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KR102819064B1 - 면역 세포로의 생체분자의 전달 - Google Patents

면역 세포로의 생체분자의 전달 Download PDF

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KR102819064B1
KR102819064B1 KR1020237021840A KR20237021840A KR102819064B1 KR 102819064 B1 KR102819064 B1 KR 102819064B1 KR 1020237021840 A KR1020237021840 A KR 1020237021840A KR 20237021840 A KR20237021840 A KR 20237021840A KR 102819064 B1 KR102819064 B1 KR 102819064B1
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cell
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셜리 마오
조지 하르토울라로스
소피아 리우
메간 하이만
파멜라 바스토
그레고리 제토
싯다르트 준준왈라
대럴 어바인
로버트 에스. 랭거
클래브스 에프. 젠슨
안드리안 율리히 에이치. 폰
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메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

항원과 같은 화합물을 면역 세포의 시토졸로 우선적으로 전달하는 방법 및 장치. 상기 방법은 표적 면역 세포를 포함하는 세포 현탁액을 미세유체 장치를 통해 통과시키는 단계, 및 현탁액을 전달하고자 하는 화합물(들) 또는 페이로드(payload)와 접촉시키는 단계를 포함한다.

Description

면역 세포로의 생체분자의 전달{DELIVERY OF BIOMOLECULES TO IMMUNE CELLS}
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 35 U.S.C.§ 119(e) 하에서 2014년 10월 31일자로 출원된 U.S. 가특허 출원 제62/073,548호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
연방 후원 연구에 대한 성명서
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 GM101420, AI112521, AI111595, 및 AI069259 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 있어 특정 권한을 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 물질에서 세포로의 전달에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 MS-윈도우와 운영 체계 호환성을 갖는 IBM-PC 기기 포맷으로 2015년 10월 30일자로 작성된 2.31 킬로바이트 크기의 "38172-508001WO_Sequence_Listing.txt"의 파일명으로 존재하는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 참고로 포함하며, 이는 본 출원의 일부로서 2015년 10월 30일자로 제출된 텍스트 파일에 담겨져 있다.
세포질로의 다당류, 단백질, 또는 핵산과 같은 거대분자의 전달은 연구 또는 치료 목적을 위해 세포 기능을 일시적 또는 영구적으로 변화시킬 수 있다. 그러나, 일차 면역 세포, 특히 휴지기 림프구로의 세포내 전달을 위한 현존 기술들은 한계를 갖는다. 전기천공법은 상당한 세포 독성을 야기한다. 바이러스 벡터는 휴지기 림프구를 감염시킬 수 없다. 세포 막 투과 (또는 형질도입) 펩티드는 일차 림프구를 효율적으로 형질감염시키지 못한다. 항체-약물 복합체 및 접합체는 각 세포 유형을 위한 특이 항체 및 상이한 페이로드를 운반하기 위한 별개의 설계를 필요로 한다. 게다가, 이들은 생산하는데 많은 비용이 들고 잠재적으로 면역원성이다. 앱타머-siRNA 키메라성 RNA는 어떠한 독성 또는 면역 활성화 없이 생체내에 표적화된 유전자 녹다운을 야기하지만 작은 RNA를 전달하는 데에만 사용되는 것으로 나타났으며, 이들은 관심있는 각 세포에 대한 특정 표적화 앱타머를 확인하는 것을 필요로 한다. 나노입자 및 리포솜 기반 기술에 있어서의 발전이 식세포 항원 제시 세포, 예를 들면, 수지상 세포 및 단핵구/대식세포로의 약물 및 항원의 개선된 세포내 전달을 초래하였지만, 림프구에 대해서는 효과적이지 못하다. 이러한 방법들 중의 대부분은 페이로드의 엔도솜 흡수를 야기하고, 페이로드의 매우 작은 부분(~1-2%로 추정됨) 만이 엔도솜에서 시토졸로 빠져나오며, 여기서 이것은 생물학적 활성을 위한 트래픽을 필요로 한다. 이러한 기술들 중의 다수는 또한 세포에 비생분해성 패킹 또는 전달 물질의 축적을 야기하며, 이것이 세포 기능에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 면역 세포로의 다양한 거대분자의 효율적인 비독성 전달을 가능케 하는 대안적인 기술들이 요구되고 있다.
본 발명은 면역 세포로의 화합물 또는 조성물의 전달과 관련된 이전의 문제들에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명 이전에는, 화합물, 예컨대, 단백질, 핵산, 탄수화물의 도입이 어려웠고 비능률적으로 일어나고/났으며 독성 화합물 또는 바이러스 벡터와 같은 바람직하지 않은 매개체의 존재를 필요로 하였다. 본 발명에 따르면, 면역 세포 기능을 가공하는 방법은 면역 세포의 세포질을 둘러싼 막의 일시적인 교란에 의한 화합물의 세포내 전달을 포함한다. 예를 들면, 화합물을 면역 세포의 시토졸로 우선적으로 전달하기 위한 바이러스 벡터-비함유 방법은 표적 면역 세포를 포함하는 세포 현탁액을 미세유체 장치(microfluidic device)를 통해 통과시키는 단계 및 현탁액을 전달하고자 하는 화합물(들) 또는 페이로드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 장치는 10-60㎛의 협착 길이 및 3-8㎛, 예컨대, 3-4㎛ 또는 4㎛의 협착 폭을 포함한다.
예를 들면, 장치는 2㎛-10㎛의 직경의 협착을 포함한다. 비처리 T 및 B 세포에 관한 바람직한 구현예에서, 장치는 약 10, 15, 20, 25, 30, 또는 10-30㎛의 길이, 약 3, 3.5, 4, 또는 3-4㎛의 폭, 약 15, 20, 25, 또는 15-25㎛의 깊이, 및/또는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 5-15도 각도를 갖는 협착을 포함한다.
협착을 통한 통과 후, 면역 세포로 전달되는 화합물의 양은 비-면역 세포로 전달된 것보다 또는, 예컨대, 세포내이입(endocytosis) 단독에 의한 세포 스퀴징의 부재하에서 면역 세포로 전달되는 양에 비해 적어도 10%(예컨대, 20%, 50%, 2배, 5배, 10배, 또는 그 이상) 더 크다. 예를 들면, 면역 세포는 B 세포, T 세포, 대식세포, 또는 수지상 세포를 포함한다. 우선적으로 면역 세포로의 페이로드의 전달을 위해, 예시적인 장치는 세포가 통과하는 30㎛의 협착 길이 및 4㎛의 협착 폭을 포함하는 하나 이상의 채널을 특징으로 한다.
섭씨 0 내지 45도의 온도, 예컨대, 0-25℃가 세포 처리 동안 사용된다. 예를 들면, 비처리 T 세포, B 세포 및/또는 단핵구의 처리는 4-8℃의 온도에서, 예컨대, 빙상에서 수행된다. 또 다른 예에서, 수지상 세포, 활성화 T 세포, 및/또는 활성화 B 세포는 20-25℃의 온도에서, 예컨대, 전형적인 주위 실온에서 장치를 사용하여 처리된다.
페이로드는 면역 세포의 세포질로 전달하고자 하는 임의의 분자 또는 화합물을 함유한다. 예를 들면, 화합물은 항원, 예컨대, 질환-관련 항원, 예를 들면, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 진균 항원을 포함한다. 항원은 정제될 수 있거나 다른 성분들의 혼합물일 수 있으며, 예컨대, 항원은 종양 세포 용해물 또는 대상체, 예컨대, 전염병에 걸린 대상체로부터의 생검 감염되거나 질환에 걸친 조직의 용해물과 같은 세포 용해물에 존재한다. 몇몇 예에서, 항원은 전체, 전장 (또는 비가공된) 단백질 항원, 예컨대, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산의 길이를 초과하는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 다른 적하 분자는 핵산, 예를 들면, siRNA, mRNA, miRNA, 암호화 또는 비-암호화 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 소분자, 예컨대, 소분자 프로브를 포함한다. 핵산, 예를 들면, DNA, 예컨대, 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드가 또한 바이러스 벡터를 필요로 하지 않으면서 이러한 방식으로 전달된다.
몇몇 예에서, 면역 세포는 활성화된 상태에 비해 휴지 상태에 있다. 예를 들면, 세포는 다음 마커들의 발현을 특징으로 한다: CD25, KLRG1, CD80, CD86, PD-1, PDL-1, CTLA-4, CD28, CD3, MHC-I, MHC-II, CD62L, CCR7, CX3CR1 및 CXCR5, 이들 각각은 가공(기재된 방법들을 사용하여 분자를 면역 세포로 도입함으로써 증가 또는 감소)될 수 있다. 세포 현탁액은 가공된 세포, 예컨대, 재현탁된 연막 세포(분별된 백혈구 세포) 또는 전혈을 포함한다. 비처리 면역 세포, 예컨대, T 세포는 (활성화된 세포에 비해) CD25, CD80, CD86, PD-1, 및 CTLA-4의 비교적 낮은 수준의 발현 및 비교적 높은 수준의 CCR7을 특징으로 한다.
비-면역 세포에 비해 화합물을 면역 세포로 우선적으로 전달하기 위한 장치는 적어도 하나의 미세유체 채널을, 예컨대, 시린지 형태로 포함하거나, 또는 다수의 채널을, 예컨대, 마이크로칩 또는 미세유체 장치의 형태로 포함한다. 예를 들면, 채널은 30㎛의 협착 길이 및 4㎛의 협착 폭을 포함한다.
본 발명은 또한 화합물의 세포내 전달에 의해 면역 세포 기능을 가공하는 방법을 포함하며, 여기서 전달은 면역 세포의 세포질을 둘러싼 막을 일시적으로 교란시키고 항원을 시토졸로 전달함으로써 매개된다. 예를 들면, 항원은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 아미노산의 길이를 포함하고, 여기서, 면역 세포는 항원을 길이가 11개 아미노산 미만인 펩티드로 가공한다. 이때 세포는 면역 세포의 표면 상에 더 짧아지고 가공된 펩티드, 항원의 I종 조직적합 항원 제한 가공 형태를 나타낸다. 예를 들면, CD8+ T 세포 또는 세포독성 T 세포로의 I종 제시를 위해 가공된 MHC/HLA에 대한 펩티드는 8-10개 잔기의 범위이고, CD4+ T 세포 또는 헬퍼 세포로의 MHC/HLA II종 제시를 위해 가공된 펩티드는 14-20개 잔기의 범위이다. 8개 잔기보다 더 짧은 펩티드(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 잔기)가 다른 T 세포 타입 또는 NK 세포로의 제시를 위해 유용하다.
예를 들면, 면역 세포를 2㎛-10㎛의 직경의 협착을 통해 통과시킴으로써 세포 막이 교란된다. 세포 스퀴징에 의해 시토졸로 전달된 항원은 전장의 비가공된 단백질이거나 또는 항원 제시 세포에 의한 항원 제시를 위해 조직적합 항원에 결합하기에 적합한 크기/길이로 가공되어야 하는 펩티드이다. 면역 세포 기능을 가공하는 방법은 항원-부하된 면역 세포를 효과기 T 세포와 접촉시키고 세포독성 T 세포 면역 반응을 활성화시킴을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 스퀴징된 항원-부하 면역 세포는 B 세포, 수지상 세포 또는 대식세포를 포함한다. 또 다른 예에서, 스퀴징된 항원-부하 면역 세포는 T 세포를 포함한다. 어느 경우에나, 스퀴징된 항원 부하 면역 세포는 스퀴징, 예컨대, 세포내이입 또는 음세포작용 단독에 의한 흡수의 부재하에서 동일한 항원 또는 페이로드와 접촉된 면역 세포에 비해 적어도 10%, 25%, 50%, 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 또는 그 이상의 항원 또는 기타의 페이로드 조성물을 포함한다.
면역 세포의 기능, 활성, 또는 활성화 상태는 이러한 처리 후 변화된다. 예를 들면, T 세포 상에 항원 제시 표현형을 부여하는 방법은 상기한 바와 같은 미세유체 장치를 통해 T 세포를 통과시킴으로써 항원, 예컨대, 전체 비가공된 단백질 또는 이의 단편을 T 세포의 시토졸로 전달함으로써 수행된다. 예를 들면, 장치는 약 2㎛-10㎛의 직경의 협착을 포함하며, T 세포는 미세유체 장치 통과 후 T 세포의 표면 상에 항원의 I종 조직적합 항원-제한된, 가공된 형태를 포함한다. 방법은 제1 (스퀴징된, 항원-부하) T 세포를 제2 T 세포와 접촉시킴을 추가로 포함할 수 있으며, 제2 T 세포는 I종 조직적합 항원 제한된 세포독성 T 세포 표현형을 포함한다. 예시적인 항원은 하나 이상의 종양 항원, 예컨대, 종양 항원의 혼합물, 예를 들면, 종양 생검 용해물, 또는 바이러스 항원을 포함한다. 이러한 방식으로의 항원-부하 T 세포의 생산이 시험관내 및/또는 생체내에서 사용되어 세포독성 T 세포 반응을 발휘한다. 따라서, 항원에 특이적인 세포독성 T 세포 반응을 활성화시키기 위한 세포-스퀴징된, 항원 부하된 T 세포 반응의 사용이 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 이러한 T 세포는 전달/부하되는 항원에 따라 종양 세포를 사멸시키고/시키거나 바이러스-감염된 세포를 사멸시킴으로써 임상적 유용성을 부여한다.
본원에 기재된 조성물은 정제된다. 정제된 화합물은 관심 화합물의 적어도 60중량%(건조 중량)이다. 바람직하게는, 제제는 관심 화합물의 적어도 75중량%, 보다 바람직하게는 적어도 90중량%, 가장 바람직하게는 적어도 99중량%이다. 순도는 임의의 표준방법에 의해, 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 HPLC 분석에 의해 측정된다. 예를 들면, 화합물, 예컨대, 단백질 항원은 천연에서 발생하는 하나 이상의 화합물로부터 분리되었다. 세포의 경우에, 정제된 집단이 선택된 세포 유형의 적어도 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%이다. 세포 분류기와 같은 장치를 사용하여 크기 또는 세포 표면 마커 발현에 의해 분리함을 포함하여 특정 세포 타입을 정제하거나 증폭하는 방법이 널리 공지되어 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 이의 바람직한 구현예의 하기 설명으로부터 및 청구항으로부터 자명해질 것이다. 본원에 인용된 모든 참조문헌은 참고로 포함된다.
도 1a는 전달 시스템을 보여주는 일련의 다이아그램이다. 시스템을 설정하기 위해, 각각의 미세유체 칩을 폴리카보네이트 유체 저장소와 접속할 수 있는 홀더에 탑재한다. 시스템을 작동시키기 위해, 전달하고자 하는 거대 분자를 세포와 혼합하고, 약 30-150㎕의 용적으로 장치 저장소에 부하한 다음 압력 공급원에 연결하여 미세유체 채널을 통한 유동을 유도한다. 도 1b는 세포 변형 및 페이로드 전달을 보여주는 다이아그램이다. 세포가 채널을 통해 유동함에 따라, 이들은 협착에서 변형하여, 막 교란을 야기한다. 그후 유체 중의 거대분자는 교란된 막을 통해 확산되고 막이 복구된 후 세포에 갇히게 된다. 이러한 도면들은 세포 스퀴징에 의한 전달을 입증한다.
도 2a 및 b는 뮤린 면역 세포로의 덱스트란 및 항체 전달을 보여주는 히스토그램 및 막대 그래프이다. 도 2a는 APC-표지된 IgG1을 전달하기 위해 CellSqueeze 장치에 의해 처리된 T 세포, B 세포 및 골수 세포 (CD11b+)의 대표적인 히스토그램을 보여준다. 도 2b는 전달 효율을 보여준다. 모든 결과는 처리한지 한 시간 내에 유동 세포계측에 의해 측정하였다. 죽은 세포는 요오드화프로피듐 염색에 의해 배제시켰다. 도 2b의 데이터(평균±SD)는 3가지 독립 실험으로부터의 것이다. 비처리 세포는 장치를 거치지 않거나 생체분자에 노출시켰다. '비 장치(no device)' 샘플은 생체분자와 함께 항온처리하였지만, 장치로 처리하지는 않았다. 이러한 대조군은 표면 결합, 세포내이입 및 기타의 백그라운드 효과를 을 설명하기 위한 것이다.
도 3a-d는 인간 면역 세포로의 덱스트란, 항체 및 siRNA의 전달을 보여주는 그래프이다. 도 3a에서, 인간 T 세포 및 MDDC를 캐스케이드 블루 표지된 3kDa 덱스트란, 플루오레세인 표지된 70kDa 덱스트란, 및 APC 표지된 IgG1의 전달에 대해 시험하였다. 30-4 (T 세포) 및 10-7 (MDDC) 장치(좌측) 및 장치 설계에 걸친 레플리케이트(우측)에 대한 대표적인 히스토그램이 나타내어져 있다. 도 3b는 각각 CD4+ T 세포 및 MDDC에서의 CD4 및 DC-SIGN 단백질 수준의 siRNA 매개된 녹다운을 보여준다. 용량 또는 협착 크기에 대한 녹다운 의존성을 평가하기 위해 상이한 siRNA 농도 및 장치 설계를 시험하였다. 도 3c는 인간 조절성 T 세포 또한 30-4 장치에 의한 처리에 대한 반응으로 CD4 발현의 상당한 녹다운을 나타내었음을 보여준다. 죽은 세포는 전달 또는 녹다운 분석에 배제시켰다. 도 3d는 Amaxa에 의한 뉴클레오펙션에 대한 T 세포에서의 장치 성능의 비교를 보여준다. CD4에 대한 siRNA의 전달 후 72 시간 후의 단백질 발현이 두 시스템에 대해 나타내어져 있다. 두 가지 방법에 의한 처리 후의 세포 생존력이 또한 나타내어져 있다.
도 4a-b는 내인성 및 바이러스성 유전자의 표적화된 녹다운에 의한 HIV 감염의 억제를 보여주는 그래프이다. 도 a에서, p24 항원에 대한 세포내 염색이 감염 24시간 후 처리된 인간 CD4+ T 세포에서의 HIV 감염 수준의 지표로서 사용되었다. 이러한 연구에서, vif 및/또는 gag, siRNA는 감염 24 시간 전에 전달되는 반면 CD4 siRNA는 감염 48 시간 전에 전달되었다. 도 4n은 실험 조건의 반복(min. N=4)에 걸쳐 p24 항원 염색의 중간 형광 강도를 보여준다. 데이터는 평균 + 1 표준 오차로서 나타내어 진다.
도 5는 백신화 방법의 다이아그램이다.
도 6은 뮤린 일차 면역 세포로의 3 kDa 및 70 kDa 덱스트란 및 항체의 흡수를 보여주는 일련의 선 그래프이다. 전달 효율 값을 계산하는데 사용되는 게이팅이 나타내어져 있다. 이들 데이터는 도 2에 나타낸 실험에 상응한다. 회색의 채워진 히스토그램은 비처리 세포를 나타내고, 흑색은 물질에 노출되었지만 장치로 처리되지 않은 세포를 나타내며, 채워지지 않은 회색은 표적 생체분자의 존재하에서 장치로 처리된 세포를 나타낸다.
도 7은 도 2에 나타낸 실험에 상응하는 세포 생존력 데이터를 보여주는 일련의 막대 그래프이다. ***는 30-4 장치로 처리된 세포의 생존력을 비 장치 또는 비 처리의 경우와 비교하여 p < 0.001임을 나타낸다. 장치로 처리된 B 세포 및 골수 세포의 생존력에 있어서의 변화는 비처리 또는 비 장치의 경우와 유의적으로 상이하지 않았다.
도 8은 골수-유래 수지상 세포(BMDC)로의 덱스트란 및 항체의 전달을 보여주는 일련의 그래프이다. BMDC는 골수 세포를 GM-CSF 함유 배지 중에서 8일간 배양함으로써 C57BL6 마우스로부터 생성되었다. 캐스케이드 블루-표지된 3 kDa 덱스트란, 플루오레세인-표지된 70 kDa 덱스트란, 및 APC-표지된 IgG1은 두 가지 장치 설계, 10-6 및 30-6을 사용하여 전달되었다.
도 9는 항체 및 덱스트란 전달의 상관성을 보여주는 그래프이다. 물질과 항온처리, 즉, 비 장치(흑색 점; 하부 좌측)와 비교하여 30-4 장치(회색 점; 중심, 상부 우측)를 사용한 T 세포로의 덱스트란 (3 kDa 및 70 kDa) 및 항체 전달.
도 10은 인간 CD4+ T 세포의 생존력을 보여주는 막대 그래프이다. 장치를 통과하는 세포는 비처리 대조군에 비해 감소된 생존력을 갖지만 뉴클레오펙션을 겪은 세포보다는 양호한 생존력을 갖는다. 일원 ANOVA에 이은 Boneferroni's 검정을 사용하여 통계적 유의도를 계산하였다. *는 p < 0.05를 나타내고 ***은 p < 0.001을 나타낸다. 다른 비교 그룹들은 유의적으로 상이한 생존력을 나타내지 않았다(즉, 비처리 또는 30-4에 비해 10-4, 및 뉴클레오펙션에 비해 30-4).
도 11은 인간 MDDC에 대한 상이한 장치 설계 시험으로부터의 전달 (상부) 및 생존력 (하부) 결과를 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 캐스케이드 블루 표지된 3kDa 덱스트란, 플루오레세인 표지된 70 kDa 덱스트란, 및 APC 표지된 IgG1 동종 대조군 항체는 6개의 상이한 장치 설계를 사용하여 그리고 Amaxa 뉴클레오펙션을 사용하여 전달되었다. 생존력 및 전달 결과는 처리 직후 측정하였다.
도 12는 Alexa 488 또는 Alexa 647 표지된 siRNA 및 3 kDa 캐스케이드 블루 표지된 덱스트란이 10-4i 장치에 의해 인간 CD4 T 세포로 및 30-5x5i 장치에 의해 뮤린 B 세포로 동시에 전달되었음을 보여주는 일련의 그래프이다. 데이터는 두 가지 물질의 전달이 밀접한 상관성이 있음을 나타낸다. 이 결과는 제안된 확산 전달 메카니즘과 일관되며, 즉, 전달 효율은 화학 구조 보다는 물질 크기에 크게 좌우된다.
도 13은 CD45RA 발현을 보여주는 그래프이다. CD45RA에 대한 siRNA는 10-4 장치에 의해 인간 T 세포로 전달되었다. 녹다운은 처리한지 72시간 후 유동 세포계측에 의해 측정하였다.
도 14는 (전달한지 48시간 후 PCR에 의해 측정된 바와 같은) CD4 mRNA 녹다운을 보여주는 막대 그래프이다.
도 15는 유동 세포계측에 의해 측정되는 바와 같이 처리후 2주에 걸쳐 CD4+ 인간 T 세포에서의 CD4의 발현 수준을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. CD3 수준을 또한 대조군 유전자로서 측정하였다.
도 16은 인간 단핵구로의 모형 적하물(model cargo), 덱스트란의 전달을 보여주는 일련의 그래프이다. 단핵구는 인간 혈액으로부터 유도되었다. 캐스케이드 블루 표지된 3 kDa 덱스트란, 및 플루오레세인 표지된 70 kDa 덱스트란은 두 가지 상이한 작동 압력에서 네 개의 상이한 장치 설계를 사용하여 전달되었다. 0psi 케이스는 덱스트란에만 노출되었을 뿐 장치로 처리되지는 않은 대조군에 상응한다. 생존력은 요오드화프로피듐 염색에 의해 측정하였다.
도 17은 인간 B 세포로의 덱스트란의 전달을 보여주는 일련의 그래프이다. B 세포는 인간 혈액으로부터 유도되었다. 캐스케이드 블루 표지된 3 kDa 덱스트란, 및 플루오레세인 표지된 2 MDa 덱스트란은 두 가지 상이한 작동 압력에서 네 개의 상이한 장치 설계를 사용하여 전달되었다. 0psi 케이스는 덱스트란에만 노출되었을 뿐 장치로 처리되지는 않은 대조군에 상응한다. 생존력은 요오드화프로피듐 염색에 의해 측정하였다.
도 18은 처리한지 72 시간 후의 DC-Sign의 측정된 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 단백질 녹다운은 6개의 상이한 장치 설계에 걸쳐 측정하고 뉴클레오펙션과 비교하였다. 뉴클레오펙션은 대조군 siRNA 전달의 경우에도 DC-Sign의 ~50% 비특이 녹다운을 야기하는 것을 보인다는 것을 주지한다. 이것은 전기천공 처리로 인한 오프-타겟 효과(off-target effect)를 나타낼 수 있으며, 즉, 전기장에의 세포의 노출이 세포, 특히 표적 단백질에 손상을 초래하여, 단백질을 표적화하는 siRNA의 부재하에서 발현 수준의 측정된 감소를 야기한다. 이러한 결과는 막 변형 방법이 비특히 (오프-타겟) 효과와 관련된 전기천공/뉴클레오펙션 방법에 비해 더욱 특이적임을 나타낸다.
도 19는 전혈에서 세포로의 불투과성 Alexa-488 표지된 10 kDa 덱스트란 염료의 전달에 관한 데이터를 보여주는 일련의 그래프이다. 형광 표지된 염료를 전혈과 혼합하고, 전혈 + 표지된 염료의 혼합물을 장치로 퍼지게 한 다음 RBC 용해 후 FACS에 의해 혈액 세포로의 전달에 대해 측정하였다. 결과는 염료가 세포로 성공적으로 전달되었으며 "세포 불투과성"을 특징으로 하는 적하 화합물이 세포 스퀴징을 사용하여 면역 세포로 효과적으로 전달된다는 것을 입증한다. 전달 과정이 전혈에서 작동한다는 것이 놀랍다. 전혈은 정제, 예컨대, 적혈구 세포로부터 말초 혈관 단핵 세포의 분멸 또는 분리 없이 가공하기가 매우 어려운데, 본원에 개시된 장치는 전혈 웰에서 화합물을 면역 세포로 전달할 수 있다. 비제한적인 예에 대해, 도 33 및 34 참조.
도 20은 미세유체 막 교란 시스템의 다이아그램이다.
도 21a-b는 Optimem 완충액 중에서 120 psi에서 10-4 칩으로 전달한지 하루 후의 mRNA 발현을 보여주는 점 도표이다.
도 22a는 상이한 칩 각도로 상이한 압력에서 10 kDa Alexa 488-표지된 덱스트란의 전달을 보여주는 다이아그램이고 도 22b는 막대 그래프이다. 괄호 안의 숫자는 협착 각도이다. 칩 각도는 0-180도 범위, 예컨대, 11-105도 범위이다. 도식은 칩 각도를 나타낸다. 깊이 파라미터는 2㎛ 내지 1 mm, 예컨대, ~20μm 범위이고 U.S. 특허 공보 제20140287509호(본원에 참고로 포함됨)에 추가로 기재되어 있다. 예시적인 파라미터는 비처리 T 및 B 세포에 대해 0-30㎛ 길이/3-4㎛ 폭/20㎛ 깊이/11도 각도를 포함한다.
도 23은 NK 세포 및 pDC로의 전사 인자 전달을 보여주는 선 그래프이다. Oct4 mRNA 발현은 마우스 비장 NK 세포로의 Oct4 재조합 단백질의 전달 후 4시간 후에 측정하였다. 이러한 데이터는 전사 인자가 활성이며 내인성 Oct4의 발현을 유도할 수 있음을 나타낸다. Oct4 전사 인자는 iPS 생성에 필요한 네 가지 인자(Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) 중의 하나이며 자체로 포지티브 피드백 조절를 발휘한다. 활성 Oct4 단백질의 전달은 증가된 Oct4 mRNA 발현을 산출한다. 활성 전사 인자의 전달은 단백질-기반 방법을 위한 재프로그래밍 공정에서 중대한 단계이다. 이러한 방법은 통합 위험을 최소화시키기 때문에 바이러스 및 DNA 기반 시스템을 능가하는 다수의 이점을 갖는다.
도 24a-b는 스퀴징에 대한 반응으로 어떠한 정상적인 DC 기능의 검출된 억제도 관찰되지 않았음을 보여주는 선 그래프이다. 도 24a: 비장 DC를 스퀴징에 의한, 항원 세포내이입 단독에 의한 처리 후 LPS (1ug/ml) 중에서 배양하였으며, 비처리된 세포는 CD80 및 CD86 발현을 상향조절하는 능력에 있어서 검출 가능한 차이를 보이지 않았다. 비 자극된 세포내이입 조건 및 4℃에서 유지된 비처리 세포가 대조군으로서 사용되었다. 도 24b: CD45 유사유전자형 마우스로부터의 비장 DC를 LPS (1ug/ml)를 갖는 C57BL6 마우스의 발바닥에 주사하고 주사한지 18 시간 후 빼낸 림프절에서 회수하였다. 림프절 회귀성에 있어서는 유의적인 차이가 검출되지 않았다.
도 25a-d는 막 변형 장치 시스템 및 방법의 사용이 다른 항원 전달 접근법에 비해 보다 효과적인 항원 제시를 야기함을 보여주는 그래프이다. 도 25a: 피하 DC 백신접종에 대한 반응으로 입양 전달된 CD8+ OT-I T 세포의 생체내 증식. 장치 처리된 BMDC(0.1 mg/ml의 Ova)는 항원을 세포내이입할 수 있는 것에 비해 T 세포 증식에 있어서 유의적인 증가(P < 0.0001)를 입증하였다. 도 25b: Ova 발현 흑색종 세포주(B16F10)의 세포 용해물로 처리된 BMDC와 공동배양된 CD8+ OT-I T 세포의 시험관내 증식. %는 10-6 CellSqueeze 장치에 의한 처리 전 BMDC 세포 현탁액에 첨가된 세포 용해물 물질의 분율을 나타낸다. CD8 T 세포는 APC와 접촉 전에 카복시플루오로세인 석신이미딜 에스테르 (CFSE)로 표지되었다. 이들이 증식하면, CFSE 염료가 딸 세포 사이에 분포하여 세포당 보다 낮은 형광 강도를 야기한다. 비증식된 T 세포는 높은 CFSE 강도를 보유한다. 도 25c: 항원-특이 IFNγ 분비 CD8 T 세포의 분율을 측정한다. 이러한 실험에서는, 마우스를 입양 전달된 OT-I T 세포의 부재하에서 Ova에 대해 백신접종하였다. 내인성, 항원 특이 반응은 백신접종한지 7일 후 백신접종된 마우스의 비장을 분리하고 이들을 시험관내에서 SIINFEKL 펩티드 (OVA 에피토프)로 재자극함으로써 측정하였다. 항원-특이 CD8 T 세포는 재자극에 대한 반응으로 IFNγ를 분비한다. 도 25d; 두 가지 상이한 장치 설계로 처리한 B 세포와 공동배양된 CD8+ OT-I T 세포의 시험관내 증식(0.1 mg/m1 Ova). CpG가 이러한 실험에서 아주반트로서 사용되었다.
도 26은 생체내 CFSE 증식 검정의 결과를 보여주는 그래프이다: 이 그래프는 항원 특이 CD8 T 세포의 증식을 측정한다. CD8 T 세포가 마우에서 활성화되고 증식됨에 따라 이들이 CFSE 염료를 희석시키고 더 낮은 형광 강도를 갖는다. 이 경우, 장치로 처리된 공여체 T 세포 또는 양성 대조군은 수용체 마우스에서 CD8 T 세포의 훨씬 더 큰 활성화 및 증식을 야기하였다. 이에 반해 세포내이입 대조군은 최소한의 효과를 나타낸다.
도 27은 항원 처리된 야생형 T 세포로의 백신접종에 대한 반응으로 마우스에서의 항원 특이 OT-I T 세포의 증식을 보여주는 일련의 히스토그램이다. T 세포 증식 반응은 CFSE 염색에 의해 측정되며, 염색은 세포가 증식함에 따라 희석된다. 보다 낮은 강도는 보다 큰 반응을 나타내고, 보다 높은 강도 피크는 반응이 없음/덜함을 나타낸다. 각 컬럼은 동일한 마우스로부터 유도된 림프절 및 비장을 갖는 실험의 레플리케이트를 나타낸다. 각 컬럼의 실험은 3마리의 마우스를 포함하였다(총 9마리 마우스).
도 28a-b는 DQ-OVA+3kDa-덱스트란+ T 세포 둘 다에 대한 게이팅을 보여주는 히스토그램이다.
도 29는 항원 제시 세포로서의 마우스 T 세포의 사용을 입증하는 막대 그래프이다. 비가공 알부민 항원을 부하하기 위해 세포 스퀴징에 의해 처리된 T 세포를 OT-1 (SIINFEKL-특이 T 세포주)와 배양하고 활성화 마커, CD25 및 CD69를 평가하였다.
도 30은 항원 제시 세포로서 B 세포의 스퀴즈-매개된 생산을 수행하고 특성화하기 위한 예시적인 과정의 개략도이다.
도 31은 세포-스퀴징된 B 세포는 강력한 CD8+ T 세포 증식을 유도함을 보여주는 일련의 히스토그램이다.
도 32는 세포-스퀴징된 수지상 세포(OVA 전달된)는 감마 인터페론을 분비함을 보여주는 일련의 히스토그램이다.
도 33은 비변형 전혈에서 직접 인간 B 및 T-세포로의 10kDa 물질의 전달을 보여주는 데이터 및 카툰을 보여준다.
도 34는 전혈에서의 생존력 및 전달 효율을 보여주는 그래프이다.
벡터-비함유 미세유체 전달 플랫폼(CellSqueeze)이 최소한의 세포독성으로 예컨대, 마우스, 인간의 일차 면역 세포의 시토졸로 직접 거대분자를 전달하는데 사용된다. 이러한 접근법의 근간이 되는 원리는 표적 세포의 신속한 기계적 변형, 또는 스퀴징에 의한 일시적인 막 교란이며, 이것은 유체 매질에서의 거대분자의 확산에 의한 흡수를 가능케 하며 이후에 세포 막 회복이 뒤따른다(문헌 참조; 예컨대, U.S. 특허 공보 제20140287509호, 본원에 참고로 포함됨. 미세유체 설계의 라이브러리를 사용하여, 덱스트란 중합체, 항체 및 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같은 시험 화합물의 흡수가 일차 인간 및 뮤린 T 세포, B 세포, 단핵구/대식세포, 및 수지상 세포+로 전달되었다. 결과는 각종 상이한 크기 및 유형의 거대분자를 전달하는 플랫폼의 유용성을 입증한다. 다양한 세포 직경(~8-30㎛), 분명한 형태, 이방성 및 막 가요성을 갖는 상이한 종류의 면역 세포로의 물질의 효율적인 전달은 상이한 세포 유형에 대한 특이적인 조건의 확인을 필요로 한다. 세포 스퀴징을 위해서는, 협착의 폭이 중요한 파라미터이며, 기하적 요소, 속도, 완충액, 및 온도와 같은 기타의 파라미터들 또한 적하물의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 비처리 T 또는 B 세포로의 적하물의 전달을 위한 예시적인 협착 폭은 3-4㎛의 범위이며; 활성화된 T 또는 B 세포로의 전달을 위해서는 4-6㎛이고; 수지상 세포로의 전달을 위해서는 6-8㎛이다.
siRNA의 전달은 왕성한 유전자 녹다운을 초래하였다. 게다가, CD4+ T 세포로의 항바이러스성 siRNA의 전달은 HIV 복제를 억제하였으며, 이는 미세유체-기반 전달의 기능적 유용성을 입증한다. 유사하게, 수지상 세포 및 B 세포로의 항원성 단백질의 전달은 시험관내 및 생체내 항원-특이 CD8+ T 세포의 보다 효과적인 항원 제시 및 보다 큰 활성화/증식을 야기하였다. 생존력을 최소한으로 손실하면서 왕성한 세포내 전달을 위한 플랫폼을 제공함으로써, 세포 스퀴징은 연구 및 임상 용도를 위해 면역 세포 기능을 조사하고 조절하기 위한 유연하고 유용한 도구를 나타낸다.
일차 면역 세포, 특히 휴지기 림프구로의 단백질 및 siRNA와 같은 생체분자의 세포내 전달은 어려웠다. 본원에 기재된 벡터-비함유 미세유체 플랫폼은 세포의 신속한 기계적 변형에 의한 일시적인 막 교란을 야기하며, 이것이 T 세포, B 세포, 단핵구/대식세포, 및 수지상 세포와 같은 면역 세포로의 거대분자의 세포내 전달을 초래한다. 16개 미세유체 장치 설계의 라이브러리를 덱스트란 중합체, siRNA 및 항체를 인간 및 뮤린 면역 세포로 전달하는 능력에 대해 시험하였다. 전달된 물질의 활성은 CD45, DC-SIGN, 및 CD4 단백질의 siRNA-매개된 녹다운을 측정함으로써 확인하였다. 바이러스 벡터도 전기장도 필요로 하지 않는 미세유체 전달은 세포 독성을 덜 가지면서 전기천공에 필적하거나 더 양호한 전달을 초래하였다. 질환 분야에서의 기술의 유용성은 바이러스성 vif 및 gag 유전자에 대해 지시된 siRNA로 처리된 일차 인간 CD4 T 세포에서 HIV 바이러스 복제를 억제함으로써 보여졌다. 따라서, 벡터-비함유 미세유체 전달은 과거에는 가공하기가 어려웠던 세포(예컨대, 일차 면역 세포)로의 거대분자의 시토졸성 전달의 장애물을 극복하는 방법을 제공한다. 따라서, 방법 및 장치는 면역 세포 기능을 가공하는데 유용하다.
특정 측면에서, 본 발명은 면역 세포를 포함하는 세포 현탁액을 미세유체 장치를 통해 통과시키고 현탁액을 화합물과 접촉시킴을 포함하는, 화합물을 면역 세포의 시토졸로 우선적으로 전달하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 장치는 약 2㎛, 3㎛, 4㎛, 5㎛, 6㎛, 7㎛, 8㎛, 9㎛, 10㎛ 또는 2㎛-10㎛의 직경의 협착을 포함하고, 면역 세포로 전달되는 화합물의 양은 비-면역 세포로 전달되는 양보다 적어도 10% 더 크다. 특정 측면에서, 본 발명은 면역 세포를 포함하는 세포 현탁액을 미세유체 장치를 통해 통과시키고 현탁액을 화합물과 접촉시킴을 포함하는, 화합물을 면역 세포의 시토졸로 전달하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 상기 장치는 약 2㎛, 3㎛, 4㎛, 5㎛, 6㎛, 7㎛, 8㎛, 9㎛, 10㎛ 또는 2㎛-10㎛의 직경의 협착을 포함한다.
용어 '세포-스퀴징된'은 세포 현탁액을 협착을 포함하는 미세유체 장치를 통해 통과시킴을 포함하는 방법을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 미세유체 장치를 통과하기 전, 동시에 또는 후에 화합물과 접촉된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 장치를 통과하지 않고서 화합물과 접촉된 면역 세포와 비교하여 장치를 통과한 후 적어도 10%, 25%, 50%, 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 또는 그 이상의 화합물을 포함한다.
면역 세포 기능의 가공
막 완전성을 일시적으로 교란하거나 변형함으로써 물질을 면역 세포의 세포내 공간으로 전달함으로써, 내부 메카니즘이 심의되고 특성화될 수 있으며, 이들의 기능이 여러 용도를 위해 조정하고 변형될 수 있다.
세포의 기능을 가공하고/하거나 이의 내부 작동을 이해하기 위한 효과적인 방법은 물질(예컨대 생활성 분자)를 세포에 도입하여 세포내 프로세스를 직접 조정하는 것이다. 본원에 기재된 방법은 세포가 들어있는 배지의 내용물 및/또는 표면 수용체에의 결합을 통한 신호전달을 조정하는데 대개 중점을 두는 현존 또는 선행 접근법들에 비해 이점을 포함한다. 면역 세포로의 세포내 전달은 현존 또는 선행 기술들을 사용한 상당한 도전이다. 본원에 기재된 CellSqueeze 플랫폼은 다양한 물질을 면역 세포로 전달하며 생체내 및 시험관내 세포 기능에 영향을 미치는 능력을 입증하였다. 이러한 방법은 임상 용도, 예컨대, 입양 전달 요법을 위해 면역 세포 기능을 프로그래밍(또는 재-프로그래밍)하는데 유용하다. 더욱이, 방법은 약물 표적 및/또는 진단법을 확인하기 위해 면역학적 메카니즘을 시험 및 규명하는데 유용하다.
본 발명의 측면은 화합물이 전혈 내에 있으면서 면역 세포(예를 들면 인간 B 및 T 세포)로 전달될 수 있다는 놀라운 발견과 관련된다. 전혈은 정제, 예컨대, 적혈구 세포로부터의 말초 혈액 단핵 세포의 분별 또는 분리 없이 가공하기가 어렵다. 그러나, 본원에 개시된 장치 및 방법은 전혈 내에서 화합물을 면역 세포로 전달한다. 본 발명은 세포 스퀴징 장치를 통해 이종 혼합물(면역 세포, 적혈구, 혈장/혈청)을 통과시키기 전에 전혈로부터 면역 세포를 분리할 필요없이 화합물을 면역 세포로 전달할 수 있다. 이러한 주목할 만한 결과는 중요한 기술적 이익을 가지며, 몇몇 경우에서 환자의 병상 치료 뿐만 아니라 세포-분별, 예컨대, 전장에의 접근 없이 현장에서 세포를 프로세싱하는 능력을 가능케 한다. 예를 들면, 대상체는 전혈을 제거하여 본 발명의 장치를 통해 통과시킨 다음, 예컨대, 연속 공정으로 재주입할 수 있다. 면역 세포의 분리 또는 증폭가 필요하지 않기 때문에, 세포의 가공이 덜 필요하고, 세포가 인공 배지와 같은 배지를 사용하여 가공할 필요가 없다. 게다가, 전혈에서 면역 세포를 처리하는 것은 높은 수준의 생존력을 유지하면서 높은 효율로 수행될 수 있다. 예컨대, 도 33 및 34 참조.
선행 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 포유동물 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 혼합된 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 전혈이다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 연막 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 림프이다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 말초 혈액 단핵 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 정제된 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 일차 세포 또는 세포주이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈구이다. 일부 구현예에서, 혈구는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 자연 킬러(NK) 세포, 수지상 세포 (DC), NKT 세포, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 호염구, 호산구, 또는 호중구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포 및 B 세포와 같은 적응 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포 선천성 면역 세포이다. 예시적인 선천성 면역 세포는 선천성 림프상 세포 (ILC1, ILC2, ILC3), 호염구, 호산구, 비만 세포, NK 세포, 호중구, 및 단핵구를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 기억 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 일차 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 마우스, 개, 고양이, 말, 랫트, 염소, 원숭이, 또는 토끼 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 비-포유동물 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 닭, 개구리, 곤충, 또는 선충 세포이다.
몇몇 예에서, 면역 세포는 활성화 상태에 비해 휴지 상태에 있으며, 예컨대, 활성화 상태에서의 세포는 일반적으로 휴지 상태에서 동일한 표현형의 세포에 비해 더 큰 직경을 포함한다. 예를 들면, 세포는 다음 마커들의 발현을 특징으로 한다: CD25, KLRG1, CD80, CD86, PD-1, PDL-1, CTLA-4, CD28, CD3, MHC-I, MHC-II, CD62L, CCR7, CX3CR1 및 CXCR5, 이들 각각은 조정될 수 있다(기재된 방법을 사용하여 분자를 면역 세포에 도입함으로써 증가 또는 감소됨). 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커의 발현은 면역 세포로의 화합물의 전달에 의해 면역 세포 상에서 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커의 발현은 면역 세포로의 화합물의 전달에 의해 면역 세포 상에서 감소된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커의 발현은 면역 세포로의 화합물의 전달에 의해 면역 세포 상에서 증가되고 하나 이상의 마커의 발현은 감소된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 비처리 면역 세포이다. 비처리 면역 세포, 예컨대, T 세포는 활성화된 면역 세포에 의한 발현 수준과 비교하여 CD25, CD80, CD86, PD-1, 및 CTLA-4의 비교적 낮은 수준의 발현 및 (활성화된 세포에 비해) 비교적 높은 수준의 CCR7을 특징으로 한다.
본 주제의 측면은 주 조직적합성 복합체(MHC)에 관한 것이다. MHC의 주 기능은 병원균으로부터 유래된 펩티드 단편에 결합하여 이들을 적합한 T 세포에 의한 인식을 위해 세포 표면 상에 표시하는 것이다. 인간에서, MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)이라고도 불린다. MHC I종 (HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C)에 상응하는 HLA는 세포 내부로부터 펩티드를 제시한다. 예를 들면, 세포가 바이러스로 감염되면, HLA 시스템이 바이러스의 단편을 세포의 표면으로 가져가서 세포가 면역계에 의해 파괴될 수 있다. 이러한 펩티드는 프로테아좀에서 분해되는 소호된 단백질로부터 생산된다. 일반적으로 MHC-1에 대해, 이러한 특정 펩티드는 길이가 약 8-10개 아미노산인 작은 중합체이다. MHC I종에 의해 제시되는 외부 항원은 세포를 파괴하는 킬러 T-세포 (CD8 양성- 또는 세포독성 T-세포라고도 불림)를 공격한다. MHC II종 (HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, 및 HLA-DR)에 상응하는 HLA는 세포의 외부로부터 T-림프구로 항원을 제시한다. 이러한 특정 항원은 T-헬퍼 세포의 증식을 자극하며, 이것이 결국 항체-생성 B-세포를 자극하여 그 특정 항원에 대한 항체를 생산한다. 자가-항원은 조절성 T 세포에 의해 억제된다.
특정 측면에서, 본 발명은 화합물 또는 조성물을 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 화합물은 단일 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 화합물의 혼합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 핵산이다. 예시적인 핵산은 재조합 핵산, DNA, 재조합 DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA, siRNA, mRNA, saRNA, miRNA, IncRNA, tRNA, 및 shRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 세포에서의 핵산에 상동성이다. 일부 구현예에서, 핵산은 세포에서의 핵산에 비상동성이다. 일부 구현예에서, 화합물은 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 핵산은 치료학적 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 치료학적 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서 핵산은 리포터 또는 선택 마커를 암호화한다. 예시적인 리포터 마커는 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 오쿠오린, 베타-갈락토시다제, 우로포르피리노겐(urogen) III 메틸트랜스퍼라제 (UMT), 및 루시퍼라제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 선택 마커는 블라스티시딘, G41 8/제네티신, 히그로마이신 B, 푸로마이신, 제오신, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 및 티미딘 키나제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 화합물은 MHC 복합체를 암호화하는 핵산이다. 일부 구현예에서, 화합물은 MHC I종 또는 MHC II종 복합체를 암호화하는 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 키메라 항원 수용체, 예를 들면, 키메라 T 세포 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산은 재조합 T 세포 수용체를 암호화한다. 예를 들면, 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산은 바이러스-비함유 방식으로, 즉, 세포 스퀴징에 의해 T 세포로 도입되어 CAR-T의 발현을 유지한다. 예를 들면, DNA의 도입은 바이러스 입자를 사용하지 않고 달성된다. 그러나, 핵산 작제물은 바이러스성 게놈 요소를 포함할 수 있으며, 이것이 통합을 도울 수 있거나 염색체외 핵산으로서 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, 화합물은 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 단백질 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 치료 단백질, 항체, 융합 단백질, 항원, 합성 단백질, 리포터 마커, 또는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 단백질은 유전자-편집 단백질 또는 뉴클레아제, 예를 들면, 아연-집게 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 메가 뉴클레아제, 또는 CRE 재조합효소이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 키메라 단백질 약물, 예를 들면, 항체 약물 접합체 또는 재조합 융합 단백질, 예를 들면, GST 또는 스트렙타비딘으로 태그된 단백질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 화합물은 전사 인자이다. 예시적인 전사 인자는 Oct5, Sox2, c-Myc, Klf-4, T-bet, GATA3, FoxP3, 및 RORγt를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 트랜스포손이다. 트랜스포손, 또는 전이 인자는 자신을 게놈 내의 다른 위치로 삽입시키는 DNA 조각이다.
일부 구현예에서, 화합물은 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 항원이다. 항원은 세포 또는 항체-매개된 면역 반응과 같은 특이 면역 반응을 자극하는 물질이다. 항원은 면역 세포에 의해 발현되는 수용체, 예를 들면, T 세포 수용체(TCR)에 결합하며, 이것은 특정 항원에 또는 항원 제시 분자, 예를 들면, MHC/HLA 이질이합체에 특이적이다. 항원-수용체 결합은 후속적으로 세포 활성화, 사이토킨 생산, 세포 이동, 세포독성 인자 분비, 및 항체 생산과 같은 다운스트림 면역 효과기 경로를 초래하는 세포내 신호전달 경로를 유발한다. 일부 구현예에서, 화합물은 질환-관련 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 외래 공급원, 예를 들면, 박테리아, 진균류, 바이러스, 또는 알레르겐으로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 항원은 내부 공급원, 예를 들면, 종양 세포 또는 자가-단백질(즉, 자가-항원)으로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 종양 용해물 중에 있다. 자가-항원은 유기체 자체 세포에 존재하는 항원이다. 자가-항원은 정상적으로는 면역 반응을 자극하지 않지만, 자가면역 질환, 예를 들면, I형 당뇨병 또는 류마티스 관절염, 다발성 경화증(및 기타의 탈수초 질환)의 맥락에서는 그러할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 신생항원이다. 신생항원은 정상적인 인간 게놈에는 부재하지만 신규 단백질 서열의 형성을 초래하는 종양-특이 DNA 변형의 결과로서 종양형성 세포 내에서 생성되는 항원이다. 예시적인 바이러스성 항원은 HIV 항원, 에볼라 항원, HPV 항원, 및 EBV 항원을 포함하며, 이것은 혼합물로서 정제 또는 전달되거나, 또는 죽거나 약독화된 바이러스 또는 바이러스 단편으로서 전달된다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 HPV16의 종양유전자 E6 및 E7로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 화합물은 미지의 병원균으로 감염된 조직으로부터의 세포 용해물을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 비-단백질 항원, 예를 들면, 지질, 당지질, 또는 다당류이다.
일부 구현예에서 단백질 또는 폴리펩티드는 리포터 또는 선택 마커이다. 예시적인 리포터 마커는 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 오쿠오린, 베타-갈락토시다제, 우로포르피리노겐(urogen) III 메틸트랜스퍼라제 (UMT), 및 루시퍼라제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 선택 마커는 블라스티시딘, G418/제네티신, 히그로마이신 B, 푸로마이신, 제오신, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 및 티미딘 키나제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 화합물은 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 소분자이다. 예시적인 소분자는 형광 마커, 염료, 약제학적 제제, 대사산물, 또는 라디오뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 약제학적 제제는 치료 약물 및/또는 세포독성제이다.
일부 구현예에서, 화합물은 나노입자를 포함한다. 나노입자의 예는 금 나노입자, 양자점, 탄소 나노튜브, 나노쉘, 덴드리머, 및 리포솜을 포함한다. 일부 구현예에서, 나노입자는 치료 분자를 함유하거나 이에 (공유적 또는 비공유적으로) 결합된다. 일부 구현예에서, 나노입자는 핵산, 예를 들면, mRNA 또는 cDNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 나노입자는 형광 또는 방사성 표지와 같은 표지를 함유한다.
본 발명의 측면은 세포내 항체의 개선된 전달에 관한 것이다. 세포내 항체의 비제한적인 예는 1999년 12월 21일자로 허여된 U.S. 특허 제6,004,940호; 2001년 12월 11일자로 허여된 U.S. 특허 제6,329,173호; 2010년 6월 10일자로 공개된 U.S. 특허 공보 제2010/0143371호; 및 2006년 2월 16일자로 공개된 U.S. 특허 공보 제2006/0034834로에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 세포내 항체의 유용성에 영향을 미치는 한계가 전혈 내의 세포를 포함하여 관심 세포에 이들을 발현시켰다. 본 발명은 이러한 한계를 극복하며, 분리된 항체, 또는 항체를 암호화하는 작제물이 면역 세포의 시토졸로 전달되도록 할 수 있다.
본 발명은 온전한 단클론성 항체의 전달뿐만 아니라 면역활성 항체 단편, 예를 들면, Fab 또는 (Fab)2 단편; 가공된 단일쇄 Fv 분자; 또는 키메라 분자, 예를 들면, 뮤린 기원의 하나의 항체 및, 예를 들면, 인간 기원의 다른 항체의 나머지 부분의 결합 특이성을 함유하는 항체의 전달도 포함한다. 또 다른 예에서, 키메라 분자는 CD3-제타 막통과 및 엔도도메인에 융합된 단클론성 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv)의 융합이다. 이러한 분자는 이의 표적의 scFv에 의한 인식에 대한 반응으로 제타 신호의 전송을 야기한다. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 가요성 링커에 의해 융합되어 scFv를 형성한다. 이러한 scFv가 신호 펩티드를 앞세워서 발생기 단백질을 세포질 망상구조 및 후속적인 표면 발현으로 지시한다. 가요성 스페이서는 scFv가 다른 방향으로 배향되어 항원 결합을 가능케 하도록 한다. 막통과 도메인은 세포로 돌출되어 목적하는 신호를 전송하는 신호전달 엔도도메인의 원래 분래로부터 통상적으로 유도되는 전형적인 소수성 알파 나선이다. 이러한 키메라 항원 수용체는 본원에 기재된 미세유체 스퀴즈법을 사용하여 T 세포로 전달된다.
일부 구현예에서, 화합물은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, CAR은 세포외 인식 도메인(예컨대, 항원-결합 도메인), 막통과 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 융합이다. 항원 개입시, CAR의 세포내 신호전달 영역이 면역 세포에서 활성화-관련 반응, 예를 들면, 사이토킨 또는 세포용해 분자의 방출을 개시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 키메라 T-세포 항원 수용체이다. 일부 구현예에서, CAR은 종양 항원에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR 항원-결합 도메인은 단일쇄 항체 가변 단편(scFv)이다. 일부 구현예에서, 화합물은 T 세포 기능을 증진시킨다. 일부 구현예에서, T 세포 기능을 증진시키는 화합물은 면역 관문 경로 억제제이다. 예시적인 면역 관문 경로 억제제는 예정사-1 경로 억제제, 예정사 리간드-1 경로 억제제, 및 항-세포독성 T-림프구 항원 4 경로 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 면역 관문 경로 억제제는 PD-1 및 CTLA-4 신호전달에 관여하는 SHP2, 티로신 포스파타제를 표적으로 할 수 있다.
일부 구현예에서, 화합물은 형광 태그된 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 형광 태그된 분자, 예를 들면, 퍼시픽 블루, Alexa 288, Cy5, 또는 캐스케이드 블루와 같은 형광색소로 태그된 분자이다. 일부 구현예에서, 화합물은 방사성 뉴클레오티드, 덱스트란 입자, 자성 비드, 또는 불투과성 염료이다. 일부 구현예에서, 화합물은 PacBlue로 표지된 3 kDa 덱스트란이다. 일부 구현예에서, 화합물은 Alexa488로 표지된 10 kDa 덱스트란 입자이다. 일부 구현예에서, 화합물은 소분자 형광단 태그된 단백질이다. 일부 구현예에서, 화합물은 Alexa647로 태그된 소분자이다. 일부 구현예에서, 화합물은 바이러스 또는 바이러스-유사 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스는 치료 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 항암 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스 또는 바이러스-유사 입자는 치료 폴리펩티드와 같은 치료 분자를 암호화하는 핵산을 함유한다.
일부 구현예에서, 화합물은 면역관용원성 인자(tolerogenic factor)를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 아주반트를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 분화 인자를 포함한다. T 세포의 분화 및/또는 활성화/성숙을 촉진시키기 위해 T 세포의 시토졸로 전달하고자 하는 예시적인 분화 인자는 T-박스 전사 인자 T-bet 및 Eomesodermin(Eomes), NFκB 및/또는 포크헤드 박스 P3 (FOXP3)을 포함한다.
세포내 전달을 위한 예시적인 화합물 및 조성물은 다음을 포함한다:
· 핵산, 특히: 화학적, 생물학적 또는 달리 변형된 DNA (플라스미드 또는 기타의 올리고) 및 RNA (예컨대 siRNA, mRNA, tRNA, saRNA, lncRNA, miRNA, 안내 RNA). 단백질: 예컨대 항체, 억제제, 효소 (예컨대 키나제), 전사 인자, 리보솜, 항원, 세포 용해물;
· 펩티드: 긴 (100-10,000개 아미노산) 및 짧은 (1-100개 아미노산) 나노물질: 예컨대 지질계 나노입자, 중합체성 나노입자, 탄소 나노튜브, 양자점, 금속성 나노입자 (금 포함);
· 바이러스: 바이러스성(또는 바이러스-유사) 입자의 세포질 전달은 달리 감염에 내성이 있는 세포를 위한 성공적인 유전자 전달을 초래한다. 복제 불능 바이러스의 사용은 세포 기능을 조절하는 추가의 수단을 나타낸다;
· 기타의 물질: 중합체, 염료, TrisNTA, 소분자 약물, 아주반트, 프로브;
· 상기의 임의의 조합의 혼합물.
화합물/조성물이 전달되는 예시적인 세포 유형(모든 후천성 및 선천성 면역 세포)은 다음을 포함한다:
· 모든 포유류 종, 예컨대, 인간, 마우스, 개, 고양이, 말, 원숭이
· B 세포 (예컨대 비처리 B 세포, 형질아세포);
· T 세포 (예컨대 Th1, Th17, Th2, Treg, CD8, CD4, Trm, Tem, Tcm);
· 수지상 세포 (예컨대 pDC, 단핵구 유래 DC, cDC, CD8+ DC, CD11b+ DC;
· 단핵구, 대식세포;
· 호중구, NK 세포, 선천성 림프상 세포 (ILC1, ILC2, ILC3), 호염구, 과립구 및 비만 세포.
· 전구 세포, (조혈성 줄기 세포, CLP, 중간엽 줄기 세포)
면역 세포 항원 제시 가공
본 발명의 특정 측면은 면역 세포의 세포질을 둘러싼 막을 일시적으로 교란시키고 항원을 시토졸로 전달함으로써 화합물의 세포내 전달을 포함하여 면역 세포 기능을 가공하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 항원은 7, 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산의 길이를 포함하고, 여기서, 면역 세포는 항원을 프로세싱하고 면역 세포의 표면 상에 항원의 I종 조직적합 항원 제한 가공된 형태를 나타낸다.
본 발명의 특정 측면은 협착을 포함하는 미세유체 장치를 통해 면역 세포를 통과시키고 면역 세포를 화합물과 접촉시킴으로써 화합물의 세포내 전달을 포함하는 면역 세포 기능을 가공하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 화합물은 항원을 포함하고 면역 세포는 항원을 프로세싱하고 항원을 면역 세포의 표면에 나타낸다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 면역 세포의 표면 상에 항원의 I종 조직적합 항원 제한 제한 가공된 형태를 나타낸다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 면역 세포의 표면 상에 항원의 II종 조직적합 항원 제한 가공된 형태를 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 막은 2㎛-10㎛ 직경의 협착을 통해 면역 세포를 통과시킴으로써 교란된다. 일부 구현예에서, 항원은 전장의 비가공된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 효과기 T 세포, 예를들면, CD8+ T 세포와 접촉하여 세포독성 T 세포 면역 반응을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 효과기 T 세포, 예를 들면, CD4+ T 세포와 접촉되어, 헬퍼 T 세포 면역 반응을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 효과기 T 세포와 접촉되어 면역관용원성 T 세포 면역 반응을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 B 세포, 수지상 세포 또는 대식세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포를 포함한다.
본 발명의 특정 측면은 미세유체 장치를 통해 T 세포를 통과시킴으로써 전체의 비가공된 항원을 T 세포의 시토졸로 전달함을 포함하는, T 세포 상에 항원 제시 표현형을 부여하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 장치는 2㎛-10㎛ 직경의 협착을 포함하고 상기 T 세포는 미세유체 장치를 통과한 후 면역 세포의 표면 상에 항원의 I종 조직적합 항원 제한 가공된 형태를 포함한다. 본 발명의 특정 측면은 미세유체 장치를 통해 T 세포를 통과시킴으로써 전체의 비가공된 항원을 T 세포의 시토졸로 전달함을 포함하는, T 세포 상에 항원 제시 표현형을 부여하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 장치는 2㎛-10㎛ 직경의 협착을 포함하고 상기 T 세포는 미세유체 장치를 통과한 후 면역 세포의 표면 상에 항원의 II종 조직적합 항원 제한 가공된 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 종양 항원 또는 바이러스성 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 제2 T 세포와 추가로 접촉되며, 제2 T 세포는 I종 조직적합 항원 제한 세포독성 T 세포 표현형을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 제2 T 세포와 추가로 접촉되며, 제2 T 세포는 II종 조직적합 항원 제한 헬퍼 T 세포 표현형을 포함한다.
본 발명의 특정 측면은 항원에 특이적인 세포독성 T 세포 반응을 활성화시키기 위한 세포-스퀴징되고, 항원 부하된 T 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 특정 측면은 항원에 특이적인 헬퍼 T 세포 반응을 활성화시키기 위한 세포-스퀴징되고, 항원 부하된 T 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 특정 측면은 항원에 특이적인 면역관용원성 T 세포 반응을 유도하기 위한 세포-스퀴징되고, 항원 부하된 T 세포의 용도에 관한 것이다.
면역 세포 귀소성 가공
본 발명의 특정 측면은 미세유체 장치를 통해 면역 세포를 통과시킴으로써 화합물을 T 세포의 시토졸로 전달함을 포함하는, 면역 세포에 귀소 표현형을 부여하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 장치는 2㎛-10㎛ 직경의 협착을 포함하고 상기 화합물은 면역 세포에 귀소 표현형의 발현을 부여한다. 예를 들면, 전달된 화합물은 특정 부위로의 귀소를 지시하는 케모카인 수용체의 발현은 증가시키고 상충하는 케모카인 수용체의 발현은 하향조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 화합물은 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 핵산이다. 예시적인 핵산은 재조합 핵산, DNA, 재조합 DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA, siRNA, mRNA, saRNA, miRNA, IncRNA, tRNA, 및 shRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 화합물은 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은은 단백질 또는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 단백질은 유전자-편집 단백질 또는 뉴클레아제, 예를 들면, 아연-집게 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 메가 뉴클레아제, 또는 CRE 재조합효소이다. 일부 구현예에서, 화합물은은 전사 인자이다. 예시적인 전사 인자는 Oct5, Sox2, c-Myc, Klf-4, T-bet, GATA3, FoxP3, 및 RORγt를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 전사 인자는 MHC 복합체의 세포 발현을 유도한다.
일부 구현예에서, 화합물은 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, CAR은 세포외 인식 도메인 (예컨대, 항원-결합 도메인), 막통과 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 융합이다. 항원 개입시, CAR의 세포내 신호전달 영역이 면역 세포에서 활성화-관련 반응, 예를 들면, 특정 조직 또는 생리학적 위치로의 귀소성을 개시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 키메라 T-세포 항원 수용체이다.
면역관용원성을 위한 면역 세포 가공
본 발명의 특정 측면은 미세유체 장치를 통해 면역 세포를 통과시킴으로써 화합물을 T 세포의 시토졸로 전달함을 포함하는, 면역 세포에 면역관용원성 표현형을 부여하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 장치는 2㎛-10㎛ 직경의 협착을 포함하고 상기 화합물은 면역관용원성 표현형을 갖는 세포로의 면역 세포의 분화를 유도한다. 일부 구현예에서, 화합물은 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 핵산이다. 예시적인 핵산은 재조합 핵산, DNA, 재조합 DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA, siRNA, mRNA, saRNA, miRNA, lncRNA, tRNA, 및 shRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정 측면은 기재된 방법에 따라 변형된 면역 세포를 환자에게 도입함으로써 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 면역억제 요법에서 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 세포를 환자로부터 분리하고, 본원에 기재된 방법에 따라 변형시켜, 다시 환자에게 도입한다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제를 환자에게 추가로 투여한다.
카미카제 면역 세포 가공
본 발명의 특정 측면은 미세유체 장치를 통해 면역 세포를 통과시킴으로써 자가-증폭 RNA를 T 세포의 시토졸로 전달함을 포함하는, 카미카제 면역 세포를 생성하는 방법에 관한 것이며, 여기서, 장치는 2㎛-10㎛ 직경의 협착을 포함하고 상기 자가-증폭 RNA는 암호화된 단백질의 연속 생산을 위해 암호화된다. 일부 구현예에서, 화합물은 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 자가-증폭 RNA(saRNA)이다.
백신 개발을 위한 항원 스크리닝
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 변형된 면역 세포는 백신 개발을 위해 항원을 스크리닝하는데 사용된다. 예를 들면, 종양 세포 용해물은 본원에 기재된 스퀴즈 방법을 사용하여 항원 제시 세포, T 세포, 또는 B 세포로 전달된다. APC를 환자-유래된 T 세포 또는 T 세포 클론/주와 항온처리하여 백신 후보 항원의 정체를 알아낸다. 또 다른 접근법에서, 종양-용해물 부하된 APC에 의해 가공되고 제시된 항원을 질량 분광법으로 확인한다. 그후 이러한 방식으로 확인된 항원을 백신화에 사용한다.
면역 세포 교환(trafficking)
본 발명의 특정 측면은 본원에 기재된 방법에 따라 T 세포에 표지를 전달하고 표지된 T 세포를 환자에게 투여함을 포함하는, 환자 내에서 T 세포 교환을 알아내는 방법에 관한 것이며, 여기서, 환자 내에서의 T 세포 교환은 표지된 T 세포를 검출함으로써 알아낼 수 있다. 일부 구현예에서, 표지는 형광 표지 또는 방사능 표지이다. 일부 구현예에서, T 세포 교환은 종양에 대한 교환이다. 예를 들면, T 세포를 환자로부터 분리하고, 동위원소를 T 세포로 전달하기 위해 미세유체 장치를 통해 통과시켜 다시 환자에게 주사할 수 있다. 그후, PET 스캔과 같은 이미징법을 사용하여 표지를 검출하고 신체를 통한 T 세포의 교환을 추적할 수 있다.
백신을 위한 항원 제시
시스템은 단백질을 면역 세포로 우선적으로 전달할 수 있기 때문에, 관심 표적에 대해 환자(인간, 마우스, 비-인간 영장류, etc.)의 백신화에서 사용하기 위해 이러한 세포를 가공하는 것이 유용하다. 특이 항원성 단백질 (또는 항원성 단백질의 혼합물, 단백질+아주반트의 혼합물, 또는 단백질의 단편에 상응하는 펩티드)을 표적 세포 (예컨대, DC, T 세포 또는 B 세포)의 시토졸로 직접 전달함으로써, 항원의 I종 MHC 제시가 유도되며, 이는 후속적으로 표적 질환, 예컨대, 암 또는 병원성 미생물 감염, 예를 들면, 바이러스 감염에 대해 CD8 T 세포 매개된 면역력을 구동한다. 이러한 프로세스에서의 아주반트의 임의 사용은 반응(예컨대 아주반트 인자의 존재하에서 세포의 효능 또는 배양을 증진시키는 물질의 공동-전달)을 증진시킨다. 본 발명 이전에는 가공하기가 어려웠거나 불가능했던 면역 세포를 조절하는 능력은, 특히 암 및 HIV와 같은 오늘날 극복해야 할 질환들에 대해, 본 발명 이전에는 가능하지 않았던 치료적 및 예방적 백신 응용을 가능케 한다. 또 다른 소견은 세포가 더 오랫동안 항원을 제시할 수 있도록 세포 생존을 증진시키는 물질을 공동-전달함; 다수의 항원에 대해 동시에 백신화; 아주반트 효과를 제공하고 면역 반응을 증진시키도록 활성화 인자의 전달 (또는 이의 노출)과 함께 백신화; 및/또는 항원 공급원으로서 세포 용해물을 사용하는 신속-반응 백신을 포함한다. 후자(알려지지 않은 새로운 병원균/질환에 대한 백신화)의 예에서, 감염된 또는 암성 세포를, 예컨대 조직 샘플링 또는 생검에 의해 환자로부터 채취하고, 이러한 세포의 용해물을 상기한 전략을 사용하여 면역 세포에 전달한다. 이러한 접근법은 항원의 정체를 미리 알지 않고도 미지의 질환과 관련된 항원에 대한 면역 반응을 높인다.
백신 아주반트
아주반트 또는 면역 반응 활성화제/강화제는 백신 항원에 대한 면역 세포, 예컨대, T 세포, 반응의 도출을 촉진시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, 면역 세포가 미세유체 장치를 통과한 후 면역 세포를 아주반트와 접촉시킨다. 예를 들면 세포를 미세유체 장치를 통과한지 약 5분 내지 약 2시간 후 또는 그 사이의 임의의 시간 또는 시간 범위에 아주반트와 접촉시킨다. 예를 들면, 세포를 미세유체 장치를 통과한지 약 5분 내지 약 1.5시간, 약 5분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 45분, 약 5분 내지 약 30분, 약 5분 내지 약 15분, 또는 약 5분 내지 약 10분 후 아주반트와 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 세포를 미세유체 장치를 통과한지 약 10분 내지 약 2시간, 약 15분 내지 약 2시간, 약 30분 내지 약 2시간, 약 45분 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 또는 약 1.5시간 내지 약 2시간 후 아주반트와 접촉시킨다. 명반 또는 유중수 에멀젼(예컨대, 프로인트 불완전 아주반트 및 MF59®)과 같은 전통적인 아주반트 이외에, 패턴 인식 수용체(PRR)에 대한 리간드와 같은 기타의 아주반트가 선천성 면역을 유도하고, APC를 표적화하며, 그 결과 후천성 면역 반응에 영향을 미침으로써 작용한다. 거의 모든 PRR 계열의 구성원이 아주반트에 대한 표적이다. 이들은 Toll-유사 수용체 (TLR), NOD-유사 수용체 (NLR), RIG-I-유사 수용체 (RLR) 및 C-타입 렉틴 수용체 (CLR)를 포함한다. 이들은 상이한 전사 인자들의 활성화를 야기하는 이산 어뎁터 분자를 포함하는 경로를 통해 신호전달한다. 전사 인자(NF-κB, IRF3)는 면역 반응의 프라이밍, 확장 및 편극화에 주요한 역할을 하는 사이토킨 및 케모카인의 생산을 유도한다. NLRP3 및 NLRC4와 같은 NLR 계열의 몇몇 구성원의 활성화는 전염증성 사이토킨 IL-1β 및 IL-18의 유도에 관여하는 인플라마솜이라도 불리는 단백질 복합체의 형성을 유발한다. NLRP3 및 NLRC4 인플라마솜은 특정 아주반트에 의해 유도되는 선천성 면역에 연련되지만 이들의 작용 메카니즘은 불명확하다.
단독으로 또는 다양한 제형으로의 PRR에 대한 천연 리간드 또는 합성 효능제. PRR 활성화는 병원균을 없애는 숙주의 능력을 증가시키는 전염증성 사이토킨/케모카인 및 I형 IFN의 생산을 자극한다. 백신 제형에서 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPs)의 삽입은 백신-특이 반응의 유도를 개선 및 촉진시킨다. 명반 또는 전통적인 에멀젼 아주반트와 함께 사용되어, PAMPS는 Th1 반응에 대한 면역 반응을 구동하는데 유용하다.
TLR3 및 RLR 리간드. 대부분의 바이러스의 복제 동안 생산되는 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 강력한 유발인자이다. 폴리(I:C)와 같은 dsRNA의 합성 유사체가 아주반트로서 유용하다. 이들은 TLR3 및 RIG-I/MDA-5를 통해 작용하여, IL-12 및 I형 IFNs 생산을 유도하고, MHC II종 분자에 대한 항원 교차-제시를 촉진시키고, 세포독성 T 세포의 생성을 향상시킨다.
TLR4 리간드. TLR4에 대한 리간드인 박테리아성 지다당류(LPS)가 오랫동안 강력한 아주반트로서 인식되어 왔지만, 이들의 발열 활성이 임상적 사용을 방해하였다. 덜 독성인 유도체의 개발물은 모노포스포릴 지질 A (MPLA)를 포함한다. MPLA는 아주반트로서 유용하며 Th1 반응에 대한 면역 반응을 구동하는데 유용하다.
TLR5 리간드. TLR5 리간드, 박테리아성 플라젤린은 강력한 T-세포 항원이며 백신 아주반트로서 가능성을 갖는다. 기타의 TLR 효능제와는 달리, 플라젤린은 강력한 Th1 반응보다는 혼합 Th1 및 Th2 반응을 초래하는 경향이 있다. 플라젤린은 항원와 혼합되거나 재조합 백신 항원에 융합된 아주반트로서 사용될 수 있다.
TLR7/8 리간드. 단일 가닥 바이러스성 RNA의 인식에 있어서 특화된 이들 리간드는 백신 아주반트로서도 유용하다. 예를 들면, 이미다조퀴놀린(즉, 이미퀴모드, 가르디퀴모드 및 R848)은 IFN-α, 및 IL-12의 생산을 유도하여 Th1 반응을 촉진시키는 수지상 세포의 다수의 하위세트에서 TLR7/8을 활성화시키는 합성 화합물이다.
TLR9 리간드. 특이 CpG 모티프 (CpG ODNs, 예를 들면, ODN 1826 및 ODN 2006)를 함유하는 올리고데옥시뉴클레오티드가 TLR9에 의해 인식된다. 이들은 항체 생산을 증진시킬 뿐만 아니라 Th1 및 Th2 반응에 대한 Th 세포 반응을 구동/촉진시킨다.
NOD2 리간드. 무라밀 디펩티드 (MDP)와 같은 박테리아 세포 벽의 단편은 널리 알려져 있는 아주반트이다. MDP는 NOD2 및 NLRP3 인플라마솜의 활성화를 유발한다.
이러한 종류의 아주반트, 예컨대, PRR 경로의 조절제는 강력한 세포-매개된 면역력을 유도하는 이들의 능력으로 인해 백신에서 유용하다. 바람직한 아주반트는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, R848, 지다당류 (LPS), rhIL-2, 항-CD40 또는 CD4OL, IL-12, 및/또는 디사이클릭 뉴클레오티드를 포함한다.
면역요법을 위한 T 세포 가공
본 발명의 특정 측면은 기재된 방법에 따라 변형된 면역 세포를 환자에게 도입함으로써 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 면역요법에서 사용하기 위한 것이다. 예를 들면, 다양한 물질을 T 세포로 전달할 수 있게 함으로써, T 세포 기능이 관심 질환을 표적화하도록 가공된다. 예를 들면, 관심 항원을 표적화하는 TCR에 대한 키메라 항원 수용체, 또는 DNA/mRNA를 전달함으로써, 질환 항원에 대해 특이적이고 킬러 (및 또는 헬퍼) T 세포 반응을 신속하게 하는 T 세포가 생성된다. NF-κB, Bcl-2, Bcl- 3, Bcl-xl, CD3/CD28의 상향조절제, CpG, R848, PD-1의 저해제, PDL-1의 저해제, CTLA-4의 저해제와 같은 다른 물질이 전달되어 세포 활성 및 생존을 증진시킨다.
예를 들면, 최근의 입양 T 세포 입양 전달 요법에서의 한 가지 공통적인 도전과제는 활성화된 T 세포가 종양의 면역억제 미세환경에 노출되어 피로/무력해져서 이들의 효능을 최소화시킨다는 것이다. 기재된 방법을 사용한 세포내 전달을 사용하여, [예컨대 면역억제 유전자 CTLA-4, PD-1, PD-2, PDl-1, PDl-2, 또는 siRNA 매개된 녹다운의 결실, 또는 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALENS), 또는 아연 집게 뉴클레아제 (ZFN) 기반 접근책과 같은 공지된 방법을 사용한 소분자 억제제/항체 기반 억제에 의해] 면역억제 경로를 교란하고, 이에 따라, 이들 T 세포는 종양 환경에서 이들의 고도로 활성화된 킬러 상태를 보유할 수 있게 된다. 게다가, 이러한 접근법은 T 세포가 그 표현형으로의 분화(보다 양호한 장기간 보호를 제공함)를 구동하는 적합한 인자의 공동-전달에 의해 기억 세포로 되도록 유도하는데 사용된다. 종래의 입양 전달에서, 환자에게 도입되는 T 세포는 증식으로 인해 이미 활성화된 반-피로(semi-exhausted) 상태로 있다. 본원에 기재된 방법은 이들의 표현형을 비처리 상태로 재설정하는데 사용된다. 따라서, 세포는 전달후 훨씬 더 많은 생체내 증식이 가능해지고 더 이상 피로한 표현형을 갖지 않게 된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 생체외 항원 특이 T 세포를 생성하는데 사용된다. 예를 들면, 항원을 DC와 같은 면역 세포로 전달하고, 그후 항원 부하된 면역 세포를 환자-유래 T 세포와 배양하여 이들을 시험관내에서 활성화시킨다. 그후, 이러한 T 세포를 환자에게 재주사하기 전에 추가의 자극을 통해 확대시킬 수 있다.
면역관용원성을 위한 항원 제시:
세포-제시된 항원에 대한 면역관용원성을 유도하기 위해, 세포를 대신에 면역관용원성을 유도할 수 있는 항원(들)과 함께 흉선 간질 림포포이에틴, 덱사메타손, 비타민 D, 레티노산, 라파마이신, 아스피린, 형질전환 성장 인자 베타, 인터류킨-10, 또는 혈관활성 장 펩티드와 같은 면역관용원과 추가로 접촉시킨다.
종양 및 T 세포 면역관용원성
종양 미세환경에서, 종양 반응성 T 세포는 면역관용원화될 수 있다. 이것은 종양 발병과 관련된 기타 세포의 면역관용원성 활성을 포함한, 다수의 억제 메카니즘으로 인한 것이다(문헌 참조; Anderson et al., J Immunol 2007, 178:1268-1276; Probst et al., Nat Immunol 2005, 6:280-286). CTLA-4 및 PD-1과 같은 관문 수용체를 통한 신호전달을 차단하는 항체-기반 약물은 원발성 및 전이성 질환 둘 다에서 항종양 반응을 야기하였다. 관문 차단제에 반응한 악성 종양은 높은 돌연변이 빈도를 가지며 암 항원에 반응성인 T-세포가 침투된다(문헌 참조; Taneja, J Urol 2012, 188:2148-2149; Brahmer et al., N Engl J Med 2012, 366:2455-2465; Wolchok et al., N Engl J Med 2013, 369:122-133). 이러한 접근법이 특정 징후에 대해서는 성공적일 수 있지만, 다수의 억제성 관문 표면 수용체의 존재가 면역요법에 이용가능한 현재 제한된 패널의 기능 차단 항체의 적용을 약화시킬 수 있다. 게다가, 다수의 차단 항체로의 전신 치료에 대한 필요가, 특히 조합하여 사용되는 경우(문헌[참조; Postow et al., J Clin Oncol 2015, 33:1974-1982 and Gao et al., Oncogene 2015]에 리뷰됨), 증가된 독성을 가질 수 있다(문헌 참조; Ribas et al., N Engl J Med 2013, 368:1365-1366; Weber et al., Cancer 2013, 119:1675-1682). 본 발명의 몇몇 측면에서, 환자 성과에 있어서의 극적인 개선은 종양 반응성 T 세포에서만 억제 경로를 저해시킴으로써 달성된다. 비제한적인 예에서, 이것은 종양 침윤 림프구(TIL), 재조합 TCR, 및 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포와 같은 입양 전달 방법에서 사용되는 T-세포 내에서 유전자 녹다운 또는 억제 경로의 녹아웃을 억제하거나 가능케 함으로써 달성될 수 있다.
SHP2는, T-세포에서 활성화시, TCR 신호전달을 약화시키고, 그 결과 암 세포에 대한 T-세포 반응을 약화시키는 유비쿼터스 티로신 포스파타제이다. 몇몇 면역 관문 수용체에 의한 SHP2를 통한 신호전달은 T-세포 활성을 감소시킨다. SHP2를 활성화시키는 억제성 수용체는 PD-1 (문헌 참조; Yokosuka et al., J Exp Med 2012, 209:1201-1217), CTLA-4 (문헌 참조; Marengere et al., Science 1996, 272:1170-1173), BTLA (문헌 참조; Watanabe et al., Nat Immunol 2003, 4:670-679) 및 LAIR-1 (문헌 참조; Lebbink et al., J Immunol 2004, 172:5535-5543) (문헌[Nirschl et al., Clin Cancer Res 2013, 19:4917-4924]에서도 검토됨)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 종양-반응성 T 세포에서 SHP2의 유전적 비활성화 또는 하향-조절(예를 들면, RNA 간섭을 사용함)은 몇몇 억제성 관문 수용체의 신호전달 차단과 유사한 항종양 반응을 제공한다. 이러한 구현예는 기타의 항종양 면역요법과 함께, SHP-1 및 -2를 포함한 티로신 포스파타제의 약리학적 억제제, 나트륨 스티보글루코네이트(SSG)의 치료적 사용을 능가하는 이점(감소된 부작용)을 가질 수 있다(문헌 참조; Yi et al., Oncotarget 2011, 2:1155-1164; Naing et al., J Cancer 2011, 2:81-89; Pathak et al., J Immunol 2001, 167:3391-3397). SHP2는 T 세포 외인성 역할을 하는 것으로 나타났으며, T-세포 상의 이들 분자의 억제는 이의 기능의 전신 억제와 관련된 임의의 잠재적인 부작용을 특이적으로 없앨 수 있다. 더욱이, T 세포에서 단일 세포내 신호전달 분자의 유전적 교란 또는 하향-조절을 통한 다중 억제 신호전달 경로를 표적화함으로써, T 세포 입양 전달 및 전신 관문 차단의 조합보다 더 큰 효능이 달성된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 핵산, 예컨대, siRNA, 소분자 억제제, 항체, 전자 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제, 또는 아연 집게 뉴클레아제가 면역 세포, 예컨대, T 세포로 전달되어, SHP2와 같은 유전자의 발현 또는 유전자 산물의 활성을 조절하여 T 세포의 거동 또는 기능을 변형시킨다. 예를 들면, Shp2 손상된 CD8 T-세포는 비손상 세포보다 더 높은 종양 진행 조절 효능을 갖는다.
초기 접근법과 관련된 T 세포에서 유전자 발현을 조절하려는 도전과제는 CellSqueeze 장치 및 본원에 기재된 방법을 사용하여 극복되었다. CellSqueeze 장치의 비제한적인 측면들은 문헌[참조; the Proceedings of the National Academy of Sciences (Sharei et al., Proc Natl Acad Sci USA 2013, 110:2082-2087) and Nano Letters (Lee et al., Nano Lett 2012, 12:6322-6327)]에 논의되어 있으며, 이들 각각의 전문은 본원에 참고로 포함된다. 예를 들면, CellSqueeze 기술은 이들이 협착을 통과하여 이들의 막을 일시적으로 교란시키고 세포질로의 표적 물질의 수송을 가능케 함에 따라 세포를 신속하게 변형시킬 수 있는 미세유체 칩을 포함할 수 있다. 더욱이, 전기장 (예컨대, 일부 구현예에서, 장치 및 방법은 전기장에의 세포의 노출 또는 적용을 포함하지 않는다) 또는 잠재적으로 독성인 외인성 물질에 대한 필요성을 없애기 때문에, CellSqueeze 기술은 세포 독성 및 오프-타켓 효과에 대한 가능성을 최소화시킨다. 본원에 기재된 미세유체 설계 및 치료 과정은 다양한 암 증상에 대해 보다 효과적인 가공된 T 세포 요법을 생성할 수 있다.
면역억제를 위한 T 세포 가공
자가-면역 질환은 종종 건강한 조직을 손상시키는 자가-반응성 면역 세포를 포함한다. T 세포로의 FoxP3 (및/또는 기타 인자)의 세포내 전달은 조절 T 세포를 생성하여 자가-면역을 반대하는데 사용된다. 이러한 Tregs는 광범위한 전신 면역억제를 위해 또는 자가-항원 특이 T 세포를 Treg 표현형으로 재프로그래밍하기 위해 생성된다. 후자는 자가-면역을 영구화하고 이들의 활성의 국소화된 억제를 야기하는 세포와 동일한 표적 부위로의 Treg 귀소성을 초래한다.
자가-증폭 RNA (sa RNA)
자가-증폭 RNA는 독특한 능력을 제공하는데, 그 이유는 이들이 관심 단백질을 발현할 뿐만 아니라 숙주 게놈으로의 통합 위험 없이 이들의 서열을 세포질적으로 복제하기 때문이다. 따라서 면역 세포로의 자가-증폭 RNA의 도입은 면역 세포 기능을 가공하는데 유용하다. 몇몇 특이 소견은 카미카제 면역 세포, 단백질 전달의 대안, 또는 세포 기능의 연속적 조절을 포함하며, 이들 각각은 아래에 기재된다.
카미카제 면역 세포
상기한 바와 유사한 백신화 또는 면역억제 계획을 위해, 관심 항원(들)을 암호화하는 saRNA는 목적하는 위치로 귀소하는 면역 세포로 전달된다. 예를 들면, saRNA를 암호화하는 암 항원을 T 세포 (또는 B 세포, 단핵구, DC, 또는 대식세포)로 전달하고 이러한 세포를 환자에게 주사하면 신속한 saRNA 복제로 인해 T 세포에서 항원이 신속하게 생산되고 이러한 T 세포가 최후에는 사멸하게 된다. 표적 항원이 부하된 죽은 T 세포의 이러한 파열(burst)은 감염을 모의하며 표적 조직에서 선천성 세포에 의한 물질의 흡수를 초래하고 표적 항원에 대한 백신 반응을 프라이밍한다. 표적 조직, 아주반트의 존재, 및 환자의 전반적인 염증 상태에 따라, 이러한 계획은 면역관용원성을 유도하는데에도 사용된다. 면역관용원성을 유도하기 위해, 상기한 카미카제 세포를 가공하여 면역관용원성 인자 및 항원을 방출시키거나 면역관용원성 인자, 예를 들면, TGF-베타 및 IL-10과 접촉시킨다. 예를 들면, 카미카제 T 또는 B 세포는 면역관용원성인 인자를 발현하면서(예컨대, TGF-베타 및 IL-10의 분비) 목적하는 항원을 과발현하는 mRNA, DNA 또는 saRNA로 부하될 수 있다. 그후 이들 세포는 사멸을 겪기 전에 림프상 기관으로 이동하고, 이것이 항원 및 면역관용원성 인자를 환경으로 방출하여 표적 항원에 대한 면역관용원성을 유도하는 것을 도울 것이다. 이것은 자가-반응성 효과기 T 세포를 없애고 자가반응성으로부터 보호할 수 있는 T reg의 생산을 자극하도록 도울 것이다. 하나의 비제한적인 예에서, 이러한 접근법은 류마티스 관절염 항원을 사용하여 이용된다.
단백질 전달의 대안
saRNA, mRNA 또는 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드는 백신 치료 vs. 단백질 전달의 펄스의 지속시간 동안 연속적인 단백질 생산을 제공한다.
세포 기능의 연속 조절
예로서 T 세포 입양 전달 요법을 사용하여, 보다 양호한 T 세포 요법의 개발은 면역억제 경로의 억제제를 암호화하는 saRNA를 사용함으로써 달성된다. saRNA는 또한 높은 T 세포 활성화 상태를 유지하기 위해 자극 단백질을 및/또는 생존을 연장시키기 위해 항-아폽토시스 단백질을 발현하는데 사용된다. 저해 억제제의 비제한적인 예는 PD-1, PD-L1, CTLA-4 또는 기타의 관문 억제제를 차단하는 임의의 물질을 포함한다. IL-2, NF-Kb, IL-7, IL-15, IL-12 등을 발현함으로써, 높은 T 세포 활성이 유지될 수 있고 Bcl2 및 Bclx1 같은 단백질이 생존을 연장하는데 도움을 줄 수 있다.
면역 세포 기능의 재프로그래밍
면역 세포는 자가조직 세포의 공급원으로서 사용된다. 세포는 수많은 질환 치료 기능을 수행하도록 재프로그래밍된다. 예를 들면, 관절염의 경우, 물질이 T 세포로 전달되어 접합부 귀소 표현형(joint homing pheonotype)의 발현을 유도하고 증상을 완화시킬 수 있는 인자들(예를 들면, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, IL-11, TGFb, 레티노산, 및 관문 자극제)의 방출을 프로그래밍하거나, 또는 파킨슨병의 경우, 물질이 T 세포 또는 B 세포로 전달되어 뇌-귀소 수용체의 발현 및 환자 결과를 개선시키는 인자의 분비를 유도한다. 관절염과 관련하여, 전염증성 사이토킨을 제거하는 것이 또한 유용하며, 예컨대, IL-2에 대해 높은 친화도를 갖는 T 세포는 자가반응성 효과기 세포가 필요로 하는 사이토킨을 흡수한다.
하기 재료 및 방법들이 본원에 기재된 데이터를 생성하는데 사용되었다.
CellSqueeze 미세유체 장치
CellSqueeze 플랫폼은 세 가지 주 성분으로 이루어진다: a) 다수의 채널을 병렬식으로 함유하며, 각각이 적어도 하나의 협착점을 함유하는 실리콘 및 유리 미세유체 칩, b) 세포 현탁액을 부하/수집할 수 있는 저장소, c) 저장소를 가압하고 칩을 통한 유체 유동을 촉진시키는 압력 조절 시스템. 전형적인 워크플로우(도 1a)에서, 표적 전달 물질을 목적하는 세포 (현탁액으로)와 혼합하고 이들을 저장소에 부하한다. 그후, 가압 튜브를 저장소에 연결하고, 챔버를 목적하는 수준으로 가압시켜 유체 유동을 개시한다. 처리 후, 세포를 출력 저장소로부터 수집하고 일정 시간, 예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 min. 또는 그 이상 동안 목적하는 온도에서 항온처리하여 추가의 가공 전에 적절한 막 회복을 보장한다.
CellSqueeze 장치 및 관련 작동 장비는 미국 SQZ Biotechnologies로부터 입수하였다. 장치를 제조자 프로토콜[참조; Sharei, A., N. Cho, S. Mao, E. Jackson, R. Poceviciute, A. Adamo, J. Zoldan, R. Langer, and K. F. Jensen. 2013. Cell squeezing as a robust, microfluidic intracellular delivery platform. Journal of visualized experiments: JoVE: e50980]에 따라 조립하여 사용하였다.
예를 들면, 개별 CellSqueeze 장치 및 관련 저장소 시스템을 70% 에탄올에서 보관하여 멸균을 유지시켰다. 각 실험을 위해, 목적하는 CellSqueeze 장치를 저장소에 연결시키고, 세포 샘플과 사용 전에 70 ul의 PBS를 사용하여 시스템을 수세하였다.
전달 실험 동안, 표적 세포, 장치+저장소, 및 수집 플레이트는 빙상에서(T 세포 및 B 세포) 또는 실온에서(수지상 세포) 유지시킨다. 세포 (PBS 또는 배양 배지 중에 2x106-1x107개 세포/ml의 농도로)를 유체 저장소에 가하기 전에 목적하는 농도로 표적 전달 물질과 혼합한다. 압력 튜브를 연결하고, 시스템을 목적하는 작동 압렵으로 설정하고, 샘플을 함유하는 저장소를 가압시켜 유동을 개시한다. 칩을 통해 통과시킨 후, 세포를 수집 저장소로부터 수집하고 96-웰 플레이트로 옮긴다. 이 공정을 임의로 반복한다. 막힘을 최소화하기 위해, 칩에서의 유동 방향을 샘플 간에 교대시킨다. 처리후 배지를 가하기 전 5분 동안 샘플을 빙상에서 항온처리되도록 하고 이들을 추가의 가공을 위해 옮긴다.
CAR T 세포
암-특이 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 T 세포를 변형시킴으로써, 세포를 프라이밍하여 달리 면역 검출을 벗어나는 종양 세포를 인식하여 사멸시킬 수 있다. 공정은 환자의 T 세포를 추출하고, 이들을 CAR을 위한 유전자로 형질감염시킨 다음 형질감염된 세포를 환자에게 재주입함을 포함한다.
이러한 인공 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체, 또는 CAR로도 공지됨)는 조직된 수용체이며, 이것은 임의의 특이성을 면역 효과기 세포에 접목시킨다. 전형적으로, 이들 수용체는 단클론성 항체의 특이성을 T 세포에 접목시키는데 사용된다. 본 발명 이전에, 핵산 암호화 서열의 전달은 전형적으로 레트로바이러스 벡터에 의해 촉진되었다. 본원에 기재된 방법은 바이러스 벡터를 사용하거나 포함하지 않는다. 암호화 서열 또는 단백질 CAR은 바이러스 벡터를 필요로 하지 않으면서 기재된 장치로 세포 스퀴징을 사용하여 T 세포와 같은 면역 세포의 시토졸로 전달된다.
치료적 용도를 위해, 환자의 T 세포를 말초 혈액으로부터 수득(및 임의로 증폭 또는 정제)하고 특정 암-관련 항원에 특이적인 인공 (키메라) 수용체를 발현하도록 변형시킨다. 변형 후, T 세포가 암을 인식하여 사멸시킨다. 예를 들면, 예시적인 CAR은 B-세포-혈액 악성종양에서 발현되는 항원인 CD19를 인식한다. T 세포가 CAR을 발현하도록 변형된 후, 변형된 T 세포를 환자에게 재주입한다. 가공된 세포는 암성 세포를 인식하여 사멸시킨다. 이러한 요법이 ALL, 비-호지킨 림프종, 및 만성 림프성 백혈병(CLL)을 위해 사용되어 왔으며, 혈액-매개 암, 예를 들면, 백혈병, B-세포 악성종양 (예컨대, 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 및 만성 림프성 백혈병), 뿐만 아니라 고형 암을 포함한 임의의 유형의 암을 위해 치료법에 적합하다. 본원에 기재된 세포 프로세싱 방법은 CAR T 세포를 생성하기 위한 보다 우수한 공정을 나타낸다.
자가조직 T 세포는 종양 세포에서 특정 항원을 인식하는 능력을 가공된 T 세포에 부여하는 CAR 단백질을 발현한다. 이러한 종양-관련 항원은 확인되었으며 당업계에 알려져 있다(아래 표 참조). 그후, 가공된 CAR T 세포를 실험실에서 확대시킨 다음 CAR T 세포의 확대된 개체군을 환자에게 주입한다. T 세포가 환자의 몸에서 증식하여, 이들의 표면에 종양-관련 항원을 갖는 암 세포를 인식하고, 이에 결합하여 이를 사멸시킨다. 임의로, 면역 관문 억제제, 예를 들면, 예정사-1 (PD-1) 억제제 또는 리간드 (PD-L1)의 억제제 및/또는 항-세포독성 T-림프구 항원 4 항-CTLA4 약물이 CAR T 세포와 조합될 수 있다.
종양의 치료
화합물 또는 조성물을 시토졸에 도입하기 위해 상기한 바와 같이 처리된 면역 세포는, 예컨대, 종양-특이 T-세포 매개된 면역 반응을 발취하여 종양을 사멸시키거나 증식을 억제함으로써 종양을 치료하는데 사용된다. 방법은 어떠한 종양 유형에도 적용 가능한데, 그 이유는 장치 및 방법이 면역 세포에 종양-특이/종양 관련 항원 또는 이의 혼합물, 예컨대, 종양 생검 세포 용해물 제제를 도입한다. 예를 들면, 종양 유형은 방광암, 유방암, 결장 및 직장 암, 자궁내막암, 신장암, 백혈병, 폐암, 흑색종, 비-호지킨 림프종, 췌장암, 전립선암, 갑상선암을 포함하며, 이들은 U.S. 인구에서 만연해 있다(참조; American Cancer Society: Cancer Facts and 도s, 2015, Atlanta, Ga: American Cancer Society, 2015. Available online). 가공된 면역 세포를 사용하여 치료되는 또 다른 종양 유형은 뇌(교아종), 간(간세포 암종) 뿐만 아니라 원발성 종양의 부위 또는 조직과는 별개의 신체의 해부학적 부위 또는 조직에서 발생하는 전이성 암을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 종양은 췌장암, 난소암, 흑색종, 폐암, 신경교종 또는 교아종 종양이다. 일부 구현예에서, 특정 환자의 종양이 표적화된다. 예를 들면, 환자로부터의 종양 용해물이 세포 스퀴징을 사용하여 면역 세포로 전달하고자 하는 항원으로서 사용될 수 있다.
종양 세포 항원
정제된 종양-관련 항원 또는 종양 세포 용해물(항원의 이종 혼합물)이 세포 스퀴징을 사용하여 면역 세포로 전달하고자 하는 항원으로서 사용된다. 종양 세포 용해물은 종양으로 진단받았고/받았거나 병리학적 악성종양에 대해 치료 예정인 대상체로부터 입수된 종양 세포주 또는 종양 생검 조직으로부터 생산된다. 종양 세포 용해물의 생산은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 종양 용해물 제제는 면역 세포의 시토졸로의 세포 스퀴즈-기반 전달에서 사용하기에 적합하다.
예를 들면, 종양 조직을 대상체로부터 절제하여, 조직을 갈아놓는다. 종양 세포를 가공, 예컨대, 분별, 증폭 또는 정제/분리한다. 비-고형 종양, 혈액-매개 종양(원발성 또는 전이성), 또는 세포주, 증폭된 세포)의 경우, 세포는 체액, 예컨대, 말초 혈액으로부터 입수하며, 임의로 증폭시키거나 정제하여 비-종양 세포로부터 종양 세포를 농축시킨다. 종양 세포(또는 종양 세포에 대해 증폭된 세포의 집단)를 가공하여 종양 세포 용해물을 수득한다(예컨대, 문헌[참조; Hatfield et al., J Immunother. 2008 Sep; 31(7): 620-632.]에 기재된 바와 같음). 예를 들면, 세포를 동결-해동 사이클(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10회 또는 그 이상의 동결/해동 사이클)에 적용한다. 임의로, 단계는 환자-특이 종양 세포 항원의 혼합물을 수득하기 위해 고체 부스러기의 제거 및 여과, 예컨대, 0.2 micron 필터를 포함한다.
비-제한적인 예에서, 세포를 액체 질소를 사용하여 다수회(예를 들면, 4회) 연속 동결/해동 사이클을 통해 용해시킨다. 그후, 세포를 1000 g에서 원심분리하기 전 약 10, 15, 또는 20초 동안 초음파처리하여 불용성 부스러기를 제거한다. 그후, 상청액을 용해물 전달에 사용한다. 임의로, 면역 세포로 전달하기 전에 지질 및/또는 핵산을 용해물로부터 제거한다. 전달 전에 아주반트를 임의로 가하여 APC 기능을 증대시킨다.
일부 구현예에서, 용해물 중의 암 항원의 비율을 선택적으로 증가시키도록 액틴과 같은 일반 내인성 단백질을 제거한다. 몇몇 실행에서, 순한 계면활성제를 용해된 세포 조성물에 가하여, 단백질이 세포에 의한 제시를 위해 전달되거나 가공하기가 어려울 수 있는 응집물을 형성하는 것을 방지하도록 돕는다.
자가조직 종양 세포 용해물은 또한 상업적으로 이용가능한 장치/방법, 예컨대, gentleMACS™ 분해기(Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여 생성할 수 있다.
종양-관련 항원은 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 항원은 생화학적으로 정제하고, 재조합적으로 발현시키고/시키거나 달리 정제/분리할 수 있다. 이러한 항원의 예는 아래 표에 나타내어져 있다.
(Buonaguro et al., Clin Vaccine Immunol. 2011 Jan; 18(1): 23-34.)
기타의 정제된 종양 항원이 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 문헌[참조; Tumor-Associated Antigens. Edited by Olivier Gires and Barbara Seliger, 2009, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co., KGaA, Weinheim]에 기재되어 있다.
바이러스 항원
바이러스-관련 항원을 세포 스퀴징을 사용하여 면역 세포에 전달할 수 있다. 바이러스-관련 항원은 당업계에 공지되어 있으며 이러한 항원은 생화학적으로 정제하고, 재조합적으로 발현시키고/시키거나 달리 정제/분리할 수 있다. 바이러스 항원의 예는 아래 표에 나타내어져 있다.
박테리아 항원
박테리아 항원을 또한 세포 스퀴징을 사용하여 면역 세포에 전달할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리아 항원은 세포내 박테리아, 예를 들면, 마이코플라스마 종(Mycoplasma sp.), 바이코박테리움 종(Mycobacterium sp.)(예컨대, M. 튜베르쿨로시스) 또는 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)와 관련된다.
하기 재료 및 방법들이 본원에 기재된 데이터를 생성하는데 사용되었다.
마우스 면역 세포 분리
T 및 B 세포를 공지된 방법, 예컨대, Stemcell Technologies(Vancouver, Canada)로부터의 세포-특이 분리 키트를 사용하여 제조자의 지침(음성 선택 기술)에 기초하여 야생형 C57BL6/J 마우스의 비장으로부터 분리하였다. 단핵구/대식세포를 1 ml의 티오글리콜레이트 용액을 복강내 주사한지 3일 후 야생형 C57BL6/J 마우스의 복강으로부터 분리하였다. 세포를 Stemcell Technologies(Vancouver, Canada)로부터의 CD11 b 양성 선택 키트를 사용하여 제조자의 지침에 기초하여 정제하였다. 세포를 10% 태아 소 혈청, 1% 항생제/항진균제, 0.5% 베타-머캅토에탄올, 1% 비필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루베이트, 및 10 mM HEPES 완충액(제조원; 모두 (Life Technologies, NY, USA))을 함유하는 글루타민 함유 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
인간 일차 T 세포 및 단핵구 유래 수지상 세포
인간 PBMC를 공지된 방법, 예컨대, Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 밀도 구배 원심분리를 사용하여 전혈로부터 분리하였다. CD4+ T 세포를 CD14 및 CD4 자성 마이크로비드 (MACS Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 사용하여 PBMC의 CD14-음성 분획으로부터 분리하였다. T 세포를 5 ng/ml rhIL-15 (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 보충된 10% 인간 혈청(AB) (GemCell, West Sacramento, CA), 100 U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신 설페이트 100㎍/ml (H 10 배지)를 함유하는 RPMI 1640 배지(Cellgro, Manassas, VA)에서 배양하여 세포 활성화 없이 세포 생존력을 유지시켰다. 인간 단핵구 유래 수지상 세포 (MDDC)를 항-CD14 자성 마이크로비드(MACS Miltenyi Biotec)를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포로부터 선택된 CD14- 양성 단핵구로부터 제조하고 100 ng/ml 인터류킨-4 및 50 ng/ml 과립구-대식세포 집락-자극 인자(R & D Systems)와 6일 동안 배양하였다.
세포 형질감염
인간 CD45 siRNA: 센스 5'-AF488 CUGGCUGAAUUUCAGAGCAdTdT-3' (서열번호 1), 인간 CD4 siRNA: 센스 5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGUdTdT-3' (서열번호 2) (Alnylam, Cambridge, MA); vif siRNA: 센스 5'-CAGAUGGCAGGUGAUGAUUGT-3', (서열번호 3) gag siRNA: 센스 5'-GAUUGUACUGAGAGACAGGCU-3' (서열번호 4) (Huang et al., 2013, Nature Biotechnology 31: 350-356); (GenePharma, Shanghai, China); 조절 스크램블 siRNA: 5'-GCCAAGCACCGAAGUAAAUUU-3' (서열번호 5), 인간 DC-SIGN siRNA: 센스 5'-GGAACUGGCACGACUCCAUUU -3' (서열번호 6) (Dharmacon, ThermoScientific, Pittsburgh, PA).
뉴클레오펙션
기재된 전기천공 실험에서, Amaxa Nucleofector II (Lonza Inc., Allendale, NJ)를 제조자의 권고에 따라 사용하였다. 인간 T 세포 실험은 인간 T 세포 키트로 인간 비자극된 T 세포, 높은 생존력, U-014에 대한 프로그램을 사용하여 수행하였다. 인간 MDDC를 위해서는 MDDC용 인간 수지상 세포 키트로 인간 수지상 세포 U-002에 대한 프로그램을 사용하였다. 간략하게, 2x106개 세포를 200 pmol의 siRNA를 갖는 100㎕의 뉴클레오펙션 용액에 현탁시키고 기기로 뉴클레오펙션시켰다. 단백질 전달을 시험하기 위해, 본 출원인은 CellSqueeze 및 뉴클레오펙션 실험 둘 다에 대해 APC-표지된 마우스 IgG1 (cl. MOPC-21, Biolegend)를 0.02 mg/mL로 사용하였다. 본 출원인은 또한 3 kDa 캐스케이드 블루 표지된 덱스트란 및 70 kD 플루오레세인 표지된 덱스트란을 0.2 mg/ml (Invitrogen)로 사용하였다.
조절 T 세포
조절 T 세포 (Tregs)는 공지된 방법을 사용하여 분리하고 확대시켰다. 예를 들면, CD4+ T 세포-풍부 PBMC는 CD4+ T 세포 RosetteSep 증폭 키트(Sigma-Aldrich and STEMCELL Technologies)를 사용하여 밀도 원심분리에 의해 건강한 개체의 말초 혈액으로부터 분리하고 항CD3-PE-Cy7, CD4-FITC, CD25- APC 및 CD127-PE로 표지하였다. CD3+CD4+CD25+CD1271ow Tregs를 FACS Aria 세포 분류기(BD Biosciences)에서 분류하고, 항-CD3/항-CD28-코팅된 마이크로비드(Invitrogen)로 자극시키고 IL-2 (300 U/mL)와 배양하였다.
siRNA 전달을 위해, 배양 7일째에, Tregs를 세척하고 X-VIVO 15 (Lonza) 배지 단독에서 1.0 x 107개 세포/ml로 재현탁시켰다. 조건당 1.0 x 106개 세포를 사용하였다. CD4 siRNA (5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3' (서열번호 7), Alnylam) 및 대조군 siRNA (siGENOME 비표적화 siRNA Pool #1, Thermo Fisher)를 100 psi에서 30-4 칩 설계로 1㎛로 사용하였다.
siRNA 전달한지 2일 후, 세포를 LIVE/DEAD® Fixable Violet 죽은 세포 염색 키트 (Life Technologies) 및 항-CD4-APC로 염색하였다. 데이터를 LSR2 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 획득하고 FlowJo (Treestar) 상에서 분석하였다.
유동 세포계측
마우스 세포를 다음의 항체로 염색하였다: 항-CD8-퍼시픽 블루, 항-CD4-APC, 항-CD11b-PE (cl. M1/70), 항-CD11c-APC. 요오드화프로피듐을 사용하여 죽은 세포를 배제시켰다. 데이터를 FACS CantoII, LSR II, 또는 LSRFortessa (BD Biosciences)를 사용하여 획득하고 FlowJo (Tree Star, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다.
인간 세포를 다음의 항체로 염색하였다: Biolegend (San Diego, CA)로부터의 항-CD3-APC (cl.OKT3), 항-CD45RA-PE-Cy7 (cl. HI100) 및 항-CD4-AF488 (cl.OKT4) 및 항-DC-SIGN-APC (c1.9E9A8) (R & D Systems, Minneapolis, MN). 죽은 세포는 시톡스 블루(Sytox blue) 및 7-AAD (7-아미노악티노마이신 D) 데드 염색 염료(Invitrogen)를 사용하여 배제시켰다. 데이터를 FACS CantoII (BD Biosciences)를 사용하여 획득하고 FlowJo (Tree Star, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다.
HIV 감염 및 세포내 p24 항원 염색
일차 CD4+ T 세포를 10-4 칩을 사용하여 5㎛ siRNA로 처리하였다. CD4의 녹다운을 위해, siRNA는 감염 전 48 시간 전에 전달한 반면 siRNA 표적화 바이러스 유전자 vif 및 gag는 감염 전 24 시간 전에 전달하였다. 그후, 세포를 5 μg/mL 피토헤마글루티닌(PHA)으로 밤새 자극시키고 96 웰 플레이트에서 HIV IIIB (400 ng/ml p24)을 갖는 2x105개 세포/웰로 하여 HIVIIIB로 감염시켰다. HIV IIIB는 NIH AIDS Reagent Program으로부터 입수하였으며 바이러스 스톡은 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다(18). 폴리브렌을 5㎍/ml로 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 1200 x g에서 원심 접종(spinoculation)함으로써 감염을 증가시켰다(19). 세포내 p24 항원 염색은 세포 투과화를 위한 Fix & Perm 키트(Invitrogen)로 항-p24 KC57-FITC 항체 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 사용하여 24 시간 후 수행하고 유동 세포계측법으로 분석하였다.
정량적 RT-PCR
총 RNA를 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 T 세포로부터 분리하고 복제 DNA는 Superscript III 및 랜덤 헥사머(Invitrogen)를 사용하여 합성하였다. 실시간 PCR은 SsoFast EvaGreen Supemix 및 Bio-Rad CFX96 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 수행하였다. 프라이머는 다음과 같았다: Gapdh 전방향: 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC -3' (서열번호 8), Gapdh 역방향: 5'-GCCCAATACGACCAAATCC -3' (서열번호 9), CD4 전방향: 5'-GGCAGTGTCTGCTGAGTGAC - 3' (서열번호 10), CD4 역방향: 5'-GACCATGTGGGCAGAACCT - 3' (서열번호 11).
통계적 분석
GraphPad Prism 4 소프트웨어(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 다중 그룹을 비교할 경우에는 일원 분산 분석 (ANOVA)과 본페로니 다중 비교 검정을 수행하거나, 2 그룹을 비교할 경우에는 양측 스튜던트 T 검정을 수행하였다. *, ** 및 ***는 본페로니 다중 비교 검정을 사용하는 경우 0.05, 0.01 및 0.001 미만의 P 값을 나타내고, ###는 양측 스튜던트 T 검정을 사용하는 경우 0.001 미만의 P 값을 나타낸다. 데이터는 달리 나타내지 않는 한 평균 ± 1 표준 편차로서 표시된다.
기계적 막 교란에 의한 전달
시험된 미세유체 장치는 다양한 협착 길이(10-50㎛), 폭 (4-9㎛) 및 채널당 협착의 수(1-5개 협착)의 45-75개 병렬식 미세유체 채널을 함유하였다. (문헌 참조; Sharei et al., 2013, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110: 2082-2087; Sharei et al., 2014, Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro 6: 470-475).
미세유체 칩을 작동시키는데 필요한 시스템은 유체 저장소를 실리콘 및 유리 장치에 고정시키는 장착 부재, 및 시스템을 통해 유체를 구동시키는데 사용되는 가스 압력을 조절하는 압력 조절 시스템을 포함하였다. 일부 구현예에서, 장치는 미세유체 채널을 통한 유동을 유도하는 시린지 또는 압력 공급원을 포함한다.
작동 과정이 도 1a에 예시되어 있다. 세포가 미세유체 채널을 통해 유동함에 따라(도 1b), 이들이 채널의 협착점에 도달하여(치료하고자 하는 세포의 대부분의 직경의 약 50% 미만) 세포의 신속한 기계적 변형 (표적 세포에 대한 협착점의 예시적인 치수는 다음과 같다: T 세포 (휴지시: 7-8㎛, 활성화시 (7-15㎛), 대식세포 (휴지시 및 활성화시: 10-30㎛), 수지상 세포 (휴지시 및 활성화시: 10-30㎛), 또는 스퀴징을 야기한다. 채널 협착이 적정 크기인 경우, 변형이 세포 막을 일시적으로 교란시킨다(예컨대, 변형 공정에는 0.1㎲-1ms가 소요되지만 막 교란은 5 min 이하 동안 벌어져 있을 수 있다). 그후, 둘러싼 완충액에 존재하는 거대분자가 막 교란을 통해 이동하기에 충분할 정도로 작다면 세포 시토졸로 들어간다. ~5 min 내에, 막은 이의 완전한 상태를 회복하며 세포에 의해 흡수된 거대분자는 세포 시토졸에 갇힌 채로 있다. 선행 연구들에서 협착 길이 (L), 폭 (W) 및 유체 속도 (V, 유체 속도는 작동 압력에 의해 측정됨을 주지한다)가 전달 효율 및 세포 생존력에 영향을 미치는 중요한 파라미터로서 확인되었다(문헌 참조; Sharei et al., 2013, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110: 2082-2087).
16개의 상이한 협착 설계의 라이브러리가 상이한 유동 조건하에서 시험되었다. 시험된 장치 설계의 라이브러리. 첫번째 숫자는 협착 길이를 나타내고, -(dash)가 앞에 붙은 그 다음의 숫자는 협착의 폭을 나타낸다. 다수의 동일한 협착이 연속하여 있다면, 이것은 'x' 다음에 협착의 수로 나타내어진다. 예를 들면, 10-5-4-5는 5㎛, 4㎛, 및 5㎛의 폭을 갖는 3개의 10㎛ 길이 협착을 연속해서 함유한다. 10-4x5는 각각 폭이 4㎛인 5개의 10㎛ 길이 협착을 함유한다.
협착 설계의 시험된 라이브러리
10-4 10-6-4-6 10-6 10-7x5
10-4x2 30-4 30-6 10-7
10-4x5 30-5-4-5 50-6 10-8
10-5-4-5
(길이 명칭 "10" 뒤의) 폭 명칭 "5-4-5" 에서 각 숫자는 세 개의 상이한 협착점을 나타낸다		 30-5x5 10-6x5 10-9
이러한 변수들은 거대분자 전달을 최적화하고 세포 독성을 최소화하기 위해 (유량을 변화시키기 위한) 압력 및 온도의 변화를 포함하였다. 모든 시험된 완충액(PBS, PBS+2% 혈청, 완전 배양 배지, 및 인간 전혈)은 시스템과 상용성인 것으로 밝혀졌으며, 이는 임의의 생리학적으로 상용성인 유체 또는 용액이 전달 장치 및 공정을 통해 세포를 현탁시키는데 적합함을 나타낸다.30-5x5, 10-4x2, 10-5-4-5, 10-6-4-6, 30-5-4-5, 및 10-4x5 설계를 또한 뮤린 및 인간 T 세포에 대해 시험하였지만, 어느 것도 30-4의 실행보다 우수하지 않았다.
전달 파라미터 및 성능에 대한 이의 영향
협착 설계 협착 기하학 (특히 길이 및 폭) 및 일련의 협착 수는 전달 효율 및 세포 생존력에 영향을 미친다. 보다 길고, 좁고 많은 다수의 협착은 전형적으로 보다 효과적인 전달을 초래하지만 낮은 생존력을 야기할 수 있다
작동 압력 시스템의 작동 압력은 세포가 채널을 이동하여 변형되는 속도를 측정한다. 보다 높은 속도가 더욱 빠른 변형을 야기하고, 이것이 보다 높은 전달 효율 및 잠재적으로 보다 낮은 생존력을 초래할 수 있다.
유동 완충액 세포가 처리 동안 현탁되는 완충액이 세포 건강에 영향을 줄 수 있으며 잠재적으로 전달되는 생체분자와 상호작용할 수 있다 (예컨대 혈청 단백질이 특정 물질과 결합할 수 있다). 전달에 대한 한 가지 공지된 효과는 칼슘에 의해 매개된다. 유동하는 완충액 중의 칼슘의 존재는 처리후 막 회복을 가속화시킨다. 칼슘-비함유 완충액에서의 작업은 생존력 감소 위험에서 전달을 증가시킬 수 있다.
작동 온도 보다 낮은 온도 (즉, 빙상에서)는 전달 효율을 개선시킨다. 온도는 많은 파라미터에 영향을 미칠 수 있다. 한 가지 가능성은 낮은 온도가 처리후 막 회복을 지연시킨다는 것이다.
일부 구현예에서, 장치는 약 5㎛ 내지 약 50㎛ 또는 그 사이의 임의의 길이 또는 범위의 협착 길이를 포함한다. 예를 들면, 협착 길이는 약 5㎛ 내지 약 40㎛, 약 5㎛ 내지 약 30㎛, 약 5㎛ 내지 약 20㎛, 또는 약 5㎛ 내지 약 10㎛에 이른다. 일부 구현예에서, 협착 길이는 약 10㎛ 내지 약 50㎛, 약 20㎛ 내지 약 50㎛, 약 30㎛ 내지 약 50㎛, 또는 약 40㎛ 내지 약 50㎛에 이른다. 일부 구현예에서, 협착 깊이는 약 2um 내지 약 200um 또는 그 사이의 임의의 깊이 또는 범위에 이른다. 예를 들면, 협착 깊이는 약 2㎛ 내지 약 150㎛, 약 2㎛ 내지 약 100㎛, 약 2㎛ 내지 약 50㎛, 약 2㎛ 내지 약 25㎛, 약 2㎛ 내지 약 15㎛, 또는 약 2㎛ 내지 약 10㎛에 이른다. 일부 구현예에서, 협착 깊이는 약 10㎛ 내지 약 200㎛, 약 25㎛ 내지 약 200㎛, 약 50㎛ 내지 약 200㎛, 약 100㎛ 내지 약 200㎛, 또는 약 150㎛ 내지 약 200㎛에 이른다. 일부 구현예에서, 협착의 입구 또는 출구 부분의 각도는 약 0도 내지 약 90도 또는 그 사이의 임의의 각도 또는 각도 범위에 이른다. 예를 들면, 각도는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 또는 약 90도 또는 그 이상에 이른다. 일부 구현예에서, 압력은 약 50 psi 내지 약 200 psi 또는 그 사이의 임의의 압력 또는 압력 범위에 이른다. 예를 들면, 압력은 약 50 psi 내지 약 150 psi, 약 50 psi 내지 약 125 psi, 약 50 psi 내지 약 100 psi, 또는 약 50 psi 내지 약 75 psi에 이른다. 일부 구현예에서, 압력은 약 75 psi 내지 약 200 psi, 약 100 psi 내지 약 200 psi, 약 125 psi 내지 약 200 psi, 약 150 psi 내지 약 200 psi, 또는 약 175 psi 내지 약 200 psi에 이른다. 일부 구현예에서, 장치는 약 2㎛ 내지 약 10㎛ 또는 그 사이의 임의의 폭 또는 폭 범위의 협착 폭을 포함한다. 예를 들면, 협착 폭은 약 3㎛, 약 4㎛, 약 5㎛, 약 6㎛, 또는 약 7㎛ 중의 어느 하나일 수 있다.일차 마우스 세포로의 전달
일차 면역 세포로의 세포내 전달을 가능케 하는 이들 플랫폼의 가능성을 평가하기 위해, 마우스 T 세포, B 세포, 및 단핵구/대식세포를 형광 표지된 덱스트란 (3, 및 70, 및 2,000 kDa), 및 항체 (약 150 kDa)의 존재하에서 미세유체 장치를 통해 통과시켰다. 이들 물질은 각각 소분자, 다당류, 및 단백질을 위한 모델로서 선택되었다. 세포 유형당 적어도 네 개의 장치 설계와 두 개의 작동 압력을 시험하였다. 협착 치수의 초기 선택은 세포주, 일차 섬유아세포 및 배아 줄기 세포에서의 작업에 의해 정해졌다. (문헌 참조; Sharei et al., 2013, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110: 2082-2087). 구체적으로, 협착의 폭은 표적 세포의 평균 직경의 ~50%로 되도록 선택되었다. 30-4 설계 (즉, 협착이 30㎛ 길이 및 4㎛ 폭을 가짐)를 사용한 전달이 림프구 및 골수 세포에 가장 효과적이었다(도 2a-c).
생체분자의 전달 (도 2a-c 및 도 6) 및 세포 생존력 (도 7)은 처리한지 1-2시간 후 유동 세포계측에 의해 측정하였다. 도 2a-c는 항체 전달 (도 2a), 독립적인 실험에서 3 kDa 덱스트란, 70 kDa 덱스트란, 및 항체의 전달 효율 (도 2b), 및 대표적인 중간 강도 데이터 (도 2c)의 대표적인 히스토그램을 보여준다. 전달 효율(백그라운드보다 높은 형광을 갖는 살아있는 세포의 퍼센트로서 정의됨) 및 중간 형광 강도가 전달의 일차 척도로서 사용되었다. 3 kDa 덱스트란은 각각 T 세포, B 세포, 및 골수 세포의 66.2±13.4%, 67.5±13.9%, 및 80.8±3.46%로 전달되었다. 보다 큰 70 kDa 덱스트란 및 Ab의 흡수는 예상대로 3 kDa 덱스트란의 흡수보다 덜 효과적이었으며, 이는 더 작은 분자가 더 효율적으로 전달됨을 시사한다. T 세포의 세포 생존력은, B 세포 또는 골수 세포는 그렇지 않지만, 비처리 세포에 비해 다소 손상되었다. 장치로 처리된 B 세포 및 골수 세포의 생존력에 있어서의 변화는 비처리 또는 비-장치 세포와 유의적으로 상이하지 않았다. 골수 유래된 수지상 세포는 이들의 보다 큰 크기 때문에 6㎛의 보다 큰 협착 폭을 사용하여, 생존력을 제한된 정도로 상실하면서, 덱스트란 및 항체를 흡수하였다(도 8). 덱스트란 (3 kDa 및 70 kDa)과 항체의 동시 전달은 이들 분자의 전달이 비례하며, 즉, 항체를 받아들인 세포는 또한 비교 양의 덱스트란 분자를 받아들임을 보여주었다(도 9).
인간 면역 세포로의 전달
이러한 접근법의 인간 면역 세포에의 적용 가능성을 조사하기 위해, T 세포의 경우 4-6㎛ 및 단핵구-유래 수지상 세포 (MDDC)의 경우 6-9㎛ 범위의 협착 폭을 갖는 장치 설계를 시험하였다. 상이한 생체분자에 대한 항체 전달 및 효율 데이터의 대표적인 히스토그램이 도 3a에 나타내어져 있다. 가장 효과적인 설계는 3 kDa 덱스트란을 T 세포 (4㎛ 협착 크기)의 70%±9% 및 MDDC (7㎛ 협착 크기)의 60%±4.5%로 전달하였다(도 3a). 70 kDa 덱스트란은 T 세포의 71%±11% 및 MDDC의 40%±14%로 전달되었으며, 단백질 (항체)은 T 세포의 65%±15% 및 MDDC의 38%±7%로 전달되었다. 형광 표지된 siRNA (CD45RA siRNA - Alexa-Fluor-488)의 전달은 유사한 결과를 산출하였다(도 12, 13).
단백질 녹다운을 시험하기 위해, 인간 CD4 또는 CD45RA에 대한 siRNA를 혈액 유래 T 세포로 전달하고 5, 1 및 0.2㎛ siRNA를 사용하여 처리한지 72시간 후 단백질 수준의 용량-의존적 녹다운을 관찰한 반면, 대조군 siRNA는 유의적인 효과를 나타내지 않았다(도 3b, 도 12, 13). CD4 mRNA는 또한 처리한지 48 시간 후 qRT-PCR에 의해 측정하는 경우 감소되었다(도 14). 5㎛ CD4 siRNA로 처리한 T 세포에서 CD4 녹-다운의 지속성을 또한 시험하였다. 녹다운은 ~10일간 지속되었다(도 14). 수지상 세포 마커 DC-SIGN를 표적으로 하는 siRNA의 전달은 또한 상이한 장치 설계를 사용하여 MDDC에서 DC-SIGN 단백질 발현의 상당하고 서열-특이적인 녹다운을 야기하였다. 상이한 장치 설계에서의 녹-다운의 수준은 덱스트란/Ab 전달 효율과 상관성이 있다. CD4 T 세포 및 MDDC에 대한 독립적인 실험으로부터의 단백질 발현 및 편집된 녹다운 데이터의 대표적인 히스토그램이 도 3b에 나타내어져 있다. 접근법은 또한 인간 조절 T 세포 (도 3c), B 세포 및 단핵구 (도 16, 17, 18)에도 적용 가능한 것으로 밝혀졌다.
미세유체 장치의 성능을 뉴클레오펙션(핵산 전달에 대한 전기천공-기반 접근법)과 비교하기 위해 인간 CD4 T 세포를 CellSqueeze 플랫폼 또는 뉴클레오펙션 기기에 의해 동시에 siRNA로 처리하고, 단백질 녹다운을 72 시간 후 유동 세포계측에 의해 측정하였다. CD4 녹다운의 정도가 둘 사이에 유사하기는 하지만(도 3d), 뉴클레오펙션 후 T 세포 생존력은 미세유체 장치로 처리한 세포에서보다 유의적으로 악화되었다(P<0.05). 표지된 덱스트란 및 단백질의 전달에 대한 두 개의 플랫폼의 효율을 비교하였다. 변형 장치의 성능을 뉴클레오펙션과 비교하면, MDDC의 맥락에서, T 세포에 대해 유사한 결과가 산출되었다. 구체적으로 최상의 미세유체 장치 (T 세포의 경우 30-4, MDDC의 경우 10-6)는 세포 생존력 및 전달에 있어서 이점을 나타내었다(도 18). 두 가지 기술 간의 siRNA 녹다운 효율의 비교 또한 세포 스퀴징이 오프-타켓 효과를 덜 야기하고(도 19) 장기간 생존력을 향상시킴을 나타내었다.
일차 인간 T 세포에서 HIV-1 감염의 억제
미세유체 접근법이 바이러스 유전자를 표적화하는 siRNA를 전달함으로써 인간 일차 CD4+ T 세포에서 HIV 감염 및 복제를 억제하는데 유용한지를 측정하기 위해 연구를 수행하였다. 바이러스 복제를 저해하는 것으로 이전에 증명된 vif 및 gag에 대한 siRNA를 HIV로 감염시키기 24 시간 전에 세포에 전달하였다. 양성 대조군으로서, HIV 수용체 CD4를 표적화하는 siRNA를 사용하였다. CD4 siRNA를 감염시키기 48 시간 전에 전달하여 표면 CD4 수준의 감소를 보장하고, 이에 따라 감염을 억제시켰다. HIV 복제를 세포내 p24 항원에 대해 염색함으로써 측정하고, 유동 세포계측에 의해 측정하였다. 독립적인 감염 실험으로부터의 대표적인 히스토그램 및 편집된 결과가 도 4a-b에 나타내어져 있다. p24 항원의 유의적인 감소가 둘 다 별도로 및 조합하여 vif 및 gag 표적화 siRNA로 처리된 T 세포에서 관찰되었다(p<0.01). 억제 효과는 CD4 녹다운에 의해 유도된 것보다 더 컸다(p<0.05) (도 4a-b).
세포 형태 변경 장치를 사용한 면역 세포로의 화합물의 생체외 시토졸성 전달
면역 세포로의 거대분자의 세포내 전달은 본 발명 이전에는 상당한 도전과제였다. 여기에 나타낸 결과는 소분자 뿐만 아니라 큰 거대분자를 진핵 세포, 예를 들면, 마우스 및 인간 면역 세포로 전달하기 위한 벡터-비함유 막 교란 기술의 유용성을 입증한다. 결과는 특히 임상 사용과 관련하여 놀라운데, 그 이유는 면역 세포가 조성물을 이들 세포의 세포로 전달하는 다른 기술들에 대해서는 저항성이기 때문이다. 본원에 기재된 데이터는 다음을 입증한다: (i) 다양한 생물학적 관련 거대분자(다당류, 단백질, 및 핵산)를 전달하는 능력; (ii) 대부분의 임상적으로-관련된 면역 세포 서브세트(T　세포, B 세포, DC, 단핵구/대식세포)에서의 효율(도 2a-c 및 도 3a-d); (iii) 벡터 물질 및 전기장으로부터의 해방, 이에 따라 식작용 포착(endocytic entrapment) 및 전기천공-수준 독성과 관련된 문제들 중의 일부를 극복함; 및 (iv) 다수 종류의 거대분자를 표적 세포로 동시 전달(도 2c, 9, 12, 13).
이러한 놀랍고도 유의적인 이점은 이전에는 예측하지 못했던 면역 세포 가공 및 임상 응용을 가능케 한다. 예를 들면, 이 시스템은 펩티드 또는 단백질계 치료제를 림프구, 기존 방법, 예컨대 전기천공이 제한된 효능을 보였던 물질로 전달하기 위한 플랫폼으로서 작용한다. 시스템의 동시 전달 특징은 다수의 치료 후보물질을 병행하여 스크리닝하여 스크리닝 공정을 가속화시키고 잠재적으로는 상보적 효과를 확인하는데 또한 유용하다. 게다가, 유사한 크기의 표지된 분자를 트레이서로 사용하면 비표지된 표적 물질의 전달 효율을 독립적으로 모니터링할 수 있다. 기타의 영상화제, 예를 들면, 양자점이 또한 이 시스템을 사용하여 전달될 수 있으며, 따라서 살아있는 세포에서 분자 상호작용의 직접 관찰을 촉진시켜 생물학적 공정에 대해 보다 깊은 이해를 얻을 수 있다.
비제한적인 예에서, 전달된 면역 세포의 생체내 이미징을 촉진시키기 위해 양자점 또는 자성 나노입자가 전달된다. 예를 들면, MRI는 자성 입자가 부하된 입양 전달된 T 세포의 국소화를 검출할 수 있다.
협착 기하학, 온도, 작동 압력 및 완충액 조성과 같은 시스템 파라미터에 대한 전달 성능의 의존성을 면역 세포 또는 면역 세포의 혼합물, 예컨대, 전혈에서의 세포로의 화합물/조성물의 전달에 대해 맞추었다. 예를 들면, 면역 세포에 대한 예시적인 장치 파라미터는 T 세포(30-4 휴지시, 10-4 활성화시), B 세포 (30-4 휴지시, 10-4 활성화시), 대식세포 (10-6), 수지상 세포 (10-6) 뿐만 아니라 혼합물, 예를 들면, 백혈구 분획/연막 세포 또는 전혈 세포를 포함한다. 모두를 위한 협착 설계의 범위는 2-10㎛ 폭, 0.1-90㎛ 길이이다). 따라서, 장치 건축을 개발하고 다른 세포 유형에 대해 확립된 설계 규정을 사용하여 프로토콜을 작동시킴으로써 표적 림프구 및 골수 세포 집단에서 플랫폼의 성능을 최적화할 수 있다. 예를 들면, 더 길고, 더 좁은 협착을 갖는 장치를 제작함으로써 전달 효율을 증가시킬 수 있다. 장치의 처리량은, 현재 100,000-1,000,000개 세포/초에서, 장치당 보다 많은 병렬 채널을 포함시키거나 작동 압력을 증가시킴으로써 또한 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 채널 깊이를 증가시키거나 추가의 채널을 병렬로 추가하여 처리량을 증가시킨다. 작동 압력은 장치의 설계에 따라 변할 수 있다. 특정 구현예에서, 압력은 1 psi 내지 1000 psi이다.
vif 및 gag 녹다운 연구는 세포 표현형을 변경시키고 질환-관련 생물학적 공정, 예를 들면, 바이러스성(e,g, HIV) 복제에 영향을 미칠 수 있는 이들 접근책의 가능성을 입증한다(도 4a, b). 이 결과는 질환 치료 및 질환 메카니즘(예컨대 특정 유전자에 대한 바이러스 복제의 의존성)을 연구하는데 있어서의 이러한 접근법의 유용성을 입증할 뿐만 아니라 잠재적으로 독성인 전달 벡터를 사용하지 않으면서 특정 숙주 세포 기능/경로를 표적화함으로써 임상 사용을 위한 면역 세포의 가공을 입증한다. 스퀴징에 의해 전달된 단백질 전사 인자, 예컨대, IRF5를 사용하여 인간 pDC에서 IFN-α 생산을 증가시킬 수 있으며, 따라서 이는 스퀴징에 의해 전달된 단백질이 또한 기능적이며 세포 표현형에 영향을 미칠 수 있음을 입증한다. 따라서, 이러한 세포내 전달 시스템은 세포외 항체 및 사이토킨-기반 접근법을 능가하는 역량으로 면역 세포 가공에 유용하다.
본원에 기재된 데이터는 (본 발명 이전에는) 가공하기가 어렵고 화합물/조성물의 시토졸성 전달을 달성하기가 어려웠던 면역 세포에 대한 시토졸성 전달에 대한 바이러스 벡터-비함유, 미세유체 접근법의 놀라운 효율을 보여준다. 데이터는 T 세포, B 세포, 골수 세포 (CD11b+), 및 수지상 세포로의 다당류, 단백질 및 핵산을 포함한 다양한 거대분자의 전달을 촉진시키는 이러한 접근법의 능력을 추가로 입증한다. 전달된 물질의 기능은 다섯 가지 상이한 유전자를 표적으로 하는 siRNA-기반 녹다운 연구에서 검증되었다. 마지막으로, HIV 감염 연구는 세포 표현형을 변경하고 전염병의 억제를 위해 바이러스 복제에 영향을 미치는 이러한 접근법의 유용성을 강조한다. 본원에 기재된 벡터-비함유 전달 시스템은 면역 세포의 기능을 가공하고/하거나 이들의 표현형, 기능, 활성화 상태를 변경하기 위한 안전하고 신뢰할 수 있으며 효과적인 방법을 제공한다.
미확인 병원균을 위한 반응 백신 시스템
전염성 병원균은 군인 및 민간인에 비슷하게 심각한 위협을 가한다. 잠재적인 생물학적 공격 및 유행성 바이러스의 진화를 막기 위해, 강력한 신속-반응 백신화 능력을 개발해야 한다. 최신의 기술로, 강한 변종을 분리하고 과학자들이 이를 특성화할 수 있기는 하지만, 효과적인 백신을 개발하기 위해서는 수년이 걸리며 수십억 달러가 소요될 수 있다. 에볼라 및 HIV와 같은 여러 치명적인 병원균은 수십년의 연구에도 불구하고 여전히 현대의 백신화 방법으로 해결할 수 없다. 본 발명은 본원에 기재된 벡터-비함유 세포내 전달 플랫폼을 사용하여 개체의 면역 세포를 직접 가공함으로써 병원균으로부터의 신속-반응, 다중-표적화, 개별화된 보호를 위한 방법 및 장치를 제공한다. 상기 방법은 새로 감염된 개체를 확인한지 수 시간 내에 국소 위험 집단의 효과적인 백신화를 가능케 하며, 아래 표 3에 나타낸 바와 같이 이전의 접근법을 능가하는 몇 가지 이점을 갖는다.
백신 특징 약독화된 바이러스 백신 재조합 항원+ 아주반트 입양 전달 신속한 반응 백신화 플랫폼
효능 높음 보통 보통/낮음 높음
개발 시간 (증상당) 수년 수개월 수개월 수시간
개발 비용(증상 당) 높음 보통 높음 낮음/없음
치료 비용 낮음 보통 높음 낮음
현장-배치가능성 있음 있음 없음 있음
개체의 APC(예컨대, B 세포, DC, 및 재프로그래밍된 T 세포)의 세포질로의 항원성 단백질의 직접 전달은 바이러스 탈출을 해소하는데 필요한 다중-표적 면역 반응의 유도를 통해 보다 효과적인 보호를 제공하면서 약독화된 바이러스 벡터의 확인 및 개발에 대한 필요성을 일소시킨다. 현장-배치 가능한 백신화 플랫폼은 수 개월/년이 아니라 수 시간 내에 발병을 해결한다.병원균이 개체에서 의심되는 경우, 먼저 감염 조직에 대해 생검을 실시한다. 병원균을 함유하는 이 조직을, 분자 성분들(즉, 항원)은 그대로 있고, 반면에 병원균은 용균 공정으로 인해 비활성화되도록 용해시킨다. 그후 이들의 혈액을 채취하고, 혈류로 다시 보내기 전에 이들 세포를 미세유체 세포내 전달 장치(3)를 통해 지나가게 함으로써 이러한 항원 혼합물이 건강한 개체의 면역 세포로 전달된다. 이러한 전달 공정은 병원균 관련 항원을 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 단핵구를 포함한 혈중의 잔류 APCs의 세포질로 도입한다. 그후, 항원 단편은 MHC-I에 의해 제시되고 질환-특이 세포독성 T 세포 CTLs의 활성화를 구동하여 보호를 제공한다. 용해는 감염된 생검을 수득한지 1-2시간 내에 완료될 수 있으며(단일 생검으로부터 다수의 건강한 환자에 대한 용량을 생성함) 건강한 환자의 후속적인 접종에는 일인당 <5 min가 소요된다(도 5). 게다가, 병원균이, 예컨대 HIV 또는 에볼라의 경우, 특성화되었다면, 세포 용해물의 사용을 항원 공급원으로서 화학적으로 정의된 합성 펩티드로 대체할 수 있으며, 따라서, 용해물의 사용을 둘러싼 잠재적인 안전성 우려를 없앨 수 있다.
신속 반응 백신 플랫폼은 종래의 비용이 많이 드는 다년간의 개발 공정이 상당한 인명 손실을 초래할 수 있는 경우 다양한 생물학적 위협으로부터의 일차 방어선을 제공한다. 이러한 백신화에 대한 접근법은 종양학 및 전염병 치료에도 적용 가능하다.
B 세포에서의 세포내 항원 부하를 위한 미세유체 스퀴징
항원 제시 세포(APCs)는 조직으로부터의 외래 또는 자가 단백질 및 펩티드를 포획하고, 적응 면역 세포를 활성화시켜 이러한 항원에 대해 염증성 또는 면역관용원성 면역 반응을 생성하는 (수지상 세포, 대식세포, B-세포를 포함한) 면역 세포의 다양한 서브세트이다. 단백질은 이들 주변의 유체-상 샘플링 또는 외래 미생물 또는 죽은 세포 부스러기의 수용체-매개된 섭취를 통해 생체내에서 APCs에 의해 섭취된다. 섭취된 단백질은 펩티드 단편 (항원)으로 분해되고, 이것이 가공되고 상호자극 신호와 함께 T-세포에 제시되어, APC에 의해 수용된 특정 신호 및 제시된 항원에 기초한 비처리 T-세포 활성화를 지시한다. T-세포 활성화에 있어서의 이러한 중요한 역할 때문에, 항원이 부하되고 생체외 활성화된 정제 APCs를 (예컨대, 입양 T-세포 요법을 위해) 배양액 중에서 기능성 T-세포를 확대시키거나 효과적인 생체내 세포 백신으로서 사용할 수 있다. 미세유체 시스템을 사용하여, APCs의 생체외 가공은 병원성 세포의 표적 사멸이 중요하고 내인성 APC 기능이 활동적으로 억제되는 암 및 HIV와 같은 질환에서 특정 유형의 면역력, 특히 세포독성 T 림프구 (CTL)를 생성하기 위한 대안적인 접근법으로서 효과적인 것으로 나타났다. 유망한 전임상 연구에도 불구하고, 세포계 백신의 임상적 번역은 여러 한계에 의해 제한되었다. 면역 세포의 시토졸로의 항원의 전달을 위한 미세유체 장치 및 관련 방법은 이전 접근법들의 다수의 문제점과 단점을 해결한다.
세포계 백신에 대한 이전의 임상 연구는, CTL을 프라이밍하는데 있어서의 이들의 효율, 및 이들의 매우 활성인 세포외 단백질 흡수 및 항원-가공 능력 때문에, 소위 "전문(professional)" APC라고 하는 수지상 세포 (DC)에 초점을 맞추었다. 그러나, 임상 사용을 위한 플랫폼으로서, DC는 인간 혈중에서의 이들의 상대적 결핍, 복잡한 서브세트 이종성, 짧은 수명, 및 증식 불능에 의해 제한된다. 이러한 문제는 대식세포 및 B-세포를 포함한 다른 세포 유형도 세포계 APC 백신을 위해 고려되도록 한다. B-세포는, 림프구로서의 이들의 독특한 특성 및 DC의 여러 한계를 극복할 수 있는 이들의 잠재력 때문에, 이러한 목적을 위해 바람직한 세포 집단이다. 예를 들면, B-세포는 순환계에서 풍부하고(혈액 mL당 0.5 백만 개 이하의 세포), 세포 활성화시 증식할 수 있으며, 정맥내 투여시 부수적인 림프상 기관으로 효율적으로 귀소한다.
APC로서의 B-세포의 이러한 이점은 T-세포의 프라이밍을 위해 항원을 획득하고 가공하는 B-세포의 능력에 있어서의 한계에 의해 상쇄된다. B-세포는 유전적으로 재배열된 B-세포 수용체(BCR)를 발현하며, 이것은 이들의 표적 항원에 결합시, 항원 흡수 및 B-세포 활성화를 촉진시킨다. B-세포는 이들의 BCR을 통해 항원을 내재화하고 일차 T-세포 반응을 프라이밍할 수 있지만, 비-특히 항원(즉, 이들의 BCR에 의해 인식되지 않은 항원)의 흡수는 대식세포 및 DC에 비해 불량하며, 이것이 이들 주변으로부터 항원을 효율적으로 음작용하고 식균한다. 게다가, CTL의 프라이밍은 I종 MHC 분자에 의한 펩티드의 제시를 통해 일어나며, 이것은 정상적으로 시토졸 (여기에 I종 MHC 가공 기계가 주로 존재한다)에 위치한 항원으로만 부하된다. 이와 달리, BCR을 통해 엔돌리소좀으로 흡수된 단백질은 CD4+T-세포에의 제시를 위해 II종 MHC 제시로 지시되는 경향이 있다. 대안적으로, B-세포 및 기타의 전문 APC는 교차 제시를 통해 I종 MHC 분자와 펩티드를 부하할 수 있으며, 이 공정에 의해 I종 펩티드-MHC 복합체가 프로테아좀 가공 또는 액포 단백질 분해를 통해 세포내이입된 항원으로부터 생산되지만, 이 공정은 일반적으로 매우 비효율적이다.
B-세포에서 항원 흡수 및 교차-제시를 증가시키는 방법이 개발되었지만, 이러한 전략들은 대개 식작용 흡수를 위해 특정 수용체를 표적화하거나, 비특이 세포내이입을 증가시키기 위해 유체상 단백질 노출과 함께 B-세포를 활성화시키거나, 항원을 면역-자극 복합체로서 전달하거나, B-세포 기능을 지시하기 위해 융합 단백질을 생성하는 데에 의존한다. 이러한 접근법들은 항원 흡수가 표적 수용체를 통한 신호전달에 의해 매개된 B-세포 상태에 있어서의 다른 변화들에 결부된다는 사실에 의해 제한되며, 이는 항원 부하 및 B-세포 활성화가 별도로 조정될 수 없음을 의미한다. 예를 들면, 휴지 B-세포는 비처리 CD8+T-세포에 대해 면역관용원성이며, 이는 자가면역을 치료하는데 있어서 잠재적으로 유용한 특성인 것으로 나타났으며, B-세포의 활성화가 이러한 적용에서 문제가 있다. 항원을 암호화하는 DNA, RNA33, 또는 바이러스 벡터로의 B-세포의 형질감염이 또한 유망한 것으로 나타났으나, 전기천공의 독성, 바이러스 벡터 패킹 성능, 형질도입 효율, 안정성, 및 항-벡터 면역력과 같은 다수의 사안에 의해 제한되었다. 본원에 기재된 방법은 이전의 접근책들의 이러한 단점에 대한 해결책을 제공한다.
B-세포가 미세유체 장치의 미소규모 채널에서 협착을 통해 통과함에 따라 일시적인 혈장 막 교란/교란에 의한 살아있는 B-세포로의 전체 단백질, 즉, 비가공 항원의 직접 시토졸성 전달이 달성된다(기계-교란). 명확하고 당업계에 인식된 모델 항원 난백알부민(OVA)을 사용하여, 이 방법을 통한 전체 단백질의 전달이 휴지 B-세포 조차도 시험관내 및 생체내 둘 다에서 효과기 CTL의 강력한 프라이밍을 유도할 수 있었다. I종 MHC에 의한 전체 단백질 전달 및 항원 제시를 위한 이러한 방법은 B-세포 활성화의 공정으로부터 항원 부하를 분리시켜, 이러한 두 가지 공정들이 면역원성 또는 면역관용원성 백신을 위해 별도로 맞춰지도록 할 수 있게 하는 B-세포에서의 일차 항원 전달법이다. 세포 스퀴징은 시험관내 CTL 확대를 위해 자가조직 B-세포를 프라이밍하는 또 다른 모듈 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라 B-세포계 백신의 개발을 촉진시킨다.
다음의 재료 및 방법을 사용하여 항원 제시에 관한 데이터를 생성하였다.
시약. TRITC- 및 캐스케이드 블루-표지된 3 kDa 덱스트란은 Life Technologies로부터 구입하였다. FITC-표지된 40 kDa 덱스트란은 Chondrex로부터 구입하였다. 모델 항원, 저 내독소 난백알부민 단백질은 Worthington Biochemical Corporation으로부터 구입하였다. CpG ODN 1826 (CpG B), CpG ODN 2395 (CpG C), 및 LPS 에쉐리키아 콜리 K12 (LPS)는 모두 Invivogen로부터 구입하였다. 다합체성/메가CD40L은 Adipogen 및 Enzo Life Sciences로부터 구입하였다.
세포 분리. 면역 세포 또는 면역 세포의 서브세트를 분리/정제 또는 증폭하기 위한 방법 및 과정은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들면 인간의 경우, 말초 혈액 단핵 세포는 정맥천자에 의해 채취된 전혈 및 표준 프로토콜을 사용하여 분리된 면역 세포의 서브세트, 예컨대, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포로부터 수득된다. 골수가 또한 면역 세포의 공급원으로서 사용된다.
본원에 기재된 실시예에서 B-세포 분리를 위해, 비장을 마우스로부터 수확하고 70㎛ 세포 스트래인너를 통해 매쉬시켰다. 적혈구를 용해시키고 휴지 B-세포를 B-세포 분리 키트, 마우스 (Miltenyi Biotec)로 제조자의 지침에 따라 세포 현탁액으로부터 분리하였다. 분리 후, B-세포 현탁액은 유동 세포계측으로 측정하여 >95% B220+이었다. CD8+T-세포 분리를 위해, 비장 및 서혜부 림프절을 수확하여 매쉬시켰다. 적혈구 용해 후, CD8a+T-세포를 CD8a+T-세포 분리 키트, 마우스 (Millenyi Biotec)로 제조자의 지침에 따라 분리하였다. CD4+T-세포 분리는 비장 및 서혜부 림프절 현탁액 상에서 CD4+T-세포 분리 키트, 마우스 (Millenyi Biotec)로 수행하였다. T-세포는 CD8a 또는 CD4 염색 및 유동 세포계측으로 측정하여 항상 >90% 순수하였다. 모든 세포 배양은 1㎕/mL의 55 mM β-머캅토에탄올로 보충된 T-세포 배지(10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, 1X 나트륨 피루베이트를 갖는 RPMI)에서 수행하였다.
세포 스퀴징에 의한 단백질 전달. 휴지 B-세포로의 전체 단백질 항원의 전달은 CellSqueeze, 미세유체 장치 및 압력 시스템(SQZ Biotech)을 사용하여 수행하였으며; 사용되는 칩 설계는 30-4×1, 10-4×1, 및 30-5×5를 포함하였으며, 여기서, X-Y×Z는 X㎛ 길이 및 Y㎛ 직경 치수의 Z개 연속 협착 채널을 나타낸다. B-세포를 100㎍/mL의 난백알부민, 0.3 mg/mL TRITC- 또는 퍼시픽 블루-표지된 3 kDa 덱스트란, 또는 0.3 mg/mL FITC-표지된 40 kDa 덱스트란을 가진 배지에 5×106개 세포/mL로 현탁시키고, 빙상에 배치하였다. 미세유체 칩 및 홀더 세트 또한 냉각될 때까지 빙수욕에 두었다. 세포 현탁액을 120 psi에서 200㎕ 분취량으로 장치를 통해 보냈다. 세포내이입 조절 B-세포는 OVA를 갖는 배지에서 동일하게 제조하였지만, 미세유체 장치를 통과하지는 않았다. 항원 부하 후, 세포를 실온에서 5분 동안 휴지시키고, PBS로 2회 세척하였다. 전달 효율을 평가하기 위해, 항원 또는 달리 전달된 것의 흡수는 유동 세포계측(형광-표지된 조성물의 검출)에 의해 측정하였다.
시험관내 세포 배양, 활성화 & 증식 검정. 기계-천공 B-세포의 시험관내 활성화를 특성화하기 위해, SQZ 장치를 통과한 세포 및 세포내이입 조절 세포를 5㎛ CpG B, 5㎛ CpG C, 또는 100 ng/mL LPS와 함께 5×105개 세포/mL로 96-웰 U-바닥 플레이트에서 항온처리하였다. 유동 세포계측은 CD86, CD40, CD69, I종 MHC, 및 II종 MHC의 세포-표면 수준을 측정하기 위해 24 및 48시간에 수행하였다. 시험관내 증식 검정을 위해, 정제된 SIINFEKL 난백알부민 펩티드 - 특이 OT-I CD8+ (제한된 I종 MHC) 또는 OT-II CD4+T-세포 (제한된 II종 MHC)를 107개 세포/mL로 현탁시키고 10 min 동안 CFSE (5㎛, Life Technologies)로 표지하였다. 1회 세척 후, T-세포 및 B-세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에서 200㎕의 T-세포 배지에 1:0.8 비로 플레이팅하였다. CpG B, CpG C, 또는 LPS를 적당한 웰에 가하고, 항-CD3/CD28 Dynabeads (Life Technologies)를 양성 대조군 웰에 1 비드/T-세포로 가하였다. T-세포 증식을 평가하기 위해 사이토킨 분석 및 유동 세포계측을 위한 상청액 수집은 2일 및 4일째에 수행하였다.
시험관내 증식 검정. -1일째, CFSE(5㎛)로 표지된 106 OT-I Thy1.1 CD8+휴지 T-세포를 C57BL/6 마우스에 안구뒤(r.o.) 주사하였다. 다음날(0일), 동물에게 전날 미세유체 SQZ 장치를 사용하여 OVA로 부하되고 5㎛ CpG B와 밤새 항온처리한 1-3 백만개 CD45.1+B-세포를 r.o. 주사하거나, 또는 주사 직전 기계-교란에 의해 OVA로 부하하지만 어떠한 TLR 리간드에도 노출시키지 않았다. 동물을 4일째에 부검하고 이들의 비장, 서혜부 림프절, 및 경부 림프절을 수확하였다. 기관을 세포 스트래인너를 통해 매쉬시켰다. 단일-세포 현탁액을 마우스 항-CD16/CD32 (eBioscience)와 항온처리하여 비특이 항체 결합을 감소시키고, 항-CD8-APC, 항-B220-PE-Cy7, 항-CD45.1-PerCP-Cy5.5, 및 항-Thy1.1-APC-Cy7로 염색시켰다. 세포 수 및/또는 CFSE 희석도를 측정하기 위한 유동 세포계측은 공지된 방법을 사용하여 수행하였다.
기계-교란(미세유체 세포 스퀴징)은 거대분자의 신속하고 효율적인 전달을 가능케 한다
B-세포를 항원으로 부하하기 위한 기계-교란의 공정은 본원에 기재된 장치를 사용하여 달성되었다. 살아있는 세포를 실리콘 장치에서 병렬 미세유체 채널을 통해 통과시켰으며; 각 채널에서, 1개 또는 그 이상의 협착이 장치를 통과한 세포의 막에 일시적인 구멍 또는 교란을 야기한다. 주변 유체에 존재하는 거대분자 적재물은 이러한 일시적인 교란/막 교란 동안 세포로 확산되어, 세포내 부하를 야기한다. 기계-교란은 일차 뮤린 B-세포를 포함한 광범위하게 다양한 세포 유형으로의 거대분자의 시토졸성 전달을 촉진시키는데 효과적이고; 효율적인 전달은 30㎛ 길이 및 5㎛ 폭의 치수를 갖는 5개 연속 협착으로 달성되었다. 장치 설계는 B-세포로의 단백질 전달 및 후속적인 항원 제시를 위해 기계-교란 파라미터에 즉각적으로 맞추도록 변경될 수 있다(병렬식 협착 채널의 수를 75개로, 더 긴 입구 영역, 가역성 등을 증가시킴). 파일럿 최적화 실험은 120 psi에서 실행하는 30-4×1 미세유체 칩(30㎛ 길이 및 4㎛ 직경인 채널 당 1개의 협착)이 5×106개 B-세포/mL의 농축 이온에서 효율적인 전달과 높은 세포 생존력 둘 다를 갖는 뮤린 B-세포의 기계-교란을 위해 효과적인 칩 설계임을 보여주었다. 또 다른 구성이 본원, 예컨대, 30-5 x 5 vs. 30-4 x 1에 기재되어 있다. 이러한 압력에서 세포는 초당 대략 1 백만개 세포의 속도로 장치를 통해 흘러간다. 미세유체 스퀴징은 세포내이입에 비해 덱스트란 흡수를 즉각 크게 증진시키며, 내재화는 3 및 40 kDa 덱스트란에 대해 각각 ~65배 및 ~25배 증가시켰다. 이것은 덱스트란 둘 다에 대해 모든 세포의 75-90%로의 전달을 나타내었다; 그에 비해, 적재물의 휴지 B-세포 세포내이입 검출 가능한 양의 10% 미만. 기계-교란 후 회복된 세포의 생존력은, 세포내이입 대조군과 유사하게, ~95%이었다. 이러한 일회용 미세유체 칩을 통과할 수 있는 세포의 최대 수에 대한 용량은 장치당 1-5 백만개 세포에 이르렀다; 그러나, 장치는 응고될 때까지 다중 분취량의 세포(실행 당 1 백만개 세포)로 실행되었으며, 소정의 실험에서 각각의 개별 장치를 통해 실행된 세포의 최대 수는 종종 5 백만개 세포를 상당히 초과하였다. 첫번째 실행에서부터 장치가 막힐 때까지 전달된 세포의 퍼센트에 있어서는 변동성이 낮았으며, 이는 장치내 변동성이 최소임을 나타낸다. 동일한 실험 기간 내의 다수 장치의 전달 성능(장치내 변동성)은 매우 일관되었다. 일부 용도에서는 보다 높은 갯수의 B-세포, 상이한 세포 밀도에서의 미세유체 장치의 효율을 필요로 할 수 있음을 인지해야 한다. 세포내 덱스트란 전달의 효율은 대개 mL당 적어도 50×106개 세포까지는 세포 농도와 무관하였으며, 이것은 강력한 확장성(scalability)에 대한 가능성을 나타낸다.
증진된 항원 제시 세포로서 기능하도록 처리된 B 세포를 보여주는 개략도가 도 30에 나타내어져 있다.
전체 단백질로 스퀴징된 다클론성 B-세포는 시험관내 에서 효과기 사이토킨을 분비하는 항원-특이 CD8+T-세포를 확장시킨다
기계-교란이 시토졸성 I종 MHC 항원 가공 및 제시 기기로의 단백질 전달을 촉진시킬 수 있는지를 알아보기 위해, 본 출원인은 상기한 최적 조건을 사용하여, 주변 배지에서 과량의 OVA의 존재하에 미세유체 장치를 통해 세포를 통과시킴으로써 모델 단백질 난백알부민 (OVA)을 휴지, 정제된 다클론성 B-세포에 전달하였다. 그후, 스퀴징된 B-세포를, B-세포-활성화 자극으로서 CpG의 존재 또는 부재하에, MHC I종-제한된 OVA 펩티드 SIINFEKL에 대해 특이적인 형질전환 T-세포 수용체를 갖는 CFSE-표지된 OT-I CD8+ T-세포와 공동-배양하였다. OT-I T-세포에서의 CFSE 희석을 유동 세포계측에 의해 분석하여 B-세포-제시된 항원에 대한 반응으로 T-세포의 증식/확장을 평가하였다. 세포 스퀴징에 의한 B-세포로의 전체 단백질 전달은 시험관내에서 왕성한 MHC I종 항원 제시 및 항원-특이 CD8+T-세포 프라이밍을 가능케 하는 것으로 밝혀졌다. 본원에 기재된 바와 같은 세포 스퀴징은 주로 항원을 시토졸에 지시하며 MHC II종 부하가 일어나는 엔도솜 구획에는 지시하지 않는다. 이와 일관되게, 데이터는 휴지 및 CpG-활성화 기계-천공 B-세포 중 어느 것도 공동 배양한지 4일 후에 OVA-특이 OT-II CD4+T-세포를 확장시킬 수 없음을 나타내었다. B-세포-프라이밍된 CD8+ T-세포 집단의 기능성을 공동-배양 2일 및 4일째의 효과기 분자의 분비를 측정함으로써 검정하였다. 스퀴징에 의해 항원으로 부하된 B-세포는, 휴지 상태이든 활성화되었든 간에, T-세포를 프라이밍하여 상당량의 그랜자임 B, IFN-γ, 및 TNF-α를 분비하는데 반해, 세포내이입에 의해 항원으로 부하된 B-세포는 기저 수준의 사이토킨을 생산하였다.
스퀴징된 B-세포는 생체내 에서 항원-특이 CD8+T-세포를 프라이밍한다
시험관내 항원-특이 T-세포 확장 플랫폼 이외에, 기재된 바와 같이 가공된 B-세포가 세포 백신으로서 사용하기 위한 수지상 세포에 대한 대안으로서 유용하다. 생체내 성능을 평가하기 위해, 유사유전자형 마커로서 Thy1.1을 발현하는 CFSE-표지된 OT-I CD8+T-세포를 항원 제시의 리포터로서 수용체 마우스에게 입양 전달하였다. 하루 후, 휴지 B-세포를 기계-교란-매개된 항원 부하 직후 주사하거나, 또는 기계-교란-부하된 B-세포를 주사하였으며, 이를 후속적으로 24 h 동안 활성화시키고 시험관내에서 CpG를 주사하였다. 세포내이입에 의해 항원으로 부하된 휴지 B-세포를 CpG로 활성화시킨 직후 또는 24 h 후 대조군으로서 사용하였다. B-세포 전달한지 4일 후, 마우스를 희생시키고 비장과 서혜부 림프절을 유동 세포계측에 의해 OT-I 증식에 대해 분석하였다. 시험관내 결과와 일관되게, 기계-천공된 B-세포는 입양 전달된 OT-I T-세포의 분열을 유발할 수 있는 반면 세포내이입 대조군은 단지 기초 분열만을 나타내었다. CpG-활성화된 및 휴지 스퀴징된 B-세포 둘 다는 비장에서 OT-I 증식을 야기하였다(각각 SQZ vs. 세포내이입과 비교하여 p < 0.001 및 p = 0.001로 주사된 OT-I T-세포의 ~45% 및 ~35% 분열). CpG-활성화된 및 휴지 스퀴징된 B-세포는 또한 세포내이입 B-세포에 비해 림프절에서 유사하게 증진된 OT-I 증식을 유발하였다(각각 CpG B 및 휴지 스퀴징된 B-세포에 의해 주사된 OT-I T-세포의 ~40% 및 ~35% 분열; 휴지 및 CpG 둘 다에 대해 SQZ vs. 세포내이입과 비교하여 p < 0.001). 세포내이입 대조군은 림프절에서 ~4% 베이스라인 분열을 보였다. 이러한 결과는 미세유체 기계-교란에 의해 부하된 B-세포가 세포 백신에 유용함을 나타내었다.
결과는 반응성 CD8+ T 세포의 활성화 상태를 평가하는 실험에 의해 추가로 확인되었다(도 29).
따라서, 여기에 기재된 바와 같은 특이 항원으로 부하된 B-세포가 세포-기반 백신을 위한 APC로서 및 항원-특이 T-세포의 확장을 위한 자가조직 시약으로서 유용하며, 특히 말초 혈액으로부터 다수회의 용이한 이용 가능성 및 실질적으로 배양물에서 추가로 확장될 수 있는 능력에 대해, 수지상 세포를 능가하는 상당한 이점을 갖는다. 본 발명 이전에는, B-세포에서의 효율적인 항원 부하를 위한 방법들, 특히 I종 MHC 제시를 위한 방법들이 시험관내 또는 생체내 사용을 위한 APC로서 다클론성 B-세포의 개발에 주요한 장벽이었다. 본원에 기재된 장치 및 방법은 휴지 또는 활성화된 B-세포의 시토졸에 및 비처리 전체 단백질로부터 유래된 펩티드의 MHC I종 제시에 직접 단백질 항원의 왕성한 부하를 야기하는 수동 확산 및 미세유체-기반 기계적 변형을 사용한 간단한 접근법을 나타낸다. 가공, 가공, 또는 변형 없이 비처리 단백질의 전달, 공정의 신속한 특성, 전달 및 기능적 결과의 상대적으로 높은 효율, 및 프로그래밍 자극 또는 수용체 표적화와 같은 세포 생물학과는 분리되어 휴지 세포로 물질을 전달하는 능력을 포함하는, 기계-교란에 의해 부여되는 장점은 무수하다.
전체 비처리 단백질 또는 폴리펩티드를 가공 및 MHC I종 제시를 위해 직접 시토졸로 전달할 수 있는 능력은 비처리 항원 가공 후 다수의 펩티드의 비편향된 제시를 가능케 한다. 미세유체 세포 스퀴징 장치는 또한 종양 용해물, 예컨대, 종양 생검 용해물, 또는 기타의 복합 단백질 공급원을 포함한 단백질의 혼합물을 전달을 가능케 한다. 단백질이 세포 활성화 상태와는 관계없이 MHC I종 가공을 위해 전달된다는 상기한 입증이 이러한 접근법의 주요 장점이며, 접근법은 단백질 부하와 세포 프로그래밍을 분리하여, 각 성분의 독립적인 조절을 촉진시킬 수 있다.
예시적인 설계는 75개의 병렬식 협착 채널을 함유한다; 그러나, 채널 수의 증가 또는 다수의 장치의 병렬식 작동이 처리량을 극적으로 향상시켰다. 당해 접근법에 의해 가능해진 이러한 사용 용이성 및 신속한 가공(예컨대, < 2 h의 전체 실험 시간 동안 장치를 통한 ~1 x 106개 세포/s의 유량)은 세포-기반 치료제의 제조를 위해 필요한 시간 및 자원 감소와 같은 임상 번역을 위한 이익을 제공한다.
APC로서 B-세포를 사용하여, 단일-용량 세포 백신을 제조하는데 필요한 환자 혈액 양이 DC-기반 접근법에 비해 대단히 감소된다. 세포내이입 또는 음세포작용과 같은 세포 흡수 공정에 의한 단백질 부하에 필요한 시간이 없어진다. 시험관내 결과는 효과기 CTL의 확장을 위한 대안적인 플랫폼으로서의 B-APC에 대한 상당한 가능성 및 생체내 효과적인 APC로서 또한 기능한 스퀴징된 B-세포를 입증하였다. 방법은 또한 MHC I종 및 II종 항원 제시 경로 둘 다를 공동-부하하여 CD4+T-세포 생성을 돕는데 유용하다.
B 세포에 의한 I종-제한된 항원 가공 및 제시
따라서, B-세포를 세포 스퀴징에 의해 가공하여 자가조직 항원-제시 세포(APC)를 생성하여 시험관내 및 생체내 둘 다에서 항원-특이 T-세포를 프라이밍하였다. 이러한 미소규모의 세포 스퀴징 공정은 혈장 막에 일시적인 교란 또는 구멍을 생성하여, 기계-교란을 통해 B-세포로의 주변 배지로부터의 전달 단백질의 세포내 전달을 가능케 한다. 휴지 및 활성화 B-세포 둘 다는 오직 항원-특이 CD8+ T-세포만 기계-교란을 통해 전달된 항원을 가공하고 제시하며, CD4+ T-세포에 대해서는 아니다. 스퀴징된 B-세포는 그랜자임 B 및 인터페론-γ를 포함한, 세포용해 기능에 중요한 효과기 사이토킨을 생산하는 다수의 효과기 CD8+ T-세포를 시험관내에서 프라이밍 및 확장시켰다. 스퀴징된 항원-부하 B-세포는 또한 마우스에 입양 전달되는 경우 생체내에서 항원-특이 CD8+ T-세포를 프라이밍할 수 있었다. 이러한 데이터는 기계-교란/막 교란이 B-세포 항원 부하, 항원-특이 CD8+ T-세포의 프라이밍, 및 B-세포 활성화로부터 항원 흡수의 분리를 위한 유용하고 매우 효율적인 방법임을 입증한다.
면역 자극 또는 면역관용원성을 위한 항원 제시 세포로서의 T 세포
본 발명 이전에는, 면역 자극 또는 면역관용원성의 목적을 위한 항원 제시가 일반적으로 항원 제시 세포, 예컨대, B 세포, 수지상 세포 및 대식세포라고 하는 세포의 선택 서브세트의 범위에 있는 것으로 추정하였으며, T 세포를 포함하지 않았는데, 그 이유는 이들이 면역 자극 또는 면역관용원성을 촉진시킨다는 맥락에서 항원을 가공 및 제시하는데 필요한 기전이 부족하다고 추정하였기 때문이다. 장치 및 세포의 스퀴즈-매개된 항원 부하가 T 세포의 시토졸로 직접 항원 단백질을 전달하는 것이 이러한 가공된 세포에 항원 제시 표현형을 부여한다는 놀라운 발견을 가져왔다.
방법은 이전에 보고된 바 없는 방식으로 생체내 T 세포 면역 반응을 조절한다. 모델 항원, 난백알부민을 CellSqueeze 장치 플랫폼을 사용하여 뮤린 일차 T 세포에 전달하고, 세포를 숙주에 주사하여 CD8+ T 세포 반응을 측정하였다. 항원 부하된 T 세포는 유동 세포계측에 의해 측정되는 바와 같이 상당한 CD8+ T 세포 반응을 생성할 수 있었으며, 이것은 외부 메카니즘, 예컨대, 세포 스퀴징에 의해 항원으로 부하된 T 세포가 정말 이들의 표면 상에 에피토프를 제시하고, 다른 T 세포와 소통하고, 측정 가능한 면역 반응을 생성할 수 있음을 나타낸다. 이러한 반응은 대조군보다 상당히 크며 수지상 세포와 같은 전문 APC을 사용한 실험에서 관찰되는 반응에 필적하였다.
이러한 조사결과는 예측하지 못한 것이며 치료 및 연구 용도를 위한 효과적인 항원 제시자로서의 T 세포의 사용을 입증하기 때문에 면역학 및 면역요법 분야에 매우 중요하다. 본 발명 이전에는, DC가 이러한 사용을 위해 널리 받아들어지는 유일한 세포였으며, 상기한 바와 같이, 세포-스퀴즈 접근법은 이러한 목적을 위한 B 세포의 신속하고, 효율적이며, 매우 증진된 생산을 위해 유용하다. T 세포가 DC보다 더 풍부하고 이용 가능하기 때문에, 이들은 더 큰 임상 효능을 제공하고 현재 비용이 많이 들고 생산하기가 어려운 세포 백신 용도에 대해 광범위한 영향을 촉진시킨다. 따라서, T 세포는 본 발명에 이르러 임의 유형의 항원, 목적(면역관용원성 vs. 면역자극), 주사 경로에 대한 제시를 위해, 임상 및 연구 용도를 위해 항원 제시 세포로서 사용될 수 있다.
세포-스퀴즈 방법을 사용하여 전체, 비가공 항원으로 처리된 마우스 T 세포가 항원 제시 세포로서 기능한다(도 29). 뮤린 T 세포를 마우스 비장으로부터 분리하고 OVA를 예시적인 10-3 및 30-4 장치 구성을 사용하여 (250, 50, 10ug/ml OVA)의 OVA 농도에서 RPMI에서 T 세포에 전달하였다. 그후, 이들 T 세포를 OT-1 T 세포 (SIINFEKL 펩티드 에피토프-특이)와 배양하고 활성화 마커 CD25 및 CD69를 평가하였다. 결과는 전체, 비가공 항원, 예컨대, 전장 난백알부민을 세포-스퀴징을 사용하여 시토졸성으로 전달하는 T 세포가 놀랍고도 효과적으로 항원을 제시하여 에피토프-특이 효과기 CD8+ T 세포를 활성화시키는 기능을 함을 입증한다.
추가의 데이터는 혈액으로부터 분리된 일차 인간 T 세포로의 DQ-Ova (DQ™ 난백알부민, Catalog # D-12053, Molecular Probes, Inc.)의 전달을 입증한다(도 28a 및 b). DQ ova는 단백질이 가공되면 FITC 채널에서 형광을 띠지만 단백질이 세포에 의해 가공되지 않으면 형광을 띠지 않는 난백알부민 단백질의 화학적으로 접합된 버전이다. 따라서, 장치-처리된 케이스에 대한 FITC 신호의 출현은 세포가 DQ-Ova 항원을 가공하였음을 나타내며, 제조한 항원-제시 T 세포(APC로서의 T 세포)가 상기한 마우스계 이외에 인간계에서도 기능한다는 관측을 추가로 뒷받침한다. 몇몇 실험에서, 퍼시픽 블루 채널에서 형광을 띠는 3kDa 덱스트란 염료를 동시-전달하였다. 결과는 CD4와 CD8 T 세포 간의 Ova 가공에 있어서의 차이 및 세포내이입 대조군에 비해 극적인 개선을 보여준다. 이러한 데이터는 항원이 T세포의 시토졸로 직접 전달되는 경우 항원 가공이 인간 T 세포에 의해 수행됨을 나타낸다. DQ-Ova 항원이 이의 형광 특성을 변화시킴을 보여주는 데이터는 항원이 인간 T 세포에서 가공되며, 따라서, 조직적합 항원에 의해 T 효과기 세포에 제시됨을 보여준다.
에피토프-특이 T 세포의 활성화가 또한 생체내에서 입증되었다. 도 26은 생체내 CFSE 증식 검정(항원 특이 CD8+ T 세포의 증식)의 결과를 보여준다. CD8 T 세포가 할성화되고 마우스에서 증식함에 따라, 이들이 CFSE 염료를 희석시켜 보다 낮은 형광 강도를 갖는다. 이 경우, 장치에 의해 처리된 공여체 T 세포 또는 양성 대조군은 수용체 마우스에서 CD8 T 세포의 상당히 더 큰 활성화 및 증식을 초래하였다. 세포내이입 대조군은 이와 달리 최소한의 효과를 보인다.
항원 처리된 야생형 T 세포로의 백신화에 대한 반응으로 마우스에서의 항원 특이 OT-I T 세포의 증식이 또한 생체내에서 입증되었다(도 27). T 세포 증식 반응은 CFSE 염색에 의해 측정하였다. 염색은 세포가 증식함에 따라 희석되며; 따라서, 더 낮은 강도는 더 큰 반응을 나타내고, 더 높은 강도 피크는 반응 없음/덜함을 나타낸다. 각 컬럼은 동일한 마우스로부터 유래된 림프절 및 비장을 사용한 실험의 레플리케이트를 나타낸다. 실험의 각 컬럼은 3마리 마우스를 포함하였다(총 n = 9마리 마우스).
아래 기재된 재료 및 방법들이 상기한 면역 자극 또는 면역관용원성을 위한 항원 제시 세포로서의 T 세포에 관한 데이터를 생성하는데 사용되었다.
실험 시각표. 다음의 실험 시각표가 사용되었다:
0일: CFSE/CellTraceViolet 표지된 OT-1 CD45.1 T 세포를 비처리 B6 숙주에 주사함
1일: 항원을 T 세포 APCS (Tc-APCs)에 전달하고, Tc-APC 및 대조군 APC를 B6 숙주에 주사함
5/6일: 면역화된 마우스로부터 비장 및 림프절을 수확하고, 유동 세포계측을 통해 T 세포 증식을 분석함
T 세포 분리(입양 전달을 위한). 재료: 100 um Falcon 세포 스트래인너; 70 um Falcon 세포 스트래인너; 암모늄-클로라이드-칼륨 (ACK) 용해 완충액; CD8a+ T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec); MACS 세포 분리 컬럼. T 세포 배지(10% FBS, pen strep, 1x 나트륨 피루베이트, 50uM b-머캅토에탄올을 갖는 RPMI); MACS 완충액(PBS 중의 0.5% BSA, 2mM EDTA). 방법: 비장 및 피부 채취 림프절을 C57BL/6J 백그라운드에서 OT-1 CD45.1 Rag 2-/- 마우스로부터 수확하고 습윤 100um 세포 스트래인너를 통해 50 mL Falcon 튜브로 매슁시켰다. 필터를 MACS 완충액으로 세척한 다음 500 rcf에서 4분 동안 회전시켰다. 상청액을 흡입한 다음 3 mL of ACK 용해 완충액을 가하여 적혈구를 용해시켰다. 12 mL의 MACS 완충액으로 반응을 켄칭시킨 다음 500 rcf에서 4분 동안 회전시켰다. 세포 펠렛을 1x107개 세포당 40uL MACS 완충액에 재현탁시킨 다음 70um 세포 스트래인너를 통해 50 mL Falcon 튜브로 여과하였다. 10uL의 CD8a+ T 세포 항체 칵테일을 1x107개 세포 당 가하고, 빙상에서 10분 동안 항온처리하였다. 1x107개 세포당 30uL MACS 완충액을 가한 다음 20uL의 스트렙타비딘 비드를 1x107개 세포당 가하고 빙상에서 15분 동안 항온처리하였다. 세포를 800 rcf에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 흡입한 다음 3 mL MACS 완충액에 재현탁시켰다. 세포 분리 컬럼은 70um 세포 스트래인너 상에 3 mL의 MACS 완충액에 이어 3 mL의 세포 현탁액을 통해 15 mL Falcon 튜브에 통과시킴으로써 제조하였다. 컬럼을 3 mL MACS 완충액으로 3x 세척하고, 혼주된 통과액을 500 rcf에서 4분 동안 회전시켰다. 상청액을 흡입하고 증폭된 CD8+ T 세포를 T 세포 배지에 현탁시켰다. CD8a에 대한 염색 및 유동 세포계측으로의 분석에 의해 >90% 순도가 확인되었다.
CellTrace Violet/CFSE 표지화. 재료: DMSO 중의 CFSE(Life Technologies, Grand Island, NY); DMSO 중의 CellTrace Violet(Life Technologies, Grand Island, NY); 정제된 OT-I CD45.1 CD8+ T 세포; 멸균 PBS; 멸균 태아 소 혈청. 방법: OT-1 CD45.1 CD8+ T 세포를 상기한 바와 같이 증폭시키고 15 mL Falcon 튜브 중에서 2.5 mL의 가온시킨 PBS에 현탁시켰다. DMSO 중의 CellTrace Violet 또는 CFSE를 가온시킨 PBS에 10 uM에서 용해시킨 다음 2.5 mL를 세포 현탁액에 가하였다(5uM 최종 농도). 세포를 37℃ 온수욕에서 10분간 정치시킨 다음 7 mL의 PBS를 가하여 반응을 켄칭시켰다. 2 mL의 FBS를 멸균 유리 피펫을 사용하여 바닥에 층상화시킨 다음 500 rcf에서 4분 동안 회전시켰다. 상청액을 흡입하고 세포를 10 mL의 PBS에서 다시 세척한 다음 500 rcf에서 회전시키고 100ul PBS당 2x107개 세포로 재현탁시켰다.
T 세포 분리(Tc-APC로서). 재료: 100 um Falcon 세포 스트래인너; 70 um Falcon 세포 스트래인너; ACK 용해 완충액; Pan T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, San Diego, CA); MACS 세포 분리 컬럼; T 세포 배지(10% FBS, pen-strep, lx 나트륨 피루베이트, 50uM b-머캅토에탄올을 갖는 RPMI); MACS 완충액(PBS 중의 0.5% BSA, 2mM EDTA). 방법: 비장 및 피부 채취 림프절을 C57BL/6J 마우스를 통해 수확하고 습윤 100um 세포 스트래인너를 통해 50mL Falcon 튜브에 매싱시켰다. 필터를 MACS 완충액으로 세척한 다음 500 rcf에서 4분간 회전시켰다. 상청액을 흡입시킨 다음 3 mL의 ACK 용해 완충액을 가하여 적혈구를 용해시켰다. 12 mL의 MACS 완충액으로 반응을 켄칭시킨 다음 500 rcf에서 4분간 회전시켰다. 세포 펠렛을 1x107개 세포당 40uL MACS 완충액에 재현탁시킨 다음 70um 세포 스트래인너를 통해 50 mL Falcon 튜브로 여과시켰다. 1x107개 세포당 20uL의 Pan T 세포 항체 칵테일을 가하고, 빙상에서 10분간 항온처리하였다. 1x107개 세포당 30uL MACS 완충액을 가한 다음 20uL의 스트렙타비딘 비드를 1x107개 세포당 가하고 빙상에서 15분 동안 항온처리하였다. 세포를 800 rcf에서 5분간 회전시키고 상청액을 흡입한 다음 3 mL MACS 완충액에 재현탁시켰다. 세포 분리 컬럼은 3 mL의 MACS 완충액에 이어 3 mL의 세포 현탁액을 통해 70um 세포 스트래인너 상에서 15 mL Falcon 튜브로 통과시킴으로써 제조하였다. 컬럼을 3mL MACS 완충액으로 3x 세척하고, 혼주된 통과물을 500 rcf에서 4분간 회전시켰다. 상청액을 흡입하고 증폭된 T 세포를 T 세포 배지에 현탁시켰다. CD3e에 대한 염색 및 유동 세포계측으로의 분석에 의해 >90% 순도가 확인되었다.
시험관내 T 세포 항원 전달 및 활성화. 재료: 정제된 T 세포; CellSqueeze 30-4 칩; CellSqueeze 장치; 지다당류(LPS); T 세포 배지(10% FBS, pen-strep, lx 나트륨 피루베이트, 50uM b-머캅토에탄올을 갖는 RPMI); OVA 단백질; SIINFEKL 펩티드. 방법: 정제된 T 세포를 1ug/mL LPS와 함께 T 세포 배지에서 빙상에서 30분간 항온처리하였다. T 세포를 T 세포 배지에서 2x 세척하고 500 rcf에서 4분간 회전한 다음 0.01mg/mL-0.1mg/mL OVA 또는 1ug/mL SIINFEKL와 빙상에서 항온처리하였다. CellSqueeze 장치를 표준 프로토콜에 따라 30-4 칩으로 조립한 다음 200uL의 T 세포 배지를 100 PSI에서 각 칩을 통해 흘려 보냈다. T 세포의 절반을 100 PSI에서 CellSqueeze 장치를 통해 통과시키고, 나머지 반은 빙상에 두었다(세포내이입 경우). 통과물을 96 웰 플레이트에서 수집하고 세포 막이 회복되도록 하기 위해 빙상에서 15분간 두었다. 세포를 350 RCF에서 10분간 회전시키고, 상청액을 플리킹시켰다. 세포를 숙주에 주사하기 전에 10분 동안 1ug/mL LPS에서 재활성화시켰다.
환자 면역 세포의 증폭
세포 스퀴징은 후속적으로 환자에게 다시 전달하기 위해 환자-유래 면역 세포를 생체외 증폭 또는 확장시키는데 또한 유용하다. 예를 들면, 항원을 기계-교란을 통해 항원 제시 세포(수지상 세포, B 세포, T 세포, 대식세포)의 시토졸로 전달한다. 이러한 항원 제시 세포는 MHC/HLA 이질이합체가 이들 표면 상에 T 세포를 자극시키고 확장시킨다는 맥락에서 가공된 항원을 가공 및 제시한다. 그후, T 세포의 확장된 집단을 환자에 재주입하여 치료적 면역 반응을 증대시킨다. 예를 들면, 항-종양 반응을 증대시키기 위해 항원은 종양 항원(또는 용해물)이다. 대안적으로, 미생물 전염병을 증대시키기 위해서는 항원 또는 박테리아성 또는 바이러스성 항원(또는 이의 단편 또는 약독화되거나 사멸된 박테리아성 세포 또는 바이러스성 입자). 또 다른 예에서, 항원은, 환자에게 다시 재주입하여 이상, 예컨대, 자가-면역 반응을 하향조절하기 위 해 면역 세포를 면역관용화시킨 다음 면역관용화된 면역 세포의 집단을 확장시키기 위해 면역관용원(상기한 바와 같음)과 함께 제시되는 자가-항원이다.
항원 제시 세포로서의 T 세포의 용도
항체 치료제를 사용한 환자의 T 세포의 활성화에 기초한 암 면역요법이 종양 관련 항원 (TAA)에 대한 기존 T 세포 반응 및 높은 빈도의 돌연변이를 갖는 이들의 증상에서 성공을 보여왔다(문헌 참조; Topalian et al., Cancer Cell 2015; 27: 450-461; Hodi et al., N Engl J Med 2010; 363: 711-723; Topalian et al., Cell 2015; 161: 185-186). 다수의 암이 낮은 빈도의 돌연변이 및 낮은 비율의 자발적인 T 세포 반응을 갖기 때문에, 암 백신의 사용이 TAA에 대한 T-세포 반응을 북돋우는 역할을 할 수 있다(문헌 참조; Melief et al., J Clin Invest 2015; 125: 3401-3412). 암 백신은 단일요법으로(문헌 참조; Ly et al., Cancer Res 2010; 70: 8339-8346; Kantoff et al., N Engl J Med 2010; 363: 411-422), 관문 차단 요법과 함께(문헌 참조; Agarwalla et al. J Immunother 2012; 35: 385-389), 또는 입양 T-세포 요법과 함께(문헌 참조; Lou et al., Cancer Res 2004; 64: 6783-6790) 사용될 가능성을 갖는다.
전임상 설정에서, 암 백신화를 위해 전문 항원 제시 세포(APC)를 사용하는 전략은 항원-펄스된 수지상 세포(DC)가 종양에 대한 보호 면역을 생성할 수 있음을 입증하였다(문헌 참조; Celluzzi et al., J Exp Med 1996; 183: 283-287; Mayordomo et al., Nat Med 1995; 1: 1297-1302; 7489412; Flamand et al., Eur J Immunol 1994; 24: 605-610). 다양한 유형의 암에서 수행된 임상 연구(문헌 참조; Nestle et al., Nat Med 1998; 4: 328-332; Hu et al., Cancer Res 1996; 56: 2479-2483; Hsu et al., Nat Med 1996; 2: 52-58; Reichardt et al., Blood 1999; 93: 2411-2419; Morse et al., Clin Cancer Res 1999; 5: 1331-1338; Yu et al., Cancer Res 2001; 61: 842-847)는 단핵구-유래 DC가 인간에서 항원-특이 면역을 유도할 수 있지만 임상 반응은 낮음을 시사한다. 예를 들면, 최초 FDA 승인된 DC-기반 암 백신(Sipuleucel-T, Provenge, Dendreon, Seattle, WA)은 호르몬-무반응 전립선암을 가진 환자에서 4개월 연장된 생존을 입증하였다(문헌 참조; Kantoff et al., N Engl J Med 2010; 363: 411-422; Higano et al., Cancer 2009; 115: 3670-3679). 이 백신이 이렇게 낮은 임상적 유용성을 갖는 이유를 설명하기 위한 가설들 중에서, Sipuleucel-T DC를 항원으로 부하하는데 사용되는 과정은 MHC I종 및 II종 제시 둘 다를 갖는 것이 아니라 MHC II종 항원 제시만을 초래할 수 있다. 이처럼, 낮은 세포독성 T 세포 활성은 이러한 제품의 불량한 효율에 있어서 역할을 할 수 있다.
TAA를 DC에 전달하기 위해 개발된 방법들은 MHC I종 및 II종 조직적합 분자 둘 다에 대한 최적의 항원 제시를 위해 CellSqueeze 플랫폼을 사용한다. 현존 항원 부하 기술의 한계를 해결함으로써, 본원에 기재된 방법은 생체내 보다 강력한 세포독성 및 헬퍼 T 세포 반응을 초래한다. 플랫폼은 세포가 협착을 통과하여 이들의 막을 일시적으로 교란시키고 세포질로의 표적 물질의 수송을 가능케 함으로써 세포를 신속하게 변형시킬 수 있는 미세유체 칩을 포함한다. 전기장 또는 외인성 증강제 또는 담체 물질에 대한 필요를 없앰으로써, 기재된 방법은 세포 독성 및 오프-타켓 효과에 대한 가능성을 최소화시킨다.
바이러스성 또는 신생 항원 표적화
중추 면역관용원성이 자가-항원에 도될 수 있기 때문에, 치료적 백신화가 본 발명에 이르러 바람직하게는 신생 항원(문헌 참조; Gubin et al., J Clin Invest 2015; 125: 3413-3421; Gubin et al., Nature 2014; 515: 577-581; Yadav et al., Nature 2014; 515: 572-576; Quakkelaar et al., Adv Immunol 2012; 114: 77-106; Castle et al., Cancer Res 2012; 72: 1081-1091) 및 바이러스 항원(문헌 참조; Melief et al., J Clin Invest 2015; 125: 3401-3412; Quakkelaar et al., Adv Immunol 2012; 114: 77-106)을 표적화한다.
항원을 확인하고 평가하기 위해, 이러한 두 개의 종양단백질의 전체 길이를 나타내고 전임상 모델에서 뿐만 아니라 전암 상태의 환자에서 반응을 보이는 HPV16의 종양유전자 E6 및 E7의 9개 긴 합성 중첩 펩티드(SLP)의 칵테일(HPV16-SLP)을 면역 반응을 평가하는데 사용한다. CellSqueeze 플랫폼을 사용하여 DC를 HPV16-SLP 칵테일로 부하하며, 이로서 펩티드가 MHC I종 및 II종 제시 경로 둘 다로 채널화되고, 이에 따라 CD4 및 CD8 T 세포의 항원-특이 확장을 유도할 수 있다. 이와 같이, 이러한 접근법은 HLA 특이 짧은 펩티드의 한계를 극복하는 다중-에피토프 반응을 즉각적으로 일으키며 보다 효과적인 치료법을 가능케 한다.
인간 및 마우스 DC로의 HPV16-SLP의 세포스퀴징: HPV16-SLP 칵테일을 인간 및 마우스 DC로 전달하는데 상이한 CellSqueeze 조건을 시험하였다. 협착 길이, 협착 폭, 협착의 수 및 협착에 접근 각도에 차이가 있는 칩 설계를 평가한다. 공정 파라미터에 대해서는, 세포 농도, 전달 배지, 전달 배지 중의 펩티드 농도, 가공 온도, 작동 압력 및 칩을 통한 통과 횟수를 조사한다. 최적화 공정에 대한 실험적 접근법은 또한 세포로의 펩티드 전달의 양을 설명하기 위한 HPV16-SLP 펩티드 칵테일의 형광 표지화를 포함한다. 더욱이, 펩티드의 최적 가공 및 제시는 유동 세포계측에 의해 TCR 특이 사합체로 제시된 펩티드를 검출함으로써 I종 및 II종의 맥락에서 설명된다. 이러한 접근법을 교차-제시를 위해 HLA 특이 I종 짧은 펩티드로의 DC의 부하와 비교한다.
이 연구는, 예컨대, 긴 펩티드의 효율적인 가공 및 APC, 예컨대, 수지상 세포에 의한 항원의 부하를 위한 조건을 포함하는, 인간 및 뮤린 DC를 HPV16-SLP 펩티드 항원 또는 항원의 혼합물, 예컨대, 바이러스 항원의 칵테일로 효율적으로 부하하는 칩 설계 및 전달 조건을 확인한다.
항원 특이 T 세포를 확장시키는 HPV 16-SLP 스퀴징된 DC의 효능의 시험관내 및 생체내 평가.
항원 특이 T 세포를 확장시키는 능력에 대해 몇가지 조건하에서 펩티드 칵테일로 부하된 DC의 기능을 시험한다. 예를 들면, 마우스를 HPV16-SLP 및 CpG로 면역화하여 항원-특이 T 세포를 유도한다. 부스팅한지 8일 후, T 세포를 면역화된 마우스의 비장으로부터 분리하고, 항원-특이 CD4 및 CD8 T 세포 확장 및 사이토킨 생산을 일으키는 부하된 세포의 능력을 알아보기 위해 HPV16-SLP 부하된 DC와 공동-배양하는데 사용한다. 인간 부하된 DC를 시험하기 위해, HPV16에 대해 반응성인 인간 T 세포 클론을 사용하여 몇가지 조건하에서 HPV16-SLP 칵테일로 부하된 인간 DC와 공동-배양한다. 항원-특이 T 세포 확장 및 사이토킨 생산을 평가한다. 인간 및/또는 마우스 부하된 DC가 기능적이며 항원-특이 T 세포를 확장시킬 수 있는지를 시험관내에서 시험한다. HLA 특이 I종 짧은 펩티드로 부하된 DC를 대조군으로서 사용한다. HLA 배칭 T 세포를 반응자(responder)로서 사용한다.
그후 생체내에서 HPV-16에 대해 항-종양 반응을 생성하는 CellSqueeze DC-기반 백신의 효능에 대해 시험하기 위해, 마우스를 HPV16-SLP 부하된 DC로 백신화하고 TC1 종양(HPV E6 및 E7, 및 c-H-ras 종양유전자를 갖는 C57BL/6 마우스의 레트로바이러스 형질도입된 폐 섬유아세포)으로 항원투여(challenge)한다. 항원투여된 마우스의 생존이 판독치이다.
이러한 연구는 CellSqueeze 기술로 생성된 DC-기반 백신이 생체내에서 보호적인 항-종양 T 세포 및/또는 항-바이러스 반응을 일으킴을 보여준다.
기타의 구현예들
본원에 참고된 특허 및 과학 문헌들은 당업계의 숙련가들에게 이용 가능한 지식을 확립한다. 본원에 인용된 모든 미국 특허 및 공개되거나 공개되지 않은 미국 특허 출원이 참고로 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원이 여기에 참고로 포함된다. 본원에 인용된 모든 다른 공개된 참고문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌이 여기에 참고로 포함된다. 본 발명이 이의 바람직한 구현예를 참고하여 특히 나타내어지고 기재되어 있지만, 형태 및 상세에 있어서 다양한 변화가 첨부된 청구항에 의해 포함된 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 그 안에서 이루어질 수 있음을 당업계의 숙련가들은 이해할 것이다.
<110> Massachusetts Institute of Technology President and Fellows of Harvard College <120> DELIVERY OF BIOMOLECULES TO IMMUNE CELLS <130> 2023-FPA-2170D <150> 62/073,548 <151> 2014-10-31 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD45 siRNA Sense <400> 1 cuggcugaau uucagagcat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD4 siRNA Sense <400> 2 gaucaagaga cuccucagut t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vif siRNA Sense <400> 3 cagauggcag gugaugauug t 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gag siRNA Sense <400> 4 gauuguacug agagacaggc u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control scrambled siRNA <400> 5 gccaagcacc gaaguaaauu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human DC-SIGN siRNA Sense <400> 6 ggaacuggca cgacuccauu u 21 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD4 siRNA <400> 7 gaucaagaga cuccucagu 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh forward <400> 8 agccacatcg ctcagacac 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh reverse <400> 9 gcccaatacg accaaatcc 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD4 forward <400> 10 ggcagtgtct gctgagtgac 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD4 reverse <400> 11 gaccatgtgg gcagaacct 19

Claims (24)

  1. 화합물을 면역 세포 내로 세포내 전달하는 단계를 포함하는 면역 세포에서 면역 세포 기능을 가공하기 위한 방법으로서,
    상기 세포내 전달은 상기 면역 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착을 통해 통과시키는 단계를 포함하고,
    상기 협착은 상기 면역 세포의 교란을 야기하여서, 면역 세포와 접촉될 때 상기 화합물이 상기 교란을 통해 면역 세포에 들어가고,
    상기 협착은 2㎛ 내지 10㎛의 직경을 갖고,
    상기 면역 세포 내로 세포내 전달될 때 상기 화합물은 상기 면역 세포에서 면역 세포 기능의 가공을 유도할 수 있는 항원이고, 및
    상기 면역 세포 기능은 항원 제시 표현형을 포함하고, 상기 면역 세포는 T 세포인 방법.
  2. 화합물을 면역 세포 내로 세포내 전달하는 단계를 포함하는 면역 세포에서 면역 세포 기능을 가공하기 위한 방법으로서,
    상기 세포내 전달은 상기 면역 세포를 포함하는 세포 현탁액을 협착을 통해 통과시키는 단계를 포함하고,
    상기 협착은 상기 면역 세포의 교란을 야기하여서, 면역 세포와 접촉될 때 상기 화합물이 상기 교란을 통해 면역 세포에 들어가고,
    상기 협착은 림프구의 경우 3-6㎛ 및 단핵구 또는 단핵구-유래 세포의 경우 6-9㎛의 직경을 갖고,
    상기 면역 세포 내로 세포내 전달될 때 상기 화합물은 상기 면역 세포에서 면역 세포 기능의 가공을 유도할 수 있고, 및
    상기 면역 세포 기능은 (a) 귀소(homing) 표현형으로서, 상기 면역 세포는 귀소 표현형을 자연적으로 포함하지 않고; (b) 면역관용원성 표현형으로서, 상기 면역 세포는 면역관용원성 표현형을 자연적으로 포함하지 않고; (c) 단백질을 연속적으로 생산하는 능력으로서, 상기 면역 세포는 단백질을 연속적으로 생산하는 능력을 자연적으로 포함하지 않고; 또는 (d) (a) 내지 (c)의 임의의 조합;을 포함하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 항원은 질환-관련 항원, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 자가-항원, 진균 항원, 종양 세포 용해물, 병원균으로 감염된 조직으로부터의 세포 용해물, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 종양 항원은 간암 항원, 폐암 항원, 방광암 항원, 유방암 항원, 결장암 항원, 직장암 항원, 자궁내막암 항원, 신장암 항원, 백혈병 항원, 비-호지킨 림프종 항원, 전립선암 항원, 갑상선암 항원, 난소암 항원, 자궁내막암 항원, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 바이러스 항원은 HIV 항원, 에볼라 항원, HPV 항원, EBV 항원, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  6. 청구항 2에 있어서,
    상기 화합물은 분화 인자를 포함하고, 상기 분화 인자는 EOMES, NFKB, FOXP3, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 핵산, 단백질 또는 펩티드, 소분자, 아주반트, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  8. 청구항 2에 있어서,
    (a) 상기 화합물은 키메라 항원 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체는 키메라 T 세포 수용체이고;
    (b) 상기 화합물은 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 ⅰ) siRNA, mRNA, miRNA, lncRNA, tRNA, saRNA, 또는 shRNA이거나 이를 암호화하고; ⅱ) 플라스미드 또는 트랜스포손이고; 또는 ⅲ) MHC 복합체를 암호화하고;
    (c) 상기 화합물은 단백질 또는 펩티드를 포함하고, 상기 단백질은 TALEN 단백질, 아연 집게 뉴클레아제, 메가 뉴클레아제, CRE 재조합효소, 또는 전사 인자를 포함하고; 또는
    (d) (a) 내지 (c)의 임의의 조합인 방법.
  9. 청구항 2에 있어서,
    상기 면역 세포는 B 세포, 수지상 세포, 대식세포, T 세포, NK 세포, 단핵구, 호중구, 과립구, 호염구, 호산구, 비만 세포, 선천성 림프상 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 항원은 전장의 비가공된 단백질을 포함하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 면역 세포는 상기 면역 세포의 표면 상에 상기 항원의 I종 또는 II종 조직적합 항원 제한 가공된 형태를 표시하는 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    (ⅰ) 상기 세포 현탁액이 상기 협착을 통해 통과되기 전에, (ⅱ) 상기 세포 현탁액이 상기 협착을 통해 통과되는 동안에, (ⅲ) 상기 세포 현탁액이 상기 협착을 통해 통과된 후에 상기 면역 세포를 상기 화합물과 접촉시키는 단계, 또는 (ⅳ) (ⅰ) 내지 (ⅲ)의 임의의 조합을 추가로 포함하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 협착은 (ⅰ) 10㎛ 내지 30㎛의 길이, (ⅱ) 3㎛ 내지 6㎛의 직경, 또는 (ⅲ) (ⅰ) 및 (ⅱ) 모두를 갖는 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 현탁액은 말초 혈액 단핵 세포를 추가로 포함하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 말초 혈액 단핵 세포는 다음의 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및 대식세포 중 하나 이상 타입의 세포를 포함하는 방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    상기 세포 현탁액은 인간, 마우스, 개, 고양이, 말, 원숭이, 또는 랫트 세포를 포함하는 방법.
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