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KR102811229B1 - 재조합 핵산 구조물 - Google Patents

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KR102811229B1
KR102811229B1 KR1020217006630A KR20217006630A KR102811229B1 KR 102811229 B1 KR102811229 B1 KR 102811229B1 KR 1020217006630 A KR1020217006630 A KR 1020217006630A KR 20217006630 A KR20217006630 A KR 20217006630A KR 102811229 B1 KR102811229 B1 KR 102811229B1
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recombinant nucleic
encoding
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올리버 케일
외르그 카우푸만
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판테르나 테라퓨틱스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 5'-> 3' 방향으로 - 5' UTR, - 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및 - 3' UTR을 포함하는 재조합 핵산 구조물에 관한 것으로서, 5' UTR은 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 유전자는 MCP-1, RPL12s.c., Ang-2, HSP70, H3.3., 갈렉틴-9, GADD34, EDN1, HSP70m5, E-셀렉틴, ICAM-1, IL-6 및 vWF로 이루어진 군으로부터 선택된다.

Description

재조합 핵산 구조물
본 발명은 재조합 핵산 구조물, 재조합 핵산 구조물을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터, 재조합 핵산 구조물 및/또는 벡터를 포함하는 세포, 재조합 핵산 구조물을 포함하는 전달 비히클, 재조합 핵산 구조물을 포함하는 약학 조성물, 질병의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한 재조합 핵산 구조물, 세포의 세포 기능을 회복하는 방법에서 사용하기 위한 재조합 핵산 구조물, 질병의 치료 및/또는 예방 방법 및 세포의 세포 기능 회복 방법에 관한 것이다.
핵산 분자는 생물학적 시스템에서 다양한 목적으로 사용된다. 여러 목적 중 하나는 유전 정보를 제공하는 것이고, 다른 하나는 디옥시리보핵산에서 리보솜으로 유전적 정보를 전달하는 것이며, 여기서 이러한 유전적 정보는 아미노산 서열로 번역된다. 후자의 단계는 메신저 리보핵산(mRNA)의 사용을 수반한다.
mRNA는 진핵 세포에서 매우 기본적인 디자인을 나타내며 전형적으로 5'-> 3' 방향으로 캡(Cap) 구조, 5' 비번역 영역(5' UTR), 종결 코돈과 함께 종결되는 코딩 서열(CDS: coding sequence)에 부착된 전형적으로 AUG 코돈으로 시작하는 코딩 서열, 3' 비번역 영역(3' UTR) 및 폴리-A-꼬리를 포함한다.
mRNA 기반 치료법은 생명공학의 초기부터 치료제로 제안되어 왔다. 원칙적으로, 투여된 mRNA 서열은 세포로 하여금 단백질을 생성하게 할 수 있고, 이는 질병을 직접 치료할 수 있거나 백신으로서 기능할 수 있다; 보다 간접적으로 단백질은 경로가 억제되거나 자극되는 방식으로 이러한 경로의 요소를 방해하여 질병을 치료하거나 개선할 수 있다.
본 발명의 기초가 되는 문제는 재조합 핵산 구조물, 바람직하게는 mRNA를 제공하는 것이며, 이에 의해 이러한 재조합 핵산 구조물은 재조합 핵산 구조물의 코딩 서열의 고발현을 가능케 한다.
본 발명의 기초가 되는 또 다른 문제는 재조합 핵산 구조물, 바람직하게는 mRNA를 제공하는 것이며, 이에 의해 이러한 재조합 핵산 구조물은 내피 세포에서 재조합 핵산 구조물의 코딩 서열의 발현을 가능케 한다.
본 발명의 기초가 되는 이러한 문제들 및 기타 문제들은 첨부된 독립 청구항의 주제에 의해 해결되며; 바람직하게는 실시형태가 첨부된 종속 청구항으로부터 취해질 수 있다.
추가로, 그리고 보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는 5'-> 3' 방향으로 다음을 포함하는 재조합 핵산 구조물에 의해, 제1 양태의 제1 실시형태이기도 한, 제1 양태에 의해 해결된다:
- 5' UTR,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' UTR,
여기서, 5' UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, Ang-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, H3.3.을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 갈렉틴-9를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, GADD34를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, EDN1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70m5를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, E-셀렉틴을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, ICAM-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, IL-6을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 vWF를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되고;
3' UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, H3.3.을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, GADD34를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, EDN1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 IL-6 을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되고,
효과기 분자는 세포의 세포 기능을 회복하는데 효과적이거나 세포 내 또는 세포 상에서 치료 효과를 발휘하는데 효과적이고,
재조합 핵산 구조물은 효과기 분자를 코딩하는 야생형 mRNA와 상이하다.
제1 양태의 제1 실시형태의 실시형태기도 한 제1 양태의 제2 실시형태에서, 재조합 구조물의 5' UTR 및 3' UTR은 상이한 기원이고, 바람직하게는 상이한 내인성 종으로부터 유래한다.
제1 양태의 제1 및 제2 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제3 실시형태에서, 재조합 구조물의 5' UTR 및 3' UTR은 동일한 기원이고, 바람직하게는 동일한 내인성 유전자 종으로부터 유래한다.
제1 양태의 제1, 제2 및 제3 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제4 실시형태에서,
a) 5' UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 여기서 3' UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나
b) 5' UTR은 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 여기서 3' UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나
c) 5' UTR은 ANG-2 를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 여기서 3' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나
d) 5' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 여기서, 3' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 양태의 제1, 제2 및 제3 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제5 실시형태에서,
a) 3'UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고 5' UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나,
b) 3'UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고 5' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나
c) 3'UTR은 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고 5' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나, 또는
d) 3'UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고 5' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제6 실시형태에서, 구조물은 다음을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나이다:
5' UTR이 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 H3.3.을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 H3.3.을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물, 및
5' UTR이 갈렉틴 9를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 갈렉틴 9를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제7 실시형태에서, 구조물은 바람직하게는 재조합 핵산 구조물의 3' 종결 말단에 폴리-A 고리를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제8 실시형태에서, 구조물은 바람직하게는 재조합 핵산 구조물의 5' 종결 말단에 캡(CAP) 구조를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및 제8 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제9 실시형태에서, 구조물은 바람직하게는 재조합 핵산 구조물의 5' 종결 말단에 IRES(internal ribosomal entry site, 내부 리보솜 진입 부위) 서열을 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 및 제9 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제10 실시형태에서, 구조물은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 바람직하게는 신호 서열은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 인-프레임(in-frame)이고 5' UTR과 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역 사이에 배열된다.
제1 양태의 제10 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제11 실시형태에서, 신호 펩티드는 효과기 분자가 분비되도록 한다.
제1 양태의 제10 및 제11 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제12 실시형태에서, 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, Ang-2의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 Ang-1의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 및 제12 실시형태의 실시형태이기도 한 제1 양태의 제13 실시형태에서, 세포 기능이 회복되는 세포 및/또는 치료 효과가 그 안에서 또는 그 상에서 발휘되는 세포는 내피 세포, 바람직하게는 혈관 내피 세포이고, 보다 바람직하게는 혈관 내피 세포는 미세혈관 내피 세포이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 및 제13 실시형태이기도 한 제1 양태의 제4 실시형태에서, 세포 기능은 내피 세포의 항-투과성 효과, 항-혈관 누출 효과, 내피 세포의 항-아폽토시스 효과 또는 내피 세포의 항-염증 효과 또는 항-스트레스 반응 효과를 가진 효과기 분자에 의해 회복될 수 있는 것이고, 바람직하게는 효과는 Tie-2 신호전달 경로, VEGF-수용체 경로, NOTCH 신호전달 경로, PI3-키나제 경로, eNOS 신호전달 경로, 시르투인-의존적 대사 및 에너지 항상성 경로, 산화적 스트레스 경로, 전단 스트레스 반응 경로, ET-1 신호 전달 경로, NO-매개된 신호 전달 경로, 및 기계화학적 전달 경로와 연결되거나 이와 관련이 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는 5'-> 3' 방향으로 다음을 포함하는 재조합 핵산 구조물에 의해, 제2 양태의 제1 실시형태이기도 한, 제2 양태에서 해결된다:
- 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역,
여기서, 효과기 분자는 질환의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위해, 세포의 세포 기능을 회복하는데 효과적이며, 여기서, 효과기 분자는 내피 세포에 의해 발현된다. 실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이 세포 기능 회복은 세포 사멸, 보다 바람직하게는 종양 내피 세포 및/또는 종양 세포의 사멸을 포함하고, 각각을 포괄하며; 또 다른 실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포 기능의 회복은 신생혈관 형성, 보다 바람직하게는 혈관 질환의 경우 신생혈관 형성을 포함하고, 각각을 포괄한다.
제2 양태의 제1 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제2 실시형태에서, 질환의 치료 및/또는 예방은 세포의 세포 기능 회복을 수반한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는 5'-> 3' 방향으로 다음을 포함하는 재조합 핵산 구조물에 의해, 제3 양태의 제1 실시형태이기도 한, 제3 양태에서 해결된다:
- 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역,
여기서, 효과기 분자는 세포의 세포 기능을 회복하기 위한 방법에서 사용하기 위해, 세포의 세포 기능을 회복하는데 효과적이며, 여기서 효과기 분자는 내피 세포에 의해 발현된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는 5'-> 3' 방향으로 다음을 포함하는 재조합 핵산 구조물에 의해, 제4 양태의 제1 실시형태이기도 한, 제4 양태에 의해 해결된다:
- 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역,
여기서, 효과기 분자는 질환의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 세포 안 또는 세포 상에서 치료 효과를 발휘하는데 효과적이며, 여기서 효과기 분자는 내피 세포에 의해 발현된다.
제4 양태의 제1 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제2 실시형태에서, 질환의 치료 및/또는 예방은 세포의 세포 기능 회복을 수반한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는 5'-> 3' 방향으로 다음을 포함하는 재조합 핵산 구조물에 의해, 제5 양태의 제1 실시형태이기도 한, 제5 양태에서 해결된다:
- 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역,
여기서, 효과기 분자는 세포의 세포 기능 회복 방법에서 사용하기 위해, 세포 안 또는 세포 상에서 치료 효과를 발휘하는데 효과적이며, 여기서 효과기 분자는 내피 세포에 의해 발현된다.
제2 양태의 제1 및 제2 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제3 실시형태에서, 제3 양태의 제1 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제2 실시형태에서, 제4 양태의 제1 및 제2 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제3 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제2 실시형태에서, 효과기 분자는 내피 세포에 의한 방법에서 발현된다.
제2 양태의 제1, 제2 및 제3 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제4 실시형태에서, 제3 양태의 제1 및 제2 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제3 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2 및 제3 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제4 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1 및 제2 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제3 실시형태에서, 내피 세포는 혈관 내피세포이고, 바람직하게는 혈관 내피 세포는 미세혈관 내피 세포이다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3 및 제4 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제5 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2 및 제3 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제4 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3 및 제4 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제5 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2 및 제3 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제4 실시형태에서, 내피 세포는 비-분열 내피 세포, 비-증식 내피 세포 또는 휴지 내피 세포이다. 이의 실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이 내피는 혈관 내피 세포, 림프 내피 세포, 내피 줄기 세포(ESC) 또는 내피 전구 세포(EPC)이다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제6 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3 및 제4 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제5 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제6 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3 및 제4 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제5 실시형태에서, 내피 세포는 노화 내피 세포이다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제7 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제6 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제7 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제6 실시형태에서, 내피 세포는 노화에 의해 손상되고/되거나 스트레스-관련 결함을 나타낸다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제8 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제7 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제8 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제7 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물은 추가로 캡 구조, IRES 서열, 추가 개시 코돈 제공 서열, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 군으로부터 선택된 하나의 구성요소를 포함한다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및 제8 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제9 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제8 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및 제8 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제9 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제8 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물은 5'-> 3' 방향으로 다음을 포함하는 군으로부터 선택된 것이다:
a) - 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
b) - 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
c) - 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역;
d) - 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역;
e) - IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역;
f) - IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역;
g) - 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
h) - 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
i) - IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
j) - IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
k) - 5' 비-번역 영역,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
l) - 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
m) - 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역;
- 캡 구조
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역;
o) - IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역;
p) - IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
- 3' 비-번역 영역;
q) - 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
r) - 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리;
s) - IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리; 및
t) - IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 및 제9 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제10 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및 제8 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제9 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 및 제9 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제10 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및 제8 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제9 실시형태에서, 재조합 핵산은 5' -> 3' 방향으로 다음을 포함한다:
- 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제11 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 및 제9 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제10 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 실시형태이기도 한 제4 양태의 제11 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 및 제9 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제10 실시형태에서, 재조합 핵산은 5' -> 3' 방향으로 다음을 포함한다:
- IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 및 제11 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제12 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제11 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 및 제11 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제12 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제11 실시형태에서, 재조합 핵산은 5' -> 3' 방향으로 다음을 포함한다:
- 캡 구조,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 및 제12 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제13 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 및 제11 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제12 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 및 제12 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제13 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 및 제11 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제12 실시형태에서, 재조합 핵산은 5' -> 3' 방향으로 다음을 포함한다:
- IRES 서열,
- 5' 비-번역 영역,
- 추가 개시 코돈 제공 서열,
- 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
- 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역,
- 3' 비-번역 영역, 및
- 폴리-A 꼬리.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 및 제13 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제14 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 및 제12 실시형태이기도 한 제3 양태의 제13 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 및 제13 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제14 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 및 제12 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제13 실시형태에서, 추가 개시 코돈 제공 서열은 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역을 가진 인-프레임(in-frame)이다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13 및 제14 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제15 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 및 제13 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제14 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13 및 제14 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제15 실시형태에서, 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12 및 제13 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제14 실시형태에서, 5' 비-번역 영역은 5' UTR이다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14 및 제15 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제16 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13 및 제14 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제15 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14 및 제15 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제16 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13 및 제14 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제15 실시형태에서, 5' 비-번역 영역은 진핵세포 유기체, 바람직하게는 포유류 유기체, 보다 바람직하게는 인간, 비-인간 영장류 예컨대 시노몰구스, 침팬지 레수스 몽키, 랫트 및 마우스를 포함하는 군으로부터 선택되는 포유류 유기체로부터 유래된다. 대안적인 실시형태에서 5' 비-번역 영역은 바이러스 유전자로부터 유래되고, 바람직하게는 바이러스는 진핵세포 유기체를 감염시킬 수 있는 바이러스이다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15 및 제16 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제17 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14 및 제15 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제16 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15 및 제16 실시형태이기도 한 제4 양태의 제17 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14 및 제15 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제16 실시형태에서, 5' UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, Ang-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, H3.3.을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 갈렉틴-9를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16 및 제17 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제18 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15 및 제16 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제17 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16 및 제17 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제18 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14 및 제15, 제16 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제17 실시형태에서, 3' 비-번역 영역은 3'-UTR이다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17 및 제18 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제19 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16 및 제17 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제18 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17 및 제18 실시형태이기도 한 제4 양태의 제19 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14 및 제15, 제16, 제17 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제18 실시형태에서, 3' 비-번역 영역은 진핵세포 유기체, 바람직하게는 포유류 유기체, 보다 바람직하게는 인간, 비-인간 영장류 예컨대 시노몰구스, 침팬지 레수스 몽키, 랫트 및 마우스를 포함하는 군으로부터 선택되는 포유류 유기체로부터 유래한다. 대안적인 실시형태에서 5' 비-번역 영역은 바이러스 유전자로부터 유래하고, 바람직하게는 바이러스는 진핵세포 유기체를 감염시킬 수 있는 바이러스이다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18 및 제19 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제20 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17 및 제18 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제19 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18 및 제19 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제20 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17 및 제18 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제19 실시형태에서, 3' UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 H3.3.을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 및 제20 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제21 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18 및 제19 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제20 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 및 제20 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제21 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18 및 제19 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제20 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물의 5' UTR 및 3' UTR은 상이한 기원이며, 바람직하게는 상이한 종으로부터 유래한다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20 및 제21 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제22 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 및 제20 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제21 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20 및 제21 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제22 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 및 제20 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제21 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물의 5' UTR 및 3' UTR은 동일한 기원이며, 바람직하게는 동일한 종으로부터 유래한다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21 및 제22 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제23 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 제20 및 제21 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제22 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 및 제20, 제21 및 제22 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제23 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20 및 제21 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제22 실시형태에서,
a) 5' UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 여기서 3' UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나,
b) 5' UTR은 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 여기서 3' UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나,
c) 5' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 여기서 3' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나,
d) 5' UTR은 ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 여기서 3' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제24 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21 및 제22 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제23 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제24 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21 및 제22 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제23 실시형태에서,
a) 3'UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고 5' UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되고,
b) 3'UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고 5' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되고,
c) 3'UTR은 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고 5' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되거나, 또는
d) 3'UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고 5' UTR은 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23 및 제24 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제25 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20,, 제21, 제22 및 제23 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제24 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23 및 제24 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제25 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제24 실시형태에서, 구조물은 다음을 포함하는 군으로부터 선택된 것이다:
5' UTR이 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 ANG-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물,
5' UTR이 H3.3.을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 H3.3.을 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물, 또는
5' UTR이 갈렉틴 9를 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고, 3' UTR이 갈렉틴 9를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체인, 구조물.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24 및 제25 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제26 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23 및 제24 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제25 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 및 제23, 제24 및 제25 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제26 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23 및 제24 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제25 실시형태에서, 구조물은 폴리-A 꼬리를 포함한다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25 및 제26 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제27 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24 및 제25 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제26 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25 및 제26 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제27 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24 및 제25 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제26 실시형태에서, 구조물은 캡(CAP) 구조를 포함한다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23, 제24, 제25, 제26 및 제27 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제28 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25 및 제26 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제27 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26 및 제27 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제28 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25 및 제26 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제27 실시형태에서, 구조물은 하나 이상의 IRES(내부 리보솜 진입 부위: internal ribosomal entry site) 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, IRES 서열은 캡(Cap) 구조를 대체한다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23, 제24, 제25, 제26, 제27 및 제28 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제29 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26 및 제27 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제28 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27 및 제28 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제29 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26 및 제27 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제28 실시형태에서, 구조물은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28 및 제29 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제30 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27 및 제28 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제29 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27 제28 및 제29 실시형태의 실시형태이기도 한 제4양태의 제30 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25 제26, 제27 및 제28 실시형태의 실시형태이기도 한 제5양태의 제29 실시형태에서, 신호 펩티드는 효과기 분자가 분비되도록 한다.
제2 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 및 제30 실시형태의 실시형태이기도 한 제2 양태의 제31 실시형태에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28 및 제29 실시형태의 실시형태이기도 한 제3 양태의 제30 실시형태에서, 제4 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 및 제30 실시형태의 실시형태이기도 한 제4 양태의 제31 실시형태에서, 및 제5 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28 및 제29 실시형태의 실시형태이기도 한 제5 양태의 제30 실시형태에서, 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 MCP-1의 신호 펩티드 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, Ang-2의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 Ang-1의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 세포 기능이 회복되는 세포 및/또는 세포 내에서 또는 상에서 치료 효과가 발휘되는 세포는 내피 세포, 바람직하게는 혈관 내피 세포이고, 보다 바람직하게는 혈관 내피 세포는 미세혈관 내피 세포이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 내피 세포는 비-분열 내피 세포, 비-증식 내피 세포 또는 휴지 내피 세포이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 내피 세포는 염증 자극에 의해 자극된 내피 세포이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 내피 세포는 노화 내피 세포이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 내피 세포는 노화에 의해 손상되고/되었거나 스트레스-관련 결함을 나타낸다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 세포 기능은 내피 세포의 항-투과성 효과, 항-혈관 누출 효과, 내피 세포의 항-아폽토시스 효과 또는 내피 세포의 항-염증 효과 또는 항-스트레스 반응 효과를 가진 효과기 분자에 의해 회복될 수 있는 것이다. 이의 실시형태에서, 효과기 분자는 혈관 생존 자극, 퇴행 억제, 아폽토시스 억제, 이동 자극, 재형성(remodelling) 자극, 신생혈관형성 자극, 관-형성/침습 자극, 증식 자극, 백혈구 부착 억제, 부착 분자 발현 억제, 조직 인자 발현 억제, NFKappaB 활성 억제 또는 단층 무결성을 촉진한다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과는 Tie-2 신호전달 경로, VEGF-수용체 경로, NOTCH 신호전달 경로, PI3-키나제 경로, eNOS 신호전달 경로, 시르투인-의존적 대사 및 에너지 항상성 경로, 산화적 스트레스 경로, 전단 스트레스 반응 경로, ET-1 신호 전달 경로, NO-매개된 신호 전달 경로, 및 기계화학적 전달 경로와 연결 또는 관련되어 있고, 바람직하게는 상기 경로는 Ang/Tie-2 신호전달 경로, VEGF/VEGF 수용체 경로 및 Notch/Notch 리간드 경로를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 경로의 요소이며, 여기서 상기 경로는 Tie-2 신호전달 경로, VEGF-수용체 경로, NOTCH 신호전달 경로, PI3-키나제 경로, eNOS 신호전달 경로, 시르투인-의존적 대사 및 에너지 항상성 경로, 산화적 스트레스 경로, 전단 스트레스 반응, 경로 ET-1 신호 전달 경로, NO-매개된 신호 전달 경로, 및 기계화학적 전달 경로를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 Ang-1, Ang-4, COMP-Ang-1, hCOMP-Ang-1, COMP-Ang-1, COMP-ANG-2, Tie-2 수용체, Tie-1 수용체, PI3-키나제, 바람직하게는 구성적 활성(constitutive active) PI3-키나제, 과활성(hyperactive) Tie-2 수용체(예컨대 R849W), VE-카데린, GRB2, GRB7, GRB14, GRB7, IQGAP1, RAC1, RAP1, DOK2, ABIN1 및 ABIN2, KLF2(크루펠(Krueppel)-유사 인자 2), 알파5 베타1 인테그린, CD73, Akt 1, Akt 2 및 Akt 3을 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 세포 기능은 혈관 누출이고, 바람직하게는, 상기 경로는 Tie-2 경로이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 VEGF, VEGF-A, VEGF-B, PDGF, bFGF, 시르투인, eNOS, RAS 및 c-MYC를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자가 혈관 재생을 회복하거나 혈관 재생, 바람직하게는 혈관 내피 혈관 재생을 제공한다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 세포 기능이 회복된 세포 및/또는 치료 효과가 세포 내에서 또는 세포 상에서 발휘되는 세포는 비-내피 세포이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 비-내피 세포는 상피 세포, 폐포 대식세포, 폐포 제1형 세포, 폐포 제2형 세포, 폐포 대식세포, 폐포세포, 폐 상피 세포, 조혈 세포, 골수 세포, 골 세포, 줄기 세포, 중간엽 세포, 신경 세포, 신경교세포, 뉴런 세포, 성상세포, 말초신경계 세포, 심장 세포, 지방 세포, 혈관 평활근 세포, 심장 근육 세포, 골격근 세포, 베타 세포, 뇌하수체 세포, 활액 내막 세포, 난소 세포, 고환 세포, B 세포, T 세포, 망상적혈구, 백혈구세포, 과립구세포, 대식세포, 호중구, 항원 제시 세포(수지상 세포), 섬유아세포, 간세포, 종양 세포 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 종양 사멸 리간드, 조혈 및 혈액 응고 관여 인자, 줄기 세포 인자, 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 종양 사멸 리간드는 Apo2L/TRAIL, IL-13, IL-10, IL-8, IL-2, 인터페론 베타, 분비된 프리즐-관련 단백질(SFRP: secreted frizzled-related 단백질) 1, SFRP 2, SFRP 3, SFRP 4 및 SFRP5와 같은 사멸 리간드 단백질의 TNF 유전자 수퍼패밀리 구성원인 IL-12를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 조혈 및 혈액 응고 관여 인자는 에리트로포이에틴, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX 및 헤파란-N-설파타제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 줄기 세포 인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 성장 인자 및 사이토카인은 아드레노메둘린, 앤지오포이에틴 패밀리, 자가분비 이동성 인자, 골 형성 단백질, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터류킨-6(IL-6), 대식세포 콜로니-자극 인자(m-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 상피세포 성장 인자(EGF), 에피린, 에리트로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자 패밀리(FGF1-23), 소마토트로핀, 리간드의 GDNF 패밀리(예컨대 신경교세포주-유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 퍼세핀, 및 아테민), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간세포암-유래 성장 인자(HDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 -1 및 인슐린-유사 성장 인자 -2(IGF-1; IGF-2), 각질형성세포 성장 인자(KGF), 이동-자극 인자(MSF), 대식세포-자극 단백질(MSP), 간세포 성장 인자-유사 단백질(HGFLP)로도 공지됨, 미오스타틴(GDF-8), 뉴레귤린 1-4(NRG1-4), 뉴트로핀(뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴트로핀-3(NT-3), 뉴트로핀-4(NT-4)), 태반 성장 인자(PGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 레날라제(RNLS) - 항-아폽토시스 생존 인자, T-세포 성장 인자(TCGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자 패밀리(VEGF), Wnt 신호전달 경로 신호전달 당단백질(WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론- 알파, 인터페론-베타, 인터류킨 2(IL-2), 인터류킨 11(IL-11), 인터페론-감마, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 및 IL-36을 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 질환은 혈관 누출, 바람직하게는 혈관 내피 세포의 누출, 보다 바람직하게는 미세 혈관 내피 세포의 누출을 특징으로 하거나 이들에 의해 야기된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 질환을 앓고 있는 대상체는 폐에서 염증을 나타낸다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 질환은 폐렴, 패혈증 및 외상을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 질환을 앓고 있는 대상체는 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS: acute respiratory distress syndrome)을 나타낸다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 질환은 폐렴, 바람직하게는 중증 지역사회-획득 폐렴(sCAP: severe community-acquired pneumonia), 지역사회 획득 폐렴(CAP), 병원-획득 폐렴(HAP: hospital-acquired pneumonia)을 포함하는 군으로부터 선택된 폐렴이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 질환은 폐 손상을 특징으로 하거나 이를 나타낸다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 폐 손상은 즉각적인 폐 손상이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 즉각적인 폐 손상은 독성 가스의 흡입, 독성 폐 부종, 바이러스 또는 박테리아 폐 감염, 위 내용물의 흡인, 담수 흡인, 염수 흡인, 폐 좌상, 지방 색전증, 양수 색전증 및 고압 산소 흡입으로 인한 것이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 폐 손성은 간접 폐 손상이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 간접 폐 손상은 패혈증, 균혈증, 내독소혈증, 중증 외상, 쇼크를 포함하는 다발성 외상, 화상, 췌장염, 말라리아 트로피카, 약물 및 면역억제, 만성 알코올 남용, 만성 폐 질환, 낮은 혈청 pH로 인한 것이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 질환 또는 효과는 혈관 재생 또는 수명이고, 여기서, 바람직하게는 효과기 분자는 VEGF, VEGF-A, VEGF-B, PDGF, bFGF, 시르투인(Sirt 1), PPAR-감마, AMPK, eNOS, RAS, c-MYC, FOXO3, PI3 키나제*, Akt, Akt*(*은 키나제의 과활성 및 구성적으로 활성인 유도체를 생성하기 위한 단백질의 융합 또는 절단된 버전을 나타냄), 아데노신 A1 수용체, 아데노신 A2A 수용체, 아데노신 A2B 수용체, 텔로머라제, 야마나카(Yamanaka) 인자(즉 Oct4, sox2, klf4, c-My)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 항아폽토시스 인자이고, 바람직하게는 정상, 즉, 비-질환 내피를 보호하며, 여기서 항아폽토시스 인자는 바람직하게는 PTEN, 서바이빈, IAP, cIAP2 및 XIAP, 뉴로글로빈(사이토크롬 c에 결합), 프로서바이벌 단백질 Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, mcl-1 A1, NR-13, BHRF1, LMW5-HL, ORF16, KS-Bcl-2, E1b-19K 및 P53을 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 아폽토시스 인자이고, 바람직하게는 종양 내피를 표적화하며, 여기서 아폽토시스 인자는 바람직하게는 PTEN, 서바이빈, IAP, cIAP2 및 XIAP, 뉴로글로빈(사이토크롬 c에 결합), 프로서바이벌 단백질 Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, mcl-1 A1, NR-13, BHRF1, LMW5-HL, ORF16, KS-BCl-2, E1b-19K, P53을 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 종양 사멸 리간드이고, 바람직하게는 종양 사멸 리간드는 프로아폽토시스성 또는 항-신생혈관형성성이고, 보다 바람직하게는 종양 사멸 리간드는 사멸 리간드 단백질의 TNF 유전자 수퍼패밀리의 구성원 예컨대 TNF-알파, Fas-L, Apo2L/TRAIL, IL-12, IL-13, IL-10, IL-8, IL-2, 분비된 프리즐-관련 단백질(SFRP) 패밀리(SFRP1, 2, 3, 4, 5), ELTD1, TGF-ß, TNF-a, IL-6, PTEN, p53 및 프로아폽토시스 기능이 있는 다른 종양 억제 유전자, 트롬보스폰딘 C, TIMP-1, TIMP-2, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, Ang-1 및 Tie-2 작용 기능이 있는 유도체, 사이토크롬 c, BH3-유일 단백질, 프로-아폽토시스 Bcl-2 단백질 Bad, Bid, Bax, Bak 및 Bim, Apaf1, 프로카스파제-8, -9 -10, 카스파제 2, 3, 6, 7, 8, 9 및 10을 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 항-염증성이고, 바람직하게는 효과기 분자는 IkappaB 및 돌연변이된 인산화 부위를 가진 유도체, PI3 키나제 및 Akt 키나제 및 과활성 형태를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 혈액 응고 및/또는 조혈에 활성이고, 바람직하게는 효과기 분자는 에리트로포이에틴, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX 및 헤파란-N-설파타제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 유전자 편집 뉴클레아제 예컨대 Cas9이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 치료 항체 또는 미끼(decoy)를 코딩한다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 종양 백신으로서 효과적이며, 바람직하게는 효과기 분자는 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 항원이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 분비된 단백질이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 자가분비 인자로서 효과적이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 효과기 분자는 주변분비(paracrine) 인자로서 효과적이다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물은 리보뉴클레오티드로 구성된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물은 디옥시리보뉴클레오티드로 구성된다.
임의의 이들의 실시형태를 포함하는 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태의 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물은 리보뉴클레오티드 및 디옥시리보뉴클레오티드로 구성된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제1 양태의 재조합 핵산 구조물을 포함하는 벡터 및/또는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 임의의 양태, 바람직하게는 제2, 제3, 제4 및 제5 양태 각각과 관련하여 기술된 재조합 핵산 구조물에 의해, 제6 양태의 제1 실시형태이기도 한 제6 양태에 의해 해결된다.
제6 양태의 제1 실시형태의 실시형태이기도 한 제6 양태의 제2 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
제6 양태의 제2 실시형태의 실시형태이기도 한 제6 양태의 제3 실시형태에서, 벡터는 세포, 바람직하게는 내피 세포에서 재조합 핵산 구조물의 발현을 가능케 하며, 보다 바람직하게는 벡터는 플라스미드 또는 바이러스이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태에 따른 재조합 핵산 구조물을 포함하는 세포, 및/또는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제7 양태에 따른 벡터에 의해, 제7 양태의 제1 실시형태이기도 한 제7 양태에 의해 해결된다.
제7 양태의 제1 실시형태의 실시형태이기도 한 제7 양태의 제2 실시형태에서, 세포는 내피 세포 또는 중간엽 줄기 세포이다.
제7 양태의 제1 및 제2 실시형태의 실시형태이기도 한 제7 양태의 제3 실시형태에서, 세포는 재조합 세포이다.
제7 양태의 제1, 제2 및 제3 실시형태의 실시형태이기도 한 제7 양태의 제4 실시형태에서, 세포는 단리된 세포이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태에 따른 재조합 핵산 구조물을 포함하는 전달 비히클에 의해, 제8 양태의 제1 실시형태이기도 한 제8 양태에 의해 해결되며, 여기서 전달 비히클은 양이온 지질 전달 입자이다.
제8 양태의 제1 실시형태의 실시형태이기도 한 제8 양태의 제2 실시형태에서, 입자는 나노입자이다.
제8 양태의 제1 및 제2 실시형태의 실시형태이기도 한 제8 양태의 제3 실시형태에서, 나노입자의 평균 크기는 약 30 nm 내지 약 200 nm, 바람직하게는 약 30 nm 내지 약 140 nm, 보다 바람직하게는 약 30 nm 내지 약 60 nm이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태에 따른 재조합 핵산 구조물을 포함하는 조성물, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제6 양태에 따른 벡터, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제7 양태에 따른 세포, 및/또는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제8 양태에 따른 전달 비히클에 의해 제9 양태의 제1 실시형태이기도 한 제9 양태에서 해결된다. 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는 또한, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태에 따른 재조합 핵산 구조물, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제6 양태에 따른 벡터, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제7 양태에 따른 세포, 및/또는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제8 양태에 따른 전달 비히클의 약제의 제조에서의 사용에 의해, 제10 양태에서 해결된다. 이의 실시형태에서, 약제는 질환, 바람직하게는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태와 관련하여 본원에 기술된 질환 치료용이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는 또한, 대상체, 바람직하게는 인간 대상체를 치료하는 방법에 의해 제11 양태에서 해결되며, 여기서 상기 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태에 따른 재조합 핵산 구조물, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제6 양태에 따른 벡터, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제7 양태에 따른 세포, 및/또는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제8 양태에 따른 전달 비히클, 및/또는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제9 양태에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이의 실시형태에서, 상기 방법은 질환, 바람직하게는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태와 관련하여 본원에 기술된 질환 치료용이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 기초가 되는 문제는 또한 대상체, 바람직하게는 인간 대상체를 백신접종하는 방법에 의해 제12 양태에서 해결되며, 여기서 상기 방법은 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태에 따른 재조합 핵산 구조물, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제6 양태에 따른 벡터, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제7 양태에 따른 세포, 및/또는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제8 양태에 따른 전달 비히클, 및/또는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제9 양태에 따른 조성물의 면역 반응, 바람직하게는 원하는 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이의 실시형태에서, 상기 방법은 질환, 바람직하게는 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 제2, 제3, 제4 및 제5 양태와 관련하여 본원에 기술된 질환 치료용이다. 바람직한 실시형태에서, 효과기 분자는 이러한 면역 반응을 유도할 수 있거나 유도하기에 적합한 것이다.
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 이종 구조물 또는 재조합 구조물은 바이러스, 세포, 조직, 또는 기관 또는 유기체와 같은 야생형 생물학적 시스템에 존재하지 않는 구조물이다. 보다 바람직하게는, 이종 구조물 또는 재조합 구조물은 상기 구조물에 포함된 적어도 하나의 구성요소가 효과기에 대한 코딩 영역과 합쳐지지 않은 것이며, 여기서 상기 요소는 5' 비-번역 영역, 3' 비-번역 영역, 캡 구조, 신호 서열 및 폴리-A 꼬리로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 5' 비-번역 영역은 5' UTR이고 3' 비-번역 영역은 3' UTR이다.
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 질환의 치료적 방법 또는 치료 및/또는 예방 방법은 요법(therapy)이다.
본 발명의 각각의 및 임의의 양태의 실시형태에서, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역은 내피 세포에 의해 발현된다. 이의 바람직한 실시형태에서, 효과기 분자를 발현하는 내피 세포는 이의 기능이 손상된 내피 세포이다. 대안적인 바람직한 실시형태에서, 효과기 분자를 발현하는 내피 세포는 이의 기능이 손상되지 않은 내피 세포이다; 이러한 경우, 효과기 분자는 내피 세포를 생성하는 효과기 분자에 의해 내보내지거나 분비되며 임의의 다른 세포, 일반적으로 임의의 다른 내피 세포에서 그 효과를 발휘하며, 이에 따라 이러한 다른 세포는 기능이 손상된 세포이다. 바람직한 실시형태에서, 세포의 손상된 기능은 이의 다양한 양태에서 본 발명에 따라 회복될 세포의 기능이다.
바람직하게는 본원에서 사용된 바와 같이, 모(parent) 서열과 동일한 기능을 나타내는 서열의 유도체; 바람직하게는 모 서열은 또는 야생형 서열이다. 바람직한 실시형태에서, 유도체 및 모체의 경우의 서열은 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
유도체가 모 서열의 절단된(truncated) 버전인 것이 본 발명에 속한다. 이러한 절단은 5' 말단, 3' 말단 또는 5' 말단과 3' 말단 둘 모두에 존재할 수 있다. 동일성 측면에서 모 서열을 참조하는 경우, 그러한 바람직한 동일성은 참조 서열로서 작용하는 모 서열의 서열과 유도체 및 모 서열 모두에 의해 공유되는 후속 뉴클레오티드의 스트레치를 지칭한다.
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역은 상기 효과기 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 5' 비-번역 영역은 5' 비-번역 서열이다.
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 3' 비-번역 영역은 5' 비-번역 서열이다.
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 재조합 핵산 구조물에 포함된 임의의 하나의 요소의 임의의 공급원의 표시는 뉴클레오티드 서열의 대체 또는 대안적인 설명으로 이해되어야 한다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 서열 중 하나, 보다 바람직하게는 각각의 인간 야생형 서열 중 하나이다. 당업자는 인간 이외의 다른 종이 그러한 야생형 서열을 제공할 수 있다는 것을 이해할 것이다; 본 발명의 실시형태에서 인간 이외의 다른 종에 대한 그러한 야생형 서열은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 또한, 그러한 야생형 서열이 GenBank와 같은 공개적으로 이용 가능한 데이터 베이스로부터 취해질 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 야생형 서열은 일반적으로 서열 오류를 수정하기 위해 시간 경과에 따라 변경될 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 서열은 본 출원의 출원일에 GenBank와 같은 상기 공개적으로 이용가능한 데이터 베이스에 기술된 것이다. 다양한 각각의 야생형 서열이 존재하는 한, 각각 및 임의의 그러한 야생형 서열이 본 발명에 포함되어야 한다. 또 다른 실시형태에서, 하나 초과의 야생형 서열이 있고 하나 초과의 야생형 서열이 상이한 지리적으로 정의된 집단 군 및/또는 상이한 유전적으로 정의된 집단 군과 같은 상이한 집단 군에 의해 제공되는 경우, 상기 상이한 집단 군 중 가장 포괄적인 군에서 우세한 야생형 서열이 야생형 서열로 간주될 수 있다.
본 발명의 실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 유도체가 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 것을 나타내는 유전자의 5' UTR의 유도체를 참조하는 경우, 동일성은 유전자의 5' UTR을 지칭하거나 이에 대해 상대적인 동일성이다.
본 발명의 실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 유도체가 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 갖는 것을 나타내는 유전자의 3' UTR의 유도체를 참조하는 경우, 동일성은 유전자의 3' UTR을 지칭하거나 이에 대해 상대적인 동일성이다.
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 신호 펩티드는 신호 펩티드에 융합되거나 부착된 폴리펩티드 또는 단백질의 세포 외 공간으로의 전달 또는 분비를 직접 또는 간접적으로 매개하는 펩티드이며, 그 결과로, 바람직하게는, 신호 서열은 각각 폴리펩티드 및 단백질에서 제거된다.
본 발명의 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물은 도면에 개시되어 있으며, 보다 구체적으로 재조합 핵산 구조물은 도 40(PAN29), 도 90(PAN58), 도 86(PAN54), 도 67(PAN50), 도 45(PAN34), 도 44(PAN33), 도 39(PAN28), 도 37(PAN12), 도 88(PAN56)에 개시되어 있다.
본 발명의 실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 미끼(decoy)는 리간드에 결합하여 신호전달 활성을 중화하는 mRNA 코딩된 단백질이다.
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리-A 꼬리는 서로 공유적으로 부착된 복수의 A를 포함하거나 이로 구성된 뉴클레오티드 서열이며, 여기서 이러한 공유 결합은 바람직하게는 포스포디에스터 연결이다. 이의 실시형태에서, 폴리-A 꼬리는 약 20 내지 약 240 A(즉 아데노신포스페이트) 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 60 내지 120 A, 보다 바람직하게는 약 100 내지 140 A 가장 바람직하게는 약 120 A를 포함한다.
폴리 A 꼬리는 천연 메신저 및 합성 센스 RNA를 안정화시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 일 실시형태에서, 긴 폴리 A 꼬리가 mRNA 분자에 추가되어 RNA를 보다 안정하게 만들 수 있다. 폴리 A 꼬리는 당업계에서 인정된 다양한 기술을 사용하여 첨가될 수 있다. 예컨대, 긴 폴리 A 꼬리는 폴리 A 중합효소(문헌[Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256])를 사용하여 합성 또는 시험관 내 전사된 RNA에 첨가될 수 있다. 전사 벡터는 또한 긴 폴리 A 꼬리를 코딩할 수 있다. 또한, 폴리 A 꼬리는 PCR 산물로부터 직접 전사되어 첨가될 수 있다. 폴리 A는 또한 RNA 리가아제를 사용하여 센스 RNA의 3' 말단에 연결될 수 있다(예컨대 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1991 edition)] 참조). 일 실시형태에서, 폴리 A 꼬리의 길이는 적어도 약 90, 200, 300, 400 적어도 500 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에서, 폴리 A 꼬리의 길이는 본 발명의 변형된 센스 mRNA 분자의 안정성 및, 따라서, 단백질의 전사를 제어하도록 조정된다. 예컨대, 폴리 A 꼬리의 길이는 센스 mRNA 분자의 반감기에 영향을 미칠 수 있으므로, 폴리 A 꼬리의 길이는 mRNA의 뉴클레아제에 대한 내성 수준을 수정하여 세포에서 단백질 발현의 시간 경과를 조절하도록 조정할 수 있다. 일 실시형태에서, 안정화된 핵산 분자는 생체 내 분해(예컨대, 뉴클레아제에 의해)에 대해 충분히 내성이 있어서, 전달 비히클 없이 표적 세포에 전달될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 이중-가닥 RNA 오염을 제거하여 선천성 면역계 활성화를 감소시키기 위해 HPLC에 의해 정제될 수 있다(예컨대 문헌[Kariko et al., Nucleic Acids Res. 2011 Nov; 39(21):e142] 참조).
실시형태에서 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 캡(CAP) 구조는 당업자에게 공지된 캡 구조를 형성하는 뉴클레오티드 서열이다. 진핵 세포에서 캡-구조는 m7G(5')ppp(5')G 5'-5'-트리포스페이트 연결 구조로 이루어져 있다. mRNA의 5'-말단에 있는 처음 2개의 리보스 당은 캡-1(2개의 리보스 당 중 첫 번째가 메틸화되는 경우) 및 캡-2 구조(2개의 리보스 당 중 두 번째가 메틸화되는 경우)로 공지된 2'-위치에서 메틸화될 수 있다. 캡-구조는 캡핑 및 2'-O-메틸트렌스퍼라제 효소 및 S-아데노실메티오닌(SAM: S-adenosylmethionine)을 메틸 공여자로서 사용하여 mRNA 전사 동안 또는 전사 후 혼입될 수 있다. 또한, 포스파타제 처리가 면역 자극 5'-포스페이트를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태에 따른 재조합 핵산 구조물의 바람직한 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물은 mRNA이다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 20을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, MCP-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 23을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 24를 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, RPL12s.c.를 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 25를 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, Ang-2를 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 26을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, Ang-2를 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 29를 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, HSP70을 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 38 또는 40을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, HSP70을 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 39 또는 43을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, H3.3.을 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 44를 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, H3.3.을 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 45를 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, 갈렉틴-9(LHALS9)를 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 46을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, 갈렉틴-9(LHALS9)를 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 47을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, IL-6을 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 30을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, IL-6을 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 33을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, vWF를 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 34를 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 37을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, Ang-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 83을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, Ang-1을 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 88을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, Ang-4를 코딩하는 유전자의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 89를 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, Ang-4를 코딩하는 유전자의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 94를 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, 구조물 PAN57의 5' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 120을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, 구조물 PAN57의 3' UTR은 뉴클레오티드 서열인 서열번호 121을 포함한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, 본원에서 개시된 각각의 및 임의의 특정 구조물에서 실현되는 5' UTR 및 3' UTR의 다양한 조합은 임의의 다른 구성성분과 관계 없이 특히 본 발명의 재조합 핵산 구조물에 함유된 효과기 분자를 코딩하는 임의의 코딩 영역과는 관계 없이 재조합 핵산 구조물에서 실현될 수 있는 5' UTR 및 3' UTR의 조합이다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 본 발명의 각각 및 임의의 양태의 실시형태에서, 그리고 바람직하게는 본원에서 사용되는 바와 같이, 내인성 유전자는 본원에 기술된 임의의 세포에 포함된 유전자이다. 이에 따라서, 5' UTR 및 3' UTR이 상이한 내인성 유전자로부터 유래한 재조합 핵산 구조물은 세포의 제1 유전자 유래의 5' UTR 및 세포의 제2 유전자 유래의 3' UTR을 포함하며, 예컨대, 5' UTR은 MCP-1 또는 Ang-2를 코딩하는 유전자로부터 유래하고, 3' UTR은 vWF를 코딩하는 유전자로부터 유래한다. 상기 세포는 동일한 세포 또는 상이한 세포일 수 있고/있거나 상기 세포는 동일한 종류의 세포 또는 상이한 종류의 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 인간 기원이다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태에 따른 재조합 핵산 구조물의 바람직한 실시형태에서, 재조합 핵산 구조물은 재조합 핵산 분자이다.
재조합 핵산 분자를 형성하는 뉴클레오티드가 변형될 수 있음은, 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 각각 및 임의의 양태에 의해 정의된 본 발명에 속한다. 적합한 변형은 코돈이 동일한 아미노산을 코딩하지만 핵산의 야생형 버전에서 발견되는 코돈보다 더 안정하도록 코돈의 하나 이상의 뉴클레오티드에서의 변경을 포함한다. 예컨대, RNA의 안정성과 더 많은 수의 시티딘(C) 및/또는 우리딘(U) 잔기 사이의 역 관계가 입증되었으며, C 및 U 잔기가 없는 RNA는 대부분의 RNase에 대해 안정적인 것으로 밝혀졌다(문헌[Heidenreich, et al. J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)]). 일부 실시형태에서, mRNA 서열에서의 C 및/또는 U 잔기의 수는 감소된다. 또 다른 실시형태에서, C 및/또는 U 잔기의 수는 특정한 아미노산을 코딩하는 하나의 코돈을 동일하거나 관련된 아미노산을 코딩하는 또 다른 코돈으로 치환함으로써 감소된다. 본 발명의 mRNA 핵산에 대해 고려되는 변형은 또한 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 5'-메틸시티딘의 혼입을 포함한다. 이러한 변형된 뉴클레오티드의 재조합 핵산 구조물, 바람직하게는 본 발명의 mRNA로의 혼입은 안정성 및 번역능력의 향상뿐만 아니라 생체 내 면역원성을 감소시킬 수 있다(문헌[Kariko, K., et al., Molecular Therapy 16(11): 1833-1840(2008)] 참조). 특히 재조합 핵산 구조물의 개별적인 뉴클레오티드의 수준에서, 본 발명의 재조합 핵산 구조물에 대한 치환 및 변형은 당업자에게 용이하게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
서열에서 C 및 U 잔기의 수를 감소시키는 것에 대한 제약은 비번역 영역에 비해, mRNA의 코딩 영역 내에서 더 클 것이다(즉, 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 메시지의 능력을 여전히 유지하면서 메시지에 존재하는 모든 C 및 U 잔기를 제거하는 것은 불가능할 것이다). 그러나 그런 유전 코드의 퇴행성은 동일한 코딩 능력을 유지하면서 서열에 존재하는 C 및/또는 U 잔기의 수를 감소시킬 수 있는 기회를 제공한다(즉, 어떤 아미노산이 코돈에 의해 코딩되는 지에 따라, RNA 서열의 변형에 대한 여러 가지 상이한 가능성이 가능할 수 있다). 예컨대, Gly에 대한 코돈은 GGU 또는 GGC 대신 GGA 또는 GGG로 변경될 수 있다.
용어 변형은 또한, 예컨대 비-뉴클레오티드 연결 또는 변형된 뉴클레오티드가 본 발명의 핵산 서열에 삽입되는 것을 포함한다(예컨대, 기능성 단백질 또는 효소를 코딩하는 mRNA 분자의 3' 및 5' 말단의 하나 또는 둘 모두의 변형). 이러한 변형은 핵산 서열에 염기 추가(예컨대, 폴리 A 꼬리 또는 더 긴 폴리 A 꼬리의 추가), 3′UTR 또는 5′UTR의 변경, 핵산과 제제(예컨대, 단백질 또는 상보적 핵산 단백질)의 착화, 핵산 분자의 구조를 변화시키는 요소(예컨대, 2차 구조를 형성함)의 포함을 포함한다.
제8 양태에 따른 전달 비히클은 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 핵산 구조물과 조합하여 전체적으로 양이온-지질-핵산 입자(cLNP: cationic-lipid-nucleic acid particle)를 생성하는 하나 이상의 적합한 지질(예컨대 리포좀)의 조성물을 기반으로 한다. 이러한 cLNP는 핵산, 특히 mRNA를 포유류 혈관계의 내피 세포로 기능적으로 전달하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 구조물과 같은 핵산과 양쪽이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질과 같은 다른 지질 성분과 조합된 양이온성 지질의 착화에 의해 형성된 지질-핵산 나노입자(LNP: lipid-nucleic acid nanoparticle)는 이미 혈청에서 RNA의 분해를 차단하고 RNA의 기능적 세포 흡수를 촉진하는데 사용되어 왔다.
그러나, 치료적 맥락에서, 특히 비경구 치료적 적용의 관점에서, 제타-전위를 특징으로 하는 지질-핵산 나노입자의 전체 전하는 나노입자의 기관 분포를 지시하는데 필수적이다. 당업자는 전반적으로 중성으로 하전된 LNP가 거의 배타적으로 망상내피계 기관, 특히 간 및 비장에 의해 흡수된다는 것을 이해할 것이다. 한편, 전반적으로 양으로 하전된 지질 나노입자가 포유류 혈관계의 세포에 약학적인 페이로드를 기능적으로 전달하는데 유용하다는 것이 또한 당업자에게 공지되어 있다.
당업자는 또한 유리 핵산, 특히 mRNA가 정맥 내로 적용되는 경우 면역 자극성임을 인식할 것이다.
따라서, 비경구 치료적 적용의 관점에서, 지질 나노입자 내부의 핵산의 철저하고 안정적인 착화는 원치 않는 면역원성 부반응을 방지하기 위해 필수적일 것이다. 또한, 지질-핵산 나노입자의 크기가 입자의 망상내피 제거를 억제하는데 결정적이라는 것도 당업자에게 공지되어 있다.
최근에 엇갈린 헤링본 마이크로믹서(SHM: staggered herringbone micromixer) 장치에 기반한 미세유체 혼합 공정을 사용하여 매우 강력한 한계 크기 siRNA LNP(약 30 nm 평균 입자 크기)가 제조될 수 있음이 기술되었다(문헌[Belliveau et al.; Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1(8)]).
나노리터 규모의 본 발명의 재조합 핵산 구조물과 같은 지질 및 핵산의 밀리초 혼합으로 인해, 생성된 입자는 밀도가 높은 고체 입자 코어 내부에 핵산이 매우 촘촘하게 패킹되어 있는 것을 특징으로 한다. 반대로, 당업자는 T-유형 커넥터를 사용하는 거대유체 혼합 공정이 일반적으로 보다 이질적인 다중 층 형태를 가진 더 큰 나노입자를 생성한다는 것을 인식할 것이다.
실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 상기 재조합 핵산 구조물, 특히 mRNA를 포유류 혈관계의 세포, 특히 폐 혈관계의 내피 세포에 기능적으로 전달하기 위한 본 발명의 재조합 핵산 구조물과 같은 핵산을 포함하는 신규한 양으로 하전된 지질-핵산 나노입자를 제공한다.
이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 본 발명의 다양한 양태의 실시형태에서, β-(L-아르기닐)-L-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드, L-아르기닐-β-알라닌-N-팔미틸-N-올레일-아미드, DOTAP(N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸-클로라이드), DOTMA(1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판(클로라이드 염)) 또는 DC-콜레스테롤을 포함하는 군으로부터 선택되는 양이온성 지질은 중성 지질과 조합되어 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형을 포함하는 지질 성분을 추가로 보호한다. 중성 지질은 디피타노일-PE(1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DOPE(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DLPE(1,2-라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DMPE, POPE, DSPE를 포함하는 군으로부터 선택되는 양쪽이온성 인지질 또는 콜레스테롤 및 스티그마스테롤을 포함하는 군으로부터 선택된 비하전 스테롤 지질일 수 있다. PEG화된 지질 성분은 메톡시PEG-DSPE, 메톡시PEG-DLG, 메톡시PEG-DMG, 메톡시PEG-DPG, 메톡시PEG-DSG, 메톡시PEG-c-DMA, 메톡시PEG-C8-Cer아미드, 메톡시PEG-C16-Cer아미드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, PEG-쇄의 사슬 길이는 750 Da 내지 5000 Da의 범위, 바람직하게는 1500 Da 내지 3000 Da의 범위의 분자량에 해당한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 지질 혼합물 중의 지질의 몰 비는 20 내지 80 몰% 양이온 지질, 10 내지 70 몰% 중성 지질 및 1 내지 10 몰% PEG화 지질의 범위, 바람직하게는 35 내지 65 몰% 양이온 지질, 35 내지 65 몰% 중성 지질 및 1 내지 5 몰% PEG화 지질의 범위(전체 지질 함량은 100%로 설정됨)이다.
바람직한 실시형태에서, 양이온 지질은 β-(L-아르기닐)-L-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 또는 L-아르기닐-β-알라닌-N-팔미틸-N-올레일-아미드이고, 중성 지질은 인지질 디피타노일-PE이고 PEG화된 지질은 메톡시PEG2000-DSPE이다. 몰 비는 50 몰% 양이온 지질, 49 몰% 디피타노일-PE 및 1 몰% mPEG2000-DSPE(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](소듐 염))이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 언급된 지질의 혼합물은 에탄올, 아세톤, 1-부탄올, 2-부탄올, tert.-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-1-프로판올, 1-프로판올, 2-프로판올, 디메틸설폭시드를 포함하는 군, 바람직하게는 에탄올, tert.-부탄올 및 1-부탄올을 포함하는 군으로부터 선택된 수 혼화성 용매에 용해된다.
용해된 지질 혼합물은 이어서 수용액 중에서 본 발명의 재조합 핵산 구조물과 같은 핵산의 용해와 신속하게 혼합되어, 지질-핵산 나노입자(LNP)가 형성된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 혼합은 미세유동 혼합 장치를 사용하여, 특히 엇갈린 헤링본-유형 혼합 챔버, 예컨대 NanoAssemblrTM(Precision NanoSystems Inc.; 캐나다, 밴쿠버) 장치를 사용하여 수행된다.
또 다른 실시형태에서, 총 지질 대 핵산 예컨대 본 발명의 재조합 핵산 구조물의 질량 비는 5 내지 60의 범위, 바람직하게는 15 내지 40의 범위이고 수성 핵산 용액 대 유기 총 지질 용액의 부피 혼합 비는 1:1 내지 6:1의 범위, 바람직하게는 2:1 내지 4:1의 범위이다. 용액의 혼합 유속은 5 ml/분 내지 25 ml/분의 범위, 바람직하게는 10 ml/분 내지 20 ml/분의 범위이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 생성된 혼합물의 유기 용매는 혼합 단계 후에 투과에 의해 또는 한외여과 막을 사용하는 접선 유동 여과에 의해 제거되며, 이에 따라 한외여과 막은 중공 섬유 막 또는 평면-스크린 막일 수 있다. 한외여과 막의 기공 크기는 1500 Da 내지 500.000 Da의 범위, 바람직하게는 1500 Da 내지 100.000 Da의 범위, 보다 더 바람직하게는 1500 Da 내지 30.000 Da의 범위의 분자량 컷오프에 해당한다. 접선 유동 여과 단계 내에서, LNP를 원하는 농도로 농축하는 것이 또한 가능하다.
생성된 LNP의 평균 입자 크기는 동적 광 산란(DLS: dynamic light scattering) 기술을 사용하여 측정될 수 있으며 바람직하게는 15 nm 내지 400 nm의 범위, 보다 바람직하게는 25 nm 내지 200 nm의 범위이고 보다 더 바람직하게는 입자는 25 nm 내지 100 nm의 범위의 크기를 갖는다. LNP의 전반적인 입자 전하는 양성이고 입자의 제타-전위는 바람직하게는 +5 mV 내지 +60 mV 사이의 범위, 보다 바람직하게는 +25 mV 내지 +60 mV의 범위이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 전달 비히클은 리포좀 전달 비히클, 예컨대 리포좀 나노입자 또는 리피도이드 나노입자이다. 일 실시형태에서, 전달 비히클은 표적 세포로의 본 발명의 재조합 핵산 구조물의 전달을 최적화하도록 선택되고/되거나 제조될 수 있다. 예컨대, 표적 세포가 내피 세포인 경우, 전달 비히클의 특성(예컨대, 크기, 전하 및/또는 pH)은 표적 세포로의 이러한 전달 비히클이 효과적으로 전달되고, 면역 제거를 감소시키고/시키거나 상기 표적 세포에서의 유지를 촉진하도록 최적화될 수 있다. 다르게는, 표적 세포가 중추 신경계에 있는 경우(신경퇴행성 질환의 치료를 위해 투여된 본 발명의 재조합 핵산 구조물과 같은 mRNA가 뇌 또는 척추 조직을 특이적으로 표적화할 수 있음), 전달 비히클의 선별 및 제조는 혈액 뇌 장벽의 침투 및 그 내부에서의 유지 및/또는 이러한 전달 비히클이 이러한 표적 세포에 직접 전달되는 대체 수단의 사용을 고려해야 한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 외인성 mRNA의 전달을 용이하게 하는 제제(예컨대 혈액 뇌 장벽의 침투를 방해하거나 개선하여 외인성 mRNA의 표적 세포로의 전달을 향상시키는 제제)와 조합될 수 있다.
리포좀(예컨대 리포좀 지질 나노입자)은 생체 내에서 진단 또는 치료 화합물의 전달 비히클로서 이들의 용도에 특히 적합한 것으로 공지되어 있으며(문헌[Lasic, Trends Biotechnol, 16: 307-321, 1998; Drummond et al, Pharmacol. Rev., 51: 691-743, 1999]) 일반적으로 하나 이상의 이중 층의 막에 의해 외부 매질로부터 격리된 내부 수성 공간을 가진 미세 소포로 특성화된다. 리포좀의 이중 층 막은 일반적으로 양친매성 분자, 예컨대 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 기원의 지질에 의해 형성된다(문헌[Lasic, Trends Biotechnol, 16: 307- 321, 1998]). 리포좀의 이중 층 막은 또한 양친매성 중합체 및 계면활성제(예컨대 폴리머좀, 니오좀 등)에 의해 형성될 수 있다. 이러한 리포좀은 또한 본 발명의 재조합 핵산 구조물을 포함하는 본 발명의 전달 비히클에서 지질 모이어티로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 양태와 관련하여 개시된 바와 같은 재조합 핵산 구조물과 관련된 임의의 특징은 동일하게 이들의 임의의 실시형태를 포함하여, 본 발명의 각각 및 임의의 다른 양태의 재조합 핵산 구조물의 실시형태임을 인지해야 한다. 보다 구체적으로, 제1 양태와 관련하여 개시된 재조합 핵산 구조물의 임의의 실시형태는 또한 제2, 제3 및 제4 양태의 재조합 핵산 구조물의 실시형태이고; 유사하게, 제2, 제3 및 제4 양태와 관련하여 개시된 재조합 핵산 구조물의 임의의 실시형태는 또한 제1 양태의 재조합 핵산 구조물의 실시형태이다.
일반적으로 코딩 영역에 인접한 UTR은 코딩 영역을 방해하지 않으며, 보다 구체적으로, UTR은 원칙적으로 코딩 영역의 발현을 방해하지 않으면서 교환될 수 있는 것으로 당업계에서 인정되고 있다(예컨대, 국제공개특허 제WO 2017/100551 A1호; 문헌[Trepotec et al.; Tissue Engineering Part A, Vol 0 Nr ja (Apr. 2018) (https://doi.org/10.1089/ten.TEA.2017.0485)] 참조).
본 발명은 본 발명의 추가 특징, 실시형태 및 이점이 취해질 수 있는 다음의 도면 및 실시형태에 의해 추가로 예시된다.
도 1은 종래 mRNA 분자 구조의 개략도이다.
도 2는 열린 해독 프레임이 나노-루시퍼라제, 즉 PAN02, PAN05, PAN07, PAN08, PAN09, PAN10, PAN11, PAN12, 13, PAN28, PAN29, PAN30, PAN31, PAN32, PAN33, PAN34, PAN35, PAN36, PAN37, PAN38, PAN39, PAN40, PAN41, PAN42, PAN43, PAN44, PAN45, PAN46, PAN47, PAN48 및 PAN49 중 하나인 코딩 서열을 가진 mRNA 구조물의 선택된 실시예의 개략도이다.
도 3은 구조물 PAN11을 포함하는 플라스미드 pcDNA3.1(-)의 제한 지도이다.
도 4는 도 3의 플라스미드 pcDNA3.1(-)의 제한 분해 지도이다.
도 5는 BamHI 제한 시 구조물 PAN28("28"), PAN13("13"), PAN12("12"), PAN11("11"), PAN10("10"), PAN09("09"), PAN08("08"), PAN07("07") 및 PAN05("05")를 포함하는 pcDNA3.1(-) 플라스미드의 비-선형화된(잘리지 않음, 수퍼코일, 좌측 레인) 및 선형화 산물(우측 레인)을 나타내는 EtBr로 염색된 1% 아가로스 겔이다.
도 6은 120 nt의 폴리-A 꼬리의 첨가에 대한 폴리-A 꼬리 PCR의 PCR 산물을 나타내는 EtBr로 염색된 1% 아가로스 겔이다.
도 7a는 표시된 유전자의 5' UTR에 대해 사용되는 5' 프라이머를 나타낸다; 제1 컬럼은 이러한 프라이머가 사용될 구조물과 관련하여 표시하고, 제2 컬럼은 5' UTR의 기원을 표시하고, 제3 컬럼은 프라이머가 뉴클레오티드 서열을 혼성화하는 위치를 표시한다.
도 7b는 표시된 유전자의 3' UTR에 대해 사용된 3' 프라이머를 나타낸다; 제1 컬럼은 이러한 프라이머가 사용될 구조물과 관련하여 나타내고, 제2 컬럼은 3' UTR의 기원을 표시하고, 제3 컬럼은 프라이머가 뉴클레오티드 서열을 혼성화하는 위치를 표시한다.
도 8은 다양한 구조물의 시험관 내 mRNA 전사체를 나타내는 EtBr 염색 후의 비-변성 아가로스 겔의 이미지이다.
도 9는 0.5 μg(좌측) 및 0.1 μg(우측)의 녹색 형광 단백질(TriLINK Biotechnology) 생산의 상업적으로, 강화된 mRNA 버전으로 형질감염된 HeLa 세포의 형질감염 24시간 후 형광 현미경 사진이다.
도 10은 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위, relative light unit)로 표시된 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서, 루시퍼라제는 감염 2시간 후(좌측 컬럼), 6시간 후(중간 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다.
도 11은 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, HPMEC의 전체 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 6시간 후(좌측 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다.
도 12는 HUVEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간 후(좌측 컬럼), 6시간 후(중간 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다.
도 13은 HUVEC 세포용해 후 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, HUVEC의 전체 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간 후(좌측 컬럼), 6시간 후(중간 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다.
도 14는 HeLa 세포에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며,여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간 후(좌측 컬럼), 6시간 후(중간 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다.
도 15a는 호모 사피엔스 C-C 모티프 케모카인 리간드 2(CCL2: chemokine ligand 2)(GenBank entry NM_002982.3)로도 지칭되는 인간 MCP-1의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 15b는 인간 MCP-1의 신호 펩티드 서열의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 둘 모두를 나타낸다.
도 15c는 인간 MCP-1의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 16a는 RPL12s.c.(GenBank entry XM_021987044.1)로도 지칭되는 스피나치아 올레라시아(Spinacia oleracea)의 엽록체(LOC110782793)인 50S 리보솜 단백질 L12의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 16b는 스피나치아 올레라시아(Spinacia oleracea)의 엽록체(LOC110782793)인 50S 리보솜 단백질 L12의 mRNA 유래의 3' UTR을 나타낸다.
도 17a는 ANGPT2 또는 Ang-2, 전사 변이체 1(GenBank entry NM_001147.2)로도 지칭되는 인간 앤지오포이에틴 2의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 17b는 인간 Ang-2의 mRNA의 신호 서열의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 둘 모두를 나타낸다.
도 17c는 인간 Ang-2의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 18a는 인간 인터류킨 6(IL-6), 전사 변이체 1(GenBank entry NM_000600.4)의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 18b는 인간 IL-6의 mRNA의 신호 서열의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 둘 모두를 나타낸다.
도 18c는 인간 IL-6의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 19a는 인간 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor, vWF)(GenBank entry NM_000552.4)의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 19b는 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 mRNA의 신호 서열의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 둘 모두를 나타낸다.
도 19c는 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 20a는 HSPA1A(GenBank entry NM_005345.5)로도 지칭되는 인간 열 충격 단백질 패밀리 A(Hsp70) 구성원 1A의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 20b는 인간 HSPA1A의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 21a는 HSPA5(GenBank entry NM_005347.4)로도 지칭되는 인간 열 충격 단백질 패밀리 A(Hsp70) 구성원 5의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 21b는 인간 HSPA5의 mRNA의 신호 서열의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 둘 모두를 나타낸다.
도 21b는 인간 HSPA5의 mRNA의 신호 서열의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 둘 모두를 나타낸다.
도 21c는 인간 HSPA1A의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 22a는 H3.3(GenBank entry NM_002107.4)으로도 지칭되는 인간 H3 히스톤 패밀리 구성원 3A(H3F3A)의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 22b는 인간 H3.3의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 23a는 인간 갈렉틴-9(LGALS9), 전사 변이체 1(GenBank entry NM_009587.2)의 mRNA의 5' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 23b는 인간 갈렉틴-9의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 24는 재조합 핵산 구조물 PAN01의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 25는 재조합 핵산 구조물 PAN03의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 26은 재조합 핵산 구조물 PAN04의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 27은 재조합 핵산 구조물 PAN06의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 28은 재조합 핵산 구조물 PAN36의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 29는 재조합 핵산 구조물 PAN37의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 30은 재조합 핵산 구조물 PAN02의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 31은 재조합 핵산 구조물 PAN05의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 32는 재조합 핵산 구조물 PAN07의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 33은 재조합 핵산 구조물 PAN08의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 34는 재조합 핵산 구조물 PAN09의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 35는 재조합 핵산 구조물 PAN10의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 36은 재조합 핵산 구조물 PAN11의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 37은 재조합 핵산 구조물 PAN12의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 38은 재조합 핵산 구조물 PAN13의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 39는 재조합 핵산 구조물 PAN28의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 40은 재조합 핵산 구조물 PAN29의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 41은 재조합 핵산 구조물 PAN30의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 42는 재조합 핵산 구조물 PAN31의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 43은 재조합 핵산 구조물 PAN32의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 44는 재조합 핵산 구조물 PAN33의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 45는 재조합 핵산 구조물 PAN34의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 46은 재조합 핵산 구조물 PAN35의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 47은 재조합 핵산 구조물 PAN38의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 48은 재조합 핵산 구조물 PAN39의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 49는 재조합 핵산 구조물 PAN40의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 50은 재조합 핵산 구조물 PAN41의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 51은 재조합 핵산 구조물 PAN42의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 52는 재조합 핵산 구조물 PAN43의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 53은 재조합 핵산 구조물 PAN44의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 54는 재조합 핵산 구조물 PAN45의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 55는 재조합 핵산 구조물 PAN46의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 56은 재조합 핵산 구조물 PAN47의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 57은 재조합 핵산 구조물 PAN48의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 58은 재조합 핵산 구조물 PAN49의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 59a는 ANGPT1 또는 Ang-1, 전사 변이체 1, GenBank entry NM_001146.4로도 지칭되는 인간 앤지오포이에틴 1의 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 59b는 인간 Ang-1의 mRNA의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 두 모두를 나타낸다.
도 59c는 인간 Ang-1의 mRNA의 성숙 펩티드의 코딩 서열(CDS)을 나타낸다.
도 59d는 인간 Ang-1의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 60a는 ANGPT4 또는 Ang-4, 전사 변이체 1, GenBank entry NM_015985.3으로도 지칭되는 인간 앤지오포이에틴 4의 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 60b는 인간 Ang-4의 mRNA의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 두 모두를 나타낸다.
도 60c는 인간 Ang-4의 mRNA의 성숙 펩티드의 코딩 서열(CDS)을 나타낸다.
도 60d는 인간 Ang-4의 mRNA의 3' UTR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 61은 합성 구조물인 COMP-Ang1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 62는 합성 구조물인 hCOMP-Ang1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 63은 합성 구조물인 CMP-Ang1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 64는 합성 구조물인 COMP-Ang2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 65는 Tie-2, GenBank entry로도 지칭되는 인간 TEK 수용체 티로신 키나제(TEK), 전사 변이체 1의 mRNA의 코딩 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 66은 R849W 돌연변이를 가진 TIE*로도 지칭되는 인간 돌연변이 TEK 수용체 티로신 키나제(TEK)의 mRNA의 코딩 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 67은 재조합 핵산 구조물 PAN50의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 68은 재조합 핵산 구조물 PAN51의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 69는 재조합 핵산 구조물 PAN52의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 70은 재조합 핵산 구조물 PAN53의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 71a는 다양한 구조물의 꼬리-PCR 산물을 나타내는 EtBr 염색 후 비-변성 아가로스 겔의 이미지이다.
도 71b는 다양한 구조물의 시험관 내 mRNA 전사체를 나타내는 EtBr 염색 후 비-변성 아가로스 겔의 이미지이다.
도 72는 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간 후(좌측 컬럼), 6시간 후(중간 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다.
도 73은 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, HPMEC의 전체 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 6시간 후(좌측 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다.
도 74a(좌측)는 HPMEC(GFP mRNA, PAN12 mRNA 및 PAN12* mRNA로 형질감염됨)에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간 후(좌측 컬럼), 6시간 후(중간 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다. PAN12*에서 100% 우리딘 뉴클레오티드 및 100% 시티딘 뉴클레오티드는 각각 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 치환된다.
도 74b(우측)는 HPMEC(GFP mRNA, PAN12 mRNA 및 PAN12* mRNA로 형질감염됨)에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 6시간 후(좌측 컬럼) 및 24시간 후(우측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다. PAN12*에서 100% 우리딘 뉴클레오티드 및 100% 시티딘 뉴클레오티드는 각각 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 치환된다.
도 75는 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음).
도 76은 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, HPMEC의 전체 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음).
도 77a(좌측)는 HPMEC(GFP mRNA, PAN12 mRNA 및 PAN12* mRNA로 형질감염됨)에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음). PAN12*에서 100% 우리딘 및 100% 시티딘 뉴클레오티드는 각각 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 치환된다.
도 77b(우측)는 HPMEC(GFP mRNA, PAN12 mRNA 및 PAN12* mRNA로 형질감염됨)에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음). PAN12*에서 100% 우리딘 뉴클레오티드 및 100% 시티딘 뉴클레오티드는 각각 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 치환된다.
도 78은 HPAEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음).
도 79는 HPAEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, HPAEC의 전체 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음).
도 80은 HeLa 세포에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음).
도 81은 HeLA 세포에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, HeLa 세포의 전체 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 1시간, 2시간, 4시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음).
도 82는 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간, 4시간, 6시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음). 구조물 PAN12*, PAN28*, PAN29*, PAN34*, PAN50* 및 PAN51*에서 100% 우리딘 뉴클레오티드 및 100% 시티딘 뉴클레오티드는 각각 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 치환된다.
도 83은 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, HPMEC의 전체 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간, 4시간, 6시간 및 24시간 후 효과기 분자로서 사용된다(좌측에서 우측으로, 1시간 결과는 가장 좌측에 나타나 있고 24시간 결과는 가장 우측에 나타나 있음). 구조물 PAN12*, PAN28*, PAN29*, PAN34*, PAN50* 및 PAN51*에서, 100% 우리딘 뉴클레오티드 및 100% 시티딘 뉴클레오티드는 각각 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 치환된다.
도 84는 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간(좌측 컬럼), 4시간(중간 컬럼) 및 6시간(우측 컬럼) 후 효과기 분자로서 사용된다. 구조물 PAN02*에서, 100% 우리딘 뉴클레오티드 및 100% 시티딘 뉴클레오티드는 각각 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 치환되고; 구조물 PAN51 w/o 캡에서 mRNA 서열은 구조물 PAN51 중 하나이지만, 임의의 5'-캡핑 구조가 없다.
도 85는 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, HPMEC의 전체 세포 용해물에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 형질감염 후 2시간(좌측 컬럼), 4시간(중간 컬럼) 및 6시간(우측 컬럼) 후 효과기 분자로서 사용된다. 구조물 PAN02*에서, 100% 우리딘 뉴클레오티드 및 100% 시티딘 뉴클레오티드는 각각 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘으로 치환되고; 구조물 PAN51 w/o 캡에서 mRNA 서열은 구조물 PAN51 중 하나이지만, 임의의 5'-캡핑 구조가 없다.
도 86은 재조합 핵산 구조물 PAN54의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 87은 재조합 핵산 구조물 PAN55의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 88은 재조합 핵산 구조물 PAN56의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 89는 재조합 핵산 구조물 PAN57의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 90은 재조합 핵산 구조물 PAN58의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 91은 재조합 핵산 구조물 PAN59의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 92는 HPMEC에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 4시간 후(좌측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다. 추가 4-시간 루시퍼라제 활성 값을 세포 세척 및 신선한 배지로 세포를 보충한 후, 형질감염 후 24시간(중간 컬럼) 및 48시간(좌측 컬럼) 후에 평가하였다.
도 93은 HEK293 세포에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 3시간 후(좌측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다. 추가 3-시간 루시퍼라제 활성 값을 세포 세척 및 신선한 배지로 세포를 보충한 후, 형질감염 후 24시간(우측 컬럼) 후에 평가하였다.
인간 배아 신장 세포 293 세포주(HEK293: human embryonic kidney 293)를 EMEM(EBSS) + 2 mM 글루타민 + 1% 비필수 아미노산(NEAA) + 10% FCS 배양 배지에서 성장시켰다. 계대배양 루틴은 하위-컨플루언트 배양(70 내지 80%) 1:2를 1:6으로 분할하는 것이다, 즉, 0.25% 트립신 또는 트립신/EDTA; 5% CO2; 37℃를 사용하여 2 내지 5x10,000 세포/cm2로 씨딩하는 것이다. mRNA 형질감염을 제조사의 프로토콜에 따라 LipofectamineTM MessengerMAXTM 형질감염 시약(InvitrogenTM)을 사용하여 수행하였다.
도 94는 HeLa 세포에서 표시된 재조합 핵산 구조물에 의해, 배지에서 루시퍼라제의 RLU(상대적 광 단위)로 표시된, 루시퍼라제의 발현을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 루시퍼라제는 3시간 후(좌측 컬럼) 효과기 분자로서 사용된다. 추가 3-시간 루시퍼라제 활성 값을 세포 세척 및 신선한 배지로 세포를 보충한 후, 형질감염 후 24시간(우측 컬럼) 후에 평가하였다.
도 95는 재조합 핵산 구조물 PAN60의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 96은 재조합 핵산 구조물 PAN61의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 97은 재조합 핵산 구조물 PAN66의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 98은 표시된 PAN mRNA 구조물로 형질감염된 HPMEC 세포로부터 단백질 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 세포를 1㎍ 상기 mRNA로 형질감염하고 6시간 후에 수확하였다. 총 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하고 항-Ang1 항체를 사용하여 면역블롯으로 분석하였다. M, 마커; UT, 비처리 세포, rec. Ang1, 재조합 hAng1.
도 99는 시험관 내 전사 후 mRNA의 아가로스 겔을 나타낸다. 2 ㎍의 표시된 mRNA를 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고 에티듐 브로마이드 염색 및 UV 빛으로 시각화하였다.
도 100은 a) PAN57의 5'UTR; b) PAN57의 3'UTR; c) PAN57의 5'PCR-프라이머; d) PAN57의 3'PCR-프라이머 및 e) PAN55, PAN56의 5'PCR-프라이머의 서열을 나타낸다.
도 1은 종래 mRNA 분자 구조의 개략도이다. 포유류 mRNA를 포함하는 진핵세포는 캡 영역, 5' 비번역 영역(UTR), 최적 번역 개시를 위한 컨센서스 Kozak 서열로 시작하는 개방 판독 프래임(ORF)이 있는 코딩 서열(CDS), 분비된 단백질 다음에 신호 펩티드 선도 서열의 경우 3' UTR, 및 3' 말단에 폴리 A-꼬리(120 nt 초과)로 구성된다.
도 2는 개방 판독 프레임이 나노-루시퍼라제 중 하나인 코딩 서열을 가진 mRNA 구조물에 대한 선택된 예의 개략도이다. 표시된 mRNA 구조물 각각 및 임의의 것에 대해 나노-루시퍼라제에 대한 개방 판독 프레임이 있는 서열을 포함하는 코딩 영역은 효과기 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 코딩 영역으로, 특히 본원에 개시된 효과기 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 코딩 영역으로 치환될 수 있으며; 이의 바람직한 실시형태에서, 효과기 분자는 Ang1 또는 COMP-Ang1이다. 본 발명에 따라, 재조합 핵산 구조물은 다음과 같이 설계된다:
재조합 핵산 구조물 PAN02는 5' 비-번역 영역으로서 Ang1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 및 3' 비-번역 영역으로서 Ang1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN05는 5' 비-번역 영역으로서 Ang2의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 및 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN07은 5' 비-번역 영역으로서 갈렉틴-9의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 및 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(wWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN08은 5' 비-번역 영역으로서 Hsp70의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 및 3' 비-번역 영역으로서 HSP70의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN09는 5' 비-번역 영역으로서 H3.3의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 및 3' 비-번역 영역으로서 H3.3의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN10은 5' 비-번역 영역으로서 RPL12s.c.의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 및 3' 비-번역 영역으로서 RPL12s.c의 3' UTR을 포함한다. 이러한 구조물은 추가로 나노-루시퍼라제 인-프레임에 대한 코딩 영역의 개시 코돈에 선행하는 또 다른 개시 코돈을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN11은 5' 비-번역 영역으로서 GADD34의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 및 3' 비-번역 영역으로서 GADD34의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN12는 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN13은 5' 비-번역 영역으로서 EDN1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 EDN1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 EDN1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN28은 5' 비-번역 영역으로서 Ang2의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 vWF의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN29는 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN30은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 HSP70의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN31은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN32는 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN33은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 부재, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN34는 5' 비-번역 영역으로서 Hsp70의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN35는 5' 비-번역 영역으로서 RPL12 s.c.(스피나치 클로로플라스트)의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN36은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN37은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 hCOMP-Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN38은 5' 비-번역 영역으로서 Ang2의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN39는 5' 비-번역 영역으로서 Ang2의 5' UTR*(결실된 상류 ATG를 가진 Ang2 5'-UTR), 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN40은 5' 비-번역 영역으로서 Ang2의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 가우시아 루시퍼라제의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN41은 5' 비-번역 영역으로서 RPL12 s.c.의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 번역 개시를 위한 부가 상류 ATG가 있는 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 RPL12 s.c.의 3' UTR을 포함한다. 상기 구조물은 추가적으로 나노-루시퍼라제 인-프레임에 대한 코딩 영역의 개시 코돈 앞에 또 다른 개시 코돈을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN42는 5' 비-번역 영역으로서 RPL12 s.c.의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 RPL12 s.c.의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN43은 5' 비-번역 영역으로서 RPL12 s.c.의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 RPL12 s.c.의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN44는 5' 비-번역 영역으로서 Hsp70의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 Hsp70의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN45는 5' 비-번역 영역으로서 Hsp70m5의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN46은 5' 비-번역 영역으로서 E-셀렉틴의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN47은 5' 비-번역 영역으로서 ICAM1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN48은 5' 비-번역 영역으로서 IL-6의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 IL-6의 3' UTR을 포함한다.
재조합 핵산 구조물 PAN49는 5' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함한다.
도 3은 본 발명의 예시적인 재조합 핵산 구조물의 발현을 위한 플라스미드에 대한 설명적인 예로서 사용된 플라스미드 pcDNA3.1(-)의 제한 지도를 나타내며, 여기서 이러한 예시적인 재조합 핵산 구조물은 구조물 PAN 11이고; 제한 부위 XhoI/HindIII가 나타나 있다.
도 4는 도 3의 pcDNA3.1-플라스미드를 발현하는 PAN11의 제한 효소 지도를 나타내며; 삽입(insert)은 조작된 5' 및 3' UTR을 가진 PAN11 서열, 신호 서열 및 나노-루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역을 나타낸다.
도 5는 구조물 PAN28("28"), PAN13("13"), PAN12("12"), PAN11("11"), PAN10("10"), PAN09("09"), PAN08("08"), PAN07("07") 및 PAN05("05")의 BamHI 제한 시 pcDNA3.1(-) 플라스미드의 비-선형화된(잘리지 않음, 수퍼코일, 좌측 레인) 및 선형화 산물(우측 레인)을 나타내는 EtBr로 염색된 1% 아가로스 겔이다.
도 6은 상이한 재조합 핵산 구조물 옆에 있는 120 nt 길이의 폴리-T 3' 프라이머에 의해 120 nt의 폴리-A 꼬리를 첨가하기 위한 폴리-A 꼬리 PCR의 PCR 산물을 나타내는 EtBr로 염색된 1% 아가로스 겔을 나타낸다. 맨 위는 표시된 재조합 핵산 구조물에 대한 최적화된 PCR 조건이 있다. 예컨대, Pan02의 경우 조건은 다음과 같다: 94℃에서 2분 동안 변성. 96℃에서 30초 동안 33회 주기, 55℃에서 15초 및 72℃에서 4분. 72℃에서 8분 동안 최종 연장.
도 8은 구조물 PAN28("28"), PAN13("13"), PAN12("12"), PAN11("11"), PAN10("10"), PAN09("09"), PAN08("08"), PAN07("07") 및 PAN05("05")의 시험관 내 전사된 mRNA를 나타내는 EtBr 염색 후의 1% 비-변성 아가로스 겔의 이미지이다. M은 높은 범위의 RiboRuler RNA 래더가 있는 레인이다. 이로부터 도 8은 전사된 mRNA가 손상되지 않았고, 보다 구체적으로, 분해되지 않았음을 알 수 있다.
도 24는 재조합 핵산 구조물 PAN01의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. PAN1은 5' 비-번역 영역으로서 Ang1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 Ang1의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 실시형태이다.
도 25는 재조합 핵산 구조물 PAN03의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. PAN03은 5' 비-번역 영역으로서 Ang1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 COMP-Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 Ang1의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 실시형태이다.
도 26은 재조합 핵산 구조물 PAN04의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. PAN04는 5' 비-번역 영역으로서 Ang2의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 실시형태이다.
도 27은 재조합 핵산 구조물 PAN06의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. PAN06은 5' 비-번역 영역으로서 Ang2의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 Ang2의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 COMP-Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 실시형태이다.
도 28은 재조합 핵산 구조물 PAN36의 기본 구조 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. PAN36은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 실시형태이다.
도 67은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN50을 나타낸다.
도 68은 5' 비-번역 영역으로서 HSP70의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제(NLuc)를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN51을 나타낸다.
도 69는 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN52를 나타낸다.
도 70은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 hCOMP-Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN53을 나타낸다.
도 71a는 구조물 PAN35("35"), PA34("34"), PAN33("33"), PAN32("32"), PAN31("31"), PAN30("30"), PAN29("29") 및 PAN12("12")의 꼬리-PCR 산물을 나타내는 EtBr 염색 후의 1% 비-변성 아가로스 겔의 이미지이다. M은 높은 범위의 RiboRuler RNA 래더가 있는 레인이다. 이로부터 도 71a는 전사된 mRNA가 손상되지 않았고, 보다 구체적으로, 분해되지 않았음을 알 수 있다.
도 71b는 구조물 PAN35("35"), PA34("34"), PAN33("33"), PAN32("32"), PAN31("31"), PAN30("30"), PAN29("29") 및 PAN12("12")의 시험관 내 mRNA 전사체를 나타내는 EtBr 염색 후의 1% 비-변성 아가로스 겔의 이미지이다. M은 높은 범위의 RiboRuler RNA 래더가 있는 레인이다. 이로부터 도 71b는 전사된 mRNA가 손상되지 않았고, 보다 구체적으로, 분해되지 않았음을 알 수 있다.
도 86은 5' 비-번역 영역으로서 RPL12s.c.의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노-루시퍼라제(NLuc)를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN54를 나타낸다.
도 87은 5' 비-번역 영역으로서 vWF의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노-루시퍼라제(NLuc)를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN55를 나타낸다.
도 88은 5' 비-번역 영역으로서 vWF의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 vWF의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노-루시퍼라제(NLuc)를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN56을 나타낸다.
도 89는 5' 비-번역 영역으로서 문헌[Jiang, Lei et al. (2018). Systemic messenger RNA as an etiological treatment for acute intermittent porphyria. Nature Medicine. 24, 1899-2909 (2018)]에 기술된 합성 핵산 서열, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노-루시퍼라제(NLuc)를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 문헌[Jiang, Lei et al. (2018). Systemic messenger RNA as an etiological treatment for acute intermittent porphyria. Nature Medicine. 24; 1899-1909 (2018)]에 기술된 핵산 서열의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN57을 나타낸다. 5' 서열 및 3' 서열은 밑줄 및 굵은 글씨로 나타나 있다.
도 90은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 나노 루시퍼라제(NLuc)를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN58을 나타낸다. 또한, PAN58은 개시 AUG의 6개 염기 상류에 컨센서스 Kozak 서열(GCCACC)을 포함한다.
도 91은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 CMP-Ang1을 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN59를 나타낸다.
도 95는 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 야생형(wt) Tie2를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN60을 나타낸다.
도 96은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 Tie2 돌연변이체 R849W를 코딩하는 코딩 영역, 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN61을 나타낸다.
도 97은 5' 비-번역 영역으로서 MCP-1의 5' UTR, 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역으로서 각각의 참조 번호가 006218.4.인 GenBank 호모 사피엔스 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제 촉매 서브유닛 알파(PIK3CA)에 따른 것인 야생형 PIK3CA, 및 3' 비-번역 영역으로서 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 3' UTR을 포함하는 본 발명의 mRNA의 또 다른 실시형태인 재조합 핵산 구조물 PAN66을 나타낸다.
열거된 서열의 서열번호는 표 1에 요약된 바와 같이 본 개시내용과 관련된다.
서열번호 도면 대상 추가 정보
1 7A 5'프라이머
2 7A 5'프라이머
3 7A 5'프라이머
4 7A 5'프라이머
5 7A 5'프라이머
6 7A 5'프라이머
7 7A 5'프라이머
8 7A 5'프라이머
9 7A 5'프라이머
10 7A 5'프라이머
11 7B 3'프라이머
12 7B 3'프라이머
13 7B 3'프라이머
14 7B 3'프라이머
15 7B 3'프라이머
16 7B 3'프라이머
17 7B 3'프라이머
18 7B 3'프라이머
19 7B 3'프라이머
20 15A 5'UTR MCP1
21 15B MCP1 의 SP(신호 펩티드) 뉴클레오티드 서열
22 15B MCP1의 SP 아미노산 서열
23 15C MCP1의 3'UTR
24 16A RPL12의 5'UTR
25 16B RPL12의 3'UTR
26 17A Ang2의 5'UTR
27 17B Ang2의 SP(신호 펩티드) 뉴클레오티드 서열
28 17B Ang2의 SP 신호 펩티드) 아미노산 서열
29 17C Ang2의 3'UTR
30 18A IL6의 5'UTR
31 18B IL6의 SP(신호 펩티드) 뉴클레오티드 서열
32 18B IL6의 SP(신호 펩티드) 아미노산 서열
33 18C IL6의 3'UTR
34 19A vWF의 5'UTR
35 19B vWF의 SP(신호 펩티드) 뉴클레오티드 서열
36 19B vWF의 SP(신호 펩티드) 아미노산 서열
37 19C vWF의 3'UTR
38 20A HSP70 A1의 5'UTR
39 20B HSP70 A1의 3'UTR
40 21A HSP70 A5의 5'UTR
41 21B HSP70 A5의 SP(신호 펩티드) 뉴클레오티드 서열
42 21B HSP70 A5의 SP(신호 펩티드) 아미노산 서열
43 21C HSP70 A5의 3'UTR
44 22A H3.3의 5'UTR
45 22B H3.3의 3'UTR
46 23A LGALS9의 5'UTR
47 23B LGALS9의 3'UTR
48 24 구조물 PAN01
49 25 구조물 PAN03
50 26 구조물 PAN04
51 27 구조물 PAN06
52 28 구조물 PAN36
53 29 구조물 PAN37
54 30 구조물 PAN02
55 31 구조물 PAN05
56 32 구조물 PAN07
57 33 구조물 PAN08
58 34 구조물 PAN09
59 35 구조물 PAN10
60 36 구조물 PAN11
61 37 구조물 PAN12
62 38 구조물 PAN13
63 39 구조물 PAN28
64 40 구조물 PAN29
65 41 구조물 PAN30
66 42 구조물 PAN31
67 43 구조물 PAN32
68 44 구조물 PAN33
69 45 구조물 PAN34
70 46 구조물 PAN35
71 47 구조물 PAN38
72 48 구조물 PAN39
73 49 구조물 PAN40
74 50 구조물 PAN41
75 51 구조물 PAN42
76 52 구조물 PAN43
77 53 구조물 PAN44
78 54 구조물 PAN45
79 55 구조물 PAN46
80 56 구조물
81 57 구조물 PAN48
82 58 구조물 PAN49
83 59A Ang1의 5'UTR
84 59B Ang1의 SP(신호 펩티드) 뉴클레오티드 서열
85 59B Ang1의 SP(신호 펩티드) 아미노산 서열
86 59C Ang1의 CDS(성숙 펩티드 + 종결 코돈)
87 - 서열번호 86 유래 아미노산 서열
88 59D Ang1의 3'UTR
89 60A Ang4의 5'UTR
90 60B Ang4의 SP(신호 펩티드) 뉴클레오티드 서열
91 60B Ang4의 SP(신호 펩티드) 아미노산 서열
92 60C Ang4의 CDS(성숙 펩티드 + 종결 코돈)
93 - 서열번호 92 유래 아미노산 서열
94 60D Ang4의 3'UTR
95 61 COMP-Ang1 CDS(성숙 pep + 종결 코돈) (랫트)
96 - 서열번호 95 유래 아미노산 서열
97 62 hCOMP-Ang1 CDS(성숙 pep + 종결 코돈) (인간)
98 - 서열번호 97 유래 아미노산 서열
99 63 CMP-Ang1 CDS(성숙 펩티드 + 종결 코돈)
100 64 COMP-Ang2 CDS(성숙 펩티드 + 종결 코돈)
101 65 Tie2 CDS(개시+성숙 펩티드+종결 코돈)
102 - 서열번호 101 유래 아미노산 서열
103 66 Tie2* CDS(R849W)(개시+성숙 펩티드+종결 코돈)
104 - 서열번호 103 유래 아미노산 서열
105 67 구조물 PAN50
106 68 구조물 PAN51
107 69 구조물 PAN52
108 70 구조물 PAN53
109 86 구조물 PAN54
110 87 구조물 PAN55
111 88 구조물 PAN56
112 89 구조물 PAN57 (Mod)
113 90 구조물 PAN58
114 91 구조물 PAN59
115 95 구조물 PAN60(Tie2 wt)
116 96 구조물 PAN61(Tie2 R849W)
117 97 구조물 PAN66(PIK3CA wt)
118 구조물 CDS(개시+성숙 펩티드+종결 코돈) PIK3CA
119 CDS (성숙 펩티드 + 종결 코돈) Nluc
120 100a (PAN57)의 5'UTR
121 100b (PAN57)의 3'UTR
122 7B 구조물 PAN01-PAN03에 대한 3'프라이머
123 100c 구조물 PAN57에 대한 5'프라이머
124 100d 구조물 PAN57에 대한 3'프라이머
125 100e 구조물 PAN55(도 87) 및 PAN56(도 88)에 대한 5'프라이머
실시예 1: 재료 및 방법
유전자 합성 및 클로닝에 의한 플라스미드 주형 생산
상이한 신호펩티드를 가진 Nluc 리포터 단백질, Ang-1 단백질 및 이들의 유도체(예컨대 COMP-Ang-1, CMP-Ang-1)를 코딩하는 서열을 상이한 이종 5' 및 3' UTR 측면에 배치 및 설계하고 BioCat(Heidelberg)에 의한 유전자 합성에 의해 생산하고 pcDNA3.1-(Thermo Fisher)로 클로닝하였다(Xho1―BamHI).
상이한 이종 5' 및 3' UTR 측면에 배치된 코딩 영역에서 wt Tie-2를 코딩하는 서열 및 특이적 Tie-2 돌연변이가 있는 서열을 설계하고(도 95 및 96 참조) ioCat(Heidelberg)에 의한 유전자 합성에 의해 생산하고 pcDNA3.1-(Thermo Fisher)로 클로닝하였다(Xho1―BamHI).
폴리아데닐화 mRNA를 생산하기 위한 PCR 생산물로부터의 시험관 내 전사
시험관 내 전사는 해당 프로모터 서열(T7, T3, SP6) 및 전사될 유전자를 포함하는 선형 DNA 주형으로부터 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 합성이다. 전형적인 전사 반응은 주형 DNA, RNA 폴리머라제, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, RNase 억제제 및 Mg2+ 이온을 포함하는 완충액으로 구성된다. 선형화된 플라스미드 DNA, PCR 산물 및 합성 DNA 올리고뉴클레오티드는 이들이 전사될 유전자의 상류에 T7 프로모터 서열을 갖는 한 전사를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 폴리-(A) 꼬리를 가진 DNA 주형을 생산하기 위해 T7 RNA 폴리머라제 서열을 포함하는 5' 프라이머 및 120 nt 폴리-T 서열을 포함하는 3' 프라이머를 사용하는 꼬리-PCR을 합성하고 정제하였다(BioSpring, Frankfurt).
시험관 내 전사를 위한 선형 DNA 주형을 선형화된 플라스미드로부터 PCR로 생산하였다. 플라스미드를 백터 백본에서 3-말단을 1회 절단하는 BamHI으로 분해하여 폴리-(A) 꼬리 PCR을 위한 주형으로서 사용될 수 있는 선형화된 벡터를 생산하였다. 5 μg 플라스미드를 50μl 및 1x HF 완충액 중의 5U BamHI 제한 효소를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 분해하였다. 소량의 분취량의 분해된 혼합물을 겔 전기영동으로 분석하여 플라스미드의 완전한 분해를 확인하였다(예컨대, 구조물 PAN28("28"), PAN13("13"), PAN12("12"), PAN11("11"), PAN10("10"), PAN09("09"), PAN08("08"), PAN07("07") 및 PAN05("05")에 대한 도 5 참조). 제한 효소를 80℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 열-불활성화하고 분해된 플라스미드를 제조사의 프로토콜(NucleoSpin Gel 및 PCR clean-up, Macherey-Nagel)에 따라 PCR 정제 컬럼으로 정제하였다. 선형화된 플라스미드는 20℃에서 수 개월 동안 저장할 수 있고 PCR 주형 생산에서 사용될 수 있다. 선형화의 목적은 IVT 반응 동안 런-온(run-on) 전사체를 생산할 가능성이 있는 환형 주형을 제거하는 것이었다.
PCR에 의한 폴리-(A) 꼬리 추가를 제조사의 프로토콜에 따라 Hot StarHiFidelity polymerase(Qiagen) 또는 Taq DNA Polymerase(Roche) 를 사용하여 수행하였다. 상기 목적을 위해, T7 프로모터 서열을 포함하는 어댑터(Adoptor) 프라이머 및 3' 폴리 A 꼬리 서열(120 nt)을 사용하여 선형 DNA-주형을 증폭하였다. 상기 어댑터 프라이머 각각은 관심 유전자로의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열과 융합된 중첩(overlap) 서열을 갖는다(예컨대, 도 7a 및 7b 참조). 전형적인 50 μl PCR 반응은 최종 농도 200 μM (각각) dNTP, 0,5 μM 각각의 프라이머, 50 ng 선형화된 프라이머 DNA, 1x PCR 반응 완충액(1,5 mM MgCl2) 및 반응 당 1,25 U Taq DNA Polymerase(5 U/μl의 0,25μl)를 포함하였다. 특정 PCR 사이클 프로그램 또는 열 프로파일을 프라이머 쌍의 Tm에 따라, 예상되는 PCR 산물의 길이에 따라 그리고 사용된 열 사이클에 따라 조정하였다. PCR 산물의 질을 겔 전기영동에 의해 분취량을 분석하여 확인하였고 상업적인 PCR 정제 키트(NucleoSpin Gel 및 PCR clean-up, Macherey-Nagel)로 정제하였다.
시험관 내 전사 반응
RNA에 5' 말단 캡 구조를 첨가하는 것은 진핵세포에서 중요한 공정이다. 이는 RNA 안정성, 효율적인 번역, 핵 전달 및 스플라이싱에 필수적이다. 상기 공정은 RNA의 5' 트리포스페이트 말단에 7-메틸구아노신 첨가를 포함한다. RNA 캡핑은 캡핑-효소를 사용하여 전사 후에 또는 ARCA(Jena Bioscience) 또는 CleanCap(Trilink Biotechnologies) 또는 EZ-Cap(ApexBio)와 같은 캡 유사체를 사용하여 전사와 동시에 수행될 수 있다. 효소적 방법에서, mRNA는 제조사의 프로토콜에 따라 우두 바이러스 mRNA 캡핑 효소(NEB)를 사용하여 캡핑될 수 있다. 상기 효소는 GTP 및 S-아데노실 메티오닌을 공여자로서 사용하여 RNA의 5' 말단에서 7-메틸구아노신 캡에 첨가한다(캡-0 구조). 두 방법 모두 형질감염 또는 다른 적용에 적합한 기능적으로 활성인 캡핑된 RNA를 제공한다. 또한, 2'-O-메틸트랜스퍼라제가 캡-1 및 캡-2 구조를 도입하기 위해 사용될 수 있다.
하기 실시예에서, T7 High Yield Transcription Kit(Thermo Scientific)를 사용하여 캡 유사체 동시 전사를 사용하는 캡핑된 RNA 전사체(PAN 01-XX)를 합성하였다.
전사 반응을 위한 DNA 주형은 선형화된 플라스미드 또는 PCR 산물이었다. 캡핑된 RNA의 경우 실온에서의 반응을 다음의 순서로 설정하였다:
1 μg DNA를 첨가하고 뉴클레아제가 없는 물로 총 부피가 20 μl가 되게 하였다. 첨가된 물의 양은 주형 DNA의 농도에 따라 달라진다. 반응을 볼텍싱으로 잘 혼합하고 건식 공기 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 다음과 같이 정제를 진행하기 전에 DNA 주형을 제거하기 위해 DNase I으로 전사 반응을 처리하였다:
1. 70 μl 뉴클레아제가 없는 물을 전사 반응에 첨가한 후 10 μl DNase I 반응 완충액을 첨가하였다.
2. 2 μl DNase I을 반응에 첨가하였다.
3. 상기 반응을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션 하였다.
캡핑된 mRNA의 컬럼 정제
1. 캡핑된 RNA를 제조사의 지시에 따라 MEGAclearKit를 사용하여 정제하였다(RNA 정제 키트에 기초한 임의의 스핀 컬럼을 사용할 수 있음).
2. RNA를 NanoDrop Spectrophotometer를 사용하여 정량화하였다.
3. 제조사의 지시에 따라, mRNA 샘플 품질을 Agilent RNA 6000 Nano Kit 및 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 또는 음성 1% 아가로스 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색(도 8 참조)에 의해 평가하였다.
HeLa 세포, HEK293 세포, HPMEC 세포, HPAEC 세포 및 HUVEC 세포의 mRNA 형질감염
HeLa 세포를 DMEM 완전 배지에서 성장시켰다. 인간 배아 신장 293 세포주(HEK293)를 EMEM(EBSS) + 2 mM 글루타민 + 1% 비필수 아미노산(NEAA) + 10% FCS 배양 배지에서 성장시켰다.
인간 배아 신장 293 세포주(HEK293)를 EMEM(EBSS) + 2 mM 글루타민 + 1% 비필수 아미노산(NEAA) + 10% FCS 배양 배지에서 성장시켰다. 계대배양 루틴은 하위-컨플루언트 배양(70 내지 80%) 1:2를 1:6으로 분할하는 것이다, 즉, 0.25% 트립신 또는 트립신/EDTA; 5% CO2; 37℃를 사용하여 2 내지 5x10,000 세포/cm2로 씨딩하는 것이다. mRNA 형질감염을 제조사의 프로토콜에 따라 LipofectamineTM MessengerMAXTM Transfection Reagent(InvitrogenTM)을 사용하여 수행하였다.
1차 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HPMEC) 및 1차 인간 폐 동맥 내피 세포(HPAEC)를 인간 폐 질환을 연구하는데 가장 적합한 인간 폐 동맥으로부터 단리하였고 단일 공여자 유래의 폐에서 단리하였다. 폐 조직은 혈액 및 림프 모세혈관이 포함되어 있기 때문에 HPMEC는 혈액 및 림프 미세혈관 내피 세포로 구성되어 있다.
HPMEC의 세포 유형은 면역형광 염색을 특징으로 한다. 이들은 CD31 및 폰 빌레브란트 인자에 대해 양성으로 염색하고 평활근 알파-액틴에 대해 음성으로 염색한다.
HUVEC, HPAEC 및 HPMEC 세포를 각각 PromoCell(독일 하이델베르그)에서 제안하는 대로 내피 세포 성장 배지에서 성장시켰다. 상기 내피 세포 성장 배지는 우 태아 혈청(0.05 ml/ml), 내피 세포 성장 보조제(소 시상하부 추출물; 0.004 ml ml), 헤파린 90 μg/ml 및 히드로코티손 1 μg/ml이 보충된 기초 배지이다. HUVEC, HPAEC 및 HPMEC 세포를 사용한 실험은 계대 번호가 8 미만인 세포에서 수행하였다.
RNA 형질감염 및 추가 mRNA 형질감염을 Lipofectamin MessengerMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA; Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행하였다. 24-웰 플레이트 형식에서의 mRNA 형질감염의 경우 1x105 세포/웰을 형질감염 24시간 전에 씨딩하여 형질감염 직전 70 내지 90 컨플루언스에 도달하도록 하였다. 단일 웰에 대해 1.5 μl Lipofectamine MessengerMAX Reagent를 25 μl OptMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA; Thermo Fisher Scientific)에 첨가하고, 볼텍싱한 후 실온에서 10분 동안 인큐베이션 하였다. 제2 웰에 500 ng 또는 1 μg mRNA를 25 μl OptiMEM에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 인큐베이션 후, 희석된 mRNA를 희석된 Lipofectamin에 첨가하고, 잘 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션 한 후 Hela 및 HEK293의 경우 0.5 ml의 완전 배지의 존재 하에 세포에 적하 형식으로 첨가하였다. HUVEC, HPAEC 및 HPMEC의 경우 내피 세포 성장 배지를 교체하고 세포를 OptiMEM으로 세척한 다음 Lipofectamin MessengerMAxX mRNA 복합 용액을 37℃에서 사전 가온된 0.5 ml OptiMEM이 포함된 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하고 OptiMEM 배지를 완전 내피 세포 성장 배지(PromoCell, 독일 하이델베르그)로 교체하였다.
형질감염된 세포 유래의 세포 용해물 또는 혈청을 지시된 시점에서 분석하였다. 다르게는, 양이온 지질 L-아르기닐-β-알라닌-N-팔미틸-N-올레일-아미드 또는 중성 및 PEG화된 공-지질과 조합된 β-(L-아르기닐)-L-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 기반 mRNA-LNP를 시험관 내 형질감염에서 사용하였다. 공-지질은 디피타노일-PE이었고 PEG화된 지질은 메톡시PEG2000-DSPE이었다.
숙주 세포로의 mRNA의 성공적인 도입을 형광 마커, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP: Green Fluorescent Protein), 예컨대 리포터 효소(예컨대 루시퍼라제 유도체)와 같이 다양한 공지된 방법을 사용하여 모니터링 하였다. 대안적으로, 변형된 mRNA의 형질감염을 또한 예컨대 웨스턴 블롯팅 또는 면역세포화학법 또는 ELISA에 의해 표적 폴리펩티드의 단백질 발현 수준을 측정하여 결정할 수 있다.
5-메틸시티딘 및/또는 슈도우리딘(또는 5-메톡시우리딘 또는 N1-메틸슈도우리딘)으로 완전히 변형된 mRNA를 Lipofectamin MessengerMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA; Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 HUVEC 또는 HPMEC(인간 폐 미세혈관 내피 세포, PromoCell, 하이델베르그) 내로 형질감염하였다. 세포 용해물을 수확하고 형질감염 후 상이한 시점(30'', 1 h, 2h, 4h, 6h 시간)에서 ELISA(또는 변역블롯 분석(웨스턴))를 실행하여 단백질 발현을 결정하였다.
Nano-Luc 루시퍼라제 활성 리포터 측정
리포터 분석 기술 매뉴얼 Nano-Glo Luciferase Assay System(Promega)에 따라 조직 배양 상청액의 샘플을 분석하여 분비된 버전에 대해 Nano-Glo-루시퍼라제 발현(Promega)의 시간 의존적 정량적 검출을 수행하였다. 요약하면, 5 내지 20 μl의 혈청 또는 용해물을 100 μl H2O 최종 부피에 희석하고 동일 부피의 재구성된 Nano-Glo 루시퍼라제 분석 시약을 96 웰 GloMax 96 마이크로플레이트에서 합하였다. 실온에서 적어도 3분 인큐베이션 한 후 적절한 발광계에서 발광을 측정하였다.
Tie-2 및 유도체의 면역블롯 검출
Tie-2 및 유도체의 면역블롯 검출을 위해 단백질 용해물을 1.5mm 즉시 사용 가능한(ready-to-use) Bis-Tris 겔 및 러닝 보조로서 MOPS-완충액을 포함하는 4 내지 12% 아크릴아미드 구배가 갖춰진 NuPage SDS-PAGE 시스템(챔버 및 전원공급 장치)에 로딩하였다(모두 Life Technologies, Grand Island, NY). 각각의 용해물 샘플을 40 μl 최종 부피로 제조하였다. 상기 샘플은 다양한 부피의 25 μg 단백질 용해물, 26 μl의 부피로 제조하기 위한 RIPA 완충액, 4 μl l0x 환원제 및 l0 μl 4x SDS 로딩 완충액(둘 모두 Life Technologies, Grand Island, NY)을 포함한다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하고 겔에 로딩하였다. 표준 설정을 제조사에 의해 200 V, 120 mA 및 최대 25 W로 선택하였다. 실행 시간은 60분이었으나 겔의 하단에 도달하는 염료의 러닝보다는 길지 않았다.
실행 종료 후, 플라스틱 케이스를 깨고 봉입된 겔을 즉시 사용 가능한 니트로셀룰로스 막 키트 및 전원 공급 장치(iBLOT; LifeTechnologies, Grand Island, NY)로 옮겼다. 기본 설정을 사용하여, 단백질 용해물을 높은 암페어 전기에 의해 겔에서 막으로 옮겼다.
전달 후, 막을 1X TBS 중의 5% BSA에서 15분 동안 및 이어서 1X TBS + 0.1 % Tween 중의 5% BSA에서 추가 15분 동안 인큐베이션 하였다. 인간 Tie-2 단백질 또는 포스포-특이적 항체(P-Tie-2, P-Akt, 하기 참조)에 대한 1차 항체를 1:500 내지 1:2000 희석의 1X TBS 용액 중의 5% BSA 3 ml에서 실온에서 3시간 동안 적용하고 오비탈 교반기에서 부드럽게 교반하였다. 막을 1X TBS/0.1 % Tween으로 매번 부드럽게 교반하면서 5분 동안 3회 세척하였다. 2차 항체(염소 항-토끼 HRP 접합체; Abeam, Cambridge, MA)를 홀스 래디시 퍼옥시다제와 접합시켜 1차 항체 항체에 결합시켰다. 2차 항체를 1X TBS 중의 5% BSA에 1:1000 내지 1:5000로 희석하고 실온에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 시간이 끝나면, 막을 1x TBS/0.1% Tween으로 매번 부드럽게 교반하면서 5분 동안 3회 세척하였다. 막을 지시에 따라 5ml Pierce WestPico Chemiluminescent Subtrate(Thermo Fisher, Rockford, IL)에서 발달시켰다.
실시예 2: HPMEC, HUVEC, HPAEC 및 HeLa 세포에서 재조합 핵산 구조물을 발현하는 루시퍼라제, Ang-1 또는 Ang-1-유도체의 발현
HeLa, HUVEC, HPAEC 및 HPMEC 세포의 mRNA 형질감염
1차 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HPMEC)는 인간 폐 질환을 연구하는데 가장 적합하며 단일 공여자의 폐에서 단리된다. 폐 조직에는 혈액 및 림프 모세혈관이 포함되어 있기 때문에, HPMEC는 혈액 및 림프 미세혈관 내피 세포를 포함한다. 상기 세포를 면역형광 염색에 의해 일상적으로 분석하였다: 이들은 CD31 및 폰 빌레브란트 인자에 대해 양성으로 염색되고 평활근 알파-액틴에 대해 음성으로 염색된다. HeLa 세포, HUVEC, HPMEC 및 HPAEC(인간 폐 동맥 내피 세포) 세포 각각을 DMEM 완전 배지 또는 내피 세포 성장 배지(PromoCell, 독일 하이델베르그, CatNo.: C-22020)에서 각각 성장시켰다. 내피 세포 성장 배지는 우 태아 혈청(0.05 ml/ml), 내피 세포 성장 보조제(소 시상하부 추출물; 0.004 ml ml), 헤파린 90μg/ml 및 히드로코티손 1 μg/ml이 보충된 기초 배지이다. HUVEC 및 HPMEC 세포를 사용한 실험은 계대 번호가 8 미만인 세포에서 수행하였다.
mRNA 형질감염을 Lipofectamin MessengerMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행하였다. 24-웰 플레이트 형식에서의 mRNA 형질감염의 경우 1x105 세포/웰을 형질감염 24시간 전에 씨딩하여 형질감염 직전 70 내지 90 컨플루언스에 도달하도록 하였다. 단일 웰에 대해 1.5μl Lipofectamine MessengerMAX Reagent를 25 μl OptMEM에 첨가하고, 볼텍싱한 후 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 제2 웰에 500 ng 또는 1 μg mRNA를 25 μl OptiMEM에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 인큐베이션 후, 희석된 mRNA를 희석된 Lipofectamin에 첨가하고, 잘 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션 한 후 Hela의 경우 0.5 ml의 완전 배지의 존재 하에 세포에 적하 형식으로 첨가하였다. HUVEC, HPMEC 및 HPAEC의 경우 내피 세포 성장 배지를 교체하고 세포를 OptiMEM으로 세척한 다음 Lipofectamin MessengerMAxX mRNA 복합 용액을 37℃에서 사전 가온된 0.5 ml OptiMEM이 있는 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하고 OptiMEM 배지를 완전 내피 세포 성장 배지(PromoCell, 독일 하이델베르그)로 교체하고 지시된 시점에서 형질감염된 세포 또는 혈청을 분석하였다. 다르게는, 양이온 지질 L-아르기닐-β-알라닌-N-팔미틸-N-올레일-아미드 또는 중성 및 PEG화된 공-지질과 조합된 β-(L-아르기닐)-L-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드에 기초한 mRNA-LNP를 시험관 내 형질감염에서 사용할 수 있다.
숙주 세포로의 mRNA의 성공적인 도입을 형광 마커, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP: Green Fluorescent Protein), 예컨대 리포터 효소(예컨대 루시퍼라제 유도체)와 같이 다양한 공지된 방법을 사용하여 모니터링 할 수 있거나 변형된 mRNA의 형질감염을 또한 예컨대 웨스턴 블롯팅 또는 면역세포화학법 또는 ELISA에 의해 표적 폴리펩티드의 단백질 발현 수준을 측정하여 결정할 수 있다.
Nano-Luc 루시퍼라제 활성 리포터 측정
리포터 분석 기술 매뉴얼 Nano-Glo Luciferase Assay System(Promega)에 따라 조직 배양 상청액의 샘플을 분석하여 분비된 버전에 대해 Nano-Glo-루시퍼라제 발현(Promega)의 시간 의존적 정량적 검출을 수행하였다. 요약하면, 5 내지 20 μl의 혈청 또는 용해물을 100 μl H2O 최종 부피에 희석하고 동일 부피의 재구성된 Nano-Glo 루시퍼라제 분석 시약을 96 웰 GloMax 96 마이크로플레이트에서 합하였다. 실온에서 적어도 3분 인큐베이션 한 후 적절한 발광계에서 발광을 측정하였다.
세포 용해물 및 상청액에서 Ang-1, COM-Ang-1, CMP-Ang-1 단백질의 검출
기술 매뉴얼에 따라 ELISA(Human Angiopoietin-1 Quantikine ELISA Kit (DANG10, , R&D systems) 또는 웨스턴 블롯에 의해 상청액 조직 배양물 유래의 샘플을 분석하여 분비된 Ang-1 및 분비된 COMP-Ang-1 또는 COMP-Ang-2 발현의 시간 의존적 정량적 검출을 수행하였다.
대략 120 뉴클레오티드의 폴리A 꼬리를 가진 것(5' 캡 서열은 제시되지 않음), 5-메틸 시티딘 및 슈도우리딘으로 완전히 변형된 것(COMP-Ang-1, 5mC/pU), 5-메틸시티딘 및 N1-메틸-슈도우리딘으로 완전히 변형된 것(COMP-Ang-1,5mC/NlmpU) 또는 비변형 된 것(COMP-Ang-, unmod)의 COMP-Ang-1(서열번호 PAN05에 제시된 mRNA 서열)의 500 ng을 Lipofectamin MessengerMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA; Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 HUVEC 또는 HPMEC(인간 폐 미세혈관 내피 세포, PromoCell, 하이델베르그) 내로 형질감염하였다. 상청액을 수확하고 형질감염 4시간 후 ELISA를 수행하여 단백질 발현 및 사이토카인 유도를 결정하였다.
Ang-1 및 유도체의 면역블롯 검출의 경우 단백질 용해물을 1.5mm 즉시 사용 가능한(ready-to-use) Bis-Tris 겔 및 러닝 보조로서 MOPS-완충액을 포함하는 4 내지 12% 아크릴아미드 구배가 갖춰진 NuPage SDS-PAGE 시스템(챔버 및 전원공급 장치)에 로딩하였다(모두 Life Technologies, Grand Island, NY). 각각의 용해물 샘플을 40 μl 최종 부피로 제조하였다. 상기 샘플은 다양한 부피의 25 μg 단백질 용해물, 26 μl의 부피로 제조하기 위한 RIPA 완충액, 4 μl l0x 환원제 및 l0 μl 4x SDS 로딩 완충액(둘 모두 Life Technologies, Grand Island, NY)을 포함한다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하고 겔에 로딩하였다. 표준 설정을 제조사에 의해 200 V, 120 mA 및 최대 25 W로 선택하였다. 실행 시간은 60분이었으나 겔의 하단에 도달하는 염료의 러닝보다는 길지 않았다.
실행 종료 후, 플라스틱 케이스를 깨고 봉입된 겔을 즉시 사용 가능한 니트로셀룰로스 막 키트 및 전원 공급 장치(iBLOT; LifeTechnologies, Grand Island, NY)로 옮겼다. 기본 설정을 사용하여, 단백질 용해물을 높은 암페어 전기에 의해 겔에서 막으로 옮겼다.
전달 후, 막을 1X TBS 중의 5% BSA에서 15분 동안 및 이어서 1X TBS + 0.1 % Tween 중의 5% BSA에서 추가 15분 동안 인큐베이션 하였다. 인간 Ang-1에 대한 1차 항체(Ang-1 ab183701 Abcam, Cambridge, UK)를 1:5000 희석의 1X TBS 용액 중의 5% BSA 3 ml에서 4℃에서 밤새 적용하고 오비탈 교반기에서 부드럽게 교반하였다. 막을 1X TBS/0.1 % Tween으로 매번 부드럽게 교반하면서 5분 동안 3회 세척하였다. 2차 항체(염소 항-토끼 HRP 접합체; Abeam, Cambridge, MA)를 홀스 래디시 퍼옥시다제와 접합시켜 1차 항체 항체에 결합시켰다. 2차 항체를 1X TBS 중의 5% BSA에 1:10000으로 희석하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 시간이 끝나면, 막을 1x TBS/0.1% Tween으로 매번 부드럽게 교반하면서 5분 동안 3회 세척하였다. 막을 지시에 따라 5ml Pierce WestPico Chemiluminescent Subtrate(Thermo Fisher, Rockford, IL)에서 발달시켰다. 웨스턴 블롯은 인간 Ang-1의 경우 70 kd, 및 COMP-Ang-1 및 CMP-Ang1으 경우 37kDa의 예상 크기 정도의 단백질을 검출하였다. 참고로, 재조합 인간 Ang-1 단백질은 R&D Systems(biotechne)에서 구입하였다.
결과
도 10 내지 14, 72 내지 85 및 92 내지 94에 제시된 단백질 발현 데이터는 코딩 영역 측부에 있는 상이한 조절 뉴클레오티드 서열의 조합이 단백질 발현 수준을 상당히 변화시킬 수 있음을 강조한다. 이러한 변화는 100% 우리딘 및 100% 시티딘 뉴클레오티드를 슈도-우리딘 및 5-메틸-시티딘(도 74 및 도 77 내지 85에서 "*"로 표시된 구조물)으로 대체함으로써 예시된 바와 같은 구조물을 형성하는 뉴클레오티드의 변형에 의해 추가로 영향을 받는다. 변화는 특정 세포 유형에서 관찰될 뿐만 아니라 상이한 세포 유형에서도 관찰된다. 예컨대, PAN02(야생형 Ang-1 mRNA)는 모든 세포주에서 가장 낮은 루시퍼라제 활성을 나타낸다(도 10 내지 14). 다른 모든 구조물은 모든 세포 유형에 걸쳐 향상된 단백질 발현을 나타낸다. 따라서, 상이한 유전자 유래의 조절 서열을 사용하는 접근법은 단백질 발현 활성을 증가시킬 수 있다. 이를 위해, 내인성 Ang-1 서열을 대체하는 것은 리포터 단백질 발현에 우수한 효과를 나타냈다.
주목할 가치가 있는 것은, 동일한 조절 서열 조차도 상이한 세포 유형에서 뚜렷한 단백질 발현 활성을 나타냈다(도 75 내지 81). 이러한 데이터는 특정 조절 서열의 사용이 맥락-특이적으로, 즉, 세포-유형 특이적 세포 환경에서 단백질 발현의 활성에 영향을 미칠 수 있다는 우리의 접근법을 더욱 뒷받침한다.
또한, 우리는 우리의 데이터가 상이한 양태, 즉 분비에 관한 것임을 보여주었다. 예컨대, 구조물 PAN12에 사용된 조절 서열은 전체 세포 용해물 뿐만 아니라 배지(상청액)에서도 세포-유형 특이적(HPMEC) 발현을 나타낸다(도 10 내지 14). 이는 이들 서열이 단백질 발현(번역)뿐만 아니라 분비에도 최적이라는 것을 나타냈다. 대조적으로, 구조물 PAN28은 모든 세포 유형에서 다소 동등하게 발현을 나타낸다. 구조물 PAN29(및 PAN58)에 사용된 조절 서열, 즉 5'-UTR 및 vWF의 3'-UTR과 조합된 MCP-1의 신호 펩티드 서열은 인간(미세혈관) 폐 내피 세포에서 고효율 단백질 발현에 특히 유용한 것으로 밝혀졌다(예컨대, 도 72 및 75 참조). 구조물 PAN54에 사용된 조절 서열, 즉 시금치 엽록체 RPL12의 5'-UTR, MCP-1의 신호 펩티드 서열 및 vWF의 3'-UTR은 도 92에 나타난 바와 같이 단백질 발현 및 분비에 동등하게 효율적인 것으로 밝혀졌다.
도 98에 나타난 바와 같이 PAN29의 조절 서열은 또한 3개의 상이한 ORF, 즉 1차 인간 폐 미세 내피 세포(HPMEC)에서 발현을 지시하는 PAN52에서의 wt Ang-1; PAN53에서의 hCOMP-Ang-1 및 PAN59에서의 CMP-Ang-1을 사용하여 기능적이다. 대조적으로 인간 Ang-1(PAN01)의 내인성 5'- 및 3'-UTR을 포함하는 mRNA 구조물은 번역되지 않는다(도 98). 도 99는 4개의 mRNA 구조물 모두 유사한 품질(무결성 및 순도)을 나타냄을 보여준다.
실시예 3: 야생형 Tie-2(PAN60) 또는 활성화 Tie-2 돌연변이(예컨대 R849W(PAN61))를 코딩하는 변형된 mRNA의 형질감염 후 Tie-2 경로 활성화
상기 실시예 1에 앞서 기술된 PCR 주형의 시험관 내 전사에 의해 이종 5' 및 3' UTR을 포함하는 변형된 mRNA를 생성하였다. 활성화 Tie-2 돌연변이(예컨대 R849W)를 코딩하는 상이한 농도의 상기 mRNA를 Lipofectamin MessengerMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA; Thermo Fisher Scientific.)를 사용하여 야생형 Tie-2를 코딩하는 mRNA 다음에 상이한 세포주(HeLa, 1차 내피 세포 예컨대 HUVEC 또는 HPMEC 또는 HPAEC)에 형질감염하였다. 정성적 웨스턴 블롯의 경우 mRNA의 형질감염 후(1 내지 24시간) 상이한 시점에서 세포 용해물을 항-포스포티로신 항체(R&D systems)로 조사하여 Tie-2 인산화(PTyr, 140 kD)를 평가하였다. 블롯을 제거하고 항-Tie-2 항체(R&D systems)로 재-프로브 하여 총 Tie-2를 검출하였다. 정량적 측정을 위해 제조사(예컨대 둘 모두R&D systems의 ELISA-Kit)의 프로토콜에 따라 인간 Tie-2 DuoSet ELISA 키트 또는 인간-Phospho-Tie-2 DuoSet IC ELISA를 사용하여 인간 Tie-2 또는 Phospho-Tie-2를 측정하는 2가지 상이한 ELISA를 수행하였다.
mRNA를 코딩하는 Tie-2 돌연변이(PAN61, R849W)의 형질감염은 야생형 Tie-2 mRNA를 코딩하는 mRNA로 형질감염된 세포 유래의 세포 용해물에 비해 또는 형질감염되지 않은 세포에 비해 Phospho-Tie-2의 존재를 증가시켰다. Tie-2 인산화의 이러한 증가는 재조합 인간 Ang-1 리간드의 존재 또는 부재에서 관찰되며 상이한 세포주에서 관찰될 수 있다. Tie-2 신호전달 경로의 활성화를 확인하고 Tie-2(R849W) 유도체를 발현함으로써 생물학적 관련 기능적 하류 신호 전달을 입증하기 위해 Akt의 인산화가 실험의 시간 경과에서 입증되었다. 이러한 실험은 Tie-2 활성화 돌연변이(R849W)를 코딩하는 mRNA가 wt Tie-2 코딩 mRNA보다 Tie-2 신호전달 경로를 활성화하는데 더 기능적이고 더 강하다는 것을 나타낸다. 이러한 경로의 과활성화는 인간 내피 및/또는 비-내피 세포에서 Tie-2 리간드(예컨대 Ang-1)의 부재 또는 존재에서 입증될 수 있다.
실시예 4: 정맥 내 투여에 의한 생체 내 적용을 위한 양이온 LNP의 mRNA 제형
생체 내 실험을 위해 mRNA-LNP를 양이온 지질로서 β-(L-아르기닐)-L-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드를 사용하여 제형화 공정에서 제조하였다. 다르게는, 양이온 지질 L-아르기닐-β-알라닌-N-팔미틸-N-올레일-아미드는 mRNA-LNP를 제조하기 위한 동일한 절차에서 사용될 수 있다.
mRNA-LNP 제형은 siRNA(문헌[Chen, S., Tam, Y.Y., Lin, P.J., Sung, M.M., Tam, Y.K.], 및 문헌[Cullis, P.R. (2016), Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. J. Control. Release 235, 236-244]. 및 (ii) 특허 출원 제US20170121712호)에 대해 기술된 방법의 변형된 절차를 사용하여 제조된다.
간단하게, 지질을 적절한 몰 비(예컨대 50:49:1 β-(L-아르기닐)-L-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드: DPyPE: mPEG2000-DSPE)로 에탄올 중에 용해한다. 지질 혼합물을 미세유체 혼합기(NanoAssemblr®; Precision Nanosystems, Vancouver, BC) 및 18ml/분의 유속을 사용하여 2:1(수성:에탄올)의 부피 비로 mRNA의 등장성 수크로스 용액과 합친다. 유사하게, 시트레이트 또는 아세테이트 완충된 mRNA 용액(PH 3 내지 4) 및 3:1(v/v; 수성:에탄올)의 약간 다른 혼합 비율 및 12 ml/분의 유속을 사용하여 LNP 제형을 수득할 수 있다.
혼합 공정 후, 제형을 3.5 K MWCO Slide-A-Lyzer 투석 카세트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 4℃에서 적어도 18시간 동안 10 mM HEPES 또는 TRIS 완충된 등장성 수크로스 용액에 대해 투석한다. 수크로스 대신, 트레할로스 또는 글루코스와 같은 다른 당이 제형 과정에서 동일하게 사용될 수 있다.
이어서, 제형을 입자 크기(Zetasizer Nano ZS 기기(Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK), RNA 캡슐화(제조사(Thermo Fisher Scientific)의 프로토콜에 따른 Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit), 및 내독소에 대해 시험하였으며 크기가 30 내지 100 nm 사이이고, 제타-전위가 25 mV 초과이고, 90% 초과의 mRNA가 캡슐화되었고 내독소가 1 EU/ml 미만인 것으로 밝혀졌다.
mRNA-LNP 제형을 -80℃에서 약 0.3 μg /μl의 RNA 농도 및 약 0.03 내지 0.05(wt/wt)의 전체 지질 비율에 대한 RNA 농도에서 추가 시험관 내 또는 생체 내 사용 때까지 저장하였다.
명세서, 청구범위 및/또는 도면에서 개시된 본 발명의 특징은 개별적으로 그리고 이들의 임의의 조합으로 본 발명을 다양한 형태로 실현하기 위한 재료일 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Pantherna Therapeutics GmbH <120> Recombinant nucleic acid construct <130> P 10045 PCT <150> EP 18 188 489.1 <151> 2018-08-10 <150> EP 18 194 023.0 <151> 2018-09-12 <150> EP 18 248 243.0 <151> 2018-12-28 <160> 125 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 taatacgact cactataggg ccctaagcca tcagcaat 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 taatacgact cactatagga aagtgattga ttcggata 38 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 taatacgact cactataggt ccccattgaa taacagcc 38 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 taatacgact cactatagga taaaagccca ggggcaag 38 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 taatacgact cactataggg tcagccatct ttcaattg 38 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 taatacgact cactataggc atatcttcat tcttcact 38 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 taatacgact cactatagga taaaagccta gtggccat 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 taatacgact cactataggg aggaaccgag aggctgag 38 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 taatacgact cactataggg gagctgttta cccccact 38 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 taatacgact cactatagga aagtgattga ttcggata 38 <210> 11 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 gccttttgca agataagag 139 <210> 12 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 gccttttgca agataagag 139 <210> 13 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 gaattttaaa gtttattta 139 <210> 14 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 atagtttaat gtattttaa 139 <210> 15 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 ttaactacat ctaaaccca 139 <210> 16 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 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69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(69) <400> 21 atgaaagtct ctgccgccct tctgtgcctg ctgctcatag cagccacctt cattccccaa 60 gggctcgct 69 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 22 Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr 1 5 10 15 Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala 20 <210> 23 <211> 373 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(373) <400> 23 acactcactc cacaacccaa gaatctgcag ctaacttatt ttcccctagc tttccccaga 60 caccctgttt tattttatta taatgaattt tgtttgttga tgtgaaacat tatgccttaa 120 gtaatgttaa ttcttattta agttattgat gttttaagtt tatctttcat ggtactagtg 180 ttttttagat acagagactt ggggaaattg cttttcctct tgaaccacag ttctacccct 240 gggatgtttt gagggtcttt gcaagaatca ttaatacaaa gaattttttt taacattcca 300 atgcattgct aaaatattat tgtggaaatg aatattttgt aactattaca ccaaataaat 360 atatttttgt aca 373 <210> 24 <211> 94 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(94) <400> 24 catatcttca ttcttcactc tttccccccc cccccttatc ctcctatcta atcctctcat 60 ctctctcctc ctcttcctcc aacaacaact aaca 94 <210> 25 <211> 148 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(148) <400> 25 ttttgagtaa ttttcaattt tgtttttgtt tttgtttttg ttgttgggag ttgttgtaat 60 ttggtaaatg ttggggtcac taaaatcttt tgttgcaatt ttagcacctt tttattagat 120 atataaaatt gggtttagat gtagttaa 148 <210> 26 <211> 329 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(329) <400> 26 aaagtgattg attcggatac tgacactgta ggatctgggg agagaggaac aaaggaccgt 60 gaaagctgct ctgtaaaagc tgacacagcc ctcccaagtg agcaggactg ttcttcccac 120 tgcaatctga cagtttactg catgcctgga gagaacacag cagtaaaaac caggtttgct 180 actggaaaaa gaggaaagag aagactttca ttgacggacc cagccatggc agcgtagcag 240 ccctgcgttt tagacggcag cagctcggga ctctggacgt gtgtttgccc tcaagtttgc 300 taagctgctg gtttattact gaagaaaga 329 <210> 27 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(54) <400> 27 atgtggcaga ttgttttctt tactctgagc tgtgatcttg tcttggccgc agcc 54 <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(18) <400> 28 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala <210> 29 <211> 3450 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(3450) <400> 29 acatcccagt ccacctgagg aactgtctcg aactattttc aaagacttaa gcccagtgca 60 ctgaaagtca cggctgcgca ctgtgtcctc ttccaccaca gagggcgtgt gctcggtgct 120 gacgggaccc acatgctcca gattagagcc tgtaaacttt atcacttaaa cttgcatcac 180 ttaacggacc aaagcaagac cctaaacatc cataattgtg attagacaga acacctatgc 240 aaagatgaac ccgaggctga gaatcagact gacagtttac agacgctgct gtcacaacca 300 agaatgttat gtgcaagttt atcagtaaat aactggaaaa cagaacactt atgttataca 360 atacagatca tcttggaact gcattcttct gagcactgtt tatacactgt gtaaataccc 420 atatgtcctg aattcaccat cactatcaca attaaaagga agaaaaaaac tctctaagcc 480 ataaaaagac atattcaggg atattctgag aaggggttac tagaagttta atatttggaa 540 aaacagttag tgcattttta ctccatctct taggtgcttt aaatttttat ttcaaaaaca 600 gcgtatttac atttatgttg acagcttagt tataagttaa tgctcaaata cgtatttcaa 660 atttatatgg tagaaacttc cagaatctct gaaattatca acagaaacgt gccattttag 720 tttatatgca gaccgtacta tttttttctg cctgattgtt aaatatgaag gtatttttag 780 taattaaata taacttatta ggggatatgc ctatgtttaa cttttatgat aatatttaca 840 attttataat ttgtttccaa aagacctaat tgtgccttgt gataaggaaa cttcttactt 900 ttaatgatga ggaaaattat acatttcatt ctatgacaaa gaaactttac tatcttctca 960 ctattctaaa acagaggtct gttttctttc ctagtaagat atatttttat agaactagac 1020 tacaatttaa tttctggttg agaaaagcct tctatttaag aaatttacaa agctatatgt 1080 ctcaagattc acccttaaat ttacttaagg aaaaaaataa ttgacactag taagtttttt 1140 tatgtcaatc agcaaactga aaaaaaaaaa agggtttcaa agtgcaaaaa caaaatctga 1200 tgttcataat atatttaaat atttaccaaa aatttgagaa cacagggctg ggcgcagtgg 1260 ctcacaccta taatcccagt acattggtag gcaaggtggg cagatcacct gaggtcagga 1320 gttcaagacc agcctggaca acatggtgaa accctgtctc tactaaataa tacaaaaatt 1380 agccaggcgt gctggcgggc acctgtaatc ccagctactc gggaggctga ggcagggaga 1440 attgcttgca ccagggaggt agaggttgca gtgagccaag atcgcaccac tgcactccag 1500 ccggggcaac agagcaagac tccatctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa agaaaagaaa 1560 atttgagaac acagctttat actcgggact acaaaaccat aaactcctgg agttttaact 1620 ccttttgaaa ttttcatagt acaattaata ctaatgaaca tttgtgtaaa gctttataat 1680 ttaaaggcaa tttctcatat attcttttct gaatcatttg caaggaagtt cagagtccag 1740 tctgtaacta gcatctacta tatgtctgtc ttcaccttac agtgttctac cattattttt 1800 tctttattcc atttcaaaat ctaatttatt ttaccccaac ttctccccac cacttgacgt 1860 agttttagaa cacacaggtg ttgctacata tttggagtca atgatggact ctggcaaagt 1920 caaggctctg ttttatttcc accaaggtgc acttttccaa caactattta actagttaag 1980 aacctcccta tcttagaact gtatctactt tatatttaag aaggttttat gaattcaaca 2040 acggtatcat ggccttgtat caagttgaaa aacaactgaa aataagaaaa tttcacagcc 2100 tcgaaagaca acaacaagtt tctaggatat ctcaatgaca agagtgatgg atacttaggt 2160 agggaaacgc taatgcagga aaaactggca acaacacaat ttatatcaat tctctttgta 2220 ggcaggtgat aaaaaattca aggacaaatc tcattatgtc attgtgcatc atatataatc 2280 tcttatgagc gagaatgggg ggaatttgtg tttttacttt acacttcaat tccttacacg 2340 gtatttcaaa caaacagttt tgctgagagg agcttttgtc tctccttaag aaaatgttta 2400 taaagctgaa aggaaatcaa acagtaatct taaaaatgaa aacaaaacaa cccaacaacc 2460 tagataacta cagtgatcag ggagcacagt tcaactcctt gttatgtttt agtcatatgg 2520 cctactcaaa cagctaaata acaacaccag tggcagataa aaatcaccat ttatctttca 2580 gctattaatc ttttgaatga ataaactgtg acaaacaaat taacattttt gaacatgaaa 2640 ggcaacttct gcacaatcct gtatccaagc aaactttaaa ttatccactt aattattact 2700 taatcttaaa aaaaattaga acccagaact tttcaatgaa gcatttgaaa gttgaagtgg 2760 aatttaggaa agccataaaa atataaatac tgttatcaca gcaccagcaa gccataatct 2820 ttatacctat cagttctatt tctattaaca gtaaaaacat taagcaagat ataagactac 2880 ctgcccaaga attcagtctt ttttcatttt tgtttttctc agttctgagg atgttaatcg 2940 tcaaattttc tttggactgc attcctcact actttttgca caatggtctc acgttctcac 3000 atttgttctc gcgaataaat tgataaaagg tgttaagttc tgtgaatgtc tttttaatta 3060 tgggcataat tgtgcttgac tggataaaaa cttaagtcca cccttatgtt tataataatt 3120 tcttgagaac agcaaactgc atttaccatc gtaaaacaac atctgactta cgggagctgc 3180 agggaagtgg tgagacagtt cgaacggctc ctcagaaatc cagtgaccca attctaaaga 3240 ccatagcacc tgcaagtgac acaacaagca gatttattat acatttatta gccttagcag 3300 gcaataaacc aagaatcact ttgaagacac agcaaaaagt gatacactcc gcagatctga 3360 aatagatgtg ttctcagaca acaaagtccc ttcagaatct tcatgttgca taaatgttat 3420 gaatattaat aaaaagttga ttgagaaaaa 3450 <210> 30 <211> 121 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(121) <400> 30 gtctcaatat tagagtctca acccccaata aatataggac tggagatgtc tgaggctcat 60 tctgccctcg agcccaccgg gaacgaaaga gaagctctat ctcccctcca ggagcccagc 120 t 121 <210> 31 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(87) <400> 31 atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60 gtgttgcctg ctgccttccc tgcccca 87 <210> 32 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(29) <400> 32 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro 20 25 <210> 33 <211> 429 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(429) <400> 33 catgggcacc tcagattgtt gttgttaatg ggcattcctt cttctggtca gaaacctgtc 60 cactgggcac agaacttatg ttgttctcta tggagaacta aaagtatgag cgttaggaca 120 ctattttaat tatttttaat ttattaatat ttaaatatgt gaagctgagt taatttatgt 180 aagtcatatt tatattttta agaagtacca cttgaaacat tttatgtatt agttttgaaa 240 taataatgga aagtggctat gcagtttgaa tatcctttgt ttcagagcca gatcatttct 300 tggaaagtgt aggcttacct caaataaatg gctaacttat acatattttt aaagaaatat 360 ttatattgta tttatataat gtataaatgg tttttatacc aataaatggc attttaaaaa 420 attcagcaa 429 <210> 34 <211> 255 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(255) <400> 34 gtggcagctc acagctattg tggtgggaaa gggagggtgg ttggtggatg tcacagcttg 60 ggctttatct cccccagcag tggggactcc acagcccctg ggctacataa cagcaagaca 120 gtccggagct gtagcagacc tgattgagcc tttgcagcag ctgagagcat ggcctagggt 180 gggcggcacc attgtccagc agctgagttt cccagggacc ttggagatag ccgcagccct 240 catttgcagg ggaag 255 <210> 35 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(66) <400> 35 atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgt 66 <210> 36 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(22) <400> 36 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys 20 <210> 37 <211> 141 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(141) <400> 37 ggctgctgca gctgcatggg tgcctgctgc tgcctgcctt ggcctgatgg ccaggccaga 60 gtgctgccag tcctctgcat gttctgctct tgtgcccttc tgagcccaca ataaaggctg 120 agctcttatc ttgcaaaagg c 141 <210> 38 <211> 243 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(243) <400> 38 ataaaagccc aggggcaagc ggtccggata acggctagcc tgaggagctg ctgcgacagt 60 ccactacctt tttcgagagt gactcccgtt gtcccaaggc ttcccagagc gaacctgtgc 120 ggctgcaggc accggcgcgt cgagtttccg gcgtccggaa ggaccgagct cttctcgcgg 180 atccagtgtt ccgtttccag cccccaatct cagagcggag ccgacagaga gcagggaacc 240 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gtgcccaaga gtggggtttt cttgaacata cttggtttcc tatttcccct tatctttcta 720 aaactgcctt tctggtggct ttttttaaaa ttattactaa tgatgctttt atagctgctt 780 ggattctctg agaaatgatg gggagtgagt gatcactggt attaacttta tacacttgga 840 tttcatttgt aactttagga tgtaaaggta tattgtgaac cctagctgtg tcagaatctc 900 catccctgaa atttctcatt agtggtactg gggtgggatc ttggatggtg acattgaaac 960 tacactaaat cccctcacta tgaatgggtt gttaaaggca atggtttgtg tcaaaactgg 1020 tttaggatta cttagattgt gttcctgaag aaaagagtcc aggtaaatgg tatgatcaat 1080 aaaggacagg ctggtgctaa cataaaatcc aatattgtaa tcctagcact ttgggaggcc 1140 aaggcgggtg gatcacaagg tcaagagata gagaccatct ttgccaacat ggtgaaactc 1200 catctctact gaaaatacaa aaattagctg ggcgtggtag tgcaagctga aggctgaggc 1260 aggagaatca ctcgaacccg ggaggcagag gttgcagtga gccgagatca caccactgta 1320 ctccagcccg gcactccagc ctggcgacaa gagtgagact ccacctcaaa aaaaaaaaaa 1380 agaatccaat actgcccaag gataggtatt ttatagatgg gcaactggct gaaaggttaa 1440 ttctctaggg ctagtagaac tggatcccaa caccaaactc ttaattagac ctaggcctca 1500 gctgcactgc ccgaaaagca tttgggcaga ccctgagcag aatactggtc tcaggccaag 1560 cccaatacag ccattaaaga tgacctacag tgctgtgtac cctggggcaa tagggttaaa 1620 tggtagttag caactagggc tagtcttccc ttacctcaaa ggctctcact accgtggacc 1680 acctagtctg taactctttc tgaggagctg ttactgaata ttaaaaagat agacttcaac 1740 tatg 1744 <210> 44 <211> 128 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(128) <400> 44 gtcagccatc tttcaattgt gttcgcagcc gccgccgcgc cgccgtcgct ctccaacgcc 60 agcgccgcct ctcgctcgcc gagctccagc cgaaggagaa ggggggtaag taaggaggtc 120 tctgtacc 128 <210> 45 <211> 521 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 3'UTR <222> (1)..(521) <400> 45 gaatccacta tgatgggaaa catttcattc tcaaaaaaaa aaaaaaaaat ttctcttctt 60 cctgttattg gtagttctga acgttagata ttttttttcc atggggtcaa aaggtaccta 120 agtatatgat tgcgagtgga aaaatagggg acagaaatca ggtattggca gtttttccat 180 tttcatttgt gtgtgaattt ttaatataaa tgcggagacg taaagcatta atgcaagtta 240 aaatgtttca gtgaacaagt ttcagcggtt caactttata ataattataa ataaacctgt 300 taaatttttc tggacaatgc cagcatttgg 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ccctcctctc tgacctttaa cctcactctc 420 accttgcacc gtgcaccaac ccttcacccc tcctggaaag caggcctgat ggcttcccac 480 tggcctccac cacctgacca gagtgttctc ttcagaggac tggctccttt cccagtgtcc 540 ttaaaataaa gaaatgaaaa tgcttgttgg cacattca 578 <210> 48 <211> 4367 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 gccctaagcc atcagcaatc cttagtatag gggcacactc atgcattcct gtcaagtcat 60 cttgtgaaag gctgcctgct tccagcttgg cttggatgtg caaccttaat aaaactcact 120 gaggtctggg agaaaatagc agatctgcag cagatagggt agaggaaagg gtctagaata 180 tgtacacgca gctgactcag gcaggctcca tgctgaacgg tcacacagag aggaaacaat 240 aaatctcagc tactatgcaa taaatatctc aagttttaac gaagaaaaac atcattgcag 300 tgaaataaaa aattttaaaa ttttagaaca aagctaacaa atggctagtt ttctatgatt 360 cttcttcaaa cgctttcttt gagggggaaa gagtcaaaca aacaagcagt tttacctgaa 420 ataaagaact agttttagag gtcagaagaa aggagcaagt tttgcgagag gcacggaagg 480 agtgtgctgg cagtacaatg acagttttcc tttcctttgc tttcctcgct gccattctga 540 ctcacatagg gtgcagcaat cagcgccgaa gtccagaaaa cagtgggaga 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 catatcttca ttcttcactc tttccccccc cccccttatc ctcctatcta atcctctcat 60 ctctctcctc ctcttcctcc aacaacaact aacaatgtgg cagattgttt tctttactct 120 gagctgtgat cttgtcttgg ccgcagccgt cttcacactc gaagatttcg ttggggactg 180 gcgacagaca gccggctaca acctggacca agtccttgaa cagggaggtg tgtccagttt 240 gtttcagaat ctcggggtgt ccgtaactcc gatccaaagg attgtcctga gcggtgaaaa 300 tgggctgaag atcgacatcc atgtcatcat cccgtatgaa ggtctgagcg gcgaccaaat 360 gggccagatc gaaaaaattt ttaaggtggt gtaccctgtg gatgatcatc actttaaggt 420 gatcctgcac tatggcacac tggtaatcga cggggttacg ccgaacatga tcgactattt 480 cggacggccg tatgaaggca tcgccgtgtt cgacggcaaa aagatcactg taacagggac 540 cctgtggaac ggcaacaaaa ttatcgacga gcgcctgatc aaccccgacg gctccctgct 600 gttccgagta accatcaacg gagtgaccgg ctggcggctg tgcgaacgca ttctggcgta 660 attttgagta attttcaatt ttgtttttgt ttttgttttt gttgttggga gttgttgtaa 720 tttggtaaat gttggggtca ctaaaatctt ttgttgcaat tttagcacct ttttattaga 780 tatataaaat tgggtttaga tgtagttaa 809 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aacggagtga ccggctggcg gctgtgcgaa cgcattctgg cgtaagggcc tttccaagat 840 tgctgttttt gttttggagc ttcaagactt tgcatttcct agtatttctg tttgtcagtt 900 ctcaatttcc tgtgtttgca atgttgaaat tttttggtga agtactgaac ttgctttttt 960 tccggtttct acatgcagag atgaatttat actgccatct tacgactatt tcttcttttt 1020 aatacactta actcaggcca ttttttaagt tggttacttc aaagtaaata aactttaaaa 1080 ttc 1083 <210> 78 <211> 984 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 78 gggctggggg agggtatata agccgagtag gcgacggtga ggtcgacgcc ggccaagaca 60 gcacagacag attgacctat tggggtgttt cgcgagtgtg agagggaagc gccgcggcct 120 gtatttctag acctgccctt cgcctggttc gtggcgcctt gtgaccccgg gcccctgccg 180 cctgcaagtc ggaaattgcg ctgtgctcct gtgctacggc ctgtggctgg actgcctgct 240 gctgcccaac tggctggcaa gatgaaagtc tctgccgccc ttctgtgcct gctgctcata 300 gcagccacct tcattcccca agggctcgct gtcttcacac tcgaagattt cgttggggac 360 tggcgacaga cagccggcta caacctggac caagtccttg aacagggagg tgtgtccagt 420 ttgtttcaga atctcggggt gtccgtaact ccgatccaaa ggattgtcct 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ttctggcgta 720 acatgggcac ctcagattgt tgttgttaat gggcattcct tcttctggtc agaaacctgt 780 ccactgggca cagaacttat gttgttctct atggagaact aaaagtatga gcgttaggac 840 actattttaa ttatttttaa tttattaata tttaaatatg tgaagctgag ttaatttatg 900 taagtcatat ttatattttt aagaagtacc acttgaaaca ttttatgtat tagttttgaa 960 ataataatgg aaagtggcta tgcagtttga atatcctttg tttcagagcc agatcatttc 1020 ttggaaagtg taggcttacc tcaaataaat ggctaactta tacatatttt taaagaaata 1080 tttatattgt atttatataa tgtataaatg gtttttatac caataaatgg cattttaaaa 1140 aattcagcaa 1150 <210> 82 <211> 975 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 gtggcagctc acagctattg tggtgggaaa gggagggtgg ttggtggatg tcacagcttg 60 ggctttatct cccccagcag tggggactcc acagcccctg ggctacataa cagcaagaca 120 gtccggagct gtagcagacc tgattgagcc tttgcagcag ctgagagcat ggcctagggt 180 gggcggcacc attgtccagc agctgagttt cccagggacc ttggagatag ccgcagccct 240 catttgcagg ggaagatgat tcctgccaga tttgccgggg tgctgcttgc tctggccctc 300 attttgccag ggaccctttg tgtcttcaca 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cat ggg caa tgt gcc tac act ttc att ctt 96 Arg Tyr Asn Arg Ile Gln His Gly Gln Cys Ala Tyr Thr Phe Ile Leu 20 25 30 cca gaa cac gat ggc aac tgt cgt gag agt acg aca gac cag tac aac 144 Pro Glu His Asp Gly Asn Cys Arg Glu Ser Thr Thr Asp Gln Tyr Asn 35 40 45 aca aac gct ctg cag aga gat gct cca cac gtg gaa ccg gat ttc tct 192 Thr Asn Ala Leu Gln Arg Asp Ala Pro His Val Glu Pro Asp Phe Ser 50 55 60 tcc cag aaa ctt caa cat ctg gaa cat gtg atg gaa aat tat act cag 240 Ser Gln Lys Leu Gln His Leu Glu His Val Met Glu Asn Tyr Thr Gln 65 70 75 80 tgg ctg caa aaa ctt gag aat tac att gtg gaa aac atg aag tcg gag 288 Trp Leu Gln Lys Leu Glu Asn Tyr Ile Val Glu Asn Met Lys Ser Glu 85 90 95 atg gcc cag ata cag cag aat gca gtt cag aac cac acg gct acc atg 336 Met Ala Gln Ile Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn His Thr Ala Thr Met 100 105 110 ctg gag ata gga acc agc ctc ctc tct cag act gca gag cag acc aga 384 Leu Glu Ile Gly Thr Ser Leu Leu Ser Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg 115 120 125 aag ctg aca gat gtt gag acc cag gta cta aat caa act tct cga ctt 432 Lys Leu Thr Asp Val Glu Thr Gln Val Leu Asn Gln Thr Ser Arg Leu 130 135 140 gag ata cag ctg ctg gag aat tca tta tcc acc tac aag cta gag aag 480 Glu Ile Gln Leu Leu Glu Asn Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Leu Glu Lys 145 150 155 160 caa ctt ctt caa cag aca aat gaa atc ttg aag atc cat gaa aaa aac 528 Gln Leu Leu Gln Gln Thr Asn Glu Ile Leu Lys Ile His Glu Lys Asn 165 170 175 agt tta tta gaa cat aaa atc tta gaa atg gaa gga aaa cac aag gaa 576 Ser Leu Leu Glu His Lys Ile Leu Glu Met Glu Gly Lys His Lys Glu 180 185 190 gag ttg gac acc tta aag gaa gag aaa gag aac ctt caa ggc ttg gtt 624 Glu Leu Asp Thr Leu Lys Glu Glu Lys Glu Asn Leu Gln Gly Leu Val 195 200 205 act cgt caa aca tat ata atc cag gag ctg gaa aag caa tta aac aga 672 Thr Arg Gln Thr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Lys Gln Leu Asn Arg 210 215 220 gct acc acc aac aac agt gtc ctt cag aag cag caa ctg gag ctg atg 720 Ala Thr Thr Asn Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln Leu Glu Leu Met 225 230 235 240 gac aca gtc cac aac ctt gtc aat ctt tgc act aaa gaa ggt gtt tta 768 Asp Thr Val His Asn Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu 245 250 255 cta aag gga gga aaa aga gag gaa gag aaa cca ttt aga gac tgt gca 816 Leu Lys Gly Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala 260 265 270 gat gta tat caa gct ggt ttt aat aaa agt gga atc tac act att tat 864 Asp Val Tyr Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr 275 280 285 att aat aat atg cca gaa ccc aaa aag gtg ttt tgc aat atg gat gtc 912 Ile Asn Asn Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val 290 295 300 aat ggg gga ggt tgg act gta ata caa cat cgt gaa gat gga agt cta 960 Asn Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu 305 310 315 320 gat ttc caa aga ggc tgg aag gaa tat aaa atg ggt ttt gga aat ccc 1008 Asp Phe Gln Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro 325 330 335 tcc ggt gaa tat tgg ctg ggg aat gag ttt att ttt gcc att acc agt 1056 Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser 340 345 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300 attttggaac tatggtagcc agatgataaa tatggttaat ttcatgtaaa acagaaaaaa 360 agagtgaaaa agagaatata catgaagaat agaaacaagc ctgccataat cctttggaaa 420 agatgtatta taccagtgaa aaggtgttat atctatgcaa acctactaac aaattatact 480 gttgcacaat tttgataaaa atttagaaca gcattgtcct ctgagttggt taaatgttaa 540 tggatttcag aagcctaatt ccagtatcat acttactagt tgatttctgc ttacccatct 600 tcaaatgaaa attccatttt tgtaagccat aatgaactgt agtacatgga caataagtgt 660 gtggtagaaa caaactccat tactctgatt tttgatacag ttttcagaaa aagaaatgaa 720 cataatcaag taaggatgta tgtggtgaaa acttaccacc cccatactat ggttttcatt 780 tactctaaaa actgattgaa tgatatataa atatatttat agcctgagta aagttaaaag 840 aatgtaaaat atatcatcaa gttcttaaaa taatatacat gcatttaata tttcctttga 900 tattatacag gaaagcaata ttttggagta tgttaagttg aagtaaaagc aagtactctg 960 gagcagttca ttttacagta tctacttgca tgtgtataca tacatgtaac ttcattattt 1020 taaaaatatt tttagaactc caatactcac cctgttatgt cttgctaatt taaattttgc 1080 taattaactg aaacatgctt accagattca cactgttcca gtgtctataa aagaaacact 1140 ttgaagtcta 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Val Met Ser Gly Gly Trp Trp Phe 420 425 430 gac gcc tgt ggc ctg tca aac ctc aac ggc gtc tac tac cac gct ccc 1344 Asp Ala Cys Gly Leu Ser Asn Leu Asn Gly Val Tyr Tyr His Ala Pro 435 440 445 gac aac aag tac aag atg gac ggc atc cgc tgg cac tac ttc aag ggc 1392 Asp Asn Lys Tyr Lys Met Asp Gly Ile Arg Trp His Tyr Phe Lys Gly 450 455 460 ccc agc tac tca ctg cgt gcc tct cgc atg atg ata cgg cct ttg gac 1440 Pro Ser Tyr Ser Leu Arg Ala Ser Arg Met Met Ile Arg Pro Leu Asp 465 470 475 480 atc taa 1446 Ile <210> 93 <211> 481 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Gln Gln Thr Arg Gln Glu Ala Asp Arg Gly Cys Glu Thr Leu Val Val 1 5 10 15 Gln His Gly His Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro Lys Ser Glu Pro 20 25 30 Cys Pro Pro Gly Pro Glu Val Ser Arg Asp Ser Asn Thr Leu Gln Arg 35 40 45 Glu Ser Leu Ala Asn Pro Leu His Leu Gly Lys Leu Pro Thr Gln Gln 50 55 60 Val Lys Gln Leu Glu Gln Ala Leu Gln Asn Asn Thr Gln Trp Leu Lys 65 70 75 80 Lys Leu Glu Arg Ala Ile Lys Thr Ile Leu Arg Ser Lys Leu Glu Gln 85 90 95 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gga aaa ctg aat ggg ata aag tgg cac tac ttc aaa ggg ccc 816 Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro 260 265 270 agt tac tcc tta cgt tcc aca act atg atg att cga cct tta gat ttt 864 Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe 275 280 285 tga 867 <210> 96 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 96 Gly Ile Leu Asp Leu Ala Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr 1 5 10 15 Asn Ala Ala Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Lys 20 25 30 Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly 35 40 45 Gly Ser Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly 50 55 60 Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr 65 70 75 80 Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn 85 90 95 Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly 100 105 110 Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln 115 120 125 Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 130 135 140 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln 145 150 155 160 Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr 165 170 175 Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg 180 185 190 Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu 195 200 205 Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn 210 215 220 Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 225 230 235 240 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln 245 250 255 Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro 260 265 270 Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe 275 280 285 <210> 97 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> CDS <222> (1)..(867) <400> 97 ggg atc tta gac ttg ggc ccg cag atg ctt cgg gaa ctg cag gaa acc 48 Gly Ile Leu Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr 1 5 10 15 aac gcg gcg ctg cag gac gtg cgg gag ctg ctg cgg cag cag gtc agg 96 Asn Ala Ala Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg 20 25 30 gag atc acg ttc ctg aaa aac acg gtg atg gag tgt gac gcg tgc gga 144 Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly 35 40 45 ggc tcc ctt gtc aat ctt tgc act aaa gaa ggt gtt tta cta aag gga 192 Gly Ser Leu Val Asn Leu Cys Thr Lys Glu Gly Val Leu Leu Lys Gly 50 55 60 gga aaa aga gag gaa gag aaa cca ttt aga gac tgt gca gat gta tat 240 Gly Lys Arg Glu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Asp Cys Ala Asp Val Tyr 65 70 75 80 caa gct ggt ttt aat aaa agt gga atc tac act att tat att aat aat 288 Gln Ala Gly Phe Asn Lys Ser Gly Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Asn Asn 85 90 95 atg cca gaa ccc aaa aag gtg ttt tgc aat atg gat gtc aat ggg gga 336 Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly 100 105 110 ggt tgg act gta ata caa cat cgt gaa gat gga agt cta gat ttc caa 384 Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln 115 120 125 aga ggc tgg aag gaa tat aaa atg ggt ttt gga aat ccc tcc ggt gaa 432 Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 130 135 140 tat tgg ctg ggg aat gag ttt att ttt gcc att acc agt cag agg cag 480 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln 145 150 155 160 tac atg cta aga att gag tta atg gac tgg gaa ggg aac cga gcc tat 528 Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr 165 170 175 tca cag tat gac aga ttc cac ata gga aat gaa aag caa aac tat agg 576 Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg 180 185 190 ttg tat tta aaa ggt cac act ggg aca gca gga aaa cag agc agc ctg 624 Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu 195 200 205 atc tta cac ggt gct gat ttc agc act aaa gat gct gat aat gac aac 672 Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn 210 215 220 tgt atg tgc aaa tgt gcc ctc atg tta aca gga gga tgg tgg ttt gat 720 Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe 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Met Pro Glu Pro Lys Lys Val Phe Cys Asn Met Asp Val Asn Gly Gly 100 105 110 Gly Trp Thr Val Ile Gln His Arg Glu Asp Gly Ser Leu Asp Phe Gln 115 120 125 Arg Gly Trp Lys Glu Tyr Lys Met Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 130 135 140 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Ile Phe Ala Ile Thr Ser Gln Arg Gln 145 150 155 160 Tyr Met Leu Arg Ile Glu Leu Met Asp Trp Glu Gly Asn Arg Ala Tyr 165 170 175 Ser Gln Tyr Asp Arg Phe His Ile Gly Asn Glu Lys Gln Asn Tyr Arg 180 185 190 Leu Tyr Leu Lys Gly His Thr Gly Thr Ala Gly Lys Gln Ser Ser Leu 195 200 205 Ile Leu His Gly Ala Asp Phe Ser Thr Lys Asp Ala Asp Asn Asp Asn 210 215 220 Cys Met Cys Lys Cys Ala Leu Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 225 230 235 240 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Phe Tyr Thr Ala Gly Gln 245 250 255 Asn His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp His Tyr Phe Lys Gly Pro 260 265 270 Ser Tyr Ser Leu Arg Ser Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Leu Asp Phe 275 280 285 <210> 99 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile 85 90 95 aat ggt gct tat ttc tgt gaa ggg cga gtt cga gga gag gca atc agg 336 Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg 100 105 110 ata cga acc atg aag atg cgt caa caa gct tcc ttc cta cca gct act 384 Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr 115 120 125 tta act atg act gtg gac aag gga gat aac gtg aac ata tct ttc aaa 432 Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys 130 135 140 aag gta ttg att aaa gaa gaa gat gca gtg att tac aaa aat ggt tcc 480 Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser 145 150 155 160 ttc atc cat tca gtg ccc cgg cat gaa gta cct gat att cta gaa gta 528 Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val 165 170 175 cac ctg cct cat gct cag ccc cag gat gct gga gtg tac tcg gcc agg 576 His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg 180 185 190 tat ata gga gga aac ctc ttc acc tcg gcc ttc acc agg ctg ata gtc 624 Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val 195 200 205 cgg aga tgt gaa gcc cag aag tgg gga cct gaa tgc aac cat ctc tgt 672 Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn His Leu Cys 210 215 220 act gct tgt atg aac aat ggt gtc tgc cat gaa gat act gga gaa tgc 720 Thr Ala Cys Met Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys 225 230 235 240 att tgc cct cct ggg ttt atg gga agg acg tgt gag aag gct tgt gaa 768 Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu 245 250 255 ctg cac acg ttt ggc aga act tgt aaa gaa agg tgc agt gga caa gag 816 Leu His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Glu 260 265 270 gga tgc aag tct tat gtg ttc tgt ctc cct gac ccc tat ggg tgt tcc 864 Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser 275 280 285 tgt gcc aca ggc tgg aag ggt ctg cag tgc aat gaa gca tgc cac cct 912 Cys Ala Thr Gly Trp Lys Gly Leu Gln Cys Asn Glu Ala Cys His Pro 290 295 300 ggt ttt tac ggg cca gat tgt aag ctt agg tgc agc tgc aac 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agt gtg aac aca gtg gct ggg atg 1296 Pro Asp Ser Gly Val Trp Val Cys Ser Val Asn Thr Val Ala Gly Met 420 425 430 gtg gaa aag ccc ttc aac att tct gtt aaa gtt ctt cca aag ccc ctg 1344 Val Glu Lys Pro Phe Asn Ile Ser Val Lys Val Leu Pro Lys Pro Leu 435 440 445 aat gcc cca aac gtg att gac act gga cat aac ttt gct gtc atc aac 1392 Asn Ala Pro Asn Val Ile Asp Thr Gly His Asn Phe Ala Val Ile Asn 450 455 460 atc agc tct gag cct tac ttt ggg gat gga cca atc aaa tcc aag aag 1440 Ile Ser Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Asp Gly Pro Ile Lys Ser Lys Lys 465 470 475 480 ctt cta tac aaa ccc gtt aat cac tat gag gct tgg caa cat att caa 1488 Leu Leu Tyr Lys Pro Val Asn His Tyr Glu Ala Trp Gln His Ile Gln 485 490 495 gtg aca aat gag att gtt aca ctc aac tat ttg gaa cct cgg aca gaa 1536 Val Thr Asn Glu Ile Val Thr Leu Asn Tyr Leu Glu Pro Arg Thr Glu 500 505 510 tat gaa ctc tgt gtg caa ctg gtc cgt cgt gga gag ggt ggg gaa ggg 1584 Tyr Glu Leu Cys Val Gln Leu Val Arg Arg Gly Glu Gly Gly Glu Gly 515 520 525 cat cct gga cct gtg aga cgc ttc aca aca gct tct atc gga ctc cct 1632 His Pro Gly Pro Val Arg Arg Phe Thr Thr Ala Ser Ile Gly Leu Pro 530 535 540 cct cca aga ggt cta aat ctc ctg cct aaa agt cag acc act cta aat 1680 Pro Pro Arg Gly Leu Asn Leu Leu Pro Lys Ser Gln Thr Thr Leu Asn 545 550 555 560 ttg acc tgg caa cca ata ttt cca agc tcg gaa gat gac ttt tat gtt 1728 Leu Thr Trp Gln Pro Ile Phe Pro Ser Ser Glu Asp Asp Phe Tyr Val 565 570 575 gaa gtg gag aga agg tct gtg caa aaa agt gat cag cag aat att aaa 1776 Glu Val Glu Arg Arg Ser Val Gln Lys Ser Asp Gln Gln Asn Ile Lys 580 585 590 gtt cca ggc aac ttg act tcg gtg cta ctt aac aac tta cat ccc agg 1824 Val Pro Gly Asn Leu Thr Ser Val Leu Leu Asn Asn Leu His Pro Arg 595 600 605 gag cag tac gtg gtc cga gct aga gtc aac acc aag gcc cag ggg gaa 1872 Glu Gln Tyr Val Val Arg Ala Arg Val Asn Thr Lys Ala Gln Gly Glu 610 615 620 tgg agt gaa gat ctc act gct tgg acc ctt agt gac att ctt cct cct 1920 Trp Ser Glu Asp Leu Thr Ala Trp Thr Leu Ser Asp Ile Leu Pro Pro 625 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Leu Ile Ala Ile Leu 740 745 750 ggc tct gct gga atg acc tgc ctg act gtg ctg ttg gcc ttt ctg atc 2304 Gly Ser Ala Gly Met Thr Cys Leu Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu Ile 755 760 765 ata ttg caa ttg aag agg gca aat gtg caa agg aga atg gcc caa gcc 2352 Ile Leu Gln Leu Lys Arg Ala Asn Val Gln Arg Arg Met Ala Gln Ala 770 775 780 ttc caa aac gtg agg gaa gaa cca gct gtg cag ttc aac tca ggg act 2400 Phe Gln Asn Val Arg Glu Glu Pro Ala Val Gln Phe Asn Ser Gly Thr 785 790 795 800 ctg gcc cta aac agg aag gtc aaa aac aac cca gat cct aca att tat 2448 Leu Ala Leu Asn Arg Lys Val Lys Asn Asn Pro Asp Pro Thr Ile Tyr 805 810 815 cca gtg ctt gac tgg aat gac atc aaa ttt caa gat gtg att ggg gag 2496 Pro Val Leu Asp Trp Asn Asp Ile Lys Phe Gln Asp Val Ile Gly Glu 820 825 830 ggc aat ttt ggc caa gtt ctt aag gcg cgc atc aag aag gat ggg tta 2544 Gly Asn Phe Gly Gln Val Leu Lys Ala Arg Ile Lys Lys Asp Gly Leu 835 840 845 cgg atg gat gct gcc atc aaa aga atg aaa gaa tat gcc tcc aaa gat 2592 Arg Met Asp Ala Ala Ile Lys Arg Met Lys Glu Tyr Ala Ser Lys Asp 850 855 860 gat cac agg gac ttt gca gga gaa ctg gaa gtt ctt tgt aaa ctt gga 2640 Asp His Arg Asp Phe Ala Gly Glu Leu Glu Val Leu Cys Lys Leu Gly 865 870 875 880 cac cat cca aac atc atc aat ctc tta gga gca tgt gaa cat cga ggc 2688 His His Pro Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly 885 890 895 tac ttg tac ctg gcc att gag tac gcg ccc cat gga aac ctt ctg gac 2736 Tyr Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp 900 905 910 ttc ctt cgc aag agc cgt gtg ctg gag acg gac cca gca ttt gcc att 2784 Phe Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile 915 920 925 gcc aat agc acc gcg tcc aca ctg tcc tcc cag cag ctc ctt cac ttc 2832 Ala Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gln Gln Leu Leu His Phe 930 935 940 gct gcc gac gtg gcc cgg ggc atg gac tac ttg agc caa aaa cag ttt 2880 Ala Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Gln Phe 945 950 955 960 atc cac agg gat ctg gct gcc aga aac att tta gtt ggt gaa aac tat 2928 Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Tyr 965 970 975 gtg gca aaa ata gca gat ttt gga ttg tcc cga ggt caa gag gtg tat 2976 Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val Tyr 980 985 990 gtg aaa aag aca atg gga agg ctc cca gtg cgc tgg atg gcc atc gag 3024 Val Lys Lys Thr Met Gly Arg Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Ile Glu 995 1000 1005 tca ctg aat tac agt gtg tac aca acc aac agt gat gta tgg tcc 3069 Ser Leu Asn Tyr Ser Val Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Val Trp Ser 1010 1015 1020 tat ggt gtg tta cta tgg gag att gtt agc tta gga ggc aca ccc 3114 Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Val Ser Leu Gly Gly Thr Pro 1025 1030 1035 tac tgc ggg atg act tgt gca gaa ctc tac gag aag ctg ccc cag 3159 Tyr Cys Gly Met Thr Cys Ala Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Pro Gln 1040 1045 1050 ggc tac aga ctg gag aag ccc ctg aac tgt gat gat gag gtg tat 3204 Gly Tyr Arg Leu Glu Lys Pro Leu Asn Cys Asp Asp Glu Val Tyr 1055 1060 1065 gat cta atg aga caa tgc tgg cgg gag aag cct tat gag agg cca 3249 Asp Leu Met Arg Gln Cys Trp Arg Glu Lys Pro Tyr Glu Arg Pro 1070 1075 1080 tca ttt gcc cag ata ttg gtg tcc tta aac aga atg tta gag gag 3294 Ser Phe Ala Gln Ile Leu Val Ser Leu Asn Arg Met Leu Glu Glu 1085 1090 1095 cga aag acc tac gtg aat acc acg ctt tat gag aag ttt act tat 3339 Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr 1100 1105 1110 gca gga att gac tgt tct gct gaa gaa gcg gcc tag 3375 Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala Glu Glu Ala Ala 1115 1120 <210> 102 <211> 1124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gly Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu 20 25 30 Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly 35 40 45 Trp Arg Pro His Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu 50 55 60 Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg 65 70 75 80 Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile 85 90 95 Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg 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tct att act atc 2016 Ile Ser Trp Thr Ile Leu Asp Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ile Thr Ile 660 665 670 cgt tac aag gtt caa ggc aag aat gaa gac cag cac gtt gat gtg aag 2064 Arg Tyr Lys Val Gln Gly Lys Asn Glu Asp Gln His Val Asp Val Lys 675 680 685 ata aag aat gcc acc atc act cag tat cag ctc aag ggc cta gag cct 2112 Ile Lys Asn Ala Thr Ile Thr Gln Tyr Gln Leu Lys Gly Leu Glu Pro 690 695 700 gaa aca gca tac cag gtg gac att ttt gca gag aac aac ata ggg tca 2160 Glu Thr Ala Tyr Gln Val Asp Ile Phe Ala Glu Asn Asn Ile Gly Ser 705 710 715 720 agc aac cca gcc ttt tct cat gaa ctg gtg acc ctc cca gaa tct caa 2208 Ser Asn Pro Ala Phe Ser His Glu Leu Val Thr Leu Pro Glu Ser Gln 725 730 735 gca cca gcg gac ctc gga ggg ggg aag atg ctg ctt ata gcc atc ctt 2256 Ala Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Lys Met Leu Leu Ile Ala Ile Leu 740 745 750 ggc tct gct gga atg acc tgc ctg act gtg ctg ttg gcc ttt ctg atc 2304 Gly Ser Ala Gly Met Thr Cys Leu Thr Val Leu Leu Ala Phe Leu Ile 755 760 765 ata ttg caa ttg aag agg gca 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cat cca aac atc atc aat ctc tta gga gca tgt gaa cat cga ggc 2688 His His Pro Asn Ile Ile Asn Leu Leu Gly Ala Cys Glu His Arg Gly 885 890 895 tac ttg tac ctg gcc att gag tac gcg ccc cat gga aac ctt ctg gac 2736 Tyr Leu Tyr Leu Ala Ile Glu Tyr Ala Pro His Gly Asn Leu Leu Asp 900 905 910 ttc ctt cgc aag agc cgt gtg ctg gag acg gac cca gca ttt gcc att 2784 Phe Leu Arg Lys Ser Arg Val Leu Glu Thr Asp Pro Ala Phe Ala Ile 915 920 925 gcc aat agc acc gcg tcc aca ctg tcc tcc cag cag ctc ctt cac ttc 2832 Ala Asn Ser Thr Ala Ser Thr Leu Ser Ser Gln Gln Leu Leu His Phe 930 935 940 gct gcc gac gtg gcc cgg ggc atg gac tac ttg agc caa aaa cag ttt 2880 Ala Ala Asp Val Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Gln Phe 945 950 955 960 atc cac agg gat ctg gct gcc aga aac att tta gtt ggt gaa aac tat 2928 Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Gly Glu Asn Tyr 965 970 975 gtg gca aaa ata gca gat ttt gga ttg tcc cga ggt caa gag gtg tat 2976 Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Gly Gln Glu Val 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1095 cga aag acc tac gtg aat acc acg ctt tat gag aag ttt act tat 3339 Arg Lys Thr Tyr Val Asn Thr Thr Leu Tyr Glu Lys Phe Thr Tyr 1100 1105 1110 gca gga att gac tgt tct gct gaa gaa gcg gcc tag 3375 Ala Gly Ile Asp Cys Ser Ala Glu Glu Ala Ala 1115 1120 <210> 104 <211> 1124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Met Asp Ser Leu Ala Ser Leu Val Leu Cys Gly Val Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gly Thr Val Glu Gly Ala Met Asp Leu Ile Leu Ile Asn Ser Leu 20 25 30 Pro Leu Val Ser Asp Ala Glu Thr Ser Leu Thr Cys Ile Ala Ser Gly 35 40 45 Trp Arg Pro His Glu Pro Ile Thr Ile Gly Arg Asp Phe Glu Ala Leu 50 55 60 Met Asn Gln His Gln Asp Pro Leu Glu Val Thr Gln Asp Val Thr Arg 65 70 75 80 Glu Trp Ala Lys Lys Val Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile 85 90 95 Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg 100 105 110 Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr 115 120 125 Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys 130 135 140 Lys Val Leu Ile 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gtggtaaatt taatcccatt tgcaaagctt ctggctggcc 1200 gctacctact aatgaagaaa tgaccctggt gaagccggat gggacagtgc tccatccaaa 1260 agactttaac catacggatc atttctcagt agccatattc accatccaca gaatcctccc 1320 ccctgactca ggagtttggg tctgcagtgt gaacacagtg gctgggatgg tggaaaagcc 1380 cttcaacatt tctgttaaag ttcttccaaa gcccctgaat gccccaaacg tgattgacac 1440 tggacataac tttgctgtca tcaacatcag ctctgagcct tactttgggg atggaccaat 1500 caaatccaag aagcttctat acaaacccgt taatcactat gaggcttggc aacatattca 1560 agtgacaaat gagattgtta cactcaacta tttggaacct cggacagaat atgaactctg 1620 tgtgcaactg gtccgtcgtg gagagggtgg ggaagggcat cctggacctg tgagacgctt 1680 cacaacagct tctatcggac tccctcctcc aagaggtcta aatctcctgc ctaaaagtca 1740 gaccactcta aatttgacct ggcaaccaat atttccaagc tcggaagatg acttttatgt 1800 tgaagtggag agaaggtctg tgcaaaaaag tgatcagcag aatattaaag ttccaggcaa 1860 cttgacttcg gtgctactta acaacttaca tcccagggag cagtacgtgg tccgagctag 1920 agtcaacacc aaggcccagg gggaatggag tgaagatctc actgcttgga cccttagtga 1980 cattcttcct cctcaaccag 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ggacaagagg gatgcaagtc 900 ttatgtgttc tgtctccctg acccctatgg gtgttcctgt gccacaggct ggaagggtct 960 gcagtgcaat gaagcatgcc accctggttt ttacgggcca gattgtaagc ttaggtgcag 1020 ctgcaacaat ggggagatgt gtgatcgctt ccaaggatgt ctctgctctc caggatggca 1080 ggggctccag tgtgagagag aaggcatacc gaggatgacc ccaaagatag tggatttgcc 1140 agatcatata gaagtaaaca gtggtaaatt taatcccatt tgcaaagctt ctggctggcc 1200 gctacctact aatgaagaaa tgaccctggt gaagccggat gggacagtgc tccatccaaa 1260 agactttaac catacggatc atttctcagt agccatattc accatccaca gaatcctccc 1320 ccctgactca ggagtttggg tctgcagtgt gaacacagtg gctgggatgg tggaaaagcc 1380 cttcaacatt tctgttaaag ttcttccaaa gcccctgaat gccccaaacg tgattgacac 1440 tggacataac tttgctgtca tcaacatcag ctctgagcct tactttgggg atggaccaat 1500 caaatccaag aagcttctat acaaacccgt taatcactat gaggcttggc aacatattca 1560 agtgacaaat gagattgtta cactcaacta tttggaacct cggacagaat atgaactctg 1620 tgtgcaactg gtccgtcgtg gagagggtgg ggaagggcat cctggacctg tgagacgctt 1680 cacaacagct tctatcggac tccctcctcc aagaggtcta 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Leu Cys Leu Ser Ile Cys Ser Val Lys Gly Arg Lys Gly Ala Lys 405 410 415 gag gaa cac tgt cca ttg gca tgg gga aat ata aac ttg ttt gat tac 1296 Glu Glu His Cys Pro Leu Ala Trp Gly Asn Ile Asn Leu Phe Asp Tyr 420 425 430 aca gac act cta gta tct gga aaa atg gct ttg aat ctt tgg cca gta 1344 Thr Asp Thr Leu Val Ser Gly Lys Met Ala Leu Asn Leu Trp Pro Val 435 440 445 cct cat gga tta gaa gat ttg ctg aac cct att ggt gtt act gga tca 1392 Pro His Gly Leu Glu Asp Leu Leu Asn Pro Ile Gly Val Thr Gly Ser 450 455 460 aat cca aat aaa gaa act cca tgc tta gag ttg gag ttt gac tgg ttc 1440 Asn Pro Asn Lys Glu Thr Pro Cys Leu Glu Leu Glu Phe Asp Trp Phe 465 470 475 480 agc agt gtg gta aag ttc cca gat atg tca gtg att gaa gag cat gcc 1488 Ser Ser Val Val Lys Phe Pro Asp Met Ser Val Ile Glu Glu His Ala 485 490 495 aat tgg tct gta tcc cga gaa gca gga ttt agc tat tcc cac gca gga 1536 Asn Trp Ser Val Ser Arg Glu Ala Gly Phe Ser Tyr Ser His Ala Gly 500 505 510 ctg agt aac aga cta gct aga gac aat gaa tta agg gaa aat gac aaa 1584 Leu Ser Asn Arg Leu Ala Arg Asp Asn Glu Leu Arg Glu Asn Asp Lys 515 520 525 gaa cag ctc aaa gca att tct aca cga gat cct ctc tct gaa atc act 1632 Glu Gln Leu Lys Ala Ile Ser Thr Arg Asp Pro Leu Ser Glu Ile Thr 530 535 540 gag cag gag aaa gat ttt cta tgg agt cac aga cac tat tgt gta act 1680 Glu Gln Glu Lys Asp Phe Leu Trp Ser His Arg His Tyr Cys Val Thr 545 550 555 560 atc ccc gaa att cta ccc aaa ttg ctt ctg tct gtt aaa tgg aat tct 1728 Ile Pro Glu Ile Leu Pro Lys Leu Leu Leu Ser Val Lys Trp Asn Ser 565 570 575 aga gat gaa gta gcc cag atg tat tgc ttg gta aaa gat tgg cct cca 1776 Arg Asp Glu Val Ala Gln Met Tyr Cys Leu Val Lys Asp Trp Pro Pro 580 585 590 atc aaa cct gaa cag gct atg gaa ctt ctg gac tgt aat tac cca gat 1824 Ile Lys Pro Glu Gln Ala Met Glu Leu Leu Asp Cys Asn Tyr Pro Asp 595 600 605 cct atg gtt cga ggt ttt gct gtt cgg tgc ttg gaa aaa tat tta aca 1872 Pro Met Val Arg Gly Phe Ala Val Arg Cys Leu Glu Lys Tyr Leu Thr 610 615 620 gat gac aaa ctt tct cag tat tta att cag cta gta cag gtc cta aaa 1920 Asp Asp Lys Leu Ser Gln Tyr Leu Ile Gln Leu Val Gln Val Leu Lys 625 630 635 640 tat gaa caa tat ttg gat aac ttg ctt gtg aga ttt tta ctg aag aaa 1968 Tyr Glu Gln Tyr Leu Asp Asn Leu Leu Val Arg Phe Leu Leu Lys Lys 645 650 655 gca ttg act aat caa agg att ggg cac ttt ttc ttt tgg cat tta aaa 2016 Ala Leu Thr Asn Gln Arg Ile Gly His Phe Phe Phe Trp His Leu Lys 660 665 670 tct gag atg cac aat aaa aca gtt agc cag agg ttt ggc ctg ctt ttg 2064 Ser Glu Met His Asn Lys Thr Val Ser Gln Arg Phe Gly Leu Leu Leu 675 680 685 gag tcc tat tgt cgt gca tgt ggg atg tat ttg aag cac ctg aat agg 2112 Glu Ser Tyr Cys Arg Ala Cys Gly Met Tyr Leu Lys His Leu Asn Arg 690 695 700 caa gtc gag gca atg gaa aag ctc att aac tta act gac att ctc aaa 2160 Gln Val Glu Ala Met Glu Lys Leu Ile Asn Leu Thr Asp Ile Leu Lys 705 710 715 720 cag gag aag aag gat gaa aca caa aag gta cag atg aag ttt tta gtt 2208 Gln Glu Lys Lys Asp Glu Thr Gln Lys Val Gln Met Lys Phe Leu Val 725 730 735 gag caa atg agg cga cca gat ttc atg gat gct cta cag ggc ttt ctg 2256 Glu Gln Met Arg Arg Pro Asp Phe Met Asp Ala Leu Gln Gly Phe Leu 740 745 750 tct cct cta aac cct gct cat caa cta gga aac ctc agg ctt gaa gag 2304 Ser Pro Leu Asn Pro Ala His Gln Leu Gly Asn Leu Arg Leu Glu Glu 755 760 765 tgt cga att atg tcc tct gca aaa agg cca ctg tgg ttg aat tgg gag 2352 Cys Arg Ile Met Ser Ser Ala Lys Arg Pro Leu Trp Leu Asn Trp Glu 770 775 780 aac cca gac atc atg tca gag tta ctg ttt cag aac aat gag atc atc 2400 Asn Pro Asp Ile Met Ser Glu Leu Leu Phe Gln Asn Asn Glu Ile Ile 785 790 795 800 ttt aaa aat ggg gat gat tta cgg caa gat atg cta aca ctt caa att 2448 Phe Lys Asn Gly Asp Asp Leu Arg Gln Asp Met Leu Thr Leu Gln Ile 805 810 815 att cgt att atg gaa aat atc tgg caa aat caa ggt ctt gat ctt cga 2496 Ile Arg Ile Met Glu Asn Ile Trp Gln Asn Gln Gly Leu Asp Leu Arg 820 825 830 atg tta cct tat ggt tgt ctg tca atc ggt gac tgt gtg gga ctt att 2544 Met Leu Pro Tyr Gly Cys Leu Ser Ile Gly Asp Cys Val Gly Leu Ile 835 840 845 gag gtg gtg cga aat tct cac act att atg caa att cag tgc aaa ggc 2592 Glu Val Val Arg Asn Ser His Thr Ile Met Gln Ile Gln Cys Lys Gly 850 855 860 ggc ttg aaa ggt gca ctg cag ttc aac agc cac aca cta cat cag tgg 2640 Gly Leu Lys Gly Ala Leu Gln Phe Asn Ser His Thr Leu His Gln Trp 865 870 875 880 ctc aaa gac aag aac aaa gga gaa ata tat gat gca gcc att gac ctg 2688 Leu Lys Asp Lys Asn Lys Gly Glu Ile Tyr Asp Ala Ala Ile Asp Leu 885 890 895 ttt aca cgt tca tgt gct gga tac tgt gta gct acc ttc att ttg gga 2736 Phe Thr Arg Ser Cys Ala Gly Tyr Cys Val Ala Thr Phe Ile Leu Gly 900 905 910 att gga gat cgt cac aat agt aac atc atg gtg aaa gac gat gga caa 2784 Ile Gly Asp Arg His Asn Ser Asn Ile Met Val Lys Asp Asp Gly Gln 915 920 925 ctg ttt cat ata gat ttt gga cac ttt ttg gat cac aag aag aaa aaa 2832 Leu Phe His Ile Asp Phe Gly His Phe Leu Asp His Lys Lys Lys Lys 930 935 940 ttt ggt tat aaa cga gaa cgt gtg cca ttt gtt ttg aca cag gat ttc 2880 Phe Gly Tyr Lys Arg Glu Arg Val Pro Phe Val Leu Thr Gln Asp Phe 945 950 955 960 tta ata gtg att agt aaa gga gcc caa gaa tgc aca aag aca aga gaa 2928 Leu Ile Val Ile Ser Lys Gly Ala Gln Glu Cys Thr Lys Thr Arg Glu 965 970 975 ttt gag agg ttt cag gag atg tgt tac aag gct tat cta gct att cga 2976 Phe Glu Arg Phe Gln Glu Met Cys Tyr Lys Ala Tyr Leu Ala Ile Arg 980 985 990 cag cat gcc aat ctc ttc ata aat ctt ttc tca atg atg ctt ggc tct 3024 Gln His Ala Asn Leu Phe Ile Asn Leu Phe Ser Met Met Leu Gly Ser 995 1000 1005 gga atg cca gaa cta caa tct ttt gat gac att gca tac att cga 3069 Gly Met Pro Glu Leu Gln Ser Phe Asp Asp Ile Ala Tyr Ile Arg 1010 1015 1020 aag acc cta gcc tta gat aaa act gag caa gag gct ttg gag tat 3114 Lys Thr Leu Ala Leu Asp Lys Thr Glu Gln Glu Ala Leu Glu Tyr 1025 1030 1035 ttc atg aaa caa atg aat gat gca cat cat ggt ggc tgg aca aca 3159 Phe Met Lys Gln Met Asn Asp Ala His His Gly Gly Trp Thr Thr 1040 1045 1050 aaa atg gat tgg atc ttc cac aca att aaa cag cat gca ttg aac 3204 Lys Met Asp Trp Ile Phe His Thr Ile Lys Gln His Ala Leu Asn 1055 1060 1065 tga 3207 <210> 118 <211> 1068 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Met Pro Pro Arg Pro Ser Ser Gly Glu Leu Trp Gly Ile His Leu Met 1 5 10 15 Pro Pro Arg Ile Leu Val Glu Cys Leu Leu Pro Asn Gly Met Ile Val 20 25 30 Thr Leu Glu Cys Leu Arg Glu Ala Thr Leu Ile Thr Ile Lys His Glu 35 40 45 Leu Phe Lys Glu Ala Arg Lys Tyr Pro Leu His Gln Leu Leu Gln Asp 50 55 60 Glu Ser Ser Tyr Ile Phe Val Ser Val Thr Gln Glu Ala Glu Arg Glu 65 70 75 80 Glu Phe Phe Asp Glu Thr Arg Arg Leu Cys Asp Leu Arg Leu Phe Gln 85 90 95 Pro Phe Leu Lys Val Ile Glu Pro Val Gly Asn Arg Glu Glu Lys Ile 100 105 110 Leu Asn Arg Glu Ile Gly Phe Ala Ile Gly Met Pro Val Cys Glu Phe 115 120 125 Asp Met Val Lys Asp Pro Glu Val Gln Asp Phe Arg Arg Asn Ile Leu 130 135 140 Asn Val Cys Lys Glu Ala Val Asp Leu Arg Asp Leu Asn Ser Pro His 145 150 155 160 Ser Arg Ala Met Tyr Val Tyr Pro Pro Asn Val Glu Ser Ser Pro Glu 165 170 175 Leu Pro Lys His Ile Tyr Asn Lys Leu Asp Lys Gly Gln Ile Ile Val 180 185 190 Val Ile Trp Val Ile Val Ser Pro Asn Asn Asp Lys Gln Lys Tyr Thr 195 200 205 Leu Lys Ile Asn His Asp Cys Val Pro Glu Gln Val Ile Ala Glu Ala 210 215 220 Ile Arg Lys Lys Thr Arg Ser Met Leu Leu Ser Ser Glu Gln Leu Lys 225 230 235 240 Leu Cys Val Leu Glu Tyr Gln Gly Lys Tyr Ile Leu Lys Val Cys Gly 245 250 255 Cys Asp Glu Tyr Phe Leu Glu Lys Tyr Pro Leu Ser Gln Tyr Lys Tyr 260 265 270 Ile Arg Ser Cys Ile Met Leu Gly Arg Met Pro Asn Leu Met Leu Met 275 280 285 Ala Lys Glu Ser Leu Tyr Ser Gln Leu Pro Met Asp Cys Phe Thr Met 290 295 300 Pro Ser Tyr Ser Arg Arg Ile Ser Thr Ala Thr Pro Tyr Met Asn Gly 305 310 315 320 Glu Thr Ser Thr Lys Ser Leu Trp Val Ile Asn Ser Ala Leu Arg Ile 325 330 335 Lys Ile Leu Cys Ala Thr Tyr Val Asn Val Asn Ile Arg Asp Ile Asp 340 345 350 Lys Ile Tyr Val Arg Thr Gly Ile Tyr His Gly Gly Glu Pro Leu Cys 355 360 365 Asp Asn Val Asn Thr Gln Arg Val Pro Cys Ser Asn Pro Arg Trp Asn 370 375 380 Glu Trp Leu Asn Tyr Asp Ile Tyr Ile Pro Asp Leu Pro Arg Ala Ala 385 390 395 400 Arg Leu Cys Leu Ser Ile Cys Ser Val Lys Gly Arg Lys Gly Ala Lys 405 410 415 Glu Glu His Cys Pro Leu Ala Trp Gly Asn Ile Asn Leu Phe Asp Tyr 420 425 430 Thr Asp Thr Leu Val Ser Gly Lys Met Ala Leu Asn Leu Trp Pro Val 435 440 445 Pro His Gly Leu Glu Asp Leu Leu Asn Pro Ile Gly Val Thr Gly Ser 450 455 460 Asn Pro Asn Lys Glu Thr Pro Cys Leu Glu Leu Glu Phe Asp Trp Phe 465 470 475 480 Ser Ser Val Val Lys Phe Pro Asp Met Ser Val Ile Glu Glu His Ala 485 490 495 Asn Trp Ser Val Ser Arg Glu Ala Gly Phe Ser Tyr Ser His Ala Gly 500 505 510 Leu Ser Asn Arg Leu Ala Arg Asp Asn Glu Leu Arg Glu Asn Asp Lys 515 520 525 Glu Gln Leu Lys Ala Ile Ser Thr Arg Asp Pro Leu Ser Glu Ile Thr 530 535 540 Glu Gln Glu Lys Asp Phe Leu Trp Ser His Arg His Tyr Cys Val Thr 545 550 555 560 Ile Pro Glu Ile Leu Pro Lys Leu Leu Leu Ser Val Lys Trp Asn Ser 565 570 575 Arg Asp Glu Val Ala Gln Met Tyr Cys Leu Val Lys Asp Trp Pro Pro 580 585 590 Ile Lys Pro Glu Gln Ala Met Glu Leu Leu Asp Cys Asn Tyr Pro Asp 595 600 605 Pro Met Val Arg Gly Phe Ala Val Arg Cys Leu Glu Lys Tyr Leu Thr 610 615 620 Asp Asp Lys Leu Ser Gln Tyr Leu Ile Gln Leu Val Gln Val Leu Lys 625 630 635 640 Tyr Glu Gln Tyr Leu Asp Asn Leu Leu Val Arg Phe Leu Leu Lys Lys 645 650 655 Ala Leu Thr Asn Gln Arg Ile Gly His Phe Phe Phe Trp His Leu Lys 660 665 670 Ser Glu Met His Asn Lys Thr Val Ser Gln Arg Phe Gly Leu Leu Leu 675 680 685 Glu Ser Tyr Cys Arg Ala Cys Gly Met Tyr Leu Lys His Leu Asn Arg 690 695 700 Gln Val Glu Ala Met Glu Lys Leu Ile Asn Leu Thr Asp Ile Leu Lys 705 710 715 720 Gln Glu Lys Lys Asp Glu Thr Gln Lys Val Gln Met Lys Phe Leu Val 725 730 735 Glu Gln Met Arg Arg Pro Asp Phe Met Asp Ala Leu Gln Gly Phe Leu 740 745 750 Ser Pro Leu Asn Pro Ala His Gln Leu Gly Asn Leu Arg Leu Glu Glu 755 760 765 Cys Arg Ile Met Ser Ser Ala Lys Arg Pro Leu Trp Leu Asn Trp Glu 770 775 780 Asn Pro Asp Ile Met Ser Glu Leu Leu Phe Gln Asn Asn Glu Ile Ile 785 790 795 800 Phe Lys Asn Gly Asp Asp Leu Arg Gln Asp Met Leu Thr Leu Gln Ile 805 810 815 Ile Arg Ile Met Glu Asn Ile Trp Gln Asn Gln Gly Leu Asp Leu Arg 820 825 830 Met Leu Pro Tyr Gly Cys Leu Ser Ile Gly Asp Cys Val Gly Leu Ile 835 840 845 Glu Val Val Arg Asn Ser His Thr Ile Met Gln Ile Gln Cys Lys Gly 850 855 860 Gly Leu Lys Gly Ala Leu Gln Phe Asn Ser His Thr Leu His Gln Trp 865 870 875 880 Leu Lys Asp Lys Asn Lys Gly Glu Ile Tyr Asp Ala Ala Ile Asp Leu 885 890 895 Phe Thr Arg Ser Cys Ala Gly Tyr Cys Val Ala Thr Phe Ile Leu Gly 900 905 910 Ile Gly Asp Arg His Asn Ser Asn Ile Met Val Lys Asp Asp Gly Gln 915 920 925 Leu Phe His Ile Asp Phe Gly His Phe Leu Asp His Lys Lys Lys Lys 930 935 940 Phe Gly Tyr Lys Arg Glu Arg Val Pro Phe Val Leu Thr Gln Asp Phe 945 950 955 960 Leu Ile Val Ile Ser Lys Gly Ala Gln Glu Cys Thr Lys Thr Arg Glu 965 970 975 Phe Glu Arg Phe Gln Glu Met Cys Tyr Lys Ala Tyr Leu Ala Ile Arg 980 985 990 Gln His Ala Asn Leu Phe Ile Asn Leu Phe Ser Met Met Leu Gly Ser 995 1000 1005 Gly Met Pro Glu Leu Gln Ser Phe Asp Asp Ile Ala Tyr Ile Arg 1010 1015 1020 Lys Thr Leu Ala Leu Asp Lys Thr Glu Gln Glu Ala Leu Glu Tyr 1025 1030 1035 Phe Met Lys Gln Met Asn Asp Ala His His Gly Gly Trp Thr Thr 1040 1045 1050 Lys Met Asp Trp Ile Phe His Thr Ile Lys Gln His Ala Leu Asn 1055 1060 1065 <210> 119 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 119 gtcttcacac tcgaagattt cgttggggac tggcgacaga cagccggcta caacctggac 60 caagtccttg aacagggagg tgtgtccagt ttgtttcaga atctcggggt gtccgtaact 120 ccgatccaaa ggattgtcct gagcggtgaa aatgggctga agatcgacat ccatgtcatc 180 atcccgtatg aaggtctgag cggcgaccaa atgggccaga tcgaaaaaat ttttaaggtg 240 gtgtaccctg tggatgatca tcactttaag gtgatcctgc actatggcac actggtaatc 300 gacggggtta cgccgaacat gatcgactat ttcggacggc cgtatgaagg catcgccgtg 360 ttcgacggca aaaagatcac tgtaacaggg accctgtgga acggcaacaa aattatcgac 420 gagcgcctga tcaaccccga cggctccctg ctgttccgag taaccatcaa cggagtgacc 480 ggctggcggc tgtgcgaacg cattctggcg taa 513 <210> 120 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 120 gggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag accccggcgc cgccacc 57 <210> 121 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 121 taataggctg gagcctcggt ggcctagctt cttgcccctt gggcctcccc ccagcccctc 60 ctccccttcc tgcacccgta ccccctccat aaagtaggaa acactacagt ggtctttgaa 120 taaagtctga gtgggcggc 139 <210> 122 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 122 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 ttgcacaaat attactttc 139 <210> 123 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 123 taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaa 38 <210> 124 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 124 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 gccgcccact cagacttta 139 <210> 125 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 125 taatacgact cactataggg tggcagctca cagctatt 38

Claims (32)

  1. 재조합 핵산 구조물로서, 5' → 3' 방향으로
    - 5' UTR,
    - 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역, 및
    - 3' UTR
    을 포함하고,
    상기 5' UTR은 MCP-1을 코딩하는 유전자의 5' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고,
    상기 3' UTR은 vWF를 코딩하는 유전자의 3' UTR 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체이고,
    효과기 분자는 세포의 세포 기능을 회복하는데 효과적이거나 세포 내에서 또는 세포 상에서 치료 효과를 발휘하는데 효과적이고, 및
    재조합 핵산 구조물은 효과기 분자를 코딩하는 야생형 mRNA와 상이한 것인, 재조합 핵산 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 구조물의 5' UTR 및 3' UTR이 상이한 기원인 것인, 재조합 핵산 구조물.
  3. 제2항에 있어서, 재조합 구조물의 5' UTR 및 3' UTR이 상이한 내인성 유전자 또는 종으로부터 유래하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  4. 제1항에 있어서, 재조합 구조물의 5' UTR 및 3' UTR이 동일한 기원인 것인, 재조합 핵산 구조물.
  5. 제4항에 있어서, 재조합 구조물의 5' UTR 및 3' UTR이 동일한 내인성 유전자 또는 종으로부터 유래하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  6. 제1항에 있어서, 구조물이 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  7. 제6항에 있어서, 구조물이 재조합 핵산 구조물의 3' 종결 말단에 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  8. 제1항에 있어서, 구조물이 캡 구조를 포함하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  9. 제8항에 있어서, 구조물이 재조합 핵산 구조물의 5' 종결 말단에 캡 구조를 포함하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  10. 제1항에 있어서, 구조물이 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 서열을 포함하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  11. 제10항에 있어서, 구조물이 재조합 핵산 구조물의 5' 종결 말단에 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 서열을 포함하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  12. 제1항에 있어서, 구조물이 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  13. 제12항에 있어서, 신호 펩티드는 효과기 분자를 코딩하는 핵산 서열과 인-프레임이고 5' UTR과 효과기 분자를 코딩하는 코딩 영역 사이에 배열되는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  14. 제12항에 있어서, 신호 펩티드는 효과기 분자의 분비를 가능하게 하는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  15. 제12항에 있어서, 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 MCP-1의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, IL-6의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, Ang-2의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체, 및 Ang-1의 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 85%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 이의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  16. 제1항에 있어서, 세포 기능이 회복되는 세포 및/또는 치료 효과가 그 안에서 또는 그 상에서 발휘되는 세포는 내피 세포인, 재조합 핵산 구조물.
  17. 제16항에 있어서, 세포는 혈관 내피 세포인, 재조합 핵산 구조물.
  18. 제17항에 있어서, 혈관 내피 세포는 미세혈관 내피 세포인, 재조합 핵산 구조물.
  19. 제1항에 있어서, 세포 기능이 내피 세포의 항-투과성 효과, 항-혈관 누출 효과, 내피 세포의 항-아폽토시스 효과 또는 내피 세포의 항-염증 효과 또는 항-스트레스 반응 효과를 가진 효과기 분자에 의해 회복될 수 있는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  20. 제19항에 있어서, 효과는 TIE-2 신호전달 경로, VEGF-수용체 경로, NOTCH 신호전달 경로, PI3-키나제 경로, eNOS 신호전달 경로, 시르투인-의존적 대사 및 에너지 항상성 경로, 산화적 스트레스 경로, 전단 스트레스 반응 경로, ET-1 신호 전달 경로, NO-매개된 신호 전달 경로, 및 기계화학적 전달 경로와 연결되거나 이와 관련이 있는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  21. 제1항에 있어서, 구조물이 효과기 분자를 발현할 수 있고/있거나 이에 적합한 것인, 재조합 핵산 구조물.
  22. 제1항에 있어서, 재조합 핵산 구조물이 mRNA인, 재조합 핵산 구조물.
  23. 제1항에 있어서, 재조합 핵산 구조물이 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합으로 구성되는 것인, 재조합 핵산 구조물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 구조물을 포함하는 벡터.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 구조물 및/또는 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 구조물을 포함하는 벡터를 포함하는 세포.
  26. 하나 이상의 지질 및 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 구조물을 포함하는 전달 비히클로서, 상기 하나 이상의 지질 및 핵산 구조물은 전체 양이온 나노입자를 형성하는 것인, 전달 비히클.
  27. 제26항에 있어서, 나노입자의 평균 크기는 30 nm 내지 200 nm인, 전달 비히클.
  28. 제27항에 있어서, 나노입자의 평균 크기는 30 nm 내지 140 nm인, 전달 비히클.
  29. 제28항에 있어서, 나노입자의 평균 크기는 30 nm 내지 60 nm인, 전달 비히클.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 구조물 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는, 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물로서, 상기 질환은 패혈증, 폐렴, 외상, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 내독소혈증, 쇼크, 화상, 췌장염, 말라리아 트로피카 및 만성 알코올 남용으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  31. 벡터 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는, 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물로서, 상기 벡터는 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 구조물을 포함하고, 상기 질환은 패혈증, 폐렴, 외상, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 내독소혈증, 쇼크, 화상, 췌장염, 말라리아 트로피카 및 만성 알코올 남용으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  32. 전달 비히클 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는, 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물로서, 상기 전달 비히클은 하나 이상의 지질 및 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 구조물을 포함하고, 상기 하나 이상의 지질 및 핵산 구조물은 전체 양이온 나노입자를 형성하고, 상기 질환은 패혈증, 폐렴, 외상, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 내독소혈증, 쇼크, 화상, 췌장염, 말라리아 트로피카 및 만성 알코올 남용으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
KR1020217006630A 2018-08-10 2019-08-07 재조합 핵산 구조물 Active KR102811229B1 (ko)

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