所述第一个芸苔属系是包含本发明的诱变过的AHAS核酸分子的抑制AHAS的除草剂-抗性的芸苔属植物；(b) 筛选种群中增加的抑制AHAS的除草剂抗性；和(c) 选择与野生型芸苔属植物相比具有增加的AHAS 抗性的一个或更多个种群成员。
在另一个方面，本发明提供了将抑制AHAS的除草剂抗性特性基因渗入到芸苔属植物中的方法，所述方法包括：(a) 使至少第一个抑制AHAS的除草剂-抗性的芸苔属系与第二个芸苔属系杂交，以形成分离的种群；(b) 筛选种群中增加的抑制AHAS的除草剂抗性；和(c) 选择具有增加的抑制AHAS的除草剂抗性的至少一个种群成员。
或者，在本发明的另一个方面，第一个和第二个亲本芸苔属植物可以是本文所述的抑制AHAS的除草剂-抗性的芸苔属植物。因而，使用本文所述的具有诱变过的AHAS核酸分子的芸苔属植物生产的任意芸苔属植物构成本发明的一部分。本文使用的杂交可以是指自交、同胞交配、回交、与另一个或同一个亲本系杂交、与种群杂交等。
在有些实施方案中，可以将本发明的诱变过的AHAS核酸分子与赋予对第二种除草剂（诸如草甘膦或草铵膦）的抗性的核酸分子一起工程化进分子堆（molecular stack）中。在其它实施方案中，所述分子堆另外包含至少一种其它核酸分子，其赋予对第三种除草剂的耐受性。在一个实施方案中，所述序列赋予对草铵膦的耐受性，且在一个具体的实施方案中，所述序列包含pat。
在其它实施方案中，本发明的芸苔属植物包含一个或更多个目标特性，在有些实施方案中，诱变过的AHAS核酸分子与目标核酸分子序列的任意组合一起堆叠，以便产生具有希望的特性组合的植物。本文使用的特性是指源自特定序列或序列集合的表型。例如，除草剂耐受性核酸分子可以与编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的任意其它核酸分子一起堆叠，所述多肽例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白(描述在，美国专利号5,366,892； 5,747,450； 5,737,514； 5,723,756； 5,593,881； Geiser 等人 (1986) Gene 48: 109-118； Lee 等人 (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 4648-4657 (Vip3A)； Galitzky 等人 (2001) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57: 1101-1109 (Cry3Bb1)；和Herman 等人 (2004) J. Agric. Food Chem. 52: 2726-2734 (Cry1F))、凝集素(Van Damme 等人 (1994) PlantMol. Biol. 24: 825-830、pentin (描述在美国专利号5,981,722)等。产生的组合也可以包括目标核酸分子中的任一个的多个拷贝。
在有些实施方案中，诱变过的AHAS核酸分子可以与其它除草剂耐受性特性一起堆叠，以产生具有其它改良性质的本发明的芸苔属植物。可以在这样的实施方案中使用的其它除草剂耐受性核酸分子包括通过其它作用模式赋予对草甘膦或AHAS 抑制剂的耐受性的那些，例如，编码草甘膦氧化-还原酶的基因，如在美国专利号5,776,760和5,463,175中更完整地描述的。可以与诱变过的AHAS核酸分子组合的其它特性包括，源自赋予植物生产更高水平的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的能力的核酸分子的那些，例如，如在美国专利号6,248,876 B1、5,627,061、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、6,225,114 B1、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re. 36,449、RE 37,287 E和5,491,288和国际公开WO 97/04103、WO 00/66746、WO 01/66704和WO 00/66747中更完整地描述的。可以与诱变过的AHAS核酸分子组合的其它特性包括赋予对磺酰脲和/或咪唑啉酮的耐受性的那些，例如，如在美国专利号5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937和5,378,824和国际公开WO 96/33270中更完整地描述的。
因而，提供了这样的芸苔属植物，其含有本发明的诱变过的AHAS核酸分子与编码目标基因（诸如AHAS-抑制剂耐受性的核酸分子）的其它突变型或重组核酸的组合(即“堆叠”)。在一个实施例中，可用于这类组合中的其它的AHAS-抑制剂耐受性核酸分子可以含有相对于野生型AHAS序列的任意突变，例如，具有突变P197S、A205V、S653N、W574L和/或A122T、及其组合 (例如，双或三突变型AHAS序列)的AHAS蛋白。在一个实施例中，提供了这样的芸苔属植物，其组合了包含在位置 A122和S653处的氨基酸突变的除草剂耐受性的AHASL蛋白、和包含在位置W574处的氨基酸突变的另一种除草剂耐受性的AHASL蛋白、以及包含在位置S653处的氨基酸突变的除草剂耐受性的AHASL蛋白。也提供了命名为PM1PM2/BnCL131A1的这样的突变型芸苔属植物系的种子，所述种子的样品已经在ATCC 登记号PTA-10321下保藏。
另外，要与AHAS-抑制剂耐受性的核酸相组合的突变型或重组核酸可以位于芸苔属的任意基因组上，并产生杂合的或纯合的堆叠。因而，用于堆叠的目标核酸可以存在于相同或不同的基因组上，作为本发明的双突变AHAS-抑制剂耐受性的核酸。例如，提供了欧洲油菜植物(含有AACC基因组)，其含有本发明的诱变过的AHAS与咪唑啉酮耐受性核酸分子的组合，所述咪唑啉酮耐受性核酸分子位于例如“A”基因组上，以产生杂合堆叠，或位于“C”基因组上，以产生纯合堆叠。在另一个实施例中，提供了芥菜植物 (含有AABB基因组) ，其含有本发明的诱变过的AHAS与咪唑啉酮耐受性核酸分子的组合，所述咪唑啉酮耐受性核酸分子位于例如“A”基因组上，以产生杂合堆叠，或位于“B”基因组上，以产生纯合堆叠。在另一个实施例中，提供了芜菁植物(含有AA基因组) ，其含有本发明的诱变过的AHAS与咪唑啉酮耐受性核酸分子的组合，所述咪唑啉酮耐受性核酸分子位于例如“A”基因组上，以产生杂合堆叠。
这样的芸苔属植物的实例包括欧洲油菜植物，其含有本发明的诱变过的AHAS核酸分子与下述分子的组合：PM2，所述PM2是来自含有单个突变的A基因组的AHASL核酸分子；W574L (参见，例如，WO 2004/040011)；且在某些实施方案中，进一步与PM1相组合，所述PM1是来自含有单个突变S653N的C基因组序列的AHASL核酸分子(参见，例如，WO 2004/040011)。另一个实例包括芥菜植物，其含有本发明的诱变过的AHAS核酸分子与bR的组合，所述bR是来自含有单个突变S653N的B基因组的AHASL核酸分子 (例如，美国专利公开号2005/0283858和2009/0013424)。其它实例包括芸苔属植物，其含有本发明的诱变过的AHAS核酸分子与PM1的组合。
在有些实施方案中，AHAS-抑制剂耐受性的核酸的组合可以提供对AHAS-抑制剂的任意耐受性水平，诸如累加效应或协同效应。
在有些实施方案中，诱变过的AHAS核酸分子可以与例如羟苯基-丙酮酸双加氧酶一起堆叠，所述羟苯基-丙酮酸双加氧酶是催化将对-羟苯基丙酮酸(HPP)转化成尿黑酸的反应的酶。抑制该酶和结合该酶从而抑制HPP向尿黑酸的转化的分子，可用作除草剂。赋予植物对这样的除草剂的耐受性的特性描述在美国专利号6,245,968 B1、6,268,549和6,069,115和国际公开WO 99/23886中。可以与诱变过的AHAS序列一起堆叠的合适的除草剂耐受性特性的其它实例包括：芳氧基烷酸酯（aryloxyalkanoate）双加氧酶核酸分子 (据报道，它会赋予对2,4-D和其它苯氧基生长素除草剂以及对芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂的耐受性，这描述在例如WO2005/107437中)和麦草畏耐受性核酸分子，其描述在例如Herman 等人 (2005) J. Biol. Chem. 280: 24759-24767中。
可以与本发明的诱变过的AHAS核酸分子相组合的除草剂耐受性特性的其它实例包括由编码外源性草丁膦乙酰基转移酶的核酸分子赋予的那些特性，如在美国专利号5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616和5,879,903中所述。含有外源性草丁膦乙酰基转移酶的植物可以表现出提高的对草铵膦除草剂的耐受性，所述草铵膦除草剂会抑制酶谷氨酰胺合酶。可以与诱变过的AHAS序列相组合的除草剂耐受性特性的其它实例包括由赋予改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的核酸分子赋予的那些特性，如在美国专利号6,288,306 B1、6,282,837 B1和5,767,373和国际公开WO 01/12825中所述。含有这样的核酸分子的植物可以表现出提高的对靶向protox 酶的任一个除草剂品种(也称作“protox 抑制剂”)的耐受性。
可以与诱变过的AHAS核酸分子相组合的除草剂耐受性基因的其它实例包括赋予对麦草畏除草剂的耐受性的那些基因。这样的基因在本领域中是已知的，且描述在例如美国专利号7,022,896和美国公开号2008/0015110中。
可以与本发明的诱变过的AHAS核酸分子组合的除草剂耐受性特性的其它实例包括赋予植物（例如，芸苔属植物）对至少一种除草剂的耐受性的那些特性。除草剂-耐受的芸苔属植物在本领域中是已知的，对特定除草剂的耐受性存在差异的植物也是如此。参见，例如，美国专利号5,627,061。通过育种或通过其它方法，诸如转基因方法，可以组合引起这些耐受性的特性（单种或复数种）和诱变过的AHAS核酸分子，以提供本发明的植物以及使用它们的方法。
诱变过的AHAS核酸分子也可以与至少一种其它特性相组合，以产生本发明的植物，其另外包含多种希望的特性组合，包括，但不限于，动物饲料需要的特性，诸如高油含量(例如，美国专利号7,238,856； 7,268,276)、氨基酸组成、蛋白含量、提高的消化性或改变的脂肪酸组成。
诱变过的AHAS核酸分子也可以与其它希望的特性相组合，例如，毒力和疾病抗性基因 (Jones 等人 (1994) Science 266: 789-793； Martin 等人 (1993) Science 262: 1432-1436； Mindrinos 等人 (1994) Cell 78: 1089-1099)，和加工或工艺产品希望的特性，诸如改性油 (例如，脂肪酸去饱和酶基因 (美国专利号5,952,544； WO 94/11516))；和聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5,602,321； β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合酶和乙酰乙酰基-CoA 还原酶(Schubert 等人 (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847)促进多羟基烷酸酯(PHA)的表达)。还可以组合除草剂-耐受的核酸分子和提供任意农艺学特性的核酸分子。
堆叠的组合可以通过任意方法来建立，包括，但不限于，通过任意已知方法或遗传转化或组合来育种植物。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，目标核酸分子序列可以在任意时间和以任意次序相组合。在共转化方法中，可以与由转化盒的任意组合提供的目标核酸分子同时导入所述特性。例如，如果要导入2个序列，则2个序列可以包含在分开的转化盒中(反式)，或包含在同一个转化盒中(顺式)。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望导入这样的转化盒，其会抑制目标核酸分子的表达。这可以与其它抑制盒或过表达盒的任意组合相组合，以在植物中产生希望的特性组合。进一步认识到，使用位点特异性的重组系统，可以在希望的基因组位置堆叠核酸分子。参见，例如，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，它们都通过引用并入本文。
检测方法
还提供了用于鉴别植物的方法和组合物，所述植物包含诱变过的AHAS核酸分子和多肽，包括后代和衍生物。这样的方法可以用于鉴别和/或检测在任意生物材料中含有这样的诱变过的序列的植物。这样的方法包括，例如，证实种子纯度的方法，和用于在种子批中筛选具有本发明的诱变过的序列的种子的方法。在一个实施方案中，提供了用于鉴别生物样品中的诱变过的AHAS序列的方法，其包括，形成生物样品和第一种和第二种核酸引物的混合物，所述引物能扩增诱变过的AHAS核酸分子；在允许第一种和第二种核酸引物扩增诱变过的AHAS核酸分子的条件下，使混合物反应；和，检测扩增的诱变过的AHAS序列核酸分子是否存在。
扩增的核酸分子(扩增子)可以是允许检测诱变过的AHAS序列的任意长度。例如，扩增子的长度可以是约10、50、100、200、300、500、700、100、2000、3000、4000、5000个核苷酸或更长。
也提供了用于鉴别或检测生物样品中的诱变过的AHAS序列的方法，所述方法包括，形成混合物，所述混合物含有具有芸苔属DNA的生物样品和能与诱变过的核酸分子杂交的核酸分子探针，在允许所述核酸分子探针与诱变过的AHAS核酸分子杂交的条件下，使混合物发生反应，并检测所述核酸分子探针是否与样品中的诱变过的AHAS核酸分子杂交，其中杂交的存在指示诱变过的AHAS核酸分子的存在。
转基因学
本发明也提供了用于增加植物的AHAS活性的方法，所述方法包括，用核酸构建体转化植物，所述核酸构建体包含可操作地连接到本发明的AHASL核苷酸上的启动子。所述方法包括，将本发明的核酸构建体导入至少一个植物细胞中，并由其再生转化的植物。所述核酸构建体包含至少一种编码本发明的除草剂-抗性的AHASL蛋白的核苷酸，尤其是图3和4所述的BN02-120或BN02-131的核苷酸序列，及其片段和变体。所述方法另外包括，使用能驱动植物细胞中的基因表达的启动子。在一个实施方案中，这样的启动子是组成型启动子或组织偏爱型启动子。与未转化的植物相比，通过该方法生产的植物包含增加的AHAS活性、尤其是除草剂-耐受的AHAS活性。因而，所述方法可以用于增强或增加植物对至少一种干扰AHAS酶的催化活性的除草剂（尤其是咪唑啉酮除草剂）的抗性。
在一个实施方案中，用于生产除草剂-抗性的植物的方法包括，使用核酸构建体转化植物细胞，所述核酸构建体包含可操作地连接到启动子上的核苷酸序列，所述启动子驱动在植物细胞中的表达，并从所述转化的植物细胞再生转化的植物。所述核苷酸序列选自编码本发明的除草剂-抗性的AHASL蛋白的那些核苷酸序列，尤其是图3和4所述的BN02-120或BN02-131的核苷酸序列，及其片段和变体。与未转化的植物相比，通过该方法生产的除草剂-抗性的植物包含增加的对至少一种除草剂的抗性，尤其是干扰AHAS酶的活性的除草剂，例如，咪唑啉酮除草剂或磺酰脲除草剂。
除草剂抗性和杂草控制
本发明的抑制AHAS的除草剂-抗性的植物可以用于控制杂草的方法中。因而，本发明另外提供了控制在包含本发明的AHASL核酸分子的除草剂-抗性的植物（诸如芸苔属植物）附近的杂草的方法。所述方法包括，将有效量的抑制AHAS的除草剂施用给杂草和除草剂-抗性的植物，其中与野生型植物相比，所述植物具有对至少一种抑制AHAS的除草剂（诸如咪唑啉酮或磺酰脲除草剂）的抗性。具有本发明的核酸序列的任意植物可以用于这样的方法中。在一个实施方案中，本发明的除草剂-抗性的植物是芸苔属农作物植物，包括，但不限于，欧洲油菜、芜菁和芥菜。
通过提供具有增加的对抑制AHAS的除草剂（诸如咪唑啉酮和磺酰脲除草剂）的抗性的植物，多种制剂可以用于保护植物免于杂草，从而增加植物生长，并减少对营养素的竞争。可单独地使用除草剂，在本文描述的植物的周围区域内进行杂草的苗前（pre-emergence）、苗后（post-emergence）、植前（pre-planting）和植时（at planting）的控制，或者可使用包含其它添加剂的抑制AHAS的除草剂制剂。也可将除草剂用于种子处理。即，在种子播种前或播种过程中，可将有效浓度或有效量的除草剂、或包含有效浓度或有效量的除草剂的组合物直接施用于种子。可在抑制AHAS的除草剂制剂或组合物中使用的添加剂包括其它除草剂、去污剂、佐剂、铺展剂、粘着剂、稳定剂等。除草剂制剂可以是湿润的或干燥的制剂，并可包括，但不限于，可流动性粉剂（flowable powders）、乳化浓缩物和液体浓缩物。按照常规方法，例如通过喷洒、灌溉、撒粉（dusting）、包被等，可以施用除草剂和除草剂制剂。
通过本领域已知的任何方法，包括，但不限于，种子处理、土壤处理和叶处理，可以施用用于本文提供的方法中的抑制AHAS的除草剂。
本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞对至少一种干扰AHAS酶的活性的除草剂的耐受性或抗性的方法。优选地，这样的抑制AHAS的除草剂是咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂或其混合物。更优选地，这样的除草剂是咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂或其混合物。对于本发明，咪唑啉酮除草剂包括，但不限于，PURSUIT®（咪草烟）、CADRE®（甲基咪草烟）、RAPTOR®（甲氧咪草烟）、SCEPTER®（灭草喹）、ASSERT®（imazethabenz）、ARSENAL®（灭草烟）、前述除草剂中任一种的衍生物、和前述除草剂中两种或更多种的混合物，例如，灭草烟/甲氧咪草烟（ODYSSEY®）。更具体地，咪唑啉酮除草剂可选自，但不限于，2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧]酸、[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸、和[6-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯与[2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。优选使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-]基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。特别优选使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。
对于本发明，磺酰脲除草剂包括，但不限于，氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、氟嘧磺隆、醚磺隆、酰嘧磺隆、fluzasulfuron、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡氯磺隆、四唑嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆（iodosulfuron）、环氧嘧磺隆、甲磺胺磺隆、氟磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、前述除草剂中任一种的衍生物、和前述除草剂中两种或更多种的混合物。本发明的三唑并嘧啶除草剂包括，但不限于，cloransulam、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺。本发明的嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂包括，但不限于，双草醚（bispyribac）、嘧草硫醚（pyrithiobac）、嘧草醚（pyriminobac）、嘧啶肟草醚和环酯草醚。磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂包括，但不限于，氟酮磺隆（flucarbazone）和丙苯磺隆（propoxycarbazone）。
要认识到，嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂和嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂紧密相关，并且由Weed Science Society of America归纳在后一名称的标题之下。因此，本发明的除草剂还包括嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂，包括，但不限于，上述的嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂。
本发明也提供了用于施用给公开的芸苔属植物的农业组合物。这类组合物可以包括除草剂、杀真菌剂、杀细菌剂、肥料等。在一个实施方案中，所述农业组合物是除草组合物，其包含一种或更多种除草剂、或一种或更多种除草剂与另一种农业组合物（诸如杀真菌剂、杀细菌剂、肥料等）的组合。
可以将任意除草剂施用于农作物、农作物部分或含有芸苔属植物的栽培区域，所述芸苔属植物含有本发明的AHAS-抑制剂耐受性的核酸序列。除草剂的分类法 (即，将除草剂分类成类别和子类)是本领域众所周知的，包括HRAC (除草剂抗性作用委员会（Herbicide Resistance Action Committee）)和WSSA (美国杂草科学协会（Weed Science Society of America）)的分类法。HRAC分类法可在例如网站hracglobal.com/Publications/ClassificationofHerbicideModeof Action/tabid/222/Default.aspx上在全世界范围内得到。
在有些实施方案中，本发明提供了一些方法，它们包括使用至少一种选自下述的抑制AHAS的除草剂：咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂、及其混合物。在这些方法中，通过本领域已知的任何方法，包括，但不限于，种子处理、土壤处理和叶处理，可以施用抑制AHAS的除草剂。
在有些实施方案中，所述抑制AHAS的除草剂可以与一种或更多种其它的农业组合物相组合，诸如其它的除草剂、杀真菌剂、杀细菌剂、抗病毒组合物、或它们的组合。用于所述组合中的其它除草剂包括任意除草剂，包括磺酰胺除草剂、有机磷酸盐除草剂和Benzothiadiazinone除草剂。磺酰胺除草剂包括、但不限于苯嘧磺草胺(saflufenacil)。有机磷酸盐除草剂包括、但不限于草甘膦和草铵膦。Benzothiadiazinone除草剂包括、但不限于苯达松。用于这类组合中的杀真菌剂包括、但不限于吡唑醚菌酯。
抑制原卟啉原[IX]氧化酶(PPO) 的除草剂也可以用于本发明的组合物中。抑制PPO的除草剂在本领域中是已知的，且包括、但不限于二苯基醚除草剂 (包括硝基苯基醚除草剂)，诸如三氟羧草醚 (5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酸)、甲羧除草醚 (5-(2，4-二氯苯氧基)-2-硝基苯甲酸甲酯)、DPEI (5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯乙酮肟-邻-(醋酸甲基酯))、DPEII (5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-3-甲氧基四氯苯酞)、氯氟草醚 ((1S)-1-羧乙基 2-氯-5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]苯甲酸酯)、氟磺胺草醚 (5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-N-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰胺)、乳氟草灵 (O-[5-(2-氯-α,α,α-三氟-对-甲苯氧基)-2-硝基苯甲酰基]-DL-乳酸乙酯)、和乙氧氟草醚 (2-氯-1-(3-乙氧基-4-硝基苯氧基)-4-(三氟甲基)苯)。抑制PPO的除草剂也包括二羧酰亚胺除草剂，诸如N-苯基-酞酰亚胺氟烯草酸([2-氯-5-(环己-1-烯-1,2-二羧酰亚胺基)-4-氟苯氧基]醋酸)、丙炔氟草胺 (N-(7-氟-3,4-二氢-3-氧代-4-丙-2-炔基-2H-1,4-苯并恶嗪-6-基)环己-1-烯-1,2-二羧酰胺)。抑制PPO的除草剂另外包括三唑啉酮除草剂，诸如唑草酮(α,2-二氯-5-[4-(二氟甲基)-4,5-二氢-3-甲基-5-氧代-1H-1,2,4-三唑-1-基]-4-氟苯丙酸)、和甲磺草胺 (N-[2,4-二氯-5-[4-(二氟甲基)-4,5-二氢-3-甲基-5-氧代-1H-1,2,4-三唑-1-基]苯基]甲磺酰胺)。抑制PPO的除草剂还包括苯基吡唑除草剂，包括，但不限于吡氯草胺 (1-[2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基]-4-硝基-1H-吡唑-5-胺)和吡草醚 (2-氯-5-(4-氯-5-二氟甲氧基-1-甲基吡唑-3-基)-4-氟苯氧基醋酸)。抑制PPO的除草剂还包括
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二唑酮除草剂诸如
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草酮 (3-[2,4-二氯-5-(1-甲基乙氧基)苯基]-5-(1,1-二甲基乙基)-1,3,4-二唑-2(3H)-酮)和丙炔
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草酮 (5-叔丁基-3-[2,4-二氯-5-(丙-2-炔基氧基)苯基]-1,3,4-
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二唑-2(3H)-酮)。抑制PPO的除草剂另外包括噻二唑酮除草剂，诸如嗪草酸甲酯 ([[2-氯-4-氟-5-[(四氢-3-氧代-1H,3H-[1,3,4]噻二唑并[3,4-a]亚哒嗪-1-基)氨基]苯基]硫代]醋酸)；以及在Zagar和Sievernich的US2008254985的部分III.4)中描述的那些(所述参考文献通过引用整体并入本文)。
生长素类除草剂也可以用于本发明的组合物中。生长素类除草剂包括这样的除草剂，其含有作用方式是生长素模仿物或生长素抑制剂(抗生长素)的除草活性成分。生长素类除草剂的实例包括、但不限于：毒莠定 (4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸)；麦草畏 (3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；氯贝酸 ((对-氯苯氧基)异丁酸)；2-(4-氯苯氧基)-2-甲基丙酸)；草除灵 (4-氯-2-氧代-3-苯并噻唑醋酸；4-氯-2-氧代苯并噻唑啉-3-基-醋酸)；TIBA (2,3,5-三碘苯甲酸)；2,3,6-TBA (2,3,6-三氯苯甲酸)；定草酯 (3,5,6-三氯-2-吡啶基氧基醋酸)；二氯喹啉酸 (3,7-二氯喹啉-8-羧酸)；和模仿生长素的或阻滞生长素的苯氧基除草剂，例如，苯氧基乙酸、苯氧基丙酸和苯氧基丁酸除草剂，包括：2,4-D ((2,4-二氯苯氧基)醋酸)、MCPA ((4-氯-2-甲基苯氧基)醋酸)、2,4-DB (4-(2,4-二氯苯氧基)丁酸)、2,4-DEP (三[2-(2,4-二氯苯氧基)乙基]磷酸酯)、4-CPA (4-氯苯氧基醋酸)、2,4,5-T ((2,4,5-三氯苯氧基)醋酸)、2,4-涕丙酸 (2-(2,4-二氯苯氧基)丙酸) 、2,4,5-涕丙酸 (2-(2,4,5-三氯苯氧基)丙酸)和2-甲-4氯丙酸(2-(2-甲基-4-氯-苯氧基)丙酸)。
本发明的农业组合物的组合的实例包括：灭草烟和甲基咪草烟；灭草烟和苯达松；灭草烟、甲基咪草烟和苯达松；灭草烟和吡唑醚菌酯；灭草烟、甲基咪草烟和吡唑醚菌酯；灭草烟和苯嘧磺草胺；灭草烟、甲基咪草烟和苯嘧磺草胺；甲基咪草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦；灭草烟、甲基咪草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦；甲基咪草烟和草甘膦；灭草烟和草甘膦；灭草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦；和苯嘧磺草胺和草甘膦。
在施用之前，可将抑制AHAS的除草剂转变成惯用的制剂，例如溶液、乳液、悬浮液、粉末（dusts）、粉剂、糊剂和颗粒剂。使用形式取决于特定的预期目的；在各个情况下，应当确保本发明的化合物的精细和均匀的分布。
可以以已知的方式制备制剂(参见例如，关于综述可见US 3,060,084, EP-A 707 445 (对于液体浓缩剂), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 第4版, McGraw-Hill, New York, 1963, 第8-57页，以及下述，WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566，Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance等人, Weed Control Handbook, 第8版, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989，和Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8))，例如通过用适合于配制农用化学药品的辅助剂（例如溶剂和/或载体）扩充活性化合物，如果需要，可使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、防沫剂、防冻剂，对于种子处理制剂，还任选地可用着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂。
适用于制剂的溶剂的实例包括水、芳族溶剂（例如Solvesso产品，二甲苯)、石蜡(例如矿物油级分)、醇类(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮类(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP, NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、二醇类、脂肪酸二甲基酰胺、脂肪酸和脂肪酸酯。也可使用溶剂混合物。
适用于本发明的制剂的载体的实例包括磨细的天然矿物（例如高岭土、粘土、滑石粉、白垩）和磨细的合成矿物（例如高度分散的二氧化硅、硅酸盐）。
适用于本发明的制剂的乳化剂包括非离子型和阴离子型乳化剂（例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐）。
适用于本发明的制剂的分散剂的实例包括木质素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。
适用于本发明的制剂的表面活性剂包括木质素磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪酸和硫酸化脂肪醇二醇醚的碱金属、碱土金属和铵盐，此外还有磺化萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯酚醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。
适合用于制备可直接喷施的溶液、乳液、糊剂或油分散体的物质是具有中至高沸点的矿物油级分，例如煤油或柴油，此外还有煤焦油和植物或动物来源的油，脂族烃、环烃和芳族烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘或其衍生物，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮，高极性溶剂，例如二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。
也可向制剂中加入防冻剂（例如甘油、乙二醇、丙二醇）和杀菌剂等。
适用于本发明的制剂的防沫剂包括例如基于硅或硬脂酸镁的防沫剂。
适用于本发明的制剂的防腐剂包括例如二氯苯酚和苯甲醇半甲醛（benzylalcoholhemiformaldehyde）。
本发明的种子处理制剂还可以包含粘合剂和任选的着色剂。
可以将粘合剂加入到公开的种子制剂中，以在处理后促进活性材料在种子上的附着。合适的粘合剂是嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，还有聚乙烯醇类、聚乙烯吡咯烷酮类、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚丁烯类、聚异丁烯类、聚苯乙烯、聚乙烯胺类、聚乙烯酰胺类、聚乙烯亚胺类(Lupasol®、Polymin®)、聚醚、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、甲基纤维素和源自这些聚合物的共聚物。
任选地，制剂中还可包含着色剂。种子处理制剂的合适的着色剂或染料是罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。
合适的胶凝剂的实例是角叉菜（Satiagel®）。
通过将活性物质与固体载体混合或相伴碾磨，可以制备粉末、用于撒播的材料和粉剂产品（dustable products）。
可通过将活性物质结合至固体载体来制备颗粒剂，例如包被的颗粒剂、浸渍的颗粒剂和均质的颗粒。固体载体的实例是矿物土，例如硅胶，硅酸盐，滑石，高岭土，attaclay，石灰石，石灰，白垩，红玄武土(bole)，黄土，粘土，白云石，硅藻土，硫酸钙，硫酸镁，氧化镁，磨细的合成材料，肥料，例如，硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素和植物来源的产物，例如谷类粗粉、树皮粗粉、木材粗粉和坚果壳粗粉、纤维素粉末和其它固体载体。
一般地，制剂包含0.01－95%（按重量计算）的，优选地0.1－90%（按重量计算）的抑制AHAS的除草剂。在该情况下，以90%（按重量计算）－100%（按重量计算）的纯度，优选地以95%（按重量计算）－100%（按重量计算）的纯度（根据NMR谱）使用抑制AHAS的除草剂。对于种子处理目的，可将各个制剂稀释2－10倍，从而产生即时可用的制备物中的浓度为0.01－60%（按重量计算），优选地0.1－40%（按重量计算）的活性化合物。
可就这样使用抑制AHAS的除草剂，或者以其制剂的形式或从中制备的使用形式进行使用，例如以可直接喷洒的溶液、粉剂、悬浮液或分散体、乳液、油分散体、糊剂、粉剂产品、用于撒播的材料、或颗粒剂的形式进行使用，通过喷洒、雾化、撒粉、撒播或灌注进行施用。使用形式完全取决于想要的目的；其希望在每种情况下确保本发明的抑制AHAS的除草剂的最佳可能的分布。
可通过加入水而从乳液浓缩物、糊剂或可湿性粉剂（可喷洒的粉末、油分散体）制备水性使用形式。为制备乳剂、糊剂或油分散体，借助于湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂可将就这样的或溶解在油或溶剂中的物质在水中进行均质化。然而，也可能制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂和如果合适还有溶剂或油组成的浓缩物，这样的浓缩物适合于用水进行稀释。
即时可用的制剂中的活性化合物浓度可在相对宽的范围内变化。一般地，其为0.0001－10%（按重量计算），优选地0.01－1%（按重量计算）。
抑制AHAS的除草剂还可成功地用于超低容量过程（ULV）中，可能施用包含超过95%（按重量计算）的活性化合物的制剂，或甚至施用无添加剂的活性化合物。
下面是制剂的实例：
1. 用于叶面施用的用水稀释的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释或未稀释的形式施用于种子。
A) 水溶性浓缩物（SL、LS）
将10重量份的抑制AHAS的除草剂溶解在90重量份的水或水溶性溶剂中。作为选择，可加入湿润剂或其它辅助剂。在用水稀释时，抑制AHAS的除草剂溶解，由此获得具有10%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。
B) 可分散的浓缩物（DC）
将20重量份的抑制AHAS的除草剂溶解在添加了10重量份的分散剂例如聚乙烯吡咯烷酮的70重量份的环己酮中。用水稀释产生分散体，由此获得具有20%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。
C) 可乳化浓缩物（EC）
将15重量份的抑制AHAS的除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物（在每种情况下为5重量份）的7重量份的二甲苯中。用水稀释产生乳剂，由此获得具有15%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。
D) 乳剂（EW、EO、ES）
将25重量份的抑制AHAS的除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物（在每种情况下为5重量份）的35重量份的二甲苯中。借助于乳化器（例如Ultraturrax）将该混合物导入30重量份的水中，并制备成均一的乳剂。用水稀释产生乳剂，由此获得具有25%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。
E) 悬浮剂（SC、OD、FS）
在搅动式球磨机中，将20重量份的抑制AHAS的除草剂在加入了10重量份的分散剂、湿润剂和70重量份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，从而产生精细的抑制AHAS的除草剂悬浮液。用水稀释产生抑制AHAS的除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。
F) 水分散性颗粒剂和水溶性颗粒剂（WG、SG）
将50重量份的抑制AHAS的除草剂在加入了50重量份的分散剂和湿润剂的情况下精细地进行碾磨，并借助于技术器具（例如挤出、喷雾塔、流化床）而制备为水分散性或水溶性的颗粒。用水稀释产生抑制AHAS的除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有50%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。
G) 水分散性粉剂和水溶性粉剂（WP、SP、SS、WS）
将75重量份的抑制AHAS的除草剂在加入了25重量份的分散剂、湿润剂和硅胶的情况下在转子-定子研磨机中进行碾磨。用水稀释产生抑制AHAS的除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有75%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。
I) 凝胶制剂（GF）
在搅动式球磨机中，将20重量份的抑制AHAS的除草剂在加入了10重量份的分散剂、1份重量的凝胶剂湿润剂和70重量份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，从而产生精细的抑制AHAS的除草剂悬浮液。用水稀释产生抑制AHAS的除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。该凝胶制剂适合用于种子处理。
2. 用于叶施用的非稀释地施用的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释的形式施用于种子。
A) 粉剂（DP、DS）
将5重量份的抑制AHAS的除草剂精细地碾磨，并紧密地与95重量份的精细粉碎的高岭土混合。这产生了具有5%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的粉剂产品。
B) 颗粒剂（GR、FG、GG、MG）
将0.5重量份的抑制AHAS的除草剂精细地碾磨。并将其与95.5重量份的载体组合，由此获得具有0.5%（w/w）的抑制AHAS的除草剂的制剂。现有的方法是挤出、喷雾干燥或流化床。这产生了用于叶使用的非稀释地施用的颗粒剂。
常规的种子处理制剂包括例如可流动性浓缩物FS、溶液剂LS、用于干处理的粉剂DS、用于浆处理的水分散性粉剂WS、水溶性粉剂SS和乳剂ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可以以稀释的或未稀释的形式施用于种子。在播种前施用于种子，或直接施用在种子上。
在一个实施方案中，使用FS制剂进行种子处理。一般地，FS制剂可包含1-800 g/L的活性成分、1－200 g/L的表面活性剂、0－200 g/L的防冻剂、0－400 g/L的粘合剂、0－200 g/L的色素和直至1升的溶剂，所述溶剂优选地是水。
本发明提供了本发明的除草剂-抗性的芸苔属植物的非转基因和转基因种子。这样的种子包括，例如，包含植物BnCL120C7或BnCL131A1的除草剂抗性特征的非转基因芸苔属种子，和包含编码除草剂-抗性的AHASL蛋白的本发明核酸分子的转基因种子。
关于种子处理，使用除草剂，优选选自下述的抑制AHAS的除草剂，或使用包含抑制AHAS的除草剂的制剂，处理本发明的除草剂-抗性的植物的种子，所述除草剂例如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸（imazamethabenz）、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚、嘧草硫醚及其混合物。
术语“种子处理”包括本领域已知的所有合适的种子处理技术，例如拌种（seed dressing）、种子包衣（seed coating）、种子涂粉（seed dusting）、浸种（seed soaking）和种子丸粒化（seed pelleting）。
根据本发明的一个变化形式，本发明的进一步目的是处理土壤的方法，其通过施用作为组合物/制剂的包含抑制AHAS的除草剂的颗粒制剂（例如任选地具有一种或更多种固体或液体的、农业上可接受的载体和/或任选地具有一种或更多种农业上可接受的表面活性剂的颗粒制剂）来进行，特别是施用到条播机中。有利地，在例如谷类、玉米、棉花和向日葵的苗床中使用该方法。
本发明还包括用含有至少一种AHAS抑制剂的种子处理制剂包被的或包含所述种子处理制剂的种子，所述AHAS抑制剂选自酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧草硫醚。
术语“种子”包括所有种类的种子和植物繁殖体，其包括但不限于真正的种子、插条、吸根、球茎(corm)、鳞茎(bulb)、果实、块茎、谷粒、扦插条（cuttings）、伐条（cut shoot）等，和在优选的实施方案中表示真正的种子。
术语“用...包被和/或包含”一般表示，活性成分在施用时绝大部分存在于繁殖产品的表面上，尽管依赖于施用方法，或多或少的成分可能渗透入繁殖产品中。当（重新）种植所述繁殖产品时，其可能吸收活性成分。
在植物播种前和植物出苗前，通过对种子进行喷洒或撒粉，使用抑制AHAS的除草剂或使用包含抑制AHAS的除草剂的制剂来施行种子处理应用。
在种子的处理中，通过用有效量的抑制AHAS的除草剂或包含抑制AHAS的除草剂的制剂处理种子来施用对应的制剂。本文，施用率通常是0.1 g－10 kg a.i.（或a.i.的混合物，或制剂）/100 kg种子，优选地1 g－5 kg/100 kg种子，特别地1 g－2.5 kg/100 kg种子。对于特定的作物例如莴苣，施用率可更高。
可以将施用于本发明的芸苔属植物上的任意除草剂制剂制备成“罐-混合”组合物。在这样的实施方案中，每个成分或成分的组合可以彼此分开储存。然后在施用前，将成分彼此混合。通常，这样的混合可以发生在施用前不久。在罐-混合过程中，每个成分在混合之前通常存在于水或合适的有机溶剂中。用于制备这样的制剂的方法和指导，在本领域中是已知的。
所述方法另外允许开发与本发明的芸苔属植物一起使用的除草剂组合。在这样的方法中，评价栽培区域的环境条件。可以评价的环境条件包括、但不限于：地面和表面水污染问题、农作物的预期用途、农作物耐受性、土壤残留物、在栽培区域中存在的杂草、土壤质地、土壤pH、土壤中有机物质的量、施用设备、和耕耘实践。在评价环境条件后，可以将有效量的除草剂的组合施用于农作物、农作物部分、农作物种子或栽培区域。
在有些实施方案中，施用于本发明的芸苔属植物上的除草剂用于防止易感的杂草或不希望的植物的生长的开始，和/或用于造成对在目标区域中生长的杂草或不希望的植物的破坏。在有些实施方案中，除草剂或除草剂混合物对影响随后种植在目标区域(即，栽培场地或区域)中的农作物的杂草或不希望的植物发挥这些作用。在所述方法中，除草剂组合的施用不需要同时发生。只要种植农作物的场地含有可检测量的第一种除草剂，且在农作物处于栽培区域期间的某时施用第二种除草剂，认为农作物已经经过根据本发明的除草剂混合物的处理。因而，提供的方法包括作为“萌前” 、“萌后” 、“植前掺入”的除草剂的施用，和/或包含在种植之前的种子处理。
另外，提供了用于包被本发明的芸苔属种子的方法。所述方法包括，用有效量的除草剂或除草剂组合(如本文别处所公开的)包被种子。所述种子然后可以种植在栽培区域中。另外提供了具有包衣的芸苔属种子，所述包衣含有有效量的除草剂或除草剂组合(如本文别处所公开的)。
“萌前”是指这样的除草剂，其在植物可见地从土壤中显现出来之前和/或种子发芽之前，施用于目标区域(例如，栽培场地或区域) 。“萌后”是指这样的除草剂，其在植物可见地从土壤中显现出来之后，施用于区域。在某些情况下，针对目标区域中的杂草或不希望的植物来使用术语“萌前”和“萌后”，且在某些情况下，针对目标区域中的农作物植物使用这些术语。当针对杂草或不希望的植物使用时，这些术语可以仅适用于存在于或被认为存在于目标区域中的杂草的特定种类、或杂草或不希望的植物的物种。尽管任意除草剂可以施用于萌前和/或萌后处理中，已知当萌前或萌后施用时，有些除草剂可以更有效地控制一种或复数种杂草或不希望的植物。例如，砜嘧磺隆具有萌前和萌后活性，而其它除草剂优势地具有萌前(丙草胺)或萌后(草甘膦)活性。特定除草剂的这些性质在本领域中是已知的，且可以由本领域技术人员容易地确定。另外，本领域技术人员能够容易地选择对于本发明的转基因植物和/或种植本发明的转基因植物的区域而言合适的除草剂和施用次数。“植前掺入”包括，在种植之前，将化合物掺入土壤中。
因而，提供了栽培农作物和/或控制杂草或不希望的植物的改良方法，例如，“植前‘烧毁’(burn down)”，其中在种植目标农作物之前，用一种或更多种除草剂处理区域，以便更好地控制杂草或不希望的植物。另外提供了栽培农作物和/或控制杂草或不希望的植物的方法，它们是“无耕作”或“低耕作” (也称作“减少的耕作”)。在这样的方法中，不耕作土壤，或在栽培周期中以与传统方法相比更低的频率耕作土壤；这些方法可以节省成本，这些成本否则会由于额外的耕作而发生，包括劳动力和燃料成本。
所述方法包括同时和/或相继施用多种除草剂。在有些实施方案中，所述方法包括，用仅一种除草剂或其它化学试剂（例如，咪唑啉酮除草剂）处理本发明的植物和/或目标区域 (例如，栽培场地或区域)和/或杂草和/或不希望的植物。
在优化杂草或不希望的植物控制过程中，向目标区域(和其中的任意植物)施用除草剂的时间可能是重要的。施用除草剂的时间，可以根据植物大小和/或目标区域中植物（例如，在该区域中生长的农作物植物或杂草或不希望的植物）的生长和/或发育阶段来确定。植物的生长和/或发育阶段在本领域中是已知的。因而，例如，向植物生长的目标区域施用除草剂或其它化学试剂的时间，可以是在一个特定区域中的一些或所有植物已经达到至少特定大小和/或生长和/或发育阶段的时间，或在一个特定区域中的一些或所有植物尚未达到特定大小和/或生长和/或发育阶段的时间。
在有些实施方案中，本发明的芸苔属植物表现出提高的对萌后除草剂处理的耐受性。例如，本发明的芸苔属植物可以耐受更高剂量的除草剂，耐受更宽范围的除草剂(即，耐受更多AHAS 抑制剂化学试剂)，和/或可以耐受与适当对照植物相比在更早或更晚的发育时间施用的除草剂剂量。
不同的化学试剂（诸如除草剂）具有不同的“残余”作用，即，化学试剂或除草剂处理对生长在处理过的区域中的植物继续具有作用的不同时间量。这样的作用可以是希望的或不希望的，取决于处理过的区域的希望的将来目的 (例如，栽培场地或区域)。因而，基于将要用于每种农作物的处理的残余作用和它们对以后将要种植在相同区域中的农作物的作用，可以选择轮作方案。本领域技术人员熟知可以用于评价除草剂的残余作用的技术；例如，起抑制AHAS的作用的除草剂在它们的残余活性水平方面存在差异。不同除草剂的残余活性在本领域中是已知的，且也已知随不同的环境因素而变化，例如，土壤湿度水平、温度、pH和土壤组成(质地和有机物质)。本发明的芸苔属植物特别适用于其中提高的对除草剂残余活性的耐受性是有益的农作物栽培方法中。
另外，本发明的芸苔属植物会提供提高的对其它化学试剂处理的耐受性，所述其它化学试剂与除草剂处理联合用于农作物，诸如安全剂、佐剂诸如磺酸铵和农作物油浓缩物等。
另外，公开的方法可以包括使用抑制AHAS的除草剂或除草剂混合物、以及一种或更多种其它的杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学灭生剂、化学信息素、驱除剂、引诱剂、信息素、进食刺激剂或其它生物活性化合物或昆虫致病性的细菌、病毒或真菌，以形成多组分混合物，产生甚至更广谱的农业保护。可以用于所述方法中的这样的农业保护剂的实例包括：杀昆虫剂诸如阿巴克丁、高灭磷、啶虫脒、amidoflumet(S-1955)、阿佛菌素、印楝素、保棉磷、联苯菊酯、联苯肼酯、噻嗪酮、克百威、杀螟丹、氟唑虫清、氟啶脲、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、可尼丁、cyflumetofen、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、狄氏剂、二氟苯隆、dimefluthrin、乐果、dinotefuran、苯虫醚、埃玛菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫清、苯硫威、双氧威、甲氰菊酯、杀灭菊酯、锐劲特、氟啶虫酰胺、flubendiamide、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、flufenerim(UR-50701)、氟虫脲、fonophos、氯虫酰肼、氟铃脲、氟蚁腙、吡虫啉、茚虫威、异丙胺磷、氟丙氧脲、马拉硫磷、metaflumizone、灭蜗灵、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、蒙五一五、甲氧滴滴涕、metofluthrin、久效磷、甲氧苯酰肼、烯啶虫胺、nithiazine、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、杀线威、对硫磷、甲基对硫磷、氯菊酯、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、profluthrin、拒嗪酮、pyrafluprole、除虫菊素、啶虫丙醚、pyriprole、蚊蝇醚、鱼藤酮、兰尼碱、多杀菌素、spirodiclofen 、spiromesifin (BSN 2060)、spirotetramat、乙丙硫磷、虫酰肼、伏虫隆、七氟菊酯、特丁磷、杀虫威、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫双、四溴菊酯、唑蚜威、敌百虫和杀虫隆；杀真菌剂如苯并噻二唑、aldimorph、amisulbrom、azaconazole、嘧菌酯、苯霜灵、苯菌灵、苯噻菌胺、苯噻菌胺异丙酯、binomial、联苯、联苯三唑醇、杀稻瘟菌素-S、波尔多液(三碱基硫酸铜)、boscalid/nicobifen、糠菌唑、磺嘧菌灵、丁硫丹、萎锈灵、环丙酰菌胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、乙菌利、克霉唑、氧氯化铜、铜盐诸如硫酸铜和氢氧化铜、cyazofamid、cyflunamid、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺、苯氟磺胺、双氯氰菌胺、哒菌酮、氯硝胺、乙霉威、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、醚菌胺(dimoxystrobin)、烯唑醇、烯唑醇-M、消螨普、discostrobin、二噻农、十二环吗啉、多果定、益康唑、乙环唑、克瘟散、氟环唑、ethaboxam、乙菌定、ethridiazole、
Figure 395817DEST_PATH_IMAGE001
唑菌酮、咪唑菌酮、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、丙森锌、甲呋酰胺、fenhexamide、fenoxanil、拌种咯、苯锈啶、芬普福、三苯基乙酸锡、三苯基氢氧化锡、福美铁、ferfurazoate、嘧菌腙、氟啶胺、咯菌腈、flumetover、fluopicolide 、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟喹唑、氟硅唑、磺菌胺、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、乙膦铝、麦穗宁、呋霜灵、furametapyr、己唑醇、hymexazole、双胍辛胺、烯菌灵、imibenconazole、培福朗、iodicarb、种菌唑、异稻瘟净、异菌脲、iprovalicarb、异康唑、稻瘟灵、春雷霉素、醚菌酯、代森锰锌、mandipropamid、代森锰、mapanipyrin、精甲霜灵、灭锈胺、甲霜灵、叶菌唑、磺菌威、代森联、苯氧菌胺/fenominostrobin、嘧菌胺、苯菌酮、咪康唑、腈菌唑、甲胂铁胺(甲基胂酸铁)、氟苯嘧啶醇、辛噻酮、甲呋酰胺、orysastrobin、霜灵、奥索利酸、oxpoconazole、氧化萎锈灵、多效唑、戊菌唑、戊菌隆、penthiopyrad、perfurazoate、膦酸、苯酞、picobenzamid、picoxystrobin、多氧菌素、噻菌灵、咪鲜胺、腐霉利、霜霉威、盐酸霜霉威、丙环唑、丙森锌、丙氧喹啉、丙硫菌唑、唑菌胺酯、pryazophos、消斑肟、嘧霉胺、消斑肟、pyrolnitrine、咯喹酮、quinconazole、喹氧灵、五氯硝苯、silthiofam、simeconazole、spiroxamine、链霉素、硫、戊唑醇、techrazene、叶枯酞、四氯硝基苯、氟醚唑、涕必灵、噻呋酰胺、硫菌灵、甲基硫菌灵、福美双、噻酰菌胺、甲基托氯磷、甲苯氟磺胺、三唑酮、三唑醇、嘧菌醇、咪唑嗪、克啉菌、trimoprhamide三环唑、肟菌酯、嗪氨灵、灭菌唑、烯效唑、有效霉素、乙烯菌核利、代森锌、福美锌和zoxamide；杀线虫剂如涕灭威、杀线威和克线磷：杀细菌剂如链霉素；杀螨剂如双甲脒、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、乙螨唑、喹螨醚、杀螨锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨酮和吡螨胺；和生物制剂，包括昆虫致病性细菌，诸如苏云金芽孢杆菌亚种Aizawai、苏云金芽孢杆菌亚种Kurstaki和包囊化的苏云金芽孢杆菌的δ内毒素(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；昆虫致病性真菌，诸如绿僵病真菌；和昆虫致病性病毒，包括杆状病毒、核多角体病毒(NPV)诸如HzNPV、AfNPV；和颗粒症病毒(GV) 诸如CpGV。这些不同的混合配偶体与在所述方法中使用的其它组合物（例如杀虫剂）的重量比通常是在100:1至1:100之间，或在30:1至1:30之间、在10:1至1:10之间、或在4:1至1:4之间。
另外提供了组合物，其包含生物学有效量的抑制AHAS的目标除草剂或除草剂的混合物和有效量的至少一种其它生物活性化合物或试剂，且还可以包含表面活性剂、固体稀释剂或液体稀释剂中的至少一种。这样的生物活性化合物或试剂的实例是：杀虫剂诸如阿巴克丁、高灭磷、啶虫脒、amidoflumet(S-1955)、阿佛菌素、印楝素、保棉磷、联苯菊酯、binfenazate、噻嗪酮、克百威、氟唑虫清、氟啶脲、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、可尼丁、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、二氟苯隆、乐果、苯虫醚、埃玛菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫清、fenothicarb、双氧威、甲氰菊酯、杀灭菊酯、锐劲特、氟啶虫酰胺、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、flufenerim(UR-50701)、氟虫脲、fonophos、氯虫酰肼、氟铃脲、吡虫啉、茚虫威、异丙胺磷、氟丙氧脲、马拉硫磷、灭蜗灵、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、蒙五一五、甲氧滴滴涕、久效磷、甲氧苯酰肼、nithiazin、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、杀线威、对硫磷、甲基对硫磷、氯菊酯、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、拒嗪酮、啶虫丙醚、蚊蝇醚、鱼藤酮、多杀菌素、spiromesifin (BSN 2060)、乙丙硫磷、虫酰肼、伏虫隆、七氟菊酯、特丁磷、杀虫威、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫双、四溴菊酯、敌百虫和杀虫隆；杀真菌剂如苯并噻二唑、嘧菌酯、苯菌灵、杀稻瘟菌素-S、波尔多液(三碱基硫酸铜)、糠菌唑、环丙酰菌胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、氧氯化铜、铜盐、cyflunamid、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺、(S)-3,5-二氯-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)-4-甲基苯甲酰胺(RH7281)、双氯氰菌胺(S-2900)、哒菌酮、氯硝胺、苯醚甲环唑、(S)-3,5-二氢--5-甲基-2-(甲硫基)-5-苯基-3-(苯基氨基)-4H-咪唑-4-酮(RP407213)、烯酰吗啉、醚菌胺(dimoxystrobin)、烯唑醇、烯唑醇-M、多果定、克瘟散、氟环唑、
Figure 952012DEST_PATH_IMAGE001
唑菌酮、咪唑菌酮、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、丙森锌(SZX0722)、拌种咯、苯锈啶、芬普福、三苯基乙酸锡、三苯基氢氧化锡、氟啶胺、咯菌腈、flumetover (RPA403397)、flumorf/flumorlin (SYP-L190)、氟嘧菌酯(HEC5725)、氟喹唑、氟硅唑、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、乙膦铝、呋霜灵、furametapyr (S-82658)、己唑醇、种菌唑、异稻瘟净、异菌脲、稻瘟灵、春雷霉素、醚菌酯、代森锰锌、代森锰、精甲霜灵、灭锈胺、甲霜灵、叶菌唑、苯氧菌胺/fenominostrobin (SSF-126)、苯菌酮(AC375839)、腈菌唑、甲胂铁胺(甲基胂酸铁)、nicobifen (BAS510)、orysastrobin、霜灵、戊菌唑、戊菌隆、噻菌灵、咪鲜胺、霜霉威、丙环唑、丙氧喹啉(DPX-KQ926)、丙硫菌唑(JAU6476)、啶斑肟、唑菌胺酯、嘧霉胺、咯喹酮、喹氧灵、spiroxamine、硫、戊唑醇、氟醚唑、涕必灵、噻呋酰胺、甲基硫菌灵、福美双、噻酰菌胺、三唑酮、三唑醇、三环唑、肟菌酯、灭菌唑、有效霉素和乙烯菌核利；杀线虫剂如涕灭威、杀线威和克线磷：杀细菌剂如链霉素；杀螨剂如双家脒、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、乙螨唑、喹螨醚、杀螨锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨酮和吡螨胺；和生物制剂，包括昆虫致病性细菌，诸如苏云金芽孢杆菌亚种Aizawai、苏云金芽孢杆菌亚种Kurstaki和包囊化的苏云金芽孢杆菌的δ内毒素(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；昆虫致病性真菌，诸如绿僵病真菌；和昆虫致病性病毒，包括杆状病毒、核多角体病毒(NPV)诸如HzNPV、AfNPV；和颗粒症病毒(GV) 诸如CpGV。所述方法也可以包括使用遗传转化成表达对无脊椎害虫具有毒性的蛋白(如苏云金芽孢杆菌δ内毒素)的植物。在这样的实施方案中，外源施用的无脊椎害虫控制化合物的作用可能与表达的毒素蛋白协同。
因而，所述方法可以采用抑制AHAS的除草剂或抑制AHAS的除草剂组合，且可以另外包含杀昆虫剂和/或杀真菌剂和/或其它农业化学试剂（诸如肥料）的应用。这样的组合处理的应用，可以拓宽针对其它杂草物种的活性范围，并抑制任意抗性生物型的增殖。
本发明提供了用于防治不希望的植被或控制杂草的方法，所述方法包括，在播种前和/或在催芽后，将本发明的抗性植物的种子与抑制AHAS的除草剂接触。所述方法还可包括，例如，在田间的土壤中或在温室中的盆栽介质中播种种子。所述方法特别地可用于在紧邻种子的附近防治不希望的植被或控制杂草。
“控制不希望的植被”可理解为表示，杀死杂草和/或延缓或抑制杂草的正常生长。杂草，在广义上理解为表示在不希望其生长的位置处生长的所有植物。
本发明的杂草包括，例如，双子叶和单子叶的杂草。双子叶杂草包括，但不限于下述属的杂草：白芥属（Sinapis）、独行菜属（Lepidium）、拉拉藤属（Galium）、繁缕属（Stellaria）、母菊属（Matricaria）、春黄菊属（Anthemis）、牛膝菊属（Galinsoga）、藜属（Chenopodium）、荨麻属（Urtica）、千里光属（Senecio）、苋属（Amaranthus）、马齿苋属（Portulaca）、苍耳属（Xanthium）、旋花属（Convolvulus）、番薯属（Ipomoea）、蓼属（Polygonum）、田菁属（Sesbania）、豚草属（Ambrosia）、蓟属（Cirsium）、飞廉属（Carduus）、苦苣菜属（Sonchus）、茄属（Solanum）、蔊菜属（Rorippa）、节节菜属（Rotala）、母草属（Lindernia）、野芝麻属（Lamium）、婆婆纳属（Veronica）、苘麻属（Abutilon）、刺酸模属（Emex）、曼陀罗属（Datura）、堇菜属（Viola）、鼬瓣花属（Galeopsis）、罂粟属（Papaver）、矢车菊属（Centaurea）、车轴草属（Trifolium）、毛茛属（Ranunculus）和蒲公英属（Taraxacum）。单子叶杂草包括，但不限于下述属的杂草：稗属（Echinochloa）、狗尾草属（Setaria）、黍属（Panicum）、马唐属（Digitaria）、梯牧草属（Phleum）、早熟禾属（Poa）、羊茅属（Festuca）、蟋蟀草属（Eleusine）、臂形草属（Brachiaria）、黑麦草属（Lolium）、雀麦属（Bromus）、燕麦属（Avena）、莎草属（Cyperus）、高梁属（Sorghum）、冰草属（Agropyron）、狗牙根属（Cynodon）、雨久花属（Monochoria）、飘拂草属（Fimbristyslis）、慈姑属（Sagittaria）、荸荠属（Eleocharis）、藨草属（Scirpus）、雀稗属（Paspalum）、鸭嘴草属（Ischaemum）、尖瓣花属（Sphenoclea）、龙爪茅属（Dactyloctenium）、剪股颖属（Agrostis）、看麦娘属（Alopecurus）、假剪股颖属（Apera）。
此外，本发明的杂草可包括，例如，生长在不希望的位置处的作物植物。例如，如果在大豆植物的田中不想要玉米植物，那么可以将在主要包含大豆植物的田中的自生自长的玉米植物当作杂草。
本文所用的冠词“一个”和“一种”是指该冠词的一个或多于一个（即，至少一个）的语法对象。举例而言，“一种成分”表示一种或更多种成分。
本文使用的单词“包含”或变化例如“包括”，将理解为表示包括所述的成分、整数或步骤或者成分、整数或步骤的组，但不排除任何其它的成分、整数或步骤或者成分、整数或步骤的组。
通过举例说明但非限定性地提供下述实施例。
实施例1 –突变型AHAS序列的制备
在建立突变型序列之前，使用
Figure 637388DEST_PATH_IMAGE002
Figure 84736DEST_PATH_IMAGE004
，分别从系BN-02 (图3和4)、系97 (含有在AHAS III中的S653N的BN-02，图3和3)和BN-11，扩增欧洲油菜AHAS I和III的整个编码序列，克隆、并测序，用作用于对比目的的参照序列。
1A. 基因修复寡核苷酸 (GRON) 设计
设计基于得到的AHAS III核酸序列的一系列基因修复寡核苷酸(GRON，如表1所示)，以在AHAS编码区中特异性地导入核酸突变，其导致与编码的AHAS III蛋白的位置122（基于拟南芥属AHAS的氨基酸编号）相对应的丙氨酸至苏氨酸氨基酸置换。设计GRON，以在AHAS III中导入GCT至ACT核苷酸变化。使用这些GRON序列，仅AHAS III核酸序列被靶向该变化。
表1. GRON序列。
Figure 819474DEST_PATH_IMAGE005
转换碱基用粗体显示。V=CY3；H=3'DMT dC CPG
1B. 细胞培养工作描述
1B.1 靶向春季芸苔系97的AHAS III基因中的A122T突变的基因修复寡核苷酸(GRON)导入实验
使用叶原生质体，从以前的Rapid Trait Development System™ (Cibus LLC, San Diego, CA, “RTDSTM ” )实验，衍生出芸苔系97，所述叶原生质体来自称作BN-02的芸苔属品种的单倍体的、小孢子-衍生的小植株。系97含有在与AHAS III蛋白的氨基酸位置653相对应的位置处的突变。所述突变由AGT至AAT的密码子变化编码，且导致丝氨酸至天冬酰胺置换，这会提供对咪草烟的耐受性。相同基因中A122T突变的添加导致与单个突变相比咪唑啉酮-耐受性的极大增强。
进行RTDSTM 实验的目的是，在系97的AHAS III基因中导入其它突变。从已经用0.5和0.2 µM Imi选择的原生质体-衍生的愈伤组织，再生系97。在10 µM Imi的浓度，选择A122T:S653N双突变。用于该实验的方法描述在部分1B.2-1B.6中。
1B.2 用于分离叶原生质体的材料的繁殖
在体外无菌条件下，繁殖从小孢子-衍生的胚衍生出的单倍体芽。每2 - 4 周继代培养扦插条，并在装有40 - 45 mL体积的RS培养基(Dovzhenko A., 2001)的培养皿 (90 mm x 20 mm)中培养。用微孔带 (3M Company)密封培养皿。切断幼叶，并用于原生质体分离。
1B.3 原生质体分离和纯化
在装有5 mL pH调至5.8的培养基B (Pelletier 等人, 1983)的培养皿中，用解剖刀将来自2-3周龄体外芽的约600 mg叶组织切成小条。1 h后，将培养基B替换为12 ml过滤除菌的酶溶液，其由其中溶解了0.5%纤维素酶YC和0.75%浸解酶R10 (二者购自Karlan Research Products, Cottonwood, Arizona)、1 g/L牛血清白蛋白、和1 g/L 2-吗啉代乙磺酸的培养基B组成。真空-浸润酶溶液，随后在黑暗中在25℃温育装有在酶溶液中的叶小片的培养皿16-18 h。使用碘克沙醇密度梯度，进行原生质体纯化。密度梯度离心后，与约5 mL W5培养基一起，取出含有纯化的原生质体的带。使用血细胞计数器测定原生质体产量，并在4℃储存原生质体2 h。
1B.4 基因修复寡核苷酸(GRON)导入
将原生质体悬浮液与等体积的冷培养基W5一起混合，转移至50 mL离心试管，并在临床离心的最低设置(约50 x g)离心10 min。取出上清液，并替换为TM培养基(Klaus, S. 2003)，调节原生质体密度至5 x 106/mL。将各自含有2.5 x 106 原生质体的500 µL等分试样分配在50 mL离心试管中。如下将GRON (例如 BnALS1122/C/41/5’Cy3/3’idC；参见表1)递送给原生质体：将它与聚乙二醇 (PEG)相混合，并在置于冰上的旋转器中混合它。每500 μL处理体积使用大约12 - 300 μg GRON。然后使用离心，收集原生质体，并在暗处在4℃储存过夜。
1B.5 将原生质体包埋在藻酸钙中
然后基于在Dovzhenko (2001)中所述的方法，将原生质体包埋在凝胶(例如，琼脂糖、藻酸盐)中。已经证实，将原生质体包埋在凝胶基质中，会增强原生质体存活，并增加原生质体-衍生的细胞的分裂频率。PEG-GRON处理后1天，将从一个处理过的样品衍生出的原生质体转移至50 mL离心试管，并允许达到室温。将试管在临床离心的最低设置(约50 x g)离心10 min。将沉淀物重新悬浮于2.75 mL培养基B (浓度降低至131 mg/L的二水氯化钙)，并在V-型60 mL试剂盆中与在相同的减少钙的培养基B中的2.75 ml 2.8% (w/v)藻酸钠溶液相混合。用多通道吸量管(使用预切尖，以提供更宽的开口)吸取原生质体-藻酸盐悬浮液，并将40 µL等分试样滴入50 mL藻酸钙培养基中。
1B.6 原生质体培养和咪唑啉酮-耐受的愈伤组织的选择
使用在与Pelletier 等人 (1983) Mol. Gen. Genet. 191:244-250所述的那些类似的培养基中的藻酸盐珠子的连续继代培养(参见表2)，选择咪唑啉酮-耐受的愈伤组织。在10 µM咪唑啉酮浓度进行PEG/GRON处理后1周，开始选择。除草剂向培养基中的加入不具有瞬即效应。最初，在没有咪唑啉酮存在的早期培养阶段已经形成的所有微菌落继续生长，但是低于没有添加除草剂的对照。在开始选择后1-2周，大多数菌落的生长减慢或停止。
在原生质体包埋后3周，通过用含有50 mM 柠檬酸钠的培养基处理它们30 - 45 min，从藻酸盐释放出细胞和微菌落。释放后，大多数菌落死亡，或由覆盖着死细胞外层的浅绿色中心组成。转移至固化的选择培养基E后，大多数仍然含有活细胞的微愈伤组织停止生长，并变成褐色。单个愈伤组织的有限生长继续，但是所有非-耐受的愈伤组织最终变成褐色。转移至固化的选择培养基后2-3周(偶尔更早)，活跃生长的愈伤组织出现在褐色细胞和微愈伤组织背景中。
表2. 用于选择咪草烟-耐受的愈伤组织的方法，从一个PEG/GRON-处理过的2.5 x 106原生质体样品开始。
天 步骤
-1 放入酶溶液。
0 纯化原生质体和PEG/GRON处理，在4℃在培养基B中过夜。
1 在藻酸盐中包埋原生质体；在20 mm x 150 mm 培养皿中，在20 mL培养基B中，培养约5 ml 40 µL珠子。
8 用培养基C替换一半液体培养基；加入10 µM的咪唑啉酮。
15 用含有10 µM咪唑啉酮的新鲜培养基C替换液体培养基。
22 从藻酸盐释放细胞；在含有10 µM咪唑啉酮的新鲜培养基C中培养。
29 用含有10 µM咪唑啉酮的新鲜培养基C替换液体培养基。
36 将细胞/微愈伤组织转移至琼脂固化的培养基E，10 µM咪唑啉酮，在145 x 20 mm培养皿中。
50 – 57 鉴别生长的愈伤组织，再次转移至琼脂固化的培养基E，10 µM咪唑啉酮。
3 - 4 周后 鉴别生长的愈伤组织，用于继代培养和分析；抛弃不生长的愈伤组织。
1B.7 从原生质体-衍生的、咪唑啉酮-耐受的、含有在AHAS III基因中的A122T:S653N双突变的愈伤组织再生植物
将已经在固化的选择培养基上发育、且已经证实具有靶向的突变(参见下面的实施例1C)的咪唑啉酮-耐受的愈伤组织转移至不含除草剂的培养基E，以加速发育。单个愈伤组织系在它们的生长速率和形态学方面存在差异。一般而言，向芽再生的发育遵循以下步骤:
未分化的绿色愈伤组织→具有深绿色区域的愈伤组织→根的发育→芽头的发育→具有超度含水的(玻璃化的)叶子的发育障碍芽的发育。
单个愈伤组织系的发育是可变的，但是通过在培养基E上的连续继代培养和繁殖、或用更低浓度的NAA修饰培养基E， 会增加获得芽形成事件的机会。
一旦芽已经在培养基E上形成并已经形成3-4片叶子，将它们转移至RS培养基(Dovzhenko, 2001)。在该培养基上，新形成的芽和叶组织随时间发育，其在形态学上是‘正常的’ (即，非-超度含水的)。随后，使用标准方法来硬化小植株，并转移至温室中。
1C. 分子筛选
关于导入的A122T突变的存在，筛选来自表现出对咪草烟的耐受性的愈伤组织的基因组DNA。使用，Edwards 等人 (1991) Nucleic Acids Research 19(6): 1349的规程，提取基因组DNA。由于AHAS I和III不含有任何内含子，从基因组DNA进行PCR是可行的。使用基因特异性的(GS)引物
Figure 428310DEST_PATH_IMAGE006
Figure 290217DEST_PATH_IMAGE007
和
Figure 300899DEST_PATH_IMAGE008
Figure 206538DEST_PATH_IMAGE009
来扩增含有AHAS III的A122 位置的区域。在纯化得到的扩增子和定量后，使用得到的扩增子作为等位基因特异性(AS) PCR反应的模板。使用3-引物混合物
Figure 302670DEST_PATH_IMAGE010
Figure 201225DEST_PATH_IMAGE011
Figure 66412DEST_PATH_IMAGE012
和
Figure 142953DEST_PATH_IMAGE013
Figure 414796DEST_PATH_IMAGE014
– 主要混合物40)来检测A122T突变的存在。设计内部引物 (BnALS1R2A)，使得当ACT (苏氨酸)密码子存在时，只有它会对合和形成产物，与BnALSOF5配对。
使用与在AS-PCR筛选中使用的相同的基因组DNA 模板，对于表现出A122T变化的所有愈伤组织，重复该基因-特异性的PCR。这次，从1% Tris-醋酸盐 EDTA凝胶对扩增子进行凝胶纯化，并在A122区域测序，以证实该变化。在证实后，从愈伤组织组织制备独立的基因组DNA样品，并再次对A122区域测序。
在已经证实来自给定的愈伤组织系的2个独立样品中A122T突变的存在后，对AHAS基因 I和III进行整体测序，以检查任意其它未预期的单核苷酸多态性(SNP)。使用
Figure 664512DEST_PATH_IMAGE015
Figure 587469DEST_PATH_IMAGE016
(对于基因I)，扩增全长基因，并克隆进TopoPCR2.1 (Invitrogen)。对每个基因的4个克隆测序，以将PCR误差与真正SNP区分开。
使用Bio-sprint仪器(Qiagen)，从由筛选的愈伤组织再生的植物组织提取基因组DNA，并再次筛选，以证实突变的存在。使用引物进行基因-特异性的PCR (GS-PCR)，以扩增在基因III中含有
Figure 897227DEST_PATH_IMAGE017
Figure 154902DEST_PATH_IMAGE018
序列的区域（具有系97背景植物），以证实它们的存在。
鉴别出共18个愈伤组织系，其中通过测序AHAS III基因，证实了A122T突变和S653N突变的存在。这些愈伤组织系中的12个再生出芽。除了1个系以外，双突变体系是AHAS III中的A122T和S653N突变纯合的(即，单倍体或纯合的二倍体)。最高等的系BnCL131A1生产了几克种子。每株植物的产量与二倍体植物的产量相当，这意味着，在选择/再生过程的某些点处，自发的二倍体化已经发生。使用该系的花粉对2个冬季油料种子芸苔(WOSR)品种BN-11和BN-19的子房授粉。另外，将来自BnCL131A1系的种子保藏于ATCC，作为登记号PTA-9279。还保藏了2个另外的系BnCL140B3和BnCL140C7，二者都含有编码AHAS III中的A122T和S653N突变的诱变过的AHAS核酸分子，分别作为登记号PTA-9402和PTA-9403。
还鉴别了另一个仅含有AHAS III序列中的A122T突变的芸苔属系。该系BnCL120C7的种子也保藏在ATCC，作为登记号PTA-9278。
实施例2: 来自欧洲油菜植物提取物和完整植物的AHAS酶活性
从种子栽培系BN02 (野生型)、PM1/PM2 (2个突变型基因，参见，例如美国专利号7,355,098)、BnCL131A1 (AHAS III A122T S653N 双突变型)和BnCL120C7 (AHAS III A122T 单个突变型) 的植物，直到3-4叶阶段，然后收获。在没有或有从100至0.78 μM的甲氧咪草烟的8个系列稀释存在下，根据Singh 等人(1988 Assay of Acetohydroxyacid Synthase. Analytical Biochemistry 171, 173-179.)，一式三份测定细胞提取物的AHAS活性。将活性表示为未抑制的(无甲氧咪草烟)活性的百分比(图1)。在图1中显示的图描述了来自3个种植日期的每个甲氧咪草烟浓度的平均百分比未抑制结果，各自具有2-3次重复，共7个独立的提取试验。误差棒代表 ± 2个平均值标准误差。
另外，与野生型植物相对比，分析了含有双突变体的欧洲油菜植物 (3-4叶阶段) 对甲氧咪草烟处理的应答。通过叶喷雾，用210 g ai/ha的甲氧咪草烟（添加了0.5% v/v Merge）处理系BN02 (野生型)和BnCL131A1 (AHAS III A122T:S653N, 双突变型)，或不喷雾作为检查。在处理后3周，评价处理过的植物，结果如图2所示。图2提供了植物 BN02 (上行)和BnCL131A1 (下行)的结果。从图2可以看出，野生型 BN-02植物几乎不耐受210 g ai/ha的甲氧咪草烟施用，而BnCL131A1系几乎完全耐受这样的施用。
还测试了含有双突变体的欧洲油菜植物的由咪唑啉酮除草剂施用造成的植物损伤。从种子栽培系BN02 (野生型)、BnCL131A1 (AHAS III A122T:S653N 双突变型)、BnCL120C7 (AHAS III A122T 单个突变型)、BnCL97 (AHAS III S653N 单个突变型)、PM1/PM2 (商业的双基因检查)、PM1 (AHAS I S653N 单个突变型)和PM2 (AHAS III W574L 单个突变型)的欧洲油菜植物，直到3-4叶阶段，然后不喷雾，或用35、70或210 g ai/ha的甲氧咪草烟（添加了0.5% v/v Merge）喷雾。在处理后2周 (DAT)，使用0至9等级（其中0是无损伤，9是植物死亡），对每个系的8-24株植物评价除草剂损伤。在下面的表3中，将结果表示为平均损伤 ± 1平均值标准误差。表示的结果覆盖了2个独立的种植，且除了BnCL97以外的所有系都喷雾。该表也呈现了± 1个平均值标准误差的值。
表3
Figure 208309DEST_PATH_IMAGE019
实施例3: 用甲氧咪草烟处理过的欧洲油菜植物的除草剂损伤评级
用甲氧咪草烟处理过的欧洲油菜植物的除草剂损伤评级。从种子栽培系BN02 (野生型)、2个系BnCL131A1 (AHAS III A122T S653N 双突变型；BnCL131A1.0和BnCL131A1.18)、PM1/PM2 (商业的双基因检查: AHAS I S653N & AHAS III W574L)的植物，直到3-4叶阶段，然后不喷雾，或用35、70或210 g ai/ha的甲氧咪草烟（添加了0.5% v/v Merge）喷雾。在喷雾后2周，对每个系的12株植物评价除草剂损伤。在下面的表4中，将结果表示为平均损伤 ± 1个平均值标准误差。表示的结果覆盖了1个种植，且对所有系都喷雾，还提供了± 2个平均值标准误差的值。
表4
Figure 985772DEST_PATH_IMAGE020
实施例4 田间试验的欧洲油菜植物的甲氧咪草烟除草剂损伤评级
在北达科他州迈诺特（Minot, North Dakota）附近的地方，对来自下述春季油料种子芸苔系的欧洲油菜植物进行田间试验：BN-02 (野生型)，BN-T (野生型)，在BN-02背景遗传型中的BnCL131A1 (AHAS III A122T S653N 双突变型)，在BN-02背景遗传型中的BnCL120C7 (BnAHASIII A122T)，在BN-02背景遗传型中的BnCL97 (BnAHASIII S653N)，在BN-T背景中的PM1/PM2 (双基因检查: AHAS I S653N & AHAS III W574L)，在BN-T背景中的PM1 (单基因检查: AHAS I S653N)和在BN-T背景中的PM2 (单基因检查：AHAS III W574L)。在5 m长单行样地中种植系，并排列成2因子裂区设计，具有3次重复和4种处理 (0 g ai/ha的甲氧咪草烟、50 g ai/ha的甲氧咪草烟、100 g ai/ha的甲氧咪草烟和200 g ai/ha的甲氧咪草烟)。在2-4叶阶段，使用上述的甲氧咪草烟处理，喷洒植物。以20加仑/英亩(或200升/ha)，稀释甲氧咪草烟产物(Beyond 120 g/L LC + 0.25% (v/v) 非离子型表面活性剂)，并使用牵引器固定的吊杆施用。
在处理后15天(DAT)，使用0至100%的等级（其中0是无损伤，100%是植物完全死亡），以每区为基础，评价除草剂损伤。使用ANOVA，统计分析损伤评级，结果如表5所示。
表5甲氧咪草烟处理后15天欧洲油菜系的田间作物损伤评级
Figure 466432DEST_PATH_IMAGE021
双突变型系BnCL131A1 (BN-02) (AHAS III A122T, S653N)表现出比单个突变型系BnCL97 (BN-02) (AHASIII S653N)和BNCL120C7 (BN-02) (AHASIII A122T)的总和大许多的除草剂耐受性。在200 g ai/ha的甲氧咪草烟，由双突变系(A122T + S653N)表现出的耐受性的量是62% (100% - 38%农作物损伤)。在200 g ai/ha，由A122T 单个突变型表现出的耐受性的量是20% (100% - 80%农作物损伤)。在200 g ai/ha，由S653N 单个突变型表现出的耐受性的量是17% (100% - 83%农作物损伤)。如果耐受性是累加的，则将A122T突变与S653N突变组合到一起所预期的耐受性是37%。相反，观察到的双突变型的耐受性是62%。因此，在双突变型系BNCL131A1(BN-02)中观察到的除草剂耐受性水平是在2个单个突变型系BNCL97 (BN-02)和BNCL120C7 (BN-02)中观察到的水平的协同作用。
实施例5 含有堆叠的AHAS特性的芸苔属植物和甲氧咪草烟除草剂损伤评级
通过常规育种方法，通过使对于CLB-1而言纯合的AHAS-抑制剂抗性系(AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N)与对于AHASL1A-W574(At)L (PM2) + AHASL1C- S653(At)N (PM1)而言纯合的AHAS-抑制剂抗性系杂交，得到含有堆叠的AHAS-抑制剂抗性的核酸分子的欧洲油菜植物。
在2个咪唑啉酮-耐受的春季欧洲油菜亲本系 “BnCL131A1” (对于A基因组咪唑啉酮-耐受的突变AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N而言纯合的)和“PM1PM2” (对于A基因组 AHAS-抑制剂耐受性的突变AHASL1A-W574(At)L (PM2) + C基因组 AHAS-抑制剂耐受性的突变AHASL1C- S653(At)N (PM1)而言纯合的)之间，在温室中生产手工杂交杂种。与各自仅含有一个AHAS-抑制剂耐受性的突变(纯合的或杂合的)的系和几个春季欧洲油菜检查一起，对得到的杂合的手工杂交的杂种系 “PM1PM2/BnCL131A1” (对于堆叠的突变AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N、AHASL1A-W574(At)L (PM2)、AHASL1C- S653(At)N (PM1)而言杂合的)进行田间试验。
在美国北达科他州的Simcoe进行3个重复试验，并使用随机化的裂区设计。所述试验用于测量在5个不同的咪唑啉酮除草剂处理等级下不同实体的植物毒性百分比(%农作物损伤)。在2-4叶阶段，以100升/ha的体积，喷洒植物。使用的咪唑啉酮除草剂等级如下(甲氧咪草烟 = BEYONDTM 120 g/I LC (BAS 72001H)；NIS = INDUCETM 90 (90% 非离子型表面活性剂；Helena Chemical Co., Collierville, TN):
Figure 447289DEST_PATH_IMAGE022
手工杂交的杂种系PM1PM2/BnCL131A1含有3个杂合的AHAS-抑制剂耐受性的突变型等位基因:
AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N
AHASL1A-W574(At)L
AHASL1C-S653(At)N
比较系BnCL131A1 (He)含有1个杂合的AHAS-抑制剂耐受性的突变型等位基因:
AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N
比较系PM2 (AHASL1A-PM2)含有1个纯合的AHAS-抑制剂耐受性的突变型等位基因:
AHASL1A-W574(At)L
且比较系PM1 (AHASL1C-PM1)含有1个纯合的AHAS-抑制剂耐受性的突变型等位基因:
AHASL1C-S653(At)N。
在田间测定的农作物损伤评级如下进行：在处理后18天，按照从0 至100%的等级，评估试验的每个样地的植物毒性水平(农作物损伤百分比)。在表6中显示了每个实体在3次重复中的平均值以及它们的统计显著性 (ANOVA) (Ho = 纯合的；He = 杂合的)。在表6中显示的每个值是3次重复的平均值。
Figure 304386DEST_PATH_IMAGE023
结果
如下将植物毒性百分比 (%农作物损伤)评级转换成除草剂耐受性评级：通过从100%减去每个系的农作物损伤评级百分比(表6)，得到除草剂耐受性百分比(表7) (Ho = 纯合的；He = 杂合的)。
Figure 936356DEST_PATH_IMAGE024
Figure 774868DEST_PATH_IMAGE025
为了理解在PM1PM2/BNCL131A1中堆叠3个杂合突变是否导致累加的或协同的除草剂耐受性作用，将观察到的BnCL131A1 (He)、PM1 (AHASL1C-PM1)和PM2 (AHASL1A-PM2)的平均除草剂耐受性累加，以得到预期的除草剂耐受性百分比(表7)。应当指出，在该实验中使用的PM1和PM2系是AHAS-抑制剂耐受性的突变纯合的。另一检查系是杂合的咪唑啉酮-耐受的PM1系和杂合的咪唑啉酮-耐受的PM2系，但是由于该材料是不可得到的，使用它们的纯合相似物。以前的研究已经证实，含有杂合的咪唑啉酮-耐受的突变的系对咪唑啉酮除草剂处理的耐受性总是低于含有纯合的AHAS-抑制剂耐受性的突变的系(数据未显示)。在140 g ai/ha的甲氧咪草烟，3个单独的系(BnCL131A1(He) + PM1 (AHASL1C-PM1) + PM2 (AHASL1A-PM2))的预期累加除草剂耐受性百分比是45%，然而观察到的PM1PM1/BnCL131A1系(在杂合状态含有所有3个突变)的除草剂耐受性百分比是78.3%。对于210 g ai/ha的更高处理等级，观察到类似的结果，其中预期的累加除草剂耐受性百分比是55%，然而观察到的PM1PM2/BnCL131A1的除草剂耐受性百分比是85% (表7)。
总之，具有杂合的AHAS-抑制剂耐受性的突变的堆叠系PM1PM2/BnCL131A1表现出协同的除草剂耐受性作用，产生意外的对咪唑啉酮除草剂的高耐受性水平，导致明显大于用单个纯合的AHAS-抑制剂耐受性的突变观察到的耐受性。
尽管已通过例证和实施例（用于理解清楚的目的）在一定程度上详述了上述发明，显而易见，可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修饰。
序列表
<110> BASF AGROCHEMICAL PRODUCTS B.V.
<120> 除草剂-抗性的AHAS-突变体及使用方法
<130> 13783-49
<140>
<141>
<150> 61/100,541
<151> 2008-09-26
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 1
ctaaccatgg cggcggcaac 20
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 2
agtctgggaa caaaccaaaa gcagtaca 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 3
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<210> 4
<211> 43
<212> DNA
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<220>
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<400> 4
cttcgcttat cccggaggta cttccatgga gatccaccaa gcc 43
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<212> DNA
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<220>
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<210> 6
<211> 21
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<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 6
cccatcaacg tactcgcacc a 21
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 7
gtcaatgtcg cacctgaaaa aaccgaca 28
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 8
gctaacccgc tgacgaggtt ggtagct 27
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 9
aaggcttggt ggatctccat ggacgt 26
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的引物
<400> 10
gaggctttcg ctagcagggc tcaa 24
<210> 11
<211> 2033
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的多核苷酸
<400> 11
tctctcctct aaccatggcg gcggcaacat cgtcttctcc gatctcctta accgctaaac 60
cttcttccaa atcccctcta cccatttcca gattctccct tcccttctcc ttaaccccac 120
agaaagactc ctcccgtctc caccgtcctc tcgccatctc cgccgttctc aactcacccg 180
tcaatgtcgc acctccttcc cctgaaaaaa ccgacaagaa caagactttc gtctcccgct 240
acgctcccga cgagccccgc aagggtgctg atatcctcgt cgaagccctc gagcgtcaag 300
gcgtcgaaac cgtctttgct tatcccggag gtgcttccat ggagatccac caagccttga 360
ctcgctcctc caccatccgt aacgtccttc cccgtcacga acaaggagga gtcttcgccg 420
ccgagggtta cgctcgttcc tccggcaaac cgggaatctg catagccact tcgggtcccg 480
gagctaccaa cctcgtcagc gggttagcag acgcgatgct tgacagtgtt cctcttgtcg 540
ccattacagg acaggtccct cgccggatga tcggtactga cgccttccaa gagacaccaa 600
tcgttgaggt aacgaggtct attacgaaac ataactattt ggtgatggat gttgatgaca 660
tacctaggat cgttcaagaa gctttctttc tagctacttc cggtagaccc ggaccggttt 720
tggttgatgt tcctaaggat attcagcagc agcttgcgat tcctaactgg gatcaaccta 780
tgcgcttacc tggctacatg tctaggttgc ctcagcctcc ggaagtttct cagttaggtc 840
agatcgttag gttgatctcg gagtctaaga ggcctgtttt gtacgttggt ggtggaagct 900
tgaactcgag tgaagaactg gggagatttg tcgagcttac tgggatcccc gttgcgagta 960
ctttgatggg gcttggctct tatccttgta acgatgagtt gtccctgcag atgcttggca 1020
tgcacgggac tgtgtatgct aactacgctg tggagcatag tgatttgttg ctggcgtttg 1080
gtgttaggtt tgatgaccgt gtcacgggaa agctcgaggc tttcgctagc agggctaaaa 1140
ttgtgcacat agacattgat tctgctgaga ttgggaagaa taagacacct cacgtgtctg 1200
tgtgtggtga tgtaaagctg gctttgcaag ggatgaacaa ggttcttgag aaccgggcgg 1260
aggagctcaa gcttgatttc ggtgtttgga ggagtgagtt gagcgagcag aaacagaagt 1320
tccctttgag cttcaaaacg tttggagaag ccattcctcc gcagtacgcg attcagatcc 1380
tcgacgagct aaccgaaggg aaggcaatta tcagtactgg tgttggacag catcagatgt 1440
gggcggcgca gttttacaag tacaggaagc cgagacagtg gctgtcgtca tcaggcctcg 1500
gagctatggg ttttggactt cctgctgcga ttggagcgtc tgtggcgaac cctgatgcga 1560
ttgttgtgga tattgacggt gatggaagct tcataatgaa cgttcaagag ctggccacaa 1620
tccgtgtaga gaatcttcct gtgaagatac tcttgttaaa caaccagcat cttgggatgg 1680
tcatgcaatg ggaagatcgg ttctacaaag ctaacagagc tcacacttat ctcggggacc 1740
cggcaaggga gaacgagatc ttccctaaca tgctgcagtt tgcaggagct tgcgggattc 1800
cagctgcgag agtgacgaag aaagaagaac tccgagaagc tattcagaca atgctggata 1860
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tcccaagtgg tggcactttc aaagatgtaa taacagaagg ggatggtcgc actaagtact 1980
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<220>
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tgatgcgatt gttgtggaca ttgacggtga tggaagcttc ataatgaacg ttcaagagct 1620
ggccacaatc cgtgtagaga atcttcctgt gaagatactc ttgttaaaca accagcatct 1680
tgggatggtc atgcaatggg aagatcggtt ctacaaagct aacagagctc acacttatct 1740
cggggacccg gcaagggaga acgagatctt ccctaacatg ctgcagtttg caggagcttg 1800
cgggattcca gctgcgagag tgacgaagaa agaagaactc cgagaagcta ttcagacaat 1860
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accgatgatc ccaagtggtg gcactttcaa agatgtaata accgaagggg atggtcgcac 1980
taagtactga gagatgaagc tggtgatcca tcatatggta aaagacttag tttcagtttt 2040
c 2041
<210> 13
<211> 2024
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的多核苷酸
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tctctcatct aaccatggcg gcggcaacat cgtcttctcc gatctcctta accgctaaac 60
cttcttccaa atcccctcta cccatttcca gattctccct tcccttctcc ttaaccccac 120
agaaaccctc ctcccgtctc caccgtcctc tcgccatctc cgccgttctc aactcacccg 180
tcaatgtcgc acctgaaaaa accgacaaga tcaagacttt catctcccgc tacgctcccg 240
acgagccccg caagggtgct gatatcctcg tggaagccct cgagcgtcaa ggcgtcgaaa 300
ccgtcttcgc ttatcccgga ggtgcttcca tggagatcca ccaagccttg actcgctcct 360
ccaccatccg taacgtcctc ccccgtcacg aacaaggagg agtcttcgcc gccgagggtt 420
acgctcgttc ctccggcaaa ccgggaatct gcatagccac ttcgggtccc ggagctacca 480
acctcgtcag cgggttagcc gacgcgatgc ttgacagtgt tcctctcgtc gccatcacag 540
gacaggtccc tcgccggatg atcggtactg acgcgttcca agagacgcca atcgttgagg 600
taacgaggtc tattacgaaa cataactatc tggtgatgga tgttgatgac atacctagga 660
tcgttcaaga agctttcttt ctagctactt ccggtagacc cggaccggtt ttggttgatg 720
ttcctaagga tattcagcag cagcttgcga ttcctaactg ggatcaacct atgcgcttgc 780
ctggctacat gtctaggctg cctcagccac cggaagtttc tcagttaggt cagatcgtta 840
ggttgatctc ggagtctaag aggcctgttt tgtacgttgg tggtggaagc ttgaactcga 900
gtgaagaact ggggagattt gtcgagctta ctgggatccc tgttgcgagt acgttgatgg 960
ggcttggctc ttatccttgt aacgatgact tgtccctgca gatgcttggc atgcacggga 1020
ctgtgtatgc taactacgct gtggagcata gtgatttgtt gctggcgttt ggtgttaggt 1080
ttgatgaccg tgtcacggga aagctcgagg cgtttgcgag cagggctaag attgtgcaca 1140
tagacattga ttctgctgag attgggaaga ataagacacc tcacgtgtct gtgtgtggtg 1200
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<211> 2024
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<220>
<223> 人工序列描述：合成的多核苷酸
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<220>
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<400> 16
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<220>
<223> 人工序列描述：合成的多肽
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Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro
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260 265 270
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275 280 285
Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu
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Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe
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Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp Arg Phe
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Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu
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<220>
<223> 人工序列描述：合成的多肽
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Lys Ile Lys Thr Phe Ile Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys
65 70 75 80
Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr
85 90 95
Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu
100 105 110
Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly
115 120 125
Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly
165 170 175
Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro
180 185 190
Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met
195 200 205
Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala
210 215 220
Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile
225 230 235 240
Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro
245 250 255
Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly
260 265 270
Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu
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Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala
355 360 365
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370 375 380
Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala
385 390 395 400
Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys
405 410 415
Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys
420 425 430
Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr
435 440 445
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450 455 460
Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr
465 470 475 480
Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly
485 490 495
Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala
500 505 510
Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln
515 520 525
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530 535 540
Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp Arg Phe
545 550 555 560
Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu
565 570 575
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580 585 590
Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln
595 600 605
Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro
610 615 620
His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Asn Gly Gly Thr Phe Lys
625 630 635 640
Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr
645 650
<210> 20
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的多肽
<400> 20
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro
1 5 10 15
Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu Thr Pro Gln Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile
35 40 45
Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp
50 55 60
Lys Ile Lys Thr Phe Ile Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys
65 70 75 80
Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr
85 90 95
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100 105 110
Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly
115 120 125
Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly
165 170 175
Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro
180 185 190
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195 200 205
Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala
210 215 220
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225 230 235 240
Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro
245 250 255
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260 265 270
Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val
275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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625 630 635 640
Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr
645 650
<210> 21
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的多肽
<400> 21
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro
1 5 10 15
Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu Thr Pro Gln Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile
35 40 45
Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp
50 55 60
Lys Ile Lys Thr Phe Ile Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys
65 70 75 80
Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr
85 90 95
Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Thr Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu
100 105 110
Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly
115 120 125
Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly
165 170 175
Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro
180 185 190
Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met
195 200 205
Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala
210 215 220
Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile
225 230 235 240
Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro
245 250 255
Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly
260 265 270
Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu
290 295 300
Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Pro Cys Asn Asp Asp Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr
325 330 335
Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe
340 345 350
Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala
355 360 365
Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly
370 375 380
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385 390 395 400
Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys
405 410 415
Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys
420 425 430
Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr
435 440 445
Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Gln Gly Lys Ala Ile Ile Ser
450 455 460
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545 550 555 560
Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu
565 570 575
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580 585 590
Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln
595 600 605
Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro
610 615 620
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625 630 635 640
Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr
645 650
<210> 22
<211> 2013
<212> DNA
<213> 拟南芥
<400> 22
atggcggcgg caacaacaac aacaacaaca tcttcttcga tctccttctc caccaaacca 60
tctccttcct cctccaaatc accattacca atctccagat tctccctccc attctcccta 120
aaccccaaca aatcatcctc ctcctcccgc cgccgcggta tcaaatccag ctctccctcc 180
tccatctccg ccgtgctcaa cacaaccacc aatgtcacaa ccactccctc tccaaccaaa 240
cctaccaaac ccgaaacatt catctcccga ttcgctccag atcaaccccg caaaggcgct 300
gatatcctcg tcgaagcttt agaacgtcaa ggcgtagaaa ccgtattcgc ttaccctgga 360
ggtgcatcaa tggagattca ccaagcctta acccgctctt cctcaatccg taacgtcctt 420
cctcgtcacg aacaaggagg tgtattcgca gcagaaggat acgctcgatc ctcaggtaaa 480
ccaggtatct gtatagccac ttcaggtccc ggagctacaa atctcgttag cggattagcc 540
gatgcgttgt tagatagtgt tcctcttgta gcaatcacag gacaagtccc tcgtcgtatg 600
attggtacag atgcgtttca agagactccg attgttgagg taacgcgttc gattacgaag 660
cataactatc ttgtgatgga tgttgaagat atccctagga ttattgagga agctttcttt 720
ttagctactt ctggtagacc tggacctgtt ttggttgatg ttcctaaaga tattcaacaa 780
cagcttgcga ttcctaattg ggaacaggct atgagattac ctggttatat gtctaggatg 840
cctaaacctc cggaagattc tcatttggag cagattgtta ggttgatttc tgagtctaag 900
aagcctgtgt tgtatgttgg tggtggttgt ttgaattcta gcgatgaatt gggtaggttt 960
gttgagctta cggggatccc tgttgcgagt acgttgatgg ggctgggatc ttatccttgt 1020
gatgatgagt tgtcgttaca tatgcttgga atgcatggga ctgtgtatgc aaattacgct 1080
gtggagcata gtgatttgtt gttggcgttt ggggtaaggt ttgatgatcg tgtcacgggt 1140
aagcttgagg cttttgctag tagggctaag attgttcata ttgatattga ctcggctgag 1200
attgggaaga ataagactcc tcatgtgtct gtgtgtggtg atgttaagct ggctttgcaa 1260
gggatgaata aggttcttga gaaccgagcg gaggagctta agcttgattt tggagtttgg 1320
aggaatgagt tgaacgtaca gaaacagaag tttccgttga gctttaagac gtttggggaa 1380
gctattcctc cacagtatgc gattaaggtc cttgatgagt tgactgatgg aaaagccata 1440
ataagtactg gtgtcgggca acatcaaatg tgggcggcgc agttctacaa ttacaagaaa 1500
ccaaggcagt ggctatcatc aggaggcctt ggagctatgg gatttggact tcctgctgcg 1560
attggagcgt ctgttgctaa ccctgatgcg atagttgtgg atattgacgg agatggaagc 1620
tttataatga atgtgcaaga gctagccact attcgtgtag agaatcttcc agtgaaggta 1680
cttttattaa acaaccagca tcttggcatg gttatgcaat gggaagatcg gttctacaaa 1740
gctaaccgag ctcacacatt tctcggggat ccggctcagg aggacgagat attcccgaac 1800
atgttgctgt ttgcagcagc ttgcgggatt ccagcggcga gggtgacaaa gaaagcagat 1860
ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acaccaggac cttacctgtt ggatgtgatt 1920
tgtccgcacc aagaacatgt gttgccgatg atcccgagtg gtggcacttt caacgatgtc 1980
ataacggaag gagatggccg gattaaatac tga 2013
<210> 23
<211> 670
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 23
Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser Ile Ser Phe
1 5 10 15
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Ser Arg Arg Arg Gly Ile Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ile Ser Ala
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys
245 250 255
Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Glu Gln Ala Met Arg
260 265 270
Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His
275 280 285
Leu Glu Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu
290 295 300
Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe
305 310 315 320
Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His
340 345 350
Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu
355 360 365
Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala
370 375 380
Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu
385 390 395 400
Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys
405 410 415
Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu
420 425 430
Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gln Lys
435 440 445
Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro
450 455 460
Gln Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala Ile
465 470 475 480
Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr
485 490 495
Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala
500 505 510
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515 520 525
Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn
530 535 540
Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Val
545 550 555 560
Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp
565 570 575
Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala
580 585 590
Gln Glu Asp Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Leu Phe Ala Ala Ala Cys
595 600 605
Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Glu Ala
610 615 620
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625 630 635 640
Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr
645 650 655
Phe Asn Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr
660 665 670

Claims (105)

1.一种分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白，所述蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
2.如权利要求1所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
3.如权利要求1所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
4.如权利要求1所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中所述核酸分子编码的AHAS蛋白对抑制AHAS的除草剂的抑制是抗性的。
5.如权利要求4所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中与由包含各个单个突变的核酸分子编码的AHAS蛋白的累加水平相比，所述编码的AHAS蛋白表现出对抑制AHAS的除草剂的抑制的抗性的协同水平。
6.如权利要求1所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有图4的BN02-131的氨基酸序列的AHAS蛋白。
7.如权利要求1所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中所述核酸分子具有图3的BN02-131的核酸序列。
8.如权利要求1所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中所述核酸分子编码欧洲油菜AHAS III蛋白。
9.一种表达载体，其包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的分离的核酸分子，所述蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
10.如权利要求9所述的表达载体，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
11.如权利要求9所述的表达载体，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处除了丝氨酸以外的氨基酸是丝氨酸至天冬酰胺置换。
12.如权利要求9所述的表达载体，其中诱变过的AHASL包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺。
13.如权利要求9所述的表达载体，其中所述核酸分子编码图4的BN02-131的氨基酸序列。
14.一种芸苔属植物，其包含编码除草剂耐受性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
15.如权利要求14所述的芸苔属植物，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
16.如权利要求14所述的芸苔属植物，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
17.如权利要求14所述的芸苔属植物，其中所述AHAS蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺。
18.如权利要求14所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物是选自欧洲油菜和芥菜的芸苔属物种。
19.如权利要求14所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物包含第二种突变的AHASL蛋白。
20.如权利要求14所述的芸苔属植物，其中所述诱变过的核酸分子是重组表达载体的一部分。
21.如权利要求14所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物对至少一种抑制AHAS的除草剂是抗性的。
22.如权利要求21所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物对选自下述的抑制AHAS的除草剂的施用是抗性的：咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂、及其混合物。
23.一种能生成芸苔属植物的芸苔属种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
24.如权利要求23所述的芸苔属种子，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
25.如权利要求23所述的芸苔属种子，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
26.如权利要求23所述的芸苔属种子，其中所述AHAS蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺。
27.一种芸苔属种子的容器，其中所述容器包含至少10%的能生成芸苔属植物的种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
28.如权利要求27所述的芸苔属种子的容器，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
29.如权利要求27所述的芸苔属种子的容器，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
30.如权利要求27所述的芸苔属种子的容器，其中所述AHAS蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺。
31.如权利要求30所述的的容器，其中所述容器包含至少25粒种子。
32.一种控制在芸苔属植物附近的杂草的方法，所述方法包括，将有效量的至少一种抑制AHAS的除草剂施用给杂草和芸苔属植物，其中所述芸苔属植物在它的基因组中包含诱变过的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL) 的编码核酸分子的至少一个拷贝，所述核酸分子编码除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
33.如权利要求32所述的方法，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
34.如权利要求32所述的方法，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述AHAS蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述芸苔属植物选自：芥菜、欧洲油菜、芜菁、埃塞俄比亚芥（B. carinata）、甘蓝和黑芥。
37.如权利要求32所述的方法，其中所述抑制AHAS的除草剂选自：咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂和它们的混合物。
38.如权利要求32所述的方法，其中所述芸苔属植物是非-转基因的。
39.一种育种芸苔属植物的方法，其中所述方法包括:
使第一种芸苔属系与第二种芸苔属系杂交，其中所述第一种芸苔属系是包含诱变过的AHAS编码序列的芸苔属植物，所述诱变过的AHAS编码序列编码除草剂-抗性的AHAS蛋白，所述AHAS蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的氨基酸位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变；和
得到种子。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述诱变过的AHAS编码序列包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变，其中所述突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述诱变过的AHAS编码序列包含在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变，其中所述突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述第一种芸苔属系是从选自下述的芸苔属系的种子得到：
BnCL120C7，所述种子的样品已经在ATCC 登记号PTA-9278下保藏；
BnCL131A1，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9279下保藏；
BnCL140B3，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9402下保藏；
BnCL140C7，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-9403下保藏；
PM1PM2/BnCL131A1，所述种子的样品已经在ATCC登记号PTA-10321下保藏；和
PM1PM2/BnCL140B3。
43.命名为BnCL120C7的芸苔属植物系的种子，所述种子的样品已经在ATCC保藏号PTA-9278下保藏。
44.从权利要求43的种子生长而成的植物。
45.来自权利要求44的植物的植物部分。
46.如权利要求45所述的植物部分，其中所述植物部分选自：花粉、原生质体、胚珠和细胞。
47.命名为BnCL131A1的芸苔属植物系的种子，所述种子的样品已经在ATCC保藏号PTA-9279下保藏。
48.从权利要求47的种子生长而成的植物。
49.来自权利要求48的植物的植物部分。
50.如权利要求49所述的植物部分，其中所述植物部分选自：花粉、原生质体、胚珠和细胞。
51.命名为BnCL140B3的芸苔属植物系的种子，所述种子的样品已经在ATCC保藏号PTA-9402下保藏。
52.从权利要求51的种子生长而成的植物。
53.来自权利要求52的植物的植物部分。
54.如权利要求53所述的植物部分，其中所述植物部分选自：花粉、原生质体、胚珠和细胞。
55.命名为BnCL140C7的芸苔属植物系的种子，所述种子的样品已经在ATCC保藏号PTA-9403下保藏。
56.从权利要求55的种子生长而成的植物。
57.来自权利要求56的植物的植物部分。
58.如权利要求57所述的植物部分，其中所述植物部分选自：花粉、原生质体、胚珠和细胞。
59.一种分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸 。
60.如权利要求59所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中所述芸苔属AHASL蛋白是AHASL III。
61.如权利要求60所述的分离的、重组的、诱变过的、或合成的核酸分子，其中所述核酸分子具有图3的BN02-131的核酸序列。
62.一种芸苔属植物，其包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸。
63.如权利要求62所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物是从栽培突变系BnCL131A1的种子得到的芸苔属植物，所述种子的样品已经在ATCC 登记号PTA-9279下保藏。
64.一种能生成芸苔属植物的芸苔属种子，所述芸苔属植物包含编码芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的突变的核酸分子，所述蛋白具有在与图5的位置122相对应的位置处的苏氨酸。
65.一种育种芸苔属植物的方法，其中所述方法包括:
使第一种芸苔属系与第二种芸苔属系杂交，其中所述第一种芸苔属系是通过栽培突变系BnCL131A1的种子得到的芸苔属植物，所述种子的样品已经在ATCC 登记号PTA-9279下保藏；和
得到种子。
66.一种非转基因的芸苔属植物，其包含编码AHAS蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
67.如权利要求66所述的非转基因的芸苔属植物，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
68.如权利要求66所述的非转基因的芸苔属植物，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
69.如权利要求65所述的非转基因的芸苔属植物，其中所述AHAS蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺。
70.如权利要求66所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物是选自欧洲油菜和芥菜的芸苔属物种。
71.如权利要求66所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物包含第二种突变的AHASL蛋白。
72.如权利要求66所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物对至少一种抑制AHAS的除草剂是抗性的。
73.如权利要求72所述的芸苔属植物，其中所述芸苔属植物对选自下述的抑制AHAS的除草剂的施用是抗性的：咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂、及其混合物。
74.一种能耐受至少一种抑制AHAS的除草剂的非转基因的芸苔属植物，其通过包括下述步骤的方法得到：(a) 向芸苔属植物细胞中导入在AHAS基因中具有定向突变的基因修复寡核碱基，以生成具有突变型AHAS基因的植物细胞，所述突变型AHAS基因表达在一个或更多个氨基酸位置处被突变的AHAS蛋白，所述位置与选自SEQ ID NO: 23的A122、P197、R199、T203、A205、W574、S653和G654的位置相对应；(b) 在有抑制AHAS的除草剂存在下，鉴别与对应的野生型植物细胞相比具有基本上正常生长的植物细胞；和(c) 从所述植物细胞再生非转基因的除草剂耐受性的具有突变的AHAS基因的芸苔属植物。
75.如权利要求74所述的非转基因的芸苔属植物，其中所述基因修复寡核碱基是混合的双链体核苷酸或SSMOV。
76.如权利要求74所述的非转基因的芸苔属植物，其中所述突变的AHAS基因包含在与选自A122和S653的位置相对应的位置处的突变。
77.如权利要求76所述的非转基因的芸苔属植物，其中所述突变的AHAS基因包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺。
78.如权利要求74所述的非转基因的芸苔属植物的种子。
79.一种生产F1杂种芸苔属种子的方法，所述方法包括，使第一种芸苔属植物与第二种芸苔属植物杂交，所述第一种芸苔属植物具有编码除草剂耐受性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变；并
得到种子。
80.如权利要求79所述的方法，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
81.如权利要求79所述的方法，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
82.一种通过如权利要求79所述的方法得到的F1杂种芸苔属种子。
83.一种植物细胞，其包含编码AHAS蛋白的诱变过的核酸分子，所述蛋白具有在与图5的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
84.如权利要求83所述的植物细胞，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
85.如权利要求83所述的植物细胞，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
86.如权利要求83所述的植物细胞，其中所述植物细胞是芸苔属植物细胞。
87.如权利要求83所述的植物细胞，其中所述植物细胞对至少一种抑制AHAS的除草剂是耐受性的。
88.如权利要求83所述的植物细胞，其中所述植物细胞是非-转基因的。
89.一种用于增加植物的除草剂-抗性的方法，所述方法包括，使第一种芸苔属植物与第二种芸苔属植物杂交，其中所述第一种芸苔属植物在它的基因组中包含诱变过的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)的编码核酸分子的至少一个拷贝，所述核酸分子编码除草剂-抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变；并
得到由杂交产生的种子。
90.如权利要求89所述的方法，另外包括，从由杂交第一种和第二种芸苔属植物得到的种子，栽培植物。
91.如权利要求89所述的方法，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
92.如权利要求89所述的方法，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
93.一种芸苔属植物，其包含编码除草剂耐受性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的诱变过的核酸分子和至少一种编码目标蛋白的其它核酸分子，所述除草剂耐受性的芸苔属乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变和在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变。
94.如权利要求93所述的芸苔属植物，其中在与SEQ ID NO: 23的位置A122相对应的位置处的突变是丙氨酸至苏氨酸置换。
95.如权利要求93所述的芸苔属植物，其中在与SEQ ID NO: 23的位置S653相对应的位置处的突变是丝氨酸至天冬酰胺置换。
96.如权利要求93所述的芸苔属植物，其中所述AHAS蛋白包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺。
97.如权利要求93所述的芸苔属植物，其中所述至少一种其它核酸分子编码提供选自下述的目标特性的目标蛋白：AHAS耐受性、草甘膦耐受性、麦草畏耐受性、PPO-抑制剂耐受性、昆虫抗性、草铵膦耐受性、HPPD-抑制剂耐受性、生长素类除草剂耐受性和疾病抗性。
98.如权利要求97所述的芸苔属植物，其中所述目标蛋白提供AHAS-抑制剂耐受性。
99.如权利要求98所述的芸苔属植物，其中所述目标蛋白是AHAS蛋白，所述AHAS蛋白包含在选自A122、P197、R199、T203、A205、W574、S653、G654、及其组合的氨基酸位置处具有至少一种突变的氨基酸分子。
100.如权利要求98所述的芸苔属植物，其中所述AHAS耐受性由选自PM1、PM2、BR1、及其组合的基因编码。
101.一种控制在芸苔属植物附近的杂草的方法，所述方法包括，将有效量的至少一种抑制AHAS的除草剂施用给杂草和芸苔属植物，其中所述芸苔属植物在它的基因组中包含第一种乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)核酸分子的至少一个拷贝和至少一个第二种AHASL核酸分子，所述第一种AHASL核酸分子编码除草剂抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在与SEQ ID NO: 23的A122和S653相对应的氨基酸位置处的突变，所述第二种AHASL核酸分子编码第二种除草剂抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在选自A122、P197、R199、T203、A205、W574、S653、G654、及其组合的位置处的突变。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述第一种AHASL核酸分子编码包含在与SEQ ID NO: 23的位置122相对应的位置处的苏氨酸和在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺的AHASL蛋白。
103.如权利要求101所述的方法，其中所述第二种AHASL核酸分子编码具有在与SEQ ID NO: 23的位置653相对应的位置处的天冬酰胺的AHASL蛋白。
104.如权利要求101所述的方法，其中所述芸苔属植物在它的基因组中包含第三种AHASL核酸分子的至少一个拷贝，所述第三种AHASL核酸分子编码第三种除草剂抗性的AHASL蛋白，所述蛋白具有在选自A122、P197、R199、T203、A205、W574、S653、G654、及其组合的位置处的突变。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述第三种AHASL核酸分子编码具有在与SEQ ID NO: 23的位置574相对应的位置处的色氨酸的AHASL蛋白。
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