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KR20220140537A - Cdkl5 결핍 장애를 치료하기 위한 유전자 요법 - Google Patents

Cdkl5 결핍 장애를 치료하기 위한 유전자 요법 Download PDF

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KR20220140537A
KR20220140537A KR1020227029963A KR20227029963A KR20220140537A KR 20220140537 A KR20220140537 A KR 20220140537A KR 1020227029963 A KR1020227029963 A KR 1020227029963A KR 20227029963 A KR20227029963 A KR 20227029963A KR 20220140537 A KR20220140537 A KR 20220140537A
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KR
South Korea
Prior art keywords
raav
sequence
promoter
ser
cdkl5
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020227029963A
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English (en)
Inventor
샤릴 린 파이피-마리시흐
매튜 스콧 풀러
마가렛 캐롤라인 라이트
로렐라이 이오아나 스토이카
스튜어트 크레이그
션 크리스토퍼 도허티
Original Assignee
울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드 filed Critical 울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 아데노-연관 바이러스 벡터, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 및 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하기 위한 유전자 요법에서의 그의 사용 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 rAAV 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 이들 제약 조성물은 CDKL 내의 돌연변이에 의해 유발된 CDD의 치료를 위한 유전자 요법에 유용할 수 있다.

Description

CDKL5 결핍 장애를 치료하기 위한 유전자 요법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 2월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/976,483; 및 2020년 10월 12일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/090,492를 우선권 주장하며, 이들 가출원의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 2월 8일에 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 ULP-007WO_SL.txt이고, 크기가 80,765 바이트이다.
발명의 기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터, 재조합 아데노-연관 바이러스 및 CDKL5 결핍 장애를 치료하기 위한 유전자 요법에서의 그의 사용 방법에 관한 것이다.
CDKL5 결핍 장애 (CDD)는 광범위한 임상 증상 및 중증도로 나타날 수 있는, CDKL5 유전자 내의 돌연변이에 의해 유발되는 희귀 신경발달 질환이다. CDD의 특징은 영아-발병 불응성 간질, 발달 지체, 지적 장애, 시각 장애, 실어증, 저긴장증, 운동 기능장애, 수면 장애, 위장 기능장애 및 호흡 곤란을 포함한다. 드물긴 하지만, 발생은 40,000 - 60,000명의 정상 출산 중 대략 1명인 것으로 여겨지며, 이는 유전적 간질의 가장 흔한 형태 중 하나를 만든다.
CDKL5 유전자는 정상 뇌 발생 및 기능에 필수적인 시클린-의존성 키나제-유사 5 (CDKL5) 단백질을 코딩한다. CDKL5 단백질은 뇌에서의 뉴런의 형성, 성장 및 이동에 관여한다. 이는 뇌에서, 우세하게는 뉴런 및 수상돌기에서 폭넓게 발현되며, 세포 증식, 뉴런 이동, 축삭 성장, 수지상 형태발생 및 시냅스 발생에서 역할을 한다.
CDD는 결실, 말단절단, 스플라이스 변이체 및 미스센스 돌연변이를 포함하는 CDKL5 유전자 내의 병원성 변이체에 의해 유발된다. 문헌 [Olson et al., 2019, Pediatric Neurology 97:18-25]을 참조한다. 이들 변이체는 뉴런에서 기능적 CDKL5 단백질의 양을 감소시키고/거나 그의 활성을 저하시킬 수 있다. CDKL5 유전자 내의 150개 초과의 돌연변이가 CDD를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Del Rosso et al., 2017, The EuroBiotech Journal 1(2): 122-127]을 참조한다.
지금까지, CDD의 기저 원인, 즉 CDKL5의 결핍을 다루는 치료는 없다. 현재, CDD 환자는 일반적으로 유의한 운동 및 지적 장애로 인해 24/7 관리를 필요로 한다. 추가로, CDD 환자가 경험하는 발작은 전형적으로 기존 항간질 약물로는 잘 제어되지 않는다. 따라서, 질환의 기저 원인 - 기능적 CDKL5의 결핍 - 을 다루는 치료 접근법이 시급히 필요하다.
본 발명은 CDD를 갖는 환자에 대한 기능적 CDKL5를 코딩하는 유전자의 전달을 매개하는 아데노-연관 바이러스 벡터의 생성을 통해 이러한 필요를 해결한다. 본 발명은 또한 CDD를 갖는 환자에게 기능적 CDKL5를 코딩하는 유전자를 전달하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 생성을 기재한다.
본 발명은 유전자 요법에서의 조성물 및 그의 사용 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, CDD의 치료에 유용한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)가 본원에 제공된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 프로모터 서열 및 (b) CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 것인 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 5'-역전된 말단 반복 서열 (5'-ITR) 서열; (b) 프로모터 서열; (c) CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열; 및 (d) 3'-역전된 말단 반복 서열 (3'-ITR) 서열을 포함하는 것인 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 5'-ITR 서열; (b) 프로모터 서열; (c) CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열; (d) 폴리아데닐화 신호 서열; 및 (e) 3'-ITR 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 5'-ITR 서열; (b) 인핸서 서열; (c) 프로모터 서열; (d) 인트론 서열; (e) CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열; (f) 폴리아데닐화 신호 서열; 및 (g) 3'-ITR 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다.
한 실시양태에서, CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열은 야생형 코딩 서열이다. 대안적 실시양태에서, CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열은 코돈-최적화된 코딩 서열이다. 하나의 예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 실시양태에서, CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 프로모터 서열 및 (b) 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 CDKL5에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다.
일부 실시양태에서, CDKL5는 서열식별번호: 1에 제시된 야생형 코딩 서열에 의해 코딩된다. 또 다른 실시양태에서, CDKL5의 변이체 또는 대안적 천연 이소형을 발현하는 코딩 서열, 예컨대 서열식별번호: 2에 제시된 코딩 서열이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, CDKL5는 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일한 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 예시적인 실시양태에서, CDKL5는 서열식별번호: 3-8로부터 선택된 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5는 서열식별번호: 3-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80% 동일한 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5는 서열식별번호: 3-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5는 서열식별번호: 3-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 3' 말단에 정지 코돈 (TGA, TAA 또는 TAG)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현된 CDKL5 단백질은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 발현된 CDKL5 단백질은 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 뉴런-특이적 프로모터이다. 한 실시양태에서, 뉴런-특이적 프로모터는 인간 시냅신 1 (SYN1) 프로모터, 마우스 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터, 래트 튜불린 알파 I (Ta1) 프로모터, 래트 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE) 프로모터, 인간 뉴런-특이적 엔올라제 (ENO2) 프로모터, 인간 혈소판-유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터, 인간 BM88 프로모터 및 뉴런 니코틴성 수용체 β2 (CHRNB2) 프로모터로부터 선택된다.
예시적인 실시양태에서, 뉴런-특이적 프로모터는 SYN1 프로모터 (예를 들어, 인간 SYN1 프로모터)이다. 한 실시양태에서, SYN1 프로모터 (예를 들어, 인간 SYN1 프로모터)는 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 유전자 프로모터, 트랜스티레틴 (TTR) 프로모터, 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터 및 알파-1 항-트립신 (A1AT) 프로모터로부터 선택된다.
예시적인 실시양태에서, 프로모터는 CBA 프로모터이다. 한 실시양태에서, CBA 프로모터는 서열식별번호: 13을 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 유전자-특이적 내인성 프로모터이다. 한 실시양태에서, 프로모터는 천연 유전자 프로모터 요소를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터는 서열식별번호: 14의 동일 길이 영역에 대해 적어도 95% 동일한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 패키징된 벡터 게놈은 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 5'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 비-AAV2 공급원으로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 패키징된 벡터 게놈은 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 서열 및 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호 서열로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이다. 한 실시양태에서, SV40 폴리아데닐화 신호 서열은 서열식별번호: 15를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 패키징된 벡터 게놈은 컨센서스 코작 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 컨센서스 코작 서열은 GCCGCCACC (서열식별번호: 16)이다. 특정 실시양태에서, 컨센서스 코작 서열은 CDKL5에 대한 코딩 서열의 상류에 위치한다.
일부 실시양태에서, 패키징된 벡터 게놈은 1종 이상의 인핸서 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인핸서는 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 유전자 인핸서, 트랜스티레틴 인핸서 (enTTR), 닭 β-액틴 (CBA) 인핸서, En34 인핸서 및 아포지단백질 E (ApoE) 인핸서로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 인핸서는 CMV 인핸서 (예를 들어, CMV 극초기 유전자 인핸서)이다. 한 실시양태에서, CMV 인핸서 (예를 들어, CMV 극초기 유전자 인핸서)는 서열식별번호: 17을 포함하거나 또는 그로 이루어진 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 인핸서는 프로모터 서열의 상류에 위치한다.
일부 실시양태에서, 패키징된 벡터 게놈은 1종 이상의 인트론 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인트론은 SV40 소형 T 인트론, 토끼 헤모글로빈 서브유닛 베타 (rHBB) 인트론, 인간 베타 글로빈 IVS2 인트론, β-글로빈/IgG 키메라 인트론 및 hFIX 인트론으로부터 선택된다. 하나의 예시적인 실시양태에서, 인트론은 SV40 소형 T 인트론이다. 한 실시양태에서, SV40 소형 T 인트론 서열은 서열식별번호: 18을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, rh10, hu37의 AAV (즉, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVhu37) 또는 그의 조작된 변이체로부터의 것이다. 예시적인 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV 혈청형 9 (AAV9) 캡시드, AAV9 변이체 캡시드, AAV 혈청형 8 (AAV8) 캡시드, AAV8 변이체 캡시드 또는 AAV 혈청형 hu37 (AAVhu37) 캡시드이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDKL5를 코딩하는 신규 코돈-최적화된 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, CDKL5를 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일하다. 일부 실시양태에서, CDKL5를 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 3-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일하고 서열식별번호: 3-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 3-8로부터 선택된 서열로부터 선택된 CDKL5를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 기능적 CDKL5 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열식별번호: 3-8에 제시된 핵산 서열의 단편이 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, CDKL5를 코딩하는 핵산 서열은 3' 말단에 정지 코돈 (TGA, TAA 또는 TAG)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDD의 치료에 유용한 신규 벡터 게놈 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 19-20으로부터 선택된 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일한 CDKL5를 코딩하는 벡터 게놈 구축물 (즉, 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 19에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 핵산 서열이 서열식별번호: 19를 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 20에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 핵산 서열이 서열식별번호: 20을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDD의 치료에서의 유전자 요법을 위한 작용제로서 유용한, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 본원에 기재된 바와 같은 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, rh10, hu37의 AAV (즉, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVhu37) 또는 그의 조작된 변이체로부터의 것이다. 예시적인 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV 혈청형 9 (AAV9) 캡시드, AAV9 변이체 캡시드, AAV 혈청형 8 (AAV8) 캡시드, AAV8 변이체 캡시드 또는 AAV 혈청형 hu37 (AAVhu37) 캡시드이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDKL5 결핍 장애 (CDD)의 치료에 유용한 rAAV이며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 프로모터 서열 및 (b) CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다. 일부 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDKL5 결핍 장애 (CDD)의 치료에 유용한 rAAV이며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 5'-ITR 서열; (b) 프로모터 서열; (c) 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 CDKL5에 대한 코딩 서열; (d) 폴리아데닐화 신호 서열; 및 (e) 3'-ITR 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDKL5 결핍 장애 (CDD)의 치료에 유용한 rAAV이며, 여기서 상기 rAAV는 AAV9 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 5'-ITR 서열; (b) 프로모터 서열; (c) 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 CDKL5에 대한 코딩 서열; (d) 폴리아데닐화 신호 서열; 및 (e) 3'-ITR 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDKL5 결핍 장애 (CDD)의 치료에 유용한 rAAV이며, 여기서 상기 rAAV는 AAV9 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV2 5'-ITR 서열; (b) SYN1 프로모터 서열 (예를 들어, 인간 SYN1 프로모터 서열); (c) 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 CDKL5에 대한 코딩 서열; (d) SV40 폴리아데닐화 신호 서열; 및 (e) AAV2 3'-ITR 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다. 예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDKL5 결핍 장애 (CDD)의 치료에 유용한 rAAV이며, 여기서 상기 rAAV는 AAV9 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 5'-ITR 서열; (b) 인핸서 서열; (c) 프로모터 서열; (d) 인트론 서열; (e) 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 CDKL5에 대한 코딩 서열; (f) 폴리아데닐화 신호 서열; 및 (g) 3'-ITR 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDKL5 결핍 장애 (CDD)의 치료에 유용한 rAAV이며, 여기서 상기 rAAV는 AAV9 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) AAV2 5'-ITR 서열; (b) CMV 인핸서 서열 (예를 들어, CMV 극초기 유전자 서열); (c) CBA 프로모터 서열; (d) SV40 소형 T 인트론 서열; (e) 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 CDKL5에 대한 코딩 서열; (f) SV40 폴리아데닐화 신호 서열; 및 (g) AAV2 3'-ITR 서열을 포함하는 것인 rAAV를 제공한다. 예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDD의 치료를 위한, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 본원에 개시된 rAAV의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 작동가능하게 연결된 성분으로서: 5'-ITR, 프로모터 서열, CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열 및 3'-ITR을 포함하는 패키징된 게놈을 함유한다. 일부 실시양태에서, 패키징된 게놈은 또한 하기 요소 중 적어도 1종을 포함한다: (a) 프로모터 서열의 상류의 인핸서 서열, (b) 프로모터의 하류의 인트론 및 (c) 3'-ITR의 상류의 폴리아데닐화 서열. 하나의 예시적인 실시양태에서, rAAV는 작동가능하게 연결된 성분으로서: AAV2 5'-ITR 서열, SYN1 프로모터 (예를 들어, 인간 SYN1 프로모터), CDKL5에 대한 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 신호 서열 및 AAV2 3'-ITR을 포함하는 패키징된 게놈을 함유한다. 일부 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다.
본 개시내용은 추가로 본원에 개시된 rAAV를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV를 포함하는 제약 조성물은 피하, 근육내, 피내, 복강내, 척수강내, 뇌실내 또는 정맥내 투여를 위해 제제화된다. 예시적인 실시양태에서, 제약 조성물은 척수강내 투여를 위해 제제화된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 적어도 1종의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDD를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 rAAV를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 벡터 게놈은 CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 것인, CDD를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 rAAV의 투여 전에 IgG-분해 프로테아제 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) IdeS 또는 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi) IdeZ)의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 IgG-분해 프로테아제를 투여받은 인간 대상체에서 치료 유효량의 본원에 개시된 적어도 1종의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 먼저 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여한 다음, 후속적으로 CNS 장애의 치료를 위해 설계된 적어도 1종의 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV는 척수강내로, 뇌실내로 또는 대수조내 전달을 통해 투여되는 것인, 인간 대상체에서 상기 CNS 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 대상체에게 치료 유효량의 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 프로모터 서열 및 CDKL5에 대한 코딩 서열을 포함하고, 여기서 인간 대상체는 코르티코스테로이드를 투여받은 것인, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 프레드니손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 부데소니드, 베타메타손 및 데플라자코르트로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론이다. 한 실시양태에서, CNS 장애는 CDD, 안젤만 증후군, 배튼병, 크라베병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 척수성 근육 위축 (SMA) 유형 I, II, III 및 IV, X-연관 근세관성 근병증, 프리드리히 운동실조, 카나반병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 부신백질이영양증, 헌팅톤병, 레트 증후군 및 척수소뇌성 운동실조로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, CNS 장애는 CDD이고, rAAV는 본원에 기재된 CDD의 치료에 유용한 rAAV를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDKL5 내 적어도 1종의 돌연변이를 갖는 것으로 진단된 인간 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 적어도 1종의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDD를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 rAAV를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 벡터 게놈은 CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 것인, CDKL5 내 적어도 1종의 돌연변이를 갖는 것으로 진단된 인간 대상체에서 CDD를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1-8로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다.
일부 실시양태에서, rAAV는 피하로, 근육내로, 피내로, 복강내로, 척수강내로, 뇌실내로, 정맥내로 또는 대수조내 전달을 통해 투여된다. 예시적인 실시양태에서, rAAV는 척수강내로 투여된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, rAAV는 대수조를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여된다. 추가 실시양태에서, rAAV는 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1013 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단일 용량의 rAAV가 투여된다. 다른 실시양태에서, 다중 용량의 rAAV가 투여된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 재조합 핵산 분자, AAV 벡터 또는 rAAV를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 구체적 실시양태에서, 숙주 세포는 AAV의 증식에 적합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 HeLa, Cos-7, HEK293, A549, BHK, Vero, RD, HT-1080, ARPE-19 및 MRC-5 세포로부터 선택된다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 특색은 본 개시내용의 하기 섹션에 기재된다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 보다 완전히 이해될 수 있다.
도 1은 SYN 프로모터의 제어 하의 CDKL5에 대한 코딩 서열을 포함하는 제1의 예시적인 패키징된 벡터 게놈 구축물을 보여주는 예시적 다이어그램이다. 도면에 사용된 약어: ITR- 역전된 말단 반복부; hSyn- 인간 시냅신 1 프로모터; SV40 폴리(A) 신호- SV40 폴리아데닐화 신호.
도 2는 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터의 제어 하의 CDKL5에 대한 코딩 서열을 포함하는 제2의 예시적인 패키징된 벡터 게놈 구축물을 보여주는 예시적 다이어그램이다. 도면에 사용된 약어: ITR- 역전된 말단 반복부; CMV- 시토메갈로바이러스; SV40 폴리(A) 신호- SV40 폴리아데닐화 신호.
도 3은 뉴로2a(Neuro2a) 세포를 플라스미드 DNA로 형질감염시킨 후 인간 CDKL5가 과다발현되는 경우에 포스포-EB2 (pEB2) 수준의 변화를 보여주는 영상이다. CDKL5의 하류 표적인 EB2는 인간 CDKL5가 이들 세포에서 과다발현되는 경우에 증가된 인산화를 나타낸다. 좌측 2개의 패널은 비처리 세포를 나타낸다. 우측 2개의 패널은 CBA 프로모터의 제어 하의 인간 CDKL5로 형질감염된 세포를 나타낸다.
도 4는 rAAV9-CBA-eGFP (좌측 패널) 또는 rAAV9-SYN-eGFP (우측 패널)가 뇌실내로 투여된 CDKL5-결핍 마우스에서의 증진된 녹색 형광 단백질 (eGFP)의 분포를 보여주는 영상이다. 벡터 둘 다는 해마 및 선조체 영역에서 높은 eGFP 수준을 생성하고, 피질 및 소뇌에서 보다 낮은 수의 eGFP-양성 세포를 생성하였다.
도 5는 CBA 및 SYN 프로모터와 함께 내인성 CDKL5 프로모터를 사용한 뉴로2a 세포에서의 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 hCDKL5 플라스미드의 발현을 보여주는 영상이다. 내인성 CDKL5 프로모터는 이들 세포에서 CBA 및 SYN 프로모터의 중간 수준으로 hCDKL5의 발현을 구동한다. 영상은 하기와 같이 좌측에서 우측으로 제시된다 (상단 4개의 패널): 비형질감염, CBA-GFP로 형질감염, SYN-GFP로 형질감염 및 내인성 CDKL5 프로모터 및 eGFP (엔도(Endo)-eGFP)로 형질감염. 하단 4개의 패널과 관련하여, 영상은 하기와 같이 좌측에서 우측으로 제시된다: 비형질감염, CBA-hCDKL5로 형질감염, SYN-hCDKL5로 형질감염 및 내인성 CDKL5 프로모터 및 hCDKL5 (엔도-hCDKL5)로 형질감염.
도 6a 패널은 rAAV9-CBA-hCDKL5 (도 6a의 좌측 패널 영상) 또는 rAAV9-SYN-hCDKL5 (도 6a의 우측 패널 영상)가 뇌실내 경로를 통해 투여된 CDKL5-결핍 마우스에서의 형광 RNA스코프(RNAScope)에 의해 검출된 바와 같은 hCDKL5 mRNA의 분포를 보여주는 영상이다. 도 6b 패널은 rAAV9-CBA-hCDKL5 (정사각형 5 및 6) 또는 rAAV9-SYN-hCDKL5 (정사각형 7 및 8)가 뇌실내 경로를 통해 투여된 CDKL5-결핍 마우스에서의 형광 RNA스코프에 의해 검출된 바와 같은 hCDKL5 mRNA의 분포를 보여주는 RNA스코프 계내 혼성화로부터의 대표적인 영상이다. 비히클이 뇌실내 경로를 통해 투여된 CDKL5 녹아웃 (KO) 마우스는 정사각형 3 및 4에 제시된다. 어떠한 비히클 또는 어느 하나의 벡터도 투여되지 않은 (나이브) CDKL5 야생형 (WT) 마우스는 정사각형 1 및 2에 제시된다.
도 7은 rAAV9-SYN-hCDKL5 또는 rAAV9-CBA-hCDKL5 (1.6e12 벡터 게놈 (vg))의 단일 뇌실내 주사가 투여된지 2주 후에 Cdkl5 녹아웃 마우스의 전두 피질로부터 단리된 CDKL5 단백질 및 인산화 EB2 (pEB2)의 수준을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 처리된 마우스는 비히클 처리된 대조군과 비교하여 CDKL5의 증가된 수준을 나타낸다. CDKL5 하류 표적인 EB2의 인산화는 CDKL5가 기능적 키나제로서 작용한다는 것을 확인시켜 준다.
도 8은 rAAV9-CBA-eGFP (CBA-eGFP) 또는 rAAV9-SYN-eGFP (SYN-eGFP)가 요추 척수강내 주사에 의해 투여된지 2주 후에 비-인간 영장류 (NHP) 대상체로부터의 CNS 및 말초 조직에서의 조직 DNA μg당 벡터 게놈의 카피수의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다. 벡터 둘 다는 조직당 유사한 양의 벡터 게놈을 생성하였다. 각각의 막대 세트에서, CBA-eGFP는 좌측 막대 (또는 수질의 경우, 중간 막대)로서 제시된 반면 SYN-eGFP는 우측 막대로서 제시된다.
도 9는 rAAV9-CBA-eGFP (좌측 3 패널) 또는 rAAV9-SYN-eGFP (우측 3 패널)가 요추 척수강내 주사에 의해 투여된지 2주 후에 NHP 대상체로부터의 eGFP에 대해 면역염색된 뇌 조직으로부터의 대표적인 명시야 현미경검사 영상을 보여주는 영상이다. rAAV9-CBA-eGFP가 투여된 대상체로부터의 eGFP-양성 세포는 성상세포/신경교 세포 형태를 가진 반면 (하단 좌측 패널), rAAV9-SYN-eGFP가 투여된 대상체로부터의 eGFP-양성 세포는 뉴런 형태를 가졌다 (하단 우측 패널).
도 10a-10c는 투여 대략 3개월 후에 웨스턴 블롯을 사용하여 CDKL5-결핍 마우스 뇌의 상이한 영역 (전두 피질: 도 10a; 해마: 도 10b; 및 뇌간: 도 10c)에서 정량화된 CDKL5의 양을 디스플레이하는 그래프를 보여준다. 처리된 마우스의 뇌에 걸친 인간 CDKL5 단백질의 중간 정도의 장기-지속 증가 (전두 피질 및 뇌간에서는 WT 수준의 20-30%, 해마에서는 35-70%)가 투여 3개월 후에 관찰되었다.
도 11a-11d는 rAAV9-SYN-hCDKL5 처리된 마우스 (SYN-hCDKL5)가 비히클 처리된 (CDD-PBS) 대조군 한배새끼와 비교하여 학습, 기억 및 운동 기능 과제를 더 우수하게 수행한다는 것을 입증하는 그래프를 보여준다. 불안-유사 행동 (도 11a), 운동 기능 (도 11b), 협응 (도 11c)의 개선, 뿐만 아니라 학습 및 기억의 정상화 (도 11d)가 관찰되었다.
도 12는 트렌델렌버그 자세에 주어진 rAAV9-SYN-eGFP의 8.06 x 1013 벡터 게놈 (vg)의 척수강내 (IT) 전달 (UX055-18-0001) 또는 7.76 x 1013 vg의 대수조내 (CM) 전달 (UX055-19-0002) 2주 후 1-2세의 암컷 비-인간 영장류 (NHP)의 CNS 내 DNA μg당 게놈 카피 (GC)를 예시하는 막대 그래프이다. 그래프는 대수조내 전달이 NHP CNS 내 두정엽 (10X), 선조체 (10X) 및 시상 (8X)을 포함한 다양한 뇌 조직에서 증가된 수의 벡터 게놈을 생성한다는 것을 예시한다. 이 그래프에 제시된 데이터는 2개의 독립적 연구의 일부로서 수집되었다.
도 13a는 제-4일 내지 제28일에 1 mg/kg 프레드니솔론의 투여 (경구 위관영양에 의함)와 함께 및 그 없이 트렌델렌버그 자세에 주어진 rAAV9-SYN-CDKL5의 7.92 x 1013 vg의 대수조내 (CM) 전달 (UX055-19-003) 4주 후 1세의 암컷 비-인간 영장류 (NHP)의 CNS 내 DNA μg당 게놈 카피 (GC)를 예시하는 막대 그래프이다. 그래프는 프레드니솔론 투여된 NHP의 다양한 뇌 조직에서 증가된 수의 벡터 게놈 (qPCR에 의해 측정됨)이 존재하였다는 것, 예컨대 선조체 (20X), 해마 (5X), 수질 (6X) 및 소뇌 (5X)에서의 증가를 예시한다. 도 13b는 벡터에 대한 프로브로 베이스스코프(BaseScope) 분석 (계내 혼성화)을 사용하여 조사된 동일한 NHP로부터의 후두 피질 및 소뇌를 함유하는 뇌의 큰 절편을 보여준다. 패널 1 및 3은 프레드니솔론이 투여되지 않은 NHP로부터의 절편을 나타내는 반면, 패널 2 및 4는 프레드니솔론이 투여된 NHP로부터의 절편을 나타낸다. 각각의 NHP에 대해 1개의 절반 관상 절편 전체로부터 적어도 1개의 벡터 게놈을 갖는 세포의 수를 계수하고, 가시화를 돕기 위해 각각의 양성 세포를 표시하는 화살표를 영상에 부가하였다. 도 13c는 프레드니솔론으로 처리되지 않은 경우와 비교하여 프레드니솔론으로 처리된 NHP에서 적어도 1개의 벡터 게놈을 함유하는 세포의 수를 보여주는 그래프이다. 종합하면, 프레드니솔론으로 처리되지 않은 경우와 비교하여 프레드니솔론으로 처리된 NHP에서 적어도 1개의 벡터 게놈을 함유하는 세포의 수가 증가하는 경향이 있었지만, 유의한 동물 대 동물 가변성이 존재하였다. 매우 높은 수의 벡터 게놈 양성 세포를 갖는 1개의 이상치 NHP가 비 프레드니솔론 군에서 주목되었다.
본 발명은 치료 용도에 사용될 다양한 신규 작용제 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 벡터, 재조합 바이러스 및 연관 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 호전, 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 기술 용어는 통상적인 용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 통상의 용어의 정의는 문헌 [Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 찾아볼 수 있다.
본 개시내용의 다양한 실시양태의 검토를 용이하게 하기 위해, 하기 구체적 용어의 설명이 제공된다:
아데노-연관 바이러스 (AAV): 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 소형의 복제-결손, 비-외피보유 바이러스. AAV는 질환을 유발하는 것으로 공지되어 있지 않고, 매우 약한 면역 반응을 이끌어낸다. AAV를 이용하는 유전자 요법 벡터는 분열 및 정지 세포 둘 다를 감염시킬 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않으면서 염색체외 상태로 지속될 수 있다. 이들 특색은 AAV를 유전자 요법을 위한 매력적인 바이러스 벡터로 만든다. 현재 12종의 AAV 혈청형 (AAV1 - 12)이 인정된다.
투여/투여하다: 임의의 효과적인 경로에 의해 작용제, 예컨대 치료제 (예를 들어, 재조합 AAV)를 대상체에게 제공하거나 주는 것. 예시적인 투여 경로는 주사 (예컨대 피하, 근육내, 피내, 복강내, 척수강내, 뇌실내 또는 정맥내 투여), 경구, 관내, 설하, 직장, 경피, 비강내, 질 및 흡입 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
코딩 서열: "코딩 서열"은 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 경우에 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코딩 서열은 코딩 영역 전후의 영역, 예를 들어 5' 비번역 (5' UTR) 및 3' 비번역 (3' UTR) 서열, 뿐만 아니라 개별 코딩 절편 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
코돈-최적화된: "코돈-최적화된" 핵산은 코돈이 특정한 시스템 (예컨대 특정한 종 또는 종의 군)에서의 발현에 최적이도록 변경된 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열은 포유동물 세포 또는 특정한 포유동물 종 (예컨대 인간 세포)에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다.
인핸서: 프로모터의 활성을 증가시킴으로써 전사 속도를 증가시키는 핵산 서열.
인트론: 단백질에 대한 코딩 정보를 함유하지 않는 유전자 내의 DNA의 스트레치. 인트론은 메신저 RNA의 번역 전에 제거된다.
역전된 말단 반복부 (ITR): 효율적인 복제에 요구되는 아데노-연관 바이러스의 게놈 내의 대칭 핵산 서열. ITR 서열은 AAV DNA 게놈의 각각의 말단에 위치한다. ITR은 바이러스 DNA 합성을 위한 복제 기점으로서의 역할을 하고, AAV 통합 벡터를 생성하기 위한 필수 시스 성분이다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 분자, 단백질, 바이러스 또는 세포)은 유기체의 세포 또는 조직 내의 다른 생물학적 성분, 또는 성분이 자연 발생하는 유기체 자체, 예컨대 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포로부터 실질적으로 분리 또는 정제되었다. "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 분자 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다.
작동가능하게 연결된: 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우에 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
제약상 허용되는 담체: 본 개시내용에 유용한 제약상 허용되는 담체 (비히클)는 통상적이다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th Edition (1975)]은 1종 이상의 치료 화합물, 분자 또는 작용제의 제약 전달에 적합한 조성물 및 제제를 기재한다.
일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정한 투여 방식에 좌우될 것이다. 예를 들어, 비경구 제제는 통상적으로 제약상 및 생리학상 허용되는 유체, 예컨대 물, 생리 염수, 평형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등을 비히클로서 포함하는 주사가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물, 예를 들어 분말, 환제, 정제 또는 캡슐 형태의 경우, 통상적인 비-독성 고체 담체는, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 스테아르산마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학상-중성인 담체에 추가로, 투여될 제약 조성물은 미량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 및 pH 완충제 등, 예를 들어 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
질환을 예방, 치료 또는 호전시키는 것: 질환 (예컨대 CDD)을 "예방하는 것"은 질환의 완전한 발생을 억제하는 것을 지칭한다. "치료하는 것"은 질환 또는 병리학적 상태 (예컨대 CDD)가 발생하기 시작한 후에 그의 징후 또는 증상을 호전시키는 치료적 개입을 지칭한다. "호전시키는 것"은 질환 (예컨대 CDD)의 징후 또는 증상의 수 또는 중증도의 감소를 지칭한다.
프로모터: 핵산 (예를 들어, 유전자)의 전사를 지시/개시하는 DNA의 영역. 프로모터는 전사 개시 부위 근처의 필요한 핵산 서열을 포함한다. 많은 프로모터 서열이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 심지어 인공 핵산 분자 내의 상이한 프로모터 서열의 조합도 가능하다. 본원에 사용된 유전자-특이적 내인성 프로모터는 관심 내인성 유전자의 발현을 조절하는 천연 프로모터 요소를 지칭한다. 한 실시양태에서, CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터는 CDKL5 유전자의 발현을 조절한다.
정제된: 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하는 것이 아니라; 오히려, 이는 상대 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어 정제된 펩티드, 단백질, 바이러스 또는 다른 활성 화합물은 자연적으로 회합된 단백질 및 다른 오염물로부터 전체적으로 또는 부분적으로 단리된 것이다. 특정 실시양태에서, 용어 "실질적으로 정제된"은 세포, 세포 배양 배지 또는 다른 조 제제로부터 단리되고 분획화에 적용되어 초기 제제의 다양한 성분, 예컨대 단백질, 세포 파편 및 다른 성분이 제거된 펩티드, 단백질, 바이러스 또는 다른 활성 화합물을 지칭한다.
재조합: 재조합 핵산 분자는 자연 발생이 아닌 서열을 갖거나 또는 서열의 2개의 달리 분리된 절편의 인공 조합에 의해 제조된 서열을 갖는 것이다. 이러한 인공 조합은 화학적 합성에 의해 또는 핵산 분자의 단리된 절편의 인공 조작에 의해, 예컨대 유전자 조작 기술에 의해 달성될 수 있다.
유사하게, 재조합 바이러스는 비-자연 발생이거나 또는 상이한 기원의 적어도 2개의 서열의 인공 조합에 의해 제조된 서열 (예컨대 게놈 서열)을 포함하는 바이러스이다. 용어 "재조합"은 또한 천연 핵산 분자, 단백질 또는 바이러스의 부분의 부가, 치환 또는 결실에 의해서만 변경된 핵산, 단백질 및 바이러스를 포함한다. 본원에 사용된 "재조합 AAV"는 재조합 핵산 분자, 예컨대 CDKL5를 코딩하는 재조합 핵산 분자가 패키징된 AAV 입자를 지칭한다.
서열 동일성: 2개 이상의 핵산 서열 또는 2개 이상의 아미노산 서열 사이의 동일성 또는 유사성은 서열 사이의 동일성 또는 유사성의 관점에서 표현된다. 서열 동일성은 백분율 동일성의 관점에서 측정될 수 있으며; 백분율이 높을수록, 서열은 더 동일하다. 서열 유사성은 백분율 유사성 (보존적 아미노산 치환을 고려함)의 관점에서 측정될 수 있으며; 백분율이 높을수록, 서열은 더 유사하다. 핵산 또는 아미노산 서열의 상동체 또는 오르토로그는 표준 방법을 사용하여 정렬 시 비교적 높은 정도의 서열 동일성/유사성을 갖는다. 이러한 상동성은 오르토로고스 단백질 또는 cDNA가 보다 멀리 관련된 종 (예컨대 인간 및 씨. 엘레간스(C. elegans) 서열)과 비교하여 보다 밀접하게 관련된 종 (예컨대 인간 및 마우스 서열)으로부터 유래된 경우에 더 유의하다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970: Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992: 및 Pearson et al., Meth. Mol. Rio. 24:307-31, 1994]에 기재되어 있다. 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]은 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항을 제시한다.
서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련하여 사용하기 위한 NCBI 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)은 국립 생물 정보 센터 (NCBI) 및 인터넷을 포함한 여러 공급원으로부터 이용가능하다. 추가의 정보는 NCBI 웹 사이트에서 찾아볼 수 있다.
혈청형: 특징적인 항원 세트에 의해 구별되는 밀접하게 관련된 미생물 (예컨대 바이러스)의 군.
스터퍼 서열: 2개의 핵산 특징부 사이에 (예컨대 프로모터와 코딩 서열 사이에) 목적하는 간격을 생성하거나 또는 핵산 분자가 목적하는 길이를 갖도록 이를 연장시키는 데 전형적으로 사용되는, 보다 큰 핵산 분자 (예컨대 벡터) 내에 함유된 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 스터퍼 서열은 단백질 코딩 정보를 함유하지 않고, 미지의/합성 기원일 수 있고/거나 보다 큰 핵산 분자 내의 다른 핵산 서열과 관련되지 않을 수 있다.
대상체: 인간 및 비-인간 포유동물을 포함하는 카테고리인 살아있는 다세포 척추동물 유기체. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 한 실시양태에서, 인간 대상체는 성인 대상체, 즉 18세 초과의 인간 대상체이다. 한 실시양태에서, 인간 대상체는 소아 대상체, 즉 0-18세의 인간 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 코르티코스테로이드를 투여받았다. 일부 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 IgG-분해 프로테아제를 투여받았다. 일부 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 코르티코스테로이드를 투여받았고, 또한 IgG-분해 프로테아제를 투여받았다.
합성: 실험실에서 인공 수단에 의해 생산되며, 예를 들어 합성 핵산은 실험실에서 화학적으로 합성될 수 있다.
비번역 영역 (UTR): 전형적 mRNA는 코딩 영역의 상류 및 하류에 각각 5' 비번역 영역 (5' UTR) 및 3' 비번역 영역 (3' UTR)을 함유한다 (문헌 [Mignone F. et al., (2002) Genome Biol 3:REVIEWS0004] 참조).
치료 유효량: 명시된 약제 또는 치료제 (예를 들어, 재조합 AAV)로 치료될 대상체 또는 세포에서 목적하는 효과를 달성하기에 충분한 상기 작용제의 양. 작용제의 유효량은 치료될 대상체 또는 세포 및 치료 조성물의 투여 방식을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 인자에 좌우될 것이다.
벡터: 벡터는 숙주 세포에서 복제 및/또는 통합되는 벡터의 능력을 파괴하지 않으면서 외래 핵산의 삽입을 허용하는 핵산 분자이다. 벡터는 숙주 세포에서 벡터가 복제되도록 하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 1종 이상의 선택 마커 유전자 및 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 삽입된 유전자 또는 유전자들의 전사 및 번역을 허용하는 필요한 조절 서열을 함유하는 벡터이다. 본원의 일부 실시양태에서, 벡터는 AAV 벡터이다.
달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. "A 또는 B를 포함하는"은 A 또는 B 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 근사치이고, 설명을 위해 제공되는 것으로 추가로 이해될 것이다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 용어의 설명을 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
재조합 AAV (rAAV):
본 발명은 유전자 요법에서의 조성물 및 그의 사용 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, CDD의 치료에 유용한, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)가 본원에 제공된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 프로모터 서열 및 (b) CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 것인 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 코딩 서열은 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 패키징된 벡터 게놈은 본원에 기재된 바와 같은 5'-ITR 서열, 인핸서, 인트론, 컨센서스 코작 서열, 폴리아데닐화 신호 및/또는 3'-ITR 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 1종 이상의 스터퍼 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 스터퍼 핵산 서열은 인트론과 CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열 사이에 위치한다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, rAAV는 AAV 캡시드를 포함한다. AAV 캡시드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, rh10, hu37의 AAV (즉, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVhu37), 뿐만 아니라 인간 및 비인간 영장류 조직으로부터 단리된 100종 초과의 변이체 중 어느 하나로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Choi et al., 2005, Curr Gene Ther. 5:299-310, 2005 및 Gao et al., 2005, Curr Gene Ther. 5:285-297]을 참조한다.
상기 언급된 캡시드 이외에, 또한 1종 이상의 유익한 치료 특성 (예를 들어, 선택 조직에 대한 개선된 표적화, 면역 반응을 피하는 증가된 능력, 중화 항체의 감소된 자극 등)을 보유하도록 조작된 변이체 AAV 캡시드가 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이러한 조작된 변이체 캡시드의 비제한적 예는 미국 특허 번호 9,506,083, 9,585,971, 9,587,282, 9,611,302, 9,725,485, 9,856,539, 9,909,142, 9,920,097, 10,011,640, 10,081,659, 10,179,176, 10,202,657, 10,214,566, 10,214,785, 10,266,845, 10,294,281, 10,301,648, 10,385,320 및 10,392,632 및 PCT 공개 번호 WO/2017/165859, WO/2018/022905, WO/2018/156654, WO/2018/222503 및 WO/2018/226602에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 본 발명에 따라 투여되는 rAAV는 AAV9 캡시드를 포함한다. AAV9 캡시드는 다중 AAV9 vp 단백질로 구성된 자기-조립된 AAV 캡시드이다. AAV9 vp 단백질은 전형적으로 서열식별번호: 22의 vp1 아미노산 서열 (진뱅크(GenBank) 수탁번호: AAS99264)을 코딩하는, 서열식별번호: 21의 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열에 의해 코딩된 대안적 스플라이스 변이체로서 발현된다. 이들 스플라이스 변이체는 서열식별번호: 22의 상이한 길이의 단백질을 생성한다. 본원에 사용된 AAV9 변이체는, 예를 들어 WO/2016/049230, 미국 특허 번호 8,927,514, 미국 특허 공개 번호 2015/0344911 및 미국 특허 번호 8,734,809에 기재된 것을 포함한다.
본원에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 투여되는 rAAV는 일부 실시양태에서 AAV9 캡시드를 포함할 수 있다. 그러나, 다른 실시양태에서, 또 다른 AAV 캡시드가 선택된다. 조직 특이성은 캡시드 유형에 의해 결정된다. 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVrh64R1, AAVrh64R2, AAVrh8을 포함한, 적합한 표적 (예를 들어, 간, 근육, 폐 또는 CNS)에 형질도입하는 AAV 혈청형이 AAV 바이러스 벡터의 캡시드에 대한 공급원으로서 선택될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2007/0036760; 미국 특허 공개 번호 2009/0197338; 및 EP1310571을 참조한다. 또한, WO 2003/042397 (AAV7 및 다른 원숭이 AAV), 미국 특허 번호 7282199 및 7790449 (AAV8)를 참조한다. 추가로, 아직 발견되지 않은 AAV 또는 이에 기초한 재조합 AAV가 AAV 캡시드에 대한 공급원으로서 사용될 수 있다. 이들 문헌은 또한 AAV를 생성하기 위해 선택될 수 있는 다른 AAV를 기재하고, 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터에 사용하기 위한 AAV 캡시드는 상기 언급된 AAV 캡시드 중 하나 또는 그의 코딩 핵산의 돌연변이유발 (즉, 삽입, 결실 또는 치환)에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 상기 언급된 AAV 캡시드 단백질 중 2 또는 3 또는 4종 또는 그 초과로부터의 도메인을 포함하는 키메라이다. 일부 실시양태에서, AAV 캡시드는 2 또는 3종의 상이한 AAV 또는 재조합 AAV로부터의 Vp1, Vp2 및 Vp3 단량체의 모자이크이다. 일부 실시양태에서, rAAV 조성물은 상기 언급된 캡시드 중 1종 초과를 포함한다.
역전된 말단 반복부 (ITR):
일부 실시양태에서, rAAV는 AAV ITR 서열을 포함하는 패키징된 벡터 게놈을 포함하며, 이는 AAV 및 아데노바이러스 헬퍼 기능이 트랜스로 제공되는 경우에, 벡터 DNA 복제 기점 및 벡터 게놈의 패키징 신호 둘 다로서 기능한다. 추가적으로, ITR은 대형 Rep 단백질에 의한 단일-가닥 핵내 닉킹을 위한 표적으로서의 역할을 하여, 복제 중간체로부터 개별 게놈을 분리한다.
일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이고, 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 비-AAV2 공급원으로부터의 것이다.
프로모터:
본원에 기재된 다양한 측면에서, rAAV는 CDKL5 발현을 구동 및 조절하는 것을 돕는 프로모터 서열을 포함하는 패키징된 벡터 게놈을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 5'-ITR 서열과 CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 인핸서 서열의 하류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 인트론 서열의 상류에 위치한다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 뉴런-특이적 프로모터이다. 한 실시양태에서, 뉴런-특이적 프로모터는 인간 시냅신 1 (SYN1) 프로모터, 마우스 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터, 래트 튜불린 알파 I (Ta1) 프로모터, 래트 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE) 프로모터, 인간 뉴런-특이적 엔올라제 (ENO2) 프로모터, 인간 혈소판-유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터, 인간 BM88 프로모터 및 뉴런 니코틴성 수용체 β2 (CHRNB2) 프로모터로부터 선택된다.
예시적인 실시양태에서, 뉴런-특이적 프로모터는 SYN1 프로모터 (예를 들어, 인간 SYN1 프로모터)이다. 한 실시양태에서, SYN1 프로모터 (예를 들어, 인간 SYN1 프로모터)는 서열식별번호: 12에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일하다. 예시적인 실시양태에서, SYN1 프로모터 (예를 들어, 인간 SYN1 프로모터)는 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 유전자 프로모터, 트랜스티레틴 (TTR) 프로모터, 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터 및 알파-1 항-트립신 (A1AT) 프로모터로부터 선택된다.
예시적인 실시양태에서, 프로모터는 CBA 프로모터이다. 한 실시양태에서, CBA 프로모터는 서열식별번호: 13을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 유전자-특이적 내인성 프로모터이다. 한 실시양태에서, 프로모터는 천연 유전자 프로모터 요소를 포함한다. 일부 예시적 실시양태에서, 본원에 기재된 패키징된 게놈은 서열식별번호: 14의 동일 길이 영역에 대해 적어도 95% 동일한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 패키징된 게놈은 서열식별번호: 14의 동일 길이 영역에 대해 적어도 95% 동일한 적어도 약 15개 (예를 들어, 약 30, 약 45, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 약 300, 약 325, 약 350, 약 375, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 525, 약 550, 약 575, 약 600, 약 625, 약 650, 약 675, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400 또는 약 1500개)의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터를 포함한다. 일부 예시적 실시양태에서, 본원에 기재된 패키징된 게놈은 서열식별번호: 14의 동일 길이 영역에 대해 100% 동일한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터를 포함한다.
다른 벡터 요소:
CDKL5에 대한 프로모터 및 코딩 서열에 추가로, 패키징된 게놈은 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열 및 효율적인 RNA 프로세싱 신호를 함유할 수 있다. 하기에 추가로 상세하게 기재된 바와 같이, 이러한 서열은 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (폴리 A) 신호, 발현을 증진시키는 조절 요소, 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 번역 효율을 증진시키는 서열 (즉, 코작 컨센서스 서열) 및 단백질 안정성을 증진시키는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, rAAV는 1종 이상의 인핸서 서열을 포함하는 패키징된 벡터 게놈을 함유한다. 한 실시양태에서, 인핸서는 시토메갈로바이러스 극초기 유전자 (CMV) 인핸서, 트랜스티레틴 인핸서 (enTTR), 닭 β-액틴 (CBA) 인핸서, En34 인핸서 및 ApoE 인핸서로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 인핸서는 CMV 인핸서 (예를 들어, CMV 극초기 유전자 인핸서)이다. 한 실시양태에서, CMV 인핸서 (예를 들어, CMV 극초기 유전자 인핸서)는 서열식별번호: 17을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, rAAV는 1종 이상의 인트론 서열을 포함하는 패키징된 벡터 게놈을 함유한다. 한 실시양태에서, 인트론은 SV40 소형 T 인트론, 토끼 헤모글로빈 서브유닛 베타 (rHBB) 인트론, 인간 베타 글로빈 IVS2 인트론, β-글로빈/IgG 키메라 인트론 및 hFIX 인트론으로부터 선택된다. 하나의 예시적인 실시양태에서, 인트론은 SV40 소형 T 인트론이다. 한 실시양태에서, SV40 소형 T 인트론 서열은 서열식별번호: 18을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, rAAV는 컨센서스 코작 서열을 포함하는 패키징된 벡터 게놈을 함유한다. 일부 실시양태에서, 컨센서스 코작 서열은 인트론 서열의 하류에 위치한다. 한 실시양태에서, 컨센서스 코작 서열은 GCCGCCACC (서열식별번호: 16)이다.
일부 실시양태에서, rAAV는 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 패키징된 벡터 게놈을 함유한다. 한 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 서열, SV40 폴리아데닐화 신호 서열, 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호 서열 및 CDKL5 유전자-특이적 내인성 폴리아데닐화 신호 서열로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호 서열은 SV40 폴리아데닐화 신호 서열이다. 한 실시양태에서, SV40 폴리아데닐화 신호 서열은 서열식별번호: 15를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
CDKL5 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드:
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 측면들은 프로모터 서열 및 CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 패키징된 게놈을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
한 실시양태에서, CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열은 야생형 코딩 서열이다. 본원에 사용된 용어 "야생형"은 자연에 존재하는 생체중합체 (예를 들어, 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열)와 동일한 생체중합체 (예를 들어, 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열)를 지칭한다.
대안적 실시양태에서, CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열은 코돈-최적화된 코딩 서열이다. 한 실시양태에서, CDKL5에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열을 포함하는 패키징된 게놈을 함유하는 벡터가 제공된다. 본원에 기재된 벡터와 함께 전달되는 폴리펩티드는 인간을 포함한 포유동물의 치료에 유용할 수 있는 CDKL5 폴리펩티드를 포괄한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터로 발현된 폴리펩티드는 CDKL5 이소형 2 (서열식별번호: 9, 진뱅크 수탁 번호 NP_001310218.1, 960개 아미노산) 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터로 발현된 폴리펩티드는 CDKL5 이소형 2이고, 서열식별번호: 9를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 한 실시양태에서, CDKL5 이소형 2 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 제시된 야생형 코딩 서열에 의해 코딩된다. 대안적 실시양태에서, CDKL5 이소형 2 폴리펩티드는 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 2 폴리펩티드는 서열식별번호: 1에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일한 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 예시적인 실시양태에서, CDKL5 이소형 2 폴리펩티드는 서열식별번호: 3-5로부터 선택된 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 2에 대한 코딩 서열은 3' 말단에 정지 코돈 (TGA, TAA 또는 TAG)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터로 발현된 폴리펩티드는 CDKL5 이소형 1 (서열식별번호: 10, 진뱅크 수탁 번호 NP_001032420.1, 1030개 아미노산) 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 벡터로 발현된 폴리펩티드는 CDKL5 이소형 1이고, 서열식별번호: 10을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 한 실시양태에서, CDKL5 이소형 1 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에 제시된 야생형 코딩 서열에 의해 코딩된다. 대안적 실시양태에서, CDKL5 이소형 1 폴리펩티드는 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 1 폴리펩티드는 서열식별번호: 2에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일한 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 예시적인 실시양태에서, CDKL5 이소형 1 폴리펩티드는 서열식별번호: 6-8로부터 선택된 코돈-최적화된 코딩 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 1에 대한 코딩 서열은 3' 말단에 정지 코돈 (TGA, TAA 또는 TAG)을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 CDKL5 폴리펩티드의 단편, 변이체, 이소형 또는 융합체를 전달하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 550 또는 적어도 600개의 아미노산 잔기를 포함하고 전장 폴리펩티드와 연관된 1종 이상의 활성 (예를 들어, CDKL5의 경우 키나제 활성)을 보유하는 CDKL5 폴리펩티드의 단편을 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 단편은 관련 기술분야에 상용적이고 널리 공지된 재조합 기술에 의해 수득될 수 있다. 더욱이, 이러한 단편은 통상의 기술자에게 공지된 상용 시험관내 검정에 의해 활성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, CDKL5 활성은 문헌 [Lin et al., 2005, Human Mol Genet 14(24): 3775-86]에 기재된 바와 같이 시험관내 자가인산화 키나제 검정에 의해 검정될 수 있다. 간략하게, 500 μg의 이소성 발현된 FLAG-태그부착된 CDKL5를 5 μg의 M2 결합된 아가로스와 함께 4시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 비드를 TLB로 3회 및 키나제 완충제 (25 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM MnCl2, 10 mM 디티오트레이톨, 0.2 mM 바나듐산나트륨 및 10 mM 니트로-페닐-포스페이트)로 2회 세척할 수 있다. 이어서, FLAG 펩티드를 사용하여 CDKL5를 용리시킬 수 있다. 이어서, 생성된 비드를 100 μM ATP, 5 μCi의 [γ-32P]-ATP (NEN) 및 기질이 첨가된 30 μl의 키나제 완충제 중에 재현탁시킬 수 있다. 키나제 검정을 30℃에서 15분간 수행하고, SDS-PAGE 단백질 로딩 완충제를 첨가하여 종결시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 상기 기재된 폴리펩티드 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CDKL5 폴리펩티드의 변이체를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 야생형 치료 폴리펩티드, 예를 들어 서열식별번호: 9의 야생형 CDKL5 이소형 2 폴리펩티드 또는 서열식별번호: 10의 야생형 CDKL5 이소형 1 폴리펩티드에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%) 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 치료 폴리펩티드는 각각의 야생형 폴리펩티드와 비교하여 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39 또는 적어도 40개의 상이한 잔기를 가질 수 있다. 이러한 변이체는 관련 기술분야에 상용적이고 널리 공지된 재조합 기술에 의해 수득될 수 있다. 더욱이, 이러한 변이체는 통상의 기술자에게 공지된 상용 시험관내 검정에 의해 키나제 활성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, CDKL5 키나제 활성 검정의 설명에 대해 문헌 [Lin et al., 2005, Human Mol Genet 14(24): 3775-86]을 참조한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 또한 상기 기재된 치료 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
신규 코돈-최적화된 서열:
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDKL5 이소형 2를 코딩하는 신규 코돈-최적화된 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, CDKL5 이소형 2를 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일하다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 2를 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 3-5에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%) 동일하다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 2를 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 3-5로부터 선택된 서열에 대해 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 1에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일하고 서열식별번호: 3-5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 3-5로부터 선택된, CDKL5 이소형 2를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 기능적 CDKL5 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열식별번호: 3-5에 제시된 핵산 서열의 단편이 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 2를 코딩하는 핵산 서열은 3' 말단에 정지 코돈 (TGA, TAA 또는 TAG)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDKL5 이소형 1을 코딩하는 신규 코돈-최적화된 핵산 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, CDKL5 이소형 1을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 2에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일하다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 1을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 6-8에 대해 적어도 80% (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100%) 동일하다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 1을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 6-8로부터 선택된 서열에 대해 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2에 제시된 야생형 코딩 서열에 대해 80% 미만 동일하고 서열식별번호: 6-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과 동일한 핵산 서열을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 6-8로부터 선택된, CDKL5 이소형 1을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 기능적 CDKL5 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열식별번호: 6-8에 제시된 핵산 서열의 단편이 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, CDKL5 이소형 1을 코딩하는 핵산 서열은 3' 말단에 정지 코돈 (TGA, TAA 또는 TAG)을 추가로 포함할 수 있다.
재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포:
일부 측면에서, 본원에 개시된 재조합 핵산 분자, 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터 또는 rAAV를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 구체적 실시양태에서, 숙주 세포는 AAV의 증식에 적합할 수 있다.
광범위한 숙주 세포, 예컨대 박테리아, 효모, 곤충, 포유동물 세포 등이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 재조합 AAV (rAAV)의 생산에 적절한 세포 (또는 세포주), 예를 들어 HeLa, Cos-7, HEK293, A549, BHK, Vero, RD, HT-1080, ARPE-19 또는 MRC-5 세포일 수 있다.
재조합 핵산 분자 또는 벡터는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 숙주 세포 배양물 내로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 분자 또는 벡터가 게놈 내로 삽입된 안정한 숙주 세포주가 생성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rAAV 벡터를 함유하는 안정한 숙주 세포주가 생성된다. rAAV 벡터를 숙주 배양물에 형질감염시킨 후에, rAAV의 숙주 게놈 내로의 통합은 문헌 [Nakai et al., Nature Genetics (2003) 34, 297-302; Philpott et al., Journal of Virology (2002) 76(11):5411-5421 및 Howden et al., J Gene Med 2008; 10:42-50]에 기재된 바와 같은 다양한 방법, 예컨대 항생제 선택, 형광-활성화 세포 분류, 서던 블롯, PCR 기반 검출, 형광 계내 혼성화에 의해 검정될 수 있다. 추가로, 안정한 세포주는 관련 기술분야에 널리 공지된 프로토콜, 예컨대 문헌 [Kidney International Vol 61 (2002):S9-S15 및 Yuan et al., Human Gene Therapy 2011 May;22(5):613-24]에 기재된 것에 따라 확립될 수 있다.
유전자 요법을 위한 재조합 AAV:
AAV는 파르보비리다에 과 및 데펜도바이러스 속에 속한다. AAV는 선형 단일-가닥 DNA 게놈을 패키징하는 소형의 비-외피보유 바이러스이다. AAV DNA의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다는 동일한 빈도로 AAV 캡시드 내로 패키징된다.
AAV 게놈은 2개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 플랭킹된 2개의 역전된 말단 반복부 (ITR)를 특징으로 한다. AAV2 게놈에서, 예를 들어 ITR의 처음 125개의 뉴클레오티드는 팔린드롬이며, 이는 그 자체로 폴딩되어 염기 쌍형성을 최대화하고 T-형상 헤어핀 구조를 형성한다. D 서열로 불리는 ITR의 다른 20개의 염기는 쌍형성되지 않은 채로 남아있다. ITR은 AAV DNA 복제에 중요한 시스-작용 서열이며; ITR은 복제 기점이고, DNA 폴리머라제에 의한 제2-가닥 합성을 위한 프라이머로서의 역할을 한다. 이러한 합성 동안 형성된 이중-가닥 DNA는 복제-형태 단량체로 불리며, 제2 라운드의 자기-프라이밍 복제에 사용되고, 복제-형태 이량체를 형성한다. 이들 이중-가닥 중간체는 가닥 대체 메카니즘을 통해 프로세싱되어, 패키징에 사용되는 단일-가닥 DNA 및 전사에 사용되는 이중-가닥 DNA를 생성한다. ITR 내에는 Rep 결합 요소 및 말단 분해 부위 (TRS)가 위치한다. 이들 특징부는 이중-가닥 중간체를 프로세싱하기 위해 AAV 복제 동안 바이러스 조절 단백질 Rep에 의해 사용된다. AAV 복제에서의 그의 역할에 추가로, ITR은 또한 AAV 게놈 패키징, 전사, 비-허용성 조건 하의 음성 조절 및 부위-특이적 통합에 필수적이다 (Days and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).
AAV의 좌측 ORF는 Rep 유전자를 함유하며, 이는 4종의 단백질 - Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 코딩한다. 우측 ORF는 Cap 유전자를 함유하며, 이는 3종의 바이러스 캡시드 단백질 (VP1, VP2 및 VP3)을 생산한다. AAV 캡시드는 이십면체 대칭으로 배열된 60종의 바이러스 캡시드 단백질을 함유한다. VP1, VP2 및 VP3은 1:1:10 몰비로 존재한다 (Daya and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).
AAV는 현재 유전자 요법을 위해 가장 빈번하게 사용되는 바이러스 중 하나이다. AAV는 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키지만, 질환을 유발하는 것으로 공지되어 있지 않고, 매우 약한 면역 반응을 이끌어낸다. AAV를 이용하는 유전자 요법 벡터는 분열 및 정지 세포 둘 다를 감염시킬 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않으면서 염색체외 상태로 지속될 수 있다. AAV의 유리한 특징부 때문에, 본 개시내용은 본원에 개시된 재조합 핵산 분자 및 방법을 위한 AAV의 사용을 고려한다.
AAV는 표적 세포에 결합하여 진입하는 능력, 핵에 진입하는 능력, 장기간 동안 핵에서 발현되는 능력 및 낮은 독성을 포함한, 유전자 요법 벡터에 대한 여러 바람직한 특색을 보유한다. 그러나, AAV 게놈의 작은 크기는 통합될 수 있는 이종 DNA의 크기를 제한한다. 이러한 문제를 최소화하기 위해, Rep 및 통합 효율 요소 (IEE)를 코딩하지 않는 AAV 벡터가 구축되었다. ITR은 이들이 패키징에 요구되는 시스 신호이기 때문에 보유된다 (Daya and Berns, Clin Microbiol Rev, 21(4):583-593, 2008).
유전자 요법에 적합한 rAAV를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971; 및 2013/0072548; 및 문헌 [Ghosh et al., Gene Ther 13(4):321-329, 2006] 참조), 본원에 개시된 재조합 핵산 분자 및 방법과 함께 이용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDKL5 결핍 장애 (CDD)의 치료를 위한, AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 본원에 개시된 rAAV의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 5'에서 3' 순서로 작동가능하게 연결된 성분으로서: 5'-ITR, 프로모터 서열, CDKL5 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열 및 3'-ITR을 포함하는 패키징된 게놈을 함유한다. 일부 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1-8 또는 그에 대해 적어도 95% 동일한 서열로부터 선택된다.
예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 변이체 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 2를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 변이체 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 3을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 변이체 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 4를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 변이체 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 5를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 변이체 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 6을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 변이체 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 7을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 변이체 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 8을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 변이체 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 AAV2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열은 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
CDKL5의 발현을 위한 예시적인 패키징된 벡터 게놈 구축물을 보여주는 예시적 다이어그램이 도 1에 제공되며, 이는 5'에서 3' 순서로: 5'-ITR, SYN1 프로모터, CDKL5 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 신호 서열 및 3'-ITR을 보여준다. 이러한 예시적인 패키징된 벡터 게놈 구축물에 대한 3,828 bp 서열이 서열식별번호: 19에 제공된다.
CDKL5의 발현을 위한 예시적인 패키징된 벡터 게놈 구축물을 보여주는 또 다른 예시적 다이어그램이 도 2에 제공되며, 이는 5'에서 3' 순서로: 5'-ITR, CMV 인핸서 (예를 들어, CMV 극초기 유전자 인핸서), CBA 프로모터, SV40 소형 T 인트론, CDKL5 코딩 서열, SV40 폴리아데닐화 신호 서열 및 3'-ITR을 보여준다. 이러한 예시적인 패키징된 벡터 게놈 구축물에 대한 4,057 bp 서열이 서열식별번호: 20에 제공된다.
제약 조성물:
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 발명의 rAAV (예를 들어, CDKL5의 전달을 위한 rAAV) 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 rAAV (예를 들어, CDKL5의 전달을 위한 rAAV)를 포함하는 제약 조성물은 피하, 근육내, 피내, 복강내, 척수강내, 뇌실내, 정맥내 또는 대수조내 투여를 위해 제제화된다. 예시적인 실시양태에서, 제약 조성물은 척수강내 투여를 위해 제제화된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 제약 조성물은 대수조내 투여를 위해 제제화된다.
일부 실시양태에서, rAAV는 인간 대상체에의 주입에 적합한 완충제/담체 중에 제제화된다. 완충제/담체는 rAAV가 주입 튜빙에 점착되는 것을 방지하지만 생체내 rAAV 결합 활성은 방해하지 않는 성분을 포함해야 한다. 다양한 적합한 용액은 완충 염수, 계면활성제 및 약 100 mM 염화나트륨 (NaCl) 내지 약 250 mM 염화나트륨과 등가의 이온 강도로 조정된 생리학상 상용성인 염 또는 염의 혼합물, 또는 등가의 이온 농도로 조정된 생리학상 상용성인 염 중 1종 이상을 포함할 수 있다. pH는 6.5 내지 8.5 또는 7 내지 8.5 또는 7.5 내지 8의 범위일 수 있다. 적합한 계면활성제 또는 계면활성제의 조합은 폴록사머, 즉 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥시드))의 2개의 친수성 쇄가 플랭킹된 폴리옥시프로필렌 10 (폴리(프로필렌 옥시드))의 중앙 소수성 쇄로 구성된 비이온성 삼블록 공중합체, 솔루톨 HS 15 (마크로골-15 히드록시스테아레이트), 라브라솔 (폴리옥시 카프릴산 글리세리드), 폴리옥시 10 올레일 에테르, 트윈 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌 글리콜 중에서 선택될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, rAAV는 NaCl (예를 들어, 200 mM NaCl), MgCl2 (예를 들어, 1 mM MgCl2), 트리스 (예를 들어, 20 mM 트리스), pH 8.0 및 폴록사머 188 (예를 들어, 0.005% 또는 0.01% 폴록사머 188)을 포함하는 용액 중에서 제제화된다.
일부 실시양태에서, rAAV는 적어도 1종의 2가 또는 다가 알콜을 포함하는 제약 조성물 중에 제제화된다. 한 실시양태에서, 2가 또는 다가 알콜은 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 소르비톨로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 알콜이다.
예시적인 실시양태에서, rAAV는 소르비톨을 포함하는 제약 조성물 중에 제제화된다. 한 실시양태에서, 소르비톨은 제제 중에 0.5 중량% 내지 20 중량%의 범위로 존재한다. 한 실시양태에서, 소르비톨은 제제 중에 1 중량% 내지 10 중량%의 범위로 존재한다. 한 실시양태에서, 소르비톨은 제제 중에 약 1 중량%, 약 2 중량%, 약 3 중량%, 약 4 중량%, 약 5 중량%, 약 6 중량%, 약 7 중량%, 약 8 중량%, 약 9 중량% 또는 약 10 중량%로 존재한다.
예시적인 실시양태에서, rAAV는 5 중량% 소르비톨 및 폴록사머 188 (예를 들어, 0.005% 또는 0.01% 폴록사머 188)을 포함하는 제약 조성물 중에 제제화된다.
CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법:
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 적어도 1종의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 rAAV를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 벡터 게놈은 CDKL5 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 것인, CDD를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1-8 또는 그에 대해 적어도 95% 동일한 서열로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDKL5 내 적어도 1종의 돌연변이를 갖는 것으로 진단된 인간 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 적어도 1종의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDD를 치료하는 방법을 제공한다. CDKL5 내 병원성 돌연변이의 비제한적 목록은 문헌 [Hector et al., 2017, Neurol Genet 3(6): e200], [Russo et al., 2009, Neurogenetics 10(3): 241-50] 및 CDKL5에 대한 라이덴 오픈 배리에이션 데이터베이스 (LOVD) 글로벌 배리옴에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 rAAV를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 벡터 게놈은 CDKL5 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 것인, CDKL5 내 적어도 1종의 돌연변이를 갖는 것으로 진단된 인간 대상체에서 CDD를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1-8 또는 그에 대해 적어도 95% 동일한 서열로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, CDKL5에 대한 코딩 서열은 서열식별번호: 1을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12-14로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터 서열은 서열식별번호: 12를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV9 캡시드이다.
임의의 적합한 방법 또는 경로가 본원에 기재된 rAAV 또는 rAAV-함유 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 투여 경로는, 예를 들어 피하로, 피내로, 복강내로, 척수강내로, 뇌실내로, 정맥내로, 대수조내 및 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, rAAV는 척수강내로 투여된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, rAAV는 대수조를 통해 투여된다.
한 실시양태에서, rAAV는 수조 척수강내 경로를 통해 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, rAAV는 요추 척수강내 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 자가-척수강내 주사기를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, CSF 역학, 생리학적 박동 및 부피 변위를 활용하는 주사기를 이용하여 rAAV를 척수강내로 전달할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 하나의 가능한 주사기의 예는 알키온 라이프사이언시스, 인크.(Alcyone Lifesciences, Inc.)에서 개발 중인 펄사(Pulsar)™ 스마트 척수강내 전달 플랫폼이다.
투여되는 특정 용량은 각각의 환자에 대한 균일 용량, 예를 들어 환자당 바이러스의 1.0 x 1011 - 1.0 x 1014 게놈 카피 (GC)일 수 있다. 대안적으로, 환자의 용량은 환자의 대략적인 체중 또는 표면적에 맞춰질 수 있다. 적절한 투여량을 결정하는 데 있어서의 다른 인자는 치료 또는 예방될 질환 또는 상태, 질환의 중증도, 투여 경로 및 환자의 연령, 성별 및 의학적 상태를 포함할 수 있다. 치료를 위한 적절한 투여량을 결정하는 데 필요한 계산의 추가의 정밀화는, 특히 본원에 개시된 투여량 정보 및 검정에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 상용적으로 이루어진다. 투여량은 또한 적절한 용량-반응 데이터와 함께, 사용되는 투여량을 결정하기 위한 공지된 검정의 사용을 통해 결정될 수 있다. 개별 환자의 투여량은 또한 질환 진행이 모니터링됨에 따라 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, rAAV는, 예를 들어 qPCR 또는 디지털 액적 PCR (ddPCR)에 의해 측정 시 환자 체중 킬로그램당 약 1.0 x 1011 게놈 카피 (GC/kg) 내지 약 1 x 1014 GC/kg, 환자 체중 킬로그램당 약 5 x 1011 게놈 카피 (GC/kg) 내지 약 5 x 1013 GC/kg, 또는 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1013 GC/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1013 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 약 1.1 x 1011, 약 1.3 x 1011, 약 1.6 x 1011, 약 1.9 x 1011, 약 2 x 1011, 약 2.5 x 1011, 약 3.0 x 1011, 약 3.5 x 1011, 약 4.0 x 1011, 약 4.5 x 1011, 약 5.0 x 1011, 약 5.5 x 1011, 약 6.0 x 1011, 약 6.5 x 1011, 약 7.0 x 1011, 약 7.5 x 1011, 약 8.0 x 1011, 약 8.5 x 1011, 약 9.0 x 1011, 약 9.5 x 1011, 약 1.0 x 1012, 약 1.5 x 1012, 약 2.0 x 1012, 약 2.5 x 1012, 약 3.0 x 1012, 약 3.5 x 1012, 약 4.0 x 1012, 약 4.5 x 1012, 약 5.0 x 1012, 약 5.5 x 1012, 약 6.0 x 1012, 약 6.5 x 1012, 약 7.0 x 1012, 약 7.5 x 1012, 약 8.0 x 1012, 약 8.5 x 1012, 약 9.0 x 1012, 약 9.5 x 1012, 약 1.0 x 1013, 약 1.5 x 1013, 약 2.0 x 1013, 약 2.5 x 1013, 약 3.0 x 1013, 약 3.5 x 1013, 약 4.0 x 1013, 약 4.5 x 1013, 약 5.0 x 1013, 약 5.5 x 1013, 약 6.0 x 1013, 약 6.5 x 1013, 약 7.0 x 1013, 약 7.5 x 1013, 약 8.0 x 1013, 약 8.5 x 1013, 약 9.0 x 1013, 약 9.5 x 1013 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여된다. rAAV는 목적하는 치료 결과를 위해 필요에 따라 단일 용량으로 또는 다중 용량 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과의 용량)으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 CDD의 치료 방법은 본원에 기재된 rAAV의 투여 전에 IgG-분해 프로테아제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 먼저 IgG-분해 프로테아제를 투여한 다음, 후속적으로 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 rAAV를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 벡터 게놈은 CDKL5 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함하는 것인, CDD를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 CDD의 치료 방법은 IgG-분해 프로테아제를 투여받은 인간 대상체에 대해 수행된다.
본 발명에 사용될 수 있는 프로테아제의 예는, 예를 들어 및 비제한적으로, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi), 미코플라스마 카니스(Mycoplasma canis), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 슈도포르시누스(Streptococcus pseudoporcinus) 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터의 시스테인 프로테아제를 포함한, WO/2020/016318 및/또는 WO/2020/159970에 기재된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, IgG-분해 프로테아제는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 IdeS (서열식별번호: 23) 또는 서열식별번호: 23에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 서열식별번호: 23의 조작된 변이체이다. 조작된 IdeS 프로테아제의 예는 WO/2020/016318 및 미국 특허 공개 번호 20180023070 및 20180037962에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 IdeS 변이체는 서열식별번호: 20에 비해 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 변형을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, IgG-분해 프로테아제는 스트렙토코쿠스 에퀴로부터의 IdeZ (서열식별번호: 24) 또는 서열식별번호: 24에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 서열식별번호: 24의 조작된 변이체이다. 조작된 IdeZ 프로테아제의 예는 WO/2020/016318에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 IdeZ 변이체는 서열식별번호: 21에 비해 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 변형을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 다른 프로테아제는, 예를 들어 및 비제한적으로, WO/2017/134274에 기재된 스트렙토코쿠스 수이스(Streptococcus suis), 스트렙토코쿠스 포르시누스(Streptococcus porcinus) 및 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi)로부터의 IgdE 효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, IgG-분해 프로테아제는 리포솜, 나노입자, 지질 나노입자 (LNP), 중합체, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 미셀 또는 세포외 소포 내에 캡슐화되거나 또는 그와 복합체화될 수 있다.
코르티코스테로이드의 사용을 포함하는, CNS 장애를 치료하는 방법:
본 발명자들은 놀랍게도 rAAV 투여 전에 코르티코스테로이드인 프레드니솔론의 투여가 다양한 뇌 조직에 존재하는 벡터 게놈의 수의 증가를 유도한다는 것을 관찰하였다. 이론에 얽매이지는 않지만, 코르티코스테로이드는 CNS 조직에서 염증을 감소시키는 작용을 하여 rAAV가 깊은 CNS 조직 내로 침투하도록 하는 것을 가능하게 하며 이러한 조직은 그렇지 않으면 코르티코스테로이드 투여의 부재 하에 접근불가능할 것으로 가정된다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 먼저 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여한 다음, 후속적으로 상기 CNS 장애의 치료를 위해 설계된 적어도 1종의 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 rAAV는 척수강내로, 뇌실내로 또는 대수조내 전달을 통해 투여되는 것인, 인간 대상체에서 CNS 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, CNS 장애의 치료를 위해 설계된 적어도 1종의 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 코르티코스테로이드를 투여받았고; 임의로, rAAV는 척수강내로, 뇌실내로 또는 대수조내 전달을 통해 투여되는 것인, 인간 대상체에서 상기 CNS 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
이러한 측면에 따른 다양한 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론, 프레드니손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 부데소니드, 베타메타손 및 데플라자코르트로부터 선택될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 프레드니솔론이다.
이러한 측면에 따른 다양한 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 적어도 약 12시간 전에 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 적어도 약 24시간 전에 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 적어도 약 2일 전에 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과 전에 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 적어도 약 7, 14, 21일 또는 그 초과 전에 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월 또는 적어도 약 3개월 전에 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 전에 1회 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 전에 2회 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 전에 3, 4, 5회 또는 그 초과 투여된다.
인간 대상체에 대한 코르티코스테로이드의 투여는 경구, 정맥내, 피내, 경피, 피하, 근육내, 흡입 (예를 들어, 에어로졸을 통함), 협측 (예를 들어, 설하), 국소 (즉, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면 둘 다), 척수강내, 관절내, 흉막내, 뇌내, 동맥내, 복강내 또는 비강내 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 경로에 의한 것일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 경구로 투여된다.
특정 실시양태에서, 코르티코스테로이드의 용량은 mg/kg 대상체 체중의 단위로 측정된다. 다른 실시양태에서, 코르티코스테로이드의 용량은 대상체에게 투여되는 용량당 mg의 단위로 측정된다. 임의의 용량 측정치는 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있고, 투여 단위는 관련 기술분야의 표준 수단에 의해 전환될 수 있다.
특정 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 약 1 mg 내지 약 1000 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 약 3 mg 내지 약 300 mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 약 5 mg 내지 약 150 mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 약 10 mg 내지 약 100 mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 약 15 mg 내지 약 80 mg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 약 20 mg 내지 약 60 mg의 용량으로 투여된다.
특정 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 약 9 mg, 약 10 mg, 약 11 mg, 약 12 mg, 약 13 mg, 약 14 mg, 약 15 mg, 약 16 mg, 약 17 mg, 약 18 mg, 약 19 mg, 약 20 mg, 약 21 mg, 약 22 mg, 약 23 mg, 약 24 mg, 약 25 mg, 약 26 mg, 약 27 mg, 약 28 mg, 약 29 mg, 약 30 mg, 약 31 mg, 약 32 mg, 약 33 mg, 약 34 mg, 약 35 mg, 약 36 mg, 약 37 mg, 약 38 mg, 약 39 mg, 약 40 mg, 약 45 mg, 약 50 mg, 약 55 mg, 약 60 mg, 약 65 mg, 약 70 mg, 약 75 mg, 약 80 mg, 약 85 mg, 약 90 mg, 약 95 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg 또는 약 1000 mg의 용량으로 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 대상체 체중의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CD19 항체는 약 0.2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD19 항체는 약 0.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-CD19 항체는 약 0.2 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg 또는 약 10 mg/kg 대상체 체중의 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 전 총 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10일 또는 그 초과 동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 특정의 예시적인 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 rAAV의 투여 전 5일 동안 1일에 1 mg/kg으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 4주 동안 1일에 1 mg/kg으로 투여될 수 있으며, 제1 용량은 rAAV의 투여 5일 전에 이루어진다. 일부 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 4주 동안 1일에 1 mg/kg으로 투여될 수 있으며, 제1 용량은 rAAV의 투여 5일 전에 이루어지고, 이어서 추가로 4주 동안 코르티코스테로이드가 점감될 수 있다.
이러한 측면에 따른 방법은 유전자 요법이 적합할 수 있는 임의의 CNS 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CNS 장애는 CDD, 안젤만 증후군, 배튼병, 크라베병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 척수성 근육 위축 (SMA) 유형 I, II, III 및 IV, X-연관 근세관성 근병증, 프리드리히 운동실조, 카나반병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 부신백질이영양증, 헌팅톤병, 레트 증후군 및 척수소뇌성 운동실조로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, CNS 장애는 CDD이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 이러한 측면에 따른 방법에 사용하기 위한 rAAV는 본원에 기재된 CDD의 치료에 유용한 rAAV를 포함한다. 예를 들어, rAAV는 AAV 캡시드 (예를 들어, AAV9 캡시드) 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 벡터 게놈은 (a) 프로모터 서열 (예를 들어, SYN1 프로모터 서열, 예를 들어 인간 SYN1 프로모터 서열); 및 (b) CDKL5 또는 그의 이소형 또는 그의 기능적 단편 또는 기능적 변이체에 대한 부분 또는 완전 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 서열식별번호: 1-8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
명세서 전반에 걸쳐, 조성물이 특정 성분을 갖거나, 함유하거나 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 또는 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나, 함유하거나 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 추가적으로, 언급된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 본 발명의 조성물이 존재하고, 언급된 공정 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 본 발명에 따른 공정 및 방법이 존재하는 것으로 고려된다.
본 개시내용에서, 요소 또는 성분이 언급된 요소 또는 성분의 목록에 포함되고/거나 그로부터 선택되는 것으로 언급되는 경우에, 요소 또는 성분은 언급된 요소 또는 성분 중 어느 하나일 수 있거나, 또는 요소 또는 성분은 언급된 요소 또는 성분 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
추가로, 본원에 기재된 조성물 또는 방법의 요소 및/또는 특색은, 본원에서 명시적이든 내포적이든, 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 방식으로 조합될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 특정한 화합물이 언급된 경우에, 그 화합물은 문맥으로부터 달리 이해되지 않는 한 본 발명의 조성물의 다양한 실시양태에서 및/또는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 개시내용 내에서, 실시양태는 명확하고 간결한 개시내용이 기재되고 도시되도록 하는 방식으로 기재되고 도시되었지만, 실시양태는 본 발명의 교시 및 발명(들)으로부터 벗어나지 않으면서 다양하게 조합되거나 분리될 수 있는 것으로 의도되고 인지될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재되고 도시된 모든 특색은 본원에 기재되고 도시된 본 발명(들)의 모든 측면에 적용가능할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
표현 "중 적어도 1종"은, 문맥 및 용도로부터 달리 이해되지 않는 한, 표현 다음에 언급된 대상 및 언급된 대상 중 2종 이상의 다양한 조합 각각을 개별적으로 포함하는 것으로 이해될 것이다. 3종 이상의 언급된 대상과 관련하여 표현 "및/또는"은 문맥으로부터 달리 이해되지 않는 한 동일한 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다.
용어 "포함하다", "포함한다", "포함하는", "갖다", "갖는다", "갖는", "함유하다", "함유한다" 또는 "함유하는" (그의 문법적 등가물 포함)의 사용은, 달리 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 이해되지 않는 한, 일반적으로 개방적 및 비제한적인 것으로, 예를 들어 추가의 언급되지 않은 요소 또는 단계를 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
용어 "약"이 정량적 값 앞에 사용되는 경우에, 본 발명은 또한 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 특정 정량적 값 자체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약"은 달리 나타내거나 추론되지 않는 한 공칭 값으로부터의 ± 10% 변동을 지칭한다.
단계의 순서 또는 특정 조치를 수행하기 위한 순서는 본 발명이 작동가능하게 유지되는 한 중요하지 않은 것으로 이해될 것이다. 더욱이, 2개 이상의 단계 또는 작용은 동시에 수행될 수 있다.
본원에서의 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 어휘, 예를 들어 "예컨대" 또는 "포함한"의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것으로 의도되고, 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 제한을 부과하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 어휘도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되지 않을 것이다.
실시예
이제 일반적으로 기재되는 개시내용은 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이며, 이는 단지 본 개시내용의 특정 측면 및 실시양태의 예시 목적을 위해 포함되고, 어떠한 방식으로도 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1:
본 실시예의 목적은 CBA-hCDKL5 플라스미드를 뉴로2a (마우스 신경모세포종) 세포로 전달하는 것이 CDKL5의 증가된 발현 및 후속적으로 CDKL5의 하류 표적인 EB2 (미세관-회합 단백질 RP/EB 패밀리 구성원 2)의 증가된 인산화를 유도한다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, 뉴로2a 세포를 48시간 동안 인간 CDKL5 cDNA의 상류에 CBA 프로모터를 함유하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시키거나 또는 비형질감염인 채로 두었다. 세포를 고정시키고, 항-CDKL5 항체 및 항-포스포-EB2 항체를 사용하여 면역세포화학을 수행하였다. 자이스 악시오 이미저 M2 형광 현미경을 사용하여 영상화를 수행하였다.
도 3에 제시된 바와 같이, 높은 수준의 hCDKL5를 발현하는 뉴로2a 세포는 CDKL5의 하류 표적인 인산화 EB2 단백질의 증진된 수준을 나타낸다. 이는 CDKL5의 뉴로2a 세포로의 전달이 CDKL5 표적, 예컨대 EB2의 활성에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 2:
본 실시예의 목적은 rAAV9-CBA-eGFP 또는 rAAV9-SYN-eGFP-처리된 Cdkl5 KO 마우스의 다양한 CNS 조직에서의 증진된 녹색 형광 단백질 (eGFP)의 발현을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, CDKL5-결핍 마우스에게 (1) AAV9 캡시드 및 CBA 프로모터 및 eGFP 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV [rAAV9-CBA-eGFP] 또는 (2) AAV9 캡시드 및 SYN 프로모터 및 eGFP 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV [rAAV9-SYN-eGFP]를 투여하였다. 마우스에게 rAAV를 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 투여하였다. 분석을 위해 투여 2-4주 후에 조직을 회수하였다. 뇌를 고정시키고, 슬라이싱하고, eGFP의 검출을 위해 면역염색하였다.
도 4에 제시된 바와 같이, eGFP는 해마, 선조체, 전두 피질 및 소뇌를 포함한, 투여 마우스 뇌의 다수 영역에서 검출되었다. 모든 마우스는 해마 및 선조체에서 가장 높은 농도의 eGFP를 가졌다. rAAV9-CBA-eGFP를 투여한 마우스는 피질에 소수의 세포를 가졌고, 소뇌에 약간 더 많은 세포를 가졌으며; rAAV9-SYN-eGFP를 투여한 마우스는 소뇌에 더 적은 세포를 가졌고, 피질에 약간 더 많은 세포를 가졌다.
본 실시예는 ICV 주사에 의한 rAAV9-CBA-eGFP 및 rAAV9-SYN-eGFP의 투여가 해마 및 선조체의 세포에서 높은 수준의 eGFP 단백질을 생성하고, 피질 및 소뇌의 세포에서 더 낮은 수준을 생성한다는 것을 입증한다.
실시예 3:
본 실시예의 목적은 인간 시냅신 (SYN) 프로모터, 구성적 프로모터 (CBA) 또는 내인성 CDKL5 프로모터가 모두 뉴로2a 세포에서 CDKL5 단백질 발현을 구동할 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, 뉴로2a 세포를 48시간 동안 eGFP 또는 hCDKL5를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질도입되지 않은 뉴로2a 세포는 대조군으로서의 역할을 하였다. 세포를 고정시키고, 항-CDKL5 항체를 사용하여 면역세포화학을 수행하였다. 자이스 악시오 이미저 M2 형광 현미경을 사용하여 영상화를 수행하였다.
도 5에 제시된 바와 같이, hCDKL5 및 eGFP는, CBA 프로모터에 의한 최고 발현 수준 및 SYN 프로모터로부터의 더 낮은 발현 수준과 비교하여, 내인성 CDKL5 프로모터 (각각 엔도-hCDKL5 및 엔도-eGFP)를 사용하여 형질감염된 뉴로2a 세포에서 중간 수준으로 발현된다. 본 실시예는 인간 CDKL5 전사 개시 부위의 상류에 놓인 뉴클레오티드 (즉, 내인성 CDKL5 프로모터)가 뉴로2a 세포에서 hCDKL5뿐만 아니라 eGFP의 발현을 구동할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4:
본 실시예의 목적은 rAAV9-SYN-hCDKL5 및 rAAV9-CBA-hCDKL5의 CDKL5-결핍 마우스로의 CSF 전달이 뇌 전반에 걸쳐 hCDKL5 mRNA 및 cDNA의 강건한 분포를 유발한다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, CDKL5-결핍 마우스에게 (1) AAV9 캡시드 및 CBA 프로모터 및 hCDKL5 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV [rAAV9-CBA-hCDKL5] 또는 (2) AAV9 캡시드 및 SYN 프로모터 및 hCDKL5 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV [rAAV9-SYN-hCDKL5]를 투여하였다. 마우스에게 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 투여하였다. 투여 2주 또는 3개월 후에 조직을 회수하였다. 뇌를 고정시키고, 슬라이싱하고, RNA스코프 계내 혼성화에 의해 처리하여 hCDKL5 mRNA 및 cDNA뿐만 아니라 Rbfox3 mRNA (뉴런 마커)를 검출하였다.
도 6a에 제시된 바와 같이, 벡터 둘 다는 해마 및 선조체 영역에서 높은 수준의 hCDKL5를 생성하였다. 공동-표지는 벡터 둘 다가 또한 피질 전반에 걸쳐 뉴런에서 hCDKL5를 발현한다는 것을 확인시켜 주었다 (도 6b). 도 6b에 제시된 바와 같이, ICV 주사에 의해 rAAV9-CBA-hCDKL5 (도 6b의 정사각형 5) 또는 rAAV9-SYN-hCDKL5 (도 6b의 정사각형 7)로 처리된 마우스는 해마, 선조체 및 피질에 hCDKL5 mRNA 및 cDNA를 가졌다. 뉴런 마커 Rbfox3과의 공동-표지를 보여주는 도 6b에 제시된 바와 같이, 2개의 벡터 사이에 전체 분포에 있어서 유사성이 주목되었고 벡터 둘 다가 뉴런에서의 발현을 구동하였다. 도 6b의 정사각형 6은 rAAV9-CBA-hCDKL5 벡터로부터 발현된 hCDKL5 및 뉴런 마커 Rbfox3의 공동-표지를 보여준다. 도 6b의 정사각형 8은 rAAV9-SYN-hCDKL5 벡터로부터 발현된 hCDKL5 및 뉴런 마커 Rbfox3의 공동-표지를 보여준다.
본 실시예에 제시된 데이터는 ICV 주사에 의한 rAAV9-CBA-hCDKL5 및 rAAV9-SYN-hCDKL5 벡터의 투여가 해마, 선조체 및 전두 피질 전반에 걸쳐 뉴런에서 hCDKL5 mRNA 및 cDNA를 유도한다는 것을 나타낸다.
실시예 5:
본 실시예의 목적은 AAV9-SYN-hCDKL5 및 AAV9-CBA-hCDKL5 rAAV가 기능적 CDKL5 단백질을 마우스 뇌로 전달할 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, CDKL5-결핍 마우스에게 rAAV9-CBA-hCDKL5 또는 rAAV9-SYN-hCDKL5를 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 투여하고, 투여 2주 후에 조직을 회수하였다. 뇌를 미세절제하고, 전두 피질을 균질화하고, 웨스턴 블롯 상에서 전개시켰으며, 이를 CDKL5, pEB2 및 β-튜불린에 대한 항체로 프로빙하였다.
도 7에 제시된 바와 같이, rAAV9-SYN-hCDKL5 또는 rAAV9-CBA-hCDKL5로 처리된 CDKL5-결핍 마우스는 비히클 대조군과 비교하여 CDKL5 단백질뿐만 아니라 인산화된 EB2 (pEB2) 단백질의 증가된 수준을 나타냈다. CDKL5 하류 표적인 EB2의 인산화는 전달된 CDKL5가 기능적 키나제로서 작용한다는 것을 확인시켜 준다.
실시예 6:
본 실시예의 목적은 AAV9-CBA-eGFP 및 AAV9-SYN-eGFP가 요추 척수강내 전달 후에 비-인간 영장류 (NHP) 뇌에 걸쳐 세포에 형질도입할 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, 어린 암컷 NHP 대상체 (n=2/벡터)에게 rAAV9-CBA-eGFP 또는 rAAV9-SYN-eGFP를 요추 척수강내 주사에 의해 투여하였다. 투여 2주 후에, 정량적 PCR에 의한 벡터 게놈 정량화를 위해 다양한 조직을 회수하였다.
처리된 NHP로부터의 CNS 및 말초 조직에서 1x103 내지 1x107 카피의 vg/μg 조직 DNA를 정량화하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, rAAV9-CBA-eGFP 및 rAAV9-SYN-eGFP 투여 둘 다는 상이한 조직 사이에 유사한 카피수를 생성하였다.
본 실시예는 척수강내 전달에 의한 rAAV9-CBA-eGFP 및 rAAV9-SYN-eGFP의 투여가 벡터 사이의 넓은 생체분포의 뚜렷한 차이 없이 분석된 모든 뇌 및 말초 영역에서 벡터 게놈을 생성한다는 것을 보여준다.
실시예 7:
본 실시예의 목적은, NHP 피질에서, AAV9-CBA-eGFP는 주로 신경교 형태를 갖는 세포에서 발현을 구동하는 반면, AAV9-SYN-eGFP는 주로 뉴런 형태를 갖는 세포에서 발현을 구동한다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, 어린 암컷 NHP 대상체 (n=2/벡터)에게 rAAV9-CBA-eGFP 또는 rAAV9-SYN-eGFP를 요추 척수강내 주사에 의해 투여하였다. 투여 2주 후에, 뇌를 회수하고, 고정시키고, 절편화하고, 자유-부유 발색 검출에 의해 eGFP에 대해 면역염색하였다.
eGFP 양성 세포는 rAAV9-CBA-eGFP 및 rAAV9-SYN-eGFP를 투여한 NHP 대상체로부터의 뇌 절편 둘 다에서 검출되었다. eGFP-양성 세포는 가장 통상적으로는 단독으로 관찰되었지만, 때때로 클러스터로 관찰되었다. 도 9에 제시된 바와 같이, rAAV9-CBA-eGFP를 투여한 NHP 대상체로부터의 eGFP-양성 세포는 다양한 형태를 가졌지만, 대부분은 넓은 분지를 갖는 신경교 세포 및 소세포체의 외관을 가졌으며, 이는 CBA 프로모터가 성상 신경교 세포 (즉, 비-뉴런 세포)에서 eGFP 페이로드를 우선적으로 발현한다는 것을 시사한다. 한편, rAAV9-SYN-eGFP를 투여한 NHP 대상체로부터의 eGFP-양성 세포는 둥근 세포체 및 보다 적은 분지를 갖는 뉴런의 외관을 가졌으며, 이는 SYN 프로모터가 목적하는 표적 세포 유형 (즉, 뉴런)에서 eGFP 페이로드를 발현하는 데 보다 효과적이라는 것을 시사한다.
척수강내 투여에 의한 rAAV9-CBA-eGFP의 투여는 대부분 eGFP-양성 성상 신경교 세포를 생성하는 반면, rAAV9-SYN-eGFP의 투여는 대부분 eGFP-양성 뉴런을 생성한다. 본 실시예에서의 데이터는 비-인간 영장류에서, SYN 프로모터가 구성적 CBA 프로모터에 비해 뉴런 세포에서의 CDKL5의 전달 및 발현에 유리할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 8:
본 실시예의 목적은 어린 CDKL5-결핍 마우스의 CSF로의 rAAV9-SYN-hCDKL5 전달이 학습, 기억 및 운동 기능을 개선시킬 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, SYN 프로모터의 제어 하에 인간 CDKL5 유전자를 발현하는 벡터 게놈 (도 1에 예시된 패키징된 게놈, 서열식별번호: 19, 3,828 bp) 및 AAV9 캡시드를 포함하는 재조합 AAV의 단일 고용량 (1.6e12 vg/마우스)을 3-5주령의 어린 수컷 및 암컷 CDKL5-결핍 마우스 (초기 증후성)의 CSF 내로 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 주사하였다. 마우스가 2-3개월령 (성체기)에 도달하였을 때, 이들은 일련의 행동 시험을 받았다. 행동 시험 후, CDKL5 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 위해 뇌를 수거하였다.
다수의 뇌 영역으로부터의 미세절제된 조직의 웨스턴 블롯 분석은 투여 대략 3개월 후에 처리된 마우스의 뇌에 걸친 인간 CDKL5 단백질의 중간 정도의 장기-지속 증가를 입증하였다 (전두 피질 및 뇌간에서는 WT 수준의 20-30%, 해마에서는 35-70%). CDKL5-결핍 마우스 뇌의 상이한 영역 (전두 피질: 도 10a; 해마: 도 10b; 및 뇌간: 도 10c)에서 정량화된 CDKL5의 양을 디스플레이하는 그래프를 보여주는 도 10a-10c를 참조한다. 도 11a-11d에 제시된 바와 같이, rAAV9-SYN-hCDKL5 처리된 수컷 및 암컷 마우스는 불안-유사 행동 (도 11a), 운동 기능 (도 11b) 및 협응 (도 11c)의 개선, 뿐만 아니라 학습 및 기억의 정상화 (도 11d)를 나타냈다.
본 실시예에서 강조된 발견은 rAAV9-SYN-hCDKL5를 어린 증후성 CDKL5-결핍 마우스에게 전달하는 경우에 심지어 중간 수준의 기능적 CDKL5도 유의하게 개선된 뇌 기능을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 9:
본 실시예의 목적은 비-인간 영장류 (NHP)의 여러 CNS 영역으로의 rAAV9-SYN-eGFP 전달이 요추 척수강내 투여와 비교하여 대수조내 투여 경로를 통한 벡터 입자의 투여에 의해 증가될 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, 어린 암컷 NHP 대상체에게 rAAV9-SYN-eGFP를 요추 척수강내 (IT) 주사에 의해 투여하거나 (n=2) (상기 실시예 6으로부터 추출된 데이터) 또는 대수조내 (CM) 투여에 의해 투여하였다 (n=3) (본 실시예 9에서 새로 생성된 데이터). 모든 NHP를 투여 동안 및 투여가 완료된 후 15분 동안 트렌델렌버그 자세로 두었다. 투여 2주 후에, 정량적 PCR에 의한 벡터 게놈 정량화를 위해 다양한 조직을 회수하였다. 도 12는 트렌델렌버그 자세에 주어진 rAAV9-SYN-eGFP의 8.06 x 1013 벡터 게놈 (vg)의 척수강내 (IT) 전달 (UX055-18-0001) 또는 7.76 x 1013 vg의 대수조내 (CM) 전달 (UX055-19-0002) 2주 후 1-2세의 암컷 비-인간 영장류 (NHP)의 CNS 내 DNA μg당 게놈 카피 (GC)를 예시하는 막대 그래프이다. 그래프는 대수조내 전달이 NHP CNS 내 두정엽 (10X), 선조체 (10X) 및 시상 (8X)을 포함한 다양한 뇌 조직에서 증가된 수의 벡터 게놈을 생성한다는 것을 예시한다. 이 그래프에 제시된 데이터는 2개의 독립적 연구의 일부로서 수집되었다.
처리된 NHP로부터의 뇌 및 척수 조직에서 1x103 내지 1x106 카피의 vg/μg 조직 DNA를 정량화하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, 많은 CNS 조직에 걸쳐 대수조로의 rAAV9-SYN-eGFP 투여가 요추 척수강내 전달보다 더 높은 카피수를 생성하였다.
본 실시예에서 강조된 발견은 NHP에서 여러 CNS 영역으로의 증가된 rAAV 전달이 대수조내 투여 경로를 통해 달성될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 10:
본 실시예의 목적은 프레드니솔론이 놀랍게도 NHP에서 대수조내 주사 후 많은 CNS 영역으로 전달된 rAAV9-SYN-hCDKL5 (UX055-19-003) 벡터 게놈의 수를 증가시킨다는 것을 입증하는 것이다.
본 실시예에서, 어린 암컷 NHP 대상체에게 rAAV9-SYN-hCDKL5를 프레드니솔론과 함께 (n=3) 또는 그 없이 (n=3) 트렌델렌버그 자세에서 대수조내 (CM) 투여에 의해 투여하였다. 프레드니솔론 처리군의 NHP는 rAAV9-SYN-hCDKL5 투여 4일 전에 시작하여 1mg/kg 프레드니솔론의 단일 1일 용량을 경구 위관영양에 의해 받았고, 연구의 종료까지 계속되었다. 투여 4주 후에, 정량적 PCR에 의한 벡터 게놈 정량화를 위해 뇌의 하나의 절반으로부터 다양한 조직을 회수하고, 계내 혼성화를 사용한 형질도입 세포 수의 분석을 위해 뇌의 다른 절반을 관상으로 절편화하였다. 프로브를 벡터 DNA에 특이적으로 결합하도록 설계하고, 헤마톡실린 대조 염색을 사용하여 개별 세포를 가시화하였다.
처리된 NHP로부터의 여러 뇌 영역, 척수 및 후근 신경절 (DRG)에서 1x103 내지 1x106 카피의 vg/μg 조직 DNA를 정량화하였다. 도 13a에 제시된 바와 같이, 전처리 및 지속된 프레드니솔론은 대수조로의 rAAV9-SYN-hCDKL5 투여와 조합된 경우에, 놀랍게도 많은 CNS 조직에 걸쳐 rAAV9-SYN-hCDKL5 단독과 비교하여 더 높은 카피수를 유도하였다. 이들 결과는 형질도입의 증가가 예상되지 않았기 때문에 놀라웠다.
도 13b에 제시된 바와 같이, 후두 피질 및 소뇌를 함유하는 절편에 대한 베이스스코프 (계내 혼성화) 분석은 프레드니솔론으로 처리된 NHP에서 형질도입 세포의 수가 증가된 경향을 입증하였지만 (패널 2 및 4), 비 프레드니솔론 군에서는 1개의 이상치 NHP로 유의한 동물 대 동물 가변성이 관찰되었다 (패널 1 및 3). 도 13c에 제시된 바와 같이, 매우 높은 수의 벡터 게놈 양성 세포를 갖는 1개의 이상치 NHP가 비 프레드니솔론 군에서 주목되었다.
이론에 얽매이지는 않지만, 선천성 면역계를 억제하는 프레드니솔론의 능력은 이러한 발견에 기여할 수 있고/거나 염증을 억제하는 프레드니솔론의 능력은 rAAV가 뇌 내로 더 깊이 침투하도록 하여 벡터 게놈 카피수에 의해 측정 시 관찰된 형질도입의 증가를 유발할 수 있는 것으로 가정된다.
본 실시예에서 강조된 발견은 코르티코스테로이드인 프레드니솔론이 rAAV 투여 전 및 투여 동안 주어지는 경우에 NHP에서 여러 CNS 영역으로의 증가된 rAAV 전달이 달성될 수 있다는 것을 나타낸다.
넘버링된 실시양태
본원에 개시된 실시양태는 본 개시내용의 넘버링된 실시양태에 제공된 바와 같은 실시양태 P1 내지 P53을 포함한다.
실시양태 P1: 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)이며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은
(a) 프로모터 서열; 및
(b) 서열식별번호: 1-8서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, CDKL5에 대한 코딩 서열
을 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P2: 실시양태 P1에 있어서, AAV 캡시드가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, rh10 또는 hu37의 AAV로부터의 것인 rAAV.
실시양태 P3: 실시양태 P2에 있어서, AAV 캡시드가 AAV9로부터의 것인 rAAV.
실시양태 P4: 실시양태 P2에 있어서, AAV 캡시드가 AAV8로부터의 것인 rAAV.
실시양태 P5: 실시양태 P1에 있어서, AAV 캡시드가 AAV9 변이체 캡시드인 rAAV.
실시양태 P6: 실시양태 P1-P5 중 어느 것에 있어서, 프로모터가 뉴런-특이적 프로모터인 rAAV.
실시양태 P7: 실시양태 P6에 있어서, 뉴런-특이적 프로모터가 인간 시냅신 1 (SYN1) 프로모터, 마우스 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터, 래트 튜불린 알파 I (Ta1) 프로모터, 래트 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE) 프로모터, 인간 뉴런-특이적 엔올라제 (ENO2) 프로모터, 인간 혈소판-유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터, 인간 BM88 프로모터 및 뉴런 니코틴성 수용체 β2 (CHRNB2) 프로모터로부터 선택된 것인 rAAV.
실시양태 P8: 실시양태 P7에 있어서, 뉴런-특이적 프로모터가 SYN1 프로모터인 rAAV.
실시양태 P9: 실시양태 P8에 있어서, SYN1 프로모터 서열이 서열식별번호: 12를 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P10: 실시양태 P8에 있어서, SYN1 프로모터 서열이 서열식별번호: 12로 이루어진 것인 rAAV.
실시양태 P11: 실시양태 P1-P5 중 어느 것에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 유전자 프로모터, 트랜스티레틴 (TTR) 프로모터, 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터 및 알파-1 항-트립신 (A1AT) 프로모터로부터 선택된 것인 rAAV.
실시양태 P12: 실시양태 P11에 있어서, 프로모터가 CBA 프로모터인 rAAV.
실시양태 P13: 실시양태 P12에 있어서, CBA 프로모터 서열이 서열식별번호: 13을 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P14: 실시양태 P12에 있어서, CBA 프로모터 서열이 서열식별번호: 13으로 이루어진 것인 rAAV.
실시양태 P15: 실시양태 P1-P5 중 어느 것에 있어서, 프로모터가 CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터인 rAAV.
실시양태 P16: 실시양태 P15에 있어서, CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터가 서열식별번호: 14의 동일 길이 영역에 대해 적어도 95% 동일한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P17: 실시양태 P1-P16 중 어느 것에 있어서, 벡터 게놈이 5'-ITR 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P18: 실시양태 P1-P17 중 어느 것에 있어서, 벡터 게놈이 3'-ITR 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P19: 실시양태 P17-P18 중 어느 것에 있어서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열이 AAV2로부터의 것인 rAAV.
실시양태 P20: 실시양태 P19에 있어서, 5'-ITR 서열 및 3'-ITR 서열이 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 rAAV.
실시양태 P21: 실시양태 P17-P18 중 어느 것에 있어서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열이 비-AAV2 공급원으로부터의 것인 rAAV.
실시양태 P22: 실시양태 P1-P21 중 어느 것에 있어서, 벡터 게놈이 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P23: 실시양태 P22에 있어서, 폴리아데닐화 신호 서열이 SV40 폴리아데닐화 신호 서열, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 서열 및 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호 서열로부터 선택된 것인 rAAV.
실시양태 P24: 실시양태 P23에 있어서, 폴리아데닐화 신호 서열이 SV40 폴리아데닐화 신호 서열인 rAAV.
실시양태 P25: 실시양태 P24에 있어서, SV40 폴리아데닐화 신호 서열이 서열식별번호: 15를 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 rAAV.
실시양태 P26: 실시양태 P1-P25 중 어느 것에 있어서, 벡터 게놈이 1종 이상의 인핸서 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P27: 실시양태 P26에 있어서, 인핸서가 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 유전자 인핸서, 트랜스티레틴 인핸서 (enTTR), 닭 β-액틴 (CBA) 인핸서, En34 인핸서 및 아포지단백질 E (ApoE) 인핸서로부터 선택된 것인 rAAV.
실시양태 P28: 실시양태 P27에 있어서, 인핸서가 CMV 인핸서인 rAAV.
실시양태 P29: 실시양태 P28에 있어서, 인핸서 서열이 서열식별번호: 17을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 rAAV.
실시양태 P30: 실시양태 P26-P29 중 어느 것에 있어서, 인핸서가 프로모터 서열의 상류에 위치하는 것인 rAAV.
실시양태 P31: 실시양태 P1-P30 중 어느 것에 있어서, 벡터 게놈이 1종 이상의 인트론 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
실시양태 P32: 실시양태 P31에 있어서, 인트론이 SV40 소형 T 인트론, 토끼 헤모글로빈 서브유닛 베타 (rHBB) 인트론, 인간 베타 글로빈 IVS2 인트론, β-글로빈/IgG 키메라 인트론 또는 hFIX 인트론으로부터 선택된 것인 rAAV.
실시양태 P33: 실시양태 P32에 있어서, 인트론이 SV40 소형 T 인트론인 rAAV.
실시양태 P34: 실시양태 P33에 있어서, SV40 소형 T 인트론 서열이 서열식별번호: 18을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 rAAV.
실시양태 P35: 상기 실시양태 중 어느 것의 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
실시양태 P36: 인간 대상체에게 치료 유효량의 실시양태 P1-P34 중 어느 것의 rAAV 또는 실시양태 P35의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
실시양태 P37: 실시양태 P36에 있어서, rAAV 또는 조성물이 피하로, 근육내로, 피내로, 복강내로, 척수강내로, 뇌실내로, 정맥내로 또는 대수조내로 투여되는 것인 방법.
실시양태 P38: 실시양태 P37에 있어서, rAAV 또는 조성물이 척수강내로 투여되는 것인 방법.
실시양태 P39: 실시양태 P37에 있어서, rAAV 또는 조성물이 대수조내 투여되는 것인 방법.
실시양태 P40: 실시양태 P37-P39 중 어느 것에 있어서, rAAV가 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
실시양태 P41: 먼저 인간 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여한 다음, 후속적으로 치료 유효량의 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 프로모터 서열 및 CDKL5에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
실시양태 P42: 먼저 인간 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여한 다음, 후속적으로 치료 유효량의 실시양태 P1-P34 중 어느 것의 rAAV 또는 실시양태 P35의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
실시양태 P43: 실시양태 P41-P42 중 어느 것에 있어서, 코르티코스테로이드가 프레드니솔론, 프레드니손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 부데소니드, 베타메타손 및 데플라자코르트로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 P44: 실시양태 P43에 있어서, 코르티코스테로이드가 프레드니솔론인 방법.
실시양태 P45: 먼저 인간 대상체에게 IgG-분해 프로테아제를 투여한 다음, 후속적으로 치료 유효량의 실시양태 P1-P34 중 어느 것의 rAAV 또는 실시양태 P35의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
실시양태 P46: 실시양태 P45에 있어서, IgG-분해 프로테아제가 스트렙토코쿠스 피오게네스의 IdeS 또는 그의 조작된 변이체인 방법.
실시양태 P47: 실시양태 P45에 있어서, IgG-분해 프로테아제가 스트렙토코쿠스 에퀴의 IdeZ 또는 그의 조작된 변이체인 방법.
실시양태 P48: 서열식별번호: 19에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 P49: 서열식별번호: 19를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 P50: 서열식별번호: 19로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
실시양태 P51: 서열식별번호: 20에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 P52: 서열식별번호: 20을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
실시양태 P53: 서열식별번호: 20으로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
참조로 포함
본원에 언급된 각각의 특허 문헌 및 과학 논문의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 개시내용은 그의 취지 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않으면서 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 개시내용을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주될 것이다. 상이한 실시양태의 다양한 구조적 요소 및 다양한 개시된 방법 단계가 다양한 조합 및 순열로 이용될 수 있고, 모든 이러한 변형은 본 개시내용의 형태로 간주될 것이다. 따라서, 본 개시내용의 범주는 상기 설명에 의해서보다는 첨부된 청구범위에 의해 나타내어지고, 청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 속하는 모든 변화는 그 안에 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ULTRAGENYX PHARMACEUTICAL INC. <120> GENE THERAPY FOR TREATING CDKL5 DEFICIENCY DISORDER <130> ULP-007WO <140> PCT/US21/17656 <141> 2021-02-11 <150> 63/090,492 <151> 2020-10-12 <150> 62/976,483 <151> 2020-02-14 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2880 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaagattc ctaacattgg taatgtgatg aataaatttg agatccttgg ggttgtaggt 60 gaaggagcct atggagttgt acttaaatgc agacacaagg aaacacatga aattgtggcg 120 atcaagaaat tcaaggacag tgaagaaaat gaagaagtca aagaaacgac tttacgagag 180 cttaaaatgc ttcggactct caagcaggaa aacattgtgg agttgaagga agcatttcgt 240 cggaggggaa agttgtactt ggtgtttgag tatgttgaaa aaaatatgct cgaattgctg 300 gaagaaatgc caaatggagt tccacctgag aaagtaaaaa gctacatcta tcagctaatc 360 aaggctattc actggtgcca taagaatgat attgtccatc gagatataaa accagaaaat 420 ctcttaatca gccacaatga tgtcctaaaa ctgtgtgact ttggttttgc tcgtaatctg 480 tcagaaggca ataatgctaa ttacacagag tacgttgcca ccagatggta tcggtcccca 540 gaactcttac ttggcgctcc ctatggaaag tccgtggaca 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agccacaatg atgtcctaaa actgtgtgac tttggttttg ctcgtaatct gtcagaaggc 1320 aataatgcta attacacaga gtacgttgcc accagatggt atcggtcccc agaactctta 1380 cttggcgctc cctatggaaa gtccgtggac atgtggtcgg tgggctgtat tcttggggag 1440 cttagcgatg gacagccttt atttcctgga gaaagtgaaa ttgaccaact ttttactatt 1500 cagaaggtgc taggaccact tccatctgag cagatgaagc ttttctacag taatcctcgc 1560 ttccatgggc tccggtttcc agctgttaac catcctcagt ccttggaaag aagatacctt 1620 ggaattttga atagtgttct acttgaccta atgaagaatt tactgaagtt ggacccagct 1680 gacagatact tgacagaaca gtgtttgaat caccctacat ttcaaaccca gagacttctg 1740 gatcgttctc cttcaaggtc agcaaaaaga aaaccttacc atgtggaaag cagcacattg 1800 tctaatagaa accaagccgg caaaagtact gctttgcagt ctcaccacag atctaacagc 1860 aaggacatcc agaacctgag tgtaggcctg ccccgggctg acgaaggtct ccctgccaat 1920 gaaagcttcc taaatggaaa ccttgctgga gctagtctta gtccactgca caccaaaacc 1980 taccaagcaa gcagccagcc tgggtctacc agcaaagatc tcaccaacaa caacatacca 2040 caccttctta gcccaaaaga agccaagtca aaaacagagt ttgattttaa tattgaccca 2100 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tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat 3840 aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg 3900 gaggtttttt agaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 3960 cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 4020 cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaa 4057 <210> 21 <211> 2211 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 9 <400> 21 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60 gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180 aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300 caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480 aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540 tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600 cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660 gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780 tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960 caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020 acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080 gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140 acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260 cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320 gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380 ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440 ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500 tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560 ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620 ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680 accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740 gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800 atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860 aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920 aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980 gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040 gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100 tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160 tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211 <210> 22 <211> 736 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 9 <400> 22 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 23 <211> 310 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 23 Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro 1 5 10 15 Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn 20 25 30 Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu 50 55 60 Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln 65 70 75 80 Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln 85 90 95 Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile 100 105 110 Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys 115 120 125 Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro 130 135 140 Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr 145 150 155 160 Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly 165 170 175 Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu 180 185 190 Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp 195 200 205 Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His 210 215 220 Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala 225 230 235 240 Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser 245 250 255 Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn 260 265 270 Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn 275 280 285 Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp 290 295 300 Ser Trp Asn Gln Thr Asn 305 310 <210> 24 <211> 349 <212> PRT <213> Streptococcus equi <400> 24 Met Lys Thr Ile Ala Tyr Pro Asn Lys Pro His Ser Leu Ser Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Thr Ala Ile Ala Ile Phe Ser Leu Ala Ser Ser Asn Ile Thr 20 25 30 Tyr Ala Asp Asp Tyr Gln Arg Asn Ala Thr Glu Ala Tyr Ala Lys Glu 35 40 45 Val Pro His Gln Ile Thr Ser Val Trp Ser Lys Gly Val Thr Pro Leu 50 55 60 Thr Pro Glu Gln Phe Arg Tyr Asn Asn Glu Asp Val Ile His Ala Pro 65 70 75 80 Tyr Leu Ala His Gln Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Ala Phe Asp Gly 85 90 95 Lys Asp Asn Leu Leu Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His 100 105 110 Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Thr Glu Ile Glu Ala Tyr Leu Ser Lys 115 120 125 His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Ile Phe Asn Asn Gln Glu Leu Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Ala Ala Ile Asp Thr Lys Asp Ser Gln Thr Asn Ser Gln Leu 145 150 155 160 Phe Asn Tyr Phe Arg Asp Lys Ala Phe Pro Asn Leu Ser Ala Arg Gln 165 170 175 Leu Gly Val Met Pro Asp Leu Val Leu Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr 180 185 190 Tyr Leu Asn Val Phe Lys Thr Gln Ser Thr Asp Val Asn Arg Pro Tyr 195 200 205 Gln Asp Lys Asp Lys Arg Gly Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg 210 215 220 Gly Asp Gln Thr Thr Leu Leu Thr Ala Arg His Asp Leu Lys Asn Lys 225 230 235 240 Gly Leu Asn Asp Ile Ser Thr Ile Ile Lys Gln Glu Leu Thr Glu Gly 245 250 255 Arg Ala Leu Ala Leu Ser His Thr Tyr Ala Asn Val Ser Ile Ser His 260 265 270 Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Asn Leu Glu 275 280 285 Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys 290 295 300 Lys Tyr Phe Val Gly Ile Asn Ala His Gly His Val Ala Ile Ser Ala 305 310 315 320 Lys Lys Ile Glu Gly Glu Asn Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe 325 330 335 Thr Leu Ser Ser Gly Lys Asp Ile Trp Gln Lys Leu Ser 340 345

Claims (57)

  1. 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)이며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은
    (a) 프로모터 서열; 및
    (b) 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로부터 선택된 서열에 대해 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, CDKL5에 대한 코딩 서열
    을 포함하는 것인 rAAV.
  2. 제1항에 있어서, AAV 캡시드가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, rh10 또는 hu37의 AAV로부터의 것인 rAAV.
  3. 제2항에 있어서, AAV 캡시드가 AAV9로부터의 것인 rAAV.
  4. 제2항에 있어서, AAV 캡시드가 AAV8로부터의 것인 rAAV.
  5. 제1항에 있어서, AAV 캡시드가 AAV9 변이체 캡시드인 rAAV.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 뉴런-특이적 프로모터인 rAAV.
  7. 제6항에 있어서, 뉴런-특이적 프로모터가 인간 시냅신 1 (SYN1) 프로모터, 마우스 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터, 래트 튜불린 알파 I (Ta1) 프로모터, 래트 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE) 프로모터, 인간 뉴런-특이적 엔올라제 (ENO2) 프로모터, 인간 혈소판-유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터, 인간 BM88 프로모터 및 뉴런 니코틴성 수용체 β2 (CHRNB2) 프로모터로부터 선택된 것인 rAAV.
  8. 제7항에 있어서, 뉴런-특이적 프로모터가 인간 SYN1 프로모터인 rAAV.
  9. 제8항에 있어서, 인간 SYN1 프로모터가 서열식별번호: 12를 포함하는 핵산 서열을 갖는 것인 rAAV.
  10. 제8항에 있어서, 인간 SYN1 프로모터가 서열식별번호: 12로 이루어진 핵산 서열을 갖는 것인 rAAV.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 유전자 프로모터, 트랜스티레틴 (TTR) 프로모터, 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터 및 알파-1 항-트립신 (A1AT) 프로모터로부터 선택된 것인 rAAV.
  12. 제11항에 있어서, 프로모터가 CBA 프로모터인 rAAV.
  13. 제12항에 있어서, CBA 프로모터가 서열식별번호: 13을 포함하는 핵산 서열을 갖는 것인 rAAV.
  14. 제12항에 있어서, CBA 프로모터가 서열식별번호: 13으로 이루어진 핵산 서열을 갖는 것인 rAAV.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터인 rAAV.
  16. 제15항에 있어서, CDKL5 유전자-특이적 내인성 프로모터가 서열식별번호: 14의 동일 길이 영역에 대해 적어도 95% 동일한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 rAAV.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 5'-ITR 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 3'-ITR 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열이 AAV2로부터의 것인 rAAV.
  20. 제19항에 있어서, 5'-ITR 서열 및 3'-ITR 서열이 서열식별번호: 11을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 rAAV.
  21. 제17항 또는 제18항에 있어서, 5'-ITR 서열 및/또는 3'-ITR 서열이 비-AAV2 공급원으로부터의 것인 rAAV.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 폴리아데닐화 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
  23. 제22항에 있어서, 폴리아데닐화 신호 서열이 SV40 폴리아데닐화 신호 서열, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 신호 서열 및 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호 서열로부터 선택된 것인 rAAV.
  24. 제23항에 있어서, 폴리아데닐화 신호 서열이 SV40 폴리아데닐화 신호 서열인 rAAV.
  25. 제24항에 있어서, SV40 폴리아데닐화 신호 서열이 서열식별번호: 15를 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 rAAV.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 1종 이상의 인핸서 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
  27. 제26항에 있어서, 인핸서가 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 유전자 인핸서, 트랜스티레틴 인핸서 (enTTR), 닭 β-액틴 (CBA) 인핸서, En34 인핸서 및 아포지단백질 E (ApoE) 인핸서로부터 선택된 것인 rAAV.
  28. 제27항에 있어서, 인핸서가 CMV 극초기 유전자 인핸서인 rAAV.
  29. 제28항에 있어서, 인핸서가 서열식별번호: 17을 포함하거나 또는 그로 이루어진 서열을 갖는 것인 rAAV.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서가 프로모터 서열의 상류에 위치하는 것인 rAAV.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 1종 이상의 인트론 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
  32. 제31항에 있어서, 인트론이 SV40 소형 T 인트론, 토끼 헤모글로빈 서브유닛 베타 (rHBB) 인트론, 인간 베타 글로빈 IVS2 인트론, β-글로빈/IgG 키메라 인트론 및 hFIX 인트론으로부터 선택된 것인 rAAV.
  33. 제32항에 있어서, 인트론이 SV40 소형 T 인트론인 rAAV.
  34. 제33항에 있어서, SV40 소형 T 인트론이 서열식별번호: 18을 포함하거나 또는 그로 이루어진 서열을 갖는 것인 rAAV.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  36. 인간 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 rAAV 또는 제35항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, rAAV 또는 조성물이 피하로, 근육내로, 피내로, 복강내로, 척수강내로, 뇌실내로, 정맥내로 또는 대수조내 전달을 통해 투여되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, rAAV 또는 조성물이 척수강내로 투여되는 것인 방법.
  39. 제37항에 있어서, rAAV 또는 조성물이 대수조내 전달을 통해 투여되는 것인 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  41. 먼저 인간 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여한 다음, 후속적으로 치료 유효량의 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 여기서 상기 벡터 게놈은 프로모터 서열 및 CDKL5에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
  42. 인간 대상체에게 치료 유효량의 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 투여하는 것을 포함하며,
    여기서 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고,
    여기서 상기 벡터 게놈은 프로모터 서열 및 CDKL5에 대한 코딩 서열을 포함하고,
    여기서 인간 대상체는 코르티코스테로이드를 투여받은 것인,
    인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
  43. 먼저 인간 대상체에게 코르티코스테로이드를 투여한 다음, 후속적으로 치료 유효량의 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 rAAV 또는 제35항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
  44. 코르티코스테로이드를 투여받은 인간 대상체에서 치료 유효량의 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 rAAV 또는 제35항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 코르티코스테로이드가 프레드니솔론, 프레드니손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 트리암시놀론, 메틸프레드니솔론, 부데소니드, 베타메타손 및 데플라자코르트로부터 선택된 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 코르티코스테로이드가 프레드니솔론인 방법.
  47. 먼저 인간 대상체에게 IgG-분해 프로테아제를 투여한 다음, 후속적으로 치료 유효량의 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 rAAV 또는 제35항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
  48. IgG-분해 프로테아제를 투여받은 인간 대상체에서 치료 유효량의 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 rAAV 또는 제35항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 CDKL5 결핍 장애 (CDD)를 치료하는 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, IgG-분해 프로테아제가 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 IdeS 또는 그의 조작된 변이체인 방법.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서, IgG-분해 프로테아제가 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi)의 IdeZ 또는 그의 조작된 변이체인 방법.
  51. 서열식별번호: 19의 서열에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  52. 서열식별번호: 19의 서열에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  53. 핵산 서열이 서열식별번호: 19를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  54. 핵산 서열이 서열식별번호: 19로 이루어진 것인 폴리뉴클레오티드.
  55. 서열식별번호: 20에 대해 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  56. 핵산 서열이 서열식별번호: 20을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  57. 핵산 서열이 서열식별번호: 20으로 이루어진 것인 폴리뉴클레오티드.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4127189A1 (en) * 2020-03-31 2023-02-08 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy for treating propionic acidemia
EP4150051A4 (en) * 2020-04-27 2025-05-21 The Trustees of The University of Pennsylvania COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CDKL5 DEFICIENCY DISORDER (CDD)
EP4387641A4 (en) * 2021-08-18 2025-07-09 Ultragenyx Pharmaceutical Inc RECOMBINANT AAV FORMULATIONS
EP4349365A1 (en) * 2022-10-07 2024-04-10 Hansa Biopharma AB Co-treatment for gene therapy
CN115554418B (zh) * 2022-11-22 2023-04-14 四川至善唯新生物科技有限公司 一种重组腺相关病毒载体的药物组合物及其用途
CN116377050A (zh) * 2022-12-16 2023-07-04 湖南家辉生物技术有限公司 一种发育性癫痫性脑病2型致病基因cdkl5突变位点的应用及其检测试剂和应用
WO2024238958A1 (en) 2023-05-18 2024-11-21 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Formulations comprising recombinant aav and methods of administering the same
WO2025122548A1 (en) * 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of disorders related to cdkl5 deficiency
WO2025155923A1 (en) 2024-01-17 2025-07-24 The Broad Institute, Inc. Aav capsid modifications that enable improved cns-wide gene delivery through interactions with the transferrin receptor
WO2025217163A2 (en) 2024-04-08 2025-10-16 The Broad Institute, Inc. Novel aav capsids binding to human cd59
WO2025217174A1 (en) 2024-04-08 2025-10-16 The Broad Institute, Inc. Aav capsid modifications that enable improved cns-wide gene delivery through interactions with carbonic anhydrase iv

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL188795C (nl) 1982-12-23 1992-10-01 Suwa Seikosha Kk Werkwijze voor het vervaardigen van een kwartsglas.
SG10201506627PA (en) 2001-11-13 2015-10-29 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
ES2975413T3 (es) 2001-12-17 2024-07-05 Univ Pennsylvania Secuencias de serotipo 8 de virus adenoasociado (AAV), vectores que las contienen y usos de las mismas
PL1625210T3 (pl) 2003-05-21 2011-05-31 Genzyme Corp Sposoby wytwarzania preparatów rekombinowanych wirionów AAV zasadniczo niezawierających pustych kapsydów
PT2657248T (pt) 2003-06-19 2017-06-26 Genzyme Corp Viriões aav com imunorreatividade diminuída e seus usos
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
CN102212558B (zh) 2003-09-30 2016-08-03 宾夕法尼亚大学托管会 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用
CN101203613B (zh) 2005-04-07 2012-12-12 宾夕法尼亚大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
PL2191001T4 (pl) 2007-04-09 2017-01-31 University Of Florida Research Foundation, Inc. Kompozycje wektora RAAV mające białka kapsydu zmodyfikowane tyrozyną i sposoby ich zastosowania
US9611302B2 (en) 2007-04-09 2017-04-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
DK2242840T3 (da) 2008-01-29 2019-10-21 Applied Genetic Tech Corporation Produktion af rekombinant adeno-associeret virus under anvendelse af bhk-celler i suspension
US8679837B2 (en) 2009-04-02 2014-03-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Inducible system for highly efficient production of recombinant Adeno-associated virus (rAAV) vectors
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
JP2013517798A (ja) 2010-01-28 2013-05-20 ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア ウイルスベクター精製における拡張可能な製造プラットフォームおよび遺伝子治療における使用のための高純度ウイルスベクター
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
US10392632B2 (en) 2011-02-14 2019-08-27 The Children's Hospital Of Philadelphia AAV8 vector with enhanced functional activity and methods of use thereof
EP2699270B1 (en) 2011-04-22 2017-06-21 The Regents of The University of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
PE20150163A1 (es) 2012-04-18 2015-02-23 Philadelphia Children Hospital Composicion y metodos para una transferencia de genes altamente eficiente usando variantes capside aav
US10294281B2 (en) 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
US10266845B2 (en) 2013-02-08 2019-04-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhanced AAV-mediated gene transfer for retinal therapies
ES2739288T3 (es) 2013-09-13 2020-01-30 California Inst Of Techn Recuperación selectiva
PL3198018T3 (pl) 2014-09-24 2021-07-19 City Of Hope Warianty wektora wirusa związanego z adenowirusami dla wysokiej skuteczności edycji genomu i jego sposoby
GB201502305D0 (en) 2015-02-12 2015-04-01 Hansa Medical Ab Protein
GB201502306D0 (en) 2015-02-12 2015-04-01 Hansa Medical Ab Protein
US10081659B2 (en) 2015-04-06 2018-09-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Adeno-associated vectors for enhanced transduction and reduced immunogenicity
US10385320B2 (en) 2015-12-02 2019-08-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Recombinant adeno-associated virus capsids with enhanced human skeletal muscle tropism
KR102704583B1 (ko) 2016-02-04 2024-09-06 게노비스 에이비 신규한 스트렙토코커스 프로테아제
CN109415704B (zh) 2016-02-16 2022-02-25 利兰斯坦福初级大学董事会 对先已存在的人中和抗体有抗性的新型重组腺相关病毒衣壳
WO2017165859A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Modified viral capsid proteins
CA3029833A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
CA3114549A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Modified aav capsid proteins and uses thereof
KR20190124309A (ko) * 2017-03-15 2019-11-04 오비드 테라퓨틱스 인크. 발작 장애들의 치료에 있어 디자이너 약물들에 의하여 배타적으로 활성화되는 디자이너 수용체들의 용도
WO2018213786A1 (en) * 2017-05-19 2018-11-22 Encoded Therapeutics, Inc. High activity regulatory elements
WO2018222503A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus with variant capsid and methods of use thereof
JP7196104B2 (ja) 2017-06-05 2022-12-26 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 増強された改変ウイルスカプシドタンパク質
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
IL276859B2 (en) * 2018-02-27 2025-12-01 Univ Pennsylvania Novel adeno-associated virus (aav) vectors, aav vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor
CA3127950A1 (en) 2019-01-28 2020-08-06 Duke University Compositions and methods for evading humoral immunity
EP4038194A1 (en) * 2019-10-04 2022-08-10 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Methods for improved therapeutic use of recombinant aav

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Publication number Publication date
TWI904135B (zh) 2025-11-11
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