DE2502621C3

DE2502621C3 - Messung elastischer und dielektrischer Eigenschaften der Membran lebender Zellen

Info

Publication number: DE2502621C3
Application number: DE2502621A
Authority: DE
Inventors: Hans Prof. Dr. Randwick Coster (Australien); Guenter Dr. Pilwat; Ulrich Dr. Zimmermann
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 1975-01-23
Filing date: 1975-01-23
Publication date: 1978-09-14
Also published as: JPS6013140B2; DE2502621B2; US4055799A; FR2298797A1; CH594888A5; FR2298797B1; JPS5197495A; DE2502621A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung elastischer und dielektrischer Eigenschaften der Membran einzelner lebender Zellen von Lebewesen oder der Membranen von in einer physiologischen Flüssigkeit im Schwebezustand befindlicher oder in einem Verband als Schicht vorliegender lebender Zellen von Lebewesen.

Bei Prozessen, die in den Zellen von Lebewesen, die sowohl Zellen tierischer als auch pflanzlicher Lebewesen oder auch Zellen von Mikroorganismen sein können, ablaufen, beispielsweise Prozesse, bei denen Stoffe in die Membran der Zellen oder durch die Membran der Zellen in das Zellinnere gelangen, spielt die Beschaffenheit der Membran der Zellen eine entscheidende Rolle. Daher ist man bestrebt, die Beschaffenheit der Membranen zu bestimmen. Auch für die Beurteilung der Wirkung von Fremdstoffen, die dem Körper eines Lebewesens zugeführt werden, auf die Membran derartiger Zellen ist die Beschaffenheit der Membran dieser Zellen von großer Bedeutung. Solche Untersuchungen sind beispielsweise zur Bestimmung der Wirkung pharmazeutischer Miuel oder der Wirkung von Giften oder von sonstigen Stoffen in für die Zellen unverträglicher Konzentration oder aber auch des Einflusses von Krankheiten auf die Membran lebender Zellen wichtig. Zwar ist es bekannt, daß die Funktionsfähigkeit der Membran lebender Zellen für die in den Zellen ablaufenden Prozesse von elastischen und dieleketrischen Eigenschaften der Membran der Zellen bestimmt wird und daß bei Änderung dieser Eigenschaften eine Änderung des Verhaltens der Zellen bei den in den Zellen ablaufenden Prozessen feststellbar ist. Es ist jedoch trotz angestrengter Bemühungen bisher nicht gelungen, durch ein einfach durchzuführendes Verfahren eine Aussage über die elastischen und dielektrischen Eigenschaften der Membran der Zelle und somit auch über die Funktionsfähigkeit von Zellen für die vorgenannten Prozesse zu erhalten. Vielmehr sind bisher zur Untersuchung der Struktur der Membran lebender Zellen von Lebewesen technisch sehr aufwendige Verfahren angewandt worden, die nicht in wirtschaftlicher Weise cinsetzbar sind. So wird

beispielsweise die Dicke der Membran dadurch gemessen, daß die Zellen mit Röntgenstrahlen durchleuchtet werden oder in den Zellen elektronenmikrojkopisch untersucht werden. Auch wird die Nahordnung der Moleküle in der Membran lebender Zellen von Lebewesen durch magnetische Anregung de:; Kernspins der Moleküle untersucht sowie das Elektronenresonanzsignal des freien Elektrons eines in die Membran eingeführten Radikals gemessen. Dadurch sind zwar Aussagen über die Änderung der Membranstruk;ur möglich. Die elastischen Eigenschaften der Membran lebender Zelicn sind jedoch auf diese Weise nicht feststellbar.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung elastischer und dielektrischer Eigenschaften der Membran einzelner lebender Zellen von Lebewesen oder der Membranen von in einer physiologischen Flüssigkeit im Schwebezustand befindlicher oder in einem Verband als Schicht vorliegender lebender Zellen von Lebewesen zu schaffen, das es auf technisch einfache und wirtschaftliche Weise ermöglicht, strukturelle Veränderungen der Membran lebender Zellen von Lebewesen zur Erkennung von auf die Membran der Zelle oder der Zellen einwirkenden Einflüsssen festzustellen. Darüber hinaus soll das Verfahren eine Aussage über den strukturellen Aufbau der Membran von Zellen von Lebewesen ermöglichen. Dadurch soll in Verbindung mit der Feststellung etwaiger struktureller Veränderungen der Membran lebender Zellen von Lebewesen infolge der Wirkung von in die Membran gelangte Fremdstoffe oder von sonstigen Stoffen, die in den Zellen in für die Zelten unverträglicher Konzentration vorliegen, oder infolge von Krankheiten eine Aussage über deren Funktionsfähigkeit für in den Zellen ablaufenden Lebensprozessen gestatten. Es ist weiter Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen.

Zur Lösung dipser Aufgabe geht die Erfindung von der Erkenntnis aus, daß die Permeabilität einer Zelle, deren Membran in ein elektrisches Spannungsfeld gebracht wird, bei einer bestimmten, im folgenden als Durchbruchsspannung bezeichneten Spannung erhöht wird. Die Membran einer lebenden Zelle, die in ihrem Normalzustand praktisch elektrisch nicht leitend ist, wird dabei elektrisch leitend. Feststellbar ist diese Änderung der Eigenschaft durch eine meßbare Erhöhung des durch die Membran fließenden elektrischen Stromes. Die Erfindung geht weiterhin von der Erkenntnis aus, daß die Höhe der Durchbruchsspannung, bei der die Permeabilitätserhöhung eintritt, im wesentlichen von den dielektrischen Eigenschaften der Membran der Zelle, von den elastischen Eigenschaften sowie von der Dicke der Membran der Zelle abhängt, wobei diese Abhängigkeit durch die Beziehung

(Höhe der Durchbruchsspannung)^:

beschrieben wird. Dabei sind

2- 0.3679 ■ Λ_ο ■ y

f ■ f ο

y der Elastizitätsmodul der Membran senkrecht zu

deren Oberfläche,
Λιι die Dicke der Membran vor dem Anlegen des elektrischen Feldes,

f·: die Dielektrizitätskonstante für die Membran, Kn die Dielektrizitätskonstante für das Vakuum.

Die Höhe der Durchbruchssoannung stellt somit eine Maßzahl für diese spezifischen Eigenschaften der Membran der Zelle dar.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird mit dem im Patentanspruch 1 angegebenen Verfahren gelöst. Dadurch, daß die Spannung impulsweise auf die Membran der Zelle oder der Zellen gegeben wird, wird gewährleistet, daß eine Zerstörung der Zelle oder der Zellen infolge Erhitzung, die bei Anwendung einer

ι» konstanten Spannung möglich wäre, verhindert wird.

Es wird also die in die physiologische Flüssigkeit eingegebene Zelle an die höchstens die Abmessung des Durchmessers der Zelle aufweisende Öffnung in einer die zur Abgabe und zur Aufnahme von Spannungs- und Stromimpulsen vorgesehenen Elektroden sowie die Meßelektroden elektrisch isolierend voneinander trennenden Wandung angesaugt oder die in die physiologische Flüssigkeit eingegebenen Zellen werden an die höchstens die Abmessung des Durchmessers der Zellen aufweisenden Öffnungen in einer die zur Abgabe und zur Aufnahme von Spannungs- und Stromimpulsen vorgesehenen Elektroden sowie die Meßelektroden elektrisch isolierend voneinander trennenden Wandung angesaugt, so daß beim Anlegen einer elektrischen Spannung an die beiden zur Abgabe und zur Aufnahme von Spannungs- und Stromimpulsen vorgesehenen Elektroden die die Öffnung oder die Öffnungen durchdringenden Stromlinien des so erzeugten elektrischen Feldes zugleich die Membran der an die Öffnung

JO angesaugten Zelle oder die Membranen der an die Öffnungen angesaugten Zellen durchdringen. Der Durchmesser der Öffnung oder der Öffnungen in der Wandung ist dabei so bemessen, daß die angesaugten Zellen die Öffnungen verstopfen.

J; Für den Fall, daß eine Vielzahl von Zellen untersucht werden soll, wird als Wandung zwischen den Elektroden zweckmäßigerweise eine Glasfritte oder ein Filter verwendet, bei denen die Öffnungen der l'oren Abmessungen von höchstens der Größe der Durchmesser der Zellen aufweisen. Dabei werden bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung die in der physiologischen Flüssigkeit im Schwebezustand befindlichen Zellen an eine Seite der die Öffnungen aufweisenden Wandung der Glasfritte oder an das Filter gesaugt, wobei sie die Öffnungen der Poren der Glasfritte oder des Filters verstopfen. Diese Verstopfung der Porenöffnungen führt einerseits zu einer Erhöhung des Strömungswiderstandes für die Flüssigkeit, der mittels eines an das System angeschlossenen Manometers meßbar ist und andererseits infolge der als elektrischer Isolation wirkenden Membran der angesaugten Zelle oder der Zellen zu einer Erhöhung des elektrischen Widerstandes zwischen den Elektroden, der mittels der an die Elektroden angeschlossenen Einrichtung meßbar ist. Im Anschluß daran wird nach dem Verfahren gemäß der Erfindung die Durchbruchsspannung für die Zellmembranen gemessen, wobei ein statistischer Mittelwert für die Durchbruchsspannung erhalten wird.

bo Da die bei Erreichen der Durchbruchsspannung erfolgende Permeabilitätshöhung der Membran der Zellen nach einer je nach Art der Zellen unterschiedlicher Zeit zwischen einer Sekunde bis zu einigen Minuten, während der keine Spannungsimpulsc an die

h5 Elektroden angelegt werden, wieder ausheilt, ist das Verfahren gemäß der Erfindung somit dem den gleichen Zellen nach relativ kurzer Zeit wiederholbar.

Für den Fall, daß nur wenige Zellen für die

Untersuchung zur Verfügung stehen oder bei Untersuchungen, bei denen die Membraneigenschaiten einzelner /eilen erlorschi werden sollen, wird als die Elektroden isolierend voneinander trennende Wandung eine solche verwendet, die nur eine Öffnung oder => anstelle der Öffnung eine Kapillare aufweist, wobei deren Durchmesser höchstens so groß ist wie der Durchmesser der zu untersuchenden Zelle. Das N erfahren gemäß der Erfindung wird sodann analog der Messung der Durchbruchsspanniing für eine Vielzahl κι von Zellen durchgeführt.

Diese Variante des Verfahrens gemäß der Erfindung, bei der eine einzelne, mehrere oder eine Vielzahl von Zellen an die Öffnungen oder die Öffnungen in einer Wandung angesaugt werden, ist für alle Zellen von r, Lebewesen anwendbar, die entweder schon in ihrem natürlichen Zustand in einer physiologischen Flüssigkeit suspendiert sind, wie beispielsweise Erythrozyten oder Leukozyten im Blut oder Mikroorganismen in ihrem Nährmedium, oder die durch Anwendung entsprechender Verfahren in physiologischer Flüssigkeit suspendierbar sind und somit als einzelne Zellen in der Flüssigkeit in der Sehwebe gehalten werden. Dies ist beispielsweise der Fall bei Tumorzellen oder bei Zellen von pflanzlichen Organen, die beispielsweise durch Anwen- 2~> dung von Dctcrgenzien oder auch Komplexbildnern, wie Älhyldiamintetracssigsäure. aus dem Verband der Zellen herauslösbar sind.

Für den Rill, daß das Verfahren gemäß der Erfindung zur Messung der Dtirchbruehsspannung der Membran sn von Zellen in einer Schicht, die aus bis zu 20 Lagen von Zellen bestehen kann, beispielsweise dem Blatt einer Pflanze oder dem Schnitt eines Zellgewebes aus einem Organ, eingesetzt wird, wird die Schicht von Zellen zweckmäßigerweise an der Öffnung oder an den r> Öffnungen in der die Elektroden elektrisch isolierend voneinander trennende Wandung durch Verkleben oder durch Andrücken mittels eines Gummiringes befestigt. Die Abmessungen der Öffnungen sind dabei zweckmäßigerweise der Größe der Schicht der Zellen angepaßt. au

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist sehr gut zur Ermittlung von durch Krankheiten oder durch Fremdstoffe oder durch Stoffe in für die Zellen unverträglicher Konzentration bewirkten Veränderungen der Membran von Zellen von Lebewesen anwendbar. Veränderungen a~> der Membranstruktur der Zellen von Lebewesen, die durch Krankheiten hervorgerufen werden, wie dies beispielsweise bei an Siehelzcllenanämie erkrankten Erythroz> len oder bei an Krebs erkrankten Gewebczcllcn. wie Tumorzellen oder dergleichen, der Fall ist. sind so durch Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung auf einfache Weise feststellbar. Durch Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung sind auf ebenso einfache Weise außerdem Voränderungen der Membranstruktur der Zellen von Lebewesen feststellbar, die durch Fremdstoffe, beispielsweise Giftstoffe oder sonstige umweltbedingte Schadstoffe oder auch Medikamente hervorgerufen worden sind. Das Verfahren gemäß der Erfindung wird daher auch zur Erkennung derartiger, die Membran der Zellen verändernder fao Einflüsse, beispielsweise auch zur Früherkennung von krankhaften Veränderungen der Membran der Zellen von Lebewesen, eingesetzt. Dabei erstreckt sich die Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung zur Ermittlung von Veränderungen der Membran der Zellen von Lebewesen beispielsweise auch auf die Ermittlung von Veränderungen der Membran der Zellen von Süßwasser- oder Meereswasseralgen.

wodurch tier Einfluß umweltbedingter Schadstoffe auf die Ökologie der Gewässer feststellbar ist. Die Verwendung des Verlahrens gemäß der Erfindung zur Ermittlung von Veränderungen der Membran von Zellen ist darüber hinaus auch bei Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien oder llefezellen. möglich. So kann beispielsweise die erforderliche Dosierung von zur Toning von Bakterien vorgesehener Mittel auf einfache Weise festgestellt werden.

Im Patentanspruch 2 ist die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung definiert.

Ausführungsbeispicle der Vorrichtung gemäß der Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und werden im folgenden näher erläutert: Es zeigt

Fig. I einen Längsschnitt durch einen Behälter mit einer eine einzige, als Kapillare ausgebildete Öffnung aufweisenden Zwischen wandung.

Fig. 2 einen Längsschnitt durch einen Behälter mit einer eine Vielzahl von Öffnungen aufweisenden Zwischen wandung,

F i g. 3 eine schematischc Darstellung der Einrichtung zur Erzeugung von Spannungsimpulsen und zur Messung der Amplitude der resultierenden Siromimpulse und der Einrichtung zur Messung der Durchbruehsspannung.

Wie aus F i g. 1 und F i g. 2 hervorgeht, weist der Behälter 1 eine Zwischenwandung 2 auf. durch die der Behälter 1 in eine Kammer 3 und eine Kammer 4 unterteilt wird. In beiden Kammern 3 und 4 ist je eine zur Abgabe der Spannungs- und Stromimpulsc vorgesehene Elektrode 5 und je eine Meßeleklrode fi angeordnet, die zur Messung der Potentialdiffercnz von auf beiden Seiten der Zwischenwandung 2 anstehenden Spannungen vorgesehen ist. Die Meßelektrodcn bestehen aus einem in einer Mikropipette angeordneten chlorierten Silberdraht, wobei die Mikropipette mit einer 2 N-KCI-Lösung gefüllt ist. die durch Zugabe einei bestimmten Menge Agar-Agar verfestigt wurde. Kam· mer 3 weist einen Anschluß 7 für die Zuführung vor physiologischer Flüssigkeit, in der sich die Zelle oder die Zellen von Lebewesen im Schwebezustand befinden auf. Kammer 4 weist einen Anschluß 8 für die Zuführung von Elektrolytflüssigkeit auf. der zugleich als l.eitungsanschluß für eine in der Zeichnung nicht dargestellte Saugeinrichtung zum Ansaugen der Zellen an die Zwischenwandung 2 dient. Die Zwischenwandung 2 ir dem in F i g. 1 dargestellten Behälter 1, der zur Messung der Durchbruchsspannung an einer einzelnen Zelle vorgesehen ist. weist eine als Kapillare ausgebildete Öffnung 9 auf. Die Zwischenwandung 2 des in Fig. 7 dargestellten Behälters 1, der zur Messung dei Durchbruchsspannung an einer Vielzahl von Zellcr vorgesehen ist, besteht aus einem eine Vielzahl vor Öffnungen 9 aufweisenden Membran-Filter, das aul einer als Stützwandung für das Membran-Filtei vorgesehenen Siebplatte 10 aufliegt und an diese übei einen Gummi-Ring 11 mittels einer in der Zeichnung nicht dargestellten Klemmvorrichtung angedrückt wird In beiden Fig. 1 und 2 sind die zu untersuchender Zellen 12 in einer Lage dargestellt, in der sie siel befinden, nachdem sie an die Zwischenwandunf angesaugt worden sind. Wie aus der Zeichnung ersichtlich isu verstopfen sie dabei die Öffnungen 9, se daß die die Öffnungen 9 durchdringenden Stromlinier eines zwischen den Elektroden 5 angelegten elektri sehen Feldes zugleich die Membran der angesaugter Zelle oder der angesaugten Zellen durchdringen.

Für den Rill, dall eine Schicht von /eilen untersucht werden soll, wird die Schicht anstelle des in Fiy.2 dargestellten Membranfilter* an die Siebplatte 10 über den Gummiring 11 angedrückt.

Wie aus I'i g. 3 hervorgeht, sind die zur Abgabe und /Ui' Aufnahme der Spannungsimpuise vorgesehenen Elektroden 5 mit einem Impulsgenerator 13. der einen niedrigen Ausgangswiderstand aufweist, verbunden. Der Impulsgenerator 13 erzeugt, in der Zeichnung nicht dargestellt, eine Folge von konstanten Spaniiungsimpulsen einer Pulsdauer zwischen I jis und 10 ms. In einer der beiden Vcrbindtingslcilungen zwischen den Elektroden 5 und dem Impulsgenerator 13 ist ein Widerstand 14 angeordnet. Er dient da/u, den über die Elektroden 5 fließenden Strom durch Spannungsabgriff an den beiden Enden des Widerstandes 14 zu ermitteln. Der an dem Widerstand 14 gemessene Spannungsabfall wird zur Anzeige auf einen Kathodenstrahloszillographen 15 gegeben, der als Speichcrosz.illograph ausgebildet ist.

Wie aus F i g. 3 ferner hervorgeht, sind die beiden zur Messung der Durchbruchsspannung der Membran der /.eile oder der Zellen vorgesehenen Meßelektrodcn 6 mil einem Differenzverstärker 16, der eine hohe Eingangsimpedan/, aufweist, verbunden. Die im Verstarker 16 verstärkten Spannungswerte werden ebenfalls auf den Kathodenstrahloszillographen 15 gegeben und zusammen mit den als Spannungsabfall über dem Widerstand 14 gemessenen Siromimpulsen auf dem Anzeigeschirm des Kaihodenstrahloszillographen angezeigt.

Wie aus F i g. 3 ebenfalls hervorgeht, ist zur Festlegung der Pulsfolge ein Impulsgeber 17 vorgesehen, der zur sequentiellen Anzeige der vom Impulsgenerator 13 ausgehenden Spannungsimpulse und somit auch der resultierenden Stromimpulse sowie der über die Meßclektroden 6 gemessenen Impulse der Potentialwerte, direkt mit dem Kathodenstrahloszillographen 15 und über eine Steuereinrichtung 18 mit dem Impulsgenerator 13 verbunden ist. Durch die Steuereinrichtung 18 werden die vom Impulsgenerator 13 ausgehenden Spannungsimpulse jeweils so lange verzögert, daß die Spannungsimpulse und die resultierenden Stromimpulsc sowie die über die Meßelektroden 6 gemessenen Impulse der Potentialwerte in der ihrer zeitlichen Aufeinanderfolge entsprechenden Reihenfolge auf dem Anzeigeschirm des Kathodenstrahloszillographen 15 angezeigt werden. Durch die Steuereinrichtung 19, über die der Impulsgeber 17 ebenfalls mit dem Impulsgenerator verbunden ist, wird die Amplitude der vom Impulsgenerator 13 ausgehenden Spannungsimpulse kontrolliert und entsprechend einer vorgegebenen Gesetzmäßigkeit erhöht.

Ausführungsbeispiel 1

1 ml Erythrozyten wurde in 100 ml einer 139mM/l Natriumchlorid sowie 15mM/l Natriumphosphat enthaltenden und eine Temperatur von etwa 20° aufweisende physiologische Lösung, deren pH-Wert 7,4 betrug, eingegeben. Die so gebildete Suspension, an der sich die Erythrozyten in der Schwebe befanden, wurden in 10 etwa gleiche Teilmengen unterteilt, von denen 9 Teilmengen jeweils mit einer unterschiedlichen, in der ersten Spalte der Tabelle 1 angegebenen Menge an Benzylalkohol versetzt wurden.

Zur Messung der Durchbruchsspannung, die mit einer Vorrichtung gemäß Fig.2 und Fig.3 durchgeführt wurde, wurden die zehn. ciiiL¹ unterschiedliche Menge an Benzylalkohol aufweisenden Teilmengen jeweils gelrennt in die Kammer 3 des Behälters 1 nach F i g. 2 gegeben, dessen Zwischenwand aus einem Membran-Filler mil einem Porendurclimesscr von 2 μηι bestand. Im Anschluß daran wurde an die Kammer 4 ein Unterdruck von elwa 0.6 atm so lange angelegt, bis die Poren des Filters mit Erythrozyten verstopft waren, was mittels eines an die Saugleitung angeschlossenen

ι» Manometers festgestellt wurde.

An die Elektroden 5 wurde sodann alle 30 Sekunden ein Spannungsimpuls einer Pulsdauer von etwa 25 μ* angelegt, wobei die Amplitude der Spannungsimpulse um jeweils 300 mV erhöht wurde. Auf diese Weise

r> wurde die Höhe der Durchbruchsspannung in einer ersten Messung grab ermittelt. In einer zweiten Messung, die nach einer Wartezeit von etwa fünf Minuten, in der die Zellen wieder ausheilten, durchgeführt wurde, wurde die Amplitude der Spannungsimpul-

-'» se im Bereich der Höhe der Durchbruchsspannung um jeweils 50 bis 100mV erhöht. Dabei wurde für die Membran der in den eine unterschiedliche Konzentration an Benzylalkohol enthaltene Teillösungen befindlichen Zellen die in der zweiten Spalte der in der Tabelle 1 aufgeführten Durchbruchsspannungen gemessen. In der dritten Spalte der Tabelle 1 sind die entsprechenden Werte für die prozentuale Änderung der gemessenen Durchbruchsspannung, bezogen auf den für die in der ersten Zeile der Tabelle 1 angegebenen Lösungen

j(> gemessenen Wert, aufgeführt.

Tabelle 1

Konzentration
an Benzylalkohol
in mM/l

Durchbruchsspannung
in Volt

Relative Änderung der Durchbruchsspannung in %

0	,42	0
40 1	,42	0
10	,38	- 3
30	,36	- 4
50	,31	- 8
70	,18	-17
45 90	,12	-21
100	,02	-28
110 (	),99	-30
120 (	),89	-37

Ausführungsbeispiel 2

In analoger Weise wie im Ausführungsbeispiel 1 =5 wurde die Durchbruchsspannung für die Membranen von Erythrozyten, die sich durch ihren Cholesteringehalt unterscheiden, gemessen. Der Cholesteringehalt der Membran der Zellen, der durch biochemische Analyse ermittelt worden war, ist in der ersten Spalte der Tabelle 2 als qualitative Änderung zu einer in der ersten Zeile der Tabelle 2 angeführten Teilmenge von Erythrozyten mit normalem Cholesteringehalt angegeben. Die gemessenen Durchbruchsspannungen sind in der zweiten Spalte der Tabelle 2 in Volt angegeben. In der dritten Spalte der Tabelle 2 sind die prozentualen Änderungen der Durchbruchsspannungen, bezogen auf die für die erste Lösung gemessenen Durchbruchsspannung, aufgeführt.

Tabelle 2

Cholcsteringehalt
der Membran der
Erythrozyten

Durchbruchsspannung in Voll

Relative Änderung der Durchbruchsspannung in %

+ 17,3 + 19,4

+ 2,2 -14,4

Ausführungsbeispiel 3

In eine eine Temperatur von etwa 20⁰C aufweisende physiologische Flüssigkeit, die 30 mMol/l KCI, 1 niMol/l

Normal	1,39
Schwache
Verarmung	1,63
Starke Verarmung	1,66
Schwache
Anreicherung	1,42
Starke
Anreicherung	1,19

10

MgCI₃, 9OmMoUl Na₃HPO₄, 30mMol/l NaH₃PO₄, 15mMol/l (NH₄)ISO₄, 0,5% Glukose sowie jeweils 100 mg/l Histidin und Leucin enthielt, wurden Bakterien der Art Escheriehia coli B 163 eingegeben. Nach etwa b

ι Stunden wurde eine Teilmenge aus der so gebildeten Lösung entnommen, in der sich die Bakterien zu diesem Zeitpunkt im logarithmischen Wachstum befanden und sodann die Durchbruchsspannung der Membran der /.eilen der in dieser Teilmengen befindlichen Bakterien

in in analoger Weise wie im Ausführungsbeispiel 1 bestimmt. Der Porendurehniesscr der Poren des verwendeten Membran-Filters betrug 0,45 iim. Die gemessene Durchbruchsspannung betrug 1,06 V. Nach weiteren zehn Stunden wurde eine weitere Teilmenge

r> der Lösung entnommen, in der sich die Bakterien zu diesem Zeitpunkt im stationären Wachstum befanden. Die gemessene Durchbruchsspannung der Membranen der Zellen der in dieser Teilmenge befindlichen Bakterien betrug 1,29 V.

Hierzu 3 BUiU Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung elastischer und dielektrischer Eigenschaften der Membran einzelner lebender Zellen von Lebewesen oder der Membranen von in einer physiologischen Flüssigkeit im Schwebezustand befindlicher oder in einem Verband als Schicht vorliegender lebender Zellen von Lebewesen, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzelne Zelle, mehrere oder eine Vielzahl einzelner Zellen oder eine ein- oder mehrlagige Schicht von Zellen in eine eine zwischen 0 und 40° C liegende Temperatur aufweisende, elektrischen Strom leitende, eine Elektrolytlösung bildende ι ϊ physiologische Flüssigkeit eingegebenen und die Zelle an die höchstens die Abmessung des Durchmessers der Zelle aufweisende Öffnung in einer die zur Abgabe und zur Aufnahme von Spannungs- und Stromimpulsen vorgesehenen Elektroden sowie die Meßelektroden elektrisch isolierend voneinander trennenden Wandung angesaugt wird oder daß die in die physiologische Flüssigkeit eingegebenen Zellen an die höchstens die Abmessung des Durchmessers der Zellen aufweisenden 2> Öffnungen in einer die zur Abgabe und Aufnahme von Spannungs- und Stromimpulsen vorgesehenen Elektroden sowie die Meßelektroden elektrisch isolierend voneinander trennenden Wandung angesaugt werden, wobei beim Anlegen einer elektrisehen Spannung an die beiden zur Abgabe und Aufnahme von Spannungs- und Stromimpulsen vorgesehenen Elektroden die die Öffnung oder die Öffnungen durchdringenden Stromlinien des so erzeugten elektrischen Feldes zugleich die Membran r> der an die Öffnung angesaugten Zelle oder die Membran der an die Öffnungen angesaugten Zellen durchdringen, worauf an die Elektroden eine Folge von Spannungsimpulsen mit einer konstanten, zwischen 1 μβ und 10 ms liegenden Pulsdauer angelegt und die Amplitude der Spannuugsimpulse zwischen 100 mV und 5 V so lange erhöht wird, bis bei Erreichen der Durchbruchsspannung die mit einem mit den Elektroden in Verbindung stehenden Sirommeßgerät meßbaren, resultierenden Stromim- 4> puls stark ansteigen, worauf die Durchbruchsspannung an zwei stromlos beidseitig der zwischen den Elektroden angebrachten Zelle, der zwischen den Elektroden angebrachten Zellen oder der zwischen den Elektroden angebrachten Schicht von Zellen >« angeordneten Meßelektroden gemessen wird.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein durch eine Zwischenwandung (2) in zwei Kammern geteilter Behälter (1) aus elektrisch nicht leitendem « Material mit jeweils einer in den Kammern (3 und 4) angeordneten Elektrode (5) zur Abgabe und zur Aufnahme von Spannungs- und Stromimpulsen und mit jeweils einer in den Kammern angeordneter, zur Messung der Durchbruchsspannung vorgesehenen t>o Meßelektrode (6) und mit zumindest einer Öffnung oder einem Leitungsanschluß (8) für die Zuführung von physiologischer Elektrolytlösung sowie für die Kingabc der Zelle, der Zellen oder der Schicht von Zellen in die eine der Kammern (3) vorgesehenen ist. h^r> in der Zwischenwandung (2) eine der Zahl der eingegebenen Zellen entsprechende Anzahl von Öffnungen (9) mit höchstens der Größe des Durchmessers der Zelle oder der Zellen entsprechenden Abmessungen und ein in die andere Kammer (4) hineinragender Leitungsanschluß (8) zum Ansaugen von Elektrolytlösung vorgesehen sind oder in der als Stützwandung für die Schicht von Zellen vorgesehenen Zwischenwandung (2) eine oder mehrere der Größe der eingegebenen Schicht von Zellen angepaßte Öffnungen vorgesehen sind und wobei die beiden zur Abgabe der Spannungsund Stromimpulse vorgesehenen Elektroden (5) mit einer Spannungsimpulse variabler Amplitude bis 5 V mit einer Spannungsimpulse variabler Amplitude bis 5 V sowie variabler zwischen 1 ps und 10 ms liegender Pulsadauer erzeugenden Einrichtung (11) und mit einer Einrichtung (13) zur Messung der Amplitude der infolge der an die Elektroden angelegten Spannungsimpulse auftretenden Stromimpulse und die beiden zur Messung der Durchbruchsspannung vorgesehenen Meßelektroden (6) mit einer Einrichtung (14, 13) zur Verstärkung und Messung von Spannungen verbunden sind.